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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-11
(54)【発明の名称】神経炎症または炎症性脳疾患の処置および予防
(51)【国際特許分類】
A61K 31/415 20060101AFI20221228BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221228BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20221228BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20221228BHJP
【ＦＩ】
A61K31/415
A61P29/00
A61P25/00
A61P25/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022526195
(86)(22)【出願日】2020-11-06
(85)【翻訳文提出日】2022-06-01
(86)【国際出願番号】 EP2020081268
(87)【国際公開番号】W WO2021089769
(87)【国際公開日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】1916234.6
(32)【優先日】2019-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2000806.6
(32)【優先日】2020-01-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2003643.0
(32)【優先日】2020-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2004315.4
(32)【優先日】2020-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520004395
【氏名又は名称】インフレイゾーム リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】クーパー，マシュー
(72)【発明者】
【氏名】オーネイル，ルーク
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC36
4C086GA13
4C086GA15
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZB11
(57)【要約】
本発明は、神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）の化合物に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）：【化1】
【請求項2】
炎症性脳疾患の処置または予防における使用のための、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項3】
前記炎症性脳疾患が、多発性硬化症である、請求項２に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項4】
前記炎症性脳疾患が、自己免疫系の無菌性髄膜炎である、請求項２に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項5】
前記炎症性脳疾患が、偏頭痛である、請求項２に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項6】
前記炎症性脳疾患の処置または予防が、神経炎症の処置または予防を含む、前記請求項２～５のいずれかに記載の使用のための化合物または塩。
【請求項7】
神経炎症の処置または予防における使用のための、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項8】
前記処置または予防が、前記化合物または前記その塩の経口投与を含む、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項9】
前記化合物または塩が、ナトリウム塩である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項10】
前記化合物または塩が、一ナトリウム塩である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項11】
前記化合物または塩が、一水和物である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項12】
前記化合物または塩が、結晶性である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項13】
前記化合物または塩が、結晶性一ナトリウム一水和物塩である、任意の前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項14】
４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する、請求項１３に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項15】
ＸＲＰＤスペクトルを有しその中の１０個の最も強いピークが４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む、請求項１３または１４に記載の使用のための化合物または塩。
【請求項16】
医薬的に許容できる賦形剤といずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩とを含む医薬組成物。
【請求項17】
経口投与に適する、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
それを必要とする患者における神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防のための方法であって、式（Ｉ）：【化2】
【請求項19】
炎症性脳疾患の処置または予防のための、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記炎症性脳疾患が、多発性硬化症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記炎症性脳疾患が、自己免疫系の無菌性髄膜炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記炎症性脳疾患が、偏頭痛である、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
