特表 2023-501262 転写調節エレメント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-18

(54)【発明の名称】転写調節エレメント

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230111BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230111BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230111BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230111BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N15/864 100Z

C12N7/01

A61P43/00 111

A61P7/04

A61K35/76

A61K48/00

C12N15/12 ZNA

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022525553

(86)(22)【出願日】2020-10-30

(85)【翻訳文提出日】2022-06-22

(86)【国際出願番号】 GB2020052762

(87)【国際公開番号】W WO2021084277

(87)【国際公開日】2021-05-06

(31)【優先権主張番号】1915953.2

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1915955.7

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1915956.5

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1917925.8

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1917926.6

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1917927.4

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2006250.1

(32)【優先日】2020-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521345464

【氏名又は名称】フリーライン セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】キア、アザデ

(72)【発明者】

【氏名】コルバウ、ロムアルド

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C084ZC021

4C084ZC022

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA53

4C087ZC02

(57)【要約】

本発明は、哺乳類細胞等の細胞内で導入遺伝子を発現させるために使用することができる、プロモーター等の転写調節エレメント（ＴＲＥ）に関する。更に、本発明は、導入遺伝子と作動可能に連結され得る、このような転写調節エレメントを含むポリヌクレオチド及びベクター、並びにこのようなベクターの使用に基づく遺伝子治療の方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含むか又はからなるコアヌクレオチド配列を含む、転写調節エレメントであって、
ａ．８０～２８０ヌクレオチド長であり、かつ：
ｉ）配列番号５に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号５の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない；及び／又は
ｉｉ）配列番号４に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない；
あるいは
ｂ．８０～２８０ヌクレオチド長であり、かつ前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置し、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を更に含む、転写調節エレメント。

【請求項2】

配列番号２９に係るヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性、任意で少なくとも９５％の同一性、又は任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、請求項１に記載の転写調節エレメント。

【請求項3】

請求項１に記載の転写調節エレメントであって、コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を更に含み、任意で、
ａ．前記コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、１つ以上の転写開始点（ＴＳＳ）を含み；任意で、前記１つ以上のＴＴＳが、
ｉ．配列番号６、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｉｉ．配列番号７、若しくは配列番号７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び／又は
ｉｉｉ．配列番号８、若しくは配列番号８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
に係るヌクレオチド配列を含むか又はからなる；
並びに／あるいは
ｂ．前記コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ｉ．配列番号６に係るヌクレオチド配列、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｉｉ．配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｉｉｉ．配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
を含む；
並びに／あるいは
ｃ．前記コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号１１によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を更に含む；
並びに／あるいは
ｄ．前記コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、５０ヌクレオチドよりも短い；任意で４０ヌクレオチドよりも短い；任意で３０ヌクレオチドよりも短い；
並びに／あるいは
ｅ．前記コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ｉ．配列番号１０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｉｉ．配列番号１２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｉｉｉ．配列番号１３に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はからなる、転写調節エレメント。

【請求項4】

請求項１又は３に記載の転写調節エレメントであって、コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を更に含み、任意で、
ａ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ｉ．配列番号１４の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．配列番号１４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１４と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｉｉｉ．配列番号１５の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｉｖ．配列番号１５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１５と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｖ．配列番号１６の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、又は少なくとも９０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｖｉ．配列番号１６に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び／あるいは
ｖｉｉ．配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
を含む；
並びに／あるいは
ｂ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有し；任意で、前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して５０％未満の同一性を有し；任意で４５％未満の同一性を有し；任意で４０％未満の同一性を有し；任意で３０％未満の同一性を有する；
並びに／あるいは
ｃ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１１０ヌクレオチドよりも短い；任意で１００ヌクレオチドよりも短い；任意で５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１０ヌクレオチドよりも短い；
並びに／あるいは
ｄ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、５～１１０ヌクレオチド長である；
並びに／あるいは
ｅ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、少なくとも７ヌクレオチド長である；
並びに／あるいは
ｆ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１０２ヌクレオチド長以下である；
並びに／あるいは
ｇ．前記コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ｉ．配列番号１８に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｉｉ．配列番号１９に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｉｉｉ．配列番号２０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｉｖ．配列番号２１に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｖ．配列番号２２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｖｉ．配列番号２３に係るヌクレオチド配列、又は配列番号２３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、転写調節エレメント。

【請求項5】

２００ヌクレオチドよりも短く；任意で１５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１２５ヌクレオチドよりも短い、請求項１、３、又は４に記載の転写調節エレメント。

【請求項6】

少なくとも８５ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１００ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１１０ヌクレオチド長である、請求項１又は３～５のいずれか一項に記載の転写調節エレメント。

【請求項7】

ａ． ａｃａｇｔｇａａｔｃ；又は
ｂ． ｃｔｃｃｔｃａｇｃｔ
から選択される１０ヌクレオチド配列で終結する、請求項１又は３～６のいずれか一項に記載の転写調節エレメント。

【請求項8】

ａ．コアヌクレオチド配列が、７３～８０ヌクレオチド長である；
及び／又は
ｂ．コアヌクレオチド配列が、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる；
及び／又は
ｃ．コアヌクレオチド配列が、配列番号２と同一である；
及び／又は
ｂ．コアヌクレオチド配列が、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる；
及び／又は
ｅ．コアヌクレオチド配列が、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる；
及び／又は
ｆ．コアヌクレオチド配列が、配列番号３と同一である、請求項１又は３～７のいずれか一項に記載の転写調節エレメント。

【請求項9】

ａ．配列番号２４；
ｂ．配列番号２５；
ｃ．配列番号２６；
ｄ．配列番号２７；
ｅ．配列番号２８；及び
ｆ．配列番号２９
からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性、任意で少なくとも９５％の同一性、又は任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、請求項１又は３～７のいずれか一項に記載の転写調節エレメント。

【請求項10】

プロモーターを含み；任意で、エンハンサーを更に含み；任意で、前記プロモーターが肝臓特異的である、請求項１～９のいずれか一項に記載の転写調節エレメント。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の転写調節エレメントを含むポリヌクレオチドであって、前記転写調節エレメントが、導入遺伝子に作動可能に連結されており、任意で、前記導入遺伝子がヒトタンパク質をコードしている、ポリヌクレオチド。

【請求項12】

導入遺伝子を含むベクターの一部であり、任意で、前記導入遺伝子がヒトタンパク質をコードしており、任意で、前記ベクターがＡＡＶベクター等のウイルス粒子である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の転写調節エレメント。

【請求項13】

請求項１１に記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載の転写調節エレメントであって、
ａ．前記転写調節エレメントが、配列番号１若しくは配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して５０％以上多く導入遺伝子を発現させる；
ｂ．前記転写調節エレメントが、配列番号１若しくは配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して８０％以上多く導入遺伝子を発現させる；又は
ｃ．前記転写調節エレメントが、配列番号１若しくは配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１００％以上多く導入遺伝子を発現させる；又は
ｄ．転写調節エレメントが、配列番号１若しくは配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１５０％以上で導入遺伝子を発現させ；
任意で、前記導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される、ポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【請求項14】

請求項１１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は転写調節エレメントであって、
ａ．導入遺伝子が、タンパク質、又は任意でｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、若しくはｓｎＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡである非翻訳ＲＮＡをコードしている；
及び／あるいは
ｂ．導入遺伝子が４ｋヌクレオチドよりも長く；任意で、前記導入遺伝子が４．２ヌクレオチドよりも長い；
及び／あるいは
ｃ．導入遺伝子が４．５ｋヌクレオチドよりも短く、任意で、前記導入遺伝子が４．４ｋヌクレオチドよりも短い；
及び／あるいは
ｄ．導入遺伝子が、ＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、前記導入遺伝子が、短縮型又は改変型のＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、前記導入遺伝子が、Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩをコードしている、ポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【請求項15】

（ｉ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の転写調節エレメントと；（ｉｉ）導入遺伝子とを含むヌクレオチド配列を含むベクターであって；任意で、
ａ．前記ベクターのヌクレオチド配列が、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を更に含み；任意で、前記シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、５０～１００ヌクレオチド長であり；任意で、前記シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、８０ヌクレオチドよりも短い；
及び／あるいは
ｂ．前記ベクターが、ＡＡＶベクター等のウイルス粒子である；
及び／あるいは
ｃ．前記転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して５０以上多く導入遺伝子を発現させ；任意で、前記導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される；
及び／あるいは
ｄ．前記転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して８０以上多く導入遺伝子を発現させ；任意で、前記導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される；
及び／あるいは
ｅ．前記転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１００以上多く導入遺伝子を発現させ；任意で、前記導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される；
及び／あるいは
ｆ．前記転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１５０以上多く導入遺伝子を発現させ；任意で、前記導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される；
及び／あるいは
ｇ．前記導入遺伝子が、タンパク質、又は任意でｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、若しくはｓｎＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡである非翻訳ＲＮＡをコードしている；
及び／あるいは
ｈ．前記導入遺伝子が４ｋヌクレオチドよりも長く；任意で、前記導入遺伝子が４．２ヌクレオチドよりも長い；
及び／あるいは
ｉ．前記導入遺伝子が４．５ｋヌクレオチドよりも短く、任意で、前記導入遺伝子が４．４ｋヌクレオチドよりも短い；
及び／あるいは
ｊ．前記導入遺伝子が、ＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、前記導入遺伝子が、短縮型又は改変型ＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、前記導入遺伝子が、Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩをコードしている；
及び／あるいは
ｋ．前記ベクターのゲノムが４．９ｋヌクレオチドよりも短く；任意で、前記ベクターのゲノムが４．５ｋヌクレオチドよりも短い；
及び／あるいは
ｌ．前記ベクターのゲノムが、約４．７ｋヌクレオチド長である、ベクター。

【請求項16】

治療方法において使用するための請求項１５に記載のベクターであって、任意で、前記治療方法が、遺伝子治療の方法及び／又は血友病Ａの治療方法であるベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、哺乳類細胞等の細胞内で導入遺伝子を発現させるために使用することができるプロモーター等の転写調節エレメント（ＴＲＥ）に関する。更に、本発明は、導入遺伝子と作動可能に連結され得る、このような転写調節エレメントを含むポリヌクレオチド及びベクター、並びにこのようなベクターの使用に基づく遺伝子治療の方法に関する。

【背景技術】

【0002】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、その有望な安全性プロファイル及びインビボにおいて多くの組織に形質導入する能力から、遺伝子治療のための大きな潜在力を有している。このようなベクターを用いた初期臨床試験では、毒性がほとんどないし全く持続せず、望ましくない免疫応答が最小限であると共に、治療された患者で長期間発現することを含む、大きな見込みが示されている。

【0003】

しかし、当技術分野で以前から認識されているように（例えば、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９５（５））、ｒＡＡＶベクターの特に不利な点は、そのパッケージング能力が限定的であることである。具体的には、野生型（ｗｔ）ＡＡＶは、約４．６～４．７キロベース（ｋｂ）のゲノムを有し、ｒＡＡＶゲノムがこの長さを大幅に超えると、最適以下の能力及び品質属性を伴う不均一な粒子集団になるというエビデンスがある。このため、より大きな生体分子のための導入遺伝子を含めようとすると、問題が生じることがある：一例として、完全長第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のｃＤＮＡは７ｋｂ超であり、これは、大きすぎてｒＡＡＶに効率的にパッケージングすることができない。例えば血友病Ａの治療において使用するための、中央のＢドメインが欠損しているが、その凝固効力を保持している短縮型の第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ－ＳＱとして知られている）が以前から知られている（Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３２，１９－２７）。しかし、この短縮されたＢドメイン欠失型の第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡでさえ約４．４ｋｂある。

【0004】

短縮型第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の導入遺伝子をｒＡＡＶに組み込もうとする以前の試みの結果、野生型よりも長いＡＡＶゲノムが得られた（Ｃｈａｏらは、２つのコンストラクトを報告しているが、いずれも野生型よりも長い４．６～４．７ｋｂである）。この問題の一部は、機能的ｒＡＡＶベクターには、単に導入遺伝子だけでなく、転写調節エレメント（プロモーター／エンハンサー）、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、及びポリアデニル化配列（ｐｏｌｙＡ）等の多くの他の特徴も必要であるという点にある。これら必要な特徴を全て含めると、ほぼ例外なく、野生型（ｗｔ）ゲノムよりも長いｒＡＡＶベクタープラスミドが得られた。

【0005】

ｒＡＡＶベクターと共に使用するための多くの転写調節エレメント（プロモーター／エンハンサー）が知られている。幾つかの公知の転写調節エレメントについては、以下の参照文献においてより詳細に説明されている：ＷＯ１６／１８１１２２（ＨＬＰ２）；Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００６ Ａｐｒｉｌ １，１０７（７）：２６５３－２６６１（ＬＰ１）；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０００；１：５２２－５３２（ＨＣＲ－ｈＡＡＴ）；Ｏｋｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，６３７－６４５（１９９６）（ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ）；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９９ Ｍａｒｃｈ，９６（７）：３９０６－３９１０（ＬＳＰ）。このような転写調節エレメントは、一般に、プロモーター、エンハンサー、及び任意で他のヌクレオチドを含む。

【0006】

従って、ｒＡＡＶベクターゲノムのサイズ（すなわち、長さ）は、少なくとも部分的には、転写調節エレメント、導入遺伝子等のサイズによって決定され、上述のように、これら特徴の性質は、ｒＡＡＶが使用される用途によって部分的又は完全に決定される。

【0007】

長い導入遺伝子を含む発現カセットの場合を含む、野生型ＡＡＶのゲノム長により近いｒＡＡＶベクターを作製できることが望ましく、より小さな転写調節エレメントを組み込むことがこの目的の一助となる。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＨＬＰ２転写調節エレメント（ＴＲＥ）に存在するヌクレオチド配列の少なくとも一部が、以下でより詳細に説明する通り欠失、変更、又は短縮されている、公知のＨＬＰ２ ＴＲＥの短かくしたバージョンに関する。本発明の短い転写調節エレメントは、少なくともある程度の機能性を保持しながら、より短いサイズを有しており、更に、以下に詳細に示すような他の驚くべき利点を潜在的に伴っているので、公知のＨＬＰ２ ＴＲＥよりも優れている。

【0009】

本発明者らは、驚くべきことに、公知のＨＬＰ２ ＴＲＥ内の相当数の領域を、ＴＲＥの効力に著しい悪影響を与えることなく欠失、短縮、又は改変することができると判断した。幾つかの例では、以下に例示する通り、本発明者らは、驚くべきことに、かなり短い長さであるにもかかわらず、ＨＬＰ２ ＴＲＥと同等の効力（すなわち、比較により約５０％以上の活性）を有するＨＬＰ２ ＴＲＥの短縮バージョン（すなわち、より少ないヌクレオチドを有するより短いバージョン）を作製できることを見出した。幾つかの例では、本発明の短い転写調節エレメントは、ＨＬＰ２又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ等の他の公知の転写調節エレメントよりも大きな効力を有する場合もある。

【0010】

具体的には、本発明者らは、ＨＬＰ２ ＴＲＥに存在し、本発明の全ての転写調節エレメントに共通する「コア」領域（「コア配列」又は「コアヌクレオチド配列」又は「コンセンサス領域」又は「コンセンサスヌクレオチド配列」として記述することもでき、これら用語は全て同義であるとみなされるべきである）を同定した。以下に詳述する通り、「コア」領域は、単独でもＴＲＥとしてある程度の最小限の効力を有し得るが、更なるヌクレオチドを含めることによって（例えば、本明細書で「拡大コア」領域と定義されるものを作製することによって）わずかに延長したとき、効力が驚くほど大幅に増大する。「拡大コア領域」又は「拡大コア配列」又は「拡大コアヌクレオチド配列」又は「拡大コンセンサス領域」又は「拡大コンセンサスヌクレオチド配列」という用語は、同義であるとみなされるべきである。

【0011】

従って、本発明者らは、ＨＬＰ２ ＴＲＥと比較して小さなサイズを有する（すなわち、短い）転写調節エレメントを得ることに成功した。転写調節エレメントが短いと、ｒＡＡＶゲノムの全体的なサイズ（長さ）を小さくすることができるため、有利である。これにより、次に、野生型のゲノム長により近いゲノムを有するので、より効率的にパッケージングされるｒＡＡＶベクターを作製することができるようになる。

