知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-06
(54)【発明の名称】がん処置のためのベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20221226BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20221226BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221226BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221226BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221226BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221226BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20221226BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221226BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20221226BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221226BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221226BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221226BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221226BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221226BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221226BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
C12N15/864 100Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61K35/761
A61K35/76
A61K39/00 H
A61K45/00
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 105
A61P43/00 111
A61K48/00
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523067
(86)(22)【出願日】2020-10-16
(85)【翻訳文提出日】2022-06-15
(86)【国際出願番号】 GB2020052620
(87)【国際公開番号】W WO2021074648
(87)【国際公開日】2021-04-22
(31)【優先権主張番号】1914984.8
(32)【優先日】2019-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2009420.7
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】598176569
【氏名又は名称】キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(72)【発明者】
【氏名】リー，リアン・ナイ
(72)【発明者】
【氏名】チンナカンナン，センティル
(72)【発明者】
【氏名】クレナーマン，ポール
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB072
4C084ZB092
4C084ZB211
4C084ZB261
4C084ZC411
4C085AA03
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZC41
(57)【要約】
本発明は、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであって、ベクターが、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力があり、ベクターが、さらなるがん特異的Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含まない、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターに関する。それはまた、ベクターの方法および使用に関する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターであって、ベクターが、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力があり、ベクターが、さらなるがん特異的Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含まない、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項2】
ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーによって特徴づけられるＣＤ８＋ Ｔ細胞の産生を誘導する能力がある、請求項１に記載のベクター。
【請求項3】
ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ２７－（ｌｏｗ）、ＣＤ１２７－（ｌｏｗ）を含む群から選択されるマーカーによって特徴づけられるＣＤ８＋ Ｔ細胞の産生を誘導する能力がある、請求項１に記載のベクター。
【請求項4】
がん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列が、１２個～４５個のヌクレオチド塩基対を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項5】
がん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列が、２４個～４５個のヌクレオチド塩基対を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項6】
がん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが腫瘍関連抗原に由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項7】
Ｔ細胞エピトープががん細胞において変異している、請求項１～６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項8】
Ｔ細胞エピトープががん細胞において過剰発現している、請求項１～７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項9】
Ｔ細胞エピトープが、ＴＲＰ－１、ＣＥＡ、ＴＡＧ－７２、９Ｄ７、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ－１、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＣＬＰＰ、サイクリン－Ａ１、サイクリン－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、ＣＤ４５、グリピカン－３、ＩＧＦ２Ｂ３、カリクレイン－４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、メロエ、ＭＵＣ５ＡＣ、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ１、ｇｐ７０、ＭＣ１Ｒ、ＴＲＰ－１／－２、β－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、胎児タンパク質ＳＩＭ１からなる群から選択される腫瘍関連抗原に由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項10】
Ｔ細胞エピトープが配列番号２（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項11】
がん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープが、結腸直腸がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、腎がん、肺がん、乳がん、乳がん、膵臓がん、脳がん、肝細胞がん、リンパ腫、白血病、胃がん、子宮頚がん、卵巣がん、甲状腺がん、黒色腫、癌腫、頭頚部がん、皮膚がん、上咽頭がん、エプスタインバー駆動型がん、ヒトパピローマウイルス駆動型がん、および軟組織肉腫に特異的である、請求項１～６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項12】
ヒト血清型５（ＡｄＨｕ５）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項13】
ＣＭＶプロモーターを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項14】
ＴＡＴＡボックスを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項15】
Ｅ１およびＥ３タンパク質を欠損する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項17】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の少なくとも２個のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項18】
各ベクターが異なるがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１６～１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含む、宿主細胞。
【請求項21】
治療における使用のための、請求項１～１９のいずれか一項に記載のベクターまたは組成物。
【請求項22】
がんの処置または防止における使用のための、請求項１～１９のいずれか一項に記載のベクターまたは組成物。
【請求項23】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む、がんを処置または防止する方法。
【請求項24】
膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーによって特徴づけられる、方法。
【請求項25】
ベクターまたは組成物が静脈内にまたは筋肉内に投与される、請求項２１もしくは２２に記載のベクターまたは組成物、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
ベクターまたは組成物が単回投与として投与される、請求項２１もしくは２２に記載のベクターまたは組成物、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項27】
ベクターまたは組成物が複数回投与として投与される、請求項２１もしくは２２に記載のベクターまたは組成物、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項28】
ベクターまたは免疫原性組成物が対象に予防的に投与される、請求項２１もしくは２２に記載のベクターまたは組成物、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項29】
ベクターまたは免疫原性組成物が対象に治療的に投与される、請求項２１もしくは２２に記載のベクターまたは組成物、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項30】
ベクターまたは組成物が免疫調節性分子と併用して、別々に、逐次的に、または同時にのいずれかで、投与される、請求項２１もしくは２２に記載のベクターまたは組成物、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項31】
免疫調節性分子が免疫チェックポイントインヒビターである、請求項３０に記載の方法、ベクター、または組成物。
【請求項32】
免疫チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ａ２ａＲ、ＢＴＬＡ、ＧＡＬ９、およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質のインヒビターである、請求項３１に記載の方法、ベクター、または組成物。
【請求項33】
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、ｉｉ）エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへクローニングするステップ、
ｉｉｉ）エピトープをコードする核酸配列を含む配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のベクターへクローニングするステップ、
を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターを作製する方法。
【請求項34】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物、１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバント、および任意選択で使用説明書を含む、キット。
【請求項35】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物と細胞を接触させるステップを含む、がん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープに対して、動物においてＴ細胞免疫応答を誘導するための方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘発する能力があるベクターに関する。膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘発するこれらのベクターは、がんの処置に用いるのに適している。本発明はまた、そのベクターを作製するための方法、および膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導するための方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
免疫のＣＤ８ Ｔ細胞アームを活性化することを目指す抗がん戦略は、顕著な効力を示している。慢性感染に対する良好なＣＤ８ Ｔ細胞応答のための必要条件とがんに対するものとの間には、かなりの重複がある－それらは、耐久性があり、機能的であり、持続的であり、正しい部位へホーミングし、長期のＴＣＲ刺激による疲弊に抵抗できなければならない。
【0003】
エピトープに基づいたがんワクチンは、特定の腫瘍関連抗原に対するＴ細胞応答を活性化するために用いられている一つの戦略である。当初は、ペプチドに基づいた単一エピトープワクチンが用いられたが、これらは自然免疫系を十分には活性化しなかったため、不良な臨床応答を示した。免疫活性化を増強するために、複数のエピトープが一緒に投与される、複数ペプチドのワクチンが開発された。
【0004】
複数エピトープを投与するこのアプローチはまた、アデノウイルスベクターを用いて実施されている。大きな導入遺伝子をコードする能力を有するアデノウイルスベクターを用いることにより、複数エピトープが、コードされ、かつコンカテマーとして送達され得る（ＢｅｉおよびＳｃａｒｄｉｎｏ．、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０；２０１０：１０２７５８）。あるいは、完全長抗原がコードされ、かつ送達され得る。しかしながら、がん細胞に対する免疫活性化を向上させる必要性がなおも存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、本明細書でミニ遺伝子ベクターと呼ばれる、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするベクターが、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導し得るという驚くべき所見から生まれている。メモリ膨張は、細胞が別個の表現型および機能を有する、安定で、拡大したＣＤ８＋ Ｔ細胞メモリプールの長期的発生を説明する。この膨張性メモリ応答は、感染の急性期を越えてまでも大量かつ機能的なままであるエピトープ特異的Ｔ細胞の長命のプールを生じる（Ｋｌｅｒｎｅｒｍａｎ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０１８ ２８３（１）：９９～１１）。膨張性メモリ細胞の特徴は抗腫瘍応答の増強を生じ得ると考えられている。
【0006】
本発明者らは、目的のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープのみが挿入される、複製欠損ＡｄＨｕ５アデノウイルスベクターバックボーンに基づいたワクチンプラットフォームを開発した。この様式において、抗原プロセシングの必要性が回避され、それは膨張性応答、そうでなければ、非膨張性エピトープが発生することを可能にする。そのベクターの単回のプライミング注射が、大きなエピトープ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生じ、そのＴ細胞が膨張性メモリ表現型を示すことが実証されている。驚くべきことに、生じた応答は、長命であり、予防的免疫化実験において、およびすでに腫瘍を有するマウスへ投与された場合において、免疫化から５０～９０日後より遅くでも、腫瘍を制御することができた。これらの応答は、長期間検出でき、ＰＤ－１が低く、チェックポイントインヒビター、Ｌａｇ－３およびＴｉｍ－３も低かった。比較して、完全長タンパク質抗原をコードするベクターの投与は、同じ規模のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答も同じ表現型のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答も生じなかった。
【0007】
アデノウイルスベクターは、一般的に、１つまたは複数のウイルス遺伝子の除去により、大きな導入遺伝子のパッケージング能力という利点を提供する。そのようなものとして、アデノウイルスベクターを用いる、エピトープに基づいたワクチンについての以前のアプローチは、コンカテマーとして複数のＴ細胞エピトープをコードしている。しかしながら、本アプローチは、長期かつ耐久性のある免疫応答が、およそ７０ｂｐの相対的に小さい挿入断片および最小のエンハンサーエレメントを含むアデノウイルスベクター（本明細書ではミニ遺伝子ベクターと呼ばれる）により生じ得ることを見出した。驚くべきことに、短い核酸配列がインビボで転写され、ＭＨＣ分子上に成功裏に提示され、ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生成させることが示された。
【0008】
追加として、ミニ遺伝子により生じたＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の規模および耐久性は、送達後のより遅い時期（５０日目より遅く）において、複数のＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含有するアデノウイルスベクターを用いて誘導された応答において以前観察されたものより、はるかに高い規模である。短いエピトープペプチド配列をコードするアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを提供することにより、そのコードされたペプチドが、ＭＨＣ分子上での提示のための正常な抗原プロセシングの必要性を回避すると考えられる。これは、結果として、予測することがより容易であり、より信頼性が高く、より広範である、ならびにより頑強かつ効果的であるＴ細胞応答を生じる。
【0009】
これらのミニ遺伝子ベクターは、伝統的なペプチドに基づいたワクチンおよびＤＮＡワクチンを凌ぐいくつかの利点を提供する。第１に、アデノウイルスベクターミニ遺伝子は、感染細胞内に適切なプライミング応答（同時刺激）を誘導することができる。これは、強力な抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の発生をもたらす。ＤＮＡおよびペプチドワクチンは、アジュバントと組み合わせない限り、プライミング応答を誘導することができない。第２に、アデノウイルスベクターミニ遺伝子は、持続的に細胞に感染することができる。この特性は、ベクターが、抗原の長期的供給源としての役割を果たすことを可能にし、それにより、抗原特異的Ｔ細胞プールのサイズを維持し得る。第３に、ペプチドおよびＤＮＡワクチンは、複数回のプライムブースト投与計画で、かつ通常、アジュバントと組み合わせて与えられない限り、長命の抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生させることができない。対照的に、長命の抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の大きなプールが、ミニ遺伝子の単回注射から生成される。これらの長命の腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、血液中に見出され、したがって、全身に存在する。それゆえに、それらは、原発腫瘍制御後の微小転移を抑制することにおいて重要な役割を果たし得る。最後に、アデノウイルスベクターミニ遺伝子はまた、ベクターおよびコード配列の単純さにより、設計および作製することが容易であるという利点も有する。
【0010】
そのようなものとして、本発明は、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターであって、ベクターが、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力がある、アデノウイルスベクターに関する。
【0011】
ある実施形態において、本発明は、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、ベクターが、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力がある、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。ある実施形態において、ベクターは、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーにより特徴づけられるＣＤ８＋ Ｔ細胞の産生を誘導する能力がある。ある実施形態において、ベクターは、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ２７（ｌｏｗ）、ＣＤ１２７（ｌｏｗ）を含む群から選択されるマーカーにより特徴づけられるＣＤ８＋ Ｔ細胞の産生を誘導する能力がある。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列は、１２個～４５個のヌクレオチド塩基対を含む。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列は、２４個～４５個のヌクレオチド塩基対を含む。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、腫瘍関連抗原に由来する。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、がん細胞において変異している。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、がん細胞において過剰発現している。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、ＴＲＰ－１、ＣＥＡ、ＴＡＧ－７２、９Ｄ７、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ－１、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＣＬＰＰ、サイクリン－Ａ１、サイクリン－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、ＣＤ４５、グリピカン－３、ＩＧＦ２Ｂ３、カリクレイン－４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、メロエ、ＭＵＣ５ＡＣ、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ１、ｇｐ７０、ＭＣ１Ｒ、ＴＲＰ－１／－２、β－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、胎児タンパク質ＳＩＭ１からなる群から選択される腫瘍関連抗原に由来する。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、配列番号１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）または配列番号２（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）を含む。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、結腸直腸がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、腎がん、肺がん、乳がん、乳がん、膵臓がん、脳がん、肝細胞がん、リンパ腫、白血病、胃がん、子宮頚がん、卵巣がん、甲状腺がん、黒色腫、癌腫、頭頚部がん、皮膚がん、上咽頭がん、エプスタインバー駆動型がん（Epstein Barr driven cancers）、ヒトパピローマウイルス駆動型がん（Human Papilloma virus driven cancers）、および軟組織肉腫に特異的である。ある実施形態において、ベクターはヒト血清型５（ＡｄＨｕ５）である。ある実施形態において、ベクターはＣＭＶプロモーターを含む。ある実施形態において、ベクターはＴＡＴＡボックスを含む。ある実施形態において、ベクターはＥ１およびＥ３タンパク質を欠損する。ある実施形態において、ベクターは、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするいかなる追加のヌクレオチド配列も含まない。したがって、ベクターは、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを有し、その核酸の転写に必要な他のベクターエレメントを含み得るが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープではないがん特異的エピトープ、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列を含まない。さらに、それは、１つより多いがん特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含まない。したがって、ベクター内の複数の抗がんＴ細胞エピトープの存在は排除される。これは、同じ抗がんＴ細胞エピトープの複数コピーまたは異なる抗がんＴ細胞エピトープのコピーを排除する。ベクターは、コンカテマー、すなわち、直列に連結された同じがん特異的Ｔ細胞エピトープの複数コピーを含有する長い連続したＤＮＡ分子を有しない。
