▶ ヴァーシティ ブラッド リサーチ インスティテュート ファウンデーション， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-11
(54)【発明の名称】胎児／新生児同種抗体血小板減少症のマウスモデル
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20060101AFI20221228BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20221228BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221228BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20221228BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027 ZNA
C12N15/10 Z
G01N33/53 N
C07K16/28
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022526031
(86)(22)【出願日】2019-11-05
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 US2019059869
(87)【国際公開番号】W WO2021091539
(87)【国際公開日】2021-05-14
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522176252
【氏名又は名称】ヴァーシティ ブラッド リサーチ インスティテュート ファウンデーション， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100134832
【弁理士】
【氏名又は名称】瀧野 文雄
(74)【代理人】
【識別番号】100165308
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 俊明
(74)【代理人】
【識別番号】100115048
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 康弘
(72)【発明者】
【氏名】ニューマン ピーター ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ジ ホイイン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
ＧＰＩＩＩａにＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ３９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異を含むトランスジェニックマウス、ならびにトランスジェニックマウスを作製する方法およびトランスジェニックマウスを使用して試験化合物をスクリーニングする方法が記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を有する変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）をコードする核酸をゲノムが含むトランスジェニックマウスであって、前記変異体ＧＰＩＩＩａが、配列番号２５における変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む、トランスジェニックマウス。
【請求項2】
配列番号２６に示される配列を含む変異体ＧＰＩＩＩａを発現する、請求項１記載のトランスジェニックマウス。
【請求項3】
前記変異体ＧＰＩＩＩａが、配列番号２５に関して変異Ｖ２２Ｍをさらに含む、請求項１記載のトランスジェニックマウス。
【請求項4】
前記変異体ＧＰＩＩＩａが抗ＨＰＡ－１ａ抗体に結合することができる、請求項１～３のいずれか一項記載のトランスジェニックマウス。
【請求項5】
変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）に特異的に結合することができる分子を同定するインビトロ方法であって、ａ）候補分子を請求項１～４のいずれか一項記載のトランスジェニックマウス由来の血小板と接触させること、および
ｂ）前記候補分子が前記血小板に結合するかどうかを判定することを含み、
前記候補分子が前記トランスジェニックマウス由来の前記血小板に結合するが、野生型マウス由来の血小板には結合しない場合、前記候補分子が前記変異体ＧＰＩＩＩａに特異的に結合することができる、方法。
【請求項6】
前記候補分子が、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項7】
雌マウスにおいて抗ＨＰＡ－１ａ同種免疫応答を防止することができる分子を同定するインビボ方法であって、ａ）野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ抗ＨＰＡ－１ａ抗体について陰性である試験マウスに候補分子を投与すること、および
ｂ）前記試験マウスにおける抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価を測定することを含み、
単一抗原ビーズアッセイによって測定された前記試験マウスにおける前記抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価が産後２週間で検出不能である場合、前記候補分子が抗ＨＰＡ－１ａ同種免疫応答を防止することができる、方法。
【請求項8】
前記試験マウスにおける前記抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価が、産後６週間で検出不能である、請求項７記載の方法。
【請求項9】
前記候補分子が、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される、請求項７または８記載の方法。
【請求項10】
抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が胎児または新生児血小板に結合するのを阻害することができる分子を同定するインビボ方法であってａ）野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ妊娠前に（ｉ）請求項１に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板、または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された試験マウスに候補分子を投与すること、および
ｂ）胎児または新生児の血小板数を測定することを含み、
前記試験マウスの子における前記胎児または新生児血小板数が対照マウスの子における前記胎児または新生児血小板数よりも多い場合、前記候補分子が、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が胎児または新生児血小板に結合するのを阻害することができる、方法。
【請求項11】
対照マウスの子と比較して、前記試験マウスの子における出血が減少または防止される、請求項１０記載の方法。
【請求項12】
前記候補分子が、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項13】
抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が妊娠マウスの胎盤を通過するのを阻害することができる分子を同定するインビボ方法であって、ａ）野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ妊娠前に（ｉ）請求項１に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板、または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された試験マウスに候補分子を投与すること、および
ｂ）胎児または新生児抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価を測定することを含み、
前記試験マウスの子における前記胎児または新生児抗体力価が対照マウスの子における前記胎児または新生児抗体力価よりも低い場合、前記候補分子が、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が前記妊娠マウスの胎盤を通過するのを阻害することができる、方法。
【請求項14】
対照マウスの子と比較して、前記試験マウスの子における出血が減少または防止される、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
前記候補分子が、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項16】
配列番号２６または配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）。
【請求項17】
請求項１６記載の変異体ＧＰＩＩＩａへの結合について抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができる分子を同定するインビトロ方法であって、ａ）基質上に固定化される前記変異体ＧＰＩＩＩａを、標識を含む前記抗ＨＰＡ－１ａ抗体と接触させてＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を形成すること、
ｂ）前記ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を溶液中の候補分子と接触させること、および
ｃ）前記基質上または前記溶液中の標識の量を検出することによって、前記候補分子が前記変異体ＧＰＩＩＩａに結合する抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合するかどうかを判定することを含み、
前記基質上で検出された標識の量が、前記ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体と前記候補分子とを接触させる前に前記基質上で検出された標識の量と比較して、前記ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体と前記候補分子とを接触させた後に減少する場合、前記候補分子が、前記変異体ＧＰＩＩＩａへの結合について前記抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができ、
または、前記溶液中の標識の量が、前記ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を前記候補分子と接触させる前の前記溶液中の標識の量と比較して、前記ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を前記候補分子と接触させた後に増加する場合、前記候補分子が、前記変異体ＧＰＩＩＩａへの結合について前記抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができる、方法。
【請求項18】
前記抗ＨＰＡ－１ａ抗体がモノクローナル抗体２６．４である、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
前記標識が、フルオロフォア、放射性同位体、化学発光プローブおよび生物発光プローブからなる群より選択される、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項20】
前記基質が、ビーズ、樹脂、粒子、膜およびゲルからなる群より選択される、請求項１７、１８または１９記載の方法。
【請求項21】
前記候補分子が、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される、請求項１７～２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
請求項１～４のいずれかに記載のトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ａ）受精マウス卵母細胞の細胞質にｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド、ｉｉ）マウスＩＴＧＢ３エクソン３を標的とするｇＲＮＡ、ｉｉｉ）マウスＩＴＧＢ３エクソン１０を標的とするｇＲＮＡ、ｉｖ）配列番号２５に関するＧＰＩＩＩａにおいてＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３ＬおよびＮ３９Ｄ変異をコードする一本鎖相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型オリゴヌクレオチド、およびｉｉ）配列番号２５に関するＧＰＩＩＩａにおいてＭ４７０Ｑ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドを注入すること；
ｂ）前記注入された卵母細胞から発生した２細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管に移植すること；および
ｃ）前記偽妊娠雌から生まれたマウスを、配列番号２５に関するＧＰＩＩＩａにおけるＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ３９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異の存在についてスクリーニングすることを含む、方法。
【請求項23】
ＩＴＧＢ３エクソン１０を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号７を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項24】
Ｍ４７０Ｑ変異をコードする前記一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドが、診断制限部位をさらにコードする、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項25】
Ｍ４７０Ｑ変異をコードする前記一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドが、ＩＴＧＢ３エクソン１０に対する１つ以上のサイレント変異をさらにコードして、エクソン１０におけるＩＴＧＢ３のＣａｓ９による反復消化をサイレンシングする、請求項２２～２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
Ｍ４７０Ｑ変異をコードする前記一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドが、配列番号８を含む、請求項２２～２５のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
ＩＴＧＢ３エクソン３を標的とする前記ｇＲＮＡが配列番号１を含む、請求項２２～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項28】
Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄ変異をコードする前記一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドが、診断制限部位をさらにコードする、請求項２２～２７のいずれかに記載の方法。
【請求項29】
Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３ＬおよびＮ３９Ｄ変異をコードする前記一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドが、ＩＴＧＢ３エクソン３に対する１つ以上のサイレント変異をさらにコードして、エクソン３におけるＩＴＧＢ３のＣａｓ９による反復消化をサイレンシングする、請求項２２～２８のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３ＬおよびＮ３９Ｄ変異をコードする前記一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドが、配列番号４を含む、請求項２２～２９のいずれかに記載の方法。
【請求項31】
配列番号２７と少なくとも９５％の同一性を有する変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）をコードする核酸をゲノムが含むトランスジェニックマウスであって、前記変異体ＧＰＩＩＩａが、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む、トランスジェニックマウス。
【請求項32】
配列番号２７に示される配列を含む変異体ＧＰＩＩＩａを発現する、請求項３１記載のトランスジェニックマウス。
【請求項33】
前記変異体ＧＰＩＩＩａが抗ＨＰＡ－１ａ抗体に結合することができる、請求項３１または３２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項34】
野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）、および配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９Ｄ、およびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａについてヘテロ接合性の子を妊娠しているマウス。
【請求項35】
抗ＨＰＡ－１ａ抗体について陽性である、請求項３４記載のマウス。
【請求項36】
妊娠前に、（ｉ）請求項１に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板、または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された、請求項３５記載のマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[関連出願の相互参照]
該当なし。
該当なし。
【0002】
[ＥＦＳ－ＷＥＢを通して提出された配列表の参照]
「１６０１８０＿００１３４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたサイズ２９．０ｋｂの配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は２０１９年１１月４日に作成され、本明細書と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを通して電子的に提出されたものであり、本出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「１６０１８０＿００１３４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたサイズ２９．０ｋｂの配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は２０１９年１１月４日に作成され、本明細書と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを通して電子的に提出されたものであり、本出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
血小板特異的抗原に対する同種抗体は、臨床的に重要な３つの出血障害、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）、血小板輸血不応状態（ＲＰＴ）および胎児／新生児同種免疫血小板減少症（ＦＮＡＩＴ－文献ではＮＡＴＰまたはＮＡＩＴと様々に呼ばれている－総説については参考文献１を参照）の原因である。ＰＴＰは、経産婦が輸血を受けた後に、輸血された血小板だけでなく自身の血小板も不可解に消失する希少難治性疾患であり、重度の血小板減少症、挫傷、および点状出血をもたらす。ＲＰＴは、血小板を何度も輸血され、臨床的に問題のままである患者に見られ、出血合併症および入院の延長につながる。ＲＰＴは、免疫原因と非免疫原因とに分離され得る。免疫原因には、妊娠、輸血および／または移植からの事前曝露に起因する、ＨＬＡおよび／または血小板特異的抗原に対する同種免疫化が含まれる。非免疫原因には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者または造血前駆細胞移植を受けた患者に関する研究に基づいて、発熱、敗血症、脾腫、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、出血、静脈閉塞性疾患（ＶＯＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および医薬品が含まれる５４。ＰＴＰまたはＲＰＴとは異なり、ＦＮＡＩＴはかなり一般的な障害であり、おおよそ出生数１０００人中１人～２０００人中１人に重篤な胎児および／または新生児血小板減少症をもたらす２、３。多くの乳児は問題なく回復するが、ＦＮＡＩＴは胎児および新生児における重度の血小板減少症の主な原因であり、ほぼ半分は「抗原陰性」血小板の輸血を必要とするほど重篤な出血を経験している４。しかしながら、ＦＮＡＩＴの最も破壊的な結果は、早ければ妊娠２０～２４週での頭蓋内出血および子宮内死亡である２、５、６。治療の進歩にもかかわらず、ＦＮＡＩＴは、満期出産児における頭蓋内出血の主要な原因のままであり４、７～１０、多くの場合生涯にわたる身体障害をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
過去６０年間にわたって多くの研究室で行われた研究により、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（ＩＳＢＴ）のＰｌａｔｅｌｅｔ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＩＳＴＨによって現在認識されている１１、５つの異なる糖タンパク質上に位置する３０を超える別個の遺伝性ヒト血小板特異的同種抗原（ＨＰＡ）系（ＨＰＡ １～３０）の同定に至った。これらのうち、ＨＰＡ－１ａ（ＰｌＡ１としても知られる）エピトープは、ＰＴＰおよびＦＮＡＩＴを最も一般的に誘発するものであり、同種抗体が検出され得る症例の原因の約８０％を占めており１２、したがって最も広範囲に研究されている。しかしながら、当該技術分野では、ＨＰＡ－１ａ／１ｂエピトープ研究のための改善されたモデル、ならびにＰＴＰおよびＦＮＡＩＴの改善された診断、予防、および治療方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の主要な態様のいくつかを以下に要約する。さらなる態様は、本開示の発明の詳細な説明、実施例、図面、および特許請求の範囲のセクションに記載されている。本開示の各セクションの説明は、他のセクションと併せて読まれることが意図されている。さらに、本開示の各セクションに記載された様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、実施形態の任意のおよびすべてのそのような組み合わせは、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【0006】