【0012】

はるかに短い転写調節エレメントを使用することが望ましい場合があり得ること、及び該転写調節エレメントに関する活性レベルがより低いことは、他の方法で、例えば野生型タンパク質に関してより高い活性レベルを有するタンパク質をコードしている導入遺伝子を使用すること等によって補償し得ることは、疑いなく理解されるであろう。このような一例は、例えば国際公開第９９／０３４９６号（Ｓｔａｆｆｏｒｄら）に開示されている通りの、３３８位にアルギニンの代わりにロイシンを有する（Ｒ３３８Ｌ）公知の「Ｐａｄｕａ」第ＩＸ因子変異体である。

【0013】

従って、ＨＬＰ２と比較して少なくともある程度の活性を保持していれば、ＨＬＰ２と比較して短い長さを有する転写調節エレメントが有利であることが理解されるであろう。また、ＨＬＰ２と比較してより短い長さ及びより高い活性レベルの両方を有する転写調節エレメントは、予想外でありかつ非常に有利であることも理解されるであろう。

【0014】

従って、本発明は、配列番号２に対して少なくとも９５％若しくは少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む若しくはからなるか、又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるコアヌクレオチド配列を含む転写調節エレメントであって、８０～２８０ヌクレオチド長であり；任意で８０～２２５ヌクレオチド長である転写調節エレメントを提供する。任意で、ポリヌクレオチド及び／又は転写調節エレメントが、本発明の転写調節エレメント等の転写調節エレメントの全部又は一部を複数コピー含む場合、そのコピーは全て、その長さを求める目的のために転写調節エレメントの一部であるとみなされるべきである。例えば、２コピーの配列番号２のコア領域からなるＴＲＥを含むポリヌクレオチドでは、ＴＲＥは、コアヌクレオチド配列の２倍の長さ（すなわち、２×７３又は１４６ヌクレオチド）を有するとみなされる。

【0015】

更に、本発明者らは、転写調節エレメントのサイズ、ひいてはｒＡＡＶゲノムの全体サイズを最小化するために、欠失、短縮、又は改変して本発明の転写調節エレメントを作製することができるＨＬＰ２ ＴＲＥの特定の領域を同定した。

【0016】

従って、本発明は、配列番号２に対して少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む若しくはからなるか、又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるコアヌクレオチド配列を含む転写調節エレメントであって、
ａ．配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
及び／又は
ｂ．配列番号５に係るヌクレオチド配列を含まず；
８０～２８０ヌクレオチド長であり；任意で８０～２２５ヌクレオチド長である、転写調節エレメントを提供する。

【0017】

あるいは、本発明は、
ａ．配列番号２に対して少なくとも９５％若しくは少なくとも９８％の同一性を有するか、又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含む若しくはからなるコアヌクレオチド配列；及び
ｂ．該コアヌクレオチド配列の５’に位置し、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列；
を含み、
８０～２８０ヌクレオチド長であり；任意で８０～２２５ヌクレオチド長である、転写調節エレメントを提供すると定義することもできる。

【0018】

以下に示す通り、８０ヌクレオチド前後の転写調節エレメントでさえも、ＨＬＰ２ ＴＲＥと比較して驚くべきレベルの効力を示す。しかし、本発明者らは、追加のヌクレオチド配列（複数可）を含めることにより、本発明の転写調節エレメントの効力を高めることができることを見出した。このような転写調節エレメントは、コアヌクレオチド配列に対して５’又は３’のいずれかに、ＨＬＰ２ ＴＲＥ又は公知のＦ２プロモーター／エンハンサー等の他のＴＲＥからのヌクレオチド配列を含めることを特徴とし得る。

【0019】

従って、本発明の転写調節エレメントは、コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を更に含んでいてもよい。

【0020】

コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号６、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号７、若しくは配列番号７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び／又は
ａ．配列番号８、若しくは配列番号８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
に係るヌクレオチド配列を含んでいてもよく、からなっていてもよい、１つ以上の転写開始点（ＴＳＳ）を含んでいてよい。

【0021】

コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号６に係るヌクレオチド配列、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｂ．配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｃ．配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含んでいてよい。

【0022】

コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列は、配列番号１１によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含んでいてもよく、又は更に含んでいてもよい。

【0023】

コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列は、５０ヌクレオチドよりも短いヌクレオチド配列を含んでいてよい。該ヌクレオチド配列は、４０ヌクレオチドより短くてもよい。該ヌクレオチド配列は、３０ヌクレオチドより短くてもよい。

【0024】

コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｃ．配列番号１３に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいてもよく、からなっていてもよい。

【0025】

本発明の転写調節エレメントは、コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を更に含んでいてもよい。

【0026】

コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号１４の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１４と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号１５の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号１５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１５と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号１６の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、又は少なくとも９０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｆ．配列番号１６に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
及び／あるいは
ｇ．配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含んでいてよい。

【0027】

コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列は、配列番号３０によって規定され得るエンハンサー配列、又は配列番号３０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。エンハンサー配列は、反復モチーフとして１回超存在していてもよい。２回、又は３回、又はそれ以上存在していてもよい。エンハンサー配列は、別のエンハンサー配列に直接隣接していてもよい。

【0028】

コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列は、別の転写調節エレメントに由来するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ヌクレオチド配列は、別の転写調節エレメントから少なくとも１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、又は少なくとも８０個の連続するヌクレオチドを含んでいてよい。別の転写調節エレメントは、ヒト転写調節エレメントであってよい。別の転写調節エレメントは、Ｆ２（プロトロンビン）、α－１－アンチトリプシン、トランスフェリン、ＡＭＢＰ、ハプトグロビン、及びトランスサイレチン（ＴＴＲ）からなる群から選択され得る。

【0029】

コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列は、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有していてよい。該ヌクレオチド配列は、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して５０％未満の同一性を有していてもよい。４５％未満の同一性を有していてもよい。４０％未満の同一性を有していてもよい。３０％未満の同一性を有していてもよい。

【0030】

コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列は、１１０ヌクレオチドよりも短いヌクレオチド配列を含んでいてもよい。該ヌクレオチド配列は、１００ヌクレオチドより短くてもよい。５０ヌクレオチドより短くてもよい。１０ヌクレオチドより短くてもよい。５～１１０ヌクレオチド長であってもよい。少なくとも７ヌクレオチド長であってもよい。１０２ヌクレオチド長以下であってもよい。

【0031】

コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列は、
ａ．配列番号１８に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１９に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号２０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号２１に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号２２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｆ．配列番号２３に係る、又は配列番号２３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

【0032】

本発明の転写調節エレメントは、
ａ．配列番号４に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない；
及び／又は
ａ．配列番号５に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号５の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まないことが好ましい。

【0033】

本発明の転写調節エレメントは、具体的には、
ａ）配列番号４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列；
及び／又は
ｂ）配列番号５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含んでいなくてもよい。

【0034】

本発明の転写調節エレメントは、２００ヌクレオチドより短くてもよい。１５０ヌクレオチドより短くてもよい。１２５ヌクレオチドより短くてもよい。

【0035】

本発明の転写調節エレメントは、少なくとも８５ヌクレオチド長又は少なくとも１００ヌクレオチド長であってよい。少なくとも１１０ヌクレオチド長であってもよい。

【0036】

本発明の転写調節エレメントは、
ａ． ａｃａｇｔｇａａｔｃ；又は
ｂ． ｃｔｃｃｔｃａｇｃｔ
から選択される１０ヌクレオチド配列で終結し得る。

【0037】

本発明者らが同定した「コア塩基配列」は、７３～８０ヌクレオチド長であってよい。「コアヌクレオチド配列」は、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有していてよい。「コアヌクレオチド配列」は、配列番号２と同一であってもよい。

【0038】

本発明者らは、「コアヌクレオチド配列」がわずかに長い（「拡大コアヌクレオチド配列」と称する）本発明の転写調節エレメントのサブセットを同定した。「拡大コアヌクレオチド配列」は、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有していてよい。「拡大コアヌクレオチド配列」は、配列番号３と同一であってもよい。

【0039】

本発明者らは、本発明の特に好ましい転写調節エレメントを同定した。以下にこれらを例示し、詳細に論じる。

【0040】

本発明の特に好ましい転写調節エレメントは、
ａ．配列番号２４
ｂ．配列番号２５
ｃ．配列番号２６
ｄ．配列番号２７
ｅ．配列番号２８；及び
ｆ．配列番号２９
からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性、任意で少なくとも９５％の同一性、又は任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を有していてよい。

【0041】

配列番号２４は、以下の実施例で詳述する特性を有する本発明の転写調節エレメント（内部呼称「ＦＲＥ４３」が割り当てられる）を定義する。それは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１７０～２４２（配列番号１を参照して本明細書で定義する）の「コアヌクレオチド配列」を含むが、一方、５’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド９９～１６９が欠損しており（従ってＨＬＰ２のヌクレオチド１１８～１６２が完全に欠損しており）、ＨＬＰ２のヌクレオチド１～９８を含む。３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～３３５を含む。ＦＲＥ４３の全長は、２６４ヌクレオチドである。

【0042】

従って、ＦＲＥ４３は、（とりわけ）
・配列番号２によって定義されるコアヌクレオチド配列を含み；
・配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
・コアヌクレオチド配列の５’に位置し、配列番号４に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
・配列番号９又は配列番号１０によって定義され得、配列番号６、７、及び８によって定義される３つのＴＳＳを含むコアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を含み；かつ
・配列番号１１を更に含むコアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を含む、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0043】

ＦＲＥ４３の３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～３３５を含むので、配列番号９を含むと定義することもでき、配列番号１０を含むと定義することもできることが理解されるであろう。

【0044】

ＦＲＥ４３はまた、配列番号２によって定義されるコアヌクレオチド配列；配列番号１８によって定義される５’領域；及び配列番号１２によって定義される３’領域を提供すると定義することもできる。

【0045】

配列番号２５は、以下の実施例で詳述する特性を有する本発明の転写調節エレメント（内部呼称「ＦＲＥ４９」が割り当てられる）を定義する。それは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１６３～２４２の「拡大コアヌクレオチド配列」を含むが、一方、５’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１～１１及びヌクレオチド４２～１６２が欠損しており（従ってＨＬＰ２のヌクレオチド１１８～１６２が完全に欠損しており）、ＨＬＰ２のヌクレオチド１２～４１を含む。３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２９６が欠損しており（従って、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２８３が完全に欠損しており）、ＨＬＰ２のヌクレオチド２９７～３３５を含む。ＦＲＥ４９の全長は、１４９ヌクレオチドである。

【0046】

従って、ＦＲＥ４９は、（とりわけ）
・配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列を含み；
・配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
・配列番号５に係るヌクレオチド配列を含まず；
・コアヌクレオチド配列に対して５’に位置し、配列番号４に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
・配列番号１０によって定義されるコアヌクレオチド配列に対して３’に位置し、配列番号６、７、及び８によって定義される３つのＴＳＳを含むヌクレオチド配列を含む、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0047】

ＦＲＥ４９はまた、配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列；配列番号１９によって定義される５’領域；及び配列番号１０によって定義される３’領域を提供すると定義することもできる。

【0048】

配列番号２６は、以下の実施例で詳述する特性を有する本発明の転写調節エレメント（内部呼称「ＦＲＥ５６」が割り当てられる）を定義する。それは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１７０～２４２の「コアヌクレオチド配列」を含むが、一方、５’セクションは、Ｆ２ ＴＲＥに由来するヌクレオチド配列を含む。３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２６４、ヌクレオチド２７３～２８３、及びヌクレオチド３０３～３３５が欠損しており（従って、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２８３によって定義されるヌクレオチド配列を含まず）、ＨＬＰ２のヌクレオチド２６５～２７２及び２８４～３０２を含む。ＦＲＥ５６の全長は、１８１ヌクレオチドである。

【0049】

従って、ＦＲＥ５６は、（とりわけ）
・配列番号２によって定義されるコアヌクレオチド配列を含み；
・配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
・配列番号５に係るヌクレオチド配列を含まず；
・コアヌクレオチド配列に対して５’に位置し、配列番号４に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
・配列番号９によって定義されるコアヌクレオチド配列に対して３’に位置し、配列番号６によって定義されるＴＳＳを含むヌクレオチド配列を含み；かつ
・配列番号１１を更に含むコアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を含む、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0050】

ＦＲＥ５６はまた、配列番号２によって定義されるコアヌクレオチド配列；配列番号２０によって定義される５’領域；及び配列番号１３によって定義される３’領域を提供すると定義することもできる。

【0051】

配列番号２７は、以下の実施例で詳述する特性を有する本発明の転写調節エレメント（内部呼称「ＦＲＥ５９」が割り当てられる）を定義する。それは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１６３～２４２の「拡大コアヌクレオチド配列」を含むが、一方、５’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１～１１、ヌクレオチド７１～９２、ヌクレオチド１０１～１０５、及びヌクレオチド１１３～１３３が欠損しており（従ってＨＬＰ２のヌクレオチド１１８～１６２によって定義されるヌクレオチド配列を含まず）、ＨＬＰ２のヌクレオチド１２～３３を含む。ＦＲＥ５９の５’セクションはまた、ＨＬＰ２のヌクレオチド１７０～２４２に少なくとも部分的に対応するヌクレオチド配列（すなわち、「コア領域」に対応するヌクレオチド配列）を含む：ＦＲＥ５９配列（配列番号２７）のヌクレオチド２３～９５は、コア領域（配列番号２）のヌクレオチド１～７３と同一である。３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２６４、ヌクレオチド２７３～２８３、及びヌクレオチド３０３～３３５が欠損しており（従って、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２８３によって定義されるヌクレオチド配列を含まず）、ＨＬＰ２のヌクレオチド２６５～２７２及び２８４～３０２を含む。ＦＲＥ５９の全長は、２０２ヌクレオチドである。

【0052】

従って、ＦＲＥ５９は、（とりわけ）
・配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列を含み；
・配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
・配列番号５に係るヌクレオチド配列を含まず；
・コアヌクレオチド配列に対して５’に位置し、配列番号４に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
・配列番号９によって定義されるコアヌクレオチド配列に対して３’に位置し、配列番号６によって定義されるＴＳＳを含むヌクレオチド配列を含み；かつ
・配列番号１１を更に含むコアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を含む、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0053】

ＦＲＥ５９はまた、配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列；配列番号２１によって定義される５’領域；及び配列番号１３によって定義される３’領域を提供すると定義することもできる。５’領域は、コア領域（すなわち配列番号２）に係るヌクレオチド配列を含むものとして更に定義することもできる。

【0054】

配列番号２８は、以下の実施例で詳述する特性を有する本発明の転写調節エレメント（内部呼称「ＦＲＥ６３」が割り当てられる）を定義する。それは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１６３～２４２の「拡大コアヌクレオチド配列」を含むが、一方、５’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１～１１、ヌクレオチド３６～７２、ヌクレオチド９９～１０４、及びヌクレオチド１２１～１２５が欠損しており（従ってＨＬＰ２のヌクレオチド１１８～１６２によって定義されるヌクレオチド配列を含まず）、ＨＬＰ２のヌクレオチド１２～３３を含む。ＦＲＥ６３の５’セクションはまた、ＨＬＰ２のヌクレオチド１７０～２４２に少なくとも部分的に対応するヌクレオチド配列（すなわち、「コア領域」に対応するヌクレオチド配列）を含む：配列比較（示さない）によって、ＦＲＥ６３配列（配列番号２８）のヌクレオチド２９～１００は、コア領域（配列番号２）のヌクレオチド２～７３と同一であることが立証される。３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２６４、ヌクレオチド２７３～２８３、及びヌクレオチド３０３～３３５が欠損しており（従って、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２８３によって定義されるヌクレオチド配列を含まず）、ＨＬＰ２のヌクレオチド２６５～２７２及び２８４～３０２を含む。ＦＲＥ６３の全長は、２０７ヌクレオチドである。

【0055】

従って、ＦＲＥ６３は、（とりわけ）
・配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列を含み；
・配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
・配列番号５に係るヌクレオチド配列を含まず；
・コアヌクレオチド配列に対して５’に位置し、配列番号４に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
・配列番号９によって定義されるコアヌクレオチド配列に対して３’に位置し、配列番号６によって定義されるＴＳＳを含むヌクレオチド配列を含み；かつ
・配列番号１１を更に含むコアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を含む、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0056】

ＦＲＥ６３はまた、配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列；配列番号２２によって定義される５’領域；及び配列番号１３によって定義される３’領域を提供すると定義することもできる。５’領域は、コア領域（すなわち配列番号２）の部分配列（ヌクレオチド２～７３）を含むものとして更に定義することもできる。

