特表 2023-500357 生物内に新規突然変異を作出するための方法およびその適用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-05

(54)【発明の名称】生物内に新規突然変異を作出するための方法およびその適用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20221223BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221223BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221223BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20221223BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20221223BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20221223BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 200Z

C12N15/09 110

C12N15/09 100

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A01K67/027

A01H1/00 A

A01H5/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022526315

(86)(22)【出願日】2020-10-13

(85)【翻訳文提出日】2022-05-06

(86)【国際出願番号】 CN2020120633

(87)【国際公開番号】W WO2021088601

(87)【国際公開日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】201911081617.X

(32)【優先日】2019-11-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202010821877.2

(32)【優先日】2020-08-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202010974151.2

(32)【優先日】2020-09-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520479722

【氏名又は名称】チンタオ、キングアグルート、ケミカル、コンパウンド、カンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＱＩＮＧＤＡＯ ＫＩＮＧＡＧＲＯＯＴ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＯＵＮＤ ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】ＮＯ．５３，ＱＩＮＧＬＯＮＧＨＥ ＲＯＡＤ，ＨＵＡＮＧＤＡＯ ＤＩＳＴＲＩＣＴ，ＱＩＮＧＤＡＯ，ＳＨＡＮＤＯＮＧ，ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】チアン、リンチエン

(72)【発明者】

【氏名】モー、ストン

(72)【発明者】

【氏名】ワン、チヤオ

(72)【発明者】

【氏名】リー、ユカイ

(72)【発明者】

【氏名】チー、ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】リー、ホアロン

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ボー

【テーマコード（参考）】

2B030

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B030AA00

2B030AB04

2B030CA14

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、遺伝子工学の技術分野に関して、特に、人工ＤＮＡ鋳型の不在下で生物内に部位特異的突然変異を作出するための方法、およびその使用に関する。この方法は、以下の工程：生物のゲノム中の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出する工程およびそれらをそれぞれ自発的に修復する工程を含んでなり、後のＤＮＡ切断は前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される。本発明において、新規標的は連続的編集によって生じた新規修復イベントによって生成された配列に基づいて設計され、よって、突然変異は、ゲノム中の特定の部位に多数回連続的に作出可能であり、これにより、ＤＮＡ切断後の修復イベントのタイプが大幅に増え、単一の遺伝子編集では見ることのできない新規の塩基置換、欠失および挿入突然変異が実現する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物内に新規突然変異を作出するための方法であって、以下の工程：前記生物のゲノムの特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出する工程、およびそれらをそれぞれ自発的に修復する工程を含んでなり、後のＤＮＡ切断が前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される、方法。

【請求項2】

前記「ＤＮＡ切断」が、標的化特性を有するヌクレアーゼを前記生物の細胞に送達してゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させることによって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記「標的化特性を有するヌクレアーゼ」がＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出すること」が、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ編集によって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントによって生成された新規配列に基づき、新規ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮタンパク質がその部位を再び切断するように設計される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出すること」が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントによって生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、異なる標的化ヌクレアーゼを異なる世代のレシピエント細胞に連続的に送達することによって作出され、前の編集を完了した突然変異細胞が後の編集の標的化ヌクレアーゼの送達を受容するためのレシピエントとして使用され、それにより、部位特異的突然変異を生成するための第２の編集を行う、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、異なる標的のための異なる標的化ヌクレアーゼを同じレシピエント細胞に送達することによって作出される、請求項１～３および５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項１～３、５および７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのそれぞれによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項１～３、５および７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記標的化ヌクレアーゼがゲノム編集を実行することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記標的化ヌクレアーゼがＤＮＡの形態である、請求項６または７に記載の方法。

【請求項12】

前記標的化ヌクレアーゼがＤＮＡではなく、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記標的化ヌクレアーゼを細胞に送達するための方法が、１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）エレクトロポレーション形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子銃衝撃；または６）アグロバクテリウム媒介形質転換法から選択される、請求項６または７に記載の方法。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる新規突然変異。

【請求項15】

請求項１４に記載の新規突然変異を有する、タンパク質またはその生物学的に活性な断片。

【請求項16】

請求項１５に記載のタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列または相補配列を含んでなる核酸。

【請求項17】

（ａ）標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
を含んでなり、前記標的ＲＮＡは、少なくとも２つの標的ＲＮＡを含んでなり、第１の標的ＲＮＡは、あるＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する、核酸。

【請求項18】

（ｂ）Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１７に記載の核酸。

【請求項19】

前記標的ＲＮＡがｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである、請求項１７または１８に記載の核酸。

【請求項20】

前記Ｃａｓポリペプチドおよび標的ＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ ｖｉｖｏ細胞に存在する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項21】

請求項１６～２０のいずれか一項に記載の核酸、およびそれに機能的に連結されたプロモーターを含んでなる組換え発現ベクター。

【請求項22】

請求項１６～２０のいずれか一項に記載の核酸を含んでなる発現カセット

【請求項23】

請求項２２に記載の発現カセットを含んでなる宿主細胞。

【請求項24】

請求項２３に記載の宿主細胞から再生される生物。

【請求項25】

標的ＤＮＡを溶解させるための方法であって、前記標的ＤＮＡを複合体と接触させることを含んでなり、前記複合体は、
（ａ）Ｃａｓポリペプチド；および
（ｂ）少なくとも２つの標的ＲＮＡ、ここで、第１の標的ＲＮＡは、前記ＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する、
を含んでなる、方法。

【請求項26】

前記標的ＲＮＡがｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記標的ＤＮＡが細菌細胞、真核細胞、植物細胞または動物細胞に存在する、請求項２５または２６に記載の方法。

【請求項28】

前記標的ＤＮＡが染色体ＤＮＡである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記Ｃａｓポリペプチドおよび標的ＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ ｖｉｖｏ細胞に存在する、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

接触させることが、前記細胞に以下：（ａ）ＣａｓポリペプチドまたはそのＣａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）標的ＲＮＡまたはその標的ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することを含んでなる、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

（ａ）Ｃａｓポリペプチド、またはそのＣａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｂ）少なくとも２つの標的ＲＮＡ、またはそれらの標的ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、第１のＲＮＡは、あるＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する、
を含んでなる、組成物。

【請求項32】

前記標的ＲＮＡがｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記Ｃａｓポリペプチドおよび前記標的ＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ ｖｉｖｏ細胞に存在する、請求項３１または３２に記載の組成物。

【請求項34】

疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項35】

（ａ）Ｃａｓポリペプチド、またはそのＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸；および
（ｂ）少なくとも２つの標的ＲＮＡ、またはそれらの標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸、ここで、第１のＲＮＡは、あるＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは、前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する；
を含んでなり、（ａ）と（ｂ）は同じまたは別の容器にある、キット。

【請求項36】

前記標的ＲＮＡがｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである、請求項３５に記載のキット。

【請求項37】

（ｂ）の標的ＲＮＡが同じまたは別の容器にある、請求項３５または３６に記載のキット。

【請求項38】

外因性のトランスジェニックマーカーに依存しない編集イベントをスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
１）レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の配列の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断が連続的に作出され、それぞれ自発的に修復され、後のＤＮＡ切断は、前のＤＮＡ切断の修復から生成された新規配列に基づいて生成される工程；
２）第１の標的遺伝子の特定の部位が連続的に切断され修復された後にある特定の編集イベントが生じ、これは突然変異細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して表現型選択が可能な形質を作出することができ、その形質に関して選択を行うために対応する選択圧が適用され、このような編集イベントを含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離される工程；
３）場合により、同時に別の標的部位を編集するために、第１の標的遺伝子に加えて、少なくとも１つの第２の標的遺伝子に対する標的化ヌクレアーゼが使用され、第２の標的遺伝子の編集イベントが富化され、第１の標的遺伝子の突然変異によって生成された選択可能な形質のスクリーニングを介して同期してスクリーニングされ、第１の標的遺伝子の編集イベントと少なくとも１つの第２の標的遺伝子の編集イベントを同時に含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離される工程
を含んでなる、方法。

【請求項39】

前記「第１の標的遺伝子」が、少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする遺伝子座であり、前記少なくとも１つの表現型選択が可能な形質が抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

「第１の標的遺伝子の特定の部位」が、連続的切断および修復の後に、レシピエント細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して少なくとも１つの表現型選択が可能な抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質を生じ得る、ある特定のタイプの突然変異が生成される部位を指す、請求項３８または３９に記載の方法。

【請求項41】

前記「ある特定のタイプの突然変異」が単一塩基の置換、複数塩基の置換、または不特定数の塩基の挿入もしくは欠失を含んでなる、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記「ある特定の選択圧」が環境圧または付加された化合物から生じる圧力であり、前記環境圧は、好ましくは高温、低温または低酸素であり、付加された化合物から生じる圧力は、好ましくは、塩イオン濃度、抗生物質、細胞毒素または除草剤から生じる圧力である、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記「ＤＮＡ切断」が、標的化特性を有するヌクレアーゼを生物の細胞に送達してゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させることによって達成される、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記「標的化特性を有するヌクレアーゼ」がゲノム編集を実行することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

「配列の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断が連続的に作出される」という特徴が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントにより生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計されることを指す、請求項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記「第２の標的遺伝子」が第１の標的遺伝子とはコードが異なる別の遺伝子を指す、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記「少なくとも１つの第２の標的遺伝子に対する標的化ヌクレアーゼ」および第１の標的遺伝子の特定の部位にＤＮＡ切断を作出するために使用される前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼが同じかまたは異なる、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記標的化ヌクレアーゼがＤＮＡの形態である、請求項３８～４５および４８～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記標的化ヌクレアーゼがＤＮＡではなく、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態である、請求項３８～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記標的化ヌクレアーゼを細胞に送達するための方法が、１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）エレクトロポレーション形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子銃衝撃；または６）アグロバクテリウム媒介形質転換法から選択される、請求項４３～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

生物ゲノムの非トランスジェニック一過性編集のための方法であって、以下の工程：
１）レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の特定の部位に対して、少なくとも２つのｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは少なくとも２つのｓｇＲＮＡ断片の組合せが設計および合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせた前記ｃｒＲＮＡの組合せまたは単独の前記ｓｇＲＮＡ組合せが、対応するＣａｓタンパク質を、レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出し、それらをそれぞれ自発的に修復するようにガイドすることができ、後のＤＮＡ切断は前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される工程；
２）適当な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または対応するそのｍＲＮＡが、上記で予め設計および合成された、第１の標的遺伝子の部位特異的編集を内因性の選択マーカーを生成するようにガイドすることができるｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは単独のｓｇＲＮＡ断片の組合せと混合され、場合により、第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つがさらに付加され、ＲＮＰ複合体を形成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションが行われる工程；
３）遺伝子編集を達成するために、上記ＲＮＰ複合体がレシピエント細胞に送達され、ゲノムＤＮＡの特定の部位と接触される工程；
４）ＲＮＰ複合体による第１の標的遺伝子の部位特異的編集によって生成された表現型選択が可能な形質に従い、その形質に関して選択を行うために対応する選択圧が適用され
、その編集イベントを含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離され、場合により、第１の標的遺伝子の編集イベントと第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子のうち少なくとも１つの編集イベントを同時に含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離される工程、
を含んでなる、方法。

【請求項54】

前記「第１の標的遺伝子」が少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする遺伝子座であり、前記少なくとも１つの表現型選択が可能な形質が抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記「第１の標的遺伝子の特定の部位」が、連続的切断および修復の後に、レシピエント細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して少なくとも１つの表現型選択が可能な抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質を生じ得るある特定のタイプの突然変異が生成される部位を指す、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

前記「ある特定のタイプの突然変異」が単一塩基の置換、複数塩基の置換、または不特定数の塩基の挿入もしくは欠失を含んでなる、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記「ある特定の選択圧」が環境圧または付加された化合物から生じる圧力であり、前記環境圧は、好ましくは高温、低温または低酸素であり、付加された化合物から生じる圧力は、好ましくは、塩イオン濃度、抗生物質、細胞毒素または除草剤から生じる圧力である、請求項５５または５６に記載の方法。

【請求項58】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がゲノム編集を実行することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項５３～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出する」という特徴が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントにより生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計されることを指す、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのそれぞれによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項５３～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子」が、第１の標的遺伝子とはコードが異なる他の遺伝子を指す、請求項５３～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」が、第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを有する同じＣａｓタンパク質を有する、請求項５３～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」ならびに第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を使用する、請求項５３～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ＲＮＰ複合体を細胞に送達するための方法が、１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）エレクトロポレーション形質転換法；４）マイクロインジェクション；または５）遺伝子銃衝撃から選択される、請求項５３～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

植物ゲノムの非トランスジェニック一過性編集のための方法であって、以下の工程：
１）レシピエント植物細胞または組織の第１の標的遺伝子の特定の部位に対して、少なくとも２つのｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは少なくとも２つのｓｇＲＮＡ断片の組合せが設計および合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせた前記ｃｒＲＮＡの組合せまたは単独の前記ｓｇＲＮＡの組合せが、対応するＣａｓタンパク質を、レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出し、それらをそれぞれ自発的に修復するようにガイドすることができ、後のＤＮＡ切断は前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される工程；
２）適当な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または対応するそのｍＲＮＡが、上記で予め設計および合成された、第１の標的遺伝子の部位特異的編集を内因性の選択マーカーを生成するようにガイドすることができるｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは単独のｓｇＲＮＡ断片組合せと混合され、場合により、第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つがさらに付加され、ＲＮＰ複合体を形成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションが行われる工程；
３）遺伝子編集を達成するために、上記ＲＮＰ複合体がレシピエント植物細胞または組織に送達され、ゲノムＤＮＡの特定の部位と接触される工程；
４）ＲＮＰ複合体による第１の標的遺伝子の部位特異的編集によって生成された表現型選択が可能な形質に従い、その形質に関して選択を行うために対応する選択圧が適用され、その編集イベントを含む細胞、組織、基間、または完全な植物体が単離され、場合により、第１の標的遺伝子の編集イベントと第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子のうち少なくとも１つの編集イベントを同時に含む細胞、組織、器官または完全な植物体が単離される工程を含んでなる、方法。

【請求項67】

前記「第１の標的遺伝子」が少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする遺伝子座であり、前記少なくとも１つの表現型選択が可能な形質が抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記「第１の標的遺伝子の特定の部位」が、連続的切断および修復の後に、レシピエント細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して少なくとも１つの表現型選択が可能な抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質を生じ得るある特定のタイプの突然変異が生成される部位を指す、請求項６６または６７に記載の方法。

【請求項69】

前記「ある特定のタイプの突然変異」が単一塩基の置換、複数塩基の置換、または不特定数の塩基の挿入もしくは欠失を含んでなる、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記「ある特定の選択圧」が環境圧または付加された化合物から生じる圧力であり、前記環境圧は、好ましくは高温、低温または低酸素であり、付加された化合物から生じる圧力は、好ましくは、塩イオン濃度、抗生物質、細胞毒素または除草剤から生じる圧力である、請求項６８または６９に記載の方法。

【請求項71】

前記「レシピエント植物細胞または組織」が、一過性発現のレシピエントとして働くことができ、かつ、組織培養によって完全な植物体に再分化可能であり、前記細胞は好ましくはプロトプラスト細胞または懸濁細胞であり、前記組織は好ましくはカルス、未熟胚、成熟胚、葉、茎頂、幼穂または胚軸である、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質がゲノム編集を実行することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に生成する」という特徴が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントによって生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計されることを指す、請求項６６～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」が、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのそれぞれによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される、請求項６６～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子」が、第１の標的遺伝子とはコードが異なる他の遺伝子を指す、請求項６６～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」が、第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを有する同じＣａｓタンパク質を有する、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」ならびに第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を使用する、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記ＲＮＰ複合体を植物細胞に送達するための方法が、１）ＰＥＧ媒介細胞プロトプラスト形質転換法；２）マイクロインジェクション；；３）遺伝子銃衝撃；４）炭化ケイ素繊維媒介方法；または５）真空浸潤法、または任意の他の一過性導入法から選択される、請求項６６～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記「第１の標的遺伝子」が、除草剤抵抗性／耐性から選択される少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子であり、前記除草剤抵抗性／耐性は、ＥＰＳＰＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、グルタミン合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤に対する抵抗性／耐性、ＡＣＣａｓｅ阻害剤に対する抵抗性／耐性、カロテノイド生合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子シャント剤に対する抵抗性／耐性、光化学系ＩＩ阻害剤に対する抵抗性／耐性またはＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、および合成成長ホルモンに対する抵抗性／耐性からなる群から選択され；好ましくは、前記「第１の標的遺伝子」は、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、ＴＩＲ１またはＡＦＢ５から選択される、請求項６６～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記「第１の標的遺伝子」がＡＬＳであり、前記「遺伝子の特定の部位」がアラビドプシスＡｔＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列における部位Ａ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｄ３７６、Ｒ３７７、Ｗ５７４、Ｓ６５３もしくはＧ６５４、および別の植物のＡＬＳタンパク質における、ＡｔＡＬＳアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指すか；または
前記ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡが、Ａ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｄ３７６、Ｒ３７７、Ｗ５７４、Ｓ６５３、Ｇ６５４もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＡｔＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＡＬＳタンパク質における、ＡｔＡＬＳアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする、
請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記「第１の標的遺伝子」がＡＣＣａｓｅであり、前記「遺伝子の特定の部位」が、ノスズメノテッポウＡｍＡＣＣａｓｅタンパク質のアミノ酸配列における部位Ｉ１７８１、Ｅ１８７４、Ｎ１８７８、Ｗ１９９９、Ｗ２０２７、Ｉ２０４１、Ｄ２０７８、Ｃ２０８８もしくはＧ２０９６、およびＡｍＡＣＣａｓｅアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当する別の単子葉植物のＡＣＣａｓｅタンパク質のアミノ酸部位を指すか；または
前記ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡが、Ｉ１７８１、Ｅ１８７４、Ｎ１８７８、Ｗ１９９９、Ｗ２０２７、Ｉ２０４１、Ｄ２０７８、Ｃ２０８８、Ｇ２０９６もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＡｍＡＣＣａｓｅアミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の単子葉植物のＡＣＣａｓｅタンパク質における、ＡｍＡＣＣａｓｅアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする、
請求項８０に記載の方法。

【請求項83】

前記「第１の標的遺伝子」がＨＰＰＤであり、前記「遺伝子の特定の部位」がイネＯｓＨＰＰＤタンパク質のアミノ酸配列における部位Ｈ１４１、Ｌ２７６、Ｐ２７７、Ｎ３３８、Ｇ３４２、Ｒ３４６、Ｄ３７０、Ｐ３８６、Ｋ４１８もしくはＧ４１９、および別の植物のＨＰＰＤタンパク質における、ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指すか；または
前記ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡが、Ｈ１４１、Ｌ２７６、Ｐ２７７、Ｎ３３８、Ｇ３４２、Ｒ３４６、Ｄ３７０、Ｐ３８６、Ｋ４１８、Ｇ４１９もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＨＰＰＤタンパク質における、ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする、
請求項８０に記載の方法。

【請求項84】

前記「第１の標的遺伝子」がＰＰＯであり、前記「遺伝子の特定の部位」がイネＯｓＰＰＯ１タンパク質のアミノ酸配列における部位Ｓ１２８、Ｖ２１７、Ｓ２２３、Ｖ３６４、Ｋ３７３、Ｌ４２３、Ｙ４２５またはＷ４７０、および別の植物のＰＰＯタンパク質における、ＯｓＰＰＯ１のアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指すか、または
前記ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡが、Ｓ１２８、Ｖ２１７、Ｓ２２３、Ｖ３６４、Ｋ３７３、Ｌ４２３、Ｙ４２５、Ｗ４７０またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＯｓＰＰＯ１アミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＰＰＯタンパク質における、ＯｓＰＰＯ１アミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする、
請求項８０に記載の方法。

【請求項85】

前記「第１の標的遺伝子」がＴＩＲ１であり、前記「遺伝子の特定の部位」が、イネＯｓＴＩＲ１タンパク質のアミノ酸配列における部位Ｆ９３、Ｆ３５７、Ｃ４１３もしくはＳ４４８、および別の植物のＴＩＲ１タンパク質における、ＯｓＴＩＲ１アミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指すか；または
前記ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡが、Ｆ９３、Ｆ３５７、Ｃ４１３、Ｓ４４８もしくはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＯｓＴＩＲ１アミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＴＩＲ１タンパク質における、ＯｓＴＩＲ１アミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする、
請求項８０に記載の方法。

【請求項86】

請求項５３～８５のいずれか一項に記載に記載の方法を使用する、非トランスジェニック一過性編集システム。

【請求項87】

選択マーカーとしてのまたは疾患の治療または生物育種における、請求項８６に記載の非トランスジェニック一過性編集システムの使用。

【請求項88】

ゲノムが、
１）第１の標的遺伝子の編集イベント；
２）第１の標的遺伝子の編集イベントと少なくとも１つの第２の標的遺伝子の編集イベント；または
３）少なくとも１つの第２の標的遺伝子編集イベント、この場合、第１の標的遺伝子の編集イベントは遺伝的分離により除去されている、
を含んでなり、非トランスジェニック様式で得られる、請求項６６～８５のいずれか一項に記載の方法によって得られる遺伝子改変植物。

【請求項89】

請求項６６～８５のいずれか一項に記載の方法によって得られる新規植物遺伝子突然変異。

【請求項90】

以下のタイプ：
アラビドプシスＡＬＳ３７６に相当する部位におけるアスパラギン酸の、任意の他のアミノ酸での置換、アラビドプシスＡＬＳ５７４に相当する部位におけるトリプトファンの、任意の他のアミノ酸での置換、アラビドプシスＡＬＳ６５３に相当する部位におけるセリンの、任意の他のアミノ酸での置換、もしくはアラビドプシスＡＬＳ６５４に相当する部位におけるセリンの、任意の他のアミノ酸での置換；またはノスズメノテッポウＡＣＣａｓｅ２０２７に相当する部位におけるトリプトファンの、任意の他のアミノ酸での置換
の１つまたは２以上の組合せを含んでなる、植物に作出された新規突然変異。

【請求項91】

アラビドプシスＡＬＳ３７６に相当する部位におけるアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、アラビドプシスＡＬＳ５７４に相当する部位におけるトリプトファンがロイシンもしくはメチオニンにより置換され、アラビドプシスＡＬＳ６５３に相当する部位におけるセリンがアスパラギンもしくはアルギニンにより置換され、またはアラビドプシスＡＬＳ６５４に相当する部位におけるグリシンがアスパラギン酸により置換され；あるいはノスズメノテッポウＡＣＣａｓｅ２０２７に相当する部位におけるトリプトファンがロイシンもしくはシステインにより置換されている、請求項９０に記載の突然変異。

