2023-500875 抗メソテリンエリブリン抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-11

(54)【発明の名称】抗メソテリンエリブリン抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221228BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20221228BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221228BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221228BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20221228BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20221228BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20221228BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20221228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221228BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221228BHJP

   A61K 31/357 20060101ALI20221228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C12P21/08

C12N15/63 Z

A61K39/395 Y

A61K47/68

A61K47/65

A61K47/60

A61K47/54

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 N

A61K31/357

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022525715

(86)(22)【出願日】2020-11-06

(85)【翻訳文提出日】2022-07-01

(86)【国際出願番号】 IB2020000917

(87)【国際公開番号】W WO2021090062

(87)【国際公開日】2021-05-14

(31)【優先権主張番号】62/932,373

(32)【優先日】2019-11-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506137147

【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(72)【発明者】

【氏名】アルボーン， アール， エフ．

(72)【発明者】

【氏名】スパイデル， ジャレド

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC06

4B064CC12

4B064CC15

4B064CC24

4B064CE03

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA05

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076DD49

4C076EE23

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB11

4C085DD32

4C085DD33

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086CA01

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA15

4H045GA21

4H045GA26

(57)【要約】

メソテリンに結合する抗体、抗原結合断片及びそのコンジュゲート（例えば、エリブリンを含むものなどの抗体－薬物コンジュゲート）が開示される。本開示は、本明細書で提供される組成物を投与することによる癌の治療における使用のための方法及び組成物に更に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗体又は抗原結合断片であって、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域を含む、単離された抗体又は抗原結合断片。

【請求項2】

単離された抗体又は抗原結合断片であって、メソテリンに結合する能力を有し、且つ配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からの３つの重鎖相補性決定領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からの３つの軽鎖相補性決定領域を含む、単離された抗体又は抗原結合断片。

【請求項3】

ヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク又は１つ以上の復帰突然変異を有するヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークを含む、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項4】

配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項5】

配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項6】

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項7】

配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項8】

配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項9】

配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項10】

配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項11】

療法剤にコンジュゲートされる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項12】

前記療法剤は、エリブリンである、請求項１１に記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項13】

式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、前記抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、ＡｂをＤに共有結合的に結び付ける切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項14】

ｐは、１～６の整数である、請求項１３に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項15】

ｐは、６である、請求項１３又は１４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項16】

ｐは、２である、請求項１３又は１４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項17】

前記切断可能なリンカーは、切断時に前記リンカー又は前記抗体若しくは抗原結合断片のいかなる一部もエリブリンに結合されたままであることがないように配置される切断可能な部分を含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項18】

前記切断可能なリンカーは、切断可能なペプチド部分を含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項19】

前記切断可能なペプチド部分は、酵素によって切断可能である、請求項１８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項20】

前記切断可能なペプチド部分は、カテプシンによって切断可能である、請求項１８又は１９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項21】

前記切断可能なペプチド部分は、カテプシンＢによって切断可能である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項22】

前記切断可能なペプチド部分又は切断可能なリンカーは、アミノ酸単位を含む、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項23】

前記アミノ酸単位は、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含む、請求項２２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項24】

前記切断可能なリンカーは、少なくとも１つのスペーサー単位を含む、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項25】

前記スペーサー単位又は切断可能なリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項26】

前記ＰＥＧ部分は、－（ＰＥＧ）_ｍ－を含み、及びｍは、１～１０の整数である、請求項２５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項27】

ｍは、２である、請求項２６に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項28】

前記スペーサー単位は、マレイミド（Ｍａｌ）部分を介して前記抗体又は抗原結合断片に結び付いている（「Ｍａｌ－スペーサー単位」）、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項29】

前記Ｍａｌ－スペーサー単位は、前記抗体又は抗原結合断片上のシステイン残基を介して前記抗体又は抗原結合断片につなぎ合わされる、請求項２８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項30】

前記システイン残基は、Ｋａｂａｔの付番方式による、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のアミノ酸位置８０位におけるシステイン残基（「ＬＣｃｙｓ８０」）である、請求項２９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項31】

ｐは、２である、請求項３０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項32】

各－Ｌ－Ｄ部分は、前記抗体又は抗原結合断片上のＬＣｃｙｓ８０に結び付けられる、請求項３１に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項33】

前記切断可能なリンカーは、前記Ｍａｌ－スペーサー単位及び切断可能なペプチド部分を含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項34】

前記切断可能なペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む、請求項３３に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項35】

前記Ｍａｌ－スペーサー単位は、前記抗体又は抗原結合断片を前記リンカー中の前記切断可能な部分に結び付ける、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項36】

前記リンカー中の前記切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分を含む、請求項３５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項37】

前記切断可能なペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む、請求項３６に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項38】

前記切断可能なリンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項39】

前記リンカー中の前記切断可能な部分は、エリブリンに直接つなぎ合わされるか、又はスペーサー単位は、前記リンカー中の前記切断可能な部分をエリブリンに結び付ける、請求項２４～３８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項40】

前記コンジュゲートの切断は、前記抗体又は抗原結合断片及びリンカーからエリブリンを放出する、請求項３９に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項41】

前記リンカー中の前記切断可能な部分をエリブリンに結び付ける前記スペーサー単位は、自己犠牲性である、請求項３９又は４０に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項42】

前記リンカー中の前記切断可能な部分をエリブリンに結び付ける前記スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）を含む、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項43】

前記ｐＡＢは、前記リンカー中の前記切断可能な部分をエリブリンに結び付ける、請求項４２に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項44】

前記ｐＡＢは、Ｃ－３５アミンを介してエリブリンに共有結合的に結び付く、請求項４２又は４３に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項45】

前記リンカー中の前記切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分を含む、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項46】

前記切断可能なペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む、請求項４５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項47】

前記切断可能なリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む、請求項４５又は４６に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項48】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク又は１つ以上の復帰突然変異を有するヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークを含む、請求項１３～４７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項49】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域を含む、請求項１３～４８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項50】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３～４９のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項51】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１３～５０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項52】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１３～５１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項53】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む、請求項１３～５２のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項54】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１３～５３のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項55】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１３～５４のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項56】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１３～５５のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項57】

式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、前記抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項58】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク又は１つ以上の復帰突然変異を有するヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークを含む、請求項５７に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項59】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域を含む、請求項５７又は５８に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項60】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項61】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項62】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項63】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項64】

式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、前記抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つ配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項65】

前記抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む、請求項６４に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項66】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項６４又は６５に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項67】

前記抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項68】

ｐは、１～６である、請求項５７～６７のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項69】

ｐは、６である、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項70】

ｐは、２である、請求項５７～６８のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。

【請求項71】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片又は請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項72】

前記抗体、抗原結合断片又は抗体－薬物コンジュゲートの複数のコピーを含む、請求項７１に記載の医薬組成物。

【請求項73】

前記抗体－薬物コンジュゲートの複数のコピーを含み、前記組成物中の前記抗体－薬物コンジュゲートの平均ｐは、約１～約６であり、任意選択で、前記組成物中の前記抗体－薬物コンジュゲートの平均ｐは、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２又は約２．３である、請求項７１又は７２に記載の医薬組成物。

【請求項74】

前記組成物中の前記抗体－薬物コンジュゲートの平均ｐは、約６である、請求項７３に記載の医薬組成物。

【請求項75】

前記組成物中の前記抗体－薬物コンジュゲートの平均ｐは、約１．９又は約２．０である、請求項７３に記載の医薬組成物。

【請求項76】

癌を有するか又は有する疑いがある対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート又は請求項７１～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項77】

前記癌は、メソテリンを発現する、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記癌は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病である、請求項７６又は７７に記載の方法。

【請求項79】

前記癌は、中皮腫、肺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

対象の癌細胞集団を減少させるか又はその成長を遅らせる方法であって、治療有効量の、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート又は請求項７１～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項81】

前記癌細胞集団は、メソテリンを発現する、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記癌細胞集団は、固形腫瘍又は血液学的悪性腫瘍である、請求項８０又は８１に記載の方法。

【請求項83】

前記癌細胞集団は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病である、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記癌細胞集団は、中皮腫、肺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項８０～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記抗体、抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬組成物の投与は、前記癌細胞集団を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％減少させる、請求項８０～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記抗体、抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬組成物の投与は、前記癌細胞集団の成長を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％遅らせる、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

癌を有するか又は有する疑いがある対象が、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート又は請求項７１～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物による治療に反応することになるかどうかを決定する方法であって、前記対象からの生体試料を提供することと；前記試料を前記抗体又は抗原結合断片と接触させることと；前記試料中の１つ以上の癌細胞への前記抗体又は抗原結合断片の結合を検出することとを含む方法。

【請求項88】

前記１つ以上の癌細胞は、メソテリンを発現する、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記癌は、メソテリンを発現する、請求項８７又は８８に記載の方法。

【請求項90】

前記癌は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病である、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記癌は、中皮腫、肺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記試料は、組織生検試料、血液試料、リンパ液試料、骨髄試料、皮膚試料又は脳脊髄液（ＣＳＦ）試料である、請求項８７～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

癌を有するか又は有する疑いがある対象の治療における使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート又は請求項７１～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項94】

前記癌は、メソテリンを発現する、請求項９３に記載の抗体、抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項95】

前記癌は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病である、請求項９３又は９４に記載の抗体、抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項96】

前記癌は、中皮腫、肺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の抗体、抗原結合断片、抗体－薬物コンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項97】

癌を有するか又は有する疑いがある対象の治療における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート又は請求項７１～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項98】

前記癌は、メソテリンを発現する、請求項９７に記載の使用。

【請求項99】

前記癌は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病である、請求項９７又は９８に記載の使用。

【請求項100】

前記癌は、中皮腫、肺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項９７～９９のいずれか一項に記載の使用。

【請求項101】

癌を有するか又は有する疑いがある対象を治療するための医薬品を製造する方法における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート又は請求項７１～７５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項102】

前記癌は、メソテリンを発現する、請求項１０１に記載の使用。

【請求項103】

前記癌は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病である、請求項１０１又は１０２に記載の使用。

【請求項104】

前記癌は、中皮腫、肺癌、卵巣癌又は胃癌である、請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項105】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードする単離された核酸。

【請求項106】

請求項１０５に記載の核酸を含む単離されたベクター。

【請求項107】

請求項１０５に記載の核酸又は請求項１０６に記載のベクターを含む単離された細胞又は細胞集団。

【請求項108】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を作製する方法であって、請求項１０７に記載の細胞又は細胞集団を、前記抗体又は抗原結合断片を産生するために好適な条件下で培養することを含む方法。

【請求項109】

請求項１３～７０のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲートを作製する方法であって、コンジュゲーションを許容する条件下において、抗体又は抗原結合断片を、エリブリンに結び付けられた切断可能なリンカーと反応させることを含む方法。

【請求項110】

エリブリンに結び付けられた前記切断可能なリンカーは、前記抗体又は抗原結合断片の軽鎖上のシステイン残基と反応する、請求項１０９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、２０１９年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／９３２，３７３号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願は、全体として参照により本明細書に援用される。

【0002】

本開示は、抗メソテリン抗体及びその抗原結合断片並びに抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などのコンジュゲート、例えばエリブリンを含むものと、メソテリンを発現し、且つ／又はチューブリンを破壊するか、若しくは本明細書に開示される組成物を投与することによる治療が適用可能な癌の治療及び診断におけるそれらの使用とに関する。

【背景技術】

【0003】

世界的に、癌は、罹病及び死亡の主要な原因の１つであり、２０１２年の新規症例は、約１４００万件であり、癌に関連した死亡は、８２０万件となっている。癌による死亡の最も多い原因は、肺癌（１５９万件の死亡例）；肝癌（７４万５０００件の死亡例）；胃癌（７２万３０００件の死亡例）；結腸直腸癌（６９万４０００件の死亡例）；乳癌（５２万１０００件の死亡例）；及び食道癌（４０万件の死亡例）である。癌の新規症例数は、今後２０年間で約７０％増加し、年間約２２００万件の新規癌症例に上ることが予想されている（Ｗｏｒｌｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１４）。

【0004】

グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型細胞表面タンパク質であるメソテリンは、中皮腫、卵巣癌及び膵臓腺癌を含む様々な癌種で高発現するため、抗体ベースの癌治療に魅力的な標的である（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（２）：２７６－８０）。メソテリンの生物学的機能について十分な理解が得られていないが、メソテリンノックアウトマウスにいかなる検出可能な表現型も見られないことを踏まえて、メソテリンが腫瘍の接着及び転移において役割を果たすことが示唆されている（Ｂｅｒａ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０（８）：２９０２－６；Ｒｕｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１０）：９１９０－８）。メソテリンは、ある種の形態の化学療法に対する抵抗性を与え、且つ細胞に増殖効果を及ぼすことによって腫瘍進行の一因となるとも考えられている（Ｂｈａｒａｄｗａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．１０：１０６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（２）：２８６－９６）。

【0005】

最近の研究では、メソテリンは、癌転移及び再発に密接に関連する過程である上皮間葉転換（ＥＭＴ）のマスターレギュレーターとして機能し得ることが示されている（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．１６：６３）。理論によって拘束されることを望むものではないが、メソテリンの阻害、例えば抗メソテリン抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣによる結合は、ＴＧＦ－β（形質転換成長因子β）シグナル伝達の抑制を介して、逆の過程である間葉上皮転換（ＭＥＴ）を誘導することによってＥＭＴを低減し得ると考えられる。逆に、メソテリンの過剰発現は、腫瘍進行及び治療反応不良に関連する癌幹細胞様表現型の誘導を通してＥＭＴを促進し得ると考えられる（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．１６：６３；Ｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２７（４）：１２５４－１２７０）。

【0006】

癌治療でよく直面する課題は、化学療法薬の治療指数が限られているため、正常組織に深刻な毒性が生じ、従ってその治療上の有用性が限られることである。癌細胞のターゲティングに際して高い特異性を実現する１つの手法は、特定の腫瘍特異抗原を発現する細胞に細胞毒性効果が送達される一方、かかる抗原の発現レベルがはるかに低いか又はそれを発現しない正常細胞が温存されるように抗体を使用することによるものである（Ａｗｗａｄ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２０１８）１０（３）；Ｌａｍｂｅｒｔ ａｎｄ Ｂｅｒｋｅｎｂｌｉｔ（２０１８）６９：１９１－２０７）。かかる腫瘍特異的ターゲティングを利用すると、抗腫瘍活性の増加及び治療薬のオフターゲット細胞毒性の低下の両方を得ることができる。腫瘍特異抗原を標的とする抗体は、抗原の生物学的活性の阻害、免疫エフェクター活性の惹起及び／又は抗体依存性細胞毒性の誘導を含む種々の機構を通して細胞毒性効果を送達し得る（Ｈｅｎｄｒｉｎｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１７）；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１２）：１６３－１９６，４５９－５９５）。

【0007】

抗体ベースの治療手法のための腫瘍特異抗原の選択には、腫瘍細胞による抗原の特異的発現及びその抗原を発現する腫瘍細胞のロバストな殺傷が関わり得る。幾つかのヒト癌は、肺癌、卵巣癌、膵癌及び胃癌を含めて、高レベルのメソテリンを発現することが認められている（Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００８）４４（１）：４６－５３；Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１６）３４（３４）：４１７１－４１７９）。メソテリン発現は、チェックポイント遮断免疫療法に対する臨床反応が不良である、ＫＲＡＳ及びＳＴＫ１１突然変異を有する肺癌並びにＨＥＲ２陰性胃癌など、薬剤抵抗性癌にも認められている。加えて、肺腺癌患者及び胃癌転移患者のメソテリン発現と全生存との間に相関があることが報告されており、メソテリン高発現が、臨床転帰の悪化を予測する因子であり得ることが示唆される（Ｋａｃｈａｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２０（４）：１０２０－１０２８；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５１（２）：１２２－１２８）。ヒト癌におけるメソテリン発現の保有率及び臨床転帰不良とのその関連性により、メソテリンは、腫瘍抗原特異的薬物送達手法、例えば抗体媒介手法の潜在的な標的となる。化学療法薬などの細胞毒性化合物とコンジュゲートした抗体は、腫瘍細胞への抗体ベースの薬物送達の細胞殺傷活性を亢進させることも探究されている。それにも関わらず、効率的な腫瘍ターゲティング、オンターゲット効果、バイスタンダー殺傷及び／又はオフターゲット効果の低下の組み合わせをもたらす好適な抗体及び／又はＡＤＣを提供することが依然として必要とされている。

【0008】

エリブリンは、大環状化合物ハリコンドリンＢの合成類似体であり、チューブリン重合、微小管集合及びチューブリン依存性ＧＴＰ加水分解の強力な阻害薬であることが以前に示されている。チューブリンは、細胞内遊走及び輸送、細胞シグナル伝達、細胞形状の維持及び細胞分裂を含む種々の生体細胞機能に関与する、微小管と呼ばれる動的な糸状の細胞骨格タンパク質を構成する。癌細胞は、分裂速度が急速であるため、チューブリン機能の妨害に対する感受性が特に高い。そのため、ハリコンドリンＢ及びエリブリンは、インビトロ及びインビボで顕著な抗癌活性を実証している（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５（１２）：４２１３－４２１９；Ｖａｈｄａｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７（１８）：２９５４－２９６１）。現在、不応性転移性乳癌患者の治療向けにエリブリンのメシル酸塩（エリブリンメシレート）が商品名Ｈａｌａｖｅｎ（商標）で販売されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

当技術分野では、ＡＤＣのコンテクストを含めてエリブリンの使用が報告されているが、特定の組織、例えばメソテリンを発現する癌組織に標的化した方式でエリブリンをより良好に送達することが依然として必要とされている。同様に、当技術分野では、例えば、抗原結合性及び／又はメソテリンを発現する標的細胞若しくは組織にエリブリンなどのペイロードを有効に送達する能力の点で優れた特性を備えた、メソテリンに結合する改良された抗体が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

様々な実施形態において、本開示は、一部には、単独で使用されるか、１つ以上の追加の薬剤に（例えば、ＡＤＣとして）連結して使用されるか、又は大型高分子の一部として使用され（例えば、二重特異性抗体、多重特異性抗体であって、単独のもの又はＡＤＣフォーマットでペイロードに連結した多重特異性抗体としてのもの）及び医薬組成物又は併用療法の一部として投与され得る新規抗体及び抗原結合断片を提供する。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト化されている。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限のみ含み、ヒトにおける免疫原性を抑えながら、非ヒト抗体の反応性を維持している。特定の実施形態において、抗体及び抗原結合断片は、ヒト癌患者の治療に有用であり得る。

【0011】

本開示は、より具体的には、様々な実施形態において、腫瘍細胞に結合し且つ／又はそれを殺傷する能力を有する抗体及び抗体－薬物コンジュゲート化合物に関する。様々な実施形態において、本化合物は、結合後に標的細胞にインターナライズする能力も有する。エリブリン薬物部分を抗体部分に結び付けるリンカーを含むＡＤＣ化合物が開示される。抗体部分は、完全長抗体又は抗原結合断片であり得る。

【0012】

一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、Ｋａｂａｔの付番方式（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１）））によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式（国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ（登録商標）））によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0013】

一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からの３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からの３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0014】

一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片である。様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域又はこれらの開示される配列と少なくとも９０％同一の配列を含む可変領域を含む。様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む。様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0015】

様々な実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、Ｋａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１９（ＨＣＤＲ１）、配列番号２０（ＨＣＤＲ２）及び配列番号２１（ＨＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号２２（ＬＣＤＲ１）、配列番号２３（ＬＣＤＲ２）及び配列番号２４（ＬＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号２５（ＨＣＤＲ１）、配列番号２６（ＨＣＤＲ２）及び配列番号２７（ＨＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号２８（ＬＣＤＲ１）、配列番号２９（ＬＣＤＲ２）及び配列番号３０（ＬＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0016】

様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号３１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３２の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号３３の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号３４の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号３５の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0017】

一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、完全長抗体である。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、単一特異性抗体若しくは抗原結合断片、二重特異性抗体若しくは抗原結合断片又は多重特異性抗体若しくは抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ断片である。

【0018】

様々な実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、療法剤、例えば１つ以上の小分子及び／又は追加の抗体若しくは抗原結合断片にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、療法剤は、エリブリンである。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４である。

【0019】

様々な実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣは、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含み；
Ｄは、療法剤、例えばエリブリン部分であり；
Ｌは、ＡｂをＤに共有結合的に結び付ける切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
を含む。

【0020】

一部の実施形態において、ｐは、１～６の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２又は６である。

【0021】

一部の実施形態において、ＡＤＣは、切断時にリンカー又は抗体若しくは抗原結合断片のいかなる一部も療法剤（例えば、エリブリン）に結合されたままであることがないように配置される切断可能な部分を含む切断可能なリンカーを含む。一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、カテプシンＢなどの酵素によって切断可能である切断可能なペプチド部分を含む。一部の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えばＶａｌ－Ｃｉｔなどのアミノ酸単位を含む。一部の実施形態において、アミノ酸単位は、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含む。

【0022】

一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、少なくとも１つのＰＥＧ部分を含む少なくとも１つのスペーサー単位を含む。一部の実施形態において、スペーサー単位又はリンカーは、（ＰＥＧ）_２を含む。一部の実施形態において、スペーサー単位は、マレイミド（Ｍａｌ）部分を介して抗体部分に結び付いている（「Ｍａｌ－スペーサー単位」）。一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、抗体又は抗原結合断片上のシステイン残基（例えば、抗体上のＬＣｃｙｓ８０残基）を介して抗体又は抗原結合断片につなぎ合わされる。一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のシステイン残基（例えば、ＬＣｃｙｓ８０）につなぎ合わされる。一部の実施形態において、ｐは、２であり、従って２つの－Ｌ－Ｄ部分が抗体又は抗原結合断片に結び付けられる。一部の実施形態において、各－Ｌ－Ｄ部分は、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のシステイン残基（例えば、ＬＣｃｙｓ８０）に結び付けられる。一部の実施形態において、システイン残基は、ＬＣｃｙｓ８０、即ちＫａｂａｔの付番方式による、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のアミノ酸位置８０位におけるシステイン残基である。一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、Ｍａｌ－スペーサー単位及び切断可能なペプチド部分を含み、切断可能なペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む。一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、抗体又は抗原結合断片を切断可能な部分に結び付ける。

【0023】

一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、少なくとも１つのＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２を含む。一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、抗体部分をリンカー中の切断可能な部分に結び付ける。一部の実施形態において、リンカー中の切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えばアミノ酸単位である。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む。

【0024】

一部の実施形態において、ＡＤＣの切断可能な部分は、エリブリンに直接つなぎ合わされるか、又はスペーサー単位は、リンカー中の切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結び付け、コンジュゲートの切断は、抗体又は抗原結合断片及びリンカーからエリブリンを放出する。

【0025】

一部の実施形態において、切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結び付けるスペーサー単位は、自己犠牲性である。一部の実施形態において、自己犠牲性スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）を含む。一部の実施形態において、ｐＡＢスペーサー単位は、Ｃ－３５アミンを介して切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結び付ける。一部の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えばアミノ酸単位である。一部の実施形態において、切断可能なリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む。一部の実施形態において、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢと、リンカーをＭａｌ部分で抗体部分につなぎ合わせるＰＥＧスペーサー単位とを含む。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む。

【0026】

様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク又は１つ以上の復帰突然変異を有するヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークを含む。様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む。様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0027】

様々な実施形態において、ＡＤＣは、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数であり、例えば、ｐは、２～６又は３～４の整数である）
を有する。

【0028】

一部の実施形態において、ｐは、１～６の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２又は６である。

【0029】

様々な実施形態において、ＡＤＣ（例えば、上記に記載されるＡＤＣ）の抗体又は抗原結合断片は、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク又は１つ以上の復帰突然変異を有するヒト重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークを含む。様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む。様々な実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0030】

様々な実施形態において、ＡＤＣは、式Ｉ：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つ配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数であり、例えば、ｐは、２～６又は３～４の整数である）
を有する。

【0031】

一部の実施形態において、ｐは、１～６の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２又は６である。

【0032】

一部の実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＩｇκ軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0033】

様々な実施形態において、本明細書では、記載される抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣ組成物を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載される１つ以上の抗体若しくは抗原結合断片及び／又は１つ以上のＡＤＣを、少なくとも薬学的に許容可能な担体と共に含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの複数のコピーを含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に開示されるＡＤＣの複数のコピーを含み、ＡＤＣの平均ｐは、約１～約６である。一部の実施形態において、組成物中のＡＤＣの平均ｐは、約１．７若しくは２又は約６である。

【0034】

様々な実施形態において、本明細書では、例えば癌の治療における、記載される抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣ組成物の治療的使用が提供される。特定の態様において、本開示は、メソテリンなど、抗体、抗原結合断片及び／又はコンジュゲート若しくはＡＤＣの抗体部分が標的とする抗原を発現する癌を治療する方法を提供する。特定の態様において、本開示は、本明細書に記載される抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣのいずれか１つの治療上有効な量及び／又はレジメンを投与することにより、腫瘍細胞又は癌細胞を殺傷するか又はその増殖を阻害する方法を提供する。一部の実施形態において、癌は、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、卵巣癌（例えば、漿液性又は明細胞性卵巣癌）、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病などのメソテリン発現癌である。

【0035】

特定の態様において、本開示は、例えば、癌（例えば、メソテリン発現癌）を有するか又は有する疑いがある対象が、メソテリンを標的とする薬剤、例えば本明細書に開示される抗体又は抗体結合断片、コンジュゲート又はＡＤＣによる治療に反応することになるかどうかを決定するための、記載される抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣ化合物及び組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、本方法は、対象からの生体試料を提供することと；試料を、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片と接触させることと；試料中の１つ以上の癌細胞への抗体又は抗原結合断片の結合を検出することとを含む。

【0036】

特定の他の態様において、本開示は、抗体若しくは抗体結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣと、薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。開示される抗体又は抗体結合断片、コンジュゲート又はＡＤＣ化合物及び組成物を作製する方法も提供される。

【0037】

一部の実施形態において、本開示の抗体又は抗原結合断片、コンジュゲート又はＡＤＣをコードする１つ又は複数の核酸配列が提供される。この１つ又は複数の核酸は、単離核酸、含む単離ベクターに取り込まれた核酸及び／又は抗体若しくは抗原結合断片を産生するために好適な条件下で細胞集団によって発現される抗体又は抗原結合断片の形態であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】フローサイトメトリーによるヒトメソテリンに対する免疫血清の特異的反応性の検出を示す。

【図2】ＥＬＩＳＡによるヒトメソテリンに対する培養上清の特異的反応性の検出を示す。

【図3】ゲル電気泳動による抗メソテリン抗体のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ増幅を示す。

【図4】Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング及び発現のための抗メソテリンクローンを示す。