【0057】

配列番号２９は、以下の実施例で詳述する特性を有する本発明の転写調節エレメント（内部呼称「ＦＲＥ７２」が割り当てられる）を定義する。それは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１６３～２４２の「拡大コアヌクレオチド配列」を含むが、一方、５’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド１～１６２が欠損している（従って、ＨＬＰ２のヌクレオチド１１８～１６２が完全に欠損している）。従って、ＦＲＥ７２は、５’セクションを有しないものとして（すなわち、「拡大コアヌクレオチド配列」に対して５’にあるヌクレオチド配列を有しないものとして）定義することができる。あるいは、ＦＲＥ７２が代わりにＨＬＰ２のヌクレオチド１７０～２４２のコアヌクレオチド配列を有すると考えられる場合、ＨＬＰ２のヌクレオチド１６３～１６９からなる５’セクションを有すると考えることもできる。３’セクションは、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２９６が欠損しており（従って、ＨＬＰ２のヌクレオチド２４３～２８３が完全に欠損しており）、ＨＬＰ２のヌクレオチド２９７～３３５を含む。ＦＲＥ７２の全長は、１１９ヌクレオチドである。

【0058】

従って、ＦＲＥ７２は、（とりわけ）
・配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列を含み；
・配列番号４に係るヌクレオチド配列を含まず；
・配列番号５に係るヌクレオチド配列を含まず；
・コアヌクレオチド配列に対して５’に位置し、配列番号４に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列を含む；かつ
・配列番号１０によって定義されるコアヌクレオチド配列に対して３’に位置し、配列番号６、７、及び８によって定義される３つのＴＳＳを含むヌクレオチド配列を含む、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0059】

ＦＲＥ７２はまた、配列番号２によって定義されるコアヌクレオチド配列；配列番号２３によって定義される５’領域；及び配列番号１０によって定義される３’領域を提供すると定義することもできる。

【0060】

あるいは、ＦＲＥ７２は、配列番号３によって定義される拡大コアヌクレオチド配列；及び配列番号１０によって定義される３’領域を提供するものと定義することもできる。

【0061】

上記に照らして、本発明の転写調節エレメントが配列番号３によって定義される「拡大コア」配列を含む場合、５’領域（１つ存在する場合）は、配列番号２によって定義される「コアヌクレオチド配列」の少なくとも６０個、少なくとも７０個、又は少なくとも７１個、又は７２個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含み得ることが理解されるであろう。

【0062】

従って、本発明は、
（ａ）配列番号３に対して少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる「拡大コア」配列；及び
（ｂ）配列番号２に対して少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、拡大コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列；
を含み、８０～２８０ヌクレオチド長である、本発明の転写調節エレメントを提供する。

【0063】

５’領域は、上記の他のエレメント（例えば、配列番号１４の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列等）を含んでいてもよい。

【0064】

転写調節エレメントは、上記で定義した通りの３’領域を更に含んでいてもよい。

【0065】

本願の教示全体に基づいて、当業者であれば、本発明の１つ以上の更なる転写調節エレメントを得るために、様々な上記で定義した転写調節エレメントのうちのいずれか１つ以上からの個々のエレメントを組み合わせてもよいことを理解することが十分に想定される。

【0066】

従って、本発明は、配列番号１によって定義されるヌクレオチド配列に係る又は由来する転写調節エレメント（ＨＬＰ２ ＴＲＥ）であって、
（ａ）
（ｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１７０～２４２；
又は
（ｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１６３～２４２；
に対して少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなるコアヌクレオチド配列、
（ｂ）コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列に対する１つ以上の欠失であって、
（ｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１～１１；及び／又は
（ｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド３６～７２；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド７１～９２；及び／又は
（ｉｖ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド９９～１０４；及び／又は
（ｖ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１０１～１０５；及び／又は
（ｖｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１２１～１２５；及び／又は
（ｖｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド４２～１６２；及び／又は
（ｖｉｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１１３～１３３；及び／又は
（ｉｘ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１～１６２；
から選択される欠失、
（ｃ）任意で、コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列に対する１つ以上の欠失であって、
（ｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド２４３～２９６；及び／又は
（ｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド２４３～２６４；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド２７３～２８３；及び／又は
（ｉｖ）配列番号１に従って付番されたヌクレオチド３０３～３３５；
から選択される欠失
を含み、８０～２８０ヌクレオチド長である転写調節エレメントを提供する。

【0067】

別の実施形態では、本発明は、配列番号１によって定義されるヌクレオチド配列に係る又は由来する転写調節エレメント（ＨＬＰ２ ＴＲＥ）であって、配列番号１に従って付番されたヌクレオチド１７０～２４２又はヌクレオチド１６３～２４２に対して少なくとも９５％又は少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなるコアヌクレオチド配列を含み、配列番号１のヌクレオチド１～１６２によって定義されるヌクレオチド配列からの１つ以上の欠失を有する転写調節エレメントを提供する。

【0068】

１つ以上の欠失は、配列番号１のヌクレオチド１～１６２によって定義されるヌクレオチド配列の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１５５個、１６０個、又は１６２個の連続するヌクレオチドからであってよい。

【0069】

転写調節エレメントは、配列番号１に従って付番されたヌクレオチド２４３～３３５によって定義されるヌクレオチド配列からの１つ以上の欠失を更に含んでいてもよい。

【0070】

１つ以上の欠失は、配列番号１のヌクレオチド２４３～３３５によって定義されるヌクレオチド配列の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、又は９０個の連続するヌクレオチドからであってよい。

【0071】

１つ以上の欠失は、配列番号１のヌクレオチド２４３～２８３によって定義されるヌクレオチド配列の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、又は９０個の連続するヌクレオチドからであってよい。

【0072】

１つ以上の欠失は、配列番号１のヌクレオチド２４３～２９６によって定義されるヌクレオチド配列の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、又は９０個の連続するヌクレオチドからであってよい。

【0073】

１つ以上の欠失は、配列番号１のヌクレオチド３０３～３３５によって定義されるヌクレオチド配列の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、又は９０個の連続するヌクレオチドからであってよい。

【0074】

配列番号１によって定義されるヌクレオチド配列に係る又は由来する転写調節エレメント（ＨＬＰ２ ＴＲＥ）は、上記で定義した通り５’及び／又は３’領域を含み得る。

【0075】

本発明の転写調節エレメントは、プロモーターを含んでいてもよく、プロモーターであってもよい。プロモーターは、肝臓特異的プロモーターであってもよく、及び／又はエンハンサーを更に含んでいてもよい。任意で、転写調節エレメントは、肝臓特異的である。幾つかの実施形態では、転写調節エレメント又はプロモーターは、少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞と比べて肝臓細胞においてより高レベルでタンパク質発現を促進する場合、肝臓特異的である。

【0076】

任意で、転写調節エレメント又はプロモーターは、少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞と比べて肝臓細胞においてより高いレベルでタンパク質発現を促進し、かつ少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞では、転写調節エレメント又はプロモーターが肝臓細胞においてタンパク質発現を促進するレベルの４０％未満、３０％未満、２５％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満のレベルで転写調節エレメント又はプロモーターがタンパク質発現を促進する場合、肝臓特異的である。

【0077】

任意で、少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞は、腎臓細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、神経芽腫細胞、肺細胞、及び初期Ｂ細胞のうちの少なくとも１つである。任意で、少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞は、腎臓細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、神経芽腫細胞、肺細胞、及び初期Ｂ細胞である。任意で、少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＡＮＣ１細胞、ＢｘＰＣ－３細胞、ＭＣＦ７細胞、１６４３細胞、ＭＲＣ－９細胞、及び６９７細胞のうちの少なくとも１つである。任意で、少なくとも１つの他の器官又は組織からの細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＡＮＣ１細胞、ＢｘＰＣ－３細胞、ＭＣＦ７細胞、１６４３細胞、ＭＲＣ－９細胞、及び６９７細胞である。

【0078】

任意で、転写調節エレメント又はプロモーターが肝臓特異的であるか否かは、導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節エレメント又はプロモーターを含むベクターをＨｕｈ７細胞及び比較対象細胞に形質導入し、導入遺伝子を発現するＨｕｈ７細胞の数を導入遺伝子を発現する比較対象細胞の数と比較することによって判定することができる。比較対象細胞は、非肝臓細胞であってよい。例えば、転写調節エレメント又はプロモーターが、乳腺細胞と比べて肝臓細胞においてより高レベルで発現を促進するかどうかをユーザが判定したい場合、ユーザは、Ｈｕｈ７細胞及びＭＣＦ７細胞等の乳腺細胞である比較対象細胞に形質導入してよい。導入遺伝子を発現するＨｕｈ７細胞の数が、導入遺伝子を発現する比較対象細胞の数よりも有意に多い場合、そのプロモーター又は転写調節エレメントは肝臓特異的である。

【0079】

導入遺伝子はＧＦＰであってもよく、その場合、ユーザは、蛍光顕微鏡を用いて導入遺伝子を発現する細胞の数（例えば、Ｈｕｈ７細胞の数又は比較対象細胞の数）を求め、緑色の蛍光を発する細胞の数をカウントしてよい。

【0080】

本発明は更に、本発明の転写調節エレメント又はプロモーターを含むポリヌクレオチド配列であって、該転写調節エレメント又はプロモーターが導入遺伝子に作動可能に連結されており、任意で、該導入遺伝子がヒトタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を提供する。

【0081】

本発明の転写調節エレメント又はプロモーターは、導入遺伝子を含むベクターの一部であってもよい。ベクターは、ＡＡＶベクター又は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター等のウイルス粒子であってもよい。

【0082】

導入遺伝子は、タンパク質又は例えば、ｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、若しくはｓｎＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡ等であってよい非翻訳ＲＮＡをコードしていてよい。導入遺伝子は、４，０００（４ｋ）ヌクレオチド又は４，０００塩基対（４ｋｂｐ）より長くてもよい。導入遺伝子は、４．２ｋヌクレオチドより長くてもよい。導入遺伝子は、４．４ｋヌクレオチドより短くてもよい。

【0083】

一実施形態では、導入遺伝子は、凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子（本明細書の他の箇所で論じた通り短縮型ＦＶＩＩＩであってもよい）又は第ＩＸ因子をコードしている。あるいは、導入遺伝子は、酵素をコードしていてもよく、それは、α－ガラクトシダーゼＡ又はβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）等のリソソーム酵素であってよい。

【0084】

本発明の転写調節エレメント又はプロモーター、並びにこのようなエレメント又はプロモーターを含むポリヌクレオチド及びそれらを含むベクターは、ＨＬＰ２ ＴＲＥ（配列番号１によって定義）又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ ＴＲＥ（配列番号３３によって定義）と比較して５０％以上多く、それが作動可能に連結されている導入遺伝子を発現し得る。

【0085】

ＨＬＰ２ ＴＲＥ（配列番号１によって定義）又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ ＴＲＥ（配列番号３３によって定義）と比較して８０％以上多く、それが作動可能に連結されている導入遺伝子を発現し得る。

【0086】

本発明者らは、驚くべきことに、ＨＬＰ２ ＴＲＥの機能を保持している短縮された（多くの場合著しく短縮された）バージョンを作製することができるだけでなく、本発明の短縮型転写調節エレメントが、実際、ＨＬＰ２ ＴＲＥ又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ ＴＲＥと比較してより優れた効果を有し得ることを見出した。

【0087】

従って、本発明の転写調節エレメント又はプロモーター、並びにこのような因子又はプロモーターを含むポリヌクレオチド及びそれらを含むベクターは、ＨＬＰ２ ＴＲＥ（配列番号１によって定義）又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ ＴＲＥ（配列番号３３によって定義）と比較して１００％以上、１１０％以上、１２０％以上、１４０％以上、又は１５０％以上多く、それが作動可能に連結されている導入遺伝子を発現し得る。

【0088】

当業者であれば、本発明の転写調節エレメントの制御下で発現した導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを、インビトロ又はインビボ系においてＨＬＰ２ ＴＲＥ又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ ＴＲＥの制御下で発現した導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルと比較することにより、本発明の転写調節エレメントを用いた導入遺伝子の発現をＨＬＰ２ ＴＲＥ（配列番号１）又はＨＣＲ－ｈＡＡＴ ＴＲＥ（配列番号３３）と比較することができる。

【0089】

例えば、発現した導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを比較するためのインビトロ試験（実施例２に記載するもの等）において、当業者は、導入遺伝子に作動可能に連結している本発明のＴＲＥを含むベクターを宿主細胞（試験細胞）に、そして、導入遺伝子に作動可能に連結しているＨＬＰ２又はＨＣＲ－ｈＡＡＴを含むベクターを幾つかの細胞（参照細胞）に形質導入することができる。導入遺伝子を発現させるのに好適な条件下で細胞を培養してよく、試験細胞及び参照細胞で発現した導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを比較することができる。好適な宿主細胞としては、培養ヒト肝臓細胞、例えばＨｕｈ７細胞等が挙げられる。ポリペプチドのレベルは、ルシフェラーゼアッセイを使用してトランスフェクトされた細胞数を反映するように正規化しなければならない。ルシフェラーゼアッセイでは、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含む等価なベクター（プロモーター及び導入遺伝子以外は同一）を用いて試験細胞及び参照細胞をトランスフェクトすると、該ベクターによってトランスフェクトされた細胞の割合は、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むベクターから発現したルシフェラーゼによって生じた蛍光シグナルと比例する。

【0090】

同様に、インビボ系で発現した導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを比較するために、当業者は、導入遺伝子に作動可能に連結している本発明のＴＲＥを含むウイルス粒子を数頭のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス等）（試験マウス）に、そして、導入遺伝子に作動可能に連結しているＨＬＰ２又はＨＣＲ－ｈＡＡＴを含むウイルス粒子を数頭の等価なマウス（参照マウス）に注射することができる。マウスを選別し、試験マウスの血液中の導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを、参照マウスの血液中の導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルと比較してよい。導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルは、肝臓細胞あたりのベクターゲノムの数に対して正規化してよい。

【0091】

導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルは、ＥＬＩＳＡを用いて評価することができる。ＥＬＩＳＡアッセイの一例では、導入遺伝子によってコードされているポリペプチドに結合する抗体をプレートに結合させてよい。導入遺伝子によってコードされているポリペプチドを未知の濃度で含むサンプルを、プレート上を通過させてよい。導入遺伝子によってコードされているポリペプチドに結合する第２の検出抗体をプレートに適用し、任意の過剰の検出抗体を洗い落としてよい。残った（すなわち、洗い落とされなかった）検出抗体は、導入遺伝子によってコードされているポリペプチドと結合する。検出抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素に連結させていてもよい。検出抗体の量を測定することによって、プレート上の導入遺伝子によってコードされているポリペプチドに結合する検出抗体のレベルを測定することができる。例えば、検出抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼに連結させた場合、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）等の基質からの青色の反応生成物の生成を触媒することができ、該青色の生成物のレベルは、４５０ｎｍにおける吸光度によって検出することができる。青色生成物のレベルは、洗浄工程後に残った検出抗体の量に比例し、これは、サンプル中の導入遺伝子によってコードされているポリペプチドの量に比例する。あるいは、例えば精製タンパク質を用いる場合、導入遺伝子によってコードされているポリペプチドの量又は濃度を分光光度的に測定してもよい。

【0092】

例えば、好適なＥＬＩＳＡアッセイキットは、実施例で用いるＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ製のＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（Ｒｅｆ：２２１４０６）である。導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードしている場合、ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイを用いて第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドのレベルを測定することができる。

【0093】

あるいは、当業者は、導入遺伝子によってコードされている発現したポリペプチドの活性を求めることによって、導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルを評価することもできる。

【0094】

例えば、導入遺伝子が第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードしている場合、導入遺伝子によってコードされているポリペプチドのレベルは、補因子活性を測定する発色アッセイ等の発色アッセイを用いて求めることができる。例えば、好適な発色アッセイは、以下の通りである。導入遺伝子によってコードされているポリペプチドを、ヒト第Ｘ因子ポリペプチド及び第ＩＸａ因子ポリペプチド、トロンビン、リン脂質、並びにカルシウムと混合する。トロンビンは、導入遺伝子によってコードされているポリペプチド（第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド等、第ＶＩＩＩ因子活性を有する）を活性化して、第ＶＩＩＩａ因子ポリペプチドを形成する。トロンビンによって活性化された第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドは、第ＩＸａ因子ポリペプチド、リン脂質、及びカルシウムと酵素複合体を形成し、この酵素複合体は、第Ｘ因子ポリペプチドから第Ｘａ因子ポリペプチドへの変換を触媒することができる。第Ｘａ因子ポリペプチドの活性は、発色基質（例えば、ＳＸａ－１１）の切断を触媒して、ｐＮＡを生成させることができる。生成されたｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍにおける発色（例えば、吸光度により測定）を求めることによって測定することができる。第Ｘ因子ポリペプチド、従って第Ｘａ因子ポリペプチドは、過剰に提供される。従って、律速因子は、第ＶＩＩＩａ因子ポリペプチドとなる。従って、生成されるｐＮＡのレベルは、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドによって生成される第Ｘａ因子ポリペプチドの量に比例し、これは、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドの活性に比例する。サンプル中の第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドの活性は、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドの補因子活性の指標である。