【請求項92】

イネＡＬＳの部位３５０におけるアスパラギン酸が任意の他のアミノ酸により置換され、イネＡＬＳの部位５４８におけるトリプトファンが任意の他のアミノ酸により置換され、もしくはバレイショＡＬＳ２の部位５６１におけるトリプトファンが任意の他のアミノ酸により置換され；またはイネＡＣＣａｓｅ２の部位２０３８におけるトリプトファンが任意の他のアミノ酸により置換されている、請求項９０に記載の突然変異。

【請求項93】

イネＡＬＳの部位３５０におけるアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、イネＡＬＳの部位５４８におけるトリプトファンがロイシンもしくはメチオニンにより置換され、またはバレイショＡＬＳ２の部位５６１におけるトリプトファンがロイシンもしくはメチオニンにより置換され；あるいはイネＡＣＣａｓｅ２の部位２０３８におけるトリプトファンがロイシンまたはシステインにより置換されている、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の突然変異。

【請求項94】

請求項８９～９３のいずれか一項に記載の新規突然変異を含んでなるタンパク質またはその生物学的に活性な断片。

【請求項95】

請求項９４に記載のタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列または相補配列を含んでなる核酸。

【請求項96】

請求項９５に記載の核酸およびそれに機能的に連結されたプロモーターを含んでなる組換え発現ベクター。

【請求項97】

請求項９５に記載の核酸を含んでなる発現カセット。

【請求項98】

請求項９７に記載の発現カセットを含んでなる植物細胞。

【請求項99】

請求項９８に記載の植物細胞を使用することにより再分化した植物。

【請求項100】

除草剤に対する抵抗性または耐性が改良された植物を生産するための方法であって、植物細胞を請求項９６に記載の組換え発現ベクターまたは請求項９７に記載の発現カセットで形質転換またはトランスフェクトすること、および形質転換またはトランスフェクトされた植物細胞を植物に再分化させることを含んでなる、方法。

【請求項101】

植物栽培地の雑草を防除するための方法であって、前記植物が請求項８８もしくは９９に記載の植物または請求項１００に記載の方法によって生産された植物を含み、前記方法は、前記栽培地に１種類以上の除草剤を、雑草を防除するために有効な量で施与することを含んでなる、方法。

【請求項102】

除草剤に対する植物細胞、植物組織、植物部分または植物体の抵抗性または耐性の改良おける、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の新規突然変異、請求項９４に記載のタンパク質もしくはその生物学的に活性な断片、請求項９５に記載の核酸、請求項９６に記載の組換え発現ベクター、または請求項９７に記載の発現カセットの使用。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

優先件情報
本願は、２０１９年１１月７日出現された中国特許出願第２０１９１１０８１６１７．Ｘ号、２０２０年８月１５日に出願された中国特許出願第２０２０１０８２１８７７．２号、および２０２０年９月１６日に出願された中国特許出願第２０２０１０９７４１５１．２号の利益を主張するものである。上記出願は、それらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。

【技術分野】

【0002】

本発明は、遺伝子工学の技術分野に関し、特に、人工ＤＮＡ鋳型の不在下で生物内に部位特異的突然変異を作出するための方法およびその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

生物のゲノムを改変するための遺伝子工学技術は、薬学分野および化学分野で慣用される遺伝子改変微生物、ならびに農業分野での昆虫抵抗性および除草剤抵抗性を有する遺伝子改変作物など、工業生産および農業生産に広く使用されている。部位特異的ヌクレアーゼの出現により、レシピエント生物のゲノムへの標的化断片化を導入し、自発的修復を引き起こすことによって、ゲノムの部位特異的編集およびゲノムのより厳密な改変を達成することが可能となった。

【0004】

遺伝子編集ツールは主として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）に関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)（ＣＲＩＳＰＲ）という３種類の配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を含む。配列特異的ヌクレアーゼは、ゲノム中の特定の部位にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を作出することができるプログラム可能なヌクレアーゼである。ＤＮＡ二本鎖切断は、細胞においてＤＮＡ損傷を修復するための内因性ＤＮＡ修復経路を活性化するが、その修復プロセスは標的部位におけるＤＮＡ配列の変化を容易にもたらし、それにより注目する部位における突然変異の導入を達成する。この技術は、生物学者が標的遺伝子を正確に標的化しそれを編集することを可能とする。とりわけ、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方は標的配列に対する特異的認識タンパク質モジュールを設計することを必要とし、それにより低いスループットおよび複雑な操作となる。しかしながら、Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて万能であり、この場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は標的部位のみに対してもしくはトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と組み合わせて設計された特異的ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によって形成され得る、または単独の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）で十分であり、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが一緒にもしくは単独のｓｇＲＮＡがＣａｓタンパク質と集合してリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、標的配列はゲノム中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に基づいて同定され、それにより部位特異的編集が実現し、よって、それはその簡単な操作、広い適用範囲およびハイスループットのために主要な遺伝子編集となっている。

【0005】

配列特異的ヌクレアーゼは、ゲノム中の特定の部位にＤＮＡ二本鎖切断を作り出す。これらのＤＮＡ二本鎖切断は、様々な異なる修復タイプへ修復される可能性があり、これらは主として塩基の挿入または欠失である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集イベントの最も一般的な２つのタイプは、切断部の塩基の挿入または切断部の塩基の欠失である(Shen et al. 2018. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants. Nature. DOI: 10.1038/s41586-018-0686-x)。コード領域における塩基の挿入または欠失はフレームシフト突然変異を引き起こし、遺伝子機能の欠損をもたらす。よって、上記遺伝子編集ツールの主要な目的は、やはり遺伝子ノックアウトを実行することである。

【0006】

配列特異的ヌクレアーゼを使用するだけでは塩基置換のタイプの突然変異を達成できないということが常に考えられてきた。このために、従来技術では３つの解決策が提案されている：１）相同組換え修復経路を誘導するために外因性ＤＮＡ断片を修復鋳型として加えること；２）ＣからＴおよびＡからＧのための単一の塩基編集ツールを連続的に開発するためにデアミナーゼをＣａｓ９と融合させること；３）小ＤＮＡ鎖の合成および置換をガイドするためにｐｅｇＲＮＡを用いて逆転写酵素をＣａｓ９と融合させること。しかしながら、これらの３つの解決策の編集効率は、遺伝子ノックアウトの効率よりもかなり低く、同時に導入された外因性ＤＮＡ断片および逆転写酵素は、生物学的安全性の懸念にも容易につながり得る。単一塩基編集の標的外効果もまた、細胞治療における潜在的適用を制限する。特に、長期にわたる植物育種事業では、生物安全性に関する規制当局の懸念を軽減しつつ標的部位における塩基置換効率をどのように改善すればよいかは、遺伝子編集技術の適用において解決する必要のある問題である。

【0007】

概要を述べると、細胞治療および生物育種の分野では、外来のＤＮＡ断片を導入することなく、特に、部位特異的塩基置換編集を効率的に実行するための非トランスジェニック一過性編集システムを介して配列特異的ヌクレアーゼの標的化ノックアウトのみを使用することによる部位特異的塩基置換の差し迫った必要がある。

【発明の概要】

【0008】

発明の概要
本発明は、人工ＤＮＡ鋳型を提供することなくゲノムに二本鎖切断を作出することだけで生物内に部位特異的突然変異を作出するための方法およびその方法の使用を提供する。

【0009】

本発明によって採用された技術的解決策は次の通りである。
生物内に新規突然変異を作出するための方法であって、以下の工程：前記生物のゲノムの特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出する工程、およびそれらをそれぞれ自発的に修復する工程を含んでなり、後のＤＮＡ切断が前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される、方法。

【発明の具体的説明】

【0010】

特定の実施形態において、「ＤＮＡ切断」は、標的化特性を有するヌクレアーゼを生物の細胞に送達してゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させることによって達成される。

【0011】

特定の実施形態において、「標的化特性を有するヌクレアーゼ」は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。

【0012】

特定の実施形態において、「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出すること」は、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ編集によって生じた前のＤＮＡ切断修復イベントから生成された新規配列に基づき、新規ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮタンパク質がその部位を再び切断するように設計される。

【0013】

別の特定の実施形態において、「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出すること」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生じた前のＤＮＡ切断修復イベントから生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計される。例えば、第２の切断は、Ｃａｓ９編集の第１の切断修復イベントから生成された新規配列に基づいて新規標的ＲＮＡを設計することによってその部位で再び実行される。同様にして、第３の切断は、図１に示されるように、第２切断修復イベントから生成された新規配列に基づいて新規標的ＲＮＡを設計することによってその部位で実行されるなどである。

【0014】

特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、異なる標的化ヌクレアーゼを異なる世代のレシピエント細胞に連続的に送達することによって作出され、前の編集を完了した突然変異細胞が後の編集の標的化ヌクレアーゼの送達を需要するためのレシピエントとして使用され、それにより、部位特異的突然変異を生成するための第２の編集を行う。この方法は好ましくは、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ編集システムに使用される。

【0015】

別の特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、異なる標的のための異なる標的化ヌクレアーゼを同じレシピエント細胞に送達することによって作出される。この方法は好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集システムに使用される。

【0016】

特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。

【0017】

別の特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。例えば、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列は、「ＮＧＧ」または「ＮＡＧ」であり(Jinek et al., "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 2012, 337:816- 821)、黄色ブドウ球菌菌(Staphylococcus aureus)のＣａｓ９により認識されるＰＡＭ配列は、「ＮＮＧＲＲＴ」または「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」であり、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴであり、サーモフィラス菌(Streptococcus thermophilus)Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡＷである。このように、ＤＮＡ分子の編集可能枠はより大きい。

【0018】

特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼは、ゲノム編集を達成することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。

【0019】

特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼはＤＮＡの形態である。

【0020】

別の特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼは、ＤＮＡではなく、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態である。タンパク質の形態が好ましい。

【0021】

特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼを細胞に送達するための方法は、限定するものではないが、１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）エレクトロポレーション形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子銃衝撃；６）アグロバクテリウム媒介形質転換法から選択される。

【0022】

この方法において、新規標的は、前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて設計され、よって、突然変異は、ゲノム中の特定の部位に多数回連続的に作出可能であり、それにより、ＤＮＡ切断後の修復イベントのタイプが指数関数的に増え、単一の遺伝子編集では見ることのできない新規タイプの塩基置換、欠失および挿入突然変異が生成し、従って、この方法は新規突然変異を作出するためのツールとして使用するために好適である。この方法は、簡単に述べれば、プログラムされた連続的切断／編集または連続的切断／編集の方法ということができる。

【0023】

特定の実施形態において、新規標的は、生物ゲノムの特定の部位において前の切断修復から生成されると予測される新規な特定の配列に基づいて設計され、その後、連続的編集が実行され、よって、その部位における可能性のある最終的な突然変異は、予測される編集を達成するように予め設計することができる。

【0024】

別の特定の実施形態において、新規標的は、生物ゲノムの特定の部位において前の切断修復から生成されると予測される新規配列に基づいて設計され、その後、連続的編集が実行され、最終的にその部位に、予測される編集イベントに加えて、様々な異なる突然変異が生成可能であり、従って、この方法は種々の異なる突然変異を作出するためのツールとして使用することができる。

【0025】

別の側面において、本発明はさらに、生物内に新規突然変異を作出するための方法であって、以下の工程：生物のゲノムまたは染色体レベルで遺伝子の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出し、それにより正確な塩基置換、欠失または挿入を達成する工程を含んでなる方法を提供する。

【0026】

特定の実施形態において、「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出すること」は、新規標的ＲＮＡが前の切断修復イベントから生成された新規配列に基づいて設計されることを指し、その同じ部位で再び切断が実行される。

【0027】

特定の実施形態において、「ＤＮＡ切断」は、標的化特性を有するヌクレアーゼによって達成される。

【0028】

本発明はさらに、前述の方法によって得られた新規突然変異を提供する。

【0029】

本発明はさらに、前述の新規突然変異を有するタンパク質またはその生物学的に活性な断片を提供する。

【0030】

本発明はさらに、タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列またはその相補配列を含んでなる核酸を提供する。

【0031】

本発明はさらに、
（ａ）標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列
を含んでなり、前記標的ＲＮＡは、少なくとも２つの標的ＲＮＡを含んでなり、第１の標的ＲＮＡは、あるＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する核酸を提供する。

【0032】

特定の実施形態において、核酸は、（ｂ）Ｃａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる。

【0033】

特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである。

【0034】

特定の実施形態において、Ｃａｓポリペプチドおよび標的ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ ｖｉｖｏ細胞に存在する。

【0035】

本発明はさらに、前述の核酸およびそれに機能的に連結されたプロモーターを含んでなる組換え発現ベクターを提供する。

【0036】

本発明はさらに、前述の核酸を含んでなる発現カセットを提供する。

【0037】

本発明はさらに、前述の発現カセットを含んでなる宿主細胞を提供する。

【0038】

本発明はさらに、前述の宿主細胞を使用することにより再生される生物体を提供する。

【0039】

本発明はさらに、標的ＤＮＡを溶解させるための方法であって、前記標的ＤＮＡを複合体と接触させることを含んでなり、前記複合体は、
（ａ）Ｃａｓポリペプチド；および
（ｂ）少なくとも２つの標的ＲＮＡ、ここで、第１の標的ＲＮＡは、前記ＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する、
を含んでなる方法を提供する。

【0040】

特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである。

【0041】

特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、細菌細胞、真核細胞、植物細胞または動物細胞に存在する。

【0042】

特定の実施形態において、標的ＤＮＡは、染色体ＤＮＡである。

【0043】

特定の実施形態において、Ｃａｓポリペプチドおよび標的ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ ｖｉｖｏ細胞に存在する。

【0044】

特定の実施形態において、接触させることは、前記細胞に以下：（ａ）ＣａｓポリペプチドまたはそのＣａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）標的ＲＮＡまたはその標的ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することを含んでなる。

【0045】

本発明はさらに、
（ａ）Ｃａｓポリペプチド、またはそのＣａｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｂ）少なくとも２つの標的ＲＮＡ、またはそれらの標的ＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、ここで、第１のＲＮＡは、あるＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する、
を含んでなる組成物を提供する。

【0046】

特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである。

【0047】

特定の実施形態において、Ｃａｓポリペプチドおよび標的ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞またはｅｘ ｖｉｖｏ細胞に存在する。

【0048】

本発明はさらに、疾患の治療のための薬剤の製造における前記組成物の使用を提供する。

【0049】

本発明の組成物で治療可能な疾患としては、限定するものではないが、１型チロシン血症、フェニルケトン尿、プロジェリア、鎌形赤血球病などの、単一の遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患が挙げられる。自発的細胞修復は、細胞に、Ｃａｓタンパク質および病原性突然変異部位を修復すると予測されるｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ組成物に送達して正常な機能的タンパク質を生成することによって誘導され、従って、治療効果が得られる。

【0050】

本発明はさらに、
（ａ）Ｃａｓポリペプチド、またはＣａｓポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸；および
（ｂ）少なくとも２つの標的ＲＮＡ、またはそれらの標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸、ここで、第１の標的ＲＮＡは、あるＤＮＡを標的としてそのＤＮＡに切断を引き起こし、後者の標的ＲＮＡは、前の切断修復イベントから生成された配列を標的とし、再び切断を作出する
を含んでなり、（ａ）と（ｂ）は同じまたは別の容器にある、キットを提供する。

【0051】

特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡである。

【0052】

特定の実施形態において、（ｂ）の標的ＲＮＡは同じ容器または別の容器にある。

【0053】

本発明はさらに、外因性のトランスジェニックマーカーに依存しない編集イベントをスクリーニングするための方法であって、以下の工程：
１）レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の配列の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断が連続的に作出され、それぞれ自発的に修復され、後のＤＮＡ切断は、前のＤＮＡ切断の修復から生成された新規配列に基づいて生成される工程；
２）第１の標的遺伝子の特定の部位が連続的に切断され修復された後にある特定の編集イベントが生じ、これは突然変異細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して表現型選択が可能な形質を作出することができ、その形質に関して選択を行うために対応する選択圧が適用され、このような編集イベントを含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離される工程；
３）場合により、同時に別の標的部位を編集するために、第１の標的遺伝子に加えて、少なくとも１つの第２の標的遺伝子に対する標的化ヌクレアーゼが使用され、第２の標的遺伝子の編集イベントが富化され、第１の標的遺伝子の突然変異によって生成された選択可能な形質のスクリーニングを介して同期してスクリーニングされ、第１の標的遺伝子の編集イベントと少なくとも１つの第２の標的遺伝子の編集イベントを同時に含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離される工程
を含んでなる方法を提供する。

【0054】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」は、少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする遺伝子座であり、前記少なくとも１つの表現型選択が可能な形質は、抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質である。

【0055】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子の特定の部位」は、連続的切断および修復の後に、レシピエント細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して少なくとも１つの表現型選択が可能な抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質を生じ得るある特定のタイプの突然変異が生成される部位を指す。

【0056】

特定の実施形態において、「ある特定のタイプの突然変異」は、単一塩基の置換、複数塩基の置換、または不特定数の塩基の挿入もしくは欠失を含んでなる。

【0057】

特定の実施形態において、「ある特定の選択圧」は、環境圧または付加された化合物から生じる圧力であり得；例えば、環境圧は、高温、低温または低酸素などであり；付加された化合物から生じる圧力は、塩イオン濃度、抗生物質、細胞毒素、除草剤などから生じる圧力であるであり得る。

【0058】

特定の実施形態において、「ＤＮＡ切断」は、標的化特性を有するヌクレアーゼを生物の細胞に送達してゲノムＤＮＡの特定の部位と接触させることによって達成される。

【0059】

特定の実施形態において、「標的化特性を有するヌクレアーゼ」は、ゲノム編集を実行することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。

【0060】

特定の実施形態において、「配列の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断が連続的に作出される」という特徴は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントにより生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計されることを指す。

【0061】

特定の実施形態において、前記「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。

【0062】

別の特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのそれぞれによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。このように、ＤＮＡ分子の編集可能枠はより大きい。

【0063】

特定の実施形態において、「第２の標的遺伝子」は、第１の標的遺伝子とはコードが異なる別の遺伝子を指す。

【0064】

特定の実施形態において、「少なくとも１つの第２の標的遺伝子に対する標的化ヌクレアーゼ」および第１の標的遺伝子の特定の部位にＤＮＡ切断を作出するために使用される前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは同じである。

【0065】

別の特定の実施形態において、「少なくとも１つの第２の標的遺伝子に対する標的化ヌクレアーゼ」および第１の標的遺伝子の特定の部位にＤＮＡ切断を作出するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは異なる。このように、第２の標的遺伝子にはより多くの選択可能な編集部位が存在する。

【0066】

特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼは、ＤＮＡの形態である。

【0067】

別の特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼは、ＤＮＡではなくｍＲＮＡまたはタンパク質の形態である。タンパク質形態が好ましい。

【0068】

特定の実施形態において、標的化ヌクレアーゼを細胞に送達するための方法は、限定するものではないが、１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）エレクトロポレーション形質転換法；４）マイクロインジェクション；５）遺伝子銃衝撃；または６）アグロバクテリウム媒介形質転換法から選択される。

【0069】

本発明はさらに、生物ゲノムの非トランスジェニック一過性編集のための方法であって、以下の工程：
１）レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の特定の部位に対して、少なくとも２つのｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは少なくとも２つのｓｇＲＮＡ断片の組合せが設計および合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせた前記ｃｒＲＮＡ組合せまたは単独の前記ｓｇＲＮＡ組合せが、対応するＣａｓタンパク質を、レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出し、それらをそれぞれ自発的に修復するようにガイドすることができ、後のＤＮＡ切断は前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される工程；
２）適当な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または対応するそのｍＲＮＡが、上記で予め設計および合成された、第１の標的遺伝子の部位特異的編集を内因性の選択マーカーを生成するようにガイドすることができるｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは単独のｓｇＲＮＡ断片組合せと混合され、場合により、第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つがさらに付加され、ＲＮＰ複合体を形成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションが行われる工程；
３）遺伝子編集を達成するために、上記ＲＮＰ複合体がレシピエント細胞に送達され、ゲノムＤＮＡの特定の部位と接触される工程；
４）ＲＮＰ複合体による第１の標的遺伝子の部位特異的編集によって生成された表現型選択が可能な形質に従い、その形質に関して選択を行うために対応する選択圧が適用され
、その編集イベントを含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離され、場合により、第１の標的遺伝子の編集イベントと第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子のうち少なくとも１つの編集イベントを同時に含む細胞、組織、器官または完全な生物体が単離される工程、
を含んでなる方法を提供する。

【0070】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」は、少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする遺伝子座であり、前記少なくとも１つの表現型選択が可能な形質は
、抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質である。

【0071】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子の特定の部位」は、連続的切断および修復の後に、レシピエント細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して少なくとも１つの表現型選択が可能な抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質を生じ得るある特定のタイプの突然変異が生成される部位を指す。

【0072】

特定の実施形態において、「ある特定のタイプの突然変異」は、単一塩基の置換、複数塩基の置換、または不特定数の塩基の挿入もしくは欠失を含んでなる。

【0073】

特定の実施形態において、「ある特定の選択圧」は、環境圧または付加された化合物から生じる圧力であり得、例えば、前記環境圧は、高温、低温または低酸素などであり、付加された化合物から生じる圧力は、塩イオン濃度、抗生物質、細胞毒素または除草剤などから生じる圧力であり得る。

【0074】

特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ゲノム編集を実行することができる人のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。

【0075】

特定の実施形態において、「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出する」という特徴は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントにより生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計されることを指す。

【0076】

特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。

【0077】

別の特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのそれぞれによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。このように、ＤＮＡ分子の編集可能枠はより大きい。

【0078】

特定の実施形態において、「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子」は、第１の標的遺伝子とはコードが異なる他の遺伝子を指す。

【0079】

特定の実施形態において、「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」は、第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを有する同じＣａｓタンパク質を有する。

【0080】

別の特定の実施形態において、「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」ならびに第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を使用する。このように、第２の標的遺伝子にはより多くの選択可能な編集部位が存在する。

【0081】

特定の実施形態において、ＲＮＰ複合体を細胞に送達するための方法は、限定するものではないが、１）ＰＥＧ媒介細胞トランスフェクション法；２）リポソーム媒介細胞トランスフェクション法；３）エレクトロポレーション形質転換法；４）マイクロインジェクション；または５）遺伝子銃衝撃などから選択される。

