特表 2023-500460 処置に対する分子応答に基づく処置の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-06

(54)【発明の名称】処置に対する分子応答に基づく処置の方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221226BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20221226BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221226BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20221226BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221226BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20221226BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20221226BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20221226BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20221226BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20221226BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/574 A

C12Q1/02

C12Q1/6837 Z

A61K45/00

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K31/517

A61K31/337

A61K31/704

A61K31/675

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022524997

(86)(22)【出願日】2020-10-29

(85)【翻訳文提出日】2022-06-13

(86)【国際出願番号】 US2020058050

(87)【国際公開番号】W WO2021087167

(87)【国際公開日】2021-05-06

(31)【優先権主張番号】62/927,557

(32)【優先日】2019-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】カーティス， クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】マクナマラ， キャサリン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CB02

2G045DA14

2G045DA36

2G045FB01

2G045FB02

2G045FB03

4B063QA01

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4B063QR55

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4C084ZB262

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4C085BB31

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4C086BC45

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4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA20

4C086ZB26

(57)【要約】

標的処置に対する乳癌の生体分子応答に基づく処置方法が提供される。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）標的処置の開始後の様々な生体分子の発現レベルまたは浸潤免疫細胞の組織学的評価を使用して、乳癌が病理学的完全奏効を達成するかどうかを決定することができる。病理学的完全奏効の可能性に基づいて、それに応じて乳癌を処置することができる。乳癌の病理学的完全奏効を診断的に決定する方法であって、乳癌を有する個体の処置中癌生検を得るか、または得たことであって、前記処置中癌生検が標的療法の開始後に得られた癌生検であることと、前記処置中癌生検の少なくとも１つの関心領域内の１またはそれを超える生体分子のセットの発現を測定するか、または測定したことと、標的療法が、分類指標および前記生体分子発現測定値を利用して、前記個体において病理学的完全奏効を提供するかどうかを決定するか、または決定したことと、を含む、方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳癌の病理学的完全奏効を診断的に決定する方法であって、
乳癌を有する個体の処置中癌生検を得るか、または得たことであって、前記処置中癌生検が標的療法の開始後に得られた癌生検であることと、
前記処置中癌生検の少なくとも１つの関心領域内の１またはそれを超える生体分子のセットの発現を測定するか、または測定したことと、
標的療法が、分類指標および前記生体分子発現測定値を利用して、前記個体において病理学的完全奏効を提供するかどうかを決定するか、または決定したことと、
を含む、方法。

【請求項2】

標的療法が病理学的完全奏効を提供すると決定される場合、前記個体にデ・エスカレーションされた治療レジメンを投与すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記デ・エスカレーションされた治療レジメンが、全身化学療法を伴わない標的治療薬を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

標的療法が、病理学的完全奏効を提供しないと決定される場合、前記個体にエスカレーションされた治療レジメンを投与すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記エスカレーションされた治療レジメンが、化学療法剤と組み合わせた標的治療薬を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記エスカレーションされた治療レジメンが、２つの標的治療薬の二重標的療法を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記乳癌が、ＨＥＲ２＋である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記１またはそれを超える生体分子のセットが、少なくとも１つの免疫応答および活性化生体分子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくとも１つの免疫応答および活性化生体分子が、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＯ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、グランザイムＢ、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ１４、ＳＴＩＮＧ、ＰＤ１／ＰＤＬ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ－１、Ｌａｇ３またはＶＩＳＴＡである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記１またはそれを超える生体分子のセットが、少なくとも１つの細胞生存生体分子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記少なくとも１つの細胞生存生体分子がベータ－２ミクログロブリンまたはＢｃｌ－２である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記乳癌が、ＨＥＲ２＋であり、前記１またはそれを超える生体分子のセットが、少なくとも１つのＨＥＲ２シグナル伝達経路生体分子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つのＨＥＲ２シグナル伝達経路生体分子が、ＨＥＲ２、ＡＫＴ／ｐ－ＡＫＴ、Ｓ６／ｐ－Ｓ６、ＰＴＥＮ、ｐ－ＥＲＫ、ｐ－ＳＴＡＴ３である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記１またはそれを超える生体分子のセットが、上皮腫瘍組織生体分子を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記少なくとも１つの上皮腫瘍組織生体分子が、ＰａｎＣＫ、Ｋｉ６７、またはベータ－カテニンである、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記１またはそれを超える生体分子のセットが、以下の生体分子：ＨＥＲ２、ＡＫＴ／ｐ－ＡＫＴ、Ｓ６／ｐ－Ｓ６、ＰＴＥＮ、ｐ－ＥＲＫ、ｐ－ＳＴＡＴ３、ＰａｎＣＫ、Ｋｉ６７、ベータカテニン、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＯ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、グランザイムＢ、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ１４、ＳＴＩＮＧ、ＰＤ１／ＰＤＬ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ－１、Ｌａｇ３、ＶＩＳＴＡ、ベータ－２ミクログロブリンまたはＢｃｌ－２のうちの少なくとも２つを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記１またはそれを超える生体分子のセットが、ＣＤ４５を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記癌が、ＨＥＲ２＋であり、前記１またはそれを超える生体分子のセットが、ＨＥＲ２を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記癌生検が、ホルマリン固定パラフィン包埋、ＯＣＴ包埋、または瞬間凍結である、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記少なくとも１つの関心領域が、パンサイトケラチン－陽性（ｐａｎＣＫ＋）腫瘍細胞またはＣＤ４５－陽性（ＣＤ４５＋）免疫細胞によって決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

乳癌を有する個体の処置前癌生検を得るか、または得たことであって、前記処置前癌生検が、標的療法の前記少なくとも１つのサイクルの前に得られた癌生検であることと、
前記処置前癌生検の少なくとも１つの関心領域内の前記１またはそれを超える生体分子のセットの発現を測定するか、または測定したことと、
前記１またはそれを超える生体分子のセットの動的生体分子発現を決定することであって、前記動的生体分子発現が、標的療法が病理学的完全奏効を提供するか、または提供しないかを決定するために前記分類指標で利用されることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

線形混合効果モデルを利用して、前記１またはそれを超える生体分子のセットの前記動的生体分子発現を定量する、請求項１６に記載の方法。

【請求項23】

前記標的治療薬が、ネオアジュバント処置レジメンの一部として投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記癌が、ＨＥＲ２＋であり、前記標的療法の少なくとも１つのサイクルが、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、またはトラスツズマブエムタンシンの投与を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

生体分子発現が、多重空間プロテオミクスによって決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記分類指標が、回帰モデルである、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記回帰モデルが、線形、ロジスティック、多項式、リッジ、ステップワイズ、ＬＡＳＳＯ、ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ、Ｌ１正則化、Ｌ２正則化、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記分類指標が、一般化線形モデル（ＧＬＭ）、通常の最小二乗法、ランダムフォレスト、決定木またはニューラルネットワークを組み込む、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記分類指標が、処置タイプ、ＥＲ状態、ＰＡＭ５０状態、腫瘍サイズ、腫瘍グレード、癌ステージ、患者の年齢または患者の民族性を組み込む、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記癌が、ＨＥＲ２＋であり、前記標的治療薬が、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、またはトラスツズマブエムタンシンのうちの１つである、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドキソルビシン、またはシクロホスファミドのうちの１つである、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記分類指標の感度に基づく閾値が、標的療法が病理学的完全奏効を提供することを決定するために利用される、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

前記閾値が、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％の特異性に基づく、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記処置中癌生検の少なくとも１つの関心領域内の免疫細胞浸潤を評価するか、または評価したこと、をさらに含み、
標的療法が前記分類指標を利用する前記個体において病理学的完全奏効を提供するかどうかを前記決定することが、前記免疫細胞浸潤評価を前記分類指標における特徴としてさらに利用する、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

前記免疫細胞浸潤が、ヘマトキシリンおよびエオシン染色または免疫染色によって評価される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

免疫細胞浸潤の前記評価が、間質性腫瘍浸潤リンパ球浸潤の評価である、請求項３４記載の方法。

【請求項37】

免疫細胞浸潤の前記評価が、腫瘍内リンパ球の評価である、請求項３４記載の方法。

【請求項38】

免疫細胞浸潤の前記評価が、ＣＤ４５－陽性細胞浸潤の評価である、請求項３４記載の方法。

【請求項39】

免疫細胞浸潤の前記評価が、ＣＤ５６－陽性細胞浸潤の評価である、請求項３４記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年１０月２９日に出願されたＣｕｒｔｉｓらの「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ Ｂａｓｅｄ Ｕｐｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」と題する米国仮出願第６２／９２７，５５７号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＣＡ１８２５１４の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

技術分野
本開示は、一般に、個体の乳癌の分子特性および処置に対する分子応答に基づく診断および処置を含む方法を対象とする。

【背景技術】

【0004】

背景
ヒト上皮増殖因子受容体２－陽性（ＨＥＲ２＋）乳癌は、癌細胞の増殖を促進するヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）と呼ばれるタンパク質の試験で陽性となる乳癌である。ＨＥＲ２＋乳癌は、浸潤性乳癌の１５～３０％を占め、侵襲性表現型と関連している。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ネラチニブ（Ｎｅｒｌｙｎｘ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｊｅｔａ）、およびトラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１またはＫａｄｃｙｌａ）を含むＨＥＲ２＋乳癌において、いくつかの標的化療法を使用することができる。標的化療法は、手術前に腫瘍サイズを減少させるための処置であるネオアジュバント処置としてよく利用される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

要旨
様々な実施形態は、標的処置に対する分子応答に基づく乳癌の診断および処置に関する。様々な実施形態では、標的処置に対する癌の分子応答は、特定の腫瘍関連または免疫関連生体分子の発現を測定することによって決定される。様々な実施形態において、線形モデルは、標的処置に対する完全な病理学的応答を達成する可能性を決定するために生体分子発現を利用した。様々な実施形態において、特定の処置レジメンは、完全な病理学的応答を達成する可能性に基づいて行われる。

【図面の簡単な説明】

【0006】

説明および特許請求の範囲は、本発明の例示的な実施形態として提示され、本発明の範囲の完全な列挙として解釈されるべきではない以下の図およびデータグラフを参照してより完全に理解されるであろう。

【0007】

【図1】図１は、本発明の一実施形態による、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を示す分類に基づいて乳癌を処置する方法の流れ図である。

【0008】

【図2】図２は、様々な実施形態に従って利用されるＧｅｏＭｘ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ）技術で分析された発見および検証コホートの概略図である。ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験に登録された浸潤性ＨＥＲ２＋乳癌患者を、割り当てられたＨＥＲ２標的療法の１サイクルとそれに続く割り当てられたＨＥＲ２標的処置プラス化学療法（ドセタキセル＋カルボプラチン）の６サイクルで処置した。組織を３つの時点で得た（処置前、処置中、および処置／手術後）。

【0009】

【図3】図３は、様々な実施形態に従って利用される、処置アーム、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）状態、および処置前バルク発現データに基づいて推測されるＰＡＭ５０状態を含む、ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７ ＤＳＰ発見コホートの臨床的特徴の要約を提供する。双方向の分割表は、ＥＲ状態、ｐＣＲ状態、および処置アームの分布を比較する。

【0010】

【図4】図４は、様々な実施形態に従って利用される、発見コホートのための病理学的に推定された細胞充実性処置前および処置中を示すチャートを提供する。緑色の陰影を有する試料は、その後の分析に使用されたものを示す。病理学的完全奏効（ｐＣＲ）カラムでは、０＝非ｐＣＲ、１＝ｐＣＲである。エストロゲン受容体（ＥＲ）状態カラムの場合、０＝ＥＲ－陰性、１＝ＥＲ－陽性である。図４はまた、様々な実施形態に従って利用される、処置中にサンプリングされた症例３０からのイン・サイチュ領域の例を提供する。細胞充実性は、明確な組織切片の病理学的検討に基づいて０であると推定されたが、腫瘍領域は、この分析で使用した組織切片の画像化時に同定された。

【0011】

【図5】図５は、様々な実施形態に従って利用される、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒワークフローを要約した概略図である。スライドをタンパク質抗体の混合物で染色する。抗体は、インデックス化オリゴが結合しており、これはその後の読み出しに使用される。ＲＯＩ（関心領域）が選択され、ＵＶ（紫外線）光を使用して照射される。ＵＶ光は、収集およびプローブごとの定量化のためにＲＯＩ内のインデックス化オリゴを切断させる。

【0012】

【図6】図６は、様々な実施形態に従って分析され、利用される関心領域を示す概略図および画像を提供する。組織試料当たりの複数の関心領域（ＲＯＩ）を、パンサイトケラチン富化（ｐａｎＣＫ－Ｅ）に基づいて選択し、４０個の腫瘍マーカーおよび免疫マーカーの空間プロテオミクスプロファイリングに供した。タンパク質カウントを、腫瘍細胞および共局在化免疫細胞を含むＰａｎＣＫ－Ｅマスクに対応する表現型領域内で、およびｐａｎＣＫ－陰性領域に対応する反転マスクについて別々に測定した。

【0013】

【図7】図７は、様々な実施形態に従って利用される複数の関心領域を示す試料画像を提供する。代表的なｐＣＲ症例（６９）および実証的な非ｐＣＲ症例（５８）についての組織標本内の空間的に分離されたＲＯＩの位置。組織当たり平均４つのＲＯＩをプロファイリングした（範囲：１～７）。

【0014】

【図8】図８は、様々な実施形態に従って生成された、Ｋｉ６７陽性パーセント（ＩＨＣを使用して評価された）を正規化されたＤＳＰ Ｋｉ６７発現（同じ症例および時点からの別個の組織切片内のすべてのＲＯＩにわたって平均化された）と比較する相関プロットを提供する。対になったＫｉ６７ ＩＨＣおよびＤＳＰデータを有する合計４２回の生検（２４回の処置前および１８回の処置中）をこの分析で利用した。ピアソン相関係数および対応するｐ値も示されている。図８はまた、様々な実施形態に従って生成された、強い（３＋）ＩＨＣ ＨＥＲ２染色（同じ症例および時点からの別個の組織切片を使用）またはより弱い（０－２）ＩＨＣ ＨＥＲ２染色を示した症例間の正規化されたＤＳＰ ＨＥＲ２発現（同じ症例および時点からのすべてのＲＯＩにわたって平均化された）を比較する箱ひげ図を提供する。対になったＨＥＲ２ ＩＨＣおよびＤＳＰデータを有する合計４４回の生検（２３回の処置前および２１回の処置中）をこの分析で利用した。ウィルコクソン検定を用いて有意性を評価した。

【0015】

【図9】図９は、様々な実施形態に従って利用される、発見コホートにおけるすべてのＲＯＩにわたる処置前のタンパク質マーカー発現のペアワイズ相関を提供する。黒い四角は、同じ階層的クラスタ内のプローブを示す。

【0016】

【図10】図１０は、様々な実施形態に従って利用されるＲＯＩに対応する、発見コホートからの未処置ＨＥＲ２－陽性乳腺腫瘍におけるＨＥＲ２およびＣＤ４５タンパク質発現の腫瘍間および腫瘍内変動を示すチャートを提供する。ｐＣＲの状態、エストロゲン受容体（ＥＲ）の状態、およびＰＡＭ５０サブタイプ（遺伝子発現プロファイリングに基づく）を含む臨床的特徴が示される。

【0017】

【図11A】図１１Ａおよび図１１Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲの場合対非ｐＣＲの場合における、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ）タンパク質データの処置中（図１１Ａ）および処置前（図１１Ｂ）からのＣＤ４５値およびＣＤ５６値を示すバイオリンプロットを提供する。各点は、その場合の処置中のすべてのｐａｎＣＫ富化ＲＯＩの平均プローブ値を表す。ｐ値は、患者によるブロックを伴う多領域データにわたる線形混合効果モデルを使用して導出された。各バイオリンプロットについて、白いボックスは四分位範囲を表し、白いボックスから延びる黒い線は四分位範囲の１．５倍を表す。発見コホートに基づく分析。

