特表 2023-500336 ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムを含むファージ組成物およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-05

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムを含むファージ組成物およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20221223BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20221223BHJP

   A23L 3/00 20060101ALI20221223BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20221223BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20221223BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N7/01 ZNA

C12N15/34

A23L3/00

A61K35/76

A61P31/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022525904

(86)(22)【出願日】2020-11-05

(85)【翻訳文提出日】2022-07-04

(86)【国際出願番号】 US2020059159

(87)【国際公開番号】W WO2021092210

(87)【国際公開日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】62/931,795

(32)【優先日】2019-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/088,394

(32)【優先日】2020-10-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520429509

【氏名又は名称】ローカス バイオサイエンシーズ，インク．

(74)【復代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】オースターアウト，デビッド ジー．

(72)【発明者】

【氏名】ガロフォロ，ポール エム．

(72)【発明者】

【氏名】セル，カート

(72)【発明者】

【氏名】テュソン，ハンナ ヒューイット

【テーマコード（参考）】

4B021

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B021LW05

4B021LW10

4B065AA01Y

4B065AA98X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA31

4B065CA41

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC90

4C087MA16

4C087MA23

4C087MA31

4C087MA35

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA59

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB35

(57)【要約】

本明細書に開示されているのは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むファージ組成物およびその使用方法である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの反復配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結されている。
【選択図】図２Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

バクテリオファージであって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、
（ｂ）カスケードポリペプチド、および
（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含む、バクテリオファージ。

【請求項2】

前記ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、請求項１に記載のバクテリオファージ。

【請求項3】

前記少なくとも１つのリピート配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される、請求項２に記載のバクテリオファージ。

【請求項4】

前記スペーサー配列が、標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、請求項２－３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項5】

前記標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、請求項４に記載のバクテリオファージ。

【請求項6】

前記標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、請求項４に記載のバクテリオファージ。

【請求項7】

前記標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項４に記載のバクテリオファージ。

【請求項8】

前記標的ヌクレオチド配列が、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項５に記載のバクテリオファージ。

【請求項9】

前記必須遺伝子が、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである、請求項８に記載のバクテリオファージ。

【請求項10】

前記カスケードポリペプチドが、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケード複合体を形成する、請求項１－９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項11】

カスケード複合体が、
（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
を含む、請求項１－１０のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項12】

Ｃａｓ複合体が、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む、請求項１１に記載のバクテリオファージ。

【請求項13】

前記核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、請求項１－１２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項14】

前記標的細菌が前記バクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される、請求項４－１３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。
。

【請求項15】

前記標的細菌が前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、請求項４－１４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項16】

前記標的細菌が前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせた前記バクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、請求項４－１３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項17】

前記標的細菌が、前記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、請求項４－１１のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項18】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が前記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、請求項４－１３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項19】

前記バクテリオファージの溶菌活性および前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、請求項１７－１８のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項20】

前記バクテリオファージの溶菌活性、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方が前記バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項１４－１９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項21】

複数の細菌系統に感染する、請求項１－２０のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項22】

前記標的細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、請求項４－２１のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項23】

前記バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項１－２２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項24】

前記バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである、請求項１－２３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項25】

前記溶原性バクテリオファージが、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる、請求項２４に記載のバクテリオファージ。

【請求項26】

前記バクテリオファージが、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、請求項１－２４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項27】

前記核酸配列が必須でないバクテリオファージ遺伝子に挿入されている、請求項１－２６のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項28】

医薬組成物であって、
（ａ）請求項１－２７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ、および
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、医薬組成物。

【請求項29】

錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

標的細菌を殺傷する方法であって、前記方法は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、
（ｂ）カスケードポリペプチド、および
（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチド
を含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを、前記標的細菌に導入する工程を含む、方法。

【請求項31】

前記ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記少なくとも１つのリピート配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいてスペーサー配列に作動可能に連結される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記スペーサー配列が、標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、請求項３０－３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記標的ヌクレオチド配列が、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

前記必須遺伝子が、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記カスケードポリペプチドが、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＴｙｐｅＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケード複合体を形成する、請求項３０－３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

カスケード複合体が、
（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
を含む、請求項３０－３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記カスケード複合体が、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、請求項３０－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記標的細菌が、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、請求項３３－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記標的細菌が、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、請求項３３－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記標的細菌が、前記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、請求項３３－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が前記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、請求項３３－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記バクテリオファージの溶菌活性および前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、請求項３３－４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記バクテリオファージの溶菌活性、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方が、前記バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項４２－４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、請求項３０－４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記標的細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、請求項３３－４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項３０－５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである、請求項３０－５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記溶原性バクテリオファージが、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記バクテリオファージが、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、請求項３０－５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記核酸配列が、必須ではないバクテリオファージ遺伝子の代わりに、またはそれに隣接して挿入される、請求項３０－５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

細菌細胞の混合集団が前記標的細菌を含む、請求項３０－５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

必要とする個体の疾患を治療する方法であって、前記方法は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを個体に投与する工程を含み、前記Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、
（ｂ）カスケードポリペプチド、および
（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチド
を含む、方法。

【請求項58】

前記ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記少なくとも１つのリピート配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記スペーサー配列が、標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、請求項５７－５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項63】

前記標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項64】

前記標的ヌクレオチド配列が、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項65】

前記必須遺伝子が、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

カスケード複合体が、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケードポリペプチドを含む、請求項５７－６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

カスケード複合体が、
（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、
（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）
を含む、請求項５７－６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記カスケード複合体がＣａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、請求項５７－６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記標的細菌が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、請求項６０－６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記標的細菌が、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせた前記バクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、請求項６０－６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記標的細菌が、前記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、請求項６０－６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が前記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、請求項６０－６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記バクテリオファージの溶菌活性および前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、請求項６０－６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記バクテリオファージの溶菌活性、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方が、前記バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項６０－７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、請求項５７－７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項５７－７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである、請求項５７－７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記溶原性バクテリオファージが、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記バクテリオファージが、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、請求項５７－７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記核酸配列が、必須ではないバクテリオファージ遺伝子の代わりに、またはそれに隣接して挿入される、請求項５７－８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記疾患が細菌感染症である、請求項５７－８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記疾患を引き起こす標的細菌が、少なくとも１つの抗生物質に耐性である薬剤耐性細菌である、請求項６０－８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記薬剤耐性細菌が少なくとも１つの抗生物質に耐性である、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記疾患を引き起こす標的細菌が多剤耐性細菌である、請求項６０－８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記多剤耐性細菌が少なくとも１種の抗生物質に耐性である、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記抗生物質が、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む、請求項８３－８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記標的細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、請求項６０－８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記疾患を引き起こす標的細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記疾患を引き起こす標的細菌がＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

前記投与する工程が、動脈内、静脈内、尿道内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５７－９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記個体が哺乳動物である、請求項５７－９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

バクテリオファージであって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、
（ｂ）Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｃおよびＣａｓ７を含むカスケードポリペプチド、ならびに
（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチド
を含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含む、バクテリオファージ。

【請求項94】

前記ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、請求項９３に記載のバクテリオファージ。

【請求項95】

前記少なくとも１つのリピート配列が、その５’末端またはその３’末端のいずれかで前記スペーサー配列に作動可能に連結される、請求項９４に記載のバクテリオファージ。

【請求項96】

前記スペーサー配列が、細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、請求項９３－９５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項97】

前記標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、請求項９６に記載のバクテリオファージ。

【請求項98】

前記標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、請求項９６に記載のバクテリオファージ。

【請求項99】

前記標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、請求項９６に記載のバクテリオファージ。

【請求項100】

前記標的ヌクレオチド配列が、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、請求項９７に記載のバクテリオファージ。

【請求項101】

前記必須遺伝子が、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである、請求項９８に記載のバクテリオファージ。

【請求項102】

前記核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、請求項９３－１０１のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項103】

前記標的細菌が、バクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される、請求項９６－１０２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項104】

前記標的細菌が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、請求項９６－１０２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項105】

前記標的細菌が、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせた前記バクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、請求項９６－１０２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項106】

前記標的細菌が、前記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、請求項９６－１０２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項107】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が前記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、請求項９６－１０２のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項108】

前記バクテリオファージの溶菌活性および前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、請求項１０５－１０７のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項109】

前記バクテリオファージの溶菌活性、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方が、前記バクテリオファージの濃度によって調節される、請求項１０３－１０８のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項110】

前記バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、請求項９３－１０９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項111】

前記標的細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、請求項９６－１１０のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項112】

前記バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項９３－１１１のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項113】

前記バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである、請求項９３－１１１のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項114】

前記溶原性バクテリオファージが、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる、請求項１１３に記載のバクテリオファージ。

【請求項115】

前記バクテリオファージが、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、請求項９３－１１４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項116】

前記核酸配列が、必須ではないバクテリオファージ遺伝子に挿入される、請求項９３－１１５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ。

【請求項117】

医薬組成物であって、
（ａ）請求項９３－１１６のいずれか一項に記載のバクテリオファージ、および
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む、医薬組成物。

【請求項118】

錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、請求項１１７に記載の医薬組成物。

【請求項119】

必要とする表面を消毒する方法であって、前記方法は、
（ｄ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、
（ｅ）カスケードポリペプチド、および
（ｆ）Ｃａｓ３ポリペプチド
を含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを前記表面に投与する工程を含む、方法。

【請求項120】

前記表面が、病院の表面、車両の表面、機器の表面、または工業的表面である、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

食品または栄養補助食品の汚染を防止する方法であって、前記方法は、
（ｇ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、
（ｈ）カスケードポリペプチド、および
（ｉ）Ｃａｓ３ポリペプチド
を含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを、食品または栄養補助食品に投与する工程を含む、方法。

【請求項122】

前記食品または栄養補助食品が、ミルク、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵シリアルベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調合乳または錠剤、液体懸濁液、乾燥経口サプリメント、湿式経口サプリメント、または乾燥経管栄養を含む、請求項１２１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１９年１１月６日に出願された米国特許出願第６２／９３１，７９５号および２０２０年１０月６日に出願された米国特許出願第６３／０８８，３９４号の利益を主張し、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むファージ組成物およびその使用方法である。

【発明の概要】

【0003】

特定の実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのリピート配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記スペーサー配列は、標的細菌における標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、非コード配列または遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、プロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記必須遺伝子は、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである。いくつかの実施形態において、上記カスケードポリペプチドは、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケード複合体を形成する。いくつかの実施形態において、カスケード複合体は、（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ複合体は、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記バクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせた上記バクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は、上記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性および上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方は、上記バクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、複数の細菌系統に感染する。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記溶原性バクテリオファージは、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、必須ではないバクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているのは、（ａ）本明細書に記載のバクテリオファージ、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。

【0004】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、標的細菌を殺傷する方法であって、上記方法は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを、上記標的細菌に導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのリピート配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかにおいてスペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記スペーサー配列は、標的細菌における標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、非コード配列または遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、プロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記必須遺伝子は、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである。いくつかの実施形態において、上記カスケードポリペプチドは、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケード複合体を形成する。いくつかの実施形態において、カスケード複合体は、（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む。いくつかの実施形態において、上記カスケード複合体は、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は、上記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性および上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方は、上記バクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、複数の細菌系統に感染する。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記溶原性バクテリオファージは、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、必須ではないバクテリオファージ遺伝子の代わりに、またはそれに隣接して挿入される。いくつかの実施形態において、細菌細胞の混合集団は上記標的細菌を含む。

【0005】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、必要とする個体の疾患を治療する方法であって、上記方法は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを個体に投与する工程を含み、上記Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのリピート配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記スペーサー配列は、標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、非コード配列または遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、プロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記必須遺伝子は、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである。いくつかの実施形態において、カスケード複合体は、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケードポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、カスケード複合体は、（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）、（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む。いくつかの実施形態において、上記カスケード複合体は、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせた上記バクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は、バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方は、上記バクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、複数の細菌系統に感染する。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記溶菌性バクテリオファージは、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、必須ではないバクテリオファージ遺伝子の代わりに、またはそれに隣接して挿入される。いくつかの実施形態において、上記疾患は細菌感染症である。いくつかの実施形態において、上記疾患を引き起こす標的細菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性である薬剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、上記薬剤耐性菌は、少なくとも１つの抗生物質に耐性である。いくつかの実施形態において、上記疾患を引き起こす標的細菌は、多剤耐性細菌である。いくつかの実施形態において、上記多剤耐性細菌は、少なくとも１つの抗生物質に対して耐性がある。いくつかの実施形態において、上記抗生物質は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む。いくつかの実施形態において、細菌感染を引き起こす上記標的細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、上記疾患を引き起こす標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。いくつかの実施形態において、上記疾患を引き起こす標的細菌はＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。いくつかの実施形態において、上記投与する工程は、動脈内、静脈内、尿道内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、個体は哺乳動物である。

【0006】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、バクテリオファージであって、ＣＲＩＳＰＲアレイ；Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｃおよびＣａｓ７を含むカスケードポリペプチド；ならびにＣａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含む、バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのリピート配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかで上記スペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記スペーサー配列は、上記標的細菌における標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、コード配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、非コード配列または遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、プロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、上記必須遺伝子は、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、上記バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は、上記バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性および上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージの溶菌活性、上記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方は、上記バクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、複数の細菌系統に感染する。いくつかの実施形態において、上記標的細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、上記溶原性バクテリオファージは、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、ｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、必須ではないバクテリオファージ遺伝子に挿入される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、医薬組成物であって、（ａ）本明細書中に記載されるバクテリオファージ、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、上記医薬組成物は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である。

【0007】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、必要とする表面を消毒する方法であって、上記方法は、（ｄ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｅ）カスケードポリペプチド、および（ｆ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを表面に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、上記表面は、病院の表面、車両の表面、機器の表面、または工業的表面である。

【0008】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、食品または栄養補助食品の汚染を防止する方法であって、上記方法は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを、食品または栄養補助食品に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、食品または栄養補助食品は、ミルク、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵シリアルベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調合乳または錠剤、液体懸濁液、乾燥経口サプリメント、湿式経口サプリメント、または乾燥経管栄養を含む。

【図面の簡単な説明】

【0009】

本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴および利点のより良好な理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。

【図1A】ｃｒアレイ２の配列および配置を示す。

【図1B】ｃｒアレイ３の配列および配置を示す

【図1C】ｃｒアレイ３の配列および配置を示す

【図1D】ｃｒアレイ４の配列および配置を示す。

【図1E】ｃｒアレイ５の配列および配置を示す。

【図2A】（上のパネル）は、形質転換体の数によって測定される、内因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムを使用してｃｒＲＮＡを含むプラスミドで２つのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統を形質転換する効果をコロニー形成単位（ＣＦＵ）で示す。下のパネルは、３つのスペーサーを含むｃｒＲＮＡと外因性のＩ－Ｃ型Ｃａｓオペロンの両方を含むプラスミドでＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを形質転換する効果を示し、これは、検出限界よりも少ない形質転換体を生じる。

【図2B】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂ１１２１系統のＣａｓオペロンヌル変異体への形質転換１ｍＬあたりに得られた細菌形質転換体の数を示す。アレイ１は細菌ゲノムを標的とし、一方アレイ２は非標的対照である。異なるプラスミドは、モル濃度によって空のベクター対照プラスミドに対して正規化された。

【図2C】ｒｐｏＢまたはｆｔｓＡまたは３スペーサーアレイであるアレイ３またはアレイ４を標的とする個々のスペーサーを、内因性Ｉ－Ｃ型Ｃａｓオペロンを含むか（ｂ１１２１）または含まない（ｂ１１２１ ｃａｓ ＫＯ）Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統に形質転換する効果を示す。

【図3A】野生型ファージｐ１７７２およびその操作されたバリアントのゲノムの概略図を示す。ゲノム軸の下のバーは、削除および置き換えされたゲノムの領域を示す。ファージゲノムの下の概略図は、削除された領域のＷＴファージ遺伝子を置き換えるために使用されたＤＮＡを図示する。アレイ１、アレイ３、およびアレイ４は細菌ゲノムを標的とし、Ｉ－Ｃ型Ｃａｓオペロンの存在下で細菌を殺傷する。アレイ２のスペーサーは標的化されていないが、このアレイは３つの標的化アレイと構造的に同じである。

【図3B】摂氏３７度で５回または１０回継代した後のｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）の配列を比較する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３を発現する操作されたファージの安定性を示すヌクレオチドレベルでの挿入物に違いは観察されなかった。

【図4】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３で操作されたファージが構造変化を示さないことを例示する。ＴＥＭで画像化した場合、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）、ｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）、およびｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ＋Ｃａｓシステム）の間に大きな形態学的差異はなかった。

【図5A】完全な構築物のファージが、異なるＣａｓタイプのバリアントにおいて野生型親ファージと同様に増幅し、同様の宿主範囲を保持することを例示する。Ｉ－Ｆ型Ｃａｓシステムを含むＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統におけるｐ１７７２ｗｔ（野生型）、ｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステム）、およびｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）のインビトロ増幅力価を示す。

【図5B】完全な構築物のファージが、異なるＣａｓタイプのバリアントにおいて野生型親ファージと同様に増幅し、同様の宿主範囲を保持することを例示する。Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムを含むＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統におけるｐ１７７２ｗｔおよびｐ１７７２ｅ００５のインビトロ増幅力価を示す。

【図5C】完全な構築物のファージが、異なるＣａｓタイプのバリアントにおいて野生型親ファージと同様に増幅し、同様の宿主範囲を保持することを例示する。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの４４系統に対するｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００４、およびｐ１７７２ｅ００５の宿主範囲を示す。（ファージの存在下でのＡＵＣ）／（ファージの非存在下でのＡＵＣ）が０．６５未満の場合、ファージは特定の系統に感染していると見なされる。

【図6A】外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがファージゲノムから効率的に発現していることを例示する。ｐ１７７２の操作されたバリアントに挿入されたスペーサーアレイおよびＣａｓオペロンの概略図を示す。

【図6B】外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがファージゲノムから効率的に発現していることを例示する。１６００分にわたってｐ１７７２ｗｔ（野生型）またはｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）に感染したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１におけるｃｒアレイ、Ｃａｓ３およびＣａｓ８の発現を示す。

【図6C】外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがファージゲノムから効率的に発現していることを例示する。１６００分にわたってｐ１７７２ｗｔ（野生型）またはｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）に感染したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１におけるｃｒアレイ、Ｃａｓ３およびＣａｓ８の発現を示す。

【図6D】外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがファージゲノムから効率的に発現していることを例示する。１６００分にわたってｐ１７７２ｗｔ（野生型）またはｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）に感染したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１におけるｃｒアレイ、Ｃａｓ３およびＣａｓ８の発現を示す。

【図6E】外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムがファージゲノムから効率的に発現していることを例示する。ｐ１７７２ｅ００５、ｐ２１３１ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）およびｐ２１３２ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）に感染してから１時間後および２４時間後のＣａｓ３の発現を示す。

【図7】Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ上にｐ１７７２ｗｔ（野生型）またはｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）をプレーティングすることから生じるプラークを示す。

【図8A】プレートベースのキルアッセイの結果を例示する。ｐ１７７２ｗｔ（野生型）、ｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）、ｐ１７７２ｅ００６（標的化ｃｒアレイ１のみ）、およびｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を、感染多重度（ＭＯＩ）１００～０．００００９５４でＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａと混合した。

【図8B】図８Ａのように設定されたプレートの一部をより大きな倍率で示す。

【図8C】ＭＯＩ １．５でｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００８（非標的化ｃｒアレイ２＋Ｃａｓシステム）、ｐ１７７２ｅ００６、およびｐ１７７２ｅ００５に感染したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの相対蛍光ユニットの定量化を示す。

【図9A】ＭＯＩ １で接種されたときのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１におけるｐ１７７２ｗｔ（野生型）、ｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）、ｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）およびｐ１７７２ｅ０６（標的化ｃｒアレイ１のみ）の２４時間にわたる増殖を示す。

【図9B】ＭＯＩ １０で接種されたときのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１におけるｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００４、ｐ１７７２ｅ００５、およびｐ１７７２ｅ００６の２４時間にわたる増殖を示す。

【図9C】ＭＯＩ １００で接種されたときのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１のｐ１７７２ｅ００６におけるｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００４、ｐ１７７２ｅ００５の２４時間にわたる増殖を示す。

【図10A】ＭＯＩ １００から０．０００１までにおける、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）、ｐ１７７２ｅ００８（非標的化ｃｒアレイ２＋Ｃａｓシステム）、ｐ１７７２ｅ００６（標的化ｃｒアレイ１のみ）、およびｐＡｒｒａｙ３（標的化ｃｒアレイ３＋Ｃａｓシステム）と混合されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖を示す。

【図10B】ＭＯＩ １００から０．０００１までにおける、ｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００８、ｐ１７７２ｅ００６、およびｐＡｒｒａｙ４（標的化ｃｒアレイ４＋Ｃａｓシステム）と混合したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖を示す。

【図10C】図１０Ａの挿入図であり、０．０２４４（上段）および０．００６１０（下段）のＭＯＩにおけるｐＡｒｒａｙ３と比較したｐ１７７２ｅ０６の拡大を示す。

【図10D】図１０Ａの約１．５のＭＯＩにおけるファージによる感染後の細菌からの蛍光シグナルの定量化である。

【図10E】図１０Ｂの約１．５のＭＯＩにおけるファージによる感染後の細菌からの蛍光シグナルの定量化である。

【図11A】異なるプロモーターを有するｐ１７７２バリアントと混合されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖を示す。ｐ１７７２ｗｔ（野生型）および同じｃｒアレイ １およびＣａｓシステムを含むバリアントと混合したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖を示し、ここで、このＣａｓシステムは異なるプロモーターによって駆動され、ＭＯＩは１００～０．００００１であった。

【図11B】異なるプロモーターを有するｐ１７７２バリアントと混合されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖を示す。図１１ＡからのＭＯＩ １．５での細胞の蛍光の定量化を示す。

【図12】図１２Ａは、１．５のＭＯＩでｐ２１３２ｗｔ（野生型）およびｐ２１３２ｅ００２（ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステムを標的とする）と混合されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖の蛍光の定量化を示す。図１２Ｂは、１．５のＭＯＩでｐ２９７３ｗｔ（野生型）およびｐ２９７３ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）と混合されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の寒天プレート上での増殖からの蛍光の定量化を示す。

【図13】異なるファージバリアントを混合したＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物の異なる系統の寒天プレート上での増殖を示す。ｐ４２０９ｗｔ（野生型）およびｐ４２０９ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を、ｂ２５５０（Ｉ－Ｅ型Ｃａｓ）、ｂ２６３１（Ｉ－Ｆ型Ｃａｓ）、ｂ２８１６（Ｉ－Ｅ／Ｉ－Ｆ型Ｃａｓ）、およびｂ２８２５（アクティブなＩ型Ｃａｓなし）系統のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａと混合し、０時間、３時間、または２４時間のインキュベーション後にプレートした。

【図14】複数のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統におけるｃｒアレイ／Ｃａｓ挿入物の有効性を示す。ｐ４２０９ｗｔ（野生型）、ｐ４２０９ｅ００１（Ｃａｓシステムのみ）およびｐ４２０９ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）は、ｂ２５５０（Ｉ－Ｅ型Ｃａｓ）、ｂ２６３１（Ｉ－Ｆ型Ｃａｓ）、ｂ２８１６（Ｉ－Ｅ／Ｉ－Ｆ型Ｃａｓ）、およびｂ２８２５（活性型のＩ型Ｃａｓなし）のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統上でプラーク形成された。

【図15A】図１５Ａ－１５Ｄは、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）とｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を比較したインビボでの有効性の結果を例示する。図１５Ａは、図１５Ｂ－１５Ｄの実験設定を示す概略図である。

【図15B】図１５Ａ－１５Ｄは、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）とｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を比較したインビボでの有効性の結果を例示する。図１５Ｂは、マウス大腿筋に注射されたときのファージの有効性を示す。左のパネルは、感染６時間後に回収されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。右のパネルは、感染６時間後に回収されたプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数を示す。

【図15C】図１５Ａ－１５Ｄは、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）とｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を比較したインビボでの有効性の結果を例示する。ｃｃｃｐ１７７２ｗｔ（野生型）とｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を比較したインビボでの有効性の結果を例示する。図１５Ｃは、マウスの大腿筋に注射されたときのファージの有効性を示し、感染８時間後および２４時間後に回収されたＣＦＵ（上）およびＰＦＵ（下）の数を示す。

