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特表2023-500248制御性Ｔ細胞表面抗原のエピトープおよびこれに特異的に結合する抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-05
(54)【発明の名称】制御性Ｔ細胞表面抗原のエピトープおよびこれに特異的に結合する抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20221223BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20221223BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20221223BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221223BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221223BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221223BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221223BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221223BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221223BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221223BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221223BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20221223BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/705 ZNA
C07K16/28
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K47/68
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P35/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525129
(86)(22)【出願日】2020-11-09
(85)【翻訳文提出日】2022-04-27
(86)【国際出願番号】 KR2020015656
(87)【国際公開番号】W WO2021091359
(87)【国際公開日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】10-2019-0142251
(32)【優先日】2019-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518426066
【氏名又は名称】グッド ティー セルズ、 インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、チョン ホ
(72)【発明者】
【氏名】キム、ポム ソク
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA45
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE59
4C085AA13
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、制御性Ｔ細胞の表面に存在する抗原であるＬｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープおよびこれに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープであって、配列番号７～配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成された群より選択される少なくともいずれか１つのポリペプチドを含むエピトープ。
【請求項2】
Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープであって、配列番号７１または配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ。
【請求項3】
配列番号７～配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成された群より選択される少なくともいずれか１つのポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片。
【請求項4】
配列番号７１または配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１または２に記載のエピトープをコーディングする核酸分子。
【請求項6】
請求項５に記載の核酸分子が挿入された発現ベクター。
【請求項7】
請求項６に記載の発現ベクターが形質感染した宿主細胞株。
【請求項8】
請求項３または４に記載の抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項9】
前記癌は、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌である、請求項８に記載の薬学組成物。
【請求項10】
請求項３または４に記載の抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体－薬物結合体。
【請求項11】
配列番号７～配列番号７０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成された群より選択される少なくともいずれか１つのポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を薬学的有効量で個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法。
【請求項12】
配列番号７１または配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を薬学的有効量で個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、制御性Ｔ細胞の表面に存在する抗原であるＬｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープおよびこれに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【0002】
すべての正常個体において最も重要な特性は、自己（ｓｅｌｆ）を構成している抗原物質に対しては有害に反応しないのに対し、非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）抗原に対してはこれを認識し除去できる能力を有することである。このように自己抗原に対する生体の無反応を免疫学的無反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）または寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）という。自己寛容は、自己抗原の特異的な受容体を持っているかもしれないリンパ球を除去することにより、または自己抗原に接した後、自ら反応する機能が不活性化することにより発生する。自己寛容を誘導したり維持し続ける上で問題が生じると、自己抗原に対して免疫反応が起こり、これによってもたらされる疾患を自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）という。
【0003】
前記自己免疫疾患の治療のために、１９７０年代初めにＧｅｒｓｈｏｎによって従来のＴ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ）の効果機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を制御および抑制できるＴ細胞の存在の可能性がある抑制Ｔ細胞という概念を導入して、最初に提示されて以来（Ｒ．Ｋ．Ｇｅｒｓｈｏｎ ａｎｄ Ｋ．Ｋｏｎｄｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７０，１８：７２３－３７）、免疫学の多くの分野で制御性Ｔ細胞の生物学的特性および機能を究明するための研究が行われてきている。
【0004】
これによって、前記制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、過剰な炎症と免疫反応の発生を自然的に防止する重要な役割を果たすが、自己免疫疾患と慢性炎症疾患が発生する場合、制御性Ｔ細胞の機能と数字が著しく減少することが報告された。したがって、免疫疾患と炎症疾患がある患者の場合、制御性Ｔ細胞が正常な水準に生成されることが重要であり、これは前記疾患の治療法の一つになり得る。
【0005】
現在まで制御性Ｔ細胞に特異的に存在する遺伝子およびタンパク質に関する研究が行われ、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３８、ＣＤ１０３、ＧＩＴＲおよびＣＤ４５ＲＢなどの物質が標識物質に相当できるとされてきたものの、まだ制御性Ｔ細胞のみを単独で標的化できる遺伝子およびタンパク質は存在しない。
【0006】
一方、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の多変可能な領域および４個の構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原の抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ－末端からはじまって、順次に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称し、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の一つの目的は、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌ）の表面に存在するＬｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープを提供することである。
【0008】
本発明の他の目的は、前記エピトープに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片を提供することである。
【0009】
本発明のさらに他の目的は、前記エピトープに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体と薬物として、例えば、抗癌剤が結合した抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供することである。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、抗体－薬物結合体を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、前記エピトープに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片；および抗体－薬物結合体を用いて癌の予防または治療する方法を提供することである。