【0012】
ある態様において、本発明は、本発明によるベクターを含む免疫原性組成物に関する。
ある態様において、本発明は、本発明による少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、２０個まで、３０個まで、４０個まで、または５０個までのベクターを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物に関する。
ある態様において、本発明は、本発明による少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、２０個まで、３０個まで、４０個まで、または５０個までのベクターを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物に関する。
【0013】
ある態様において、本発明は、本発明によるベクターまたは本発明による免疫原性組成物を含む、宿主細胞に関する。
ある態様において、本発明は、治療における使用のための、本発明によるベクターまたは組成物に関する。
ある態様において、本発明は、治療における使用のための、本発明によるベクターまたは組成物に関する。
【0014】
ある態様において、本発明は、本発明によるベクターまたは組成物の治療的有効量を投与するステップを含む、がんを処置または防止する方法に関する。
ある態様において、本発明は、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、本発明によるベクターまたは組成物の治療的有効量をそれを必要とする対象に投与するステップ、を含み、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーにより特徴づけられる、方法に関する。
ある態様において、本発明は、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、本発明によるベクターまたは組成物の治療的有効量をそれを必要とする対象に投与するステップ、を含み、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーにより特徴づけられる、方法に関する。
【0015】
ある態様において、本発明は、上記のベクターを作製する方法であって：
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、
ｉｉ）エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへクローニングするステップ、
ｉｉｉ）エピトープをコードする核酸配列を含む配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへクローニングするステップ、
を含む、方法に関する。
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、
ｉｉ）エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへクローニングするステップ、
ｉｉｉ）エピトープをコードする核酸配列を含む配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへクローニングするステップ、
を含む、方法に関する。
【0016】
ある態様において、本発明は、本発明によるベクター、１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバント、および任意選択で、使用説明書を含む、キットに関する。
【0017】
ある態様において、本発明は、細胞を、本発明によるベクターまたは組成物と接触させるステップを含む、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープに対して、動物においてＴ細胞免疫応答を誘導するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＡＨ１ ＣＤ８＋ Ｔ細胞腫瘍エピトープをコードするＡｄＨｕ５複製欠損ベクターでのＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化は、末梢において耐久性のあるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を刺激する。図１Ａは、ＭＨＣ－１結合性ＣＴ２６特異的がんエピトープを発現するＡｄＨｕ５ベクターの作製に用いられる構築物の概略図である。図１Ｂは、ＡＨ１（左）およびＡｄ－Ｉ８Ｖ（右）ワクチン接種されたマウス由来の血液における％ＣＤ８＋ ＡＨ１テトラマー＋（ｔｅｔ＋） 細胞を示すＦＡＣＳプロットである。図１Ｃは、２つの独立した実験からの７日目（左）および５０日目（右）における血液中のＡＨ１テトラマー特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を示す図である。図１Ｄは、同じ試料由来の血液におけるＣＤ８＋ ＡＨ１－ｔｅｔ＋（左）およびＡＨ１－ｔｅｔ－（右）集団の示されたマーカーの存在を示すＦＡＣＳプロットである。図１Ｅは、２つの独立した実験からの７日目（左）および５０日目（右）における同じ群由来のＡＨ１－ｔｅｔ－ ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較したＡＨ１－ｔｅｔ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型を示す図である。Ｇｅｏ Ｍ ＦＩ＝幾何平均蛍光強度。
【図2-1】膨張性メモリＡＨ１特異的Ｔ細胞は、Ａｄ－ＡＨ１での予防的ワクチン接種後も治療的ワクチン接種後も、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてＣＴ２６腫瘍成長の阻害を示す。（Ａ）予防的ワクチン接種（Ｐ１およびＰ２の２回、独立して実施された）および治療的ワクチン接種（Ｔ１）についての実験設定を示す図である。星は、触知できる腫瘍の存在を示す。（Ｂ～Ｄ）予防的（Ｐ１およびＰ２）（ＢおよびＣ）および治療的ワクチン接種設定（Ｔ１）（Ｄ）における異なる群（群あたりＮ＝５）についての腫瘍成長曲線を示す図である。Ｔ１において、矢印は、ワクチン接種の時点を示す。Ａｄ－ＡＨ１（１×１０８ＩＵ）でワクチン接種されたマウスは緑色、Ａｄ－ＡＨ１ Ｌｏｗ（１×１０７ＩＵ）はオレンジ色、Ａｄ－ＡＨ１（１×１０８ＩＵ）＋Ａｄ－ＧＳＷ１１（１×１０８ＩＵ）は赤色、Ａｄ－ＧＳＷ１１（１×１０８ＩＵ）は薄紫色、Ａｄ－Ｉ８Ｖ（１×１０８ＩＵ）は灰色、ナイーブマウスは黒色で示されている。ＴＦ＝腫瘍なし。
【図2-2】（Ｅ、Ｇ、Ｌ）曝露後１８日目における群間での腫瘍サイズの統計的有意差を示す図である。点は、個々のマウスを示す。（Ｆ、Ｈ、Ｊ）グラフは、腫瘍が明らかな腫瘍成長を示す日（対照については曝露後７日目、Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウスについては曝露後１８日目）からの線形回帰により決定された腫瘍成長曲線の傾きを示す。（Ｋ）腫瘍成長速度は、比成長速度を決定するように再計算された。移植と人道的なエンドポイントとの間の腫瘍成長速度は、以下の方程式を用いて計算された比成長速度（ＳＧＲ、％／日）のパラメータを用いて定量化された：［１５］ＳＧＲ＝ｌｎ（Ｖ２／Ｖ１）／（ｔ２－ｔ１）、式中、Ｖ１およびＶ２は、移植後１日目（Ｖ１は０．０１ｍｍに固定された）（ｔ１＝０日目）およびエンドポイント（ｔ２）、それぞれにおける腫瘍体積である。
【図3】ＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、腫瘍と脾臓の間で存在量および表現型の両方が異なる。（Ａ）Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウス由来の腫瘍（上部パネル）および脾臓（下部パネル）における％ＣＤ８＋ ＡＨ１－ｔｅｔ＋ 細胞を示す代表的なＦＡＣＳプロット。陰性対照について、腫瘍および脾臓試料が、完全な範囲の蛍光色素コンジュゲート型抗体、および腫瘍試料についての無関係のＨ２－Ｌｄ結合テトラマー（ｐｐ８９）または脾臓試料についてのテトラマーなし（ｔｅｔなし）を用いて染色された。（Ｂ）グラフは、予防的（左パネル）および治療的（右パネル）ワクチン接種マウスからの腫瘍（上部パネル）および脾臓（下部パネル）における％ＣＤ８＋ ＡＨ１－ｔｅｔ＋ 細胞を示す。（Ｃ）予防的ワクチン接種マウス（Ａｄ－ＡＨ１）および対照マウス（Ａｄ－Ｉ８Ｖおよびナイーブ）からの腫瘍および脾臓におけるＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型を示すヒートマップ。細胞における値は、２つの独立した実験（Ｎ＝５～１０）の平均を示す。幾何的ＭＦＩにより定量化されたマーカーは、０～１００％スケールに標準化されている。
【図4】（Ａ）Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウス由来の腫瘍において、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋ 細胞）の存在は、予防的ワクチン接種後（左）も治療的ワクチン接種後（右）も対照マウスと比較して低いように思われる。Ａｄ－ＡＨ１およびＡｄ－ＡＨ１＋Ａｄ－ＧＳＷ１１ワクチン接種マウスからのデータはグループ化され、同様に、Ａｄ－Ｉ８Ｖワクチン接種マウスおよびナイーブマウスがグループ化された（それぞれ、ワクチン接種および対照により示されている）。（Ｂ）ＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧ免疫化は、腫瘍におけるＴｒｍ ｔｅｔ＋ 細胞のパーセンテージを増加させる。単独かまたは組み合わせてのＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧで免疫されたマウスは、対照マウス（ナイーブまたは無関係のＡｄＨｕ５構築物（ＡｄＨｕ５－Ｉ８Ｖ－ＭＧまたはＡｄＨｕ５－ＧＳＷ１１）で免疫された）と比較してレジデントメモリ表現型を有する腫瘍におけるＡＨ－１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（ＴＩＬ）のパーセンテージの増加を示している。
【図5】ＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧ免疫化は、腫瘍成長の間、機能的なままである、脾臓におけるＡＨ－１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞を誘導する。脾細胞およびＴＩＬを、ＡＨ－１ペプチドで刺激して、ＩＦＮ－ガンマ分泌に基づいたそれらの細胞傷害性潜在能力を測定した。免疫化動物由来のＡＨ－１ペプチド特異的脾細胞は、ペプチド刺激に応答することができる（ＡおよびＢ）。対照的に、ＴＩＬにおけるＣＤ８ Ｔ細胞は、ペプチド刺激に応答しなかった（ＣおよびＤ）；しかしながら、ＰＭＡ－イオノマイシンに応答して分泌されたＩＦＮ－ｇのレベルもまた低く、腫瘍におけるＣＤ８ Ｔ細胞下方制御の全般的な状態を示している。
【図6】（Ａ）図は、各動物（点で示されている）についての腫瘍成長曲線の傾きと血液（左）、脾臓（中央）におけるＣＤ８＋ ＡＨ－１特異的Ｔ細胞のパーセンテージ、および腫瘍におけるＣＤ８＋ ＡＨ１ ｔｅｔ＋ 細胞の絶対数（右）との間での相関を示す。データは、２つの独立した予防的実験（Ｐ１およびＰ２）および単一の治療的実験（Ｔ１）について示されている。より低い腫瘍成長速度が、腫瘍曝露後の脾臓および血液におけるＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞のレベルの増加と相関しているが、腫瘍におけるＡＨ－１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の絶対数とは弱く相関している。（Ｂ）は、比成長速度に関する様々なコンパートメント由来の抗原特異的細胞の比較を示す。
【図7A】（Ａ）完全長ｇｐ９０をコードするＡｄＨｕ５ベクター（ＡｄＨｕ５－ｇｐ９０ＦＬ）での治療的免疫化は、類似したレベルの腫瘍制御を与えない。各群における腫瘍の比成長速度は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて比較された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図7B】（Ｂ）治療的および予防的免疫化により腫瘍を排除したマウスは、循環中のＡＨ－１特異的細胞を有し続けている。６カ月前に腫瘍を完全に排除したマウスの血液がサンプリングされ、テトラマー染色によりＡＨ１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞について染色された。
【図8-1】ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ミニ遺伝子構築物で免疫されたＨＨＤマウスは、膨張性メモリ表現型を有するＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞の長命の循環する集団を発生した。（Ａ） ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ 細胞のレベルは、ＨＨＤマウスの群（群あたりＮ＝４～５）が１×１０８ＩＵ ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１ｍｉｎｉまたは１×１０９Ｉ．Ｕ．ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＦＬで免疫された後の血液においてテトラマー染色により測定された。用いられた構築物の概略図が示されている。これらの細胞は、（Ｂ）メモリサブセットを決定するためにＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、膨張性細胞のマーカー（Ｃ）ＣＸ３ＣＲ１および（Ｄ）ＫＬＲＧ－１、ならびに疲弊のマーカー（Ｅ）ＰＤ－１、（Ｆ）Ｔｉｍ３、および（Ｇ）Ｌａｇ－３に関して、表面染色により表現型を決定された。示された結果は、２つの独立した実験の１つからの群あたり４～５匹のマウスからである。
【図8-2】ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ミニ遺伝子構築物で免疫されたＨＨＤマウスは、膨張性メモリ表現型を有するＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞の長命の循環する集団を発生した。（Ａ） ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ 細胞のレベルは、ＨＨＤマウスの群（群あたりＮ＝４～５）が１×１０８ＩＵ ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１ｍｉｎｉまたは１×１０９Ｉ．Ｕ．ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＦＬで免疫された後の血液においてテトラマー染色により測定された。用いられた構築物の概略図が示されている。これらの細胞は、（Ｂ）メモリサブセットを決定するためにＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、膨張性細胞のマーカー（Ｃ）ＣＸ３ＣＲ１および（Ｄ）ＫＬＲＧ－１、ならびに疲弊のマーカー（Ｅ）ＰＤ－１、（Ｆ）Ｔｉｍ３、および（Ｇ）Ｌａｇ－３に関して、表面染色により表現型を決定された。示された結果は、２つの独立した実験の１つからの群あたり４～５匹のマウスからである。
【図9】ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ミニ遺伝子の単回投与でプライムされたマウスは、腫瘍曝露後、より高いパーセンテージの循環ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞を発生し、腫瘍成長のより良い制御を示している。（Ａ）１×１０８ＩＵ ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１ｍｉｎｉかまたは１×１０９Ｉ．Ｕ．ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＦＬのいずれかでの免疫化後５３日目（実線）または９９日目（破線）において、動物に１×１０６（実線））かまたは５×１０５（破線）のいずれかのＨＨＤ－ＮＹ－ＥＳＯ－１肉腫細胞を皮下（ｓ．ｃ）注射した。陰性対照として、マウスの群を１×１０８Ｉ．Ｕ．の無関係のＡｄＨｕ５－ミニ遺伝子構築物で免疫するか（Ｎ＝５）またはナイーブのままにしておくか（Ｎ＝１０）のいずれかであった。腫瘍は、１～２日ごとにデジタルカリパスを用いて測定された。（Ｂ）ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ 細胞の循環レベルが、腫瘍曝露から１４日後に採取された血液においてテトラマー染色により測定された。（Ｃ～Ｄ）腫瘍曝露前の血液中で検出されたＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋のレベルに対する、（Ｃ）初期（１４日目）および（Ｄ）後期、２７／２８日目において測定された腫瘍のサイズが示されている。統計的測定はＴ検定により実施された。示されたデータは、２つの別々の独立した実験からである。
【図10】腫瘍由来のＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞（ＴＩＬ）は、疲弊および活性化のマーカーのレベルの上昇を示している。治癒していない潰瘍によるかまたはそれらのサイズが１３００ｍｍ３に近づいたときかのいずれかである、人道的なエンドポイントに達したとき、マウスは屠殺され、脾臓および腫瘍が取り出され、分析された。リンパ球は、両方のコンパートメントから単離され、（Ａ）ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージが測定された。（Ｂ）ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ 細胞のパーセンテージもまた決定され、アポトーシスマーカー（Ｆ）ＦａｓＬと共に、疲弊マーカー（Ｃ）ＰＤ－１、（Ｄ）Ｔｉｍ－３、および（Ｅ）Ｌａｇ－３のレベルも決定された。
【図11】ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ミニ遺伝子免疫化後、ＣＸ３ＣＲ１が、脾臓およびＴＩＬにおいてＮＹ－ＥＳＯ－１１５７－１６５ Ｔｅｔ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞上で優先的に上方制御されている。人道的なエンドポイントに達したときにＴＩＬまたは脾臓から単離されたリンパ球が、テトラマーで染色され、Ｔｅｔ＋ 細胞上の以下の分子のレベルが決定された。（Ａ）脾臓および（Ｂ）ＴＩＬにおける膨張性マーカーＣＸ３ＣＲ１。（Ｃ）エフェクターメモリ表現型のマーカー、ＣＤ４４およびＣＤ６２Ｌ、ならびに（Ｄ）レジデントメモリマーカーＣＤ１０３およびＣＤ６９。（Ｅ）両方のコンパートメントにおけるＣＤ４＋ 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のレベルもまた、細胞内染色により決定された。
【図12-1】ＣＸ３ＣＲ１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞は、酸化ストレスに対してより抵抗性が高く、より高いレベルの健康な分極したミトコンドリアを含有する。（Ａ）Ａｄ－ｌａｃＺまたはＭＣＭＶ感染マウス由来のＣＸ３ＣＲ１＋／－ｇｆｐ脾細胞における感染後５１日目以降での細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルがＣｅｌｌＲＯＸ Ｒｅｄアッセイにより検出された（Ｎ＝２つの独立した実験）。（Ｂ）ＭＣＭＶまたはＡｄＨｕ５組換えアデノベクター（Ａｄ－Ｉ８Ｖ）で１００日より前に感染したＣ５７ＢＬ／６マウス由来の末梢血リンパ球が、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（全てのミトコンドリアを検出する）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄ（健康な分極したミトコンドリアのみを検出する）で染色され、その後、抗マウスＣＤ８、抗マウスＣＸ３ＣＲ１、ＬｉｖｅＤｅａｄ近赤外固定可能なマーカー（LiveDead nearIR Fixable Marker）で表面染色され、その後、ＬＳＲＩＩで分析され、データがＦｌｏｗＪｏで計算された。抗原特異的ＣＸ３ＣＲ１＋ 膨張性細胞は、より健康なミトコンドリアを含有し、酸化還元回復力の増強を示す。
【図12-2】（Ｄ）および（Ｅ）は、無血清培地（すなわち、ストレス）中でインキュベートされた場合、バルク（図Ｄ）および抗原特異的集団（図Ｅ）において、ＣＸ３ＣＲ１陰性Ｔ細胞と比較してＣＸ３ＣＲ１＋ 集団が顕著に生存したことを示す。（Ｆ）は、血清飢餓での活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを示し、ＣＸ３ＣＲ１＋ Ｔ細胞（バルクおよび抗原特異的）が内因的に、より低いレベルの活性酸素種を有し、酸化ストレスに対してより抵抗性が高いことを示している。
【図13】ＨＰＶ１６ Ｅ７４９－５７ミニ遺伝子ベクターでの予防的免疫化は、腫瘍曝露からの保護を与える。Ｅ７４９－５７特異的細胞は、腫瘍移植の部位へ移動することができ、腫瘍曝露からの保護を与える。
【図14】ＭＣＭＶに対するＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするパネルミニ遺伝子の最適以下の用量での免疫化後の相乗効果。既知のＭＣＭＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに対する３つのミニ遺伝子のパネル、すなわち、Ｍ４５（９８５ＨＧＩＲＮＡＳＦＩ９９３）、Ｍ３８（３１６ＳＳＰＰＭＦＲＶ３２５）、およびｍ１３９（４１９ＴＷＹＧＦＣＬＬ４２６）が構築された。これらは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ個々のミニ遺伝子としてかまたはカクテルとしてかのいずれかで静脈内注射された。Ｍ３８およびｍ１３９をコードするミニ遺伝子は、１×１０７感染単位（Ｉ．Ｕ）の最適以下の用量で注射され、一方、Ｍ４５をコードするミニ遺伝子は、１×１０８Ｉ．Ｕの最適用量で注射された。免疫化後６日目における血液中のＭ３８特異的細胞のレベルが測定された。驚くべきことに、最適以下の用量のＭ３８ミニ遺伝子およびｍ１３９ミニ遺伝子ベクター、加えて最適用量におけるＭ４５ミニ遺伝子を含有する混合ミニ遺伝子ワクチンを受けたマウスは、最適以下の用量のＭ３８ミニ遺伝子ベクター単独のみを注射された群と比較してより高いレベルのＭ３８特異的Ｔ細胞を発生した。この予想外の結果は、最適以下の用量でのミニ遺伝子ベクターのカクテルの送達が、相加効果を生じて、単一ベクター単独での免疫化により観察されたものより抗原特異的Ｔ細胞の規模を増強し得ることを示唆している。
【図15】ＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧ免疫化マウスの腫瘍由来のＣＤ８ Ｔ細胞は、より高いレベルのグランザイムＢを発現する。１５Ａは、移植から２３日後、免疫化から１６日後の腫瘍の全ＣＤ８ Ｔ細胞におけるグランザイムＢのレベル、および分析時点における腫瘍サイズを示す。１５Ｂは、移植から２３日後、免疫化から１６日後の腫瘍のＡＨ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞における転写因子Ｔ－ｂｅｔおよびＥｏｍｅｓのレベルを示す。
【図16】抗ＰＤ－Ｌ１と併用した治療的ワクチンとしてのＧＰ７０４２３－４３１（ＡＨ１）ミニ遺伝子の試験。１６Ａは、腫瘍曝露から７日後に、示されたアデノベクターで免疫されたマウスの群が、その後、抗ＰＤ－Ｌ１またはアイソタイプ対照で処置されたことを示す。個々のマウスの腫瘍サイズが示されている。１６Ｂは、マウスの全ての群の生存曲線を示す。１６Ｃは、免疫化から１５日後（腫瘍曝露から２２日後）の循環中のＧＰ７０４２３－４３１（ＡＨ１）Ｔｅｔ＋ 細胞の％を示す。１６Ｄは、各群における腫瘍の比成長速度がＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて比較されたことを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５
【図17-1】１７Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ予防的（Ａ、Ｃ）または治療的（Ｂ、Ｄ）ワクチン接種からの脾臓由来および腫瘍由来の単一細胞が、エクスビボで、ＡＨ１ペプチド（４μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ－イオノマイシン（ＩＯ）で７時間、刺激され、その後、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生について染色された。各試料について、低レベルバックグラウンド活性化（培地のみ）が引き算された。
【図17-2】１７Ｅ～Ｈ 抗ＰＤ－Ｌ１と併用された治療的ワクチン接種からの脾臓由来および腫瘍由来の単一細胞が、エクスビボで、ＡＨ１ペプチド（４μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ－イオノマイシン（ＩＯ）で７時間、刺激され、その後、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生について染色された。各試料について、低レベルバックグラウンド活性化（培地のみ）が引き算された。脾臓（１７Ｅ）および腫瘍（１７Ｇ）におけるＣＤ８ Ｔ細胞応答、ならびに脾臓（１７Ｆ）および腫瘍（１７Ｈ）におけるＣＤ４ Ｔ細胞応答が示されている。
【図18】２つの腫瘍抗原をコードする２つのミニ遺伝子が腫瘍制御を向上させるかどうかを決定するためのパイロット実験。Ａは、用いられたプロトコールを示す－０日目における腫瘍移植の実施、７日目におけるＡｄＨｕ５－ＡＨ１ミニ遺伝子（ＭＧ）、ＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８－２７ｍｅｒ ＭＧ、Ｃｏｍｂｏ（両方のＭＧ － ＡｄＨｕ５－ＡＨ１およびＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８－２７ｍｅｒ）、無関係のＡｄＨｕ５－ＭＧのうちの１つでのワクチン接種、ワクチン接種なし、処置群あたりＮ＝６。移植後１２日目、１６日目、および１９日目に、各群の半分はチェックポイントインヒビター抗ＰＤ－１で処置され、群の半分はアイソタイプ対照で処置された。１３日目および２０日目に採血が実施された。図１８Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦは、時間経過に対する腫瘍成長を示す。
【図19】陰性対照および単一ミニ遺伝子でのワクチン接種と比較した、抗ＰＤ－１を加えた混合ミニ遺伝子処置の比較を示す。
【図20】混合ミニ遺伝子処置、単一ミニ遺伝子処置、および陰性対照についての線形回帰により計算された腫瘍の成長速度。
【図21】混合ミニ遺伝子処置でのワクチン接種ならびに単一ミニ遺伝子ＡｄＨｕ５－ＡＨ１およびＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８－２７ｍｅｒでのワクチン接種から産生され、ワクチン接種から６日後に測定された、％ＣＤ８＋ ＡＨ１－ｔｅｔ＋ 細胞および％ＣＤ８＋ ｅｆ２８－ｔｅｔ＋ 細胞。