前記処置または予防が、神経炎症の処置または予防を含む、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
神経炎症の処置または予防のための、請求項１８に記載の方法。
【請求項25】
前記処置または予防が、前記化合物または前記その塩の経口投与を含む、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記化合物または塩が、ナトリウム塩である、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記化合物または塩が、一ナトリウム塩である、請求項１８～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記化合物または塩が、一水和物である、請求項１８～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記化合物または塩が、結晶性である、請求項１８～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記化合物または塩が、結晶性一ナトリウム一水和物塩である、請求項１８～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記結晶性一ナトリウム一水和物塩が、４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記結晶性一ナトリウム一水和物塩が、ＸＲＰＤスペクトルを有しその中の１０個の最も強いピークが４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）：
の化合物に関する。
【化1】
【背景技術】
【0002】
炎症性脳疾患は、多発性硬化症、自己免疫系の無菌性髄膜炎、および偏頭痛を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、式（Ｉ）の化合物が血液脳関門を越えること、およびミクログリア中のＮＬＲＰ３炎症応答を阻害することに特に効果的であり、これにより神経炎症および炎症性脳疾患の効果的処置を提供する、という発見に一部基づく。最も特別には、神経炎症は、式（Ｉ）の化合物の経口投与により効果的に阻害され得る。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明の第一の態様において、神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）：
の化合物またはその医薬的に許容できる塩が提供される。
【化2】
【0005】
一実施形態において、化合物または塩は、炎症性脳疾患の処置または予防における使用のためである。一実施形態において、炎症性脳疾患は、多発性硬化症である。別の実施形態において、炎症性脳疾患は、自己免疫系の無菌髄膜炎である。別の実施形態において、炎症性脳疾患は、慢性偏頭痛などの偏頭痛である。
【0006】
化合物または塩が炎症性脳疾患の処置または予防における使用のためである、一実施形態において、処置または予防は、神経炎症の処置または予防を含む。典型的には、神経炎症の処置または予防は、ＮＬＲＰ３阻害を介して実現される。本明細書で用いられる用語「ＮＬＲＰ３阻害」は、ＮＬＲＰ３の活性レベルの完全な、または部分的な低減を指し、例えば活性ＮＬＲＰ３の阻害および／またはＮＬＲＰ３活性化の阻害を包含する。
【0007】
一実施形態において、化合物または塩は、神経炎症の処置または予防における使用のためである。典型的には、神経炎症の処置または予防は、ＮＬＲＰ３阻害を介して実現される。
【0008】
一実施形態において、処置または予防は、化合物またはその塩の経口投与を含む。さらなる実施形態において、処置または予防は、化合物またはその塩の１日１回の経口投与を含む。
【0009】
一実施形態において、化合物または塩は、一ナトリウム塩などの、ナトリウム塩である。一実施形態において、化合物または塩は、一水和物である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性一ナトリウム一水和物塩である。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、ＸＲＰＤスペクトルを有し、その中の１０個の最も強いピークは、４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む。ＸＲＰＤスペクトルは、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載された通り得られてよい。
【0010】
一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される通りである。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される多形体を有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される方法に従って調製される。
【0011】
典型的には、本発明の第一の態様の任意の実施形態により、処置または予防は、化合物またはその塩を患者に投与することを含む。患者は、任意のヒトまたは他の動物であってよい。典型的には患者は、哺乳動物、より典型的にはヒトまたはウシ、ブタ、ラム、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウスなどの家畜哺乳動物である。最も典型的には患者は、ヒトである。
【0012】
本発明の第二の態様において、医薬的に許容できる賦形剤と、本発明の第一の態様の化合物または塩とを含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、経口投与に適する。
【0013】
本発明の第三の態様において、それを必要とする患者における神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防のための方法であって、式（Ｉ）：
の化合物またはその医薬的に許容できる塩の治療的または予防的に効果的な量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法が提供される。
【化3】
【0014】
一実施形態において、方法は、炎症性脳疾患の処置または予防のための方法である。一実施形態において、炎症性脳疾患は、多発性硬化症である。別の実施形態において、炎症性脳疾患は、自己免疫系の無菌髄膜炎である。別の実施形態において、炎症性脳疾患は、慢性偏頭痛などの偏頭痛である。