第一の態様では、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を有する変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）をコードする核酸をゲノムが含むトランスジェニックマウスが本明細書で提供され、変異ＧＰＩＩＩａは、配列番号２５における変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む。いくつかの実施形態では、マウスは、配列番号２６に示される配列を含む変異体ＧＰＩＩＩａを発現する。いくつかの実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａは、配列番号２５に関して変異Ｖ２２Ｍをさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａは抗ＨＰＡ－１ａ抗体に結合することができる。
【0007】
第２の態様では、変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）に特異的に結合することができる分子を同定するインビトロ方法が本明細書で提供され、方法は、候補分子を本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板と接触させること、および候補分子が血小板に結合するかどうかを判定することを含み、候補分子がトランスジェニックマウス由来の血小板に結合するが、野生型マウス由来の血小板には結合しない場合、候補分子は変異体ＧＰＩＩＩａに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、候補分子は、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される。
【0008】
第３の態様では、雌マウスにおいて抗ＨＰＡ－１ａ同種免疫応答を防止することができる分子を同定するインビボ方法が本明細書で提供され、方法は、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ抗ＨＰＡ－１ａ抗体について陰性である試験マウスに候補分子を投与すること、および試験マウスにおける抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価を測定することを含み、単一抗原ビーズアッセイによって測定された試験マウスにおける抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価が分娩後２週間で検出不能である場合、候補分子は抗ＨＰＡ－１ａ同種免疫応答を防止することができる。いくつかの実施形態では、試験マウスにおける抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価は、分娩後６週間で検出不能である。いくつかの実施形態では、候補分子は、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される。
【0009】
第４の態様では、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が胎児または新生児血小板に結合するのを阻害することができる分子を同定するインビボ方法が本明細書で提供され、方法は、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ妊娠前に（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板、または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された試験マウスに候補分子を投与すること、および胎児または新生児の血小板数を測定することを含み、試験マウスの子における胎児または新生児血小板数が対照マウスの子における胎児または新生児血小板数よりも多い場合、候補分子は、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が胎児または新生児血小板に結合するのを阻害することができる。いくつかの実施形態では、対照マウスの子と比較して、試験マウスの子において出血が減少または防止される。いくつかの実施形態では、候補分子は、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される。
【0010】
第５の態様では、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が妊娠マウスの胎盤を通過するのを阻害することができる分子を同定するインビボ方法が本明細書で提供され、方法は、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ妊娠前に（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板、または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された試験マウスに候補分子を投与すること、および胎児または新生児抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価を測定することを含み、試験マウスの子における胎児または新生児抗体力価が対照マウスの子における胎児または新生児抗体力価よりも低い場合、候補分子は、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が妊娠マウスの胎盤を通過するのを阻害することができる。いくつかの実施形態では、対照マウスの子と比較して、試験マウスの子において出血が減少または防止される。いくつかの実施形態では、候補分子は、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される。
【0011】
第６の態様では、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む変異体血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）が本明細書で提供される。
【0012】
第７の態様では、本明細書に記載の変異体ＧＰＩＩＩａへの結合について抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができる分子を同定するインビトロ方法が本明細書で提供され、方法は、基質上に固定化される変異体ＧＰＩＩＩａを、標識を含む抗ＨＰＡ－１ａ抗体と接触させてＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を形成すること、ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を溶液中の候補分子と接触させること、および基質上または溶液中の標識の量を検出することによって、候補分子が変異体ＧＰＩＩＩａに結合する抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合するかどうかを判定することを含み、基質上で検出された標識の量が、ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体と候補分子とを接触させる前に基質上で検出された標識の量と比較して、ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体と候補分子とを接触させた後に減少する場合、候補分子は、変異ＧＰＩＩＩａへの結合について抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができ、または、溶液中の標識の量が、ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を候補分子と接触させる前の溶液中の標識の量と比較して、ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を候補分子と接触させた後に増加する場合、候補分子は、変異ＧＰＩＩＩａへの結合について抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができる。いくつかの実施形態では、抗ＨＰＡ－１ａ抗体はモノクローナル抗体２６．４である。いくつかの実施形態では、標識は、フルオロフォア、放射性同位体、化学発光プローブおよび生物発光プローブからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、基質は、ビーズ、樹脂、粒子、膜およびゲルからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、候補分子は、抗体、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、および前述のいずれかの一本鎖形態からなる群から選択される。
【0013】
第８の態様では、本明細書に記載のトランスジェニックマウスを作製するための方法が本明細書で提供され、方法は、受精マウス卵母細胞の細胞質にｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド、ｉｉ）マウスＩＴＧＢ３エクソン３を標的とするｇＲＮＡ、ｉｉｉ）マウスＩＴＧＢ３エクソン１０を標的とするｇＲＮＡ、ｉｖ）配列番号２５に関してＧＰＩＩＩａのＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３ＬおよびＮ３９Ｄ変異をコードする一本鎖相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型オリゴヌクレオチド、およびｉｉ）配列番号２５に関してＧＰＩＩＩａのＭ４７０Ｑ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドを注入すること；注入された卵母細胞から生成された２細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管に移植すること；および偽妊娠雌から生まれたマウスを、配列番号２５に関してＧＰＩＩＩａのＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ３９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異の存在についてスクリーニングすることを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＢ３エクソン１０を標的とするｇＲＮＡは、配列番号７を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ４７０Ｑ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドは、診断制限部位をさらにコードする。いくつかの実施形態では、Ｍ４７０Ｑ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドは、ＩＴＧＢ３エクソン１０に対する１つ以上のサイレント変異をさらにコードして、エクソン１０におけるＩＴＧＢ３のＣａｓ９による反復消化をサイレンシングする。いくつかの実施形態では、Ｍ４７０Ｑ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドは、配列番号８を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＢ３エクソン３を標的とするｇＲＮＡは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドは、診断制限部位をさらにコードする。いくつかの実施形態では、Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドは、ＩＴＧＢ３エクソン３に対する１つ以上のサイレント変異をさらにコードして、エクソン３におけるＩＴＧＢ３のＣａｓ９による反復消化をサイレンシングする。いくつかの実施形態では、Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄ変異をコードする一本鎖ＨＤＲ鋳型オリゴヌクレオチドは、配列番号４を含む。
【0014】
第９の態様では、配列番号２７と少なくとも９５％の同一性を有する変異血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）をコードする核酸をゲノムが含むトランスジェニックマウスが本明細書で提供され、変異体ＧＰＩＩＩａは、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む。いくつかの実施形態では、マウスは、配列番号２７に示される配列を含む変異体ＧＰＩＩＩａを発現する。いくつかの実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａは抗ＨＰＡ－１ａ抗体に結合することができる。
【0015】
第１０の態様では、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）、および配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９Ｄ、およびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａについてヘテロ接合性の子を妊娠しているマウスが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、マウスは抗ＨＰＡ－１ａ抗体について陽性である。いくつかの実施形態では、マウスを妊娠前に、（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板、または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫した。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A-1B】ヒトＧＰＩＩＩａ ＰＳＩドメインおよびＥＧＦ１ドメインの三次元構造を示す。ＰＳＩドメインはＧＰＩＩＩａのハイブリッドドメインとＥＧＦ１ドメインとの間にあり、ＨＰＡ－１ａ（ＰｌＡ１）エピトープの発現を制御する多型アミノ酸３３は、ＥＧＦ１ドメインの直線的に離れているが立体配置的に近い反対側にあることに留意されたい。Ｃｙｓ１３とのジスルフィド結合を介してＥＧＦ１ドメインをＰＳＩドメインに連結するＣｙｓ４３５へのアラニンの変異は、すべてではないが一部の母体抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体の結合の喪失をもたらすことが以前に示されており、ＥＧＦ１中の非多型アミノ酸がこれらのいわゆるＩＩ型抗体のエピトープの一部を構成するという推測につながる。
【図2A-2F】ＡＰＬＤヒト化トランスジェニックマウスのＣＲＩＳＰＲ媒介発生を示す。図２Ａ：ＧＰＩＩＩａ ＰＳＩドメインの三次元構造あり、マウスタンパク質中で変異して２２～４０アミノ酸ループをヒト化した残基の位置を示す。図２Ｂ：ＩＴＧＢ３遺伝子座の概略図であり、ｇＲＮＡ結合部位（赤色の棒）、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（マゼンタ色の棒）、およびＣａｓ９切断部位（赤色の矢印の先）の位置を示す。２００ｂｐのＡＰＬＤ相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を、４つの所望のアミノ酸置換（赤色で標識された変異ヌクレオチド）、および８０ヌクレオチド相同アームに隣接する診断用ＢａｍＨ１制限部位（青色で標識されたサイレント変異ヌクレオチド）を導入するように設計した。ＨＤＲ鋳型はまた、サイレント変異をコードするヌクレオチド（緑色）を導入して、Ｃａｓ９による再切断を防止する。図２Ｃ：パネルＢに示される、ＩＴＧＢ３遺伝子へのＣａｓ９ヌクレアーゼを標的化とするように設計された２０ｂｐ ｇＲＮＡを、Ｃａｓ９およびピューロマイシン耐性遺伝子の両方をコードするＣＲＩＳＰＲベクターｐｘ４５９のＢｂｓＩ部位にクローニングした。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ受精卵の前核に、ＨＤＲ鋳型と共にｐｘ４５９プラスミドを微量注入して、ヒト化ＡＰＬＤマウスを作製した。図２Ｄ：マウスＩＴＧＢ３遺伝子の標的部位を取り囲む７１７ｂｐ領域内へのＨＤＲ鋳型の組み込みを報告するように設計されたＰＣＲ戦略。導入されたＢａｍＨ１を青色のボックスでマークする。図２Ｅ：２匹の代表的な子の遺伝子型決定：子の尾からのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨ１で消化して、正しく標的化されたＡＰＬＤ対立遺伝子を同定した。子＃１のＰＣＲ産物をＢａｍＨ１で切断し、ＨＤＲオリゴの取り込みの成功を実証する。矢印は、予想されるＢａｍＨ１消化産物を示す。図２Ｆ：ゲノム編集部位を取り囲むＩＴＧＢ３遺伝子座を、子＃１のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ配列分析に供したところ、マウスＩＴＧＢ３の両方の対立遺伝子へのヒト配列の正確なホモ接合性組込みが確認された。
【図3A-3B】ＡＰＬＤヒト化マウスＰＳＩドメインが、すべてではないが多くのヒト抗ＨＰＡ－１ａ同種抗血清の結合を支援することを示す。図３Ａ：ＨＰＡ－１ａ選択的マウスｍＡｂ、ＳＺ２１のヒトおよびマウス血小板への結合のフローサイトメトリー分析。ＳＺ２１は、アロ選択性を示し、ＨＰＡ－１ｂではなく、ヒトＨＰＡ－１ａ陽性のヒト血小板に結合し、野生型ではなく、ＡＰＬＤマウス血小板に結合することに留意されたい。ＰＳＩドメイン特異的ｍＡｂであるＰＳＩＢ１は、ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａの発現の陽性対照として使用され、示されるように、種またはＨＰＡアロタイプにかかわらず、すべてのＰＳＩドメインに結合する。図３Ｂ：ヒトおよびマウス形態のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａに結合する抗ＨＰＡ－１ａ母体同種抗血清の抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析。５つの異なるヒトＦＮＡＩＴ同種抗血清を、示された表現型のヒトまたはマウスの血小板と共にインキュベートした。次いで、血小板／抗体複合体を界面活性剤溶解し、マウス血小板から免疫複合体を捕捉するための抗マウスＣＤ４１、またはヒト血小板から免疫複合体を捕捉するためのｍＡｂ ＡＰ２のいずれかでコーティングされたマイクロタイターウェルに添加した。ヒト同種抗血清２、３および４はヒトＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａおよびＡＰＬＤマウスＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａと同様に反応するが、同種抗血清１および５はマウスＡＰＬＤ ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａと反応せず、これらのポリクローナル血清中に存在するＨＰＡ－１ａ特異的同種抗体の大部分は、より複雑なエピトープ要件を有することを示唆していることに留意されたい。予想されるように、いずれのＦＮＡＩＴ同種抗血清も野生型マウスＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａと反応しない。
【図4A-4B】ＩＩ型抗ＨＰＡ－１ａ抗体の結合のための構造的要件を示す。図４Ａ：ＨＰＡ－１ａ特異的モノクローナル抗体の、ヒトおよびマウス血小板との反応性のフローサイトメトリー分析。示された種からの、示された表現型を有する血小板を、ｍＡｂ ＳＺ２１、２６．４およびＢ２Ｇ１と反応させた。ＩＩ型ｍＡｂ ２６．４は、図４Ｂに示すように、ＰＳＩドメインに空間的に近いＥＧＦ１ドメインの残基４７０でマウスＧＰＩＩＩａがＭｅｔからＧｌｎにヒト化されることを必要とすることに留意されたい。別のＩＩ型ＨＰＡ－１ａ特異的ｍＡｂであるＢ２Ｇ１は、ＡＰＬＤＱ血小板と非反応性のままであり、ＨＰＡ－１ａエピトープの形成を制御するＬｅｕ３３Ｐｒｏ多型に対するポリクローナル体液性応答におそらくは存在する結合特異性の複雑さを強調している。
【図5A-5C】Ｉ－ＥＧＦ１内の複数のアミノ酸がＩＩ型抗ＨＰＡ－１ａ抗体の結合に寄与し得ることを示す。図５Ａ：ＰＳＩおよびＩ－ＥＧＦ１ドメインのヒト対マウスの比較であり、相違が赤色で強調される。特に、ＰＳＩドメインにおけるＡＰＬＤ配列ならびにＥＧＦ１内のＱ４７０Ｍ、Ｈ４４６Ｐ、Ｇ４６３ＤおよびＰ４６４Ｑの相違に留意されたい。図５Ｂ：β３ ＰＳＩおよびＩ－ＥＧＦ１ドメインと結合した抗体Ｂ２Ｇ１の可変領域の構造モデル。抗体は、表示されるＣＤＲループと共に黄褐色の表面として示され、一方、抗原－抗体界面のインテグリンβ３残基の側鎖は、棒および点として示されている。界面相互作用残基には、多型アミノ酸３３だけでなく、ＰＳＩドメイン中のＰ３２、ならびにＩ－ＥＧＦ１のＨ４４６およびＱ４７０も含まれることに留意されたい。Ｇ４６３およびＰ４６４が、界面の近くにはないことにも留意されたい。図５Ｃ上：ヒトＧＰＩＩｂ、および示されたヒト化アミノ酸置換を発現するように変異させたマウスＧＰＩＩＩａアイソフォームを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、示された抗体とインキュベートし、フローサイトメトリー分析に供した。ＰＳＩドメイン特異的ｍＡｂ、ＰＳＩＢ１をトランスフェクション効率の対照として使用した。図５Ｂのドッキングモデルで予測されるように、ｍＡｂ ２６．４はその結合にＱ４７０を必要とするが、Ｂ２Ｇ１はＱ４７０とＨ４４６の両方を必要とすることに留意されたい。図５Ｃ下：ヒトＧＰＩＩｂ、および示されたマウスアミノ酸を発現するように変異させたヒトＧＰＩＩＩａアイソフォームを発現するプラスミドでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、示された抗体を使用してフローサイトメトリー分析に供した。Ｑ４７０→Ｍ変異は２６．４とＢ２Ｇ１の両方の結合の喪失をもたらすが、Ｈ４４６→Ｐアミノ酸置換はＢ２Ｇ１のみに影響を及ぼすことに留意されたい。