【図22-1】２つのミニ遺伝子構築物／ワクチン（ｃｏｍｂｏ－ＡｄＨｕ５－ＡＨ１およびＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８）での同時的静脈内免疫化が、ワクチン接種から１１日後に測定された単一ワクチンと類似した規模および表現型での両方の抗原特異的集団を誘導する。
【図22-2】２つのミニ遺伝子構築物／ワクチン（ｃｏｍｂｏ－ＡｄＨｕ５－ＡＨ１およびＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８）での同時的静脈内免疫化が、ワクチン接種から１１日後に測定された単一ワクチンと類似した規模および表現型での両方の抗原特異的集団を誘導する。
【図23】がん細胞におけるＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをターゲットする２つのミニ遺伝子（ＡｄＨｕ５－ＡＨ１およびＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８）での免疫化は、腫瘍成長を制御する。図２０における線形回帰データが、比成長速度として再計算されている。
【図24】メモリＴ細胞の非通常性サブセット：膨張性メモリＴ細胞の転写プロファイリング。（Ａ）膨張性／非膨張性ＣＤ８ Ｔ細胞のＰＣＡ。急性期（７日目または２１日目）およびより遅い時期（５０日目または１００日目）における、膨張性試料（Ｍ３８、Ｄ８Ｖ（より遅い時期）、すなわち、膨張性メモリ、青色の円で囲まれている）および非膨張性試料（Ｍ４５、Ｉ８Ｖ（より遅い時期）、すなわち、セントラルメモリ、茶色の円で囲まれている）、ならびにナイーブ試料の２つの独立したモデルの転写プロファイルの分布を示す３Ｄ ＰＣＡ。（Ｂ）疲弊／非疲弊ＣＤ８ Ｔ細胞のＰＣＡ。異なる時期における、非疲弊試料（３０日目におけるＡｒｍ、球形は青色の円で囲まれている）と共に、疲弊のモデル（３０日目におけるＣｌ１３、四面体は灰色の円で囲まれている）、およびナイーブ試料の転写プロファイルの分布を示す３Ｄ ＰＣＡ。時期：６日目（黄色）、８日目（茶色）、１５日目（ピンク色）、３０日目（黒色）、ナイーブ（緑色）。
【図25】膨張性メモリサブセットは、他のＴ細胞メモリサブセットと比較して異なる遺伝子モジュールを発現する。（Ａ）膨張性試料の重み付け遺伝子同時発現ネットワーク分析。遺伝子同時発現ネットワーク分析は、６つの遺伝子モジュールを検出した（マージ距離＝０．２５、ｓｏｆｔ－ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｗｅｒ β＝９）；青色モジュール（強調）遺伝子は、免疫関連ＧＯカテゴリーに関して濃縮されており、Ｔｂｘ２１、Ｅｏｍｅｓ、Ｚｅｂ２、およびＥ２ｆ２などの関連遺伝子を含有する。（Ｂ）青色モジュール遺伝子に基づいた膨張性／疲弊試料のＰＣＡ。最初の３つの主成分を用い、かつ膨張性試料のみの遺伝子同時発現ネットワーク分析における青色モジュールとして検出された５８８個の遺伝子の遺伝子セットに基づいたＰＣＡプロット。プロットは、ナイーブ（緑色）、非膨張性および非疲弊（青色）、ならびに膨張性および疲弊（赤色）試料の分布を示す（球形：疲弊研究；四面体：膨張研究）（膨張性メモリ集団は、青色の円で囲まれた赤色四面体である）。（Ｃ）青色モジュール遺伝子に基づいた膨張性／疲弊試料の階層的クラスタリング。外れ値を除去した後（Ｓｏｆｔ－ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ ｐｏｗｅｒ β＝２０）に膨張性試料の反復遺伝子同時発現ネットワーク分析において青色モジュールとして検出された４６９個の遺伝子の遺伝子セットに基づいた、膨張性－疲弊マージセットに関する試料クラスタリング分析（ユークリッド距離）を示すデンドログラムプロット。メモリ膨張クラスターは長方形に含有されている。
【図26A】（Ａ）ミニ遺伝子免疫原カセットを有するＡｄＨｕ５アデノウイルスの概略図およびミニ遺伝子免疫原カセットのクローズアップ表示を示す。
【図26B】（Ｂ）ミニ遺伝子免疫原カセットと共のＡＡＶ ＩＴＲの概略図、およびミニ遺伝子免疫原カセットのクローズアップ表示を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
ここで、本発明は、さらに記載される。以下の段落において、本発明の種々の態様はより詳細に定義されている。そのように定義された各態様は、明らかにそれとは反対に示されていない限り、任意の他の態様と組み合わせられ得る。特に、好ましいまたは有利であるとして示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であるとして示された任意の他の特徴と組み合わせられ得る。本発明の実践は、他に指定がない限り、当業者の能力の範囲内である、免疫学、分子生物学、化学、生化学、および組換えＤＮＡテクノロジーの通常の技術を用いる。そのような技術は、文献に十分、説明されており、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０１２）を参照されたい。
【0020】
本発明は、単一のがん特異的エピトープをコードするアデノウイルスベクターが、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生じるという驚くべき所見に基づいている。膨張性メモリ応答という用語は、持続的で、機能的で、耐久性のあるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を指す。生じたＣＤ８＋ Ｔ細胞のプールは、長期ＴＣＲ刺激により起こり得る疲弊に抵抗することができる。Ｔ細胞疲弊は、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３、およびＬａｇ－３などのマーカーの上方制御により特徴づけられ得る。
【0021】
膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、他のＣＤ８＋ メモリサブセットと比較して独特な表現型により特徴づけられ、例として、マーカーＣＸ３ＣＲ１およびＫＬＲＧ－１の発現が挙げられる。その細胞はまた、セントラルメモリＴ細胞サブセットとも疲弊メモリＴ細胞サブセットとも異なる転写プロファイルを示す。その細胞はまた、内因的に活性酸素種のより低いレベルによる可能性がある酸化還元回復力の増強および酸化ストレスに対する回復力などの特徴を示す。特に、転写プロファイルは、転写因子Ｔｂｘ２１により駆動され、Ｅｏｍｅｓからの寄与は最小である。これは結果として、長命であり、かつエフェクター機能を保持しながら末梢器官において大量に存在するＣＤ８＋ Ｔ細胞表現型を生じる。抗原特異的膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、独特なセットのプロセシング、提示、および共刺激の条件を通して発生する。エピトープのプロセシングは、免疫プロテアソームとは無関係に起こり、より後期における非造血性非通常性ＡＰＣによる提示が、この表現型を保存するのに役立ち得る。理論によって縛られるものではないが、目的の単一エピトープをコードする本発明のベクターを用いることにより、抗原プロセシングの必要性が回避され、それにより、膨張性メモリ応答を生じると考えられる。
【0022】
ある実施形態において、本発明は、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターであって、前記ベクターが膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力がある、ベクターに関する。ある実施形態において、アデノウイルスベクターは、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、例えば、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含み、そのベクターは、いかなる追加のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープも含まない。そのようなものとして、本発明のベクターは、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ、例えば、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードする。本発明は、１つより多いまたは複数のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするアデノウイルスベクターにまで及ぶことはない。
【0023】
ある実施形態において、本発明は、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスベクターであって、前記ベクターが膨張性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する能力がある、ベクターに関する。ある実施形態において、アデノウイルスベクターは、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含み、そのベクターはいかなる追加のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープも含まない。そのようなものとして、本発明のアデノウイルスベクターは、単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードする。本発明は、１つより多いまたは複数のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするアデノウイルスベクターにまで及ぶことはない。
【0024】
単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードする本発明のベクターは、単回投与から、持続的で、機能的で、耐久性のあるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を発生させることができる。生じたＣＤ８＋ Ｔ細胞のプールは、長期ＴＣＲ刺激により起こり得る疲弊に抵抗することができる。生じたＣＤ８＋ Ｔ細胞のプールはまた、酸化還元回復力の増強および低レベルの活性酸素種を示し得る。
【0025】
本明細書で用いられる場合、用語「ベクター」は、そのベクター配列が連結されている別の核酸を細胞へ輸送する能力がある核酸配列を指す。本発明のベクターは、アデノウイルスであり、細胞による発現に適した（例えば、転写調節エレメントに連結された）形態をとる遺伝子構築物を含有する、単一のがん特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0026】
本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」は、短いタンパク質配列であり得る、免疫系により認識される抗原の一部を指す。「がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子と結合した抗原提示細胞により提示され得、その後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識されるエピトープを指す。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＭＨＣ ＩＩと結合するＣＤ４共受容体を発現し、ＭＨＣ ＩＩ分子により提示されたペプチドを認識する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＭＨＣ Ｉと結合するＣＤ８共受容体を発現し、ＭＨＣ Ｉ分子により提示されたペプチドを認識する。
【0027】
膨張性メモリＴ細胞は、特異的なマーカーおよび細胞表面マーカーの存在により特徴づけられ得る。これらのマーカーを同定および定量化するための方法は当技術分野において周知されている。適切な方法の例には、親和性に基づいた分離方法、磁気細胞ソーティング技術、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）などの蛍光に基づいた細胞ソーティング技術が挙げられるが、それらに限定されない。膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、いくつかのマーカーの存在により特徴づけることができ、そのマーカーの例には、ＣＸ３ＣＲ１、ＫＬＲＧ－１、ＣＤ４４が挙げられるが、それらに限定されない。膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、いくつかのマーカーの低発現により特徴づけることができ、そのマーカーの例には、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７が挙げられるが、それらに限定されない。用語「低発現」は、そのマーカーの発現がない細胞を指す場合があり、その用語はまた、試料において他の細胞と比べてそのマーカーの発現が低い細胞を指す場合もある。
【0028】
ある実施形態において、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーにより特徴づけられ、ただし、記号表示（＋）はそのマーカーの存在を示し、記号表示（－）はそのマーカーの低発現または発現なしを示す。（－）記号表示が低発現を意味する場合、これは、「（ｌｏｗ）」によりさらに示される場合がある。膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ２７－（ｌｏｗ）、ＣＤ１２７－（ｌｏｗ）を含む群から選択されるマーカーにより特徴づけられ得る。
【0029】
膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、表現型ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－により特徴づけられ得る。膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、表現型ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ２７－（ｌｏｗ）、ＣＤ１２７－（ｌｏｗ）により特徴づけられ得る。
【0030】
膨張性メモリ応答において産生されたＣＤ８＋ Ｔ細胞は、いくつかの他の特性を有し得る。例えば、細胞は、Ｔｂｘ２１（Ｔ－ｂｅｔとも呼ばれる）により駆動された転写プロファイルを含む。これらの細胞は、Ｔｂｘ２１の持続発現を示す。その細胞はまた、一般的に細胞成長および増殖に関与する転写因子、Ｅ２ｆ２の持続発現を示し得る。その細胞はまた、転写因子Ｅｏｍｅｓの発現を欠き、または低い発現を有し得る。
【0031】
膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、抗原への曝露後、古典的収縮を示し得ない。抗原への曝露後の古典的なメモリ進化の間、細胞は、全循環ＣＤ８＋ Ｔ細胞の１％未満を構成する収縮したセントラルメモリプールを形成する。しかしながら、膨張性メモリ細胞は、血液中を循環する細胞の大きなプールとして維持される。そのようなものとして、ある実施形態において、生じた膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、全ＣＤ８＋ Ｔ細胞のおよそ２％～およそ２０％、好ましくは全ＣＤ８＋ Ｔ細胞のおよそ８％～およそ２０％、より好ましくは全ＣＤ８＋ Ｔ細胞のおよそ１２％～およそ２０％を形成する。
【0032】
ある実施形態において、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞の大きなプールは、それらのエフェクターメモリ表現型を保持する。生じた膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、それらのメモリエフェクター表現型を長期間、保持し得、そのエフェクター表現型はＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－により特徴づけられる。膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、本発明のベクターへの曝露後最長６０日間、本発明のベクターへの曝露後最長５５日間、本発明のベクターへの曝露後最長５０日間、本発明のベクターへの曝露後最長４０日間、または本発明のベクターへの曝露後最長３０日間、それらのメモリエフェクター表現型を保持し得る。
【0033】
膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞はまた、疲弊のマーカーを欠損し得る。Ｔ細胞疲弊は、過剰なＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）刺激から起こり得る。Ｔ細胞疲弊のマーカーは、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３、Ｌａｇ－３などのマーカーの上方制御を含み得る。そのようなものとして、ある実施形態において、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３、Ｌａｇ－３からなる群から選択されるマーカーを欠きまたはその低発現を示し得る。
【0034】
単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列は、およそ１２塩基対～およそ４５塩基対までを含み得、別の実施形態において、前記ヌクレオチド配列はおよそ１５塩基対～およそ４５塩基対を含み得、別の実施形態において、前記ヌクレオチド配列はおよそ１８塩基対～およそ４５塩基対を含み得、別の実施形態において、前記ヌクレオチド配列はおよそ２１塩基対～およそ４５塩基対を含み得、好ましい実施形態において、前記ヌクレオチド配列はおよそ２４塩基対～およそ４５塩基対を含み得る。そのようなものとして、ベクターは、およそ５アミノ酸～およそ１５アミノ酸を含む単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードし、別の実施形態において、ベクターはおよそ６アミノ酸～およそ１５アミノ酸を含むエピトープをコードし、別の実施形態において、ベクターはおよそ７アミノ酸～およそ１５アミノ酸を含むエピトープをコードし、好ましい実施形態において、ベクターはおよそ８アミノ酸～およそ１５アミノ酸を含むエピトープをコードする。
【0035】
単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、それが免疫応答を誘発する点において免疫原性エピトープである。Ｔ細胞エピトープは、その後の免疫応答を惹起するために主要組織適合複合体と結合する。そのようなものとして、ある実施形態において、そのエピトープは、ＭＨＣ分子に結合し、かつ提示される能力がある。ＭＨＣと結合し、それにしたがって、免疫応答を生じさせるエピトープを同定するための、当技術分野において知られた多数の方法がある。これらの方法は、ペプチド－ＭＨＣ結合予測モデルを含み、そのモデルの、公的に利用可能な多数のプログラムがある。
【0036】
ある実施形態において、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する。ＴＡＡは、がんによって産生された抗原性産物であり、それは、腫瘍の標的同定のためのバイオマーカーを提供する。ＴＡＡは、異常に発現した自己抗原、変異した自己抗原、および腫瘍特異的抗原へ大きく分類され得る。そのようなものとして、ＴＡＡは、がん細胞において上方制御されまたは過剰発現し得る。ＴＡＡは、がん細胞内で変異し得る。ＴＡＡは、がん細胞に特異的であり、かつがん細胞内でのみ発現する場合があり、これは、腫瘍特異的抗原とも呼ばれ得る。
【0037】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、がん細胞において変異している。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、がん細胞において過剰発現している。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、非コード腫瘍特異的エピトープである。本明細書で用いられる場合、用語「非コード腫瘍特異的エピトープ」は、がん細胞に見出されるペプチドであって、そのペプチドが、健康な細胞において後成的に抑制されているヌクレオチド配列に由来する、ペプチドを指す。これらのペプチド配列は、腫瘍細胞内で異常に発現している。
【0038】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、潜在性エピトープではない。本明細書で用いられる場合、「潜在性エピトープ」とは、免疫適格性個体において免疫原性ではないエピトープを指す。
【0039】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、ウイルス性に駆動されたがんに関連しているウイルスエピトープであり得る。ウイルス性に駆動されたがんは、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、ＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ球向性ウイルス）、またはＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）であり得る。
【0040】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、ＴＲＰ－１、ＣＥＡ、ＴＡＧ－７２、９Ｄ７、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ－１、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、ＣＬＰＰ、サイクリン－Ａ１、サイクリン－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、ＣＤ４５、グリピカン－３、ＩＧＦ２Ｂ３、カリクレイン－４、ＫＩＦ２０Ａ、レングシン、メロエ、ＭＵＣ５ＡＣ、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ１、ｇｐ７０、ＭＣ１Ｒ、ＴＲＰ－１／－２、β－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４からなる群から選択される腫瘍関連抗原に由来する。
【0041】
がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、プライベートエピトープであり得る。本明細書で用いられる場合、用語「プライベートエピトープ」は、もっぱら、たった一人のがんにおけるたった１つの抗原にだけ見出されるエピトープを指す。がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、パブリックエピトープであり得る。本明細書で用いられる場合、用語「パブリックエピトープ」は、２人以上の人のがんに見出されるエピトープを指す。
【0042】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、ネオエピトープであり得る。本明細書で用いられる場合、用語「ネオエピトープ」は、腫瘍細胞内での変異を通して生じているエピトープを指し、特に、体細胞変異またはパッセンジャー変異が、ネオエピトープの生成をもたらし得る。ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、ネオエピトープではない。
【0043】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、結腸直腸がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、腎がん、肺がん、乳がん、乳がん、膵臓がん、脳がん、肝細胞がん、リンパ腫、白血病、胃がん、子宮頚がん、卵巣がん、甲状腺がん、黒色腫、癌腫、頭頚部がん、皮膚がん、上咽頭がん、エプスタインバー駆動型がん、ヒトパピローマウイルス駆動型がん、および軟組織肉腫に特異的である。本明細書で用いられる場合、用語「がん」は、異常な細胞成長を有する疾患を指し、本明細書で用いられる場合、その用語は、原発腫瘍と原発腫瘍の転移の両方を指す。
【0044】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、配列番号１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）または配列番号２（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）または配列番号３７（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）を含む。がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープが、ウイルス性に駆動されたがんに関連しているウイルスエピトープである場合、そのエピトープは、配列番号７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を含み得る。ウイルス性に駆動されたがんは、ＥＢＶ駆動型がん、ＨＴＬ駆動型がん、およびＨＰＶ駆動型がんから選択され得る。ＥＢＶ駆動型がんは、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ならびに深刻な免疫障害に関連した２つのより希少な腫瘍、形質芽球性リンパ腫（ＰＢＬ）および原発性体腔性リンパ腫（ＰＥＬ）、Ｔ細胞またはＮＫ細胞のＬＰＤおよび悪性リンパ腫、上皮由来の上咽頭癌腫（ＮＰＣ）および胃癌腫、ならびに平滑筋肉腫から選択され得る。ＨＰＶ駆動型がんは、肛門生殖器がん、中咽頭がん、口腔がん、頭頸部扁平上皮がん、および咽頭がんを含み得る。
【0045】
ある実施形態において、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、表１におけるエピトープのうちの１つまたは複数を含む。
【0046】
【表1】
【0047】
さらに、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは、プロテオミクスアプローチ、質量分析アプローチ、ゲノムアプローチ、トランスクリプトーム分析、バイオインフォマティクスアプローチ、およびインシリコ方法などの当技術分野において知られた技術を用いて決定され得る。当業者が、本発明のベクター内にコードされるべき適切なエピトープを選択することは可能である。
【0048】
がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞をコードする核酸は、哺乳動物コドン使用頻度について最適化されたコドンであり得る。適切には、その核酸配列は、ヒトコドン使用頻度について最適化されたコドンであり得る。
【0049】
ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み得る。ベクターはアデノウイルスを含み得る。
アデノウイルスベクターまたはＡＡＶベクターはまた、エンハンサーおよびプロモーター領域などの追加の特徴を有し得る。ある実施形態において、ベクターは、強いプロモーターを含み得、その例には、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、ベクターは、ＣＭＶプロモーターを含み、ＣＭＶプロモーターについての適切な配列は、配列番号１８に提供されている。ある実施形態において、ベクターは、ＴＡＴＡボックスを含み得る。ある実施形態において、ベクターは、翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。コザック配列は、コンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有し、適切なコザック配列は、配列番号１９に提供されている。ある実施形態において、ベクターは、終結配列および／またはポリアデニル化配列を含む。適切なポリアデニル化配列は、配列番号３４に提供されている。ＡＡＶベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含み得る。適切なＩＴＲ配列は、配列番号４２に提供されている。