【0015】
方法が炎症性脳疾患の処置または予防における使用のための方法である、一実施形態において、処置または予防は、神経炎症の処置または予防を含む。典型的には、神経炎症の処置または予防は、ＮＬＲＰ３阻害を介して実現される。
【0016】
一実施形態において、方法は、神経炎症の処置または予防のための方法である。典型的には、神経炎症の処置または予防は、ＮＬＲＰ３阻害を介して実現される。
【0017】
一実施形態において、処置または予防は、化合物またはその塩の経口投与を含む。さらなる実施形態において、処置または予防は、化合物またはその塩の１日１回の経口投与を含む。
【0018】
一実施形態において、化合物または塩は、一ナトリウム塩などの、ナトリウム塩である。一実施形態において、化合物または塩は、一水和物である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性一ナトリウム一水和物塩である。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、ＸＲＰＤスペクトルを有し、その中の１０個の最も強いピークは、４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む。ＸＲＰＤスペクトルは、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載された通り得られてよい。
【0019】
一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される通りである。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される多形体を有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される方法に従って調製される。
【0020】
本発明の第三の態様の任意の実施形態により、患者は、任意のヒトまたは他の動物であってよい。典型的には患者は、哺乳動物、より典型的にはヒトまたはウシ、ブタ、ラム、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウスなどの家畜哺乳動物である。最も典型的には患者は、ヒトである。
【0021】
実験
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】試験Ａ － １または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の健常な自由行動下の成体雄マウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物のレベル（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。
【図2】試験Ａ － １または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の健常な自由行動下の成体雄マウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物のレベル（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。
【図3A】試験Ｂ － 式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）は、初代ミクログリアにおいてＮＬＲＰ３インフラマソームを阻害することにおいてＭＣＣ９５０より高い効力を呈する。Ａ）ＮＬＲＰ３阻害剤ＭＣＣ９５０による、プライミングされたミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。ＡＴＰ（５ｍＭ）でのＭＣＣ９５０阻害のＩＣ５０は、初代マウスミクログリアでは７．５ｎＭであると決定された。
【図3B】試験Ｂ － 式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）は、初代ミクログリアにおいてＮＬＲＰ３インフラマソームを阻害することにおいてＭＣＣ９５０より高い効力を呈する。Ｂ）式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）による、プライミングされたミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。式（Ｉ）の化合物についてのＡＴＰ（５ｍＭ）での阻害のＩＣ５０は、初代マウスミクログリアでは４．７４ｎＭであると決定された。
【図4】試験Ｃ － 式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）による、プライミングされたヒトミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。式（Ｉ）の化合物についてのＡＴＰ（５ｍＭ）での阻害のＩＣ５０は、１名の健常ドナーから単離された初代ヒトミクログリアでは１４２ｎＭであると決定された。データは、ｎ＝１の健常ドナーおよびｎ＝４の技術的反復測定を表す。エラーバーはＳＥＭ。
【発明を実施するための形態】
【0023】
試験Ａ － 健常マウスにおける血液脳関門通過
目的
本試験は、経口投与後の自由行動下の成体雄マウスの左および右線条体における式（Ｉ）の化合物の遊離濃度を決定するために設計された。
目的
本試験は、経口投与後の自由行動下の成体雄マウスの左および右線条体における式（Ｉ）の化合物の遊離濃度を決定するために設計された。
【0024】
動物
成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２２～２８ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ、オランダ）を、実験に用いた。到着後に、動物を、ワイヤーメッシュの天井が付いたポリプロピレンケージ（４０×５０×２０ｃｍ）中にて５匹からなる群で、温度（２２±２℃）および湿度（５５±１５％）制御環境ならびに１２時間明周期（７：００～１９：００）で飼育した。手術後に、動物を、個別に飼育した（ケージ３０×３０×４０ｃｍ）。標準飼料（ＳＤＳ Ｄｉｅｔｓ、ＲＭ１ＰＬ）および国内品質の水道水を随意に利用できた。
成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２２～２８ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ、オランダ）を、実験に用いた。到着後に、動物を、ワイヤーメッシュの天井が付いたポリプロピレンケージ（４０×５０×２０ｃｍ）中にて５匹からなる群で、温度（２２±２℃）および湿度（５５±１５％）制御環境ならびに１２時間明周期（７：００～１９：００）で飼育した。手術後に、動物を、個別に飼育した（ケージ３０×３０×４０ｃｍ）。標準飼料（ＳＤＳ Ｄｉｅｔｓ、ＲＭ１ＰＬ）および国内品質の水道水を随意に利用できた。