【図15D】図１５Ａ－１５Ｄは、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）とｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を比較したインビボでの有効性の結果を例示する。図１５Ｄは、静脈内投与されたときのファージの有効性を示し、感染９時間後、１２時間後、１５時間後および２４時間後に回収されたＣＦＵ（上）およびＰＦＵ（下）の数を示す。

【図15E】図１５Ｅは、図１５Ｆの実験設定を示す。

【図15F】図１５Ｆは、ｐ１７７２ｗｔおよびｐ１７７２ｅ００５による治療の用量反応を示し、感染８時間後および２４時間後に回収されたＣＦＵ（上）およびＰＦＵ（下）の量を示す。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。多重比較を使用した一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）、またはテューキー検定を使用した二元配置ＡＮＯＶＡ。

【図16】野生型ファージｐ００４ｋおよびその操作されたバリアントｐ００４ｋｅ００７のゲノムの概略図である。ゲノム軸の下のバーは、削除および置き換えされたゲノムの領域を示す。ファージゲノムの下の概略図は、削除された領域においてＷＴファージ遺伝子を置き換えるために使用されたＤＮＡを例証する。

【図17A】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｒアレイ／Ｃａｓシステム挿入物の有効性を例証する。図１７Ａは、大腸菌の３つの系統（ｂ３４０２、ｂ３４１８、またはｂ４０９８）と混合したｐ００４ｋｗｔ（野生型）およびｐ００４ｋｅ００７（ｃｒアレイ５＋Ｃａｓシステム）の寒天プレート上での増殖を示す。

【図17B】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｒアレイ／Ｃａｓシステム挿入物の有効性を例証する。図１７Ｂ－１７Ｄは、それぞれ、ｂ３４０２、ｂ３４１８、およびｂ４０９８における細胞増殖の光学密度の定量化である。

【図17C】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｒアレイ／Ｃａｓシステム挿入物の有効性を例証する。図１７Ｂ－１７Ｄは、それぞれ、ｂ３４０２、ｂ３４１８、およびｂ４０９８における細胞増殖の光学密度の定量化である。

【図17D】図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｃｒアレイ／Ｃａｓシステム挿入物の有効性を例証する。図１７Ｂ－１７Ｄは、それぞれ、ｂ３４０２、ｂ３４１８、およびｂ４０９８における細胞増殖の光学密度の定量化である。

【図18】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３操作された参照ファージＰＢ１ｅ００２（ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）がｐ１７７２ｅ００５（ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）と協調して作用することを例示する。

【図19】異なるスペーサー配列を含む挿入物でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓをトランスフェクトした後に産生された形質転換体の数を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

詳細な説明
特定の実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒアレイとも称する）、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージである。また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージを含む医薬組成物である。本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを標的細菌に導入する工程を含む、標的細菌を殺傷する方法である。さらに本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、必要とする個体の疾患を治療する方法であり、この方法は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを個体に投与する工程を含む。

【0011】

特定の用語
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の開示の説明に使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示を限定することを意図するものではない。

【0012】

文脈が別のことを示さない限り、本明細書に記載の本開示の様々な特徴は、任意の組み合わせで使用することができることが具体的に意図されている。さらに、本開示はまた、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略されることを企図する。例証するために、組成物が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと明細書に述べられている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせのいずれかが、単独でまたは任意の組み合わせで、省略され、特許請求されないことが具体的に意図される。

【0013】

当業者は、文献における一貫性の欠如および用語を統一するための当技術分野における継続的な努力のために、様々なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムおよびそれらの構成要素を指定するそのような用語の互換性を理解する。

【0014】

明細書中の説明および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0015】

投与量または期間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、＋０．５％、また±０．１％でさえの変動を指す。本明細書で使用される場合、「ＸとＹの間」および「約ＸとＹの間」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「約ＸとＹの間」などの語句は「約Ｘと約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹまで」などの語句は「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。

【0016】

本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと」、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含有すること（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、言及された特徴、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の機能、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。

【0017】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に列挙された特定の材料または工程、および特許請求された開示の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきであることを意味する。したがって、本開示の請求項において使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と等価であると解釈されることを意図するものではない。

【0018】

本明細書で使用される「からなる」および「からなり」という用語は、他に直接述べられていない、いかなる機能、工程、操作、要素、および／または構成要素も除外する。「からなる」の使用は、その節に記載されている機能、工程、操作、要素、および／または構成要素のみの範囲内に限定し、他の機能、工程、操作、要素、および／または構成要素を全体として特許請求の範囲から除外する。

【0019】

「相補的」または「相補性」という用語は、本明細書で使用される場合、塩基対形成による、許容される塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は相補的配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は「部分的」であり、ヌクレオチドの一部のみが結合するか、または一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合に完全である。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を及ぼす。

【0020】

「相補性」は、本明細書で使用される場合、コンパレーターヌクレオチド配列との１００％の相補性または同一性を意味するか、またはそれは、１００％未満の相補性（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味する。相補的または相補可能は、変異に対して「相補的」または変異を「相補すること」の観点で使用することもできる。

【0021】

本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲファージ」、「ＣＲＩＳＰＲ増強ファージ」、および「ｃｒファージ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの少なくとも１つの構成要素をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含むバクテリオファージＤＮＡを含むバクテリオファージ粒子を指す（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイ、ｃｒＲＮＡ、例えば、標的化ｃｒＲＮＡの挿入を含むＰ１バクテリオファージ）。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの少なくとも１つの転写活性化因子をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの抗ＣＲＩＳＰＲポリペプチドの少なくとも１つの成分をコードする。

【0022】

本明細書で使用される場合、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列の状況における「実質的に同一」または「実質的な同一性」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または目視検査によって測定されるような、最大の一致のために比較および整列された場合に、少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および／または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。いくつかの実施形態において、実質的な同一性は、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。配列比較のために、通常、１つの配列が参照配列として機能し、これに対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列と参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0023】

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性方法の検索などのツールによって、および任意選択で、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実装によって行われる。テスト配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性の割合」は、２つの整列された配列によって共有される同一の構成要素の数を、参照配列セグメント内の構成要素の総数、つまり参照配列全体、または参照配列のより小さな定義された部分で除算したものである。配列同一性パーセントは、同一性の割合に１００を掛けたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列またはその一部、あるいはより長いポリヌクレオチド配列に対するものである。いくつかの場合において、「同一性パーセント」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定される。

【0024】

本明細書で使用される場合、「標的ヌクレオチド配列」とは、標的遺伝子の部分（すなわち、ゲノム内の標的領域、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する「プロトスペーサー配列」）を指し、これは、ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に対して、完全に相補的または実質的に相補的である（例えば、少なくとも７０％相補的（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上））。

【0025】

本明細書で使用される場合、「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」という用語は、スペーサー配列に一致するヌクレオチド配列に隣接する標的ＤＮＡ分子上に存在するＤＮＡ配列を指す。このモチーフは、スペーサー配列がその領域に相補的である結果として結合する領域の隣の標的遺伝子において見られ、スペーサーヌクレオチド配列との塩基対形成が始まる点を特定する。必要である正確なＰＡＭ配列は、異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム間で各々変動する。ＰＡＭの非限定的な例には、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＧ、ＴＴＣ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ、および／またはＣＣが含まれる。いくつかの場合において、Ｉ型システムにおいて、ＰＡＭはスペーサーに一致する配列のすぐ５’に位置し、したがってスペーサーヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列に対して３’に位置し、カスケードによって直接認識される。いくつかの場合において、Ｂ。ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ Ｉ－Ｃ型システムについては、ＰＡＭはＹＹＣであり、ここで、ＹはＴまたはＣのいずれかであり得る。いくつかの場合において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｉ－Ｃ型システムについては、ＰＡＭはＴＴＣである。一旦、同族のプロトスペーサーとＰＡＭが認識されると、Ｃａｓ３が動員され、次いで標的ＤＮＡが切断および分解される。ＩＩ型システムについては、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡがＲループを形成して、ガイドＲＮＡとゲノムのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ対形成を通して特定のＤＮＡ配列を調べるために、ＰＡＭが必要とされる。ＰＡＭ特異性は、Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合特異性の関数である（例えば、Ｃａｓ９のＣ末端におけるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン）。

【0026】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、調節ＲＮＡなどを生成するために使用することができる核酸分子を指す。遺伝子は、機能的なタンパク質または遺伝子産物を産生するために使用できる場合とできない場合がある。遺伝子には、コード領域と非コード領域（例えば、イントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列、および／または５’および３’非翻訳領域）の両方が含まれる。遺伝子は「単離された」ものであり、これは、その天然状態の核酸に関連して通常見出される成分を実質的または本質的に含まない核酸を意味する。そのような成分には、他の細胞材料、組換え産生からの培養培地、および／または核酸を化学的に合成する際に使用される様々な化学物質が含まれる。

【0027】

「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語によって、対象の状態の重症度が減少されるか、少なくとも部分的に改善または修正されること、ならびに、少なくとも１つの臨床症状における、ある程度の軽減、緩和または減少が達成されること、ならびに／あるいは疾患もしくは状態の進行の遅延、および／または疾患もしくは病気の発症の遅延が存在することが意図される。感染、疾患または状態に関して、この用語は、感染、疾患または状態の症状または他の徴候の減少を指す。いくつかの実施形態において、治療は、感染、疾患または状態の症状または他の徴候の少なくとも約５％、例えば、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上の減少を提供する。

【0028】

「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語（およびそれらの文法的変形）は、対象における感染、疾患、状態、および／もしくは臨床症状の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または、疾患、状態、および／もしくは臨床症状の発症前に本明細書に開示された方法を実施しない場合に起こるであろうものと比較した、感染、疾患、状態および／または臨床症状の発症の重症度の低下を指す。したがって、いくつかの実施形態において、感染を防ぐために、食品、表面、医療器具およびデバイスは、本明細書に開示される組成物を用いて、および本明細書に開示される方法によって処理される。

【0029】

本明細書で使用される「感染症」、「疾患」、または「状態」に関する用語は、対象における任意の不都合な、ネガティブな、または有害な生理学的状態を指す。いくつかの実施形態において、「感染症」、「疾患」、または「状態」の原因は、対象内および／または対象上の標的細菌集団の存在である。いくつかの実施形態において、細菌集団は、１つ以上の標的細菌種を含む。いくつかの実施形態において、細菌集団中の１つ以上の細菌種は、１つ以上の細菌の１つ以上の系統を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌集団は、急性または慢性である「感染」、「疾患」、または「状態」を引き起こす。いくつかの実施形態において、標的細菌集団は、局所的または全身性である「感染」、「疾患」、または「状態」を引き起こす。いくつかの実施形態において、標的細菌集団は、特発性である「感染」、「疾患」、または「状態」を引き起こす。いくつかの実施形態において、標的細菌集団は、呼吸器吸入、摂取、皮膚および創傷感染症、血流感染症、中耳感染症、胃腸管感染症、腹膜感染症、尿路感染症、泌尿生殖器管感染症、口腔軟組織感染症、腹腔内感染症、表皮または粘膜吸収、眼感染症（コンタクトレンズレンズ汚染を含む）、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染症、関節プロテーゼ、歯科用インプラント、カテーテルおよび心臓インプラントなどの留置医療機器の感染、性的接触、ならびに／または院内および換気装置に関連する細菌性肺炎を含むがこれらに限定されない手段を通じて獲得される「感染症」、「疾患」、または「状態」を引き起こす。

【0030】

本明細書で使用される「個体」または「対象」という用語は、細菌が関与する感染症、疾患、または状態を有するか、または細菌に感受性である任意の動物を含む。したがって、いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、甲殻類、または軟体動物である。哺乳動物の対象には、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーなど）、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど、および実験動物（例えば、ラット、モルモット、マウス、アレチネズミ、ハムスターなど）が含まれるが、これらに限定されない。鳥類の対象には、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ、ウズラ、キジ、ペットとして飼われている鳥（インコ、オウム、コンゴウインコ、コカトゥー、カナリアなど）が含まれるが、これらに限定されない。魚類の対象には、水産養殖で使用される種（マグロ、サケ、ティラピア、ナマズ、コイ、トラウト、タラ、バス、スズキ、フエダイなど）が含まれるが、これらに限定されない。甲殻類の対象には、水産養殖で使用される種（例えば、エビ、クルマエビ、ロブスター、ザリガニ、カニなど）が含まれるが、これらに限定されない。軟体動物の対象には、水産養殖で使用される種（例えば、アワビ、ムール貝、カキ、アサリ、ホタテなど）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、適切な対象は、雄性および雌性の両方、ならびに胚性（例えば、子宮内または卵内）、乳児、若年、青年、成人および老人の対象を含む、任意の年齢の対象を含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。

【0031】

本明細書で使用される場合、核酸配列の文脈で「単離された」という用語は、その天然の環境から離れて存在する核酸配列である。

【0032】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、関心対象のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子（例えば、本明細書に開示される組換え核酸分子およびＣＲＩＳＰＲアレイ）を意味し、ここで、ヌクレオチド配列は、少なくとも対照配列（例えば、プロモーター）と作動可能に関連している。

【0033】

本明細書で使用される場合、「キメラ」は、少なくとも２つの構成要素が異なる供給源（例えば、異なる生物、異なるコード領域）に由来する核酸分子またはポリペプチドを指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、「選択可能なマーカー」は、発現されたときにマーカーを発現する宿主細胞に別個の表現型を付与し、したがってそのような形質転換細胞を、マーカーを有さないものと区別することを可能にするヌクレオチド配列を意味する。

【0035】

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、核酸（または複数の核酸）を細胞に移入し、送達し、または導入するための組成物を指す。

【0036】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、生物学的ではなく、または他の方法で望ましくない材料を意味し、すなわち、この材料は、毒性などの望ましくない、いかなる生物学的効果も引き起こすことなく対象に投与される。

【0037】

本明細書で使用される場合、「バイオフィルム」という用語は、多糖のマトリックスに埋め込まれた微生物の蓄積を意味する。バイオフィルムは、固体の生物学的または非生物学的表面に形成され、医学的に重要であり、体内の微生物感染の８０％以上を占める。

【0038】

本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を説明するために使用される。

【0039】

本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、材料が得られる生物学的供給源から分離されるように、実験用試薬を保持するための容器に含まれて起こる事象を説明するために使用される。インビトロアッセイは、生細胞または死細胞が利用される細胞ベースのアッセイを包含することができる。インビトロアッセイはまた、無傷の細胞が利用されない無細胞アッセイを包含することができる。

【0040】

ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、細菌および古細菌に見出される自然に適応性のある免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、獲得免疫の一形態を提供する、侵入するファージやプラスミドに対する防御に関与するヌクレアーゼシステムである。一連のｃａｓ遺伝子およびそれらの系統発生的関係に基づいた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの多様性が存在する。少なくとも６つの異なる型（ＩからＶＩ）が存在し、Ｉ型は細菌と古細菌の両方で同定されたすべてのシステムの５０％以上を表す。いくつかの実施形態において、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが本明細書で使用される。

【0041】

Ｉ型システムは、Ｉ－Ａ型、Ｉ－Ｂ型、Ｉ－Ｃ型、Ｉ－Ｄ型、Ｉ－Ｅ型、Ｉ－Ｆ型、およびＩ－Ｕ型を含む７つのサブタイプに分けられる。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、カスケードと呼ばれるマルチサブユニット複合体（抗ウイルス防御に関連する複合体用）、Ｃａｓ３（標的ＤＮＡの分解の原因となるヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、およびエキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質）、およびｃｒＲＮＡをコードするＣＲＩＳＰＲアレイ（カスケード複合体を安定化し、カスケードとＣａｓ３をＤＮＡ標的に方向付ける）が含まれる。カスケードはｃｒＲＮＡと複合体を形成し、タンパク質－ＲＮＡ対は、ｃｒＲＮＡ配列の５’末端と事前定義されたプロトスペーサーとの間の相補的な塩基対形成によってそのゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内にコードされた領域および病原体ゲノム内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を介して、病原体ＤＮＡの相同遺伝子座に方向付けられる。塩基対形成は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡ配列の間で起こり、コンフォメーション変化を引き起こす。Ｉ－Ｅ型システムにおいて、ＰＡＭはカスケード内のＣａｓＡタンパク質によって認識され、次に隣接するＤＮＡを巻き戻して、標的とｃｒＲＮＡのスペーサー部分との間の塩基対形成の程度を評価する。十分な認識により、カスケードはＣａｓ３を動員および活性化する。次に、Ｃａｓ３は非標的鎖にニックを入れ、この鎖を３’から５’の方向に分解し始める。

【0042】

Ｉ－Ｃ型システムにおいて、タンパク質Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｃ、およびＣａｓ７は、カスケードエフェクター複合体を形成する。Ｃａｓ５はプレ－ｃｒＲＮＡ（これは、マルチスペーサーアレイ、または２つのリピート間の単一スペーサーの形をとることができる）を処理して、残りのリピート配列と線形スペーサーから形成されたヘアピン構造で形作られる個々のｃｒＲＮＡを生成する。次に、エフェクター複合体は処理されたｃｒＲＮＡに結合し、ＤＮＡをスキャンしてＰＡＭ部位を特定する。Ｉ－Ｃ型システムにおいて、ＰＡＭはＣａｓ８ｃタンパク質によって認識され、次いでこれは、ＤＮＡ二重鎖をほどくように作用する。ＰＡＭの３’の配列がエフェクター複合体に結合しているｃｒＲＮＡスペーサーと一致する場合、複合体のコンフォメーション変化が起こり、Ｃａｓ３がその部位に動員される。次に、Ｃａｓ３は非標的鎖にニックを入れ、ＤＮＡの分解を開始する。

【0043】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して内因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して外因性である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来するＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｕ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。

【0044】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲアレイのプロセシングは、以下のプロセスを含むが、これらに限定されない：１）プレ－ｃｒＲＮＡをコードする核酸の転写、２）カスケードおよび／または、Ｃａｓ６などのカスケードの特定のメンバーによるプレ－ｃｒＲＮＡの認識、および（３）カスケードまたはＣａｓ６などのカスケードのメンバーによるプレ－ｃｒＲＮＡの成熟型ｃｒＲＮＡへのプロセシング。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムの作用機序は、以下のプロセスを含むが、これらに限定されない：４）カスケードとの成熟ｃｒＲＮＡ複合体形成、５）複合体化した成熟ｃｒＲＮＡ／カスケード複合体による標的認識、および６）ＤＮＡ分解をもたらす標的におけるヌクレアーゼ活性。

【0045】

ＣＲＩＳＰＲファージ
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むバクテリオファージ組成物およびその使用方法である。

【0046】

バクテリオファージまたは「ファージ」は、一群の細菌ウイルスを表し、環境源から操作または供給される。個々のバクテリオファージの宿主範囲は通常狭く、このことは、ファージは細菌種の１つの系統または少数の系統に非常に特異的であり、この特異性により抗菌作用が独特になることを意味する。バクテリオファージは、宿主の細胞機構に応じて複製する細菌ウイルスである。バクテリオファージは、一般的に、ライフスタイルに応じて毒性または溶原性ファージに分類される。溶菌性バクテリオファージとしても知られる毒性バクテリオファージは、溶菌性複製のみを受けることができる。溶菌性バクテリオファージは宿主細胞に感染し、複製を何度も繰り返し、細胞溶解を引き起こして新しく作られたバクテリオファージ粒子を放出する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶菌性バクテリオファージは、それらの複製能力を保持している。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶菌性バクテリオファージは、細胞溶解を引き起こすそれらの能力を保持している。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶菌性バクテリオファージは、それらの複製能力および細胞溶解を引き起こす能力の両方を保持している。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、細胞溶解を複製および／または引き起こすバクテリオファージの能力に影響を及ぼさない。テンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）または溶原性（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ）バクテリオファージは、細菌ゲノムに組み込まれるか、染色体外プラスミドとして維持されるかのいずれかで、ファージが複製を停止し、宿主細胞内に安定して存在する溶原性を受ける可能性がある。溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）ファージも、対応する溶菌性バクテリオファージと同様に溶菌性複製を受ける可能性がある。溶原性ファージが溶解的に複製するか、感染時に溶原性を示すかは、増殖条件や細胞の生理学的状態を含むさまざまな要因に依存する。溶原性ファージがゲノムに組み込まれている細菌細胞は、溶原性細菌または溶原菌と呼ばれる。有害条件への曝露は、溶原性ファージの再活性化、溶原性状態の終了、およびファージによる溶菌性複製の再開を引き起こす可能性がある。このプロセスは誘導と呼ばれる。溶原状態の終了に有利な有害条件には、乾燥、ＵＶまたは電離放射線への曝露、および変異原性化学物質への曝露が含まれる。これは、ファージ遺伝子の発現、組み込みプロセスの逆転、および溶菌増殖につながる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される溶原性バクテリオファージは、溶菌性にされる。「溶原性遺伝子」という用語は、その遺伝子産物が溶原性ファージの溶原性を促進する任意の遺伝子を指す。溶原性遺伝子は、バクテリオファージの宿主ゲノムへの組み込みを促進するインテグラーゼタンパク質の場合のように、直接促進することができる。溶原性遺伝子は、溶菌性複製に必要な遺伝子の転写を防ぎ、溶原性の維持を促進するＣＩ転写調節因子の場合のように、間接的に溶原性を促進することもできる。

【0047】

バクテリオファージは、３つの一般的なアプローチを使用して合成ＤＮＡをパッケージ化し、送達する。第１のアプローチでは、合成ＤＮＡは、通常は選択可能なマーカーを含む、標的化された様式でバクテリオファージゲノムに組換えられる。第２のアプローチでは、ファージ内の制限部位を使用して、インビトロで合成ＤＮＡを導入する。第３のアプローチでは、一般に、ファージパッケージング部位および溶菌性複製起点をコードするプラスミドがバクテリオファージ粒子のアセンブリーの一部としてパッケージングされる。得られるプラスミドは新造された（ｃｏｉｎｅｄ）「ファージミド」と呼ばれる。

【0048】

ファージは、進化の理由から、所与の細菌系統に限定されている。いくつかの場合において、それらの遺伝物質を不適合系統に注入することは逆効果である。したがって、ファージは、限られた断面の細菌系統に特異的に感染するように進化してきた。しかし、遺伝物質を広範囲の細菌に注入するファージがいくつか発見されている。古典的な例はＰ１ファージであり、これはさまざまな範囲のグラム陰性菌にＤＮＡを注入することが示されている。

【0049】

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、第１のスペーサー配列をコードする第１の核酸配列、またはそこから転写されるｃｒＲＮＡを含むバクテリオファージであり、第１のスペーサー配列は、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、第１のスペーサー配列をコードする第１の核酸配列、またはそこから転写されるｃｒＲＮＡを含み、第１のスペーサー配列は、バクテリオファージが溶菌性にされるという条件で、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは溶原性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルを確立することにおいて役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、溶原性サイクルの確立と、バクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持の両方において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、リプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃＩリプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子の調節エレメントの除去によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子のプロモーターの除去によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子の機能的エレメントの除去によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、活性化因子遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃＩＩ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｌｅｘＡ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｉｎｔ（インテグラーゼ）遺伝子である。いくつかの実施形態において、２つ以上の溶原性遺伝子は、バクテリオファージ溶原性サイクルの停止および／または溶菌サイクルの誘導を引き起こすために、除去、置き換え、または不活性化される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子に向けられた第２のスペーサーを含む第２のＣＲＩＳＰＲアレイを介して溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１つ以上の溶菌性遺伝子の挿入によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶菌サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の挿入によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶菌サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の発現を変化させることによって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、表現型的に、溶原性バクテリオファージから溶菌性バクテリオファージに変化する。いくつかの実施形態において、表現型の変化は、溶原性が不可能であるため、バクテリオファージを溶菌性にするための自己標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介する。いくつかの実施形態において、自己標的化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、プロファージゲノムからの自己標的化ｃｒＲＮＡを含み、溶原菌を殺傷する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、環境変化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、環境変化には、温度、ｐＨ、または栄養素の変化、抗生物質、過酸化水素、外来ＤＮＡ、またはＤＮＡ損傷剤への曝露、有機炭素の存在、および重金属（例えば、クロム（ＶＩ）の形で）の存在が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、溶菌性にされるバクテリオファージは、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、溶菌性にされるバクテリオファージは、追加のＣＲＩＰＳＲアレイを導入することによって、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、バクテリオファージの溶菌活性および／またはＣＲＩＳＰＲアレイの活性によって引き起こされる細胞死を超えて、標的細菌にいかなる新たな特性も付与しない。さらに本明細書で開示されるのは、いくつかの実施形態において、第１のスペーサー配列をコードする第１の核酸配列またはそこから転写されるｃｒＲＮＡを含む溶原性バクテリオファージであり、第１のスペーサー配列は、バクテリオファージは溶菌性にされるという条件下で、標的細菌中の標的遺伝子からの標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、複数の細菌系統に感染する。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、非必須遺伝子内にある。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、非コード配列である。いくつかの実施形態において、非コード配列は遺伝子間配列である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的細菌において高度に保存された配列の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的細菌に存在する配列の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、必須遺伝子のプロモーター配列の全部または一部を含む標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列は、少なくとも１つのリピート配列を含む第１のＣＲＩＳＰＲアレイを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリピート配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかで第１のスペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。