【0013】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明は、Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープまたは前記エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【0015】
本発明において、前記「Ｌｒｉｇ－１タンパク質」は、制御性Ｔ細胞の表面に存在する膜貫通タンパク質であって、細胞外あるいはルーメン側のロイシン反復配列（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ））と３つの免疫グロブリン様ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ）、細胞膜貫通配列および細胞質尾部から構成されている。ＬＲＩＧ遺伝子ファミリーはＬＲＩＧ１、ＬＲＩＧ２とＬＲＩＧ３が存在し、それぞれのファミリーを構成するアミノ酸は非常に保全的に構成されている。前記ＬＲＩＧ１遺伝子は正常皮膚で高く発現しており、基底と毛包細胞に発現して上皮幹細胞の増殖を調節することができる。したがって、表皮の恒常性の維持に重要な役割をし、不存在の場合、乾癬や皮膚癌に発展しうる。ＬＲＩＧ１が位置した染色体３ｐ１４．３部分が切断される場合には癌細胞に発展する可能性があると報告されており、実際に腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と扁平上皮癌（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）ではＬＲＩＧ１の発現が非常に減少していることが確認された。ところが、最近は、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質を発現する癌は２０～３０％程度に過ぎないことが究明されている。一方、本発明の目的上、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質は、ヒトまたはマウスに存在するタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0016】
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するＬｒｉｇ－１タンパク質であってもよい。
【0017】
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質は、配列番号１で表されるヒト由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質であってもよく、これは配列番号２で表される核酸配列によってコーディングされてもよいが、これに限定されるものではない。
【0018】
本発明の他の例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質は、配列番号３で表されるマウス由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質であってもよく、これは、配列番号４で表される核酸配列によってコーディングされてもよいが、これに限定されるものではない。
【0019】
本発明のさらに他の例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質は、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0020】
本発明の前記Ｌｒｉｇ－１細胞外ドメインは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインであってもよい。本発明の目的上、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外タンパク質は、ヒトまたはマウスに由来するＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0021】
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、ヒト由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質の３５番目～７９４番目のアミノ酸配列に相当する配列番号５で表されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0022】
本発明の他の例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、マウス由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質の３５番目～７９４番目のアミノ酸配列に相当する配列番号６で表されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0023】
以下、本発明についてより詳しく説明する。
【0024】
１．Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープ
本発明の一実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープであって、前記配列番号１、３、５および５で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の一部のアミノ酸、例えば、２個～５０個；６個～４５個；または１０個～４４個などのアミノ酸からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の他の実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープであって、配列番号７～７０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成された群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むエピトープを提供する。
本発明の一実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープであって、前記配列番号１、３、５および５で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の一部のアミノ酸、例えば、２個～５０個；６個～４５個；または１０個～４４個などのアミノ酸からなるものであってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の他の実施形態によれば、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープであって、配列番号７～７０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成された群より選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むエピトープを提供する。
【0025】
本発明の一例として、前記Ｌｉｒｇ－１タンパク質のエピトープは、配列番号７１または配列番号７２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0026】
本発明の前記エピトープは、立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）であってもよい。
【0027】
本発明の前記「立体構造エピトープ」は、連続的な配列からなる１次元的な線状エピトープとは異なり、不連続的なアミノ酸配列から構成される。このような立体構造エピトープは、抗体抗原結合部位の３次元的な構造と反応する。
【0028】
２．Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープをコーディングする核酸分子
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する前記エピトープをコーディングする核酸分子を提供する。
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する前記エピトープをコーディングする核酸分子を提供する。
【0029】
本発明の核酸分子は、本発明で提供するポリペプチドのアミノ酸配列を、当業者に知られているように、ポリヌクレオチド配列に翻訳された核酸分子のすべてを含む。そのため、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）による多様なポリヌクレオチド配列が製造可能であり、これもすべて本発明の核酸分子に含まれる。
【0030】
３．Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープをコーディングする核酸分子が挿入された発現ベクター
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
【0031】
本発明において、前記「ベクター」は、ある核酸分子が連結された他の核酸を輸送できる前記核酸分子である。ベクターの一類型は、追加的なＤＮＡセグメントが結紮できる円形二重鎖ＤＮＡを指す「プラスミド」である。また、他の類型のベクターはファージベクターである。さらに他の類型のベクターはウイルス性ベクターで、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結紮できる。あるベクターは、それらが流入した宿主細胞で自律的な複製が可能である（例えば、バクテリア性ベクターはバクテリア性複製起源を有するエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非－エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に流入しながら宿主細胞のゲノムに統合され、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。それだけでなく、あるベクターは、これらが作動レベルで連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と名付けられる。一般的に、組換えＤＮＡ手法で有用な発現ベクターは、たびたびプラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、ベクターの中でプラスミドが最も通常使用される形態であるため、相互交換して使用可能である。
【0032】
本発明において、前記発現ベクターの具体例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムダ状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１ Ｐ２２、Ｑμμ、Ｔ－ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択できるが、これに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する時には目的とする宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ－デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われるが、これに限定されるものではなく、当業者は使用する発現ベクターおよび宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含むが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物の生産の有無によって選別可能である。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選別され、これはすでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに制限を設けない。