【0025】
手術
マウスにイソフルランを利用して麻酔をかけた（２％および５００ｍＬ／分Ｏ２）。Ｆｉｎａｄｙｎｅ（１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）を、手術前、手術中および術後回復期間に鎮痛のために投与した。ブピバカインとエピネフリンの混合物を、切開部位の局所鎮痛に用いた。
マウスにイソフルランを利用して麻酔をかけた（２％および５００ｍＬ／分Ｏ２）。Ｆｉｎａｄｙｎｅ（１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）を、手術前、手術中および術後回復期間に鎮痛のために投与した。ブピバカインとエピネフリンの混合物を、切開部位の局所鎮痛に用いた。
【0026】
微小透析プローブの植え込み
動物を、定位固定装置（Ｋｏｐｆ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）に配置した。３ｍｍの露出したポリアクリロニトリル膜（ＭＱ－ＰＡＮ３／３）を有するＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、左および右線条体に両側性に植え込んだ（プローブのチップに関する座標：０°の角度および０．０ｍｍに設定されたインサイザーバー（ｉｎｃｉｓｏｒ ｂａｒ）でＡＰ=＋０．８ｍｍ（ブレグマまで）、ＭＬ＝±１．７ｍｍ（正中線まで）、ＤＶ＝－４．０ｍｍ（硬膜まで））。全ての座標は、Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ（２００８）による「Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｌｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」に基づいた。プローブを、ステンレス鋼製ねじおよび歯科用セメントで頭蓋骨に取り付けた。
動物を、定位固定装置（Ｋｏｐｆ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）に配置した。３ｍｍの露出したポリアクリロニトリル膜（ＭＱ－ＰＡＮ３／３）を有するＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、左および右線条体に両側性に植え込んだ（プローブのチップに関する座標：０°の角度および０．０ｍｍに設定されたインサイザーバー（ｉｎｃｉｓｏｒ ｂａｒ）でＡＰ=＋０．８ｍｍ（ブレグマまで）、ＭＬ＝±１．７ｍｍ（正中線まで）、ＤＶ＝－４．０ｍｍ（硬膜まで））。全ての座標は、Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｌｉｎ（２００８）による「Ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｌｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」に基づいた。プローブを、ステンレス鋼製ねじおよび歯科用セメントで頭蓋骨に取り付けた。
【0027】
用量配合剤
式（Ｉ）の化合物の一ナトリウム塩を、５ｍＬ／ｋｇでの経口投薬用に０．２および４ｍｇ／ｍＬ；それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ、の濃度で（非塩形態に関して）滅菌水道水中で配合した。用量配合剤を、表１に示す。各動物に投与された容量を、表２に示す。
式（Ｉ）の化合物の一ナトリウム塩を、５ｍＬ／ｋｇでの経口投薬用に０．２および４ｍｇ／ｍＬ；それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ、の濃度で（非塩形態に関して）滅菌水道水中で配合した。用量配合剤を、表１に示す。各動物に投与された容量を、表２に示す。
【表1】
【表2】
【表3】
【0028】
実験計画
ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、可撓性ＰＥＥＫチュービング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．米国；ＰＫ００５－０２０）で微小灌流ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ）に連結し、流速０．１２μＬ／分の１４７ｍＭ ＮａＣｌ、３．０ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２、および１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する人工ＣＳＦ（灌流液）のスローフロー（ｓｌｏｗ ｆｌｏｗ）と、０．８μＬ／分のＵＰ＋０．０２Ｍ ＦＡ＋０．０４％アスコルビン酸のキャリアフロー（ｃａｒｒｉｅｒ ｆｌｏｗ）で灌流した。最短で２時間の予備安定化の後、微小透析試料を、６０分間隔で収集した。２種のベースライン試料の収集後に、式（Ｉ）の化合物（滅菌水道水中の１または２０ｍｇ／ｋｇ）を、ｔ＝０分に経口投与した。具体的な微小透析試料採取スケジュールを、表３に示す。試料を、自動フラクションコレクター（ＵＶ８３０１５０１、ＴＳＥ、Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ、マルタ）を用いてミニバイアル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｅ ＡＢ、スウェーデン；４００１０２９）に収集した。実験終了時に、動物を殺処分した。
ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、可撓性ＰＥＥＫチュービング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．米国；ＰＫ００５－０２０）で微小灌流ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ）に連結し、流速０．１２μＬ／分の１４７ｍＭ ＮａＣｌ、３．０ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２、および１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する人工ＣＳＦ（灌流液）のスローフロー（ｓｌｏｗ ｆｌｏｗ）と、０．８μＬ／分のＵＰ＋０．０２Ｍ ＦＡ＋０．０４％アスコルビン酸のキャリアフロー（ｃａｒｒｉｅｒ ｆｌｏｗ）で灌流した。最短で２時間の予備安定化の後、微小透析試料を、６０分間隔で収集した。２種のベースライン試料の収集後に、式（Ｉ）の化合物（滅菌水道水中の１または２０ｍｇ／ｋｇ）を、ｔ＝０分に経口投与した。具体的な微小透析試料採取スケジュールを、表３に示す。試料を、自動フラクションコレクター（ＵＶ８３０１５０１、ＴＳＥ、Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ、マルタ）を用いてミニバイアル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｅ ＡＢ、スウェーデン；４００１０２９）に収集した。実験終了時に、動物を殺処分した。