【図5】精製した４８個のＲｂ－ｈｕ－ｘｉ抗メソテリン抗体の概要を示す。

【図6A】抗メソテリン－ＡｕＦコンジュゲートについてのインビトロ細胞ベース効力の結果を示す。

【図6B】抗メソテリン－ＡｕＦコンジュゲートについてのインビトロ細胞ベース効力の結果を示す。

【図7】エピトープビニングによる抗メソテリン抗体の特徴付けを示す。

【図8】ヒト化３４５Ａ１２抗体についてのＤＳＣ分析結果を示す。３４５Ａ１２ Ｆ（ａｂ’）２断片を、１００℃／時間の走査速度を用いて２５～１００℃の範囲の熱分析に供した。

【図9】様々なマトリックスにおけるＭＯＲＡｂ－１０９（３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリン）（ＤＡＲ２）の安定性を示す。

【図10A】２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は２．５ｍｇ／ｋｇの１０２Ａ６Ａ２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣで治療したヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＮＣＩ－Ｈ２１１０異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１０Ａ）及び体重変化（図１０Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－００４－２０１６）。

【図10B】２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は２．５ｍｇ／ｋｇの１０２Ａ６Ａ２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣで治療したヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＮＣＩ－Ｈ２１１０異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１０Ａ）及び体重変化（図１０Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－００４－２０１６）。

【図11A】３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ（５、１０、１５又は２０ｍｇ／ｋｇ）（図１１Ａ）又は３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ（５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇ）（図１１Ｂ）で治療した雌ＣＤ－１マウスの体重変化を示す（研究Ｍ１０９－００６－２０１７）。

【図11B】３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ（５、１０、１５又は２０ｍｇ／ｋｇ）（図１１Ａ）又は３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ（５、１０又は２０ｍｇ／ｋｇ）（図１１Ｂ）で治療した雌ＣＤ－１マウスの体重変化を示す（研究Ｍ１０９－００６－２０１７）。

【図12A】２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣで治療したヒトＮＳＣＬＣ ＮＣＩ－Ｈ２１１０異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１２Ａ）及び体重変化（図１２Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－００７－２０１７）。

【図12B】２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣで治療したヒトＮＳＣＬＣ ＮＣＩ－Ｈ２１１０異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１２Ａ）及び体重変化（図１２Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－００７－２０１７）。

【図13A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１３Ａ）及び体重変化（図１３Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－０１０－２０１８）。

【図13B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１３Ａ）及び体重変化（図１３Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－０１０－２０１８）。

【図14A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）又はエリブリンで治療したヒト中皮腫ＨＡＹ異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１４Ａ）及び体重変化（図１４Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－０１０－２０１８）。

【図14B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）又はエリブリンで治療したヒト中皮腫ＨＡＹ異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１４Ａ）及び体重変化（図１４Ｂ）を示す（研究Ｍ１０９－０１０－２０１８）。

【図15A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）又はエリブリンで治療したヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）における抗腫瘍効果（図１５Ａ）及び体重変化（図１５Ｂ）を示す。

【図15B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）又はエリブリンで治療したヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）における抗腫瘍効果（図１５Ａ）及び体重変化（図１５Ｂ）を示す。

【図16A】種々のＤＡＲ種のＭＯＲＡｂ－１０９又はエリブリンで治療したヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）における抗腫瘍効果（図１６Ａ）及び体重変化（図１６Ｂ）を示す。

【図16B】種々のＤＡＲ種のＭＯＲＡｂ－１０９又はエリブリンで治療したヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）における抗腫瘍効果（図１６Ａ）及び体重変化（図１６Ｂ）を示す。

【図17】様々な細胞株におけるメソテリン（ＭＳＬＮ）発現と、エリブリン及びＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）のインビトロ効力（ＩＣ_５０）との間の相関分析を示す。全５１種の細胞株及びメソテリン発現レベルが高い（平均蛍光強度（ＭＦＩ）のＦＡＣＳ染色８０以上の）細胞株のサブセットでＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）の相関を分析した。メソテリン発現レベルが低い（ＭＦＩのＦＡＣＳ染色８０未満の）細胞株は、このサブセットから除外した。

【図18A】５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の種々の用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１８Ａ及び図１８Ｂ）及び体重変化（図１８Ｃ）を示す。

【図18B】５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の種々の用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１８Ａ及び図１８Ｂ）及び体重変化（図１８Ｃ）を示す。

【図18C】５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の種々の用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図１８Ａ及び図１８Ｂ）及び体重変化（図１８Ｃ）を示す。

【図19】５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲の種々の用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）による治療後のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍担持マウスにおける全抗体及びインタクトＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。

【図20A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（０．１又は３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ－３－Ａ１－Ｔ１異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図２０Ａ）及び体重変化（図２０Ｂ）を示す。

【図20B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（０．１又は３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ－３－Ａ１－Ｔ１異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図２０Ａ）及び体重変化（図２０Ｂ）を示す。

【図21A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１０ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（０．１又は３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＣ－Ｆ－２５）における抗腫瘍効果（図２１Ａ）及び体重変化（図２１Ｂ）を示す。

【図21B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１０ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（０．１又は３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＣ－Ｆ－２５）における抗腫瘍効果（図２１Ａ）及び体重変化（図２１Ｂ）を示す。

【図22A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１０ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（０．２又は３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＡ－７３７）における抗腫瘍効果（図２２Ａ）及び体重変化（図２２Ｂ）を示す。

【図22B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１０ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（０．２又は３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＡ－７３７）における抗腫瘍効果（図２２Ａ）及び体重変化（図２２Ｂ）を示す。

【図23A】１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデル（各群３匹のマウス）における抗腫瘍効果（図２３Ａ）及び体重変化（図２３Ｂ）を示す。

【図23B】１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデル（各群３匹のマウス）における抗腫瘍効果（図２３Ａ）及び体重変化（図２３Ｂ）を示す。

【図24A】１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療した後のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍担持マウスからの血漿試料中におけるＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（図２４Ａ）又はＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）（図２４Ｂ）のＤＡＲを示す。

【図24B】１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療した後のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍担持マウスからの血漿試料中におけるＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（図２４Ａ）又はＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）（図２４Ｂ）のＤＡＲを示す。

【図25A】ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞に対するＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（図２５Ａ）又はＢＡＹ ９４－９３４３（図２５Ｂ）の細胞毒性（％殺傷率）を示す。両方の抗ＭＳＬＮ ＡＤＣを単独で及び非コンジュゲート型抗体の存在下で評価した。

【図25B】ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌細胞に対するＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（図２５Ａ）又はＢＡＹ ９４－９３４３（図２５Ｂ）の細胞毒性（％殺傷率）を示す。両方の抗ＭＳＬＮ ＡＤＣを単独で及び非コンジュゲート型抗体の存在下で評価した。

【図26A】ルシフェラーゼアッセイにより測定したときの、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４（図２６Ａ）又はＢＡＹ ９４－９３４３及びアネツマブ（図２６Ｂ）のＡＤＣＣ活性を示す。ＡＤＣＣ活性は、相対曲線下面積（ＡＵＣ）によって計算した。

【図26B】ルシフェラーゼアッセイにより測定したときの、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４（図２６Ａ）又はＢＡＹ ９４－９３４３及びアネツマブ（図２６Ｂ）のＡＤＣＣ活性を示す。ＡＤＣＣ活性は、相対曲線下面積（ＡＵＣ）によって計算した。

【図27】マウス及びヒト血漿中における抗ＭＳＬＮ ＡＤＣ、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及びＢＡＹ ９４－９３４３の安定性分析を示す。

【図28A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図２８Ａ）及び体重変化（図２８Ｂ）を示す。

【図28B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図２８Ａ）及び体重変化（図２８Ｂ）を示す。

【図29A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト中皮腫ＨＡＹ異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図２９Ａ）及び体重変化（図２９Ｂ）を示す。

【図29B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト中皮腫ＨＡＹ異種移植モデルにおける抗腫瘍効果（図２９Ａ）及び体重変化（図２９Ｂ）を示す。

【図30A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（１０ｍｇ／ｋｇ）、エリブリン（１ｍｇ／ｋｇ）又はＤＭ４（０．３ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）における抗腫瘍効果（図３０Ａ）及び体重変化（図３０Ｂ）を示す。

【図30B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（１０ｍｇ／ｋｇ）、エリブリン（１ｍｇ／ｋｇ）又はＤＭ４（０．３ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）における抗腫瘍効果（図３０Ａ）及び体重変化（図３０Ｂ）を示す。

【図31A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）（２５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＡ－５８６）における抗腫瘍効果（図３１Ａ）及び体重変化（図３１Ｂ）を示す。

【図31B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）（２５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＡ－５８６）における抗腫瘍効果（図３１Ａ）及び体重変化（図３１Ｂ）を示す。

【図32A】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１２．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ×３）、ＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）（１２．５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＬ－５２９）における抗腫瘍効果（図３２Ａ）及び体重変化（図３２Ｂ）を示す。

【図32B】ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）（１２．５ｍｇ／ｋｇ、ＱＷ×３）、ＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）（１２．５ｍｇ／ｋｇ）又はエリブリン（３．２ｍｇ／ｋｇ）で治療したヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＬ－５２９）における抗腫瘍効果（図３２Ａ）及び体重変化（図３２Ｂ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

開示される組成物及び方法は、この説明の一部を成す添付の図と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、更に容易に理解され得る。本明細書で使用される用語法は、あくまでも詳細な実施形態を例として説明することを目的とするに過ぎず、文脈上特に指示がない限り、特許請求される組成物及び方法を限定する意図はないことが理解されるべきである。

【0040】

本明細書全体を通して、本説明は組成物及びその組成物の使用方法に言及している。本開示が、ある組成物に関連する特徴又は実施形態を説明又は特許請求する場合、かかる特徴又は実施形態は、その組成物の使用方法にも等しく適用可能である。同様に、本開示が、ある組成物の使用方法に関連する特徴又は実施形態を説明又は特許請求する場合、かかる特徴又は実施形態は、その組成物にも等しく適用可能である。

【0041】

値の範囲が表されるとき、それには、その範囲内にある任意の特定の値を用いる実施形態が含まれる。更に、範囲で記述される値への言及には、その範囲内にあるあらゆる値が含まれる。いずれの範囲も、その端点を含み、且つ組み合わせ可能である。先行語「約」の使用によって値が近似値として表されるとき、その特定の値が別の実施形態を成すことが理解されるであろう。特定の数値への言及には、文脈上特に明確に指示されない限り、少なくともその特定の値が含まれる。「又は」の使用は、その使用の具体的な文脈上特に指示されない限り、「及び／又は」を意味するものとする。本明細書に引用する全ての参考文献は、あらゆる目的で参照によって援用される。参考文献と本明細書が矛盾する場合、本明細書が優先するものとする。

【0042】

明確にするため、本明細書において別々の実施形態に関連して説明されている本開示の組成物及び方法の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせても提供され得ることが理解されるべきである。逆に、簡略にするため、単一の実施形態に関連して説明されている本開示の組成物及び方法の様々な特徴は、別々に又は任意の部分的な組み合わせでも提供され得る。

【0043】

定義
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、本説明の態様に関して様々な用語が用いられる。特に指示されない限り、かかる用語には、当技術分野におけるその通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と整合するように解釈されるべきである。

【0044】

本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈上特に明確に指示されない限り、複数形を含む。

【0045】

数的な値及び範囲の文脈で用語「約」又は「およそ」は、本明細書に含まれる教示から当業者に明らかなとおり、反応混合物中に所望の量の核酸又はポリペプチドを有するなど、実施形態が意図したとおりに機能し得るような、記載される値又は範囲に近似するか又はそれに近い値又は範囲を指す。従って、これらの用語は、系統誤差から生じる値を超える値を包含する。一部の実施形態において、約とは、数的な量の±１０％を意味する。

【0046】

用語「抗体－薬物コンジュゲート」、「抗体コンジュゲート」、「コンジュゲート」、「イムノコンジュゲート」及び「ＡＤＣ」は、同義的に使用され、治療用化合物（例えば、エリブリン部分）が抗体部分に連結しているものを指し、一般式：Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ（式Ｉ）（式中、Ａｂは、抗体部分（例えば、抗体又は抗原結合断片）であり、Ｌは、リンカー部分であり、Ｄは、薬物部分（例えば、エリブリン薬物部分）であり、及びｐは、各抗体部分の薬物部分の数である）によって定義される。エリブリン薬物部分を含むＡＤＣにおいて、「ｐ」は、抗体部分に連結したエリブリン部分の数を指す。一部の実施形態において、リンカーＬは、抗体部分と治療用化合物とに直接結び付くことのできる切断可能な部分を含むか、又は切断可能な部分は、１つ若しくは複数のスペーサー単位によって抗体部分及び治療用化合物のいずれか若しくは両方に結び付けられ得る。一部の実施形態において、スペーサー単位が切断可能な部分を治療用化合物に結び付けるとき、それは、自己犠牲性スペーサー単位である。

【0047】

用語「抗体」は、最も広義には、免疫グロブリン分子の可変領域内にある少なくとも１つの抗原認識部位を介してタンパク質、ポリペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は前述の組み合わせなどの標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指して使用される。抗体の重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とで構成される。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。本願の目的上、成熟重鎖及び軽鎖可変ドメインは、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）内においてＮ末端からＣ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４に並んで含む。「抗体」は、天然に存在するもの又は従来のハイブリドーマ技術によって作製されるモノクローナル抗体などの人工的なものであり得る。用語「抗体」には、完全長モノクローナル抗体及び完全長ポリクローナル抗体並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び単鎖抗体などの抗体断片が含まれる。抗体は、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ又はそのサブクラス（例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のいずれか１つであり得る。この用語は、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び所望の生物学的活性を示す限り、抗原認識部位を含有する任意の修飾免疫グロブリン分子を更に包含する。

【0048】

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を占める個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原エピトープを対象とする。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体製剤は、典型的には、異なるエピトープを対象とする（又はそれに特異的な）多数の抗体を含む。修飾語句「モノクローナル」は、その抗体が実質的に均質な抗体集団から得られているという特徴を指示するものであり、その抗体が任意の特定の方法によって作製されている必要があると解釈されてはならない。例えば、本開示において使用されることになるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－８及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－９７に記載される技法を用いてもファージ抗体ライブラリから単離され得る。

【0049】

本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である一方、１つ又は複数の鎖の残りの部分が、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体と、標的抗原に特異的に結合し、且つ／又は所望の生物学的活性を呈する限り、かかる抗体の断片とを含む。

【0050】

用語「キメラ抗体」は、本明細書で使用されるとき、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。一部の例では、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性及び活性を有する１つの種に由来する抗体の可変領域に対応する一方、定常領域は、別の種（例えば、ヒト）に由来する抗体と相同であり、それにより後者の種における免疫応答が最小限に抑えられる。

【0051】

本明細書で使用されるとき、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、ウサギ）抗体及びヒト抗体からの配列を含む抗体の形態を指す。かかる抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことになる。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性及び／又は活性の精密化及び最適化のため、Ｆｖフレームワーク領域及び／又は置き換えられた非ヒト残基内のいずれかにある残基の置換によって更に修飾され得る。

【0052】

抗体の「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原（例えば、メソテリン）に特異的に結合する能力を保持している抗体又はタンパク質の１つ以上の断片を指す。抗原結合断片は、抗原発現細胞にインターナライズする能力も保持していることができる。一部の実施形態において、抗原結合断片は、免疫エフェクター活性も保持している。完全長抗体の断片が完全長抗体の抗原結合機能を果たし得ることが示されている。抗体の「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）単一の可変ドメイン、例えばＶＨドメインを含むｄＡｂ断片（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－６；及び国際公開第１９９０／００５１４４号パンフレットを参照されたい）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いると、これらを合成リンカーによってつなぎ合わせることができ、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）として作製することが可能となる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３を参照されたい。かかる単鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」又は「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されることが意図され、当技術分野では、結合時に細胞内にインターナライズすることのできる例示的なタイプの結合断片として公知である（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）９：２１３１－４１；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５１：４２７－３２；及びＦｉｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＭＡｂｓ ７：３９０－４０２を参照されたい）。特定の実施形態において、ｓｃＦｖ分子は、融合タンパク質に組み込まれ得る。ダイアボディなど、他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現する二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を許容しないほど短いリンカーを使用し、従ってそれらのドメインが強制的に別の鎖の相補ドメインと対合して２つの抗原結合部位を作り出す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－８；及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－３を参照されたい）。抗原結合断片は、当業者に公知の従来技法を用いて得られ、そうした結合断片は、インタクトな抗体と同じ方法で有用性（例えば、結合親和性、インターナリゼーション）に関してスクリーニングされる。抗原結合断片は、インタクトなタンパク質を例えばプロテアーゼ又は化学的切断によって切断することにより調製され得る。

【0053】

「インターナリゼーション性」は、抗体又は抗原結合断片に関連して本明細書で使用されるとき、細胞への結合時に細胞の脂質二重層膜を通して内部コンパートメント、典型的には細胞の分解性コンパートメント内に取り込まれる（即ち「インターナライズされる」）能力を有する抗体又は抗原結合断片を指す。例えば、インターナリゼーション性抗メソテリン抗体は、細胞膜上のメソテリンへの結合後に細胞内に取り込まれる能力を有するものである。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣに使用される抗体又は抗原結合断片は、インターナリゼーション性抗体又はインターナリゼーション性抗原結合断片を介して（ＡＤＣが抗原結合後に細胞膜を通して移行することが可能となる）、細胞表面抗原（例えば、メソテリン）を標的化する。

【0054】

用語「メソテリン」又は「ＭＳＬＮ」は、本明細書で使用されるとき、任意の天然形態のヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）を指す。この用語は、完全長メソテリン（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＡＡＣ５０３４８．１）及び細胞プロセシングから生じる任意の形態のヒトメソテリンを包含する。この用語は、限定はされないが、スプライス変異体、アレル変異体及びアイソフォームを含めて、メソテリンの天然に存在する変異体も包含する。メソテリンは、ヒトから単離され得るか、又は組換えで若しくは合成方法により作製され得る。この用語は、抗メソテリン抗体、例えば本明細書に開示される抗体及び／又は抗原結合断片が特異的に結合することのできる任意の合成変異体も包含し得る。

【0055】

用語「抗メソテリン抗体」又は「メソテリンに特異的に結合する抗体」は、メソテリンに特異的に結合する任意の形態の抗体又はその断片を指し、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体及びメソテリンに特異的に結合する限り、生物学的に機能性の抗体断片を包含する。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣに使用される抗メソテリン抗体は、インターナリゼーション性抗体又はインターナリゼーション性抗体断片である。３４５Ａ１２（例えば、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４）及び１０２Ａ６Ａ２は、例示的なインターナリゼーション性抗ヒトメソテリン抗体である。本明細書で使用されるとき、用語「特異的」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」及び「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、抗体が標的抗原エピトープに選択的に結合することを指す。抗体は、所与の条件の組の下において、適切な抗原への結合を無関係な抗原又は抗原混合物への結合と比較することにより、結合の特異性に関して試験することができる。抗体が、無関係な抗原又は抗原混合物と比べて少なくとも２、５、７又は１０倍高い親和性で適切な抗原に結合する場合、それは、特異的と見なされる。「特異的抗体」又は「標的特異的抗体」は、標的抗原（例えば、ヒトメソテリン）にのみ結合し、しかし他の抗原に結合しない（又は最小限の結合のみを呈する）ものである。

【0056】

用語「エピトープ」は、抗体によって認識され、且つ特異的に結合される能力を有する抗原の一部分を指す。抗原がポリペプチドであるとき、エピトープは、連続アミノ酸で形成され得るか、又はポリペプチドが三次構造に折り畳まれることにより隣り合って並ぶ非連続アミノ酸で形成され得る。抗体によって結合されるエピトープは、抗原－抗体複合体の直接的な視覚化によるエピトープ同定のためのＸ線結晶学並びに抗体による抗原の断片若しくは突然変異変種への結合のモニタリング又は抗体及び抗原の種々の部分の溶媒露出度のモニタリングを含めて、当技術分野において公知の任意のエピトープマッピング技法を用いて同定され得る。抗体エピトープのマッピングに使用される例示的戦略としては、限定はされないが、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、タンパク質限定分解、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピング、水素－重水素交換及び質量分析法が挙げられる（例えば、Ｇｅｒｓｈｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）２１：１４５－５６；及びＨａｇｅｒ－Ｂｒａｕｎ ａｎｄ Ｔｏｍｅｒ（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２：７４５－５６を参照されたい）。

【0057】

競合的結合及びエピトープビニングも、同一の又は重複するエピトープを共有する抗体の決定に用いることができる。競合的結合は、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１^ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ １９８８，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１４）に記載されるアッセイなど、クロスブロッキングアッセイを用いて評価することができる。一部の実施形態では、クロスブロッキングアッセイにおいて参照抗体又は結合タンパク質（例えば、表１～表３に特定されるものから選択されるＣＤＲ及び／又は可変ドメインを含む結合タンパク質）によるメソテリンなどの標的抗原への結合が試験抗体又は結合タンパク質によって少なくとも約５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．５％若しくはそれを超えるか又はその間にある任意のパーセンテージ）だけ低下するとき及び／又はその逆のとき、競合的結合が同定される。一部の実施形態において、競合的結合は、共有されているか若しくは同様の（例えば、部分的に重複している）エピトープに起因し得るか、又は抗体若しくは結合タンパク質が近傍のエピトープに結合する立体障害に起因し得る（例えば、Ｔｚａｒｔｏｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｏｒｒｉｓ，ｅｄ．（１９９８）ｖｏｌ．６６，ｐｐ．５５－６６）を参照されたい）。一部の実施形態では、競合的結合を用いて、同様のエピトープを共有する結合タンパク質群を分取することができる。例えば、結合に関して競合する結合タンパク質は、重複するか又は近傍のエピトープを有する結合タンパク質群として「ビンに入れる」ことができる一方、競合しないものは、重複するか又は近傍のエピトープを有しない別の結合タンパク質群に分けられる。

【0058】

用語「ｋ_ｏｎ」又は「ｋ_ａ」は、抗体／抗原複合体を形成するための抗原への抗体の会合についてのオン速度定数を指す。この速度は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法又はＥＬＩＳＡアッセイなどの標準アッセイを用いて決定することができる。

【0059】

用語「ｋ_ｏｆｆ」又は「ｋ_ｄ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についてのオフ速度定数を指す。この速度は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法又はＥＬＩＳＡアッセイなどの標準アッセイを用いて決定することができる。

【0060】

用語「Ｋ_Ｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指す。Ｋ_Ｄは、ｋ_ａ／ｋ_ｄによって計算される。この速度は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法又はＥＬＩＳＡアッセイなどの標準アッセイを用いて決定することができる。

【0061】

用語「ｐ」、又は「薬物負荷量」、又は「薬物：抗体比」、又は「薬物対抗体比」、又は「ＤＡＲ」は、式（Ｉ）のＡＤＣにおける各抗体部分当たりの薬物部分の数、即ち各抗体又は抗原結合断片（Ａｂ）当たりの薬物負荷量又は－Ｌ－Ｄ部分の数を指す。エリブリン薬物部分を含むＡＤＣでは、「ｐ」は、抗体部分に連結したエリブリン部分の数を指す。例えば、２個のエリブリン部分が抗体部分に連結している場合、ｐ＝２である。式（Ｉ）のＡＤＣの複数のコピーを含む組成物では、「平均ｐ」は、ＡＤＣ集団中の各抗体又は抗原結合断片当たりの－Ｌ－Ｄ部分の数の平均を指し、「平均薬物負荷量」とも称される。

【0062】

「リンカー」又は「リンカー部分」は、本明細書では、化合物、通常、エリブリンなどの薬物部分を抗体部分などの別の部分に共有結合的につなぎ合わせる能力を有する任意の化学的部分を指して使用される。リンカーは、化合物又は抗体が活性のままである条件において、酸誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、光に基づく切断、エステラーゼ誘導切断及び／又はジスルフィド結合切断を起こし易いか、又はそれに対して実質的に抵抗性であり得る。

【0063】

用語「薬剤」は、本明細書では、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生物学的材料から作られる抽出物を指して使用される。用語「療法剤」又は「薬物」は、生物学的過程を調節する能力があり、且つ／又は生物学的活性を有する薬剤を指す。本明細書に記載されるエリブリン単量体は、例示的療法剤である。

【0064】

用語「化学療法剤」又は「抗癌剤」は、本明細書では、作用機序に関わらず、癌の治療に有効なあらゆる薬剤を指して使用される。転移又は血管新生の阻害は、多くの場合に化学療法剤の特性である。化学療法剤には、抗体、生体分子及び小分子が含まれ、本明細書に記載されるとおりのエリブリンが包含される。化学療法剤は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤であり得る。用語「細胞増殖抑制剤」は、細胞成長及び／又は細胞の増大を阻害又は抑制する薬剤を指す。用語「細胞毒性剤」は、主に細胞の発現活性及び／又は機能に干渉することによって細胞死を引き起こす物質を指す。

【0065】

用語「エリブリン」又は「エリブリン単量体」は、本明細書で使用されるとき、元々、海洋性海綿動物クロイソカイメン（Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉａ ｏｋａｄａｉ）から分離された大環状化合物であるハリコンドリンＢの合成類似体を指す。エリブリンは、微小管動態阻害薬であり、チューブリンに結合し、有糸分裂紡錘体集合を阻害することによってＧ２／Ｍ期の細胞周期停止を誘導すると考えられている。用語「エリブリンメシレート」は、商品名Ｈａｌａｖｅｎ（商標）で販売されているエリブリンのメシル酸塩を指す。例示的エリブリン類似体には、米国特許第６，２１４，８６５号明細書及び米国特許第６，６５３，３４１号明細書（これらは、開示されるエリブリン構造及びその構造の合成方法に関して参照により本明細書に援用される）に示され、及び説明されているものが含まれる。

【0066】

用語「エリブリン二量体」は、本明細書で使用されるとき、２個のエリブリン単量体が直接又は化学的リンカー（例えば、第二級アミン、ジヒドロキシル第二級アミン）のいずれかで共有結合又は非共有結合によって結び付いている二量体形態のエリブリンを指す。エリブリン二量体は、一部の実施形態では、Ｃ－３４位で第二級アミンによって共有結合的に連結した２個のエリブリン単量体又はＣ－３５位でジヒドロキシル第二級アミンによって共有結合的に連結した２個のエリブリン単量体からなり得る。Ｃ－３４位で第二級アミンによって共有結合的に連結した２個のエリブリン単量体からなるエリブリン二量体は、本明細書では、「脱ＯＨエリブリン二量体」と称され得る。Ｃ－３５位でジヒドロキシル第二級アミンによって共有結合的に連結した２個のエリブリン単量体からなるエリブリン二量体は、本明細書では、「ジＯＨエリブリン二量体」と称され得る。用語「エリブリン二量体薬物部分」は、エリブリン二量体の構造を提供するＡＤＣ又は組成物の成分、例えば式（Ｉ）のＡＤＣ中又は－Ｌ－Ｄを含む組成物中のエリブリン二量体（Ｄ）成分を指す。一部の実施形態において、脱ＯＨエリブリン二量体及び／又はジＯＨエリブリン二量体は、他のエリブリン二量体フォーマットと比べて向上したコンジュゲーション適合性をもたらす。