【図11B】図１１Ａおよび図１１Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲの場合対非ｐＣＲの場合における、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ）タンパク質データの処置中（図１１Ａ）および処置前（図１１Ｂ）からのＣＤ４５値およびＣＤ５６値を示すバイオリンプロットを提供する。各点は、その場合の処置中のすべてのｐａｎＣＫ富化ＲＯＩの平均プローブ値を表す。ｐ値は、患者によるブロックを伴う多領域データにわたる線形混合効果モデルを使用して導出された。各バイオリンプロットについて、白いボックスは四分位範囲を表し、白いボックスから延びる黒い線は四分位範囲の１．５倍を表す。発見コホートに基づく分析。

【0018】

【図12】図１２は、様々な実施形態に従って利用される、パンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域における処置前対処置中のタンパク質マーカー発現レベルとの比較に基づく処置関連変化を実証するボルケーノプロットを提供する。有意性、－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ調整ｐ値）は、ｙ軸に沿って示されている。

【0019】

【図13】図１３は、様々な実施形態に従って利用される、処置前対処置中のバルクＲＮＡ発現レベルとの比較に基づく処置関連変化を示すボルケーノプロットを提供する。対応するＤｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ）タンパク質マーカーを有するＲＮＡ転写物をこの分析で使用した。有意性、－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ調整ｐ値）は、ｙ軸に沿って示されている。発見コホートに基づく分析。

【0020】

【図14】図１４は、様々な実施形態に従って利用される、ＤＳＰとバルク発現データとの間の比較分析において使用されるタンパク質抗体および遺伝子名の対の表を提供する。

【0021】

【図15】図１５は、トラスツズマブ処置症例（アーム１および３、ｎ＝２３）におけるパンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域における処置前対処置中のタンパク質マーカー発現レベルの比較に基づく処置関連変化を実証するボルケーノプロットを提供する。有意性－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ調整ｐ値）は、様々な実施形態に従って利用されるｙ軸に沿って示される。発見コホートに基づく分析。

【0022】

【図16A】図１６Ａおよび図１６Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ対非ｐＣＲ症例における処置関連変化を示すボルケーノプロットを提供する。

【図16B】図１６Ａおよび図１６Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ対非ｐＣＲ症例における処置関連変化を示すボルケーノプロットを提供する。

【0023】

【図17A】図１７Ａおよび図１７Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ対非ｐＣＲ症例におけるタンパク質マーカーのペアワイズ相関を提供する。黒い四角は、階層的クラスタを画定する。

【図17B】図１７Ａおよび図１７Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ対非ｐＣＲ症例におけるタンパク質マーカーのペアワイズ相関を提供する。黒い四角は、階層的クラスタを画定する。

【0024】

【図18】図１８は、様々な実施形態に従って利用される、タンパク質発現に基づくＥＲ＋およびＥＲ－の場合における処置関連変化（処置前から処置中）を示すウォーターフォールプロットを提供する。

【0025】

【図19】図１９は、様々な実施形態に従って利用される、ＤＳＰタンパク質発現データからのパンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域に基づく処置関連変化（処置前から処置中）を示すウォーターフォールプロットを提供する。入力データをエストロゲン受容体（ＥＲ）状態および病理学的完全奏効（ｐＣＲ）転帰の両方によって層別化した。発見コホートに基づく分析。

【0026】

【図20】図２０は、様々な実施形態に従って利用される、ＨＥＲ２富化および非ＨＥＲ２富化症例（ｎ＝７正常様、ｎ＝２管腔Ｂ、ｎ＝２基底、ｎ＝１管腔Ａ）におけるＤＳＰタンパク質発現の処置関連変化（処置前から処置中）を示すウォーターフォールプロットを提供する。発見コホートにおいて分析を行った。

【0027】

【図21】図２１は、様々な実施形態に従って利用される、ＤＳＰタンパク質発現データからのパンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域に基づく処置関連変化（処置前から処置中）を示すウォーターフォールプロットである。試料をＰＡＭ５０状態（ＨＥＲ２富化またはその他）および病理学的完全奏効（ｐＣＲ）転帰の両方によって層別化した。

【0028】

【図22】図２２は、ＤＳＰタンパク質発現データからパンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域を使用して生成されたウォーターフォールプロットを提供し、様々な実施形態に従って利用される、他の分析で使用される各試料からの２～７個の領域ではなく、各試料をプロファイルするために１つの領域のみが使用される（時点当たりの単一領域のランダム試料の１００回の反復にわたって平均化される）場合の処置関連変化（処置前から処置中）を示す。上のプロットはすべての患者についてのものであり、下のプロットは病理学的完全奏効（ｐＣＲ）状態によって層別化されている。発見コホートに基づく分析。

【0029】

【図23】図２３は、様々な実施形態に従って利用される、パンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域におけるＤＳＰタンパク質発現レベルを使用して、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を受けなかった腫瘍における処置前から手術までの処置関連変化を示すボルケーノプロットを提供する。有意性、－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ調整ｐ値）は、ｙ軸に沿って示されている。発見コホートに基づく分析。

【0030】

【図24】図２４は、様々な実施形態に従って利用される、２つの症例からのＲＯＩの代表的なイン・サイチュ画像、ならびにｐａｎＣＫ富化領域におけるＨＥＲ２およびＣＤ４５タンパク質レベル（ｌｏｇ２正規化）の定量化を提供する。

【0031】

【図25】図２５は、様々な実施形態に従って利用される、時点当たりの症例ごとにプロファイリングされたすべての領域についてのＤＳＰ ＨＥＲ２タンパク質レベルの処置前および処置中の比較を示すチャートを提供する。

【0032】

【図26】図２６は、様々な実施形態に従って利用される、患者内および患者間でのＤＳＰ ＨＥＲ２タンパク質発現処置前対処置中の平均二乗誤差の比較を示す表を提供する。Ｐ値は、両側対ウィルコクソン符号順位検定に基づく。分析は、発見コホートに基づく。

【0033】

【図27】図２７は、様々な実施形態に従って利用される、各ＤＳＰ腫瘍および免疫マーカーについての処置前対処置中の不均一性を示すチャートを提供する。Ｐ値は、両側対ウィルコクソン符号順位検定に基づく。分析は、発見コホートに基づく。

【0034】

【図28】図２８は、様々な実施形態に従って利用される、非ｐＣＲ症例（手術時に腫瘍細胞が存在する患者）における各ＤＳＰタンパク質マーカーの処置前、処置中および処置後の不均一性を示すチャートを提供する。発見コホートに基づく分析。

【0035】

【図29】図２９は、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲおよび非ｐＣＲ症例のＤＳＰタンパク質マーカーにおける処置中の不均一性を示すチャートである。

【0036】

【図30】図３０は、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲおよび非ｐＣＲの場合におけるＤＳＰタンパク質マーカー発現の処置前処置の不均一性を示すチャートを提供する。不均一性は、分散分析に基づいて患者内の平均二乗誤差として計算した。Ｐ値は、両側ウィルコクソン一致対符号順位検定に基づく。発見コホートに基づく分析。

【0037】

【図31】図３１は、様々な実施形態に従って利用される、組織試料当たりの複数の関心領域（ＲＯＩ）に対して実行されたデジタル空間プロファイリング（ＤＳＰ）の概略図を提供する。タンパク質カウントを、腫瘍細胞および共局在化免疫細胞を含むｐａｎＣＫ富化（腫瘍富化）マスクに対応する表現型領域内で、およびｐａｎＣＫ－陰性（腫瘍微小環境、ＴＭＥ）領域に対応する反転マスクについて別々に測定した。

【0038】

【図32A】図３２Ａ、図３２Ｂ、および図３２Ｃは、様々な実施形態に従って利用される、処置前、処置中、および処置後にプロファイリングされた免疫高密度ｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現の差を明らかにするＤＳＰタンパク質データのウォーターフォールプロットを提供する。不均一性は、分散分析に基づいて患者内の平均二乗誤差として計算した。Ｐ値は、両側対ウィルコクソン符号順位検定に基づく。分析は、発見コホートに基づく。

【図32B】図３２Ａ、図３２Ｂ、および図３２Ｃは、様々な実施形態に従って利用される、処置前、処置中、および処置後にプロファイリングされた免疫高密度ｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現の差を明らかにするＤＳＰタンパク質データのウォーターフォールプロットを提供する。不均一性は、分散分析に基づいて患者内の平均二乗誤差として計算した。Ｐ値は、両側対ウィルコクソン符号順位検定に基づく。分析は、発見コホートに基づく。

【図32C】図３２Ａ、図３２Ｂ、および図３２Ｃは、様々な実施形態に従って利用される、処置前、処置中、および処置後にプロファイリングされた免疫高密度ｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現の差を明らかにするＤＳＰタンパク質データのウォーターフォールプロットを提供する。不均一性は、分散分析に基づいて患者内の平均二乗誤差として計算した。Ｐ値は、両側対ウィルコクソン符号順位検定に基づく。分析は、発見コホートに基づく。

【0039】

【図33A】図３３Ａおよび図３３Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ症例（ｎ＝１４）および非ｐＣＲ症例（ｎ＝１４）において、処置前および処置中のｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現を比較する、ＤＳＰタンパク質データを用いて生成されたウォーターフォールプロットを提供する。処置前、ｐＣＲ症例および非ｐＣＲ症例における免疫マーカーの倍率変化値間の相関は、０．９８であり、ｐＣＲ転帰にかかわらず、ｐａｎＣＫ富化領域および周囲の微小環境にわたって同様の免疫分布を示し、この相関は、処置中高いままであった（０．９５）。発見コホートに基づく分析。

【図33B】図３３Ａおよび図３３Ｂは、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ症例（ｎ＝１４）および非ｐＣＲ症例（ｎ＝１４）において、処置前および処置中のｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現を比較する、ＤＳＰタンパク質データを用いて生成されたウォーターフォールプロットを提供する。処置前、ｐＣＲ症例および非ｐＣＲ症例における免疫マーカーの倍率変化値間の相関は、０．９８であり、ｐＣＲ転帰にかかわらず、ｐａｎＣＫ富化領域および周囲の微小環境にわたって同様の免疫分布を示し、この相関は、処置中高いままであった（０．９５）。発見コホートに基づく分析。

【0040】

【図34A】図３４Ａおよび図３４Ｂは、ＤＳＰタンパク質データを用いて作成され、様々な実施形態に従って利用される、ＥＲ－陽性症例（ｎ＝１４）およびＥＲ－陰性症例（ｎ＝１４）において、処置前および処置中のｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現を比較するウォーターフォールプロットを提供する。発見コホートに基づく分析。

【図34B】図３４Ａおよび図３４Ｂは、ＤＳＰタンパク質データを用いて作成され、様々な実施形態に従って利用される、ＥＲ－陽性症例（ｎ＝１４）およびＥＲ－陰性症例（ｎ＝１４）において、処置前および処置中のｐａｎＣＫ富化領域と周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域との間の免疫マーカー発現を比較するウォーターフォールプロットを提供する。発見コホートに基づく分析。

【0041】

【図35】図３５は、様々な実施形態に従って利用される、代表的な組織スタンプの処置前および処置中のＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＣＤ８シグナルの分布を示す多重免疫組織化学（ｍＩＨＣ）画像を提供する。ｐａｎＣＫ ｍＩＨＣチャネル（図示せず）を使用して、ｐａｎＣＫマスクおよび組織マスク（黄色で輪郭が描かれている）を生成した。ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＣＤ８のＩＨＣマーカー発現レベルを、組織切片全体（すべてのデジタル化サブ画像にわたって）およびｐａｎＣＫ富化腫瘍領域内（すべてのデジタル化サブ画像にわたって）で定量化した。

【0042】

【図36】図３６は、様々な実施形態に従って利用される、ｐａｎＣＫ富化バイナリマスクおよび腫瘍－微小環境境界の周辺複雑度に基づく定量化の図を提供する。

【0043】

【図37】図３７は、様々な実施形態に従って利用される、ｐＣＲ症例と非ｐＣＲ症例との間の処置前の周辺複雑度値の比較を示すバイオリンプロットを提供する。線形モデルを用いて計算され、患者によってブロックされたＰ値。分析は、発見コホートに基づく。

【0044】

【図38】図３８は、様々な実施形態に従って利用される、処置前対処置中の周辺複雑度の値の比較を示すバイオリンプロットを提供する。ＰａｎＣＫ富化ＲＯＩを使用して周辺複雑度を定量化した。線形モデルを用いて計算され、患者によってブロックされたＰ値。分析は、発見コホートに基づく。

【0045】

【図39】図３９は、様々な実施形態に従って利用される、発見コホートからの処置前および処置中の組織標本におけるＤＳＰタンパク質発現値と関心領域（ＲＯＩ）当たりの周辺複雑度との間のスピアマン相関を示すプロットを提供する。有意に相関するプローブ：ｐ値＜．０５にはアスタリスクを付す。周辺複雑度と最も高い相関を有するマーカーであるＫｉ－６７の相関プロットであり、各ドットは個々のＲＯＩを表す。

【0046】

【図40】図４０は、様々な実施形態に従って生成された、発見（訓練）コホートにおける複数の仮説についてホルム・ボンフェローニ補正による入れ子式交差検証を使用して比較された様々なモデルの受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）性能下の領域を提供する。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、処置前および処置中の時点の両方からのＤＳＰ ｐａｎＣＫ富化データを有する症例を使用して作成した（ｎ＝２３）。処置前、処置中および処置前と処置中の組み合わせ（「処置中＋処置前」）のＤＳＰタンパク質マーカー平均値（ＲＯＩ全体で平均した）を使用して訓練されたＬ２正則化分類指標のＲＯＣ曲線および統計学的比較。

【0047】

【図41】図４１は、様々な実施形態に従って生成された、発見（訓練）コホートにおける複数の仮説についてホルム・ボンフェローニ補正による入れ子式交差検証を使用して比較された様々なモデルの受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）性能下の領域を提供する。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、処置前および処置中の時点の両方からのＤＳＰ ｐａｎＣＫ富化データを有する症例を使用して作成した（ｎ＝２３）。すべてのマーカー、腫瘍マーカーおよび免疫マーカーの平均値を用いて、処置中プラス処置前の訓練したＤＳＰタンパク質Ｌ２正則化分類指標のＲＯＣ曲線および統計学的比較。この分析では、処置前および処置中の両方の時点からの交差領域平均マーカー値を使用した。

【0048】

【図42】図４２は、様々な実施形態に従って生成された、腫瘍マーカーおよび免疫マーカーについてのマーカー平均対標準誤差（ＳＥＭ）を使用して訓練されたＤＳＰタンパク質処置中プラス処置前Ｌ２正則化分類指標を比較する（複数の仮説についてはホルム・ボンフェローニ補正による入れ子式交差検証を使用して）受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）性能の下の領域を提供する。発見コホートにおいてモデル比較を行った。

【0049】

【図43】図４３は、様々な実施形態に従って生成された、発見（訓練）コホートにおける複数の仮説についてホルム・ボンフェローニ補正による入れ子式交差検証を使用して比較された様々なモデルの受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）性能下の領域を提供する。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、処置前および処置中の時点の両方からのＤＳＰ ｐａｎＣＫ富化データを有する症例を使用して作成した（ｎ＝２３）。ＥＲおよびＰＡＭ５０状態を使用して訓練されたモデルに対する処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質Ｌ２正則化分類指標のＲＯＣ曲線および統計的比較。これらの２つのモデルを、処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質データ、ＥＲおよびＰＡＭ５０状態を組み込んだモデルと比較した。