アデノウイルスベクターまたはＡＡＶベクターはまた、エンハンサーおよびプロモーター領域などの追加の特徴を有し得る。ある実施形態において、ベクターは、強いプロモーターを含み得、その例には、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、ベクターは、ＣＭＶプロモーターを含み、ＣＭＶプロモーターについての適切な配列は、配列番号１８に提供されている。ある実施形態において、ベクターは、ＴＡＴＡボックスを含み得る。ある実施形態において、ベクターは、翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。コザック配列は、コンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有し、適切なコザック配列は、配列番号１９に提供されている。ある実施形態において、ベクターは、終結配列および／またはポリアデニル化配列を含む。適切なポリアデニル化配列は、配列番号３４に提供されている。ＡＡＶベクターは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含み得る。適切なＩＴＲ配列は、配列番号４２に提供されている。
【0050】
ある実施形態において、ベクターは、追加のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含まない。ベクターは、単一のがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードするだけである。ある実施形態において、アデノウイルスベクターは、ベクターバックボーン、プロモーター領域、および単一のがん特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチド配列からなる。アデノウイルスバックボーンは、エンハンサー領域、プロモーター領域、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列などの追加の特徴を含み得る。
【0051】
ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり得る。好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、血清型２または５であり得る。ＡＡＶベクターはＩＴＲ配列を含み得、好ましい実施形態において、そのＩＴＲ配列は、コードされたがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープに隣接する。がん特異的エピトープの５’側に存在するＩＴＲ配列、およびがん特異的エピトープの３’側に存在するＩＴＲ配列があり得る。５’ＩＴＲ配列は、配列番号３９を含み得る。３’ＩＴＲ配列は配列番号４２を含み得る。ＡＡＶベクターは、がん特異的エピトープの５’側に配列、例えば配列番号３８を含み得る。ＡＡＶベクターは、がん特異的エピトープの３’側に配列、例えば配列番号４１を含み得る。がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含むＡＡＶベクターを産生するために、ヘルパープラスミドが用いられ得る。ヘルパープラスミドは、ＡＡＶ複製またはパッケージングに必要とされる遺伝子を提供するために用いられ得る。ある実施形態において、ヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡアデノウイルスタンパク質をコードし、ならびに／またはＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする。
【0052】
アデノウイルスベクターは種Ｃの血清型であり得る。種Ｃは、Ａｄ１、２、５、および６血清型を含む。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターはヒト血清型５（ＡｄＨｕ５）である。アデノウイルスベクターが、例えば免疫原性を低下させ、かつそのベクターのバイオセーフティを向上させるために、改変されることは好ましくあり得る。そのようなものとして、アデノウイルスベクターは、複製不能であり得る。アデノウイルスベクターは、Ｅ１およびＥ３タンパク質を欠損し得る。アデノウイルスベクターは、がん特異的エピトープの５’側に配列、例えば配列番号１３を含み得る。アデノウイルスベクターは、がん特異的エピトープの３’側に配列、例えば配列番号１４を含み得る。
【0053】
他のアデノウイルスベクターもまた、本発明のためのベクターに適し得る。ある実施形態において、ベクターは、動物、例えば、イヌ、サル、特にアカゲザルおよびチンパンジー由来のアデノウイルスベクターであり得る。ある実施形態において、アデノウイルスベクターは、非ヒト霊長類に由来した希少な血清型ベクターであり得る。チンパンジーに由来したベクターは、本発明のためのベクターに適し得、例には、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄＹ２５が挙げられるが、それらに限定されない。
【0054】
ある実施形態において、上記で定義されているようなベクターを含む免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物はさらに、１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含み得る。
【0055】
本発明によるベクターを含む免疫原性組成物は、本発明によるベクターを含む少なくとも１つの他の免疫原性組成物と組み合わせて用いられ得、各ベクターが、異なるがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードする。本発明による第１のベクターを含む免疫原性組成物は、本発明による第２のベクターを含む免疫原性組成物と別々に、逐次的に、または同時に投与され得る。
【0056】
ある実施形態において、免疫原性組成物は、本発明による少なくとも２つのベクターを含み得る。少なくとも２つのベクターが、異なるがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードすることは、好ましくあり得る。さらなる追加のベクターが組成物中に存在する場合、そのベクターは、異なるがん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープをコードし得る。免疫原性組成物はさらに、１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含み得る。理論によって縛られるものではないが、異なるエピトープをコードするベクターのカクテルの使用は、結果として、より強い免疫応答を生じ得、さらに、免疫応答を増強する相乗効果があり得る。
【0057】
本発明の組成物は、本明細書に記載されているような少なくとも２つのベクターを含む場合、そのベクターは、同じ時点または異なる時点での投与のための別々の薬物として提供され得る。
【0058】
ある実施形態において、本明細書に記載されているような少なくとも２つのベクターを含む場合、そのベクターは、異なる時点での投与のための別々の薬物として提供され得る。別々にかつ異なる時点で投与される場合、一方のベクターが最初に投与され得る。いくつかの実施形態において、両方が、同じ日または異なる日に投与され得、それらは、処置サイクルの間、同じスケジュールまたは異なるスケジュールを用いて投与され得る。
【0059】
あるいは、組成物が、本明細書に記載されているような少なくとも２つのベクターを含む場合、そのベクターの投与は、同時に実施され得る。同時投与が用いられる場合、ベクターは、別々の薬学的組成物として製剤化され得る。好ましい実施形態において、少なくとも２つのベクターは、単一の薬学的組成物として製剤化され得る。
【0060】
本発明の組成物は、液体、例えば、溶液、乳濁液、または懸濁液の形態をとり得る。本発明の液体組成物は、それらが溶液であろうと、懸濁液であろうと、または他の同類の形であろうと、以下のうちの１つまたは複数も含み得る：水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水、合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリンなどの固定油、または他の溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための作用物質。組成物は、ガラス、プラスチック、または他の材料でできたアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアルに封入され得る。
【0061】
本発明のベクターまたは組成物の静脈内製剤は、無菌注射用水性液または非水性（例えば、油性）溶液または懸濁液の形態をとり得る。無菌注射用調製物はまた、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であり得る。許容される媒体および溶媒の中で用いられ得るものは、水、リン酸緩衝溶液、リンゲル液、および等張食塩水である。加えて、無菌固定油が溶媒または懸濁化剤として用いられ得る。この目的のために、任意の無刺激性の固定油が用いられ得、それには、合成モノまたはジグリセリドが挙げられる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が、本発明の静脈内製剤の調製に用いられ得る。
【0062】
免疫原性組成物は、薬学分野において周知された方法論を用いて調製され得る。例えば、注射により投与されることを意図される組成物は、溶液を形成するために本発明のベクターを水と組み合わせることにより調製され得る。均一な溶液または懸濁液の形成を促進するために、界面活性剤が加えられ得る。
【0063】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているようなベクターまたは免疫原性組成物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスであり得る。宿主細胞はベクターを形質導入され得る。宿主細胞は、アデノウイルスストックを作製するために用いられ得る。
【0064】
ある実施形態において、ベクターまたは免疫原性組成物は、治療用である。好ましい実施形態において、ベクターまたは免疫原性組成物は、がんの処置または防止用である。
用語「処置」は、疾患、病的状態、または障害を治癒させ、改善し、安定化させ、または防止する意図での患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害の好転へ特定的に向けられた処置を含み、およびまた原因療法、すなわち、関連した疾患、病的状態、または障害の原因の除去へ向けられた処置も含む。加えて、この用語は、対症療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりむしろ症状の軽減のために設計された処置；予防的療法、すなわち、関連した疾患、病的状態、または障害の発生を最小限にし、または部分的もしくは完全に阻害することに向けられた処置；および支持療法、すなわち、関連した疾患、病的状態、または障害の好転へ向けられた別の特定的治療を補うために用いられる処置を含む。
用語「処置」は、疾患、病的状態、または障害を治癒させ、改善し、安定化させ、または防止する意図での患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害の好転へ特定的に向けられた処置を含み、およびまた原因療法、すなわち、関連した疾患、病的状態、または障害の原因の除去へ向けられた処置も含む。加えて、この用語は、対症療法、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒よりむしろ症状の軽減のために設計された処置；予防的療法、すなわち、関連した疾患、病的状態、または障害の発生を最小限にし、または部分的もしくは完全に阻害することに向けられた処置；および支持療法、すなわち、関連した疾患、病的状態、または障害の好転へ向けられた別の特定的治療を補うために用いられる処置を含む。
【0065】
本発明はさらに、がんを処置または防止する方法であって、それを必要とする対象に、本発明によるベクターまたは組成物の治療的有効量を投与するステップを含む、方法に関する。
【0066】
ある実施形態において、本発明は、がんの処置または防止のための薬物の製造における本明細書に記載されたベクターまたは組成物の使用に関する。ある実施形態において、本発明は、がんの処置または防止における本明細書に記載されたベクターまたは組成物の使用に関する。
【0067】
本明細書で用いられる場合、用語「治療的有効な」は、用いられる組成物の量が、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を改善するのに十分な量であることを指す。そのような改善は、低下または変化を必要とするだけであり、必ずしも除去を必要としない。
【0068】
本発明はまた、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、本発明によるベクターまたは組成物の治療的有効量を投与するステップを含み、前記ＣＤ８＋ Ｔ細胞が、ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ６２Ｌ－を含む群から選択されるマーカーによって特徴づけられる、方法を提供する。
【0069】
好ましくは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、表現型ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、およびＣＤ６２Ｌ－により特徴づけられる。より好ましくは、それらは、表現型ＣＸ３ＣＲ１＋、ＫＬＲＧ－１＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ２７（ｌｏｗ）、ＣＤ１２７（ｌｏｗ）により特徴づけられる。
【0070】
ベクターまたは免疫原性組成物は、結腸直腸がん、前立腺がん、食道がん、肝臓がん、腎がん、肺がん、乳がん、乳がん、膵臓がん、脳がん、肝細胞がん、リンパ腫、白血病、胃がん、子宮頚がん、卵巣がん、甲状腺がん、黒色腫、癌腫、頭頚部がん、皮膚がん、および軟組織肉腫の処置または防止に用いられ得る。
【0071】
本明細書に記載されているようなベクターまたは組成物は、任意の通常の経路により投与され得る。ベクターまたは組成物は、任意の通常の経路により投与され得、その経路には、経口、局所的、非経口、舌下、直腸、膣、眼、鼻腔内、肺、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、脳内、経皮、経粘膜、吸入による経路が挙げられるが、それらに限定されない。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸、膀胱内、皮内、局所的、または皮下の投与が挙げられる。ある実施形態において、ベクターまたは組成物は、静脈内または筋肉内に投与される。組成物は、１つまたは複数の投薬量単位の形態をとり得る。
【0072】
特定の実施形態において、腫瘍の部位においてなど、処置を必要とするエリアへ局所的に本発明のベクターまたは組成物を投与することは望ましくあり得る。別の実施形態において、静脈内注射または注入によりベクターまたは組成物を投与することは望ましくあり得る。特定の障害または状態の処置において有効である／活性がある本発明のベクターの量は、障害または状態の性質に依存し、標準臨床技術により決定され得る。加えて、任意で、インビトロまたはインビボアッセイが、最適な投薬量範囲を同定するのを助けるために用いられ得る。組成物中に用いられる正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。
【0073】
組成物は、適切な投薬量が得られるように、本発明によるベクターの有効量を含む。化合物の正しい投薬量は、特定の製剤、投与様式、ならびに処置されることになっているそれの特定の部位、宿主、および疾患によって異なる。年齢、体重、性別、食事、投与の時間、排出の速度、宿主の状態、混合薬、反応感受性、および疾患の重症度のような他の因子が考慮されるべきである。投与は、連続的にまたは定期的に行われ得る。
【0074】
がんの治療において、本発明のベクターまたは免疫原性組成物は、既存の治療と併用して用いられ得る。一実施形態において、ベクターまたは組成物は、既存の治療または治療剤、例えば抗がん治療と併用して、用いられる。したがって、別の態様において、本発明はまた、本発明のベクターまたは組成物の投与および抗がん治療を含む併用療法に関する。抗がん治療は、治療剤または放射線療法を含み得、遺伝子治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、骨髄移植、ナノセラピー、標的抗がん治療、または腫瘍退縮薬を含む。他の治療剤の例には、チェックポイントインヒビター、抗悪性腫瘍剤、免疫原性剤、弱毒化がん性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮａ２、ＧＭ－ＣＳＦ）、標的小分子および生物学的分子（例えば、シグナル伝達経路のコンポーネント、例えば、チロシンキナーゼのモジュレータおよび受容体型チロシンキナーゼのインヒビター、ならびに腫瘍特異的抗原と結合する作用物質、例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト）、抗炎症剤、細胞毒性剤、放射能毒性剤、または免疫抑制剤、および免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞、化学療法が挙げられる。一実施形態において、ベクターまたは組成物は、手術と併用して用いられる。本発明のベクターまたは組成物は、他の治療と同じ時点または異なる時点に、例えば同時に、別々に、または逐次的に、投与され得る。
【0075】
ある実施形態において、ベクターまたは組成物は、免疫調節剤と併用して用いられる。免疫調節剤は、免疫調節剤と同時に、逐次的に、または別々に投与され得る。特定の実施形態において、免疫調節剤は、免疫チェックポイントインヒビターであり得、免疫チェックポイントインヒビターの例には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ａ２ａＲ、ＢＴＬＡ、ＧＡＬ９、およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質のインヒビターが挙げられるが、それらに限定されない。
【0076】
ある特定の腫瘍タイプは、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１単剤療法に対して無応答性であると以前、報告されている。驚くべきことに、ミニ遺伝子ベクターでの免疫化が、抗ＰＤ－Ｌ１治療などのチェックポイントインヒビターと併用して投与された場合、腫瘍制御の増強を生じ得ることが、本明細書で示されている。これは、標準チェックポイントインヒビター治療に対して無応答であると知られている腫瘍モデルにおいて有効であると示されている。そのようなものとして、ある実施形態において、本ベクターまたは組成物は、チェックポイントインヒビター無応答性腫瘍の処置のためにチェックポイントインヒビターと組み合わせて用いられ得る。
【0077】
本発明のベクターまたは組成物および免疫調節剤は、同じ時点または異なる時点における投与のための別々の薬物として提供され得る。
ある実施形態において、本発明のベクターまたは組成物および免疫調節剤は、異なる時点における投与のための別々の薬物として提供される。別々にかつ異なる時点に投与される場合、ベクターかまたは免疫調節剤のいずれかが、最初に投与され得る。いくつかの実施形態において、両方が同じ日または異なる日に投与され得、それらは、処置サイクルの間、同じスケジュールまたは異なるスケジュールを用いて投与され得る。
ある実施形態において、本発明のベクターまたは組成物および免疫調節剤は、異なる時点における投与のための別々の薬物として提供される。別々にかつ異なる時点に投与される場合、ベクターかまたは免疫調節剤のいずれかが、最初に投与され得る。いくつかの実施形態において、両方が同じ日または異なる日に投与され得、それらは、処置サイクルの間、同じスケジュールまたは異なるスケジュールを用いて投与され得る。
【0078】
あるいは、免疫調節剤の投与は、ベクターまたは免疫原性組成物の投与と同時に実施され得る。同時投与が用いられる場合、ベクターまたは免疫原性組成物および免疫調節剤は、別々の薬学的組成物として製剤化され得る。ベクターまたは免疫原性組成物および免疫調節剤は、単一の薬学的組成物として製剤化され得る。
【0079】
本発明のベクターまたは組成物は、予防的または治療的に投与され得る。用語「予防的に」は、疾患に対して保護効果を生じることを意図された投与を指す。用語「治療的に」は、治癒効果を生じることを意図された投与を指す。
【0080】
本発明のベクターまたは組成物は、単回投与として投与され得る。その投与は、予防的設定または治療的設定で提供され得る。ある実施形態において、単回投与は、１つまたは複数の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、単一用量単位として提供され得る。
【0081】
本発明のベクターまたは組成物は複数回投与として投与され得る。複数回投与が投与される場合、１回もしくは複数回が予防的に投与され、または１回もしくは複数回が治療的に投与され得る。複数回投与が投与される場合、１回または複数回が予防的に投与され、かつ１回または複数回が治療的に投与され得る。ある実施形態において、ベクターは、「プライムブースト」レジメンとして投与され得、アデノウイルスベクターの最初の投与（プライミング投与）、続いて、２回目の投与（ブースト投与）がある。
【0082】
投薬遅延および／または用量低減ならびにスケジュール調整が、個々の患者の処置に対する耐性に依存して必要な場合、実施される。
免疫原性組成物が少なくとも２つのベクターを含み、かつ前記ベクターが、上記のように異なるエピトープをコードする場合、前記ベクターの間で相乗作用があり得る。そのようなものとして、ベクターのそれぞれは、最適以下の用量で投与され得る。用語「最適以下の」用量は、腫瘍を完全に除去または根絶することを意図されていないが、それにも関わらず、一部の腫瘍細胞または組織が壊死になることを生じる用量レベルを指す。当業者は、患者の年齢、疾患の状態、ならびに腫瘍または転移のサイズおよび位置などの因子によって、これを達成するために必要とされる適切な用量を決定することができる。
免疫原性組成物が少なくとも２つのベクターを含み、かつ前記ベクターが、上記のように異なるエピトープをコードする場合、前記ベクターの間で相乗作用があり得る。そのようなものとして、ベクターのそれぞれは、最適以下の用量で投与され得る。用語「最適以下の」用量は、腫瘍を完全に除去または根絶することを意図されていないが、それにも関わらず、一部の腫瘍細胞または組織が壊死になることを生じる用量レベルを指す。当業者は、患者の年齢、疾患の状態、ならびに腫瘍または転移のサイズおよび位置などの因子によって、これを達成するために必要とされる適切な用量を決定することができる。
【0083】
ある実施形態において、上で記載されたベクターを作製する方法であって：
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、
ｉｉ）前記エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへクローニングするステップ、
ｉｉｉ）前記エピトープをコードする核酸配列を含む配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへクローニングするステップ、
を含む、方法が提供される。
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、
ｉｉ）前記エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへクローニングするステップ、
ｉｉｉ）前記エピトープをコードする核酸配列を含む配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへクローニングするステップ、
を含む、方法が提供される。
【0084】
適切なクローニング方法は当技術分野内で知られており、クローニング方法の例には、制限ライゲーション方法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、ライゲーション非依存性クローニングが挙げられるが、それらに限定されない。当業者は、前記配列をプラスミドへクローニングするための適切な方法を決定することができる。エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへ導入するためのクローニング方法は、以前のクローニング方法と同じまたは異なり得る。ある実施形態において、エピトープ配列をコードする核酸配列を第１のプラスミドへ導入するためのクローニング方法は、制限ライゲーション方法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、ライゲーション非依存性クローニングから選択される。ある実施形態において、エピトープをコードする核酸配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへ導入するためのクローニング方法は、制限ライゲーション方法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、ライゲーション非依存性クローニングから選択される。
【0085】
ある実施形態において、ステップｉｉｉ）は、エピトープをコードする核酸配列を含む配列を、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへクローニングすることを含み、前記エピトープをコードする核酸配列を含む配列がまた、翻訳開始配列、プロモーター、終結配列、ポリアデニル化配列を含む群から選択される追加の特徴も含む。
【0086】
ある実施形態において、ベクターを作製する方法は：
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、
ｉｉ）センスおよびアンチセンスプライマーをアニールさせるステップ、
ｉｉｉ）アニールされたプライマーを、供与体プラスミドへの挿入を可能にするために適切な制限酵素で消化するステップ、および
ｉｖ）供与体プラスミドを、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへ移入するステップ、
を含む。
ｉ）センスおよびアンチセンスプライマーとして、エピトープをコードする核酸配列を合成するステップ、
ｉｉ）センスおよびアンチセンスプライマーをアニールさせるステップ、
ｉｉｉ）アニールされたプライマーを、供与体プラスミドへの挿入を可能にするために適切な制限酵素で消化するステップ、および
ｉｖ）供与体プラスミドを、アデノウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドへ移入するステップ、
を含む。
【0087】
適切な制限酵素および部位は、当業者に知られている。供与体プラスミドへの挿入を可能にするためにセンスおよびアンチセンスプライマー内に適切な制限部位を設計することは、当業者の能力の範囲内である。