【図6A-6D】ＡＰＬＤＱヒト化トランスジェニックマウスのＣＲＩＳＰＲ媒介発生を示す。図６Ａ：ＧＰＩＩＩａ ＰＳＩドメインの三次元構造あり、ＡＰＬＤマウスＧＰＩＩＩａタンパク質中でＱに変異したＥＧＦ１ドメイン中の残基Ｍ４７０の位置を示す。図６Ｂ：ＩＴＧＢ３遺伝子座の概略図であり、ｇＲＮＡ結合部位（赤色の棒）、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（マゼンタ色の棒）、およびＣａｓ９切断部位（赤色の矢印の先）の位置を示す。１６７ｂｐ相同組換え修復（ＨＤＲ）鋳型を、８２および７７ヌクレオチド相同アームに隣接するＭからＱへのアミノ酸置換（赤色で標識された変異ヌクレオチド）を導入するように設計した。ＨＤＲ鋳型はまた、サイレント変異を導入して（緑色のヌクレオチド）、Ｃａｓ９による再切断を防止する。図６Ｃ：ＡＰＬＤ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ受精卵の細胞質に、Ｃａｓ－９タンパク質、ｇＲＮＡをＨＤＲ鋳型と共に微量注入して、ヒト化ＡＰＬＤＱマウスを作製した。図６Ｄ：ゲノム編集部位を取り囲むＩＴＧＢ３遺伝子座を子のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ配列分析に供したところ、マウスＩＴＧＢ３の１つの対立遺伝子へのＨＤＲ配列の正確なヘテロ接合性組込みが確認された。
【図7】ヒトおよびマウス形態のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａに結合する抗ＨＰＡ－１ａ母体同種抗血清の抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を示す。１６の異なるヒトＦＮＡＩＴ同種抗血清またはＰＴＰ同種抗血清を、示された表現型のヒトまたはマウスの血小板と共にインキュベートした。次いで、血小板／抗体複合体を界面活性剤溶解し、マウス血小板から免疫複合体を捕捉するための抗マウスＣＤ４１、またはヒト血小板から免疫複合体を捕捉するためのｍＡｂ ＡＰ２のいずれかでコーティングされたマイクロタイターウェルに添加した。ヒトＦＮＡＩＴ同種抗血清２、３、４、７、１１、１２、１３ならびにＰＴＰ同種抗血清２および３はヒトＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａおよびＡＰＬＤマウスＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａと同様に反応するが、ヒトＦＮＡＩＴ同種抗血清１、５、９、１０はマウスＡＰＬＤ ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａとあまり反応せず、これらのポリクローナル血清中に存在するＨＰＡ－１ａ特異的同種抗体の大部分は、より複雑なエピトープ要件を有することを示唆していることに留意されたい。予想されるように、いずれのＦＮＡＩＴ同種抗血清も野生型マウスＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａと反応しない。
【図8】Ｉ型ではなく、ＩＩ型の抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体による、ヒトαＩＩｂβ３へのＰＡＣ－１結合の阻害を示す。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を野生型ヒトαＩＩｂβ３＋ＥＧＦＰでトランスフェクションした。細胞を、Ｉ型ｍＡｂ ＳＺ２１、ＩＩ型ｍＡｂ Ｂ２Ｇ１および２６．４、または以前に特徴決定されたＩ型ＰＴＰ抗血清（ＰＴＰ－１）、もしくは以前に特徴決定されたＩＩ型ＦＮＡＩＴ抗血清（ＦＮＡＩＴ－５およびＦＮＡＩＴ－９）からの精製ＩｇＧ画分のいずれかとプレインキュベートした。プレインキュベーション後、フィブリノーゲンリガンド模倣体ｍＡｂ ＰＡＣ－１を、０．２ｍＭ Ｃａ＋２および２ｍＭ Ｍｎ＋２を含有する緩衝液中に添加した。ＥＧＦＰ陽性細胞を、フローサイトメトリーによってＰＡＣ－１の結合について分析した。ＰＡＣ－１結合を全β３表面発現に対して正規化し、緩衝液対照のパーセンテージとして示した。データは平均±ＳＤ（ｎ≧２）である。モノクローナルおよびポリクローナルのＩＩ型抗体の両方が様々な程度でＰＡＣ－１結合を阻害するが、Ｉ型抗体はほとんど効果がないことに留意されたい。
【図9】ＡＰＬＤ＋／＋雄と交配した予備免疫された野生型雌が、重度の血小板減少症の子を出産することを示す。繁殖対照＃１は、ＡＰＬＤ Ｃ５７ＢＬ／６雄と交雑されたＷＴ非免疫化Ｂａｌｂ／ｃ雌である。繁殖対照＃２は、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６雄と交雑された免疫化Ｂａｌｂ／ｃ雌である。
【図10A-10D】雌が１回だけ同種免疫化されたにもかかわらず、胎児／新生児血小板減少症が少なくとも５回のその後の妊娠の間持続することを示す。母体抗ＡＰＬＤ β３インテグリン抗体は、子における血小板減少症および出血を引き起こす。
【図11】図９に示すＡＰＬＤモデルと同様に、ＡＰＬＤＱ雄と交配した予備免疫された野生型雌が、重度の血小板減少症の子を出産することを示す。繁殖対照＃１は、ＡＰＬＤ Ｃ５７ＢＬ／６雄と交雑されたＷＴ非免疫化Ｂａｌｂ／ｃ雌である。繁殖対照＃２は、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６雄と交雑された免疫化Ｂａｌｂ／ｃ雌である。
【図12A-12D】図１１に概説される繁殖において、子の血小板減少症および出血が最大４回の妊娠まで続くことを示す。母体抗ＡＰＬＤ β３インテグリン抗体は、子における血小板減少症および出血を引き起こす。
【図13】４μｇ／ｍｌのｍＡｂ ２６．４が、マウスＡＰＬＤＱ血小板へのマウスポリクローナル抗ＡＰＬＤＱ抗体の結合をインビトロで効率的に阻害することを示す。２μｇ／ｍｌ～１６μｇ／ｍｌの間で試験したすべての濃度が、結合を効果的に阻害した。
【図14】ＩＶＩＧおよびｍＡｂ ２６．４処置プロトコルを示す。交配後１０日目および１７日目にＩＶ導入された１ｇ／ｋｇのヒトＩＶＩＧによる処置で、ＡＰＬＤＱ同種免疫化した雌に生まれた子の血小板数が増加する。同様に、交配後１０日目および１７日目に導入された３０μｇ／マウスのＰＧ－ＬＡＬＡ形態のｍＡｂ ２６．４による処置で、ＡＰＬＤＱ同種免疫化した雌に生まれた子の血小板数が増加する。
【図15】ＩＶＩＧおよびＰＧ－ＬＡＬＡ ２６．４の両方が、ＡＰＬＤＱ同種免疫化雌マウスの子における血小板数を効果的に上昇させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
［参照による組み込み］
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許および特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許および特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0018】
ＦＮＡＩＴおよびＰＴＰは、血小板特異的抗原に対する同種抗体によって引き起こされる出血障害である。ＨＰＡ－１ａ（ＰｌＡ１としても知られる）エピトープは、ＰＴＰおよびＦＮＡＩＴを最も一般的に誘発するヒト血小板同種抗原であり、同種抗体が検出され得る症例の原因の約８０％を占める。ＨＰＡ－１ａ／－１ｂ同種抗原系は、血小板膜糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩＩａ１３、１４（＝αＩＩｂβ３血小板フィブリノーゲン受容体のβ３インテグリンサブユニット）におけるＬｅｕ３３Ｐｒｏ多型によって制御され、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のＨＬＡ－ＤＲＢ３＊０１０１対立遺伝子も有する、Ｐｒｏ３３（＝ＨＰＡ－１ｂ）ホモ接合性個体は、ＧＰＩＩＩａのＬｅｕ３３（ＨＰＡ－１ａ）形態に対する同種免疫応答を発生させるリスクが最も高い１５－１７。多型アミノ酸３３は、プレキシン、セマフォリン、インテグリン（ＰＳＩ）ドメインとして知られている高度にジスルフィド結合した結び目様構造内に位置し、それ自体はＧＰＩＩＩａのハイブリッドおよびインテグリン上皮成長因子１（ＥＧＦ、Ｉ－ＥＧＦ１）ドメインの間にある１８（図１Ａ～図１Ｂを参照されたい）。興味深いことに、Ｉ型抗体として分類されるいくつかの母体抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が、ＰＳＩドメインとＥＧＦ１ドメインとを連結するジスルフィド結合が破壊されたＧＰＩＩＩａの変異型に正常に結合する一方、その他（ＩＩ型）は反応性を失い１９、（１）ＨＰＡ－１ａに対する同種免疫応答が不均一であること、および（２）直線的に離れたＥＧＦドメイン内の配列が、少なくともいくつかの母体抗ＨＰＡ－１ａ抗体についてＧＰＩＩＩａ上で高親和性抗体を形成するように要求され得ることを実証している（図１Ａ～図１Ｂに概略的に示す）。
【0019】
多型アミノ酸３３を取り囲む分子の領域におけるＧＰＩＩＩａの三次元構造データの分析に基づいて、本明細書中に記載されるのは、ＰＳＩおよびＥＧＦ１ドメイン内に選択されたヒト化残基を有するマウスＧＰＩＩＩａアイソフォームを発現したトランスジェニックマウスである。選択されたヒト化残基を有するＧＰＩＩＩａアイソフォームに対する、一連のモノクローナルおよびポリクローナルＨＰＡ－１ａ特異的抗体の結合も記載されている。結合は、この臨床的に重要なヒト血小板同種抗原系に対するポリクローナル同種免疫応答の複雑な不均一性を示す。この同種免疫応答の高分解能マッピングは、ＦＮＡＩＴの診断を改善し得、予防的および治療的抗ＨＰＡ－１ａ剤の合理的な設計、選択および／またはスクリーニングを容易にするはずである。
【0020】
現在、ヒトＦＮＡＩＴにおいて見られるような、ＧＰＩＩＩａに対する抗ＨＰＡ－１ａ抗血清に由来する広範囲のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の結合を正確に反映する、ＦＮＡＩＴの動物モデルは存在しない。さらに、予防的および治療的試薬の設計、選択およびスクリーニングに適したＦＮＡＩＴの動物モデルは存在しない。これは、ヒトＧＰＩＩＩａと比較したマウスＧＰＩＩＩａの配列および構造の相違によるものであり、結合モノクローナルおよびポリクローナル抗体の変化をもたらす。
【0021】
ＧＰＩＩＩａにおけるヒト化変異を含むトランスジェニックマウスが本明細書で提供される。ＧＰＩＩＩａの変異によって、マウスは、抗ＨＰＡ－１ａ抗血清からのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体に結合する変異体ＧＰＩＩＩａを発現する。トランスジェニックマウスに由来する細胞および組織も本明細書で提供される。野生型マウスＧＰＩＩＩａ配列は、本明細書では配列番号２５として含まれる。トランスジェニックマウスＧＰＩＩＩａ配列は、ＧＰＩＩＩａ（配列番号２５）中に少なくともＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９Ｄ、およびＭ４７０Ｑ変異を含み、抗ＨＰＡ－１ａ抗体、ならびにいくつかの実施形態ではモノクローナルおよびポリクローナル抗ＨＰＡ－１ａ抗体に結合することができる変異体ＧＰＩＩＩａをもたらす。いくつかの実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａ配列は、配列番号２５の少なくともＭ４７０Ｑ変異およびアミノ酸残基２２～４０の変異を含み、アミノ酸残基２２～４０は、ヒトＧＰＩＩＩａのＰＳＩドメインにおける、ＥＧＦ１およびＥＧＦ２ドメインに隣接するループ領域に対応する配列ＭＣＡＷＣＳＤＥＡＬＰＬＧＳＰＲＣＤ（配列番号２８）で置き換えられている。一実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａは、モノクローナル抗体２６．４に結合することができる。いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスは、配列番号２６のアミノ鎖配列を含む変異ＧＰＩＩＩａを発現する。いくつかの実施形態では、トランスジェニックマウスは、配列番号２７のアミノ鎖配列を含む変異ＧＰＩＩＩａを発現する。
【0022】
マウスＧＰＩＩＩａ（配列番号２５）
ＥＳＮＩＣＴＴＲＧＶＮＳＣＱＱＣＬＡＶＳＰＶＣＡＷＣＳＤＥＴＬＳＱＧＳＰＲＣＮＬＫＥＮＬＬＫＤＮＣＡＰＥＳＩＥＦＰＶＳＥＡＱＩＬＥＡＲＰＬＳＳＫＧＳＧＳＳＡＱＩＴＱＶＳＰＱＲＩＡＬＲＬＲＰＤＤＳＫＩＦＳＬＱＶＲＱＶＥＤＹＰＶＤＩＹＹＬＭＤＬＳＦＳＭＫＤＤＬＳＳＩＱＴＬＧＴＫＬＡＳＱＭＲＫＬＴＳＮＬＲＩＧＦＧＡＦＶＤＫＰＶＳＰＹＭＹＩＳＰＰＱＡＩＫＮＰＣＹＮＭＫＮＡＣＬＰＭＦＧＹＫＨＶＬＴＬＴＤＱＶＳＲＦＮＥＥＶＫＫＱＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧＦＤＡＩＭＱＡＴＶＣＤＥＫＩＧＷＲＮＤＡＳＨＬＬＶＦＴＴＤＡＫＴＨＩＡＬＤＧＲＬＡＧＩＶＬＰＮＤＧＨＣＨＩＧＴＤＮＨＹＳＡＳＴＴＭＤＹＰＳＬＧＬＭＴＥＫＬＳＱＫＮＩＮＬＩＦＡＶＴＥＮＶＶＳＬＹＱＮＹＳＥＬＩＰＧＴＴＶＧＶＬＳＤＤＳＳＮＶＬＱＬＩＶＤＡＹＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥＥＬＳＬＳＦＮＡＴＣＬＮＮＥＶＩＰＧＬＫＳＣＶＧＬＫＩＧＤＴＶＳＦＳＩＥＡＫＶＲＧＣＰＱＥＫＥＱＳＦＴＩＫＰＶＧＦＫＤＳＬＴＶＱＶＴＦＤＣＤＣＡＣＱＡＦＡＱＰＳＳＰＲＣＮＮＧＮＧＴＦＥＣＧＶＣＲＣＤＱＧＷＬＧＳＭＣＥＣＳＥＥＤＹＲＰＳＱＱＥＥＣＳＰＫＥＧＱＰＩＣＳＱＲＧＥＣＬＣＧＱＣＶＣＨＳＳＤＦＧＫＩＴＧＫＹＣＥＣＤＤＦＳＣＶＲＹＫＧＥＭＣＳＧＨＧＱＣＮＣＧＤＣＶＣＤＳＤＷＴＧＹＹＣＮＣＴＴＲＴＤＴＣＭＳＴＮＧＬＬＣＳＧＲＧＮＣＥＣＧＳＣＶＣＶＱＰＧＳＹＧＤＴＣＥＫＣＰＴＣＰＤＡＣＳＦＫＫＥＣＶＥＣＫＫＦＮＲＧＴＬＨＥＥＮＴＣＳＲＹＣＲＤＤＩＥＱＶＫＥＬＴＤＴＧＫＮＡＶＮＣＴＹＫＮＥＤＤＣＶＶＲＦＱＹＹＥＤＴＳＧＲＡＶＬＹＶＶＥＥＰＥＣＰＫＧＰＤＩＬＶＶＬＬＳＶＭＧＡＩＬＬＩＧＬＡＴＬＬＩＷＫＬＬＩＴＩＨＤＲＫＥＦＡＫＦＥＥＥＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ
ＥＳＮＩＣＴＴＲＧＶＮＳＣＱＱＣＬＡＶＳＰＶＣＡＷＣＳＤＥＴＬＳＱＧＳＰＲＣＮＬＫＥＮＬＬＫＤＮＣＡＰＥＳＩＥＦＰＶＳＥＡＱＩＬＥＡＲＰＬＳＳＫＧＳＧＳＳＡＱＩＴＱＶＳＰＱＲＩＡＬＲＬＲＰＤＤＳＫＩＦＳＬＱＶＲＱＶＥＤＹＰＶＤＩＹＹＬＭＤＬＳＦＳＭＫＤＤＬＳＳＩＱＴＬＧＴＫＬＡＳＱＭＲＫＬＴＳＮＬＲＩＧＦＧＡＦＶＤＫＰＶＳＰＹＭＹＩＳＰＰＱＡＩＫＮＰＣＹＮＭＫＮＡＣＬＰＭＦＧＹＫＨＶＬＴＬＴＤＱＶＳＲＦＮＥＥＶＫＫＱＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧＦＤＡＩＭＱＡＴＶＣＤＥＫＩＧＷＲＮＤＡＳＨＬＬＶＦＴＴＤＡＫＴＨＩＡＬＤＧＲＬＡＧＩＶＬＰＮＤＧＨＣＨＩＧＴＤＮＨＹＳＡＳＴＴＭＤＹＰＳＬＧＬＭＴＥＫＬＳＱＫＮＩＮＬＩＦＡＶＴＥＮＶＶＳＬＹＱＮＹＳＥＬＩＰＧＴＴＶＧＶＬＳＤＤＳＳＮＶＬＱＬＩＶＤＡＹＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥＥＬＳＬＳＦＮＡＴＣＬＮＮＥＶＩＰＧＬＫＳＣＶＧＬＫＩＧＤＴＶＳＦＳＩＥＡＫＶＲＧＣＰＱＥＫＥＱＳＦＴＩＫＰＶＧＦＫＤＳＬＴＶＱＶＴＦＤＣＤＣＡＣＱＡＦＡＱＰＳＳＰＲＣＮＮＧＮＧＴＦＥＣＧＶＣＲＣＤＱＧＷＬＧＳＭＣＥＣＳＥＥＤＹＲＰＳＱＱＥＥＣＳＰＫＥＧＱＰＩＣＳＱＲＧＥＣＬＣＧＱＣＶＣＨＳＳＤＦＧＫＩＴＧＫＹＣＥＣＤＤＦＳＣＶＲＹＫＧＥＭＣＳＧＨＧＱＣＮＣＧＤＣＶＣＤＳＤＷＴＧＹＹＣＮＣＴＴＲＴＤＴＣＭＳＴＮＧＬＬＣＳＧＲＧＮＣＥＣＧＳＣＶＣＶＱＰＧＳＹＧＤＴＣＥＫＣＰＴＣＰＤＡＣＳＦＫＫＥＣＶＥＣＫＫＦＮＲＧＴＬＨＥＥＮＴＣＳＲＹＣＲＤＤＩＥＱＶＫＥＬＴＤＴＧＫＮＡＶＮＣＴＹＫＮＥＤＤＣＶＶＲＦＱＹＹＥＤＴＳＧＲＡＶＬＹＶＶＥＥＰＥＣＰＫＧＰＤＩＬＶＶＬＬＳＶＭＧＡＩＬＬＩＧＬＡＴＬＬＩＷＫＬＬＩＴＩＨＤＲＫＥＦＡＫＦＥＥＥＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ
【0023】
ヒト化マウスＧＰＩＩＩａ変異体１（配列番号２６）
ＥＳＮＩＣＴＴＲＧＶＮＳＣＱＱＣＬＡＶＳＰＶＣＡＷＣＳＤＥＡＬＰＬＧＳＰＲＣＤＬＫＥＮＬＬＫＤＮＣＡＰＥＳＩＥＦＰＶＳＥＡＱＩＬＥＡＲＰＬＳＳＫＧＳＧＳＳＡＱＩＴＱＶＳＰＱＲＩＡＬＲＬＲＰＤＤＳＫＩＦＳＬＱＶＲＱＶＥＤＹＰＶＤＩＹＹＬＭＤＬＳＦＳＭＫＤＤＬＳＳＩＱＴＬＧＴＫＬＡＳＱＭＲＫＬＴＳＮＬＲＩＧＦＧＡＦＶＤＫＰＶＳＰＹＭＹＩＳＰＰＱＡＩＫＮＰＣＹＮＭＫＮＡＣＬＰＭＦＧＹＫＨＶＬＴＬＴＤＱＶＳＲＦＮＥＥＶＫＫＱＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧＦＤＡＩＭＱＡＴＶＣＤＥＫＩＧＷＲＮＤＡＳＨＬＬＶＦＴＴＤＡＫＴＨＩＡＬＤＧＲＬＡＧＩＶＬＰＮＤＧＨＣＨＩＧＴＤＮＨＹＳＡＳＴＴＭＤＹＰＳＬＧＬＭＴＥＫＬＳＱＫＮＩＮＬＩＦＡＶＴＥＮＶＶＳＬＹＱＮＹＳＥＬＩＰＧＴＴＶＧＶＬＳＤＤＳＳＮＶＬＱＬＩＶＤＡＹＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥＥＬＳＬＳＦＮＡＴＣＬＮＮＥＶＩＰＧＬＫＳＣＶＧＬＫＩＧＤＴＶＳＦＳＩＥＡＫＶＲＧＣＰＱＥＫＥＱＳＦＴＩＫＰＶＧＦＫＤＳＬＴＶＱＶＴＦＤＣＤＣＡＣＱＡＦＡＱＰＳＳＰＲＣＮＮＧＮＧＴＦＥＣＧＶＣＲＣＤＱＧＷＬＧＳＱＣＥＣＳＥＥＤＹＲＰＳＱＱＥＥＣＳＰＫＥＧＱＰＩＣＳＱＲＧＥＣＬＣＧＱＣＶＣＨＳＳＤＦＧＫＩＴＧＫＹＣＥＣＤＤＦＳＣＶＲＹＫＧＥＭＣＳＧＨＧＱＣＮＣＧＤＣＶＣＤＳＤＷＴＧＹＹＣＮＣＴＴＲＴＤＴＣＭＳＴＮＧＬＬＣＳＧＲＧＮＣＥＣＧＳＣＶＣＶＱＰＧＳＹＧＤＴＣＥＫＣＰＴＣＰＤＡＣＳＦＫＫＥＣＶＥＣＫＫＦＮＲＧＴＬＨＥＥＮＴＣＳＲＹＣＲＤＤＩＥＱＶＫＥＬＴＤＴＧＫＮＡＶＮＣＴＹＫＮＥＤＤＣＶＶＲＦＱＹＹＥＤＴＳＧＲＡＶＬＹＶＶＥＥＰＥＣＰＫＧＰＤＩＬＶＶＬＬＳＶＭＧＡＩＬＬＩＧＬＡＴＬＬＩＷＫＬＬＩＴＩＨＤＲＫＥＦＡＫＦＥＥＥＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ
ＥＳＮＩＣＴＴＲＧＶＮＳＣＱＱＣＬＡＶＳＰＶＣＡＷＣＳＤＥＡＬＰＬＧＳＰＲＣＤＬＫＥＮＬＬＫＤＮＣＡＰＥＳＩＥＦＰＶＳＥＡＱＩＬＥＡＲＰＬＳＳＫＧＳＧＳＳＡＱＩＴＱＶＳＰＱＲＩＡＬＲＬＲＰＤＤＳＫＩＦＳＬＱＶＲＱＶＥＤＹＰＶＤＩＹＹＬＭＤＬＳＦＳＭＫＤＤＬＳＳＩＱＴＬＧＴＫＬＡＳＱＭＲＫＬＴＳＮＬＲＩＧＦＧＡＦＶＤＫＰＶＳＰＹＭＹＩＳＰＰＱＡＩＫＮＰＣＹＮＭＫＮＡＣＬＰＭＦＧＹＫＨＶＬＴＬＴＤＱＶＳＲＦＮＥＥＶＫＫＱＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧＦＤＡＩＭＱＡＴＶＣＤＥＫＩＧＷＲＮＤＡＳＨＬＬＶＦＴＴＤＡＫＴＨＩＡＬＤＧＲＬＡＧＩＶＬＰＮＤＧＨＣＨＩＧＴＤＮＨＹＳＡＳＴＴＭＤＹＰＳＬＧＬＭＴＥＫＬＳＱＫＮＩＮＬＩＦＡＶＴＥＮＶＶＳＬＹＱＮＹＳＥＬＩＰＧＴＴＶＧＶＬＳＤＤＳＳＮＶＬＱＬＩＶＤＡＹＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥＥＬＳＬＳＦＮＡＴＣＬＮＮＥＶＩＰＧＬＫＳＣＶＧＬＫＩＧＤＴＶＳＦＳＩＥＡＫＶＲＧＣＰＱＥＫＥＱＳＦＴＩＫＰＶＧＦＫＤＳＬＴＶＱＶＴＦＤＣＤＣＡＣＱＡＦＡＱＰＳＳＰＲＣＮＮＧＮＧＴＦＥＣＧＶＣＲＣＤＱＧＷＬＧＳＱＣＥＣＳＥＥＤＹＲＰＳＱＱＥＥＣＳＰＫＥＧＱＰＩＣＳＱＲＧＥＣＬＣＧＱＣＶＣＨＳＳＤＦＧＫＩＴＧＫＹＣＥＣＤＤＦＳＣＶＲＹＫＧＥＭＣＳＧＨＧＱＣＮＣＧＤＣＶＣＤＳＤＷＴＧＹＹＣＮＣＴＴＲＴＤＴＣＭＳＴＮＧＬＬＣＳＧＲＧＮＣＥＣＧＳＣＶＣＶＱＰＧＳＹＧＤＴＣＥＫＣＰＴＣＰＤＡＣＳＦＫＫＥＣＶＥＣＫＫＦＮＲＧＴＬＨＥＥＮＴＣＳＲＹＣＲＤＤＩＥＱＶＫＥＬＴＤＴＧＫＮＡＶＮＣＴＹＫＮＥＤＤＣＶＶＲＦＱＹＹＥＤＴＳＧＲＡＶＬＹＶＶＥＥＰＥＣＰＫＧＰＤＩＬＶＶＬＬＳＶＭＧＡＩＬＬＩＧＬＡＴＬＬＩＷＫＬＬＩＴＩＨＤＲＫＥＦＡＫＦＥＥＥＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ
【0024】
ヒト化マウスＧＰＩＩＩａ変異体２（配列番号２７）
ＥＳＮＩＣＴＴＲＧＶＮＳＣＱＱＣＬＡＶＳＰＭＣＡＷＣＳＤＥＡＬＰＬＧＳＰＲＣＤＬＫＥＮＬＬＫＤＮＣＡＰＥＳＩＥＦＰＶＳＥＡＱＩＬＥＡＲＰＬＳＳＫＧＳＧＳＳＡＱＩＴＱＶＳＰＱＲＩＡＬＲＬＲＰＤＤＳＫＩＦＳＬＱＶＲＱＶＥＤＹＰＶＤＩＹＹＬＭＤＬＳＦＳＭＫＤＤＬＳＳＩＱＴＬＧＴＫＬＡＳＱＭＲＫＬＴＳＮＬＲＩＧＦＧＡＦＶＤＫＰＶＳＰＹＭＹＩＳＰＰＱＡＩＫＮＰＣＹＮＭＫＮＡＣＬＰＭＦＧＹＫＨＶＬＴＬＴＤＱＶＳＲＦＮＥＥＶＫＫＱＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧＦＤＡＩＭＱＡＴＶＣＤＥＫＩＧＷＲＮＤＡＳＨＬＬＶＦＴＴＤＡＫＴＨＩＡＬＤＧＲＬＡＧＩＶＬＰＮＤＧＨＣＨＩＧＴＤＮＨＹＳＡＳＴＴＭＤＹＰＳＬＧＬＭＴＥＫＬＳＱＫＮＩＮＬＩＦＡＶＴＥＮＶＶＳＬＹＱＮＹＳＥＬＩＰＧＴＴＶＧＶＬＳＤＤＳＳＮＶＬＱＬＩＶＤＡＹＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥＥＬＳＬＳＦＮＡＴＣＬＮＮＥＶＩＰＧＬＫＳＣＶＧＬＫＩＧＤＴＶＳＦＳＩＥＡＫＶＲＧＣＰＱＥＫＥＱＳＦＴＩＫＰＶＧＦＫＤＳＬＴＶＱＶＴＦＤＣＤＣＡＣＱＡＦＡＱＰＳＳＰＲＣＮＮＧＮＧＴＦＥＣＧＶＣＲＣＤＱＧＷＬＧＳＱＣＥＣＳＥＥＤＹＲＰＳＱＱＥＥＣＳＰＫＥＧＱＰＩＣＳＱＲＧＥＣＬＣＧＱＣＶＣＨＳＳＤＦＧＫＩＴＧＫＹＣＥＣＤＤＦＳＣＶＲＹＫＧＥＭＣＳＧＨＧＱＣＮＣＧＤＣＶＣＤＳＤＷＴＧＹＹＣＮＣＴＴＲＴＤＴＣＭＳＴＮＧＬＬＣＳＧＲＧＮＣＥＣＧＳＣＶＣＶＱＰＧＳＹＧＤＴＣＥＫＣＰＴＣＰＤＡＣＳＦＫＫＥＣＶＥＣＫＫＦＮＲＧＴＬＨＥＥＮＴＣＳＲＹＣＲＤＤＩＥＱＶＫＥＬＴＤＴＧＫＮＡＶＮＣＴＹＫＮＥＤＤＣＶＶＲＦＱＹＹＥＤＴＳＧＲＡＶＬＹＶＶＥＥＰＥＣＰＫＧＰＤＩＬＶＶＬＬＳＶＭＧＡＩＬＬＩＧＬＡＴＬＬＩＷＫＬＬＩＴＩＨＤＲＫＥＦＡＫＦＥＥＥＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ
ＥＳＮＩＣＴＴＲＧＶＮＳＣＱＱＣＬＡＶＳＰＭＣＡＷＣＳＤＥＡＬＰＬＧＳＰＲＣＤＬＫＥＮＬＬＫＤＮＣＡＰＥＳＩＥＦＰＶＳＥＡＱＩＬＥＡＲＰＬＳＳＫＧＳＧＳＳＡＱＩＴＱＶＳＰＱＲＩＡＬＲＬＲＰＤＤＳＫＩＦＳＬＱＶＲＱＶＥＤＹＰＶＤＩＹＹＬＭＤＬＳＦＳＭＫＤＤＬＳＳＩＱＴＬＧＴＫＬＡＳＱＭＲＫＬＴＳＮＬＲＩＧＦＧＡＦＶＤＫＰＶＳＰＹＭＹＩＳＰＰＱＡＩＫＮＰＣＹＮＭＫＮＡＣＬＰＭＦＧＹＫＨＶＬＴＬＴＤＱＶＳＲＦＮＥＥＶＫＫＱＳＶＳＲＮＲＤＡＰＥＧＧＦＤＡＩＭＱＡＴＶＣＤＥＫＩＧＷＲＮＤＡＳＨＬＬＶＦＴＴＤＡＫＴＨＩＡＬＤＧＲＬＡＧＩＶＬＰＮＤＧＨＣＨＩＧＴＤＮＨＹＳＡＳＴＴＭＤＹＰＳＬＧＬＭＴＥＫＬＳＱＫＮＩＮＬＩＦＡＶＴＥＮＶＶＳＬＹＱＮＹＳＥＬＩＰＧＴＴＶＧＶＬＳＤＤＳＳＮＶＬＱＬＩＶＤＡＹＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥＥＬＳＬＳＦＮＡＴＣＬＮＮＥＶＩＰＧＬＫＳＣＶＧＬＫＩＧＤＴＶＳＦＳＩＥＡＫＶＲＧＣＰＱＥＫＥＱＳＦＴＩＫＰＶＧＦＫＤＳＬＴＶＱＶＴＦＤＣＤＣＡＣＱＡＦＡＱＰＳＳＰＲＣＮＮＧＮＧＴＦＥＣＧＶＣＲＣＤＱＧＷＬＧＳＱＣＥＣＳＥＥＤＹＲＰＳＱＱＥＥＣＳＰＫＥＧＱＰＩＣＳＱＲＧＥＣＬＣＧＱＣＶＣＨＳＳＤＦＧＫＩＴＧＫＹＣＥＣＤＤＦＳＣＶＲＹＫＧＥＭＣＳＧＨＧＱＣＮＣＧＤＣＶＣＤＳＤＷＴＧＹＹＣＮＣＴＴＲＴＤＴＣＭＳＴＮＧＬＬＣＳＧＲＧＮＣＥＣＧＳＣＶＣＶＱＰＧＳＹＧＤＴＣＥＫＣＰＴＣＰＤＡＣＳＦＫＫＥＣＶＥＣＫＫＦＮＲＧＴＬＨＥＥＮＴＣＳＲＹＣＲＤＤＩＥＱＶＫＥＬＴＤＴＧＫＮＡＶＮＣＴＹＫＮＥＤＤＣＶＶＲＦＱＹＹＥＤＴＳＧＲＡＶＬＹＶＶＥＥＰＥＣＰＫＧＰＤＩＬＶＶＬＬＳＶＭＧＡＩＬＬＩＧＬＡＴＬＬＩＷＫＬＬＩＴＩＨＤＲＫＥＦＡＫＦＥＥＥＲＡＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥＡＴＳＴＦＴＮＩＴＹＲＧＴ
【0025】
本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、参照配列と比較して１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を有するポリペプチドを指す。例えば、配列番号２６は、配列番号２５の変異体である。変異体ＧＰＩＩＩａは、例えば、配列番号２５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一であり、配列番号２５に関してＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９Ｄ、およびＭ４７０Ｑ変異を含むアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａは、配列番号２５に関してＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異、ならびに配列番号２５に関して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５、最大２０、最大２５、または最大３０個の追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。
【0026】
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、１つ以上のアミノ酸が別の生物学的に類似した残基によって置換されていることを示す。例としては、類似の特徴を有するアミノ酸残基、例えば、小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸の置換が挙げられる。ペプチドおよびタンパク質における表現型的にサイレントな置換に関するさらなる情報については、例えば、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１３１０（１９９０）を参照されたい。以下の表では、アミノ酸の保存的置換を物理化学的特性によって分類する。Ｉ：中性かつ／または親水性、ＩＩ：酸およびアミド、ＩＩＩ：塩基性、ＩＶ：疎水性、Ｖ：芳香族、かさ高いアミノ酸。
【表1】
【0027】
以下の表では、アミノ酸の保存的置換を物理化学的特性によって分類する。ＶＩ：中性または疎水性、ＶＩＩ：酸性、ＶＩＩＩ：塩基性、ＩＸ：極性、Ｘ：芳香族。
【表2】
【0028】
タンパク質機能に影響を及ぼさない保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：４１２－４１７（１９９７）を参照されたい）。
【0029】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の対応性について比較およびアラインメント（必要に応じてギャップの導入）した場合に、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の指定されたパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。当技術分野で知られている様々なアルゴリズムおよびソフトウェアを使用して、アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得ることができる。
【0030】
そのような配列アラインメントアルゴリズムの非限定的な１つの例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４－２２６８（１９９０）に記載され、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３－５８７７（１９９３）で修正され、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９１））に組み込まれている。特定の実施形態では、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているように使用することができる。ＢＬＡＳＴ－２、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０（１９９６））、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列をアライメントするために使用することができる、公開されたさらなるソフトウェアプログラムである。特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または９０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して）決定される。特定の代替実施形態では、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））を組み込んだＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して（例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５の長さ重みを使用して）、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定することができる。あるいは、特定の実施形態では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７（１９８９））を使用して決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用して、かつ残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを含むＰＡＭ１２０を使用して決定することができる。当業者は、特定のアライメントソフトウェアによる最高のアライメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態では、アライメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。同一性を計算するための他のリソースには、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ ｅｄ．，１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ ｅｄ．，１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １（Ｇｒｉｆｆｉｎ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｄｓ．，１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載された方法が含まれる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、哺乳動物などの非ヒト動物、一般にラットまたはマウスなどのげっ歯類を指し、動物の細胞の１つ以上（好ましくはすべて）が本明細書に記載の導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、したがって成熟動物のゲノムに残り、それによってトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指示する外因性ＤＮＡを指す。ノックアウト動物は、トランスジェニック動物の定義に含まれる。
【0032】
胚操作および多能性幹細胞または卵母細胞のエレクトロポレーションまたは微量注入を介してトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１号、米国特許出願第１０／００６，６１１号、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００２）；および「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ」、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００２）に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0033】
一般に、本明細書に記載されるトランスジェニックマウスは、本明細書に記載されるように作製されたベクターを受精卵母細胞の前核または細胞質に注入することによって作製され、全細胞のＧＰＩＩＩａにおいて、配列番号２５に関してＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ３９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異を含むトランスジェニックマウスを、標準的なトランスジェニック技術を使用して、例えば「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００２）；米国特許第４，７３６，８６６および４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１および６，７９１，００６号、ならびにＨｏｇａｎの、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ」、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００２）に記載されるように作製するために使用される。
【0034】
遺伝子を変異させるための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，０２２，８９３号およびＧｉｒｏｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２１８，５９５号、ならびにＷ．Ｖｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｒｅｙ Ｃｒｏｓｓ）の米国特許第６，３４４，５９６号；Ｔ．Ｔ．Ｓｕｎ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の米国特許第６，３３９，１８３号；Ｄ．ＣｏｏｐｅｒおよびＥ．Ｋｏｒｅｎ Ｕ．Ｓ．の米国特許第６，３３１，６５８号；Ｈ．Ｌｕｂｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｒｅｙ Ｃｒｏｓｓ；Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の米国特許第６，２５５，５５４号；Ｐ．Ｐｒｉｅｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の米国特許第６，２０４，４３１号；Ｌ．Ｄｉａｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｘｔｒａｎ Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）の米国特許第６，１６６，２８８号；Ｊ．Ｍ．Ｈｙｔｔｉｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈａｒｍｉｎｇ ＢＶ）の米国特許第５，９５９，１７１号；Ｈ．Ｌｕｂｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｒｅｙ Ｃｒｏｓｓ）の米国特許第５，８８０，３２７号；Ｇ．Ｂｒｅｍの米国特許第５，６３９，４５７号；Ｉ．Ｇａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｌｔｄ．；Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ）の米国特許第５，６３９，９４０号；Ｗ．Ｄｒｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｒｅｙ Ｃｒｏｓｓ）の米国特許第５，５８９，６０４号；Ｔｏｗｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（ＵＡＢ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の米国特許第５，６０２，３０６号；ＬｅｄｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（Ｈａｒｖａｒｄ）の米国特許第４，７３６，８６６号；およびＭｅａｄｅ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ（Ｂｉｏｇｅｎ）の米国特許第４，８７３，３１６号を参照されたい。
【0035】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるようなトランスジェニックマウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して作製される。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（「Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ，２０１３，１５３（４）：９１０－９１８）を参照されたい。ＧＰＩＩＩａを変異させ、トランスジェニックマウスを作製するために、ｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、ｉｉ）目的の領域を標的とし、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位の前にあるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との両方をコードするベクター、および一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）相同組換え修復鋳型を、受精したマウス卵母細胞の前核または細胞質に注入する。いくつかの実施形態では、単離されたｇＲＮＡ、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型およびＣａｓ９ヌクレアーゼが、受精マウス卵母細胞の前核または細胞質に注入される。いくつかの実施形態では、ベクターはレポーター遺伝子または選択マーカーを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはマウスＩＴＧＢ３エクソン３を標的とし、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型はＧＰＩＩＩａ Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄ変異をコードする。いくつかの実施形態では、マウスＩＴＧＢ３エクソン３を標的とするｇＲＮＡは、配列５’－ＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧ－３’（配列番号１）を有する。いくつかの実施形態では、ＧＰＩＩＩａ Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３ＬおよびＮ３９Ｄ変異をコードするｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型は、配列５’－ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＧＣ－３’（配列番号４）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型は、診断制限部位を導入するサイレント変異をコードする。いくつかの実施形態では、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型は、目的の標的遺伝子に対するサイレント変異をコードして、得られた変異遺伝子のＣａｓ９による反復消化をサイレンシングする。
【0037】
マウスＩＴＧＢ３遺伝子配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１６４１６およびＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ＿００００７７．６として入手可能である。ＩＴＧＢ３におけるＡ３０、Ｐ３２、Ｌ３３、Ｄ３９およびＱ４７０変異に対応するゲノムのヌクレオチド変異を図２Ｂおよび図６Ｂに概説する。
【0038】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはＩＴＧＢ３エクソン１０を標的とし、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型はＧＰＩＩＩａ Ｍ４７０Ｑ変異をコードする。いくつかの実施形態では、マウスＩＴＧＢ３エクソン１０を標的とするｇＲＮＡは、配列５’－ＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡ－３’（配列番号７）を有する。いくつかの実施形態では、ＧＰＩＩＩａ Ｍ４７０Ｑ変異をコードするｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型は、配列５’－ＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＴＧＣＧＡＧＴＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡ－３’（配列番号８）を有する。いくつかの実施形態では、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型は、診断制限部位を導入するサイレント変異をコードする。いくつかの実施形態では、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型は、目的の標的遺伝子に対するサイレント変異をコードして、得られた変異遺伝子のＣａｓ９による反復消化をサイレンシングする。
【0039】
トランスジェニック初代動物は、ＧＰＩＩＩａにおけるＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異の存在に基づいて同定することができる。変異の存在は、例えば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の目的の領域のＰＣＲ増幅または配列決定によって直接検出され得る。次いで、トランスジェニック初代動物を使用して、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、ＧＰＩＩＩａにＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異を有するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物とさらに交配することができる。
【0040】
本明細書に記載のトランスジェニック動物、ならびにそれに由来する細胞および組織は、変異体ＧＰＩＩＩａに結合することができる因子、例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗ＨＰＡ－１ａ抗体またはそのフラグメントの同定および研究に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のトランスジェニック動物を使用して、例えば、血小板数、血小板濃度、出血、または試験因子の薬物動態を監視することによって、ＲＰＴ、ＰＴＰ、またはＦＮＡＩＴの治療または予防に有用な試験因子を特徴付けることができる。
【0041】
スクリーニング方法
本発明は、インビトロおよびインビボスクリーニング方法を提供する。一実施形態は、変異体糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）に特異的に結合することができる分子を同定する、インビトロ方法である。この実施形態の一態様では、候補分子を、変異体ＧＰＩＩＩａをコードする核酸をゲノムが含むトランスジェニックマウス由来の血小板と接触させ、変異体ＧＰＩＩＩａは、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む。候補分子がトランスジェニックマウス由来の血小板に結合するが、野生型マウスまたは変異体ＧＰＩＩＩａを含まないマウス由来の血小板には結合しない場合、候補分子は変異体ＧＰＩＩＩａに特異的に結合するとみなすことができる。
本発明は、インビトロおよびインビボスクリーニング方法を提供する。一実施形態は、変異体糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）に特異的に結合することができる分子を同定する、インビトロ方法である。この実施形態の一態様では、候補分子を、変異体ＧＰＩＩＩａをコードする核酸をゲノムが含むトランスジェニックマウス由来の血小板と接触させ、変異体ＧＰＩＩＩａは、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む。候補分子がトランスジェニックマウス由来の血小板に結合するが、野生型マウスまたは変異体ＧＰＩＩＩａを含まないマウス由来の血小板には結合しない場合、候補分子は変異体ＧＰＩＩＩａに特異的に結合するとみなすことができる。
【0042】
血小板結合は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、バイオレイヤー干渉法および表面プラズモン共鳴を含む公知の方法によって定性的または定量的に測定することができる。
【0043】