【0050】

【図44】図４４は、様々な実施形態に従って生成された、他のモデルと比較して４０個すべてのマーカーを使用した処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質Ｌ２正則化分類指標についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線およびＡＵＲＯＣ（受信者動作特性下面積）定量化を提供する。ＲＯＣならびにＥＲ、ＰＡＭ５０状態および強い（３＋）ＨＥＲ２ ＩＨＣ（免疫組織化学）染色状態を使用して訓練したモデルとの統計学的比較、処置前、ｎ＝１９名の患者において、すべてのデータが利用可能であった。これらの２つのモデルはまた、処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質データ、ＥＲ、ＰＡＭ５０状態およびＨＥＲ２ ＩＨＣ染色状態を組み込んだモデルと比較される。ＲＯＣならびにＥＲ、ＰＡＭ５０状態およびＨＥＲ２ ＦＩＳＨ（蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション）比を使用して訓練したモデルとの統計学的比較、処置前、ｎ＝２１人の患者において、すべてのデータが利用可能であった。これらの２つのモデルはまた、処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質データ、ＥＲ、ＰＡＭ５０状態およびＨＥＲ２ ＦＩＳＨ比を組み込んだモデルと比較される。ＲＯＣおよび処置中間質性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用して訓練したモデルとの統計学的比較を、ｎ＝１６の患者において、すべてのデータが利用可能であった。これらの２つのモデルはまた、処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質データおよび処置中ＴＩＬを組み込んだモデルと比較される。

【0051】

【図45】図４５は、様々な実施形態に従って生成された、ＤＳＰタンパク質マーカーの平均値対ＤＳＰタンパク質マーカーに対応するＲＮＡ転写物を使用したバルクＲＮＡ発現を使用して訓練された処置中プラス処置前Ｌ２正則化分類指標のＲＯＣおよび統計学的比較を提供する。ＲＯＣ曲線を、ＤＳＰ ｐａｎＣＫが富化されたデータおよび処置前および処置中の時点の両方からのバルク発現データを有する症例を使用して作成した（ｎ＝２１）。

【0052】

【図46】図４６は、ＤＳＰタンパク質プローブ（症例ごとに全ＲＯＩにわたって平均）と、実施形態に従って利用されるこれらのマーカーの処置前に対応するバルクＲＮＡ転写物との間のスピアマン相関を示すプロットを提供する。有意に相関するプローブ（ｐ値＜．０５）をアスタリスクで示す。２つの例示的な相関プロットが示されており、各ドットは単一の場合を表す。発見コホートに基づく分析。

【0053】

【図47】図４７は、様々な実施形態に従って利用される、モデル試験に使用されるＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ）検証コホートについての臨床的特徴を要約する表を提供する。処置アーム、病理学的完全奏効（ｐＣＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）の状態、および処置前のバルク発現データに基づいて推測されるＰＡＭ５０の状態が含まれる。双方向の分割表は、ＥＲ状態、ｐＣＲ状態、および処置アームの分布を比較する。

【0054】

【図48】図４８は、様々な実施形態に従って利用される、検証コホートにおけるパンサイトケラチン富化（ＰａｎＣＫ－Ｅ）領域における処置前対処置中のタンパク質マーカー発現レベルの比較に基づく処置関連変化を実証するボルケーノプロットを提供する。有意性、－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ調整ｐ値）は、ｙ軸に沿って示されている。

【0055】

【図49】図４９は、様々な実施形態に従って利用される、検証コホートにおけるＰａｎＣＫ－Ｅ領域におけるｐＣＲ対非ｐＣＲ症例の処置関連変化を示すボルケーノプロットを提供する。有意性、－ｌｏｇ１０（ＦＤＲ調整ｐ値）は、ｙ軸に沿って示されている。

【0056】

【図50】図５０は、様々な実施形態に従って生成された、４０－ｐｌｅｘ ＤＳＰタンパク質マーカーパネルを使用した、発見（訓練）コホート（ｎ＝２３、交差検証によって評価）および検証（試験）コホート（ｎ＝２８、訓練試験によって評価）における処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質Ｌ２正則化分類指標の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を提供する。

【0057】

【図51】図５１は、様々な実施形態に従って生成された、発見コホートにおいて訓練され、検証コホートにおいて試験された、Ｌ２正則化処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質モデルにおける４０個のマーカーのそれぞれについての係数を示すプロットを提供する。

【0058】

【図52】図５２は、様々な実施形態に従って生成された、時点（ｎ＝２３）と、トラスツズマブまたはトラスツズマブ＋ラパチニブで処置された症例のサブセット（ｎ＝１９）の両方からのｐａｎＣＫ富化データを有するすべての症例を使用した発見コホートにおける、処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質Ｌ２正則化分類指標の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を提供する。モデル性能を、両方のコホートにおいてプロファイリングされた４０個のＤＳＰタンパク質マーカーを使用した交差検証によって評価した。

【0059】

【図53】図５３は、様々な実施形態に従って生成された、発見コホートにおけるすべての症例を使用し、トラスツズマブで処置された症例（アーム１および３）のみを使用して訓練された処置前ＤＳＰタンパク質に対するマーカー係数を比較する相関プロットを提供する。

【0060】

【図54】図５４は、様々な実施形態に従って生成された、トラスツズマブ（アーム１および３）で処置された症例のみを使用して訓練された、Ｌ２正則化処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質モデルにおける各マーカーの係数を示すプロットを提供する。

【0061】

【図55】図５５は、様々な実施形態に従って生成された、ＤＳＰタンパク質マーカーパネル由来のＨＥＲ２およびＣＤ４５を使用した、発見（訓練）コホート（ｎ＝２３、交差検証によって評価）および検証（試験）コホート（ｎ＝２８、訓練試験によって評価）における処置中プラス処置前Ｌ２正則化分類指標のＲＯＣ曲線を提供する。

【0062】

【図56】図５６は、様々な実施形態に従って生成された、ＣＤ４５およびＨＥＲ２のみを使用して訓練された、Ｌ２正則化処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質モデルにおける各マーカーの係数を示すチャートを提供する。

【0063】

【図57】図５７は、様々な実施形態に従って生成された、ＤＳＰタンパク質マーカーパネル由来のＣＤ４５を使用した、発見（訓練）コホート（ｎ＝２３、交差検証によって評価）および検証（試験）コホート（ｎ＝２８、訓練試験によって評価）における処置中プラス処置前Ｌ２正則化分類指標のＲＯＣ曲線を提供する。

【0064】

【図58】図５８は、様々な実施形態に従って生成された、ＣＤ４５のみを使用して訓練されたＬ２正則化処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質モデルにおける各マーカーの係数を示すチャートを提供する。

【0065】

【図59】図５９は、様々な実施形態に従って生成された、ＤＳＰタンパク質マーカーパネル由来のＣＤ４５を使用した、発見（訓練）コホート（ｎ＝２３、交差検証によって評価）および検証（試験）コホート（ｎ＝２８、訓練試験によって評価）における処置中Ｌ１正則化分類指標のＲＯＣ曲線を提供する。

【0066】

【図60】図６０は、様々な実施形態に従って利用される、キャレット（＾）によって示される発見コホートにおけるシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）＜３を有するマーカーの表を提供し、検証コホートにおけるＳＮＲ＜３を有するマーカーは、アスタリスク（＊）によって示される。

【発明を実施するための形態】

【0067】

詳細な説明
ここで図面およびデータを参照すると、癌の予測されたｐＣＲに基づいて病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を予測し、ＨＥＲ２＋乳癌を処置する方法が提供される。当該分野で理解されているように、病理学的完全奏効は、ネオアジュバント化学療法の完了後の乳房組織におけるすべての浸潤性癌の消失として定義される。多数の実施形態は、乳癌と診断された患者の１またはそれを超える腫瘍生検を評価することに関する。いくつかの実施形態では、個体は、ＨＥＲ２＋乳癌と診断される。いくつかの実施形態では、腫瘍生検の分子評価は、任意の処置（すなわち、処置前）の前に行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍生検の分子評価は、ネオアジュバント処置中に起こり得る標的療法の開始後（本明細書では処置中時点とも呼ばれる）に行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍生検の分子評価は、標的療法の開始直後（例えば、開始後約４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間または１６８時間）に行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍生検の分子評価は、標的療法の第１サイクルの完了直後（例えば、最初のサイクルの完了後約４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間）に行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍生検の分子評価は、標的療法の任意の処置前と開始後の両方で行われる。いくつかの実施形態では、標的療法の開始後の生体分子発現を使用してｐＣＲを予測する。これらの実施形態のいくつかでは、任意の処置前および標的療法の１サイクル後に生じる生体分子発現の変化を使用してｐＣＲを予測する。いくつかの実施形態では、標的療法の開始後の免疫浸潤細胞の組織学的評価を使用して、ｐＣＲを予測する。

【0068】

複数の実施形態によれば、処置は、処置をエスカレーションまたはデ・エスカレーションするために利用することができるｐＣＲを達成するためのネオアジュバント治療に対する応答の可能性によって決定される。いくつかの実施形態では、ネオアジュバント治療は、その後の治療（例えば、手術）の前に腫瘍サイズを縮小させるために使用される。いくつかの実施形態では、ネオアジュバント治療がｐＣＲを達成すると予測される場合、（例えば）ＨＥＲ２を対象とした標的処置を全身化学療法なし（すなわち、非標的化学療法）で投与するなど、デ・エスカレーションされた処置が利用される。標的処置としては、（限定されないが）トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的化学療法剤が使用される（例えば、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ－ＤＭ１））。多くの実施形態では、ネオアジュバント治療がｐＣＲをもたらすと予測されない場合、（例えば）ネオアジュバントおよび／またはアジュバントの状況を含む化学療法および／または二重標的療法による標的処置などのエスカレーションされた処置レジメンを投与することができる。化学療法剤としては、（限定されないが）パクリタキセル（タキソール）を含むタキサン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）を含むアントラサイクリン、シクロホスファミド、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0069】

最近の発見に基づいて、標的療法の開始後の特定の腫瘍および免疫生体分子の発現とｐＣＲとの関連が現在認識されており、処置および監視の過程を示している。したがって、実施形態は、乳癌によく適した処置レジメンを決定するために、標的処置によってｐＣＲを達成する可能性に基づいて乳癌を分類することに関する。

【0070】

分子応答によって決定される乳癌の処置
いくつかの実施形態は、標的処置（特にネオアジュバント標的処置）後のｐＣＲの可能性で乳癌を分類することに関する。いくつかの実施形態では、乳癌分類は、標的処置の開始後に決定される腫瘍生検における生体分子発現に基づく。いくつかの実施形態によれば、特定の生体分子発現パターンは、乳癌がｐＣＲを達成する高い可能性を有するかどうかを示す。いくつかの実施形態では、乳癌分類は、標的療法の開始後の免疫浸潤細胞の組織学的評価に基づく。いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫浸潤細胞の評価は、発現の変化および／または免疫細胞浸潤の変化を決定することができるように、標的処置の処置前および開始後に決定される。ｐＣＲ可能性の分類に基づいて、いくつかの実施形態は、乳癌における一連の処置を決定する。

【0071】

図１には、標的療法の開始後の生体分子の発現および／または免疫細胞の浸潤に基づいて個体の乳癌を分類する方法が提供されており、これはｐＣＲの可能性を示し、したがって癌はそれに応じて処置される。いくつかの実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２＋である。プロセス１００は、標的処置の開始後に、いくつかの生体分子の発現を測定すること１０１、および／または乳癌の免疫細胞浸潤を評価することから始まる。いくつかの実施形態では、乳癌生検を利用して生体分子発現および／または免疫細胞浸潤分析を行う。いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤分析は、生検の特定関心領域で行われる。いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤分析は、腫瘍細胞と浸潤免疫細胞とが相互作用している領域で行われる。いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤分析は、パンサイトケラチン陽性（ｐａｎＣＫ＋）腫瘍細胞を有する領域で行われ、これは腫瘍細胞と直接相互作用している浸潤免疫細胞を示す。いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤分析は、汎白血球マーカーであるＣＤ４５－陽性（ＣＤ４５＋）免疫細胞を有する領域で行われる。

【0072】

いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤は、標的処置の開始後に決定される。適切な処置過程を決定し、投与することができるように、初期処置中に生体分子発現および／または免疫細胞浸潤を決定することが有利である。様々な実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤は、処置開始後かつ１サイクルの完了前、１サイクルの処置後かつ第２サイクルの処置前、少なくとも１つのサイクルの処置後かつ第３サイクルの処置前、少なくとも１つのサイクルの処置後かつ第４サイクルの処置前、またはそれらの任意の組み合わせで決定される。いくつかの実施形態では、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤は、任意の標的処置の前に処置前で決定される。複数の実施形態によれば、生体分子発現および／または免疫細胞浸潤が複数の時点で決定される場合、生体分子発現の動態を決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、生体分子発現の変化および／または免疫細胞浸潤の処置前から処置の第１サイクル後までの変化。いくつかの実施形態では、線形混合効果モデルを利用して、処置前から処置の第１サイクル後までの生体分子発現の動態を定量化する。前述のように、標的処置としては、（限定されないが）トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0073】

ここで、本明細書に記載されるように、いくつかの生体分子が、乳癌がｐＣＲを達成する可能性が高いかどうかの指標を提供することが理解される。一般に、ＨＥＲ２シグナル伝達および免疫活性化に関連する生体分子を検出および測定することができる。最近の知見に基づいて、以下のＨＥＲ２シグナル伝達経路生体分子（ＲＮＡまたはタンパク質）：ＨＥＲ２、ＡＫＴ／ｐ－ＡＫＴ、Ｓ６／ｐ－Ｓ６、ＰＴＥＮ、ｐ－ＥＲＫおよびｐ－ＳＴＡＴ３の測定は、乳癌が（ネオアジュバント治療の全過程の後）ｐＣＲを達成するかどうかの指標を提供することが見出された。同様に、上皮腫瘍組織内に発現した生体分子の測定値は、乳癌が（ネオアジュバント治療の全過程の後）ｐＣＲを達成するかどうかの指標を提供することが分かった：ＰａｎＣＫ、Ｋｉ６７、およびベータ－カテニン。一般に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路生体分子の減少は、ｐＣＲを示す。同様に、以下の免疫応答および活性化生体分子（ＲＮＡまたはタンパク質）：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＯ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、グランザイムＢ、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ１４、ＳＴＩＮＧ、ＰＤ１／ＰＤＬ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ－１、Ｌａｇ３およびＶＩＳＴＡの測定は、乳癌が（ネオアジュバント治療の全過程の後）ｐＣＲを達成するかどうかの指標を提供することが分かった。一般に、免疫応答および活性化生体分子の増加は、ｐＣＲを示す。さらに、以下の細胞生存生体分子（ＲＮＡまたはタンパク質）：ベータ－２ミクログロブリンおよびＢｃｌ－２の測定は、乳癌が（ネオアジュバント治療の全過程の後に）ｐＣＲを達成するかどうかの指標を提供することが分かった。乳癌がｐＣＲを達成するかどうかの指標を提供する他の生体分子測定を行うことができることを理解されたい。

【0074】

ＨＥＲ２、Ｋｉ６７、ｐＳ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＳＴＩＮＧ、ＶＩＳＴＡおよびＣＤ６６Ｂを含む多くの生体分子が、ｐＣＲ状態の予測に大きく寄与することを見つけ出した。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１またはそれを超えるＨＥＲ２、Ｋｉ６７、ｐＳ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＳＴＩＮＧ、ＶＩＳＴＡおよびＣＤ６６Ｂ生体分子発現測定が、ｐＣＲ状態を予測するために決定される。

【0075】

腫瘍組織への免疫細胞の浸潤はまた、乳癌がｐＣＲを達成する可能性が高いかどうかの指標を提供することが、さらに理解される。一般に、リンパ球および他の免疫細胞は、組織学または免疫染色技術によって評価することができる。いくつかの実施形態では、癌生検をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、浸潤する免疫細胞を計数することができる。いくつかの実施形態では、Ｈ＆Ｅ染色癌生検を評価して、間質性腫瘍浸潤リンパ球（ｓＴＩＬ）または腫瘍内リンパ球（ｉＴｕ－Ｌｙ）の浸潤を定量する。いくつかの実施形態では、癌生検は、浸潤リンパ球の数を決定するために抗ＣＤ４５抗体および／または抗ＣＤ５６で免疫染色することによって評価することができる。免疫染色は、発色免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光、または元素同位体染色（例えば、抗体標識元素同位体）を含む（ただしこれらに限定されない）多くの方法で行うことができる。