【0050】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたはファージミドＤＮＡは、溶原性（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ）またはテンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたはファージミドには、Ｐ１ファージ、Ｍ１３ファージ、λファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ７ｍファージ、φＣ２ファージ、φＣＤ２７ファージ、φＮＭ１ファージ、Ｂｃ４３１ ｖ３ファージ、φ１０ファージ、φ２５ファージ、φ１５１ファージ、Ａ５１１様ファージ、Ｂ０５４、０１７６様ファージ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒファージ（ＮＣＴＣ１２６７６およびＮＣＴＣ１２６７７など）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φＣＤ１４６ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φＣＤ２４－２ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージである。

【0051】

いくつかの実施形態において、複数のバクテリオファージが一緒に使用される。いくつかの実施形態において、一緒に使用される複数のバクテリオファージは、サンプルまたは対象内の同じまたは異なる細菌を標的とする。いくつかの実施形態において、一緒に使用されるバクテリオファージは、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ７ｍファージ、または本明細書に記載のバクテリオファージの任意の組み合わせを含む。

【0052】

いくつかの実施形態において、関心対象のバクテリオファージは、環境源または商業研究ベンダーから得られる。いくつかの実施形態において、得られたバクテリオファージは、細菌のライブラリーおよびそれらの関連系統に対する溶菌活性についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、スクリーニングされた細菌において一次耐性を生成するそれらの能力について、細菌のライブラリーおよびそれらの関連系統に対してスクリーニングされる。

【0053】

いくつかの実施形態において、核酸は、バクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸は、ｃｒアレイ、Ｃａｓシステム、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、関心対象のオペロンの末端の転写ターミネーター部位でバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の除去された非必須遺伝子の置き換えとしてバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の除去された溶原性遺伝子の置き換えとしてバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸による置き換えは、バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸による置き換えは、溶原性バクテリオファージを溶菌性にする。

【0054】

いくつかの実施形態において、核酸は、第１の位置でバクテリオファージゲノムに導入され、一方、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子は、別個の位置でバクテリオファージゲノムから別個に除去および／または不活化される。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去は、溶原性バクテリオファージを溶菌性バクテリオファージにする。同様に、いくつかの実施形態において、１つ以上の溶菌性遺伝子がバクテリオファージに導入されて、非溶菌性の溶原性バクテリオファージを溶菌性バクテリオファージにする。

【0055】

いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の置き換え、除去、不活性化、またはそれらの任意の組み合わせは、化学的、生化学的、および／または任意の適切な方法によって達成される。いくつかの実施形態において、１つ以上の溶菌性遺伝子の挿入は、任意の適切な化学的、生化学的、および／または相同組換えによる物理的方法によって達成される。

【0056】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φＣＤ１４６ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、φＣＤ２４－２ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージである。

【0057】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、バクテリオファージの生存に必須ではない遺伝子である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、溶菌サイクルの誘導および／または維持に必須ではない遺伝子である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、φＣＤ１４６ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージからのｇｐ４９である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、φＣＤ２４－２ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバクテリオファージからのｇｐ７５である。

【0058】

本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、完全な外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含むバクテリオファージである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。特定の実施形態において、本明細書に開示されるのは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージである。

【0059】

ＣＲＩＳＰＲアレイ
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイ（ｃｒアレイ）は、スペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、処理された成熟ｃｒＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、成熟ｃｒＲＮＡは、ファージまたは標的細菌に導入される。いくつかの実施形態において、内因性または外因性のＣａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲアレイを成熟型ｃｒＲＮＡにプロセシングする。いくつかの実施形態において、外因性Ｃａｓ６は、ファージに導入される。いくつかの実施形態において、ファージは、外因性Ｃａｓ６を含む。いくつかの実施形態において、外因性Ｃａｓ６は、標的細菌に導入される。

【0060】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、スペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１つのリピート配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリピート配列は、その５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは任意の長さであり、１つ以上の必須遺伝子を標的とすることによって標的細菌の所望のレベルの殺傷を達成するために必要なリピートヌクレオチド配列と交互になっている任意の数のスペーサーヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１から約１００のスペーサーヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、それぞれがその５’末端およびその３’末端でリピートヌクレオチド配列に連結される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上のスペーサーヌクレオチド配列を含むか、本質的になるか、またはそれからなる。

【0061】

スペーサー配列
いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的細菌における標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、コード領域である。いくつかの実施形態において、コード領域は必須遺伝子である。いくつかの実施形態において、コード領域は、非必須遺伝子である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、非コード配列である。いくつかの実施形態において、非コード配列は遺伝子間配列である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的細菌において高度に保存された配列の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的細菌に存在する配列の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、必須遺伝子のプロモーター配列の全部または一部を含む標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態において、ミスマッチは隣接している。いくつかの実施形態において、ミスマッチは連続していない。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列に対して７０％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列に対して８０％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相補性である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列に対して１００％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、長さが少なくとも約８ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって完全な相補性または実質的な相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、長さが少なくとも約２０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドである標的ヌクレオチド配列の領域にわたって完全な相補性または実質的な相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’領域は、標的ヌクレオチド配列に対して１００％相補的であり、一方、スペーサーの３’領域は、標的ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であり、したがって、標的ヌクレオチドに対するスペーサー配列の全体的な相補性は１００％未満である。例えば、いくつかの実施形態において、２０ヌクレオチドスペーサー配列（シード領域）の３’領域の最初の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的である（例えば、少なくとも約７０％相補的である）。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の３’末端の最初の７から１２ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的である（例えば、少なくとも約５０％相補的（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上））。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の３’末端の最初の７から１０ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して７５％－９９％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも約５０％から約９９％相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の３’末端の最初の７から１０ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、実質的に相補的である（例えば、少なくとも標的ヌクレオチド配列に対して約７０％相補的）。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の最初の１０ヌクレオチド（シード領域内）は、標的ヌクレオチド配列に対して１００％相補的であり、一方、スペーサー配列の５’領域の残りのヌクレオチドは、実質的に相補的である（例えば、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％相補的）。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’領域（例えば、５’末端の最初の８ヌクレオチド、５’末端の最初の１０ヌクレオチド、５’末端の最初の１５ヌクレオチド、５’末端の最初の２０ヌクレオチド）は、標的ヌクレオチド配列に対して約７５％以上の相補性（７５％から約１００％の相補性）を有し、一方、スペーサー配列の残りは、標的ヌクレオチド配列に対して約５０％以上の相補性を有する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列の５’末端の最初の８ヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して１００％の相補性を有するか、または１つまたは２つの変異を有し、したがって、標的ヌクレオチド配列に対して、それぞれ、約８８％相補的または約７５％相補的であり、一方。スペーサーヌクレオチド配列の残りは、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも約５０％以上相補的である。

【0062】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、長さが約１５ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、長さが約１５ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドである（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ヌクレオチド以上）。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、約８から約１５０ヌクレオチド、約８から約１００ヌクレオチド、約８から約５０ヌクレオチド、約８から約４０ヌクレオチド、約８から約３０ヌクレオチド、約８から約２５ヌクレオチド、約８から約２０ヌクレオチド、約１０から約１５０ヌクレオチド、約１０から約１００ヌクレオチド、約１０から約８０ヌクレオチド、約１０から約５０ヌクレオチド、約１０から約４０ヌクレオチド、約１０から約３０ヌクレオチド、約１０から約２５ヌクレオチド、約１０から約２０ヌクレオチド、約１５から約１５０ヌクレオチド、約１５から約１００ヌクレオチド、約１５から約５０ヌクレオチド、約１５から約４０ヌクレオチド、約１５から約３０ヌクレオチド、約２０から約１５０ヌクレオチドヌクレオチド、約２０から約１００ヌクレオチドヌクレオチド、約２０から約８０ヌクレオチドヌクレオチド、約２０から約５０ヌクレオチドヌクレオチド、約２０から約４０ヌクレオチド、約２０から約３０ヌクレオチド、約２０から約２５ヌクレオチド、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３２ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４４ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１１０ヌクレオチド、少なくとも約１２０ヌクレオチド、少なくとも約１３０ヌクレオチド、少なくとも約１４０ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上、およびその中の任意の値または範囲である。いくつかの実施形態において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムは、約３０から３９ヌクレオチド、約３１から約３８ヌクレオチド、約３２から約３７ヌクレオチド、約３３から約３６ヌクレオチド、約３４から約３５ヌクレオチド、または約３５ヌクレオチドのスペーサー長を有する。いくつかの実施形態において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｉ－Ｃ型 Ｃａｓシステムは、約３４ヌクレオチドのスペーサー長を有する。いくつかの実施形態において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２９、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも約３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約２０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約４５、または約４５ヌクレオチド超のスペーサー長を有する。

【0063】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、スペーサー配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の相同性を含む。いくつかの場合において、スペーサー配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、スペーサー配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、スペーサー配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して１００％の相同性を含む。いくつかの場合において、スペーサー配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つの、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または。の３４を超えるヌクレオチドを有する少なくとも一部を含む。

【0064】

「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドベースで）ことを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較のウィンドウ全体で２つの最適に整列された配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定することによって、両方の配列で発生して一致する位置の数を算出すること、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（つまり、ウィンドウサイズ）で除算すること、および結果に１００を掛けて配列の同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。

【0065】

２つのタンパク質間の「相同性」または「類似性」という用語は、アミノ酸配列および１つのタンパク質配列のその保存されたアミノ酸置き換え物を第２のタンパク質配列と比較することによって決定される。類似性は、当技術分野でよく知られている手順、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって決定され得る。

【0066】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサー配列の同一性は同じである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサー配列の同一性は異なる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサー配列の同一性は異なるが、１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサー配列の同一性は異なり、重複する配列である１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上のスペーサー配列の同一性は異なり、重複する配列ではない１つ以上の標的ヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中のＰＡＭ配列（標的領域のすぐ３’に位置するＰＡＭ配列）に直接隣接して位置する長さ約１０から約４０の連続したヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接して位置しているか（ｌｏｃａｔｅｄ ａｄｊａｃｅｎｔ）または側面に隣接している（ｆｌａｎｋｅｄ）。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上の配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上の配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の相同性を含む。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上の配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上の配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上の配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つに対して１００％の相同性を含む。いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲアレイの２つ以上の配列は、配列番号１２－２２のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４ヌクレオチド、または３４を超えるヌクレオチドを有する部分を少なくとも含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、配列番号１２－１５のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第１のスペーサー配列、配列番号１６－１８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第２のスペーサー配列、配列番号１９－２１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第３のスペーサー配列を含み、ここで、
上記第１のスペーサー配列、第２のスペーサー配列、および第３のスペーサー配列は０から８ヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１２－１５のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１６－１８のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２０－２３のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１２－１５のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１６－１８のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号１９－２１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１２－１５のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１６－１９のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号１９－２１のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％の相同性を含む。

【0068】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、配列番号１２に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のスペーサー配列、配列番号１６に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第２のスペーサー配列、配列番号２０に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第３のスペーサー配列を含み、ここで、上記第１のスペーサー配列、第２のスペーサー配列、および第３のスペーサー配列は０～８ヌクレオチド修飾を含む、。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１２に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１６に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号１９に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１２に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。第２のスペーサー配列は、配列番号１６に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。第３のスペーサー配列は、配列番号１９に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１２に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１６に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号１９に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、配列番号１３に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第１のスペーサー配列、配列番号１７に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第２のスペーサー配列、および配列番号２０に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第３のスペーサー配列を含み、ここで、上記第１のスペーサー配列、第２のスペーサー配列、および第３のスペーサー配列は０～８ヌクレオチド修飾を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１３に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１７に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２０に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１３に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１７に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２０に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１３に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１７に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２０に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイは、配列番号１４に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第１のスペーサー配列、配列番号１８に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第２のスペーサー配列、および配列番号２１に対して少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む第３のスペーサー配列を含み、ここで、上記第１のスペーサー配列、第２のスペーサー配列、および第３のスペーサー配列は、０～８ヌクレオチド修飾を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１４に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１８に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２１に対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１４に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１８に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２１に対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、第１のスペーサー配列は、配列番号１４に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、第２のスペーサー配列は、配列番号１８に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含み、そして第３のスペーサー配列は、配列番号２１に対して少なくともまたは約１００％の相同性を含む。

【0071】

ＰＡＭ配列は、その領域に対して相補的であることの結果としてスペーサー配列が結合する領域の隣の標的遺伝子に見出され、スペーサーヌクレオチド配列との塩基対形成が開始する点を特定する。必要である正確なＰＡＭ配列は、異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムごとに変動し、確立されたバイオインフォマティクスと実験の手順によって識別される。ＰＡＭの非限定的な例には、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＧ、ＴＴＣ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＴＧ、ＧＡＧ、および／またはＣＣが含まれる。Ｉ型システムの場合、ＰＡＭはスペーサーに一致する配列のすぐ５’に位置し、したがってスペーサーヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列の３’に位置し、カスケードによって直接認識される。一旦プロトスペーサーが認識されると、カスケードは一般にエンドヌクレアーゼＣａｓ３を動員し、標的ＤＮＡを切断および分解する。ＩＩ型システムの場合、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡがＲループを形成して、ガイドＲＮＡとゲノムのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋペアリングを介して特定のＤＮＡ配列を調べるには、ＰＡＭが必要である。ＰＡＭ特異性は、Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合特異性の関数である（例えば、Ｃａｓ９のＣ末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン）。

【0072】

いくつかの実施形態において、殺傷される細菌中の標的ヌクレオチド配列は、関心対象の任意の必須の標的ヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、必須ではない配列である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子のプロモーターをコードするヌクレオチド配列またはその相補体の全部または一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、必須遺伝子のプロモーターまたはその一部に相補的である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子のコード鎖または非コード鎖に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、必須遺伝子の転写領域のコーディング上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、その生存のために決定的に重要である生物の任意の遺伝子である。しかし、必須であることは、生物が住んでいる状況に大きく依存する。例えば、デンプンを消化するために必要とされる遺伝子は、デンプンが唯一のエネルギー源である場合にのみ必須である。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロモーター配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的細菌の生存に必要とされる必須遺伝子の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、必須遺伝子は、Ｔｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫ。いくつかの実施形態において、非必須遺伝子は、生存にとって決定的に重要ではない生物の任意の遺伝子である。しかし、本質的でないことは、生物が生きている状況に大きく依存する。

【0074】

いくつかの実施形態において、関心対象の標的ヌクレオチド配列の非限定的な例には、転写調節因子、翻訳調節因子、ポリメラーゼ遺伝子、代謝酵素、トランスポーター、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、ＤＮＡ複製酵素、ＤＮＡ修飾または分解酵素、調節ＲＮＡ、転移ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡをコードする標的ヌクレオチド配列が含まれる。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、細胞分裂、細胞構造、代謝、運動性、病原性、毒性、または抗生物質耐性に関与する遺伝子に由来する。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、その機能がまだ特徴付けられていない仮想の遺伝子に由来する。したがって、例えば、これらの遺伝子は、任意の細菌からの任意の遺伝子である。

【0075】

完全な構築物ファージのための適切なスペーサー配列は、代表的なゲノムの検索セットを位置付けすること、関連するパラメーターでゲノムを検索すること、ＣＲＩＳＰＲ操作ファージにおける使用のためのスペーサーの品質を決定することによって特定され得る。

【0076】

最初に、代表的なゲノムの適切な検索セットが位置付けされ、関心対象の生物／種／標的のために取得される。代表的なゲノムのセットは、ＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋまたはＰＡＴＲＩＣデータベースを含むがこれらに限定されない、さまざまなデータベースで見つけることができる。ＮＣＢＩ ｇｅｎｂａｎｋは、利用可能な最大のデータベースの１つであり、これまでに配列決定されたほぼすべての生物の参照ゲノムと提出されたゲノムの混合物が含まれている。具体的には、病原性原核生物の場合、ＰＡＴＲＩＣ（Ｐａｔｈｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）データベースは、ゲノムの追加の包括的なリソースを提供し、臨床的に関連する系統および医薬品に関連するゲノムに焦点を当てる。上記のデータベースは両方とも、ＦＴＰ（ファイル転送プロトコル）サーバーを介したゲノムの一括ダウンロードを許容し、迅速かつプログラム可能なデータセットの取得を可能にしている。

【0077】

次に、適切なスペーサー配列を位置付けするために、関連するパラメーターを用いてゲノムを検索する。ゲノムは、順方向と逆方向の両方の相補鎖の方向で最初から最後まで読み取られ、ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）部位を含むＤＮＡの連続したストレッチを位置付けすることができる。スペーサー配列は、ＰＡＭ部位に３’または５’で隣接するＮ長のＤＮＡ配列になり（ＣＲＩＳＰＲシステム型によって異なる）、ここで、Ｎは関心対象のＣａｓシステムに固有であり、一般的に事前に知られている。ＰＡＭ配列とスペーサー配列の特性評価は、Ｃａｓシステムの発見と初期調査中に実行し得る。観察されたすべてのＰＡＭ隣接スペーサーは、ダウンストリームで使用するためにファイルおよび／またはデータベースに保存し得る。必要とされる正確なＰＡＭ配列は、異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム間で変動し、確立されたバイオインフォマティクスおよび実験の手順によって識別される。

【0078】

次に、ＣＲＩＳＰＲ操作されたファージで使用するためのスペーサーの品質が決定される。観察された各スペーサーは、それらが存在する評価されたゲノムの数を決定するために評価され得る。観察されたスペーサーは、それらが所与の各ゲノムにおいて何回存在し得るかを見るために評価され得る。Ｃａｓシステムは、変異が発生した場合に標的部位を認識できない可能性があり、追加の「バックアップ」部位の各々が、適切な非変異標的位置存在する可能性を増大するために、ゲノムあたり１つより多く存在するスペーサーは有利であり得る。観察されたスペーサーは、それらがゲノムの機能的に注釈が付けられた領域で発生するかどうかを決定するために評価され得る。そのような情報が利用可能である場合、機能注釈をさらに評価して、ゲノムのそれらの領域が生物の生存および機能に「必須」であるかどうかを決定し得る。関心対象となるすべてまたはほぼすべての評価済みゲノム（＞＝９９％）に存在するスペーサーに焦点を当てることにより、スペーサーの選択は多くの標的化ゲノムに対して広く適用可能であり得る。保存されたスペーサーの大規模な選択プールが存在する場合、既知の機能を有するゲノムの領域で発生するスペーサーが優先され、それらのゲノム領域が生存に「必須」であり、ゲノムあたりに１回以上存在する場合は優先度が高くなる。

【0079】

完全構築物ファージのためのスペーサー配列が、いくつかの実施形態において、検証される。いくつかの実施形態において、第１の工程は、関心対象の生物、種、または標的の中で複製するプラスミドを同定することを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、選択可能なマーカーを有する。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの実施形態において、発現カセットは、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、アデニンデアミナーゼ（ａｄａ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（Ｂｓｒ、ＢＳＤ）、ブレオマイシン結合タンパク質（Ｂｌｅ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）、シトシンデアミナーゼ（ｃｏｄＡ）、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｐａｃ）、またはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｈ）、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、ポリミキシンＢ、エリスロマイシン、カルベニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ、（Ｐａｃ）、またはゼオシン（Ｓｈ ｂｌａ）である。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、チミジル酸シンターゼ、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはグルタミンシンテターゼに関与する遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。

【0080】

いくつかの実施形態において、第２の工程は、Ｃａｓシステムをコードする遺伝子が関心対象の生物、種、または標的において発現されるように、Ｃａｓシステムをコードする遺伝子をプラスミドに挿入することを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｃａｓシステムの上流に提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｃａｓシステムの発現を駆動するために、関心対象の生物、種、または標的によって認識される。例示的なプロモーターには、Ｌ－アラビノース誘導性（ａｒａＢＡＤ、Ｐ_ＢＡＤ）プロモーター、任意のｌａｃプロモーター、Ｌ－ラムノース誘導性（ｒｈａＰＢＡＤ）プロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージプロモーター（ｐＬｐＬ－９Ｇ－５０）、アンヒドロテトラサイクリン誘導性（ｔｅｔＡ）プロモーター、ｔｒｐ、Ｉｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ－１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、Ｉｐｐ－ｌａｃ、ｃｓｐＡ、１１－ｌａｃオペレーター、Ｔ３－ｌａｃオペレーター、Ｔ４遺伝子３２、Ｔ５－ｌａｃオペレーター、ｎｐｒＭ－ｌａｃオペレーター、Ｖｈｂ、プロテインＡ、コリネバクテリア－Ｅ．ｃｏｌｉ様プロモーター、ｔｈｒ、ｈｏｒｎ、ジフテリア毒素プロモーター、ｓｉｇ Ａ、ｓｉｇ Ｂ、ｎｕｓＧ、ＳｏｘＳ、ｋａｔｂ、ａ－アミラーゼ（Ｐａｍｙ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３（２つの重複するＲＮＡポリメラーゼσ因子認識部位、σΑ、σΒで構成される）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３、ｒｐｌＫ－ｒｐｌＡ、フェレドキシンプロモーター、および／またはキシロースプロモーター）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＢＢａ＿Ｊ２３１０２、ＢＢａ＿Ｊ２３１０４、またはＢＢａ＿Ｊ２３１０９である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、内因性ＣＲＩＳＰＲプロモーター、内因性Ｃａｓオペロンプロモーター、ｐ１６、ｐｌｐｐ、またはｐｔａｔなどの生物、種、または標的細菌に由来するものである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｇｐ１０５またはｇｐ２４５のプロモーターなどのファージプロモーターである。いくつかの実施形態において、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）が、プロモーターとＣａｓシステムとの間に提供される。いくつかの実施形態において、ＲＢＳは、関心対象の生物、種、または標的によって認識される。

【0081】

いくつかの実施形態において、第３の工程は、プラスミドにゲノム標的化スペーサーを提供することを含む。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化スペーサーは、バイオインフォマティクスを使用して同定される。いくつかの実施形態において、ゲノム標的化スペーサーは、リピート－スペーサー－リピートの上流に提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターが提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｃｒＲＮＡの発現を駆動するために、関心対象の生物、種、または標的によって認識される。いくつかの実施形態において、第３の工程のためのクローニングは、クローンニングされるスペーサーによって標的化されない生物または種を使用することを含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、第４の工程は、Ｃａｓシステムを発現するプラスミドに非標的スペーサーを提供することを含む。いくつかの実施形態において、非標的スペーサーは、配列がランダムであることを含む。いくつかの実施形態において、非標的スペーサーは、関心対象の生物、種、または標的のゲノムにおける標的化部位を含まない配列を含む。いくつかの実施形態において、非標的スペーサー配列は、バイオインフォマティクスを使用して、関心対象の生物、種、または標的のゲノムにおいて標的部位を含まないことが決定される。いくつかの実施形態において、非標的スペーサー配列は、リピート－スペーサー－リピートの上流に提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターが提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｃｒＲＮＡの発現を駆動するために、関心対象の生物、種、または標的によって認識される。

【0083】

いくつかの実施形態において、第５の工程は、生成された各スペーサーの有効性を決定することを含む。いくつかの実施形態において、殺傷効力が決定される。いくつかの実施形態において、細菌ゲノムを標的とする際の各スペーサーの有効性が決定される。いくつかの実施形態において、スペーサーを含むプラスミドは、非標的スペーサーを含むプラスミドと比較した場合に、約０．５倍、約１倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、６０倍、８０倍、または最大約１００倍の移動速度の減少を含む。

【0084】

リピートヌクレオチド配列
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイのリピートヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの任意の既知のリピートヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、リピートヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、内部ヘアピン）からのネイティブリピートの二次構造を含む合成配列のものである。いくつかの実施形態において、リピートヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの既知のリピートヌクレオチド配列に基づいて互いに異なる。いくつかの実施形態において、リピートヌクレオチド配列はそれぞれ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（例えば、内部ヘアピン）からのネイティブリピートの別個の二次構造から構成される。いくつかの実施形態において、リピートヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムで操作可能な別個のリピートヌクレオチド配列の組み合わせである。