【0067】

用語「クリプトフィシン」は、本明細書で使用されるとき、元々、シアノバクテリアのノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）から分離されたマクロライド化合物であるクリプトフィシン－１又は抗チューブリン活性を保持しているその任意の合成類似体を指す。例示的クリプトフィシン類似体には、国際公開第２０１７／１３６７６９号パンフレット（これは、その開示される全てのクリプトフィシン構造及びそれらの構造の合成方法に関して参照により本明細書に援用される）に示され、及び説明されているものが含まれる。用語「クリプトフィシン薬物部分」は、クリプトフィシンの構造を有するＡＤＣ又は組成物の成分を指す。

【0068】

用語「相同体」は、例えば、対応する位置において同じ又は同様の化学的残基の配列を有することにより、別の分子との相同性を呈する分子を指す。

【0069】

用語「～を阻害する」又は「～の阻害」は、本明細書で使用されるとき、測定可能な大きさだけ減少させることを意味し、必須ではないが、完全な防止又は阻害を含み得る。

【0070】

用語「バイスタンダー殺傷」又は「バイスタンダー効果」は、標的陽性細胞の存在下における標的陰性細胞の殺傷を指し、標的陽性細胞の非存在下では、標的陰性細胞の殺傷が観察されない。標的陽性細胞と標的陰性細胞との間の細胞間接触又は少なくとも近接性がバイスタンダー殺傷を可能にする。この種の殺傷は、標的陰性細胞の無差別な殺傷を指す「オフターゲット殺傷」と区別可能である。「オフターゲット殺傷」は、標的陽性細胞の非存在下でも観察され得る。

【0071】

用語「癌」は、細胞集団が無制御な細胞成長によって特徴付けられる、哺乳類における生理的条件を指す。癌の例としては、限定はされないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられる。かかる癌の詳細な例としては、中皮腫、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、卵巣癌（例えば、漿液性、明細胞性又は上皮性卵巣癌）、膵癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌又は白血病などのメソテリン発現癌が挙げられる。

【0072】

用語「腫瘍」及び「新生物」は、前癌病変を含む、良性又は悪性のいずれかである過剰な細胞成長又は増殖によって生じる任意の組織塊を指す。

【0073】

用語「腫瘍細胞」は、非腫瘍原性細胞及び癌幹細胞の両方を含めて、腫瘍に由来する個々の細胞又は全細胞集団を指す。本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍細胞」は、単に再生及び分化能を欠いている腫瘍細胞を指す場合、用語「非腫瘍原性」で修飾されることになり、そうした腫瘍細胞が癌幹細胞と区別される。

【0074】

用語「対象」及び「患者」は、本明細書では、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含めた任意の哺乳類など、任意の動物を指して同義的に使用される。一部の実施形態において、哺乳類は、マウスである。一部の実施形態において、哺乳類は、ヒトである。

【0075】

「医薬組成物」は、投与を可能にし、続いて１つ又は複数の活性成分の意図した生物学的活性を提供するような形態及び／又は治療効果を実現するような形態の調製物であって、その製剤が投与されるであろう対象にとって許容し難いほど毒性の高い構成成分を他に含有しない調製物を指す。医薬組成物は、無菌であり得る。

【0076】

「医薬賦形剤」は、補助剤、担体、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、保存剤などの材料を含む。

【0077】

「薬学的に許容可能」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用が連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認済み若しくは承認見込みであること又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。

【0078】

例えば、本明細書に開示されるとおりの抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの「有効量」は、具体的に記載される目的を果たすのに十分である、例えば投与後に腫瘍成長速度又は腫瘍容積の低減、癌の症状又は他の何らかの治療有効性指標の低減などの治療効果をもたらすのに十分な量である。有効量は、記載される目的に関連したルーチンの方法で決定することができる。用語「治療有効量」は、対象の疾患又は障害を治療するのに有効な抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの量を指す。癌の場合、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの治療有効量は、癌細胞数を低減し、腫瘍サイズを低減し、腫瘍転移を阻害し（例えば、遅らせるか又は止める）、腫瘍成長を阻害し（例えば、遅らせるか又は止める）、且つ／又は１つ以上の症状を緩和することができる。「予防有効量」は、所望の予防結果の実現に必要な投薬量及び期間でそれに有効な量を指す。典型的には、予防用量は、疾患が起こる前の又は疾患の初期段階にある対象において用いられるため、予防有効量は、治療有効量より少ないことになる。

【0079】

本明細書で使用されるとき、「治療すること」又は「療法的」及び文法的に関連する用語は、生存期間の延長、低い罹患率及び／又は代替的な治療モダリティの副産物である副作用の軽減など、疾患の任意の帰結の任意の改善を指す。当技術分野で容易に理解されるとおり、疾患の完全な根絶が包含されるが、それが治療行為に必須というわけではない。「治療」又は「治療する」は、本明細書で使用されるとき、対象、例えば患者への、記載される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの投与を指す。治療とは、例えば、癌などの障害、障害の症状又は障害になり易い素因を根治すること、治癒すること、緩和すること、軽減すること、変化させること、改善すること、寛解させること、緩和すること、好転させること又はそれに影響を及ぼすことであり得る。一部の実施形態において、ある病態を有する対象を治療することに加えて、本明細書に開示される組成物は、その病態が発症する可能性を防止又は低減するために予防的に提供することもできる。

【0080】

一部の実施形態において、標識された抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣが使用される。好適な「標識」としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。

【0081】

「タンパク質」とは、本明細書で使用されるとき、少なくとも２つの共有結合的に結び付いたアミノ酸を意味する。この用語は、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを包含する。一部の実施形態において、２つ以上の共有結合的に結び付いたアミノ酸は、ペプチド結合によって結び付いている。例えば、タンパク質が発現システム及び宿主細胞を使用して組換えで作られるとき、タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合で構成され得る。代わりに、タンパク質は、合成アミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン及びノルロイシン）を含み得る。「組換えタンパク質」は、当技術分野において公知の任意の技法及び方法を用いた組換え技術を用いて、即ち組換え核酸の発現を通して作られたタンパク質である。組換えタンパク質の作製方法及び技法は、当技術分野において周知である。

【0082】

アミノ酸配列について、配列同一性及び／又は類似性は、限定はされないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７－９５によって記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔシーケンスプログラムであって、好ましくはデフォルト設定を使用するもの又は目視検査によることを含めて、当技術分野において公知の標準技法を用いて決定され得る。一部の実施形態において、パーセント同一性は、ＦａｓｔＤＢにより、以下のパラメータ：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップサイズペナルティ０．３３；及びジョイニングペナルティ３０に基づいて計算される（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ）。

【0083】

概して、本明細書に開示されるタンパク質及びその変異体、例えば標的抗原（メソテリンなど）の変異体、チューブリン配列の変異体及び抗体可変ドメインの変異体（個々の変異体ＣＤＲを含む）間のアミノ酸相同性、類似性又は同一性は、本明細書に示される配列と少なくとも８０％であり、例えば少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ほぼ１００％又は１００％の相同性又は同一性である。

【0084】

同じように、本明細書に特定される抗体及び他のタンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗原結合タンパク質のコード配列中のヌクレオチド残基と同一である、候補配列中にあるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。具体的な方法は、デフォルトパラメータに設定した、オーバーラップ幅及びオーバーラップ率をそれぞれ１及び０．１２５に設定したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。

【0085】

アミノ酸配列変異を導入する部位又は領域は、予め決められているが、突然変異自体は、予め決められたものでなくてもよい。例えば、所与の部位における突然変異のパフォーマンスを最適化するため、標的コドン又は領域でランダム突然変異誘発を行い、発現した抗原結合タンパク質ＣＤＲ変異体を所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングし得る。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め決められた部位に置換突然変異を作り出す技法は、例えば、ＭＩ３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発など、周知である。

【0086】

抗メソテリン抗体及び抗原結合断片
本開示は、様々な実施形態において、腫瘍細胞（例えば、メソテリン発現腫瘍細胞）に結合し且つ／又はそれを殺傷する能力を有する抗体又はその抗原結合断片並びにコンジュゲート及び治療用組成物におけるその使用に関する。

【0087】

一部の実施形態において、抗体は、単独で使用されるか、又は医薬組成物若しくは併用療法の一部及び／又はＡＤＣ中の抗体部分として投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗メソテリン抗体及び抗原結合断片は、そのままで（即ちコンジュゲートしていない形態で）且つＡＤＣ中の抗体部分として有用である。一部の実施形態において、抗メソテリン抗体及び抗原結合断片は、ヒト化されている。一部の実施形態において、抗メソテリン抗体及び抗原結合断片は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限のみ含み、ヒトにおける免疫原性を抑えながら、非ヒト（例えば、ウサギ）抗体の反応性を保持している。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗メソテリン抗体及び抗原結合断片は、当業者に公知の１つ以上の抗メソテリン抗体と比較したとき、向上した安定性、製剤化し易さ、凝集、結合親和性、治療有効性、オフターゲット毒性及び／又は代謝プロファイルの１つ以上を提供する。

【0088】

様々な実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、例えば、癌細胞上に発現するとおりのメソテリンに特異的に結合する。抗体又は抗原結合断片は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析により測定したとき、≦１ｍＭ、≦１００ｎＭ又は≦１０ｎＭ又はその間にある任意の大きさの解離定数（Ｋ_Ｄ）で標的抗原に結合し得る。特定の実施形態において、Ｋ_Ｄは、１ｐＭ～５００ｐＭである。一部の実施形態において、Ｋ_Ｄは、５００ｐＭ～１μＭ、１μＭ～１００ｎＭ又は１００ｍＭ～１０ｎＭである。

【0089】

一部の実施形態において、抗体部分は、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む４本鎖抗体である（免疫グロブリンとも称される）。一部の実施形態において、抗体部分は、２本鎖半抗体（１本の軽鎖及び１本の重鎖）又は免疫グロブリンの抗原結合断片である。

【0090】

一部の実施形態において、抗体部分は、抗体又はその抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗体部分は、インターナリゼーション性抗体又はそのインターナリゼーション性抗原結合断片である。一部の実施形態において、インターナリゼーション性抗体又はそのインターナリゼーション性抗原結合断片は、細胞の表面上に発現する標的癌抗原に結合し、結合次第、細胞に侵入する。一部の実施形態において、ＡＤＣのエリブリン薬物部分は、標的癌抗原を発現する細胞にＡＤＣが侵入してそこに存在するようになった後（即ちＡＤＣがインターナライズされ終えた後）、ＡＤＣの抗体部分から放出される。

【0091】

様々な実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、表３～表５に掲載されるものから取った対を成す重鎖及び軽鎖可変ドメインの組又は対を成す重鎖及び軽鎖の組からの６つのＣＤＲ配列の組、例えば表１～表２に掲載されるＣＤＲの組を含み得る。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク（任意選択で、結合親和性を改善するため１つ以上の復帰突然変異を含む）並びに／又はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン若しくはその断片を更に含む。例えば、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメイン（ＩｇＧ１など）及びヒトκ又はλ軽鎖定常ドメインを含み得る。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリンＧサブタイプ１（ＩｇＧ１）重鎖定常ドメインをヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインと共に含む。

【0092】

本開示の例示的抗体のアミノ酸及び核酸配列を表１～表１０に示す。

【0093】

【表1】

【0094】

【表2】

【0095】

【表3】

【0096】

【表4】

【0097】

【表5】

【0098】

【表6】

【0099】

【表7】

【0100】

【表8】

【0101】

【表9】

【0102】

【表10】

【0103】

【表11】

【0104】

一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、ヒトメソテリンに結合し、Ｋａｂａｔの付番方式（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔによって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0105】

一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、ヒトメソテリンに結合し、且つＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0106】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる配列番号１又はＩＭＧＴによる配列番号７）、ＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる配列番号２又はＩＭＧＴによる配列番号８）、ＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる配列番号３又はＩＭＧＴによる配列番号９）；及びＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔによる配列番号４又はＩＭＧＴによる配列番号１０）、ＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔによる配列番号５又はＩＭＧＴによる配列番号１１）及びＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔによる配列番号６又はＩＭＧＴによる配列番号１２）の１、２、３、４、５又は６個以下のアミノ酸付加、欠失又は置換を含む。

【0107】

一部の実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、ヒト化されている。一部の実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限のみ含み、ヒトにおける免疫原性を抑えながら、非ヒト（例えば、ウサギ）抗体の反応性を保持している。一部の実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、１つ以上の別の抗メソテリン抗体と比較したとき、向上した安定性、製剤化し易さ、結合親和性、治療有効性及び／又は凝集レベルの低下の１つ以上を提供する。

【0108】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列若しくは配列番号１３と少なくとも９０％同一の配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列若しくは配列番号１４と少なくとも９０％同一の配列を含む軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列若しくは配列番号１５と少なくとも９０％同一の配列を含む重鎖定常領域及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列若しくは配列番号１６と少なくとも９０％同一の配列を含む軽鎖定常領域を含む。

【0109】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７の重鎖アミノ酸配列若しくは配列番号１７と少なくとも９０％同一の配列及び／又は配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列若しくは配列番号１８と少なくとも９０％同一の配列を含む。

【0110】

一部の実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインを含む。

【0111】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、Ｋａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１９（ＨＣＤＲ１）、配列番号２０（ＨＣＤＲ２）及び配列番号２１（ＨＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号２２（ＬＣＤＲ１）、配列番号２３（ＬＣＤＲ２）及び配列番号２４（ＬＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号２５（ＨＣＤＲ１）、配列番号２６（ＨＣＤＲ２）及び配列番号２７（ＨＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号２８（ＬＣＤＲ１）、配列番号２９（ＬＣＤＲ２）及び配列番号３０（ＬＣＤＲ３）の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。

【0112】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、配列番号３１の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３２の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0113】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、配列番号３３の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号３４の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。

【0114】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、配列番号３５の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３６の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0115】

様々な実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４である。

【0116】

本明細書に記載される抗メソテリン抗原結合ドメインは、単独で（例えば、抗体又は抗原結合断片として）、１つ以上の追加の薬剤に（例えば、ＡＤＣとして）連結して又は大型高分子（例えば、二重特異性抗体又は多重特異性抗体）の一部として有用であり得る。

【0117】

一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、療法剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、化学療法剤は、エリブリンである。一部の実施形態において、化学療法剤は、エリブリン二量体である。

【0118】

一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、二重特異性又は多重特異性抗体中の抗原結合ドメインであり、且つ／又はその一部である。一部の実施形態において、二重特異性又は多重特異性抗体は、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つのＨＣＤＲ；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、多重特異性抗体は、１つ以上の追加の抗原結合ドメイン、例えば同じ抗原（即ちメソテリン）又は他の抗原に対する抗原結合ドメインを含む。

【0119】

一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗原結合ドメイン及び／又は抗原結合断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ断片である。

【0120】

一部の実施形態において、単独で又は大型高分子の一部として用いられる、本明細書に開示される抗原結合ドメイン（例えば、抗メソテリン抗原結合ドメイン）は、メソテリン結合機能を保持しながら、更なる修飾（例えば、１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入）を含み得る。

【0121】

抗体－薬物コンジュゲート
更に、本明細書では、様々な実施形態において、化学療法薬部分、例えばエリブリンを、本明細書に開示される抗メソテリン抗体に結び付けるリンカーを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物が提供される。抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物は、式Ｉ：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、Ａｂは、本明細書に開示されるインターナリゼーション性抗メソテリン抗体又はそのインターナリゼーション性抗原結合断片であり；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、ＡｂをＤに共有結合的に結び付ける切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
によって表され得る。

【0122】

本開示のＡＤＣ化合物は、薬物部分（例えば、エリブリン）にコンジュゲートした（例えば、リンカーによって共有結合的に結び付いた）抗体部分（その抗原結合断片を含む）を含み、薬物部分は、抗体部分にコンジュゲートしていないとき、細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果を有する。様々な実施形態において、薬物部分は、コンジュゲート中で結合しているとき、低下した細胞毒性を呈するか又はそれを全く呈さず、しかしリンカー及び抗体部分から切断された後、細胞毒性を取り戻す。様々な実施形態において、薬物部分は、コンジュゲート中で結合しているとき、低下したバイスタンダー殺傷を呈するか又はそれを全く呈さず、しかしコンジュゲートから切断された後、バイスタンダー殺傷の増加を呈する。

【0123】

一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣ化合物は、ＡＤＣの抗体部分が標的とする抗原（例えば、メソテリン）を発現する癌細胞又は腫瘍組織に有効用量の薬物部分（例えば、エリブリン）を選択的に送達することができる。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣ化合物は、メソテリンを発現しないか又はメソテリンの発現レベルがはるかに低いかのいずれかである正常細胞又は組織を温存しつつ、メソテリンを発現する細胞又は組織にエリブリンを送達することにより、癌を特異的に標的化する。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣ化合物は、別の抗体、リンカー及び／又は薬物部分を含むＡＤＣ、例えばＢＡＹ ９４－９３４３と比較して、オンターゲット殺傷の向上及び／又はオフターゲット殺傷の低下を示す。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣ化合物は、別の抗体、リンカー及び／又は薬物部分を含むＡＤＣ、例えばＢＡＹ ９４－９３４３と比較して、ＡＤＣによるＡＤＣＣ活性保持の向上を示す。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣ化合物は、別の抗体、リンカー及び／又は薬物部分を含むＡＤＣ、例えばＢＡＹ ９４－９３４３と比較して、安定性（例えば、血漿安定性）の向上を示す。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣ化合物は、別の抗体、リンカー及び／又は薬物部分を含むＡＤＣ、例えばＢＡＹ ９４－９３４３と比較して、抗腫瘍有効性の向上を示す。

【0124】

一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣ化合物は、単剤型の薬物（即ち抗体部分にコンジュゲートされていない）として評価したときのエリブリンの用量と比較して、低い用量のエリブリンで有利な抗腫瘍有効性を提供することができる。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣ化合物の腫瘍特異的ターゲティングによれば、単剤型の薬物として評価したときのエリブリンと比較して、ＡＤＣの抗腫瘍活性が増加し、且つ／又はオフターゲット細胞毒性が低下する。例えば、一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣ化合物は、単剤型の薬物として評価したときのエリブリンの用量の少なくとも１０分の１、少なくとも１５分の１、少なくとも２０分の１又は少なくとも３０分の１の用量のエリブリンで有利な抗腫瘍活性を示す。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣ化合物は、そのままのエリブリンと比べて向上した毒性学的又は安全性プロファイルを提供しながら、単剤型の薬物として評価したときのエリブリンの活性と同等の又はそれより優れた抗腫瘍活性を実証する。

【0125】

一部の実施形態において、リンカーは、細胞外で安定しており、従って細胞外条件に存在するとき、ＡＤＣは、インタクトなままであるが、細胞、例えば癌細胞にインターナライズされると、切断される能力を有する。一部の実施形態において、メソテリンを発現する細胞にＡＤＣが侵入すると、エリブリン薬物部分が抗メソテリン抗体部分から切断され、切断によって非修飾形態のエリブリンが放出される。

【0126】

一部の実施形態において、リンカーは、切断時にリンカー又は抗体部分のいかなる部分もエリブリン薬物部分に結合されたままであることがないように配置される切断可能な部分を含む。一部の実施形態において、リンカー中の切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分である。一部の実施形態において、切断可能なペプチド部分を含むＡＤＣは、別のリンカー部分を含むＡＤＣと比べて低い凝集レベル、抗体：薬物比の向上、癌細胞のオンターゲット殺傷の増加、非癌細胞のオフターゲット殺傷の減少及び／又は高い薬物負荷量（ｐ）を実証する。一部の実施形態において、効力及び／又は細胞毒性の増加は、中程度のメソテリンを発現する癌において提供される。一部の実施形態において、切断可能なペプチド部分は、酵素によって切断可能であり、リンカーは、酵素切断可能なリンカーである。一部の実施形態において、酵素は、カテプシンＢであり、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーである。一部の実施形態において、酵素切断可能なリンカー（例えば、カテプシン切断可能なリンカー）は、別の切断機構と比較して上述の向上した特性の１つ以上を呈する。

【0127】

一部の実施形態において、リンカー中の切断可能なペプチド部分は、アミノ酸単位を含む。一部の実施形態において、アミノ酸単位は、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含む。一部の実施形態において、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含むＡＤＣは、別のアミノ酸単位又は別の切断可能な部分を含むＡＤＣと比べて安定性の増加、オフターゲット細胞殺傷の減少、オンターゲット細胞殺傷の増加、低い凝集レベル及び／又は高い薬物負荷量を実証する。

【0128】

一部の実施形態において、リンカーは、抗体部分を切断可能な部分につなぎ合わせる少なくとも１つのスペーサー単位を含む。一部の実施形態において、リンカー中のスペーサー単位は、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み得る。ＰＥＧ部分は、例えば、－（ＰＥＧ）_ｍ－（式中、ｍは、１～１０の整数である）を含み得る。一部の実施形態において、リンカー中のスペーサー単位は、（ＰＥＧ）_２を含む。一部の実施形態において、短いスペーサー単位（例えば、（ＰＥＧ）_２）を含むＡＤＣは、リンカー長さが短いにも関わらず、長いスペーサー単位（例えば、（ＰＥＧ）_８）を含むＡＤＣと比べて低い凝集レベル及び／又は高い薬物負荷量を実証する。

【0129】

一部の実施形態において、リンカー中のスペーサー単位は、ＡＤＣの抗体部分にマレイミド部分（Ｍａｌ）を介して結び付く。一部の実施形態において、抗体部分にＭａｌを介して結び付いたリンカーを含むＡＤＣは、抗体部分に別の部分を介して結び付いたリンカーを含むＡＤＣと比べて高い薬物負荷量を実証する。一部の実施形態において、リンカー中のＭａｌは、抗体部分にシステイン残基（例えば、ＬＣｃｙｓ８０）を介してつなぎ合わされる。一部の実施形態において、リンカー中のＭａｌは、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のシステイン残基（例えば、ＬＣｃｙｓ８０）につなぎ合わされる。一部の実施形態において、ｐは、２であり、２つの－Ｌ－Ｄ部分が抗体又は抗原結合断片に結び付いている。一部の実施形態において、各－Ｌ－Ｄ部分は、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のシステイン残基（例えば、ＬＣｃｙｓ８０）に結び付いている。一部の実施形態において、システイン残基は、ＬＣｃｙｓ８０である。一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、ＰＥＧ部分を含む。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_ｍ、例えばＭａｌ－（ＰＥＧ）_２を含む。一部の実施形態において、Ｍａｌ－スペーサー単位は、抗体部分をリンカー中の切断可能な部分に結び付ける。一部の実施形態において、リンカー中の切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えばアミノ酸単位である。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む。

【0130】

一部の実施形態において、リンカー中の切断可能な部分は、ＡＤＣのエリブリン薬物部分に直接つなぎ合わされ、切断可能な部分は、抗体部分に直接つながっているか、又はスペーサー単位を通してつながっているかのいずれかである。一部の実施形態において、スペーサー単位も、リンカー中の切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結び付ける。一部の実施形態において、リンカー中の切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結び付けるスペーサー単位は、自己犠牲性である。一部の実施形態において、自己犠牲性スペーサーは、標的細胞において非修飾エリブリンを放出する能力を有する。一部の実施形態において、自己犠牲性スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルアルコール、例えばｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ｐＡＢ）を含む。リンカー中のｐＡＢは、一部の実施形態において、切断可能な部分をエリブリン薬物部分に結び付ける。一部の実施形態において、切断可能な部分は、切断可能なペプチド部分、例えばアミノ酸単位である。一部の実施形態において、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む。一部の実施形態において、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢと、リンカーを、Ｍａｌを通して抗体部分につなぎ合わせるＰＥＧスペーサー単位とを含む。

【0131】

一部の実施形態において、ｐは、１～８又は２～６の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２又は６である。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含み、及びｐは、２である。一部の実施形態において、リンカーは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含み、及びｐは、６である。

【0132】

一部の実施形態において、抗体部分は、Ｍａｌ部分と、ＰＥＧ部分と、Ｖａｌ－Ｃｉｔと、ｐＡＢとを含むリンカーを介してエリブリン薬物部分にコンジュゲートされる。これらの実施形態では、マレイミド部分がリンカー－薬物部分を抗体部分に共有結合的に結び付け、ｐＡＢが自己犠牲性スペーサー単位としての役割を果たす。かかるリンカーは、「Ｍａｌ－ＶＣ－ｐＡＢ」リンカー、「Ｍａｌ－ＶＣＰ」、「マレイミド－ＶＣＰ」又は「ＶＣＰ」リンカー、「Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－ＶＣＰ」リンカー又は「Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢ」リンカーと称され得る。一部の実施形態において、エリブリン薬物部分は、Ｃ－３５位で共有結合的に連結したエリブリンである。一部の実施形態において、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢリンカーのｐＡＢは、エリブリン薬物部分のＣ－３５アミンに結び付けられている。

【0133】

３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４は、上記の表１～表１０に示される配列を含むか又はそれによってコードされる、例えば配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む例示的抗メソテリン抗体である。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣの抗体部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣの抗体部分は、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４である。

【0134】

一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣは、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンを含む。これらの実施形態において、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４を含む抗体部分は、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含むリンカーを介してエリブリン薬物部分につなぎ合わされる。かかるＡＤＣは、「ＭＯＲＡｂ－１０９」と称され得る。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣは、ＭＯＲＡｂ－１０９である。

【0135】

一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣは、ＭＯＲＡｂ－１０９であり、２のｐを有する。一部の実施形態において、ｐが２であるとき、このＡＤＣは、「ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）」と称され得る。他の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣは、ＭＯＲＡｂ－１０９であり、６のｐを有する。一部の実施形態において、ｐが６であるとき、このＡＤＣは、「ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）」と称され得る。

【0136】

様々な実施形態において、リンカーは、細胞内インターナリゼーション後の切断及び隣接細胞へのリンカー－薬物部分及び／又は薬物部分単独の拡散を通したバイスタンダー殺傷（隣接細胞、例えばメソテリンを発現しない隣接細胞の殺傷）を容易にするように設計される。一部の実施形態において、リンカーは、細胞インターナリゼーションを促進する。一部の実施形態において、リンカーは、標的組織へのＡＤＣ結合性及びＡＤＣの抗体部分が標的とする抗原を発現しないが、その抗原を発現する標的癌組織を取り囲む癌性組織のバイスタンダー殺傷性を確保しつつ、細胞外環境での切断を最小限に抑え、それによりオフターゲット組織（例えば、非癌性組織）に対する毒性を低減するように設計される。一部の実施形態において、マレイミド（Ｍａｌ）部分と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ又は「ＶＣ」）と、ｐＡＢとを含むリンカーは、これらの機能的特徴を提供する。一部の実施形態において、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含むリンカーは、抗体部分及びエリブリン薬物部分をつなぎ合わせるとき、これらの機能的特徴を提供するのに特に有効である。一部の実施形態において、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含むリンカーは、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４などの抗メソテリン抗体部分及びエリブリン薬物部分をつなぎ合わせるとき、これらの機能的特徴の一部又は全てを提供するのに有効である。