【0076】

多くの実施形態では、生体分子発現測定値および／または免疫細胞浸潤の評価は、腫瘍生検の少なくとも１つの領域で行われる。いくつかの実施形態では、生体分子発現測定および／または免疫細胞浸潤の評価を腫瘍生検の少なくとも２つの領域で行い、測定値を適切な方法（例えば、和、平均、中央値、標準誤差、標準偏差、重み付け）で組み合わせる。生体分子発現測定を行うための腫瘍生検内の関心領域は、任意の適切な方法によって決定することができる。いくつかの実施形態では、関心領域は、腫瘍細胞の同定、浸潤免疫細胞の同定、またはそれらの組み合わせによって決定される。いくつかの実施形態では、関心領域は、ｐａｎＣＫ＋発現によって決定される。いくつかの実施形態では、関心領域は、ＣＤ４５＋発現によって決定される。

【0077】

図示のように、プロセス１００はまた、生体分子発現測定値および／または浸潤免疫細胞データを分類指標モデルへの入力として利用して、乳癌が、標的処置後にｐＣＲを有する可能性が高いまたは有する可能性がないとして、分類する（１０３）。生体分子発現測定値および／または浸潤免疫細胞データを利用してｐＣＲの分類を提供することができる任意の適切な分類指標を利用することができる。いくつかの実施形態では、分類指標は、回帰モデルである。回帰モデルとしては、（限定されないが）線形、ロジスティック、多項式、リッジ、段階的、ＬＡＳＳＯ、ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ、Ｌ１正則化、Ｌ２正則化、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。様々な実施形態において、分類指標は、一般化線形モデル（ＧＬＭ）、通常の最小二乗法、ランダムフォレスト、決定木またはニューラルネットワークのうちの１つである。モデルは、１またはそれを超える時点で測定された生体分子および／または浸潤免疫細胞データを有した個体のコレクションを利用して訓練することができ、一連の処置（特にネオアジュバント処置）後のｐＣＲを決定した。したがって、様々な実施形態では、ベースラインおよび／または標的処置の開始後に腫瘍生検から測定された生体分子および／または浸潤免疫細胞データを評価された乳癌（例えば、ＨＥＲ２＋）を有する個体のコレクションを利用して、ｐＣＲを予測するモデルを訓練することができる。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、個体がデ・エスカレーションされた処置を受けるべきかどうかを決定するように訓練される。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、個体がエスカレーションされた処置を受けるべきかどうかを決定するように訓練される。

【0078】

いくつかの実施形態では、ベースラインおよび標的処置の開始後に腫瘍生検から測定された生体分子および／または浸潤免疫細胞データを評価された乳癌を有する個体のコレクションで、動的測定を利用してｐＣＲを予測するモデルを訓練することができる。添付の原稿に詳述されているように、標的処置の開始後の静的生体分子発現測定および／または浸潤免疫細胞データと、ベースラインから標的処置の開始後までの動的生体分子発現測定の両方は、それぞれｐＣＲの有意な予測を提供し、回帰モデルの特徴として利用することができる。追加の特徴は、処置タイプ、ＥＲ状態、ＰＡＭ５０状態、腫瘍サイズ、腫瘍グレード、癌ステージ、患者の年齢、および患者の民族性を含む（ただしこれらに限定されない）回帰モデルで利用することができる。

【0079】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、１またはそれを超える生体分子発現測定値および／または浸潤免疫細胞データのセットに基づいてｐＣＲを分類するように訓練することができる。生体分子発現測定および／または浸潤免疫細胞データとしては、（これらに限定されないが）単一領域の発現レベルおよび／または浸潤データ、複数領域にわたる平均発現、複数領域にわたる合計発現、複数領域にわたる中央値発現、複数領域にわたる標準誤差発現、および複数領域にわたる標準偏差発現が挙げられる様々な実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２シグナル伝達経路生体分子、上皮腫瘍生体分子、免疫応答および活性化生体分子、細胞生存生体分子、浸潤免疫細胞データ、またはそれらの組み合わせを利用する。したがって、分類指標モデルは、以下の生体分子：ＨＥＲ２、ＡＫＴ／ｐ－ＡＫＴ、Ｓ６／ｐ－Ｓ６、ＰＴＥＮ、ｐ－ＥＲＫ、ｐ－ＳＴＡＴ３、ＰａｎＣＫ、Ｋｉ６７、ベータ－カテニン、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＯ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、グランザイムＢ、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ１４、ＳＴＩＮＧ、ＰＤ１／ＰＤＬ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＩＤＯ－１、Ｌａｇ３、ＶＩＳＴＡ、ベータ－２ミクログロブリンおよびＢｃｌ－２のうちの１を超える測定値のセットを利用することができる。同様に、モデルは、Ｈ＆Ｅ染色または免疫染色によって決定される浸潤免疫細胞データを利用することができる。

【0080】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２の発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、Ｋｉ６７の発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ｐＳ６の発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５の発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ５６の発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＳＴＩＮＧの発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＶＩＳＴＡの発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ６６Ｂの発現を含む１またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。

【0081】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびＫｉ６７の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびｐＳ６の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびＣＤ４５の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびＣＤ５６の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびＳＴＩＮＧの発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびＶＩＳＴＡの発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２およびＣＤ６６Ｂの発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。

【0082】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびＨＥＲ２の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびＫｉ６７の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびｐＳ６の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびＣＤ５６の発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびＳＴＩＮＧの発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびＶＩＳＴＡの発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５およびＣＤ６６Ｂの発現を含む２またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。

【0083】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＫｉ６７の発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびｐＳ６の発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＣＤ５６の発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＳＴＩＮＧの発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＶＩＳＴＡの発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＣＤ６６Ｂの発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。

【0084】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＥＲ２の発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＫｉ６７の発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびｐＳ６の発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＳＴＩＮＧの発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＶＩＳＴＡの発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＣＤ６６Ｂの発現を含む３またはそれを超える生体分子発現測定値のセットを利用する。

【0085】

いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、浸潤免疫細胞の定量化を利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ｓＴＩＬの定量化を利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、ｉＴｕ－Ｌｙの浸潤グレードスコアを利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、定量化ＣＤ４５＋細胞を利用する。いくつかの実施形態では、分類指標モデルは、定量化ＣＤ５６＋細胞を利用する。

【0086】

いくつかの実施形態では、分類指標の感度、特異性、および曲線下面積（ＡＵＣ）メトリックは、所望の性能を達成するように変更することができる。場合によっては、各個体が適切に処置されることを確実にするために個体のロバストな分類を確実にするために、より高い特異性が所望され得る。場合によっては、検出限界がより低くなり、真の陽性結果を見逃す数が減少するように、より高い感度が望まれる。したがって、様々な実施形態において、特異性は、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、またはそれらの間に設定される。また、様々な実施形態において、感度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、またはそれらの間に設定される。

【0087】

癌の分類に基づいて、ＨＥＲ２＋乳癌は、それに応じて処置される１０５。いくつかの実施形態では、ｐＣＲが示されるとき、デ・エスカレーションされた処置レジメン、例えば（例えば）全身化学療法を伴わないＨＥＲ２に対する標的処置レジメン（すなわち、非標的化化学療法）が投与される。標的処置としては、（限定されないが）トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的化学療法剤が、使用される（例えば、Ｔ－ＤＭ１）。多くの実施形態では、ｐＣＲが示されない場合、（例えば）化学療法レジメンまたは二重標的処置レジメン（すなわち、２つの標的治療薬）による標的処置などのエスカレーションされた処置レジメンが投与される。化学療法剤としては、（限定されないが）パクリタキセル（タキソール）を含むタキサン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）を含むアントラサイクリン、シクロホスファミド、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0088】

乳癌を分子的に分類および処置するためのプロセスの具体例を上に記載したが、当業者は、本発明のいくつかの実施形態によれば、プロセスの様々なステップを異なる順序で行うことができ、特定のステップが任意であり得ることを理解することができる。したがって、プロセスの様々なステップを特定の用途の要件に適切に使用できることは明らかである。さらに、所与の用途の要件に適した分子的に分類および処置するための様々なプロセスのいずれも、様々な実施形態に従って利用することができる。

【0089】

生体分子発現を測定する方法
生体分子発現は、当業者によって理解されるように、様々な実施形態によるいくつかの方法によって検出および測定することができる。いくつかの実施形態では、乳癌腫瘍を患者から生検または外科的に切除し、固定し、生体分子発現の検出および測定のために調製する。ホルムアルデヒド、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、メタノール、エタノール、ＯＣＴ包埋および瞬間凍結を含む（ただしこれらに限定されない）任意の適切な固定方法を利用することができる。

【0090】

腫瘍の関心領域における生体分子を検出および測定することは、腫瘍のバルクＲＮＡプロファイリングよりも良好なｐＣＲの予測を提供し得ることが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、関心領域または特定の細胞型が、同定され、生体分子検出および測定技術に使用される。いくつかの実施形態では、生体分子の検出および測定を関心領域上で直接行うことができる顕微鏡法を用いて関心領域を同定することができるように、組織を抗体で処理および／または染色する。いくつかの実施形態では、関心領域は、ｐａｎＣＫ＋腫瘍細胞によって同定される。いくつかの実施形態では、関心領域は、ＣＤ４５＋免疫細胞によって同定される。いくつかの実施形態では、生体分子発現を決定するために多重空間組織分析が行われる。いくつかの実施形態では、生組織または固定組織を抗体で処理し、および／または単離細胞を使用して検出および測定のために生体分子を抽出することができるフローサイトメトリーによって細胞型を同定および単離できるように染色する。

【0091】

多くの実施形態では、多重空間組織分析を利用して、固定組織の関心領域におけるタンパク質および／またはＲＮＡ発現を検出する。いくつかの実施形態では、タンパク質およびＲＮＡの発現は、固定組織の関心領域で同時に評価される。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇのＧｅｏＭｘ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ＤＳＰ）（ワシントン州シアトル）、Ａｋｏｙａ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＣＯＤＥＸ（カリフォルニア州メンロパーク）、Ａｋｏｙａ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＶｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ、Ｈａｒｖａｒｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅの周期的免疫蛍光法（ＣｙＣＩＦ）（マサチューセッツ州ボストン）、ＩｏｎＰａｔｈの多重Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｉｏｎ Ｂｅａ Ｉｍａｇｉｎｇ（ＭＩＢＩ）（カリフォルニア州メンロパーク）、Ａｋｏｙａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｐａｌキット、Ｒｏｃｈｅ－ＶｅｎｔａｎａのＤＩＳＣＯＶＥＲＹシステム（アリゾナ州オロバレー）、およびＧｅｎｏｔｉｐｉｘ－ＨｉｓｔｏＲｘの自動定量分析（ＡＱＵＡ）（ニューヘイブン、コネチカット州）を含む（ただしこれらに限定されない）、多重空間組織分析を行うための多数の方法論およびキットがある。一般に、これらのシステムは、関心領域内の複数の生体分子を検出することができる。組織を分析するためのプロトコルのさらなる総説は、Ｅ．Ｒ．Ｐａｒｒａ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｄｉａｇｎ．２０１８，２，４３－５３、ならびにＥ．Ｒ．Ｐａｒｒａ，Ａ．Ｆｆａｎｃｉｓｃｏ－Ｃｒｕｚ、およびＩ．Ｉ．Ｗｉｓｔｕｂａ Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１９，１１，Ｅ２４７に見出すことができ、これらの開示はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

【0092】

多重空間組織分析の一例は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇのＧｅｏＭｘ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ＤＳＰ）であり、これは、ＲＮＡ発現のためのオリゴのパネルおよび／またはペプチド発現のための抗体を利用して、選択された領域におけるＲＮＡまたはペプチドの発現を検出することができる。この機械の詳細およびこの機械を利用する方法は、例示的な実施形態に記載されている。一般に、同定された関心領域（例えば、ｐａｎＣＫ＋領域）を選択し、抗体および／またはプローブのパネルを、関心領域でインキュベートして、目的の生体分子を結合および同定する。インキュベーション後、次いで、過剰な未結合試薬を洗い流す。パネル内の各抗体およびプローブは、バーコードとして使用されるオリゴテールが付着している。オリゴテールバーコードは、ＵＶ照射によって放出可能である。生体分子の付着および洗浄後、ＵＶ光はバーコードを放出し、次いでこれをＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒを用いて検出および測定し、これにより目的の生体分子の相対濃度（対照に対して正規化）を決定する。

【0093】

生体分子の抽出が行われる実施形態では、生物源から生体分子を抽出するためのいくつかの方法が周知である。一般に、生体分子は、細胞または組織から抽出され、次いで、さらなる分析のために準備される。あるいは、生体分子は、典型的には固定され、さらなる分析のために準備される細胞内で観察することができる。直接検査のために生体分子を抽出するか組織を固定するかの決定は、実行されるアッセイに依存する。一般に、イン・サイチュハイブリダイゼーションおよび組織学試料は固定組織で行われるが、核酸増殖技術（例えば、配列決定）およびタンパク質定量化技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、抽出された生体分子を利用して行われる。

【0094】

いくつかの実施形態では、生体分子を調べるために利用される細胞は、生検で直接抽出または分析することができる乳癌の新生物細胞および／または浸潤免疫細胞である。いくつかの実施形態では、（例えば）原発性、結節性および／または遠位腫瘍などの固形腫瘍生検が利用される。いくつかの実施形態では、関心領域は、腫瘍細胞（例えば、パンサイトケラチン－陽性（ｐａｎＣＫ＋）腫瘍細胞）、浸潤免疫細胞（例えば、ＣＤ４５－陽性（ＣＤ４５＋））、またはそれらの組み合わせを検出することによって決定される。関心領域を同定するため、または特定の細胞型を単離するための任意の適切な手段またはバイオマーカーが、様々な実施形態に従って利用され得ることが理解されるべきである。

【0095】

ハイブリダイゼーション技術、核酸増殖技術、配列決定、抗体検出、および質量分析を含む（ただしこれらに限定されない）いくつかのアッセイは、生物学的試料における生体分子発現を決定するために公知である。イン・サイチュハイブリダイゼーション、マイクロアレイ（例えば、カリフォルニア州サンタクララのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、およびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ（ワシントン州シアトル）を含む（ただし、これらに限定されない）いくつかのハイブリダイゼーション技術を使用することができる。同様に、ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲを含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの核酸増殖技術を使用することができる。さらに、腫瘍組織のゲノム配列決定、エクソーム配列決定、標的遺伝子配列決定、サンガー配列決定、およびＲＮＡ－ｓｅｑを含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの配列決定技術を使用することができる。イン・サイチュ組織学／免疫組織化学、免疫蛍光染色および周期的免疫蛍光染色、ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロットを含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの抗体技術を使用することができる。

【0096】

当技術分野で理解されているように、陽性検出を得るためには、ゲノム遺伝子座、遺伝子またはペプチドの一部のみを検出する必要があり得る。多くのハイブリダイゼーション技術において、検出プローブは、典型的には１０塩基～５０塩基であるが、正確な長さは、アッセイ条件およびアッセイ開発者の選好に依存する。多くの増幅技術では、アンプリコンは５０～１０００塩基であることが多く、これもアッセイ条件およびアッセイ開発者の選好に依存する。多くの配列決定技術では、ゲノム遺伝子座および転写物は、１０～数百塩基の配列リードで同定され、これもアッセイ条件およびアッセイ開発者の選好に依存する。多くの抗体技術では、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が使用され得る。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション、標的化配列決定および抗体検出技術は、乳癌のｐＣＲの指標を与えるものなどの、いくつかの目的の遺伝子の配列を対象とする。