【0033】
本発明の核酸分子がコーディングするタンパク質の精製を容易にするために、タグ（Ｔａｇ）配列を前記発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ－ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグまたはｆｌａｇタグを含むが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
【0034】
４．Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープをコーディングする核酸分子が挿入された発現ベクターが形質転換された宿主細胞株
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞株を提供する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞株を提供する。
【0035】
本発明において、前記「宿主細胞」には、ポリペプチド挿入物の組込みのためのベクターのレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）であり得るか、またはレシピエントであった個別的な細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、前記子孫は自然的な、偶発的なまたは故意の突然変異のために必ずしも元の親細胞と完全に同一（形態学上またはゲノムＤＮＡ補完体において）でなくてもよい。宿主細胞には本願のポリペプチドで体内で形質転換された細胞が含まれる。
【0036】
本発明において、前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞を含むことができ、例えば、大膓菌、ストレプトミセス、サルモネラティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞、ピキアパストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウズメラノーマ細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）またはＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）の動物細胞；または植物細胞であってもよいが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた宿主細胞株として使用可能な細胞はすべて利用可能である。
【0037】
本発明の前記形質転換方法は、前記宿主細胞に目的とするベクターを注入させる任意の方法であって、宿主細胞にベクターを注入させることができる公知の方法であればすべて含まれてもよく、例えば、ＣａＣｌ２を用いた方法、電気穿孔法、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法、ＤＥＡＥ－デキストラン処理法、遺伝子打ち込みおよびウイルスを用いた形質転換方法などを利用することができるが、これに限定されるものではない。
【0038】
５．抗体または抗原結合断片
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
【0039】
本発明において、前記抗体は、全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または抗体の一部分であって、Ｌｒｉｇ－１タンパク質に結合する能力を有し、本発明の結合分子と競争的にＬｒｉｇ－１抗原決定部位に結合する抗体断片のすべてを含む。
【0040】
本発明において、前記「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割を果たすタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、前記抗原は、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）の表面に存在するＬｒｉｇ－１タンパク質であってもよい。好ましくは、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質のロイシンリッチ部位（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｇｉｏｎ）または免疫グロブリン様ドメインを特異的に認識するものであってもよいが、これに限定されない。
【0041】
本発明において、前記「免疫グロブリン」は、重鎖および軽鎖を有し、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域および可変領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の多変可能な領域および４個の構造領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原の抗原決定基（Ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ－末端からはじまって、順次に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称し、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【0042】
本発明において、前記「全長抗体」は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合で連結されており、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧを含む。前記ＩｇＧはその亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【0043】
また、本発明において、前記「抗原結合断片」は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、抗原結合断片の例は、（１）軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の不変領域（ＣＬ）および重鎖の１番目の不変領域（ＣＨ１）からなるＦａｂ断片；（２）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（３）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（４）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；（５）分離されたＣＤＲ領域；（６）２個の連結されたＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（７）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが抗原結合部位を形成するように結合させるペプチドリンカーによって結合した単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（８）二特異的な単鎖Ｆｖ二量体および（９）遺伝子の融合によって作製された多価または多特異的な断片であるダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）などを含む。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素、例えば、パパインまたはペプシンを用いる場合、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２の断片を得ることができ、遺伝子組換え技術により作製することができる。
【0044】
また、本発明において、前記抗体は、単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ヒト抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）、両特異性分子、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、二重特異的抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗体模倣体、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）またはその断片であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0045】
また、本発明において、前記「単クローン抗体」は、実質的に同一の抗体集団で得た単一分子組成の抗体分子を称するもので、特定の抗原決定基（Ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して単一結合特異性および親和度を示す。
【0046】
本発明において、前記「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域およびヒト抗体の不変領域を組換えた抗体であって、マウス抗体に比べて免疫反応が大きく改善された抗体である。
【0047】
また、本発明において、前記「ヒト化抗体」は、ヒトでない種に由来する抗体のタンパク質配列をヒトで自然的に生産された抗体変異体と類似するように変形させた抗体を意味する。その例として、前記ヒト化抗体は、マウス由来のＣＤＲをヒト抗体由来のＦＲと組換えてヒト化可変領域を製造し、これを好ましいヒト抗体の不変領域と組換えてヒト化抗体を製造することができる。
【0048】
本発明において、前記「結合」または「特異的結合」は、本願の抗体または抗体組成物の抗原に対する親和度を示すものである。抗原抗体結合における「特異的結合」は、典型的に解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｄ）が１×１０－５Ｍ未満または１×１０－６Ｍ未満または１×１０－７Ｍ未満の場合、非特異的な背景結合と区分される。特異的結合は、当業界における公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、免疫沈殿（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、共沈殿（ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）などの方法で検出可能であり、非特異的結合と特異的結合を区分できる適切な対照群を含む。
【0049】
本発明の抗体または抗原結合断片は、単量体の抗原結合能の少なくとも一部を含む二量体、三量体、四量体、五量体などの多量体で存在できる。このような多量体はまた、同種多量体、または異種多量体を含むものである。抗体多量体は、多数の抗原結合部位を含むため、単量体と比較して抗原に対する結合能に優れている。抗体の多量体はさらに、多機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ、ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ、ｔｅｔｒａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体の作製にも容易である。
【0050】