【0137】

一部の実施形態において、抗メソテリン抗体又は抗原結合断片は、本明細書に開示される配列（例えば、表１～表３に開示される６つのＣＤＲ及び／又は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む）を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、完全長抗体である。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、単一特異性抗体若しくは抗原結合断片、二重特異性抗体若しくは抗原結合断片又は多重特異性抗体若しくは抗原結合断片である。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ断片である。

【0138】

一部の実施形態において、抗メソテリン抗体（Ａｂ）部分と、切断可能なペプチド部分とを含むＡＤＣは、別の抗体又は抗原結合断片を含むＡＤＣと比べて低い凝集レベル、抗体：薬物比の向上、癌細胞のオンターゲット殺傷の増加、非癌細胞のオフターゲット殺傷の減少、高い薬物負荷量（ｐ）、細胞毒性及び／又は効力の増加を実証する。一部の実施形態において、ＡＤＣは、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含み；
Ｄは、化学療法剤（例えば、エリブリン）であり；
Ｌは、ＡｂをＤに共有結合的に結び付ける切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
のＡＤＣである。

【0139】

一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0140】

一部の実施形態において、ＡＤＣは、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は抗原結合断片は、メソテリン及び／又はメソテリン発現細胞に結合する能力を有し、且つＫａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、ＡｂをＤに共有結合的に結び付ける切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
を有する。

【0141】

一部の実施形態において、メソテリン及び／又はメソテリン発現細胞を標的とする抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0142】

一部の実施形態において、ＡＤＣは、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、Ｋａｂａｔの付番方式によって定義される、配列番号１（ＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号４（ＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＬＣＤＲ２）及び配列番号６（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）；又はＩＭＧＴの付番方式によって定義される、配列番号７（ＨＣＤＲ１）、配列番号８（ＨＣＤＲ２）及び配列番号９（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；並びに配列番号１０（ＬＣＤＲ１）、配列番号１１（ＬＣＤＲ２）及び配列番号１２（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む、メソテリン及び／又はメソテリン発現細胞を標的とする抗体又はその抗原結合断片であり；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
を有する。

【0143】

一部の実施形態において、メソテリン及び／又はメソテリン発現細胞を標的とする抗体又は抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン及びヒトＩｇκ軽鎖定常ドメインを含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＩｇκ軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0144】

一部の実施形態において、ＡＤＣは、式（Ｉ）：
Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）_ｐ （Ｉ）
（式中、
Ａｂは、抗体又は抗原結合断片であり、抗体又は抗原結合断片は、メソテリンに結合する能力を有し、且つ配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；
Ｄは、エリブリンであり；
Ｌは、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢを含む切断可能なリンカーであり；及び
ｐは、１～８の整数である）
を有する。

【0145】

一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びヒトＩｇκ軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態において、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0146】

一部の実施形態において、ＡＤＣの抗体又は抗原結合断片は、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４である。一部の実施形態において、ｐは、１～８である。一部の実施形態において、ｐは、２又は６である。一部の実施形態において、ｐは、２である。

【0147】

一部の実施形態において、エリブリン薬物負荷量のレベルが低い（例えば、ｐが２である）、本明細書に開示されるＡＤＣ（例えば、本明細書に開示される抗メソテリン抗体及びリンカーを含むもの）は、薬物負荷量のレベルが高い（例えば、ｐが６である）ＡＤＣと同じ又は同様のレベルのエリブリンを癌細胞又は腫瘍組織に送達することができる。一部の実施形態において、薬物負荷量のレベルが低い（例えば、ｐが２である）ＡＤＣは、薬物負荷量のレベルが高い（例えば、ｐが６である）ＡＤＣとほぼ同等の又はそれより優れた腫瘍成長阻害及び／又はインビボ抗癌治療有効性を提供することができる。

【0148】

一部の実施形態において、各エリブリン部分は、切断可能なリンカーによってメソテリン標的化抗体又は抗原結合断片に抗体又は断片上のシステイン残基（例えば、ＬＣｃｙｓ８０）を介してつなぎ合わされる。一部の実施形態において、メソテリン標的化抗体又は抗原結合断片には、例えば、抗体又は抗原結合断片上の２つのシステイン残基を介して合計２つのリンカー－エリブリン部分が結び付いている（即ち、このＡＤＣは、ＤＡＲ２を有することになる）。一部の実施形態において、１つ又は複数のシステイン残基は、ＬＣｃｙｓ８０である。

【0149】

ヒト療法剤、例えば腫瘍学的薬剤として使用するためのＡＤＣの開発及び生産には、所望の１つ又は複数の標的に結合する能力及び単独で癌の治療に使用される薬物に結び付く能力を有する抗体を同定するだけではないより多くのことが必要となり得る。抗体を薬物に連結すると、抗体及び薬物の一方又は両方の活性に大きい予測不可能な効果が及ぶこともあり、効果は、抗体並びに／又は選択されるリンカー及び／若しくは薬物の種類に応じて異なることになる。従って、一部の実施形態において、ＡＤＣの成分は、（ｉ）抗体及び薬物部分が単独で呈する１つ以上の治療特性が保持され、（ｉｉ）抗体部分の特異的結合特性が維持され；（ｉｉｉ）薬物負荷量及び薬物対抗体比が最適化され；（ｉｖ）抗体部分との安定した結び付きによる薬物部分の送達、例えば細胞内送達が可能であり；（ｖ）標的部位に輸送又は送達されるまでインタクトなコンジュゲートとしてＡＤＣの安定性が保持され；（ｖｉ）投与前又は投与後のＡＤＣの凝集が最小限となり；（ｖｉｉ）細胞環境における切断後に薬物部分の治療効果、例えば細胞毒性効果が実現し；（ｖｉｉｉ）抗体及び薬物部分単独と同等であるか又はそれより優れたインビボ抗癌治療有効性を呈し；（ｉｘ）薬物部分によるオフターゲット殺傷が最小限となり；及び／又は（ｘ）望ましい薬物動態特性及び薬力学特性、製剤化し易さ及び毒性学的／免疫学的プロファイルを呈するように選択される。治療的使用のための向上したＡＤＣの同定には、これらの特性の各々をスクリーニングする必要があり得る（Ａｂ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１４：１６０５－１３）。

【0150】

一部の実施形態において、化学療法薬、例えばエリブリンにつなぎ合わされた抗メソテリン抗体又は抗原結合断片を含む、本明細書に開示されるＡＤＣは、望ましい特性の特定の組み合わせを実証する。それらの特性としては、限定はされないが、いずれも他の抗体部分を使用したＡＤＣと比較したときの、有効な薬物負荷レベル、低い凝集レベル、貯蔵条件下での及び／又は体内で循環中にあるときの安定性（例えば、血清及びマトリックス安定性）、非コンジュゲート化抗体と同等の標的発現細胞に対する親和性の保持、標的発現細胞に対する強力な細胞毒性、高レベルのバイスタンダー殺傷及び／又は有効なインビボ抗癌活性が挙げられる。一部の実施形態において、こうしたコンジュゲートの高い抗癌活性は、抗原発現が中程度の細胞株で試験したときにも見られ、このＡＤＣによって送達される毒素ペイロードに対する強力な感受性を実証している。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗メソテリン抗体又は抗原結合断片を含むＡＤＣは、別の抗体部分を含むＡＤＣと比較して、特に有利な抗腫瘍細胞毒性及び／又は効力並びに向上したオフターゲット毒性並びに薬物代謝及び薬物動態（ＤＭＰＫ）プロファイルを呈する。一部の実施形態において、本明細書に開示されるヒト化抗メソテリン抗体とエリブリンとを含むＡＤＣは、意外にも、別の抗体部分及び／又はコンジュゲートを含むＡＤＣと比較して有利な薬理学的及び毒性学的特性を提供する。

【0151】

本開示のＡＤＣ化合物は、有効用量の細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤を癌細胞又は腫瘍組織に選択的に送達し得る。一部の実施形態において、ＡＤＣの細胞毒性活性及び／又は細胞増殖抑制活性は、細胞の標的抗原発現レベルに依存する。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣは、同じ抗原を低いレベルで発現する癌細胞と比較して、高いレベルの標的抗原を発現する癌細胞の殺傷に特に有効である。一部の実施形態において、開示されるＡＤＣは、同じ抗原を低いレベルで発現する癌細胞と比較して、標的抗原を中程度のレベルで発現する癌細胞の殺傷に特に有効である。

【0152】

例示的なメソテリン高発現癌としては、限定はされないが、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌、明細胞性卵巣癌）、膵癌、中皮腫、子宮内膜癌、非小細胞肺癌（例えば、腺癌）及び結腸直腸癌が挙げられる。例示的な中程度のメソテリン発現の癌としては、限定はされないが、胃癌、胸腺癌及び胆管細胞癌が挙げられる。例示的なメソテリン低発現癌としては、限定はされないが、黒色腫及びリンパ腫が挙げられる。一部の実施形態において、メソテリン発現癌としては、突然変異及び／又は薬剤抵抗性を有する癌、例えばＫＲＡＳ／ＳＴＫ１１変異型肺癌（非小細胞肺腺癌）、例えばＰＤ－１チェックポイント遮断による治療に抵抗性を呈する変異型肺癌を挙げることができる。

【0153】

薬物部分
本明細書に記載されるＡＤＣの薬物部分（Ｄ）は、任意の化学療法剤であり得る。有用なクラスの化学療法剤としては、例えば、抗チューブリン剤が挙げられる。特定の実施形態において、薬物部分は、抗チューブリン剤である。記載されるＡＤＣ及び組成物に使用される１つの例示的な薬物部分は、エリブリンである。記載されるＡＤＣ及び組成物に使用される別の例示的な薬物部分は、エリブリン二量体である。

【0154】

様々な実施形態において、開示されるＡＤＣにおいてその天然形態で使用されるエリブリンの構造は、式（ＩＩ）に示されるとおりである。

【化1】

【0155】

様々な他の実施形態において、開示されるＡＤＣにおいて使用されるエリブリンの構造は、米国特許出願公開第２０１８０１９３４７８号明細書（これは、全てのエリブリン構造及びそれらの構造の合成方法に関して参照により本明細書に援用される）に示されるとおりである。

【0156】

薬物負荷量
薬物負荷量は、ｐによって表すことができ、本明細書では薬物対抗体比（ＤＡＲ）とも称される。薬物負荷量は、例えば、各抗体部分につき１～１０個の薬物部分の範囲であり得る。一部の実施形態において、ｐは、１～１０の整数である。一部の実施形態において、ｐは、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３又は１～２の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４又は２～３の整数である。一部の実施形態において、ｐは、１～８の整数である。一部の実施形態において、ｐは、１～６の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２～６の整数である。一部の実施形態において、ｐは、２である。一部の実施形態において、ｐは、６である。

【0157】

薬物負荷量は、一部の実施形態では、抗体部分にある結び付ける部位の数によって制限され得る。一部の実施形態において、ＡＤＣのリンカー部分（Ｌ）は、抗体部分にある１つ以上のアミノ酸残基上の化学的に活性な基を通して抗体部分に結び付く。例えば、リンカーは、抗体部分に遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオール又はカルボキシル基を介して（例えば、Ｎ末端若しくはＣ末端、１つ以上のリジン残基のεアミノ基、１つ以上のグルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基又は１つ以上のシステイン残基のスルフヒドリル基に）結び付けられ得る。リンカーが結び付けられる部位は、抗体部分のアミノ酸配列中の天然残基であり得るか、又はそれは、例えば、ＤＮＡ組換え技術により（例えば、アミノ酸配列にシステイン残基を導入することにより）又はタンパク質生化学により（例えば、還元、ｐＨ調整又は加水分解により）抗体部分に導入され得る。

【0158】

一部の実施形態において、抗体部分にコンジュゲートすることのできる薬物部分の数は、遊離システイン残基の数によって制限される。例えば、システインチオール基で結び付く場合、抗体にあるシステインチオール基は、僅か１個若しくは数個であり得るか、又はそれを通してリンカーが結び付き得る十分に反応性のあるチオール基は、僅か１個若しくは数個であり得る。概して、抗体は、薬物部分に連結し得る、遊離した反応性のあるシステインチオール基を多く含まない。実際、抗体中のほとんどのシステインチオール残基は、鎖間又は鎖内のいずれかのジスルフィド結合に関与する。従って、システインにコンジュゲートするには、一部の実施形態では、抗体を少なくとも部分的に還元する必要があり得る。抗体にリンカー－毒素を過剰に結び付けると、ジスルフィド結合の形成に利用可能なシステイン残基が還元されることにより、抗体が不安定になり得る。従って、一部の実施形態では、薬物：抗体比を最適にすれば、抗体部分が不安定化することなく、ＡＤＣの効力が（各抗体に結び付いている薬物部分の数が増加することにより）増加するはずである。一部の実施形態において、最適な比は、２又は６であり得る。一部の実施形態において、最適な比は、２である。

【0159】

一部の実施形態では、１つ以上の部位特異的コンジュゲーション技術を用いることにより、定義付けられた薬物負荷量、即ち定義付けられた薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有する均一なＡＤＣ生成物が作製される。一部の実施形態では、残基特異的コンジュゲーション技術（ＲＥＳＰＥＣＴ）により、抗体の軽鎖又は重鎖に部位特異的コンジュゲーションのための遊離システイン残基を作成することができる。ＲＥＳＰＥＣＴフォーマット化した抗体の例示的な作成プロトコルについては、Ａｌｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（５）：３４７－５７及び国際公開第２０１６２０５６１８号パンフレット及び同第２０１７１０６６４３号パンフレット（これらの各々は、部位特異的コンジュゲーションの実施方法に関して参照により本明細書に援用される）に記載されている。一部の実施形態において、ＡＤＣは、リンカー（例えば、Ｍａｌ－（ＰＥＧ）_２－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ｐＡＢリンカー）を介して抗体部分を薬物部分に共有結合的に結び付ける部位特異的コンジュゲーションを用いて作製される。一部の実施形態において、エリブリン薬物部分を含むＡＤＣ又は組成物について約２のＤＡＲを目標として、部位特異的コンジュゲーションが用いられる。

【0160】

ヒト定常領域にキメラ化又はヒト化したウサギモノクローナル抗体では、軽鎖内に不対のシステインが生じ、それらの残基がコンジュゲーションに利用可能なまま残り得る（Ａｌｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（５）：３４７－５７；国際公開第２０１６２０５６１８号パンフレット）。一部の実施形態において、部位特異的コンジュゲーションに用いられる抗体部分は、ＲＥＳＰＥＣＴ－Ｌフォーマット化抗体である。本明細書には、軽鎖８０位に不対のシステイン（ＬＣｃｙｓ８０）を有する例示的ＲＥＳＰＥＣＴ－Ｌフォーマット化抗体が記載される。本明細書で使用されるとき、「ＬＣｃｙｓ８０」又は「Ｃｙｓ８０」は、Ｋａｂａｔの付番方式による、抗体又は抗原結合断片上の軽鎖可変領域のアミノ酸位置８０位におけるシステイン残基を指す。例えば、一部の実施形態では、本明細書に開示される軽鎖可変領域において、ＬＣｃｙｓ８０は、アミノ酸８０位に存在する。ＲＥＳＰＥＣＴ－Ｌ誘導体化抗体は、ＤＡＲが約２のＡＤＣをもたらすことができる。一部の実施形態において、約２の薬物負荷量及び／又は平均薬物負荷量は、例えば、部位特異的コンジュゲーションを用いて実現される。

【0161】

医薬組成物
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される１つ以上の抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を更に提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも１つの追加の薬剤を含む。

【0162】

一部の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣの複数のコピーを含む医薬組成物を更に提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるＡＤＣの複数のコピーを含む医薬組成物を更に提供する。一部の実施形態において、組成物中のＡＤＣの平均ｐは、約１～約８である。一部の実施形態において、組成物中のＡＤＣの平均ｐは、約２又は約６である。一部の実施形態において、組成物中のＡＤＣの平均ｐは、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２又は約２．３である。一部の実施形態において、組成物中のＡＤＣの平均ｐは、約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４又は６．５である。

【0163】

一部の実施形態において、医薬組成物は、１つ以上の追加の療法剤、例えばメソテリン発現癌を治療する能力を有する１つ以上の薬剤、ステロイドなどを更に含み得る。

【0164】

治療的使用及び治療方法
本明細書では、障害、例えば腫瘍学的障害に対する対象の治療において、開示される抗体、抗原結合断片、コンジュゲート、ＡＤＣ及び／又は医薬組成物を使用する方法が開示される。抗体、抗原結合断片、コンジュゲート及び／又はＡＤＣは、単独で又は第２の療法剤と組み合わせて投与され得、任意の薬学的に許容可能な製剤、投薬量及び投与レジメンで投与され得る。抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの治療有効性が毒性並びに有効性指標に関して評価され、それに応じて調整され得る。有効性の尺度としては、限定はされないが、インビトロ又はインビボで観察される細胞増殖抑制効果及び／若しくは細胞毒性効果、腫瘍容積の減少、腫瘍成長阻害並びに／又は生存期間の延長が挙げられる。

【0165】

抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣが細胞に細胞増殖抑制効果及び／又は細胞毒性効果を及ぼすかどうかを決定する方法は、公知である。例えば、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの細胞毒性活性又は細胞増殖抑制活性は、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの標的タンパク質を発現する哺乳類細胞を細胞培養培地に曝露することと；約６時間～約５日の期間にわたって細胞を培養することと；細胞生存率を測定することとによって測定され得る。細胞ベースのインビトロアッセイは、ＡＤＣの生存率（増殖）、細胞毒性及びアポトーシス誘導（カスパーゼ活性化）の測定にも用いることができる。

【0166】

抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣが細胞増殖抑制効果を及ぼすかどうかの決定には、チミジン取込みアッセイが用いられ得る。例えば、標的抗原を発現する癌細胞を９６ウェルプレートの１ウェル当たり５，０００細胞の密度で７２時間の期間にわたって培養し、その７２時間の期間の最後の８時間中に０．５μＣｉの３Ｈ－チミジンに曝露することができる。抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの存在下及び非存在下における培養物の細胞への３Ｈ－チミジンの取込みが測定される。

【0167】

細胞毒性の決定のために、壊死又はアポトーシス（プログラム細胞死）が測定され得る。壊死には、典型的には、細胞膜の透過性の増加；細胞の膨張及び細胞膜の破裂が伴う。アポトーシスは、典型的には、膜の小疱形成、細胞質の凝縮及び内因性エンドヌクレアーゼの活性化によって特徴付けられる。癌細胞にこれらの効果のいずれかが決定されれば、それは、癌の治療においてＡＤＣが有用であることを示している。

【0168】

細胞生存率は、例えば、ニュートラルレッド、トリパンブルー、クリスタルバイオレット又はＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの色素の細胞における取込みを決定することにより測定され得る（例えば、Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３：４７３－６を参照されたい）。かかるアッセイでは、色素を含有する培地で細胞がインキュベートされ、細胞が洗浄され、及び色素の細胞取込みを反映する残存色素が分光光度法で測定される。特定の実施形態において、調製したＡＤＣのインビトロ効力及び／又は細胞毒性は、クリスタルバイオレットアッセイを用いて判定される。クリスタルバイオレットは、トリアリールメタン色素であり、生細胞の核に蓄積する。このアッセイでは、細胞は、決められた時間にわたってＡＤＣ又は対照薬剤に曝露され、その後、細胞は、クリスタルバイオレットで染色され、大量の水で洗浄され、次に１％ＳＤＳで可溶化され、分光光度法によって読み取られる。タンパク質結合色素のスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）も細胞毒性の測定に使用することができる（Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７－１２）。

【0169】

アポトーシスは、例えば、ＤＮＡ断片化を測定することによって定量化され得る。ＤＮＡ断片化をインビトロで定量的に決定するための市販の光度測定方法が利用可能である。かかるアッセイの例は、ＴＵＮＥＬ（これは、断片化されたＤＮＡ中の標識ヌクレオチドの取込みを検出する）及びＥＬＩＳＡベースのアッセイを含めて、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ（１９９９）Ｎｏ．２，ｐｐ．３４－３７（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。

【0170】

アポトーシスは、細胞の形態学的変化を測定することによっても決定され得る。例えば、壊死と同様に、ある種の色素（例えば、アクリジンオレンジ又は臭化エチジウムなど、例えば蛍光色素）の取込みを測定することにより、細胞膜の完全性の喪失を決定することができる。アポトーシス細胞数の測定方法については、Ｄｕｋｅ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９２）ｐｐ．３．１７．１－３．１７．１６）によって記載されている。細胞は、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム又はヨウ化プロピジウム）で標識して、核の内膜に沿ったクロマチン凝縮及び辺縁趨向に関して細胞を観察することもできる。アポトーシスを決定するために測定し得る他の形態学的変化としては、例えば、細胞質凝集、膜の小疱形成の増加及び細胞萎縮が挙げられる。

【0171】

開示されるＡＤＣは、バイスタンダー殺傷活性に関しても評価され得る。バイスタンダー殺傷活性は、例えば、１つが標的抗原陽性であり、１つが標的抗原陰性である２つの細胞株を用いるアッセイにより決定され得る。これらの細胞株を標識して、それらを区別し得る。例えば、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ（商標）グリーン（ＮＬＧ）で標識した標的陽性細胞と、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ（商標）レッド（ＮＬＲ）で標識した標的陰性細胞とを共培養し、ＡＤＣで処理した後、細胞毒性をモニタし得る。標的陽性細胞と混合したときの標的陰性細胞の殺傷は、バイスタンダー殺傷を示す指標となる一方、標的陽性細胞の非存在下での標的陰性細胞の殺傷は、オフターゲット殺傷を示す指標となる。

【0172】

一部の実施形態において、本開示は、チューブリンの破壊によって癌細胞若しくは癌組織を殺傷するか、その成長を阻害若しくは調節するか、又はその代謝に干渉する方法を特徴とする。本方法は、チューブリンの破壊によって治療利益を得る任意の対象で用いることができる。チューブリンの破壊が有益となり得る対象としては、限定はされないが、胃癌、卵巣癌（例えば、上皮性卵巣癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、乳癌、子宮内膜癌（例えば、漿液性子宮内膜癌）、骨肉腫、カポジ肉腫、精巣胚細胞癌、頭頸部癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、子宮癌、胆管癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫、頭頸部癌、食道癌、膵癌、前立腺癌、脳癌（例えば、膠芽腫）、甲状腺癌、結腸直腸癌及び／若しくは皮膚癌（例えば、黒色腫）又はこれらの任意の転移を有するか又は有するリスクがある者が挙げられる（Ｄｕｍｏｎｔｅｔ ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．９：７９０－８０３）。

【0173】

様々な実施形態において、開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣは、メソテリン発現癌細胞又は組織など、メソテリンを発現する任意の細胞又は組織において投与され得る。例示的実施形態には、メソテリン媒介性細胞シグナル伝達を阻害する方法又は細胞を殺傷する方法が含まれる。本方法は、癌性細胞又は転移性病変など、メソテリンを発現する任意の細胞又は組織で用いることができる。メソテリン発現癌の非限定的な例としては、中皮腫、膵癌（例えば、膵臓腺癌）、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌、明細胞性卵巣癌、上皮性卵巣癌）及び肺癌（例えば、非小細胞肺癌、肺腺癌）が挙げられる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３３２１４）。他の例示的メソテリン癌としては、子宮内膜癌、結腸直腸癌、胃癌、白血病、乳癌、子宮頸癌、頭頸部癌、肝癌、前立腺癌、腎癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、子宮癌及び胆管癌が挙げられる。メソテリン発現細胞の非限定的な例としては、ＯＶＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞、ＨＥＣ－２５１ヒト類内膜細胞、Ｈ２２６ヒト肺扁平上皮細胞中皮腫細胞及びメソテリン又はその一部分をコードする組換え核酸を含む細胞が挙げられる。

【0174】

例示的方法は、有効量、即ち細胞を殺傷するのに十分な量の、本明細書に記載されるとおりの抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣを細胞に接触させるステップを含む。本方法は、培養下の細胞に対して、例えばインビトロ、インビボ、エキソビボ又はインサイチューで使用することができる。例えば、メソテリンを発現する細胞（例えば、腫瘍又は転移性病変の生検により回収された細胞；樹立癌細胞株からの細胞；又は組換え細胞）を培養培地中でインビトロ培養することができ、接触させるステップは、培養培地に抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣを加えることにより影響を受け得る。本方法は、詳細には、メソテリンを発現する腫瘍細胞を含めた、メソテリンを発現する細胞の殺傷を生じさせることになる。代わりに、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣは、インビボで効果を及ぼすため、任意の好適な投与経路（例えば、静脈内、皮下又は腫瘍組織との直接的な接触）によって対象に投与することができる。この手法は、他の細胞表面抗原を標的化する抗体及びＡＤＣにも用いることができる。

【0175】

開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣ治療用組成物のインビボ効果は、好適な動物モデルで評価することができる。例えば、異種癌モデルを使用し得、ここで、癌外植片又は継代異種移植片組織がヌードマウス又はＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入される（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２－８）。有効性は、腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮又は転移などを測定するアッセイを用いて予測し得る。

【0176】

アポトーシスなどの機構による腫瘍死滅の促進を評価するインビボアッセも用いることができる。一部の実施形態において、治療用組成物で治療された腫瘍担持マウスからの異種移植片をアポトーシスフォーカスの存在に関して調べ、未治療の対照異種移植片担持マウスと比較することができる。治療したマウスの腫瘍にアポトーシスフォーカスがどの程度見られるかは、組成物の治療有効性の指標を与える。

【0177】

更に、本明細書では、癌の治療方法が提供される。本明細書に開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣは、治療目的で非ヒト哺乳類又はヒト対象に投与することができる。治療的方法は、腫瘍を有する哺乳類に、癌細胞表面に発現する抗原に結合するか、それに結合するために接触可能であるか、又はそこに局在化する抗体、抗原結合断片及び／又はターゲティング抗体に連結したエリブリンを含むＡＤＣの生物学的に有効な量を投与することを伴う。

【0178】

例示的実施形態は、メソテリンを発現する細胞にエリブリンを送達する方法であって、メソテリンエピトープに免疫特異的に結合する抗体にエリブリンをコンジュゲートすることと、細胞を抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣに曝露することとを含む方法である。本開示の抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣが適応となるメソテリンを発現する例示的腫瘍細胞としては、卵巣癌細胞、類内膜細胞及び肺扁平上皮細胞中皮腫細胞が挙げられる。

【0179】

別の例示的実施形態は、標的抗原発現腫瘍（例えば、メソテリン発現腫瘍）の成長を低減又は阻害する方法であって、治療有効量の抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣを投与することを含む方法である。一部の実施形態において、治療は、患者の腫瘍の成長を低減又は阻害し、転移性病変の数又はサイズを低減し、腫瘍負荷を低減し、原発腫瘍負荷を低減し、侵襲性を低減し、生存期間を延長させ、且つ／又はクオリティオブライフを維持するか若しくは向上させるのに十分である。一部の実施形態において、腫瘍は、単独投与時のＡＤＣの抗体又は抗原結合部分による治療に抵抗性又は難治性であり、及び／又は腫瘍は、単独投与時のエリブリンによる治療に抵抗性又は難治性である。