【0085】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、その５’末端でリピート配列の３’末端に連結される。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、その５’末端で、リピート配列の３’末端の約１から約８、約１から約１０、または約１から約１５ヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態において、リピート配列の約１から約８、約１から約１０、約１から約１５ヌクレオチドは、リピート配列の３’末端の一部である。いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、その３’末端でリピート配列の５’末端に連結される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、その３’末端で、リピート配列の５’末端の約１から約８、約１から約１０、または約１から約１５ヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態において、リピート配列の約１から約８、約１から約１０、約１から約１５ヌクレオチドは、リピート配列の５’末端の一部である。

【0086】

いくつかの実施形態において、スペーサーヌクレオチド配列は、その５’末端で第１のリピート配列に連結され、その３’末端で第２のリピート配列に連結されて、リピート－スペーサー－リピート配列を形成する。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、その５’末端で第１のリピート配列の３’末端に連結され、その３’末端で第２のリピート配列の５’に連結され、ここで、スペーサー配列および第２のリピート配列が反復されて、ｎが１から１００までの任意の整数であるようにリピート－（スペーサー－リピート）ｎ配列を形成する。いくつかの実施形態において、リピート－（スペーサー－リピート）ｎ配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上、のスペーサーヌクレオチド配列を含み、これらから本質的になり、またはこれらからなる。

【0087】

いくつかの実施形態において、リピート配列は、野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのリピート配列と同一であるか、または実質的に同一である。いくつかの実施形態において、リピート配列は、表３に見出されるリピート配列である。いくつかの実施形態において、リピート配列は、本明細書に記載の配列である。いくつかの実施形態において、リピート配列は、野生型リピート配列の一部（例えば、野生型リピート配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の連続ヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、リピート配列は、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、リピート配列は、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチドを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、リピート配列は、約２０から４０、２１から４０、２２から４０、２３から４０、２４から４０、２５から４０、２６から４０、２７から４０、２８から４０、２９から４０、３０から３０、３１から４０、３２から４０、３３から４０、３４から４０、３５から４０、３６から４０、３７から４０、３８から４０、３９から４０、２０から３９、２０から３８、２０から３７、２０から３６、２０から３５、２０から３４、２０から３３、２０から３２、２０から３１、２０から３０、２０から２９、２０から２８、２０から２６、２０から２５、２０から２４、２０から２３、２０から２２、または２０から２１ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、リピート配列は、約２０から３５、２１から３５、２２から３５、２３から３５、２４から３５、２５から３５、２６から３５、２７から３５、２８から３５、２９から３５、３０から３０、３１から３５、３２から３５、３３から３５、３４から３５、２５から４０、２５から３９、２５から３８、２５から３７、２５から３６、２５から３５、２５から３４、２５から３３、２５から３２、２５から３１、２５から３０、２５から２９、２５から２８、２５から２６ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、システムは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態において、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＩ－Ｃ型Ｃａｓシステムは、約２５から３８ヌクレオチドのリピート長を有する。

【0088】

いくつかの実施形態において、リピート配列は、配列番号２４－２８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、リピート配列は、配列番号２４－２８のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の相同性を含む。いくつかの場合において、リピート配列は、配列番号２４－２８のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、リピート配列は、配列番号２４－２８のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、リピート配列は、配列番号２４－２８のいずれか１つに対して１００％の相同性を含む。いくつかの場合において、リピート配列は、配列番号２４－２８のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３２を超えるヌクレオチドを有する部分を少なくとも含む。

【0089】

転写活性化因子
いくつかの実施形態において、核酸配列は、転写活性化因子をさらに含む。いくつかの実施形態において、コードされた転写活性化因子は、標的細菌内の関心対象の遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、外因性であるか内因性であるかに関わらず、標的細菌内の関心対象の遺伝子の発現を活性化する。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、標的細菌内の１つ以上の阻害要素の活性を破壊することによって、標的細菌内の関心対象の発現遺伝子を活性化する。いくつかの実施形態において、阻害要素は、転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、阻害要素は、グローバル転写抑制因子を含む。いくつかの実施形態において、阻害要素は、ヒストン様核様体構造化（Ｈ－ＮＳ）タンパク質またはそのホモログまたは機能的断片である。いくつかの実施形態において、阻害要素は、ロイシン応答性調節タンパク質（ＬＲＰ）である。いくつかの実施形態において、阻害要素は、ＣｏｄＹタンパク質である。

【0090】

いくつかの細菌において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ほとんどの環境条件下で、発現が不十分であり、サイレントであると見なされる。これらの細菌においては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの調節は、転写調節因子、例えば、宿主ゲノムの転写調節に広く関与しているヒストン様核様体構造化（Ｈ－ＮＳ）タンパク質の活性の結果である。Ｈ－ＮＳは、ＤＮＡの曲がりを生じるＡＴに富む部位に沿った多量体化によって宿主の転写調節に対する制御を発揮する。Ｅ．ｃｏｌｉなどの一部の細菌では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３オペロンの調節はＨ－ＮＳによって調節されている。

【0091】

同様に、いくつかの細菌では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの抑制は、阻害要素、例えば、ロイシン応答性調節タンパク質（ＬＲＰ）によって制御される。ＬＲＰは、転写開始部位の上流および下流領域への結合に関与する。特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現調節におけるＬＲＰの活性は、細菌によって異なる。種間抑制活性が広いＨ－ＮＳとは異なり、ＬＲＰは宿主のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現を示差的に調節することが示されてきた。そのため、いくつかの場合において、ＬＲＰはさまざまな細菌においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現を調節する宿主特異的な手段を反映する。

【0092】

いくつかの場合において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの抑制はまた、抑制性要素ＣｏｄＹによって制御される。ＣｏｄＹは、ＤＮＡ結合を介して作用するＧＴＰ感知転写リプレッサーである。ＧＴＰの細胞内濃度は、環境の栄養状態の指標として機能する。通常の培養条件下では、ＧＴＰは豊富であり、ＣｏｄＹと結合して転写活性を抑制する。しかし、ＧＴＰ濃度が低下すると、ＣｏｄＹはＤＮＡの結合活性が低下し、以前は抑制されていた遺伝子の転写が起こる。そのため、ＣｏｄＹは厳格なグローバル転写リプレッサーとして機能する。

【0093】

いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＬｅｕＯポリペプチド、その任意のホモログまたは機能的フラグメント、ＬｅｕＯコード配列、またはＬｅｕＯをアップレギュレートする薬剤である。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、ＬｅｕＯの任意のオルソログまたは機能的同等物を含む。いくつかの細菌では、ＬｅｕＯは、細菌の環境栄養状態に応答するグローバル転写調節因子として作用することにより、Ｈ－ＮＳに反対に作用する。通常の状態では、ＬｅｕＯの発現は不十分である。しかし、アミノ酸の飢餓および／または細菌のライフサイクルにおける定常期の到達下では、ＬｅｕＯはアップレギュレーションされる。ＬｅｕＯの発現の増加は、重複するプロモーター領域においてこれはＨ－ＮＳに拮抗することをもたらし、遺伝子発現に影響を及ぼす。ＬｅｕＯの過剰発現は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現をアップレギュレートする。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおいて、ＬｅｕＯはＣａｓＡの上流におけるＬｅｕＯとＨ－ＮＳの結合配列と予想されているｃａｓＡＢＣＤＥオペロンの発現増加を促進する。

【0094】

いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現は、阻害要素の破壊をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現による阻害要素の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現は、Ｈ－ＮＳの活性に起因するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの転写抑制を取り除く。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現による阻害要素の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現の増加を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現によって引き起こされる阻害要素の破壊によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現の増加は、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプロセシングの増加を引き起こす。いくつかの実施形態において、ＬｅｕＯの発現による阻害要素の破壊によるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現の増加は、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸配列のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓプロセシングの増加を引き起こし、その結果、細菌に対するＣＲＩＳＰＲアレイの致死性のレベルを増加させる。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、バクテリオファージおよび／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性の増加を引き起こす。

【0095】

調節エレメント
いくつかの実施形態において、核酸配列は、様々な生物または細胞における発現のための様々なプロモーター、ターミネーターおよび他の調節エレメントと作動可能に関連している。いくつかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸配列は、プロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロモーターおよび／またはターミネーターは、ＣＲＩＳＰＲアレイに作動可能に連結される。本開示を用いて有用な任意のプロモーターが使用され、例えば、本明細書に開示されるように、関心対象の生物で機能するプロモーター、ならびに構成的、誘導性、発生調節、組織特異的／好ましいプロモーターなどが含まれる。本明細書で使用される調節エレメントは、内因性または異種である。いくつかの実施形態において、対象生物に由来する内因性調節エレメントは、それが自然に生じない遺伝的状況に挿入され（例えば、自然界に見られるものとは異なるゲノム内の位置）、それにより、組換えまたは非ネイティブ核酸を生成する。

【0096】

いくつかの実施形態において、核酸配列の発現は、構成的であり、誘導可能であり、時間的に調節され、発達的に調節され、または化学的に調節される。いくつかの実施形態において、核酸配列の発現は、核酸配列を関心対象の生物において機能的なプロモーターに作動可能に連結することによって、構成的にされ、誘導可能にされ、時間的に調節され、発達的に調節され、または化学的に調節される。いくつかの実施形態において、抑制は、核酸配列を、関心対象の生物において機能的である誘導性プロモーターに作動可能に連結することによって可逆的にされる。本明細書に開示されるプロモーターの選択は、発現のための量的、時間的および空間的要件に応じて、また形質転換される宿主細胞に応じて変化する。

【0097】

本明細書に開示される方法、バクテリオファージおよび組成物と共に使用するための例示的なプロモーターには、細菌において機能的であるプロモーターが含まれる。例えば、Ｌ－アラビノース誘導性（ａｒａＢＡＤ、Ｐ_ＢＡＤ）プロモーター、任意のｌａｃプロモーター、Ｌ－ラムノース誘導性（ｒｈａＰＢＡＤ）プロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージプロモーター（ｐＬｐＬ－９Ｇ－５０）、アンヒドロテトラサイクリン－誘導性（ｔｅｔＡ）プロモーター、ｔｒｐ、Ｉｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ－１、ｃａｄＡ、ｎａｒ、Ｉｐｐ－ｌａｃ、ｃｓｐＡ、１１－ｌａｃオペレーター、Ｔ３－ｌａｃオペレーター、Ｔ４遺伝子３２、Ｔ５－ｌａｃオペレーター、ｎｐｒＭ－ｌａｃオペレーター、Ｖｈｂ、プロテインＡ、コリネバクテリア－Ｅ．ｃｏｌｉ様プロモーター、ｔｈｒ、ｈｏｒｎ、ジフテリア毒素プロモーター、ｓｉｇ Ａ、ｓｉｇ Ｂ、ｎｕｓＧ、ＳｏｘＳ、ｋａｔｂ、ａ－アミラーゼ（Ｐａｍｙ）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３（２つの重複するＲＮＡポリメラーゼσ因子認識部位、σΑ、σΒで構成される）、Ｐｔｍｓ、Ｐ４３、ｒｐｌＫ－ｒｐｌＡ、フェレドキシンプロモーター、および／またはキシロースプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＢＢａ＿Ｊ２３１０２プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＢＢａ＿Ｊ２３１０４、ＢＢａ＿Ｊ２３１０９などの広範囲の細菌で機能する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、内因性ＣＲＩＳＰＲプロモーター、内因性Ｃａｓオペロンプロモーター、ｐ１６、ｐｌｐｐ、またはｐｔａｔなどの標的細菌に由来するものである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｇｐ１０５またはｇｐ２４５のプロモーターなどのファージプロモーターである。

【0098】

いくつかの実施形態において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の相同性を含む。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の相同性を含む。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つに対して１００％の相同性を含む。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つの、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチド、または５０を超えるヌクレオチドを有する部分を少なくとも含む。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号１－１１のいずれか１つの、少なくともまたは約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５ヌクレオチド、または２１５を超えるヌクレオチドを有する部分を少なくとも含む。

【0099】

いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターが使用される。いくつかの実施形態において、化学調節プロモーターが、外因性化学調節因子の適用を通じて、生物における遺伝子の発現を調節するために使用される。化学調節プロモーターの使用は、例えば、生物が誘導化学物質で処理される場合にのみ、核酸配列によってコードされるＲＮＡおよび／またはポリペプチドが合成されることを可能にする。化学物質誘導性プロモーターが使用されるいくつかの実施形態において、化学物質の適用は遺伝子発現を誘導する。化学的に抑制可能なプロモーターが使用されるいくつかの実施形態において、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光誘導性プロモーターであり、特定の波長の光の適用が遺伝子発現を誘導する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光抑制性プロモーターであり、特定の波長の光の適用が遺伝子発現を抑制する。

【0100】

発現カセット
いくつかの実施形態において、核酸配列は、発現カセットであるか、または発現カセット内にある。いくつかの実施形態において、発現カセットは、本明細書に開示される核酸配列を発現するように設計される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素をコードする発現カセットである。いくつかの実施形態において、核酸配列は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素をコードする発現カセットである。いくつかの実施形態において、核酸配列は、操作可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする発現カセットである。いくつかの実施形態において、核酸配列は、カスケードおよびＣａｓ３を含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの操作可能な構成要素をコードする発現カセットである。いくつかの実施形態において、核酸配列は、ｃｒＲＮＡ、カスケードおよびＣａｓ３を含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの操作可能な構成要素をコードする発現カセットである。

【0101】

いくつかの実施形態において、関心対象の核酸配列を含む発現カセットはキメラであり、これは、その構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに関して異種であることを意味する。いくつかの実施形態において、発現カセットは天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られている。

【0102】

いくつかの実施形態において、発現カセットは、選択された宿主細胞において機能的である転写および／または翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含む。いくつかの実施形態において、終結領域は、関心対象の異種核酸配列を超えた転写の終結、および正しいｍＲＮＡポリアデニル化に関与する。いくつかの実施形態において、終結領域は、転写開始領域に天然であるか、関心対象の作動可能に連結された核酸配列に対してネイティブであるか、宿主細胞に対してネイティブであるか、または別の供給源に由来する（すなわち、プロモーターに対して、関心対象の核酸配列に対して、宿主に対して、またはそれらの任意の組み合わせに対して、外来性または異種である）。いくつかの実施形態において、ターミネーターは、本明細書に開示される核酸配列に作動可能に連結される。

【0103】

いくつかの実施形態において、発現カセットは、選択可能なマーカーのためのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、マーカーが、選択剤（例えば、抗生物質）を使用することによるなどの化学的手段によって選択される形質を付与するかどうか、またはマーカーは、スクリーニングによる（例えば、蛍光）などの観察もしくはテストを通じて特定される単なる特性であるかに依存して、選択可能であるか、またはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードする。

【0104】

ベクター
発現カセットに加えて、本明細書に開示される核酸配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲアレイを含む核酸配列）は、ベクターに関連して使用される。ベクターは、移入、送達、または導入されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。ベクターの一般的なクラスの非限定的な例には、二本鎖または一本鎖の線状または環状の、自己伝達性または可動性である場合とそうでない場合がある、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリベクターである。ベクターは、細胞ゲノムに組み込まれるか、または染色体外に存在するかのいずれかによって、原核生物または真核生物の宿主を形質転換する（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。さらに、シャトルベクターが含まれ、これは、天然にまたは設計により、２つの異なる宿主生物において複製することができるＤＮＡビヒクルを意味する。いくつかの実施形態において、シャトルベクターは、放線菌および細菌および／または真核生物において複製する。いくつかの実施形態において、ベクター中の核酸は、宿主細胞における転写のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、そしてそれらに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターである。

【0105】

コドン最適化
いくつかの実施形態において、核酸配列は、関心対象の任意の種における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化には、種固有のコドン使用表を使用したコドン使用バイアスのヌクレオチド配列の変更が含まれる。コドン使用表は、関心対象の種で最も高度に発現している遺伝子の配列分析に基づいて生成される。ヌクレオチド配列が核内で発現される場合、コドン使用表は、関心対象の種について高度に発現された核遺伝子の配列分析に基づいて生成される。ヌクレオチド配列の修飾は、種特異的コドン使用表をネイティブなポリヌクレオチド配列に存在するコドンと比較することによって決定される。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブなヌクレオチド配列に対して、１００％未満の同一性（例えば、５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの同一性）を有するヌクレオチド配列であるが、それでも、元のヌクレオチド配列によってコードされるものと同じ機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をもたらす。いくつかの実施形態において、本開示の核酸配列は、関心対象の生物／種における発現のために最適化されたコドンである。

【0106】

形質転換
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸配列、および／または発現カセットは、一過性におよび／または安定して、宿主生物のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される核酸配列および／または発現カセットは、当業者に知られている任意の方法によって細胞に導入される。形質転換の例示的な方法には、コンピテントセルのエレクトロポレーションによる形質転換、コンピテントセルによる受動的取り込み、コンピテントセルの化学的形質転換、ならびに核酸の細胞への導入をもたらす任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的メカニズムが含まれる。それらの任意の組み合わせを含むセルに。いくつかの実施形態において、細胞の形質転換は、核形質転換を含む。いくつかの実施形態において、細胞の形質転換は、プラスミド形質転換および接合を含む。

【0107】

いくつかの実施形態において、１つより多くの核酸配列が導入される場合、ヌクレオチド配列は、単一の核酸構築物の一部として、または別個の核酸構築物として組み立てられ、同じかまたは異なる核酸構築物上に位置する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換事象において、または別個の形質転換事象において、関心対象の細胞に導入される。

【0108】

Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ａ型システム、Ｉ－Ｂ型システム、Ｉ－Ｃ型システム、Ｉ－Ｄ型システム、Ｉ－Ｅ型システム、またはＩ－Ｆ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ａ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｂ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｃ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｄ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｅ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｉ－Ｆ型システムである。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、カスケードポリペプチドを含む。Ｉ型カスケードポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲアレイをプロセシングして、プロセシングされたＲＮＡを生成し、これは、プロセシングされたＲＮＡのスペーサーに相補的な標的配列に複合体を結合するために使用される。いくつかの実施形態において、Ｉ型カスケード複合体は、Ｉ－Ａ型カスケードポリペプチド、Ｉ－Ｂ型カスケードポリペプチド、Ｉ－Ｃ型カスケードポリペプチド、Ｉ－Ｄ型カスケードポリペプチド、Ｉ－Ｅ型カスケードポリペプチド、Ｉ－Ｆ型カスケードポリペプチド、またはＩ－Ｕ型カスケードポリペプチドである。

【0109】

いくつかの実施形態において、Ｉ型カスケード複合体は、（ａ）Ｃａｓ７（Ｃｓａ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ａ１（Ｃｓｘ１３）ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２（Ｃｓｘ９）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓａ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ６ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ３’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’’ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ａ型）、（ｂ）Ｃａｓ６ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｂ（Ｃｓｈ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｓｈ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｂ型）、（ｃ）Ｃａｓ５ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ８ｃ（Ｃｓｄ１）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ７（Ｃｓｄ２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（Ｉ－Ｃ型）、（ｄ）Ｃａｓｌ Ｏｄ（Ｃｓｃ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｃ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型）をコードするヌクレオチド配列、（ｅ）Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（ＣａｓＣ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ５（ＣａｓＤ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチドＣａｓ６ｅ（ＣａｓＥ）ポリペプチドをコードする配列（Ｉ－Ｅ型）、および／または（ｆ）Ｃｙｓ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃｙｓ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｃａｓ７（Ｃｙｓ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣａｓ６ｆポリペプチド（Ｉ－Ｆ型）をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的細菌に対して外因性である。

【0111】

標的細菌
いくつかの実施形態において、標的細菌は、標的細菌の１つ以上の種を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌は、標的細菌の１つ以上の系統を含む。いくつかの実施形態において、標的細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、カルバペネム耐性Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、拡張スペクトルベータラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉが含まれる。細菌のさらなる非限定的な例には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を含むがこれに限定されない乳酸菌、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、もしくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを含むがこれらに限定されない合成液体燃料（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｅｌ）細菌系統、または、例えば、植物および動物に対して病原性である細菌が含まれる。いくつかの実施形態において、細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。いくつかの実施形態において、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍである。いくつかの実施形態において、細菌はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎである。いくつかの実施形態において、細菌はＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍである。いくつかの実施形態において、細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍである。いくつかの実施形態において、細菌はＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉである。いくつかの実施形態において、細菌はＭｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。いくつかの実施形態において、細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである。

【0112】

いくつかの実施形態において、標的細菌は、感染または疾患を引き起こす。いくつかの実施形態において、感染または疾患は、急性または慢性である。いくつかの実施形態において、感染または疾患は、局所的または全身性である。いくつかの実施形態において、感染または疾患は特発性である。いくつかの実施形態において、感染または疾患は、呼吸器吸入、摂取、皮膚および創傷感染症、血流感染症、中耳感染症、胃腸管感染症、腹膜感染症、尿路感染症、泌尿生殖器管感染症、口腔軟組織感染症、腹腔内感染症、表皮または粘膜吸収、眼感染症（コンタクトレンズレンズ汚染を含む）、心内膜炎、嚢胞性線維症における感染症、関節プロテーゼ、歯科用インプラント、カテーテルおよび心臓インプラントなどの留置医療機器の感染、性的接触、ならびに／または院内および換気装置に関連する細菌性肺炎を含むがこれらに限定されない手段を通じて獲得される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、尿路感染症を引き起こす。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、尿路感染症を引き起こす。いくつかの実施形態において、標的細菌は、炎症性疾患を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、自己免疫疾患を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を引き起こす。いくつかの実施形態において、標的細菌は、乾癬を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、乾癬性関節炎（ＰＡ）を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、関節リウマチ（ＲＡ）を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、多発性硬化症（ＭＳ）を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、グレーブス病を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、橋本甲状腺炎を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、重症筋無力症を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、血管炎を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、癌を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、癌の進行を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、癌転移を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、癌治療に対する耐性を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、癌に対処するために使用される療法には、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、標的薬物療法、および／または放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、肛門、膀胱、血液および血液成分、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頸部、結腸および直腸、食道、腎臓、喉頭、リンパ系、筋肉（すなわち、軟組織）、口腔および咽頭、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、小腸、胃、精巣、甲状腺、子宮、および／または外陰部を含むがこれらに限定されない器官で発生する。いくつかの実施形態において、標的細菌は、中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、自閉症を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、双極性障害を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、大うつ病性障害を引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、てんかんを引き起こし、および／または悪化させる。いくつかの実施形態において、標的細菌は、アルツハイマー病、ハンチントン病、および／またはパーキンソン病を含むがこれらに限定されない神経変性障害を引き起こし、および／または悪化させる。

【0113】

嚢胞性線維症および嚢胞性線維症に関連する気管支拡張症は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染に関連している。例えば、Ｐ．Ｆａｒｒｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２５２，Ｎｏ．２、ｐｐ．５３４－５４３（２００９）を参照。いくつかの実施形態において、１つ以上のバクテリオファージは、嚢胞性線維症または嚢胞性線維症に関連する気管支拡張症を有する患者に投与される。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオファージの組み合わせが、嚢胞性線維症または嚢胞性線維症に関連する気管支拡張症を有する患者に投与される。いくつかの実施形態において、嚢胞性線維症または嚢胞性線維症に関連する気管支拡張症を有する患者へのバクテリオファージの投与は、患者における細菌負荷の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、細菌負荷の減少は、嚢胞性線維症または嚢胞性線維症に関連する気管支拡張症を有する患者の臨床的改善をもたらす。

【0114】

非嚢胞性線維症気管支拡張症は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染に関連している。例えば、Ｒ．Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．１７９－１８９（２０１６）を参照。いくつかの実施形態において、１つ以上のバクテリオファージは、非嚢胞性線維症気管支拡張症を有する患者に投与される。いくつかの実施形態において、２つ以上のバクテリオファージの組み合わせが、非嚢胞性線維症気管支拡張症の患者に投与される。いくつかの実施形態において、非嚢胞性線維症気管支拡張症を有する患者へのバクテリオファージの投与は、患者における細菌負荷の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、細菌負荷の減少は、非嚢胞性線維症気管支拡張症の患者の臨床的改善をもたらす。