【0095】

例えば、好適な発色アッセイは、実施例で用いるＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ製のＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（Ｒｅｆ：２２１４０６）である。第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドの活性は、ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイを用いて測定することができる。

【0096】

比較に用いられる導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子をコードしていてよく、具体的には、当技術分野で周知のＢドメインが欠失している短くした第ＶＩＩＩ因子（「ＳＯ」）等の短縮型又は改変型第ＶＩＩＩ因子をコードしていてよい。

【0097】

また、本発明は、（ｉ）本発明の転写調節エレメントと；（ｉｉ）本明細書で定義する導入遺伝子とを含むヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

【0098】

ベクターのヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を更に含んでいてもよい。シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、５０～１００ヌクレオチド長であってよい。シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、８０ヌクレオチドより短くてもよい。

【0099】

ベクターは、ＡＡＶベクター又は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター等のウイルス粒子であってもよい。

【0100】

本発明はまた、治療方法において使用するためのＡＡＶ又はｒＡＡＶベクターであって、任意で、該治療方法が遺伝子治療方法であるベクターを提供する。治療方法又は遺伝子治療方法は、血友病Ａの治療であってよい。

【0101】

本発明はまた、有効量のＡＡＶ又はｒＡＡＶを投与することを含む治療方法であって、任意で、該治療方法が、遺伝子治療方法及び／又は血友病Ａの治療方法である方法を提供する。

【0102】

本発明はまた、治療方法におけるＡＡＶ又はｒＡＡＶの使用であって、任意で、該治療方法が、遺伝子治療の方法及び／又は血友病Ａの治療方法である使用を提供する。

【0103】

「遺伝子治療」は、導入遺伝子（第ＩＸ因子ヌクレオチド配列等）を発現することができる本発明のベクターを、それが投与される宿主に投与することを含む。

【0104】

任意で、治療方法は、血友病（例えば、血友病Ａ又はＢ）又はフォン・ヴィルブランド病等の凝固障害を治療する方法である。好ましくは、凝固障害は、出血の増加及び／又は凝固の減少を特徴とする。任意で、治療方法は、血友病、例えば血友病Ａの治療方法である。幾つかの実施形態では、治療方法は、本発明のベクターを患者に投与することを含む。任意で、患者は、血友病Ａに罹患している患者である。任意で、患者は、第ＩＸ因子に対する抗体又は阻害因子を有している。任意で、ベクターは静脈内に投与される。任意で、ベクターは、患者に１回だけ投与（すなわち、単回投与）するためのものである。

【0105】

上記方法において血友病Ａを「治療」する場合、これは、血友病の１つ以上の症状が寛解することを意味する。血友病の症状が完全に改善され、その結果、患者においてもはや症状が存在しなくなることを意味するものではないが、幾つかの方法では、そのような場合もある。治療方法により、血友病Ａの症状のうちの１つ以上の重症度が治療前よりも低くなり得る。任意で、投与前の状況に対して、治療方法は、患者の血液中の循環第ＶＩＩＩ因子の量／濃度、及び／又は患者の所与の体積の血液内で検出可能な第ＶＩＩＩ因子活性の全体レベル、及び／又は患者の血液中の第ＶＩＩＩ因子の比活性（第ＩＸ因子タンパク質の量あたりの活性）を増加させる。

【0106】

「治療上有効な量」とは、例えば、（血友病Ｂの症状を寛解させるのに十分なレベルの機能的第ＶＩＩＩ因子が生成されるように）被験体における機能的第ＩＸ因子のレベルを上昇させる等の所望の治療結果を達成するために必要な投与量及び期間において有効な量を指す。

【0107】

任意で、患者の体重１ｋｇあたりベクターゲノム１×１０^１１個未満、１×１０^１２個未満、５×１０^１２未満、２×１０^１２個未満、１．５×１０^１２個未満、３×１０^１２個未満、１×１０^１３個未満、２×１０^１３個未満、又は３×１０^１３個未満の用量のベクターが投与される。任意で、投与されるベクター／ウイルス粒子の用量は、被験体が、血友病ではない健常被験体の第ＶＩＩＩＩ因子活性の１０％～９０％、２０％～８０％、３０％～７０％、２５％～５０％、２０～１５０％、３０～１４０％、４０％～１３０％、５０～１２０％、６０％～１１０％、又は７０～１００％の活性で第ＶＩＩＩ因子を発現するように選択される。

【図面の簡単な説明】

【0108】

次に、以下の図面を参照して本発明を非限定的な例によって説明する。

【図1】本発明の幾つかの転写調節エレメント（内部呼称ＦＲＥ４３、ＦＲＥ４９、ＦＲＥ５６、ＦＲＥ５９、ＦＲＥ６３、及びＦＲＥ７２が割り当てられる）の模式図を示し、保持されるＨＬＰ２ ＴＲＥのヌクレオチド領域を示す（陰影領域）。矢印は、コア領域の断片の５’領域への挿入（＊）及びヌクレオチド２４３～２８３の欠失に続くＨＬＰ２のヌクレオチド２６５～２７２の挿入（＊＊）を示す。

【図2】比較の目的でＨＬＰ２ ＴＲＥに由来する様々な転写調節エレメントのグローバル配列アラインメントを示す。コンセンサス領域又はコア領域の一部を形成するヌクレオチド（すなわち、ＨＬＰ２のヌクレオチド１７０～２４２）を示す（＊）。

【図3】以下に記載する実験において使用するための全体的な第ＶＩＩＩ因子発現カセットの一部としての本発明の転写調節エレメント（ＴＲＥ）を示す。ループ状逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が、本発明の転写調節エレメント（Ｐ）、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列（ＳＰ）、短縮型第ＶＩＩＩ因子をコードしているヌクレオチド配列（ｈＦＶＩＩＩ－ＳＱ）、及び合成ポリＡ配列（ＳＰＡ）を含むカセットを挟んでいる。発現カセットの全長（Ｌ）は、明らかに、様々なエレメントの長さに依存する。

【図4】第ＶＩＩＩ因子発現カセットにおける本発明の例示された転写調節エレメントを用いて実施した２つの（４Ａ－Ｃ ｉ及びｉｉ）インビトロ試験の結果を示す。ＨｕＨ７細胞に、関心対象のＴＲＥを含むＦＶＩＩＩ－ＳＱコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、培養上清中のＦＶＩＩＩ活性のレベルを分析した。４Ａ）ｉ）及び４Ａ）ｉｉ）は、ＦＶＩＩＩレベル（％ＦＶＩＩＩ：Ｃ、後述のＦＶＩＩＩ発色活性アッセイを用いて決定）を示し；４Ｂ）ｉ）及び４Ｂ）ｉｉ）は、対応するトランスフェクトされたウェルからのルシフェラーゼ活性レベルを示し；４Ｃ）ｉ）及び４Ｃ）ｉｉ）は、ルシフェラーゼ発現レベルに対して正規化した４Ａ）ｉ）及び４Ａ）ｉｉ）からのＦＶＩＩＩレベルを示し；それにより、転写調節エレメントの相対効力を示す。比較の目的でＨＬＰ２を提供する。棒グラフは、トリプリケートの実験からの平均値を表す。ＲＬＵ＝相対発光単位。

【図5】第ＶＩＩＩ因子発現カセットにおける本発明の例示された転写調節エレメントを用いて実施したインビボ試験の結果を示す。６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０^１２ｖｇ／ｋｇのウイルスベクターを静脈内注射した。コンストラクトあたり６頭のマウスに注射した。注射後２８日目にマウスを選別し、クエン酸抗凝固剤中に血液を収集した。血液及びマウス肝臓を分析のために提供した。血液は、ＦＶＩＩＩ分析を実行するために使用した、一方、肝生検は、ベクターゲノムを算出するために使用した。５Ａ）ｉ）、５Ａ）ｉｉ）、５Ａ）ｉｉｉ）、及び５Ａ）ｉｖ）は、第ＶＩＩＩ因子の抗原レベル（後述のＦＶＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡ抗原アッセイを用いて決定）を示し；５Ｂ）ｉ）、５Ｂ）ｉｉ）、５Ｂ）ｉｉｉ）、及び５Ｂ）ｉｖ）は、肝臓細胞当たりの推定ベクターゲノム数を示し；５Ｃ）ｉ）、５Ｃ）ｉｉ）、５Ｃ）ｉｉｉ）、及び５Ｃ）ｉｖ）は、細胞あたりのベクターゲノムに対して正規化したＦＶＩＩＩ抗原レベルを示し；それにより、転写調節エレメントの相対効力を示す。棒グラフは、平均値（ｎ＝６）を表す。

【図6】ＦＲＥ７２のプロモーター忠実度に関するインビトロ試験の結果を示す。ＦＲＥ７２のプロモーター忠実度を、様々な異なる組織からの細胞株で評価した；Ｈｕｈ７：肝臓。ＨＥＫ２９３Ｔ：腎臓。ＰＡＮＣ１：膵臓。ＢｘＰＣ－３：膵臓。ＭＣＦ７：乳腺。１６４３：神経芽腫。ＭＲＣ－９：肺。６９７：初期Ｂ細胞。１×１０^５のＭＯＩで対照ベクターＡＡＶＳ３．ＣＡＧ．ＧＦＰ若しくはＡＡＶＳ３．ＦＲＥ７２．ＧＦＰを細胞に形質導入した、又は未処理とした。図６は、各細胞型につき３つの列を示す；各細胞型の左側の列（灰色）は、ＡＡＶＳ３．ＦＲＥ７２．ＧＦＰを形質導入した細胞に関し；各細胞型の中央の列（黒色）は、対照ベクターを形質導入した細胞に関し；各細胞型の右側の列（白色）は、未処理の細胞に関する。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＭＣＦ－７細胞では、左側（「灰色」）の列が小さすぎて、図６では見えず；同様に、ＨＥＫ２９３Ｔ、１６４３、及び６９７細胞では、右側（「白」）の列が小さすぎて、図６では見えない。

【図7】ＦＲＥ７２プロモーターの寿命延長を確認するために実施したインビボ試験の結果を示す。ＦＲＥ７２プロモーターの転写制御下にあるＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子を含むＡＡＶ８コンストラクトを調製し、野生型マウスに投与した。尾部採血により（注射後３１日目、５６日目、１０４日目）、そして、最後は心臓穿刺を介して（注射後２３０日目）血液サンプルを採取した。各サンプル中のＦＶＩＩＩ抗原量を測定し、データ点をグラフに示す。棒グラフは中央値を表す。

【図8】Ｈｕｈ７細胞にプラスミドをトランスフェクションした後のヒトタンパク質の発現を比較したインビトロ試験の結果を示す。プラスミドは、ＦＲＥ７２プロモーター、又は公知のＨＣＲ－ｈＡＡＴ若しくはＨＬＰ２プロモーターのいずれかを使用した。トランスフェクション後３日目に培養上清中のタンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。トランスフェクション効率を正規化するために、ＣＭＶ－ルシフェラーゼ対照プラスミドをコトランスフェクションベクターとして使用した。図８Ａは、ルシフェラーゼ補正前の結果を示し、図８Ｂは、ルシフェラーゼ補正後の結果を示す。棒グラフは中央値を表す。

【発明を実施するための形態】

【0109】

一般的定義
特に定義しない限り、本明細書で使用されるの技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0110】

一般に、「含む」という用語は、含むがそれには限定されないことを意味することを意図する。例えば、「コアヌクレオチド配列を含む転写調節エレメント」という語句は、転写調節エレメントが少なくともコアヌクレオチド配列を有するが、追加のヌクレオチド配列等の更なる構成要素を含んでいてもよいことを意味すると解釈されるべきである。

【0111】

本発明の幾つかの実施形態では、単語「含む」は、語句「からなる」又は語句「から本質的になる」に置き換えられる。「からなる」という用語は、限定的であることを意図する。例えば、「配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるコアヌクレオチド配列」という語句は、コアヌクレオチド配列が配列番号２を参照して定義され、それ以上何も含まないことを意味すると理解されるべきである。同様に、「配列番号２から本質的になるコアヌクレオチド配列」という語句は、コアヌクレオチド配列が、転写調節エレメントの機能に実質的に影響を与える追加のヌクレオチド配列を含まないことを意味すると理解されるべきである。

【0112】

本発明の目的で、２つの配列（２つのポリヌクレオチド配列等）の同一性パーセントを求めるために、最適な比較目的のための配列のアラインメントをとる（例えば、第２の配列と最適なアラインメントをとるために第１の配列にギャップを導入してもよい）。次いで、各位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、その位置のヌクレオチドは同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有されている同一位置の数の関数である（すなわち、同一性パーセント＝同一位置の数／参照配列における位置の総数×１００）。

【0113】

通常、配列比較は、参照配列の全長に対して行われる。例えば、所与の（「試験」）配列が配列番号１に対して９５％同一であるかどうかをユーザが判定したい場合、その例では配列番号１が参照配列となる。ヌクレオチド配列が配列番号１（参照配列の一例）に対して少なくとも８０％同一であるかどうかを評価するために、当業者は配列番号１の全長に対してアライメントを実施し、試験配列中の何箇所が配列番号１と同一であるかを特定する。位置の少なくとも８０％が同一である場合、試験配列は配列番号１に対して少なくとも８０％同一である。配列が配列番号１よりも短い場合、ギャップ又は欠損位置は非同一位置であるとみなされるべきである。

【0114】

誤解を避けるため、「少なくとも８０％の同一性」、「少なくとも９０％の同一性」、「少なくとも９５％の同一性」、及び／又は「少なくとも９８％の同一性」に対する言及は全て、暗に１００％の同一性を含むと読み取られるべきであることが理解されるであろう。

【0115】

当業者は、２つの配列間の相同性又は同一性を求めるために利用可能な様々なコンピュータプログラムを認識している。例えば、配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。実施形態では、２つのアミノ酸又は核酸の配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重みを用いて、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを用いて求められる。

【0116】

「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、及び「ポリヌクレオチド配列」という用語は、互いに同義であることを意図しており、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指す。核酸には、天然の、合成の、及び改変又は変更されたポリヌクレオチドが含まれる。「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はこれらのアナログであってもよい。

【0117】

「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、又は「ポリヌクレオチド配列」がある長さを有すると称される場合、これは一般に、例えば４，０００（又は４ｋ）ヌクレオチド等の所与の数のヌクレオチドを指す。あるいは、ヌクレオチド配列の長さは、所与の数の塩基対（ｂｐ）（例えば、１１８ｂｐ）として定義することもできる。「塩基対」という用語は、一般に、二本鎖のヌクレオチドを指すことが理解される。しかし、当技術分野では、例えばその相補鎖と並べたときにそれが有する塩基対の数によって一本鎖（ｓｓ）核酸に言及することも珍しくはない。従って、塩基対による長さへの単なる言及は、ヌクレオチドをその二本鎖形態に限定するものと解釈されるべきではなく、本出願の目的のために、「４ｋ ｂｐ」及び「４ｋヌクレオチド」という用語は同義であるとみなされるべきである。

【0118】

ある範囲の可能な配列の長さに言及するとき、「～」という用語は、その範囲の端点を含むと理解されるべきである。従って、「８０～２８０ヌクレオチド」に対する言及は、８０ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列を含み、２８０ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列も含む。同様に、ヌクレオチドの配列、例えば「配列番号１のヌクレオチド３０３～３３５によって定義される配列」への言及は、その配列内の列挙されたヌクレオチド３０３及び３３５を含むと理解されるべきである。