【0180】

更に、本開示の抗体は、獣医学的目的のため又はヒト疾患の動物モデルとして、メソテリンを発現する非ヒト哺乳類に投与され得る。後者に関して、かかる動物モデルは、開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの治療有効性の評価（例えば、投薬量及び投与の時間経過の試験）に有用であり得る。

【0181】

更に、本明細書では、開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの治療的使用が提供される。例示的実施形態は、標的抗原発現癌（例えば、メソテリン発現癌）の治療における抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの使用であり、それが開示される。標的抗原（例えば、メソテリン）を発現する癌を有する対象の同定方法は、当技術分野において公知であり、開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣによる治療に好適な患者を同定するために用いられ得る。

【0182】

別の例示的実施形態は、標的抗原発現癌（例えば、メソテリン発現癌）の治療用医薬品の製造方法における抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの使用である。

【0183】

前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に好適な薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に製剤化され得る。例示的実施形態は、本開示の抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。好適な担体には、治療用組成物と組み合わせたとき、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、且つ概して患者の免疫系と反応しない任意の材料が含まれる。

【0184】

薬学的に許容可能な担体には、生理的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、メシル酸塩などの１つ以上並びにこれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、組成物中には、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類又は塩化ナトリウムが含まれる。薬学的に許容可能な担体は、湿潤剤又は乳化剤、保存剤又は緩衝剤など、ＡＤＣの保存期間又は有効性を亢進させる少量の補助物質を更に含み得る。

【0185】

治療用製剤は、可溶化され、その治療用組成物を腫瘍部位に送達可能な任意の経路によって投与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、限定はされないが、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、臓器内、同所性などが挙げられる。治療用タンパク質調製液は凍結乾燥し、滅菌粉末として例えば真空下で保存し、次に注射前に静菌水中（例えば、ベンジルアルコール保存剤を含有する）又は滅菌水中に再構成することができる。治療用製剤は、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣ又はその薬学的に許容可能な塩、例えばメシル酸塩を含み得る。

【0186】

本明細書に開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣは、それを必要としている患者に対して、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量で投与され得る。一部の実施形態において、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣは、連日、隔月又はその間の任意の期間で患者に投与される。前述の方法を用いた癌治療のための投薬量及び投与プロトコルは、方法及び標的の癌によって異なることになり、概して当技術分野で認められている幾つもの他の要因に依存することになる。

【0187】

様々な送達システムが公知であり、本開示の１つ以上の抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの投与に用いることができる。抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの投与方法としては、限定はされないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与（例えば、鼻腔内及び経口経路）が挙げられる。加えて、例えば、インへラー又は噴霧器及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用による肺内投与が用いられ得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号明細書、同第５，９８５，３２０号明細書、同第５，９８５，３０９号明細書、同第５，９３４，２７２号明細書、同第５，８７４，０６４号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，２９０，５４０号明細書及び同第４，８８０，０７８号明細書；並びに国際公開第１９９２／０１９２４４号パンフレット、同第１９９７／０３２５７２号パンフレット、同第１９９７／０４４０１３号パンフレット、同第１９９８／０３１３４６号パンフレット及び同第１９９９／０６６９０３号パンフレットに記載される肺内投与のための組成物及び方法を参照されたい。ＡＤＣは、任意の好都合な経路、例えば注入若しくはボーラス注射によるか、又は上皮若しくは皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）からの吸収により投与され得る。投与は、全身投与又は局所投与のいずれでもあり得る。

【0188】

本明細書に開示される治療用組成物は、無菌であり、且つ製造及び貯蔵条件下で安定しているものであり得る。一部の実施形態において、抗体、抗原結合断片及び／若しくはＡＤＣ又は医薬組成物の１つ以上は、乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は水分を含まない濃縮物としてハーメチックシール容器に供給され、これは、対象への投与に際して適切な濃度となるように（例えば、水又は生理食塩水で）再構成することができる。一部の実施形態において、予防用又は治療用薬剤又は医薬組成物の１つ以上は、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇ若しくは少なくとも１００ｍｇ又はその間の任意の量の単位投薬量の乾燥滅菌凍結乾燥粉末としてハーメチックシール容器に供給される。一部の実施形態において、凍結乾燥した抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣ又は医薬組成物は、当初の容器に２℃～８℃で保存される。一部の実施形態において、本明細書に記載される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣ又は医薬組成物の１つ以上は、ハーメチックシール容器、例えば薬剤の分量及び濃度を表示する容器に液体形態で供給される。一部の実施形態において、ハーメチックシール容器には、少なくとも０．２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ ＡＤＣの投与される組成物の液体形態が供給される。液体形態は、当初の容器に２℃～８℃で保存され得る。

【0189】

一部の実施形態において、開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣは、非経口投与に好適な医薬組成物に取り込むことができる。注射用溶液は、フリント若しくはアンバーバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジ或いは他の公知の送達又は保存装置内にある液体又は凍結乾燥のいずれかの投薬形態で構成され得る。

【0190】

本明細書に記載される組成物は、種々の形態であり得る。それらとしては、例えば、液体、半固体及び固体投薬形態、例えば液体溶液（例えば、注射用及び注入用溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、リポソーム及び坐薬などが挙げられる。形態は、意図される投与様式及び治療上の適用に依存する。

【0191】

様々な実施形態において、治療は、許容可能な投与経路による抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣ製剤の単回ボーラス又は反復投与を含む。

【0192】

最も有効な投与レジメンの決定を促進する等のため、所与の試料中の標的抗原レベル（例えば標的抗原発現細胞レベル）に関して患者が評価され得る。例示的実施形態は、本開示の抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣによる治療が患者に反応することになるかどうかを決定する方法であって、患者からの生体試料を提供することと、生体試料に抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣを接触させることとを含む方法である。例示的生体試料としては、炎症性滲出物、血液、血清、腸液、便試料又は腫瘍生検（例えば、標的抗原発現癌、例えばメソテリン発現癌を有するか又はそのリスクがある患者に由来する腫瘍生検）などの組織又は体液が挙げられる。一部の実施形態において、対象から試料（例えば、組織及び／又は体液）を入手することができ、好適な免疫学的方法を用いて標的抗原（例えば、メソテリン）のタンパク質発現を検出及び／又は測定することができる。かかる評価は、療法全体を通したモニタリングのためにも用いられ、他のパラメータの評価と組み合わせて療法の成功を判断するのに有用である。

【0193】

一部の実施形態において、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの有効性の評価は、対象からの腫瘍試料に抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣを接触させることと、腫瘍成長速度又は容積を評価することとにより得る。一部の実施形態において、抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣが有効であると決定された場合、それを対象に投与し得る。

【0194】

上記の治療手法は、多様な追加の手術、化学療法又は放射線療法レジメンのいずれか１つと組み合わせることができる。一部の実施形態において、本明細書に開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣ又は組成物は、１つ以上の追加の療法剤、例えば１つ以上の化学療法剤と共製剤化及び／又は共投与される。化学療法剤の非限定的な例としては、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物及びスルホン酸アルキル；代謝拮抗薬、例えば葉酸、プリン又はピリミジン拮抗薬；抗有糸分裂剤、例えばエリブリン又はエリブリンメシレート（Ｈａｌａｖｅｎ（商標））、ビンカアルカロイド類及びアウリスタチン類などの抗チューブリン剤；細胞毒性抗生物質；ＤＮＡ発現又は複製に損傷を与えるか又はそれに干渉する化合物、例えばＤＮＡ副溝結合剤；及び成長因子受容体拮抗薬が挙げられる。一部の実施形態において、化学療法剤は、細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤であり得る。細胞毒性剤の例としては、限定はされないが、エリブリン又はエリブリンメシレート（Ｈａｌａｖｅｎ（商標））、アウリスタチン類（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））、メイタンシノイド類（例えば、メイタンシン）、ドラスタチン類、デュオスタチン類、クリプトフィシン類、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、タキサン類、タキソール類及びコルヒチン類などの抗有糸分裂剤；アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン）；細胞毒性抗生物質（例えば、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、デュオカルマイシン類（例えば、ＣＣ－１０６５）、オーレオマイシン類、デュオマイシン類、カリケアマイシン類、エンドマイシン類、フェノマイシン類）；アルキル化剤（例えば、シスプラチン）；インターカレート剤（例えば、臭化エチジウム）；トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、エトポシド、テニポシド）；Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２又は２１３、Ｐ３２などの放射性同位体及びルテチウムの放射性同位体（例えば、Ｌｕ１７７）；及び細菌、真菌、植物又は動物起源の毒素（例えば、リシン（例えば、リシンＡ鎖）、ジフテリア毒素、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（例えば、ＰＥ４０）、エンドトキシン、ミトゲリン、コンブレスタチン、レストリクトシン、ゲロニン、αサルシン、アブリン（例えば、アブリンＡ鎖）、モデシン（例えば、モデシンＡ鎖）、クリシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害薬、グルココルチコイド）が挙げられる。

【0195】

また、本明細書では、例えば、上記に記載される方法に係る癌の治療用医薬品の製造における開示される抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの１つ以上の使用も開示される。一部の実施形態において、本明細書に開示されるＡＤＣは、例えば、上記に記載される方法に係る癌の治療に使用される。

【0196】

様々な実施形態において、本明細書に記載される臨床検査及び治療適用における使用のためのキットは、本開示の範囲内にある。かかるキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器であって、その各々が本明細書に開示される方法で使用される別個の要素の１つを含む容器を受けるように区画化されている運搬手段、パッケージ又は容器を、本明細書に記載される使用など、使用に関する説明書を含む表示又は添付文書と共に含み得る。キットは、薬物部分を含む容器を含み得る。本開示は、薬剤の分量を表示するアンプル又はサシェットなどのハーメチックシール容器にパッケージングされた抗体、抗原結合断片及び／又はＡＤＣの１つ以上又はその医薬組成物も提供する。

【0197】

キットは、上記に記載される容器と、それに関連する１つ以上の他の容器であって、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ；内容物を列挙する運搬手段、パッケージ、容器、バイアル及び／又はチューブの表示及び／又は使用説明書並びに使用説明書を含む添付文書を含めた、商業的観点及び使用者の観点から望ましい材料を含む容器とを含み得る。

【0198】

本組成物が特定の治療法又は予後判定、予防、診断若しくは臨床検査適用などの非治療適用に使用されることを指示するため、容器上又は容器と共に表示が存在し得る。表示は、本明細書に記載されるものなど、インビボ又はインビトロのいずれかの使用についての指図も指示し得る。指図及び／又は他の情報は、キットと共に又はキット上に含まれる１つ若しくは複数の添付文書又は１つ若しくは複数の表示にも含まれ得る。表示は、容器上にあるか又はそれに付随し得る。表示は、表示を形成する英字、数字又は他の文字が容器自体に成形又はエッチングされているとき、容器上にあるとし得る。表示は、それが同時に容器も保持する入れ物又は運搬手段内に例えば添付文書として存在するとき、容器に付随するとし得る。表示は、本組成物が本明細書に記載される癌などの病態の診断又は治療に使用されることを指示し得る。

【0199】

本明細書に記載される本発明の方法の他の好適な変形形態及び適合形態は、当業者に自明であり、本明細書に開示される本発明又は実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な均等物を用いてなされ得ることが容易に理解されるであろう。ここで、本発明を詳細に記載したが、あくまでも説明のために含まれる、限定することを意図しない以下の例を参照することにより、それが更に明確に理解されるであろう。

【実施例】

【0200】

実施例１：ヒトメソテリンに対するキメラ抗体作成
以下に記載する手順に従い、ウサギ及びヒト免疫グロブリン配列を含有するキメラ抗体を作成した。抗体をヒトメソテリンへの結合及びエピトープ結合に関して分析した。様々なレベルのメソテリンを発現するヒト細胞株において、これらの組換えキメラ抗メソテリン抗体の初期ＡＤＣ細胞毒性を評価した。ヒト化及びＡＤＣ開発のためのリード抗体については、実施例２～３に記載する。

【0201】

１．１ 試薬及び材料
１．１．１ 抗体
以下の研究で使用した抗体は、ウサギ－ヒトキメラ（－ｘｉ）形態の抗ヒトメソテリン抗体であり、軽鎖８０位（ＬＣｃｙｓ８０）に不対のシステインを有する。この抗体を以下の第１．５節に記載するとおり精製し、脱システイン化した。最終的なタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより判定した。

【0202】

１．１．２ コンジュゲーション可能な細胞毒及びＬＣｃｙｓ８０ ＡＤＣ
以下の研究で使用したリンカー－細胞毒化合物には、Ｍａｌ－ＰＥＧ_２－アウリスタチンＦが含まれる。抗体をＭａｌ－ＰＥＧ_２－アウリスタチンＦと１：５（ｍＡｂ：ペイロード）のモル比でコンジュゲートした。コンジュゲートしたＬＣｃｙｓ８０抗体を、ランニング緩衝液として１×ＤＰＢＳを使用した、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ上の２×５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による脱塩クロマトグラフィーを用いて精製した。最終的なタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイにより決定した。

【0203】

１．１．３ 腫瘍細胞株
ウサギ－ヒトキメラＡＤＣの分析に使用したヒト腫瘍細胞株には、Ａ４３１－Ｋ５（ヒトメソテリンを安定にトランスフェクトしたヒトメラノーマ細胞Ａ４３１、ＭＳＬＮ^ｈｉ）、Ａ４３１（ＭＳＬＮ^ｌｏ）及びＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣癌、ＭＳＬＮ^ｈｉ）が含まれた。Ａ４３１－Ｋ５細胞は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手した。使用した細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から直接入手した。

【0204】

１．１．４ 他の試薬
使用した試薬の全ては、特に指示されない限り、供給業者から研究グレード以上で入手した。

【0205】

１．２ ウサギにおけるヒトメソテリンに対する抗体の作成
ベクターｐ０３０１からのヒトメソテリンｃＤＮＡをＡｌｄｅｖｒｏｎ発現ベクターにクローニングした（ｐＢ８－メソテリン－ｈｕｍ）。次に、２羽のウサギをこの免疫ベクターｐＢ８－メソテリン－ヒトで免疫した。４回の遺伝子適用後、免疫プロトコルの５２日目に免疫血清を採取した。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中にウサギ免疫血清を１：１０００又は１：５０００希釈し、Ａｌｄｅｖｒｏｎ発現ベクターにクローニングしたヒトメソテリンｃＤＮＡ（ｐＢ１－メソテリン－ｈｕｍ）を、予め一過性にトランスフェクトした哺乳類細胞及び同じベクターにクローニングした無関係のｃＤＮＡを一過性にトランスフェクトした哺乳類細胞を使用したフローサイトメトリーによって試験した。次に、１０μｇ／ｍＬヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｒ－フィコエリトリン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃４０３０－０９）で免疫血清から抗体を検出した。免疫化、フローサイトメトリー及び細胞の凍結保存は、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（Ｄｒｅｉｂｕｒｇ、独国）によって実施された。

【0206】

１．３ 抗メソテリン抗体を産生する培養物のハイスループットスクリーニング
１．３．１ 細胞培養
凍結保存したウサギリンパ節細胞（２．０×１０^７細胞）を解凍し、次に２．５μｇ／ｍＬのヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）由来レクチンで活性化し、ＤＮアーゼＩによって３７℃、５％ＣＯ_２で１時間回復させた。細胞を３８４ウェルプレートに各ウェル５細胞でフィーダー細胞（ウサギＣＤ１５４を発現するＣＨＯ）と共に播種し、１０．５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ２及び１０．５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ２１サイトカイン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含有する完全ＩＭＤＭ（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＭＥＭ ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５５μＭ ２－Ｍｅを補足したＩＭＤＭ）で培養した。

【0207】

１．３．２ ヒトメソテリンに対するウサギＩｇＧ及びポリクローナル抗体の単離
２週目に、ユウロピウムクリプテートを使用したＩｇＧ ＦＲＥＴにより、ウサギＩｇＧ抗体を産生するウェルを同定した。ＩｇＧを産生するウェルについて、１μｇ／ｍＬのＣＨＯ－ＭＴ４０メソテリンをコートしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより、ウサギＩｇＧ Ｆｃγ抗体の存在に関してスクリーニングした。メソテリン特異的ウサギＩｇＧを産生する培養物が１μｇ／ｍＬのメソテリンに対するＥＬＩＳＡスクリーニングによって確認され、それらを１μｇ／ｍＬのＣＤ７３－ｈｉｓに対してカウンタースクリーニングした。ＦＲＥＴ及びＥＬＩＳＡは、Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）ＦＸロボットシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）で実施した。

【0208】

１．３．３ ヒトメソテリンに対するウサギ抗体のｍＲＮＡ遺伝子レスキュー
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）－９６全ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ウサギＩｇＧ抗メソテリン抗体を産生するウェルから全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを合成し、インハウスのプライマー（表１１）を用いるＰｌａｔｉｎｕｍ ＴａｑワンステップＲＴ－ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＰＣＲにより、軽鎖及び重鎖可変領域を増幅した。この軽鎖及び重鎖可変領域を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ増幅キット及びサーモサイクラー（４０サイクル、９４℃１分、５４℃１分、６８℃１．５分）を使用してネステッドプライマー（表１２）で増幅した。増幅したＤＮＡ鋳型をゲル電気泳動によって視覚化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、及びＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によってインハウスのプライマー（表１３）を用いてＤＮＡ配列が決定された。Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子ウサギファミリー（ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ）並びにインハウスのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎプライマーデータベース（Ｂｌａｓｔｎ）に対して、ＤＮＡ配列を分析した。Ｖ及びＪ遺伝子プライマーのために５’末端に付加されるヒトＦｃリンカーを含有するＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎプライマー（表１４）は、同定するか又は設計するかのいずれかであった。プライマーは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。

【0209】

【表12】

【0210】

【表13】

【0211】

【表14】

【0212】

【表15】

【0213】

１．３．４ ＰＣＲ断片
ＰＣＲ増幅した可変ドメインは、５’末端及び３’末端において、サブクローニングベクター内にあるクローニング部位と相同な１５塩基対を含んだ。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコルに従って使用して、ヒトγ（ｐ１９７４ ｐＣ＋７５ＩＺ－ｌｄｒ－ＩｎＦｕｓｉｏｎ－ｈｕｇａｍｍａ）又はκ定常領域（ｐ１９７５ ｐＣ＋７５ＩＢ－ｌｄｒ－ＩｎＦｕｓｉｏｎ－ｈｕｋａｐｐａ）を含有する発現プラスミドにＰＣＲ断片をサブクローニングした。１μＬのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応物を製造者のプロトコルに従ってＳｔｅｌｌａｒコンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に形質転換した。形質転換体をマイクロタイタープレート振盪機上で１ｍＬ ＴＢ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）中３７℃で一晩成長させた。翌日、ｅｐＭｏｔｉｏｎ ５０７５を製造者のプロトコルに従って使用して、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）で培養物をミニプレップした。

【0214】

１．３．５ 遺伝子合成断片
ヒト化重鎖及び軽鎖可変ドメインをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における発現のためにコドン最適化し、これがＧｅｎｅＡｒｔによって合成された。これらの可変ドメインは、コザック翻訳開始配列及びＩｇ分泌リーダー配列と共に合成し、５’末端及び３’末端において、サブクローニングベクター内にあるクローニング部位と相同な１５塩基対を含んだ。ＧｅｎｅＡｒｔによって合成されたＰＣＲ断片を、ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ヒトγ（ｐ１９７４ ｐＣ＋７５ＩＺ－ｌｄｒ－ＩｎＦｕｓｉｏｎ－ｈｕｇａｍｍａ）又はκ定常領域（ｐ１９７５ ｐＣ＋７５ＩＢ－ｌｄｒ－ＩｎＦｕｓｉｏｎ－ｈｕｋａｐｐａ）を含有する発現プラスミドにサブクローニングした。クローンは、全てシーケンシングして挿入物の存在及び忠実度を確認した。

【0215】

１．４ 一過性ｍＡｂ産生
１．４．１ ＨＥＫ細胞
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でトランスフェクトする３×１０^６細胞の１ミリリットルにつき、３３３．３ｎｇ ＨＣプラスミド及び３３３．３ｎｇ ＬＣプラスミドを５０μＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で５～１０分間インキュベートした。同様に、２．６７μＬ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを５０μＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中でインキュベートした。このＤＮＡ混合物にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液を追加し、室温で２０～３０分間インキュベートした。ＤＮＡ：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ混合物をかき混ぜながら細胞に加え、３７℃、８％ＣＯ_２で、１２５ｒｐｍで振盪してインキュベートした。翌日、このトランスフェクションに細胞１ｍＬ当たり５μＬのエンハンサー１及び５０μＬのエンハンサー２を加え、インキュベーションを更に７～１０日間継続した。４８～７２時間後、１０ｇ／ＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｍＭ吉草酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１：１００のＣＤ脂質濃縮物（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）当たり１０ｇの最終濃度の細胞を供給した。

【0216】

１．４．２ ＣＨＯ細胞
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でトランスフェクトする６×１０^６細胞の１ミリリットルにつき、５００ｎｇ ＨＣプラスミド及び５００ｎｇ ＬＣプラスミドをＯｐｔｉ－ＰＲＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中に４０μＬの総容積として混合した。同様に、３．２μＬ ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯを３６．８μＬ Ｏｐｔｉ－ＰＲＯ中に混合した。このＤＮＡ混合物にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ溶液を加え、室温で１～５分間インキュベーションした。ＤＮＡ：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ混合物をかき混ぜながら細胞に加え、３７℃、８％ＣＯ_２で、１２５ｒｐｍで振盪してインキュベートした。翌日、このトランスフェクションに細胞１ｍＬ当たり６μＬのエンハンサー及び１６０μＬのフィードを加え、細胞を３２℃、５％ＣＯ_２に移した。５日目、細胞１ｍＬ当たり１６０μＬの追加のフィードを加えた。１２～１４日目、上清を回収した。

【0217】

１．５ ｍＡｂ精製及び脱システイン化
１．５．１ 抗体精製
Ｐｒｏｓｅｐ－ｖＡ Ｈｉｇｈ ＣａｐａｃｉｔｙプロテインＡ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＤＰＢＳで平衡化させて、２ｍＬの試料に５０μＬを加えた。室温で１時間インキュベートした後、フィルタプレートに培地及び樹脂を加え、１ｍＬ ＤＰＢＳで２回洗浄した。４００μＬ ０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．９を加えることにより、樹脂から試料を溶出させた後、続いて１５，０００×ｇで３０秒間遠心した。２０μＬの１Ｍトリス、ｐＨ８．０で試料を中和した。０．５ｍＬ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、１０ｋカットオフフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１５，０００×ｇで５分間遠心することにより試料を約１００μＬに濃縮し、０．５ｍＬ Ｚｅｂａ脱塩カラム、７Ｋ ＭＷＣＯを製造者のプロトコルに従って使用してＤＰＢＳで緩衝液交換した。ＡＵ２８０を測定することによりｍＡｂ濃度を決定し、ｍＡｂの消衰係数を用いてｍｇ／ｍＬに変換した。

【0218】

１．５．２ システインキャップ除去
ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓ精製プラットフォーム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製を実施した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化させた５ｍＬ ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に最大１Ｌまでの馴化培地をロードした。ロードした後、安定したベースラインが観察されるまで、カラムを大量の平衡化緩衝液で洗浄した。結合した材料を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．９を用いて溶出させた。溶出した材料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化させた２６／１０ ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直ちに注入し、同じ緩衝液中に溶出させた。ピーク画分をプールした。ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）並びに還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動法によって材料のタンパク質含量を分析した。

【0219】

１．６ ＡＤＣ開発のための組換えキメラ抗メソテリン抗体の初期スクリーニング及び特徴付け
抗メソテリン抗体を一過性に発現させて、９６ディープウェルプレートでＥｘｐｉ－２９３培地を使用して培養した。上清から抗体を精製し、上記に記載したとおり脱システイン化した。Ｍａｌ－ＰＥＧ_２－アウリスタチンＦをペイロードとして使用して、１：５（ｍＡｂ：ペイロード）のモル比を用いて抗体をコンジュゲートした。コンジュゲートした抗体をＴｈｅｒｍｏ Ｚｅｂａスピン脱塩プレートを使用して脱塩することにより、余分な遊離ペイロードを除去した。

【0220】

１．７ 結合の特徴付け
１．７．１ Ｏｃｔｅｔを使用した抗メソテリンエピトープビニング
初めに、カスタマイズした結合アッセイを用いて、ストレプトアビジンチップでＯｃｔｅｔを使用して、メソテリンに対する抗体結合エピトープを特徴付けた。抗メソテリン抗体のエピトープ結合は、公知の抗メソテリン抗体、ＭＯＲＡｂ－００９（アマツキシマブ）が結合するエピトープに対して正規化した。ＭＯＲＡｂ－００９と同じ、近い又は異なるエピトープに対するその結合に基づいて抗体をグループ化した。全ての抗体が異なるエピトープビニングとつながるまで、ステップを繰り返した。Ｏｃｔｅｔの結果に基づき、結合親和性を、高い、中程度及び低いとして順位付けした。結合ステップは、全て０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ緩衝液中で実行した。

【0221】

１．７．２表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）結合分析
メソテリンに対する抗メソテリン抗体結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ－１００、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１４２６０７５）により、Ｓ ＣＭ５シリーズのチップを使用して測定した。１×ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で抗体濃度を１μｇ／ｍＬに、且つメソテリン（５０μｇ）を１００ｎＭに調整した。製造者のプロトコルに従い、固定化ウィザードでＣＭ５チップを使用して抗ヒト抗体捕捉チップを調製した。最終的な捕捉抗体レベルは、ＨＢＳ－Ｐ＋中、８０００～９０００ＲＵであった。チップは、３００秒の緩衝液注入と、続く３０秒の再生のサイクルを５回、いずれも全４フローセルにわたって３０μＬ／分で行うアッセイのために調製した。個々のリガンド溶液を１０μＬ／分で９０秒間順次注入することにより、抗体がフローセル２～４に捕捉された。分析物の注入は、分析物溶液を低濃度から高濃度に順次、３０μＬ／分で各２４０秒間注入することによる単一サイクル反応速度方式で行った。検出は、２－１、３－１、４－１であった。一連の同一のリガンド捕捉注入と、続く５回の各２４０秒間の緩衝液単独注入、１８００秒間の解離及び上記のとおりの再生による二重参照法を実施した。リガンドは、全てメソテリンへの結合に関してデュプリケートで分析した。反応速度解析は、ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して、１：１ラングミュア当てはめモデルを用いて実施した。デュプリケートランからオン速度、オフ速度及び親和性定数の平均を求めた。

【0222】

１．８ インビトロ細胞毒性分析
Ａ４３１、Ａ４３１－Ｋ５及びＯＶＣＡＲ３細胞を継代培養し、９６ウェル組織培養プレート内の完全成長培地に５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩（１６時間）インキュベートした。２ｍＬディープウェル希釈プレートに、試験試薬を２００ｎＭから出発して１：３段階希釈した（合計１０点の希釈）。希釈した試料（１００μＬ）を細胞プレートに加えた（試験試料の出発濃度１００ｎＭ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で更に５日間インキュベートした。次に、培地を廃棄し、プレートを２００μＬ ＤＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの０．２％クリスタルバイオレット溶液によって室温で１５分間染色し、次に大量の水道水で洗浄した。プレートを風乾させて、クリスタルバイオレットを２００μＬの１％ＳＤＳ溶液で溶解した。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して分析した。