【表4】
【0029】
生物分析
ＭｅｔａＱｕａｎｔプローブからの微小透析試料は、名目容量５５．２μＬの透析物を含有した。ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析試料中の式（Ｉ）の化合物のレベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量した。
ＭｅｔａＱｕａｎｔプローブからの微小透析試料は、名目容量５５．２μＬの透析物を含有した。ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析試料中の式（Ｉ）の化合物のレベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量した。
【0030】
透析試料を、アセトニトリルと混合し、この混合物の分割量を、自動サンプルインジェクター（ＳＩＬ－２０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本）によりＬＣシステムに注入した。較正物質およびインラン（ｉｎ－ｒｕｎ）ＱＣ試料を、微小透析試料と同じ組成の分析用透析物中で調製した。
【0031】
化合物のクロマトグラフィー分離を、溶離液Ａ（超純水＋０．１％ギ酸）中の溶離液Ｂ（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）を流速０．３ｍＬ／分で用いて、勾配溶出実行中の温度４０℃で保持された逆相カラム（１００×３．０ｍｍ、粒子径２．５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で実施した。
【0032】
ＭＳ分析を、ＡＰＩ４０００ＭＳ／ＭＳ検出器およびＴｕｒｂｏ Ｉｏｎ Ｓｐｒａｙインターフェース（両者ともＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）からなるＡＰＩ４０００ＭＳ／ＭＳシステムを用いて実施した。取得を、５．５ｋＶに設定されたイオン化スプレー電圧でのポジティブイオン化モードで実施した。プローブ温度を、５５０℃に設定した。機器を、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。
【0033】
分析物のＭＲＭトランジションを、表４に示す。適切なインラン検量線を、加重（１／ｘ）回帰を利用してフィットさせ、試料濃度を、これらの検量線を利用して決定した。正確度を、一連の各試料の後に、品質管理試料により検証した。濃度を、Ａｎａｌｙｓｔ（商標）データシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で計算した。
【表5】
【0034】
データ評価
式（Ｉ）の化合物の薬物動態データを、実験の際の希釈について修正された微小透析液中の濃度（平均＋ＳＥＭ）として表す。透析物中の式（Ｉ）の化合物の薬物動態データは、回復については修正しなかった。結果を、Ｐｒｉｓｍ５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でプロットした。
式（Ｉ）の化合物の薬物動態データを、実験の際の希釈について修正された微小透析液中の濃度（平均＋ＳＥＭ）として表す。透析物中の式（Ｉ）の化合物の薬物動態データは、回復については修正しなかった。結果を、Ｐｒｉｓｍ５ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でプロットした。
【0035】
結果
図１は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。図２は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。１ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後５時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で１２～１３ｎＭの平均ピークレベルを示した。２０ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後６時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で２０１～２４３ｎＭの平均ピークレベルを示した。
図１は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。図２は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。１ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後５時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で１２～１３ｎＭの平均ピークレベルを示した。２０ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後６時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で２０１～２４３ｎＭの平均ピークレベルを示した。
【0036】