【0088】
コードされるエピトープは、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープである。複数のがん特異的エピトープが決定されており、当技術分野において知られている。ベクター内でコードされる適切なエピトープを選択することは、当業者にとって可能である。がん特異的エピトープを同定するためのさらなる方法は、当技術分野において知られており、それには、バイオインフォマティクスアプローチ、トランスクリプトーム分析、およびインシリコ方法が挙げられる。
【0089】
アデノウイルスベクターをコードする第２のプラスミドは、以下の特徴のいずれかを含み得る。アデノウイルスベクターは、エンハンサーおよびプロモーター領域、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーターなどの強いプロモーターを含み得る。好ましい実施形態において、ベクターはＣＭＶプロモーターを含む。ベクターはＴＡＴＡボックスを含み得る。ある実施形態において、ベクターは、翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。コザック配列は、コンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有する。ある実施形態において、ベクターは、終結配列および／またはポリアデニル化配列を含む。アデノウイルスベクターは、種Ｃの血清型、例えば、Ａｄ１、２、５、および６血清型であり得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターはヒト血清型５（ＡｄＨｕ５）である。アデノウイルスベクターが、例えば免疫原性を低下させ、かつそのベクターのバイオセーフティを向上させるために、改変されることは好ましくあり得る。そのようなものとして、アデノウイルスベクターは、複製不能であり得る。アデノウイルスベクターは、Ｅ１およびＥ３タンパク質を欠損し得る。
【0090】
供与体プラスミドを第２のプラスミドへ移入するステップは、任意の方法、例えば、ライゲーション方法により実施され得る。
本発明のある実施形態において、本明細書に記載されているようなベクターまたは免疫原性組成物、１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバント、および任意で、使用説明書を含む、キットが提供される。
本発明のある実施形態において、本明細書に記載されているようなベクターまたは免疫原性組成物、１つまたは複数の追加の活性成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバント、および任意で、使用説明書を含む、キットが提供される。
【0091】
追加の活性物質には、チェックポイントインヒビター、抗悪性腫瘍剤、免疫原性剤、弱毒化がん性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮａ２、ＧＭ－ＣＳＦ）、標的小分子および生物学的分子（例えば、シグナル伝達経路のコンポーネント、例えば、チロシンキナーゼのモジュレータおよび受容体型チロシンキナーゼのインヒビター、ならびに腫瘍特異的抗原と結合する作用物質、例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト）、抗炎症剤、細胞毒性剤、放射能毒性剤、または免疫抑制剤、および免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞が挙げられ得る。
【0092】
薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントには、水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水、合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリンなどの固定油、または他の溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための作用物質が挙げられ得る。
【0093】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているようなベクターまたは免疫原性組成物と細胞を接触させるステップを含む、がん特異的ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープに対して、動物においてＴ細胞免疫応答を誘導するための方法に関する。
【0094】
細胞を、ベクターまたは組成物と、インビトロ様式で、エクスビボ様式で、またはインビボ様式で接触させ得る。細胞をベクターまたは組成物と、インビトロかまたはエクスビボかのいずれかで接触させる場合、その後に、細胞を対象に投与し得る。
【0095】
Ｔ細胞免疫応答は、膨張性メモリＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を含み得る。
別の態様において、本発明は、実施例および／または添付の図面に示されているようなベクターを提供する。
別の態様において、本発明は、実施例および／または添付の図面に示されているようなベクターを提供する。
【0096】
本明細書で他に規定がない限り、本開示に関連して用いられる科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味をもつものとする。前述の開示は、この発明を作製および使用する方法、加えてその最良の様式を含め、本発明の範囲内に包含される主題の一般的説明を提供するが、以下の実施例は、当業者がこの発明を実施するのを可能にするために、およびその完全な書面での説明を提供するために、提供される。しかしながら、当業者は、これらの実施例の詳述が、本発明への制限として読まれるべきではなく、本発明の範囲は、この開示に添付された特許請求の範囲およびその等価物から捉えられるべきであることは認識しているだろう。本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を鑑みれば、当業者に明らかであろう。
【0097】
この明細書に言及された全ての文書は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、非限定的例においてさらに記載されている。
本発明は、非限定的例においてさらに記載されている。
【実施例】
【0098】
実施例１
ＣＴ２６結腸直腸癌腫で同定されたＣＤ８エピトープである、優性ＡＨ１エピトープをコードする単一のＡｄＨｕ５構築物は免疫原性である
内因性ネオ抗原を有するマウスがんモデルにおける一連の実験を、ミニ遺伝子ワクチン接種が内因性Ｔ細胞エピトープに対してＴ細胞応答を生じさせることができるかどうかを調べるために実施した。ＣＴ２６マウス結腸直腸癌腫モデルを利用し、そのペプチド配列ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（ＡＨ－１と名付けられた、配列番号１）は、ＢａｌｂｃマウスによりＨ２－ＤＬ拘束様式で認識される内因性レトロウイルスであるマウス白血病ウイルスのタンパク質（ＭｕＬＶ ｅｎｖ ｇｐ７０４２３－４３２）に由来した。「潜在性」ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ、ＧＧＰＥＳＦＹＣＡＳＷ（ＭｕＬＶ ｅｎｖ ｇｐ９０１４７－１５８由来、ＧＳＷ１１と名付けられた、配列番号３）をコードするミニ遺伝子もまた試験した。このＨ－２Ｄｄ拘束性エピトープは、健康な免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導しない － それもまたＭｕＬＶに由来するが、それは、ＡＨ－１とは異なるオープンリーディングフレームでコードされている。さらに、それは、カノニカルペプチドモチーフに従わないため、Ｄｄ ＭＨＣ分子と安定的に結合せず、そのため、それが細胞表面から失われる前の２０分間の安定化の非常に速い半減期を有する。対照的に、ＡＨ－１は、６０分間の半減期を有する；結果的に、ＧＳＷ１１に対するＣＤ８ Ｔ細胞特異的応答は、制御性ＣＤ４ Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が全身性に枯渇したときのみ発生し（Ｊａｍｅｓら、２０１０ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０４８～５０５５）、抗原提示細胞の非常に高いレベルの活性化をもたらす（Ｓｈｅｖａｃｈ．、２００９ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０（５）：６３６～４５）。これは、そのような不安定な「潜在性」エピトープに対する応答が、全身性Ｔｒｅｇ枯渇を必要とすることなく、免疫適格性動物においてミニ遺伝子免疫化により生じ得るかどうかを調べるために含まれた。２つのエピトープを、別々のミニ遺伝子として、前に記載されているようにＡｄＨｕ５バックボーン上に構築した（図１Ａ）。
ＣＴ２６結腸直腸癌腫で同定されたＣＤ８エピトープである、優性ＡＨ１エピトープをコードする単一のＡｄＨｕ５構築物は免疫原性である
内因性ネオ抗原を有するマウスがんモデルにおける一連の実験を、ミニ遺伝子ワクチン接種が内因性Ｔ細胞エピトープに対してＴ細胞応答を生じさせることができるかどうかを調べるために実施した。ＣＴ２６マウス結腸直腸癌腫モデルを利用し、そのペプチド配列ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（ＡＨ－１と名付けられた、配列番号１）は、ＢａｌｂｃマウスによりＨ２－ＤＬ拘束様式で認識される内因性レトロウイルスであるマウス白血病ウイルスのタンパク質（ＭｕＬＶ ｅｎｖ ｇｐ７０４２３－４３２）に由来した。「潜在性」ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープ、ＧＧＰＥＳＦＹＣＡＳＷ（ＭｕＬＶ ｅｎｖ ｇｐ９０１４７－１５８由来、ＧＳＷ１１と名付けられた、配列番号３）をコードするミニ遺伝子もまた試験した。このＨ－２Ｄｄ拘束性エピトープは、健康な免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導しない － それもまたＭｕＬＶに由来するが、それは、ＡＨ－１とは異なるオープンリーディングフレームでコードされている。さらに、それは、カノニカルペプチドモチーフに従わないため、Ｄｄ ＭＨＣ分子と安定的に結合せず、そのため、それが細胞表面から失われる前の２０分間の安定化の非常に速い半減期を有する。対照的に、ＡＨ－１は、６０分間の半減期を有する；結果的に、ＧＳＷ１１に対するＣＤ８ Ｔ細胞特異的応答は、制御性ＣＤ４ Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が全身性に枯渇したときのみ発生し（Ｊａｍｅｓら、２０１０ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０４８～５０５５）、抗原提示細胞の非常に高いレベルの活性化をもたらす（Ｓｈｅｖａｃｈ．、２００９ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０（５）：６３６～４５）。これは、そのような不安定な「潜在性」エピトープに対する応答が、全身性Ｔｒｅｇ枯渇を必要とすることなく、免疫適格性動物においてミニ遺伝子免疫化により生じ得るかどうかを調べるために含まれた。２つのエピトープを、別々のミニ遺伝子として、前に記載されているようにＡｄＨｕ５バックボーン上に構築した（図１Ａ）。
【0099】
Ａｄ－ＡＨ１ ｌｏｗとして１×１０８または１×１０７感染単位（ＩＵ）の用量におけるミニ遺伝子ベクターＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧでのＢＡＬＢ／ｃマウスの注射は、ＡＨ１テトラマー染色により検出されているように（図１Ｂ）、ワクチン接種後７日目において全ＣＤ８＋ Ｔ細胞のおよそ２５％での血液中にＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を誘導した（図１Ｃ、左）。このレベルは、時間と共に徐々に５０日目において約５％（図１Ｃ、右）へ、ワクチン接種後８０日目において約２．５％（データ未呈示）へ減少した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡｄミニ遺伝子ワクチン接種後に、より高いレベルにおいてはプラトーであるが、類似したパーセンテージが観察されている。ＡＨ１特異的応答は、ナイーブマウスにおいても無関係のエピトープ（Ｉ８Ｖ、β－ガラクトシダーゼ（細菌の酵素）に由来したエピトープ）をコードするＡｄＨｕ５ミニ遺伝子でワクチン接種されたマウスにおいても検出することができなかった（図１Ｃ、左および右）。
【0100】
ＧＳＷ１１特異的応答は、ＧＳＷ１１テトラマー染色によってもＧＳＷ１１ペプチド刺激によっても検出することができず、そのような「潜在性」の不安定なエピトープが免疫適格性動物においてＣＤ８ Ｔ細胞応答を発生させることができないことを示している。それにも関わらず、ＡｄＨｕ５－ＡＨ－１のみで免疫された群対両方のミニ遺伝子ＡｄＨｕ５－ＡＨ－１＋ＡｄＨｕ５－ＧＳＷ１１で免疫された動物におけるＡＨ－１＋ テトラマー応答の規模の差はなかった（図１Ｃ、左）ことに注目することは興味深く、非免疫原性エピトープをコードするＡｄＨｕ５ミニ遺伝子構築物の同時送達は、ＡＨ－１特異的応答の誘導に干渉しなかったことを示している。
【0101】
ＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の規模は時間と共に減少したが、それらの表現型は安定したままであった － Ｃ５７ＢＬ／６マウス１５において観察されたそれと類似して、同じマウス由来の血液中のテトラマー陰性（ｔｅｔ－）集団と比較して、エフェクターメモリ表現型（ＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－、図１Ｄおよび１Ｅ、上の行）を有し、より低いレベルのＣＤ２７（図１Ｄおよび１Ｅ、中央の行）およびより高いレベルのＰＤ－１（図１Ｄおよび１Ｅ、下の行）を発現する（図１Ｄおよび１Ｅ）。加えて、この集団内で、高レベルのＣＸ３ＣＲ１および低レベルのＣＤ１２７も検出された。５０日までに、そのエフェクターメモリ表現型のわずかな喪失が、活性化マーカーＣＤ２７およびＰＤ－１のいくらかの上方制御と共に、観察された（図１Ｅ、それぞれ、左パネル、上、中央、および下）。
【0102】
実施例２
ＡｄＨｕ－５ミニ遺伝子免疫化は、予防的および治療的免疫化モデルにおいてＣＴ２６腫瘍成長を遅らせる
この予防的免疫化レジメンの保護効率を測定するために、免疫された動物に、Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種から５日後、ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した（図２Ａ、Ｂ～Ｃ）。Ａｄ－ＡＨ１で免疫された全ての動物は、腫瘍成長を有意に抑制し、曝露された動物のうちの１匹（１／１５）において完全寛解があった（図２ＢおよびＣ）。免疫原性データから予想されるように、無関係のミニ遺伝子Ａｄ－ＧＳＷ１１のみで免役された群（図２Ｂ－Ｐ１）も免疫されていない群（図２Ｂ－Ｐ１）も保護は見られなかった。興味深いことに、低用量のＡｄ－ＡＨ１（１×１０７ＩＵ）１７でワクチン接種された群においてわずかにより良い制御が見られた（図２Ｃ－Ｐ２）（統計的に有意ではなかったが）。ＡＤ－ＡＨ１ワクチン接種マウスと対照マウスとの間で、腫瘍曝露後１８日目において、腫瘍サイズの有意な差が観察された（図２Ｅおよび２Ｇ）。加えて、腫瘍が成長し始めた日から、腫瘍が成長する速度（曲線にフィッティングされた線形回帰線の傾きによって決定された）は、対照マウスと比較してＡｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウスにおいて低かった（図２Ｆ、２Ｈ、および２Ｋ）。結論として、ＣＴ２６腫瘍曝露前と後のＡｄ－ＡＨ１ワクチン接種は、腫瘍成長を遅らせる。
ＡｄＨｕ－５ミニ遺伝子免疫化は、予防的および治療的免疫化モデルにおいてＣＴ２６腫瘍成長を遅らせる
この予防的免疫化レジメンの保護効率を測定するために、免疫された動物に、Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種から５日後、ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した（図２Ａ、Ｂ～Ｃ）。Ａｄ－ＡＨ１で免疫された全ての動物は、腫瘍成長を有意に抑制し、曝露された動物のうちの１匹（１／１５）において完全寛解があった（図２ＢおよびＣ）。免疫原性データから予想されるように、無関係のミニ遺伝子Ａｄ－ＧＳＷ１１のみで免役された群（図２Ｂ－Ｐ１）も免疫されていない群（図２Ｂ－Ｐ１）も保護は見られなかった。興味深いことに、低用量のＡｄ－ＡＨ１（１×１０７ＩＵ）１７でワクチン接種された群においてわずかにより良い制御が見られた（図２Ｃ－Ｐ２）（統計的に有意ではなかったが）。ＡＤ－ＡＨ１ワクチン接種マウスと対照マウスとの間で、腫瘍曝露後１８日目において、腫瘍サイズの有意な差が観察された（図２Ｅおよび２Ｇ）。加えて、腫瘍が成長し始めた日から、腫瘍が成長する速度（曲線にフィッティングされた線形回帰線の傾きによって決定された）は、対照マウスと比較してＡｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウスにおいて低かった（図２Ｆ、２Ｈ、および２Ｋ）。結論として、ＣＴ２６腫瘍曝露前と後のＡｄ－ＡＨ１ワクチン接種は、腫瘍成長を遅らせる。
【0103】
次に、治療的曝露モデルにおいてミニ遺伝子構築物を試験した（図２Ｄ）。マウスの群に、腫瘍細胞を皮下注射し、その６日後、Ａｄ－ＡＨ１を静脈内注射した（図２Ａおよび図２Ｄ）。前述同様に、Ａｄ－ＡＨ－１での免疫化は腫瘍成長を遅らせた － Ａｄ－ＡＨ１免疫化マウスは、免疫後１８日目において、ナイーブおよび無関係のＡｄＨｕ５免疫化動物と比較して有意により小さい腫瘍を有し（図２Ｉおよび２Ｊ）、ある動物は腫瘍なしのままであった（１／１０）。
【0104】
実施例３
ＡｄＨｕ５－ＡＨ１ミニ遺伝子免疫化は特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型を変化させる
担がんマウスを、人道的なエンドポイントに達したとき、選別して屠殺した。そのポイントにおいて、腫瘍（ＴＩＬ）および脾臓におけるＡＨ－１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の規模を決定した。ＡＨ１テトラマー染色（図３Ａ、上部パネル）は、ワクチン接種マウス由来の腫瘍、加えて対照マウスにおいて高レベルのＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示した（図３Ｂ、上の行の左と右）。異なる／無関係のＨ２－Ｌｄ結合テトラマーと共に蛍光色素コンジュゲート型抗体（ＭＣＭＶ ｐｐ８９エピトープを認識する）の完全パネルでの染色は、少しの陽性細胞も示さず（図３Ａ）、高レベルのＡＨ－１テトラマー細胞が、自己蛍光の結果でもＨ２－Ｌｄテトラマーの非特異的結合の結果でもないことを確認した。しかしながら、この時期において、腫瘍制御の喪失が生じていたことは注目に値する。
ＡｄＨｕ５－ＡＨ１ミニ遺伝子免疫化は特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型を変化させる
担がんマウスを、人道的なエンドポイントに達したとき、選別して屠殺した。そのポイントにおいて、腫瘍（ＴＩＬ）および脾臓におけるＡＨ－１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の規模を決定した。ＡＨ１テトラマー染色（図３Ａ、上部パネル）は、ワクチン接種マウス由来の腫瘍、加えて対照マウスにおいて高レベルのＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を示した（図３Ｂ、上の行の左と右）。異なる／無関係のＨ２－Ｌｄ結合テトラマーと共に蛍光色素コンジュゲート型抗体（ＭＣＭＶ ｐｐ８９エピトープを認識する）の完全パネルでの染色は、少しの陽性細胞も示さず（図３Ａ）、高レベルのＡＨ－１テトラマー細胞が、自己蛍光の結果でもＨ２－Ｌｄテトラマーの非特異的結合の結果でもないことを確認した。しかしながら、この時期において、腫瘍制御の喪失が生じていたことは注目に値する。
【0105】
予防的免疫化の後期において、ＡＨ－１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の集団が全群において脾臓（図３Ｂ、下の行の左）で検出され、群間でほとんど差はなかった。対照的に、腫瘍曝露後にＡｄ－Ｈｕ５ ＡＨ－１で免疫された動物だけが、脾臓においてＡＨ－１テトラマー陽性細胞のレベルの上昇を生じ（図３Ｂ、下の行の右）、免疫化が、他のコンパートメントにおけるテトラマー陽性細胞のレベルをブーストし得ることを示唆した。
【0106】
表現型分析は、脾臓において、Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウス由来のこれらのＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、大部分、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１２７、Ｆａｓ、およびＬＦＡ－１を上方制御し、かつＣＤ２７およびＴｒｍ細胞マーカー（ＣＤ６９＋ ＣＤ１０３＋）を下方制御するエフェクターメモリ細胞（ＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－）であることを示した（図３Ｃ、右パネル）。対照的に、腫瘍におけるＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、異なる表現型を発現し、高度に上方制御されるようになったが、高レベルのＰＤ－１により証明されているように、疲弊していた（図３Ｃ、左パネル）。ＰＤ－１上方制御は、ＴＩＬにおける他のＣＤ８ Ｔ細胞上のＰＤ－１のレベルがそれほど高くないため（図３Ｃ、中央のパネル）、大規模なＴＣＲ刺激による可能性が高い。下方制御されているＣＤ１２７、ならびにテトラマー陽性ＴＩＬと非テトラマー陽性ＴＩＬの両方において同じままであるＣＤ２７およびＣＤ６９＋ ＣＤ１０３＋を除いて、全ての示されたマーカーが上昇している（図３Ｃ、左および中央のパネル）。したがって、免疫化は、リンパ球系コンパートメントにおけるテトラマー陽性細胞のレベルを変化させ、かつＴＩＬにおいて表現型をエフェクターメモリの１つへ歪めるように思われる。
【0107】
実施例４
制御性Ｔ細胞のパーセンテージは、対照マウスと比較してＡｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウス由来の腫瘍において、より低いように思われ、一方、Ａｄ－ＡＨ１免疫化後のＴＩＬにおいてＴｒｍが増加している
免疫化が腫瘍微小環境において他の変化を生じるかどうかを決定するために、ＴｒｅｇおよびＡＨ－１特異的レジデントメモリＴ細胞（Ｔｒｍ）のレベルを測定した。ＣＤ４ Ｔ細胞コンパートメント内で、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋）細胞の集団が、対照群（ナイーブおよび無関係のＡｄ免疫化群）と比較して、Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種群由来の腫瘍において、より低いことを見出した（図４Ａ）。
制御性Ｔ細胞のパーセンテージは、対照マウスと比較してＡｄ－ＡＨ１ワクチン接種マウス由来の腫瘍において、より低いように思われ、一方、Ａｄ－ＡＨ１免疫化後のＴＩＬにおいてＴｒｍが増加している
免疫化が腫瘍微小環境において他の変化を生じるかどうかを決定するために、ＴｒｅｇおよびＡＨ－１特異的レジデントメモリＴ細胞（Ｔｒｍ）のレベルを測定した。ＣＤ４ Ｔ細胞コンパートメント内で、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋）細胞の集団が、対照群（ナイーブおよび無関係のＡｄ免疫化群）と比較して、Ａｄ－ＡＨ１ワクチン接種群由来の腫瘍において、より低いことを見出した（図４Ａ）。
【0108】
最近、Ｔｒｍ表現型を発現する抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が、より優れた腫瘍制御を発揮したことが報告されている。これと一致して、アデノウイルスベクターミニ遺伝子免疫化が、ＴＩＬにおいてＡＨ１＋ ＣＤ１０３＋ ＣＤ６９＋ Ｔｒｍのパーセンテージを増加させることを見出した。これは、免疫化群が組み合わされ、陰性対照（ＩｒｒＡｄ（無関係の抗原）およびナイーブ）群と比較された場合、統計的に有意である。ナイーブ群において、ＡＨ１＋ テトラマーの大きな集団の存在にも関わらず（図８Ａ）、ＣＤ１０３＋ ＣＤ６９＋ ＣＤ６２Ｌ低（ｌｏｗ）、ＣＤ４４高（ｈｉ）のＴｒｍ表現型をほとんど示さなかった（図４Ｂ）。予防的と治療的の両方の免疫化設定においてこの増加は明らかであった（図４Ｂ）。まとめると、このがんモデルにおいて、ミニ遺伝子免疫化は、腫瘍微小環境を、腫瘍細胞の好都合な認識および殺害へと変化させるように思われる。
【0109】
実施例５
ＴＩＬにおける抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は同族ペプチドに対して応答性ではないが、同族動物由来の脾細胞はそれらの機能性を保持する
ＡＨ１テトラマー染色により腫瘍において検出されたＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の高いパーセンテージ（図３Ａ）は、ＡＨ１特異的ＴＣＲを発現する細胞の数を示す。しかしながら、これは、ＴＣＲシグナル伝達およびＴ細胞活性化がＡＨ１ペプチドとの相互作用で起こるかどうかを立証していない。したがって、脾臓および腫瘍由来の単一細胞を、（１）ＴＣＲシグナル伝達の効果を測定するためにＡＨ１ペプチドで、および（２）非特異的活性化を測定するためにＰＭＡ／ＩＯで刺激した。炎症促進性サイトカインのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生を読み出しとして用いた。対応するマウス由来の脾細胞もまた、同族ペプチドおよびＰＭＡ／ＩＯで刺激した。
ＴＩＬにおける抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は同族ペプチドに対して応答性ではないが、同族動物由来の脾細胞はそれらの機能性を保持する
ＡＨ１テトラマー染色により腫瘍において検出されたＡＨ１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の高いパーセンテージ（図３Ａ）は、ＡＨ１特異的ＴＣＲを発現する細胞の数を示す。しかしながら、これは、ＴＣＲシグナル伝達およびＴ細胞活性化がＡＨ１ペプチドとの相互作用で起こるかどうかを立証していない。したがって、脾臓および腫瘍由来の単一細胞を、（１）ＴＣＲシグナル伝達の効果を測定するためにＡＨ１ペプチドで、および（２）非特異的活性化を測定するためにＰＭＡ／ＩＯで刺激した。炎症促進性サイトカインのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生を読み出しとして用いた。対応するマウス由来の脾細胞もまた、同族ペプチドおよびＰＭＡ／ＩＯで刺激した。
【0110】