【0119】

ポリヌクレオチド等の核酸分子は、直鎖状である場合「５’末端」及び「３’プライム末端」を有する。「５’末端」は、その５’リン酸がペントース環の３’酸素に連結されていないことによって定義される。「３’末端」は、その３’酸素がペントース環の５’リン酸に連結されていないことによって定義される。しかし、「５’」及び「３’」という用語は、当技術分野では、核酸分子内の相対的な位置を指すものとしても理解される。従って、例えば、特定の核酸又は核酸の配列は、該特定の核酸又は核酸の配列が所与の配列よりも５’末端に近い場合、該所与の配列に対して５’に又は該所与の配列の５’に位置していると言うことができる。同様に、特定の核酸又は核酸の配列は、該特定の核酸又は核酸の配列が所与の配列よりも３’末端に近い場合、該所与の配列に対して３’に又は該所与の配列の３’に位置していると言うことができる。「上流」又は「下流」等の用語も、このような相対的な位置を説明するために用いられ；本願内では、「に対して５’」、「に対して５’に位置する」、「の５’」、「の５’に位置する」、及び「上流」という用語は全て同義であるとみなされるものとする。同様に、「に対して３’」、「に対して３’に位置する」、「の３’」、「の３’に位置する」、及び「下流」という用語は全て同義であるとみなされる。別の配列の３’又は５’であると記載されたヌクレオチド配列は、直接隣接していなくてもよい；すなわち、それらの間に１つ以上の追加の配列が介在していてもよいことが理解されるであろう。

【0120】

「転写調節エレメント」とは、該転写調節エレメントが作動可能に連結された核酸（通常、遺伝子）の発現に影響を及ぼす、制御する、又は効果をもたらす核酸配列（複数可）を指す。転写調節エレメントとしては、プロモーター及びエンハンサーが挙げられる。任意で、本発明の転写調節エレメントは、プロモーター及びエンハンサーを含む。ＡＡＶ又はｒＡＡＶベクター配列等のベクター配列は、一般に、導入遺伝子等の異種ポリヌクレオチドの転写を促進するために１つ以上の「転写調節エレメント」を含む。

【0121】

用語「作動可能に連結された」とは、本発明の転写調節エレメントが、別の核酸配列（導入遺伝子等）を発現させるように、該別の核酸配列に対して適切な位置に存在することを意味する。

【0122】

本発明の転写調節エレメントは、組織特異的であってもよい、すなわち、特定の細胞型において、他の組織型よりも大きく転写を誘導／開始させることができる。例えば、本発明の転写調節エレメントは、肝臓特異的であってよい。

【0123】

本発明の転写調節エレメントは、遺伝子治療において使用するためのＡＡＶベクター内に含まれていてよい。「遺伝子治療」は、導入遺伝子（第ＶＩＩＩ因子をコードしているヌクレオチド配列等）を発現させることができるＡＡＶ／ウイルス粒子を、それが投与される宿主に投与することを含む。このような場合、ベクタープラスミドは、一般に、発現カセットを含む。

【0124】

本明細書において記載するとき、「発現カセット」とは、導入遺伝子と、該導入遺伝子に作動可能に連結された本発明の転写調節エレメントとを含む核酸のヌクレオチド配列を指す。任意で、カセットは、エンハンサー、イントロン、非翻訳領域、転写ターミネーター等の追加の転写調節エレメントを更に含む。

【0125】

発現カセットは、少なくとも１つのＩＴＲを含んでいてもよい。発現カセットは、より典型的には、２つのＩＴＲ（一般に、発現カセットのいずれの末端にも１つ、すなわち、５’末端に１つ、３’末端に１つ）を含む。発現カセットとＩＴＲのうちの１つ以上との間に介在する配列が存在していてもよい。発現カセットは、２つの通常のＩＴＲ間に位置するか、又は２つのＤ領域で遺伝子操作されたＩＴＲの両側に位置するウイルス粒子に組み込まれてもよい。任意で、発現カセットは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及び／又はＡＡＶ６に由来するＩＴＲ配列を含む。好ましくは、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。

【0126】

「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞に導入されることを意図する（又は、例えばベクターを介して導入された）核酸（通常、異種）を指す。導入遺伝子は、特定の関心対象のポリペプチド若しくはタンパク質をコードしている遺伝子であってもよく、又は例えば、任意でｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ若しくはｓｎＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ若しくは他の阻害性核酸である非翻訳ＲＮＡをコードしていてもよい。導入遺伝子が肝臓で発現することを意図している場合、転写調節エレメントは肝臓特異的であってもよい、すなわち、肝臓細胞において他の組織型よりも実質的に多くのタンパク質発現を促進する。任意で、ＴＲＥは、肝臓特異的プロモーターであってよく、これは、ヒト肝臓特異的プロモーターであってよい。導入遺伝子は、任意の好適な遺伝子であってよい。ベクタープラスミドが遺伝子治療において使用するためのものである場合、導入遺伝子は、疾患を治療するために用いることができるタンパク質又はヌクレオチドの配列を含むか又はコードしている任意の遺伝子であってよい。例えば、導入遺伝子は、酵素、代謝タンパク質、シグナル伝達タンパク質、抗体、抗体断片、抗体様タンパク質、抗原、又はｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡ等の非翻訳ＲＮＡをコードしていてよい。

【実施例】

【0127】

材料及び方法
ＦＶＩＩＩコンストラクト
ヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱ（上述のようにＢドメインの代わりに１４アミノ酸のリンカー領域を含有するＦＶＩＩＩをコードしている）のｃＤＮＡを、肝臓特異的プロモーター駆動型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにクローニングした。

【0128】

２つの異なるコドン最適化ＦＶＩＩＩバリアント（「ｃｏ０２」及び「ｃｏ１９」と称する）を使用した。ＡＡＶ組換え体のゲノムサイズを小さくするために、以下に記載する通りの多数の小さな肝臓特異的プロモーターを設計した。

【0129】

ＡＡＶベクターの作製
ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐ機能、アデノウイルスヘルパー機能、並びにＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接するＦＶＩＩＩ発現カセットを含有する組み換え体ゲノムをコードしているプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトリプルプラスミドトランスフェクトすることによってＡＡＶ粒子を作製した。トランスフェクションの７２時間後に細胞ペレット及び上清を収集し、ＰＯＲＯＳ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ及びＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等の樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによってＡＡＶ粒子を精製した。次いで、ＡＡＶをＰＢＳに一晩透析し、４℃で保存し、ｑＰＣＲによって滴定した。

【0130】

アッセイ
ＦＶＩＩＩ発色活性アッセイ
Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩＩ：Ｃ発色アッセイ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ，ｒｅｆ ２２１４０６）は、ＦＶＩＩＩ ＦＶＩＩＩ：Ｃの補因子活性を測定する。

【0131】

トロンビン活性化を通して、ＦＶＩＩＩ：Ｃポリペプチドはヒト第ＩＸａ因子、リン脂質、及びカルシウムと複合体を形成する。これら条件下では、このアッセイにおいて特定の濃度で過剰に提供された第Ｘ因子が第Ｘａ因子に変換される（活性化される）。この生成される第Ｘａ因子は、律速因子であるＦＶＩＩＩ：Ｃに正比例する。第Ｘａ因子は、発色基質であるＳｘａ－１１によって直接測定される。第Ｘａ因子は、発色基質を切断し、ｐＮＡを放出させる。ｐＮＡの生成は第Ｘａ因子活性に比例し、これは、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性に直接関連する。放出されたｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍで発色を測定することによって求めることができ、これは、サンプル中の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子によって生成される第Ｘａ因子ポリペプチドの量に相対し、これは、サンプル中のＦＶＩＩＩ：Ｃの活性に比例する。

【0132】

製造業者の指示書に従ってアッセイを実施する。簡潔に述べると、３７℃でプレインキュベートしたマイクロプレートウェルに、５０μＬの較正物質である血漿、（試薬Ｒ４で）希釈した試験血漿、又は細胞上清／溶解物、又は対照を添加し、続いて、試薬Ｒ１及びＲ２をそれぞれ５０μＬずつ添加し、これを６ｍＬの蒸留水で再構成し、３７℃に予熱する。混合後、これら成分は１５０μＬの反応液を形成し、これを３７℃で５分間インキュベートする。その後、反応に試薬Ｒ３を補給し、それ自体を６ｍＬの蒸留水に再懸濁させ、３７℃に予熱し、２００μＬの混合液を３７℃で更に５分間インキュベートする。５０μＬの２０％酢酸又はクエン酸（２０ｇ／Ｌ）を添加することによって反応を停止させた後、得られた２５０μＬの混合液の吸光度を４０５ｎｍで測定する。

【0133】

試薬：
Ｒ１－フィブリン重合阻害剤の存在下で凍結乾燥させたヒト第Ｘ因子。
Ｒ２－活性化試薬－第ＩＸａ因子（ヒト）、一定かつ最適化された濃度、ヒトトロンビン、カルシウム、及び合成リン脂質を含有、凍結乾燥。
Ｒ３－ＳＸａ－１１－発色基質、第Ｘａ因子に特異的、凍結乾燥、トロンビン阻害剤入り。
Ｒ４－Ｔｒｉｓ－ＢＳＡバッファ。１％ＢＳＡ、ＰＥＧ、ＦＶＩＩＩ：Ｃ安定剤、及びアジ化ナトリウム（０．９ｇ／Ｌ）を含有。

【0134】

発色活性アッセイからの読み出しに関連して、「％ＦＶＩＩＩ活性」（「％ＦＶＩＩＩ：Ｃ」とも称される）は「％正常」であり、これは、例えば、ＨｕＨ－７細胞におけるＦＶＩＩＩ発現カセットの発現の文脈において、１００％ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト血漿サンプルに関連して、ＨｕＨ－７細胞におけるＦＶＩＩＩ発現カセットの発現後の上清中で検出されたＦＶＩＩＩ活性が、１００％ＦＶＩＩＩ活性を有する該ヒト血漿サンプル中で検出されたＦＶＩＩＩ活性の指定の％であることを意味する。

【0135】

ＦＶＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡ抗原アッセイ
Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩＩ：Ａｇキット（Ｓｔａｇｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ｒｅｆ ００２８０）は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により血漿中のＦＶＩＩＩを定量するための抗原性アッセイである。アッセイしたサンプル中のＦＶＩＩＩは、プラスチック製マイクロプレートウェルの壁にプレコーティングされたマウスモノクローナル抗ヒトＶＩＩＩ：Ａｇ抗体によって捕捉される。十分なインキュベーション及び洗浄により非特異的結合を減少させた後、ペルオキシダーゼと結合したマウス抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体が、捕捉されたＦＶＩＩＩの残りの遊離抗原決定基に結合する。次いで、結合したペルオキシダーゼがＴＭＢ基質によって明らかになる。強酸を添加することによって、ＴＭＢによって誘導される発色を停止させる。発色の強度は、４５０ｎｍで吸光度を測定することにより求められる、アッセイしたサンプル中のＦＶＩＩＩ濃度に正比例する。

【0136】

このアッセイからの読み出しは、「％正常」として表してよく、これは、例えば、マウスにおけるＦＶＩＩＩコンストラクトの発現の文脈において、１００％ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト血漿サンプルに関連して、マウス血漿サンプル中で検出されたＦＶＩＩＩ分子（厳密には、エピトープ）の数が、１００％ＦＶＩＩＩ活性を有する該ヒト血漿サンプル中で検出されたＦＶＩＩＩ分子／エピトープの数の指定の％であることを意味する。

【0137】

上記の活性及び抗原の両アッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ（活性又は抗原レベル）は、ＷＨＯ国際標準（ＮＩＢＳＣコード０７／３１６）に対して較正された、製造業者によって推奨又は同梱された既知のＦＶＩＩＩ活性又は抗原（必要に応じて）の凍結乾燥ヒト血漿サンプルを用いて、マウス又はヒト細胞上清のサンプルで定量される。

【0138】

実施例１－小さな肝臓特異的転写調節エレメントの設計及び選択
ＨＬＰ２ ＴＲＥに基づく多数の異なるＴＲＥを設計し、全長に基づいて選択した。様々な脊椎動物の関連するα－１－アンチトリプシンのＴＲＥにおける保存領域からの判断に基づいて、ＴＲＥへの欠失を適用した。驚くべきことに、ＨＬＰ２ ＴＲＥよりも著しく短いが、ある程度の機能を保持しているＴＲＥを作製できることが見出された。場合によっては、以下の例に示す通り、活性レベルは少なくともＨＬＰ２ ＴＲＥと同程度である。

【0139】

図１は、ＨＬＰ２ ＴＲＥ及び本発明の多数の転写調節エレメントの模式図を示す。陰影領域は、ＨＬＰ２が由来するα－１－アンチトリプシンＴＲＥに高度に保存されていることを本発明者らが見出したヌクレオチド配列を表す。欠失させる領域を同定したら、欠失自体は公知の技術を用いて行った。公知のＤＮＡ合成技術を用いることによって、本明細書に開示された配列に従って転写調節エレメントを作製することができる。従って、本発明の転写調節エレメントは、欠失を用いてＨＬＰ２配列の必要な部分を除去することによってＨＬＰ２ ＴＲＥから誘導することもでき；あるいは、本発明のＴＲＥは、部位特異的変異誘発を介して合成することもできる。

【0140】

以下の転写調節エレメントを設計し、試験した（比較対象としてＨＬＰ２を使用した）：
・ＦＲＥ４３（配列番号２４）
・ＦＲＥ４９（配列番号２５）
・ＦＲＥ５６（配列番号２６）
・ＦＲＥ５９（配列番号２７）
・ＦＲＥ６３（配列番号２８）
・ＦＲＥ７２（配列番号２９）

【0141】

少なくとも基本的なレベルの機能を有する転写調節エレメントを得るために必要な最小限の長さを求めるために、更に３つの転写調節エレメントを設計し、試験した：
・ＦＲＥ４６は、配列番号２によって定義される「コアヌクレオチド配列」からなる。従って、ＦＲＥ４６は、配列番号１のヌクレオチド１７０～２４２に対応し、７３ヌクレオチド長である。
・ＦＲＥ４７は、配列番号２によって定義される「コアヌクレオチド配列」と共に、「コアヌクレオチド配列」に対して３’に位置する配列番号６によって定義されるＴＳＳ配列からなる。従って、ＦＲＥ４７は、配列番号１のヌクレオチド１７０～２４２＋ヌクレオチド２９７～３０２に対応し、７９ヌクレオチド長である。
・ＦＲＥ４８は、配列番号３によって定義される「拡大コアヌクレオチド配列」と共に、「拡大コアヌクレオチド配列」に対して３’に位置する配列番号６によって定義されるＴＳＳ配列からなる。従って、ＦＲＥ４８は、配列番号１のヌクレオチド１６３～２４２＋ヌクレオチド２９７～３０２に対応し、８６ヌクレオチド長である。

【0142】

図２は、上記の方法を用いて得られた上記転写調節エレメントのヌクレオチド配列を示す。比較目的のために、ＨＬＰ２のヌクレオチド配列を提供する。

【0143】

実施例２－インビトロにおける評価
設計した転写調節エレメントの活性をインビトロで評価するために、ヒト凝固因子ＶＩＩＩバリアント（ＦＶＩＩＩ－ＳＱ；すなわち、例えばＬｉｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９５前喝に記載の通り、Ｂドメインの代わりに１４ｂｐのリンカー領域を含有するＦＶＩＩＩ）の「ｃｏ０２」と命名されたコドン最適化導入遺伝子の上流に位置するそれぞれのＴＲＥ（ＨＬＰ２（比較目的のため）又は上記実施例１で定義したもののうちの１つ）を含む候補プラスミドで、肝臓細胞由来の細胞癌細胞株ＨｕＨ７を一過的にトランスフェクトした。「ｃｏ０２」配列を配列番号３１として提供する。導入遺伝子及び転写調節エレメントは、ＡＡＶ２からのＩＴＲに隣接していた。ＤＭＥＭ低グルコース＋１０％ ＦＢＳ＋ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｄ１０培地）において、１２ウェルプレートの１ウェルあたり合計２．５×１０^５個のＨｕｈ７細胞を播種した。実験をトリプリケートで実施した。

【0144】

プラスミドの一過性トランスフェクションについては、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクションプロトコルに従って、細胞播種の２４時間後に１．８μｇのプラスミド（上記の通り設計）及び０．２μｇのＣＭＶ－ルシフェラーゼプラスミドを混合し、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ Ｒｅａｇｅｎｔ（８μＬ）に添加した。トランスフェクション効率をモニタリングするために、ＣＭＶ－ルシフェラーゼプラスミド（全プラスミドの１０％）を各トランスフェクションに含めた。