【0082】

本発明はさらに、植物ゲノムの非トランスジェニック一過性編集のための方法であって、以下の工程：
１）レシピエント植物細胞または組織の第１の標的遺伝子の特定の部位に対して、少なくとも２つのｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは少なくとも２つのｓｇＲＮＡ断片の組合せが設計および合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡと組み合わせた前記ｃｒＲＮＡ組合せまたは単独の前記ｓｇＲＮＡ組合せが、対応するＣａｓタンパク質を、レシピエント細胞の第１の標的遺伝子の特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に作出し、それらをそれぞれ自発的に修復するようにガイドすることができ、後のＤＮＡ切断は前のＤＮＡ切断修復から生成された新規配列に基づいて生成される工程；
２）適当な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質または対応するそのｍＲＮＡが、上記で予め設計および合成された、第１の標的遺伝子の部位特異的編集を内因性の選択マーカーを生成するようにガイドすることができるｃｒＲＮＡ断片とｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組合せまたは単独のｓｇＲＮＡ断片組合せと混合され、場合により、第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つがさらに付加され、ＲＮＰ複合体を形成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベーションが行われる工程；
３）遺伝子編集を達成するために、上記ＲＮＰ複合体がレシピエント植物細胞または組織に送達され、ゲノムＤＮＡの特定の部位と接触される工程；
４）ＲＮＰ複合体による第１の標的遺伝子の部位特異的編集によって生成された表現型選択が可能な形質に従い、その形質に関して選択を行うために対応する選択圧が適用され、その編集イベントを含む細胞、組織、基間、または完全な植物体が単離され、場合により、第１の標的遺伝子の編集イベントと第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子のうち少なくとも１つの編集イベントを同時に含む細胞、組織、器官または完全な植物体が単離される工程を含んでなる方法を提供する。

【0083】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」は、少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする遺伝子座であり、前記少なくとも１つの表現型選択が可能な形質が抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質である。

【0084】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子の特定の部位」は、その部位における連続的切断および修復の後に、レシピエント細胞にある特定の選択圧に対する抵抗性を付与して少なくとも１つの表現型選択が可能な抵抗性／耐性形質または成長に有利な形質を生じ得るある特定のタイプの突然変異が生成される部位を指す。

【0085】

特定の実施形態において、「ある特定のタイプの突然変異」は、単一塩基の置換、複数塩基の置換、または不特定数の塩基の挿入もしくは欠失を含んでなる。

【0086】

特定の実施形態において、「ある特定の選択圧」は、環境圧または付加された化合物から生じる圧力であり得、例えば、環境圧は、好ましくは高温、低温または低酸素などであり、付加された化合物から生じる圧力は、塩イオン濃度、抗生物質、細胞毒素または除草剤などから生じる圧力であり得る。

【0087】

特定の実施形態において、「レシピエント植物細胞または組織」は、一過性発現のレシピエントとして働くことができ、かつ、組織培養によって完全な植物体に再分化することができる任意の細胞または組織である。特に、前記細胞は、プロトプラスト細胞または懸濁細胞であり、前記組織は、好ましくはカルス、未熟胚、成熟胚、葉、茎頂、幼穂、胚軸などである。

【0088】

特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ゲノム編集を実行することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。

【0089】

特定の実施形態において、「特定の部位に２箇所以上のＤＮＡ切断を連続的に生成する」という特徴は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって生成された前のＤＮＡ切断修復イベントによって生成された新規配列に基づき、新規標的ＲＮＡがその部位を再び切断するように設計されることを指す。

【0090】

特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、異なるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをそれぞれ有する同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによって形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。

【0091】

別の特定の実施形態において、「２箇所以上のＤＮＡ切断」は、各ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡで異なるＰＡＭ配列を認識する２つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのそれぞれによって個々に形成されたＲＮＰ複合体が、対応する標的配列を連続的に切断する場合に作出される。このように、ＤＮＡ分子の編集可能枠はより大きい。

【0092】

特定の実施形態において、「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子」は、第１の標的遺伝子とはコードが異なる他の遺伝子を指す。

【0093】

特定の実施形態において、「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」は、第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを有する同じＣａｓタンパク質を有する。

【0094】

別の特定の実施形態において、「第２、第３またはそれ以降の標的遺伝子を標的とする人工的に合成されたｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ断片または人工的に合成されたｓｇＲＮＡ断片のうちの少なくとも１つ」ならびに第１の標的遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、異なるＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を使用する。このように、第２の標的遺伝子にはより多くの選択可能な編集部位が存在する。

【0095】

特定の実施形態において、ＲＮＰ複合体を植物細胞に送達するための方法は、限定するものではないが、１）ＰＥＧ媒介細胞プロトプラスト形質転換法；２）マイクロインジェクション；；３）遺伝子銃衝撃；４）炭化ケイ素繊維媒介方法；または５）真空浸潤法、または任意の他の一過性導入法から選択される。遺伝子銃衝撃が好ましい。

【0096】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」は、除草剤抵抗性／耐性から選択される少なくとも１つの表現型選択が可能な形質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子であり、前記除草剤抵抗性／耐性は、ＥＰＳＰＳ阻害剤（グリホサートを含む）に対する抵抗性／耐性、グルタミン合成阻害剤（グルホシネートを含む）に対する抵抗性／耐性、ＡＬＳまたはＡＨＡＳ阻害剤（イミダゾリンまたはスルホニル尿素を含む）に対する抵抗性／耐性、ＡＣＣａｓｅ阻害剤（アリールオキシフェンオキシプロピオン酸（ＦＯＰ）を含む）に対する抵抗性／耐性、カロテノイド生合成阻害剤（フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）段階のカロテノイド生合成阻害剤、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤またはその他のカロテノイド生合成標的阻害剤を含む）に対する抵抗性／耐性、セルロース阻害剤に対する抵抗性／耐性、脂質合成阻害剤に対する抵抗性／耐性、長鎖脂肪酸阻害剤に対する抵抗性／耐性、微小管重合阻害剤に対する抵抗性／耐性、光化学系Ｉ電子シャント剤に対する抵抗性／耐性、光化学系ＩＩ阻害剤（カルバミン酸塩、トリアジンおよびトリアゾンを含む）に対する抵抗性／耐性、ＰＰＯ阻害剤に対する抵抗性／耐性、および合成成長ホルモン（ジカンバ、２，４－Ｄ（すなわち、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）を含む）に対する抵抗性／耐性からなる群から選択される。ここで、第１の標的遺伝子は、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣａｓｅ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、ＴＩＲ１、ＡＦＢ５から選択され、これらの除草剤標的遺伝子の特定の部位において連続的切断および修復の後に作出されるいくつかのタイプの突然変異は、レシピエント植物細胞に対応する除草剤に対する抵抗性／耐性を付与し得る。

【0097】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」はＡＬＳであり、「遺伝子の特定の部位」は、アラビドプシス(Arabidopsis)ＡｔＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１に示される通り）における部位Ａ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｄ３７６、Ｒ３７７、Ｗ５７４、Ｓ６５３またはＧ６５４、および別の植物のＡＬＳタンパク質における、ＡｔＡＬＳアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指す。ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ａ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｄ３７６、Ｒ３７７、Ｗ５７４、Ｓ６５３、Ｇ６５４またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＡｔＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＡＬＳタンパク質における、ＡｔＡＬＳアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする。ＡＬＳ Ｗ５７４部位が好ましい。選択圧は、好ましくは、ピロキシスラムまたはニコスルフロン処理である。

【0098】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」はＡＣＣａｓｅであり、「遺伝子の特定の部位」は、ノスズメノテッポウ(Alopecurus myosuroides)ＡｍＡＣＣａｓｅタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３に示される通り、遺伝子配列は配列番号４に示される通り）における部位Ｉ１７８１、Ｅ１８７４、Ｎ１８７８、Ｗ１９９９、Ｗ２０２７、Ｉ２０４１、Ｄ２０７８、Ｃ２０８８またはＧ２０９６、およびＡｍＡＣＣａｓｅアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当する別の単子葉植物のＡＣＣａｓｅタンパク質のアミノ酸部位を指す。ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｉ１７８１、Ｅ１８７４、Ｎ１８７８、Ｗ１９９９、Ｗ２０２７、Ｉ２０４１、Ｄ２０７８、Ｃ２０８８、Ｇ２０９６またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＡｍＡＣＣａｓｅアミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の単子葉植物のＡＣＣａｓｅタンパク質における、ＡｍＡＣＣａｓｅアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする。ＡＣＣａｓｅ Ｗ２０２７部位が好ましい。選択圧は、好ましくは、キザロホップ－ｐ－エチル処理である。

【0099】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」がＨＰＰＤであり、前記「遺伝子の特定の部位」がイネ(Oryza sativa)ＯｓＨＰＰＤタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５に示される通り、ゲノム配列は配列番号６に示される通り）における部位Ｈ１４１、Ｌ２７６、Ｐ２７７、Ｎ３３８、Ｇ３４２、Ｒ３４６、Ｄ３７０、Ｐ３８６、Ｋ４１８またはＧ４１９、および別の植物のＨＰＰＤタンパク質における、ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指す。ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｈ１４１、Ｌ２７６、Ｐ２７７、Ｎ３３８、Ｇ３４２、Ｒ３４６、Ｄ３７０、Ｐ３８６、Ｋ４１８、Ｇ４１９またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＨＰＰＤタンパク質における、ＯｓＨＰＰＤアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする。選択圧は、好ましくはビンスカルフェントラゾン(biscarfentrazone)処理である。

【0100】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」はＰＰＯであり、「遺伝子の特定の部位」は、イネＯｓＰＰＯ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７に示される通り、ゲノム配列は配列番号８に示される通り）における部位Ｓ１２８、Ｖ２１７、Ｓ２２３、Ｖ３６４、Ｋ３７３、Ｌ４２３、Ｙ４２５またはＷ４７０、および別の植物のＰＰＯタンパク質における、ＯｓＰＰＯ１のアミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指す。ｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡは、Ｓ１２８、Ｖ２１７、Ｓ２２３、Ｖ３６４、Ｋ３７３、Ｌ４２３、Ｙ４２５、Ｗ４７０またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＯｓＰＰＯ１アミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびにＯｓＰＰＯ１アミノ酸配列を参照標準として使用して、別の植物のＰＰＯタンパク質に相当する上述のアミノ酸部位およびそれらの組合せの配列を含んでなる標的配列を標的とする。選択圧は、好ましくはサフルフェナシル処理である。

【0101】

特定の実施形態において、「第１の標的遺伝子」はＴＩＲ１であり、「遺伝子の特定の部位」は、イネＯｓＴＩＲ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９に示される通り、ゲノム配列は配列番号１０に示される通り）における部位Ｆ９３、Ｆ３５７、Ｃ４１３またはＳ４４８、および別の植物のＴＩＲ１タンパク質における、ＯｓＴＩＲ１アミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位に相当するアミノ酸部位を指す。ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｆ９３、Ｆ３５７、Ｃ４１３、Ｓ４４８、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＯｓＴＩＲ１アミノ酸配列部位をコードする配列を含んでなる標的配列、ならびに別の植物のＴＩＲ１タンパク質における、ＯｓＴＩＲ１アミノ酸配列を参照標準として使用することにより上記アミノ酸部位、およびそれらの任意の組合せに相当するアミノ酸部位をコードする配列を含んでなる標的配列を標的とする。選択圧は、好ましくは２，４－Ｄ処理である。

【0102】

本発明はさらに、前述の方法を使用する非トランスジェニック一過性編集システムを提供する。

【0103】

本発明はさらに、選択マーカーとしての前述の非トランスジェニック一過性編集システムの使用を提供する。

【0104】

本発明はさらに、疾患の治療における前述の非トランスジェニック一過性編集システムの使用を提供する。

【0105】

本発明はさらに、生物育種における前述の非トランスジェニック一過性編集システムの使用を提供する。

【0106】

本発明はさらに、前述の方法によって得られる、ゲノムに第１の標的遺伝子の編集イベントを含む遺伝子改変植物を提供し、遺伝子改変植物は非トランスジェニック様式で得られる。

【0107】

本発明はさらに、前述の方法によって得られる、ゲノムに第１の標的遺伝子の編集イベントを含み、さらに少なくとも１つの第２の標的遺伝子編集イベントを含む遺伝子改変植物を提供し、遺伝子改変植物は非トランスジェニック様式で得られる。

【0108】

本発明はさらに、前述の方法によって得られる、ゲノムに少なくとも１つの第２の標的遺伝子編集イベントを含む遺伝子改変植物を提供し、遺伝子改変植物は非トランスジェニック様式で得られ、第１の標的遺伝子編集イベントは遺伝的分離によって除去されている。

【0109】

本発明はさらに、ゲノムに１）第１の標的遺伝子の編集イベント；２）第１の標的遺伝子の編集イベントと少なくとも１つの第２の標的遺伝子の編集イベント；または３）少なくとも１つの第２の標的遺伝子編集イベント、この場合、第１の標的遺伝子の編集イベントは遺伝的分離により除去されている、を含んでなり、非トランスジェニック様式で得られる、前述の方法によって得られる遺伝子改変植物のゲノムを提供する。

【0110】

本発明の別の側面は、前述の方法によって得られる新規植物遺伝子突然変異を提供する。

【0111】

本発明はまた、以下のタイプ：
アラビドプシスＡＬＳ３７６に相当する部位におけるアスパラギン酸の、任意の他のアミノ酸での置換、アラビドプシスＡＬＳ５７４に相当する部位におけるトリプトファンの、任意の他のアミノ酸での置換、アラビドプシスＡＬＳ６５３に相当する部位におけるセリンの、任意の他のアミノ酸での置換、もしくはアラビドプシスＡＬＳ６５４に相当する部位におけるセリンの、任意の他のアミノ酸での置換；またはノスズメノテッポウＡＣＣａｓｅ２０２７に相当する部位におけるトリプトファンの、任意の他のアミノ酸での置換の１つまたは２以上の組合せを含んでなる、植物に作出された新規突然変異を提供する。

【0112】

特定の実施形態において、アラビドプシスＡＬＳ３７６に相当する部位におけるアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され（Ｄ３７６Ｅ）、アラビドプシスＡＬＳ５７４に相当する部位におけるトリプトファンがロイシンもしくはメチオニンにより置換され（Ｗ５７４ＬもしくはＷ５７４Ｍ）、アラビドプシスＡＬＳ６５３に相当する部位におけるセリンがアスパラギンもしくはアルギニンにより置換され（Ｓ６５３ＮもしくはＳ６５３Ｒ）、またはアラビドプシスＡＬＳ６５４に相当する部位におけるグリシンがアスパラギン酸により置換され（Ｇ６５４Ｄ）、ここで、これらのアミノ酸部位は、シロイヌナズナの対応するアミノ酸の部位を参照として使用することにより述べられる；あるいはノスズメノテッポウＡＣＣａｓｅ２０２７に相当する部位におけるトリプトファンがロイシンまたはシステインにより置換され（Ｗ２０２７ＬまたはＷ２０２７Ｃ）、ここで、これらのアミノ酸部位は、ノスズメノテッポウの対応するアミノ酸の部位を参照として使用することにより述べられる。

【0113】

別の特定の実施形態において、突然変異タイプはＳ６５３Ｒ／Ｇ６５４Ｄであり、これらのアミノ酸部位は、シロイヌナズナの対応するアミノ酸部位を参照として使用することにより述べられる。

【0114】

特定の実施形態において、イネＡＬＳの部位３５０におけるアスパラギン酸は任意の他のアミノ酸により置換され、イネＡＬＳの部位５４８におけるトリプトファンは任意の他のアミノ酸により置換され、もしくはバレイショ(Solanum tuberosum L.)ＡＬＳ２の部位５６１におけるトリプトファンは任意の他のアミノ酸により置換され；またはイネＡＣＣａｓｅ２の部位２０３８におけるトリプトファンは任意の他のアミノ酸により置換されている。

【0115】

別の特定の実施形態において、イネＡＬＳの部位３５０におけるアスパラギン酸はグルタミン酸により置換され（Ｄ３５０Ｅ）、イネＡＬＳの部位５４８におけるトリプトファンはロイシンもしくはメチオニンにより置換され（Ｗ５４８ＬもしくはＷ５４８Ｍ）、またはバレイショＡＬＳ２の部位５６１におけるトリプトファンがロイシンもしくはメチオニンにより置換され（Ｗ５６１ＬもしくはＷ５６１Ｍ）；あるいはイネＡＣＣａｓｅ２の部位２０３８におけるトリプトファンがロイシンまたはシステインにより置換され（Ｗ２０３８ＬまたはＷ２０３８Ｃ）、ここで、イネＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１１に示され、バレイショＳｔＡＬＳ２タンパク質のアミノ酸配は配列番号１９に示され、イネＡＣＣａｓｅ２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１３に示される。

【0116】

本発明はさらに、前述の新規突然変異を有するタンパク質またはその生物学的に活性な断片を提供する。

【0117】

本発明はまた、前記タンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列または相補配列を含んでなる核酸を提供する。

【0118】

本発明はさらに、核酸およびそれに機能的に連結されたプロモーターを含んでなる組換え発現ベクターを提供する。

【0119】

本発明はさらに、核酸を含んでなる発現カセットを提供する。

【0120】

本発明はさらに、発現カセットを含んでなる植物細胞を提供する。

【0121】

本発明はさらに、前記植物細胞を使用することにより再分化された植物を提供する。

【0122】

本発明の別の側面は、除草剤に対する抵抗性または耐性が改良された植物を生産するための方法であって、前記植物細胞を植物体に再分化させることを含んでなる、方法。

【0123】

本発明の別の側面は、植物栽培地の雑草を防除するための方法であって、前記植物が前述の植物または前述の方法によって生産された植物を含み、栽培地に１種類以上の除草剤を、雑草を防除するために有効な量で施与することを含んでなる方法を提供する。

【0124】

本発明の別の側面はまた、除草剤に対する植物細胞、植物組織、植物部分または植物体の抵抗性または耐性の改良おける、新規突然変異、タンパク質もしくはその生物学的に活性な断片、核酸、組換え発現ベクターまたは発現カセットの使用を提供する。

【0125】

本発明は以下の優れた技術効果を有する：
連続的編集によって生じた新規修復イベントから生成された配列に基づいて新規標的を設計することができ、これはゲノム中の特定の部位に多数回連続的に突然変異を形成することができ、それによりＤＮＡ切断後の修復イベントのタイプが指数関数的に増え、単一の遺伝子編集では見ることのできない新規タイプの塩基置換、欠失および挿入突然変異が実現する。すなわち、前の遺伝子編集修復から生成された配列を後の遺伝子編集標的として使用する、本発明により採用されるプログラムされた連続的切断／編集法は、単純なノックアウトを介する一塩基編集および部位に正確な欠失および挿入という新規機能を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを提供する。

【0126】

本発明は、外因性マーカーの不在下で遺伝子編集イベントのスクリーニングを実現し、さらに、非トランスジェニック遺伝子編集を実現することができ、細胞治療および生物育種における方法の生物学的安全性の懸念を大幅に軽減することができる。

【0127】

特に、本発明によって提供される植物非トランスジェニック一過性編集法は、Ｃａｓタンパク質および人工的に合成されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの小断片を含むだけで、工程のどこにも外因性ＤＮＡの関与はなく、第１の標的遺伝子を連続的切断／編集を介して編集することによって内因性抵抗性選択マーカーを作出し、従って、編集イベントは、事実上、遺伝子改変操作を含まずに効果的にスクリーニングすることができ、よって、この方法は化学的突然変異誘発法または放射線誘導育種法と同等であり、何世代にもわたる継続的な外因性トランスジェニック成分の分離および検出の必要もなく、これにより育種周期が短縮され、生物学的安全性が保証され、管理費用および承認費用が節約でき、厳密な植物育種に多大な応用展望が提供される。

【発明を実施するための形態】

【0128】

発明の詳細な説明
本発明において、特に断りのない限り、本明細書に使用される科学用語および技術用語は、当業者に共通に理解されている意味を有する。さらに、タンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学、免疫学関連用語および本明細書に使用される研究手順は総て、対応する分野で広く使用されている用語および常法である。同時に、本発明をより良く理解するために、関連用語の定義および説明を以下に示す。

【0129】

用語「ゲノム」は、本明細書において使用する場合、生物の各細胞もしくはウイルスもしくはオルガネラに存在する遺伝物質（遺伝子および非コード配列）の総ての相補物、ならびに／または一単位（ハプロイド）として親から受け継いだ完全なゲノムを指す。

【0130】

用語「遺伝子編集」は、生きている生物の遺伝情報またはゲノムの標的化された特定の改変を行うための戦略および技術を指す。従って、遺伝子コード領域の編集を含むだけでなく、ゲノムの遺伝子コード領域以外の領域の編集も含む。この用語はまた、核（存在する場合）および細胞のその他の遺伝情報の編集または改変も含む。

【0131】

用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ」は、限定されるものではないが、１）ＳｐＣａｓ９、ＳｃＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ｘＣａｓ９、ＶＲＥＲ－Ｃａｓ９、ＥＱＲ－Ｃａｓ９、ＳｐＧ－Ｃａｓ９、ＳｐＲＹ－Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＮＧ－Ｃａｓ９、ＮＧＡ－Ｃａｓ９（ＶＱＲ）などを含むＣａｓ９；２）ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、ＭＡＤ７などを含むＣａｓ１２、または上記ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼの任意の変異体もしくは誘導体を含むＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼまたはそれをコードする核酸配列であり得、好ましくは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼは、対応する野生型配列に比べて、得られたＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼが異なるＰＡＭ配列を認識するような突然変異を含んでなる。本明細書において使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼ」は、天然のＣＲＩＳＰＲシステムで確認され、その後、その天然バックグラウンドから単離され、好ましくは改変または組み合わせて、標的ゲノム工学のツールとして好適な、対象とする組換え構築物とされた任意のヌクレアーゼである。元の野生型ＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼがＤＮＡ認識、すなわち、結合特性を提供する限り、いずれのＣＲＩＳＰＲ系ヌクレアーゼも使用可能であり、場合により、本発明の種々の実施形態に好適となるようにリプログラムまたはそうでなければ突然変異されていてもよい。

【0132】

用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、遺伝子発現を転写レベルで調節するＲＮＡ干渉とは異なる、クラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)に頼る配列特異的遺伝子操作技術を指す。

【0133】

「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」および「Ｃａｓ９」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（例えば、活性なＣａｓ９のＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含んでなるＲＮＡガイドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復および関連システム）ゲノム編集システムの一成分である。ガイドＲＮＡの誘導下でＤＮＡ標的配列を標的として切断してＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成することができる。

【0134】

「Ｃａｓタンパク質」または「Ｃａｓポリペプチド」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によりコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。Ｃａｓタンパク質は、細菌または古細菌タンパク質であり得る。例えば、本明細書のＩ～ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、一般に原核生物に起源し、Ｉ型およびＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌または古細菌種に由来し、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓ９）は細菌種に由来し得る。「Ｃａｓタンパク質」には、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、またはそれらの組合せもしくは複合体が含まれる。