【0097】

遺伝子配列および／またはアッセイツール（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、増幅プライマー）においてわずかな変異が存在し得るが、検出アッセイにおいて同様の結果を提供することが予想されることを理解されたい。これらの小さな変異には、（限定されないが）挿入、欠失、一塩基多型、およびアッセイ設計による他の変異が含まれる。いくつかの実施形態では、検出アッセイは、高い相同性を有するが完全な相同性を有さない（例えば、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の相同性）ゲノム遺伝子座および転写物を検出することができる。いくつかの実施形態では、検出アッセイは、変化した、欠失したか、もしくは挿入された１塩基対、変化した、欠失したか、もしくは挿入された２塩基対、変化した、欠失したか、もしくは挿入された３塩基対、変化した、欠失したか、もしくは挿入された４塩基対、変化した、欠失したか、もしくは挿入された５塩基対、または変化した、欠失したもしくは挿入された５を超える塩基対を有するゲノム遺伝子座および転写物を検出することができる。当技術分野で理解されているように、ハイブリダイゼーションに使用される核酸ポリマーが長いほど、ハイブリダイゼーションが起こるために必要な相同性は低くなる。

【0098】

いくつかの遺伝子転写物は、発現されるいくつかのアイソフォームを有することも理解されるべきである。当技術分野で理解されているように、多くの代替アイソフォームは、分子分類、したがって転移能の同様の指標を与えると理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子転写物の代替アイソフォームも包含される。

【0099】

浸潤免疫細胞の評価
浸潤免疫細胞は、当業者によって理解されるように、様々な実施形態によるいくつかの方法によって検出および評価することができる。いくつかの実施形態では、乳癌腫瘍は、患者から生検または外科的に切除され、固定され、免疫細胞浸潤の検出および評価のために調製される。ホルムアルデヒド、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、メタノール、エタノール、ＯＣＴ包埋および瞬間凍結を含む（ただしこれらに限定されない）任意の適切な固定方法を利用することができる。

【0100】

腫瘍の関心領域における浸潤免疫細胞の検出および評価は、ｐＣＲのロバストな予測を提供し得ることが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、関心領域または特定の細胞型は、同定され、浸潤免疫細胞の検出および評価技術に使用される。いくつかの実施形態では、浸潤免疫細胞の検出および評価を関心領域上で直接行うことができる顕微鏡法によって関心領域を同定することができるように、組織は抗体で処理され、および／または染色される。いくつかの実施形態では、関心領域は、ｐａｎＣＫ＋腫瘍細胞によって同定される。いくつかの実施形態では、関心領域は、ＣＤ４５＋免疫細胞によって同定される。

【0101】

多くの実施形態において、組織学的分析は、組織学的染色および／または免疫染色によって行われる。いくつかの実施形態では、癌生検をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、浸潤する免疫細胞を計数することができる。いくつかの実施形態では、Ｈ＆Ｅ染色癌生検を評価して、間質性腫瘍浸潤リンパ球（ｓＴＩＬ）または腫瘍内リンパ球（ｉＴｕ－Ｌｙ）の浸潤を定量する。典型的には、ｓＴＩＬは、関心領域内の全細胞のｓＴＩＬの割合によって決定される０～１００％のスコアとして定量化される。ｉＴｕ－Ｌｙは、典型的には、半定量的浸潤グレード（０～３）によってスコア化される。いくつかの実施形態では、癌生検は、浸潤リンパ球の数を決定するために抗ＣＤ４５抗体および／または抗ＣＤ５６で免疫染色することによって評価することができる。免疫染色は、発色免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光、または元素同位体染色（例えば、抗体標識元素同位体）を含む（ただしこれらに限定されない）多くの方法で行うことができる。浸潤リンパ球は、いくつかの方法で、典型的にはパーセンテージとして定量化することができる。いくつかの実施形態では、浸潤リンパ球は、関心領域における全細胞のパーセンテージとして定量される。いくつかの実施形態では、浸潤リンパ球は、全リンパ球のパーセンテージ（例えば、腫瘍組織中のリンパ球の数を腫瘍および周囲組織中のリンパ球の総数で割ったもの）として定量される。いくつかの実施形態では、浸潤リンパ球は、面積（例えば、ｍｍ^２）当たりのカウント数として定量化される。様々な実施形態において、組織学的分析は、病理学者および／または自動画像分析機によって行われる。浸潤する免疫細胞の組織学的分析の詳細については、Ｒ．Ｓａｌｇａｄｏら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ ２６（２）：２５９－７１、およびＣ．Ｄｅｎｋｅｒｔら、Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．２０１６ Ｏｃｔ；２９（１０）：１１５５－６４を参照されたい。その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0102】

キット
いくつかの実施形態では、キットは、乳癌が標的処置後にｐＣＲを達成する可能性が高いかどうかを決定するために利用される。キットを使用して、本明細書に記載の生検の関心領域におけるバイオマーカーの発現を検出することができる。例えば、キットは、ｐＣＲの可能性を決定するために使用することができる、本明細書に記載の遺伝子バイオマーカーのうちの１またはそれを超えるいずれかを検出するために使用することができる。キットは、生体分子発現を決定するための１またはそれを超える薬剤、免疫細胞の浸潤を評価するための１またはそれを超える薬剤、対象から得られた生物学的試料（例えば、生検）を採取するための容器、生物学的試料（例えば、ＦＦＰＥのための試薬および材料）を固定および調製するための適切な手段、および関心領域を同定するための試薬、ならびに薬剤を生物学的試料と反応させて試料に由来するバイオマーカー遺伝子の発現を検出するための印刷された説明書を含み得る。薬剤は、別々の容器に包装されてもよい。キットは、生化学アッセイ、酵素アッセイ、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたは配列決定アッセイを実施するための１またはそれを超える対照参照試料および試薬をさらに含み得る。

【0103】

いくつかの実施形態では、キットは、目的の生体分子を検出および測定するために使用される。核酸検出キットは、様々な実施形態によれば、ゲノム遺伝子座および／または発現転写物のセットに特異的なハイブリダイゼーション可能な相補配列および／または増幅プライマーのセットを含む。いくつかの例では、キットは、ゲノム遺伝子座および／または発現転写物のセットの検出および／または定量化を容易にするのに十分なさらなる試薬を含むであろう。いくつかの例では、キットは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０個の生体分子の発現を検出および／または定量することができるであろう。いくつかの例では、キットは、配列決定技術を用いて数千またはそれを超える生体分子の発現を検出および／または定量することができるであろう。

【0104】

いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション可能な補体配列のセットは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＩｌｌｕｍｉｎａによって設計されたものなどのアレイ上に固定化される。多くの実施形態において、ハイブリダイゼーション可能な相補配列のセットは、ハイブリダイズした種の検出を促進するために「バーコード」に連結され、ハイブリダイゼーションが溶液中で、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって設計されたもの中で行われ得るように提供される。いくつかの実施形態では、増幅された種の増幅および検出を促進するためのプライマーのセット（場合によっては、プローブ）が、ＰＣＲが、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州フォスターシティ）によって設計されたものなどの溶液中で行われ得るように提供される。

【0105】

キットは、キットに含まれる組成物用の１またはそれを超える容器を含むことができる。組成物は、液体形態であり得るか、または凍結乾燥され得る。組成物に適した容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成することができる。キットはまた、腫瘍生検の生体分子発現を決定する方法のための書面の説明書を含む添付文書を含むことができる。
ＨＥＲ２＋乳癌に対する適用および処置

【0106】

様々な実施形態は、癌が標的処置、特に短期標的処置後にｐＣＲを達成する可能性が高いかどうかの指標に基づく乳癌診断および処置を対象とする。本明細書に記載されるように、予後診断手順は、生検の関心領域を利用して、生体分子発現および／または免疫細胞活性化、特にＨＥＲ２＋シグナル伝達ならびに免疫応答および活性化に関連する生体分子を検出および決定することができる。生体分子発現および／または免疫細胞活性化ならびに訓練された分類指標を使用して、乳癌を、標的処置単独ではｐＣＲを達成する可能性が低いｐＣＲを達成する可能性が高いと分類する。ｐＣＲを達成する可能性に基づいて、個体に適切な処置を投与することができる。

【0107】

診断指標および処置
いくつかの実施形態は、標的処置の開始後に乳癌を処置する方法の診断指標を得ることを対象とする。いくつかの実施形態では、乳癌を有する個体からの標的処置の開始後に癌生検を抽出し、生検をさらに分析する。

【0108】

いくつかの実施形態では、以下のように乳癌患者に対して診断指示を実施することができる。
ａ）少なくとも１つのサイクルの標的処置を行う
ｂ）生検を抽出する
ｃ）１またはそれを超えるバイオマーカーのセットの静的および／または動的発現を決定する
ｄ）標的処置単独でｐＣＲを提供できるかどうかを診断し、適切な処置戦略を決定する

【0109】

いくつかの実施形態では、乳癌が標的処置でｐＣＲを達成できるかどうかの指標が得られると、デ・エスカレーションされた処置が投与される。いくつかの実施形態では、ｐＣＲが乳癌に適応される場合、特にネオアジュバント設定において、全身化学療法なし（すなわち、非標的化学療法）で標的処置が投与される。いくつかの実施形態では、乳癌はＨＥＲ２＋であり、標的処置はＨＥＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、標的化学療法剤が、使用される（例えば、Ｔ－ＤＭ１）。標的ＨＥＲ２処置としては、（限定されないが）トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、Ｔ－ＤＭ１、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。多くの実施形態では、ｐＣＲが乳癌に適応されない場合、エスカレーションされた処置がネオアジュバントおよび／またはアジュバント設定で投与される。いくつかの実施形態では、ｐＣＲが示されない場合、化学療法による標的処置が投与される。いくつかの実施形態では、ｐＣＲが示されない場合、化学療法による二重標的処置が投与される。化学療法剤としては、（限定されないが）パクリタキセル（タキソール）を含むタキサン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）を含むアントラサイクリン、シクロホスファミド、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0110】

いくつかの実施形態では、診断は。閾値に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、閾値は、分類指標の感度、特異性、および／または曲線下面積（ＡＵＣ）メトリックによって決定される。場合によっては、各個体が適切に処置されることを確実にするために、個体のロバストな分類を確実にするために、より高い特異性を有する閾値が所望され得る。例えば、ｐＣＲを達成する可能性が高いとして個体を分類する場合、高い特異性を有することが望ましい場合がある。個体がｐＣＲを達成する可能性が高いが、代わりにネオアジュバント処置からｐＣＲを達成することができないと誤って分類された場合、処置レジメンはより厳しい化学療法剤を必要とし、および／または長期化する可能性があり、したがって個体は最初に化学療法による標的処置を受けることがより良好であったであろう。場合によっては、検出限界がより低くなり、真の陽性結果を見逃す数が減少するように、より高い感度が望まれる。したがって、様々な実施形態において、特異性は、約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、またはそれらの間に設定される。また、様々な実施形態において、感度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、またはそれらの間に設定される。

【0111】

具体的な処置レジメンもまた、企図される。いくつかの実施形態では、ｐＣＲが、ＨＥＲ２＋乳癌において示される場合、以下の治療薬の組み合わせが処置レジメンで投与される。
・ トラスツズマブおよびラパチニブ
・ トラスツズマブおよびペルツズマブ
・ Ｔ－ＤＭ１単独
・ Ｔ－ＤＭ１およびペルツズマブ

【0112】

いくつかの実施形態では、ｐＣＲが、ＨＥＲ２＋乳癌について示されない場合、以下の治療薬の組み合わせが処置レジメンで投与される。
・ トラスツズマブ、ペルツズマブ、および化学療法剤
・ Ｔ－ＤＭ１およびペルツズマブ、続いて毎週のパクリタキセル、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド
・ トラスツズマブ、ペルツズマブ、およびタキサン
・ Ｔ－ＤＭ１、ペルツズマブ、およびアントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）

【0113】

特定の治療薬組み合わせは限定的であると考えるべきではなく、標的治療薬および／または化学療法剤のいくつかの組み合わせを投与することができることを理解されたい。

【0114】

当業者によって理解されるように、投薬レジメンおよび治療薬レジメンは、処置されるべき乳癌に対して適切に投与され得る。例えば、以下の投与量を様々な実施形態による処置サイクルで利用することができる。
・ ペルツズマブ：６０分間にわたる８４０ｍｇのＩＶ注入、次いで３０～６０分間にわたる４２０ｍｇのＩＶ注入＋
・ トラスツズマブ：最初に９０分間にわたる８ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入、次いで３０～９０分間にわたる６ｍｇ／ｋｇのＩＶ注入＋
・ パクリタキセル：３時間にわたる１７５ｍｇ／ｍ^２のＩＶ注入
・ ドキソルビシン：６０ｍｇ／ｍ^２のＩＶ注入

【0115】

いくつかの実施形態では、薬物は、一連の処置の一部として治療的有効量で投与される。この文脈で使用される場合、「処置する」とは、処置される障害の少なくとも１つの症状を改善すること、または有益な生理学的効果を提供することを意味する。例えば、症状のそのような改善の１つは、腫瘍サイズの縮小および／またはｐＣＲの達成であり得る。

【0116】

治療的有効量は、乳癌の症状を予防、減少、改善または排除するのに十分な量であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量は、乳癌の成長および／または転移を減少させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、ｐＣＲを達成するのに十分な量である。

【実施例】

【0117】

例示的な実施形態
本発明の実施形態は、その中で提供されるいくつかの例を用いてよりよく理解されるであろう。結腸直腸癌の組み合わせ分子指標を同定するプロセスの多くの例示的な結果が記載されている。検証結果も、提供される。

【0118】

実施例１：ネオアジュバント治療によるＨＥＲ２－陽性乳房腫瘍の空間プロテオミクス特徴付けは、応答を予測する
ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）－陽性乳癌は、浸潤性乳癌の１５～３０％を占め、侵襲性表現型と関連している。ネオアジュバント化学療法へのＨＥＲ２標的薬剤の添加は、初期段階のＨＥＲ２－陽性乳癌における病理学的完全奏効（ｐＣＲ）率を劇的に改善したが、患者の４０～５０％は処置後に残存疾患を有する。逆に、２つの標的薬剤を用いた場合および化学療法を用いない場合のＨＥＲ２阻害は、ｐＣＲをもたらす可能性があり、これは、患者のサブセットにおいて化学療法を排除することが可能であり得ることを示唆している。ＨＥＲ２標的療法に対する応答の指標を提供するバイオマーカーの同定は、ネオアジュバント治療のレジメンを描写するのに役立ち得る。

【0119】

処置前試料のバルク遺伝子発現プロファイリングは、ネオアジュバント設定におけるＨＥＲ２標的療法に対する応答に関連する腫瘍特性（ＨＥＲ２富化内因性サブタイプ、ＨＥＲ２発現レベルおよびＥＳＲ１発現レベル）および微小環境特性（増加した免疫浸潤）を同定している。腫瘍細胞は、共局在化および遠位間質細胞および免疫細胞の両方で同時にプロファイリングされるので、バルク発現プロファイリングは、処置全体にわたる腫瘍および微小環境の変化を分析するための不完全なツールである。特に、悪性腫瘍細胞が線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞と相互作用する複雑な腫瘍エコシステム内の特定の地理的または表現型細胞集団に観察された変化を割り当てることは困難である。さらに、免疫細胞は、腫瘍コアに浸潤するものと、排除されるものとにさらに分けることができる。今のところ、治療中に腫瘍および免疫微小環境がどのように変化するかはあまり理解されておらず、縦方向組織試料の多重化されたイン・サイチュプロファイリングを必要とする。