示された通り、結果は、経口投与後に血液脳関門を越える式（Ｉ）の化合物の能力を実証する。式（Ｉ）の化合物は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化の高度に効果的な阻害剤であることが過去に実証されている（全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／１３１０９８号参照）。その上、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害は、多発性硬化症および自己免疫系の無菌性髄膜炎などの障害の処置に関連づけられている（例えば、Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２０１３， １４７（３）： ２２３－２２８； Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ， ２００４， ３： １－１０； Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２０１３， １３９： １１－１８；およびＣｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２０１５， ２１（３）： ２４８－２５５参照、全てが全体として参照により本明細書に組み入れられる）。ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害はまた、慢性偏頭痛のマウスモデルにおいて効果的であることが実証されている（全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ２０１９， １６： ７８参照）。そのため、式（Ｉ）の化合物は、多発性硬化症、自己免疫系の無菌性髄膜炎、および偏頭痛などの、神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防に効果的であろうと考えられる。
【0037】
試験Ｂ － 初代ミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害におけるＭＣＣ９５０との比較
目的
ＭＣＣ９５０は、以下の式：
を有する過去に報告されたＮＬＲＰ３阻害剤である（全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｃｏｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１５， ｖｏｌ． ２１（３）， ｐｐ．２４８－２５５参照）。
目的
ＭＣＣ９５０は、以下の式：
【化4】
【0038】
試験Ｂの狙いは、カノニカルＮＬＲＰ３活性化因子であるＡＴＰで活性化されたＬＰＳでプライミングされたミクログリアにおいて式（Ｉ）の化合物およびＭＣＣ９５０のＩＣ５０を決定することであった。
【0039】
初代ミクログリア培養物
初代ミクログリア培養物を、Ｃ５７ＢＬ／６生後１日目（Ｐ１）の子供マウスから調製し、過去に記載された通りカラムフリーの磁気分離システムにより精製した（全体として参照により本明細書に組み入れられるＧｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１１， ｖｏｌ． １９４（２）、 ｐｐ．２８７－２９６参照）。初代ミクログリアを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地(１０％熱非働化ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００μＭ非必須アミノ酸、および２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ)中で保持した。細胞をその後、５％ＣＯ２インキュベータ中にて３７℃で保持した。
初代ミクログリア培養物を、Ｃ５７ＢＬ／６生後１日目（Ｐ１）の子供マウスから調製し、過去に記載された通りカラムフリーの磁気分離システムにより精製した（全体として参照により本明細書に組み入れられるＧｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１１， ｖｏｌ． １９４（２）、 ｐｐ．２８７－２９６参照）。初代ミクログリアを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地(１０％熱非働化ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００μＭ非必須アミノ酸、および２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ)中で保持した。細胞をその後、５％ＣＯ２インキュベータ中にて３７℃で保持した。
【0040】
ＩＣ５０決定のためのＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ
マウスＩＬ－１βキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ００８）を用いて、上昇する濃度のＭＣＣ９５０および式（Ｉ）の化合物で予め処置され、ＡＴＰ ５ｍＭで１時間活性化された、ＬＰＳでプライミングされたミクログリア（２００ｎｇ／ｍｌで３時間）の上清中のＩＬ－１βレベルを測定した。
マウスＩＬ－１βキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ００８）を用いて、上昇する濃度のＭＣＣ９５０および式（Ｉ）の化合物で予め処置され、ＡＴＰ ５ｍＭで１時間活性化された、ＬＰＳでプライミングされたミクログリア（２００ｎｇ／ｍｌで３時間）の上清中のＩＬ－１βレベルを測定した。
【0041】
結果
結果を図３に示す。ＭＣＣ９５０は、７．５ｎＭのＩＣ５０を得たが（図３Ａ）、式（Ｉ）の化合物は、同様の条件下で４．７ｎＭの効力を呈した（図３Ｂ）。したがって式（Ｉ）の化合物は、初代ミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害においてＭＣＣ９５０と比較して高い効力を呈する。
結果を図３に示す。ＭＣＣ９５０は、７．５ｎＭのＩＣ５０を得たが（図３Ａ）、式（Ｉ）の化合物は、同様の条件下で４．７ｎＭの効力を呈した（図３Ｂ）。したがって式（Ｉ）の化合物は、初代ミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害においてＭＣＣ９５０と比較して高い効力を呈する。
【0042】
試験Ｃ－初代ヒトミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害
目的
カノニカルＮＬＲＰ３活性化因子であるＡＴＰで活性化されたＬＰＳでプライミングされたミクログリアにおいて式（Ｉ）の化合物のＩＣ５０を決定することである。
目的
カノニカルＮＬＲＰ３活性化因子であるＡＴＰで活性化されたＬＰＳでプライミングされたミクログリアにおいて式（Ｉ）の化合物のＩＣ５０を決定することである。
【0043】
ヒト脳試料
ヒト脳材料を、臨床的に充分に証明されかつ神経学的に確認された症例および非神経学的対照からの死後材料を供給するＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ （ＮＢＢ；オランダ アムステルダム）の迅速剖検システムを介して得た。剖検を、同意書がＮＢＢにより得られているドナーについて、実施した。１例の健常脳組織試料を、この実験で用いた。