【0135】

「Ｃａｓ９変異体」または「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体」は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの変異体を指し、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃＲＮＡに、またはｓｇＲＮＡに会合した場合、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、ＤＮＡ標的配列の全部または一部を認識してそれに結合し、場合により、ＤＮＡ標的配列の全部または一部を解き、ＤＮＡ標的配列の全部もしくは一部にニックを入れるか、またはＤＮＡ標的配列の全部もしくは一部を切断する能力を保持する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体には、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体が含まれ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、以下のように親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼとは異なる：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（標的部位を改変し得るポリヌクレオチド特異的エンドヌクレアーゼ複合体を形成するためのｇＲＮＡとの複合体とした場合）は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（同じ標的部位を改変し得るポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成するために同じｇＲＮＡとの複合体とした場合）に比べて、限定されるものではないが、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、標的外切断の低減、またはそれらの任意の組合せなどの少なくとも１つの改良された特性を有する。

【0136】

本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体には、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡに、またはｓｇＲＮＡに会合した場合の二本鎖ＤＮＡ標的部位に結合してニックを入れることができる変異体が含まれるが、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡに、またはｓｇＲＮＡに会合した場合に標的部位に結合して二本鎖切断（切断）を生じ得る。

【0137】

「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書においては互換的に使用され、通常、複合体を形成するように部分的に相補的なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子からなり、ｃｒＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）に標的配列と特異的に結合するよう指示するために標的配列と十分な相補性を有する配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いた補正のために特定の遺伝子を標的とするために使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。しかしながら、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の特性を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計し得ることも当技術分野で公知である。

【0138】

用語「シングルガイドＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」は、本明細書においては互換的に使用され、可変の標的化ドメイン（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたトレーサー対合配列に連結）のｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）の融合を含んでなる、２つのＲＮＡ分子の合成融合を指す。ｓｇＲＮＡは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含んでなってよく、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合によりＤＮＡ標的部位に結合し、または場合によりＤＮＡ標的部位にニック入れるかもしくはＤＮＡ標的部位を切断する（一本鎖または二本鎖切断を導入する）ことができるように、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に誘導することができる。

【0139】

特定の実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体として細胞に送達することができる。ＲＮＰは、ｇＲＮＡとの複合体とされた精製Ｃａｓ９タンパク質から構成され、ＲＮＰが、限定されるものではないが、幹細胞および免疫細胞を含む多くのタイプの細胞に効率的に送達可能であることは当技術分野で周知である(Addgene, Cambridge, MA, Mirus Bio LLC, Madison, WI)。

【0140】

本明細書において、プロトスペーサー隣接モチーフ(protospacer adjacent motif)（ＰＡＭ）は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムによって認識される（標的とされた）標的配列（プレスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。この標的ＤＮＡ配列が適当なＰＡＭ配列に隣接しなければ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは標的ＤＮＡ配列を上手く認識することはできない可能性がある。本明細書におけるＰＡＭの配列および長さは、使用するＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体によって異なり得る。ＰＡＭ配列はいずれの長さであってもよいが、一般には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。

【0141】

本明細書において使用する場合、用語「生物」または「生体」は、動物、植物、真菌、細菌などを含む。

【0142】

本明細書において使用する場合、用語「宿主細胞」は、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞などを含む。

【0143】

本発明において、「動物」としては、限定するものではないが、脊椎動物、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類など、ならびに無脊椎動物、例えば、昆虫が挙げられる。

【0144】

本発明において、「植物」は、光合成を行うことができるいずれの分化した多細胞生物も意味すると理解されるべきであり、特に、単子葉植物または双子葉植物、例えば、以下のものである：（１）食用作物：イネ属種(Oryza spp.)、例えば、イネ(Oryza sativa）、野生イネ(Oryza latifolia)、イネ(Oryza sativa）、アフリカイネ（Oryza glaberrima)；コムギ属種(Triticum spp.)、例えば、コムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(T. Turgidumssp. Durum)； オオムギ属種(Hordeum spp.)、例えば、オオムギ(Hordeum vulgare)、ホルデウム・アリゾニカム(Hordeum arizonicum)；ライムギ (Secale cereale)；カラスムギ属種(Avena spp.)、例えば、エンバク(Avena sativa)、カラスムギ(Avena fatua)、アベナ・ビザンチン(Avena byzantine)、アベナ・ファツアｖａｒ．サティバ(Avena fatua var.sativa)、アベナ・ハイブリダ(Avena hybrida)；ヒエ属種(Echinochloa spp.)、例えば、トウジンビエ(Pennisetum glaucum)、ソルガム、ソルガム(Sorghum bicolor)、ソルガム・バルガレ(Sorghum vulgare)、ライコムギ、ゼア・メイ (Zea mays)またはトウモロコシ、キビ、イネ、アワ(Foxtail millet)、キビ、ソルガム(Sorghum bicolor)、キビ属(Panicum)、ソバ属種(Fagopyrum spp.)、キビ(Panicum miliaceum)、アワ(Setaria italica)、ワイルドライス(Zizania palustris)、テフ(Eragrostis tef)、キビ(Panicum miliaceum)、シコクビエ(Eleusine coracana); （２）マメ科作目：ダイズ属種(Glycine spp.)、例えば、ダイズ(Glycine max)、ソーヤ・ヒスピダ(Soja hispida)、ソーヤ・マックス(Soja max)、ソラマメ属種(Vicia spp.)、ササゲ属種(Vigna spp.)、エンドウ属種(Pisum spp.)、ソラマメ、ルピナス属種(Lupinus spp.)、ソラマメ属、タマリンド(Tamarindus indica)、レンズマメ(Lens culinaris)、レンリソウ属種(Lathyrus spp.)、フジマメ、ソラマメ、リョクトウ、アズキ、ヒヨコマメ；（３）油料作物：ラッカセイ(Arachis hypogaea)、ラッカセイ属種(Arachis spp)、偽ゴマ属種(Sesamum spp.)、ヒマワリ属種(Helianthus spp.)、例えば、ヒマワリ(Helianthus annuus)、アブラヤシ属(Elaeis)、例えば、アブラヤシ(Eiaeis guineensis)、アメリカアブラヤシ(Elaeis oleifera)、ダイズ、セイヨウアブラナ(Brassicanapus)、ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)、ゴマ(Sesamum orientale)、カラシナ(Brassica juncea)、ナタネ、アブラツバキ(Camellia oleifera)、アブラヤシ、オリーブ、ひまし油植物、セイヨウアブラナ(Brassica napus L.)、カノーラ；（４）繊維作物：サイザルアサ(Agave sisalana)、ワタ属種(Gossypium spp.)、例えば、ワタ属(Gossypium)、ゴシピウム・バルバデンセ(Gossypium barbadense)、ゴシピウム・ヒルスツムGossypium hirsutum）、ケナフ(Hibiscus cannabinus)、サイザルアサ(Agave sisalana)、マニラアサ(Musa textilis Nee)、アマ(Linum usitatissimum)、コウマ(Corchorus capsularis L)、カラムシ(Boehmeria nivea) (L.)、アサ(Cannabis sativa)、アサ(Cannabis sativa)；（５）果実作物：ナツメ属種(Ziziphus spp.)、キュウリ属種(Cucumis spp.)、パッションフルーツ(Passiflora edulis)、ブドウ属種(Vitis spp.)、スノキ属種(Vaccinium spp.)、セイヨウナシ(Pyrus communis)、サクラ属種(Prunus spp.)、バンジロウ属種(Psidium spp.)、ザクロ(Punica granatum)、リンゴ属種(Malus spp.)、スイカ(Citrullus lanatus)、ミカン属種(Citrus spp.)、イチジク(Ficus carica)、キンカン属種(Fortunella spp.)、オランダイチゴ属種(Fragaria spp.)、サンザシ属種(Crataegus spp.)、カキノキ属種(Diospyros spp.)、ピタンガ(Eugenia unifora)、ビワ(Eriobotrya japonica)、リュウガン(Dimocarpus longan)、パパイヤ(Carica papaya)、ヤシ属種(Cocos spp.)、スターフルーツ(Averrhoa carambola)、マタタビ属種(Actinidia spp.)、アーモンド(Prunus amygdalus)、バショウ属種(Musa spp.) （マレーヤマバショウ(musa acuminate)）、ワニナシ属種(Persea spp.)（アボカド(Persea Americana)）、グァバ(Psidium guajava)、マメーリンゴ(Mammea Americana)、マンゴー(Mangifera indica)、カンラン(Canarium album)（オリーブ(Oleaeuropaea)）、パパイヤ)(Caricapapaya)、ココヤシ(Cocos nucifera)、アセロラ(Malpighia emarginata)、サポジラ(Manilkara zapota)、パイナップル(Ananas comosus)、アナナス属種(Annona spp.)、ポンカン(Citrus reticulate)（ミカン属種）、パンノキ属種(Artocarpus spp.)、レイシ(Litchi chinensis)、スグリ属種(Ribes spp.)、キイチゴ属種(Rubus spp.)、セイヨウナシ、モモ、
アンズ、ウメ、ヤマモモ、レモン、キンカン、ドリアン、オレンジ、イチゴ、ブルーベリー、ハミウリ、マスクメロン、ナツメヤシ、クルミ、サクラ；（６）根茎作物：キャッサバ属種(Manihot spp.)、サツマイモ(Ipomoea batatas)、サトイモ(Colocasia esculenta)、塊茎カラシ、アリウム・セパ(Allium cepa) （タマネギ）、エレオカリス・ツベロサ(eleocharis tuberose)(シログワイ)、ハマスゲ(Cyperus rotundus)、サンヤク(Rhizoma dioscoreae)；（７）野菜作物：ホウレンソウ属種(Spinacia spp.)、インゲンマメ属(Phaseolus spp.)、レタス(Lactuca sativa)、ツルレイシ属種(Momordica spp)、パセリ(Petroselinum crispum)、トウガラシ属種(Capsicum spp.)、ナス属種(Solanum spp.)（例えば、バレイショ(Solanum tuberosum)、ヒラナス(Solanum integrifolium)、トマト(Solanum lycopersicum)）、トマト属種(Lycopersicon spp.)（例えば、トマト(Lycopersicon esculentum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、リコペルシコン・ピリフォルム(Lycopersicon pyriforme)）、マクロチロマ属種(Macrotyloma spp.)、ケール、トカドヘチマ(Luffa acutangular)、レンティル、オクラ、タマネギ、バレイショ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ(Brussels sprouts)、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、カラードグリーン、カボチャ、トウガン(Benincasa hispida)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、セロリ(Apium graveolens)、ヒユ属種(Amaranthus spp.)、ネギ属種(Allium spp.)、トロロアオイ属種(Abelmoschus spp.)、エンダイブ(Cichorium endivia)、カボチャ属種(Cucurbita spp.)、コリアンダー(Coriandrum sativum)、アピシニアガラシ(B.carinata)、ダイコン(Rapbanus sativus)、アブラナ属種(Brassica spp.)（例えば、ナタネ(Brassica napus)、カブ種(Brassica rapa ssp.)、キャノーラ、ナタネ、アブラナ、アブラナ、カラシナ、キャベツ、クロガラシ、キャノーラ（ナタネ）、
メキャベツ、ナス科(Solanaceae)(ナス)、アマトウガラシ(Capsicum annuum)(ピーマン)、キュウリ、ヘチマ、ハクサイ、アブラナ、キャベツ、ヒョウタン、ニラ、ハス、レンコン、レタス；（８）花卉作物：ノウゼンハレン(Tropaeolum minus)、キンレンカ(Tropaeolum majus)、ダンドク(Canna indica)、ウチワサボテン属種(Opuntia spp.)、マンジュギク属種(Tagetes spp.)、シンビジウム属(Cymbidium)（ラン）、ハマユウ(Crinum asiaticum L.)、クンシラン、アマリリス(Hippeastrum rutilum)、ハマナス(Rosa rugosa)、コウシンバラ(Rosa Chinensis)、マツリカ(Jasminum sambac)、チューリップ(Tulipa gesneriana L.)、サクラ属種(Cerasus sp.)、ファルビチス・ニル(Pharbitis nil)(L.)アサガオ、キンセンカ(Calendula officinalis L.)、ハス属種(Nelumbo sp.)、ヒナギク(Bellis perennis L.)、カーネーション(Dianthus caryophyllus)、ペチュニア(Petunia hybrida)、チューリップ(Tulipa gesneriana L.)、リリウム・ブラウニー(Lilium brownie)、ウメ(Prunus mume)、スイセン(Narcissus tazetta L.)、オウバイ(Jasminum nudiflorum Lindl.)、オトメザクラア(Primula malacoides)、ジンチョウゲ(Daphne odora)、ツバキ(Camellia japonica)、ギンコウボク(Michelia alba)、モクレン(Magnolia liliiflora)、ムーシュウチュウ(Viburnum macrocephalum)、クンシラン(Clivia miniate)、ホンカイドウ(Malus spectabilis)、ボタン(Paeonia suffruticosa)、シャクヤク(Paeonia lactiflora)、チョウジ(Syzygium aromaticum)、アザレア(Rhododendron simsii)、シャクナゲ(Rhododendron hybridum)、カラタネオガタマ(Michelia figo (Lour.) Spreng.)、ハナズオウ(Cercis chinensis)、ヤマブキ(Kerria japonica)、タニウツギ(Weigela florida)、レンギョウ(Fructus forsythyae)、オウバイモドキ(Jasminum mesnyi)、ブルークローバー(Parochetus communis)、シクラメン(Cyclamen persicum Mill.)、コチョウラン交配種(Phalaenophsis hybrid)、デンドロビウム・ノビル(Dendrobium nobile)、ヒヤシンス(Hyacinthus orientalis)、イチハツ(Iris tectorum Maxim)、オランダカイウ(Zantedeschia aethiopica)、キンセンカ(Calendula officinalis)、ヒイロサンジコ(Hippeastrum rutilum)、
ベゴニア・センパフローレンス(Begonia semperflorenshybr)、フクシア(Fuchsia hybrida)、シラホシベゴニア(Begonia maculataRaddi)、（ゼラニウム）、ポトス(Epipremnum aureum)；（９）薬用作物：ベニバナ(Carthamus tinctorius)、ハッカ属種(Mentha spp.)、ルバーブ(Rheum rhabarbarum)、サフラン(Crocus sativus)、クコ(Lycium chinense)、ポリゴナツム・オドラツム(Polygonatum odoratum)、ポリゴナツム・キンギアヌム(Polygonatum Kingianum)、ハナスゲ(Anemarrhena asphodeloides Bunge)、バクモンドウ(Radix ophiopogonis)、バイオ(Fritillaria cirrhosa)、キョウオウ(Curcuma aromatica)、ヨウシュンシャ(Amomum villosum Lour.)、ツルドクダミ(Polygonum multiflorum)、シンシュウダイオウ(Rheum officinale)、カンゾウ(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、キバナオウギ(Astragalus membranaceus)、チョウセンニンジン(Panax ginseng)、サンシチニンジン(Panax notoginseng)、ゴカヒ(Acanthopanax gracilistylus)、トウキ(Angelica sinensis)、センキュウ(Ligusticum wallichii)、ミシマサイコ(Bupleurum sinenses DC.)、シロバナチョウセンアサガオ(Datura stramonium Linn.)、チョウセンアサガオ(Datura metel L.)、タイワンハッカ(Mentha haplocalyx)、メハジキ(Leonurus sibiricus L.)、カワミドリ(Agastache rugosus)、コガネバナ(Scutellaria baicalensis)、ウツボグサ(Prunella vulgaris L.)、ピレトルム・カルネウム(Pyrethrum carneum)、イチョウ(Ginkgo biloba L.)、ボリビアキナノキ(Cinchona ledgeriana)、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)（野生種）、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa Linn)、コショウ(Piper Nigrum L.)、バンランコン(Radix Isatidis)、オオバナオケラ(Atractylodes macrocephala Koidz)；（１０）原料作物：パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)、トウゴマ(Ricinus communis)、オオアブラギリ(Vernicia fordii)、クワ(Morus alba L.)、ホップ(Humulus lupulus)、カバノキ属(Betula)、アルヌス・クレマストギン・ブルク(Alnus cremastogyne Burk.)、ウルシ(Rhus verniciflua stokes)；（１１）牧草作物：カモジグサ属種(Agropyron spp.)、シャジクソウ属種(Trifolium spp.)、ススキ(Miscanthus sinensis)、チカラシバ属種(Pennisetum sp.)、クサヨシ(Phalaris arundinacea)、パニクム・ウィルガツム(Panicum virgatum)、プレーリーグラス、インディアングラス、ビッグブルーステムグラス、オオアワガエリ(Phleum pratense)、シバ、カヤツリグサ科(cyperaceae)(コブレシア・ピグマエア(Kobresia pygmaea)、タカヒカゲスゲ(Carex pediformis)、ホソバヒカゲスゲ(Carex humilis))、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa Linn)、オオアワガエリ(Phleum pratense L.)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、シナガワハギ(Melilotus suavcolen)、ゲンゲ(Astragalus sinicus)、サンヘンプ(Crotalaria juncea)、ツノクサネム(Sesbania cannabina)、アカウキクサ(Azolla imbircata)、ホテイアオイ(Eichhornia crassipes)、クロバナエンジュ(Amorpha fruticose)、ルピナス(Lupinus micranthus)、シャジクソウ属(Trifolium)、ムラサキモメンヅル(Astragalus adsugens pall)、ボタンウキクサ(Pistia stratiotes linn)、ナガエツルノゲイトウ(Alternanthera philoxeroides)、ドクムギ属(Lolium)；（１２) 糖料作物：サトウキビ属種(Saccharum spp.)、テンサイ(Beta vulgaris)；（１３）飲料作物：チャノキ(Camellia sinensis)、チャノキ(Camellia Sinensis)、チャ、コーヒー（コーヒーノキ属種(coffea spp.))、カカオ(Theobroma cacao)、
ホップ(Humulus lupulus Linn.)；（１４）芝生植物：ビーチグラス(Ammophila arenaria)、イチゴツナギ属種(Poa spp.)(ナガハグサ(Poa pratensis)(ブルーグラス))、ヌカボ属種(Agrostis spp.)(ヌカボ(Agrostis matsumurae)、コヌカグサ(Agrostis palustris))、ドクムギ属種(Lolium spp.) (ネズミムギ)、ウシノケグサ属種(Festuca spp.) （ウシノケグサ(Festuca ovina L.)）、シバ属種(Zoysia spp.)（ノシバ(Zoysiajaponica)）、ギョウギシバ属種(Cynodon spp.) (ギョウギシバ(Cynodon dactylon)／バミューダグラス)、セントオーガスチングラス (Stenotaphrum secundatum)、スズメノヒエ属(Paspalum spp.)、ムカデシバ(Eremochloa ophiuroides) (センチピードグラス)、アキソノプス属種(Axonopus spp.)（カーペットグラス）、ボウテロウア・ダクチロイデス(Bouteloua dactyloides) （バッファローグラス）、ボウテロウア属品種(Bouteloua var. spp.)（ブルーグラマ(Bouteloua gracilis)）、メヒシバ(Digitaria sanguinalis)、ハマスゲ(Cyperus rotundus)、ヒメクグ(Kyllingabrevifolia)、チャガヤツリ(Cyperusamuricus)、ヒメムカシヨモギ(Erigeron canadensis)、チドメグサ(Hydrocotylesibthorpioides)、ヤハズソウ(Kummerowiastriata)、ニシキソウ(Euphorbia humifusa)、ビオラ・アルベンシス(Viola arvensis)、ノヤマスゲ(Carex rigescens)、カレックス・ヘテロスタキヤ(Carex hetelostachya)、シバ；（１５）樹木作物：マツ属種(Pinus spp.)、ヤナギ属種(Salix spp.)、カエデ属種(Acer spp.)、フヨウ属種(Hibiscus spp.)、ユーカリ属種(Eucalyptus spp.)、イチョウ(Ginkgo biloba)、ホウライチク属種(Bambusa sp.)、ハコヤナギ属種(Populus spp.)、プロソピス属種(Prosopis spp.)、コナラ属種(Quercus spp.)、ナツメヤシ属種(Phoenix spp.)、ブナ種(Fagus spp.)、パンヤノキ(Ceiba pentandra)、ニッケイ属種(Cinnamomum spp.)、シナソ属種(Corchorus spp.)、ヨシ(Phragmites australis)、ホオズキ属種(Physalis spp.)、ヌスビトハギ属種(Desmodium spp.)、ハコヤナギ、セイヨウキヅタ(Hedera helix)、モウハクヨウ(Populus tomentosa Carr)、サンゴジュ(Viburnum odoratissinum)、イチョウ(Ginkgo biloba L.)、コナラ属(Quercus)、ニワウルシ(Ailanthus altissima)、ツバキ(Schima superba)、ナナメノキ(Ilex purpurea)、モミジバスズカケノキ(Platanus acerifolia)、トウネズミモチ(ligustrum lucidum)、ブクスス・メジストフィラ・レブル(Buxus megistophylla Levl.)、ダフリアカラマツ(Dahurian larch)、ブラックワトル(Acacia mearnsii)、バビショウ(Pinus massoniana)、カシアマツ(Pinus khasys)、ショウコウ(Pinus yunnanensis)、ウンナンマツ(Pinus finlaysoniana)、アブラマツ(Pinus tabuliformis)、チョウセンゴョウマツ(Pinus koraiensis)、クロクルミ(Juglans nigra)、レモン(Citrus limon)、モミジバスズカケノキ(Platanus acerifolia)、フトモモ(Syzygium jambos)、ハンカチノキ(Davidia involucrate)、キワタ(Bombax malabarica L.)、パンヤノキ(Ceiba pentandra (L.))、バウヒニア・ブラケアナ(Bauhinia blakeana)、アメリカネムノキ(Albizia saman)、ネムノキ(Albizzia julibrissin)、サンゴシトウ(Erythrina corallodendron)、デイコ(Erythrina indica)、タイサンボク(Magnolia grandiflora)、ソテツ(Cycas revolute)、サルスベリ(Lagerstroemia indica)、針葉樹、高木、低木；（１６）堅果作物：ブラジルナッツノキ(Bertholletia excelsea)、クリ属種(Castanea spp.)、ハシバミ属種(Corylus spp.)、ペカン属種(Carya spp.)、クルミ属種(Juglans spp.)、ピスタチオ(Pistacia vera)、カシュー(Anacardium occidentale)、マカダミア(Macadamia integrifolia)、ペカン(Carya illinoensis Koch)、マカダミア、ピスタチオ、アーモンド、堅果を産生するその他の植物；（１７）その他：シロイヌナズナ(arabidopsis thaliana)、ヒメスズメノヒエ(Brachiaria eruciformis)、シンクリノイガ(Cenchrus echinatus)、エノコログサ(Setaria faberi)、オヒシバ(eleusine indica)、カダバ・ファリノーサ(Cadaba farinose)、藻類、カレックス・エラータ(Carex elata)、観賞植物、オオバナカリッサ(Carissa macrocarpa)、チョウセンアザミ属種(Cynara spp.)、
ニンジン(Daucus carota)、ヤマノイモ属種(Dioscorea spp.)、エリアンサス属種(Erianthus sp.)、オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)、ワスレグサ(Hemerocallis fulva)、ミヤコグサ属種(Lotus spp.)、オオスズメノヤリ(Luzula sylvatica)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、シナガワハギ属種(Melilotus spp.)、クロミグワ(Morus nigra)、タバコ属種(Nicotiana spp.)、オリーブ属種(Olea spp.)、オルニソプス属種(Ornithopus spp.)、アメリカボウフウ(Pastinaca sativa)、ニワトコ属種(Sambucus spp.)、シロガラシ属種(Sinapis sp.)、シジギウム属種(Syzygium spp.)、ガマグラス(Tripsacum dactyloides)、リンパウイ(Triticosecale rimpaui)、ニオイスミレ(Viola odorata)など。