【0120】

ＧｅｏＭｘ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）技術を使用して、処置前、ラパチニブ、トラスツズマブ、またはその両方からなるＨＥＲ２標的療法の１４～２１日間後（処置中）、およびＨＥＲ２標的療法との併用化学療法の完了後の手術時（処置後）に、腫瘍をサンプリングしたネオアジュバントＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験（Ｓ．Ｈｕｒｖｉｔｚら、ｍｅｄＲｘｉｖ ２０２０．０９．１６．２０１９４３２４（２０２０）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に登録されたＨＥＲ２－陽性乳癌患者２８人の初期発見セットからの保管組織をアッセイした。結果はその後、Ｂ０７臨床試験からの２９人の患者の独立した検証セットで検証された。重要なことに、ネオアジュバント設定は、処置応答の早期評価を可能にし、ｐＣＲは、ＨＥＲ２－陽性疾患の長期生存の強力な代用である（Ｊ．Ｈｕｏｂｅｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１８、１６９～１７７（２０１９）；Ｋ Ｒ．Ｂｒｏｇｌｉｏら、ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ ２，７５１－７６０（２０１６）；およびＰ．Ｃｏｒｔａｚａｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３８４、１６４－１７２（２０１４）；その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＳＰは、癌シグナル伝達経路および腫瘍共局在化免疫微小環境の多重プロテオーム特性評価のための組織領域の地理的および表現型選択を可能にする（Ｍ．Ｉ．Ｔｏｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７７，３８１０（２０１７）；およびＣ．Ｒ．Ｍｅｒｒｉｔｔら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８、５８６～５９９（２０２０）；その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。特に、空間的不均一性は、試料当たり複数のパンサイトケラチン（ｐａｎＣＫ）富化領域にわたって４０個の腫瘍および免疫タンパク質をプロファイリングすることによって、未処置乳腺腫瘍、ならびに一致した処置中の生検および処置後の外科試料における癌シグナル伝達経路および微小環境組成の変化において特徴付けられた。処置中のタンパク質発現は、検証コホートにおける処置応答をロバストに予測したこれらのデータに基づいて、ｐＣＲおよび分類指標を達成するために続いた腫瘍において、劇的に変化した。この新しい空間プロテオミクスバイオマーカーは、このコホートにおけるトランスクリプトームデータに基づくＰＡＭ５０サブタイプおよび分類指標などの確立された予測因子よりも優れており、初期段階のＨＥＲ２－陽性乳癌における治療を個別化するための新しい道を示唆している。

【0121】

結果
未処置ＨＥＲ２－陽性乳腺腫瘍の空間プロテオーム解析
ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験の参加者（初期ＨＥＲ２－陽性乳癌におけるＮＣＴ００７６９４７０）は、トラスツズマブ、ラパチニブ、または両方の薬剤のいずれかを含む１サイクルのネオアジュバントＨＥＲ２標的療法と、それに続く６サイクルの割り当てられたＨＥＲ２標的療法プラス３週間ごとに与えられるドセタキセルおよびカルボプラチン（Ｓ．Ｈｕｒｖｉｔｚら、（２０２０）、上掲）を受けた。ＨＥＲ２標的療法の１４～２１日後に処置前および処置中にコア生検を得て、処置後に外科的切除標本を得た（図２）。最初に、発見コホートには、３つの時点すべてからＦＦＰＥ試料が利用可能であった２８人の患者が含まれていた（処置前、処置中および手術時）。コホートは、ｐＣＲおよびＥＲ状態の両方（図３および図４）についてバランスをとり、すべての探索的分析のために使用した。モデル性能の評価のために、一致した処置前および処置中のＦＦＰＥ試料を有するＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７コホートからの２９人の患者の検証コホートを利用した。

【0122】

ＤＳＰは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片の多重プロテオミクスプロファイリングを可能にし（図５）、関心領域（ＲＯＩ）を地理的特性および表現型特性の両方に基づいて選択することができる。ｐａｎＣＫ富化戦略を用いて、組織標本当たり平均４つの領域にわたって癌細胞および共局在化免疫細胞をプロファイリングした（図６）。ＣＤ４５、ｐａｎＣＫ、およびｄｓＤＮＡは、視覚化のための選択された免疫蛍光マーカー、空間的に分離された領域（図７）、およびタンパク質定量化のためのＵＶ照射を支配するマスクであり、ｐａｎＣＫ免疫蛍光に基づいて生成した。合計で４０の腫瘍および免疫タンパク質を、ＤＳＰを用いてプロファイリングし、ＤＳＰおよび直交技術の両方を用いて評価したタンパク質は、強い一致を示した（図６および図８）。同じ患者からの対になった処置前および処置中のバルク遺伝子発現データを利用して、ＰＡＭ５０サブタイプを推測し、空間的に分解したＤＳＰデータとの比較を可能にした。

【0123】

未処置腫瘍では、免疫マーカー間の相関が顕著であり、複数の免疫細胞亜集団の協調作用が示唆された（図９）。ＨＥＲ２経路メンバーおよび他の下流癌シグナル伝達マーカーも高度に相関していたが、腫瘍マーカーと免疫マーカーとの間の相関はほとんどのマーカー対で最小であった。ＨＥＲ２および汎白血球マーカーＣＤ４５（図１０）を含めて、プロテオミクスレベルでの腫瘍間および腫瘍内変動は、処置前に明らかであった。マーカー当たりの複合スコアを導出するために患者当たりすべてのＲＯＩを平均すると、ベースラインＨＥＲ２レベルは、ＣＤ４５レベルのように、ｐＣＲを達成した腫瘍対達成しなかった腫瘍で類似していることが見出された（平均ｐＣＲ症例：１４．５０、平均非ｐＣＲ症例：１５．００）（平均ｐＣＲ：９．９０、平均非ｐＣＲ：９．６４）。患者によるブロックを伴う線形混合効果モデル（方法）を使用して、ＨＥＲ２およびＣＤ４５を含む個々のＤＳＰタンパク質マーカーは、処置前のｐＣＲ対非ｐＣＲ症例とで有意に異ならないことがさらに見出された（すべてのマーカーについて未調整ｐ＞０．１０）。

【0124】

短期ＨＥＲ２標的療法後の減少した癌シグナル伝達および増加した免疫浸潤
ＤＳＰを使用して、発見コホートにおける処置中（ＨＥＲ２標的療法単独の単一サイクル後）生検をプロファイリングすることによって、短期ＨＥＲ２標的療法中の乳腺腫瘍および免疫マーカーの両方における処置関連変化を調べた。処置中の時点でｐＣＲと最も関連していたタンパク質マーカーは、ＣＤ４５（未調整ｐ＝０．００２４）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞マーカーであるＣＤ５６（未調整ｐ＝０．００５５）であった（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。処置前と比較した処置中のタンパク質レベルの倍率変化を、患者によるブロックを伴う線形混合効果モデルを使用して定量化し、ボルケーノプロットにおけるそれらの倍率変化と比較したすべてのマーカーの有意性（偽発見調整ｐ値）を可視化した。これらの分析は、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐＥＲＫ、Ｓ６およびｐＳ６を含む他の下流経路メンバーを伴うＨＥＲ２およびＫｉ６７の劇的な減少を明らかにし、リン酸化タンパク質は、比較的より多く減少した（図１２）。細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ４５およびＣＤ８を含む免疫マーカーは、処置による発現の最大の増加を示した。注目すべきことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の発現の増加は、細胞型逆重畳積分によりＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７トランスクリプトームデータで同様に観察されたが、処置を介在させずに反復生検を受けた対照アームの不足を考えると、観察された免疫変化がＨＥＲ２標的療法または反復生検に関連するかどうかは不明である。より一般的には、処置時対処置前のバルクトランスクリプトームデータは、タンパク質レベルで見られた変化を反映していたが、倍率変化は減衰していた（図１３）。例えば、ＤＳＰタンパク質マーカーに対応する遺伝子（図１４）を使用すると、ＨＥＲ２、ＡＫＴ、Ｋｉ６７および乳癌関連ケラチン遺伝子（ＫＲＴ７、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ１９）の発現が処置と共に有意に減少し、一方免疫マーカーが増加することが分かった。異なる分析物、測定値、および組織切片の使用にもかかわらず、ＤＳＰタンパク質およびバルクＲＮＡデータセットは、ネオアジュバント処置中の免疫細胞浸潤の増加を伴うＨＥＲ２シグナル伝達および乳癌関連マーカーの減少を一貫して示した。ラパチニブが、ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７治験において、より低いｐＣＲ率と関連していたことを考えると、トラスツズマブ処置症例（アーム１および３、ｎ＝２３）における処置中の変化をさらに評価し、全コホートと同様のパターンが観察された（図１５）。

【0125】

次に、ＨＥＲ２標的療法に対する腫瘍感度に基づいて処置関連変化がどのように異なるかを調べ、ネオアジュバント治療後のｐＣＲの達成に基づいて腫瘍を層別化した（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。ｐＣＲ症例では、多数の免疫マーカーが処置と共に増加したが、非ｐＣＲ症例では、有意な処置関連免疫変化は観察されず、Ｋｉ６７およびＨＥＲ２シグナル伝達の減少は、中程度であった。これらのパターンはまた、タンパク質マーカー相関のペアワイズ比較によって可視化することができ、これにより、ｐＣＲ（ｐＣＲ症例における全マーカーにわたる平均倍率変化：－０．２３１、非ｐＣＲ症例：－０．０７５、両側ウィルコクソン順位和検定ｐ＜２．２ｅ－１６）を達成するために、発生した腫瘍における免疫マーカークラスターと癌細胞マーカークラスターとの間のより強い負の相関が明らかになった（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。

【0126】

ＥＲ状態およびＨＥＲ２富化サブタイプの両方がネオアジュバント治療に対する応答に関連しているので、これらの共変量によるタンパク質マーカー発現変化を分析した。ＥＲ－陰性腫瘍は、ＥＲ－陽性腫瘍と比較して、処置中に（処置前と比較して）より有意な変化を示した（平均絶対倍率変化ＥＲ－陰性症例：０．５９、平均ＥＲ－陽性症例：０．３６、両側ウィルコクソン順位和検定ｐ＝０．００４５、図１８）。しかし、腫瘍を転帰で層別化した場合、ｐＣＲ症例は、ＥＲ状態にかかわらず非ｐＣＲ症例よりも有意な変化を示し（図１９）、ＥＲ状態は、このコホートではｐＣＲを予測しなかった（ｐ＝０．４７）。同様に、処置前にＨＥＲ２富化として分類された腫瘍は、他のサブタイプと比較して、処置中の生検において腫瘍および免疫マーカーの有意な変化を示した（図２０および図２１）。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＥＲ２富化症例では処置により有意に増加したが、他の症例ではわずかに減少した。全ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７トランスクリプトームコホートと同様に、ＨＥＲ２富化サブタイプは、ｐＣＲを予測しなかった（ｐ＝０．８７）。

【0127】

多領域サンプリングの有用性を評価するために、１００回のシミュレーションにわたって平均化された組織試料当たり単一のランダムに選択された領域を使用して、処置時対処置前の変化を測定した（図２２）。すべての腫瘍領域に基づく所見と一致して、ＣＤ４５およびＣＤ８は、処置中に最大の増加を示したが、ＨＥＲ２およびｐＳ６は、単一領域分析で最も減少した。処置によるマーカー倍率変化の大きさは、非ｐＣＲ症例よりもｐＣＲ症例で大きかったが（ｐＣＲ症例における全マーカーにわたる平均絶対倍率変化：０．８７対非ｐＣＲ症例：０．３３、両側ウィルコクソン順位和検定ｐ＝１．０２ｅ－０７）、個々のマーカーは、単一領域分析では処置により有意に増加せず、分散の増加を反映した。

【0128】

ＨＥＲ２標的療法と化学療法の併用に関連する生物学を解明するために、手術時に存在する残存腫瘍細胞を有する患者（非ｐＣＲ症例）において処置関連変化も調べた。非ｐＣＲ症例は、処置中の時点で限られた変化を示したが、手術の時点までに、ＨＥＲ２および下流のＡＫＴシグナル伝達経路の実質的な減少、ならびにｐａｎＣＫ富化領域における免疫マーカーの付随する増加があった（図２３）。注目すべきことに、ＨＥＲ２は、その下流経路メンバーよりも有意に減少し、これは、耐性に寄与する代償経路活性化を反映し得る。いくつかの免疫マーカーは、手術時に非ｐＣＲ症例で有意に増加したが（ｎ＝８）、倍率変化は処置時にサンプリングされたｐＣＲ症例と比較して減少した（処置後の非ｐＣＲの平均倍率変化：０．３０、処置中のｐＣＲの平均倍率変化：０．８５、両側ウィルコクソン順位和検定ｐ＝０．００２１、図１６Ａおよび図１６Ｂ）。非ｐＣＲ症例において手術時に増加した免疫マーカーの中で、ＣＤ５６は最も有意であり、化学療法ストレスを受けた腫瘍細胞の同定および死滅におけるＮＫ細胞の役割に潜在的に関連していた。ＮＫ細胞は、ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７バルク発現データにおいて手術時に増加することが同様に見出された。

【0129】

ＨＥＲ２標的療法中の腫瘍および免疫マーカーの増加した不均一性
腫瘍不均一性がＨＥＲ２－陽性乳癌の明確な特徴であることを考慮して、乳腺腫瘍生検の異なる領域内のＨＥＲ２タンパク質発現の変動を、ネオアジュバント処置を通して患者間で調べた。２つの例示的な症例（図２４）について示されるように、各組織試料内の地理的に異なる領域にわたるＨＥＲ２タンパク質レベルは、大部分の症例において処置前に比較的一貫したＨＥＲ２タンパク質レベルを示した（図２５）。領域間および患者間の両方で処置中にＨＥＲ２タンパク質発現でのはるかに大きな不均一性が、観察された（図２６）。そのような領域的不均一性は、血管系、組織構造、免疫浸潤、または生検自体による薬物動態学的差異を反映することがあり、処置中の試料当たりの複数の領域をプロファイリングすることの重要性を強調する。

【0130】

処置中の腫瘍および免疫タンパク質マーカーの両方にわたる領域的不均一性も調査した。各マーカーおよび各時点で、コホートにわたる領域的不均一性を、ＡＮＯＶＡ（方法）に基づく患者内平均二乗誤差として計算した。すべてのマーカーにわたって、ＤＳＰタンパク質の不均一性は、ＨＥＲ２について述べたものと同様に、処置前と比較して処置中に有意に増加した（図２７）。これらの変化は広範であり、処置中のすべての腫瘍マーカーおよび免疫マーカーについて、処置前と比較して不均一性が高かった。最大の不均一性を有するプローブは、腫瘍マーカー（ＨＥＲ２、ｐＳ６）および免疫マーカー（ＣＤ３、ＣＤ８）の両方を含んでいた。ｐＣＲを達成できなかった腫瘍の中で、本発明者らは、ネオアジュバント治療の過程を通して不均一性を評価した。腫瘍マーカー間の不均一性は、処置中および処置前で有意に異ならなかった（両側ウィルコクソン順位和検定ｐ＝０．５２）が、手術時（処置後）に増加したのに対して、免疫マーカー不均一性は、処置時に増加し、その後、手術時に減少した（図２８）。ｐＣＲを達成した腫瘍は、処置中の腫瘍マーカー（ＨＥＲ２を含む）間で、より高いタンパク質不均一性を示したが、免疫マーカーにわたって、より高い不均一性を示さなかった（図２９）。非ｐＣＲ症例における処置中のより高い免疫マーカーの不均一性は、一部の領域が他の領域よりも大きな免疫流入を経験するという一貫性の低い免疫応答を反映し得る。より高い処置前ＨＥＲ２不均一性は、ｐＣＲ症例と比較して非ｐＣＲ症例では観察されなかった。また、腫瘍マーカー間で同等の領域的不均一性は、ｐＣＲ症例および非ｐＣＲ症例で認められた（図３０）。