図５Ａおよび５Ｂに示されているように、ミニ遺伝子免疫化群由来のＣＤ８＋ 脾細胞は、予防的ワクチン接種マウスと治療的ワクチン接種マウスの両方から、エクスビボで、ＡＨ１ペプチドで刺激した場合、応答する（すなわち、ＩＦＮγを産生する）ことができ、ＡＨ１で免疫されていない脾細胞からは非常に小さい応答が記録された。対照的に、対応する免疫化動物のＴＩＬにおいて観察されたサイトカイン産生は非常に低いか、全くなかった。ＰＭＡ／ＩＯ刺激もまた、免疫化ＴＩＬから非常に少ないＩＦＮ－ガンマ産生を誘導し、ＡＨ－１で免疫されていない動物においてさらにより低いレベルが観察された。まとめると、その結果は、遅い時点で、腫瘍における抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は機能障害性であるが、他のコンパートメントにおける類似した抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞はそれらの機能を維持することを示唆している。さらに、ＴＩＬにおける機能障害は、その細胞が、無傷の抗原提示細胞を必要としないＰＭＡ／ＩＯ刺激に応答することができなかったため、内因性である可能性が高い。最後に、これらの結果はまた、ミニ遺伝子免疫化が、他のコンパートメント、例えば脾臓においてＩＦＮ－ガンマ産生抗原特異的細胞の集団を上昇させるが、これは、抗原特異的細胞が腫瘍細胞に応答して上昇したときには、起こらないことを示している。
【0111】
実施例６
ミニ遺伝子免疫化は、腫瘍成長を遅くさせる末梢におけるＡＨ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を誘導する
腫瘍の成長速度が計算されたとき、免疫化の追加の効果が明らかにされた。成長速度は、腫瘍が明らかな腫瘍成長を示した日（陰性対照について移植後７日目、およびＡＨ１免疫化動物について移植後１８日目）からとられた曲線にフィットする線形回帰線の傾きを計算することにより決定された（図６Ａ）。あるいは、比成長速度が、同じ生データを用いて計算された（図６Ｂ）。腫瘍エスケープが起こったときでさえ、腫瘍は、対照と比較して、より遅い速度で成長したことを見出し、膨張性細胞により発揮された淘汰圧が、適合性のより低い腫瘍集団の成長を生じた可能性があることを示唆している。あるいは、腫瘍は、実際、対照と同じ速度で分裂しているが、それらのある割合が、膨張性抗ＡＨ１ ＣＤ８ Ｔ細胞によって常に排除される。腫瘍の成長速度（図２Ｄから）を、腫瘍曝露後のＴＩＬまたは脾臓におけるテトラマー陽性細胞のパーセンテージに対してプロットされた場合、予防的曝露研究と治療的曝露研究の両方から、腫瘍成長速度とＡＨ１テトラマー＋ 脾細胞との間に強い逆相関が観察され（図３Ｂ）、これらの細胞のより高いレベルが結果として、腫瘍成長のより良い制御を生じることを示している。
ミニ遺伝子免疫化は、腫瘍成長を遅くさせる末梢におけるＡＨ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を誘導する
腫瘍の成長速度が計算されたとき、免疫化の追加の効果が明らかにされた。成長速度は、腫瘍が明らかな腫瘍成長を示した日（陰性対照について移植後７日目、およびＡＨ１免疫化動物について移植後１８日目）からとられた曲線にフィットする線形回帰線の傾きを計算することにより決定された（図６Ａ）。あるいは、比成長速度が、同じ生データを用いて計算された（図６Ｂ）。腫瘍エスケープが起こったときでさえ、腫瘍は、対照と比較して、より遅い速度で成長したことを見出し、膨張性細胞により発揮された淘汰圧が、適合性のより低い腫瘍集団の成長を生じた可能性があることを示唆している。あるいは、腫瘍は、実際、対照と同じ速度で分裂しているが、それらのある割合が、膨張性抗ＡＨ１ ＣＤ８ Ｔ細胞によって常に排除される。腫瘍の成長速度（図２Ｄから）を、腫瘍曝露後のＴＩＬまたは脾臓におけるテトラマー陽性細胞のパーセンテージに対してプロットされた場合、予防的曝露研究と治療的曝露研究の両方から、腫瘍成長速度とＡＨ１テトラマー＋ 脾細胞との間に強い逆相関が観察され（図３Ｂ）、これらの細胞のより高いレベルが結果として、腫瘍成長のより良い制御を生じることを示している。
【0112】
実施例７
ＡｄＨｕ５－ＡＨ１ミニ遺伝子構築物での免疫化は、ＡｄＨｕ５－ｇｐ９０ＦＬでの免疫化と比較して、より良い腫瘍制御を与え得る
優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするアデノウイルス構築物および完全長タンパク質ｇｐ９０（前記エピトープが由来している）をコードする類似した構築物により与えられる保護を、治療的免疫化実験において比較した。ここで、ミニ遺伝子構築物は、腫瘍の統計的有意なより低い成長速度により証明されているように、ＡｄＨｕ５－ｇｐ９０－ＦＬと比較して、より良い制御を発揮することが見出された（図７Ａ）。腫瘍を排除したマウス（図２Ｂから）由来の血液を、曝露からおよそ６カ月後、サンプリングし、ＡＨ１ Ｔｅｔ＋ 細胞の集団が循環中に検出され続け、機能性ＣＤ８ Ｔ細胞応答が長期に存在することを示している（図７Ｂ）。
ＡｄＨｕ５－ＡＨ１ミニ遺伝子構築物での免疫化は、ＡｄＨｕ５－ｇｐ９０ＦＬでの免疫化と比較して、より良い腫瘍制御を与え得る
優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするアデノウイルス構築物および完全長タンパク質ｇｐ９０（前記エピトープが由来している）をコードする類似した構築物により与えられる保護を、治療的免疫化実験において比較した。ここで、ミニ遺伝子構築物は、腫瘍の統計的有意なより低い成長速度により証明されているように、ＡｄＨｕ５－ｇｐ９０－ＦＬと比較して、より良い制御を発揮することが見出された（図７Ａ）。腫瘍を排除したマウス（図２Ｂから）由来の血液を、曝露からおよそ６カ月後、サンプリングし、ＡＨ１ Ｔｅｔ＋ 細胞の集団が循環中に検出され続け、機能性ＣＤ８ Ｔ細胞応答が長期に存在することを示している（図７Ｂ）。
【0113】
実施例８
ＨＬＡ：Ａ２拘束性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープである、ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７～１６５）（配列番号２）での免疫化は、ＨＬＡ：Ａ２拘束性膨張性メモリ応答の発生をもたらす
がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１由来の優性ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを発現するミニ遺伝子構築物を、Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失している複製欠損ＡｄＨｕ５バックボーン上のＣＭＶプロモーターの調節下に前記エピトープを挿入することにより作製した（図８Ａ）。完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１を含有する対照アデノベクターもまた構築した。これらを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＨＬＡ－Ａ２抗原を発現するトランスジェニックＨＨＤマウスへ静脈内注射した。ＨＨＤマウスにおいて、Ｈ－２Ｄｂおよびマウスのベータ－２－ミクログロブリン（ｂ２ｍ）のノックアウトもある（ＨＬＡ－Ａ２ ＨＨＤｂ２ｍハイブリッド分子に加えて）。これは、結果として、ＭＨＣクラス１としてＨＬＡ－Ａ２のみを生じる。テトラマー染色により血液中において、エピトープＮＹ－ＥＳＯ－１に対するそれらのＣＤ８ Ｔ細胞応答が追跡された。図８Ａに示されているように、免疫されたマウスは、いずれの構築物に対しても応答し、テトラマー特異的細胞の集団は７日目に測定可能であった。完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質で免疫されたマウスの大部分において、その応答は、２１日目までに減少し、実験の期間の間、低いが検出可能なレベル（およそ２～５％）で残存したが、遅い時点でさえもこの応答の高レベル（最高２０％）を示すいく匹かのマウスがあった。対照的に、ミニ遺伝子構築物で免疫されたマウスの大部分は、その後の時点においてテトラマー陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の一貫して上昇するレベルを示した。これは、ミニ遺伝子ベクターでの免疫化後の以前報告された動態と一致した。
ＨＬＡ：Ａ２拘束性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープである、ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７～１６５）（配列番号２）での免疫化は、ＨＬＡ：Ａ２拘束性膨張性メモリ応答の発生をもたらす
がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１由来の優性ＨＬＡ－Ａ２拘束性エピトープを発現するミニ遺伝子構築物を、Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失している複製欠損ＡｄＨｕ５バックボーン上のＣＭＶプロモーターの調節下に前記エピトープを挿入することにより作製した（図８Ａ）。完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１を含有する対照アデノベクターもまた構築した。これらを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおけるＨＬＡ－Ａ２抗原を発現するトランスジェニックＨＨＤマウスへ静脈内注射した。ＨＨＤマウスにおいて、Ｈ－２Ｄｂおよびマウスのベータ－２－ミクログロブリン（ｂ２ｍ）のノックアウトもある（ＨＬＡ－Ａ２ ＨＨＤｂ２ｍハイブリッド分子に加えて）。これは、結果として、ＭＨＣクラス１としてＨＬＡ－Ａ２のみを生じる。テトラマー染色により血液中において、エピトープＮＹ－ＥＳＯ－１に対するそれらのＣＤ８ Ｔ細胞応答が追跡された。図８Ａに示されているように、免疫されたマウスは、いずれの構築物に対しても応答し、テトラマー特異的細胞の集団は７日目に測定可能であった。完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質で免疫されたマウスの大部分において、その応答は、２１日目までに減少し、実験の期間の間、低いが検出可能なレベル（およそ２～５％）で残存したが、遅い時点でさえもこの応答の高レベル（最高２０％）を示すいく匹かのマウスがあった。対照的に、ミニ遺伝子構築物で免疫されたマウスの大部分は、その後の時点においてテトラマー陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の一貫して上昇するレベルを示した。これは、ミニ遺伝子ベクターでの免疫化後の以前報告された動態と一致した。
【0114】
テトラマー陽性細胞の表現型が決定され、膨張性細胞表現型を示すことが見出され、主にエフェクターメモリ（ＣＤ４４＋ ＣＤ６２Ｌ－、図８Ｃ）であり、高度に分化し、ＫＬＲＧ１－ｈｉ（図８Ｄ）およびＣＸ３ＣＲ１＋（図８Ｅ）を発現した。これらの細胞はまた、より遅い時期においてＰＤ－１ ｌｏｗであり、興味深いことに、完全長構築物での免疫化により産生されたテトラマー陽性細胞と比較して、より低いレベルのＰＤ－１を発現するように思われた（図８Ｆ）。Ｔｉｍ－３およびＬａｇ－３などの他の疲弊マーカーのレベルもまた、それらの完全長で誘導された対応物と比較して、ミニ遺伝子で誘導されたテトラマー＋ ＣＤ８ Ｔ細胞において低かった（図８ＧおよびＨ）。まとめると、データは、ミニ遺伝子構築物上のＣＤ８ Ｔ細胞ペプチドエピトープが、プロセシングされ、ヒトＨＬＡ－Ａ２抗原上へ負荷され得、その後、プライムし、膨張性ＣＤ８ Ｔ細胞応答を発生させ得ることを示している。さらに、これらの応答は、大きくかつ耐久性があり、免疫化後の遅い時点でさえも、チェックポイントインヒビターの発現が非常に低いか、全くなかった。
【0115】
実施例９
ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７～１６５）での免疫化は腫瘍曝露を制御する
これらの応答が腫瘍を制御することができるかどうかを決定するために、ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質を安定的にトランスフェクトされたＨＨＤマウスに由来した多数の肉腫細胞（０．５～１×１０６細胞）をマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍成長を追跡した。その結果は、ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１ミニ遺伝子で免疫されたマウスが、早い時点および遅い時点において腫瘍成長を遅らせることができ（図９Ａ）、２／１０匹の動物が、腫瘍の完全な排除を示した。加えて、この制御は、高い用量（実線）とより低い用量（破線）の両方の曝露おいて観察された。対照的に、ＦＬベクターで免疫されたマウスは、より低い曝露用量において腫瘍成長を制御することができたが、より高い細胞濃度（実線）においてそのようにすることができなかった。マウスがＨＬＡ－Ａ２についてのみトランスジェニックであるため、ヒトタンパク質であるＮＹ－ＥＳＯ－１は、おそらく、免疫原性であり、腫瘍曝露で、ナイーブマウスＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞により認識されただろうことは注目に値する。腫瘍曝露から２週間後に採取された血液を、Ｔｅｔ＋ 細胞の存在について分析した。全ての群は、腫瘍曝露から１４日後、検出可能な循環ｔｅｔ＋ 応答を発生し、ＭＧで免疫された群が、最も大きい規模を示した（図９Ｂ）。腫瘍曝露前に循環中の２．５％より多いｔｅｔ＋ 細胞を有する動物は、早い時点および遅い時点において腫瘍成長のより良い制御を発揮した（図９ＣおよびＤ）。この相関は、ＦＬベクターで免疫された動物においては観察されなかった。実験のこの部分からのデータは、ミニ遺伝子ベクターでの単一プライミング免疫化が腫瘍曝露に対して長命の保護を与え得ることを示している。
ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７～１６５）での免疫化は腫瘍曝露を制御する
これらの応答が腫瘍を制御することができるかどうかを決定するために、ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質を安定的にトランスフェクトされたＨＨＤマウスに由来した多数の肉腫細胞（０．５～１×１０６細胞）をマウスに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍成長を追跡した。その結果は、ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１ミニ遺伝子で免疫されたマウスが、早い時点および遅い時点において腫瘍成長を遅らせることができ（図９Ａ）、２／１０匹の動物が、腫瘍の完全な排除を示した。加えて、この制御は、高い用量（実線）とより低い用量（破線）の両方の曝露おいて観察された。対照的に、ＦＬベクターで免疫されたマウスは、より低い曝露用量において腫瘍成長を制御することができたが、より高い細胞濃度（実線）においてそのようにすることができなかった。マウスがＨＬＡ－Ａ２についてのみトランスジェニックであるため、ヒトタンパク質であるＮＹ－ＥＳＯ－１は、おそらく、免疫原性であり、腫瘍曝露で、ナイーブマウスＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞により認識されただろうことは注目に値する。腫瘍曝露から２週間後に採取された血液を、Ｔｅｔ＋ 細胞の存在について分析した。全ての群は、腫瘍曝露から１４日後、検出可能な循環ｔｅｔ＋ 応答を発生し、ＭＧで免疫された群が、最も大きい規模を示した（図９Ｂ）。腫瘍曝露前に循環中の２．５％より多いｔｅｔ＋ 細胞を有する動物は、早い時点および遅い時点において腫瘍成長のより良い制御を発揮した（図９ＣおよびＤ）。この相関は、ＦＬベクターで免疫された動物においては観察されなかった。実験のこの部分からのデータは、ミニ遺伝子ベクターでの単一プライミング免疫化が腫瘍曝露に対して長命の保護を与え得ることを示している。
【0116】
実施例１０
ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７～１６５）での免疫化は、脾臓において抗原特異的Ｔ細胞の集団をもたらす
動物を、腫瘍サイズが１３００ｍｍ３に近づきつつあるときかまたは４８時間後好転しない潰瘍が発生したときのいずれかであるエンドポイントにそれらが達したとき、選別して屠殺した。ナイーブ群について１７～２９日目の間、ＭＧについて２８～２９日目の間、ＦＬについて２６～２９日目の間、無関係のＡｄ群について２２～２９日目の間に腫瘍を取り出した。その時点において、腫瘍および脾臓からリンパ球を単離して、免疫化が腫瘍免疫微小環境の組成および腫瘍特異的細胞の機能性を変化させたかどうかを調べた。脾細胞および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離し、全ての群由来のＴＩＬが類似したレベルのＣＤ８ Ｔ細胞を含有することが見出された（図１０Ａ）。脾臓のＣＤ８ Ｔ細胞のレベルは、ＭＧ免疫化群においてわずかに上昇したが、これは、統計的有意性に達していなかった。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｔｅｔ＋ 細胞が、全ての群のＴＩＬにおいて検出され、免疫化群と非免疫化群との間のＴｅｔ＋ ＴＩＬのパーセンテージにおいて統計的差はなかった（図１０Ｂ）。しかしながら、Ｔｅｔ＋ 脾細胞のパーセンテージにおける差が観察され、非免疫化動物と比較して、ＭＧおよびＦＬ免疫化動物においてより高いレベルであった。腫瘍は、それらがそれらのエンドポイントに達したため、取り出され、この時点において、チェックポイントインヒビターＰＤ－１の発現が、全ての群においてｔｅｔ＋ ＴＩＬで上昇していることが見出された（図１０Ｃ）。Ｆａｓが全ての群の脾細胞およびまたＴＩＬにおいて上方制御され（図１０Ｄ）、Ｔｅｔ＋ 細胞の活性化を示している。興味深いことに、ＭＧおよびＦＬ免疫化動物由来のＣＤ８ Ｔｅｔ＋ 脾細胞が、より高いレベルのＰＤ－１を発現し、ＦＬ免疫化動物が脾細胞上のＰＤ－１の最も高い発現を示した。ＦＬ免疫化はまた、脾細胞およびＴＩＬ上のより高いレベルのＬａｇ－３を生じた。Ｌａｇ－３およびＴｉｍ－３は、他の条件のＴｅｔ＋ 脾細胞上で上方制御されなかった；しかし、全ての群において、Ｔｅｔ＋ ＴＩＬで類似したレベルで検出された（図１０ＥおよびＦ）。
ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（１５７～１６５）での免疫化は、脾臓において抗原特異的Ｔ細胞の集団をもたらす
動物を、腫瘍サイズが１３００ｍｍ３に近づきつつあるときかまたは４８時間後好転しない潰瘍が発生したときのいずれかであるエンドポイントにそれらが達したとき、選別して屠殺した。ナイーブ群について１７～２９日目の間、ＭＧについて２８～２９日目の間、ＦＬについて２６～２９日目の間、無関係のＡｄ群について２２～２９日目の間に腫瘍を取り出した。その時点において、腫瘍および脾臓からリンパ球を単離して、免疫化が腫瘍免疫微小環境の組成および腫瘍特異的細胞の機能性を変化させたかどうかを調べた。脾細胞および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離し、全ての群由来のＴＩＬが類似したレベルのＣＤ８ Ｔ細胞を含有することが見出された（図１０Ａ）。脾臓のＣＤ８ Ｔ細胞のレベルは、ＭＧ免疫化群においてわずかに上昇したが、これは、統計的有意性に達していなかった。ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｔｅｔ＋ 細胞が、全ての群のＴＩＬにおいて検出され、免疫化群と非免疫化群との間のＴｅｔ＋ ＴＩＬのパーセンテージにおいて統計的差はなかった（図１０Ｂ）。しかしながら、Ｔｅｔ＋ 脾細胞のパーセンテージにおける差が観察され、非免疫化動物と比較して、ＭＧおよびＦＬ免疫化動物においてより高いレベルであった。腫瘍は、それらがそれらのエンドポイントに達したため、取り出され、この時点において、チェックポイントインヒビターＰＤ－１の発現が、全ての群においてｔｅｔ＋ ＴＩＬで上昇していることが見出された（図１０Ｃ）。Ｆａｓが全ての群の脾細胞およびまたＴＩＬにおいて上方制御され（図１０Ｄ）、Ｔｅｔ＋ 細胞の活性化を示している。興味深いことに、ＭＧおよびＦＬ免疫化動物由来のＣＤ８ Ｔｅｔ＋ 脾細胞が、より高いレベルのＰＤ－１を発現し、ＦＬ免疫化動物が脾細胞上のＰＤ－１の最も高い発現を示した。ＦＬ免疫化はまた、脾細胞およびＴＩＬ上のより高いレベルのＬａｇ－３を生じた。Ｌａｇ－３およびＴｉｍ－３は、他の条件のＴｅｔ＋ 脾細胞上で上方制御されなかった；しかし、全ての群において、Ｔｅｔ＋ ＴＩＬで類似したレベルで検出された（図１０ＥおよびＦ）。
【0117】
実施例１１
ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（－）での免疫化後にＣＸ３ＣＲ１が抗原特異的脾細胞において上方制御される
ＴＩＬおよび脾細胞を、膨張性メモリのマーカーに関してさらに特徴づけた。脾臓において、仮定された通り、ミニ遺伝子免疫化マウス由来の抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のみが、上方制御されたＣＸ３ＣＲ１発現のより大きい集団を示したが、腫瘍において、全ての群由来の抗原特異的細胞が、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉの細胞の大きいパーセンテージを示した（図１１Ｂ）。全ての群の脾臓および腫瘍における抗原特異的細胞の大部分は、エフェクターメモリであった（図１１Ｃ）。アデノウイルス免疫化が腫瘍微小環境を変化させるかどうかを調べるために、腫瘍および脾臓におけるＴｒｅｇのレベルを測定した － 脾臓におけるＴｒｅｇのレベルは、完全長免疫化群においてわずかに上昇したが、腫瘍におけるＴｒｅｇのレベルは、群間で異ならなかった（図１１Ｄ）。同様に、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて観察されたものとは違って、腫瘍においてレジデントメモリ抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のレベルに差はなかった（図１１Ｅ）。
ＡｄＨｕ５－ＮＹ－ＥＳＯ－１（－）での免疫化後にＣＸ３ＣＲ１が抗原特異的脾細胞において上方制御される
ＴＩＬおよび脾細胞を、膨張性メモリのマーカーに関してさらに特徴づけた。脾臓において、仮定された通り、ミニ遺伝子免疫化マウス由来の抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のみが、上方制御されたＣＸ３ＣＲ１発現のより大きい集団を示したが、腫瘍において、全ての群由来の抗原特異的細胞が、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉの細胞の大きいパーセンテージを示した（図１１Ｂ）。全ての群の脾臓および腫瘍における抗原特異的細胞の大部分は、エフェクターメモリであった（図１１Ｃ）。アデノウイルス免疫化が腫瘍微小環境を変化させるかどうかを調べるために、腫瘍および脾臓におけるＴｒｅｇのレベルを測定した － 脾臓におけるＴｒｅｇのレベルは、完全長免疫化群においてわずかに上昇したが、腫瘍におけるＴｒｅｇのレベルは、群間で異ならなかった（図１１Ｄ）。同様に、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて観察されたものとは違って、腫瘍においてレジデントメモリ抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のレベルに差はなかった（図１１Ｅ）。
【0118】
実施例１２
ＣＸ３ＣＲ１ｈｉ ＣＤ８ Ｔ細胞は酸化ストレスに対して、より抵抗性が高い
膨張性メモリ細胞は、Ｂｃｌ－ＸＬを含む抗アポトーシス経路に関与するいくつかの分子を上方制御する。ヒト単球上のＣＸ３ＣＲ１発現は、抗酸化ストレスを低下させることにより、細胞生存を助けることが報告されている。したがって、ＣＸ３ＣＲ１発現が、膨張性メモリ細胞に生存促進性効果を与えるかどうかを調べた。感染後５１日目以降におけるＡｄ－ｌａｃＺまたはＭＣＭＶ感染マウス由来のＣＸ３ＣＲ１＋／－ｇｆｐ脾細胞における細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルをＣｅｌｌＲＯＸ Ｒｅｄアッセイによって検出した。定常状態において、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉ ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＸ３ＣＲ１陰性（ｎｅｇ）および中間（ｉｎｔ） ＣＤ８ Ｔ細胞集団と比較して、より低いレベルのＲＯＳを含有し（図１２Ａおよび１２Ｃ）、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉ 細胞が内因的に、より低いレベルのＲＯＳを有することを示唆した。興味深いことには、ＣＸ３ＣＲ１ ｇｆｐ／ｇｆｐマウス由来のＣＸ３ＣＲ１ｈｉ 細胞もまた、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ サブセットと比較して、より低いレベルのＲＯＳを有し、この効果が、もっぱらＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達だけに依存するのではないことを示している。また、バルクＣＸ３ＣＲ１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞サブセット（図１２Ｆ、中央）および抗原特異的ＣＸ３ＣＲ１＋ Ｔ細胞（図１２Ｆ、右）における活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルは、血清飢餓時、それらのＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ 対応物と比較して、より低いままであり、したがって、酸化還元回復力の増強を示している。追加として、無血清培地においてインキュベートされた場合（すなわち、ストレス）、バルク（図１２Ｄ）および抗原特異的集団（図１２Ｅ）におけるＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ Ｔ細胞と比較して、ＣＸ３ＣＲ１＋ 集団が顕著に生存した。
ＣＸ３ＣＲ１ｈｉ ＣＤ８ Ｔ細胞は酸化ストレスに対して、より抵抗性が高い
膨張性メモリ細胞は、Ｂｃｌ－ＸＬを含む抗アポトーシス経路に関与するいくつかの分子を上方制御する。ヒト単球上のＣＸ３ＣＲ１発現は、抗酸化ストレスを低下させることにより、細胞生存を助けることが報告されている。したがって、ＣＸ３ＣＲ１発現が、膨張性メモリ細胞に生存促進性効果を与えるかどうかを調べた。感染後５１日目以降におけるＡｄ－ｌａｃＺまたはＭＣＭＶ感染マウス由来のＣＸ３ＣＲ１＋／－ｇｆｐ脾細胞における細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルをＣｅｌｌＲＯＸ Ｒｅｄアッセイによって検出した。定常状態において、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉ ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＸ３ＣＲ１陰性（ｎｅｇ）および中間（ｉｎｔ） ＣＤ８ Ｔ細胞集団と比較して、より低いレベルのＲＯＳを含有し（図１２Ａおよび１２Ｃ）、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉ 細胞が内因的に、より低いレベルのＲＯＳを有することを示唆した。興味深いことには、ＣＸ３ＣＲ１ ｇｆｐ／ｇｆｐマウス由来のＣＸ３ＣＲ１ｈｉ 細胞もまた、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ サブセットと比較して、より低いレベルのＲＯＳを有し、この効果が、もっぱらＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達だけに依存するのではないことを示している。また、バルクＣＸ３ＣＲ１＋ ＣＤ８ Ｔ細胞サブセット（図１２Ｆ、中央）および抗原特異的ＣＸ３ＣＲ１＋ Ｔ細胞（図１２Ｆ、右）における活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルは、血清飢餓時、それらのＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ 対応物と比較して、より低いままであり、したがって、酸化還元回復力の増強を示している。追加として、無血清培地においてインキュベートされた場合（すなわち、ストレス）、バルク（図１２Ｄ）および抗原特異的集団（図１２Ｅ）におけるＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ Ｔ細胞と比較して、ＣＸ３ＣＲ１＋ 集団が顕著に生存した。