【0145】

トランスフェクション後（約１８時間後）、培地を５００μＬの新鮮ＤＭＥＭ低グルコース＋１０％ ＦＢＳ＋ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｄ１０培地）に交換した。２４時間後、培地を新鮮ＤＭＥＭ低グルコース＋ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｄ０培地）に交換した。翌日、すなわちトランスフェクション後３日目に、細胞及び培地を収集した。

【0146】

ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃ（６）（ｒｅｆ．２２１４０６）キットを用いてＦＶＩＩＩ活性を評価した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３において吸光度を測定した。並行して、細胞を溶解させ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ３９７Ａ溶解バッファ）、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１５０１）に供してルシフェラーゼ発現を測定した。ＦＶＩＩＩ活性を正規化するための内部対照として、ルシフェラーゼ発現を使用した。ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を使用して解析を行った。

【0147】

インビトロ実験の結果を図４に示す。最も関連性の高いパネルは、４（Ｃ ｉ）及び４（Ｃ ｉｉ）であり、これらは、トランスフェクションのレベルに対して正規化したときの、様々なＴＲＥによって達成された相対平均ＦＶＩＩＩ発現を示す。

【0148】

実施例３－インビボにおける評価
ＡＡＶ８キャプシドによってキャプシド形成されたヒトＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードしているコドン最適化ヌクレオチド配列（「ｃｏ１９」と命名）を含むゲノムを有するＡＡＶ粒子を上記の通り作製した。「ｃｏ１９」配列を配列番号３２として提供する。上記の通り、ＡＡＶ粒子を作製した。

【0149】

図３は、上記の方法を用いて得られたカセットを示す模式図を提供する。エレメントＰは、ＨＬＰ２に由来するか又はＨＬＰ２である、プロモーター／エンハンサー等の転写調節エレメントを表す（これらに由来するＴＲＥの有用性を評価するために比較目的で使用した）。ネイティブのＦＶＩＩＩシグナルペプチドを、７２ｂｐ長の異種シグナルペプチド（「ＳＰ８」と称する）の野生型コード配列に置き換えた。

【0150】

６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０^１２ｖｇ／ｋｇのウイルスベクターを静脈内注射した。コンストラクトあたり６頭のマウスに注射した。注射後２８日目にマウスを選別し、クエン酸抗凝固剤中に血液を収集した。血液及びマウス肝臓を分析のために提供した。

【0151】

血液は、ＦＶＩＩＩ分析を実行するために使用し、一方、肝生検は、ベクターゲノムを算出するために使用した。

【0152】

ＡＡＶ注射後の肝臓細胞あたりのベクターゲノム数を求めるために、製造業者の指示書に従ってＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて約４０ｍｇの凍結肝臓サンプルからＤＮＡを単離した。製造業者の指示書に従ってＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑ－ＰＣＲ）増幅を行った。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてｑ－ＰＣＲを行った。ＡＡＶのコピー数を推定することができるようにするために、導入遺伝子を定量するためのプライマーセットを設計した。標準曲線からゲノムコピー数を算出し、その後、ｑＰＣＲによって定量したマウスＧＡＰＤＨに対して正規化した。

【0153】

ＡＡＶ注射後のＦＶＩＩＩタンパク質のレベルを求めるために、製造業者の指示書に従ってＡｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）によって、クエン酸処理した血漿からのＦＶＩＩＩ抗原レベルを測定した。必要であると思われる場合、更に希釈を行った。

【0154】

結果を図５に示す。最も関連性の高いパネルは、図５（Ｃ）（ｉ）～５（Ｃ）（ｉｖ）であり、これらは、細胞あたりのウイルスゲノムレベルに対して正規化した相対ＦＶＩＩＩレベルを示す。

【0155】

実施例４－ＦＲＥ７２の組織特異性の評価
図６は、ＦＲＥ７２のプロモーター忠実度に関するインビトロ試験の結果を示す。ＦＲＥ７２のプロモーター忠実度を、様々な異なる組織からの細胞株で評価した；Ｈｕｈ７：肝臓。ＨＥＫ２９３Ｔ：腎臓。ＰＡＮＣ１：膵臓。ＢｘＰＣ－３：膵臓。ＭＣＦ７：乳腺。１６４３：神経芽腫。ＭＲＣ－９：肺。６９７：初期Ｂ細胞。１×１０^５のＭＯＩで対照ベクターＡＡＶＳ３．ＣＡＧ．ＧＦＰ若しくはＡＡＶＳ３．ＦＲＥ７２．ＧＦＰを細胞に形質導入した、又は未処理とした。図６は、各細胞型につき３つの列を示す；各細胞型の左側の列（灰色）は、ＡＡＶＳ３．ＦＲＥ７２．ＧＦＰを形質導入した細胞に関し；各細胞型の中央の列（黒色）は、対照ベクターを形質導入した細胞に関し；各細胞型の右側の列（白色）は、未処理の細胞に関する。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＭＣＦ－７細胞では、左側（「灰色」）の列が小さすぎて、図６では見えず；同様に、ＨＥＫ２９３Ｔ、１６４３、及び６９７細胞では、右側（「白」）の列が小さすぎて、図６では見えない。

【0156】

実施例５－ＦＲＥ７２プロモーターはインビボで長期発現を提供する
ＦＲＥ７２プロモーターの転写制御下にあるＦＶＩＩＩ－ＳＱ導入遺伝子（ＦＶＩＩＩｃｏ１９－ＳＱと命名）を含むＡＡＶベクターをＡＡＶ８キャプシドでシュードタイプ化した。ＩＴＲ、プロモーター、及び導入遺伝子を含むベクターゲノムの全長は４８４５ｂｐであった（配列番号３４）。

【0157】

得られたＡＡＶ８ベクターを６～８週齢のＣ５７ＢＬ６野生型マウスの尾静脈に投与した。ベクターは注射前４℃で保存していた。２×１０^１２ｖｇ／ｋｇの用量を得るのに適切な接種材料を得るために、オリジナルのウイルス懸濁液を滅菌Ｘ－ｖｉｖｏ １０（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ０４－３８０Ｑ）で希釈した。

【0158】

注射後３１日目、５６日目、及び１０４日目に、各マウスの側尾静脈から１００μＬの血液サンプルを採取した。注射後２３０日目に最後の採血を行い、血液サンプルに従って選別された重度に麻酔された動物から心臓穿刺を介して最大体積（約１ｍＬ）の血液サンプルを採取した。回収した血液をクエン酸系抗凝固剤で希釈（１：１０希釈）し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。

【0159】

「材料と方法」に上記した通りＦＶＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡ抗原アッセイを使用して、血漿サンプルをＦＶＩＩＩ抗原レベルについて分析した。結果を図７に示す。棒は中央値を表す。

【0160】

実施例６－公知のＨＬＰ２及びＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーターに対するＦＲＥ７２の比較
ＦＲＥ７２プロモーター又は公知のＨＬＰ２若しくはＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーターのいずれかの制御下でヒトタンパク質をコードしているコドン最適化導入遺伝子配列を組み込んだ３つの別々の試験プラスミドＤＮＡコンストラクトを調製した。

【0161】

各プロモーターの発現レベルを比較するために、Ｈｕｈ７細胞（ＪＣＲＢ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ番号ＪＣＲＢ０４０３）を９６ウェルプレートのＤＭＥＭ低グルコース、１０％ ＦＢＳ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｄ１０培地）に播種し（１ウェルあたり３０，０００細胞）３７℃及び５％ＣＯ_２で培養した（１日目）。翌日（細胞播種の約２４時間後；２日目）、プラスミドＤＮＡ－トランスフェクション試薬混合物を調製し、Ｈｕｈ７細胞にトランスフェクトした。０．２２５μｇの試験プラスミドＤＮＡ及び０．０２５μｇのＣＭＶ－ルシフェラーゼ対照プラスミド（ＦＬＪ－ＰＬ２８２）を、ＤＮＡ１μｇあたり４μＬのＦｕＧＥＮＥ（又はプラスミドＤＮＡ０．２５μｇあたり１μＬのＦｕＧＥＮＥ）の比でＦｕＧｅｎｅと混合した。９６ウェルトランスフェクション実験では、１ウェルあたり１μＬのＦｕＧＥＮＥ混合物を添加した。プラスミドＤＮＡ－トランスフェクション試薬混合物を、３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩細胞においてでインキュベートした。

【0162】

翌朝（３日目）、トランスフェクションの約１８時間後に、培地を新鮮Ｄ１０培地に交換し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌朝（２４時間後；４日目）、培地を新鮮ＤＭＥＭ低グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋インスリン－トランスフェリン－セレンサプリメント（Ｄ０／ＩＴＳ培地）に交換した。翌日（５日目）、細胞及び培地を収集した。

【0163】

培養培地におけるタンパク質発現を、ＥＬＩＳＡキットを用いて評価した。ＥＬＩＳＡと並行して、Ｈｕｈ７細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ１５０１／Ｅ４５３０）のルシフェラーゼ溶解バッファ１００μＬで細胞を処理した。細胞溶解物を－８０℃で保存した。ルシフェラーゼアッセイの当日、細胞溶解物を解凍し、サンプル２０μＬを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘプレートリーダーにおいて発光によってルシフェラーゼ発現を測定した。詳細なプロトコルは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｉｔｉｎ ＃ＴＢ２８１に掲載されている。タンパク質レベルを正規化するための内部対照として、ルシフェラーゼ発現を使用した。ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を使用して解析を行った。

【0164】

結果を図８Ａ（ルシフェラーゼ補正前）及び図８Ｂ（ルシフェラーゼ補正後）に示す。

【0165】

【表1-1】

【0166】

【表1-2】

【0167】

配列
＞配列番号１－ＨＬＰ２ ＴＲＥ
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctgggcccatgccacctccaactggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc

＞配列番号２－コアヌクレオチド配列
agtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc

＞配列番号３－拡大コアヌクレオチド配列
cccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc

＞配列番号４－ＨＬＰ２の５’セクション（配列番号１の１１８～１６２）
tggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagat

＞ ＞配列番号５－ＨＬＰ２の３’セクション（配列番号１の２４３～２８３）
gttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggaca

＞ ＞配列番号６－ＴＳＳ
tcagct

＞ ＞配列番号７－ＴＳＳ
tcaggc

＞配列番号８－ＴＳＳ
cactga

＞配列番号９－３’セクション（配列番号１の２８４～３０２）
gggccctgtc tcctcagct

＞配列番号１０－ＦＲＥ４９、ＦＲＥ７２、及びＦＲＥ７５の３’セクション（配列番号１の２９７～３３５）
tcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc

＞配列番号１１－３’セクション、配列番号１の２６５～２７２
ttaaatac

＞配列番号１２－ＦＲＥ４３の３’セクション
gttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc

＞配列番号１３－ＦＲＥ５６、ＦＲＥ５９、及びＦＲＥ６３の３’セクション
ttaaatacgg gccctgtctc ctcagct

＞配列番号１４－ＨＬＰ２の５’セクション（配列番号１の１２～３３）
gcaaacattg caagcagcaa ac

＞配列番号１５－ＨＬＰ２の５’セクション（配列番号１の１２～４１）
gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca

＞配列番号１６－ＨＬＰ２の５’セクション（配列番号１の１～９８）
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctg

＞配列番号１７－ＨＬＰ２の５’セクション（配列番号１の１６３～１６９）
cccagcc

＞配列番号１８－ＦＲＥ４３の５’セクション
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctg

＞配列番号１９－ＦＲＥ４９の５’セクション
gcaaacattgcaagcagcaaacagcaaaca

＞配列番号２０－ＦＲＥ５６の５’セクション
cgtgttcctgctctttgtccctctgtcctacttagactaatatttgccttgggtactgcaaacaggaaatgggggagggac

＞配列番号２１－ＦＲＥ５９の５’セクション
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc

＞配列番号２２－ＦＲＥ６３の５’セクション
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggcgtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc

＞配列番号２３－ＦＲＥ７２の５’セクション
cccagcc

＞配列番号２４－ＦＲＥ４３ ＴＲＥ
ccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagacacctctctgagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc

＞配列番号２５－ＦＲＥ４９ ＴＲＥ
gcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc

＞配列番号２６－ＦＲＥ５６ ＴＲＥ
cgtgttcctgctctttgtccctctgtcctacttagactaatatttgccttgggtactgcaaacaggaaatgggggagggacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccttaaatacgggccctgtctcctcagct

＞配列番号２７－ＦＲＥ５９ ＴＲＥ
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccccccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccttaaatacgggccctgtctcctcagct

＞配列番号２８－ＦＲＥ６３ ＴＲＥ
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggcgtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccccccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccttaaatacgggccctgtctcctcagct

＞配列番号２９－ＦＲＥ７２ ＴＲＥ
cccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc

＞配列番号３０－ａｐｏＥエンハンサー、ＨＮＦ５
gcaaaca

＞配列番号３１－ｃｏ０２ ｃｏｄｏｐ ＦＶＩＩＩ－ＳＱ
atgcagattgagctgtctacctgcttctttctgtgcctgctgagattctgctttagtgctacaaggcgttactatctgggagctgtggagctgtcttgggattacatgcagtcagacctgggagagctgccagtggatgccagatttccccctcgagtgcccaagagcttcccttttaatacctctgtggtgtataagaaaaccctgtttgtggagtttaccgatcacctgttcaacattgctaagccaaggccaccctggatgggcctgctgggaccaacaatccaggctgaggtgtatgatacagtggtcatcaccctgaagaacatggcttcccaccctgtgtcactgcatgctgtgggagtgagctactggaaggccagtgagggagctgagtatgatgatcagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtgtttcctggaggctctcatacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggcccaatggctagtgatcccctgtgcctgacctacagctatctgtctcatgtggacctggtgaaggatctgaacagtggcctgattggagccctgcttgtgtgtcgtgaaggctctctggccaaggaaaagacccagacactgcataagttcatcctgctttttgctgtgtttgatgagggcaagtcctggcacagtgagacaaagaactccctgatgcaggacagggatgctgccagtgccagggcctggcccaagatgcatacagtgaatggctatgtgaataggtccctgcctggcctgattggatgtcacagaaagagtgtgtattggcatgtgattggcatgggcaccacacctgaggttcactccatcttcctggagggccatacctttcttgtgagaaaccacaggcaggccagtctggagatcagtcctatcaccttcctgacagcccagaccctgcttatggatctgggccagttcctgcttttttgccacatctccagtcaccagcatgatggcatggaggcttatgtgaaggtggactcctgtcctgaggaacctcagctgagaatgaagaacaatgaggaagctgaggactatgatgatgacctgacagactctgagatggatgtggttagatttgatgatgacaactctccttcctttattcaaatccgatcagtggccaagaaacacccaaagacatgggtgcattacattgctgcagaggaggaggactgggattatgctcctctggtgctggcccctgatgacaggtcctacaagtcccagtatctgaacaatggccctcagaggattggcagaaagtacaagaaagtgaggttcatggcttatacagatgagacattcaagacaagggaggccatccagcatgagagtggcatcctgggaccactgctttatggagaagtgggagacaccctgcttatcatttttaaaaaccaggcttccaggccctacaatatctatcctcatggcatcacggatgtgagacccctgtacagtaggagactgcctaagggagtgaagcacctgaaggacttcccaatcctgcctggagagattttcaagtataagtggacagtgacagtggaggatggcccaaccaagagtgaccccaggtgcctgacaagatactattcttcctttgtgaatatggagagggacctggcctctggcctgattggacctctgcttatctgttacaaggagtctgtggatcagagaggcaaccagatcatgagtgacaagaggaatgtgatcctgttcagtgtgtttgatgagaacaggtcttggtatctgacagagaacatccagagattcctgcccaatcctgctggagtgcaactggaggaccctgagtttcaggcctccaacatcatgcatagcatcaatggctatgtgtttgactccctccaactgagtgtgtgcctgcatgaggtggcttattggtacattctgagcattggagcccagacagatttcctgagtgtgttctttagtggctacaccttcaagcataagatggtgtatgaggacaccctgacactgttccccttttctggagagacagtgttcatgtccatggagaatcctggcctgtggattctgggctgccacaactctgatttccgtaatcgtggcatgacagcccttctgaaggtgtcttcctgtgacaagaacacaggagactactatgaggattcttatgaggacatcagtgcttatctgcttagcaagaacaatgccattgagccaaggagcttttctcagaatcctccagtgctgaagagacaccagagagagatcacgcgtaccacactccagagtgatcaggaggaaattgactatgatgacacaatcagtgtggagatgaaaaaggaggactttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccccaggtctttccagaagaaaaccagacattactttattgctgcagtggagagactgtgggattatggcatgtccagctctccacatgtgctgagaaatagagcccagagtggcagtgtgccccagttcaagaaagtggttttccaggagtttacagatggatcatttacacagcctctgtacagaggagagctgaatgagcatctgggcctgcttggcccatatatcagagctgaggtggaggataacatcatggtgaccttccgtaatcaggccagcaggccctactccttttattcatccctgatctcctatgaggaagaccagagacagggagctgagccaagaaagaactttgtgaagcccaatgagacaaagacctacttttggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaggatgagtttgattgcaaggcttgggcttacttcagtgatgtggatctggagaaggatgtgcattctggcctgattggaccactgcttgtgtgccataccaacacactgaatcctgctcatggcagacaagtgacagtgcaggagtttgccctgttctttaccatctttgatgagacaaagagctggtacttcacagagaacatggagaggaattgcagggctccttgtaacatccagatggaggacccaaccttcaaggagaactacagatttcatgctatcaatggctatatcatggatacactgcctggcctggtcatggctcaggaccagaggatcaggtggtatctgcttagcatgggctccaatgagaatatccacagcatccatttctctggccatgtgtttaccgtgagaaaaaaggaggaatataagatggccctgtacaacctgtatcctggagtgtttgagacagtggagatgctgccatctaaggctggcatctggagggtggagtgcctgattggagagcacctgcatgctggcatgtctaccctgtttctggtgtactccaataagtgtcagacaccactgggcatggccagtggccatatcagagatttccagatcacagcctctggacagtatggacagtgggctccaaagctggctagactgcactattctggctccatcaatgcctggtccaccaaggagcccttctcctggatcaaggtggacctgcttgctcccatgatcattcatggcatcaagacacagggagccaggcagaagttctcttccctgtacatcagccagtttatcatcatgtattctctggatggcaagaaatggcagacctacagaggcaattctacaggcacactgatggtgttctttggcaatgtggacagctctggcatcaagcacaacatcttcaatccccctatcattgctagatacatcagactgcaccctacccattattctatccgatccacactgagaatggagctgatgggctgtgatctgaacagctgttctatgccactgggcatggagtccaaggccatcagtgatgctcagatcacagcctccagctacttcaccaatatgtttgctacatggtcccctagcaaggccaggctgcacctccagggcagatccaatgcttggagacctcaagttaacaatccaaaggagtggctccaggtggattttcagaaaaccatgaaggtgacaggagtgaccacccagggagtgaagtctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctgatctcttcgagtcaagatggacaccagtggacactgttctttcagaatggcaaggtgaaggtgttccagggcaatcaggattcctttaccccagtggtgaacagcctggacccaccactgcttacaagatacctgagaatccaccctcagtcctgggtgcatcagattgctctgaggatggaggtgctgggatgtgaggctcaggacctgtattga