【0115】

バクテリオファージ
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、偏性溶菌性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子が保持されている溶原性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、いくつかの溶原性遺伝子が除去、置き換え、または不活化された溶原性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、溶原性遺伝子が除去、置き換え、または不活性化され、それによってバクテリオファージを溶菌性にする溶原性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ１７７２、ＰＢ１、ｐ００４ｋ、またはｐ００４ｅｘを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．を標的とするｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、またはＰＢ１である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．を標的とするｐ００４ｋまたはｐ００ｅｘである。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ｐ００４ｋ、またはｐ００ｅｘを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．を標的とする。いくつかの実施形態において、バクテリオファージはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓを標的とする。

【0116】

いくつかの実施形態において、関心対象のバクテリオファージは、環境源から、または商業的研究ベンダーから得られる。いくつかの実施形態において、得られたバクテリオファージは、細菌のライブラリーおよびそれらの関連系統に対する溶菌活性についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、スクリーニングされた細菌において一次耐性を生成するそれらの能力について、細菌のライブラリーおよびそれらの関連系統に対してスクリーニングされる。

【0117】

挿入部位
いくつかの実施形態において、バクテリオファージへの核酸配列の挿入は、バクテリオファージの溶菌活性を保存する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、バクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、関心対象のオペロンの末端の転写ターミネーター部位でバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、１つ以上の除去された非必須遺伝子の置き換えとしてバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、１つ以上の除去された溶原性遺伝子の置き換えとしてバクテリオファージゲノムに挿入される。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸配列による置き換えは、バクテリオファージの溶菌活性に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸配列による置き換えは、バクテリオファージの溶菌活性を保存する。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸配列による置き換えは、バクテリオファージの溶菌活性を増強する。いくつかの実施形態において、非必須および／または溶原性遺伝子の核酸配列による置き換えは、溶原性バクテリオファージを溶菌性にする。

【0118】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、第１の位置でバクテリオファージゲノムに導入され、一方、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子は、別個の位置でバクテリオファージゲノムから別個に除去および／または不活化される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、第１の位置でバクテリオファージに導入され、一方、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子は、複数の別個の位置でバクテリオファージゲノムから別々に除去および／または不活化される。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去および／または不活性化は、バクテリオファージの溶菌活性に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去および／または不活性化は、バクテリオファージの溶菌活性を保存する。いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の除去は、溶原性バクテリオファージを溶菌性バクテリオファージにする。

【0119】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、前述の手段のいずれかによって溶菌性にされた溶原性バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、溶原性バクテリオファージは、１つ以上の溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶菌活性は、少なくとも１つの溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によるものである。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、バクテリオファージにおける溶原性サイクルを確立することにおいて役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、溶原性サイクルの確立およびバクテリオファージにおける溶原性サイクルの維持の両方において役割を果たす。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、リプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃＩリプレッサー遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、活性化因子（アクチベーター）遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｃＩＩ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｌｅｘＡ遺伝子である。いくつかの実施形態において、溶原性遺伝子は、ｉｎｔ（インテグラーゼ）遺伝子である。いくつかの実施形態において、２つ以上の溶原性遺伝子は、バクテリオファージ溶原性サイクルの停止および／または溶菌サイクルの誘導を引き起こすために、除去、置き換え、または不活性化される。いくつかの実施形態において、溶原性バクテリオファージは、１つ以上の溶菌性遺伝子の挿入によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、溶原性バクテリオファージは、溶菌サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の挿入によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、溶原性バクテリオファージは、溶菌サイクルの誘導に寄与する１つ以上の遺伝子の発現を変化させることによって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、溶原性バクテリオファージは、表現型的に、溶原性バクテリオファージから溶菌性バクテリオファージに変化する。いくつかの実施形態において、溶原性バクテリオファージは、環境変化によって溶菌性にされる。いくつかの実施形態において、環境変化には、温度、ｐＨ、または栄養素の変化、抗生物質、過酸化水素、外来ＤＮＡ、またはＤＮＡ損傷剤への曝露、有機炭素の存在、および重金属（例えば、クロム（ＶＩ）の形で）の存在が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、溶菌性にされた溶原性バクテリオファージは、溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、溶菌性にされた溶原性バクテリオファージは、最初に導入されたＣＲＩＳＰＲアレイの自己標的化活性によって溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、溶菌性にされた溶原性バクテリオファージは、追加のＣＲＩＳＰＲアレイを導入することによって溶原性状態に戻ることが防止される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、バクテリオファージの溶菌活性および／または第１もしくは第２のＣＲＩＳＰＲの活性によって引き起こされる細胞死を超えた標的細菌へのいかなる新たな特性も付与しない。

【0120】

いくつかの実施形態において、１つ以上の非必須および／または溶原性遺伝子の置き換え、除去、不活性化、またはそれらの任意の組み合わせは、化学的、生化学的、および／または任意の適切な方法によって達成される。いくつかの実施形態において、１つ以上の溶菌性遺伝子の挿入は、相同組換えによる任意の適切な化学的、生化学的、および／または物理的方法によって達成される。

【0121】

非必須遺伝子
いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、バクテリオファージの生存に必須ではない遺伝子である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、溶菌サイクルの誘導および／または維持に必須でない遺伝子である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージから除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、Ｔ４ Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージからのｈｏｃ遺伝子である。いくつかの実施形態において、除去および／または置き換えされる非必須遺伝子には、Ｔ７ Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージからのｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４．５、ｇｐ４．７、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、除去および／または置き換えされる非必須遺伝子は、Ｔ７ｍ Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージからのｇｐ０．６、ｇｐ０．６５、ｇｐ０．７、ｇｐ４．３、ｇｐ４，５、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0122】

抗菌剤およびペプチド
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗菌ペプチド、抗菌ペプチドの機能的断片、または溶菌性遺伝子を発現するようにさらに遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、本明細書に開示される少なくとも１つの抗菌剤またはペプチドを発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、核酸配列のタンパク質産物がファージ耐性細菌を標的とする酵素製剤（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、バイオフィルムマトリックスを分解（ｂｒｅａｋｉｎｇ ｄｏｗｎ）または分解（ｄｅｇｒａｄｉｎｇ）することを補助する酵素をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ＤｉｓｐｅｒｓｏｎＤアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ－グルコシダーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼまたはリアーゼをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、酵素は、セルラーゼＡとも呼ばれるグリコシルヒドロキシラーゼ５ファミリーの酵素などの、セルラーゼのグリコシルヒドロキシラーゼファミリーなどのセルラーゼ；ポリグルコサミン（ＰＧＡ）デポリメラーゼ；および結腸酸デポリメラーゼ（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）、例えば、１，４－Ｌ－フコダイス加水分解酵素コラン酸（ｃｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）を分解する１，４－ベータ－フコシド加水分解酵素、解重合アルギナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、本明細書に開示される酵素を分泌する。

【0123】

いくつかの実施形態において、抗菌剤またはペプチドは、本明細書に開示されるバクテリオファージによって発現および／または分泌される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、アンピシリン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、オフロキサシン、シプロフラキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシン、または任意の本明細書に開示される抗生物質などの抗生物質を分泌および発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗菌ペプチドをコードする核酸配列を含み、抗菌ペプチドを発現するか、または標的細菌の殺傷を補助もしくは増強するペプチドを分泌する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ペプチドをコードする核酸配列、抗菌ペプチドをコードする核酸配列を含み、あるいは抗菌ペプチドを発現するか、または第１のおよび／もしくは第２のＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性を補助または増強するペプチドを分泌する。

【0124】

使用方法
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージのいずれかを標的細菌に導入する工程を含む、標的細菌を殺傷する方法である。

【0125】

本明細書でさらに開示されるのは、特定の実施形態において、必須遺伝子に標的ヌクレオチド配列を含む第１の細菌種と、必須遺伝子に標的ヌクレオチド含まない第２の細菌種とを有する細菌細胞の混合集団を改変する方法であって、この方法は、本明細書に開示されるバクテリオファージのいずれかを細菌細胞の混合集団に導入する工程を含む。

【0126】

また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、必要とする個体の疾患を治療する方法であり、この方法は、本明細書に開示されるバクテリオファージのいずれかを個体に投与する工程を含む。

【0127】

いくつかの実施形態において、標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムによるＣＲＩＳＰＲアレイのプロセシングによって殺傷されて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベースのエンドヌクレアーゼ活性を方向付けることが可能であるプロセシングされたｃｒＲＮＡ、および／または細菌の標的遺伝子の標的ヌクレオチド配列での切断を生じる。

【0128】

いくつかの実施形態において、標的細菌は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は、バクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する。

【0129】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶菌活性およびＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は相乗的である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの溶菌活性は、バクテリオファージの濃度によって調節される。いくつかの実施形態において、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性は、バクテリオファージの濃度によって調節される。

【0130】

いくつかの実施形態において、細菌の相乗的殺傷は、細菌に投与されるバクテリオファージの濃度を増加させることによって、第１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性よりもバクテリオファージの溶菌活性による殺傷を優先するように調節される。いくつかの実施形態において、細菌の相乗的殺傷は、細菌に投与されるバクテリオファージの濃度を減少させることによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性よりもバクテリオファージの溶菌活性による殺傷を優先しないように調節される。いくつかの実施形態において、低濃度で、溶菌複製は、標的細菌の増幅および殺傷を可能にする。いくつかの実施形態において、高濃度では、ファージの増幅は必要とされない。いくつかの実施形態において、細菌の相乗的殺傷は、バクテリオファージの溶菌活性よりもＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性による殺傷を優先するように、スペーサーの数、長さ、組成、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを変更することによって調節され、その結果、ＣＲＩＳＰＲアレイの致死性を増加させる。いくつかの実施形態において、細菌の相乗的殺傷は、バクテリオファージの溶解活性よりもＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性による殺傷を優先しないように、スペーサーの数、長さ、組成、同一性、またはそれらの任意の組み合わせを変えることによって調節され、その結果、ＣＲＩＳＰＲアレイの致死性を低下させる。

【0131】

投与経路と投与量
本明細書に開示される組成物の投与量および投与期間は、対象の年齢、対象の体重、およびファージの耐性を含む様々な要因に依存する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、動脈内、静脈内、尿道内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせで患者に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、経口投与によって患者に投与される。

【0132】

いくつかの実施形態において、１０^３から１０^２０ＰＦＵの間のファージの用量が与えられる。いくつかの実施形態において、１０^３から１０^１０ＰＦＵの間のファージの用量が与えられる。いくつかの実施形態において、１０^６から１０^２０ＰＦＵの間のファージの用量が与えられる。いくつかの実施形態において、１０^６から１０^１０ＰＦＵの間のファージの用量が与えられる。例えば、いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、１０^３から１０^１１ＰＦＵの間の量の組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、約１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１６、１０^１７、１０^１８、１０^１９、１０^２０、１０^２１、１０^２２、１０^２３、ｌ０^２４ＰＦＵ以上の量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１０^１ＰＦＵ未満の量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、１０^１から１０^８、１０^４と１０^９、１０^５と１０^１０、または１０^７と１０^１１ＰＦＵの間で量の組成物中に存在する。

【0133】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたは混合物は、１日に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４回、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたは混合物は、週に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１回、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたは混合物は、１ヶ月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０回、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージまたは混合物は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、または２４時間毎に、それを必要とする対象に投与される。

【0134】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物（バクテリオファージ）は、疾患または状態の発生前、発生中、または発生後に投与される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージを含む組成物を投与するタイミングは変化する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は予防薬として使用され、疾患または状態の発生を予防するために、状態または疾患の傾向がある対象に継続的に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、症状の発症中または発症後できるだけ早く対象に投与される。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、症状の発症の最初の４８時間以内、症状の発症の最初の２４時間以内、症状の発症の最初の６時間以内、または症状の発症の３時間以内に開始される。いくつかの実施形態において、組成物の最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用する本明細書に記載の任意の経路によるなど、実用的な任意の経路を介する。いくつかの実施形態において、組成物は、疾患または状態の発症が検出されたかまたは疑われた後、実行可能であるとすぐに、そして疾患の治療に必要な期間、例えば、約１ヶ月から約３ヶ月までなどで投与される。いくつかの実施形態において、治療の長さは、対象ごとに異なる。

【0135】

細菌感染
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、細菌感染を治療する方法である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ヒトまたは動物の対象において、本明細書に開示されるように、細菌によって媒介されるかまたは引き起こされる疾患または状態を治療または予防する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、ヒトまたは動物の対象において、本明細書に開示されるように、細菌によって引き起こされるまたは悪化する疾患または状態を治療または予防する。このような細菌は、通常、腸、口腔、肺、脇腹、眼、膣、肛門、耳、鼻、または喉の組織を含む対象の組織と接触している。いくつかの実施形態において、細菌感染は、細菌の活性を調節することによって、および／または細菌を直接殺傷することによって治療される。

【0136】

いくつかの実施形態において、標的細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、カルバペネム耐性Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉが含まれる。さらなる細菌の非限定的な例には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を含むがこれに限定されない乳酸菌、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、もしくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを含むがこれらに限定されない合成液体燃料（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｅｌ）細菌系統、または、例えば、植物および動物に対して病原性である細菌が含まれる。いくつかの実施形態において、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。

【0137】

いくつかの実施形態において、細菌集団に存在する１つ以上の標的細菌は病原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は尿路病原性である。いくつかの実施形態では、病原性細菌は尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は下痢原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は糖尿病誘発性大腸菌（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は様々な０抗原：Ｈ抗原血清型大腸菌である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は腸内病原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。

【0138】

いくつかの実施形態において、病原性細菌は、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ－９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、またはＲ２０２９ｌを含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの様々な系統である。

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の胃腸管における感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の標的細菌を調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つ以上の標的細菌を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つ以上の標的腸内病原性細菌を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、標的腸内病原性細菌は、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つまたは複数の標的下痢原性細菌を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、標的下痢原性細菌は、下痢原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の複数の細菌から１つまたは複数の標的Ｓｈｉｇａ毒素産生細菌を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、標的のＳｈｉｇａ毒素産生細菌は、Ｓｈｉｇａ毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。

【0140】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ－９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、またはＲ２０２９ｌを含む対象のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の１つ以上の標的腸内病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌株を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。

【0141】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の尿路における感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の尿路細菌叢内の標的細菌を調節および／または殺傷するために使用される。尿路細菌叢には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、および一部のアルファ溶血性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の尿路細菌叢内の複数の細菌から１つ以上の標的尿路病原性細菌を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。

【0142】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の皮膚上の感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の皮膚上の標的細菌を調節および／または殺傷するために使用される。

【0143】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象の粘膜上の感染症、疾患、または状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象の粘膜上の標的細菌を調節および／または殺傷するために使用される。

【0144】

いくつかの実施形態において、病原性細菌は抗生物質耐性である。一実施形態では、病原性細菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）である。

【0145】

いくつかの実施形態において、細菌集団に存在する１つ以上の標的細菌は、バイオフィルムを形成する。いくつかの実施形態において、バイオフィルムは、病原性細菌を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、バイオフィルムを処置するために使用される。

【0146】

いくつかの実施形態において、標的細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが含まれる。いくつかの実施形態において、細菌の非限定的な例には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、カルバペネム耐性Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉｔｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉが含まれる。さらなる細菌の非限定的な例には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．を含むがこれに限定されない乳酸菌、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、もしくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを含むがこれらに限定されない合成液体燃料（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｅｌ）細菌系統、または、例えば、植物および動物に対して病原性である細菌が含まれる。いくつかの実施形態において、細菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。

【0147】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、にきびおよび他の関連する皮膚感染症を治療する。

【0148】

いくつかの実施形態において、標的細菌は、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌株である。ＭＤＲ株は、少なくとも１つの抗生物質に耐性のある細菌株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、およびメチシリンなどの抗生物質クラスに耐性がある。いくつかの実施形態において、細菌株は、セフトビプロール、セフタロリン、クリンダマイシン、ダルババンシン、ダプトマイシン、リネゾリド、ムピロシン、オリタバンシン、テジゾリド、テラバンシン、チゲサイクリン、バンコマイシン、アミノグリコシド、カルバペネム、セフタジジム、セフェピム、セフトビプロール、フルオロキノロン、ピペラシリン、チカルシリン、リネゾリド、ストレプトグラミン、チゲサイクリン、ダプトマイシン、などの抗生物質またはそれらの任意の組み合わせに耐性がある。ＭＤＲ株の例には、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ（ＶＲＥ）、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、拡張スペクトルβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生グラム陰性菌、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ（ＫＰＣ）産生グラム陰性菌、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどの多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ ＧＮＲ）ＭＤＲＧＮ細菌が含まれる。

【0149】

いくつかの実施形態では、標的細菌はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。いくつかの実施形態では、標的細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓである。いくつかの実施形態では、標的細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉである。いくつかの実施形態では、標的細菌はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒである。いくつかの実施形態では、標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。いくつかの実施形態では、標的細菌はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒである。いくつかの実施形態では、標的細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。いくつかの実施形態において、標的細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、標的細菌は、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、獣医および医療用途、ならびに研究用途で使用するためのものである。

【0150】

マイクロバイオーム
「マイクロバイオーム」、「マイクロバイオータ」、および「微生物生息地」は、本明細書以下で交換可能に使用され、対象の体表面、空洞、および体液上またはその中に生息する微生物の生態学的群集を指す。マイクロバイオームの生息地の非限定的な例には、腸、結腸、皮膚、皮膚表面、皮膚孔、膣腔、臍帯領域、結膜領域、腸領域、胃、鼻腔および通路、胃腸管、泌尿生殖器管、唾液、粘液、および糞便が含まれる。いくつかの実施形態では、マイクロバイオームは、細菌、古細菌、原生生物、真菌、およびウイルスを含むがこれらに限定されない微生物材料を含む。いくつかの実施形態では、微生物材料は、グラム陰性菌を含む。いくつかの実施形態では、微生物材料は、グラム陽性菌を含む。いくつかの実施形態では、微生物材料は、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、またはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓを含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の標的細菌を調節または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、溶解活性、またはそれらの組み合わせによって、マイクロバイオーム内の標的細菌を調節および／または死滅させるために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の標的細菌を調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、対象のマイクロバイオーム内の複数の細菌から１つ以上の標的細菌を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。いくつかの実施形態において、標的細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態では、大腸菌は多剤耐性（ＭＤＲ）系統である。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、拡張スペクトルベータラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）系統である。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、カルバペネム耐性系統である。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、非多剤耐性（非ＭＤＲ）系統である。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、非カルバペネム耐性系統である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は尿路病原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は下痢原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、下痢原性大腸菌（ＤＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、志賀毒素産生性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、Ｓｈｉｇａ毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、様々なＯ抗原：Ｈ抗原血清型Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、病原性細菌は腸内病原性である。いくつかの実施形態において、病原性細菌は、腸内病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）である。

【0152】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の胃腸管の微生物叢または腸内細菌叢内の標的の単一または複数の細菌を調節または殺傷するために使用される。ミクロビオームまたは腸内細菌叢の改変（例えば、腸内毒素症）は、糖尿病、精神障害、潰瘍性大腸炎、結腸直腸癌、自己免疫障害、肥満、糖尿病、中枢神経系の疾患および炎症性腸疾患などの健康状態のリスクを高める。胃腸管の疾患および状態に関連し、バクテリオファージによって調節または殺傷される例示的な細菌には、Ｅ．ｃｏｌｉの菌系統、亜菌系統、およびエンテロタイプが含まれる。

【0153】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ＣＤ０４３、ＣＤ０５、ＣＤ０７３、ＣＤ０９３、ＣＤ１８０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２８、ＣＤ１９９、ＣＤ１１１、ＣＤ１０８、ＣＤ２５、ＣＤ１４８、ＣＤ１５４、ＦＯＢＴ１９５、ＣＤ０３、ＣＤ０３８、ＣＤ１１２、ＣＤ１９６、ＣＤ１０５、ＵＫ１、ＵＫ６、ＢＩ－９、ＣＤ０４１、ＣＤ０４２、ＣＤ０４６、ＣＤ１９、またはＲ２０２９ｌを含む対象のマイクロバイオーム内の１つ以上の標的腸内病原性Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌株を選択的に調節および／または殺傷するために使用される。

【0154】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、対象の胃腸管のマイクロバイオームまたは腸内細菌叢内の標的の単一または複数の細菌を調節または殺傷するために使用される。マイクロバイオームまたは腸内細菌叢の改変（例えば、腸内毒素症）は、糖尿病、精神障害、潰瘍性大腸炎、結腸直腸癌、自己免疫障害、肥満、糖尿病、中枢神経系の疾患および炎症性腸疾患などの健康状態のリスクを高める。胃腸管の疾患および状態に関連し、バクテリオファージによって調節または殺傷さられる細菌の例示的なリストには、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、ｇｅｍｅｌｌａｃｅａｅ、ｂａｃｔｅｒｉｏｄａｌｅｓ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、ｂｌａｕｔｉａ、ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｄｏｒｅａ、ｂｌａｕｔｉａ、ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｕｃｃｕｓ、ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ、ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ（ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、ｇｅｍｅｌｌａ ｍｏｒｉｂｉｌｌｕｍ、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｃｃａｅ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｕｍ、ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ、ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ、ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、ｒｕｍｉｎｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｂｌａｕｔｉａ、ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｇｏｒｄｏｎｉｂａｃｔｅｒ、ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、ａｒｅｖｏｔｅｌｌａ、ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ、ｂｉｌｏｐｈｉｌａ、ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ、ｇｅｍｅｌｌａ、ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ、ｒｏｔｈｉａ、ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびｐｒｏｔｅｕｓが含まれる。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、健康なマイクロバイオームを促進するために対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、対象のマイクロバイオームの健康を促進するマイクロバイオーム組成物に回復するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージを含む組成物は、プレバイオティクスまたは第３の薬剤を含む。いくつかの実施形態において、マイクロバイオーム関連の疾患または障害は、本明細書に開示されるバクテリオファージによって治療される。

【0156】

環境療法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるバクテリオファージは、食品および農業の衛生（肉、果物および野菜の衛生を含む）、病院の衛生、家庭の衛生、車両および設備の衛生、工業的衛生などのためにさらに使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、抗生物質耐性または他の望ましくない病原体を、医学、獣医、畜産、または、細菌がヒトもしくは動物に感染する任意の追加の環境から除去するために使用される。

【0157】

医療機関でのファージの環境への適用は、消毒が困難または不可能な病原体による院内感染の潜在的な原因である、内視鏡などの機器やＩＣＵなどの環境向けである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるファージは、一般的に使用される消毒剤に対して耐性となる細菌属が生息する機器または環境を処理するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるファージ組成物は、無生物を消毒するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環境は、ファージ力価を有する水溶液で噴霧、塗装、または注がれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の溶液は、１０^１－１０^２０の間のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、バクテリオファージの環境への分布を容易にするために、乾燥分散剤を含むエアロゾル化剤によって適用される。いくつかの実施形態では、物体は、本明細書に開示されるバクテリオファージを含む溶液に浸漬される。

【0158】

衛生
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、様々な分野において、衛生剤として使用される。「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語が使用され得るが、適切な場合、この用語は、単一のバクテリオファージ、バクテリオファージ混合物などの複数のバクテリオファージ、およびバクテリオファージと、消毒剤、洗剤、界面活性剤、水などの薬剤との混合物を含むと広く解釈されるべきであることに留意されるべきである。

【0159】

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、手術室、病室、待合室、実験室、または他の雑多な病院設備を含む病院施設を消毒するために使用される。いくつかの実施形態では、この機器は、心電計、呼吸器、心臓血管補助装置、大動脈内バルーンポンプ、注入装置、他の患者ケア装置、テレビ、モニター、リモコン、電話、ベッドなどを含む。いくつかの状況において、バクテリオファージはエアロゾルキャニスターを介して適用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、トランスファービヒクルで物体上のファージを拭くことによって適用される。

【0160】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、患者ケアデバイスと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、従来の換気装置または呼吸療法装置と組み合わせて使用されて、患者間の内面および外面を洗浄する。換気装置の例には、手術中の換気をサポートするデバイス、無能力の患者の換気をサポートするデバイス、および同様の機器が含まれる。いくつかの実施形態において、従来の治療法には、自動または電動装置、または救急治療室や救急車で一般的に見られるような手動のバッグタイプの装置が含まれる。いくつかの実施形態において、呼吸療法は、慢性閉塞性肺疾患または喘息で一般的に使用される気管支拡張薬などの薬物を導入するための吸入器、または持続的気道陽圧装置などの気道開存性を維持するための装置を含む。

【0161】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、髄膜炎または腸管感染症などの伝染性の高い細菌性疾患が存在する領域において、表面を洗浄し、コロニー形成した人々を治療するために使用される。