本発明において、前記「多機能性」とは、２つ以上の活性または機能（例えば、抗原結合能、酵素活性、リガンドまたは受容体結合能）を有する抗体または抗原結合断片を称するもので、例えば、本発明の抗体は、酵素活性を有するポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどと結合できる。多機能性抗体はさらに、多価性（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）または多特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ、ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃなど）形態の抗体を含む。
【0051】
６．抗体または抗原結合断片を有効成分として含む薬学組成物
また、本発明による抗体は、制御性Ｔ細胞上に存在する配列番号７～７２のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を活性化または維持させるか；または抑制して、エフェクターＴ細胞の活性を調節することにより、癌を予防または治療することができる。
また、本発明による抗体は、制御性Ｔ細胞上に存在する配列番号７～７２のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を活性化または維持させるか；または抑制して、エフェクターＴ細胞の活性を調節することにより、癌を予防または治療することができる。
【0052】
本発明において、前記「癌」は、哺乳類において典型的に調節されない細胞成長で特徴づけられた生理的状態を示すか、指す。本発明において、予防、改善または治療の対象になる癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）であってもよく、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0053】
７．抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片；および薬物を含む抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を提供する。
【0054】
本発明において、前記「抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）」とは、抗体と薬物の生物学的活性を低下させることなく薬物と抗体を化学的に連結した形態を指す。本発明において、前記抗体－薬物結合体は、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ－末端のアミノ酸残基に薬物が結合した形態、具体的には、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ－末端、α－アミン基に薬物が結合した形態をいう。
【0055】
本発明において、前記「薬物」は、細胞に特定の生物学的活性を有する任意の物質を意味することができ、これはＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む概念である。前記薬物は、α－アミン基と反応して架橋できる反応基を含む形態であってもよいし、α－アミン基と反応して架橋できる反応基を含むリンカーが連結されている形態も含む。
【0056】
本発明において、前記α－アミン基と反応して架橋できる反応基の例としては、抗体の重鎖または軽鎖のＮ－末端のα－アミン基と反応して架橋できれば、その種類は特に限定されず、当業界で公知のアミン基と反応する種類をすべて含む。その例として、イソチオシアネート（Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、イソシアネート（Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）、アシルアジド（Ａｃｙｌ ａｚｉｄｅ）、ＮＨＳエステル（ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、スルホニルクロライド（Ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アルデヒド（Ａｌｄｅｈｙｄｅ）、グリオキサール（Ｇｌｙｏｘａｌ）、エポキシド（Ｅｐｏｘｉｄｅ）、オキシラン（Ｏｘｉｒａｎｅ）、カーボネート（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アリールハライド（Ａｒｙｌ ｈａｌｉｄｅ）、イミドエステル（Ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、カルボジイミド（Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、アンハイドライド（Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）およびフルオロフェニルエステル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）のいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0057】
本発明において、抗体－薬物結合体は、前記抗体または抗原結合断片として、本発明のエピトープ、すなわち、Ｌｒｉｇ－１タンパク質；またはＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの一部のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ；前記式１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むエピトープ；または配列番号４８～１１３のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含み、この時、前記薬物は、Ｌｒｉｇ－１抗体が標的とする疾患を治療できる薬物であればすべて含まれてもよく、例えば、癌を治療可能な抗癌剤を治療できる薬物であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0058】
本発明の一例として、前記抗癌剤は、癌の予防、改善または治療のために使用される薬物であれば制限なく含まれるが、例えば、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ヴィスクム・アルブム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・チウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、カペシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンブラスチン、イダルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、レウコボリン、トレトニン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、オラパリブ、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン、５ＦＵ、ボリノスタット、エンチノスタットおよびカルムスチンからなる群より選択可能であり、これに限定されるものではない。
【0059】
８．抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を有効成分として含む薬学組成物
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片；または抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗体または抗原結合断片；または抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0060】
本発明において、前記薬学組成物において有効成分として含む抗体または抗原結合断片；またはこれに薬物が結合した抗体－薬物結合体は、配列番号７～７２のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌を非常に効果的に治療することができる。
【0061】
本発明において、前記癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）であってもよく、具体例として、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0062】
９．その他
一方、本発明において、「予防」は、本発明の薬学組成物を用いて疾患の症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
一方、本発明において、「予防」は、本発明の薬学組成物を用いて疾患の症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
【0063】
また、本発明において、「治療」は、本発明の薬学組成物を用いて疾患の症状が好転するか、有利になるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
【0064】
本発明において、前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。
【0065】
本発明において、前記薬学組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【0066】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。
【0067】
本発明において、前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。
【0068】
本発明において、前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与可能である。
【0069】
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含んだ様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化可能である。
【0070】
１０．治療方法
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明による抗体または抗原結合断片；または抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法に関する。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明による抗体または抗原結合断片；または抗体－薬物結合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）を個体に投与するステップを含む癌の予防または治療方法に関する。
【0071】
本発明の前記「癌」は、哺乳類で典型的に調節されない細胞成長で特徴づけられた生理的状態を示すか、指す。本発明において、予防、改善または治療の対象になる癌は、固形臓器（ｓｏｌｉｄ ｏｒｇａｎ）で異常に細胞が成長して発生した塊からなる固形癌（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）であってもよく、固形臓器の部位によって、胃癌、肝臓癌、膠細胞腫、卵巣癌、大膓癌、頭頸部癌、膀胱癌、腎細胞癌、乳癌、転移癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫または肺癌などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0072】