＞配列番号３２－ｃｏ１９ ｃｏｄｏｐ ＦＶＩＩＩ－ＳＱ
atgcagattgagctctccacctgcttcttcctctgcctcttgagattctgtttctctgctactagaagatattatcttggggcagtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggagaactgcctgtggatgccagatttccccctcgagtgcccaagagcttcccctttaacacctcagtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttacagaccatctcttcaacattgctaagcccagacctccctggatgggcctgctgggccctaccatccaagctgaagtgtatgacactgttgtgatcacactcaagaacatggcctcccatcctgtgtccctgcatgcagtgggagtctcctactggaaggcctcagaaggagcagagtatgatgaccagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtgtttcctggagggagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggacctatggccagtgaccctctgtgtcttacctattcctacctgtcacatgtggatctggtgaaggacctgaacagtggcctgattggggctctgctggtttgcagagaaggcagcttggccaaggagaagacccaaaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggggaaatcatggcactcagagaccaagaacagcctcatgcaggatagggatgctgccagtgccagggcttggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaatagaagcctgcctgggctgataggctgtcacagaaaatctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacacctgaggtgcactccattttcctggagggccacaccttccttgtgagaaaccacagacaagcttccctggagatcagcccaatcacctttctgactgctcaaaccctcctgatggatctgggccagttcctgctgttctgtcatatctcctcacaccagcatgatggaatggaagcttatgtcaaggtggactcctgcccagaggaaccacagctcagaatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgacagactctgaaatggatgtggtcagatttgatgatgacaacagcccttcattcatccaaatcagatctgtggccaagaagcatcccaagacctgggtgcactacatagctgctgaggaggaggactgggactatgcccctctggtcctggcccctgatgacagaagctataaaagccagtacctgaataatggcccccagagaattggcagaaagtacaagaaagtcagattcatggcttacactgatgagaccttcaaaaccagggaagccatccagcatgagtcaggcatcctgggccccctgctgtatggggaggttggagataccctgctgattatcttcaaaaaccaggcaagcaggccctacaatatctaccctcatggcatcactgatgtcaggccactgtattccagaagactgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttcccaatcctgccaggggagattttcaaatacaagtggacagtgactgtggaggatggaccaaccaagtcagatcctagatgtctgaccagatactactccagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggcctgattggccctctgctgatctgctataaagagtcagtggaccagagaggcaaccagatcatgagtgacaaaagaaatgtgatcttgttctcagtgtttgatgagaatagatcttggtacctcacagaaaacatccagaggttcctgcccaatccagctggggtgcagctggaagatccagaattccaggccagcaacatcatgcatagcatcaatggttatgtctttgacagcctgcagctgtcagtgtgtctgcatgaagttgcttactggtatattctgtccattggagcccagacagacttcctgtctgtcttcttctctggctacacctttaaacacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccctttctctggggaaacagtgttcatgtccatggaaaaccctggactgtggatcctgggctgccataacagtgacttcagaaacagaggcatgacagccctgctcaaggtgtccagctgtgataagaacacaggagactactatgaggatagctatgaggacatcagtgcttacctgctgagcaagaataatgccattgaacccaggtcattttcccaaaatccccctgtgctgaaaaggcaccagagggagatcacgcgtaccaccctgcagagtgaccaggaggaaattgattatgatgacaccatctctgtggaaatgaaaaaggaggattttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccctagaagcttccagaaaaagactagacactacttcattgctgcagtggagagactctgggattatggcatgagctccagcccccatgtgctgagaaatagagctcagagtggcagtgtgccacagttcaagaaggtggtgtttcaggagttcactgatggctccttcacacaaccactttacagaggagaactgaatgagcacctgggcctcctgggcccctacatcagggctgaagtggaggataacattatggtcacatttaggaatcaggcttccagaccctactccttttattcctcactcatttcctatgaggaggaccagaggcagggagctgagcccagaaaaaattttgtgaaacccaatgaaaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaggatgaatttgactgcaaggcttgggcttacttttctgatgtggaccttgagaaagatgtgcattcaggcctcattgggccactgctggtgtgccacaccaatacactgaaccctgctcatgggagacaggtcacagtgcaggagtttgcactcttctttaccatctttgatgagaccaagtcctggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccttgtaacatccagatggaggatcccaccttcaaggaaaactacagattccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgccaggcctggtgatggcccaggaccagaggatcaggtggtacctcctgtctatgggcagcaatgaaaatatccacagcattcacttctctggacatgtgtttactgtgaggaagaaggaggaatacaagatggctctgtacaacctctaccctggggtgtttgaaacagtggagatgctgccctccaaggctggcatctggagagtggaatgtctgattggggagcatctgcatgctggcatgagcacactgttcctggtgtattccaacaagtgccagaccccactgggcatggcctcaggacatatcagggacttccagatcactgctagtggacaatatggacagtgggcacccaagctggccagactgcactactcaggctccatcaatgcctggagtaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatacatggcatcaagacccagggagctagacagaagttcagctccctgtacatctcccaattcatcatcatgtactctctggatggcaagaaatggcagacctacagaggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttggaaatgttgactcttctggcatcaagcacaacatcttcaacccccccatcattgccagatatatcaggctccaccccacccactactccataaggagcaccctgagaatggagctgatgggctgtgacctgaattcctgctccatgcccctgggcatggaatccaaggcaatctctgatgcacagatcacagcctcctcctacttcaccaacatgtttgcaacctggagcccctccaaggccagactgcacctgcagggcaggtccaatgcttggagaccacaagtgaacaacccaaaggagtggctgcaggtggacttccagaagaccatgaaagtgactggagtgaccacccagggagtgaaatccctgctcactagcatgtatgtgaaggaattcctgatcagtagctctcaagatggccaccagtggaccctgttcttccagaatggcaaggtgaaggtgtttcagggcaaccaggattccttcacccctgtggtgaatagcctggatcccccactgctgaccagatacctgagaatccacccccagtcctgggttcaccagattgccctgagaatggaggtgctgggctgtgaggcccaggacctgtactga

＞配列番号３３－公知のｈＡＡＴ ＴＲＥ
aggctcagaggcacacaggagtttctgggctcaccctgcccccttccaacccctcagttcccatcctccagcagctgtttgtgtgctgcctctgaagtccacactgaacaaacttcagcctactcatgtccctaaaatgggcaaacattgcaagcagcaaacagcaaacacacagccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgagaggggtacccggggatcttgctaccagtggaacagccactaaggattctgcagtgagagcagagggccagctaagtggtactctcccagagactgtctgactcacgccaccccctccaccttggacacaggacgctgtggtttctgagccaggtacaatgactcctttcggtaagtgcagtggaagctgtacactgcccaggcaaagcgtccgggcagcgtaggcgggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgcttaaatacggacgaggacagggccctgtctcctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatgatccccctgatctgcggcc

＞配列番号３４－ＦＶＩＩＩｃｏ１９ＳＱ ＡＡＶコンストラクト配列
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTTAATtaacccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatcgcgccaccatgaagctgctcgcagcaactgtgctactcctcaccatctgcagccttgaaggagctactagaagatattatcttggggcagtggagctgagctgggactacatgcagtctgacctgggagaactgcctgtggatgccagatttccccctcgagtgcccaagagcttcccctttaacacctcagtggtgtacaagaagaccctgtttgtggagtttacagaccatctcttcaacattgctaagcccagacctccctggatgggcctgctgggccctaccatccaagctgaagtgtatgacactgttgtgatcacactcaagaacatggcctcccatcctgtgtccctgcatgcagtgggagtctcctactggaaggcctcagaaggagcagagtatgatgaccagaccagccagagagagaaggaggatgacaaggtgtttcctggagggagccacacctatgtgtggcaggtgctgaaggagaatggacctatggccagtgaccctctgtgtcttacctattcctacctgtcacatgtggatctggtgaaggacctgaacagtggcctgattggggctctgctggtttgcagagaaggcagcttggccaaggagaagacccaaaccctgcacaagttcatcctgctgtttgctgtgtttgatgaggggaaatcatggcactcagagaccaagaacagcctcatgcaggatagggatgctgccagtgccagggcttggcccaagatgcacactgtgaatggctatgtgaatagaagcctgcctgggctgataggctgtcacagaaaatctgtgtactggcatgtgattggcatgggcaccacacctgaggtgcactccattttcctggagggccacaccttccttgtgagaaaccacagacaagcttccctggagatcagcccaatcacctttctgactgctcaaaccctcctgatggatctgggccagttcctgctgttctgtcatatctcctcacaccagcatgatggaatggaagcttatgtcaaggtggactcctgcccagaggaaccacagctcagaatgaagaacaatgaggaggctgaggactatgatgatgacctgacagactctgaaatggatgtggtcagatttgatgatgacaacagcccttcattcatccaaatcagatctgtggccaagaagcatcccaagacctgggtgcactacatagctgctgaggaggaggactgggactatgcccctctggtcctggcccctgatgacagaagctataaaagccagtacctgaataatggcccccagagaattggcagaaagtacaagaaagtcagattcatggcttacactgatgagaccttcaaaaccagggaagccatccagcatgagtcaggcatcctgggccccctgctgtatggggaggttggagataccctgctgattatcttcaaaaaccaggcaagcaggccctacaatatctaccctcatggcatcactgatgtcaggccactgtattccagaagactgcctaagggggtgaagcacctgaaggacttcccaatcctgccaggggagattttcaaatacaagtggacagtgactgtggaggatggaccaaccaagtcagatcctagatgtctgaccagatactactccagctttgtgaacatggagagagacctggcctctggcctgattggccctctgctgatctgctataaagagtcagtggaccagagaggcaaccagatcatgagtgacaaaagaaatgtgatcttgttctcagtgtttgatgagaatagatcttggtacctcacagaaaacatccagaggttcctgcccaatccagctggggtgcagctggaagatccagaattccaggccagcaacatcatgcatagcatcaatggttatgtctttgacagcctgcagctgtcagtgtgtctgcatgaagttgcttactggtatattctgtccattggagcccagacagacttcctgtctgtcttcttctctggctacacctttaaacacaagatggtgtatgaggacaccctgaccctgttccctttctctggggaaacagtgttcatgtccatggaaaaccctggactgtggatcctgggctgccataacagtgacttcagaaacagaggcatgacagccctgctcaaggtgtccagctgtgataagaacacaggagactactatgaggatagctatgaggacatcagtgcttacctgctgagcaagaataatgccattgaacccaggtcattttcccaaaatccccctgtgctgaaaaggcaccagagggagatcacgcgtaccaccctgcagagtgaccaggaggaaattgattatgatgacaccatctctgtggaaatgaaaaaggaggattttgacatctatgatgaggatgagaaccagagccctagaagcttccagaaaaagactagacactacttcattgctgcagtggagagactctgggattatggcatgagctccagcccccatgtgctgagaaatagagctcagagtggcagtgtgccacagttcaagaaggtggtgtttcaggagttcactgatggctccttcacacaaccactttacagaggagaactgaatgagcacctgggcctcctgggcccctacatcagggctgaagtggaggataacattatggtcacatttaggaatcaggcttccagaccctactccttttattcctcactcatttcctatgaggaggaccagaggcagggagctgagcccagaaaaaattttgtgaaacccaatgaaaccaagacctacttctggaaggtgcagcaccatatggcccctaccaaggatgaatttgactgcaaggcttgggcttacttttctgatgtggaccttgagaaagatgtgcattcaggcctcattgggccactgctggtgtgccacaccaatacactgaaccctgctcatgggagacaggtcacagtgcaggagtttgcactcttctttaccatctttgatgagaccaagtcctggtatttcactgagaacatggagaggaactgcagggccccttgtaacatccagatggaggatcccaccttcaaggaaaactacagattccatgccatcaatggctacatcatggacaccctgccaggcctggtgatggcccaggaccagaggatcaggtggtacctcctgtctatgggcagcaatgaaaatatccacagcattcacttctctggacatgtgtttactgtgaggaagaaggaggaatacaagatggctctgtacaacctctaccctggggtgtttgaaacagtggagatgctgccctccaaggctggcatctggagagtggaatgtctgattggggagcatctgcatgctggcatgagcacactgttcctggtgtattccaacaagtgccagaccccactgggcatggcctcaggacatatcagggacttccagatcactgctagtggacaatatggacagtgggcacccaagctggccagactgcactactcaggctccatcaatgcctggagtaccaaggagcccttcagctggatcaaggtggacctgctggcccccatgattatacatggcatcaagacccagggagctagacagaagttcagctccctgtacatctcccaattcatcatcatgtactctctggatggcaagaaatggcagacctacagaggcaatagcactggcaccctgatggtgttttttggaaatgttgactcttctggcatcaagcacaacatcttcaacccccccatcattgccagatatatcaggctccaccccacccactactccataaggagcaccctgagaatggagctgatgggctgtgacctgaattcctgctccatgcccctgggcatggaatccaaggcaatctctgatgcacagatcacagcctcctcctacttcaccaacatgtttgcaacctggagcccctccaaggccagactgcacctgcaGGGCAGGTCCAATGCTTGGAGACCACAAGTGAACAACCCAAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAAGTGACTGGAGTGACCACCCAGGGAGTGAAATCCCTGCTCACTAGCATGTATGTGAAGGAATTCCTGATCAGTAGCTCTCAAGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTTCAGGGCAACCAGGATTCCTTCACCCCTGTGGTGAATAGCCTGGATCCCCCACTGCTGACCAGATACCTGAGAATCCACCCCCAGTCCTGGGTTCACCAGATTGCCCTGAGAATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGAAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
＞配列番号３５ ＦＲＥ７５ ＴＲＥ
gcaaacattgcaagcagcaaacagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccccccagccagtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagcttcaggcaccaccactgacctgggacagtgaatc
＞配列番号３６ ＦＲＥ４６ ＴＲＥ
agtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccc
＞配列番号３７ ＦＲＥ４７ ＴＲＥ
agtggacttagcccctgtttgctcctccgataactggggtgaccttggttaatattcaccagcagcctccccctcagct