【0145】

特定の実施形態において、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、ナタネ、ムラサキウマゴヤシ、ワタ、オオムギ、キビ、サトウキビ、トマト、タバコ、キャッサバ、バレイショ、サツマイモ、ハクサイ、キャベツ、キュウリ、ブッソウゲ、ポトス(Scindapsus aureus)、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、ミカン、モモ、セイヨウナシ、バナナなどから選択される。

【0146】

本明細書において使用する場合、用語「植物」は、植物全体および植物のいずれの後代、細胞、組織または部分も含む。用語「植物部分」は、例えば、限定するものではないが、種子（成熟種子、種皮を含まない未熟胚、および未熟種子を含む）；挿し穂；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、蕾、葉、根、茎、および関連の外植体）を含む植物のいずれの部分も含む。植物組織または植物器官は、種子、カルス組織、または構造もしくは機能的単位に組織化された他のいずれかの植物細胞集団であり得る。植物細胞または組織培養物は、その細胞または組織が由来する植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、その植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができる。これに対して、植物を再生できない植物細胞もある。植物細胞または組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、絹糸、花、仁、穂、穂軸、鞘、または茎であり得る。

【0147】

植物部分は、収穫可能な部分および後代植物を繁殖させるために使用できる部分を含んでなる。繁殖に使用可能な植物部分としては、例えば、限定するものではないが、種子；果実；接ぎ穂；実生；塊茎；および根茎が挙げられる。収穫可能な植物部分は、例えば、限定するものではないが：花；花粉；実生；塊茎；葉；茎；果実；種子；および根を含む有用な植物部分のいずれであってもよい。

【0148】

植物細胞は、植物の構造的および生理学的単位である。本明細書において使用する場合、植物細胞にはプロトプラストおよび部分的に細胞壁を有するプロトプラストが含まれる。植物細胞は、単離された単細胞または細胞凝集塊（例えば、ルーズカルスおよび培養細胞）の形態であってもよく、より高次の組織単位（例えば、植物組織、植物器官、および植物体）の一部であってもよい。従って、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子生産細胞、または完全な植物を再生することができる細胞もしくは細胞集合物であり得る。従って、本明細書における実施形態において、複数の植物細胞を含有し、完全な植物に再生可能な種子は「植物部分」と見なされる。

【0149】

本明細書において使用する場合、用語「プロトプラスト」は、細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、脂質二重膜が露出している植物細胞を指す。一般に、プロトプラストは、細胞培養物または完全な植物を再生する能力を有する、細胞壁のない単離された植物細胞である。

【0150】

植物「後代」には、植物のいずれの後続世代も含む。

【0151】

用語「細菌」は、原核生物界の総ての生物を含む総ての原核生物を意味する。用語「細菌」は、マイコプラズマ属、クラミジア属、アクチノミセス属、ストレプトミセス属、およびリケッチア属を含む、細菌と見なされる総ての微生物を含む。この定義には、球菌、桿菌、螺旋状菌、スフェロプラスト、プロトプラストなどを含むあらゆる形態の細菌が含まれる。この用語はまた、グラム陰性またはグラム陽性である原核生物も含む。「グラム陰性」および「グラム陽性」は、当技術分野で周知のグラム染色法（例えば、Finegold and Martin, Diagnostic Microbiology, 6th Ed., CV Mosby St. Louis, pp. 13 -15[1982]を参照のこと）を用いた染色パターンを意味する。「グラム陽性細菌」は、グラム染色に使用される原色素を保持することができる細菌であり、染色された細胞は顕微鏡下で濃青色～紫色に見える。「グラム陰性菌」は、グラム染色に使用される原色素を保持しないが、対比色素で染まる。よって、グラム陰性菌は、グラム染色反応後に赤く見える。

【0152】

本明細書において使用する場合、用語「真菌」は、二相性真菌を含む、カビおよび酵母などの真核生物を指す。

【0153】

用語「除草剤耐性」および「除草剤抵抗性」は、互換的に使用可能であり、両方とも除草剤耐性および除草剤抵抗性を指す。「除草剤耐性の改良」および「除草剤抵抗性の改良」は、除草剤に対する耐性または抵抗性が、野生型遺伝子を含む植物に比べて改良されていることを意味する。

【0154】

用語「野生型」は、自然界で見出すことができる核酸分子またはタンパク質を指す。

【0155】

本発明において、用語「栽培地」は、本発明の植物が栽培される土壌などの場所を含んでなり、また、例えば、植物種子、植物実生および生育植物も含んでなる。用語「雑草を防除する有効量」は、標的雑草の生長または発達に影響を及ぼすため、例えば、標的雑草の生長もしくは発達を妨げるもしくは阻害するため、または雑草を枯死させるために十分な除草剤の量を指す。有利には、雑草を防除する有効量は、本発明の植物種子、植物実生または植物の生長および／または発達に有意な影響を及ぼさない。当業者は、慣例の実験からこのような雑草を防除する有効量を決定することができる。

【0156】

用語「標的ＤＮＡ」は、本明細書において使用する場合、「標的部位」または「標的配列」を含んでなるＤＮＡポリヌクレオチドを指す。

【0157】

用語「溶解(lysis)」は、ＤＮＡ分子の共有結合性の主鎖の切断を意味する。溶解は、限定するものではないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む様々な方法によって誘発させることができる。一本鎖および二本鎖両方の溶解が可能であり、二本鎖溶解は２つの異なる一本鎖溶解イベントによって生じ得る。ＤＮＡ溶解は、平滑末端または突出末端を生じ得る。特定の実施形態において、ＤＮＡ標的化ＲＮＡおよび部位特異的改変ポリペプチドを含んでなる複合体が標的化二本鎖ＤＮＡ溶解のために使用される。

【0158】

用語「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む機能的分子（例えば、限定するものではないが、特定のタンパク質）を発現する核酸断片を含んでなる。

【0159】

特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列とは、ＲＮＡへ転写され得るＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質へ翻訳され得るＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードすることができ、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質へ翻訳できないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、もしくはＤＮＡ標的化ＲＮＡ；これらは「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」としても知られる）をコードすることもできる。

【0160】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本発明においては互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応するおよび天然のアミノ酸の人為的化学類似体である、アミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」はまた、限定するものではないが、グリコシル化、脂質連結、硫酸化、グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、水酸化およびＡＤＰ－リボシル化を含む、それらの修飾形態も含み得る。

【0161】

用語「生物学的に有効な断片」は、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から１以上のアミノ酸残基が欠損しているがその機能活性を保持している断片を指す。

【0162】

本明細書で使用されるアミノ酸置換に関する用語に関して、最初の文字は、特定の配列中の特定の位置の天然アミノ酸を表し、その後の数字は、対応する配列中の位置を表し、２つ目の文字は、天然アミノ酸を置換するための異なるアミノ酸を表す。例えば、Ｗ５７４Ｌは、５７４番の位置のトリプトファンがロイシンにより置換されていることを意味する。二重または多重突然変異に関しては、各突然変異を「／」で分ける。

【0163】

用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互換的に使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッドを含んでなり、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。

【0164】

用語「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」は両方とも、ＤＮＡまたはＲＮＡにおける塩基の配列を指す。

【0165】

本発明において使用される場合、「発現カセット」、「発現ベクター」および「発現構築物」は、植物において対象とするヌクレオチド配列の発現に好適な、組換えベクターなどのベクターを指す。用語「発現」は、機能的生成物の産生を指す。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（例えば、ｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡを生成するための転写）および／またはＲＮＡの、前駆体または成熟タンパク質への翻訳を指し得る。

【0166】

本発明の「発現構築物」は、線状核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクターであり得、またはいくつかの実施形態では、翻訳され得るＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。

【0167】

本発明の「発現構築物」は、異なる供給源からの対象とする調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ供給源からの対象とする調節配列およびヌクレオチド配列を含んでなり得るが、通常天然に存在するものとは異なる様式で配置されている。

【0168】

用語「組換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築物」は、本明細書においては互換的に使用され、ベクターおよび少なくとも１つの挿入配列を含んでなるＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは、通常、挿入配列の発現および／または増幅の目的で、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために作出される。この挿入配列はプロモーター配列に、作動可能に連結してもよいし、または作動不能に連結してもよく、またはＤＮＡ調節配列に、作動可能に連結してもよいし、または作動不能に連結してもよい。

【0169】

用語「調節配列」および「調節要素」は、互換的に使用され、コード配列の上流（５’非コード配列）、中流または下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。植物発現調節要素は、植物における対象とするヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳を制御し得るヌクレオチド配列を指す。

【0170】

調節配列としては、限定するものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリＡ認識配列が挙げられる。

【0171】

用語「プロモーター」は、別の核酸フラグメントの転写を制御し得る核酸フラグメントを指す。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターは、それが植物細胞に由来するかどうかにかかわらず、植物細胞において遺伝子の転写を制御し得るプロモーターである。このプロモーターは、構成プロモーターまたは組織特異的プロモーターまたは発達段階により調節されるプロモーターまたは誘導プロモーターであり得る。

【0172】

用語「構成プロモーター」は、一般に、ほとんどの場合、ほとんどの細胞腫で遺伝子発現を生じるプロモーターを指す。「組織特異的プロモーター」および「組織好適プロモーター」は、互換的に使用され、必ず例外なくというわけではないが主としてある組織または器官で発現され、また、特定の細胞または細胞種でも発現されるプロモーターを指す。「発達段階により調節されるプロモーター」とは、活性が発達事象によって決定されるプロモーターを指す。「誘導プロモーター」は、内因性または外因性刺激（環境、ホルモン、化学シグナルなど）に応答して作動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。

【0173】

本明細書において使用する場合、用語「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の転写が転写調節要素によって制御および調節されるような、調節要素（例えば、限定するものではないが、プロモーター配列、転写終結配列など）と核酸配列（例えば、コード配列またはオープンリーディングフレーム）の連結を指す。調節要素領域と核酸分子を作動可能に連結するための技術は当技術分野で公知である。

【0174】

核酸分子（例えば、プラスミド、線状核酸フラグメント、ＲＮＡなど）またはタンパク質を植物に「導入すること」とは、核酸またはタンパク質が植物細胞内で機能し得るように植物細胞をその核酸またはタンパク質で形質転換することを指す。本発明において使用される用語「形質転換」は、安定形質転換および一過性形質転換を含んでなる。

【0175】

用語「安定形質転換」は、外因性ヌクレオチド配列の植物ゲノムへの導入がその外因性遺伝子の安定な遺伝をもたらすことを指す。ひと度、安定に形質転換されると、外因性核酸配列は植物ゲノムおよびそのいずれの後代にも安定に組み込まれる。

【0176】

用語「一過性形質転換」は、機能を遂行するための核酸分子またはタンパク質の植物細胞への導入が外来遺伝子の安定な遺伝をもたらさないことを指す。一過性形質転換において、外因性核酸配列は、植物ゲノムに組み込まれない。

【0177】

特に定義のない限り、本明細書において使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価ないずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用可能であるが、以下、好ましい方法および材料を説明する。

【0178】

本明細書に引用されている総ての刊行物および特許は、各個の刊行物および特許が正確かつ個々に引用することにより本明細書の一部とされ、および引用されている刊行物に関連する方法および／または材料を開示および記載するために引用することにより本明細書の一部とされるかのように、引用することにより本明細書の一部とされる。出願日までに刊行されたいずれの刊行物の引例も、本発明が既存の発明の公開に先行するに適格でないことを承認するものと解釈されるべきでない。さらに、示されている公開日は実際の公開日とは異なることがあり、実際の公開日は独立検証を要する場合がある。

【0179】

特に記載や暗示のない限り、本明細書において使用する場合、「１つの(a)」、「１つの(a/an)」および「その(the)は、「少なくとも１つの」を意味する。本明細書に記載または引用される総ての特許、特許出願、および刊行物は、それらが個々に引用されている場合と同じ引例の程度で、それらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。

【図面の簡単な説明】

【0180】

【図1】図１は、本発明に従って生物内に新規突然変異を作出するための方法の概略図を示す。この図では、ＰＡＭとしてＮＧＧを有するＣａｓ９のみを例に挙げているが、同様にして、異なるＰＡＭ（例えばＮＧ）を有する他のＣａｓ９変異体も使用可能である。

【図2】図２は、シロイヌナズナのＡＬＳ遺伝子部位Ｗ５７４およびＳ６５３におけるｇＲＮＡ設計の概略図を示す。

【図3】図３は、２つの異なるプログラムされた連続的切断／編集ベクターで形質転換されたシロイヌナズナＴ２世代除草剤抵抗性系統を示す。ｐＱＹ７４３およびｐＱＹ７４５はベクター番号である。抵抗性系統は正常に発根することができたが、野生型Ｃｏｌ－０および非抵抗性系統はそうではなかった。

【図4】図４は、イマザピック抵抗性Ｔ２世代シロイヌナズナ系統のＡＬＳ遺伝子のシーケンシグピークの図を示し、矢印で示されるＴはＧから変異し、Ｗ５７４Ｌ変異を生じている。

【図5】図５は、シロイヌナズナのＡＬＳ遺伝子のＷ５７４部位におけるプログラムされた連続的切断／編集スキームの設計を示す。Ｔ－ＤＮＡ配列は、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、Ｃａｓ９およびＨｙｇＲの４つの遺伝子を発現した。それらのうち、ｓｇＲＮＡ１とＣａｓ９は複合体を形成し、これはゲノム中のＡＬＳのＷ５７４コドンを切断し、細胞の自発的修復を介して－Ｇ遺伝子型を形成すると思われた。この新規配列は、ｓｇＲＮＡ２とＣａｓ９によって形成された複合体によって認識および切断可能であり、細胞の自発的修復を介して＋Ｔ遺伝子型を形成し、Ｗ５７４Ｌを生じていた。

【図6】図６は、イマザピックによってスクリーニングされたシロイヌナズナの抵抗性実生およびＡＬＳ Ｗ５７４部位のシーケンシング結果を示す。

【図7】図７は、シロイヌナズナのＡＬＳ遺伝子のＳ６５３部位におけるプログラムされた連続的切断／編集スキームの設計を示す。Ｔ－ＤＮＡ配列は、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、Ｃａｓ９およびＨｙｇＲの４つの遺伝子を発現した。それらのうち、ｓｇＲＮＡ１とＣａｓ９は複合体を形成し、これはゲノム中のＡＬＳのＳ６５３コドンを切断する。細胞の自発的修復の後、－Ｇ遺伝子型が形成された。この配列はｓｇＲＮＡ２とＣａｓ９によって形成された複合体によって認識および切断可能であった。細胞の自発的修復の後、＋Ａ遺伝子型が形成され、Ｓ６５３Ｎが生じてした。

【図8】図８は、イマザピックによってスクリーニングされたシロイヌナズナの抵抗性実生およびＡＬＳ Ｓ６５３部位のシーケンシング結果を示す。左のパネルは抵抗性実生のスクリーニング結果および抵抗性実生の比率を示し、右のパネルはシーケンシングピークの図およびＳ６５３部位の突然変異のタイプを示す。

【図9】図９は、シロイヌナズナのＡＬＳ遺伝子のＷ５７４部位におけるプログラムされた連続的切断／編集スキームの設計を示す。Ｔ－ＤＮＡ配列は、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、Ｃａｓ９およびＨｙｇＲの４つの遺伝子を発現した。それらのうち、ｓｇＲＮＡ１およびＣａｓ９は複合体を形成し、これはゲノム中のＡＬＳのＷ５７４コドンを切断する。細胞の自発的修復の後、＋Ａ遺伝子型が形成された。この配列はｓｇＲＮＡ２とＣａｓ９によって形成された複合体によって認識および切断可能であった。細胞の自発的修復の後、－Ｇ遺伝子型が形成され、Ｗ５７４Ｍが生じていた。これら２つの切断は異なるＰＡＭ部位を使用していた。

【図10】図１０は、イネのＡＣＣａｓｅ２遺伝子のＷ２０３８部位におけるプログラムされた連続的切断／編集スキームの設計を示す。この部位は、ノスズメノテッポウのＡＣＣａｓｅ２遺伝子の部位Ｗ２０２７に相当する。Ｔ－ＤＮＡ配列は、ｓｇＲＮＡ１、ｓｇＲＮＡ２、Ｃａｓ９およびＨｙｇＲの４つの遺伝子を発現した。それらのうち、ｓｇＲＮＡ１とＣａｓ９は複合体を形成し、これはゲノム中のＡＣＣａｓｅのＷ２０３８コドンを切断する。細胞の自発的修復の後に－Ｇ遺伝子型が形成された。この配列はｓｇＲＮＡ２とＣａｓ９によって形成された複合体によって認識および切断可能であった。細胞の自発的修復の後、＋Ｔ遺伝子型が形成され、Ｗ２０３８Ｌが生じていた。

【図11】図１１は、ハイグロマイシン（５０ｕｇ／Ｌ）およびキザロホップ－ｐ（５０ｕｇ／Ｌ）で同時スクリーニングされたイネの抵抗性カルスおよびＷ２０３８部位のシーケンシング結果を示す。

【図12】図１２は、原核生物発現により産生され、精製されたＳｐＣａｓ９およびＮＧＡ－Ｃａｓ９タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の図を示す。矢印で示されるバンドは、Ｃａｓ９タンパク質バンドである。

【図13】図１３は、アガロースゲル電気泳動により検出された、ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８標的部位およびＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８標的部位を含むＤＮＡ断片に対する精製Ｃａｓ９タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断活性を示し、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡ断片が同時に添加された場合にのみ、ＤＮＡ断片が予測された大きさに切断され得ることが見て取れる。

【図14】図１４は、ＲＮＰ形質転換イネプロトプラストのＯｓＡＬＳ Ｗ５４８標的部位のシーケンシングピークの図を示し、この部位はシロイヌナズナのＡＬＳ Ｗ５７４部位に相当する。元のＧ塩基シグナルピークに加え、矢印で示される場所に突然変異によって得られたＴ塩基シグナルピークが存在し、Ｗ５４８Ｌ変異に至っていた。

【図15】図１５は、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位においてＲＮＰにより編集され、５０ｕｇ／Ｌ キザロホップ－ｐでスクリーニングされたイネの抵抗性カルスを示す。矢印は抵抗性カルスを示す。

【図16】図１６は、抵抗性カルスから分化したイネ実生のＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８標的部位のシーケンシングピークの図を示す。矢印で示されるＴはＧから変異し、Ｗ２０３８Ｌ変異を生じていた。

【図17】図１７は、ハロキシホップ－ｐに対するＴ１世代ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８Ｌ編集実生の抵抗性試験を示す。左から右へ、実生１番は野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５（イネ品種）の水処理対照の結果を示し、実生２～４番は、野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５および２つのＲＮＰで遺伝子銃により形質転換したＴ１世代Ｗ２０３８Ｌ編集系統ＱＹ３６７－７－１２およびＱＹ３６７－７－１８の結果を示し、これらは総て５ｇ／ｍｕ（ｍｕ、面積の単位、１ｍｕ＝１／１５ヘクタール）のハロキシホップ－ｐ有効成分で処理した。編集された系統がハロキシホップ－ｐに対する抵抗性を生じたことは明らかである。

【図18】図１８は、キザロホップ－ｐに対するＴ１世代ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８Ｌ編集実生の抵抗性試験を示す。左から右へ、実生１番は野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５の水処理対照の結果を示し、実生２～４番は、野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５および２つのＲＮＰで遺伝子銃により形質転換されたＴ１世代Ｗ２０３８Ｌ編集系統ＱＹ３６７－５－１０およびＱＹ３６７－５－２１の結果を示し、これらは総て５ｇ／ｍｕのハロキシホップ－ｐ有効成分で処理した。編集された系統がハロキシホップ－ｐに対する抵抗性を生じたことは明らかである。

【図19】図１９は、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位およびＯｓＢＡＤＨ２遺伝子においてＲＮＰによって同時に編集し、５０ｕｇ／Ｌキザロホップ－ｐでスクリーニングしたイネの抵抗性カルスを示す。矢印は抵抗性カルスを示す。

【図20】図２０は、Ｔ０世代２部位編集実生のＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８標的部位のシーケンシングピークの図を示す。矢印で示されるＴはＧから変異し、Ｗ２０３８Ｌ変異を生じていた。

【図21】図２１は、Ｔ０世代２部位編集実生のＯｓＢＡＤＨ２標的部位のシーケンシングピークの図を示す。＋Ａ同型接合突然変異が矢印で示される位置に生じていた。

【図22】図２２は、ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４遺伝子においてＲＮＰによって同時に編集され、５ｍｇ／Ｌピロキシスラムでスクリーニングしたイネの抵抗性カルスを示す。矢印は抵抗性カルスを示す。

【図23】図２３は、Ｔ０世代２部位編集実生のＯｓＡＬＳ Ｗ５４８標的部位のシーケンシングピークの図を示す。Ｇ塩基およびＴ塩基の両方のシグナルピークが矢印で示される位置に存在し、Ｗ５４８Ｌ変異を生じていた。

【図24】図２４は、Ｔ０世代２部位編集実生のＯｓＳＷＥＥＴ１４標的部位のシーケンシングピークの図を示す。－Ｃ同型接合突然変異が矢印で示される部位に生じていた。

【図25】図２５は、ニコスルフロンに対するＴ１世代ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４２部位編集実生の抵抗性試験を示す。左から右へ、実生１番は野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５の水処理対照の結果を示し、実生２～３番は、野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５およびＲＮＰで遺伝子銃により形質転換されたＴ１世代Ｗ５４８Ｌ編集系統ＱＹ３６０－７－１１の結果を示し、これらは両方とも４ｇ／ｍｕのニコスルフロン有効成分で処理した。編集された系統がニコスルフロンに対する抵抗性を生じたことは明らかである。