【0131】

ＤＳＰデータをさらに分析して、隣接する微小環境を捕捉するように設計された周囲のｐａｎＣＫ－陰性領域と比較して、ｐａｎＣＫ富化領域（他の分析で使用される）における免疫細胞の組成を調べた（図３１）。処置前には、Ｔ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）およびマクロファージ（ＣＤ６８）マーカーの両方が、周囲の微小環境でより優勢であったが、ＣＤ５６－陽性ＮＫ細胞および免疫抑制マーカー（例えば、ＶＣＴＮ１、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ）は、ｐａｎＣＫ富化領域でより高かった（図３２Ａ～図３２Ｃ）。これらの知見は、Ｔ細胞排除と一致しており、ＩＤＯおよびＰＤ－Ｌ１は、エフェクターＴ細胞の腫瘍内増殖を損なうと考えられる。ＨＥＲ２標的療法単独の間に同様の免疫プロファイルが観察された。しかし、処置後、腫瘍が残存している非ｐＣＲ症例では、ＣＤ８およびＣＤ６８を含む隣接する微小環境と比較して、ほとんどの免疫マーカーは、ｐａｎＣＫ富化領域でより優勢であった。処置前および処置中の両方において、免疫細胞の局在化は、ｐＣＲを達成した患者および達成しなかった患者（図３３Ａおよび図３３Ｂ）、ならびにＥＲ－陽性対ＥＲ－陰性症例（図３４Ａおよび図３４Ｂ）で類似していた。

【0132】

原理の予備的証明として、他の多重化画像化技術を同様に使用してｐａｎＣＫ富化腫瘍をプロファイリングすることができることに注目して、ｐａｎＣＫ富化を伴う多重免疫組織化学（ｍＩＨＣ）も使用して、ｐＣＲを達成した患者および達成しなかった患者からの組織試料をプロファイリングした。ｐａｎＣＫ抗体を使用してマスク領域を定義し、ＤＳＰに基づく処置で有意に変化したいくつかのマーカー、すなわちＨＥＲ２、ＣＤ４５およびＣＤ８を、組織切片全体にわたり、かつｐａｎＣＫ富化領域内で定量した（図３５）。予想通り、全組織切片をｐａｎＣＫ富化領域と比較した場合、タンパク質発現シグナルの変化は弱められた。これらのデータは、乳房および他の腫瘍における腫瘍および共局在化免疫変化を定義するためにｐａｎＣＫ富化が有益であり得るという概念をさらに支持する。

【0133】

腫瘍細胞および免疫細胞の地理空間分布は、複数の腫瘍型における再発および生存に関連している。ここで、処置と腫瘍－微小環境境界との間の関係は、周辺複雑度を使用して調査され、周辺複雑度は、領域の面積で除算された領域の周囲長に比例する（方法、図３６）。処置前に、ｐＣＲ症例と非ｐＣＲ症例との間で周辺複雑度の有意差は、観察されなかった（ｐ＝０．２９９、図３７）。しかしながら、周辺複雑度は、処置前と比較して処置中に有意に減少した（ｐ＝１．３２ｅ－６、図３８）。これらのデータは、処置が腫瘍細胞の地理的分布ならびに腫瘍細胞含有量に影響を及ぼし得ることを示唆している。実際、増殖性マーカーであるＫｉ６７は、周辺複雑度と高度に相関していた（図３９）。したがって、高度に増殖性の腫瘍の場合、腫瘍－微小環境境界の周囲長は、比較的大きく、周囲の微小環境とのクロストークを増加させる可能性がある。

【0134】

対となるおよび処置前および処置中の生検のＤＳＰは、ｐＣＲに関連する特徴を明らかにする
非ｐＣＲ症例と比較したｐＣＲ症例における処置関連変化の劇的な差（図１６Ａおよび図１６Ｂ）を考慮して、次に、処置前または治療の過程の早期のＤＳＰタンパク質マーカーの状態を使用してｐＣＲを予測できるかどうかを評価しようとした。Ｌ２正則化ロジスティック回帰を使用して、複数のＲＯＩプロファイリングされた処置前、処置中、または処置前および処置中（「ｏｎ－＋ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」と示される）の両方の平均マーカー発現にわたる平均ＤＳＰタンパク質発現レベルに基づいて、ｐＣＲ状態によって腫瘍を分類し、発見コホート内の入れ子式交差検証によってモデル性能を評価した（方法）。両時点のデータを有する腫瘍をこの分析で利用した（ｎ＝２３症例、図４）。処置中のタンパク質発現に基づくモデルは、処置前のタンパク質発現に基づくモデルよりも優れており（平均ＡＵＲＯＣ＝０．７２８対０．６１４）、処置中および処置前の両方のタンパク質発現レベル（平均ＡＵＲＯＣ＝０．７３３）を組み込んだモデルと同等に機能した（図４０）。免疫マーカーと腫瘍マーカーの両方を使用して訓練された分類指標は、腫瘍マーカーのみを使用したモデルよりも優れており、治療応答を予測するために同時に行う腫瘍および免疫プロファイリングの有用性を強調している（図４１）。

【0135】

ＤＳＰタンパク質の処置中プラス処置前分類指標について、全領域にわたる平均マーカー発現および領域間の各マーカーの平均の標準誤差（ＳＥＭ）の両方を組み込むようにモデルを拡張することによって、複数領域サンプリングおよび不均一性の重要性を調査した（方法）。この分析は、両方の時点でプロファイリングされた少なくとも３つの領域を有する患者に限定された（ｎ＝１６、方法）。腫瘍マーカーについての平均免疫値およびＳＥＭを利用することは、腫瘍マーカーおよび免疫マーカーの両方についての平均値に基づくモデルよりも優れており（図４２）、腫瘍マーカー間の不均一性を捕捉する分類指標が、ｐＣＲの予測を改善し得ることを示唆することが見出された。

【0136】

ＤＳＰタンパク質の処置中プラス処置前分類指標の性能を、転帰（ＥＲ状態およびＰＡＭ５０サブタイプ）と以前に関連した特徴と比較し、発見コホートにおける交差検証によってモデルを再び評価した。注目すべきことに、ＥＲ状態およびＨＥＲ２富化ＰＡＭ５０状態に基づくモデルは、このコホートではあまり機能せず（平均ＡＵＲＯＣ＝０．５８９）、ＤＳＰタンパク質の処置中プラス処置前データセットに、これらの２つの特徴または追加の病理学的特徴を追加しても、ＡＵＲＯＣは改善されなかった（図４３および図４４）。これらの症例のバルクトランスクリプトームデータが利用可能であることを考慮して、ＤＳＰタンパク質パネルと重複する３７個のマーカーについて、対になった処置時および処置前のバルクＲＮＡ発現データを使用してモデルを構築した。このモデルはまた、ＤＳＰタンパク質データに基づくものよりも著しく悪い性能を示した（図４５、交差検証によるｐ＜０．０００１）。３７個の重複するＤＳＰ発現マーカーおよびバルクＲＮＡ発現マーカーの中で、１６個のみが処置前に正の相関があったので（図４６）、これは驚くべきことではない。タンパク質発現が細胞表現型のより近位の読み出しである場合、ｐａｎＣＫ富化、ＲＮＡ一過性／分解、および翻訳後調節を含む様々な因子が、タンパク質発現レベルとＲＮＡ発現レベルとの間の強い相関の欠如に寄与し得る。

【0137】

ＤＳＰは、独立した検証コホートにおいてｐＣＲを予測する
これらの有望な知見に照らして、ＴＲＩＯ Ｂ０７臨床試験からの患者の独立したコホート（ｎ＝２９）におけるＤＳＰタンパク質の処置中プラス処置前分類指標の性能を評価することがさらに求められた（図４７）。発見コホートと同様に、処置前および処置中の各腫瘍組織から平均４つのｐａｎＣＫ－陽性領域をプロファイリングし、４０個のタンパク質抗体の同じパネルを利用した。処置前と比較した処置中のマーカーの変化は、発見コホートで観察されたものと同様であった（図４８）：Ｔ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８）は増加したが、腫瘍マーカーＨＥＲ２およびＫｉ６７は最も有意な減少を示した。発見コホートと同様に、検証コホートにおいて、処置中および処置前のタンパク質発現の差は、最終的にｐＣＲを起こした腫瘍においてより劇的であった（図４９）。発見コホートで訓練されたＬ２正則化ロジスティック回帰モデルのＡＵＲＯＣ性能を検証（試験）コホートで評価した。ｐＣＲの予測における処置中プラス処置前ＤＳＰタンパク質モデルの性能は、発見（交差検証によって評価し、平均ＡＵＲＯＣ＝０．７３３）コホートおよび検証（訓練試験によって評価し、ＡＵＲＯＣ＝０．７２５）コホートにおいて比較的高かった（図５０）。発見コホートにおいて訓練され、検証コホートにおいて試験された処置前の分類指標において、最大のＬ２正則化係数を有するマーカーは、処置中のＣＤ４５タンパク質レベルであった。一般に、大きな係数を有する特徴には、腫瘍浸潤リンパ球およびマクロファージ集団（ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ６６Ｂ）を表す処置中マーカーが含まれた（図５１）。処置中のＨＥＲ２タンパク質発現は、モデルにおいて負の係数を有し、これは、処置中の高いＨＥＲ２レベルに関連する不良な転帰と一致していた。

【0138】

現在のネオアジュバント処置パラダイムにおけるトラスツズマブの広範な使用を考慮して、モデル性能を、トラスツズマブ含有症例における最良の性能の処置中＋処置前ＤＳＰタンパク質モデルについてさらに評価した（アーム１および３、ｎ＝１９）。同様のモデル性能およびマーカー係数が、完全な発見コホートにおいて、およびトラスツズマブで処置された検証コホートにおける症例のサブセットにおいて、観察された（図５２～図５４）。独立したコホートにおけるこれらの知見の検証は、その後の治療がそれに応じて調整され得るように、どの患者がＨＥＲ２標的療法中に早期に応答するかを予測するための多重空間プロテオミクスプロファイリングの可能性を実証する。

【0139】

生物学的有意性の２つのマーカー、ＣＤ４５およびＨＥＲ２を選択して、低下したマーカーセットを使用してモデル性能を評価した。ここでも、Ｌ２正則化ロジスティック回帰モデルを発見コホートで訓練し、検証（試験）コホートで評価した。ｐＣＲの予測における処置中プラス処置前ＤＳＰ ＨＥＲ２、ＣＤ４５モデルの性能は、発見（交差検証によって評価し、平均ＡＵＲＯＣ＝０．８０９）コホートおよび検証（訓練試験によって評価し、ＡＵＲＯＣ＝０．７５４）コホートの両方で高かった（図５５）。全マーカーパネルと同様に、処置中ＣＤ４５は、最大の係数を有した（図５６）。

【0140】

最後に、ＣＤ４５のみに基づいてモデルを構築し、性能を評価した。Ｌ２正則化を発見コホートにおいて訓練し、検証（試験）コホートにおいて評価した。ｐＣＲの予測における処置中プラス処置前ＣＤ４５モデルの性能は、発見（交差検証によって評価し、平均ＡＵＲＯＣ＝０．８６６）コホートおよび検証（訓練試験によって評価し、ＡＵＲＯＣ＝０．７４９）コホートの両方において高かった（図５７）。再び、処置中ＣＤ４５は、最大の係数を有した（図５８）。

【0141】

ＣＤ４５に基づくＬ１正則化モデルもまた、発見コホートで訓練し、検証（試験）コホートで評価した。ｐＣＲの予測における処置中ＣＤ４５モデルの性能は、発見（交差検証によって評価し、平均ＡＵＲＯＣ＝０．９２０）コホートおよび検証（訓練試験によって評価し、ＡＵＲＯＣ＝０．７４９）コホートの両方において高かった（図５９）。

【0142】

考察
バルクゲノムおよびトランスクリプトームプロファイリングは、近年の癌バイオマーカー発見努力の中心である。しかしながら、不均一な細胞集団間の混合は、そのようなデータの分析を複雑にし、細胞集団の組成および局在の変化が疾患進行の生物学または処置応答の機構を反映し得る、縦方向試料を研究するときに、問題は悪化する。実際、バルクゲノムおよびトランスクリプトームプロファイリングに基づいてＨＥＲ２標的療法に対する応答の検証されたバイオマーカーを確立するための努力は、他の試験コホートおよびＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７において今日まで限られた成功しか収めていない。治療による腫瘍免疫微小環境のイン・サイチュプロテオミクスプロファイリングは、解離技術の限界を回避し、ネオアジュバントＨＥＲ２標的療法に対する応答に関連する特徴を明らかにする能力を改善すると推論された。ここで、ＤＳＰ技術を使用して、ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験におけるネオアジュバントＨＥＲ２標的療法の前、間および後にサンプリングされた乳腺腫瘍からの保管組織の単一の５μｍ切片上で４０個の腫瘍および免疫マーカーをひとまとめにしてプロファイリングした。腫瘍内不均一性を考慮しながらシグナルを増強するために、ｐａｎ－ＣＫマスキング戦略を使用して、腫瘍細胞および共局在化免疫細胞を、試料当たり複数の領域にわたって富化した。

【0143】

この試験コホートからの縦方向乳房生検のＤＳＰは、それぞれ浸潤白血球および細胞傷害性Ｔ細胞と一致する、ＣＤ４５およびＣＤ８発現の増加を伴う、処置中のＨＥＲ２および下流ＡＫＴシグナル伝達の顕著な減少を含む、治療に関連する変化を明らかにした。手術時までに、ネオアジュバント治療の全過程の後、腫瘍－免疫組成物は、非ｐＣＲ症例におけるＣＤ５６発現の増加と共にかなり変化し、化学療法ストレスを受けた腫瘍細胞のＮＫ細胞媒介性死滅を潜在的に反映した。処置中の腫瘍および免疫マーカーの両方の変化は、独立した検証コホートにおいてｐＣＲを達成し続け、決定的に、処置中および処置前のタンパク質発現がロバストに応答を予測した腫瘍において、より劇的であった（ＡＵＲＯＣ＝０．７２５）。処置中のタンパク質発現レベルも同様に、ｐＣＲを予測した一方で、将来の研究では、処置中の組織のみのプロファイリングが、その後のｐＣＲを予測するのに十分であり得ることを強調しており、このコホートでは、処置前のタンパク質発現、確立された予測的特徴、バルクの処置前および処置中の遺伝子発現データのいずれも予測的ではなく、この新規多重空間プロテオミクスバイオマーカーの優位性および患者層別化のためのその潜在的な有用性を強調した。したがって、これらの知見は、例えばＨＥＲ２標的薬剤を組み合わせることによって、治療をエスカレーションされるべき集団のサブセットを同定すること、または例えば化学療法およびその関連毒性の短縮または省略によって、治療を安全にデ・エスカレーションされるべき集団のサブセットを同定することにかなり重点を置いていることを考慮すると、重大な満たされていない臨床的必要性に対処する。画像化、循環腫瘍ＤＮＡ、および処置前免疫スコアまたは内因性サブタイプを含む、初期段階のＨＥＲ２＋乳癌におけるエスカレーション対デ・エスカレーションされたアプローチの個別化された標的化を導くのに役立つ多数のバイオマーカーが検討されているが、現在のところ、患者の層別化を導くことができる検証されたバイオマーカーはない。新規の非常に有効であるが潜在的に毒性の薬剤を含む、ＨＥＲ２標的療法の選択肢の増加は、応答における大きな不均一性と相まって、ＨＥＲ２＋乳癌を、今後１０年間にわたる最適な個別化治療の開発のための理想的な状況にする。