本発明の抗体または抗原結合断片；および抗体－薬物結合体は、配列番号７～７２のいずれか１つのアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌を非常に効果的に治療することができる。
【0073】
本発明において、前記「個体」は、癌の発病が疑われる個体であって、前記癌発病の疑われる個体は、当該疾患が発病したか発病しうるヒトを含むネズミ、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の抗体または抗体－薬物結合体で治療可能な個体は制限なく含まれる。
【0074】
本発明の方法は、抗体または抗体－薬物結合体を薬学的有効量で投与することを含むことができる。好適な１日の総使用量は正しい医学的判断範囲内で処置医師によって決定可能であり、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては、他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに使用されるか同時使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野でよく知られた類似因子によって異なって適用することが好ましい。
【0075】
一方、これに限定されないが、前記癌の予防または治療方法は、１つ以上の癌疾患に対する治療的活性を有する化合物または物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。
【0076】
本発明において、前記「併用」は、同時、個別または順次投与を示すと理解されなければならない。前記投与が順次または個別的な場合、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないようにするものでなければならない。
【0077】
本発明において、前記抗体または抗体－薬物結合体の投与用量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．０００１μｇ～５００ｍｇであってもよいが、これに限定されるものではない。
【発明の効果】
【0078】
本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、制御性Ｔ細胞上に存在する本発明のエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌の予防、改善または治療に非常に効率的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１タンパク質の構造を示す図である。
【図2】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１タンパク質の構造を示す図である。
【図3】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図4】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図5】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図6】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１、Ｌｒｉｇ－２およびＬｒｉｇ－３ ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。
【図7】本発明の一実施例による制御性Ｔ細胞と非制御性Ｔ細胞内のＬｒｉｇ－１タンパク質の発現量の比較結果を示す図である。
【図8】本発明の一実施例による制御性Ｔ細胞の表面にＬｒｉｇ－１タンパク質の発現を示す図である。
【図9】本発明の一実施例において抗体（ＧＴＣ２１０－０１、ＧＴＣ２１０－０２、ＧＴＣ２１０－０３、ＧＴＣ２１０－０４、ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）とＬｒｉｇ－１タンパク質に対する結合力を分析した結果を示す図である。
【図10】本発明の一実施例においてＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な単クローン抗体（ＧＴＣ２１０－０１、ＧＴＣ２１０－０２、ＧＴＣ２１０－０３、ＧＴＣ２１０－０４、ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）と制御性Ｔ細胞内でＬｒｉｇ－１タンパク質誘導Ｓｔａｔ３リン酸化調節機序を分析した結果を示す図である。
【図11】本発明の一実施例においてＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な単クローン抗体を用いた癌治療の実験設計図を示す図である。
【図12】本発明の一実施例においてＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な単クローン抗体（ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）を用いた癌治療効果を示す図である。
【図13】本発明の一実施例による質量分析の条件を示す図である。
【図14】本発明の一実施例による質量分析の条件を示す図である。
【図15】本発明の一実施例による質量分析の条件を示す図である。
【図16】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてキモトリプシンを用いた共有結合ラベリングＭＳの結果を示す図である。
【図17】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてキモトリプシンを用いた共有結合ラベリングＭＳの結果を示す図である。
【図18】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてトリプシンを用いた共有結合ラベリングＭＳの結果を示す図である。
【図19】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてトリプシンを用いた共有結合ラベリングＭＳの結果を示す図である。
【図20】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いた共有結合ラベリングＭＳの結果を示す図である。
【図21】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いた共有結合ラベリングＭＳの結果を示す図である。
【図22】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてキモトリプシンを用いたクロス結合ＭＳの結果を示す図である。
【図23】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてトリプシンを用いたクロス結合ＭＳの結果を示す図である。
【図24】本発明の一実施例によるＬｉｒｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいてＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いたクロス結合ＭＳの結果を示す図である。
【図25】本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの中でＧＴＣ１１０－０４抗体が特異的に結合するエピトープ部位を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0080】
本発明は、Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質のエピトープまたは前記エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【0081】
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、ヒト由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質の３５番目～７９４番目のアミノ酸配列に相当する配列番号５で表されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0082】
本発明の他の例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、マウス由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質の３５番目～７９４番目のアミノ酸配列に相当する配列番号６で表されてもよいが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【0083】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0084】
実施例
［準備例１］Ｔ細胞の亜型細胞の培養
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でのみＬｒｉｇ－１タンパク質が発現するかを確認するために、Ｔ細胞の亜型（ｓｕｂｓｅｔ）であるＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびｉＴｒｅｇを用意した。前記ｉＴｒｅｇは、自然的に分離したｎＴｒｅｇとは異なり、下記の組成を含む培地で分化を人工的に誘導した細胞を意味する。
［準備例１］Ｔ細胞の亜型細胞の培養
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でのみＬｒｉｇ－１タンパク質が発現するかを確認するために、Ｔ細胞の亜型（ｓｕｂｓｅｔ）であるＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびｉＴｒｅｇを用意した。前記ｉＴｒｅｇは、自然的に分離したｎＴｒｅｇとは異なり、下記の組成を含む培地で分化を人工的に誘導した細胞を意味する。
【0085】
Ｔ細胞の亜型はまず、マウスの脾臓から得たナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を分離した後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｈｙｃｌｏｎｅ、ｌｏｇａｎ、ＵＴ）１０％を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）栄養培地に下記表１の成分をそれぞれさらに含ませて、３７℃、５％ＣＯ２培養器内で７２時間培養によりそれぞれの細胞に分化誘導した。
【0086】
【表1】
【0087】
［実施例１］Ｌｒｉｇ－１構造の分析
制御性Ｔ細胞の表面タンパク質であるＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な抗体を作製するために、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの３次元立体構造を予測した。
制御性Ｔ細胞の表面タンパク質であるＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な抗体を作製するために、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの３次元立体構造を予測した。
【0088】
まず、抗原決定基（Ｅｐｉｔｏｐｅ）の塩基配列予測のためにＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ；ＥＣＤ）の構造を確認するために、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）とＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）ツールを用いて３次元立体構造を予測した後、その結果を図１および２に示した。