【図26】図２６は、フルカルバゾン－Ｎａに対するＴ１世代ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４２部位編集実生の抵抗性試験を示す。左から右へ、実生１番は野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５の水処理対照の結果を示し、実生２～３番は、野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５およびＲＮＰで遺伝子銃により形質転換されたＴ１世代Ｗ５４８Ｌ編集系統ＱＹ３６０－７－９の結果を示し、これらは両方とも２ｇ／ｍｕのフルカルバゾン－Ｎａ有効成分で処理した。これらの編集系統がフルカルバゾン－Ｎａに対する抵抗性を生じたことは明らかである。

【図27】図２７は、イマザピックに対するＴ１世代ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４２部位編集実生の抵抗性試験を示す。左から右へ、実生１番は野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５の水処理対照の結果を示し、実生２～３番は、野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５およびＲＮＰで遺伝子銃により形質転換されたＴ１世代Ｗ５４８Ｌ編集系統ＱＹ３６０－７－１１の結果を示し、これらは両方とも７ｇ／ｍｕイマザピック有効成分で処理した。これらの編集系統がイマザピックに対する抵抗性を生じたことは明らかである。

【図28】図２８は、ピロキシスラムに対するＴ１世代ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４２部位編集実生の抵抗性試験を示す。左から右へ、実生１番は野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５の水処理対照の結果を示し、実生２４３番は、野生型Ｈｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５およびＲＮＰ ＲＮＰで遺伝子銃により形質転換されたＴ１世代Ｗ５４８Ｌ編集系統ＱＹ３６０－７－２およびＱＹ３６０－７－１１の結果を示し、これらは総て２ｇ／ｍｕピロキシスラム有効成分で処理した。これらの編集系統がピロキシスラムに対する抵抗性を生じたことは明らかである。

【図29】図２９は、２９３Ｔ細胞におけるＨＢＢ遺伝子のプログラムされた連続的切断／編集スキームを示す。Ａ．２９３Ｔ細胞におけるプログラムされた連続的切断／編集のためのＨＢＢ遺伝子部位の設計を示す；Ｂ．各編集ベクターの４８時間の形質転換後の、２９３Ｔ細胞におけるＨＢＢ遺伝子のプログラムされた連続的切断／編集の変換効率；Ｃ．２９３Ｔ細胞におけるＨＢＢ遺伝子のプログラムされた連続的切断／編集およびＨＢＢ遺伝子の単一の部位切断／編集から生成された遺伝子編集タイプの比率；ＷＴ：野生型、ｉｎｄｅｌ：欠失または挿入の遺伝子型、Ｃ－＞Ｔ ＳＮＰ：切断部におけるＣからＴへの塩基置換を有する遺伝子型。

【0181】

配列表の説明
本発明に含まれる主要な配列は次のようにまとめられ、関連する配列は配列表に示す。

【0182】

【表1】

【実施例】

【0183】

発明の行うための実施形態
以下、さらに本発明を実施例と併せて説明する。以下の実施例は例として示され、本発明の保護範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例の実験方法は、特に断りのない限り、慣用される分子生物学、組織培養技術および農学の手引書に記載されている方法であった。例えば、具体的な工程は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版)" (Sambrook, J., Russell, David W., 2001, Cold Spring Harbor)、"Plant Propagation by Tissue Culture" (Edwin F. George , Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk, 2008, Springer)に見出すことができる。以下の実施例で使用される材料、試薬、機器などは、特に断りのない限り、商業的供給源から入手することができる。

【0184】

実施例１：シロイヌナズナのＡＬＳ遺伝子のＷ５７４およびＳ６５３部位に対するプログラムされた連続的切断／編集により導入される予測可能な塩基置換の設計
Ａ．実験材料
１．シロイヌナズナ材料
野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０は双子葉植物のモデル品種であり、その原種種子は、the Department of Weeds, College of Plant Protection, China Agricultural Universityにより提供され、その繁殖および保存は、本分野の標準法に従って本発明者らの研究室で行った。

【0185】

２．ベクター
ベクタープラスミドｐＣＢＣ－ｄＴ１Ｔ２(Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1):327、詳細についてはhttps://www.addgene.org/50590/を参照のこと)、ｐＨＥＥ４０１Ｅ（Wang ZP, Xing HL, Dong L, Zhang HY, Han CY, Wang XC, Chen QJ Genome Biol. 2015 Jul 21; 16:144. doi: 10.1186/s13059-015-0715-0.具体的な情報はhttps://www.addgene.org/71287/for specific informationを参照のこと）、およびｐＨＥＥ４０１Ｅ－ＮＧ（Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded Targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129に報告されているような突然変異をｐＨＥＥ４０１Ｅに導入して、ＮＧ ＰＡＭを認識することができるベクターｐＨＥＥ４０１Ｅ－ＮＧを構築した）はＡｄｄｇｅｎｅウェブサイトから購入するか、または従来の分子生物学的方法に従って本発明者らの研究室で構築し、本発明者らの研究室で維持した。

【0186】

３．主要な機器
ピペットガン、水浴、ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－ｒａｄ Ｔ１００）、電気泳動装置（ＷＩＸ－ＥＰ６００）、ゲルイメージャー、電気ブラストドライヤー、遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２４Ｒ）、ハイスループットティッシュレイヤー、振盪機、電子天秤、ｐＨメーターなど。

【0187】

４．主要な試薬
ハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｓｉｎｇｋｅ Ｂｉｏから購入）、アガロースゲル回収キットおよびプラスミド抽出キット（Ｓｐａｒｋｊａｄｅから購入）、ＢｓａＩおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢから購入）、Ｔｒａｎｓ５αコンピテント細胞およびＥＨＡ１０５コンピテント細胞（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、北京、中国から購入）、ＧＶ３１０１アグロバクテリウムコンピテント細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＡｎｇｙｕＢｉｏから購入）、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、カナマイシン、セファロスポリン、ハイグロマイシン、アガロース、酵母粉末、トリプトン、ＮａＣｌ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入）、ＭＳ粉末、スクロース、Ｓｉｌｗｅｔ－７７、ハイグロマイシン（Ｓｏｌａｒｂｉｏから購入）、核酸色素（Ｄｕｒｅｄ）、無水エタノール（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍから購入）など。

【0188】

５．主要な溶液の調製
１）種子殺菌剤： ４ｍＬの１０％ＳＤＳ、２０ｍＬ ＮａＣｌＯ、水を加えて２００ｍＬとする。
２）ＳＤＳ抽出バッファー： ４０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの０．１Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＬの１０％ＳＤＳ、水を加えて２００ｍＬとする。
３）感染溶液： １．５ｇのスクロース、９μＬのＳｉｌｗｅｔ－７７、３０ｍＬの超純水を加える。
４）ＬＢ固形培地： ５ｇの酵母粉末、１０ｇのトリプトン、１０ｇのＮａＣｌ、１５ｇの寒天、水を加えて１Ｌとし、１２１℃で１５分間滅菌し、後の使用のためにプレートに注ぐ。
５）５０×ＴＡＥ保存液： ２４２ｇのＴｒｉｓ、３７．２ｇのＮａ_２ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ、８００ｍＬの超純水を加え、よく撹拌して溶解させ、５７．１ｍＬの酢酸を加え、よく撹拌し、最後に脱イオン水で１Ｌに希釈し、室温で保存する。
６）ＭＳ固形培地： ４．４２ｇのＭＳ粉末および１０ｇのスクロースを秤量し、８００ｍＬの超純水を加え、ｐＨ５．８に調整し、水を加えて１Ｌとし、１０ｇのフィタゲルを加え、１２１℃で１５分間滅菌し、後の使用のためにプレートに注ぐ。

【0189】

Ｂ．実験方法
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９二重標的ベクターの設計および構築
１．１標的設計
シロイヌナズナＡＬＳ遺伝子を配列番号２に示した。１９塩基の標的配列ｇＲＮＡ１（５’－ＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＴＧＧＧＡ－３’）を、シロイヌナズナＡＬＳ５７４部位付近のＡＧＡをＰＡＭとして用いて設計し、編集後にＰＡＭの最初の３－４位の間で１個のＧ塩基の欠失があると予測され、その後、その欠失から生成された配列に基づいて第２の標的配列ｇＲＮＡ２（５’－ＧＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＴＧＧＡ－３’）が設計され、図２に示されるように、第２編集によって１個のＴ塩基が挿入され、それによりＴＧＧ－ＴＴＧの変換が実現すると予測された。

【0190】

同様に、１９塩基の標的配列ｇＲＮＡ３（５’－ＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＡＧＴＧＧ－３’）を、シロイヌナズナＡＬＳ６５３部位付近のＴＧＧをＰＡＭとして用いて設計し、編集後にＰＡＭの第１の３－４位の間で１個のＧ塩基の欠失があると予測され、その後、その欠失から生成された配列に基づいて第２の標的配列ｇＲＮＡ４（５’－ＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧ－３’）が設計され、図２に示されるように、第２編集の後に１個のＡ塩基が挿入され、それによりＡＧＴ－ＡＡＴの変換が実現すると予測された。

【0191】

１．２ ベクターの構築
Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ 2014. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. Nov 29;14(1): 327によって記載されている方法に従った。具体的には、ｄＴ１Ｔ２プラスミドを、それぞれＡＬＳ５７４および６５３部位の二重標的断片を増幅するための鋳型として使用してｓｇＲＮＡ発現カセットを構築した。ｐＨＥＥ４０１ＥおよびｐＨＥＥ４０１Ｅ－ＮＧのベクター骨格をＢｓａＩで消化し、これらのバンドをゲルから切り出し、回収し、この標的断片をそのまま、消化の後に連結反応に使用した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてこれらのベクター骨格と標的断片を連結し、連結産物をＴｒａｎｓ５αコンピテント細胞に形質転換し、異なるモノクローンをシーケンシングのために採取した。シーケンシングによる確認の後、プラスミドを抽出するためにＳｐａｒｋｊａｄｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて組換えプラスミドを得、これらをそれぞれｐＱＹ７４３およびｐＱＹ７４５と呼称した。

【0192】

２．標的検出のためのプライマーの設計
標的検出のためのプライマーはＡＬＳ５７４およびＡＬＳ６５３標的部位を中心とし、上流検出用のプライマーはＡＬＳ５７４標的部位から約１００ｂｐであり、下流検出用のプライマーはＡＬＳ６５３標的部位から約２８０ｂｐであった。プライマー配列は次の通りであった：５７４／６５３ｃｈｅｃｋｉｎｇ－Ｆ：５’ＡＴＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴ３’、および５７４／６５３ｃｈｅｃｋｉｎｇ－Ｒ：５’ＣＣＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＡ３’。

【0193】

３．シロイヌナズナ遺伝子形質転換システムの樹立
３．１ アグロバクテリウム形質転換
構築された組換えプラスミドをアグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞に形質転換して組換えアグロバクテリウム細胞を得た。

【0194】

３．２ アグロバクテリウム感染溶液の調製
１）活性化したアグロバクテリウムを採取し、３０ｍｌのＹＥＰ液体培地（２５ｍｇ／Ｌ Ｒｉｆおよび５０ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ含有）に植え込み、２００ｒｐｍにて２８℃で一晩、ＯＤ６００値が約１．０～１．５となるまで培養した。
２）６０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、アグロバクテリウムを回収し、上清を廃棄した。
３）アグロバクテリウムを感染溶液（Ｈを調整する必要はない）に、後の使用のためにＯＤ６００＝０．８となるように再懸濁した。

【0195】

３．３ シロイヌナズナの形質転換
１）植物の形質転換前には、植物が十分に生育しているか、花序が豊富か、ストレス応答がないか注意を払った。第１の形質転換は草丈が約２０ｃｍとなった際に行った。灌水は、土壌が乾燥した際に適宜行うことができる。形質転換の前日に、生長した長角果をハサミで切り取った。
２）形質転換させる植物の花序を上記の溶液に３０秒～１分間、穏やかに撹拌しながら浸漬し、浸潤した植物に液体膜の層がなければならない。
３）形質転換が完了した後に、植物を暗所で２４時間培養し、その後、取り出して生育のために通常の明所環境に置いた。
４）１週間後、第２の形質転換を同様にして行うことができる。

【0196】

３．４ 採種
種子が成熟した後、それらを採取した。採取後、種子を３７℃のオーブンで約１週間乾燥させた。

【0197】

４．トランスジェニック植物の選択
種子を殺菌剤で５分間処理し、脱イオン水で５回洗浄し、ＭＳ選択培地（３０μｇ／ｍＬハイグロマイシン、１００μｇ／ｍＬセファロスポリン含有）に一様に拡げ、この培地を明所インキュベーター（温度２２℃、１６時間明期、８時間暗期、光強度１００～１５０μｍｏｌ／ｍ^２／ｓ、湿度７５％）に置き、１週間後、陽性実生を選択し、土壌に移植した。

【0198】

５．Ｔ１突然変異植物の検出
５．１ ゲノムＤＮＡの抽出
１）シロイヌナズナの葉を切り取り、２ｍＬの遠沈管に入れ、鋼球を加え、これらの葉をハイスループットティッシュライザーで摩砕した。
２）摩砕が完了した後に、４００μＬのＳＤＳ抽出バッファーを加え、転倒して混合し、６５℃の湯浴中で１５分間インキュベートし、５分おきに転倒して混合した。
３）１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。
４）３００μＬの上清をピペットで吸い取り、新しい１．５ｍＬの遠沈管に移し、－２０℃に予冷した等容量のイソプロパノールをこの遠沈管に加え、この遠沈管を－２０℃で１時間または一晩置いた。
５）１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を廃棄した。
６）５００μＬの７０％エタノールをこの遠沈管に加えてペレットを洗浄し、洗浄溶液を遠心分離の後に廃棄し（ペレットを捨てないように注意する）、室温で乾燥させ、３０μＬの超純水を加えてＤＮＡを溶解させ、ＤＮＡを－２０℃保存した。

【0199】

５．２ ＰＣＲ増幅
抽出したＴ１植物ゲノムを鋳型として使用し、検出プライマーを用いて標的断片を増幅させ、５μＬの増幅産物をピペットで吸い取り、１％アガロースゲル電気泳動により検出し、ゲルイメージャーで画像を得た。残った生成物をシーケンシング会社に送り、直接シーケンシングを行った。

【0200】

６．Ｔ２突然変異植物の検出
単一の植物からＴ１系統の種子を採取した後、２つのベクターの異なる系統の種子を選択し、イマザピック選択培地（ＭＳ培地＋０．２４μｇ／ｍＬイマザピック）に拡げて選択を行い、１週間後に陽性実生を土壌に移植し、分子検出を行い、この方法は工程５と同じであった。

【0201】

使用したプライマーおよびそれらの配列：

【0202】

【表2】

【0203】

Ｃ．実験結果
１．Ｔ１植物の遺伝子型検出
Ｔ１種子をＭＳハイグロマイシン抵抗性培地によって選択し、ｐＱＹ７４３ベクターについては合計３２個体の陽性実生を得、ｐＱＹ７４５ベクターについては合計１８個体の陽性実生を得た。各ベクターに関して１０個体の実生を選択し、その葉のゲノムＤＮＡを抽出して標的部位を検出した。Ｔ１世代ではＡＬＳ５７４部位に編集は生じておらず、ＡＬＳ６５３部位に設計予測と符合した編集イベントが存在したことが判明した。検出結果を表１に示す。

【0204】

【表3】

【0205】

２．Ｔ２世代種子の選択結果
単一植物のＴ２世代種子を採取した後、それらをイマザピック抵抗性培地に拡げて選択を行い、図３に示されるように、野生型Ｃｏｌ－０はこの抵抗性培地で生長できないが、突然変異系統の陽性植物はこの抵抗性培地で正常に生長できたことが見て取れる。

【0206】

各ベクターについて１０個体の実生を選択し、分子検出のために葉からそのゲノムＤＮＡを抽出した。図４に示されるように、ｐＱＹ７４３ベクターでは、予測に即して同型接合突然変異、すなわち、ＴＧＧからＴＴＧへの突然変異を有するものが６系統存在することが判明した。さらに、異型接合性突然変異を有するものが１系統存在し、キメラ突然変異を有するものが３系統存在した。検出結果を表２に示す。

【0207】

【表4】

【0208】

上記の結果は、本発明のプログラムされた連続的切断／編集という技術的解決策を使用することによって、標的部位における予測した突然変異の設計および実現が達成でき、Ｃａｓ９タンパク質を用いて連続的ｓｇＲＮＡ組合せを設計した場合にのみ塩基置換突然変異が実現できることを示した。

【0209】

実施例２：シロイヌナズナＡＬＳ遺伝子のＷ５７４およびＳ６５３部位におけるプログラムされた連続的切断／編集による複数の突然変異タイプの達成
ベクターの設計、構築、ならびにシロイヌナズナの形質転換および選択のための操作工程は実施例１を参照して行った。ＡｔＡＬＳ Ｗ５７４部位については、ベクター設計は実施例１と同じであった。ベクターの概略図を図５に示し、Ｗ５７４Ｌ突然変異は、特定の部位においてまず－Ｇ、次いで＋Ｔによって実現されるはずであることが予測された。ベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ１世代には編集イベントは検出されなかった。トランスジェニックシロイヌナズナのＴ２世代を０．２４ｍｇ／Ｌイマザピックで選択したところ、図６の左のパネルに示されるように、多数の除草剤抵抗性植物が得られ、これらの抵抗性植物の分子検出を行ったところ、ＰＣＲ産物シーケンシング結果は、図６の右のパネルに示されるように、予測されたＷ５７４Ｌ突然変異がＷ５７４部位に見られただけでなく、別の抵抗性突然変異Ｗ５７４Ｍも見られたことを示した。

【0210】

ＡｔＡＬＳ Ｓ６５３部位についても、ベクター設計は実施例１と同じであった。ベクター図を図７に示し、Ｓ６５３Ｎ突然変異は、特定の部位においてまず－Ｇ、次いで＋Ａによって実現されるはずであると予測された。ベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ１世代には、予測されたＳ６５３Ｎの編集イベントは検出されなかった。トランスジェニックシロイヌナズナのＴ２世代を、０．２４ｍｇ／Ｌイマザピックで継続的に選択したところ、図８の左のパネルに示されるように、多数の除草剤抵抗性植物が得られ、これらの抵抗性植物に分子検出を行ったところ、ＰＣＲ産物シーケンシング結果は、図８の右のパネルに示されるように、Ｓ６５３部位に予測されたＳ６５３Ｎ突然変異が生じただけでなく、他の２つの抵抗性突然変異Ｓ６５３ＲおよびＳ６５３Ｒ／Ｇ６５４Ｄも生じたことを示した。

【0211】

上記の結果は、本発明のプログラムされた連続的切断／編集という技術的解決策を使用することによって、標的部位に関して設計された予測される突然変異に加え、対応するＣａｓ９タンパク質を用いて連続的ｓｇＲＮＡ組合せを設計した場合にのみ複数の機能的突然変異タイプが作出できることも示した。

【0212】

実施例３：シロイヌナズナＡＬＳ遺伝子のＷ５７４部位付近でプログラムされた連続的切断／編集を行うための異なるＰＡＭを使用することによるＷ５７４Ｍ抵抗性突然変異の作出
ＡｔＡＬＳ Ｗ５７４部位付近の配列

【化1】

については、Ｗ５７４部位により近いＧＧをまずＰＡＭとして用いてｓｇＲＮＡ１：５’ＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＴＧ３’を設計したこと以外（ここで、Ｗ５７４部位を下線で示し、ＮＧ ＰＡＭを斜体で示した）、ベクターの設計、構築、ならびにシロイヌナズナの形質転換および選択のための操作工程は実施例１を参照して行った。切断および修復の後に＋Ａによって新規配列

【化2】

が生成されるはずであることが予測された。ＡＧを新規ＰＡＭ部位として使用してｓｇＲＮＡ２：５’ＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＧＡ３’を設計し、細胞の自発的修復の後に－Ｇ遺伝子型が生成され、Ｗ５７４Ｍが生じていた。すなわち、このスキームでは、２つの切断のために異なるＰＡＭ部位が使用された。ベクター図を図９に示す。ベクターを用いてシロイヌナズナを形質転換し、Ｔ１世代トランスジェニック系統に遺伝子型検出を行い、そこから予測されるＷ５７４Ｍの編集イベントが検出され、植物はイマザピック処理に対して抵抗性を示した。

【0213】

これらの結果は、プログラムされた連続的切断／編集を実行するために本発明の技術的解決策を使用し、異なるＰＡＭを使用することで、アミノ酸置換を得るためにより広い配列範囲で編集が行えることを示した。

【0214】

実施例４：ネＡＬＳ遺伝子のＤ３５０およびＷ５４８部位に関する予測可能な塩基置換の設計
Nishimasu et al. 2018 Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science 361(6408):1259-1262. doi: 10.1126/science.aas9129に報告されているような突然変異をｐＨＵＥ４１１(A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327. 10.1186/s12870-014-0327-y, see details in https://www.addgene.org/71287/)に導入して、ＮＧ ＰＡＭを認識することができるベクターｐＨＵＥ４１１－ＮＧを構築した。

【0215】

イネＡＬＳ遺伝子配列を配列番号１２に示した。５’ＧＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＴＣＧ３’（下線の部分がシロイヌナズナＡＬＳ－Ｄ３７６に相当するＯｓＡＬＳ－Ｄ３５０部位であった）および編集から生成されると予測された新規配列５’ＧＧＣＧＴＧＣＧＧＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧ３’を標的として使用することにより、Xing HL, Dong L, Wang ZP, Zhang HY, Han CY, Liu B, Wang XC, Chen QJ. BMC Plant Biol. 2014に記載されている方法に従って二重標的ベクターを構築し、ＧＡＴ－ＧＡＡの変換を獲得してＯｓＡＬＳ Ｄ３５０Ｅ突然変異を生じると予測された。

【0216】

５’ＧＧＴＡＴＧＧＴＴＧＴＧＣＡＡＴＧＧＧＡ３’（下線部はシロイヌナズナＡＬＳ－Ｗ５７４に相当するＯｓＡＬＳ－Ｗ５４８部位であった）および編集から生成されると予測された新規配列５’ＧＧＴＡＴＧＧＴＴＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡ３’を標的として使用することにより、二重標的ベクターを構築し、ＴＧＧ－ＴＴＧの変換を獲得してＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌ突然変異を生じると予測された。