【0223】

１．９ 結果
１．９．１ ウサギの免疫化
２羽のウサギをプラスミドｐＢ８－メソテリン－ヒトで４回の遺伝子適用にわたってＤＮＡ免疫した。免疫化プロトコルの５２日目に免疫血清を採取し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：１０００又は１：５０００希釈し、メソテリン発現細胞を使用したフローサイトメトリーによって試験した。いずれの免疫ウサギからの血清も、ｐＢ１－メソテリン－ｈｕをトランスフェクトした細胞であるメソテリン発現細胞に結合した（図１、下の曲線）。逆に、免疫ウサギからの血清は、無関係のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞に結合しなかった（図１、上の曲線）。

【0224】

１．９．２ ヒトメソテリンに対するウサギポリクローナル抗体を産生する培養物のハイスループットスクリーニング
ウサギリンパ節細胞を回収し、凍結保存した。解凍したリンパ節からの細胞（２×１０^７細胞）を３８４ウェルプレートに各ウェル５細胞でフィーダー細胞と共に播種し、１０．５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２及び１０．５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－２１サイトカインを含有する完全ＩＭＤＭで培養した。播種から２週間後、ユウロピウムクリプテートを使用したＩｇＧ ＦＲＥＴにより、ウサギＩｇＧ抗体を産生するウェルを同定し、１８，７１５個のＩｇＧ産生培養物について、ＥＬＩＳＡによりヒトメソテリン反応性に関してスクリーニングした。８５個のメソテリン特異的培養物がメソテリンに対する反応性に関して再確認され、それらをヒトＣＤ７３への反応性に対してカウンタースクリーニングした。ウサギＦｃγ抗体を産生する培養物で、ＣＤ７３との交差反応性のない、０．２を上回るＯＤ_４５０でメソテリンに結合したことが確認されたものは、５４個あった（図２）。一次ＥＬＩＳＡ結果は、最も右側の一連のバーによって示され、二次ＥＬＩＳＡ結果は、最も左側の一連のバーによって示され、及びヒトＣＤ７３結合は、中央の一連のバーによって示される。

【0225】

１．９．３ 可変領域のＲＴ－ＰＣＲ、シーケンシング及びクローニング
ウサギＩｇＧ抗メソテリン抗体を産生する５４個の確認された培養物から全ＲＮＡを単離し、ＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡを合成し、軽鎖及び重鎖可変領域をＰＣＲ増幅した。Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子ウサギファミリー（ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ）を使用して５２個のＤＮＡ配列を分析し、定常領域発現ベクターへのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングに特異的なプライマーで５１個をＰＣＲ増幅した（図３）。合計４８個の抗体をヒト定常領域発現ベクターにクローニングし、続いてｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。５１個のトランスフェクタントのうちの４５個に抗体が検出され（図４）、ウサギ可変領域をヒト定常領域発現ベクターにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングした。

【0226】

１．９．４ メソテリン発現細胞に対するＡＤＣの初期スクリーニング
第１．５節に記載した方法に従ってキメラウサギ抗ヒトメソテリン（ｒｂ－ｈｕ－ｘｉ抗ＭＳＬＮ）抗体を精製した。精製抗体のタンパク質濃度を決定した（図５）。ＡＤＣ開発のための抗メソテリン抗体のスクリーニングを完了するため、抗メソテリン抗体とＭａｌ－ＰＥＧ_２アウリスタチンＦのマイクロコンジュゲーションを実施し、ＯＶＣＡＲ３、Ａ４３１－Ｋ５及びＡ４３１細胞株を使用してインビトロ細胞ベースの効力アッセイでＡＤＣを特徴付け、ここで、ＯＶＣＡＲ３及びＡ４３１－Ｋ５は、高レベルのメソテリンを発現し、Ａ４３１（ＭＳＬＮ^－）は、ＡＤＣのオフターゲット殺傷及び特異性の評価のための対照細胞株として使用した（図６）。

【0227】

１．９．５ 抗メソテリン抗体のエピトープ結合
４８個の抗メソテリン抗体のメソテリンに対する結合エピトープについて、第１．７．１節に指示するとおりＯｃｔｅｔを用いて特徴付けた。これらの抗体について６個の異なるエピトープが同定され、Ｏｃｔｅｔによれば、１０２Ａ６は現行のフォーマットでは結合がないことが観察された（図７）。メソテリンに対する抗体結合親和性について、第１．７．２節に指示するとおりＢＩＡｃｏｒｅにより測定した。結合親和性結果を表１５にまとめる。

【0228】

【表16】

【0229】

上記の結果に基づき、スケールアップコンジュゲーション及び特徴付けに、表１６に指示するとおりの、全てのエピトープビンを網羅する１５個の抗体を選択した。１０２Ａ６Ａも、アウリスタチンＦにコンジュゲートしたときの有利なインビトロ効力に基づいて選択した。

【0230】

【表17】

【0231】

実施例２：抗メソテリンＡＤＣのヒト化
以下に記載する手順に従い、ヒト化抗メソテリン抗体を作成した。抗体及びＡＤＣについて、ヒトメソテリンに対する結合活性の保持及びメソテリンを発現する細胞に対する細胞殺傷効力を分析した。抗体は、薬物負荷量、凝集、熱安定性並びに血清及びマトリックス安定性に関しても生物物理学的に特徴付けた。リードヒト化抗体及びＡＤＣは、実施例３に記載されるとおりインビボで評価した。

【0232】

２．１ 試薬及び材料
２．１．１ 抗体
以下の研究で使用した抗体は、軽鎖８０位に不対のシステイン（ＬＣｃｙｓ８０）を有し、ウサギ－ヒトキメラ（－ｘｉ）形態及びヒト化（－ｚｕ）形態の両方の抗ヒトメソテリン抗体３３Ｏ１１、２０１Ｃ１５、１１１Ｂ１０、３２４Ｏ５、１７８Ｆ１６、２６４Ｅ２４、２３７Ｎ１８、３８３Ｉ１８、３９３Ｌ１４、３４６Ｃ６、６２Ｂ１０、５５Ｂ４、ＭＯＲＡｂ００９、１２０Ｎ１８、３４５Ａ１２及び１０２Ａ６Ａ２を含む。Ｐｒｏｓｅｐ－ｖＡ Ｈｉｇｈ ＣａｐａｃｉｔｙプロテインＡ樹脂及びＺｅｂａ脱塩カラムを使用して、これらの抗体をバッチ精製した。馴化培地を精製し、第１．５節（実施例１）に記載されるとおり脱システイン化した。最終的なタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより判定した。

【0233】

２．１．２ コンジュゲーション可能な細胞毒及びＬＣｃｙｓ８０ ＡＤＣ
以下の研究で使用したリンカー－細胞毒化合物には、マレイミド－ＶＣＰ－エリブリン、マレイミド－ＶＣＰ－クリプトフィシン及びマレイミド－ＶＣＰ－エリブリン二量体が含まれる。１×ＤＰＢＳで平衡化させたＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による脱塩クロマトグラフィーを用いてコンジュゲート型抗体を精製した。最終的なタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイにより決定した。

【0234】

２．１．３ 腫瘍細胞株
ウサギ－ヒトキメラＡＤＣの分析に使用したヒト腫瘍細胞株には、Ａ４３１（ヒトメラノーマ細胞、ＭＳＬＮ^ｎｅｇ）、Ａ３（ヒトメソテリンを安定にトランスフェクトしたＡ４３１、ＭＳＬＮ^ｈｉ） ＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣癌細胞、ＭＳＬＮ^ｈｉ）、ＨＥＣ－２５１（ヒト類内膜、ＭＳＬＮ^ｍｅｄ）及びＨ２２６（ヒト肺扁平上皮細胞中皮腫、ＭＳＬＮ^ｌｏ）が含まれた。使用した細胞株は、全てアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から直接入手したものであり、但し、Ａ３は、ＭｏｒｐｈｏｔｅｋでＡ４３１親細胞株から作成され、ＨＥＣ－２５１は、ＪＣＲＢから入手した。

【0235】

２．１．４ 他の試薬
使用した試薬の全ては、特に指示されない限り、供給業者から研究グレード以上で入手した。

【0236】

２．２ ＡＤＣの生物物理学的特徴付け
２．２．１ ＳＥＣ－ＨＰＬＣ凝集分析
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを使用して、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を実行した。ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ（２．７μｍ、７．８×５０ｍｍ、シリアル番号０００６３４４４２４－１３、バッチ番号０００６３４４４２４）ガードカラムをＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ分析カラム（２．７μｍ、７．８×３００ｍｍ、シリアル番号０００６３３６８３７－４、バッチ番号０００６３３６８３７）に接続し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５％ＩＰＡ、ｐＨ７．４によって０．５ｍＬ／分の流量で平衡化させた。

【0237】

Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣを使用したサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により、ＬＣｃｙｓ８０ ＡＤＣの凝集を分析した。抗体及びＡＤＣは、１×ＤＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬで調製し、８μＬ（１６μｇ）の各試料を注入し、３６分間のランにかけた。データは、全てＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析した。パーセント凝集率、パーセント単量体率及びパーセント断片化率が報告された。

【0238】

２．２．２ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）ＤＡＲ分析
Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２６０システムで疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）を用いてＤＡＲを分析した。試料をＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｙｌ－５ＰＷカラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、７．５ｍｍ内径×７．５ｃｍ、１０μｍ、非多孔性サイズ）に注入し、０．７ｍＬ／分での、１００％の移動相Ａにおける３分間の平衡化、１５分間のグラジエント（０～１００％Ｂ）、１００％Ｂにおける５分間の保持、１００％Ａへの１分間の切り替え及び再び１００％の移動相Ａにおける５分間の平衡化によってカラムから溶出させた。移動相Ａは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０であった。移動相Ｂは、２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノール、ｐＨ７．０であった。検出は、２８０ｎｍ（参照３２０ｎｍ）で実施した。ＤＡＲは、以下の式により決定した：
［ＡＵＣ＋１＋２（ＡＵＣ＋２）＋３（ＡＵＣ＋３）＋．．．ｎ（ＡＵＣ＋ｎ）］／ΣＡＵＣｔｏｔ］
（式中、ＡＵＣ＋１は、１つの細胞毒とコンジュゲートしたＡＤＣに対応する抗体ピークの曲線下面積であり、及びＡＵＣ＋２は、２つの細胞毒とコンジュゲートしたＡＤＣに対応する抗体ピークの曲線下面積である。ΣＡＵＣｔｏｔは、コンジュゲート型のピーク及び非コンジュゲート型のピーク（ＤＡＲ＝０、１及び２）を合わせた曲線下面積である）。

【0239】

２．２．３ 液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ）ＤＡＲ分析
ＤＡＲは、ＳＱＤ／ＰＤＡ検出を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣによるＬＣ－ＭＳ法を用いても分析した。試料を６５℃でＰｒｏｔｅｏｍｉｘ ＲＰ－１０００カラム（５μｍ、１０００Å、４．６ｍｍ×１５ｃｍ、Ｓｅｐａｘ）に注入し、２５％Ｂでの３分間の平衡化、２５％から５５％Ｂへの２７分間の直線グラジエント、５５％Ｂでの５分間の保持、９０％Ｂへの１分間の切り替え、９０％Ｂでの５分間の保持、２５％Ｂへの１分間の切り替え戻し及び２５％Ｂでの５分間の再平衡化によって溶出させた。移動相Ａは、水中０．１％ＴＦＡであり、及び移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。次に、溶出液をＰＤＡ検出器とＳＱＤ検出器とに１０：１分割した。ＳＱＤ検出器は、ＥＳポジティブ、キャピラリー電圧３．５ＫＶ、コーン電圧５０Ｖ、エクストラクター５Ｖ及びＲＦレンズ０．３Ｖ、ソース温度１５０℃、脱溶媒和温度３５０℃にセットアップした。質量データは、２００～２０００ｍ／ｚで４０分間、連続モード及び走査時間１秒で取得した。ＭａｓｓＬｙｎｘ及びＭａｘＥｎｔ１を使用してオフラインでデータを分析し、デコンボリューション処理を行った。ＤＡＲは、以下の式を用いて計算した：
２［［ＡＵＣＬＣ＋１＋２（ＡＵＣＬＣ＋２）＋３（ＡＵＣＬＣ＋３）＋．．．ｎ（ＡＵＣＬＣ＋ｎ）］／ΣＩＬＣｔｏｔ］＋２［［ＡＵＣＨＣ＋１＋２（ＡＵＣＨＣ＋２）＋３（ＡＵＣＨＣ＋３）＋．．．ｎ（ＡＵＣＨＣ＋ｎ）］／ΣＡＵＣＨＣｔｏｔ］
（式中、ＡＵＣＬＣ＋１は、１つの細胞毒とコンジュゲートした軽鎖ピークの曲線下面積であり、ＡＵＣＬＣ＋２は、２つの細胞毒とコンジュゲートした軽鎖ピークの曲線下面積であり、以下同様である。ＡＵＣＨＣは、対応する重鎖の曲線下面積であり、ΣＡＵＣＬＣｔｏｔ及びΣＡＵＣＨＣｔｏｔは、それぞれ、全ての非コンジュゲート型及びコンジュゲート型軽鎖及び重鎖を合わせた曲線下面積である）。

【0240】

２．３ 結合の特徴付け
２．３．１ Ｏｃｔｅｔを使用した抗メソテリンエピトープビニング
初めに、カスタマイズした結合アッセイを用いて、ストレプトアビジンチップでＯｃｔｅｔを使用して、メソテリンに対する抗体結合エピトープを特徴付けた。抗メソテリン抗体のエピトープ結合は、公知の抗メソテリン抗体、ＭＯＲＡｂ－００９が結合するエピトープに対して正規化した。ＭＯＲＡｂ－００９と同じ、近い又は異なるエピトープに対するその結合に基づいて抗体をグループ化した。全ての抗体が異なるエピトープビニングとつながるまで、ステップを繰り返した。ｏｃｔｅｔの結果に基づき、結合親和性を、高い、中程度及び低いとして順位付けした。結合ステップは、全て０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴ緩衝液中で実行した。

【0241】

２．３．２ 表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）結合分析
メソテリンに対する抗メソテリン抗体結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ－１００、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１４２６０７５）により、Ｓ ＣＭ５シリーズのチップを使用して測定した。１×ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で抗体濃度を１μｇ／ｍＬに、且つメソテリン（５０μｇ）を１００ｎＭに調整した。製造者のプロトコルに従い、固定化ウィザードでＣＭ５チップを使用して抗ヒト抗体捕捉チップを調製した。最終的な捕捉抗体レベルは、ＨＢＳ－Ｐ＋中、８０００～９０００ＲＵであった。チップは、３００秒の緩衝液注入と、続く３０秒の再生のサイクルを５回、いずれも全４フローセルにわたって３０μＬ／分で行うアッセイのために調製した。個々のリガンド溶液を１０μＬ／分で９０秒間順次注入することにより、抗体がフローセル２～４に捕捉された。分析物の注入は、分析物溶液を低濃度から高濃度に順次、３０μＬ／分で各２４０秒間注入することによる単一サイクル反応速度方式で行った。検出は、２－１、３－１、４－１であった。一連の同一のリガンド捕捉注入と、続く５回の各２４０秒間の緩衝液単独注入、１８００秒間の解離及び上記のとおりの再生による二重参照法を実施した。リガンドは、全てメソテリンへの結合に関してデュプリケートで分析した。反応速度解析は、ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して、１：１ラングミュア当てはめモデルを用いて実施した。デュプリケートランからオン速度、オフ速度及び親和性定数の平均を求めた。

【0242】

２．４ 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）熱安定性分析
ＶＰキャピラリー示差走査熱量計（ＶＰ－ＣａｐＤＳＣ；Ｍｉｃｒｏｃａｌ、ＶＰ－ＣａｐＤＳＣ、＃１２－０７－１４９、付属Ｏｒｉｇｉｎ－７グラフ作成及びＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－キャピラリーＤＳＣソフトウェア ｖ．２．０）を使用して、様々なＦ（ａｂ’）２断片及び対照の高次構造及び熱安定性を解読し、比較した。２０％Ｃｏｎｔｒａｄ溶液を用いて試料を９６ウェルアッセイプレート（Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ）に調製し、１０℃でオートサンプラーにおいて分析した。

【0243】

２．５ キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析
ＣＦＲ導入及び始動手順に従ってオートサンプラー試薬を充填した。システム安定性標準物質としてはヘモグロビンを使用した。バッチデータ解析にはデフォルト設定を使用した。焦点化時間＃１は、システム適合性標準物質及び試料の両方について１，５００Ｖで１分間実施した。焦点化時間＃２は、システム適合性標準物質について３，０００Ｖで５分間、ＴＩＧＣ試料及び対応緩衝液対照について３，０００Ｖで１１分間実施した。デュプリケートのＴＩＧＣ試料は４．５分で焦点化時間＃２を用い、試料は、全てシステム適合性標準物質でブラケット法を適用した。試料は、０．１のピーク幅パラメータ及び５の閾値を用いて自動的に積分され、ｐＩ７．５～９．４で積分された。

【0244】

２．６ ＤＡＲ２及びＤＡＲ ６ＭＯＲＡｂ－１０９ ＡＤＣの調製
３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４ ＣＨＯＺＮ細胞株を生存率が３０％未満になるまでｗａｖｅバッグ（２０Ｌ）内で培養し、ＴＦＦを使用して２Ｌに濃縮した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２で予め平衡化させたＡｍｏｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂に抗体を捕捉し、安定したベースラインが実現するまで同じ緩衝液で洗浄し（未結合の材料を除去する）、次に、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭシステイン、ｐＨ７．２を使用して低速の流量においてオンカラムで８時間還元し、次に２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５を使用してオンカラムで６０時間、再び酸化させた。結合した材料を０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させて、次に１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４でダイアフィルトレーションし、１０ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。最終的な回収率は１００％であった。

【0245】

ＤＡＲ２ ＭＯＲＡｂ－１０９については、マレイミド－ＶＣＰ－エリブリンを１：２．５（ｍＡｂ：ペイロード）のモル比で（ＤＭＳＯ中に）室温で１時間加えた。コンジュゲーション後、材料を２ｍｇ／ｍＬに希釈し、１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡでのダイアフィルトレーションによって未コンジュゲートのリンカー－ペイロードを除去し、５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＤＡＲ２材料を分取Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ ＨＩＣクロマトグラフィーによって精製した。最終的な材料は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＨＩＣ－ＨＰＬＣによって特徴付けた。

【0246】

ＤＡＲ６ ＭＯＲＡｂ－１０９については、精製／脱システイン化した抗体を１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に７．５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、等容積の同じ緩衝液中の２５０μＭ ＴＣＥＰを５０分間加えることにより更に還元し、次に等しい総容積の１×ＤＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ中の５０％プロピレングリコールを加え、次に最後にマレイミド－ＶＣＰ－エリブリンを１：８（ｍＡｂ：ペイロード）のモル比で加え、室温で１時間インキュベートした。ＡＤＣをＧ－２５クロマトグラフィーによって精製することにより、未コンジュゲートのペイロードを除去し、１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡに製剤化した。最終的な材料は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＨＩＣ－ＨＰＬＣによって特徴付けた。

【0247】

２．７ インビトロ血清安定性
ＰＢＳ又はヒト血清のいずれかに、抗メソテリンＡＤＣ（ペイロードとしてマレイミド－ＶＣＰ－エリブリン）を０．５ｍｇ／ｍＬで調製した。試料を３７℃で０、２４、４８、７２、９６又は２４０時間インキュベートし、次に－８０℃に移して保存した。全ての試料を周囲温度に解凍し、試験のために１：２，０００で一回希釈した。全ｍＡｂ、全ＡＤＣに関して且つ細胞ベースの効力で試料を試験した。全ｍＡｂアッセイは、Ｇｙｒｏｌａｂ ＸＰ上での段階的サンドイッチフォーマットとして開発し、ビオチン化メソテリンで捕捉し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ＩｇＧ１ Ｆｃで検出した。全ｍＡｂ及びインタクトＡＤＣアッセイの定量化可能な範囲は、それぞれ、６．２５～８００ｎｇ／ｍＬ及び６．２５～８００ｎｇ／ｍＬであった。検量線及びＱＣはＭＯＲＡｂ－１０９（３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリン）で行った。

【0248】

２．８ ＭＯＲＡｂ－１０９ ＡＤＣのインビトロＤＡＲ感受性マトリックス安定性
ＰＢＳ又はヒト、サル、ラット若しくはマウス血清のいずれかに、０．１ｍｇ／ｍＬのＭＯＲＡｂ－１０９（３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリン）ＤＡＲ ２をトリプリケートで調製した。試料を３７℃で０、２４、４８、７２、９６又は２４０時間インキュベートした。各時点で取り出した試料を－８０℃に移して保存した。分析は、無標識バイオレイヤー干渉アッセイを用いて実施した。マトリックス試料は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０及び１％ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ（アッセイ緩衝液）中に１：２０に希釈した。ＭＯＲＡｂ－１０９ ＤＡＲ ０、ＤＡＲ １、ＤＡＲ ２及びＤＡＲ ６の対照試料は、対応するマトリックス中に０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。陰性対照試料は５％マトリックス単独であった。アッセイ緩衝液中の５μｇ／ｍＬのビオチン化メソテリンをＳＡストレプトアビジンバイオセンサーチップ（３００秒；Ｐａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に捕捉し、続いて希釈した安定性試料及び対照を捕捉した（３００秒）。次に、１００ｍｇ／ｍＬのウサギ－ヒトキメラ抗エリブリン抗体５Ｅ４を結合させることによってペイロードを定量化した。会合を３００秒間モニタした時点で、結合は平衡に達していた。２９５秒間の会合時点における各試料について、解離相の終了時の結合レベル（Ｒ_ｅｑ）を決定した。ｔ_０に対する相対的なパーセントＲ_ｅｑ（ここで、パーセントＲ_ｅｑ＝Ｒ_ｅｑｔ_ｘ／Ｒ_ｅｑｔ_０［１００］及びｔ_ｘ＝０～２４０時間である）をプロットすることにより、安定性を決定した。

【0249】

２．９ インビトロ細胞毒性分析
Ａ４３１、Ａ３、ＯＶＣＡＲ３、ＨＥＣ－２５１及びＨ２２６細胞を継代培養し、９６ウェル組織培養プレート内の完全成長培地に５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩（１６時間）インキュベートした。２ｍＬディープウェル希釈プレートに、試験試薬を２００ｎＭから出発して１：３段階希釈した（合計１０点の希釈）。希釈した試料（１００μＬ）を細胞プレートに加えた（試験試料の出発濃度１００ｎＭ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で更に５日間インキュベートした。次に、培地を廃棄し、プレートを２００μＬ ＤＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの０．２％クリスタルバイオレット溶液によって室温で１５分間染色し、次に大量の水道水で洗浄した。プレートを風乾させて、クリスタルバイオレットを２００μＬの１％ＳＤＳ溶液で溶解した。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して分析した。

【0250】

２．１０ 結果
２．１０．１ ヒト化抗メソテリンエリブリンＡＤＣの初期スクリーニング
１５個の抗メソテリン抗体をサブクローニングし、スケールアップ発現させて精製し、マレイミド－ＶＣＰ－エリブリンをペイロードとして使用してＣｙｓ８０位にコンジュゲートした。全てのＡＤＣを精製し、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる凝集分析、ＨＩＣ－ＨＰＬＣによるＤＡＲ分析並びにＡ４３１－Ａ３（ＭＳＬＮ^ｈｉ）、Ａ４３１（ＭＳＬＮ^ｌｏ）及びＯＶＣＡＲ３（ＭＳＬＮ^ｈｉ）細胞株での細胞ベースのアッセイを用いて特徴付けた。細胞をＡＤＣで６時間処理し、次に洗い流すか、又は効力比較のため４８時間（Ａ４３１－Ａ３及びＡ４３１細胞）若しくは７２時間（ＯＶＣＡＲ３細胞）処理した。特徴付けデータを表１７にまとめる。以下の特徴付けデータに基づき、６つの抗体（太字）をヒト化に選択した。

【0251】

【表18】

【0252】

２．１０．２ ＡＤＣのＨＣ１－ＬＣ１ヒト化及びインビトロ細胞毒性
ＩＧＢＬＡＳＴ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ））及びＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（国際免疫遺伝学情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ＩＭＧＴ（登録商標）））ツールを使用して、ヒト生殖細胞系列可変ドメインタンパク質配列との最も近い相同性に関して、ウサギ１０２Ａ６Ａ２、１１Ｂ１０、２０１Ｃ１５、３４５Ａ１２及び３４６Ｃ６ Ｆｖ領域の配列をＢＬＡＳＴにかけた。ウサギフレームワーク配列を、最も近い相同性を示すヒト生殖系列配列に置き換えて、ＣＤＲグラフト化ヒト化変異体（ＨＣ１及びＬＣ１）を作成した。Ｋａｂａｔ定義によるＦＷＲＨ２の最終的な２つの残基が、ウサギ残基として保持された。１１１Ｂ１０については、最終的なＫａｂａｔ定義によるＦＷＲＨ３残基が保持された。全てのクローンについて、Ｖκ領域のＲＥＳＰＥＣＴ－ＬモチーフＣｙｓ８０及びＡｌａ８３が保持された。ヒト化抗体を作成した後、キメラ抗体及びヒト化抗体を両方とも、様々な疎水性の３つの異なるペイロード（マレイミド－ＶＣＰ－エリブリン、マレイミド－ＶＣＰ－クリプトフィシン及びマレイミド－ＶＣＰ－エリブリン二量体）とコンジュゲートした。全ての抗体について、メソテリンに対する結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅにより測定し、表１８にまとめるとおり、パーセント（％）凝集、ＤＡＲ及びインビトロ効力に関してＡＤＣを特徴付けた。ヒト化抗メソテリンＡＤＣのペイロード効力も測定しており、表１９にまとめる。ＡＤＣは、試験した５つの細胞株全てにおいて、低いナノモル濃度の細胞殺傷ＥＣ５０値を示した。

【0253】

【表19】

【0254】

【表20】

【0255】

【表21】

【0256】

【表22】

【0257】

２．１０．３ ヒト化精密化
２０１Ｃ１５、３４５Ａ１２及び３４６Ｃ６クローンについてはメソテリン結合が失われたため、続いてメソテリンへの結合を保持するように突然変異させる必要があった。ウサギ及びＣＤＲグラフト化Ｆｖ配列を用いて可変ドメインのインシリコモデルを作成した。ウサギ及びヒト化モデルの理論上の構造を重ね合わせ、ＣＤＲに近接している残基について、ＣＤＲループが構造全体に構造的影響を及ぼす可能性を分析した。ウサギ配列とヒト化配列との間で異なる残基を同定した。これらの異なる残基のほとんどは、二量体界面に位置しなかったか、又はＣＤＲから遠隔にあった。ＶＨ及びＶκ領域の幾つかの残基はＣＤＲに近接している（５Å以内にある）ことが分かり、これらを更に分析した。