【0089】
図１に示すように、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのうち、Ｌｒｉｇ－ＬＲＲドメイン（アミノ酸配列４１～４９４番）内にはＬＲＲ１～ＬＲＲ１５の計１５個のロイシンリッチ部位（Ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ）が存在した。前記ＬＲＲドメインそれぞれは２３～２７個のアミノ酸から構成され、ロイシンは３～５個存在した。
【0090】
また、図２に示すように、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのうち、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のアミノ酸配列４９４～７８１番には免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）が３個存在した。
【0091】
［実施例２］Ｌｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの制御性Ｔ細胞での特異的発現の確認
Ｌｒｉｇ－１タンパク質が制御性Ｔ細胞に特異的なバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）として作用できるかを検証した。
Ｌｒｉｇ－１タンパク質が制御性Ｔ細胞に特異的なバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）として作用できるかを検証した。
【0092】
前記検証のために、マウスの脾臓からＣＤ４ビーズを通して磁石活性細胞分類機（ｍａｇｎｅｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。以後、ＣＤ２５抗体を用いて、蛍光活性細胞分類機（ＦＡＣＳ）を用いて制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ）細胞および非制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ）細胞を分離した。それぞれの細胞および前記準備例１で分化された細胞はトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）を用いてｍＲＮＡを抽出した後、ゲノミックＲＮＡは、ｇＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、会社で提供したプロトコルによって、ｇＤＮＡを除去した。ｇＤＮＡの除去されたｍＲＮＡは、ＢＤｓｐｒｉｎｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡに合成した。
【0093】
前記ｃＤＮＡでＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現量を定量的に確認するためにリアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行った。
【0094】
前記リアルタイム重合酵素連鎖反応は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、会社で提供したプロトコルによって、９５℃で３分、６１℃で１５秒、７２℃で３０秒ずつ、４０サイクルの条件で、下記表２のプライマーを用いて行い、相対的な遺伝子発現量は△ＣＴ方法を用いて計算し、ＨＰＲＴを用いて一般化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）して、その結果を図３～６に示した。
【0095】
【表2】
【0096】
図３に示すように、非制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ）細胞に比べて、制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ）細胞でＬｒｉｇ－１の発現が１８．１倍高いことが分かる。これは、従来知られている制御性Ｔ細胞のマーカーであるＬａｇ３およびＩｋｚｆ４と比較した時、約１０倍程度発現量が高い水準であった。また、図４および５に示すように、他の種類の免疫細胞に比べて、制御性Ｔ細胞、特に誘導された制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）に比べて、自然的に分離した制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）でＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現が著しく高かった。
【0097】
また、図６に示すように、Ｌｒｉｇファミリーに相当するＬｒｉｇ－１、Ｌｒｉｇ－２およびＬｒｉｇ－３の中でＬｒｉｇ－１の発現が最も高かった。
【0098】
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質は、制御性Ｔ細胞、特に自然的に存在する制御性Ｔ細胞で特異的に発現することが分かる。
【0099】
［実施例３］Ｌｒｉｇ－１タンパク質の制御性Ｔ細胞での特異的発現の確認
Ｌｒｉｇ－１ ｍＲＮＡから発現したＬｒｉｇ－１タンパク質が制御性Ｔ細胞でのみ特異的に発現するかを確認した。
Ｌｒｉｇ－１ ｍＲＮＡから発現したＬｒｉｇ－１タンパク質が制御性Ｔ細胞でのみ特異的に発現するかを確認した。
【0100】
制御性Ｔ細胞特異的な転写因子であるＦＯＸＰ３プロモーターにＲＦＰ（Ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合したＦＯＸＰ３－ＲＦＰ注入（Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）マウスを用いて、前記マウスの脾臓から、ＣＤ４ビーズで磁石活性細胞分類機（ｍａｇｎｅｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。以後、ＲＦＰタンパク質を用いて、蛍光活性細胞分類機（ＦＡＣＳ）により制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＲＦＰ＋Ｔ）細胞および非制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＲＦＰ－Ｔ）細胞を分離して得た。それぞれの前記細胞は、購入したＬｒｉｇ－１抗体および陰性対照群はアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）により染色して蛍光活性細胞分類機でＬｒｉｇ－１の発現量を測定して、その結果を図７に示した。
【0101】
図７に示すように、点線で表示される非制御性Ｔ細胞の場合、陰性対照群とほぼ同じＬｒｉｇ－１の発現レベルを見せたが、制御性Ｔ細胞の場合、Ｌｒｉｇ－１の発現レベルの高い細胞が多数存在した。
【0102】
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質は、制御性Ｔ細胞で特異的に発現することが分かる。
【0103】
［実施例４］制御性Ｔ細胞の表面でのＬｒｉｇ－１タンパク質特異的発現の確認
Ｌｒｉｇ－１タンパク質が細胞治療のターゲットになるためには、制御性Ｔ細胞の表面で発現してこそさらに効果的にターゲット治療が可能なため、Ｌｒｉｇ－１タンパク質が表面で発現するか否かを確認した。
Ｌｒｉｇ－１タンパク質が細胞治療のターゲットになるためには、制御性Ｔ細胞の表面で発現してこそさらに効果的にターゲット治療が可能なため、Ｌｒｉｇ－１タンパク質が表面で発現するか否かを確認した。
【0104】
前記準備例１のそれぞれの分化されたＴ細胞亜型を抗－ＣＤ４－ＡＰＣおよび抗Ｌｒｉｇ－１－ＰＥ抗体で染色し、蛍光活性細胞分類機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いてそれぞれの細胞表面でＬｒｉｇ－１の発現量を測定して、その結果を図８に示した。
【0105】
図８に示すように、活性化されたＴ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞およびナイーブ（Ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞ではＬｒｉｇ－１の発現が０．７７～１５．３の量で発現するのに対し、分化が誘導されたＴ細胞（ｉＴｒｅｇ）では８３．９と高く発現した。
【0106】
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で特異的に発現するだけでなく、特に制御性Ｔ細胞の表面でさらに高く発現することが分かる。
【0107】
［製造例１～８］Ｌｒｉｇ－１タンパク質に特異的な単クローン抗体の作製
本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な抗体を作製した。本抗体は特定の抗原決定基を決めて生産するのではなく、Ｌｒｉｇ－１タンパク質にどの部位でも結合できる抗体を生産した。
本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質に特異的な抗体を作製した。本抗体は特定の抗原決定基を決めて生産するのではなく、Ｌｒｉｇ－１タンパク質にどの部位でも結合できる抗体を生産した。
【0108】
前記抗体を作製するために、Ｌｒｉｇ－１タンパク質が発現する細胞を作製した。より詳しくは、配列番号２に相当するＤＮＡ断片およびｐｃＤＮＡ（ｈｙｇｒｏ）を切断酵素で切断した後、３７℃で培養してライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）して、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のＤＮＡ配列が挿入（ｉｎｓｅｒｔ）されているｐｃＤＮＡを作製した。前記作製された配列番号２が挿入されたｐｃＤＮＡは、Ｌ細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により導入されてＬ細胞の表面にＬｒｉｇ－１タンパク質が発現できるようにした。
【0109】
前記細胞表面に発現するＬｒｉｇ－１に結合できる軽鎖（Ｌｒｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）および重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）アミノ酸の配列をＨｕｍａｎ ｓｃＦｖ ｌｉｂｒａｒｙから選別して、計８個の重鎖および軽鎖を選別した。
【0110】
前記選別された重鎖および軽鎖アミノ酸配列をｍｌｇＧ２ａ Ｆｃ領域またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と融合して単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を作製した。前記単クローン抗体の配列は下記表３の通りである。
【0111】
【表3-1】
【0112】
【表3-2】
【0113】
【表3-3】
【0114】
【表3-4】
【0115】
【表3-5】
【0116】
【表3-6】
【0117】
【表3-7】
【0118】
【表3-8】
【0119】
【表3-9】
【0120】
［実施例５］本発明による抗体のＬｒｉｇ－１タンパク質に対する結合能評価