【0217】

次に、これら２つのベクターをイネに導入してトランスジェニック植物を得、同定したところ、予測された置換Ｄ３５０ＥおよびＷ５４８Ｌを有する植物が得られたことが示された。圃場での除草剤抵抗性生物検定の結果は、Ｄ３５０ＥおよびＷ５４８Ｌ突然変異体はＡＬＳ阻害剤除草剤に対する抵抗性を獲得したことを示した。

【0218】

実施例５：予測可能な塩基置換の設計およびイネＡＣＣａｓｅ２遺伝子のＷ２０３８部位に関する複数の突然変異タイプの選択
イネＡＣＣａｓｅ２遺伝子配列を配列番号１４に示し、配列中、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位はノスズメノテッポウのＡＣＣａｓｅ Ｗ２０２７部位に相当した。この部位に近接したＡＧＧをＰＡＭとして用いてｓｇＲＮＡ１：５’ＴＴＣＡＴＣＣＴＣＧＣＴＡＡＣ－ＴＧＡＧ３’を設計し、切断および修復の後に－Ｇによって新規配列が形成されると予測された。このＡＧＧを引き続きＰＡＭとして用いてｓｇＲＮＡ２：５’ＣＴＴＣ－ＡＴＣＣＴＣＧＣＴＡＡＣＴＧＡＧ３’を設計し、再び切断および修復の後に＋Ｔ遺伝子型が形成されてＷ２０３８Ｌ突然変異が生じた。ｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２をｐＨＵＥ４１１ベクター上に構築して編集ベクターを形成し、このベクターの図を図１０に示した。

【0219】

この編集ベクターを用いてＨｕａｉｄａｏ Ｎｏ ５（イネ品種）のカルスを形質転換し、３週間の５０μｇ／Ｌハイグロマイシンおよび５０μｇ／Ｌキザロップ(quizalop)－ｐでの同時選択の後に、図１１の左のパネルに示されるように多数の抵抗性カルスが得られた。抵抗性カルスを遺伝子型同定のために採取し、図１１の右のパネルに示されるように、予測されたＷ２０３８Ｌ突然変異だけなくＷ２０３８Ｃ突然変異も生じていたことが判明した。

【0220】

イネ遺伝子のプログラムされた連続的切断／編集の上記結果は、本発明の技術的解決策が単子葉植物および双子葉植物の両方に適用可能であることを示した。

【0221】

実施例６：ＳｐＣａｓ９およびＮＧＡ－Ｃａｓ９タンパク質の発現および精製
１．実験機器および試薬

【0222】

【表5】

【0223】

【表6】

【0224】

２．実験方法
２．１ ｐＥＴ１５ｂ－Ｃａｓ９発現ベクターの構築
植物コドンの最適化の後に得られたＳｐＣａｓ９およびＮＧＡ－Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に示し、これらの配列がＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより鋳型ＤＮＡとして合成された。

【0225】

ＮＧ－Ｃａｓ９配列およびＮＧＡ－Ｃａｓ９配列をそれぞれ増幅した後、インフュージョン法によって２つの断片をｐＥＴ１５ｂ発現ベクターに連結し、ＤＨ５ａに形質転換し、確認の後に配列を決定した。

【0226】

【表7】

【0227】

２．２ タンパク質の発現および精製
構築した発現ベクターを大腸菌(Escherichia coli)Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換し、ＩＰＴＧによってその発現を誘導し、これらの細菌を採取し、溶解させ、Ｎｉ－ＮＴＡカラムによって精製した。具体的な方法は次の通りであった。
ａ）組換え発現ベクターをＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株に形質転換し、単一のコロニーを１０ｍｌのＬＢ培地、ＣｍＲ＋Ａｍｐ（ｐＥＴ１５ｂ）またはＣｍＲ＋Ｋａｎａ（ｐＥＴ２８ａ）抵抗性に採取し、２００ｒｐｍにて３７℃で一晩培養し、１ＬのＬＢ培地を含有する２Ｌ振盪フラスコに移し、３７℃、２００ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．６～０．８となるまで培養し、１８℃に冷却し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで一晩、その発現を誘導し、これらの細菌を４０００ｇでの遠心分離によって採取した。
ｂ）採取した細菌をＮｉ－バッファーＡ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ β－メルカプトエタノールに再懸濁し、終濃度１ｍＭのＰＭＳＦおよび２５０ｕｌのカクテル阻害剤を添加した後、よく混合した。
ｃ）再懸濁させた細胞を超音波破砕器で破砕した後、それらを４００００ｇにて３０分間４℃で遠心分離し、上清を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムに通した。
ｄ）Ｎｉ－ＮＴＡカラムによる精製： 溶解液上清を２０分間、樹脂と合わせ、５０ｍＭイミダゾールを含有するバッファーＡで溶出させて不純物を除去し、最後に４００ｍＭイミダゾールを含有する溶出バッファーで溶出させた。
ｅ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動システムを用いてタンパク質の精製効果を検出した。
ｆ）このバッファーを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、３％グリセロールに変更することで透析を行った。
ｈ）最終のサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけてタンパク質の精製効果を検出した。限外濾過により濃縮した後、後の使用のためにタンパク質を－８０℃で冷凍した。

【0228】

２．３ Ｃａｓ９融合タンパク質の発現および精製
ＳｐＣａｓ９およびＮＧＡ－Ｃａｓ９タンパク質の精製結果を図１２に示した。矢印はＣａｓ９タンパク質バンドを示し、より高純度が達成されたことを示す。

【0229】

実施例７：ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８標的部位およびＯｓＡＬＳ Ｗ５４８標的部位に対してそれぞれ検出されたＳｐＣａｓ９タンパク質およびＮＧＡ Ｃａｓ９タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素切断活性
１．ＯｓＡＬＳ遺伝子およびＯｓＡＣＣａｓｅ２遺伝子のＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)に入力し、シロイヌナズナＡＬＳタンパク質のアミノ酸部位５７４に相当するＯｓＡＬＳのＷ５４８（ＯｓＡＬＳの５４８番目のアミノ酸、イネＡＬＳタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１１に示した）およびノスズメノテッポウのアミノ酸部位２０２７に相当するＯｓＡＣＣａｓｅ２のＷ２０３８（ＯｓＡＣＣａｓｅ２の２０３８番目のアミノ酸、イネＡＣＣａｓｅ２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１３に示した）に関して以下のｓｇＲＮＡを設計し、これらのｓｇＲＮＡはＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成された。

【0230】

【化3】

【0231】

２．特定の検出プライマー、ＯｓＡＬＳ２６５ＡＡ－Ｆ：５’ｇｇｔｃｔｔｇｃｇｔｃｔｇｇｔｔｇｇｃ３’およびＯｓＡＬＳ－ｅｎｄ－Ｒ：５’ｃｃａｔｇｃｃａａｇｃａｃａｔｃａａａｃａａｇ３’を用いて、ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８標的部位を含む断片を増幅したところ、このＰＣＲ産物は１２００ｂｐの長さであった。

【0232】

特定の検出プライマー、ＯｓＡＣＣ１７５０ＡＡ－Ｆ：５’ｇｃｇａａｇａａｇａｃｔａｔｇｃｔｃｇｔａｔｔｇｇ３’およびＯｓＡＣＣ２１９６ＡＡ－Ｒ：５’ｃｔｔａａｔｃａｃａｃｃｔｔｔｃｇｃａｇｃｃ３’を用いて、ＯｓＡＣＣａｓｅ Ｗ２０３８標的部位を含む断片を増幅したところ、このＰＣＲ産物は１５００ｂｐの長さであった。

【0233】

ＰＣＲシステムを下表に示した。

【0234】

【表8】

【0235】

３．ＰＣＲ反応を確立し、反応条件を下表に示した。

【0236】

【表9】

【0237】

４．ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検出し、さらなる確認のために配列決定を行った。適正に確認された後、ゲルを切り出してＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を、３０ｕｌのＲＮアーゼ非含有超純水を加えることによって溶解させ、その濃度を測定した。

【0238】

５．以下の検出システムを用いてＣａｓ９タンパク質活性を検出し、システムが準備された後に、それを３７℃で１時間インキュベートした。

【0239】

【表10】

【0240】

６．反応が完了した後、システムを６５℃で１０分間処理し、４ｕｌの６×ＤＮＡローディングバッファーを加え、２％アガロースゲル上に流してバンドサイズを検出した。

【0241】

結果を図１３に示し、精製されたＣａｓ９タンパク質はｓｇＲＮＡの存在下でのみ、ＤＮＡ二本鎖を設計された標的部位で切断できたことが見て取れる。

【0242】

実施例８：イネプロトプラストを２つの異なる標的化ＲＮＰ複合体で形質転換することによるＯｓＡＬＳ５４８部位におけるＷ５４８Ｌ突然変異の達成
１．イネプロトプラストの調製およびＰＥＧ媒介形質転換は、公開されている方法(Bart et al., 2006)の基づき、一部改変して行い、具体的な調製工程は次の通りであった。
（１）プロトプラスト用のイネ実生をまず準備した。イネ品種は日本晴であった。まず、イネ種子を脱穀し、脱穀した種子を７５％エタノールで１分間すすぎ、５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで２０分間処理し、次に、無菌水で５回洗浄し、ウルトラクリーンテーブル上に置き、ブロー乾燥させ、次に、１／２ＭＳ培地を含む組織培養フラスコに、各フラスコに種子２０個として入れた。プロトプラストは、種子を２６℃、１２時間明期で約１０日間インキュベートすることによって調製した。
（２）実生の葉鞘を選別し、鋭利なＧｉｌｌｅｔｔｅかみそり刃で約１ｍｍ片に刻み、後の使用のために０．６ＭマンニトールおよびＭＥＳ培養培地（配合：０．６Ｍマンニトール、０．４Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．７）中に入れた。総ての材料を刻んだ後、それらを２０ｍＬの酵素溶解溶液（配合：１．５％セルラーゼＲ１０／ＲＳ（ＹａＫｕｌｔ Ｈｏｎｓｈａ）、０．５％マセロザイムＲ１０（ＹａＫｕｌｔ Ｈｏｎｓｈａ）、０．５Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．７、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ＢＳＡ、５ｍＭ β－メルカプトエタノール）に移し、アルミニウム箔に包み、２８℃にて振盪機に置いた。酵素溶解は５０ｒｐｍにて暗所で約４時間行い、最後の２分間は速度を１００ｒｐｍに増した。
（３）酵素溶解後、等容量のＷ５溶液（配合：１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭＥＳ）を加え、１０秒間水平振盪してプロトプラストを遊離させた。酵素溶解から得られた細胞を３００メッシュの篩で濾過し、１５０ｇにて５分間遠心分離してプロトプラストを回収した。
（４）これらの細胞をＷ５溶液で２回すすぎ、１５０ｇで５分間の遠心分離によってプロトプラストを回収した。
（５）プロトプラストを適当量のＭＭＧ溶液（配合：３．０５ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ_２、１ｇ／Ｌ ＭＥＳ、９１．２ｇ／Ｌマンニトール）で再懸濁させ、プロトプラスト濃度は約２×１０^６細胞／ｍＬとした。

【0243】

２．ＲＮＰ複合体の調製：
ＯｓＡＬＳ５４８標的部位配列

【化4】

（ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８部位に下線、シロイヌナズナＡＬＳ Ｗ５７４に相当、Ｃａｓ９タンパク質により認識されるＰＡＭ部位を斜体の小文字で示した）に従い、精製されたＮＧＡ－Ｃａｓ９タンパク質を、ＲＮＰ複合体を調製するために選択した。ＧＧＡをＰＡＭとして使用し＞ＣｒＲＮＡ１－５４８－Ｇ：５’－ＧＧＧＵＡＵＧＧＵＵＧＵＧＣＡＡＵＧＧＧＡｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕ－３’を設計し、編集後にＰＡＭの最初の３－４位の間で１個のＧ塩基が欠失すると予測され、次に、上記の欠失から生じた配列を用いて第２の＞ＣｒＲＮＡ２－５４８＋Ｔ：５’－ＵＧＧＧＵＡＵＧＧＵＵＧＵＧＣＡＡＵＧＧＡｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕ－３’を設計し、第２の編集の後に１個のＴ塩基が挿入されてＴＧＧ－ＴＴＧの変換が得られると予測された。

【0244】

＞ＣｒＲＮＡ１－５４８－Ｇおよび＞ＣｒＲＮＡ１－５４８＋ＴはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙにより合成され、ｓｇＲＮＡもまた合成された。

【0245】

【化5】

【0246】

説明書に従い、合成されたｃｒＲＮＡおよびＧｅｎＣＲＩＳＰＲ ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＳＣ１９３３）を等モルで混合し、ｃｒＲＮＡ＆ｔｒａｃｒＲＮＡアニーリングバッファー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＳＣ１９５７－Ｂ）を加え、アニーリングしてｇＲＮＡを調製した。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、５’－ａｇｃａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕ－３’であった。

【0247】

ＲＮＰ反応系は下表に従って準備し、反応系が準備された後に、それを２５℃で１０分間インキュベートした。

【0248】

【表11】

【0249】

３．プロトプラストの形質転換
（１）上記で調製した、ＭＭＧに再懸濁させたプロトプラスト２００μｌを取り、インキュベーション後に生成されたＲＮＰ複合体（２０μｇのＣａｓ９タンパク質、２０μｇのｓｇＲＮＡ）を加え、軽く打ちつけてよく混合した。
（２）等容量の４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ溶液（配合：４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ、０．５Ｍマンニトール、１００ｍＭ ＣａＣｌ_２）を加え、軽く打ちつけてよく混合し、２８℃、暗所で１５分間静置した。
（３）誘導および形質転換後、１．５ｍＬのＷ５溶液をゆっくり加え、軽く打ちつけて細胞をよく混合し、これらの細胞を１５０ｇで３分間の遠心分離によって回収した。この工程を１回繰り返した。
（４）これらの細胞を１．５ｍＬのＷ５溶液を加えることによって再懸濁させ、２８℃のインキュベーターに入れ、暗所で１２～１６時間培養した。これらの細胞をプロトプラストゲノムＤＮＡの抽出に使用する場合には、４８～６０時間インキュベートしなければならない。

【0250】

４．ゲノム標的編集イベントの検出
（１）プロトプラストＤＮＡは、一部改変したＣＴＡＢ法を用いて抽出し、この方法は以下に具体的に記載した：プロトプラストを遠心分離し、上清を廃棄し、５００μＬのＤＮＡ抽出溶液を加え、振盪し、よく混合し、６５℃の湯浴中で１時間インキュベートし；湯浴中でのインキュベーション後にこのサンプルを冷却し、等容量のクロロホルムを加え、数回転倒してよく混合し、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し；４００μｌの上清を取り、新しい１．５ｍＬ遠沈管に移し、１ｍＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加え、－２０℃で２０分間静置して沈降させ；ＤＮＡを１２，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により沈降させ、沈降物を空気中で乾燥させ、次いで、５０μｌの超純水を加えることにより溶解させ、後の使用のために－２０℃で保存した。

【0251】

（２）遺伝子特異的プライマーを用いて、Ｗ５４８標的部位を含む断片を増幅させ、標的部位に対して以下の検出プライマーを設計した。

【化6】

【0252】

ＰＣＲ反応系を下表に示した。

【0253】

【表12】

【0254】

（３）ＰＣＲ反応を確立し、一般反応条件を下表示した。

【0255】

【表13】

【0256】

（４）検出はアガロースゲル電気泳動によって行い、ＰＣＲ断片を回収し、配列を決定した。

【0257】

５．実験結果：
合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用いてアニーリングにより調製されたｇＲＮＡを使用するか、または合成ｓｇＲＮＡを直接使用することによって、精製ＮＧＡ－Ｃａｓ９タンパク質との活性ＲＮＰ複合体が形成できた。ＯｓＡＬＳ５４８標的化部位の配列決定により、ＴＧＧからＴＴＧへの突然変異が検出でき、このことは、一連の順序でｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと組み合わせたＲＮＰ複合体から生成されたプログラムされた連続的切断／編集によって、細胞内で標的部位の部位特異的突然変異が達成できたことを証明した。図１４のプロトプラストＯｓＡＬＳ５４８標的シーケンシングピーク図に、矢印の先で示されるように、最初のＧ塩基シグナルピークに加えて、この突然変異から生成されたＴ塩基シグナルピークも存在し、これによりＯｓＡＬＳ５４８部位のＷ５４８Ｌ突然変異が生じていた。

【0258】

実施例９：２つの異なる標的化ＲＮＰ複合体を用いたイネカルス衝撃によるＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位におけるＷ２０３８Ｌ突然変異の達成
１．ＲＮＰ複合体の調製：
ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８標的部位配列

【化7】

（ここで、ノスズメノテッポウＡＣＣａｓｅ Ｗ２０２７に相当するＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位を下線で示し、Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるＰＡＭ部位を斜体の小文字で示した）に従い、精製されたＳｐＣａｓ９タンパク質を、ＲＮＰ複合体を調製するために選択した。ＧＧＡをＰＡＭとして使用して＞ＣｒＲＮＡ１－２０３８－Ｇ：５’－ＧＵＵＣＡＵＣＣＵＣＧＣＵＡＡＣＵＧＧＡＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕ－３’を設計し、編集後にＰＡＭの最初の３－４位の間で１つのＧ塩基が欠失されると予想され、次に、その欠失から生じた配列を用いて第２の＞ＣｒＲＮＡ２－２０３８＋Ｔ：５’－ＵＧＵＵＣＡＵＣＣＵＣＧＣＵＡＡＣＵＧＡＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕ－３’を設計し、第２の編集の後に１個のＴ塩基が挿入されてＴＧＧ－ＴＴＧの変換が得られると予測された。

【0259】

＞ＣｒＲＮＡ１－２０３８－Ｇおよび＞ＣｒＲＮＡ２－２０３８＋ＴはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙにより合成され、ｓｇＲＮＡもまた合成された。

【化8】

【0260】

説明書に従い、合成されたｃｒＲＮＡおよびＧｅｎＣＲＩＳＰＲ ｔｒａｃｒＲＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＳＣ１９３３）を等モルで混合し、ｃｒＲＮＡ＆ｔｒａｃｒＲＮＡアニーリングバッファー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＳＣ１９５７－Ｂ）を加え、アニーリングしてｇＲＮＡを調製した。

【0261】

ＲＮＰ複合体は、実施例８と同じ反応系でインキュベートすることによって調製した。形質転換のための１０回の遺伝子銃衝撃の量を例に挙げると：２０μｇのＣａｓ９タンパク質、２０μｇのｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、１０μｌの１０×Ｃａｓ９反応バッファーを、ＲＮアーゼ非含有超純水で合計１００μｌとし、２５℃で１０分間インキュベートし、穏やかに混合する。

【0262】

２．イネカルスの誘導
成熟および充実したイネ種子を選別し、脱穀し、以下の工程に従って消毒した。
（１）イネ種子を脱穀し、イネ品種は、種子市場から購入したＨｕａｉｄａｏ Ｎｏ．５であった。
（２）種子を無菌水で、水が透明になるまで回数に制限無く洗浄した。
（３）７０％アルコールで１分間滅菌した後、種子を、水平振盪機上の１０％次亜塩素酸ナトリウム中に置き、振盪下で２５分間インキュベートした。
（４）次亜塩素酸ナトリウム消毒後、種子を無菌水で５回洗浄した。これらの種子をカルス誘導培地（配合：ＭＳ粉末（４．４２ｇ／Ｌ）＋２，４－Ｄ（２ｍｇ／Ｌ）＋スクロース（３０ｇ／Ｌ）＋フィタゲル（４ｇ／Ｌ））に播種し、暗所、２８℃で培養してカルスを誘導した。

【0263】

３．遺伝子銃ＲＮＰ衝撃：
（１）高張培養
良好な胚形成能を有するカルスを高張培地（配合：ＭＳ粉末（４．４２ｇ／Ｌ）＋２，４－Ｄ（２ｍｇ／Ｌ）＋スクロース（３０ｇ／Ｌ）＋Ｄ－マンニトール（０．４Ｍ））＋フィタゲル（４ｇ／Ｌ））に移し、無菌操作はウルトラクリーンベンチで行い、培養は暗所、２５℃で４～６時間行った。
（２）金粉末懸濁液の調製：輸入した１．５ｍＬ ＥＰチューブを使用することにより、３０ｍｇの金粉末（直径０．６μｍ）を秤量し；１ｍＬの７０％エタノールを加え、ボルテックスで十分に撹拌し、氷上で１０分静置した。１分間の遠心分離の後、上清を廃棄し；１ｍＬの無菌水を加え、ボルテックスで十分に撹拌し、１分間遠心分離し、上清を廃棄し、上記の操作を３回繰り返した。５００μＬの滅菌グリセロール（５０％）を加え、ボルテックスで十分に撹拌し、濃度６０μｇ／μｌで金粉末懸濁液を調製し、－２０℃で保存した。
（３）５０μｌの金粉末懸濁液（６０μｇ／ｍｌ）を取り、１００μＬの調製されたＲＮＰ複合体を加え、穏やかに混合した。
（４）１５μｌのＲＮＰ／金粉末混合物を取り、ＰＤＳ－１０００ベンチトップ遺伝子銃（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の切断可能な膜の中央に置き、ブロー乾燥させ、その後、機器の説明書に従って衝撃を行った。
衝撃パラメーター：真空度は２６～２８であり、距離は６ｃｍであり、空気圧は１１００ｐｓｉまたは１３５０ｐｓｉであった。
（５）衝撃が完了した後、カルスを高張培地にて２５℃で一晩、暗所で培養した（１６時間）。

【0264】

４．選択、分化および発根：
（１）衝撃を施したカルスを一晩培養した後、誘導培地に移し、２８℃で１週間培養した。
（２）１週間の再生の後、カルスを選択培地（配合：４．１ｇ／Ｌ Ｎ６粉末＋０．３ ｇ／Ｌカゼイン加水分解物＋２．８ｇ／Ｌプロリン＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋３％スクロース＋５０ｕｇ／Ｌキザロホップ－ｐ＋５００ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ（セファロスポリン）＋０．１ｇ／Ｌイノシトール＋０．３５％フィタゲル、ｐＨ５．８）に移して３～４週間選択を行い；図１５に示されるように、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８の予測編集のために、５０ｕｇ／Ｌキザロホップ－ｐを選択に使用した。
（３）選択された、生長状態が良好な抵抗性カルスを分化培地（配合：ＭＳ粉末（４．４２ｇ／Ｌ）＋ＫＴ（１ｍｇ／Ｌ）＋スクロース（３０ｇ／Ｌ）＋フィタゲル（４．５ｇ／Ｌ）＋５０ｕｇ／Ｌキザロホップ－ｐ、ｐＨ５．８）に移し、分化を誘導するために２～４週間、照明下、２８℃で培養した。
（４）分化した実生を発根のために発根培地（配合：１／２ＭＳ粉末（２．３ｇ／Ｌ）＋スクロース（３０ｇ／Ｌ）＋フィタゲル（４．５ｇ／Ｌ））に移し、発根が完了した後に実生を強化し、次いで、土壌を詰めたポットに移植し、栽培のために温室に移した。