ヒト脳材料を、臨床的に充分に証明されかつ神経学的に確認された症例および非神経学的対照からの死後材料を供給するＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ （ＮＢＢ；オランダ アムステルダム）の迅速剖検システムを介して得た。剖検を、同意書がＮＢＢにより得られているドナーについて、実施した。１例の健常脳組織試料を、この実験で用いた。
【0044】
ミクログリア単離法
ヒト成人ミクログリア細胞を、Ｂｓｉｂｓｉらにより過去に記載された通り単離および培養した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２００２， ｖｏｌ． ６１（１１）， ｐｐ．１０１３－１０２１）。手短に述べると、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ （オランダ アムステルダム）で、組織試料を皮質下白質から切り出し、培地を含む試験管中で４℃で貯蔵した。試料をその後、培地を含む試験管中でＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ ライデン)に運搬した。目視できる血管を、除去し、脳組織を、ＰＢＳで洗浄した。０．２５％トリプシン中での２０分間消化の後、細胞懸濁液を、穏やかに研和し、１０％ＦＣＳおよび抗生物質サプリメントを含有するＤＭＥＭ／ＨＡＭ－Ｆ１２培地で洗浄した。１００μｍフィルターに通した後、ミエリンを、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離により除去した。赤血球を、ＰＢＳ中の１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ３および０．２％ＢＳＡと氷上で１５分間インキュベートすることにより溶解した。次に、細胞懸濁液を、非コーティング９６ウェルプレートに４００００～１０００００細胞／ウェルの密度で播種した。ミクログリア細胞の増殖および生存を促進するために、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを、播種の際およびその後３日ごとに最終濃度２０ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。３～５日後に、培養物を、培地で洗浄して細胞片を除去し、これをアッセイ０日目と定義した。培養されたミクログリア細胞の純度を、ミクログリア同定マーカ（Ｉｂａ１）および活性化マーカ（ＣＤ４５）について免疫染色により検証した。加えて培養物を、アストロサイト（ＧＦＡＰ発現）および神経細胞（ＮｅｕＮ発現）を含む潜在的に混入する細胞集団についてチェックした。ＱＣプレートを、実験開始の同日に４％ホルムアルデヒドで固定した。
ヒト成人ミクログリア細胞を、Ｂｓｉｂｓｉらにより過去に記載された通り単離および培養した（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２００２， ｖｏｌ． ６１（１１）， ｐｐ．１０１３－１０２１）。手短に述べると、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ （オランダ アムステルダム）で、組織試料を皮質下白質から切り出し、培地を含む試験管中で４℃で貯蔵した。試料をその後、培地を含む試験管中でＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダ ライデン)に運搬した。目視できる血管を、除去し、脳組織を、ＰＢＳで洗浄した。０．２５％トリプシン中での２０分間消化の後、細胞懸濁液を、穏やかに研和し、１０％ＦＣＳおよび抗生物質サプリメントを含有するＤＭＥＭ／ＨＡＭ－Ｆ１２培地で洗浄した。１００μｍフィルターに通した後、ミエリンを、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離により除去した。赤血球を、ＰＢＳ中の１５５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ３および０．２％ＢＳＡと氷上で１５分間インキュベートすることにより溶解した。次に、細胞懸濁液を、非コーティング９６ウェルプレートに４００００～１０００００細胞／ウェルの密度で播種した。ミクログリア細胞の増殖および生存を促進するために、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを、播種の際およびその後３日ごとに最終濃度２０ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。３～５日後に、培養物を、培地で洗浄して細胞片を除去し、これをアッセイ０日目と定義した。培養されたミクログリア細胞の純度を、ミクログリア同定マーカ（Ｉｂａ１）および活性化マーカ（ＣＤ４５）について免疫染色により検証した。加えて培養物を、アストロサイト（ＧＦＡＰ発現）および神経細胞（ＮｅｕＮ発現）を含む潜在的に混入する細胞集団についてチェックした。ＱＣプレートを、実験開始の同日に４％ホルムアルデヒドで固定した。
【0045】
ＩＣ５０決定のためのＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ
０日目にミエリンおよび細胞片を、培地での洗浄により除去した。２および３日目に（Ｔ＝０時間）、培地を、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ ８０μｌ（無血清培地中で調製）と交換して、ミクログリアをプライミングした。Ｔ＝＋１．５時間に、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０６４ｎＭの式（Ｉ）の化合物（ＰＢＳ中）を添加した。３０分後に、５ｍＭ ＡＴＰ（無血清培地中の最終濃度）を、培養物に添加した。惹起後の異なる時点で、上清を、別の９６ウェルプレートに収集し、－２０℃で貯蔵した（分析される試料をＡＴＰ添加後２時間目に収集した）。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））サイトカインイムノアッセイ（Ｕ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔ）を用いて、キット（ＭＳＤ ＃ Ｋ１５１ＴＵＫ－２）と共に提供された製造業者の使用説明書に従い、各条件からの細胞上清中のＩＬ－１βの濃度を定量した。