【0119】
次に、ＭＣＭＶまたはアデノベクターに持続的に感染したマウス由来の末梢血リンパ球を、ミトコンドリア質量のマーカーとして用いられるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎおよび分極した健康なミトコンドリアのみを染色するＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄを用いて染色することにより、これらのサブセットにおける脱分極したミトコンドリアのパーセンテージを決定した。脱分極したミトコンドリアは、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎが陽性であるが、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄが陽性ではなく、分極したミトコンドリアからフローサイトメトリーにより分離され得る。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＸ３ＣＲ１ｈｉ ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ ＣＤ８と比較して、より低いパーセンテージの脱分極したミトコンドリアを含有する。
【0120】
Ｔ細胞（図１２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、マウスＣＸ３ＣＲ１ｈｉ ＣＤ８ Ｔ細胞が、それらのＣＸ３ＣＲ１ｎｅｇ ＣＤ８ Ｔ細胞の対応するものに対して、宿主においてそれらの長期残留性および蓄積を促進し得る、生存促進の優位性を有することを示している。
【0121】
重要なことには、がんは、腫瘍微小環境において悪性細胞、顆粒球、ＴＡＭ、およびＭＳＤＣにより発生した活性酸素種（ＲＯＳ）を通して主に媒介される酸化ストレスに関連づけられる。したがって、これらの性質はまた、いったんその細胞が腫瘍内にあるならば、それらの細胞傷害能力を保護しかつ保存し得る。
【0122】
実施例１３：
ＨＰＶにおける優性Ｅ７エピトープをコードするＡｄＨｕ５－Ｒ９Ｆでの免疫化はＴＣ１－ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７子宮頚癌腫曝露に対抗してレベルを保護する
Ｅ７タンパク質における優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするミニ遺伝子構築物により与えられる保護を、予防的免疫化モデルにおいて、完全長Ｅ７タンパク質をコードする類似した構築物により与えられるものと比較した。いずれかの構築物で免疫されたマウスは、腫瘍曝露で完全な保護を与える（図１３Ｂ）大きなエピトープ特異的応答（図１３Ａ）を生じ、タンパク質全体対エピトープ単独により与えられた保護のレベルにおいて差は観察されなかった。
ＨＰＶにおける優性Ｅ７エピトープをコードするＡｄＨｕ５－Ｒ９Ｆでの免疫化はＴＣ１－ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７子宮頚癌腫曝露に対抗してレベルを保護する
Ｅ７タンパク質における優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするミニ遺伝子構築物により与えられる保護を、予防的免疫化モデルにおいて、完全長Ｅ７タンパク質をコードする類似した構築物により与えられるものと比較した。いずれかの構築物で免疫されたマウスは、腫瘍曝露で完全な保護を与える（図１３Ｂ）大きなエピトープ特異的応答（図１３Ａ）を生じ、タンパク質全体対エピトープ単独により与えられた保護のレベルにおいて差は観察されなかった。
【0123】
実施例１４
最適以下の用量におけるＭＣＭＶに対するＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするミニ遺伝子のパネルでの免疫化後の相乗効果
既知のＭＣＭＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに対する３つのミニ遺伝子のパネル、すなわち、Ｍ４５（９８５ＨＧＩＲＮＡＳＦＩ９９３ 配列番号１０）、Ｍ３８（３１６ＳＳＰＰＭＦＲＶ３２５ 配列番号１１）、およびｍ１３９（４１９ＴＷＹＧＦＣＬＬ４２６ 配列番号１２）を構築した。これらを、個々のミニ遺伝子としてかまたはカクテルとして一緒に混合してかのいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ静脈内注射した。Ｍ３８およびｍ１３９をコードするミニ遺伝子は、１×１０７感染単位（Ｉ．Ｕ）の最適以下の用量で注射され、一方、Ｍ４５をコードするミニ遺伝子は１×１０８Ｉ．Ｕ．の最適用量で注射された。免疫化後６日目における血液中のＭ３８特異的細胞のレベルを測定した。驚くべきことに、最適以下の用量でのＭ３８ミニ遺伝子およびｍ１３９ミニ遺伝子ベクター、加えて、最適用量でのＭ４５ミニ遺伝子を含有する混合ミニ遺伝子ワクチンを受けたマウスは、最適以下の用量のＭ３８ミニ遺伝子ベクター単独のみを注射された群と比較して、より高いレベルのＭ３８特異的Ｔ細胞を発生した。この予想外の結果は、最適以下の用量でのミニ遺伝子ベクターの混合物の送達が、最適以下の用量の単一のベクター単独での免疫化で観察されたものに対して、抗原特異的Ｔ細胞の規模を増強する相加効果を生じ得ることを示唆している。
最適以下の用量におけるＭＣＭＶに対するＣＤ８ Ｔ細胞エピトープをコードするミニ遺伝子のパネルでの免疫化後の相乗効果
既知のＭＣＭＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに対する３つのミニ遺伝子のパネル、すなわち、Ｍ４５（９８５ＨＧＩＲＮＡＳＦＩ９９３ 配列番号１０）、Ｍ３８（３１６ＳＳＰＰＭＦＲＶ３２５ 配列番号１１）、およびｍ１３９（４１９ＴＷＹＧＦＣＬＬ４２６ 配列番号１２）を構築した。これらを、個々のミニ遺伝子としてかまたはカクテルとして一緒に混合してかのいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ静脈内注射した。Ｍ３８およびｍ１３９をコードするミニ遺伝子は、１×１０７感染単位（Ｉ．Ｕ）の最適以下の用量で注射され、一方、Ｍ４５をコードするミニ遺伝子は１×１０８Ｉ．Ｕ．の最適用量で注射された。免疫化後６日目における血液中のＭ３８特異的細胞のレベルを測定した。驚くべきことに、最適以下の用量でのＭ３８ミニ遺伝子およびｍ１３９ミニ遺伝子ベクター、加えて、最適用量でのＭ４５ミニ遺伝子を含有する混合ミニ遺伝子ワクチンを受けたマウスは、最適以下の用量のＭ３８ミニ遺伝子ベクター単独のみを注射された群と比較して、より高いレベルのＭ３８特異的Ｔ細胞を発生した。この予想外の結果は、最適以下の用量でのミニ遺伝子ベクターの混合物の送達が、最適以下の用量の単一のベクター単独での免疫化で観察されたものに対して、抗原特異的Ｔ細胞の規模を増強する相加効果を生じ得ることを示唆している。
【0124】
実施例１５
ミニ遺伝子免疫化は、腫瘍環境を変化させ、より高いレベルのグランザイムＢを生じる
ミニ遺伝子免疫化を実施し、続いてグランザイムＢのレベルを分析した。腫瘍の全ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるグランザイムＢのレベルを、腫瘍移植から２３日後、ミニ遺伝子での免疫化から１６日後に、細胞内サイトカイン染色、続いて腫瘍から調製された単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーにより評価した。図１５に見られるように、グランザイムＢのレベルは、免疫化が完全長エピトープベクターで実施された場合と比較して、ミニ遺伝子ベクターで免疫されたＣＤ８＋ Ｔ細胞において有意により高かった。腫瘍サイズもまた、腫瘍移植後２３日目に評価し、図１５は、ミニ遺伝子免疫化が対照と比較して腫瘍サイズを有意に低下させたことを示している。
ミニ遺伝子免疫化は、腫瘍環境を変化させ、より高いレベルのグランザイムＢを生じる
ミニ遺伝子免疫化を実施し、続いてグランザイムＢのレベルを分析した。腫瘍の全ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるグランザイムＢのレベルを、腫瘍移植から２３日後、ミニ遺伝子での免疫化から１６日後に、細胞内サイトカイン染色、続いて腫瘍から調製された単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーにより評価した。図１５に見られるように、グランザイムＢのレベルは、免疫化が完全長エピトープベクターで実施された場合と比較して、ミニ遺伝子ベクターで免疫されたＣＤ８＋ Ｔ細胞において有意により高かった。腫瘍サイズもまた、腫瘍移植後２３日目に評価し、図１５は、ミニ遺伝子免疫化が対照と比較して腫瘍サイズを有意に低下させたことを示している。
【0125】
テトラマー＋ ＣＤ８ Ｔ細胞をまた、転写因子ＥｏｍｅｓおよびＴｂｅｔのレベルについて評価した。ミニ遺伝子ベクターで免疫された動物から採取されたテトラマー＋ ＣＤ８ Ｔ細胞は、他の群から単離されたテトラマー＋ 細胞と比較して、より高いレベルのＴｂｅｔおよびより低いレベルのＥｏｍｅｓを発現した。
【0126】
実施例１６
ミニ遺伝子免疫化および抗ＰＤ－Ｌ１治療での併用処置は腫瘍制御を増強する
ＣＴ２６腫瘍は、抗ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１単剤療法に対して無応答性であることが報告されている（Ｓｅｌｂｙら、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ａｎｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ、ａｎｄ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０１６年９月９日；１１（９）：ｅ０１６１７７９－１９）。しかしながら、本データは、ミニ遺伝子と抗ＰＤ－Ｌ１の併用療法が腫瘍制御および生存の増強を生じることを実証している。
ミニ遺伝子免疫化および抗ＰＤ－Ｌ１治療での併用処置は腫瘍制御を増強する
ＣＴ２６腫瘍は、抗ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１単剤療法に対して無応答性であることが報告されている（Ｓｅｌｂｙら、Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ａｎｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｏｕｓｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ、ａｎｄ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍａｃａｑｕｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０１６年９月９日；１１（９）：ｅ０１６１７７９－１９）。しかしながら、本データは、ミニ遺伝子と抗ＰＤ－Ｌ１の併用療法が腫瘍制御および生存の増強を生じることを実証している。
【0127】
マウスの群を、図１６に示されているように、アデノウイルスベクターで免疫した。腫瘍曝露から７日後、マウスに抗ＰＤ－Ｌ１またはアイソタイプ対照を投与した。図１６Ａは、ミニ遺伝子が抗ＰＤ－Ｌ１治療と併用して投与された場合、腫瘍制御の増強（すなわち、腫瘍サイズの低下）が観察されることを示している。その併用療法はまた、無関係（ｉｒｒ）ＡｄＨｕ５で免疫された未処置の対象と比較しておよそ３３％の、全ての処置された動物の人道的エンドポイントまでの時間の増加を生じている。マウスの全ての群の生存曲線は図１６Ｂに示されている。免疫化から１５日後（腫瘍曝露から２２日後）の循環中のＧＰ７０４２３－４３１ Ｔｅｔ＋ 細胞の％を評価した。併用療法は、ミニ遺伝子単独処置と比較して循環中のテトラマー＋ 細胞のレベルを増加させ（図１６Ｃ）、腫瘍の成長速度を有意に低下させた（図１６Ｄ）。
【0128】
実施例１７
腫瘍由来および脾臓由来細胞におけるＩＦＮγ産生の分析
脾臓由来および腫瘍由来単一細胞を、予防的と治療的の両方で免疫されたマウスから取得し、ＡＨ１ペプチド（４μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ－イオノマイシン（ＩＯ）で７時間、エクスビボで刺激し、その後、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生について染色した。ＩＦＮγ分泌細胞が検出され、予防的（図１７Ａ）または治療的（図１７Ｂ）に免疫された群の脾臓においてのみ上昇しており、腫瘍において検出されたＩＦＮγ分泌細胞は少なくまたは全くなかった（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）。抗ＰＤ－Ｌ１と併用した治療的ワクチン接種の実験は、ＡＨ１ペプチド（４μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ－イオノマイシン（ＩＯ）で７時間、エクスビボで刺激し、その後、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生について染色した。脾臓と腫瘍の両方におけるＩＦＮγ分泌性ＣＤ８ Ｔ細胞は、ミニ遺伝子単独処置と比較して併用療法で処置された試料において増加した（図１７Ｅおよび図１７Ｇ）。ＣＤ４ Ｔ細胞コンパートメントにおいて、ＩＦＮγ分泌性ＣＤ４ Ｔ細胞が、抗ＰＤ－Ｌ１と併用されたワクチン接種群の腫瘍（図１７Ｈ）において検出することができたが、脾臓においては検出することができなかった（図１７Ｆ）。
腫瘍由来および脾臓由来細胞におけるＩＦＮγ産生の分析
脾臓由来および腫瘍由来単一細胞を、予防的と治療的の両方で免疫されたマウスから取得し、ＡＨ１ペプチド（４μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ－イオノマイシン（ＩＯ）で７時間、エクスビボで刺激し、その後、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生について染色した。ＩＦＮγ分泌細胞が検出され、予防的（図１７Ａ）または治療的（図１７Ｂ）に免疫された群の脾臓においてのみ上昇しており、腫瘍において検出されたＩＦＮγ分泌細胞は少なくまたは全くなかった（図１７Ｃおよび図１７Ｄ）。抗ＰＤ－Ｌ１と併用した治療的ワクチン接種の実験は、ＡＨ１ペプチド（４μｇ／ｍｌ）またはＰＭＡ－イオノマイシン（ＩＯ）で７時間、エクスビボで刺激し、その後、ＩＦＮγの細胞内サイトカイン産生について染色した。脾臓と腫瘍の両方におけるＩＦＮγ分泌性ＣＤ８ Ｔ細胞は、ミニ遺伝子単独処置と比較して併用療法で処置された試料において増加した（図１７Ｅおよび図１７Ｇ）。ＣＤ４ Ｔ細胞コンパートメントにおいて、ＩＦＮγ分泌性ＣＤ４ Ｔ細胞が、抗ＰＤ－Ｌ１と併用されたワクチン接種群の腫瘍（図１７Ｈ）において検出することができたが、脾臓においては検出することができなかった（図１７Ｆ）。
【0129】
実施例１８
２つの異なる腫瘍抗原をコードする２つのＡｄＨｕ５ミニ遺伝子（ＭＧ）の組合せでの免疫化は、治療的免疫化モデルにおいて、単一での免疫化に対して生存の増強を与える
マウスの皮下にＣＴ２６腫瘍細胞（５×１０５細胞／マウス）を移植した。６日後、マウスに、それぞれ、異なるＣＴ２６腫瘍をコードする単一のミニ遺伝子ワクチンＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧもしくはＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８－２７ｍｅｒＭＧを１×１０８ＩＵで、または両方のミニ遺伝子ワクチンを一緒に（Ｃｏｍｂｏ、両方とも１×１０８ＩＵで）、ワクチン接種した。移植から１２日後、１６日後、および１９日後、各群の半分を、チェックポイントインヒビター抗ＰＤ－１で処置し、群の半分を、アイソタイプ対照で処置した。腫瘍成長を、１．３ｃｍ３に近づくまでモニターした。
２つの異なる腫瘍抗原をコードする２つのＡｄＨｕ５ミニ遺伝子（ＭＧ）の組合せでの免疫化は、治療的免疫化モデルにおいて、単一での免疫化に対して生存の増強を与える
マウスの皮下にＣＴ２６腫瘍細胞（５×１０５細胞／マウス）を移植した。６日後、マウスに、それぞれ、異なるＣＴ２６腫瘍をコードする単一のミニ遺伝子ワクチンＡｄＨｕ５－ＡＨ１－ＭＧもしくはＡｄＨｕ５－ｅ２Ｆ８－２７ｍｅｒＭＧを１×１０８ＩＵで、または両方のミニ遺伝子ワクチンを一緒に（Ｃｏｍｂｏ、両方とも１×１０８ＩＵで）、ワクチン接種した。移植から１２日後、１６日後、および１９日後、各群の半分を、チェックポイントインヒビター抗ＰＤ－１で処置し、群の半分を、アイソタイプ対照で処置した。腫瘍成長を、１．３ｃｍ３に近づくまでモニターした。
【0130】
図１８Ｂ～Ｆは、混合ワクチン（Ｃｏｍｂｏ）でのワクチン接種が、陰性対照（非ワクチン接種または無関係の抗原をコードするＡｄＨｕ５－ＭＧでワクチン接種された）と比較して、腫瘍成長を遅くすることを示している。図１９Ａは、抗ＰＤ－１を加えた混合ワクチン処置が、陰性対照に対して生存を増強したことを示し、一方、図１９Ｂに示されているように、混合ワクチンでの処置は一般的に、陰性対照または単一のミニ遺伝子ワクチンのみでワクチン接種された群と比較して、中央値生存を増加させた。
【0131】
腫瘍の成長速度を、曲線の傾き（急勾配＝より速い成長速度）を計算するための時間に対する腫瘍サイズの単純線形回帰分析により決定した（図２０）。あるいは、同じデータを用いて、比成長速度として成長速度を計算した（図２３）。ワクチン接種タイプによる個々のマウスの値が示されている。混合ワクチン接種は、陰性対照群と比較して、腫瘍成長を有意に遅くした（図２０および図２３）。ワクチン接種から６日後に血液をサンプリングし、ＣＤ８に対する表面マーカーおよびＡＨ－１またはｅ２ｆ８抗原に特異的なテトラマーに関して染色した（図２１）。生きているＣＤ８ Ｔ細胞コンパートメントにおける％Ｔｅｔ＋が示されている。混合ワクチンでのワクチン接種は、ＡｄＨｕ５－ＡＨ－１ ＭＧのみでワクチン接種された群と比較して、ＡＨ－１ ｔｅｔ＋ 集団の規模を増加させる（図２１）。図２２および２３は、２つのミニ遺伝子構築物／ワクチンでの同時静脈内免疫化（ｃｏｍｂｏ）が両方の抗原特異的集団を、単一ワクチンと類似した規模および表現型で誘導し、腫瘍成長を制御するように作用することを示している。
【0132】
方法
動物
マウス実験は、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ規則に従って実施され（プロジェクトライセンス番号ＰＢＡ４３Ａ２Ｅ４およびＰＰＬ ３０／３２９３）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄにおける地域倫理審査委員会により認可された。雄および雌マウスは、特定病原体除去（ＳＰＦ）条件で個々に換気されたケージにおいて維持され、通常の固形飼料食餌を与えられた。ＨＬＡ－Ａ２についてトランスジェニックの成体ＨＨＤマウスは、前記大学のＢＳＬ２施設で飼育され、Ｖｉｎｃｅｎｚｏ Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ（ＨＩＵ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ）好意で提供された。週齢６～８週間のＢａｌｂｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｍａｒｇａｔｅ、ＵＫ）から入手された。
動物
マウス実験は、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ規則に従って実施され（プロジェクトライセンス番号ＰＢＡ４３Ａ２Ｅ４およびＰＰＬ ３０／３２９３）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄにおける地域倫理審査委員会により認可された。雄および雌マウスは、特定病原体除去（ＳＰＦ）条件で個々に換気されたケージにおいて維持され、通常の固形飼料食餌を与えられた。ＨＬＡ－Ａ２についてトランスジェニックの成体ＨＨＤマウスは、前記大学のＢＳＬ２施設で飼育され、Ｖｉｎｃｅｎｚｏ Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ（ＨＩＵ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ）好意で提供された。週齢６～８週間のＢａｌｂｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｍａｒｇａｔｅ、ＵＫ）から入手された。
【0133】
アデノウイルスベクター
ＮＹ－ＥＳＯ－１研究について、完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子または優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＬＷＴＱＣを、ＡｄＨｕ５ベクターバックボーンへクローニングした。ＣＴ－２６研究について、完全長マウス白血病ウイルス遺伝子ｇｐ９０または優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１）を上記のように挿入して、構築物ＡｄＨｕ５－ＦＬおよびＡｄＨｕ５－ ＡＨ１－ＭＧを作製した。その構築物は、ウイルスベクターコア施設（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により、２９３Ａ細胞において塩化セシウム遠心分離による精製を用いて、スケールアップされ、精製され、定量化され、ストックはＰＢＳ中、－８０℃で保存された。推定ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰ（配列番号４）を含有するＣＴ２６腫瘍由来の免疫原性変異をコードする第２の構築物ＡｄＨｕ５－ｅ２ｆ８－２７ＭＧを、作製し、２９３Ａ細胞においてスケールアップし、膜精製（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）により精製した。
ＮＹ－ＥＳＯ－１研究について、完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１遺伝子または優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＬＷＴＱＣを、ＡｄＨｕ５ベクターバックボーンへクローニングした。ＣＴ－２６研究について、完全長マウス白血病ウイルス遺伝子ｇｐ９０または優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１）を上記のように挿入して、構築物ＡｄＨｕ５－ＦＬおよびＡｄＨｕ５－ ＡＨ１－ＭＧを作製した。その構築物は、ウイルスベクターコア施設（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）により、２９３Ａ細胞において塩化セシウム遠心分離による精製を用いて、スケールアップされ、精製され、定量化され、ストックはＰＢＳ中、－８０℃で保存された。推定ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＶＩＬＰＱＡＰＳＧＰＳＹＡＴＹＬＱＰＡＱＡＱＭＬＴＰＰ（配列番号４）を含有するＣＴ２６腫瘍由来の免疫原性変異をコードする第２の構築物ＡｄＨｕ５－ｅ２ｆ８－２７ＭＧを、作製し、２９３Ａ細胞においてスケールアップし、膜精製（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）により精製した。
【0134】
ＨＰＶ１６ Ｅ７研究について、完全長ＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子または優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号７）をＡｄＨｕ５ベクターバックボーンへクローニングした。対照ベクターは、ＡｄＨｕ５ベクターバックボーンへ挿入された、細菌酵素β－ガラクトシダーゼ由来のＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＩＣＰＭＹＡＲＶ（配列番号８）で構成された。
【0135】
マウス免疫化および腫瘍曝露および抗ＰＤ－Ｌ１抗体での処置
示されているように、マウスを、ウイルスの１×１０７～９感染単位（ＩＵ）での尾静脈注射により静脈内で免疫した。ＮＹ－ＥＳＯ－１についてトランスジェニックなＨＨＤ肉腫細胞株またはＣＴ２６結腸直腸がんまたはＴＣ－１（ＨＰＶ１６ Ｅ７発現）細胞株を、０．１～１×１０６細胞／２００μｌの間で側腹部に皮下注射した。マイコプラズマ検査を、注射前の細胞株に実施し、マイコプラズマ陰性細胞のみを用いた。
示されているように、マウスを、ウイルスの１×１０７～９感染単位（ＩＵ）での尾静脈注射により静脈内で免疫した。ＮＹ－ＥＳＯ－１についてトランスジェニックなＨＨＤ肉腫細胞株またはＣＴ２６結腸直腸がんまたはＴＣ－１（ＨＰＶ１６ Ｅ７発現）細胞株を、０．１～１×１０６細胞／２００μｌの間で側腹部に皮下注射した。マイコプラズマ検査を、注射前の細胞株に実施し、マイコプラズマ陰性細胞のみを用いた。
【0136】
腫瘍曝露後、マウスをモニターし、触知できたとき、腫瘍直径を、１～２日ごとにデジタルカリパスを用いて測定し、体積を、変形楕円式、体積＝（幅）２×長さ／２を用いて計算し、腫瘍成長の速度を決定した。
【0137】
治療的曝露研究について、マウスに、まず、側腹部の皮下に腫瘍細胞を移植した － ６～７日後、その動物を、１×１０７～９ＩＵでの関連アデノウイルスベクターで尾静脈を介して静脈内に免疫し、前述のように腫瘍を測定した。いくつかの実験において、マウスを、０．２ｍｇの抗マウスＰＤ－Ｌ１（クローン１０Ｆ、９Ｇ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）かまたはアイソタイプ対照かのいずれかで、腫瘍移植後１４日目、１７日目、２０日目、および２２日目に静脈内注射により処置した。
【0138】
血液および組織からのリンパ球単離
血液、脾臓、および腫瘍試料を、酵素的および機械的消化を用いて処理し、高生存能を有するリンパ球集団を取得した。腫瘍を切除し、その後、コラゲナーゼおよびＤＮアーゼで、３７℃、４５分間、消化した。消化された腫瘍を１００μｍ細胞篩に通し、その後、完全ＲＰＭＩで洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを再懸濁し、その後、前述のように洗浄しかつペレット化する前に、４０μｍ細胞篩に通した。その後、単離された腫瘍細胞を再懸濁し、カウントした。