【0162】

いくつかの実施形態において、給水は、本明細書に開示される組成物で処理される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、汚染された水、貯水槽、井戸、貯水池、貯蔵タンク、水道、導管、および同様の配水装置に見られる水を処理するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、水、油、冷却液、および他の液体が収集プールに蓄積する工業用貯蔵タンクに適用される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、細菌の増殖を低減するために、定期的に工業用貯蔵タンクに導入される。

【0163】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、家、アパート、マンション、コンドミニアム、寮、または任意の生活領域などの生活領域を消毒するために使用される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、劇場、コンサートホール、美術館、駅、空港、ペット用ベッドなどのペットエリア、またはトイレなどの公共エリアを消毒するために使用される。この能力において、バクテリオファージは、ポンプ噴霧器、エアゾール容器、噴出ボトル、事前に湿らせたタオルなどを含む従来の装置から分配され、消毒される領域に直接適用される（例えば、噴霧される）か、またはタオル、スポンジなどの輸送ビヒクルを介して、その領域に移される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるファージは、台所、寝室、浴室、ガレージ、地下室などを含む、家の様々な部屋に適用される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるファージは、従来のクリーナーと同じ方法である。いくつかの実施形態において、ファージは、従来のクリーナーが適切なバクテリオファージの生物学的活性を維持するように製剤化されるという条件で、従来のクリーナーと組み合わせて（その前に、その後に、または同時に）適用される。

【0164】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、紙製品の処理中または処理の完了後のいずれかで、紙製品の成分に添加される。本明細書に開示されるバクテリオファージが添加される紙製品には、ペーパータオル、トイレットペーパー、ウェットティッシュが含まれるがこれらに限定されない。

【0165】

食品安全
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、汚染を防止するために、任意の食品または栄養補助食品に使用される。食品または医薬品の例としては、牛乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、牛乳ベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵シリアルベースの製品、牛乳ベースの粉末、乳児用調合乳または錠剤、液体懸濁液、乾燥経口サプリメント、湿式経口サプリメント、またはドライチューブ給餌である。

【0166】

バクテリオファージの衛生に関する幅広い概念は、他の農業用途や生物にも適用できる。生産品は、果物や野菜、乳製品、その他の農産物を含む農産物を含む。例えば、切りたての農産物は、病原菌で汚染された加工工場に頻繁に到着する。これは、追跡可能な食品媒介性疾患の発生につながった。いくつかの実施形態において、バクテリオファージ調製物の農産物への適用は、食品媒介性疾患に関連する細菌の種に対して特異性を有する単一のファージまたはファージ混合物の適用を通じて、食品媒介性疾患の可能性を実質的に低減または排除する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、その時点での細菌汚染を低減するために、またはその後の時点での汚染から保護するために、生産および処理の様々な段階で適用される。

【0167】

いくつかの実施形態において、特定のバクテリオファージは、レストラン、食料品店、農産物流通センターでの農産物に適用される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、サラダバーの果物および野菜の内容物に定期的または継続的に適用される。いくつかの実施形態において、サラダバーへの、または食品の外部を消毒するためのバクテリオファージの適用は、ミスト化またはスプレープロセスまたは洗浄プロセスである。

【0168】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、肉、農産物、果物や野菜のカット、および他の食品を含むパッケージを含むマトリックスまたは支持媒体で使用される。いくつかの実施形態において、包装に適したポリマーは、バクテリオファージ調製物で含浸される。

【0169】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、農家および家畜飼料において使用される。いくつかの実施形態において、家畜を飼育している農場では、家畜は、飲料水、食物、またはその両方にバクテリオファージが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバクテリオファージは、死骸に噴霧され、と畜場を消毒するために使用される。

【0170】

農産物の生物的防除剤として特定のバクテリオファージを使用すると、多くの利点が得られる。例えば、バクテリオファージは、一般的な化学消毒剤のように天然の微生物叢の生態学的バランスを乱すことはない、対象となる食品由来の病原菌を特異的に溶解する、天然の無毒な製品であるが、しかしこれは、標的化された食品由来の病原体を特異的に溶解する。バクテリオファージは、化学消毒剤とは異なり、宿主細菌とともに進化する天然物であるため、最近出現した耐性菌に対して活性のある新しいファージが必要に応じて迅速に特定されるのに対して、新しい効果的な消毒剤の特定ははるかに長いプロセスであり、数年である。

【0171】

医薬組成物
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）本明細書に開示されるような核酸配列、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。また、本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）本明細書に開示されるようなバクテリオファージ、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。明細書にさらに開示されるのは、特定の実施形態において、（ａ）本明細書に開示されるような組成物、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。

【0172】

いくつかの実施形態において、本開示は、細菌、古細菌感染症を治療するために、または領域を消毒するための、医薬組成物およびそれを投与する方法を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に上記で論じられた試薬のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物または方法は、尿路感染症（ＵＴＩ）および／または炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ））を治療する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物または方法は、クローン病を治療する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬組成物または方法は、潰瘍性大腸炎を治療する。

【0173】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、薬剤、医薬剤、担体、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含む。

【0174】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、適切な方法に従って、医薬担体中での投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、本開示による医薬組成物の製造において、バクテリオファージは、とりわけ、許容可能な担体と混合される。いくつかの実施形態において、担体は、固体（粉末を含む）または液体、あるいはそれらの両方であり、好ましくは、単位用量組成物として製剤化される。いくつかの実施形態において、１つ以上のバクテリオファージは、薬学の任意の適切な方法によって調製される、本明細書に開示される組成物に組み込まれる。

【0175】

いくつかの実施形態において、対象をインビボで治療する方法であって、本明細書に開示されるバクテリオファージを含む医薬組成物を薬学的に許容される担体中で投与することを含み、医薬組成物は治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージの必要とするヒト対象または動物へのその投与は、当該技術分野で知られている任意の手段による。

【0176】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、経口投与用である。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、カプセル、錠剤、および散剤などの固体剤形、またはエリキシル、シロップ、および懸濁液などの液体剤形で投与される。いくつかの実施形態において、口腔（舌下）投与に適した組成物および方法は、フレーバーベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中にバクテリオファージを含むロゼンジ、ならびに、ゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアカシアなどの不活性塩基にバクテリオファージを含むトローチを含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、バクテリオファージの滅菌水性および非水性注射溶液を含む非経口投与に適している。いくつかの実施形態において、これらの調製物は、意図されたレシピエントの血液と等張である。いくつかの実施形態において、これらの調製物は、組成物を、意図されたレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および溶質を含む。いくつかの実施形態において、水性および非水性の滅菌懸濁液は、懸濁剤および増粘剤を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルに提示され、例えば、使用直前に注射用の生理食塩水または水滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存される。

【0178】

いくつかの実施形態において、直腸投与に適した方法および組成物は、単位用量坐剤として提示される。いくつかの実施形態において、これらは、バクテリオファージを１つ以上の従来の固体担体、例えば、カカオバターと混合し、次いで、得られた混合物を成形することによって調製される。いくつかの実施形態において、皮膚への局所適用に適した方法および組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形態である。いくつかの実施形態において、使用される担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤、およびそれらの２つ以上の組み合わせが含まれる。

【0179】

いくつかの実施形態において、経皮投与に適した方法および組成物は、レシピエントの表皮と長期間密接に接触したままであるように適合された別個のパッチとして提示される。

【0180】

いくつかの実施形態において、対象の鼻投与に適した、または他の方法で肺に投与される方法および組成物は、例えば、対象が吸入するバクテリオファージ組成物を含む呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁液によって投与される任意の適切な手段を含む。いくつかの実施形態において、呼吸可能な粒子は液体または固体である。本明細書で使用される場合、「エアロゾル」は、細気管支または鼻腔に吸入することができる任意のガス媒介懸濁相を含む。いくつかの実施形態において、液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段によって生成される。いくつかの実施形態において、組成物を含む固体粒子のエアロゾルは、製薬分野で知られている技術によって、任意の固体粒子状薬剤エアロゾル発生器で生成される。

【0181】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージを物体または対象の表面に投与するために適した方法および組成物は、水溶液を含む。いくつかの実施形態において、そのような水溶液は、物体または対象の表面に噴霧される。いくつかの実施形態において、水溶液を使用して、細菌を含む異物の破片を形成する対象の物理的創傷を洗浄および清浄にする。

【0182】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるバクテリオファージは、治療上有効な量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される少なくとも１つのバクテリオファージ組成物は、医薬製剤として製剤化される。いくつかの実施形態において、製剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のバクテリオファージを含む。本明細書に開示される。いくつかの場合において、医薬製剤は、本明細書に記載のバクテリオファージと、賦形剤、希釈剤、または担体のうちの少なくとも１つを含む。

【0183】

いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤を含む。賦形剤は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（１９８６）に記載されており、これらには、溶媒、分散媒体、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、が含まれるが、これらに限定されない。薬剤、保存剤、固体結合剤、および潤滑剤が挙げられるがこれらに限定されない。

【0184】

適切な賦形剤の非限定的な例には、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、キレート剤、分散促進剤、崩壊剤、香味剤、甘味料、着色剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0185】

いくつかの実施形態において、賦形剤は、緩衝剤である。適切な緩衝剤の非限定的な例には、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および重炭酸カルシウムが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、以下の列挙された任意の１つ以上の緩衝剤を含む：重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、および他のカルシウム塩。

【0186】

いくつかの実施形態において、賦形剤は保存剤である。適切な保存剤の非限定的な例には、アルファ－トコフェロールおよびアスコルビン酸塩などの抗酸化剤、ならびにパラベン、クロロブタノール、およびフェノールなどの抗菌剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗酸化剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、ｐ－アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノールおよびＮ－アセチルシステインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、保存剤は、バリダマイシンＡ、ＴＬ－３、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、Ｎ－ａ－トシル－Ｐｈｅ－クロロメチルケトン、Ｎ－ａ－トシル－Ｌｙｓ－クロロメチルケトン、アプロチニン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ジイソプロピルフルオロホスフェート、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤を含む。

【0187】

いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤として結合剤を含む。適切な結合剤の非限定的な例には、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ_１２－Ｃ_１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖類、およびそれらの組み合わせが含まれる。

【0188】

いくつかの実施形態において、製剤に使用される結合剤は、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、コムギデンプンなどのデンプン；ショ糖、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリンなどの糖；天然および合成ガム；ゼラチン；微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロースなどのセルロース誘導体。ポリビニルピロリドン（ポビドン）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；ソルビトール、キシリトール、マンニトールなどのアルコール、および水またはそれらの組み合わせから選択される。

【0189】

いくつかの実施形態において、医薬製剤は、賦形剤として潤滑剤を含む。適切な潤滑剤の非限定的な例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水素化植物油、ステロテックス（ｓｔｅｒｏｔｅｘ）、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽質鉱物油が含まれる。いくつかの実施形態において、医薬製剤中にある潤滑剤は、金属ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウムなど）、脂肪酸エステル（ステアリルフマル酸ナトリウムなど）、脂肪酸（ステアリン酸など）、脂肪アルコール、ベヘン酸グリセリル、ミネラルオイル、パラフィン、水素化植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属ラウリル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムなど）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、タルクまたはそれらの組み合わせから選択される。

【0190】

いくつかの実施形態において、賦形剤は、香味料を含む。いくつかの実施形態において、香味料は、天然油植物、葉、花、および果物からの抽出物、ならびにそれらの組み合わせを含む。

【0191】

いくつかの実施形態において、賦形剤は甘味料を含む。適切な甘味料の非限定的な例には、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、およびそれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリンおよびナトリウム塩などのそのさまざまな塩；アスパルテームなどのジペプチド甘味料；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（ステビオシド）；スクラロースなどのスクロースのクロロ誘導体；ならびにソルビトール、マンニトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）などの糖アルコールが含まれる。

【0192】

いくつかの場合において、医薬製剤は着色剤を含む。適切な着色剤の非限定的な例には、食品、薬物および化粧品の色（ＦＤ＆Ｃ）、薬物および化粧品の色（Ｄ＆Ｃ）、および外部の薬物および化粧品の色（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が含まれる。

【0193】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される医薬製剤は、キレート剤を含む。いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの二ナトリウム塩、三ナトリウム塩、四ナトリウム塩、二カリウム塩、三カリウム塩、二リチウム塩および二アンモニウム塩；ＥＤＴＡのバリウム、カルシウム、コバルト、銅、ジスプロシウム、ユーロピウム、鉄、インジウム、ランタン、マグネシウム、マンガン、ニッケル、サマリウム、ストロンチウム、または亜鉛のキレートを含む。

【0194】

いくつかの場合において、医薬製剤は希釈剤を含む。希釈剤の非限定的な例には、水、グリセロール、メタノール、エタノール、および他の同様の生体適合性希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態において、希釈剤は、酢酸、クエン酸、マレイン酸、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸、または同様のものなどの水性酸である。

【0195】

いくつかの実施形態において、医薬製剤は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ドキュセートナトリウム、四級アンモニウム化合物、Ｌ－ロイシンなどのアミノ酸、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のグリセリド、またはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。

【0196】

いくつかの場合において、医薬製剤は追加の薬剤を含む。いくつかの実施形態において、追加の医薬製剤は抗生物質である。いくつかの実施形態において、抗生物質は、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン（第１、第２、第３、第４および第５世代セファロスポリンを含む）、リンコサミド、マクロライド、モノバクタム、ニトロフラン、キノロン、ペニシリン、スルホンアミド、ポリペプチドまたはテトラサイクリンからなる群のものである。

【0197】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシンまたはパロモマイシンなどのアミノグリコシドである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、ゲルダナマイシンまたはハービマイシンなどのアンサマイシンである。

【0198】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、ロラカルベフなどのカルバセフェムである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチンまたはメロペネムなどのカルバペネムである。

【0199】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチンもしくはセファロチンなどのセファロスポリン（第１世代）、またはセファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジルもしくはセフロキシムなどのセファロスポリン（第２世代）である。いくつかの実施形態において、抗生物質は、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフチゾキシムおよびセフトリアキソンなどのセファロスポリン（第３世代）、またはセフェピムもしくはセフトビプロールなどのセファロスポリン（第４世代）である。

【0200】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、クリンダマイシンおよびアジスロマイシンなどのリンコサミド、またはアジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシンおよびスペクチノマイシンなどのマクロライドである。

【0201】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、アズトレオナムなどのモノバクタム、またはフラゾリドンまたはニトロフラントインなどのニトロフランである。

【0202】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧまたはＶ、ピペラシリン、テモシリンおよびチカールなどのペニシリンである。

【0203】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、マフェニド、スルホナミドクリソイジン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム、またはトリメトプリム－スルファメトキサゾール（コ－トリモキサゾール）（ＴＭＰ－ＳＭＸ）などのスルホンアミドである。

【0204】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗生物質は、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンなどのキノロンである。

【0205】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、バシトラシン、コリスチンまたはポリミキシンＢなどのポリペプチドである。

【0206】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗生物質は、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはオキシテトラサイクリンなどのテトラサイクリンである。

【0207】

番号付きの実施形態
番号付きの実施形態１は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２は、ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、実施形態１のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態３は、少なくとも１つのリピート配列がその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される、実施形態２のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態４は、スペーサー配列が標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、実施形態１－３のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態５は、標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、実施形態１－４のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態６は、標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、実施形態１－５のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態７は、標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、実施形態１－６のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態８は、標的ヌクレオチド配列が必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、実施形態１－７のバクテリオファージを含む。番号付けされた実施形態９は、必須遺伝子がＴｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである、実施形態１－８のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０は、カスケードポリペプチドがＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケード複合体を形成する、実施形態１－９のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１は、カスケード複合体が以下を含む、実施形態１－１０のいずれか１つのバクテリオファージを含む：（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を持たないＣａｓ３’’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム；（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）。番号付きの実施形態１２は、Ｃａｓ複合体が、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む、実施形態１－１１のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１３は、核酸配列はプロモーター配列をさらに含む、実施形態１－１２のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１４は、標的細菌がバクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される、実施形態１－１３のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１５は、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、実施形態１－１４のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１６は、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、実施形態１－１５のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１７は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、実施形態１－１６のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１８は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性がバクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、実施形態１－１７のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１９は、バクテリオファージの溶菌活性およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、実施形態１－１８のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２０は、バクテリオファージの溶菌活性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方がバクテリオファージの濃度によって調節される、実施形態１－１９のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２１は、バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、実施形態１－２０のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２２は、実施形態１－２１のいずれか１つのバクテリオファージを含み、標的細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびそれらの任意の組み合わせである。番号付きの実施形態２３は、バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、実施形態１－２２のいずれか一項に記載のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２４は、バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性バクテリオファージである、実施形態１－２３のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２５は、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶原性バクテリオファージが溶菌性にされる、実施形態１－２４のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２６は、バクテリオファージがｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、実施形態１－２５のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２７は、核酸配列が必須でないバクテリオファージ遺伝子に挿入されている、実施形態１－２６のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態２８は、（ａ）実施形態１－２７のいずれか１つのバクテリオファージ。（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。番号付きの実施形態２９は、医薬組成物が錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、実施形態１－２８の医薬組成物を含む。番号付きの実施形態３０は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを、標的細菌に導入する工程を含む、標的細菌を殺傷する方法を含む。番号付きの実施形態３１は、ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、実施形態１－３０の方法を含む。番号付きの実施形態３２は、少なくとも１つのリピート配列がその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される、実施形態１－３１の方法を含む。番号付きの実施形態３３は、スペーサー配列が標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、実施形態１－３２のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態３４は、標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、実施形態１－３３の方法を含む。番号付きの実施形態３５は、標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、実施形態１－３４の方法を含む。番号付きの実施形態３６は、標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、実施形態１－３５の方法を含む。番号付きの実施形態３７は、標的ヌクレオチド配列が、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、実施形態１－３６の方法を含む。番号付きの実施形態３８は、必須遺伝子がＴｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである実施形態１－３７の方法を含む。番号付きの実施形態３９は、カスケードポリペプチドがＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケード複合体を形成する、実施形態１－３８のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態４０は、カスケード複合体が以下を含む、実施形態１－３９のいずれか１つの方法を含む：（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’ ’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５
ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）。（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）。番号付きの実施形態４１は、カスケード複合体が、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む、実施形態１－４０の方法を含む。番号付きの実施形態４２は、核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、実施形態１－４１のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態４３は、標的細菌が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、実施形態１－４２のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態４４は、標的細菌が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、実施形態１－４３のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態４５は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、実施形態１－４３のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態４６は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性がバクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、実施形態１－４５のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態４７は、バクテリオファージの溶菌活性およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、実施形態１－４６のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態４８は、バクテリオファージの溶菌活性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方がバクテリオファージの濃度によって調節される、実施形態１－４７のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態４９は、バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、実施形態１－４８のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態５０は、標的細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、実施形態１－１９のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態５１は、バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、請求項３０－５０のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態５２は、バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性バクテリオファージである、実施形態１－５１のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態５３は、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶原性バクテリオファージが溶菌性にされる、実施形態１－５２の方法を含む。番号付きの実施形態５４は、バクテリオファージがｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、実施形態１－５３のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態５５は、核酸配列が、必須でないバクテリオファージ遺伝子の代わりにまたは隣接して挿入される、実施形態１－５４のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態５６は、細菌細胞の混合集団が標的細菌を含む、実施形態１－５５のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態５７は、必要とする個体の疾患を治療する方法を含み、この方法は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）カスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを個体に投与する工程を含む。番号付きの実施形態５８は、ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、実施形態１－５７の方法を含む。番号付きの実施形態５９は、少なくとも１つのリピート配列がその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される、実施形態１－５８の方法を含む。番号付きの実施形態６０は、スペーサー配列が標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、実施形態１－５９のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態６１は、標的ヌクレオチド配列がコード配列を含む、実施形態１－６０の方法を含む。番号付きの実施形態６２は、標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、実施形態１－６１の方法を含む。番号付きの実施形態６３は、標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、実施形態１－６２の方法を含む。番号付きの実施形態６４は、標的ヌクレオチド配列が、必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、実施形態１－６３の方法を含む。番号付きの実施形態６５は、必須遺伝子がＴｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである実施形態１－６４の方法を含む。番号付きの実施形態６６は、カスケード複合体が、Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、またはＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのカスケードポリペプチドを含む、実施形態１－６５のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態６７は、カスケード複合体が以下を含む、実施形態１－６６のいずれか１つの方法を含む：（ｉ）Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ８ａ１ポリペプチドまたはＣａｓ８ａ２ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、Ｃｓａ５ポリペプチド、Ｃａｓ６ａポリペプチド、Ｃａｓ３’ポリペプチド、およびヌクレアーゼ活性を有さないＣａｓ３’ ’ポリペプチド（Ｉ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｉ）Ｃａｓ６ｂポリペプチド、Ｃａｓ８ｂポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、およびＣａｓ５ポリペプチド（Ｉ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｉｉ）Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｉｖ）Ｃａｓ１０ｄポリペプチド、Ｃｓｃ２ポリペプチド、Ｃｓｃ１ポリペプチド、Ｃａｓ６ｄポリペプチド（Ｉ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｖ）Ｃｓｅ１ポリペプチド、Ｃｓｅ２ポリペプチド、Ｃａｓ７ポリペプチド、Ｃａｓ５ポリペプチド、およびＣａｓ６ｅポリペプチド（Ｉ－Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）；（ｖｉ）Ｃｓｙ１ポリペプチド、Ｃｓｙ２ポリペプチド、Ｃｓｙ３ポリペプチド、およびＣｓｙ４ポリペプチド（Ｉ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）。番号付きの実施形態６８は、カスケード複合体が、Ｃａｓ５ｄポリペプチド、Ｃａｓ８ｃポリペプチド、およびＣａｓ７ポリペプチド（Ｉ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム）を含む、実施形態１－６７の方法を含む。番号付きの実施形態６９は、核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、実施形態１－６８のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７０は、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、実施形態１－６９のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７１は、標的細菌が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、実施形態１－７０のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７２は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、実施形態１－７１のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７３は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性がバクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、実施形態１－７２のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７４は、バクテリオファージの溶菌活性およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、実施形態１－７３のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７５は、バクテリオファージの溶菌活性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方がバクテリオファージの濃度によって調節される、実施形態１－７４のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態７６は、バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、実施形態１－７５のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態７７は、バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、実施形態１－７６のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７８は、バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである、実施形態１－７７のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態７９は、溶原性バクテリオファージが、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶菌性にされる、実施形態１－７８の方法を含む。番号付きの実施形態８０は、バクテリオファージがｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、実施形態１－７９のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態８１は、核酸配列が必須でないバクテリオファージ遺伝子の代わりに、または隣接して挿入される、実施形態１－８０のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態８２は、疾患が細菌感染
症である、実施形態１－８１のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態８３は、疾患を引き起こす標的細菌が、少なくとも１つの抗生物質に耐性である薬剤耐性細菌である、実施形態１－８２のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態８４は、薬剤耐性細菌が少なくとも１つの抗生物質に耐性である、実施形態１－８３の方法を含む。番号付きの実施形態８５は、疾患を引き起こす標的細菌が多剤耐性細菌である、実施形態１－８４のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態８６は、多剤耐性細菌が少なくとも１種の抗生物質に耐性である、実施形態１－８５の方法を含む。番号付きの実施形態８７は、抗生物質がセファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、コリスチン、アミノグリコシド、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはメチシリンを含む、実施形態１－８６のいずれか１つに記載の方法を含む。番号付きの実施形態８８は、細菌感染を引き起こす標的細菌が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、番号付きの実施形態８９は、疾患を引き起こす標的細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである、実施形態１－８８の方法を含む。番号付きの実施形態９０は、疾患を引き起こす標的細菌がＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである、実施形態１－８９の方法を含む。番号付きの実施形態９１は、投与が、動脈内、静脈内、尿道内、筋肉内、経口、皮下、吸入、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態１－９０のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態９２は、個体が哺乳動物である、実施形態１－９１のいずれか１つの方法を含む。番号付きの実施形態９３は、実施形態１－９２のバクテリオファージを含み、バクテリオファージは、以下を含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含む：（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｂ）Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｃおよびＣａｓ７を含むカスケードポリペプチド、および（ｃ）Ｃａｓ３ポリペプチド。番号付きの実施形態９４は、ＣＲＩＳＰＲアレイがスペーサー配列および少なくとも１つのリピート配列を含む、実施形態１－９３のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態９５は、少なくとも１つのリピート配列がその５’末端またはその３’末端のいずれかでスペーサー配列に作動可能に連結される、実施形態１－９４のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態９６は、スペーサー配列が標的細菌中の標的ヌクレオチド配列に相補的である、実施形態１－９５のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態９７は、実施形態１－９６のバクテリオファージを含み、ここで、標的ヌクレオチド配列は、コード配列を含む。番号付きの実施形態９８は、標的ヌクレオチド配列が非コード配列または遺伝子間配列を含む、実施形態１－９７のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態９９は、標的ヌクレオチド配列がプロモーター配列の全部または一部を含む、実施形態１－９８のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１００は、標的ヌクレオチド配列が必須遺伝子の転写領域のコード鎖上に位置するヌクレオチド配列の全部または一部を含む、実施形態１－９９のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０１は、必須遺伝子がＴｓｆ、ａｃｐＰ、ｇａｐＡ、ｉｎｆＡ、ｓｅｃＹ、ｃｓｒＡ、ｔｒｍＤ、ｆｔｓＡ、ｆｕｓＡ、ｇｌｙＱ、ｅｎｏ、ｎｕｓＧ、ｄｎａＡ、ｄｎａＳ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＢ、ｇｌｔＸ、ｈｉｓＳ、ｒｐｌＣ、ａｓｐＳ、ｇｙｒＢ、ｇｌｎＳ、ｄｎａＥ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｐｈｅＴ、ｉｎｆＢ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＦ、ａｌａＳ、ｌｅｕＳ、ｓｅｒＳ、ｒｐｌＤ、ｇｙｒＡ、またはｍｅｔＫである、実施形態１－１００のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０２は、核酸配列がプロモーター配列をさらに含む、実施形態１－１０１のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０３は、標的細菌がバクテリオファージの溶菌活性によってのみ殺傷される、実施形態１－１０２のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０４は、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によってのみ殺傷される、実施形態１－１０３のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０５は、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性と組み合わせたバクテリオファージの溶菌活性によって殺傷される、実施形態１－１０４のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０６は、バクテリオファージの溶菌活性とは無関係に、標的細菌がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性によって殺傷される、実施形態１－１０５のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０７は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性がバクテリオファージの溶菌活性を補足または増強する、実施形態１－１０６のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０８は、バクテリオファージの溶菌活性およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性が相乗的である、実施形態１－１０７のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１０９は、バクテリオファージの溶菌活性、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの活性、またはそれらの両方がバクテリオファージの濃度によって調節される、実施形態１－１０８のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１０は、バクテリオファージが複数の細菌系統に感染する、実施形態１－１０９のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１１は、実施形態１－１１０のいずれか１つのバクテリオファージを含み、標的細菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ複合体、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｔｉｕｍ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍグループＧ２、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、非結核性ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、およびこれらの任意の組み合わせである、番号付きの実施形態１１２は、バクテリオファージが偏性溶菌性バクテリオファージである、実施形態１－１１１のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１３は、バクテリオファージが溶菌性にされる溶原性（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）バクテリオファージである、実施形態１－１１２のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１４は、溶原性遺伝子の除去、置き換え、または不活性化によって溶原性バクテリオファージが溶菌性にされる、実施形態１－１１３のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１５は、バクテリオファージがｐ１７７２、ｐ２１３１、ｐ２１３２、ｐ２９７３、ｐ４２０９、ｐ１１０６、ｐ１５８７、ｐ１８３５、ｐ２０３７、ｐ２４２１、ｐ２３６３、ｐ４２０９、ｐ００４ｋ、またはＰＢ１である、実施形態１－１１４のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１６は、核酸配列が、必須でないバクテリオファージ遺伝子に挿入される、実施形態１－１１５のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１１７は、（ａ）実施形態１－１１６のいずれか１つのバクテリオファージ、および（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。番号付きの実施形態１１８は、錠剤、液体、シロップ、経口製剤、静脈内製剤、鼻腔内製剤、眼製剤、耳製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、およびそれらの任意の組み合わせの形態である、実施形態１１７の医薬組成物を含む。番号付きの実施形態１１９は、必要とする表面を消毒する方法を含み、この方法は、（ｄ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｅ）カスケードポリペプチド、および（ｆ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含む、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを表面に投与する工程を含み、ここで、バクテリオファージは、実施形態１－１１８のいずれか１つのバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１２０は、表面が病院の表面、車両の表面、機器の表面、または工業用表面である、実施形態１１９の方法を含む。番号付きの実施形態１２１は、食品または栄養補助食品の汚染を防止する方法を含み、この方法は、食品または栄養補助食品に、（ｇ）ＣＲＩＳＰＲアレイ、（ｈ）カスケードポリペプチド、および（ｉ）Ｃａｓ３ポリペプチドを含むＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸配列を含むバクテリオファージを投与する工程を含み、バクテリオファージは実施形態１－１２０のバクテリオファージを含む。番号付きの実施形態１２２は、食品また
は栄養補助食品が、ミルク、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、アイスクリーム、発酵シリアルベースの製品、ミルクベースの粉末、乳児用調合乳または錠剤、液体懸濁液、乾燥経口サプリメント、湿式経口サプリメント、または乾燥経管栄養給餌を含む、実施形態１１２の方法を含む。