【0168】

本発明の付番された態様
１． 配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含むか又はからなるコアヌクレオチド配列を含む転写調節エレメントであって、８０～２８０ヌクレオチド長であり；任意で、８０～２２５ヌクレオチド長である転写調節エレメント。

【0169】

２． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を更に含む、態様１に記載の転写調節エレメント。

【0170】

３． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、１つ以上の転写開始点（ＴＳＳ）を含む、態様２に記載の転写調節エレメント。

【0171】

４． １つ以上のＴＳＳが、
ａ．配列番号６、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号７、若しくは配列番号７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び／又は
ａ．配列番号８、若しくは配列番号８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
に係るヌクレオチド配列を含むか又はからなる、態様３に記載の転写調節エレメント。

【0172】

５． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号６に係るヌクレオチド配列、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｂ．配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｃ．配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含む、態様２～４のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0173】

６． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号１１によって定義されるヌクレオチド配列又は配列番号１１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を更に含む、態様２～５のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0174】

７． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、５０ヌクレオチドよりも短く；任意で４０ヌクレオチドよりも短く；任意で３０ヌクレオチドよりも短い、態様２～６のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0175】

８． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｃ．配列番号１３に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はからなる、態様２～７のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0176】

９． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を更に含む、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0177】

１０． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１４の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１４と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号１５の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号１５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１５と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号１６の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、又は少なくとも９０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｆ．配列番号１６に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
及び／あるいは
ｇ．配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含む、態様９に記載の転写調節エレメント。

【0178】

１１． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有する、態様９又は態様１０に記載の転写調節エレメント。

【0179】

１２． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して５０％未満の同一性を有し；任意で４５％未満の同一性を有し；任意で４０％未満の同一性を有し；任意で３０％未満の同一性を有する、態様１１に記載の転写調節エレメント。

【0180】

１３． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１１０ヌクレオチドよりも短く；任意で１００ヌクレオチドよりも短く；任意で５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１０ヌクレオチドよりも短い、態様９～１２のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0181】

１４． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、５～１１０ヌクレオチド長である、態様９～１３のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0182】

１５． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、少なくとも７ヌクレオチド長である、態様９～１４のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0183】

１６． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１０２ヌクレオチド長以下である、態様９～１５のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0184】

１７． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１８に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１９に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号２０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２０と９０％若しくは１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号２１に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号２２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｆ．配列番号２３に係る又は配列番号２３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、態様９～１６のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0185】

１８．
ａ．配列番号４に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない；
及び／又は
ａ．配列番号５に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号５の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない；
上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0186】

１９．
ａ．配列番号４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含まない；
及び／又は
ｂ．配列番号５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含まない、態様１８に記載の転写調節エレメント。

【0187】

２０． ２００ヌクレオチドよりも短く；任意で１５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１２５ヌクレオチドよりも短い、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0188】

２１． 少なくとも８５ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１００ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１１０ヌクレオチド長である、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0189】

２２． 配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含むか又はからなるコアヌクレオチド配列を含む転写調節エレメントであって、
ａ．配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドを含まず；
及び／又は
ｂ．配列番号５の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドを含まず；
８０～２８０ヌクレオチド長である、転写調節エレメント。

【0190】

２３．
ａ．配列番号４に対して少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、若しくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含まない；
及び／又は
ｂ．配列番号５に対して少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％、若しくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含まない、態様２２に記載の転写調節エレメント。

【0191】

２４． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を更に含む、態様２２又は態様２３に記載の転写調節エレメント。

【0192】

２５． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、１つ以上の転写停止点（ＴＳＳ）を含む、態様２４に記載の転写調節エレメント。

【0193】

２６． １つ以上のＴＳＳが、
ａ．配列番号６、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号７、若しくは配列番号７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び／又は
ａ．配列番号８、若しくは配列番号８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
に係るヌクレオチド配列を含む、態様２５に記載の転写調節エレメント。

【0194】

２７． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号６に係るヌクレオチド配列、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｂ．配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｃ．配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含む、態様２４、態様２５、又は態様２６に記載の転写調節エレメント。

【0195】

２８． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号１１によって定義されるヌクレオチド配列又は配列番号１１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を更に含む、態様２４～２７のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0196】

２９． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、５０ヌクレオチドよりも短く；任意で４０ヌクレオチドよりも短く；任意で３０ヌクレオチドよりも短い、態様２４～２８のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0197】

３０． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｃ．配列番号１３に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はからなる、態様２４～２９のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0198】

３１． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を更に含む、態様２２～３０のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0199】

３２． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１４の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１４と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号１５の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号１５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１５と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号１６の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、又は少なくとも９０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｆ．配列番号１６に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
及び／あるいは
ｇ．配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含む、態様３１に記載の転写調節エレメント。

【0200】

３３． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有する、態様３１又は３２に記載の転写調節エレメント。

【0201】

３４． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して５０％未満の同一性を有し；任意で４５％未満の同一性を有し；任意で４０％未満の同一性を有し；任意で３０％未満の同一性を有する、態様３３に記載の転写調節エレメント。

【0202】

３５． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１１０ヌクレオチドよりも短く；任意で１００ヌクレオチドよりも短く；任意で、５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１０ヌクレオチドよりも短い、態様３１～３４のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0203】

３６． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、５～１１０ヌクレオチド長である、態様３１～３５のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0204】

３７． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、少なくとも７ヌクレオチド長である、態様３１～３６のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0205】

３８． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１０２ヌクレオチド長以下である、態様３１～３７のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0206】

３９． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１８に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１９に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号２０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号２１に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号２２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｆ．配列番号２３に係る、又は配列番号２３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、態様３１～３８のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0207】

４０． ２００ヌクレオチドよりも短く；任意で１５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１２５ヌクレオチドよりも短い、態様２２～３９のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0208】

４１． 少なくとも８５ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１００ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１１０ヌクレオチド長である、態様２２～４０のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0209】

４２．
ａ．配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列又は配列番号２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含むか又はからなるコアヌクレオチド配列；及び
ｂ．該コアヌクレオチド配列の５’に位置し、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して６０％未満の同一性を有するヌクレオチド配列；
を含み、
８０～２８０ヌクレオチド長である、転写調節エレメント。

【0210】

４３． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１４の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１４と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号１５の少なくとも１０個、少なくとも１５個、又は少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号１５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１５と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号１６の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、又は少なくとも９０個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
ｆ．配列番号１６に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
及び／あるいは
ｇ．配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含む、態様４２に記載の転写調節エレメント。

【0211】

４４． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は４５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して５０％未満の同一性を有し；任意で４５％未満の同一性を有し；任意で４０％未満の同一性を有し；任意で３０％未満の同一性を有する、態様４２又は態様４３に記載の転写調節エレメント。

【0212】

４５． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１１０ヌクレオチドよりも短く；任意で１００ヌクレオチドよりも短く；任意で５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１０ヌクレオチドよりも短い、態様４２～４４のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0213】

４６． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、５～１１０ヌクレオチド長である、態様４２～４５のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0214】

４７． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、少なくとも７ヌクレオチド長である、態様４２～４６のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0215】

４８． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、１０２ヌクレオチド長以下である、態様４２～４７のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0216】

４９． コアヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１８に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１９に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｃ．配列番号２０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｄ．配列番号２１に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｅ．配列番号２２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｆ．配列番号２３に係る、又は配列番号２３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、態様４２～４８のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0217】

５０． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を更に含む、態様４２～４９のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0218】

５１． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号６に係るヌクレオチド配列又は配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を含む、態様５０に記載の転写調節エレメント。

【0219】

５２． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号６に係るヌクレオチド配列、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｂ．配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号９と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；又は
ｃ．配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、若しくは配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
を含む、態様５１に記載の転写調節エレメント。

【0220】

５３． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、配列番号１１によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号１１と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列を更に含む、態様５０～５２のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0221】

５４． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、５０ヌクレオチドよりも短く；任意で４０ヌクレオチドよりも短く；任意で３０ヌクレオチドよりも短い、態様５０～５３のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0222】

５５． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、１つ以上の転写開始点（ＴＳＳ）を含む、態様５０～５４のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0223】

５６． １つ以上のＴＳＳが、
ａ．配列番号６、若しくは配列番号６と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号７、若しくは配列番号７と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び／又は
ｃ．配列番号８、若しくは配列番号８と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
に係るヌクレオチド配列を含む、態様５５に記載の転写調節エレメント。

【0224】

５７． コアヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列が、
ａ．配列番号１０に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１０と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；
ｂ．配列番号１２に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１２と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列；及び
ｃ．配列番号１３に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１３と１ヌクレオチドだけ異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか又はからなる、態様５０～５６のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0225】

５８．
ａ．配列番号４に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号４の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない；
及び／又は
ａ．配列番号５に係るヌクレオチド配列も含まず、配列番号５の少なくとも２０個、少なくとも３０個、若しくは少なくとも４０個の連続するヌクレオチドも含まない、態様４２～５７のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0226】

５９．
ａ．配列番号４に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含まない；
及び／又は
ｂ．配列番号５に対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含まない、態様５８に記載の転写調節エレメント。

【0227】

６０． ２００ヌクレオチドよりも短く；任意で１５０ヌクレオチドよりも短く；任意で１２５ヌクレオチドよりも短い、態様４２～５９のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0228】

６１． 少なくとも８５ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１００ヌクレオチド長であり、任意で少なくとも１１０ヌクレオチド長である、態様４２～６０のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0229】

６２．
ａ． ａｃａｇｔｇａａｔｃ；又は
ｂ． ｃｔｃｃｔｃａｇｃｔ
から選択される１０ヌクレオチド配列で終結する、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0230】

６３． コアヌクレオチド配列が７３～８０ヌクレオチド長である、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0231】

６４． コアヌクレオチド配列が、配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0232】

６５． コアヌクレオチド配列が配列番号２と同一である、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0233】

６６． コアヌクレオチド配列が、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか又はからなる、態様１～６５のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0234】

６７． コアヌクレオチド配列が、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性、任意で少なくとも９８％の同一性を有する、態様６６に記載の転写調節エレメント。

【0235】

６８． コアヌクレオチド配列が配列番号３と同一である、態様６７に記載の転写調節エレメント。

【0236】

６９．
ａ．配列番号２４；
ｂ．配列番号２５；
ｃ．配列番号２６；
ｄ．配列番号２７；
ｅ．配列番号２８；及び
ｆ．配列番号２９
からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の同一性、任意で少なくとも９５％の同一性、又は任意で少なくとも９８％の同一性を有する、態様１～６８のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0237】

７０．
ａ．配列番号２４；
ｂ．配列番号２５；
ｃ．配列番号２６；
ｄ．配列番号２７；
ｅ．配列番号２８；及び
ｆ．配列番号２９
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、態様１～６３のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0238】

７１． プロモーターを含み；任意で、エンハンサーを更に含む、上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0239】

７２． プロモーターが肝臓特異的である、態様７１に記載の転写調節エレメント。

【0240】

７３． 上記態様のいずれか１つに記載の転写調節エレメントを含むポリヌクレオチドであって、該転写調節エレメントが、任意で導入遺伝子に作動可能に連結されており、該導入遺伝子が、ヒトタンパク質をコードしている、ポリヌクレオチド。

【0241】

７４． 導入遺伝子を含むベクターの一部であり、任意で、該ベクターが、ＡＡＶベクター等のウイルス粒子である、態様１～７２のいずれか１つに記載の転写調節エレメント。

【0242】

７５． 転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して５０％以上多く導入遺伝子を発現させる、態様７３に記載のポリヌクレオチド又は態様７４に記載の転写調節エレメント。

【0243】

７６． 転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して８０％以上多く導入遺伝子を発現させる、態様７３に記載のポリヌクレオチド又は態様７４に記載の転写調節エレメント。

【0244】

７７． 転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１００％以上多く導入遺伝子を発現させ；任意で、該転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１１０％以上、１２０％以上、１４０％以上、又は１５０％以上多く導入遺伝子を発現させる、態様７３のポリヌクレオチド又は態様７４の転写調節エレメント。

【0245】

７８． 導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される、態様７５～７７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【0246】

７９． 導入遺伝子が、タンパク質、又は任意でｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、若しくはｓｎＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡである非翻訳ＲＮＡをコードしている、態様７３～７８のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【0247】

８０． 導入遺伝子が４ｋヌクレオチドよりも長く；任意で、該導入遺伝子が４．２ｋヌクレオチドよりも長い、態様７３～７９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【0248】

８１． 導入遺伝子が４．５ｋヌクレオチドよりも短く、任意で、該導入遺伝子が４．４ｋヌクレオチドよりも短い、態様８０に記載のポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【0249】

８２． 導入遺伝子が、ＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、該導入遺伝子が、短縮型又は改変型のＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、該導入遺伝子が、Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩをコードしている、態様７３～８１のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド又は転写調節エレメント。

【0250】

８３． （ｉ）態様１～７２のいずれか１つに記載の転写調節エレメントと；（ｉｉ）導入遺伝子とを含むヌクレオチド配列を含むベクター。

【0251】

８４． ベクターのヌクレオチド配列が、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を更に含む、態様８３に記載のベクター。

【0252】

８５． シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、５０～１００ヌクレオチド長である、態様８４に記載のベクター。

【0253】

８６． シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、８０ヌクレオチド長よりも短い、態様８５に記載のベクター。

【0254】

８７． ＡＡＶベクター等のウイルス粒子である、態様８３～８６のいずれか１つに記載のベクター。

【0255】

８８． 転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して５０％以上多く導入遺伝子を発現させる、態様８３～８７のいずれか１つに記載のベクター。

【0256】

８９． 転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して８０％以上多く導入遺伝子を発現させる、態様８３～８７のいずれか１つに記載のベクター。

【0257】

９０． 転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１００％以上多く導入遺伝子を発現させ；任意で、該転写調節エレメントが、配列番号１又は配列番号３３によって定義される転写調節エレメントと比較して１１０％以上、１２０％以上、１４０％以上、又は１５０％以上多く導入遺伝子を発現させる、態様８３～８７のいずれか１つに記載のベクター。

【0258】

９１． 導入遺伝子の発現が、Ｈｕｈ７細胞においてインビトロで決定される、態様８９～９０のいずれか１つに記載のベクター。

【0259】

９２． 導入遺伝子が、タンパク質、又は任意でｓｉＲＮＡ、若しくはｍｉＲＮＡ、若しくはｓｎＲＮＡ、若しくはアンチセンスＲＮＡである非翻訳ＲＮＡをコードしている、態様８３～９１のいずれか１つに記載のベクター。

【0260】

９３． 導入遺伝子が４ｋヌクレオチドよりも長く；任意で、該導入遺伝子が４．２ヌクレオチドよりも長い、態様８３～９２のいずれか１つに記載のベクター。

【0261】

９４． 導入遺伝子が４．５ｋヌクレオチドよりも短く、任意で、該導入遺伝子が４．４ｋヌクレオチドよりも短い、態様９３に記載のベクター。

【0262】

９５． 導入遺伝子が、ＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、該導入遺伝子が、短縮型又は改変型のＦＶＩＩＩをコードしており；任意で、該導入遺伝子が、Ｂドメイン欠失型ＦＶＩＩＩをコードしている、態様８３～９４のいずれか１つに記載のベクター。

【0263】

９６． ベクターのゲノムが４．９ｋヌクレオチドよりも短く；任意で、ベクターのゲノムが４．５ｋヌクレオチドよりも短い、態様８３～９５のいずれか１つに記載のベクター。

【0264】

９７． ベクターのゲノムが、約４．７ｋヌクレオチド長である、態様９６に記載のベクター。

【0265】

９８． 治療方法において使用するための態様８３～９７のいずれか１つに記載のベクターであって、任意で、該治療方法が、遺伝子治療の方法及び／又は血友病Ａの治療方法であるベクター。

【0266】

９９． 有効量の態様８３～９７のいずれか１つに記載のベクターを患者に投与することを含む治療方法であって、任意で、遺伝子治療の方法及び／又は血友病Ａの治療方法である、治療方法。

【0267】

１００． 治療方法における態様８３～９７のいずれか１つに記載のベクターの使用であって、任意で、該治療方法が、遺伝子治療の方法及び／又は血友病Ａの治療方法である使用。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【国際調査報告】