血液、脾臓、および腫瘍試料を、酵素的および機械的消化を用いて処理し、高生存能を有するリンパ球集団を取得した。腫瘍を切除し、その後、コラゲナーゼおよびＤＮアーゼで、３７℃、４５分間、消化した。消化された腫瘍を１００μｍ細胞篩に通し、その後、完全ＲＰＭＩで洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを再懸濁し、その後、前述のように洗浄しかつペレット化する前に、４０μｍ細胞篩に通した。その後、単離された腫瘍細胞を再懸濁し、カウントした。
【0139】
腫瘍およびワクチン特異的Ｔ細胞の検出および分析
ウイルスおよびワクチン特異的Ｔ細胞を検出するために用いられたテトラマーおよびペンタマーの詳細は表２に示されている。
ウイルスおよびワクチン特異的Ｔ細胞を検出するために用いられたテトラマーおよびペンタマーの詳細は表２に示されている。
【0140】
【表2】
【0141】
表２に列挙された試薬を、モノマーとして合成し、ストレプトアビジン－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）の添加によりテトラマー化した。モノマーの構築のためのペプチドをＰｒｏｉｍｍｕｎｅ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）から入手した。全血のおよそ５０μｌのアリコートを、テトラマーのクラスＩペプチド複合体を含有する溶液の５０μｌを用いて３７℃で２０分間、染色し、続いて、ｍＡｂおよび固定可能なＮＩＲ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色で染色した。
【0142】
抗体染色
単一細胞懸濁液を、非特異的抗体結合を防止するためにＦｃＲブロッキング試薬（ＣＤ１６／ＣＤ３２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロッキングした（４℃で２０分間）。引き続いて、細胞を、テトラマー（上記のような）および様々な蛍光色素コンジュゲート型抗体で免疫染色した（４℃で２０分間）。全ての抗体パネルにおいて、固定可能な生死判別色素（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）近赤外色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加えて、分析から死細胞を排除した。以下の抗体は、リストにおいてマークされたものを除いて、１：１００の濃度でフローサイトメトリーに用いられた：ＣＤ４－ＡＦ７００（ＲＭＡ４－４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（５３－６．７ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｒ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８／ＬＦＡ－１（Ｈ１５５－７８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２７（ＬＦ．３Ａ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４４（ＩＭ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１／２００）、ＣＤ９５／Ｆａｓ（Ｊｏ２ ＢＤ）、ＣＤ１０３（２Ｅ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１／２００）、ＣＤ１２７（ＳＢ／１９９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２７９／ＰＤ－１（ＲＭＰ１－３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＸ３ＣＲ１（ＳＡ０１１Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＬＲＧ１（２Ｆ１、ａｂｃａｍ）、ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞内染色に必要とされる単一細胞試料の固定化および透過処理（ＦｏｘＰ３／転写因子染色バッファーセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを用いる）の前に、細胞外染色を実施した。細胞内サイトカイン染色について、腫瘍由来または脾臓由来の単一細胞を、エクスビボで、陽性対照（２μｇ／ｍｌにおけるＰＭＡおよび４．４μｇ／ｍｌにおけるＩＯ）および陰性対照（培地のみ）と共にペプチド（４μｇ／ｍｌ）で２．５時間、刺激し、その後、細胞を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ、１μｌ／ｍｌ）と３７℃で４、５時間、インキュベートした。用いられた抗体は、以下の表に列挙されている。これらは、示されている場合を除いて１：１００希釈で用いられた。
単一細胞懸濁液を、非特異的抗体結合を防止するためにＦｃＲブロッキング試薬（ＣＤ１６／ＣＤ３２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロッキングした（４℃で２０分間）。引き続いて、細胞を、テトラマー（上記のような）および様々な蛍光色素コンジュゲート型抗体で免疫染色した（４℃で２０分間）。全ての抗体パネルにおいて、固定可能な生死判別色素（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）近赤外色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加えて、分析から死細胞を排除した。以下の抗体は、リストにおいてマークされたものを除いて、１：１００の濃度でフローサイトメトリーに用いられた：ＣＤ４－ＡＦ７００（ＲＭＡ４－４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（５３－６．７ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｒ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８／ＬＦＡ－１（Ｈ１５５－７８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２７（ＬＦ．３Ａ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４４（ＩＭ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１／２００）、ＣＤ９５／Ｆａｓ（Ｊｏ２ ＢＤ）、ＣＤ１０３（２Ｅ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１／２００）、ＣＤ１２７（ＳＢ／１９９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２７９／ＰＤ－１（ＲＭＰ１－３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＸ３ＣＲ１（ＳＡ０１１Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ－１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＬＲＧ１（２Ｆ１、ａｂｃａｍ）、ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞内染色に必要とされる単一細胞試料の固定化および透過処理（ＦｏｘＰ３／転写因子染色バッファーセット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを用いる）の前に、細胞外染色を実施した。細胞内サイトカイン染色について、腫瘍由来または脾臓由来の単一細胞を、エクスビボで、陽性対照（２μｇ／ｍｌにおけるＰＭＡおよび４．４μｇ／ｍｌにおけるＩＯ）および陰性対照（培地のみ）と共にペプチド（４μｇ／ｍｌ）で２．５時間、刺激し、その後、細胞を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ、１μｌ／ｍｌ）と３７℃で４、５時間、インキュベートした。用いられた抗体は、以下の表に列挙されている。これらは、示されている場合を除いて１：１００希釈で用いられた。
【0143】
【表3-1】
【0144】
【表3-2】
【0145】
フローサイトメトリー
全ての免疫染色試料を、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターを用いるフローサイトメトリーにより分析した。データ解析を、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０を用いて行った。細胞は、リンパ球、単一細胞、生細胞、および引き続き、分析のために関連マーカーに関してゲーティングした。
全ての免疫染色試料を、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターを用いるフローサイトメトリーにより分析した。データ解析を、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ ｖ１０を用いて行った。細胞は、リンパ球、単一細胞、生細胞、および引き続き、分析のために関連マーカーに関してゲーティングした。
【0146】
ＣｅｌｌＲＯＸ ｒｅｄアッセイ
５０日より前にＭＣＭＶまたはＡｄ－ｌａｃＺに感染したＣＸ３ＣＲ１ｇｆｐ／＋またはｇｆｐ／ｇｆｐマウスから単一細胞の脾細胞を調製した。その脾細胞を、９６ウェルプレートへ蒔き、完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）中で４８時間、培養した。細胞を遠沈し、２００μｌ無菌ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した。その後、細胞を．無血清ＲＰＭＩかまたはＲＰＭ＋１０％ＦＣＳかのいずれかで処理した（ウェルあたり４０μｌで加えた）。これらを、３７℃で１～１．５時間、インキュベートした。ＣｅｌｌＲＯＸ ｒｅｄ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を無血清培地で１：５０に希釈し、その後、希釈された試薬の４μｌを各ウェルに加え、３７℃で４０分間、インキュベートした。その後、細胞を、適切な表面抗体（適切なテトラマー－ＰＥ、ＣＤ８－ｅＦｌｕｏｒ ４５０、ＣＤ６２Ｌ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００、ＣＤ４４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、および固定可能なＬｉｖｅＤｅａｄマーカー）で、３７℃、２０分間、染色した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、その後、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＬＳＲＩＩで分析し、生きているＣＤ８ Ｔ細胞に関するＣｅｌｌＲＯＸ ｒｅｄの幾何平均をＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算した。
５０日より前にＭＣＭＶまたはＡｄ－ｌａｃＺに感染したＣＸ３ＣＲ１ｇｆｐ／＋またはｇｆｐ／ｇｆｐマウスから単一細胞の脾細胞を調製した。その脾細胞を、９６ウェルプレートへ蒔き、完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）中で４８時間、培養した。細胞を遠沈し、２００μｌ無菌ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した。その後、細胞を．無血清ＲＰＭＩかまたはＲＰＭ＋１０％ＦＣＳかのいずれかで処理した（ウェルあたり４０μｌで加えた）。これらを、３７℃で１～１．５時間、インキュベートした。ＣｅｌｌＲＯＸ ｒｅｄ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を無血清培地で１：５０に希釈し、その後、希釈された試薬の４μｌを各ウェルに加え、３７℃で４０分間、インキュベートした。その後、細胞を、適切な表面抗体（適切なテトラマー－ＰＥ、ＣＤ８－ｅＦｌｕｏｒ ４５０、ＣＤ６２Ｌ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００、ＣＤ４４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、および固定可能なＬｉｖｅＤｅａｄマーカー）で、３７℃、２０分間、染色した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、その後、ＰＢＳ中に再懸濁し、ＬＳＲＩＩで分析し、生きているＣＤ８ Ｔ細胞に関するＣｅｌｌＲＯＸ ｒｅｄの幾何平均をＦｌｏｗＪｏソフトウェアで計算した。
【0147】
ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒアッセイ
１００日より前にＭＣＭＶまたはＡｄＨｕ５組換えアデノベクター（Ａｄ－Ｉ８Ｖ）に感染したＣ５７ＢＬ／６由来のＰＢＬを、抗マウスＣＤ８、抗マウスＣＸ３ＣＲ１、ＬｉｖｅＤｅａｄ近赤外固定可能なマーカーで染色した。１２．５ｎｍ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎおよび１２．５ｎｍ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での３７℃、３０分間の染色を、表面染色の前に行い、その後、ＬＳＲＩＩで分析し、データを ＦｌｏｗＪｏで計算した。
１００日より前にＭＣＭＶまたはＡｄＨｕ５組換えアデノベクター（Ａｄ－Ｉ８Ｖ）に感染したＣ５７ＢＬ／６由来のＰＢＬを、抗マウスＣＤ８、抗マウスＣＸ３ＣＲ１、ＬｉｖｅＤｅａｄ近赤外固定可能なマーカーで染色した。１２．５ｎｍ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎおよび１２．５ｎｍ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での３７℃、３０分間の染色を、表面染色の前に行い、その後、ＬＳＲＩＩで分析し、データを ＦｌｏｗＪｏで計算した。
【0148】
統計解析
記述統計学（パーセント平均値、標準偏差、カウント数）をＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて計算した。平均値の比較のためのＰ値を、Ｔ検定、一元配置および二元配置ＡＮＯＶＡによって決定し、多重比較のためにＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋを用いて補正した。統計的有意性をｐ＜０．０５として定義した。
記述統計学（パーセント平均値、標準偏差、カウント数）をＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（Ｇｒａｐｈｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて計算した。平均値の比較のためのＰ値を、Ｔ検定、一元配置および二元配置ＡＮＯＶＡによって決定し、多重比較のためにＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋを用いて補正した。統計的有意性をｐ＜０．０５として定義した。
【0149】
組換えＡＡＶミニ遺伝子作製のための方法
目的のミニ遺伝子をコードする組換えＡＡＶは、ＨＥＫ ２９３細胞を３つのプラスミド：（１）目的のミニ遺伝子を含有するＡＡＶ－ＩＴＲプラスミド［ＡＡＶ－ＩＴＲ－ミニ遺伝子］、（２）ＡＡＶ複製に必要とされるＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡアデノウイルスタンパク質をコードするアデノウイルスヘルパープラスミド、ならびに（３）ＡＡＶ－ＩＴＲ－ミニ遺伝子をＡＡＶウイルス粒子内にパッケージングするために必要とされるＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするヘルパープラスミドでトランスフェクトすることにより作製される。
目的のミニ遺伝子をコードする組換えＡＡＶは、ＨＥＫ ２９３細胞を３つのプラスミド：（１）目的のミニ遺伝子を含有するＡＡＶ－ＩＴＲプラスミド［ＡＡＶ－ＩＴＲ－ミニ遺伝子］、（２）ＡＡＶ複製に必要とされるＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡアデノウイルスタンパク質をコードするアデノウイルスヘルパープラスミド、ならびに（３）ＡＡＶ－ＩＴＲ－ミニ遺伝子をＡＡＶウイルス粒子内にパッケージングするために必要とされるＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードするヘルパープラスミドでトランスフェクトすることにより作製される。
【0150】
ベクター配列：
以下は、本発明のベクターに用いられ得る例示的な配列を提供する。
配列番号１３ ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側のＡｄＨｕ５アデノウイルスヌクレオチド配列：
配列番号１４ ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側のＡｄＨｕ５アデノウイルスヌクレオチド配列：
ミニ遺伝子免疫原カセット：
配列番号１５ Ｔ細胞エピトープの５’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列
Ｔ細胞エピトープ配列の５’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列
配列番号１６ ａｔｔＲ１配列
配列番号１７ ａｔｔＬ１配列
配列番号１８ ＣＭＶプロモーター配列
配列番号１９ コザック配列
配列番号２０ 開始コドン
Ｔ細胞エピトープ：
配列番号２ ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープ
配列番号２１ ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）コドン最適化ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープヌクレオチド配列
配列番号１ ＡＨ１エピトープ
配列番号２２ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ＡＨ１エピトープヌクレオチド配列
配列番号３ ＧＳＷ１１エピトープ
配列番号２３ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ＧＳＷ１１エピトープヌクレオチド配列
配列番号４ ｅ２ｆ８エピトープ
配列番号２４ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ｅ２ｆ８エピトープヌクレオチド配列
配列番号５ Ｍｔｃｈ１－１０ｍｅｒエピトープ
配列番号２５ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍｔｃｈ１－１０ｍｅｒエピトープヌクレオチド配列
配列番号６ Ｍｔｃｈ１－９ｍｅｒエピトープ
配列番号２６ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍｔｃｈ１－９ｍｅｒエピトープヌクレオチド配列
配列番号８ Ｉ８Ｖエピトープ
配列番号２７ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｉ８Ｖエピトープヌクレオチド配列
配列番号９ ｐｐ８９エピトープ
配列番号２８ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ｐｐ８９エピトープヌクレオチド配列
配列番号１０ Ｍ４５エピトープ
配列番号 ２９ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍ４５エピトープヌクレオチド配列
配列番号１１ Ｍ３８エピトープ
配列番号３０ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍ３８エピトープヌクレオチド配列
配列番号１２ ｍ１３９エピトープ
配列番号３１ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ｍ１３９エピトープヌクレオチド配列
配列番号７ ＨＰＶ１６ Ｅ７４９－５７エピトープ
配列番号３２ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ＨＰＶ１６ Ｅ７４９－５７エピトープヌクレオチド配列
配列番号３３ Ｔ細胞エピトープ配列の３’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列
Ｔ細胞エピトープ配列の３’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列：
停止コドン
配列番号３４ ＢＧＨポリＡ配列
配列番号３５ ａｔｔＬ２配列
配列番号３６ ａｔｔＲ２配列
上記のミニ遺伝子免疫原カセットは、ＡＡＶベクターと共に用いられ得る。例えば、逆方向末端反復配列を含むＡＡＶベクターが用いられ得る。配列例は、下記に提供されている。
配列番号３８ ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側のＡＡＶヌクレオチド配列
ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側のＡＡＶヌクレオチド配列についての記述：
配列番号３９ ５’ＩＴＲヌクレオチド配列
配列番号４０ ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側の余分な配列
配列番号４１ ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側のＡＡＶアデノウイルスヌクレオチド配列
ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側のＡＡＶアデノウイルスヌクレオチド配列についての記述：
配列番号４２ ３’ＩＴＲヌクレオチド配列
配列番号４３ ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側の余分配列
以下は、本発明のベクターに用いられ得る例示的な配列を提供する。
配列番号１３ ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側のＡｄＨｕ５アデノウイルスヌクレオチド配列：
配列番号１４ ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側のＡｄＨｕ５アデノウイルスヌクレオチド配列：
ミニ遺伝子免疫原カセット：
配列番号１５ Ｔ細胞エピトープの５’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列
Ｔ細胞エピトープ配列の５’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列
配列番号１６ ａｔｔＲ１配列
配列番号１７ ａｔｔＬ１配列
配列番号１８ ＣＭＶプロモーター配列
配列番号１９ コザック配列
配列番号２０ 開始コドン
Ｔ細胞エピトープ：
配列番号２ ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープ
配列番号２１ ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）コドン最適化ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープヌクレオチド配列
配列番号１ ＡＨ１エピトープ
配列番号２２ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ＡＨ１エピトープヌクレオチド配列
配列番号３ ＧＳＷ１１エピトープ
配列番号２３ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ＧＳＷ１１エピトープヌクレオチド配列
配列番号４ ｅ２ｆ８エピトープ
配列番号２４ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ｅ２ｆ８エピトープヌクレオチド配列
配列番号５ Ｍｔｃｈ１－１０ｍｅｒエピトープ
配列番号２５ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍｔｃｈ１－１０ｍｅｒエピトープヌクレオチド配列
配列番号６ Ｍｔｃｈ１－９ｍｅｒエピトープ
配列番号２６ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍｔｃｈ１－９ｍｅｒエピトープヌクレオチド配列
配列番号８ Ｉ８Ｖエピトープ
配列番号２７ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｉ８Ｖエピトープヌクレオチド配列
配列番号９ ｐｐ８９エピトープ
配列番号２８ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ｐｐ８９エピトープヌクレオチド配列
配列番号１０ Ｍ４５エピトープ
配列番号 ２９ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍ４５エピトープヌクレオチド配列
配列番号１１ Ｍ３８エピトープ
配列番号３０ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化Ｍ３８エピトープヌクレオチド配列
配列番号１２ ｍ１３９エピトープ
配列番号３１ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ｍ１３９エピトープヌクレオチド配列
配列番号７ ＨＰＶ１６ Ｅ７４９－５７エピトープ
配列番号３２ マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）コドン最適化ＨＰＶ１６ Ｅ７４９－５７エピトープヌクレオチド配列
配列番号３３ Ｔ細胞エピトープ配列の３’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列
Ｔ細胞エピトープ配列の３’側のミニ遺伝子免疫原カセットヌクレオチド配列：
停止コドン
配列番号３４ ＢＧＨポリＡ配列
配列番号３５ ａｔｔＬ２配列
配列番号３６ ａｔｔＲ２配列
上記のミニ遺伝子免疫原カセットは、ＡＡＶベクターと共に用いられ得る。例えば、逆方向末端反復配列を含むＡＡＶベクターが用いられ得る。配列例は、下記に提供されている。
配列番号３８ ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側のＡＡＶヌクレオチド配列
ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側のＡＡＶヌクレオチド配列についての記述：
配列番号３９ ５’ＩＴＲヌクレオチド配列
配列番号４０ ミニ遺伝子免疫原カセットの５’側の余分な配列
配列番号４１ ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側のＡＡＶアデノウイルスヌクレオチド配列
ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側のＡＡＶアデノウイルスヌクレオチド配列についての記述：
配列番号４２ ３’ＩＴＲヌクレオチド配列
配列番号４３ ミニ遺伝子免疫原カセットの３’側の余分配列
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【配列表】
【国際調査報告】