【実施例】

【0208】

実施例１：本願において使用される操作されたファージ
バクテリオファージは、ｃｒアレイおよびＣａｓ構築物を含むように設計した。表１Ａは、以下の応用において使用されるファージの成分を示す。表１Ｂは、ｃｒアレイとＣａｓプロモーターの両方の発現を駆動するように使用されるプロモーターの配列を示す。表１Ｃは、特定の部位を標的とするために使用されるｃｒアレイのスペーサー配列の配列を示す。さらに、図１Ａ－１Ｄは、以下の実施例で使用されるｃｒアレイ２－ｃｒアレイ５の配列およびアラインメントを示す。ｃｒアレイ３とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＩ型ＣＣＲＩＳＰＲ挿入物を組み合わせた完全な配列を図１Ｅおよび表１Ｄに示す。

【0209】

【表1】

【0210】

実施例２：外因性ＣａｓオペロンおよびｃｒＲＮＡスペーサーは細菌を殺傷した。
機能的なＩ－Ｃ型Ｃａｓオペロンを有するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統を、ＣａｓのみまたはｃｒＲＮＡを含むプラスミドで形質転換した。内因性のＩ－Ｃ型Ｃａｓシステムの存在下では、ｃｒＲＮＡの発現は、細菌を自己標的化して自身のＤＮＡを分解させる。形質転換体の数は、プラスミドに特異的な抗生物質選択を用いて寒天プレート上で増殖するコロニーの数を計数することによって決定した。コロニーを形成できる唯一の細菌は、プラスミドを獲得し、自己標的化を生き残る細菌である。これらのデータは、図２Ａに示すように、外因性Ｃａｓ発現が内因性システムよりも自己標的化を改善し、内因性システムが存在しない場合に機能することを示す。上の２つのパネルは、Ｃａｓのみのプラスミド、単一の標的化スペーサーを含むプラスミド、または３スペーサー標的化アレイを含むプラスミドを、内因性のＩ－Ｃ型Ｃａｓシステムを含む系統に形質転換した結果を示す。この実験設定では、個々のスペーサーまたはアレイが内因性のＣａｓシステムと作用し、ほとんどの形質転換体を殺傷するのに十分であった。下のパネルは、外因性のＩ－Ｃ型ＣａｓオペロンをｃｒＲＮＡプラスミドに追加すると、形質転換に際しての殺傷がさらに促進され、存在する細菌のレベルが検出レベルを下回っていることを示す。

【0211】

プラスミドを、機能的なＩ－Ｃ型Ｃａｓオペロンを含まないＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統に形質転換した。形質転換されたプラスミドは、スペーサーアレイのみ、またはスペーサーアレイとＩ－Ｃ型Ｃａｓオペロンのいずれかを発現した。図２Ｂは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂ１１２１系統のＣａｓオペロンヌル変異体への形質転換１ｍＬあたりに得られた細菌形質転換体の数を示す。アレイ１は細菌を標的とし、一方アレイ２は非標的対照である。異なるプラスミドは、モル濃度によって空のベクター対照プラスミドに対して正規化された。細胞をＣａｓと標的化アレイ１の両方で形質転換した場合、検出された形質転換体の数が減少した。標的化アレイ１のみ、またはＣａｓと非標的化アレイ２でトランスフェクトされた細胞は、空のベクターを受容した形質転換体の数と比較した場合、形質転換体の数の減少を示さなかった。

【0212】

個々のスペーサーまたは固有のアレイを含むプラスミドを、内因性Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムを有するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２１、または同じ系統のＣａｓオペロンヌルバリアントに形質転換した。細胞死はｂ１１２１トランスフェクト細胞で観察されたが、Ｃａｓオペロンヌル変異体では観察されなかった。これらのデータは、図２Ｃに示すように、ｒｐｏＢとｆｔｓＡ、ならびにアレイ３およびアレイ４を標的とする個々のスペーサーが、内因性のＩ－Ｃ型Ｃａｓシステムと連携して細胞を殺傷することができることを示す。

【0213】

実施例３：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ完全構築物で操作されたファージの安定性
図３Ａは、野生型ファージｐ１７７２およびその操作されたバリアントのゲノムの概略図を示す。ゲノム軸の下のバーは、削除および置き換えされたゲノムの領域を示す。ファージゲノムの下の概略図は、削除された領域のＷＴファージ遺伝子を置き換えるために使用されたＤＮＡを図示する。ＣＲＩＳＰＲアレイｃｒアレイ１、ｃｒアレイ３、およびｃｒアレイ４は細菌を標的とし、活性Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムの存在下で細菌を殺傷することが期待される。ｃｒアレイ２は非標的化スペーサーから作られているが、構造的には３つの標的化アレイと同じであり、Ｉ型Ｃａｓ特異的自己標的化活性を示すための対照として機能する。

【0214】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３構築物を保有するファージを連続的に継代して、ファージゲノムに含まれるリピートの安定性を評価した。ｐ１７７２ｅ００５は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統ｂ１１２６（Ｉ－Ｆ型系統）で連続増幅された。増幅１－８は、１工程の増幅として実行され、ここでは、５０μＬの細菌の一晩培養物を１５ｍＬのファルコンチューブ内の５ｍＬのＬＢに添加し、続いて１μＬの以前の溶解物を直ちに添加した。混合物は、振とうインキュベーター内で３７℃にて１０－１６時間増殖させた。インキュベーション後、ファージと細菌の混合物を５，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離し、上清を０．４５μｍシリンジフィルターでろ過し、４℃で保存した。増幅９では、増幅８の連続１０倍希釈液を、ｂ１１２１系統またはｂ１１２６系統の軟寒天オーバーレイにスポットした。各プレートからの単一のプラークをピペットで拾い上げて２００μＬのＰＢＳに取り、増幅９を得た。１０マイクロリットルの増幅９を、５０μＬのｂ１１２１またはｂ１１２６に一晩添加し、５ｍＬのＬＢに加え、約１６時間増殖させた後、遠心分離およびろ過を行った。サンガー配列決定のために、操作部位に隣接するプライマーを使用して溶解物からＰＣＲによってファージＤＮＡを増幅した。サンガー法およびＮＧＳ法は、ファージゲノムにロードした場合のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３構築物の安定性および完全性を確認した（図３Ｂを参照）。

【0215】

実施例４．ＣＲＩＳＰＲ構築物を使用したバクテリオファージの形態
１．５ｍＬの粗溶菌物を４℃および２４，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清の一部（約１．４ｍＬ）を穏やかに廃棄し、残りの溶解物に１ｍＬの酢酸アンモニウム（０．１Ｍ、ｐＨ ７．５）を加え、遠心分離した。この工程は２回実行した。洗浄されたファージサンプルは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法によって可視化された。グロー放電されたｆｏｒｍｖａｒ／カーボンコーティングされた４００メッシュの銅グリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）を２５μＬのサンプル懸濁液の液滴に５分間浮かせ、２滴の脱イオン水にすばやく移し、続いて、２％酢酸ウラニル水溶液の液滴を３０秒間染色する。グリッドを濾紙でブロットし、風乾した。サンプルは、８０ｋＶで動作するＪＥＯＬ ＪＥＭ－１２３０透過型電子顕微鏡を使用して観察され、画像は、Ｇａｔａｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｕｉｔｅ３．０ソフトウェアを備えたＧａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ ＳＣ１０００ ＣＣＤカメラを使用して撮影された。結果を図４に例示する。改変後のファージ形態に明らかな観察可能な変化はなかった。

【0216】

実施例５．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ完全構築物で操作されたファージの増幅
ｐ１７７２ｗｔ（野生型）および操作されたバリアントｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）およびｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を、感染多重度（ＭＯＩ）１で指数関数的に増殖するｂ１１２６の培養物と混合した。感染後０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、７時間１０分、および２４時間後に、プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）の列挙（図５Ａ－５Ｂ）ならびにＲＮＡの単離および定量化のためにサンプルを収集した。ＰＦＵの列挙のために、各時点で収集されたサンプルを０．４５μｍフィルターでろ過して、ファージを宿主細菌から分離した。スライド３に記載したように、軟寒天オーバーレイを調製した。ファージサンプルの１０倍段階希釈液をオーバーレイにスポットし、３７℃でインキュベートした。翌日、プラークをカウントし、最初のサンプルのＰＦＵ／ｍＬを計算するために使用した。これらのデータに基づくと、ファージ増殖パターンに有意差は観察されず、各ファージは同様の最大力価に達した。

【0217】

ｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００４、およびｐ１７７２ｅ００５を１ｅ６の粒子数に希釈し、個々のファージを使用して、０．０１のＭＯＩで３４の異なる細菌のパネルに感染させた。６００ｎｍの波長での光学密度（ＯＤ）の読み取り値は、２０時間の時間経過にわたって１時間ごとにキャプチャされた。得られたＯＤ読み取り値を使用して、３つのファージのうちの１つの存在下で細菌増殖曲線を生成した。積分を使用して、各増殖曲線についての曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、ここで、ファージ添加に際してＡＵＣが小さいほど、細菌負荷が減少していることを示す。宿主範囲は、培養物のＯＤ６００（濁度）を経時的に監視して、グラフの下部に示される導入ファージの開始量（１ミリリットルあたりのプラーク形成単位での入力ファージ力価）で細菌増殖曲線を取得することによって決定した。ファージの存在下と非存在下で、特定の系統のＡＵＣを比較した。図５Ｃは、ファージの存在下での系統成長のＡＵＣ計算を、ファージの非存在下での系統成長のＡＵＣで除算した、ＡＵＣ比を例示する。各行は、固有の細菌系統を表す。ヒートマップの値が暗いほど、細菌負荷が大幅に減少していることを示す。（ファージの存在下でのＡＵＣ）／（ファージの非存在下でのＡＵＣ）が０．６５未満の場合、ファージは所与の系統に感染すると見なされた。ＡＵＣ比のヒートマップは、操作されたファージバリアントがこのアッセイで野生型の親に匹敵する宿主範囲を有していたことを示す。ｐ１７７２ｗｔ、ｐ１７７２ｅ００４、およびｐ１７７２ｅ００５の宿主範囲は互いに類似しており、アッセイの誤差の範囲内であった。プラークによるＡＵＣヒットの宿主範囲確認は、ＷＴとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３の間に違いがないことを示す。

【0218】

表２は、２つの独特な完全構築物を含む操作されたファージｐＡｒｒａｙ３（ｐアレイ３）（ｃｒアレイ３＋Ｃａｓシステムを標的とする）およびｐＡｒｒａｙ４（ｐアレイ４）（ｃｒアレイ４＋Ｃａｓシステムを標的とする）の代表的な増殖実験からのデータを示す。このアッセイでは、ＬＢ増殖培地に細菌の単一コロニーを接種すること、および「入力ＰＦＵ／ｍＬ」列に示されるようにファージを添加することにより、増幅を行った。増幅を一晩インキュベートした。インキュベーション後、細菌を濾過により除去し、溶菌物中のファージ力価を軟寒天オーバーレイ法により定量化した。溶解物の力価は「出力ＰＦＵ／ｍＬ」の列に示される。これらのデータは、操作されたファージが効果的に複製されたことを示す。これらのデータは、タイトレーションアッセイの相対的な精度も示す。

【0219】

【表2】

【0220】

実施例６．操作されたファージにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの発現
この実施例は、Ｃａｓシステムおよびｃｒアレイがファージゲノムから首尾よく発現されたことを示す。図６Ａは、ｐ１７７２および本明細書に記載の他のファージに操作されたスペーサーアレイ（ｃｒアレイ）およびＣａｓオペロンの配置を示す。矢印は、遺伝子発現の定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析に使用されるプライマー対の結合位置を表す。

【0221】

Ｃａｓオペロンを含まないｐ１７７２ｗｔ（野生型）を対照として使用した。ＲＮＡ単離のために、各時点で収集されたサンプルをＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔに直接追加した。サンプルを室温で５分間インキュベートし、５０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットは－８０℃で保存した。次に、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡを単離した。ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＢｉｏＲａｄ ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して実行された。すべてのデータは、２つの生物学的複製の平均であった。倍率変化は２^{－ΔΔＣｔ}であり、ハウスキーピング遺伝子としてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ遺伝子ｒｐｓＨを使用し、各データポイントを同じ時点で対照のみの細胞と比較した。

【0222】

図６Ｂ－６Ｄは、ファージｐ１７７２の異なるバリアントによるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統の感染後の示されたＲＮＡの相対的発現レベルを示す。これらのグラフのデータは、ファージが存在しないビヒクル対照と比較した発現の倍数変化として表されている。各時点は、その時点の感染していない対照に対して正規化した。細菌のハウスキーピング遺伝子ｒｐｓＨを使用してサンプルを正規化することにより、細菌濃度の変化を説明した。これらのデータは、ファージがＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに感染している間にｃｒアレイ、Ｃａｓ３、およびＣａｓ８ｃ転写物を生成することを示す。パネルＢ－Ｄで使用された細菌宿主は内因性Ｃａｓオペロンを含んでいたため、ｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）とｐ１７７２ｗｔの間の違いは、内因性発現を超えたファージを介した発現の増加を表す。

【0223】

図６Ｅは、異なる操作されたファージゲノムからのｃａｓ３ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。これらのデータは、感染後１時間で、他の２つの操作されたファージ、ｐ２１３１ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）およびｐ２１３２ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）よりもｐ１７７２ｅ００５からのｃａｓ３発現が多いことを示す。しかし、感染後２４時間で、ファージはほぼ同じ量のｃａｓ３を発現した。これらのデータは、ｃａｓ３ ＲＮＡの発現をファージｇＤＮＡの量と比較すること、および感染後１時間でｐ１７７２ｅ００５に正規化することによって計算された。これらのアッセイで使用された細菌系統はＣａｓヌルであったため、内因性ｃａｓ３発現による寄与は存在しない。

【0224】

実施例７．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ完全構築物で操作した場合のファージ溶菌活性
上部寒天オーバーレイは、ｐ１７７２インジケーター系統ｂ１１２１の飽和一晩培養物１００μＬを、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有するＬＢ中の６ｍＬの０．３７５％寒天と混合することによって調製した。上部寒天が固化した後、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）とｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）およびｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）の連続１０倍希釈系列の２μＬ液滴を上部寒天の表面にスポットした。プレートを３７℃で約１８時間インキュベートし、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８００顕微鏡を使用して４倍および１０倍の倍率で画像化した。図７は、ｐ１７７２ファージの改善されたプラーク形態を図示する。野生型ファージの形態は、かすんでいるプラークを生成することが観察されたが、操作されたバリアントｐ１７７２ｅ００５は、かすんでいるハローを有するが中央が透明である同様のサイズのプラークを生成した。このデータは、ｐ１７７２ｅ００５がｐ１７７２ｗｔよりも完全に細菌を殺傷したことを示唆する。

【0225】

実施例８：ｃｒアレイおよびＣａｓオペロンを含むファージは、ｃｒアレイのみを含むファージよりも細菌を殺傷するのに効果的であった
ｐ１７７２野生型および操作されたファージは、対数増殖において細菌と混合され、ＬＢ寒天上の２μｌのスポットで直ちにプレーティングされた。ファージと細菌の比率は、細菌の量が各希釈で一定に保たれるように希釈系列を通して変更されたが、ファージの量は１対４希釈であった。最高希釈では、感染多重度（ＭＯＩ）は１００であり、これは、細菌あたり約１００個のファージが存在したことを意味する。図８Ａでは、これらのスポット中で増殖する細菌コロニーがほとんどないか、または全くないことによって示されるように、ｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）とｐ１７７２ｅ００６（標的化ｃｒアレイ１のみ）の両方が、一晩のインキュベーション後にＩ－Ｃ型系統に存在する細菌の大部分を一貫して殺傷したのに対して、野生型ファージは細菌コロニー形成を制御しなかった。したがって、野生型およびｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）は、ＭＯＩが１００であっても、細菌の複製を制御できなかった。図８Ｂは、細菌の内因性Ｃａｓシステムに起因して、ｐ１７７２ｅ００６がこの細菌系統の野生型よりも効果的に細菌を殺傷したが、しかし、外因性のＣａｓシステム（ｐ１７７２ｅ００５）も含むファージほどには効果的ではないようであったことを示す。これは、インキュベーション時間が長くなると、ｐ１７７２ｅ００５よりもｐ１７７２ｅ００６にさらされたスポットでより多くの細菌がコロニーを形成するためである。

【0226】

図８Ｃは、図８Ａ－８Ｂで実施された同じタイプのアッセイからの単一のＭＯＩの定量化である。図８Ａ－８Ｂとは対照的に、パネルＣの細菌系統は、内因性のＣａｓシステムを有していなかったが、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子のゲノムに統合されたコピーを有していた。プレートを画像化し、各スポットの蛍光を定量化した。１．５のＭＯＩの結果が示されるが、０．４より上のＭＯＩはすべて、１．５のＭＯＩと一致する結果を有する。内因性Ｃａｓシステムがないため、ｃｒアレイのみのファージ（ｐ１７７２ｅ００６）は野生型ファージと同様に挙動した。非標的ｃｒアレイ（ｐ１７７２ｅ００８）を含む完全に操作されたファージもまた、野生型と比較して改善されなかった。しかし、標的化ｃｒアレイ（ｐ１７７２ｅ００５）を含む完全に操作されたファージは、他のどのファージバリアントよりも大幅に細胞増殖を抑制した。このデータは、完全に操作されたバリアントが、効果的であるために内因性のＣａｓシステムを必要としなかったことを示す。

【0227】

活性な内因性Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステムを有するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統（ｂ１１２１）を対数増殖期中期まで増殖させ、示された感染多重度（ＭＯＩ）で液体培養物中のファージに感染させた。すべての場合において、ファージは、図９Ａ－９Ｃに示されるように、細菌を首尾よく殺傷し、これは、感染していない対照と比較して回収されたコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの減少によって示された。ｐ１７７２ｅ００５（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）とｐ１７７２ｅ００６（ｃｒアレイ１のみを標的とする）の両方が、野生型ファージよりも効率的に細菌を殺傷した。ｐ１７７２ｅ００４（Ｃａｓシステムのみ）は、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）または自己標的バリアントと比較して改善された活性を有さず、このことは、自己標的ｃｒＲＮＡとＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素の両方がファージの効力を改善するために必要であったことを実証する。特に、ｐ１７７２ｅ００６およびｐ１７７２ｅ００５は同じレベルで殺傷し、このことは、操作されたファージバリアントが、互換性のある活性なＣａｓシステムの存在下でファージからの細菌標的化Ｃａｓシステムの発現によって殺傷することができたことを実証する。これらの図の点線は、アッセイの検出限界（ＬＯＤ）を表す。コロニーが得られなかったサンプルはＬＯＤに表示される。

【0228】

実施例９：複数の異なるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標的化スペーサーはファージの有効性を改善した
ｐ１７７２野生型および操作されたファージバリアントは、対数増殖においてｍＣｈｅｒｒｙ発現細菌と混合し、そしてＬＢ寒天上に直ちにプレーティングした。ファージの希釈系列を実行することによってファージ対細菌の比率を変更し、その結果、細菌の量は各スポットで一定のままであったが、ファージの量は変化した。感染多重度（ＭＯＩ）が最も高かったのは１００であり、これは、細菌あたり約１００個のファージが存在することを意味する。一晩のインキュベーション後、明視野およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光によってプレートを画像化することによって細菌の増殖を記録した。これらの画像に基づいてサンプルの定量化を行った。