手短に述べると、ＭＳＤプレートを、振とう台の上で、Ｄｉｌｕｅｎｔ１００で希釈された捕捉抗体により室温で２時間コートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、２５μＬ／ウェルのＤｉｌｕｅｎｔ４３、ならびに２５μＬ／ウェルの未希釈試料および標準曲線濃度を、技術的に二重で添加し、振とうしながら（５００ｒｐｍ）４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、Ｄｉｌｕｅｎｔ３で希釈されたＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇコンジュゲート化検出抗体を、各ウェルに添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートをその後、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、水で１：２希釈されたＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ－Ｔ ４ｘ（界面活性剤含む）１５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートを、ＭＳＤ ｓｅｃｔｏｒ ｉｍａｇｅｒ ｍｏｄｅｌ ６０００を用いて読み取り、濃度を、ＭＳＤ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ４を用いて計算した。試料を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ６００リーダで分析し、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＷＯＲＬＢＥＮＣＨでＭＳＤプレートから作成された複合データセットを解析した。
０日目にミエリンおよび細胞片を、培地での洗浄により除去した。２および３日目に（Ｔ＝０時間）、培地を、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ ８０μｌ（無血清培地中で調製）と交換して、ミクログリアをプライミングした。Ｔ＝＋１．５時間に、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０６４ｎＭの式（Ｉ）の化合物（ＰＢＳ中）を添加した。３０分後に、５ｍＭ ＡＴＰ（無血清培地中の最終濃度）を、培養物に添加した。惹起後の異なる時点で、上清を、別の９６ウェルプレートに収集し、－２０℃で貯蔵した（分析される試料をＡＴＰ添加後２時間目に収集した）。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））サイトカインイムノアッセイ（Ｕ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｔ）を用いて、キット（ＭＳＤ ＃ Ｋ１５１ＴＵＫ－２）と共に提供された製造業者の使用説明書に従い、各条件からの細胞上清中のＩＬ－１βの濃度を定量した。手短に述べると、ＭＳＤプレートを、振とう台の上で、Ｄｉｌｕｅｎｔ１００で希釈された捕捉抗体により室温で２時間コートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、２５μＬ／ウェルのＤｉｌｕｅｎｔ４３、ならびに２５μＬ／ウェルの未希釈試料および標準曲線濃度を、技術的に二重で添加し、振とうしながら（５００ｒｐｍ）４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、Ｄｉｌｕｅｎｔ３で希釈されたＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ－Ｔａｇコンジュゲート化検出抗体を、各ウェルに添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートをその後、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、水で１：２希釈されたＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ－Ｔ ４ｘ（界面活性剤含む）１５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートを、ＭＳＤ ｓｅｃｔｏｒ ｉｍａｇｅｒ ｍｏｄｅｌ ６０００を用いて読み取り、濃度を、ＭＳＤ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ４を用いて計算した。試料を、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｓ６００リーダで分析し、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＷＯＲＬＢＥＮＣＨでＭＳＤプレートから作成された複合データセットを解析した。
【0046】
結果
上清中のＩＬ－１β濃度を、ＭＳＤキットに含まれる組換えＩＬ－１βの標準曲線を利用して逆算した。図４に示される通り、式（Ｉ）の化合物は、１４２ｎＭのＩＣ５０を得ており、したがって化合物がヒトミクログリア中のＩＬ－１β産生を阻害するのに効果的であることを実証する。
上清中のＩＬ－１β濃度を、ＭＳＤキットに含まれる組換えＩＬ－１βの標準曲線を利用して逆算した。図４に示される通り、式（Ｉ）の化合物は、１４２ｎＭのＩＣ５０を得ており、したがって化合物がヒトミクログリア中のＩＬ－１β産生を阻害するのに効果的であることを実証する。
【0047】
ミクログリアは、脳および脊髄に存在し、中枢神経系の能動免疫防御の主要な形態として作用する。ミクログリア中の炎症応答は、多発性硬化症、自己免疫系の無菌性髄膜炎、および慢性偏頭痛などの障害に関連づけられている（例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ２０１７， ｖｏｌ． １３， ｐｐ． １６６１－１６６７； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２０１９， ｖｏｌ． １０， ａｒｔｉｃｌｅ ２８６；およびＨｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ， ２０１９， １６： ７８参照）。本明細書に提示された結果は、（ｉ）式（Ｉ）の化合物がミクログリア中のＮＬＲＰ３の高度に強力な阻害剤であること、および（ｉｉ）それが経口投与後に血液脳関門を越えることによりそのようなミクログリアに到達し得ること、の両方を実証する。そのため、式（Ｉ）の化合物は、多発性硬化症および自己免疫系の無菌性髄膜炎などの神経炎症または炎症性脳疾患の処置または予防に効果的であろうと考えられる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【国際調査報告】