別のインビトロ方法は、本発明の変異体ＧＰＩＩＩａへの結合について抗ＨＰＡ－１ａ抗体と競合することができる分子を同定することができる。一実施形態では、方法は、（ａ）基質上に固定化された変異体ＧＰＩＩＩａを、標識を含む抗ＨＰＡ－１ａ抗体と接触させてＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を形成すること；（ｂ）ＧＰＩＩＩａ－抗体複合体を溶液中の候補分子と接触させること；（ｃ）基質上または溶液中の標識の量を検出することによって、抗ＨＰＡ－１ａ抗体の変異体ＧＰＩＩＩａへの結合について候補分子が競合するかどうかを決定すること、を含む。候補分子は、変異体ＧＰＩＩＩａに結合すること、および抗体の結合を妨げることによって抗体と競合する。このアッセイにおける陽性結果は、候補分子のＧＰＩＩＩａへの結合部位が、抗体が結合するＧＰＩＩＩａ上のエピトープと重なるか、またはそれを含むことを示す。特定の実施形態では、変異体ＧＰＩＩＩａは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0044】
「標識」は、標識された分子を生成するために、分子に直接的または間接的にコンジュゲートすることができる検出可能な化合物である。標識は、それ自体で検出可能であり得るか（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または間接的に、例えば、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒することによって（例えば、酵素標識）、または他の間接的検出手段によって（例えば、ビオチン化）検出され得る。一実施形態では、標識は、フルオロフォア、放射性同位体、化学発光プローブおよび生物発光プローブからなる群より選択される。
【0045】
候補分子による抗ＨＰＡ－１ａ抗体結合の防止（すなわち、競合）は、標識の有無を検出することによって決定することができる。例えば、方法がクロマトグラフィーを介して行われる場合、溶出液中の標識の存在は、変異体ＧＰＩＩＩａへの結合についての候補分子による競合を示す。標識の不存在は、固定化ＧＰＩＩＩａ上の抗体の保持／結合を示す（すなわち、競合しない、または競合が制限されている）。あるいは、抗体が固定化されている基質を標識の有無について分析することができ、標識の存在は候補分子による競合が制限されていることまたは競合がないことを示し、標識の不存在は候補分子がＧＰＩＩＩａに結合し、抗体の結合を妨げたことを示す（すなわち、競合する）。Ｉ
【0046】
特定の実施形態では、ＨＰＡ－１ａ抗体は、ＰＳＩＢ１、ＳＺ２１、および２６．４からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗ＨＰＡ－１ａ抗体は２６．４である。
【0047】
変異体ＧＰＩＩＩａは、当技術分野で公知の任意の多孔質または非多孔質基質に固定化することができる。固定化基質の非限定的な例としては、ビーズ、樹脂、粒子、膜およびゲルが挙げられる。基質は、アガロース、アルギネート、ガラス、および磁性材料を含む、様々な材料で構成することができる。固定化は、吸着、親和性タグ結合、または共有結合などの任意の既知の方法を使用して達成することができる。
【0048】
本発明によって提供されるインビボ方法の中には、雌マウスにおいて抗ＨＰＡ－１ａ同種免疫応答を予防することができる分子を同定する方法がある。一実施形態では、方法は、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ抗ＨＰＡ－１ａ抗体について陰性である試験マウスに候補分子を投与すること、および試験マウスにおいて抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価を測定することを含む。候補分子は、試験マウスにおける抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価が、分娩時、産後１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間および／または１０週間で検出不能であれば、抗ＨＰＡ－１ａ同種免疫応答を予防することができる。
【0049】
本発明はさらに、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が妊娠マウスの胎盤を通過するのを阻害することができる分子を同定するインビボ方法を提供する。一実施形態では、方法は、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ妊娠前に、（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された試験マウスに候補分子を投与すること、および胎児または新生児の抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価を測定することを含む。試験マウスの子における胎児または新生児の抗体力価が対照マウスの子における胎児または新生児の抗体力価よりも低い場合、候補分子は、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が妊娠マウスの胎盤を通過するのを阻害することができる。
【0050】
さらに、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が胎児または新生児血小板に結合するのを阻害することができる分子を同定するインビボ方法を提供する。一実施形態では、方法は、野生型血小板膜糖タンパク質ＩＩＩａ（ＧＰＩＩＩａ）と、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａとについてヘテロ接合性である子を妊娠しており、かつ妊娠前に、（ｉ）本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来の血小板または（ｉｉ）配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化された試験マウスに候補分子を投与すること、および胎児または新生児の血小板数を測定することを含む。試験マウスの子における胎児または新生児血小板数が対照マウスの子における胎児または新生児血小板数よりも多い場合、候補分子は、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体が胎児または新生児血小板に結合するのを阻害することができる。
【0051】
本明細書で使用される場合、「対照マウス」は、対照マウスが候補分子で処置されていないことを除いて、比較されている試験マウスと同じ条件を含み、同じ方法および同じ時間枠で評価されるマウスである。例えば、試験マウスを妊娠前に本発明のトランスジェニックマウス由来の血小板または本発明の変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化した場合、対照マウスを同じ条件下で予備免疫した。同様に、試験マウスが野生型ＧＰＩＩＩａ、ならびに配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａについてヘテロ接合性である子を妊娠している本発明の方法では、対照マウスは、同様のヘテロ接合性の子を妊娠している。特定のパラメータが測定され、かつ／または結果が試験マウスと対照マウスとの間で比較される場合、測定または評価は、同じ条件下で同じ技術／アッセイを使用して行われる。ヘテロ接合性の子の妊娠を達成するために、野生型雌マウスを本発明のトランスジェニック雄マウスと交配する。
【0052】
本発明の方法に従って、多種多様な候補分子をスクリーニングすることができる。本明細書で使用される場合、「候補分子」は、任意の化学化合物であり得る。高分子、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質複合体、糖タンパク質、抗体、オリゴヌクレオチドおよび核酸、ならびに小分子、例えばアミノ酸、ヌクレオチド、有機化合物、無機化合物および有機金属化合物は、候補化合物の例である。候補分子は、天然に存在し得るか、合成され得るか、または天然成分と合成成分の両方を含み得る。
【0053】
本発明の方法において使用またはスクリーニングするための抗体には、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントが含まれ得る。抗原結合フラグメントには、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２が含まれる。前述の抗体および抗原結合フラグメントのそれぞれの一本鎖形態も含まれる。
【0054】
いくつかの実施形態では、候補分子は、ライブラリー、例えば無機または有機化学ライブラリー、ペプチドライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリー、抗体ライブラリー、または混合分子ライブラリーのメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、方法は、小分子、例えば天然産物またはコンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーをスクリーニングすることを含む。
【0055】
候補分子がライブラリー、例えば抗体またはその抗原結合フラグメントを含むライブラリーの一部である場合、本発明の変異体ＧＰＩＩＩａは、エピトープビニングアッセイで使用することができる。エピトープビニングは、標的抗原、例えば、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に対するモノクローナル抗体のライブラリーを特徴付け、選別するために使用され得る競合的イムノアッセイである。類似の標的に対する抗体を、ライブラリー中の他のすべての抗体に対してペアワイズ方式で試験して、抗体が抗原のエピトープへの結合を互いにブロッキングするかどうかを決定する。各抗体の競合的ブロッキングプロファイルは、ライブラリー中の他のすべての抗体に対して作成される。密接に関連するビニングプロファイルは、抗体が同じまたは密接に関連するエピトープを有し、一緒に「ビニング」されることを示す。（例えば、Ｂｒｏｏｋｓ Ｂ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１０９－１１２（２０１４）；Ｅｓｔｅｐ Ｐ．ｅｔ ａｌ．、ＭＡｂｓ ５：２７０－２７８（２０１３）を参照されたい。）エピトープビニングは、当技術分野ではエピトープマッピングまたはエピトープ特性決定とも呼ばれる。
【0056】
候補分子は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、経口、非経口、吸入、または局所経路のいずれかによって投与することができる。非経口投与には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、および膣内投与が含まれる。経口剤形としては、例えば、固体製剤、液体製剤および懸濁製剤が挙げられる。経口胃管栄養法は、経口投与の好ましい形態である。経鼻エアロゾル剤または吸入剤形は、例えば、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。候補分子は、緩衝剤（例えばアセテート、ホスフェートまたはシトレート緩衝液）、場合により界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えばヒトアルブミン）などを含む組成物で投与することができる。担体または希釈剤の形態および特徴は、組み合わせる有効成分の量、投与経路および他の周知の変数によって指図することができる。当業者は、候補分子の構造および性質に応じて、適切な経路および剤形を容易に決定することができる。候補分子の投与量は、当業者によって経験的に決定することができる。
【0057】
本発明の方法に応じて、候補分子は、妊娠前、妊娠中および産後の時点で１回または複数回投与することができる。例えば、候補分子は、交配前の１～１４日の間、交配後１～２４日の間、および／または産後１～２８日の間の１回または複数回投与することができる。一実施形態では、候補分子は、交配後１０日目および１７日目に投与される。当業者は、候補分子およびスクリーニングされている特定の効果に応じて、投与スケジュールを経験的に決定することができる。
【0058】
本発明のいくつかの方法では、雌マウスを妊娠前に変異体ＧＰＩＩＩａで免疫化して、抗ＨＰＡ－１ａ抗体の産生を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫化は、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａを発現するトランスジェニックマウス由来の血小板の投与を含む。いくつかの実施形態では、免疫化は、例えば、配列番号２５に関して変異Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑを含む変異体ＧＰＩＩＩａの投与を含む。投与は、既知の方法を介して、好ましくは注射によって行われる。免疫化は、例えば、交配前、マウスの妊娠期間中または子の誕生後の１～１４日の間の１回または複数回行うことができる。いくつかの実施形態では、予備免疫化は、交配の１～１４日前に１回または複数回行われる。
【0059】
本発明の特定の方法では、母体、胎児および／または新生児の抗ＨＰＡ－１ａ抗体力価が測定される。抗体力価は、成体マウス、新生児マウス、または胎児マウスからの試料で測定することができる。抗体力価は、化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ラテラルフローアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを含む公知の方法によって測定することができる。例えば、抗体力価は、ビーズ、マイクロウェルプレートまたは微粒子などの表面上に標識を含む適切な抗原、例えばＨＰＡ－１ａをコーティングし、抗原を分析される試料と反応させ、次いで標識の強度を測定することによって測定することができる。間接的イムノアッセイも使用することができる。一実施形態では、抗体力価は、単一抗原ビーズアッセイを用いて測定される。一実施形態では、抗体力価は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として表される。
【0060】
抗体力価は、スクリーニングアッセイに応じて、１つ以上の時点で評価することができる。例えば、抗体力価は、雌マウスにおいて交配前の１～１４日の間、交配後１～２４日の間、および／または産後１～２８日の間に測定することができる。新生児の抗体力価は、例えば、分娩直後、分娩の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２時間後、ならびに／または分娩の１、２、３、４、５、および／もしくは６日後、ならびに／または分娩の１、２、３、および／もしくは４日後に測定することができる。胎児の抗体力価は、例えば妊娠１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および／または２２日目に測定することができる。いくつかの実施形態では、抗体力価は、候補分子を母親に投与してから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２４、３０、３６、４２および／もしくは４８時間後、ならびに／または１、２、３、４、５および／もしくは６日後、ならびに／または１、２、３もしくは４週間後に、成体、新生児または胎児マウスで測定される。
【0061】
本発明のいくつかの方法では、胎児または新生児血小板数を、解剖した胎児または新生児から採取した血液中で測定する。血小板数は、血球計を使用して手動で計算することができ、または例えば、光学的光散乱／蛍光分析、フローサイトメトリーもしくはインピーダンス分析を使用する自動化された方法によって測定することができる。血小板数は、スクリーニングアッセイに応じて、１つ以上の時点で決定することができる。例えば、新生児の血小板数は、分娩直後、分娩の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２時間後、ならびに／または分娩の１、２、３、４、５、および／もしくは６日後、ならびに／または分娩の１、２、３、および／もしくは４日後に測定することができる。胎児の血小板数は、例えば妊娠１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１および／または２２日目に測定することができる。いくつかの実施形態では、血小板数は、候補分子を母親に投与してから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２４、３０、３６、４２および／もしくは４８時間後、ならびに／または１、２、３、４、５および／もしくは６日後、ならびに／または１、２、３もしくは４週間後に、胎児または新生児で測定される。
【0062】
本発明のいくつかの態様では、胎児または新生児において出血を評価する。本明細書で使用される「出血」は、胎児または新生児の体腔、四肢、または頭蓋内への血液の貯留を意味する。一実施形態では、出血は頭蓋内出血である。出血は、解剖された胎児または新生児において視覚的に評価することができる。
【0063】
当業者は、評価スケジュールを決定することができ、例えば抗体力価、血小板数、出血などの測定を、候補分子およびそれがスクリーニングされている特定の効果に応じて経験的に決定することができる。
【0064】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味を制御すると理解されるべきである。
【0065】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては文書全体を包含し得る。さらに、本明細書で引用または言及される任意の製品の製造業者の説明書またはカタログは、参照により組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる文献、またはその中の任意の教示は、本発明の実施に使用することができる。参照により本明細書に組み込まれる文献は、先行技術であるとは認められない。
【0066】
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも１つの」を意味すると理解されるべきである。
【0067】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じ様式で、すなわちそのように結合された要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。「および／または」節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定される要素に関連するか否かにかかわらず、他の要素が任意選択的に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド用語と組み合わせて使用される場合、一実施形態ではＡのみ（Ｂ以外の要素を任意選択的に含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）、等を指すことができる。
【0068】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意選択的に、追加の列挙されていない項目も含む。明確にそうでないことを示された用語だけ、例えば「～のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」または「～のうちの正確に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、または特許請求の範囲で使用される場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、いくつかの要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「～のうち１つ」、「～のうちの１つのみ」、または「～のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものする。「～から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【0069】
実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉で説明されている場合はいつでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で説明されている他の類似の実施形態が含まれる。
【0070】
本明細書で使用される場合、数に関して「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、数のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の５％の範囲内に入る数を含むと一般的に解釈される。
【0071】
数値範囲は、範囲を定義する数を含み、本明細書で提供される任意の個々の値は、本明細書で提供される他の個々の値を含む範囲の終点として機能することができる。例えば、１、２、３、８、９、および１０などの値のセットは、１～１０、１～８、３～９などの数の範囲の開示でもある。同様に、開示された範囲は、その範囲に包含される各個々の値の開示である。例えば、５～１０の記載された範囲は、５、６、７、８、９、および１０の開示でもある。
【0072】
本発明は、１つまたは複数の好ましい実施形態に関して説明されており、明示的に述べられたものを除いて、多くの均等物、代替物、変形、および修正が可能であり、本発明の範囲内であることを理解されたい。
【0073】
実施例
実施例１
本明細書中に記載される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換え修復を使用したＦＮＡＩＴのマウスモデルの発生を実証する。具体的には、この実施形態は、配列番号２５に関してＧＰＩＩＩａにＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異を含むトランスジェニックマウスの発生を実証する。
実施例１
本明細書中に記載される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同組換え修復を使用したＦＮＡＩＴのマウスモデルの発生を実証する。具体的には、この実施形態は、配列番号２５に関してＧＰＩＩＩａにＴ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、Ｎ２９ＤおよびＭ４７０Ｑ変異を含むトランスジェニックマウスの発生を実証する。
【0074】
材料および方法