【0265】

５．抵抗性カルスおよびＴ０組織培養実生における標的編集イベントの検出：
選択から合計１１の抵抗性カルスが得られ、それらのＤＮＡをＣＴＡＢ法によって抽出した。標的部位に対する検出プライマーは次のように設計した：ＯｓＡＣＣ２０３８ｔｅｓｔ－Ｆ：５’ＣＴＧＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧＴＧ３’、ＯｓＡＣＣ２０３８ｔｅｓｔ－Ｒ：５’ＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴ－ＣＴＧＡＣＣ３’、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位を含むＰＣＲ断片を増幅し、回収し、配列決定した。シーケンシング検出は、それらのうち１０がＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位においてＴＧＧからＴＴＧの突然変異を有することを示し、３サンプルは同型接合突然変異体であった。

【0266】

抵抗性カルス分化によって得られたＴ０世代組織培養実生に関して、そのＤＮＡを、編集標的部位配列を検出するために抽出し、図１６に示されるように、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位においてＴＧＧからＴＴＧへの型接合突然変異も存在した。

【0267】

６．ＡＣＣａｓｅ阻害剤除草剤に対するＴ１世代実生の抵抗性試験
Ｗ２０３８Ｌ突然変異を含むＴ０系統の繁殖の後に、Ｔ１世代突然変異実生を、圃場濃度のキザロホップ－ｐおよびハロキシホップ－ｐを用いた除草剤抵抗性に関して試験した。図１７～１８に示されるように、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８Ｌ突然変異系統がこれら２つのＡＣＣａｓｅ阻害剤除草剤に対して有意に抵抗性であったことが見て取れた。

【0268】

概要を述べると、合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用いてアニーリングにより調製されたｇＲＮＡを使用するか、または合成ｓｇＲＮＡを直接使用することによって、精製ＳｐＣａｓ９タンパク質との活性ＲＮＰ複合体が形成でき；遺伝子銃衝撃を受けたカルスは、組織培養段階でキザロホップ－ｐを使用することによって選択することができ；Ｔ０世代組織培養実生のＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８標的部位の配列決定によってＴＧＧからＴＴＧへの同型接合突然変異が検出でき；この突然変異はＴ１世代に遺伝可能であり、ＡＣＣａｓｅ阻害剤除草剤に対する抵抗性を示し、このことはさらに、連続的標的化ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと組み合わせたＲＮＰ複合体から生成されたプログラムされた連続的切断／編集は細胞において標的部位の部位特異的突然変異を達成でき、組織培養選択のための細胞内因性選択マーカーの生産を誘導し、それにより除草剤抵抗性作物を作出できることを実証した。

【0269】

実施例１０：異なる標的化ＲＮＰ複合体はイネカルスのＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位およびＯｓＢＡＤＨ２遺伝子を同時に編集する
ＲＮＰ複合体は実施例８に従う方法によって調製し、遺伝子銃衝撃および組織培養手順は実施例９のものと同じであった。ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８部位を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの他、ＯｓＢＡＤＨ２遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを同時に加え、それらをＳｐＣａｓ９タンパク質とともにインキュベートして第２の標的遺伝子ＯｓＢＡＤＨ２に対する標的化ＲＮＰ複合体を形成した。遺伝子銃衝撃を行い、再生培養、スクリーニング、分化および発根の後にＴ０世代組織培養実生を得、繁殖後にＴ１世代を得た。

【0270】

イネＯｓＢＡＤＨ２ゲノム配列を配列番号１７に示した。ＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)に従い、標的部位配列

【化9】

（ここで、Ｃａｓ９タンパク質により認識されるＰＡＭ部位を斜体の小文字で示した）
を選択し、精製されたＳｐＣａｓ９タンパク質を選択してＲＮＰ複合体を調製した。ＣＧＧをＰＡＭとして使用して＞ＣｒＲＮＡ１－ＯｓＢＡＤＨ２：５’－ＣＣＡＡＧＵＡＣＣＵＣＣＧＣＧＣＡＡＵＣＧｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｕｇｃｕ－３’を設計し、キザロホップ－ｐの選択によって得られた抵抗性カルスにおいて、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８Ｌの抵抗性突然変異およびＯｓＢＡＤＨ２のノックアウト突然変異イベントが同時に検出できると予測された。

【0271】

＞ＣｒＲＮＡ１－ＯｓＢＡＤＨ２はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙにより合成され、ｓｇＲＮＡもまた合成された。

【化10】

【0272】

図１９に示されるように、実施例９の形質転換工程に従って抵抗性カルスを選択し、抵抗性カルスを選択し、分化および実生の出現を経てカルスおよびＴ０世代組織培養実生のＯｓＡＣＣａｓｅ２およびＯｓＢＡＤＨ２標的部位における配列を決定した。ＯｓＢＡＤＨ２標的検出プライマーは次の通りであった。

【化11】

【0273】

結果として、選択によって合計１３の抵抗性カルスが得られ、そのうち１１カルスでＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８Ｌ突然変異イベントが検出され、これらの１１のカルスサンプルに関するＯｓＢＡＤＨ２標的配列の検出は、それらのうち８カルスがＯｓＢＡＤＨ２標的部位における編集イベントを同時に含むことを示した。分化により得られたＴ０世代組織培養実生では、図２０～２１に示されるように、ＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８Ｌ突然変異およびＯｓＢＡＤＨ２＋Ａ同型接合突然変異の存在が検出された。

【0274】

概要を述べると、イネカルスに一連の標的化ｃｒＲＮＡ標的化またはｓｇＲＮＡ標的化ＲＮＰ複合体で遺伝子銃衝撃を施してＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８の部位特異的編集を実行し、同時に、第２の標的遺伝子ＯｓＢＡＤＨ２を標的とする標的化ＲＮＰ複合体を加え、カルスの選択は組織培養段階においてキザロホップ－ｐを用いて行い；抵抗性カルスの６１％にＯｓＡＣＣａｓｅ２ Ｗ２０３８突然変異およびＯｓＢＡＤＨ２の標的化ノックアウトが同時に生じ、Ｔ０世代組織培養実生にＯｓＢＡＤＨ２の同型接合突然変異を含む系統が検出された。これらは、連続的切断／編集を耐性遺伝子の部位特異的編集に関するＲＮＰ形質転換と組み合わせると、内因性選択マーカーが生成でき、対応する選択圧を富化すると第２の標的遺伝子の編集イベントを同時にスクリーニングすることができ、それにより非トランスジェニック手段によるゲノムの部位特異的編集が達成できることを示した。

【0275】

実施例１１：異なる標的化ＲＮＰ複合体はイネカルスのＯｓＡＬＳ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４遺伝子を同時に編集する
ＯｓＡＬＳ５４８部位に対する標的化ＲＮＰ複合体は、実施例８に従う方法によって調製し、ｃｒＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ配列はそれぞれ実施例８の場合と同じであった。

【化12】

【0276】

実施例８を参照して、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをＮＧＡ－Ｃａｓ９とともにインキュベートして、ＯｓＡＬＳ５４８部位を標的とするＲＮＰ複合体を調製した。

【0277】

ＯｓＡＬＳ５４８部位に対する標的化ＲＮＰ複合体に加え、ＯｓＳＷＥＥＴ１４遺伝子に対するｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを同時に加え、ＳｐＣａｓ９タンパク質とともにインキュベートすることによって第２の標的遺伝子ＯｓＳＷＥＥＴ１４に対する標的化ＲＮＰ複合体を形成した。遺伝子銃衝撃、再生培養、選択、分化、発根を行うことによってＴ０世代組織培養実生を得、繁殖によってＴ１世代を得た。選択圧は５ｍｇ／Ｌピロキシスラムであった。

【0278】

イネＯｓＳＷＥＥＴ１４ゲノム配列を配列番号１８に示した。ＣＲＩＳＰＯＲオンラインツール(http://crispor.tefor.net/)に従い、標的部位配列

【化13】

（ここで、ＳｐＣａｓ９タンパク質により認識されるＰＡＭ部位を斜体の小文字で示す）を選択し、精製されたＳｐＣａｓ９タンパク質をＲＮＰ複合体の調製のために選択した。ＧＧＧをＰＡＭとして用いて以下を設計し、

【化14】

ピロキシスラムの選択によって得られた抵抗性カルスにおいて、ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌの抵抗性突然変異およびＯｓＳＷＥＥＴ１４のノックアウト突然変異が同時に検出できると予測された。

【0279】

＞ＣｒＲＮＡ１－Ｏｓ ＳＷＥＥＴ１４はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙにより合成され、ｓｇＲＮＡもまた合成された。

【化15】

【0280】

抵抗性カルスは、図２２に示されるように、実施例９に記載されているような遺伝子銃衝撃および組織培養手順に従って選択し、抵抗性カルスを選択して分化および実生の出現を行い、ここで、選択培地の配合は、４．１ｇ／Ｌ Ｎ６粉末＋０．３ｇ／Ｌカゼイン加水分解物＋２．８ｇ／Ｌプロリン＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋３％スクロース＋５ｍｇ／Ｌピロキシスラム＋５００ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ（セファロスポリン）＋０．１ｇ／Ｌイノシトール＋０．３５％フィタゲル、ｐＨ５．８であった。

【0281】

カルスおよびＴ０世代組織培養実生のＯｓＡＬＳ５４８部位およびＯｓＳＷＥＥＴ１４標的部位の配列を決定した。ＯｓＳＷＥＥＴ１４標的部位検出プライマーは次の通りであった。

【化16】

【0282】

結果として、選択によって合計９つの抵抗性カルスが得られ、そのうち８カルスでＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌ突然変異イベントが検出され、これら８つのカルスサンプルにおけるＯｓＳＷＥＥＴ１４標的配列の検出は、そのうち５カルスがＯｓＳＷＥＥＴ１４標的部位に編集イベントを含むことを示した。分化によって得られたＴ０世代組織培養実生では、図２３～２４に示されるように、ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌ突然変異とＯｓＳＷＥＥＴ１４－Ｃ同型接合突然変異の両方が検出できた。

【0283】

ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌ突然変異の存在が検出されたＴ０系統を繁殖させた後、Ｔ１世代突然変異実生系統に対して、圃場濃度のピロキシスラム、イマザピック、ニコスルフロンおよびフルカルバゾン－Ｎａを用いて除草剤抵抗性を検定した。図２５～２８に示されるように、ＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌ変異系統は、これらの４種類のＡＬＳ阻害剤除草剤の総てに対して有意な抵抗性を示したことが見て取れる。

【0284】

概要を述べると、合成ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを用いてアニーリングにより調製されたｇＲＮＡを使用するか、または合成ｓｇＲＮＡを直接使用することによって、精製ＳｐＣａｓ９タンパク質との活性ＲＮＰ複合体が形成でき；細胞における標的部位の部位特異的突然変異は、ＲＮＰ複合体と一連の標的化ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとの組合せから生成されるプログラムされた連続的切断／編集によって達成でき、遺伝子銃衝撃を受けたカルスの選択は、組織培養段階でピロキシスラムを用いて実行することができ、Ｔ０世代組織培養実生のＯｓＡＬＳ５４８標的部位の配列決定によって、ＴＧＧからＴＴＧへの突然変異が検出され、この突然変異はＴ１世代へ遺伝可能であり、ＡＬＳ阻害剤除草剤に対する抵抗性を示した。

【0285】

第２の標的遺伝子ＯｓＳＷＥＥＴ１４を標的とする標的化ＲＮＰ複合体を同時に加え、かつ、ＮＧＧ ＰＡＭを認識するＳｐＣａｓ９タンパク質を使用することによって、イネカルスが遺伝子銃衝撃を受けた後、カルスの選択を、組織培養段階においてピロキシスラムを用いて行った。抵抗性カルスの５５％にＯｓＡＬＳ Ｗ５４８Ｌ突然変異およびＯｓＳＷＥＥＴ１４の標的化ノックアウトが同時に見られ、ＯｓＳＷＥＥＴ１４の同型接合突然変異の存在がＴ０世代組織培養実生で検出でき、このことはさらに、内因性選択マーカーが、プログラムされた連続的切断／編集とＰＮＰ形質転換から生成された抵抗性遺伝子の部位特異的編集との組合せによって生成可能であり、第２の標的遺伝子の編集イベントは、異なるＰＡＭ部位を認識するＣａｓ９タンパク質を同時に使用し、対応する選択圧を付加することによって同時に選択でき、それにより、非トランスジェニック的手段によってゲノムの部位特異的編集が達成できることを示した。

【0286】

実施例１２：バレイショ(Solanum tuberosum L.)外植体を２つの異なる標的化ＲＮＰ複合体で衝撃することによるＳｔＡＬＳ５６１部位におけるＷ５６１Ｌ突然変異の作出
バレイショＳｔＡＬＳ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１９に示し、バレイショＳｔＡＬＳ２遺伝子の配列を配列番号２０に示した。ＲＮＰ複合体の調製および遺伝子銃衝撃のための方法は実施例８～９を参照し、シロイヌナズナＡＬＳ５７４部位に相当するバレイショＳｔＡＬＳ２のＳｔＡＬＳ２Ｗ５６１部位の元の配列および設計された編集配列に関するｓｇＲＮＡは次の通りであった。

【化17】

【0287】

そしてＲＮＰ複合体は、実施例８に記載の方法に従って調製した。

【0288】

レシピエントバレイショ品種はＡｔｌａｎｔｉｃまたはＦａｖｏｒｉｔａであり、葉、茎およびその腋芽をそれぞれ外植体として用いた。遺伝子銃衝撃および選択および分化のための方法は次の通りであった。
（１）葉： 全葉を切り取り、高張Ｍ６培地（配合：４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋１ｍｌ／Ｌ Ｂ５ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｌａｂ、Ｇ２１９）＋３０ｇ／Ｌスクロース＋８ｇ／Ｌ寒天＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．８ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド＋０．２Ｍマンニトール＋２５０ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ）に平らに拡げ、各衝撃ショット当たり約５～６葉を使用した。プレインキュベーション２４時間の後、金粉末による衝撃を行った。衝撃後、それらを高張Ｍ６培地中、暗所で２日間継続培養し、その後、Ｍ６培地（４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋１ｍｌ／Ｌ Ｂ５ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｌａｂ、Ｇ２１９）＋３０ｇ／Ｌスクロース＋８ｇ／Ｌ寒天＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．８ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド＋２５０ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ）に移し、１週間継続培養し、次いで１週間後に選択圧をかけたＭ６培地に移し、２０μｇ／Ｌクロルスルフロン（配合：４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋１ｍｌ／Ｌ Ｂ５ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｌａｂ、Ｇ２１９）＋３０ｇ／Ｌスクロース＋８ｇ／Ｌ寒天＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．８ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド＋２５０ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋２０μｇ／Ｌクロルスルフロン）の選択圧を用いて抵抗性カルスの選択を行い、４週間後、それらを、選択圧を含む幼芽誘導培地Ｒ４（配合：４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋１ｍｌ／Ｌ Ｂ５ビタミン（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｌａｂ、Ｇ２１９）＋３０ｇ／Ｌスクロース＋８ｇ／Ｌ寒天＋２ｍｇ／Ｌ ＧＡ３＋０．８ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド＋２５０ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋２０μｇ／Ｌクロルスルフロン）に実生が出現するまで移した。

【0289】

（２）茎： バレイショ茎（腋芽を含まない）を採取し、切り口を上に向けて縦切りにし、ＣＩＭＩ培地（４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋２０ｇ／Ｌスクロース＋８ｇ／Ｌ寒天＋０．５ｍｇ／Ｌゼアチンヌクレオシド＋２ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋２５０ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋２０μｇ／Ｌクロルスルフロン）に置き、次いで遺伝子銃衝撃を行い、衝撃後１日暗所で培養し、これらの茎を新鮮なＣＩＭＩ培地に移し、１週間、継続培養し、その後これらの茎を、選択圧を含むＳＩＭＩ培地（配合：４．４２ｇ／Ｌ ＭＳ粉末＋２０ｇ／Ｌスクロース＋８ｇ／Ｌ寒天＋１ｍｇ／Ｌゼアチンリボシド＋０．１ｍｇ／Ｌ ＧＡ３＋２５０ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋２０μｇ／Ｌクロルスルフロン）に移し、実生が出現するまで抵抗性幼芽に関して選択を行った。

【0290】

（３）腋芽： バレイショの茎から腋芽を採取し、縦切りにし、ＣＩＭＩ培地に移し
、切り口を上に向けてＣＩＭＩ培地に置き、次いで遺伝子銃衝撃を行い、衝撃後１日暗所で培養し、それらを新鮮なＣＩＭＩ培地に移し、１週間、継続培養し、その後それらを、選択圧を含むＳＩＭＩ培地に移し、実生が出現するまで抵抗性幼芽に関して選択を行った。

【0291】

ＳｔＡＬＳ２ Ｗ５６１部位の検出プライマーは次の通りであった。

【化18】

【0292】

検出後、抵抗性スクリーニングＴ０世代バレイショ組織培養実生のＳｔＡＬＳ２ Ｗ５６１部位にＷ５６１Ｌの編集イベントが見られ、これは、本発明により提供された非トランスジェニック一過性遺伝子編集方法が外因性トランスジェニック要素を自殖または交雑によって分離および除去することが困難であり得るバレイショなどの作物に好適であることを実証した。

【0293】

実施例１３：ヒト２９３Ｔ細胞における塩基置換のためのプログラムされた連続的切断／編集スキームの使用の成功
ヒト胎児腎臓細胞２９３ＴのＨＢＢ（ヘモグロビンサブユニットβ）遺伝子（そのＤＮＡ配列を配列番号２１に示し、そのＣＤＳ配列を配列番号２２に示し、そのアミノ酸配列を配列番号２３に示した）を選択し、ｓｇＲＮＡの連続的切断／編集のための標的部位を第１エキソンの領域内に設計し、この第１の標的はｃａｔｇｇｔｇｃａＣｃｔｇａｃｔｃｃｔｇＡＧＧであった。この標的を認識するｓｇＲＮＡをｓｇＨＢＢと呼称し、この部位のｓｇＲＮＡ切断部に１個のＣ塩基の欠失が生成され得ると予測された。第２の標的は、第１の標的の切断／編集から生成される１個のＣ塩基の欠失を有する配列を認識するｃｃａｔｇｇｔｇｃａｔｃｔｇａｃｔｃｔｇＡＧＧであり、この標的のｓｇＲＮＡはｓｇＨＢＢ－ｃと呼称した。２９３Ｔ細胞において標的部位を有さないｓｇＲＮＡを設計し、ｓｇＮＯＴＡＲと呼称し、これを本実験のトランスフェクションの相補的プラスミドとして使用した。

【0294】

上記の設計に従って、それぞれ相補的一本鎖ＤＮＡ断片を合成した。アニーリング後、ＢｂｓＩ酵素で消化したｐｘ４５８（ａｄｄｇｅｎｅ：４８１３８）プラスミドに連結し、大腸菌ＤＨ５ａコンピテントに形質転換した。結果として得られる大腸菌の単一コロニーを配列決定によって確認した後、プラスミドを抽出し、内毒素非含有プラスミド抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏ）で精製した。

【0295】

増殖の旺盛な２９３Ｔ細胞を消化し、０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｉｃｏ）で単離し、ＤＭＥＭ培地（１０％ウシ胎児血清；ペニシリン＋ストレプトマイシン二重抵抗性）で希釈し、２４ウェル培養プレートに播種し、二酸化炭素インキュベーター内に一晩置いた。翌日、それらを、連続的切断／編集：ｓｇＨＢＢおよびｓｇＨＢＢ－ｃプラスミド各０．５ｕｇ；単一標的切断／編集：ｓｇＨＢＢおよびｓｇＮＯＴＡＲプラスミド各０．５ｕｇ；無標的対照：ｐＥＧＦＰ－ｃ１プラスミド１μｇに従って別々に混合した。形質転換はリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。各群３反復とした。

【0296】

形質転換の４８時間後に、蛍光顕微鏡で写真を撮影して形質転換効率を記録し、各ウェルの全ＤＮＡを核酸抽出キット（Ｏｍｅｇａ）で抽出した。

【0297】

設計したＨｉ－ｔｏｍシーケンシングプライマーは次の通りであった。

【化19】

【0298】

これらのプライマーを用いて各ＤＮＡサンプルについてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物のハイスループットシーケンシングを、Ｈｉ－ｔｏｍ法(Sci China Life Sci. 2019 Jan;62(1):1-7. doi: 10.1007/s11427-018-9402-9)を用いて行った。

【0299】

シーケンシング結果の統計データを表６および表７に示した。これらのデータは、ＨＢＢ部位における連続的切断／編集法が約１．６７％の割合でＣからＴへの編集結果（結果としてＰ６Ｓ突然変異を生じる）を生じ、一方、単一標的切断／編集法はこのような塩基置換を生じることができないことを示した。

【0300】

【表14】

【0301】

【表15】

【0302】

さらに、鎌形赤血球貧血およびβ－サラセミアは両方とも、成人のヘモグロビンβサブユニットをコードするＨＢＢ遺伝子における突然変異によって引き起こされる遺伝性貧血である。これらの疾患を有する患者は、生涯を通して輸血またはその他の療法を必要とすることがある。上記の実験の結果は、本発明によって提供されるようなプログラムされた連続的切断／編集という技術的解決策によって、ＨＢＢ遺伝子の突然変異部位に関して、突然変異部位に予測された修復を誘導するようにｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの組合せが設計可能であり、その結果、細胞が活性なヘモグロビンを産生し、機能を回復し、それにより治療効果が達成されることを実証した。すなわち、本発明によって提供される組成物は疾患の治療において用途を有する。

【0303】

様々な試験を同時に行った後、この新規な方法は完全にＣａｓ９の既存の機能に基づいていることから、本発明の方法は、Ｃａｓ９が十分に機能し得る他の生物（植物、動物、真菌または細菌など）において特定の断片の塩基置換、欠失および挿入の新たな機能を達成するために十分適用可能である。

【0304】

本明細書に記載されている総ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が個々に具体的に引用することにより本明細書の一部とされるかのように、引用することにより本明細書の一部とされる。

【0305】

明瞭な理解のため、実施例および実施形態により以上の本発明をより詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および改変が実施可能であることは明らかであり、このような変更および改変は総て本発明の範囲にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【配列表】

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【国際調査報告】