前記製造例１～８で作製された本発明による単クローン抗体がＬｒｉｇ－１をよく認識するかを確認するために、Ｌｒｉｇ－１を安定して発現するＬ細胞に前記製造例１～８の抗体それぞれを結合させた後、マウス抗体を認識できかつ、ｅＦｌｏｕｒ６７０がコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れた後、ＦＡＣＳを用いて前記単クローン抗体のＬｒｉｇ－１タンパク質に対する結合力を分析して、その結果を図９に示した。
前記製造例１～８で作製された本発明による単クローン抗体がＬｒｉｇ－１をよく認識するかを確認するために、Ｌｒｉｇ－１を安定して発現するＬ細胞に前記製造例１～８の抗体それぞれを結合させた後、マウス抗体を認識できかつ、ｅＦｌｏｕｒ６７０がコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れた後、ＦＡＣＳを用いて前記単クローン抗体のＬｒｉｇ－１タンパク質に対する結合力を分析して、その結果を図９に示した。
【0121】
図９に示すように、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質特異的な単クローン抗体ともＬ細胞の表面に存在するＬｒｉｇ－１タンパク質を効果的に認識して結合したことを確認することができた。
【0122】
［実施例６］本発明による抗体の制御性Ｔ細胞内の信号伝達経路の調節
前記製造例１～８で作製された本発明による単クローン抗体がＬｒｉｇ－１タンパク質を通して制御性Ｔ細胞内の信号伝達経路にどのような影響を与えるかを分析するために、前記製造例１～８の抗体を制御性Ｔ細胞に処理して前記制御性Ｔ細胞の表面に存在するＬｒｉｇ－１を刺激した後、ホスホチロシン免疫ブロット（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）により刺激された制御性Ｔ細胞内に存在するＳｔａｔ３タンパク質のチロシンリン酸化（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）の程度を分析し、その結果を図１０に示した。
前記製造例１～８で作製された本発明による単クローン抗体がＬｒｉｇ－１タンパク質を通して制御性Ｔ細胞内の信号伝達経路にどのような影響を与えるかを分析するために、前記製造例１～８の抗体を制御性Ｔ細胞に処理して前記制御性Ｔ細胞の表面に存在するＬｒｉｇ－１を刺激した後、ホスホチロシン免疫ブロット（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）により刺激された制御性Ｔ細胞内に存在するＳｔａｔ３タンパク質のチロシンリン酸化（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）の程度を分析し、その結果を図１０に示した。
【0123】
図１０に示すように、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質特異的な単クローン抗体（ＧＴＣ２１０－０１、ＧＴＣ２１０－０２、ＧＴＣ２１０－０３およびＧＴＣ２１０－０４）は、Ｓｔａｔ３のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をＴｈ１７細胞と同じ水準に増加させることを確認することができた。一方、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質特異的な単クローン抗体（ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）は、Ｓｔａｔ３のリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）をｉＴｒｅｇ細胞と同じ水準に引き続き維持および減少させることを確認することができた。
【0124】
［実施例７］ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４抗体の癌治療効果
前記製造例５～８で作製された本発明による単クローン抗体（ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）の固形癌に対する治療効果を確認するために、図１１に示すように、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）をマウスの背中に３×１０５細胞の量で皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、４日、８日、１２日目に前記製造例５～８の抗体を２００ｕｇの量で腹腔内注射した。前記メラノーマ細胞の移植後に時間の経過による腫瘍の体積変化を測定して、その結果を図１２に示した。
前記製造例５～８で作製された本発明による単クローン抗体（ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）の固形癌に対する治療効果を確認するために、図１１に示すように、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ）をマウスの背中に３×１０５細胞の量で皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、４日、８日、１２日目に前記製造例５～８の抗体を２００ｕｇの量で腹腔内注射した。前記メラノーマ細胞の移植後に時間の経過による腫瘍の体積変化を測定して、その結果を図１２に示した。
【0125】
図１２に示すように、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質特異的な単クローン抗体（ＧＴＣ１１０－０１、ＧＴＣ１１０－０２、ＧＴＣ１１０－０３およびＧＴＣ１１０－０４）を処理した場合、抗体を処理しなかった陰性対照群に比べて腫瘍の大きさが著しく減少したことを確認することができた。
【0126】
これにより、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質特異的な単クローン抗体は、多様な固形癌細胞の成長を抑制して、これを効果的に予防、改善または治療できることが分かる。
【0127】
［実施例８］本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質のエピトープの確認
Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて前記製造例８のＧＴＣ１１０－０４抗体が結合できる部位である構造のエピトープを発掘するために、下記の実験を行った。
Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて前記製造例８のＧＴＣ１１０－０４抗体が結合できる部位である構造のエピトープを発掘するために、下記の実験を行った。
【0128】
［８－１］共有結合ラベリングＭＳ（Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＭＳ；ＣＬ－ＭＳ）
［８－１－１］キモトリプシンによるエピトープの確認
前記製造例８のＧＴＴＣ１１０－０４抗体と、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（抗原）とを２：１の比率で混合して十分に反応させた抗原－抗体結合体と、抗体が結合しないＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（抗原）をそれぞれ用意した。その後、前記それぞれのサンプルに１％を超えないようにＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）を添加した後、３７℃で１分間十分に反応させ、イミダゾールを添加して反応を終結させた。反応が終結した前記それぞれのサンプルにメタノールを添加し、遠心分離して上澄液を除去した。以後、８Ｍのウレアおよび０．１ＭのＮａＣｌが含まれた溶液を追加して、再懸濁させた後に、キモトリプシンを入れてペプチド結合が切れるようにした。
［８－１－１］キモトリプシンによるエピトープの確認
前記製造例８のＧＴＴＣ１１０－０４抗体と、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（抗原）とを２：１の比率で混合して十分に反応させた抗原－抗体結合体と、抗体が結合しないＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（抗原）をそれぞれ用意した。その後、前記それぞれのサンプルに１％を超えないようにＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）を添加した後、３７℃で１分間十分に反応させ、イミダゾールを添加して反応を終結させた。反応が終結した前記それぞれのサンプルにメタノールを添加し、遠心分離して上澄液を除去した。以後、８Ｍのウレアおよび０．１ＭのＮａＣｌが含まれた溶液を追加して、再懸濁させた後に、キモトリプシンを入れてペプチド結合が切れるようにした。
【0129】
このようにペプチド結合が切れた前記それぞれのサンプルを用いて、ハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）ＧＯＬＤＴＭ（１．９μｍ、１×１００ｍｍ）カラムを用いて、３０℃の条件で、下記表４に記載のように、流体クロマトグラフィー（ＶａｎｑｕｉｓｈＴＭ Ｆｌｅｘ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ＵＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ））を行った。
【0130】
【表4】
【0131】
以後、図１３～図１５に記載の条件によって質量分析（Ｑ ＥｘａｃｔｉｖｅＴＭ Ｐｌｕｓ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ））を行い、測定された抗原－抗体結合体と抗原の質量分析値を比較して、その結果を図１６と、表５に示した。さらに、測定された質量分析値を抗原－抗体結合体／抗原で計算して、図１７に示した。
【0132】
【表5-1】
【0133】
【表5-2】
【0134】
図１６および１７と表５に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、３６－６４番目；１０５－１３４番目；２５２－２５４番目；３２９－３４７番目；５２９－５３５番目；５９９－６１２番目；５９９－６１４番目；５９９－６１５番目；５９９－６２４番目；６２４－６３６番目；７００－７３５番目；７１５－７２７番目；および７２８－７３５番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、抗原と比較して抗原－抗体結合体間の比率が１．２以上現れるので、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープとして選定される可能性があることが確認された。さらに、配列番号７～１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、その実際の差値がさらに有意に現れてエピトープとして選定される可能性がさらに高いことが確認された。
【0135】
［８－１－２］トリプシンによるエピトープの確認
前記［８－１－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにトリプシンを用いて、その結果を図１８および１９と、下記表６に示した。
前記［８－１－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにトリプシンを用いて、その結果を図１８および１９と、下記表６に示した。
【0136】
【表6】
【0137】