抗体－ヒトＧＰＩＩＩａのＬｅｕ３３対立遺伝子アイソフォームに対する特異性を有する、以下の３つの抗体をこの研究で使用した：マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＳＺ２１２０、ＦＮＡＩＴに罹患した乳児を出産した、ＨＰＡ－１ａ同種免疫化女性からの不死化Ｂ細胞に由来するヒトｍＡｂ ２６．４２１、およびＨＰＡ－１ａ同種免疫化女性からの、ファージディスプレイによって単離されたｓｃＦｖフラグメントに由来するヒト化ＩｇＧであるＢ２Ｇ１２２。ヒト母体抗ＨＰＡ－１ａ抗血清は、Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｓｔｅｒ、Ｄｒ．Ｄａｎ Ｂｏｕｇｉｅ、およびＤｒ．Ｂｒｉａｎ Ｃｕｒｔｉｓ（Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）によって提供された。ヒトおよびマウス両方のβ３インテグリンＰＳＩドメインの両方に結合し、その結合がＬｅｕ３３Ｐｒｏ多型２３の影響を受けない、マウスｍＡｂであるＰＳＩＢ１は、親切にもＤｒ．Ｈｅｙｕ Ｎｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ）から提供された。ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ上の複合体依存性エピトープを認識したが、ＨＰＡ－１ａ抗体結合を妨害しない２４ｍＡｂ ＡＰ２は、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ（Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から提供された。
抗体－ヒトＧＰＩＩＩａのＬｅｕ３３対立遺伝子アイソフォームに対する特異性を有する、以下の３つの抗体をこの研究で使用した：マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＳＺ２１２０、ＦＮＡＩＴに罹患した乳児を出産した、ＨＰＡ－１ａ同種免疫化女性からの不死化Ｂ細胞に由来するヒトｍＡｂ ２６．４２１、およびＨＰＡ－１ａ同種免疫化女性からの、ファージディスプレイによって単離されたｓｃＦｖフラグメントに由来するヒト化ＩｇＧであるＢ２Ｇ１２２。ヒト母体抗ＨＰＡ－１ａ抗血清は、Ｄｒ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａｓｔｅｒ、Ｄｒ．Ｄａｎ Ｂｏｕｇｉｅ、およびＤｒ．Ｂｒｉａｎ Ｃｕｒｔｉｓ（Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）によって提供された。ヒトおよびマウス両方のβ３インテグリンＰＳＩドメインの両方に結合し、その結合がＬｅｕ３３Ｐｒｏ多型２３の影響を受けない、マウスｍＡｂであるＰＳＩＢ１は、親切にもＤｒ．Ｈｅｙｕ Ｎｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ）から提供された。ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ上の複合体依存性エピトープを認識したが、ＨＰＡ－１ａ抗体結合を妨害しない２４ｍＡｂ ＡＰ２は、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ（Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から提供された。
【0075】
マウスＧＰＩＩＩａのＡＰＬＤヒト化形態を発現するマウスの一段階発生－ｇＲＮＡを、オフターゲット効果を最小限に抑えるためにＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を使用して設計し、５’－ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に先行するように選択した。Ｃａｓ９、およびＩＴＧＢ３エクソン３を標的とするｓｇＲＮＡ（ＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧ、配列番号１）を共発現するベクターを生成するために、一対のオリゴ（５’－ＣＡＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＡＣＡＴＣＧ－３’（配列番号２）および５’－ＡＡＡＣＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣ－３’（配列番号３））をアニーリングし、Ｃａｓ９発現プラスミドｐｘ４５９（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）のＢｂｓＩ部位にクローニングした。５’－ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＡＧＣＴＣＴＧ－ＡＴＧＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＧＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＡＧＧＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＧＣ－３’（配列番号４）の配列を有する２００ヌクレオチド長の一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）で合成した。このオリゴは、マウスβ３遺伝子のアンチセンス鎖に対応し、マウスβ３インテグリンサブユニットのＰＳＩドメインに４つのヒトアミノ酸置換を導入する５つのヌクレオチド置換を含む。ｓｓＯＤＮはまた、４つのサイレント変異を含み、そのうちの２つは診断用ＢａｍＨ１制限部位をプラスミドに導入し、そのうちの２つはＣａｓ９によるヒト化マウスβ３遺伝子の反復消化を回避するように配列を変異させる。
【0076】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスを過剰排卵させ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄と交配させ、卵管から受精卵を回収した。ｐｘ４５９プラスミド（１０ｎｇ／μｌ）およびｓｓＯＤＮ（５ｎｇ／μｌ）を受精卵母細胞の前核に注入した。注入した接合子を、アミノ酸を含む単純カリウム最適化培地（ＫＳＯＭ）中、５％ＣＯ２および９５％加湿空気中、３７°Ｃで一晩培養した。次いで、二細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管に移植した。子の尾から単離したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲおよびその後の配列分析によって遺伝子型決定した。標的遺伝子座を囲む領域を、ＧＰＩＩＩａ ｆｗ１：５’－ＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴＧＡＣ－３’（配列番号５）およびＧＰＩＩＩａ ｒｅｖ１：５’－ＣＡＣＣＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧ－ＴＧ－３’（配列番号６）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応は、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、ドイツ）を用いて行った。ＰＣＲ産物をＱｉａＱｕｉｃｋスピンカラムを用いて精製し、ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で消化し、２％アガロースゲルで分析し、配列決定してＤＮＡ二本鎖切断が忠実に修復されたことを確認した。
【0077】
マウスＧＰＩＩＩａのＡＰＬＤＱヒト化形態を発現するマウスの一段階発生－ｇＲＮＡ（ＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＴＣＡＣＡＣＡ，（配列番号７））、ｓｓＯＤＮ ５’－ＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＴＧＣＧＡＧＴＧＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡ－３’（配列番号８）、およびＣａｓ－９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９微量注入カクテルを、受精ＡＰＬＤ ＧＰＩＩＩａ卵母細胞の細胞質に注入した（図６Ａ～図６Ｄ）。微量注入から生まれたマウスを、ＰＣＲおよびその後の配列決定分析によって所望の点変異の存在についてスクリーニングした。標的遺伝子座を囲む領域を、ＧＰＩＩＩａ ｆｗ２：５’－ＧＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＧＣＣ－３’（配列番号９）およびＧＰＩＩＩａ ｒｅｖ２：５’－ＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＡＴＣＧＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号１０）を用いて増幅した。
【0078】
マウスおよびヒトＧＰＩＩＩａプラスミドへのアミノ酸置換の導入－マウスＧＰＩＩＩａをコードするｃＤＮＡ発現ベクター、ｐＣＭＶ３－マウスＩＴＧＢ３を、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｇｅｎｅ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）から購入した。Ｑｕｉｃｋ－Ｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してこのプラスミドにヌクレオチド置換を導入して、Ｔ３０→Ａ、Ｓ３２→Ｐ、Ｑ３３→Ｌ、およびＮ３９→Ｄに変換すると、ＡＰＬＤマウスＧＰＩＩＩａと呼ばれる、完全ヒト化ＰＳＩドメインを含有するマウスＧＰＩＩＩａをコードするプラスミドが得られた。これを鋳型として使用して、マウスＥＧＦ１ドメイン内のＭ４７０およびＰ４４６をコードするコドンにさらなる変異を導入して、それらをそれぞれＱ４７０およびＨ４４６にヒト化し、得られた構築物をＡＰＬＤＱ、ＡＰＬＤＨおよびＡＰＬＤＱＨと呼んだ。逆に、Ｇ４６３Ｐ４６４→ＤＱ、Ｈ４４６→Ｐ、およびＱ４７０→Ｍ変異をヒトＩＴＧＢ３発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３－ヒトＩＴＧＢ３に導入して、ヒトＥＧＦ１ドメイン内のＤ４６３Ｑ４６４、Ｐ４４６またはＭ４７０を含むヒトＧＰＩＩＩａをコードするプラスミドを作製した。これらの変異を導入するために使用されるプライマーを表１に列挙する。すべての構築物および変異をヌクレオチド配列決定によって確認した。
【0079】
【表3】
【0080】
野生型および変異αｌｌｂβ３アイソフォームの発現－ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、マウスまたはヒトＧＰＩＩＩａの野生型または変異形態をコードするプラスミドと共に、ヒトαＩＩｂをコードするプラスミドでトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、トランスフェクションの１日前に、抗生物質を含まない１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で６ウェルプレートで増殖させて、トランスフェクション時に８０～９０％の細胞密集度を得た。細胞を、２５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ中１μｇの各プラスミドおよび５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を３７°Ｃでさらに４８時間増殖させてタンパク質を発現させた。
【0081】
フローサイトメトリー－一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞への抗体結合のフローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩまたはＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してトランスフェクションの４８時間後に行った。トランスフェクションされていない細胞を陰性対照として使用した。抗体結合は、ＦＩＴＣ標識ヤギ（Ｆａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ、ＦＩＴＣ標識ヤギ（Ｆａｂ’）２抗マウスＩｇＧを適宜用いて検出した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用してデータを分析した。
【0082】
抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体によるヒトαＩＩｂβ３へのＰＡＣ－１結合の阻害－ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、野生型ヒトαＩＩｂβ３＋ＥＧＦＰでトランスフェクションした。細胞を、２．５μｇ／ｍｌのｍＡｂ ＳＺ２１、Ｂ２Ｇ１、もしくは２６．４、または正常対照、ＰＴＰもしくはＦＮＡＩＴ試料からの精製された総ＩｇＧと共に、室温で３０分間、１：５０希釈でプレインキュベートし、次いで、０．２ｍＭ Ｃａ＋２および２ｍＭ Ｍｎ＋２を含む２．５μｇ／ｍｌのＰＡＣ－１を添加した後、さらに３０分間インキュベートした。総β３表面発現を検出して結合および競合データを正規化できるように、細胞をマウスｍＡｂ、ＡＰ３で別々に染色した。ＥＧＦＰ陽性細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ（ＰＡＣ－１用）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（ＡＰ３用）で染色した後、フローサイトメトリーによって分析した。ＰＡＣ－１結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をβ３発現に対して正規化し、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体の非存在下での対照のパーセンテージとして表した。
【0083】
修正した抗原捕捉酵素結合免疫吸着アッセイ－８×１０７の洗浄ヒトまたはマウス血小板を、１：５に希釈したヒトＦＮＡＩＴ同種抗血清と室温で１時間インキュベートし、洗浄し、次いで、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含む２００μｌの氷冷溶解緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド］に溶解した。溶解物を、マウス血小板から免疫複合体を捕捉するための抗マウスＣＤ４１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、またはヒト血小板から免疫複合体を捕捉するためのｍＡｂ ＡＰ２でコーティングされたマイクロタイターウェルに添加した。結合した免疫複合体を、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して検出した。
【0084】
分子モデリングおよびドッキング－Ｂ２Ｇ１ Ｆａｂの可変領域のモデルを、Ｒｏｓｅｔｔａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ２５－２９を使用して生成した。αＩＩｂβ３３０（ＰＤＢコード：３ＦＣＳ）の結晶構造からのＰＳＩおよびＩ－ＥＧＦ１ドメインの構造を、ＣｌｕｓＰｒｏタンパク質－タンパク質ドッキングサーバ３１～３５を使用して抗体Ｂ２Ｇ１のＣＤＲループ領域にドッキングした。残基Ａ３０、Ｐ３２およびＬ３３をインテグリンβ３上のドッキング部位として定義した。「抗体モード」３６を使用して、非相補性決定領域を自動的にマスキングした。
【0085】
統計－示すデータは平均±ＳＥＭである。統計的比較は、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて行った。差をＰ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【0086】
結果
マウス血小板ＧＰＩＩＩａのＰＳＩドメインにおけるＨＰＡ－１ａエピトープの再現－図１Ａ～図１Ｂおよび図２Ａに示すように、多型アミノ酸Ｌｅｕ３３は、ＧＰＩＩＩａのＰＳＩドメインから延びる長い柔軟なループの末端に位置する。マウスＧＰＩＩＩａのＮ末端残基１～６６で構成される小さな構築物に一連のアミノ酸置換を組み込む以前の研究は、Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄのヒト化（図２Ａに概略的に示す）が、Ｉ型、ＨＰＡ－１ａ選択的ｍＡｂ、ＳＺ２１、および少なくともいくつかのヒトポリクローナル抗ＨＰＡ－１ａ同種抗血清の結合を再構成するために必要であることを実証した３７。これらのデータに基づいて、これらの４つのアミノ酸置換をコードするマウスＩＴＧＢ３遺伝子座のエクソン３に修復鋳型を導入するためのＣＲＩＳＰＲ戦略が考案された（図２Ｂ）。図２Ｂに示されるｇＲＮＡ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＡＰＬＤ ＨＤＲ鋳型をコードするプラスミド構築物（図２Ｃ）を微量注入した６０個の接合子から、１匹の雌子孫が適切に確認された遺伝子型（図２Ｄ－図２Ｆ）を示し、これをＡＰＬＤマウスに指定した。
マウス血小板ＧＰＩＩＩａのＰＳＩドメインにおけるＨＰＡ－１ａエピトープの再現－図１Ａ～図１Ｂおよび図２Ａに示すように、多型アミノ酸Ｌｅｕ３３は、ＧＰＩＩＩａのＰＳＩドメインから延びる長い柔軟なループの末端に位置する。マウスＧＰＩＩＩａのＮ末端残基１～６６で構成される小さな構築物に一連のアミノ酸置換を組み込む以前の研究は、Ｔ３０Ａ、Ｓ３２Ｐ、Ｑ３３Ｌ、およびＮ３９Ｄのヒト化（図２Ａに概略的に示す）が、Ｉ型、ＨＰＡ－１ａ選択的ｍＡｂ、ＳＺ２１、および少なくともいくつかのヒトポリクローナル抗ＨＰＡ－１ａ同種抗血清の結合を再構成するために必要であることを実証した３７。これらのデータに基づいて、これらの４つのアミノ酸置換をコードするマウスＩＴＧＢ３遺伝子座のエクソン３に修復鋳型を導入するためのＣＲＩＳＰＲ戦略が考案された（図２Ｂ）。図２Ｂに示されるｇＲＮＡ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＡＰＬＤ ＨＤＲ鋳型をコードするプラスミド構築物（図２Ｃ）を微量注入した６０個の接合子から、１匹の雌子孫が適切に確認された遺伝子型（図２Ｄ－図２Ｆ）を示し、これをＡＰＬＤマウスに指定した。
【0087】
ＧＰＩＩＩａのＥＧＦ１ドメイン内の特定のアミノ酸は、ＩＩ型ＨＰＡ－１ａ抗体の結合を支持するために必要とされる－以前の研究は、ＨＰＡ－１ａに対する免疫応答がポリクローナルかつ異質であり、いくつかの同種抗体血清は、多型アミノ酸３３に加えて、直線的に離れたＥＧＦ１ドメインのまだ特徴付けられていない領域内の不連続配列を必要とする亜集団を含むことを示している１９、３８。図３Ａに示すように、プロトタイプＩ型ＨＰＡ－１ａ特異的ｍＡｂであるＳＺ２１は、野生型ではなく、ＡＰＬＤマウスＧＰＩＩＩａ（ｍｕＧＰＩＩＩａ）に容易に結合し、マウスＰＳＩドメイン内のそのエピトープの再現が確認されている。より複雑なポリクローナルヒト母体抗ＨＰＡ－１ａ同種抗血清中に存在する可能性が高い抗体集団の結合に必要な構造的要件についてのさらなる洞察を得るために、本発明者らは、５つの異なるヒトＦＮＡＩＴ同種抗血清の、マイクロタイターウェルに固定化されたｍｕＧＰＩＩＩａ、ＡＰＬＤ ｍｕＧＰＩＩＩａまたはヒトＧＰＩＩＩａに結合する能力を調べた。図３Ｂに示すように、５つの代表的な同種抗血清のうちの３つはＡＰＬＤ ｍｕＧＰＩＩＩａと反応したが、他の２つは反応せず、これらの同種抗血清が、結合のためにヒト化ＰＳＩドメインの外側の残基を必要とする、いわゆるＩＩ型抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体１９の大部分を含有するという考えと一致した。さらなるヒト抗ＨＰＡ－１ａ同種抗血清の反応性および特異性を図７に示す。
【0088】
ＩＩ型抗ＨＰＡ－１ａ抗体の結合のための構造的要件を決定するために、本発明者らは、マウスＡＰＬＤ血小板へのプロトタイプＩＩ型抗体、ｍＡｂ ２６．４の結合を調べた。図４Ａに示すように、図３Ｂのヒト同種抗血清１および５と同様に、ｍＡｂ ２６．４は、ＡＰＬＤ ＧＰＩＩＩａを発現するマウス血小板に結合することができなかった。ＰＳＩとＥＧＦ１ドメインとの間の界面の詳細な調査（図４Ｂ）により、ヒトＧＰＩＩＩａのＥＧＦ１ドメインから伸長するループが、アミノ酸Ｑ４７０を多型残基Ｌｅｕ３３に近接させることが明らかになった。この残基は、マウスＧＰＩＩＩａにおけるメチオニンである（Ｓｅｒ４６９は両種において保存されている）。Ｑ４７０がＩＩ型抗ＨＰＡ－１ａ抗体によって認識されるエピトープの一部を形成するかどうかを決定するために、本発明者らは、マウスＥＧＦ１ドメインにおいてＭ４７０をＱに変化させる（方法を参照）ＨＤＲを導入することによって、本発明者らのＡＰＬＤマウスから始まるマウスＧＰＩＩＩａの配列をさらに改変した。ｍＡｂ２６．４はここで、本発明者らがＡＰＬＤＱマウスと命名した、この第二世代ＨＰＡ－１ａヒト化トランスジェニックマウス由来の血小板に容易に結合した（図４Ａ）。対照的に、ｍＡｂ ＳＺ２１の結合は、ＥＧＦ１ドメインのさらなるヒト化によって増強されず、エピトープが完全にＰＳＩドメイン内に含まれるＩ型抗体として分類されることと一致する。予想外にも、ＡＰＬＤＱマウス由来の血小板は、Ｂ２Ｇ１と呼ばれる、ＨＰＡ－１ａ同種免疫化女性２２からファージディスプレイによって単離されたＨＰＡ－１ａ特異的ｍＡｂと完全に非反応性であり、ポリクローナル母体抗ＨＰＡ－１ａ同種抗血清中に存在し得る抗体亜集団の特異性におけるさらなる予想外の複雑性を実証した。
【0089】
図５Ａは、ＧＰＩＩＩａのＰＳＩドメインおよびＥＧＦ１ドメインの、マウス対ヒト間のアミノ酸の違いを強調している。示されるように、多型残基３３に空間的に近いＱ４７０Ｍの相違に加えて、ＥＧＦ１では２つの種の間に６つのさらなるアミノ酸の相違がある。ＧＰＩＩＩａのＥＧＦ１ドメインおよびＰＳＩドメインとのＢ２Ｇ１の分子ドッキング分析（図５Ｂ）は、これらの７つのアミノ酸のうち、Ｈ４４６およびＱ４７０のみがＬ３３と一緒に抗体／抗原界面にあると予測されることを明らかにした。したがって、追加のＰｒｏ４４６→Ｈｉｓアミノ酸置換を有するマウスＧＰＩＩＩａのＡＰＬＤＱアイソフォームの発現は、Ｂ２Ｇ１結合を支持した。逆に、ヒトＨ４４６をプロリン残基で置換すると、Ｂ２Ｇ１結合が完全に失われたが、Ｑ４７０をメチオニン残基で置換した場合、Ｂ２Ｇ１およびｍＡｂ ２６．４の両方がヒトＧＰＩＩＩａとの反応性を失った。対照的に、ＨＰＡ－１ａ特異的抗体のいずれも、Ｇ４６３ＤおよびＰ４６４Ｑの変異によって影響されず（図５Ｃ）、抗体／抗原界面に存在しないことと一致した（図５Ｂ）。まとめると、これらのデータは、可変数の空間的に近い非多型アミノ酸が、それぞれ多型残基３３周りに集中する複数のエピトープを形成し、これが、抗ＨＰＡ－１ａ抗血清中に存在するポリクローナル抗体亜集団によって認識される標的認識部位を共に含むことを実証している。