【0258】

ＶＨ領域の２つのヒト化領域が、クローン２０１Ｃ１５、３４５Ａ１２及び３４６Ｃ６の抗原結合に干渉する可能性があると同定された。いずれのクローンも、ウサギ配列と比べてＨＣ１のＮ末端が１アミノ酸長かった。また、各々が、ＦＷＲＨ３に２つのアミノ酸欠失も有した（残基７２～７３）。これらのクローンの各々について、ＨＣ１の最初の５アミノ酸及びＦＷＲＨ３欠失を取り囲む６アミノ酸（残基７１～７６）をウサギ配列に復帰させた。３４５Ａ１２の残基９３もＨＣ５でウサギに復帰させた。ＬＣ１に関して、２０１Ｃ１５、３４５Ａ１２及び３４６Ｃ６のＮ末端をウサギ配列に復帰させた。２０１Ｃ５（残基６７）及び３４５Ａ１２（残基７０）のＦＷＲＬ３の１つの残基が、ＣＤＲと相互作用する可能性があると同定され、３４６Ｃ６のＦＷＲＬ２の１つの残基（残基３６）も同様に同定された。

【0259】

２．１０．４ ３４５Ａ１２の超ヒト化
抗原結合に決定的に重要であるものとしてＶκに追加のウサギ残基が同定されたことに伴い、３４５Ａ１２の更なる突然変異体を作成して、ＶＨ及びＶκ領域全体にわたって導入するヒト残基の数を増やした。インシリコモデルの分析により、ＶＨの残基３５、４８、４９、５７、５８、６１、６２、６３及び６４並びにＶκの残基１、３、２４、５５及び７０が同定された。

【0260】

２．１０．５ 超ヒト化３４５Ａ１２抗体の生物物理学的特徴付け
３５０ｍＬのスケールアップ細胞培養物から超ヒト化３４５Ａ１２抗体を精製し、１×ＤＰＢＳ中に製剤化した。これらの抗体を物理化学特性の評価のために濃縮した。表２０に示されるとおり、濃縮ステップ中にＨＣ１０－ＬＣ７及びＨＣ１５－ＬＣ７の組み合わせが沈殿し、これは相対的に低いｐＩ又は溶解不良に起因した可能性があった。精製した抗体をメソテリン結合親和性に関してＢＩＡｃｏｒｅにより分析した。データを以下の表２１にまとめる。

【0261】

【表23】

【0262】

【表24】

【0263】

２．１０．６ ＤＳＣ及びｃＩＥＦ分析
Ｆ（ａｂ’）２断片の熱融解曲線をＤＳＣにより分析した。ＨＣ１５－ＬＣ４ Ｆ（ａｂ’）２及びＨＣ１０－ＬＣ４ Ｆ（ａｂ’）２のプロファイルを図８に示す。

【0264】

３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４ ｍＡｂのｐＩをｃＩＥＦにより分析した。ｐＩは、各ｍＡｂ、３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４についての８．１９と３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４についての８．２５との間の０．０６ｐＨ単位以内の差があった（表２２）。

【0265】

【表25】

【0266】

２．１０．７ 血清安定性
３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４ ＡＤＣのＰＢＳ／ヒト血清安定性評価について、第２．７節に記載されるとおり、最長１０日間試験した。データを以下の表２３にまとめる。

【0267】

【表26】

【0268】

【表27】

【0269】

【表28】

【0270】

２．１０．８ ＤＡＲ感受性Ｏｃｔｅｔアッセイを用いた様々なマトリックス中における３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンのマトリックス安定性
３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリン（ＤＡＲ２）について、マウス、ラット、カニクイザル及びヒト血漿及び血清におけるインビトロ安定性を分析した。ＡＤＣをマトリックス中において０．１ｍｇ／ｍＬで１週間インキュベートし、１、２、３、４及び１０日後に時点を取り出した。第２．３．１節に記載されるとおり、ＤＡＲ感受性Ｏｃｔｅｔ（バイオレイヤー干渉法）ベースのアッセイを用いて分析を行った。結果を図９に示す。３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリン（ＤＡＲ２）は、ペイロードの時間依存的放出を実証し、３７℃で１０日間インキュベートした後の平均放出率は２０％であった。

【0271】

２．１０．９ ヒトメソテリンに対するウサギＩｇＧ及びポリクローナル抗体を産生する培養物
２週目に、ユウロピウムクリプテートを使用したＩｇＧ ＦＲＥＴにより、ウサギＩｇＧ抗体を産生するウェルを同定した。ＩｇＧを産生するウェルについて、１μｇ／ｍＬのＣＨＯ－ＭＴ４０メソテリンをコートしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより、ウサギＩｇＧ Ｆｃγ抗体の存在に関してスクリーニングした。メソテリン特異的ウサギＩｇＧを産生する培養物が１μｇ／ｍＬのメソテリンに対するＥＬＩＳＡスクリーニングによって確認され、それらを１μｇ／ｍＬのＣＤ７３－ｈｉｓに対してカウンタースクリーニングした。ＦＲＥＴ及びＥＬＩＳＡは、Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）ＦＸロボットシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）で実施した。

【0272】

実施例３：インビボ研究
ヒト肺及び胃癌異種移植モデル並びにヒト中皮腫患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルを使用して、以下に記載するプロトコルに従ってリードヒト化抗メソテリン抗体とエリブリンコンジュゲートとを含むＡＤＣをマウスで評価した。種々のＤＡＲ種のＡＤＣの抗癌活性及びオフターゲット毒性を判定した。

【0273】

３．１ 試薬及び材料
３．１．１ 抗体
以下の研究で使用した抗体は、軽鎖８０位に不対のシステイン（ＬＣｃｙｓ８０）を有し、ウサギ－ヒトキメラ（－ｘｉ）形態及びヒト化（－ｚｕ）形態の両方の抗ヒトメソテリン抗体ｘｉ３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２、ｘｉ１０２Ａ６Ａ２－ＨＣ１－ＬＣ２、ｚｕ３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２、ｚｕ３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４及びｚｕ３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４を含む。

【0274】

３．１．２ コンジュゲーション可能な細胞毒及びＬＣｃｙｓ８０ ＡＤＣ
以下の研究で使用したリンカー－細胞毒化合物には、マレイミド－ＶＣＰ－エリブリン及びマレイミド－ＶＣＰ－ジＯＨエリブリン二量体が含まれる。

【0275】

３．１．３ 腫瘍細胞株
以下の研究では、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７及びヒト中皮腫癌細胞株ＨＡＹを使用した。使用した細胞株は、全てアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から直接入手し、但し、ＨＡＹ細胞については、ＮＣＩから入手した。

【0276】

３．１．４ 他の試薬
使用した試薬の全ては、特に指示されない限り、供給業者から研究グレード以上で入手した。

【0277】

３．２ ヒト癌異種移植モデルにおけるインビボスクリーニング及び有効性研究
３．２．１ 研究動物
最大耐用量（ＭＴＤ）研究には、雌ＣＤ－１ ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、７～９週齢）を使用し、ＮＣＩ－Ｈ２１１０及びＨＡＹ異種移植片研究には、雌ＮＯＤ．ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用し、及びＮＣＩ－Ｎ８７異種移植片研究には、雌ＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、５週齢）を使用した。動物は、入荷次第、接種前に５～７日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物には耳標を付け、研究開始前に秤量した。

【0278】

３．２．２ 細胞培養
凍結ストックからの凍結保存ＮＣＩ－Ｈ２１１０、ＮＣＩ－Ｎ８７又はＨＡＹ細胞を、必要な補足成分を含有する培地で培養した。細胞を完全培地で２代にわたって継代培養した後、インビボ接種に使用した。

【0279】

３．２．３ 腫瘍移植、登録手順及び治療
氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合したＰＢＳ中に、ＮＣＩ－Ｈ２１１０及びＨＡＹ細胞について１．０×１０^８細胞／ｍＬ又は５．０×１０^７細胞／ｍＬの最終濃度となるように細胞を懸濁した。マウスに１００μＬ／マウスの細胞混合物を皮下注射し、体重及び腫瘍成長をモニタした。移植後３日目から週に３回、デジタルノギスによって測定値を取った。

【0280】

３．２．４ 腫瘍測定及び治療
腫瘍容積は、以下の式を用いて計算した：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６。腫瘍移植片が１００ｍｍ^３の平均容積に達したところで、マウスを各群５匹のマウスに無作為化した。治療は、２００μＬの容積で静脈内投与した。各研究の終了時に最終的な体重を測定し、記録した。

【0281】

３．２．５ 統計分析
反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定により、各治療群からの動物の腫瘍容積を対照群と比較した。各実験群内での腫瘍成長の比較も同じ統計分析を用いて実施した。

【0282】

３．３ ヒト中皮腫ＰＤＸモデルにおけるインビボ有効性研究
３．３．１ 研究動物
ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ雌マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ、５～６週齢）は、入荷次第、接種前に少なくとも４日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物に耳印を付け、研究開始前に秤量した。

【0283】

３．３．２ 異種移植
研究０日目、無菌条件下で５匹のドナーマウスからＭｅｓｏ ７２１２腫瘍を採取した。ドナー腫瘍組織を２×２ｍｍ片に切り出し、０．９％生理食塩水で覆われている滅菌ペトリ皿に置いた。並行して、受容側の動物を鎮痛薬Ｍｅｔａｃａｍ（登録商標）（２ｍｇ／ｋｇ）で皮下治療し、次にＥｔｏｍｉｄａｔ－Ｌｉｐｕｒｏ（登録商標）（１２ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内注射（０．１５ｍＬ／マウス）によって麻酔した。左側腹部の５～８ｍｍの皮膚に表層縦切開を入れた。側腹部から直接、切開部に外科用ハサミの先端を挿入し、それを用いて皮下腔にポケットを形成した。外科用ピンセットを用いてポケットに各マウス１つの腫瘍片を移植した。金属クリップで切開部を閉じ、動物を清潔なケージに戻した。

【0284】

３．３．３ 実験手順
腫瘍の増殖中、デジタルノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を使用して腫瘍直径を測定した。動物をその腫瘍容積に基づいて実験群に無作為に割り付けた（腫瘍容積の組入れ基準、０．１～０．３ｃｍ^３）。腫瘍容積及び体重を週２回記録した。

【0285】

３．３．４ 治療
無作為化当日、エリブリンを０．２、０．３及び３．２ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ ０、２及び６）を無作為化当日に１０．０ｍｇ／ｋｇの用量又は４日間連日２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。全実験群で、静脈内注射の投与容積は１０ｍＬ／ｋｇであった。

【0286】

３．３．５ 統計分析
腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較も同じ統計分析で実施した。

【0287】

３．４ 結果－インビボスクリーニング及び有効性研究
３．４．１ 研究Ｍ１０９－００４－２０１６：ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおける３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２及び１０２Ａ６Ａ２ ＨＣ１－ＬＣ２エリブリン二量体ＡＤＣのインビボスクリーニング
ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＮＣＩ－Ｈ２１１０異種移植モデルにおいて、抗メソテリン抗体の２つのクローン（３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２及び１０２Ａ６Ａ２－ＨＣ１－ＬＣ２）の比較インビボスクリーニングを実施した。２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は２．５ｍｇ／ｋｇの１０２Ａ６Ａ２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣでマウスを治療した。両方のＡＤＣの抗腫瘍活性及び体重変化を、それぞれ図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。

【0288】

３．４．２ 研究Ｍ１０９－００６－２０１７：ＣＤ－１マウスにおける３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４エリブリン二量体ＡＤＣの最大耐用量（ＭＴＤ）の予備的評価
５、１０、１５若しくは２０ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１－ＬＣ２－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は５、１０若しくは２０ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣの投与後、雌ＣＤ－１マウスの体重変化を測定した。各ＡＤＣの体重変化を、それぞれ図１１Ａ及び図１１Ｂに示す。

【0289】

３．４．３ 研究Ｍ１０９－００７－２０１７：ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおける３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４エリブリン二量体ＡＤＣのインビボスクリーニング
ヒトＮＳＣＬＣ ＮＣＩ－Ｈ２１１０異種移植モデルにおいて、抗メソテリン抗体の２つの更なるクローン（３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４及び３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４）の比較インビボスクリーニングを実施した。２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１０－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣ又は２．５ｍｇ／ｋｇの３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ジＯＨエリブリン二量体ＡＤＣでマウスを治療した。両方のＡＤＣの抗腫瘍活性及び体重変化を、それぞれ図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。

【0290】

その抗腫瘍活性及び毒性プロファイルに基づき、ＭＯＲＡｂ－１０９ ＡＤＣに使用される抗体の候補クローンとして３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４クローンを選択した。

【0291】

３．４．４ 研究Ｍ１０９－０１０－２０１８：ヒト胃癌異種移植モデルにおける３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンＡＤＣ（ＭＯＲＡｂ－１０９）のＤＡＲ２及びＤＡＲ６種の抗腫瘍効果
ヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおいて、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンＡＤＣ（ＭＯＲＡｂ－１０９）の２つのＤＡＲ種（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で比較した。両方のＤＡＲ２及びＤＡＲ６ ＡＤＣ種とも、持続性のある同程度の抗腫瘍応答を実証し（図１３Ａ）、いずれのＤＡＲ種の投与後にも、体重減少はほとんど乃至全く観察されなかった（図１３Ｂ）。

【0292】

３．４．５ 研究Ｍ１０９－０１０－２０１８：ヒト中皮腫異種移植モデルにおける３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンＡＤＣ（ＭＯＲＡｂ－１０９）のＤＡＲ２及びＤＡＲ６種の抗腫瘍効果
ヒト中皮腫ＨＡＹ異種移植モデルにおいて、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンＡＤＣ（ＭＯＲＡｂ－１０９）の２つのＤＡＲ種（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）を比較した。両方のＤＡＲ２及びＤＡＲ６ ＡＤＣ種とも、単回用量（５ｍｇ／ｋｇ）のＭＯＲＡｂ－１０９で治療したマウスにおいて持続性のある同程度の抗腫瘍応答を実証した一方、エリブリン単独（ＭＴＤ（３．２ｍｇ／ｋｇ）又はＭＯＲＡｂ－１０９（０．１ｍｇ／ｋｇ）に見られるのと等価なモル量のエリブリンで投与した）は、限られた抗腫瘍効果のみを示した（図１４Ａ）。ＭＴＤ用量のエリブリンで治療したマウスでは、急性の一時的な体重減少が観察された一方、いずれのＡＤＣで治療したマウスにおいても、体重減少は観察されなかった（図１４Ｂ）。

【0293】

３．４．６ ヒト中皮腫ＰＤＸモデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）の抗腫瘍効果
ヒト中皮腫ＰＤＸモデル、Ｍｅｓｏ７２１２（ＭＶ１５３６９）において、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンＡＤＣ（ＭＯＲＡｂ－１０９）（ＤＡＲ６）の抗腫瘍効果を調べた。２つの異なる治療レジメン：１０ｍｇ／ｋｇ ＭＯＲＡｂ－１０９の単回投与又は２．５ｍｇ／ｋｇの４日連日投与を試験した。ＭＯＲＡｂ－１０９の両方の治療レジメンとも、持続性のある同等の抗腫瘍応答を実証した一方、等価なモル量のエリブリン単独（０．２ｍｇ／ｋｇ）は、限られた抗腫瘍効果のみを示した（図１５Ａ）。両方のＭＯＲＡｂ－１０９ ＡＤＣ治療とも、ＭＴＤ用量のエリブリン単独と比較して抗腫瘍活性の有意な増加を示した（Ｐ＜０．０５）。全ての治療についての体重変化を図１５Ｂに示す。

【0294】

３．４．７ ヒト中皮腫ＰＤＸモデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）の抗腫瘍効果
ヒト中皮腫ＰＤＸモデル、Ｍｅｓｏ７２１２（ＭＶ１６０７１）において、３４５Ａ１２－ＨＣ１５－ＬＣ４－ＶＣＰ－エリブリンＡＤＣ（ＭＯＲＡｂ－１０９）の２つのＤＡＲ種（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）の抗腫瘍効果を１０ｍｇ／ｋｇの単回投与で調べた。ＭＯＲＡｂ－１０９の両方のＤＡＲ２及びＤＡＲ６種とも、持続性のある同等の抗腫瘍応答を実証した一方、等価なモル量のエリブリン単独（０．３ｍｇ／ｋｇ）及びエリブリンがコンジュゲートされていないＭＯＲＡｂ－１０９種（ＤＡＲ０）は、限られた抗腫瘍効果のみを示すか又はそれを全く示さなかった（図１６Ａ）。いずれの群においても、体重減少は観察されなかった（図１６Ｂ）。ＭＯＲＡｂ－１０９のＤＡＲ２種とＤＡＲ６種との間に抗腫瘍効果の統計学的差異はなかった。

【0295】

実施例４：メソテリン（ＭＳＬＮ）発現及びインビトロ効力
４．１ 方法
細胞毒性：細胞を継代培養し、９６ウェル組織培養プレート内の完全成長培地に５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩（１６時間）インキュベートした。２ｍＬディープウェル希釈プレートに、試験試薬を２００ｎＭから出発して１：３段階希釈した（合計１０点の希釈）。希釈した試料（１００μＬ）を細胞プレートに加えた（試験試料の出発濃度１００ｎＭ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で更に５日間インキュベートした。次に、培地を廃棄し、プレートを２００μＬ ＤＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの０．２％クリスタルバイオレット溶液によって室温で１５分間染色し、次に大量の水道水で洗浄した。プレートを風乾させて、クリスタルバイオレットを２００μＬの１％ＳＤＳ溶液で溶解した。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データは、ＩＣ_５０の決定に関してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでノンパラメトリックスピアマン分析を用いて相関分析を実施した。

【0296】

４．２ 結果
全ての細胞株について、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）の効力とメソテリン発現との間に相関が観察された（図１７；表２４及び表２５）。

【0297】

ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）については、メソテリン発現が低い（平均蛍光強度（ＭＦＩ）のＦＡＣＳ染色が８０未満の）細胞株を分析から除外したとき、効力とメソテリン発現との間に有意な相関が観察された（図１７；表２４及び表２５）。ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）の効力は、メソテリン発現レベルが高いほど、メソテリン発現と相関した。

【0298】

【表29】

【0299】

【表30】

【0300】

【表31】

【0301】

実施例５：ヒト胃癌（ＮＣＩ－Ｎ８７）異種移植モデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９の用量反応
５．１ 方法
５．１．１ インビボ有効性
動物：入荷時に５週齢の雌ＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を接種前に５～７日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物には耳標を付け、研究開始前に秤量した。

【0302】

細胞培養：凍結保存ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を解凍し、必要な補足成分を含有する培地で成長させた。細胞を完全培地で２代にわたって継代培養した後、インビボ接種に使用した。

【0303】

腫瘍移植、登録手順及び治療：ＰＢＳ中の細胞懸濁液を１．０×１０^８細胞／ｍＬの最終濃度となるように氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。１００μＬ／マウスの混合物を皮下注射した。マウスの臨床的ウェルビーイングに関して、移植後３日目から週３回、体重及びデジタルノギスによる腫瘍測定値でモニタした。

【0304】

腫瘍測定及び治療：腫瘍容積（ＴＶ）（ｍｍ^３）は、以下の式を用いて計算した：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６。腫瘍が平均約１００ｍｍ^３に達したとき、動物を各群５匹に無作為化した。治療は、２００μＬの容積の被験物質を静脈内投与した。研究終了時、最終的な体重を測定し、記録した。

【0305】

統計分析：腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較を同じ統計分析で実施した。

【0306】

５．１．２ 薬物動態（ＰＫ）
インタクトＡＤＣアッセイ及び全抗体アッセイの両方を用いてＰＫ分析を実施した。全抗体とは、コンジュゲート種及び非コンジュゲート種を含む全ての種を合わせた全体を指す（即ちＤＡＲ０＋ＤＡＲ１＋ＤＡＲ２＋．．．＋ＤＡＲｎ）一方、インタクトＡＤＣとは、全てのコンジュゲート種を指す（即ちＤＡＲ１＋ＤＡＲ２＋．．．＋ＤＡＲｎ）。全抗体アッセイでは、捕捉にビオチン化メソテリンを使用した。インタクトＡＤＣアッセイでは、捕捉にビオチン化抗エリブリン５Ｅ４ Ｆａｂ断片を使用し、検出にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＦｃを使用した。試料分析はＧｙｒｏｓアナライザーで実施した。データ分析はＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ ７．４．１で実施し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでプロットした。

【0307】

５．２ 結果
５ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇまでのＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）の用量範囲について、用量依存的有効性が観察された（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。いずれの用量群においても、体重減少は観察されなかった（図１８Ｃ）。治療した動物では、ＡＵＣの用量依存的増加によって示されるとおり、ＡＤＣの用量依存的曝露が観察された（図１９及び表２６）。

【0308】

【表32】

【0309】

実施例６：ヒト卵巣癌（ＯＶＣＡＲ－３－Ａ１－Ｔ１）異種移植モデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９のインビボ抗腫瘍有効性
６．１ 方法
動物：入荷時に５週齢の雌ＮＯＤ．ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を接種前に５～７日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物には耳標を付け、研究開始前に秤量した。

【0310】

細胞培養：凍結保存ＯＶＣＡＲ－３－Ａ１－Ｔ１細胞を解凍し、必要な補足成分を含有する培地で成長させた。細胞を完全培地で２代にわたって継代培養した後、インビボ接種に使用した。

【0311】

腫瘍移植、登録手順及び治療：ＰＢＳ中の細胞懸濁液を５．０×１０^７細胞／ｍＬの最終濃度となるように氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。１００μＬ／マウスの混合物を皮下注射した。マウスの臨床的ウェルビーイングに関して、移植後３日目から週３回、体重及びデジタルノギスによる腫瘍測定値でモニタした。

【0312】

腫瘍測定及び治療：腫瘍容積（ＴＶ）（ｍｍ^３）は、以下の式を用いて計算した：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６。腫瘍が平均約１００ｍｍ^３に達したとき、動物を各群５匹に無作為化した。治療は、２００μＬの容積の被験物質を静脈内投与した。研究終了時、最終的な体重を測定し、記録した。

【0313】

統計分析：腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較を同じ統計分析で実施した。

【0314】

６．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ－３－Ａ１－Ｔ１異種移植モデルにおいて腫瘍増殖遅延を実証した（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。

【0315】

実施例７：ヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＣ－Ｆ－２５）におけるＭＯＲＡｂ－１０９のインビボ抗腫瘍有効性
７．１ 方法
動物：入荷時に５週齢の非近交系無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）雌マウス（ＨＳＤ：Ａｔｈｙｍｉｃ Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を接種前に少なくとも４日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物に耳印を付け、研究開始前に秤量した。

【0316】

異種移植：ヒト患者由来の原発性非小細胞肺腺癌から、ＬＣ－Ｆ－２５を増殖腫瘍（Ｐ９．１．１／０）として樹立した。ＬＣ－Ｆ－２５は、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析に基づけば、他の腫瘍型（例えば、ＬＸＦＡ－７３７など（実施例８））と比べて陽性率及び全体的な強度の点でＭＳＬＮ発現が低い。

【0317】

実験手順：１０８～２８８ｍｍ^３の樹立増殖ＬＣ－Ｆ－２５腫瘍（Ｐ９．１．１／０）を有する３１匹のマウスについて、腫瘍容積平均値及び中央値がそれぞれ１５３．５及び１２６ｍｍ^３に達したとき、治療に割り付けた。

【0318】

治療：各７～８匹のマウスの４群で有効性を評価した：
・群１では、１日目に媒体を５ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群２及び群３では、１日目にエリブリンをそれぞれ０．１ｍｇ／ｋｇ（５ｍＬ／ｋｇ）及び３．２ｍｇ／ｋｇ（６．４ｍＬ／ｋｇ）、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群４では、１日目にＭＯＲＡｂ－１０９を１０ｍｇ／ｋｇ（５ｍＬ／ｋｇ）、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。

【0319】

実験期間中は週２回、腫瘍を測定し、マウスを秤量した。

【0320】

統計分析：測定毎にマン・ホイットニーノンパラメトリック比較検定による統計分析を実施した。各治療群を対照群と比較した。

【0321】

７．２ 結果
静脈内経路によって１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与したＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ＬＣ－Ｆ－２５腫瘍担持マウスによって体重減少なしに良好に忍容された（図２１Ｂ）。ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ＬＣ－Ｆ－２５ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルにおいて１０ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖遅延を実証した（図２１Ａ）。

【0322】

静脈内経路によって０．１ｍｇ／ｋｇの単回用量（１０ｍｇ／ｋｇで投与したときのＭＯＲＡｂ－１０９におけるペイロードの等価なモル量）で投与したエリブリンは、ＬＣ－Ｆ－２５腫瘍担持マウスによって良好に忍容されたが、統計的に有意な腫瘍成長阻害は誘導しなかった（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。

【0323】

静脈内経路によって３．２ｍｇ／ｋｇの単回用量（マウスＭＴＤ投薬量又は１０ｍｇ／ｋｇで投与したときのＭＯＲＡｂ－１０９におけるエリブリンのモル量の３２倍）で投与したエリブリンは、ＬＣ－Ｆ－２５腫瘍担持マウスによって良好に忍容されたが、投与から３～１０日後に僅かな一過性の体重減少を引き起こした（図２１Ｂ）。この用量で、エリブリンは統計的に有意な腫瘍成長阻害を誘導し、８匹中６匹のマウスに部分的な腫瘍退縮があった（図２１Ａ）。

【0324】

実施例８：ヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＡ－７３７）におけるＭＯＲＡｂ－１０９のインビボ抗腫瘍有効性
８．１ 方法
動物：雌ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｒｌ：ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ）、４～６週齢。

【0325】

異種移植：ヒト患者由来の原発性非小細胞肺腺癌から、ＬＸＦＡ－７３７を増殖腫瘍（Ｐ１４Ｎ４）として樹立した。ＬＸＦＡ－７３７は、ＩＨＣ分析に基づけば、他の腫瘍型（例えば、ＬＣ－Ｆ－２５（実施例７）など）と比べて全体的な強度及び高い陽性率の点で中程度のＭＳＬＮ発現を有する。

【0326】

実験手順：十分な数の動物において腫瘍移植片が５０～２５０ｍｍ^３（例えば、８０～２００ｍｍ^３）の研究容積基準に達するまで、動物をモニタした。腫瘍容積中央値及び平均値が同等の群となることを目指して、マウスを群に割り付けた。無作為化当日を０日目に指定した。

【0327】

治療：各６～７匹のマウスの４群で有効性を評価した：
・群１では、１日目に媒体を５ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群２及び群３では、１日目にエリブリンをそれぞれ０．２ｍｇ／ｋｇ及び３．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群４では、１日目にＭＯＲＡｂ－１０９を１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。