図１８および１９と、表６に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、２４－３７番目；３８－４５番目；４６－９４番目；１４１－１５４番目；１７９－１８６番目；２１６－２２６番目；５３２－５４０番目；５５９－５６９番目；６１４－６２９番目；６９０－６９４番目；７２７－７３９番目；および７４０－７５４番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、抗原と比較して抗原－抗体結合体間の比率が１．２以上現れるので、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープとして選定される可能性があることが確認された。さらに、配列番号１４～２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、その実際の差値がさらに有意に現れてエピトープとして選定される可能性がさらに高いことが確認された。
【0138】
［８－１－３］Ａｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃによるエピトープの確認
前記［８－１－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いて、その結果を図２０および２１と、下記表７に示した。
前記［８－１－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いて、その結果を図２０および２１と、下記表７に示した。
【0139】
【表7-1】
【0140】
【表7-2】
【0141】
図２０および２１と、表７に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、１－１５番目；１６－１８番目；３１－４５番目；３１－５５番目；２８９－３１８番目；３６０－３６１番目；４９８－５０６番目；５０７－５１７番目；５７３－６００番目；５８５－６００番目；６０１－６２０番目；６０１－６２６番目；６０５－６２０番目；６１１－６１８番目；６１１－６２０番目；６６７－６８１番目；６９５－７２２番目；６９６－７０９番目；および６９６－７２２番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、抗原と比較して抗原－抗体結合体間の比率が１．２以上現れるので、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープとして選定される可能性があることが確認された。さらに、配列番号２３～２８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、その実際の差値がさらに有意に現れてエピトープとして選定される可能性がさらに高いことが確認された。
【0142】
前記［８－１－１］～［８－１－３］で確認されたエピトープの結果をオーバーラップさせる方式の追加分析を行った結果、前記結果で挙げられたポリペプチドがエピトープの可能性があり、特に配列番号２９～３２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがさらにＬｒｉｇ－１タンパク質のＧＴＣ１１０－０４抗体に対するエピトープである可能性があることが分かる。
【0143】
［８－２］クロス－結合ＭＳ（Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ ＭＳ；ＸＬ）
［８－２－１］キモトリプシンによるエピトープの確認
［８－２－１］キモトリプシンによるエピトープの確認
【0144】
前記製造例８のＧＴＣ１１０－０４抗体と、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（抗原）とを２：１の比率で混合して十分に反応させた抗原－抗体結合体サンプルを２個用意した。以後、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に十分に溶かしたＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ、２０５９３、Ｔｈｅｒｍｏ）を前記１つのサンプルに１：５０（サンプル：ＤＳＧ）の比率で添加し（Ｔ％）、他の１つのサンプルにはＤＭＳＯのみを添加（Ｃ％）した後に、２５℃で１時間十分に反応させた。その後、前記［８－１－１］と同様の方法でキモトリプシンを処理し、ＬＣ－ＭＳ分析を行って、質量分析値を導出した。
【0145】
以後、ＤＳＧが添加されたサンプル（Ｔ％）とＤＭＳＯのみが添加されたサンプル（Ｃ％）間の質量分析値間の差を確認し、差のあるエピトープの中からエピトープではない結合補助サイト（モードタイプおよびループタイプ）を除いて、最終的にその値が１０％以下である部位を導出する分析を行って、その結果を図２２と、下記表８に示した。
【0146】
【表8】
【0147】
図２２と、表８に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、４７２－４９４番目（配列番号３２）；配列番号４９５－５１１番目（配列番号３３）；５２５－５３０番目（配列番号３４）；５６０－５６７番目（配列番号３５）；５６８－５７９番目（配列番号３６）；６８０－６９３番目（配列番号３７）；および７４５－７６２番目（配列番号３８）アミノ酸からなるポリペプチドは、クロス結合比率が５％または１０％以下に相当する非常に低い水準と確認されることから、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープとして選定される可能性があることが確認された。
【0148】
［８－２－２］トリプシンによるエピトープの確認
前記［８－２－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにトリプシンを用いて、その結果を図２３と、下記表９に示した。
前記［８－２－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにトリプシンを用いて、その結果を図２３と、下記表９に示した。
【0149】
【表9】
【0150】
図２３と、表９に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、１－４番目（配列番号８０）；４６－９２番目（配列番号４０）；１６４－１７２番目（配列番号４１）；２６４－２７４番目（配列番号４２）；２６７－２７４番目（配列番号４３）；２６８－２７４番目（配列番号４４）；２７５－２８７番目（配列番号４５）；２７５－３０３番目（配列番号４６）；３８６－３９４番目（配列番号４７）；３９５－４２４番目（配列番号４８）；４２５－４４１番目（配列番号４９）；４４２－４７９番目（配列番号５０）；４８０－４９８番目（配列番号５１）；４９８－５３１番目（配列番号５２）；５３２－５４０番目（配列番号５３）；５４１－５５６番目（配列番号５４）；および６１５－６２９番目（配列番号５５）アミノ酸からなるポリペプチドは、クロス結合比率が５％または１０％以下に相当する非常に低い水準と確認されることから、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープとして選定される可能性があることが確認された。
【0151】
［８－２－３］Ａｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃによるエピトープの確認
前記［８－２－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いて、その結果を図２４と、下記表１０に示した。
前記［８－２－１］に記載の方法と同様にエピトープ確認のための実験を行うが、ただし酵素をキモトリプシンの代わりにＡｓｐ－Ｎ＋Ｌｙｓ－Ｃを用いて、その結果を図２４と、下記表１０に示した。
【0152】
【表10】
【0153】
図２４と、表１０に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、４６－１０２番目（配列番号５６）；９３－１０２番目（配列番号５７）；１５０－１６３番目（配列番号５８）；１６４－１８２番目（配列番号５９）；２１６－２２６番目（配列番号６０）；２２７－２６７番目（配列番号６１）；２６８－２７４番目（配列番号６２）；３１９－３６１番目（配列番号６３）；４１１－４１５番目（配列番号６４）；４５６－４７６番目（配列番号６５）；４７７－４９８番目（配列番号６６）；４９８－５０６番目（配列番号６７）；５３８－５５６番目（配列番号６８）；５５７－５７２番目（配列番号６９）；および５５７－６００番目（配列番号７０）アミノ酸からなるポリペプチドは、クロス結合比率が５％または１０％以下に相当する非常に低い水準と確認されることから、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のエピトープとして選定される可能性があることが確認された。
【0154】
前記［８－２－１］～［８－２－３］で確認されたエピトープの結果をオーバーラップすることにより追加分析を行った結果、前記結果で挙げられたポリペプチドがエピトープの可能性があり、特に配列番号３２～３６、配列番号４０～４２、６４および６８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがさらにＬｒｉｇ－１タンパク質のＧＴＣ１１０－０４抗体に対するエピトープである可能性があることが分かる。
【0155】
［８－３］エピトープの予測
前記［８－１］および［８－２］で導出されたエピトープの結果をオーバーラップする過程により得られた特定エピトープの配列に基づいて、前記［８－１］と同様の方法でエピトープ確認のための実験を行って、その結果を下記表１１および１２に示した。
前記［８－１］および［８－２］で導出されたエピトープの結果をオーバーラップする過程により得られた特定エピトープの配列に基づいて、前記［８－１］と同様の方法でエピトープ確認のための実験を行って、その結果を下記表１１および１２に示した。
【0156】
【表11】
【0157】
【表12】
【0158】
前記表１１および１２に示すように、配列番号４で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインにおいて、４６－８７番目；または４６－６４番目のアミノ酸からなるポリペプチドが多様な酵素を用いて測定した結果で高い比率で差が生じることを確認した。
【0159】
前記結果を通して、ＧＴＣ１１０－０４抗体は、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの中で、４６－８７番目；または４６－６４番目のアミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合できることが分かる（図２５の丸表示部分）。
【0160】
以上、本発明について詳しく説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載の本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で多様な修正および変形が可能であることは、当技術分野における通常の知識を有する者には自明であろう。
【0161】
産業上の利用可能性
本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、制御性Ｔ細胞上に存在する本発明のエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌の予防、改善または治療に非常に効率的に使用することができる。
本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、制御性Ｔ細胞上に存在する本発明のエピトープに特異的に結合して前記制御性Ｔ細胞の機能を抑制し、エフェクターＴ細胞の活性は維持あるいは上昇させて、癌の予防、改善または治療に非常に効率的に使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】