【0229】

５つの異なるファージバリアントを使用して、外因性Ｉ－Ｃ型Ｃａｓシステム（ｐ１７７２ｅ００８）を有する非標的性ｃｒＲＮＡ、外因性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ｐ１７７２ｅ００６）を伴わない自己標的化ｃｒＲＮＡのみ、外因性のＩ－Ｃ型Ｃａｓシステムとともに送達される２つの異なる自己標的化ｃｒアレイ（ｐＡｒｒａｙ３およびｐＡｒｒａｙ４）、および親の野生型ファージ（ｐ１７７２ｗｔ）を送達する溶菌性ファージの効果を決定した。これらのアッセイにおいて、内因性Ｃａｓシステムを欠くＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統および示されたファージを、示された比率で組み合わせ、すぐにＬＢプレートにプレーティングした。これらのアッセイで使用された宿主細菌系統はＣａｓヌルであり、相対蛍光の測定を通じて細菌の観察と定量化を容易にするために、染色体に組み込まれたｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を有していた。結果を図１０Ａ－１０Ｂに示す。暗いスポットはより高い細菌増殖を表す。各画像の右側の数字は感染多重度（ＭＯＩ）を表す。最高のＭＯＩでは、１つの細菌ごとに約１００のファージが存在した。これらのプレート画像は、より高いＭＯＩでは、ファージｐＡｒｒａｙ３およびｐＡｒｒａｙ４（両方とも活性なＩ－Ｃ型Ｃａｓシステムをコードするｐ１７７２ファージであり、それぞれが３つの異なる自己標的スペーサーで構成される固有のｃｒアレイを備えている）が、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａをｐ１７７２ｗｔ、Ｃａｓオペロンと非標的化スペーサーを含むファージ（ｐ１７７２ｅ００８）、またはｃｒアレイを含むが外因性Ｃａｓシステムを含まないｐ１７７２（ｐ１７７２ｅ００６）よりも効果的に殺傷したことを示す。予想通り、細菌には内因性のＣａｓシステムがないため、ｃｒＲＮＡのみのファージ（ｐ１７７２ｅ００６）はファージの効力を改善しなかった。

【0230】

図１０Ｃは、図１０Ａのボックスのより高解像度の図であり、完全に操作されたファージ（ｐＡｒｒａｙ３）と、ｃｒアレイのみを有し、Ｃａｓオペロンを含まないファージ（ｐ１７７２ｅ０６）との間の違いを強調している。下の行（ＭＯＩ ０．００６１０）では、ｐＡｒｒａｙ３はｐ１７７２ｅ００６よりも明確なプラークを形成した（すなわち、ｐＡｒｒａｙ３サンプルのスポットはより明るかった）。上の行（ＭＯＩ ０．０２４４）では、ｐＡｒｒａｙ３はｐ１７７２ｅ００６よりもより良好に細菌の増殖を抑制した（暗いスポット）。

【0231】

図１０Ｄ－Ｅは、存在する蛍光細菌の相対量を定量化する、図１０Ａおよび図１０Ｂに示される同じプレートの対応する蛍光画像の下の第４行（ＭＯＩ－１．５）の定量化を示す。明視野画像と一致して、ＭＯＩが約１．５の場合、ｐＡｒｒａｙ３およびｐＡｒｒａｙ４で処理されたサンプルは、野生型ファージまたは非標的化（ｐ１７７２ｅ００８）およびｃｒアレイのみで操作されたファージ（ｐ１７７２ｅ００６）で処理されたサンプルよりも有意に少ない蛍光シグナル（生存細菌細胞の喪失を示す）を示した。

【0232】

実施例１０：ｃａｓオペロンの発現を駆動するさまざまなプロモーターを用いるｃｒアレイ／Ｃａｓ挿入物の有効性。
ｐ１７７２野生型および操作されたファージバリアントは、対数増殖においてｍＣｈｅｒｒｙ発現細菌と混合され、そしてＬＢ寒天上にすぐにプレーティングした。ファージの希釈系列を実施することによってファージ対細菌の比率を変更したので、バクテリオファージの量は各スポットで一定のままであったが、ファージの量は変化した。感染多重度（ＭＯＩ）が最も高かったのは１００であり、このことは、細菌あたり約１００個のファージが存在していたことを意味する。一晩のインキュベーション後、明視野およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光によってプレートを画像化することによって細菌の増殖を記録した。これらの画像に基づいてサンプルの定量化を行った。図１１Ａは、異なるプロモーターによって発現されるＣａｓシステムおよびｃｒアレイを含むファージのｐ１７７２野生型および複数の操作されたバリアントによる細菌の殺傷を示す。すべての操作されたファージバリアントは、ｐ１７７２ｅ００５と同じ構造を有し（図３Ａを参照）、Ｃａｓオペロンの発現を駆動するプロモーターの同一性のみが異なる。ｐ１７７２ｅ０１６は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの内因性Ｉ－ＣＣａｓシステムを駆動するプロモーターを使用した。ｐ１７７２ｅ００５、ｐ１７７２ｅ０１７、ｐ１７７２ｅ０２１はすべて、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターまたはＥ．ｃｏｌｉ細菌プロモーターの誘導体を使用した。ｐ１７７２ｅ０１８、ｐ１７７２ｅ０２２、およびｐ１７７２ｅ０２３はすべて、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの細菌プロモーターを使用した。ｐ１７７２ｅ０１９およびｐ１７７２ｅ０２０は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファージプロモーターを使用した。両方のプレートは同じアッセイからのものであり、対照（ｐ１７７２ｗｔおよびｐ１７７２ｅ００５）は、スポットをプレーティングする前の同じファージと細菌の混合物からのものである。使用した細菌宿主系統は、染色体からｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣａｓ－ヌルＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統であった。個々の画像は、４倍の対物レンズと明視野照明を使用して取得され、次にステッチされて、ここに示される画像が取得された。図１１Ｂは、図１１Ａに示されるのと同じプレートの対応する蛍光画像の下の４列目（ＭＯＩ－１．５）の定量化を示す。全体的な有効性の違いは、ｐ１７７２ｗｔと比較して有意に少ない蛍光シグナル（生存可能な細菌細胞の喪失を示す）によって示される、使用された異なるプロモーター間で観察された。

【0233】

実施例１１：複数の異なるファージが対数減少の有効性を改善した
野生型および操作されたファージバリアントを、対数増殖においてｍＣｈｅｒｒｙ発現細菌と混合し、そしてＬＢ寒天上に直ちにプレーティングした。示される結果は、感染多重度（ＭＯＩ）１．５からのものであり、単一の細菌あたり約１．５個のファージが存在したことを意味する。一晩のインキュベーション後、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光についてプレートを画像化することにより細菌の増殖を記録した。図１２Ａ－１２Ｂに示される定量化は、これらの画像に基づいて、サンプルに対して実行した。２つの独特な野生型ファージ（ｐ２１３１およびｐ２９７３）と、Ｃａｓシステムおよびｃｒアレイ１（ｐ２１３２ｅ００２およびｐ２９７３ｅ００２）を含むそれらの操作された対応物をテストした。約１．５のＭＯＩで、操作されたファージは野生型ファージよりもはるかに少ない生存細菌を有していた。これらの結果は、ファージが送達するＣａｓシステムが複数の独特なファージにおいて機能することを示す。

【0234】

実施例１２：代替ファージおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ系統におけるスペーサーアレイ／Ｃａｓ挿入物の有効性
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ系統のパネルに対して、ｐ４２０９ｗｔ（野生型）およびｐ４２０９ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を用いて実施した。簡単に説明すると、対数増殖期の初期細菌培養物をファージと混合して、図に記載されている最終力価を得た。サンプルを直ちにプレーティングし（ｔ＝０時間）、その後３７℃で３時間および２４時間インキュベートした。プレートを画像化し、野生型と完全な構築物のバリアントの違いを表にまとめた。ｐ４２０９野生型および操作されたファージバリアントは、対数増殖で細菌と混合し、すぐにＬＢ寒天培地にプレーティングしたか、またはプレーティング前に液体中で示された時間インキュベートした。バクテリオファージの希釈系列を実施することにより、バクテリオファージに対するファージの比率を変更し、その結果、バクテリオファージの量は各スポットで一定に保たれるが、ファージの量は変化する。バクテリオファージと細菌の相対的な比率は、細菌が複製されてファージに屈するにつれて、実験の過程でシフトした。一晩のインキュベーション後、プレートを画像化することにより細菌の増殖を記録した。画像の各セットの上部にあるラベルは、その画像に示される細菌系統のＣａｓタイプを示す。図１３Ａはこのアッセイの結果を示す。系統ｂ２５５０では、すべての時点で、ｐ４２０９ｅ００２は、同じ力価のｐ４２０９ｗｔと比較して、１×１０^９ＰＦＵ／ｍＬの力価で細菌の増殖を完全に阻害した。ｔ＝０ｈのｂ２６３１系統では、１×１０^５ＰＦＵ／ｍＬの力価でｐ４２０９ｅ００２の増殖は観察されなかったが、同じ力価のｐ４２０９ｗｔでは増殖が目に見えて大きかった。ｔ＝３ｈの同じ系統では、どの力価でもｐ４２０９ｅ００２の増殖は観察されなかったが、すべての力価でｐ４２０９ｗｔの目に見える増殖が存在した。ｔ＝０ｈのｂ２８１６系統では、１×１０^９ＰＦＵ／ｍＬの力価のｐ４２０９ｅ００２の方が、同じ力価のｐ４２０９ｗｔよりもわずかに少ない増殖が観察された。ｔ＝３ｈの同じ系統では、１×１０^９ＰＦＵ／ｍＬの力価でｐ４２０９ｅ００２の増殖はほとんど観察されなかったが、同じ力価のｐ４２０９ｗｔでは有意な増殖が存在した。ｔ＝０ｈのｂ２８２５系統では、１×１０^７ＰＦＵ／ｍＬの力価でｐ４２０９ｅ００２の増殖は観察されなかったが、同じ力価のｐ４２０９ｗｔで有意な増殖が観察された。ｔ＝３ｈの同じ系統では、１×１０^９ＰＦＵ／ｍＬおよび１×１０^７ＰＦＵ／ｍＬの力価でｐ４２０９ｅ００２のある程度の増殖が観察されたが、同じ力価のｐ４２０９ｗｔでは目に見えて多い増殖が存在した。まとめると、これらのデータは、独特なファージｐ４２０９ｅ００２が、いくつかの無関係なＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ系統に対してＣａｓおよびｃｒＲＮＡスペーサー活性を改善したことを示す。

【0235】

ｐ４２０９ｗｔ、ｐ４２０９ｅ００１（Ｃａｓシステムのみ）、およびｐ４２０９ｅ００２（標的化ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステム）を複数の細菌系統でプラーク形成させ、プラーク化の効率を調べた。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂ１１２１系統は、すべての変異系統を同等にサポートし、力価の基準として提供されている。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｂ２６３１系統では、野生型バリアントは有意に減少したレベルでプラーク形成し、Ｃａｓのみのバリアントはまったくプラーク形成せず、完全に操作されたバリアントはｂ１１２１と比較して効率を損なうことなくプラーク形成した。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂ２８１６系統では、野生型もＣａｓのみのバリアントもいかなる活性の証拠も示さなかったが、完全に操作されたバリアントはクリアリングゾーンを生成した。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂ２８２５系統では、野生型およびＣａｓのみのバリアントではプラーク化効率が大幅に低下したが、完全に操作されたバリアントではｂ１１２１と同等の効率が維持された。ｂ２６３１とｂ２８２５の両方は、有害な影響を有する操作事象（Ｃａｓシステムの挿入）の例、すなわち、プラーク形成の効率の低下（ｂ２６３１）またはプラークの透明度の低下（ｂ２８２５）のいずれかを示す。どちらの場合も、標的化ｃｒアレイ（Ｃａｓシステムの活性を有効にする）を追加すると、活性の減少をレスキューするのみならず、野生型の親で見られるよりも活性を改善した。プレート画像の下部にあるラベルは、その画像に示される細菌系統と、それに含まれる内因性Ｃａｓシステムのタイプを示す。これらの結果は、Ｃａｓシステムおよび標的化ｃｒアレイが、さまざまな細菌系統を複製して殺傷するファージの能力を改善したことをさらに裏付けている。

【0236】

実施例１３．インビボ有効性研究
図１５Ａは、ｐ１７７２ｗｔ（野生型）およびｐ１７７２ｅ００５（ｃｒアレイ１＋Ｃａｓシステムを標的とする）を用いたインビボ有効性モデリングのために利用される材料および方法を概説する。Ｅｎｖｉｇｏからの雌性ＩＣＲマウスは、－４日目と－１日目の２回のシクロホスファミド（それぞれ１５０ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を介して好中球減少症にした。好中球減少症の誘発に続いて、マウスは、単回の筋肉内注射によってＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂ１１２１に感染させた。以前のモデル開発は、～５ｅ６ ＣＦＵがこの特定の系統の理想的な接種材料であると判断した。感染後（ｐ．ｉ）３時間で、感染した大腿部に、ビヒクル（１×ＴＢＳ＋１０ｍＭ塩）、ｐ１７７２ｗｔ、またはｐ１７７２ｅ００５のいずれかを１回筋肉内注射することにより、マウスを治療した。左下の表は、各実験で感染した各大腿部に送達された合計ＰＦＵの詳細を示す。マウスを安楽死させ、接種後の示された時点で大腿筋を採取した。大腿部はビーズビーターシステムを使用して均質化した。ホモジネートを段階的に希釈し、ＣＦＵ定量のためにプレーティングした。ホモジネートはまた０．４５μｍフィルターでろ過した。ろ液を段階的に希釈し、ｐＦＵ定量のためにｂ１１２１オーバーレイプレートにプレーティングした。すべてのＣＦＵおよびＰＦＵ測定値はｇ組織に対して正規化された。

【0237】

細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）およびファージプラーク形成単位（ＰＦＵ）の両方が、各実験について示される。図１５Ｂ－１５Ｃは、ファージが筋肉内投与されたマウスにおけるファージの有効性を示す。示された時点で大腿筋組織を採取した。両方の複製は、完全に操作されたファージが野生型ファージよりもコロニー形成を大幅に減少させることを示す。図１５Ｄは、ファージが静脈内投与されたマウスにおけるファージの有効性を示す。示された時点で大腿筋組織を採取した。完全に操作されたファージは、野生型ファージよりも大幅に細菌を破壊する。まとめると、図１５Ｂ－１５Ｄからのこれらのデータは、さまざまな経路で送達されたファージが大腿部に入り、細菌を殺傷することを示す。すべての時点で、完全に操作されたファージで処理されたマウスの大腿組織のＣＦＵ／ｇは、野生型ファージで処理されたマウスよりも低い。図１５Ｅは、マウス感染モデルにおけるファージ処理の用量反応を確立するモデルの実験計画を示す概略図である。この実験は、図１５Ａに示されるものと同様に実施されたが、現在の標準治療を表す抗生物質治療群が追加で含む。ファージの投与量も、異なるグループ間で力価測定される。

【0238】

図１５Ｆは、マウスにおける異なる用量のファージまたは抗生物質による治療の結果を示す。全体として、これらのデータは、操作されたｐ１７７２ｅ００５がｐ１７７２ｗｔよりもマウス感染モデルにおいて効果的であることを示す。さらに、操作されたファージは、与えられた抗生物質治療よりも優れた性能を示した。パネルＢ－ＤおよびＦでは、データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。統計的有意性は、多重比較を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはテューキーの検定を伴う二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して決定される。

【0239】

実施例１４：大腸菌における標的化ｃｒアレイ
図１６は、野生型ファージｐ００４ｋおよびその操作されたバリアントｐ００４ｋｅ０７のゲノムの概略図を示す。ゲノム軸の下のバーは、削除および置き換えされたゲノムの領域を示す。ファージゲノムの下の概略図は、削除された領域のＷＴファージ遺伝子を置き換えるために使用されたＤＮＡを図示する。

【0240】

大腸菌ファージｐ００４ｋ－ｗｔ（野生型）およびｐ００４ｋｅ００７（標的化ｃｒアレイ５＋Ｃａｓシステム）を、細菌が対数増殖している間に示された細菌系統と混合し、接種の３時間後にＬＢ寒天上にプレーティングした。ファージの希釈系列を実施することによってファージ対細菌の比率を変更したので、細菌の量は各スポットで一定のままであったが、ファージの量は変化した。細菌が複製されてファージに屈するにつれて、ファージと細菌の相対的な比率は実験の過程でシフトしたので、そのため、ＭＯＩはリストしていない。画像の各セットの上部にあるラベルは、表示される系統を示す。

【0241】

このアッセイにおいて、ファージは、対数増殖中期において、示された細菌培養物と１：１で混合されて、画像の左側に記載された最終的なファージ力価を得た。図１７Ａに示すように、バクテリオファージ混合物を３時間インキュベートし、次いで、２μｌの培養物をＬＢプレートにスポットした。ファージを生き残った細菌は複製して目に見えるコロニーを形成するので、細菌が少ないほどファージの殺傷がより良好である。このアッセイでは、操作されたファージはすべての希釈で野生型よりも細菌をより良好に殺傷するように見えたが、１×１０^７希釈は各Ｅ．ｃｏｌｉ系統で最も視覚的に顕著であった。図１７Ｂ－１７Ｄは、図１７Ａの画像の定量化を示す。定量化は、各スポットの相対光学密度を比較することによって決定した（本質的に、各スポットがどれだけ暗いか、暗いスポットはより多くの細胞増殖を示す）。まとめると、これらのデータは、Ｃａｓシステムと細菌ゲノムを標的とするｃｒアレイを含む操作されたファージが、複数の系統で野生型ファージの親よりも殺傷を改善したことを示す。これらのデータは、外因性Ｃａｓシステムを発現するファージが多様なヒト病原体に対するファージを改善することを実証する。

【0242】

実施例１５．インビボ有効性研究
ｂ１１２１の培養物を一晩増殖させ、ＬＢ＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２＋１０ｍＭ ＣａＣｌ_２に逆希釈し、そして０．４５のＯＤ６００まで増殖させた。培養物を分割し、ＬＢ／塩（細胞のみの対照）、ｐ１７７２ｅ００５（ＭＯＩ＝０．１）、ＰＢ１ｅ００２（ＭＯＩ＝０．１）、またはｐ１７７２ｅ００５＋ＰＢ１ｅ００２のカクテル（ファージあたりＭＯＩ＝０．１）のいずれかで処理した。すべてのサンプルをマイクロタイタープレート内で３７℃にて２４時間振とうしながらインキュベートし、６３０ｎｍにおけるＯＤを１０分ごとに測定した。データは、１２回の繰り返しの平均として表示される。エラーバーは標準偏差を表す。データは、２つの完全な構築物ファージのカクテルが、どちらかのファージ自体よりも培養のリバウンドを大幅に抑制することを示す。図１８Ａは、ｐ１７７２ｅ００５とＰＢ１ｅ００２の間の協調性を示す。

【0243】

実施例１６：異なるリピート配列の活性
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養の培養物を、異なるリピート配列を含むベクターで形質転換した。ベクターは、空のベクターｐＵＣＰ１９（空のベクター）であるか、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｉ型ＣＣａｓシステムと表３にリストされたリピート配列に隣接するｇｙｒＢ遺伝子を標的とするスペーサーを含むｐＵＣＰ１９ベクターを含んだ。アリコートは各テスト条件から取り、希釈し、そして列挙された細菌ＣＦＵにスポットする。

【0244】

【表3】

【0245】

このアッセイの結果を図１９に示す。特定の配列は、異なる数の形質転換体をもたらした。リピート１とリピート３はどちらも、空のベクターまたはリピート２、４、もしくは５で形質転換された細菌よりも少ない数の形質転換体を生じた。これは、リピート配列の配列がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ培養におけるファージ標的化の有効性に影響を与えることを示す。

【0246】

実施例１７：標的細菌を標的とするスペーサー配列の設計および検証
スペーサーの設計
スペーサー配列は、以下のプロトコルを使用して設計される。最初に、関心対象の生物／種／標的についての代表的なゲノムの適切な検索セットが取得される。適切なデータベースの例には、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋおよびＰＡＴＲＩＣ（Ｐａｔｈｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）データベースが含まれる。ゲノムはＦＴＰ（ファイル転送プロトコル）サーバーを介して一括でダウンロードされ、迅速かつプログラムされたデータセットの取得が可能になる。

【0247】

ゲノムは、適切なスペーサー配列を位置決めするために関連するパラメーターで検索される。ゲノムは、順方向と逆方向の両方の相補方向で最初から最後まで読み取られることができ、ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）部位を含むＤＮＡの連続したストレッチを位置決めことができる。スペーサー配列は、ＰＡＭ部位に３’で隣接するＮ長のＤＮＡ配列であり、Ｎは関心対象のＣａｓシステムに特異的であり、一般に事前に知られている。ＰＡＭ配列およびスペーサー配列の特性評価は、一般的に、Ｃａｓシステムの発見と初期研究中に実施される。観察されたすべてのＰＡＭ隣接スペーサーは、ダウンストリーム使用のためにファイルおよび／またはデータベース化するために保存できる。

【0248】

次に、ＣＲＩＳＰＲ操作されたファージにおける使用のためのスペーサーの品質は、以下のプロセスを使用して決定される。まず、観察された各スペーサーを評価して、それらが存在する評価済みゲノムの数を決定できる。さらに、観察されたスペーサーを評価して、特定の各ゲノムに存在する可能性のある回数を確認できる。ゲノムごとに１つより多くの位置に存在するスペーサーは、変異が発生した場合にＣａｓシステムが標的部位を認識できない可能性があり、追加の「バックアップ」部位ごとに、適切な非変異標的位置が存在する可能性が高まるため、有利な場合がある。観察されたスペーサーは、それらがゲノムの機能的に注釈が付けられた領域で発生するかどうかを決定するために評価することができる。そのような情報が利用できる場合、機能的な注釈付けをさらに評価して、ゲノムのそれらの領域が生物の生存および機能のために「必須」であるかどうかを判断できる。関心対象である、すべてまたはほぼすべての評価されたゲノム（＞＝９９）に存在するスペーサーに焦点を当てることで、スペーサーの選択を正当化するための幅広い適用性が保証される。保存されたスペーサーの大規模な選択プールが存在する場合、既知の機能を有するゲノムの領域に存在するスペーサーが優先され、それらのゲノム領域が生存に「必須」であり、ゲノムごとに１回より多く存在する場合は優先度が高くなる。

【0249】

スペーサーの検証
次に、同定されたスペーサー配列は、以下の手順を完了することによって検証することができる。最初に、関心対象の生物において複製し、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を有するプラスミドが同定される。Ｃａｓシステムをコードする遺伝子は、関心対象の生物で発現するようにプラスミドに挿入される。Ｃａｓシステムの上流には、Ｃａｓシステムの発現を駆動するために関心対象の生物によって認識されるプロモーターが含まれている。プロモーターとＣａｓシステムの間に、関心対象の生物によって認識されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が含まれている。

【0250】

次に、生物情報学的に同定されたゲノム標的化スペーサーを、Ｃａｓシステムを発現するプラスミドに挿入する。リピート－スペーサー－リピートの上流には、ｃｒＲＮＡの発現を駆動するために関心対象の生物によって認識されるプロモーターが含まれている。そのようなプロモーターの例を表１Ｂに示す。このクローニングは、クローニングされるスペーサーによって標的とされない生物または系統において実施する必要がある。

【0251】

次に、非標的化スペーサーを、Ｃａｓシステムを発現するプラスミドに挿入する。このスペーサーの配列はランダムに生成され、その後、関心対象の生物のゲノムに標的部位がないことを生物情報学的に確認することができる。リピート－スペーサー－リピートの上流には、ｃｒＲＮＡの発現を駆動するために関心対象の生物によって認識されるプロモーターが含まれている。

【0252】

次に、試験された各スペーサーの殺傷効力が決定される。表４にリストされているプラスミドは、同じモル濃度に正規化されている。各プラスミドは、形質転換、コンジュゲーション、またはプラスミドを細胞に導入するための他の方法によって、関心対象の生物に移入される。形質転換された細胞は、適切な選択培地（例えば、抗生物質を含む寒天）にプレーティングされる。コロニーへの細胞増殖に続いて、それぞれの異なるプラスミド移入から生じたコロニーが数えられる。非標的化スペーサーを含む対照プラスミドよりも有意に低い移入率を有する標的化スペーサーを含むプラスミドは、細菌ゲノムを標的化することに成功していると考えられる。

【0253】

【表4】

【0254】

本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置き換えが、本開示から逸脱することなく、当技術分野の当業者に行われる。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替案が、本開示の実施において使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによって網羅されることが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18】

【図19】

【配列表】

2023500336000001.app

【国際調査報告】