【0328】

実験期間中は週２回、腫瘍を測定し、マウスを秤量した。無作為化（０日目）の翌日の投与初日が１日目であった。

【0329】

統計分析：腫瘍成長の阻害、％単位の試験／対照値（Ｍｉｎ．Ｔ／Ｃ）：Ｘ日目における対照群に対する試験群の残存腫瘍容積（ＲＴＶ）中央値の比に１００を乗じることにより、試験対対照値（％単位のＴ／Ｃ）を計算した。試験群及び対照群について、腫瘍容積が２倍になる時間及び４倍になる時間（Ｔｄ、Ｔｑ）は、ある群が２００％又は４００％のＲＴＶ中央値に達するまでにかかる時間間隔（日数単位）として定義した。

【0330】

８．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ＬＸＦＡ－７３７ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（図２２Ａ）において１０ｍｇ／ｋｇでロバストな抗腫瘍有効性を実証し（Ｔ／Ｃ最小値、４１日目に２．３％）、研究中にそのＴｑに達することはなかった。単回用量で投与したＭＯＲＡｂ－１０９も、ＬＸＦＡ－７３７腫瘍担持マウスによって体重減少なしに良好に忍容された（図２２Ｂ）。

【0331】

静脈内経路によって３．２ｍｇ／ｋｇ（マウスＭＴＤ投薬量又は１０ｍｇ／ｋｇで投与したときのＭＯＲＡｂ－１０９におけるエリブリンのモル量の３２倍）の単回用量で投与したエリブリンは、ＬＸＦＡ－７３７腫瘍担持マウスによって良好に忍容され、抗腫瘍有効性を示し（Ｔ／Ｃ最小値、２７日目に４．２％）、そのＴｑは８０．１％であった。しかしながら、エリブリンは、投与後に僅かな一過性の体重減少を引き起こした（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇで投与したときのＭＯＲＡｂ－１０９におけるエリブリンのモル量の２倍である０．２ｍｇ／ｋｇの単回用量では、限られた抗腫瘍有効性のみを示した（Ｔ／Ｃ最小値、４４日目に５１．１％）。

【0332】

実施例９：ヒト胃癌（ＮＣＩ－Ｎ８７）異種移植モデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９の用量反応
９．１ 方法
９．１．１ インビボ有効性
動物：入荷時に５週齢の雌ＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を接種前に５～７日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物には耳標を付け、研究開始前に秤量した。

【0333】

細胞培養：凍結保存ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を解凍し、必要な補足成分を含有する培地で成長させた。細胞を完全培地で２代にわたって継代培養した後、インビボ接種に使用した。

【0334】

腫瘍移植、登録手順及び治療：ＰＢＳ中の細胞懸濁液を１．０×１０^８細胞／ｍＬの最終濃度となるように氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。１００μＬ／マウスの混合物を皮下注射した。マウスの臨床的ウェルビーイングに関して、移植後３日目から週３回、体重及びデジタルノギスによる腫瘍測定値でモニタした。

【0335】

腫瘍測定及び治療：腫瘍容積（ＴＶ）（ｍｍ^３）は、以下の式を用いて計算した：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６。腫瘍が平均約１００ｍｍ^３に達したとき、動物を各群５匹に無作為化した。治療は、２００μＬの容積の被験物質を静脈内投与した。研究終了時、最終的な体重を測定し、記録した。

【0336】

統計分析：腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較を同じ統計分析で実施した。

【0337】

９．１．２ 薬物動態（ＰＫ）
インタクトＡＤＣアッセイ及び全抗体アッセイの両方を用いてＰＫ分析を実施した。全抗体とは、コンジュゲート種及び非コンジュゲート種を含む全ての種を合わせた全体を指す（即ちＤＡＲ０＋ＤＡＲ１＋ＤＡＲ２＋．．．＋ＤＡＲｎ）一方、インタクトＡＤＣとは、全てのコンジュゲート種を指す（即ちＤＡＲ１＋ＤＡＲ２＋．．．＋ＤＡＲｎ）。全抗体アッセイでは、捕捉にビオチン化メソテリンを使用し、検出にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＦｃを使用した。インタクトＡＤＣアッセイでは、捕捉にビオチン化抗エリブリン５Ｅ４を使用し、検出にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ヒトＦｃを使用した。試料分析はＧｙｒｏｓアナライザーで実施した。データ分析はＷａｔｓｏｎＬＩＭＳ ７．４．１で実施し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでプロットした。エリブリンは、血漿、腫瘍及び骨髄試料からＬＣ－ＭＳを用いて定量化した。

【0338】

９．１．３ ＬＣ－ＭＳ
分析には、個々のマウスからの２０～５０μＬのＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）血漿又はＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）投与マウスからの５０μＬの等しくプールした血漿を使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ストレプトアビジン（１００μＬ）を３μｇの捕捉選択ヒトＩｇＧ－Ｆｃ ＰＫビオチンコンジュゲートと共に室温で１時間インキュベートし、次にＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で洗浄した。次に、ＭＯＲＡｂ－１０９複合体を捕捉するため、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液に希釈した血漿試料を、複合体化／洗浄したビーズと混合し、室温で１時間インキュベートし、次にＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で２回洗浄した。複合体を含有する洗浄したビーズをＰＮＧａｓｅ緩衝液中のＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅＦ（１μＬ）によって３７℃で１時間脱グリコシルし、次にＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で１回洗浄した。捕捉／脱グリコシルしたＭＯＲＡｂ－１０９の溶出を０．１％ギ酸含有１０％アセトニトリル（３０μＬ）で行った。Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２／ＭクラスＵＰＬＣ分析で、インタクトな質量又は換算質量に関して試料を分析した。

【0339】

９．２ 結果
１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２又はＤＡＲ６）で治療したヒト胃癌ＮＣＩ－Ｎ８７異種移植モデルにおける抗腫瘍効果及び体重変化を、それぞれ図２３Ａ及び図２３Ｂに示す。

【0340】

ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）及び非コンジュゲート型抗体のＰＫ分析を表２７に示す。非コンジュゲート型及びＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）の全抗体は同様であった一方、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ６）は低く、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）が循環中で安定していることが示された。

【0341】

血漿試料からのＡＤＣのＤＡＲ分析により、ＤＡＲ６種についてペイロード放出率が高く、エリブリンの高い血漿レベルに寄与したことが示された（表２８及び表２９）。

【0342】

【表33】

【0343】

【表34】

【0344】

【表35】

【0345】

実施例１０：３４５Ａ１２ ＨＣ１５ ＬＣ４とアネツマブとの比較－結合親和性
１０．１ 方法
抗体：３４５Ａ１２ ＨＣ１５ ＬＣ４（ＭＯＲＡｂ－１０９中の抗メソテリン抗体）及びアネツマブ。ヒト抗メソテリン抗体であるアネツマブの配列は、表３０に示す。

【0346】

結合親和性：ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ－１００機器においてＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液中で結合測定を実施した。抗体をＨＢＳ－Ｐ＋で１μｇ／ｍＬに希釈した。試料を室温で５分間、１４，０００×ｇで遠心し、次に上清を新しい１．５ｍＬ ＢＩＡｃｏｒｅチューブに移し、キャップをかぶせた。メソテリン（５０μｇ）を１×ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液で１００ｎＭに希釈し、次にＢＩＡｃｏｒｅチューブに１００、２０、４、０．８及び０．１６ｎＭで５倍段階希釈し、キャップをかぶせた。製造者のプロトコルに従い、固定化ウィザードでＣＭ５チップを使用して抗ヒト抗体捕捉チップを調製した。最終的な捕捉抗体レベルは、ＨＢＳ－Ｐ＋中、８０００～９０００ＲＵであった。チップは、３００秒の緩衝液注入と、続く３０秒の再生のサイクルを５回、いずれも全４フローセルにわたって３０μＬ／分で行うアッセイのために調製した。

【0347】

個々のリガンド溶液を１０μＬ／分で９０秒間順次注入することにより、抗体がフローセル２～４に捕捉された。分析物の注入は、分析物溶液を低濃度から高濃度に順次、３０μＬ／分で各２４０秒間注入することによる単一サイクル反応速度方式で行った。検出は、２－１、３－１、４－１であった。一連の同一のリガンド捕捉注入と、続く５回の各２４０秒間の緩衝液単独注入、１８００秒間の解離及び上記のとおりの再生による二重参照法を実施した。リガンドは、全てメソテリンへの結合に関してデュプリケートで分析した。反応速度解析は、ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して、１：１ラングミュア当てはめモデルを用いて実施した。デュプリケートランからオン速度、オフ速度及び親和性定数の平均を求めた。

【0348】

１０．２ 結果
３４５Ａ１２ ＨＣ１５ ＬＣ４は、アネツマブの４０倍高い親和性を呈した（表３１）。３４５Ａ１２ ＨＣ１５ ＬＣ４は、カニクイザルメソテリンに対する結合親和性を保持していた一方、アネツマブはカニクイザルメソテリンに結合しなかった。いずれの抗体もラットメソテリンに結合しなかった。

【0349】

【表36】

【0350】

【表37】

【0351】

【表38】

【0352】

実施例１１：ＭＯＲＡｂ－１０９とＢＡＹ ９４－９３４３との比較－インビトロ効力
１１．１ 方法
ＡＤＣ：ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）及びアネツマブラブタンシン（ＢＡＹ ９４－９３４３）を評価した。アネツマブラブタンシン、別名ＢＡＹ ９４－９３４３は、アネツマブがジスルフィド含有リンカー（還元可能なＳＰＤＢリンカー［４－（２－ピリジルジチオ）ブタン酸Ｎ－スクシンイミジル］）を介してメイタンシノイドチューブリン阻害薬ＤＭ４にコンジュゲートしたものを含むＡＤＣである。ＢＡＹ ９４－９３４３は、実施例１５に記載されるとおり作成した。

【0353】

細胞毒性：細胞を継代培養し、９６ウェル組織培養プレート内の完全成長培地に５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩（１６時間）インキュベートした。２ｍＬディープウェル希釈プレートに、試験試薬を２００ｎＭから出発して１：３段階希釈した（合計１０点の希釈）。希釈した試料（１００μＬ）を細胞プレートに加えた（試験試料の出発濃度１００ｎＭ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で更に５日間インキュベートした。次に、培地を廃棄し、プレートを２００μＬ ＤＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの０．２％クリスタルバイオレット溶液によって室温で１５分間染色し、次に大量の水道水で洗浄した。プレートを風乾させて、クリスタルバイオレットを２００μＬの１％ＳＤＳ溶液で溶解した。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データは、ＩＣ_５０の決定に関してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して分析した。

【0354】

１１．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２及びＤＡＲ６）は、ＭＳＬＮ陽性細胞株に対して特異的細胞毒性を示した（表３２）。対照的に、ＢＡＹ ９４－９３４３は、ＭＳＬＮ陽性細胞株及びＭＳＬＮ陰性細胞株の両方に対して殺傷を実証した。

【0355】

【表39】

【0356】

実施例１２：ＭＯＲＡｂ－１０９とＢＡＹ ９４－９３４３との比較－特異性
１２．１ 方法
細胞毒性：細胞を継代培養し、９６ウェル組織培養プレート内の完全成長培地に５，０００細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩（１６時間）インキュベートした。２ｍＬディープウェル希釈プレートに、試験試薬を２００ｎＭから出発して１：３段階希釈した（合計１０点の希釈）。希釈した試料（１００μＬ）を細胞プレートに加えた（試験試料の出発濃度１００ｎＭ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で更に５日間インキュベートした。次に、培地を廃棄し、プレートを２００μＬ ＤＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの０．２％クリスタルバイオレット溶液によって室温で１５分間染色し、次に大量の水道水で洗浄した。プレートを風乾させて、クリスタルバイオレットを２００μＬの１％ＳＤＳ溶液で溶解した。プレートを５７０ｎｍで読み取った。データは、ＩＣ_５０の決定に関してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して分析した。

【0357】

１２．２ 結果
非コンジュゲート型抗体による細胞毒性アッセイでは、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）によるメソテリン発現細胞の特異的殺傷が実証され（図２５Ａ）、しかしＢＡＹ ９４－９３４３によっては実証されなかった（図２５Ｂ）。理論によって拘束されるものではないが、ＢＡＹ ９４－９３４３について観察される非コンジュゲート型抗体による競合の欠如は、ペイロードの放出を示唆し、これは、抗体結合が非コンジュゲート型の競合相手によって阻止されたときであっても、殺傷につながり得る。このペイロード放出は、ＢＡＹ ９４－９３４３について観察されるメソテリン陰性細胞株に対する細胞毒性レベルが比較的高いことと整合している（表３２）。ペイロード放出は、図２７（血漿安定性比較）でも直接観察される。

【0358】

実施例１３：ＭＯＲＡｂ－１０９とＢＡＹ ９４－９３４３との比較－ＡＤＣＣ活性
１３．１ 方法
ＭＳＬＮ発現ＣＨＯ細胞を解凍し、９６ウェル組織培養プレート内の完全ＲＰＭＩ－４％超低濃度ＩｇＧ ＦＢＳに１，０００細胞／ウェル（２５μＬ）で播種した。試験試薬（３４５Ａ１２抗体、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及びＢＡＹ ９４－９３４３）を完全ＲＰＭＩ－４％超低濃度ＩｇＧ ＦＢＳで２０μｇ／ｍＬから出発して１：２．５段階希釈し、次に細胞プレートに移し（２５μＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２で６０分間インキュベートした。６，０００個のジャーカットエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を解凍し、細胞プレートに加え（２５μＬ）、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で１８～２２時間インキュベートした。

【0359】

ルシフェラーゼアッセイ試薬を暗所で解凍した。各ウェルに７５μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、プレートをプレート振盪機で３０秒間振盪した。５分間インキュベートした後、プレートをルミノメーターで読み取った。

【0360】

１３．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及び３４５Ａ１２ ＨＣ１５ ＬＣ４は同程度のＡＤＣＣ活性を有する（図２６Ａ及び表３３）一方、ＢＡＹ ９４－９３４３はアネツマブよりも弱いＡＤＣＣ活性を有した（図２６Ｂ及び表３４）。

【0361】

【表40】

【0362】

【表41】

【0363】

実施例１４：マトリックスにおけるＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３の安定性
１４．１ 方法
抗ＭＳＬＮ ＡＤＣをヒト血漿又はマウス血漿のいずれかに０．１ｍｇ／ｍＬで調製し、試料を３７℃で０、２４、４８、７２、９６及び２４０時間インキュベートし、次に時点が達成されたところで－８０℃に移して保存した。全ての試料を周囲温度に解凍し、試験のために１：１００希釈した。ＤＡＲ感受性安定性アッセイをＧｙｒｏｌａｂでの段階的サンドイッチフォーマットとして開発した。アッセイでは、遮断及び試料結合後の捕捉にビオチン化メソテリンを使用し、検出にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗エリブリン５Ｅ４ Ｆａｂ又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ＤＭ４（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）を使用した。検量線及び品質管理は、ＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３で行った。

【0364】

１４．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ヒト血漿及びマウス血漿の両方でＢＡＹ ９４－９３４３よりも安定性が高かった（図２７）。

【0365】

実施例１５：ヒト胃癌（ＮＣＩ－Ｎ８７）異種移植モデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３の抗腫瘍有効性
１５．１ 方法
１５．１．１ ＢＡＹ ９４－９３４３の作成
ＢＡＹ ９４－９３４３は、アネツマブがジスルフィド含有リンカー（還元可能なＳＰＤＢリンカー［４－（２－ピリジルジチオ）ブタン酸Ｎ－スクシンイミジル］）を介してメイタンシノイドチューブリン阻害薬ＤＭ４にコンジュゲートしたものを含むＡＤＣである。アネツマブからの配列は、Ｂｅａｃｏｎデータベース（Ｈａｎｓｏｎ－Ｗａｄｅ）から入手した。オーバーラップオリゴヌクレオチドから抗体配列（表３０）を作成し、ＰＣＲ増幅し、発現プラスミドにクローニングし、配列を確認した。２９３Ｆ細胞に安定プールを作成し、生存率が３０％未満になるまで細胞を成長させた。アネツマブを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて馴化培地から精製した。ＳＰＤＢ－ＤＭ４（Ｌｅｖｅｎａ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）とのリジン反応性コンジュゲーションによってＢＡＹ ９４－９３４３を作成し、３．７のＤＡＲを実現した。非コンジュゲート型ペイロードを脱塩クロマトグラフィーによって除去した。

【0366】

１５．１．２ インビボ有効性
動物：入荷時に５週齢の雌ＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を接種前に５～７日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物には耳標を付け、研究開始前に秤量した。

【0367】

細胞培養：凍結保存ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を解凍し、必要な補足成分を含有する培地で成長させた。細胞を完全培地で２代にわたって継代培養した後、インビボ接種に使用した。

【0368】

腫瘍移植、登録手順及び治療：ＰＢＳ中の細胞懸濁液を１．０×１０^８細胞／ｍＬの最終濃度となるように氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。１００μＬ／マウスの混合物を皮下注射した。マウスの臨床的ウェルビーイングに関して、移植後３日目から週３回、体重及びデジタルノギスによる腫瘍測定値でモニタした。

【0369】

腫瘍測定及び治療：腫瘍容積（ＴＶ）（ｍｍ^３）は、以下の式を用いて計算した：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６。腫瘍が平均約１００ｍｍ^３に達したとき、動物を各群５匹に無作為化した。治療は、２００μＬの容積の被験物質を静脈内投与した。研究終了時、最終的な体重を測定し、記録した。

【0370】

統計分析：腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較を同じ統計分析で実施した。

【0371】

１５．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及びＢＡＹ ９４－９３４３は両方とも、ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍担持マウスにおいて同程度の有効性を実証した（図２８Ａ）。いずれの群においても体重減少は観察されなかった（図２８Ｂ）。

【0372】

実施例１６：ヒト中皮腫（ＨＡＹ）異種移植モデルにおけるＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３の抗腫瘍有効性
１６．１ 方法
動物：入荷時に５週齢の雌ＮＯＤ．ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を接種前に５～７日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物には耳標を付け、研究開始前に秤量した。

【0373】

細胞培養：凍結保存ＨＡＹ細胞を解凍し、必要な補足成分を含有する培地で成長させた。細胞を完全培地で２代にわたって継代培養した後、インビボ接種に使用した。

【0374】

腫瘍移植、登録手順及び治療：ＰＢＳ中の細胞懸濁液を５．０×１０^７細胞／ｍＬの最終濃度となるように氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。１００μＬ／マウスの混合物を皮下注射した。マウスの臨床的ウェルビーイングに関して、移植後３日目から週３回、体重及びデジタルノギスによる腫瘍測定値でモニタした。

【0375】

腫瘍測定及び治療：腫瘍容積（ＴＶ）（ｍｍ^３）は、以下の式を用いて計算した：Ｗ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）×Ｄ（ｍｍ）×π／６。腫瘍が平均約１００ｍｍ^３に達したとき、動物を各群５匹に無作為化した。治療は、２００μＬの容積の被験物質を静脈内投与した。研究終了時、最終的な体重を測定し、記録した。

【0376】

統計分析：腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較を同じ統計分析で実施した。

【0377】

１６．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及びＢＡＹ ９４－９３４３は両方とも、ＨＡＹ腫瘍担持マウスにおいて同程度の有効性を実証した（図２９Ａ）。いずれの群においても体重減少は観察されなかった（図２９Ｂ）。

【0378】

実施例１７：ヒト中皮腫ＰＤＸモデル（Ｍｅｓｏ７２１２）におけるＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３の抗腫瘍有効性
１７．１ 方法
動物：入荷時点で５～６週齢のＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ雌マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）を接種前に少なくとも４日間順化させた。動物は、換気されたケージに各３～５匹のマウスを飼育し、滅菌飼料ペレット及び給水ボトルは自由に利用可能とした。動物に耳印を付け、研究開始前に秤量した。

【0379】

異種移植：０日目、無菌条件下で５匹のドナーマウスからＭｅｓｏ ７２１２腫瘍を採取した。腫瘍組織を２×２ｍｍ片に切り出し、０．９％生理食塩水で覆われている滅菌ペトリ皿に置いた。並行して、受容側の動物を鎮痛薬Ｍｅｔａｃａｍ（登録商標）（２ｍｇ／ｋｇ）で皮下治療し、次にＥｔｏｍｉｄａｔ－Ｌｉｐｕｒｏ（登録商標）（１２ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内注射（０．１５ｍＬ／マウス）によって麻酔した。左側腹部の５～８ｍｍの皮膚に表層縦切開を入れた。側腹部から直接切開部に外科用ハサミの先端を挿入し、それを用いて皮下腔にポケットを形成した。外科用ピンセットを用いてポケットに各マウス１つの腫瘍片を移植した。最後に、金属クリップで切開部を閉じ、動物を清潔なケージに入れた。

【0380】

実験手順：異種移植後、マウスにおける腫瘍の生着及び増殖を触診によって少なくとも週２回コントロールした。腫瘍が触知可能なったところで、デジタルノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）による腫瘍直径の測定を実施した。

【0381】

治療開始前、動物をその腫瘍容積に基づいて実験群に無作為に割り付けた（腫瘍容積の組入れ基準、０．１～０．３ｃｍ^３）。治療初日から、腫瘍容積及び体重を週２回記録した。動物福祉を１日２回検査した。

【0382】

治療：薬剤は、全て無作為化当日に単回用量として静脈内投与した。対照群の動物は、同じ方法でＤＰＢＳによって治療した。

【0383】

統計分析：腫瘍容積及び体重のデータに関して記述統計量を求めた。反復測定二元配置ＡＮＯＶＡと、続くボンフェローニ事後検定を用いることにより、各治療群の動物の腫瘍容積を対照群と比較した。加えて、各群内での動物の腫瘍成長比較も同じ統計分析で実施した。

【0384】

１７．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）及びＢＡＹ ９４－９３４３は両方とも、Ｍｅｓｏ７２１２腫瘍担持マウスにおいて腫瘍退縮を実証した（図３０Ａ）。いずれの群においても体重減少は観察されなかった（図３０Ｂ）。

【0385】

実施例１８：ヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＡ－５８６）におけるＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３の抗腫瘍有効性
１８．１ 方法
動物：雌ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス、４～６週齢。

【0386】

異種移植：原発性非小細胞肺腺癌ヒト患者由来のＬＸＦＡ－５８６樹立増殖腫瘍（Ｔ２Ｎ１Ｍ０）。

【0387】

実験手順：十分な数の動物において腫瘍移植片が５０～２５０ｍｍ^３（例えば、８０～２００ｍｍ^３）の研究容積基準に達するまで、動物をモニタした。腫瘍容積中央値及び平均値が同等の群となることを目指して、マウスを群に割り付けた。群への割り付け作業（登録、層別無作為化）は、無作為化と称することもできる。無作為化当日を実験０日目に指定した。

【0388】

治療：各６～７匹のマウスの４群で有効性を評価した：
・群１では、１日目に媒体を５ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群２では、１日目にＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）を２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群３では、１日目にＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）を２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群４では、１日目にエリブリンを３．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。

【0389】

実験期間中は週２回、腫瘍を測定し、マウスを秤量した。無作為化（０日目）の翌日の投与初日が１日目であった。

【0390】

１８．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ＬＸＦＡ－５８６ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルにおいて２５ｍｇ／ｋｇでロバストな抗腫瘍有効性を実証し（Ｔ／Ｃ最小値、４１日目に１．８％）（図３１Ａ）、研究中にそのＴｑに達することはなかった。単回用量で投与したＭＯＲＡｂ－１０９も、ＬＸＦＡ－５８６腫瘍担持マウスによって体重減少なしに良好に忍容された（図３１Ｂ）。

【0391】

ＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）は、ＬＸＦＡ－５８６ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルにおいて２５ｍｇ／ｋｇでＭＯＲＡｂ－１０９と同程度のロバストな抗腫瘍有効性を実証し（図３１Ａ）、研究中にそのＴｑに達することはなかった。しかしながら、ＢＡＹ ９４－９３４３中のＤＭ４ペイロードのモル量は、ＭＯＲＡｂ－１０９中のエリブリンペイロードの量のおよそ２倍である。

【0392】

静脈内経路によって３．２ｍｇ／ｋｇ（マウスＭＴＤ投薬量又は１０ｍｇ／ｋｇで投与したときのＭＯＲＡｂ－１０９におけるエリブリンのモル量の３２倍）の単回用量で投与したエリブリンは、ＬＸＦＡ－５８６腫瘍担持マウスによって良好に忍容され、抗腫瘍有効性を示した（Ｔ／Ｃ最小値、２１日目に１４．８％）。しかしながら、エリブリンは、投与後に僅かな一過性の体重減少を引き起こした（図３１Ａ及び図３１Ｂ）。

【0393】

実施例１９：ヒトＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（ＬＸＦＬ－５２９）におけるＭＯＲＡｂ－１０９及びＢＡＹ ９４－９３４３の抗腫瘍有効性
１９．１ 方法
動物：雌ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕマウス、４～６週齢。

【0394】

異種移植：原発性非小細胞肺腺癌ヒト患者からのＬＸＦＬ－５２９樹立増殖腫瘍（Ｔ３Ｎ１Ｍ０）。

【0395】

実験手順：十分な数の動物において腫瘍移植片が５０～２５０ｍｍ^３（例えば、８０～２００ｍｍ^３）の研究容積基準に達するまで、動物をモニタした。腫瘍容積中央値及び平均値が同等の群となることを目指して、マウスを群に割り付けた。群への割り付け過程（登録、層別無作為化）は、無作為化と称することもできる。無作為化当日を実験０日目に指定した。

【0396】

治療：各６～７匹のマウスの６群で有効性を評価した：
・群１では、１日目に媒体を５ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群２では、１日目にＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）を１２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群３では、１日目にエリブリンを３．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群４では、１日目にＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）を２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群５では、１日目にＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）を１２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、単回用量で投与した。
・群６では、ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）を１２．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．、１、８及び１６日目の用量で投与した。

【0397】

実験期間中は週２回、腫瘍を測定し、マウスを秤量した。無作為化（０日目）の翌日の投与初日が１日目であった。

【0398】

１９．２ 結果
ＭＯＲＡｂ－１０９（ＤＡＲ２）は、ＬＸＦＬ－５２９ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルにおいて１２．５及び２５ｍｇ／ｋｇでロバストな抗腫瘍有効性を実証した（図３２Ａ）。単回用量で投与したＭＯＲＡｂ－１０９も、ＬＸＦＬ－５２９腫瘍担持マウスによって体重減少なしに良好に忍容された（図３２Ｂ）。

【0399】

しかしながら、ＢＡＹ ９４－９３４３（ＤＡＲ約４）は、１２．５ｍｇ／ｋｇ（２５ｍｇ／ｋｇのＭＯＲＡｂ－１０９中のエリブリンペイロードの量と等価なＤＭ４ペイロードのモル量）では、抗腫瘍有効性を実証しなかった（図３２Ａ）。

【0400】

静脈内経路によって３．２ｍｇ／ｋｇ（マウスＭＴＤ投薬量）の単回用量で投与したエリブリンは、ＬＸＦＬ－５２９腫瘍担持マウスによって良好に忍容され、抗腫瘍有効性を示した。しかしながら、エリブリンは、投与後に僅かな一過性の体重減少を引き起こした（図３２Ａ及び図３２Ｂ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図25A】

【図25B】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【配列表】

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【国際調査報告】