【0144】

より一般的には、結果は、治療による腫瘍および免疫細胞シグナル伝達の近位読み出しを提供するための保管組織試料の多重イン・サイチュプロテオーム分析の実現可能性および能力を示す。ここでプロファイリングされたものを含む多くのシグナル伝達タンパク質／ホスホタンパク質は、タンパク質ネットワークのボトルネックと考えられ、突然変異および転写変化を統合し、これを処置関連変化を研究するための特に強力なアプローチにする。重要なことに、ＤＳＰ抗体パネルは、カスタマイズすることができ、ＥＲまたは他の腫瘍特異的マーカーおよびシグナル伝達経路などの目的の追加の／代替のマーカーを含めることができる。この研究はまた、腫瘍細胞のｐａｎＣＫ富化（または特定の細胞集団を富化するための他のマーカー）および局所的な腫瘍不均一性および処置関連変化を捕捉するための多領域プロファイリングの値を含む研究設計上の考慮事項、他の上皮腫瘍型に広く適用可能であるべき概念を明らかにする。これは、ＤＳＰの定量的および多重性と共に、古典的なＩＨＣと比較して顕著な違いを表す。注目すべきことに、この研究におけるＤＳＰ測定は、約３００～６００個の細胞からなる定義された細胞集団の領域分析に基づいた。本明細書に記載されている新規バイオマーカーの開発には単一細胞の分割は必要ではなかったが（実際、そのようなアプローチの臨床的実施を複雑にする可能性がある）、そのようなデータは、細胞状態および細胞間相互作用の同定をさらに可能にすることができ、空間プロファイリング技術の分割およびスループットの進歩によって促進され、将来の研究の分野になる可能性が高い。

【0145】

方法
コホート選択
ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験は、ステージＩ～ＩＩＩの片側ＨＥＲ２－陽性乳癌女性１３０人（Ｓ．Ｈｕｒｖｉｔｚら、（２０２０）、上掲）を含むランダム化多施設試験であった。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ（ＵＣＬＡ）のＩＲＢは、臨床試験ＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７（０８－１０－０３５）を承認した。ＳｔａｎｆｏｒｄのＩＲＢは、Ｃｕｒｔｉｓ Ｌａｂ（ｅＰｒｏｔｏｃｏｌ＃３２１８０）において、相関研究のためにＴＲＩＯ－ＵＳ Ｂ０７臨床試験標本の使用を承認した。インフォームドコンセントをすべての参加者から得た。これは、患者の試料を他の研究者と共有するための患者からの同意を含む。登録された患者は、トラスツズマブ、ラパチニブ、またはトラスツズマブとラパチニブの併用という標的療法の種類を決定する３つの処置群にランダムに割り当てられた。乳腺腫瘍生検を、処置前および１４～２１日間の割り当てられたＨＥＲ２標的療法（化学療法なし）の後に得て、その後、割り当てられたＨＥＲ２標的処置プラスドセタキセルおよびカルボプラチンを３週間ごとに６サイクル投与し、手術を行った。各時点について、コア生検または外科組織切片を得て、新鮮凍結材料またはＦＦＰＥ材料のいずれかとして保存した。合計で、３つの時点すべてから入手可能なＦＦＰＥ試料を有する２８例（処置前、処置中および手術時）を、試料の利用可能性および質に基づいて、ｐＣＲ状態およびＥＲ状態によってバランスをとりながら、発見コホートに含めるために選択した（図２および図３）。分類指標の性能を評価するために、処置前および処置中に利用可能なＦＦＰＥ試料を有する追加の２９症例を検証コホートのために選択した（図４７～図４９）。注目すべきことに、検証コホートは、モデル性能を評価するためにのみ使用された。他のすべての分析は、発見コホートに基づく。腫瘍細胞充実性を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した腫瘍切片を使用して、委員会認定の乳房病理学者（ＧＲＢ）によって評価した。０の細胞充実性を有する試料は、さらなる分析から省いた。０の細胞充実性を有すると推定された他の組織切片については、ＤＳＰを実施するために使用したＦＦＰＥ切片（病理学的レビューに使用したＨ＆Ｅ切片とは異なる）で腫瘍細胞を同定し、これらを分析に含めた（図４）。ＦＦＰＥブロックを５μｍ厚で切片化し、ＤＳＰ実験の前に４℃で３週間未満保存した。

【0146】

ＤＳＰデータ生成および分析
Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＤＳＰ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＦＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＵＳＥ ＯＮＬＹ．診断手順では使用しない）を以前に記載されたように行った（Ｃ．Ｒ．Ｍｅｒｒｉｔｔら、（２０２０）、上掲）。簡単に記載すると、組織スライドを、光切断可能なインデックス化オリゴを含有するタンパク質抗体の多重パネルで染色し、その後の読み取りを可能にした（図５）。関心領域（ＲＯＩ）を、ＤＳＰプロトタイプ機器で選択し、ＵＶ光を使用して照射した。各ＲＯＩから放出されたインデックス化オリゴを収集し、マイクロタイタープレート上の指定されたウェルに堆積させ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ読み出し（直接タンパク質ハイブリダイゼーション）中に各ＲＯＩのウェルインデックス付けを可能にした。カスタムマスクは、以前に記載されたように（Ｒ．Ｎ．Ａｍａｒｉａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４，１６４９－１６５４（２０１８）、その開示が参照により本明細書に組み込まれる）、ＩｍａｇｅＪパイプラインを使用して生成された。各組織試料について、４つ（範囲１～７）のｐａｎＣＫ富化（ｐａｎＣＫ－Ｅ）ＲＯＩの平均から各マーカーの数を得た。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（Ｖ．Ａ．Ｍａｌｋｏｖら、ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅ ２、８０（２００９）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、各ＲＯＩにおける各マーカーの生タンパク質カウントを生成した。大体の数を（３つの陽性対照マーカーの幾何平均に基づいて）ＥＲＣＣ正規化した。ヒストンＨ３をハウスキーピングマーカーとして使用し、極端なヒストンＨ３を有するＲＯＩ（平均から３標準偏差を超える）を選別した（ＲＯＩの１％未満）。２つのＩｇＧ抗体の幾何平均を使用してバックグラウンドノイズを計算し、シグナル対ノイズ比＜３×のマーカーに注目した（図６０）。ＲＯＩ面積に基づいて免疫マーカーを正規化して、領域内の免疫含有量の総密度を測定した。腫瘍マーカーを、ハウスキーピング抗体（ヒストンＨ３）を使用して正規化して、細胞ごとに癌シグナル伝達経路の状態を捕捉した。さらなる品質管理として、面積正規化要素およびハウスキーピング正規化要素を、ＲＯＩごとに比較し、ＲＯＩを２つの方法にわたって異なる正規化要素でフィルタリングした（これは全ＲＯＩの６％を表した）。すべての正規化された数を下流分析のためにｌｏｇ２空間に変換した。この研究で実施された分析は、本質的に比較的であり（例えば、処置前対処置中、ｐＣＲ対非ｐＣＲ）、正規化方法の変動にロバストである。

【0147】

バルクｍＲＮＡ発現分析
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量した。ＲＮＡ試料を、Ｑｕｉｃｋ ＡＭＰ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、シアニン５－ＣＴＰまたはシアニン３－ＣＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識した。遺伝子発現マイクロアレイ実験を、各ベースライン試料を、１４～２１日間のＨＥＲ２標的療法後（処置中）に採取した試料と比較することによって行った。各処置中試料を同じ患者からの処置前試料と比較した。Ｌｉｍｍａ（Ｍ．Ｅ．Ｒｉｔｃｈｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３、ｅ４７（２０１５）；およびＭ．Ｅ．Ｒｉｔｃｈｉｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３、２７００－２７０７（２００７）；その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。）をバックグラウンド補正（「ｎｏｒｍｅｘｐ」）、アレイ内正規化（「ｌｏｅｓｓ」）、アレイ間正規化、および複製プローブの平均化に使用した。バッチ補正およびＤＳＰコホートとの比較を含む下流分析では、正規化された数をｌｏｇ２空間に変換した。マイクロアレイの実行日に関連する潜在的なバッチの影響を除去するために、コンバット（Ｗ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｂｉｏｓｔａｔｉｃｓ ８，１１８－１２７（２００７）、その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を使用した。ＰＡＭ５０の状態の処置前および処置中は、データセット組成の変動に対してロバストなＮ－ｏｆ－１アルゴリズムであるＡＩＭＳ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ）を使用して推測した（Ｅ．Ｒ．Ｐａｑｕｅｔら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９，３２（２０１７）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。このコホートにおけるＨＥＲ２富化症例の予想される優位性を考慮して、このアプローチを利用した。

【0148】

相関分析
ＤＳＰタンパク質データとバルクＲＮＡデータとの間のスピアマン順位相関を、患者当たりのすべてのＤＳＰ ＲＯＩ（ｐａｎＣＫ富化ＲＯＩおよび周囲の微小環境富化ＲＯＩの両方）の平均を使用して、処置前試料について計算した。タンパク質マーカー間の相関を示すプロット（図９、図１７Ａおよび図１７Ｂ）を、黒い四角の形で階層的クラスタリングと重ねた。ｐＣＲ対非ｐＣＲ症例における相関値の分布の差を、両側ウィルコクソン２試料ｔ検定を用いて評価した。

【0149】

比較分析
患者ごとに複数の領域をサンプリングしたＤＳＰタンパク質データの比較分析（例えば、処置前対処置中、ｐＣＲ対非ｐＣＲ、ｐａｎＣＫ－富化対ｐａｎＣＫ－陰性）のために、本発明者らは、患者によるブロックを伴う線形混合効果モデルを利用した（Ｄ．Ｂａｔｅｓら、Ｊ Ｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗ ６７，１－４８（２０１５）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。このモデルは、患者ごとにプロファイリングされたＲＯＩの数の差を制御しながら、患者に合わせた方法でマーカーレベルを比較することを可能にする。固定効果の係数は、その変数（ボルケーノプロットのｘ軸）に起因する変化であり、偽発見率を計算するために使用されるｐ値（ボルケーノプロットのｙ軸）は、ｔ値（試料データの変動に対する差の大きさの尺度）に基づく。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ＆Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順（Ｙ．ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＹ．Ｈｏｃｈｂｅｒｇ、Ｊ Ｒ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｂ ５７、２８９～３００（１９９５）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を使用して偽発見率（ＦＤＲ）を計算し、０．０５のＦＤＲ調整ｐ値を有意性閾値として設定した。

【0150】

領域サブサンプリング
処置中対処置前のタンパク質発現変化を評価する場合に、複数の領域ではなく、組織試料当たり単一のランダムに選択された領域を利用することの影響を分析した。これらの分析（図２１）では、１００回の反復を行い、各組織から単一領域を選択し、これらの１００回の実験にわたって平均した倍率変化および対応するｐ値を計算した。ランダムサンプリングの数は、使用される反復回数がさらに増加（ｐ値収束）するように、結果として得られる出力をロバストにするのに必要な数を超える反復の数を上げることによって、経験的に選択された。

【0151】

分子データを用いたＬ２正則化ロジスティック回帰
モデルおよび特徴：ソルバーとしてｌｉｂｌｉｎｅａｒを使用したＬ２－ロジスティック回帰を、ｐＣＲ対非ｐＣＲ症例の分類に使用した。処置前および処置中のマーカー値をすべてのＲＯＩにわたって平均して、その時点の各マーカーの複合値を導出した。データが単一の時点でのみ利用可能であったので、５人の患者をモデルから除外した（図４）。平均ＤＳＰマーカー発現特徴を、患者の時点、腫瘍対免疫マーカー、ＤＳＰタンパク質特徴対確立された予測特徴（ＥＲ状態およびＰＡＭ５０分類）、およびＤＳＰタンパク質対バルクＲＮＡ特徴（ＤＳＰタンパク質マーカーに対応するＲＮＡ遺伝子転写物を使用）を比較するモデルにおいて使用した。不均一性を評価するために、少なくとも３つのＲＯＩを有する組織の全ＲＯＩにわたるマーカー値について平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算して、その時点の各マーカーの複合値を導出した。これらのＳＥＭ特徴を、不均一性の予測値を評価するモデルにおける平均発現特徴と組み合わせて使用した。

【0152】

モデル比較および内部交差検証による性能の評価：モデル性能を評価し、Ｐｙｔｈｏｎパッケージｓｋｌｅａｒｎ（Ｆ．Ｐｅｄｒｅｇｏｓａら、Ｊ Ｍａｃｈ Ｌｅａｒｎ Ｒｅｓ １２、２８２５－２８３０（２０１１）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を使用した入れ子式交差検証を使用して、モデルを比較した。層別化サンプリング（「層別化交差検証」）を使用してデータをＮ倍に分割した。倍率の数は、試験データが各クラスからの２つの症例を含むように、非ｐＣＲ群（症例が少ないクラス）の症例数に基づいて選択した。各モデルをＮ－１倍で訓練し、残りの倍率で平均ＡＵＲＯＣを用いてスコア化した。このプロセスを、毎回異なる倍率を維持しながら繰り返した。Ｎ－１訓練データセット内の層別化交差検証を使用してＬ２ペナルティ重みを選択し、この内側交差検証内の最高平均精度に関連する重みをスコアリングのために選択した。この入れ子式交差検証プロセスを、ランダムに生成された倍率を使用して１００回繰り返した。次いで、複数の仮説についてのホルム・ボンフェローニ補正による対のない両側ｔ検定を使用して、モデルスコアを比較した。ＲＯＣ曲線は、Ｎ倍交差検証の１００回の反復からのＲＯＣ曲線にわたって平均化することによって生成され、各反復は異なるランダムな倍率の分割を含む。

【0153】

独立コホートにおけるモデル性能の評価：上記のように、処置前および処置中のマーカー値をすべてのＲＯＩにわたって平均して、その時点の各マーカーの複合値を導出した。モデル選択は、上記の交差検証を使用して行った。最良の性能のモデルを選択し、発見コホート全体を使用して訓練した。最後に、ＡＵＲＯＣに基づくモデル性能を独立した検証（試験）コホートで評価した。

【0154】

不均一性の測定基準
マーカーの不均一性を、マーカー値を従属変数とし、患者の同一性を独立変数とする線形モデルで行われた分散分析からの平均二乗誤差として計算した（データセットは、関心の特定の時点または臨床転帰に従属させた）。

【0155】

周辺複雑度
ＩｍａｇｅＪ（Ａ．Ｂ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ １４（２０１２）、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、各ＲＯＩについてｐａｎＣＫ富化バイナリマスクについて周辺複雑度を計算した。患者によるブロックを伴う線形混合効果モデルを使用して、処置前および処置中のすべてのｐａｎＣＫ－富化領域ならびにｐＣＲを達成した症例対ｐＣＲを達成しなかった症例の周辺複雑度とを比較した。

【0156】

多重ＩＨＣ分析
染色されていないパラフィン包埋切片を、以下のマーカーを使用した多重ＩＨＣ分析によって分析した：ＰａｎＣＫ（ＡＥ１／ＡＥ２）、ＣＤ８、ＣＤ４５ ＬＣＡ、およびＨＥＲ２（２９Ｄ８ ＣＳＴ）。染色された試料をスキャンし、一連の正方形のサブ画像としてデジタル化し（「スタンプ」）、ＨＡＬＯを使用して視覚化した。ＰａｎＣＫマスキングおよび組織領域マスキングを、Ｆｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）を使用して各スタンプされた組織領域に対して行った。簡潔には、ＰａｎＣＫチャネルを使用して、ｐａｎＣＫ－陽性領域および組織領域全体のためのマスク（以下のＩｍａｇｅＪツールを使用する：コントラスト強調、閾値、拡張、穴を埋める、選択を作成）を作製し、（ＩｍａｇｅＪ Ｍｅａｓｕｒｅツールを使用して）各マスク領域内でＣＤ８、ＣＤ４５およびＨＥＲ２を定量した。加重平均（各マスク領域に対応する重みを有する）を使用して、組織（組織マスクまたはｐａｎＣＫマスク領域のいずれか）を含むすべての走査サブ画像にわたるＣＤ８、ＣＤ４５、およびＨＥＲ２レベルを計算した。

【0157】

均等論
上記の説明は、本発明の多くの特定の実施形態を含むが、これらは本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、むしろその一実施形態の例として解釈されるべきである。したがって、本発明の範囲は、例示された実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって決定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【国際調査報告】