【0090】
考察
ＨＰＡ－１ａエピトープの分子的性質を特徴付けることを目的とした初期の研究は、サイズが１７ｋＤａ３９から６６ｋＤａ４０の範囲のＧＰＩＩＩａのトリプシンまたはキモトリプシンタンパク質分解フラグメントがＨＰＡ－１ａ特異的同種抗体に結合することができることを見出した。後のＢｅｅｒおよびＣｏｌｌｅｒ４１による研究では、６６ｋＤａポリペプチドが、残基３４８～６５４を含有するより大きな５０ｋＤａフラグメント（現在はＥＧＦ１ドメインを含有することが知られている）に結合したＧＰＩＩＩａジスルフィドの１７ｋＤａアミノ末端フラグメント（現在はＰＳＩドメインを含有することが知られている）から構成されることが見出された。ＨＰＡ－１ａエピトープの形成がＧＰＩＩＩａのアミノ末端におけるＬｅｕ３３Ｐｒｏアミノ酸置換によって制御されているという発見に続いて１３、１４、この多型残基を取り囲む小さな合成ペプチドが合成されたが、ＨＰＡ－１ａ同種抗体に結合することができず４２、これはおそらく、複雑なジスルフィド結合の結び目様の構造を形成するＧＰＩＩＩａの最初の５５アミノ酸内に７つのシステイン残基が存在するので、直鎖ペプチドが畳まれて適切な三次立体配座をとることができないためである。興味深いことに、原核生物のλｇｔ２２バクテリオファージプラークで産生されたＧＰＩＩＩａの最初の６６アミノ酸（すなわち、ＰＳＩドメイン全体）から構成される幾分大きな組換えタンパク質は、ＰＴＰ患者からの４つの異なる抗ＨＰＡ－１ａ血清と反応することができ４３、それにより、ＨＰＡ－１ａエピトープを多型アミノ酸３３を取り囲むＧＰＩＩＩａのアミノ末端７ｋＤａに集中させた。
ＨＰＡ－１ａエピトープの分子的性質を特徴付けることを目的とした初期の研究は、サイズが１７ｋＤａ３９から６６ｋＤａ４０の範囲のＧＰＩＩＩａのトリプシンまたはキモトリプシンタンパク質分解フラグメントがＨＰＡ－１ａ特異的同種抗体に結合することができることを見出した。後のＢｅｅｒおよびＣｏｌｌｅｒ４１による研究では、６６ｋＤａポリペプチドが、残基３４８～６５４を含有するより大きな５０ｋＤａフラグメント（現在はＥＧＦ１ドメインを含有することが知られている）に結合したＧＰＩＩＩａジスルフィドの１７ｋＤａアミノ末端フラグメント（現在はＰＳＩドメインを含有することが知られている）から構成されることが見出された。ＨＰＡ－１ａエピトープの形成がＧＰＩＩＩａのアミノ末端におけるＬｅｕ３３Ｐｒｏアミノ酸置換によって制御されているという発見に続いて１３、１４、この多型残基を取り囲む小さな合成ペプチドが合成されたが、ＨＰＡ－１ａ同種抗体に結合することができず４２、これはおそらく、複雑なジスルフィド結合の結び目様の構造を形成するＧＰＩＩＩａの最初の５５アミノ酸内に７つのシステイン残基が存在するので、直鎖ペプチドが畳まれて適切な三次立体配座をとることができないためである。興味深いことに、原核生物のλｇｔ２２バクテリオファージプラークで産生されたＧＰＩＩＩａの最初の６６アミノ酸（すなわち、ＰＳＩドメイン全体）から構成される幾分大きな組換えタンパク質は、ＰＴＰ患者からの４つの異なる抗ＨＰＡ－１ａ血清と反応することができ４３、それにより、ＨＰＡ－１ａエピトープを多型アミノ酸３３を取り囲むＧＰＩＩＩａのアミノ末端７ｋＤａに集中させた。
【0091】
１９９０年代半ばに発表された２つの研究は、ＨＰＡ－１ａ抗体のサブセットによって認識されるＨＰＡ－１エピトープが、より複雑であり得ることを明らかにした。Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．は、部位特異的変異導入を使用して、ＰＳＩドメインをＧＰＩＩＩａのＥＧＦ１ドメインに連結するジスルフィド結合を破壊し、いくつかの抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体は良好に結合し続けたが、ほぼ３分の１が変異タンパク質との一部または全部の反応性を失ったことを見出した１９。これらの知見に基づいて、発明者らは、ＰＳＩドメインおよびＥＧＦ１ドメインに存在する不連続な線状配列への依存性に基づいて、ＨＰＡ－１ａ抗体をＩ型またはＩＩ型として分類できることを提案した。この概念は、１２１の母体抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体の約２０％が、フラグメントがＰＳＩドメインおよびＥＧＦ１ドメインの両方を含む場合に限り、ＧＰＩＩＩａの組換えフラグメントと反応することを見出したＳｔａｆｆｏｒｄおよび共同研究者ら４４の研究によって支持された。Ｈｏｎｄａおよび共同研究者ら３８は、Ｘｅｎｏｐｕｓタンパク質がヒトアミノ酸２６～３８ならびにアミノ酸２８７～４９０を含む場合にのみ、ヒトＧＰＩＩＩａ配列の様々なパッチを含むアフリカツメガエルＧＰＩＩＩａ分子から構成されるキメラタンパク質と反応するＩＩ型抗体の存在を検出した。
【0092】
抗体の観点から見たエピトープ：ＨＰＡ－１ａ抗体力価のみが臨床転帰の重症度と相関することは一貫して見出されておらず４５、４６、ＨＰＡ－１ａ特異的同種抗体をＩ型対ＩＩ型にさらに分割することは、期待に反して、診断上の利点も予後上の利点ももたらさなかった４４。しかしながら、最近、Ｓａｎｔｏｓｏおよび共同研究者らは、抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体の特定の集団が、内皮細胞上に存在する、αＩＩｂではなく、αｖインテグリンサブユニットと複合体を形成する場合に、ＧＰＩＩＩａに優先的に結合すること、およびそのような抗体はＦＮＡＩＴにおける頭蓋内出血の発症と強く関連することを報告した４７。これらの知見は、いくつかの重要な意味を有する。第１に、すべての母体ポリクローナル抗ＨＰＡ－１ａ抗血清内に常に存在する抗ＨＰＡ－１ａ抗体の異なる集団を同定し、それらを識別することが、血小板減少症およびＦＮＡＩＴの症例における出血のリスクを予測するための鍵であり得ることを、それらは強く示唆している。第２に、それらは、多型アミノ酸残基３３を取り囲む局所的立体配座の影響が、同種抗体結合のためのコア標的認識部位、およびその後のエフェクター結果の決定に大きな影響を及ぼすことを実証している。２つの異なるＩＩ型モノクローナル抗ＨＰＡ－１ａ抗体の結合が、ＧＰＩＩＩａのＥＧＦ１ドメイン内の異なるアミノ酸に対するそれらの要求によって互いから識別され得るという本発明者らの発見は（図５Ａ～図５Ｃ）、抗体／エピトープ認識が単に多型アミノ酸よりも多く関与し、おそらくは実質的に任意の同種免疫応答を含む抗体亜集団間で異なるという考えに、さらに支持を添える。特定のマウス→ヒトのアミノ酸置換を含有するマウスＧＰＩＩＩａを発現する細胞を使用して、ポリクローナル免疫応答をＨＰＡ－１ａにマッピングすることは、ＨＰＡ－１ａ特異的モノクローナル抗体の数の増加と共に、同種抗体亜集団の高分解能分析を可能にして、予測診断上の利益を提供し得る。興味深いことに、予備的研究（図８）は、Ｉ型およびＩＩ型の同種抗体集団が、血小板がそれらのリガンドと相互作用する能力に対して異なる効果を有することを示している。Ｉ型抗体は最小限の効果しか有さないが、ＩＩ型抗体は、おそらくインテグリン活性化プロセス中のＧＰＩＩＩａの伸長を抑制することによって、フィブリノーゲン模倣物であるＰＡＣ－１のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ複合体への結合を有意に遮断する４８。この点に関するさらなる研究は、計画された広範囲にわたる臨床研究の対象である。
【0093】
所与のポリクローナル血清内の個々の抗体集団が異なる表面トポグラフィ要件を有することは、それらが様々な病態生理学的効果を誘導することができる理由を説明する。組織適合性試験の世界では、細胞表面抗原の遺伝子型マッチングに加えて、分子表面上で一緒にクラスター形成する不連続な位置の残基によって寄与されるエピトープを含む、レシピエントの抗体／エピトープレパートリーの表現型決定が、移植成功の重要な予測因子であり得るという証拠が増えている４９。構造に基づくマッチングは、難治性血小板減少症患者における血小板輸血支援を改善するための戦略として既に検証されている５０、５１。したがって、多形性の違いだけでなく、同種抗体亜集団の接触面積も考慮する精密な医薬ベースの診断レジメンが、免疫応答のポリクローナル性のより正確な解析を提供するために必要とされることが可能であり、血小板減少症、出血、および頭蓋内出血のリスクをより正確に予測することを可能にする。
【0094】
ＧＰＩＩＩａにおける臨床的に重要なＬｅｕ３３Ｐｒｏ多型によって生成される応答のポリクローナル性質は複雑であり、依然として予防および治療の両方に関連する興味深い調査領域である。ＨＰＡ－１特異的抗体のポリクローナル性質、および任意の母体抗血清が、異なる角度から多型アミノ酸３３に来て、異なるトポグラフィ分布で結合し、さらなる残基の関与に起因して異なる親和性で結合する抗体を含有する可能性を考慮すると、本発明者らは、ポリクローナル母体抗体の結合を遮断し、胎児血小板の循環からのクリアランスを防ぐために、単一ではなくＨＰＡ－１特異的ｍＡｂの混合物が必要であり得ると推測する。ＥＧＦ１内の２つの残基（Ｈ４４６およびＱ４７０）がＩＩ型抗ＨＰＡ－１ａ同種抗体の結合に必要かつ十分であると同定することは、まだ特徴付けられていないＩＩ型同種抗体の結合を支持するために、ＥＧＦ１内または外部の残基が必要とされ得る可能性を排除しない。例えば、ＰＳＩドメイン内のＤ３９およびハイブリッド／ＰＳＩ界面のＲ９３は両方とも、ヒト抗ＨＰＡ－１ａ抗体の結合に影響を及ぼすことが報告されているが３７、５２、他の抗体は、インテグリンの屈曲した立体配座に特異的であり、それは、この研究に記載されるような、ＰＳＩドメインおよびＥＧＦ１ドメインの両方に対するそれらの要求に起因する可能性がある。５３ＨＰＡ－１ａ同種免疫化個体の同種抗血清内に存在する抗体亜集団の範囲が拡大していることを実証する本発明者らの原子レベル精査は、同種抗体媒介血小板破壊を阻害するための狭いエピトープ特異性を有する単一試薬の開発の課題を強調している。妊娠中または出産直後に母体循環に導入されたヒト化抗ＨＰＡ－１ａ特異的ｍＡｂの予防的送達を使用して、母体を通過した新生児血小板を除去することができ、それによって第一に同種免疫応答の発生を予防または軽減する。
【0095】
実施例２
抗ＨＰＡ－１ａ ｍＡｂの腹腔内注射は、ＡＰＬＤＱマウスにおいて重度の血小板減少症を誘発したが、野生型マウスでは誘発しなかった。さらに、ＡＰＬＤＱマウス由来の血小板は、野生型マウスに導入した場合、これらのヒト化残基によって作り出されたエピトープに特異的、かつ重要なことに限定される強力なポリクローナル免疫応答を誘発し、ＡＰＬＤＱヒト化形態のマウスＧＰＩＩＩａがマウスにおいて免疫原性であることを実証している。ＡＰＬＤＱ血小板で予備免疫し、ＡＰＬＤＱ雄マウスと交配した野生型雌マウスは、重度の血小板減少症の子を出産し、その多くは付随する出血表現型を示した（図１１および図１２Ａ～図１２Ｄ）。しかしながら、ｍＡｂ ２６．４は、マウスＡＰＬＤＱ血小板へのマウスポリクローナル抗ＡＰＬＤＱ抗体の結合を効率的に阻害する（図１３）。
抗ＨＰＡ－１ａ ｍＡｂの腹腔内注射は、ＡＰＬＤＱマウスにおいて重度の血小板減少症を誘発したが、野生型マウスでは誘発しなかった。さらに、ＡＰＬＤＱマウス由来の血小板は、野生型マウスに導入した場合、これらのヒト化残基によって作り出されたエピトープに特異的、かつ重要なことに限定される強力なポリクローナル免疫応答を誘発し、ＡＰＬＤＱヒト化形態のマウスＧＰＩＩＩａがマウスにおいて免疫原性であることを実証している。ＡＰＬＤＱ血小板で予備免疫し、ＡＰＬＤＱ雄マウスと交配した野生型雌マウスは、重度の血小板減少症の子を出産し、その多くは付随する出血表現型を示した（図１１および図１２Ａ～図１２Ｄ）。しかしながら、ｍＡｂ ２６．４は、マウスＡＰＬＤＱ血小板へのマウスポリクローナル抗ＡＰＬＤＱ抗体の結合を効率的に阻害する（図１３）。
【0096】
ＩＶＩＧ（静脈内免疫グロブリン）は、バッチあたり１０００～１５，０００人の健康なドナーのプール血漿から得られる高度に精製されたグロブリン調製物である。ＩＶＩＧは、自然免疫細胞および適応免疫細胞を含む、複数のレベルの細胞免疫区画を標的とする。ＩＶＩＧは、主に活性化かつ阻害性ＦｃγＲを介して、樹状細胞、マクロファージおよび顆粒球と相互作用する。ＦＮＡＩＴの治療のためのＩＶＩＧの最初の母体注入が１９８８年に報告され（Ｂｕｓｓｅｌ ＪＢ、ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９８８；３１９（２１）：１３７４－８）、その後、ＩＶＩＧは、ＦＮＡＩＴ用の標準的な出生前治療戦略としての根拠を急速に得た。最近の系統的な総説は、コルチコステロイドの添加の有無にかかわらず、週１回のＩＶＩＧ投与がＦＮＡＩＴにおけるファーストライン出生前治療であり、乳児におけるＦＮＡＩＴの影響を軽減または緩和し、血小板減少症の重症度を軽減するのに役立つことを示唆している（Ｄｉａｎ Ｗｉｎｋｅｌｈｏｒｓｔ，ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ．２０１７；１２９（１１）：１５３８－１５４７）。
【0097】
妊娠中の雌マウスに静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）またはｍＡｂ ２６．４を交配後１０および１７日目に投与すると、母体循環と胎児循環の両方で抗ＡＰＬＤＱ同種抗体の濃度が低下し、重要なことに、子の血小板数が正常化した（図１４および図１５）。まとめると、これらのデータは、臨床的に重要なＦＮＡＩＴの特徴の多くを再現する、ＦＮＡＩＴの新規なマウスモデルを確立する。
【0098】
References
1. Newman PJ, McFarland JG, Aster RH. The Alloimmune Thrombocytopenias. In: Loscalzo J, Schafer AI, eds. Thrombosis and Hemorrhage: Lippincott Williams and Wilkins; 2003:441-456.
2. Williamson LM, Hackett G, Rennie J, et al. The natural history of fetomaternal alloimmunization to the platelet- specific antigen HPA-1a (PlA1, Zwa) as determined by antenatal screening. Blood. 1998;92(7):2280-2287.
3. Kjeldsen-Kragh J, Killie MK, Tomter G, et al. A screening and intervention program aimed to reduce mortality and serious morbidity associated with severe neonatal alloimmune thrombocytopenia. Blood. 2007;110(3):833-839.
4. Bussel J. Diagnosis and management of the fetus and neonate with alloimmune thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 2009;7 Suppl 1:253-257.
5. Giovangrandi Y, Daffos F, Kaplan C, Forestier F, Mac AJ, Moirot M. Very early intracranial haemorrhage in alloimmune fetal thrombocytopenia. Lancet. 1990;336(8710):310.
6. Mueller-Eckhardt C, Kiefel V, Grubert A, et al. 348 cases of suspected neonatal alloimmune thrombocytopenia. Lancet. 1989;1:363-366.
7. Bonacossa IA, Jocelyn LJ. Alloimmune thrombocytopenia of the newborn: neurodevelopmental sequelae. Am J Perinatol. 1996;13(4):211-215.
8. Dreyfus M, Kaplan C, Verdy E, Schlegel N, Durand-Zaleski I, Tchernia G. Frequency of immune thrombocytopenia in newborns: a prospective study. Immune Thrombocytopenia Working Group. Blood. 1997;89(12):4402-4406.
9. Spencer JA, Burrows RF. Feto-maternal alloimmune thrombocytopenia: a literature review and statistical analysis. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2001;41(1):45-55.
10. Turner ML, Bessos H, Fagge T, et al. Prospective epidemiologic study of the outcome and cost-effectiveness of antenatal screening to detect neonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-HPA-1a. Transfusion. 2005;45(12):1945-1956.
11. Curtis BR, McFarland JG. Human platelet antigens - 2013. Vox Sang. 2014;106(2):93-102.
12. Davoren A, Curtis BR, Aster RH, McFarland JG. Human platelet antigen-specific alloantibodies implicated in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion. 2004;44(8):1220-1225.
13. Newman PJ, Derbes RS, Aster RH. The human platelet alloantigens, PlA1 and PlA2, are associated with a leucine33/proline33 amino acid polymorphism in membrane glycoprotein IIIa, and are distinguishable by DNA typing. JClinInvest. 1989;83:1778-1781.
14. Goldberger A, Kolodziej M, Poncz M, Bennett JS, Newman PJ. Effect of single amino acid substitutions on the formation of the PlA and Bak alloantigenic epitopes. Blood. 1991;78:681-687.
15. Valentin N, Vergracht A, Bignon JD, et al. HLA-DRw52a is involved in alloimmunization against PlA1 antigen. HumImmunol. 1990;27:73-79.
16. Maslanka K, Yassai M, Gorski J. Molecular identification of T cells that respond in a primary bulk culture to a peptide derived from a platelet glycoprotein implicated in neonatal alloimmune thrombocytopenia. JClinInvest. 1996;98:1802-1808.
17. Ahlen MT, Husebekk A, Killie MK, Skogen B, Stuge TB. T-cell responses associated with neonatal alloimmune thrombocytopenia: isolation of HPA-1a-specific, HLA-DRB3*0101-restricted CD4+ T cells. Blood. 2009;113(16):3838-3844.
18. Xiao T, Takagi J, Coller BS, Wang JH, Springer TA. Structural basis for allostery in integrins and binding to fibrinogen-mimetic therapeutics. Nature. 2004;432(7013):59-67.
19. Valentin N, Visentin GP, Newman PJ. Involvement of the cysteine-rich domain of glycoprotein IIIa in the expression of the human platelet alloantigen, PlA1: evidence for heterogeneity in the humoral response. Blood. 1995;85(11):3028-3033.
20. Weiss EJ, Goldschmidt-Clermont PJ, Grigoryev D, Jin Y, Kickler TS, Bray PF. A monoclonal antibody (SZ21) specific for platelet GPIIIa distinguishes P1A1 from P1A2. Tissue Antigens. 1995;46(5):374-381.
21. Eksteen M, Tiller H, Averina M, et al. Characterization of a human platelet antigen-1a-specific monoclonal antibody derived from a B cell from a woman alloimmunized in pregnancy. J Immunol. 2015;194(12):5751-5760.
22. Griffin HM, Ouwehand WH. A human monoclonal antibody specific for the leucine-33 (P1A1, HPA-1a) form of platelet glycoprotein IIIa from a V gene phage display library. Blood. 1995;86(12):4430-4436.
23. Zhu G, Zhang Q, Reddy EC, et al. The integrin PSI domain has an endogenous thiol isomerase function and is a novel target for antiplatelet therapy. Blood. 2017;129(13):1840-1854.
24. Pidard D, Montgomery RR, Bennett JS, Kunicki TJ. Interaction of AP-2, a monoclonal antibody specific for the human platelet glycoprotein IIb-IIIa complex, with intact platelets. JBiolChem. 1983;258:12582-12586.
25. Sivasubramanian A, Sircar A, Chaudhury S, Gray JJ. Toward high-resolution homology modeling of antibody Fv regions and application to antibody-antigen docking. Proteins. 2009;74(2):497-514.
26. Marze NA, Lyskov S, Gray JJ. Improved prediction of antibody VL-VH orientation. Protein Eng Des Sel. 2016;29(10):409-418.
27. Weitzner BD, Gray JJ. Accurate Structure Prediction of CDR H3 Loops Enabled by a Novel Structure-Based C-Terminal Constraint. J Immunol. 2017;198(1):505-515.
28. Weitzner BD, Jeliazkov JR, Lyskov S, et al. Modeling and docking of antibody structures with Rosetta. Nat Protoc. 2017;12(2):401-416.
29. Lyskov S, Chou FC, Conchuir SO, et al. Serverification of molecular modeling applications: the Rosetta Online Server that Includes Everyone (ROSIE). PLoS One. 2013;8(5):e63906.
30. Zhu J, Luo BH, Xiao T, Zhang C, Nishida N, Springer TA. Structure of a complete integrin ectodomain in a physiologic resting state and activation and deactivation by applied forces. Mol Cell. 2008;32(6):849-861.
31. Comeau SR, Gatchell DW, Vajda S, Camacho CJ. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes. Bioinformatics. 2004;20(1):45-50.
32. Comeau SR, Gatchell DW, Vajda S, Camacho CJ. ClusPro: a fully automated algorithm for protein-protein docking. Nucleic Acids Res. 2004;32(Web Server issue):W96-99.
33. Kozakov D, Brenke R, Comeau SR, Vajda S. PIPER: an FFT-based protein docking program with pairwise potentials. Proteins. 2006;65(2):392-406.
34. Kozakov D, Beglov D, Bohnuud T, et al. How good is automated protein docking? Proteins. 2013;81(12):2159-2166.
35. Kozakov D, Hall DR, Xia B, et al. The ClusPro web server for protein-protein docking. Nat Protoc. 2017;12(2):255-278.
36. Brenke R, Hall DR, Chuang GY, et al. Application of asymmetric statistical potentials to antibody-protein docking. Bioinformatics. 2012;28(20):2608-2614.
37. Barron-Casella EA, Nebbia G, Rogers OC, King KE, Kickler TS, Casella JF. Construction of a human platelet alloantigen-1a epitope(s) within murine glycoprotein IIIa: identification of residues critical to the conformation of the antibody binding site(s). Blood. 1999;93(9):2959-2967.
38. Honda S, Honda Y, Bauer B, Ruan C, Kunicki TJ. The impact of three-dimensional structure on the expression of PlA alloantigens on human integrin beta 3. Blood. 1995;86(1):234-242.
39. Newman PJ, Martin LS, Knipp MA, Kahn RA. Studies on the nature of the human platelet alloantigen, PlA1: localization to a 17,000-dalton polypeptide. MolImmunol. 1985;22:719-729.
40. Kornecki E, Chung SY, Holt JC, Cierniewski CS, Tuszynski GP, Niewiarowski S. Identification of PlAl alloantigen domain on a 66 kDa protein derived from glycoprotein IIIa of human platelets. BiochimBiophysActa. 1985;818(3):285-290.
41. Beer J, Coller BS. Evidence that platelet glycoprotein IIIa has a large disulfide- bonded loop that is susceptible to proteolytic cleavage. JBiolChem. 1989;264:17564-17573.
42. Flug F, Espinola R, Liu LX, et al. A 13-mer peptide straddling the leucine33/proline33 polymorphism in glycoprotein IIIa does not define the PlA1 epitope. Blood. 1991;77:1964-1969.
43. Bowditch RD, Tani PH, Halloran CE, Frelinger AL, III, McMillan R, Ginsberg MH. Localization of a PlA1 epitope to the amino terminal 66 residues of platelet glycoprotein IIIa. Blood. 1992;79:559-562.
44. Stafford P, Ghevaert C, Campbell K, et al. Immunologic and structural analysis of eight novel domain-deletion beta3 integrin peptides designed for detection of HPA-1 antibodies. J Thromb Haemost. 2008;6(2):366-375.
45. Ghevaert C, Campbell K, Stafford P, et al. HPA-1a antibody potency and bioactivity do not predict severity of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion. 2007;47(7):1296-1305.
46. Killie MK, Husebekk A, Kaplan C, Taaning E, Skogen B. Maternal human platelet antigen-1a antibody level correlates with the platelet count in the newborns: a retrospective study. Transfusion. 2007;47(1):55-58.
47. Santoso S, Wihadmadyatami H, Bakchoul T, et al. Antiendothelial alphavbeta3 Antibodies Are a Major Cause of Intracranial Bleeding in Fetal/Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016;36(8):1517-1524.
48. Zhou D, Thinn AMM, Zhao Y, Wang Z, Zhu J. Structure of an extended beta3 integrin. Blood. 2018;132(9):962-972.
49. Duquesnoy RJ. The eplet load concept in clinical transplantation. Pediatr Transplant. 2016;20(7):884-885.
50. Duquesnoy RJ. Structural epitope matching for HLA-alloimmunized thrombocytopenic patients: a new strategy to provide more effective platelet transfusion support? Transfusion. 2008;48(2):221-227.
51. Brooks EG, MacPherson BR, Fung MK. Validation of HLAMatchmaker algorithm in identifying acceptable HLA mismatches for thrombocytopenic patients refractory to platelet transfusions. Transfusion. 2008;48(10):2159-2166.
52. Watkins NA, Schaffner-Reckinger E, Allen DL, et al. HPA-1a phenotype-genotype discrepancy reveals a naturally occurring Arg93Gln substitution in the platelet beta 3 integrin that disrupts the HPA-1a epitope. Blood. 2002;99(5):1833-1839.
53. Thinn AMM, Wang Z, Zhou D, Zhao Y, Curtis BR, Zhu J. Autonomous conformational regulation of beta3 integrin and the conformation-dependent property of HPA-1a alloantibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018.
54. Hod E1, Schwartz J., Platelet transfusion refractoriness. Br J Haematol. 2008 Jul;142(3):348-60. Epub 2008 May 28.
1. Newman PJ, McFarland JG, Aster RH. The Alloimmune Thrombocytopenias. In: Loscalzo J, Schafer AI, eds. Thrombosis and Hemorrhage: Lippincott Williams and Wilkins; 2003:441-456.
2. Williamson LM, Hackett G, Rennie J, et al. The natural history of fetomaternal alloimmunization to the platelet- specific antigen HPA-1a (PlA1, Zwa) as determined by antenatal screening. Blood. 1998;92(7):2280-2287.
3. Kjeldsen-Kragh J, Killie MK, Tomter G, et al. A screening and intervention program aimed to reduce mortality and serious morbidity associated with severe neonatal alloimmune thrombocytopenia. Blood. 2007;110(3):833-839.
4. Bussel J. Diagnosis and management of the fetus and neonate with alloimmune thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 2009;7 Suppl 1:253-257.
5. Giovangrandi Y, Daffos F, Kaplan C, Forestier F, Mac AJ, Moirot M. Very early intracranial haemorrhage in alloimmune fetal thrombocytopenia. Lancet. 1990;336(8710):310.
6. Mueller-Eckhardt C, Kiefel V, Grubert A, et al. 348 cases of suspected neonatal alloimmune thrombocytopenia. Lancet. 1989;1:363-366.
7. Bonacossa IA, Jocelyn LJ. Alloimmune thrombocytopenia of the newborn: neurodevelopmental sequelae. Am J Perinatol. 1996;13(4):211-215.
8. Dreyfus M, Kaplan C, Verdy E, Schlegel N, Durand-Zaleski I, Tchernia G. Frequency of immune thrombocytopenia in newborns: a prospective study. Immune Thrombocytopenia Working Group. Blood. 1997;89(12):4402-4406.
9. Spencer JA, Burrows RF. Feto-maternal alloimmune thrombocytopenia: a literature review and statistical analysis. Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2001;41(1):45-55.
10. Turner ML, Bessos H, Fagge T, et al. Prospective epidemiologic study of the outcome and cost-effectiveness of antenatal screening to detect neonatal alloimmune thrombocytopenia due to anti-HPA-1a. Transfusion. 2005;45(12):1945-1956.
11. Curtis BR, McFarland JG. Human platelet antigens - 2013. Vox Sang. 2014;106(2):93-102.
12. Davoren A, Curtis BR, Aster RH, McFarland JG. Human platelet antigen-specific alloantibodies implicated in 1162 cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion. 2004;44(8):1220-1225.
13. Newman PJ, Derbes RS, Aster RH. The human platelet alloantigens, PlA1 and PlA2, are associated with a leucine33/proline33 amino acid polymorphism in membrane glycoprotein IIIa, and are distinguishable by DNA typing. JClinInvest. 1989;83:1778-1781.
14. Goldberger A, Kolodziej M, Poncz M, Bennett JS, Newman PJ. Effect of single amino acid substitutions on the formation of the PlA and Bak alloantigenic epitopes. Blood. 1991;78:681-687.
15. Valentin N, Vergracht A, Bignon JD, et al. HLA-DRw52a is involved in alloimmunization against PlA1 antigen. HumImmunol. 1990;27:73-79.
16. Maslanka K, Yassai M, Gorski J. Molecular identification of T cells that respond in a primary bulk culture to a peptide derived from a platelet glycoprotein implicated in neonatal alloimmune thrombocytopenia. JClinInvest. 1996;98:1802-1808.
17. Ahlen MT, Husebekk A, Killie MK, Skogen B, Stuge TB. T-cell responses associated with neonatal alloimmune thrombocytopenia: isolation of HPA-1a-specific, HLA-DRB3*0101-restricted CD4+ T cells. Blood. 2009;113(16):3838-3844.
18. Xiao T, Takagi J, Coller BS, Wang JH, Springer TA. Structural basis for allostery in integrins and binding to fibrinogen-mimetic therapeutics. Nature. 2004;432(7013):59-67.
19. Valentin N, Visentin GP, Newman PJ. Involvement of the cysteine-rich domain of glycoprotein IIIa in the expression of the human platelet alloantigen, PlA1: evidence for heterogeneity in the humoral response. Blood. 1995;85(11):3028-3033.
20. Weiss EJ, Goldschmidt-Clermont PJ, Grigoryev D, Jin Y, Kickler TS, Bray PF. A monoclonal antibody (SZ21) specific for platelet GPIIIa distinguishes P1A1 from P1A2. Tissue Antigens. 1995;46(5):374-381.
21. Eksteen M, Tiller H, Averina M, et al. Characterization of a human platelet antigen-1a-specific monoclonal antibody derived from a B cell from a woman alloimmunized in pregnancy. J Immunol. 2015;194(12):5751-5760.
22. Griffin HM, Ouwehand WH. A human monoclonal antibody specific for the leucine-33 (P1A1, HPA-1a) form of platelet glycoprotein IIIa from a V gene phage display library. Blood. 1995;86(12):4430-4436.
23. Zhu G, Zhang Q, Reddy EC, et al. The integrin PSI domain has an endogenous thiol isomerase function and is a novel target for antiplatelet therapy. Blood. 2017;129(13):1840-1854.
24. Pidard D, Montgomery RR, Bennett JS, Kunicki TJ. Interaction of AP-2, a monoclonal antibody specific for the human platelet glycoprotein IIb-IIIa complex, with intact platelets. JBiolChem. 1983;258:12582-12586.
25. Sivasubramanian A, Sircar A, Chaudhury S, Gray JJ. Toward high-resolution homology modeling of antibody Fv regions and application to antibody-antigen docking. Proteins. 2009;74(2):497-514.
26. Marze NA, Lyskov S, Gray JJ. Improved prediction of antibody VL-VH orientation. Protein Eng Des Sel. 2016;29(10):409-418.
27. Weitzner BD, Gray JJ. Accurate Structure Prediction of CDR H3 Loops Enabled by a Novel Structure-Based C-Terminal Constraint. J Immunol. 2017;198(1):505-515.
28. Weitzner BD, Jeliazkov JR, Lyskov S, et al. Modeling and docking of antibody structures with Rosetta. Nat Protoc. 2017;12(2):401-416.
29. Lyskov S, Chou FC, Conchuir SO, et al. Serverification of molecular modeling applications: the Rosetta Online Server that Includes Everyone (ROSIE). PLoS One. 2013;8(5):e63906.
30. Zhu J, Luo BH, Xiao T, Zhang C, Nishida N, Springer TA. Structure of a complete integrin ectodomain in a physiologic resting state and activation and deactivation by applied forces. Mol Cell. 2008;32(6):849-861.
31. Comeau SR, Gatchell DW, Vajda S, Camacho CJ. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes. Bioinformatics. 2004;20(1):45-50.
32. Comeau SR, Gatchell DW, Vajda S, Camacho CJ. ClusPro: a fully automated algorithm for protein-protein docking. Nucleic Acids Res. 2004;32(Web Server issue):W96-99.
33. Kozakov D, Brenke R, Comeau SR, Vajda S. PIPER: an FFT-based protein docking program with pairwise potentials. Proteins. 2006;65(2):392-406.
34. Kozakov D, Beglov D, Bohnuud T, et al. How good is automated protein docking? Proteins. 2013;81(12):2159-2166.
35. Kozakov D, Hall DR, Xia B, et al. The ClusPro web server for protein-protein docking. Nat Protoc. 2017;12(2):255-278.
36. Brenke R, Hall DR, Chuang GY, et al. Application of asymmetric statistical potentials to antibody-protein docking. Bioinformatics. 2012;28(20):2608-2614.
37. Barron-Casella EA, Nebbia G, Rogers OC, King KE, Kickler TS, Casella JF. Construction of a human platelet alloantigen-1a epitope(s) within murine glycoprotein IIIa: identification of residues critical to the conformation of the antibody binding site(s). Blood. 1999;93(9):2959-2967.
38. Honda S, Honda Y, Bauer B, Ruan C, Kunicki TJ. The impact of three-dimensional structure on the expression of PlA alloantigens on human integrin beta 3. Blood. 1995;86(1):234-242.
39. Newman PJ, Martin LS, Knipp MA, Kahn RA. Studies on the nature of the human platelet alloantigen, PlA1: localization to a 17,000-dalton polypeptide. MolImmunol. 1985;22:719-729.
40. Kornecki E, Chung SY, Holt JC, Cierniewski CS, Tuszynski GP, Niewiarowski S. Identification of PlAl alloantigen domain on a 66 kDa protein derived from glycoprotein IIIa of human platelets. BiochimBiophysActa. 1985;818(3):285-290.
41. Beer J, Coller BS. Evidence that platelet glycoprotein IIIa has a large disulfide- bonded loop that is susceptible to proteolytic cleavage. JBiolChem. 1989;264:17564-17573.
42. Flug F, Espinola R, Liu LX, et al. A 13-mer peptide straddling the leucine33/proline33 polymorphism in glycoprotein IIIa does not define the PlA1 epitope. Blood. 1991;77:1964-1969.
43. Bowditch RD, Tani PH, Halloran CE, Frelinger AL, III, McMillan R, Ginsberg MH. Localization of a PlA1 epitope to the amino terminal 66 residues of platelet glycoprotein IIIa. Blood. 1992;79:559-562.
44. Stafford P, Ghevaert C, Campbell K, et al. Immunologic and structural analysis of eight novel domain-deletion beta3 integrin peptides designed for detection of HPA-1 antibodies. J Thromb Haemost. 2008;6(2):366-375.
45. Ghevaert C, Campbell K, Stafford P, et al. HPA-1a antibody potency and bioactivity do not predict severity of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion. 2007;47(7):1296-1305.
46. Killie MK, Husebekk A, Kaplan C, Taaning E, Skogen B. Maternal human platelet antigen-1a antibody level correlates with the platelet count in the newborns: a retrospective study. Transfusion. 2007;47(1):55-58.
47. Santoso S, Wihadmadyatami H, Bakchoul T, et al. Antiendothelial alphavbeta3 Antibodies Are a Major Cause of Intracranial Bleeding in Fetal/Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016;36(8):1517-1524.
48. Zhou D, Thinn AMM, Zhao Y, Wang Z, Zhu J. Structure of an extended beta3 integrin. Blood. 2018;132(9):962-972.
49. Duquesnoy RJ. The eplet load concept in clinical transplantation. Pediatr Transplant. 2016;20(7):884-885.
50. Duquesnoy RJ. Structural epitope matching for HLA-alloimmunized thrombocytopenic patients: a new strategy to provide more effective platelet transfusion support? Transfusion. 2008;48(2):221-227.
51. Brooks EG, MacPherson BR, Fung MK. Validation of HLAMatchmaker algorithm in identifying acceptable HLA mismatches for thrombocytopenic patients refractory to platelet transfusions. Transfusion. 2008;48(10):2159-2166.
52. Watkins NA, Schaffner-Reckinger E, Allen DL, et al. HPA-1a phenotype-genotype discrepancy reveals a naturally occurring Arg93Gln substitution in the platelet beta 3 integrin that disrupts the HPA-1a epitope. Blood. 2002;99(5):1833-1839.
53. Thinn AMM, Wang Z, Zhou D, Zhao Y, Curtis BR, Zhu J. Autonomous conformational regulation of beta3 integrin and the conformation-dependent property of HPA-1a alloantibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018.
54. Hod E1, Schwartz J., Platelet transfusion refractoriness. Br J Haematol. 2008 Jul;142(3):348-60. Epub 2008 May 28.
【図1A-1B】
【図2A-2F】
【図3A-3B】
【図4A-4B】
【図5A-5C】
【図6A-6D】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-10D】
【図11】
【図12A-12D】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】