特表 2023-501263 第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-18

(54)【発明の名称】第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230111BHJP

   C07K 14/755 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 38/37 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230111BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/755 ZNA

C12N15/10 200Z

C12N15/864 100Z

C12N7/01

A61P7/04

A61K38/37

A61K48/00

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022525555

(86)(22)【出願日】2020-10-30

(85)【翻訳文提出日】2022-06-16

(86)【国際出願番号】 GB2020052760

(87)【国際公開番号】W WO2021084275

(87)【国際公開日】2021-05-06

(31)【優先権主張番号】1915953.2

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1915955.7

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1915956.5

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1917925.8

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1917926.6

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1917927.4

(32)【優先日】2019-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】2006250.1

(32)【優先日】2020-04-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521345464

【氏名又は名称】フリーライン セラピューティクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】キア、アザデ

(72)【発明者】

【氏名】カンパー、ファブリツィオ

(72)【発明者】

【氏名】コルバウ、ロムアルド

(72)【発明者】

【氏名】ドデヴ、ティホミル

(72)【発明者】

【氏名】マッキントッシュ、ジェニー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084DC15

4C084MA16

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA16

4C087MA17

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA53

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA42

4H045DA66

4H045EA24

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、対応する野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを提供し、ここで、該１つ以上の置換変異は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの２つのドメイン間のドメイン間インターフェイスに位置する。本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ構築物、そのような組換えＡＡＶ構築物を含むＡＡＶウイルス粒子、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、またはＡＡＶウイルス粒子を含む組成物、並びに本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子および組成物の治療における使用も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、１つ以上の置換変異を含み、該１つ以上の置換変異は、配列番号１のＭ６６２に対応するアミノ酸の置換を含み、該１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｃ置換を含まない、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項2】

（ｉ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより高い比活性を有する；および／または
（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより高い安定性を有する；および／または
（ｉｉｉ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより長い半減期を有し、任意にここで、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたときに、該参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより長い半減期を有する；および／または
（ｉｖ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現される、
請求項１の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項3】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性よりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、または少なくとも５．５倍高い比活性を有する、請求項２の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項4】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．２、少なくとも２．５、少なくとも２．８若しくは少なくとも３倍の半減期であるより長い半減期を有する、および／または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、活性化されたときに、活性化されたときの参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．２、少なくとも２．５、少なくとも２．８若しくは少なくとも３倍の半減期である半減期を有し、任意に、ここで、該より長い半減期は、血漿中のより長い半減期である、請求項２または３の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項5】

（ｉ）発現される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルが、宿主細胞によって分泌されるＦＶＩＩＩポリペプチドのレベルであり、任意にここで、該宿主細胞は、ヒト肝細胞であり、任意にここで、該ヒト肝細胞は、Ｈｕｈ７細胞である；および／または
（ｉｉ）発現される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルが、インビボ発現である、
請求項２から４のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項6】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含むが、１つ以上の置換変異を含まない、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも、より高い比活性および／若しくはより高い安定性を有し並びに／または宿主細胞中でより高いレベルで発現され、任意にここで、該参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１、３または５の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、請求項２から５のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項7】

１つ以上の置換変異が、メチオニンのトリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシンまたはフェニルアラニンでの置換を含む、請求項１から６のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項8】

１つ以上の置換変異が、配列番号１のＭ６６２に対応するアミノ酸の芳香族アミノ酸での置換を含む、請求項１から７のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項9】

１つ以上の置換変異がＭ６６２Ｗ置換を含む、請求項１から８のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項10】

１つ以上の置換変異がＭ６６２ＷおよびＨ６９３Ｗ置換を含む、請求項１から９のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項11】

１つ以上の置換変異が第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化を阻害しない、請求項１から１０のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項12】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号１、３若しくは５において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号１、３若しくは５の少なくとも１３４９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項13】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドがベータドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項14】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号１の位置１から７３１および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸を含む、請求項１から１３のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項15】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号２８において記載されるアミノ酸配列、または配列番号２８において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項16】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉｉｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｖ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
（Ａ）該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い比活性を有する；および／または
（Ｂ）該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する；および／または
（Ｃ）該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現される、
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項17】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．配列番号１のＭ６６２若しくはＨ６９３に対応するアミノ酸の置換；または
ｂ．第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含む一対のアミノ酸のシステイン残基での置換であって、
ｉ．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＭ１４７、Ｓ１４９若しくはＳ２８９に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＥ１９６９、Ｅ１９７０若しくはＮ１９７７に対応するか；
ｉｉ．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＴ６６７、Ｔ６６９、Ｎ６８４、Ｌ６８７、Ｉ６８９、Ｓ６９５若しくはＦ６９７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＳ１７９１、Ｇ１７９９、Ａ１８００、Ｒ１８０３、Ｅ１８４４、Ｓ１９４９、Ｇ１９８１、Ｖ１９８２、若しくはＹ１９７９に対応するか；または
ｉｉｉ．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＡ１０８、Ｔ１１８若しくはＶ１３７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＮ２１７２、Ｑ２３２９若しくはＹ２３３２に対応する、
置換
からなる群から選択される１つ以上の置換変異を含む、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【請求項18】

第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、請求項１から１７のいずれか一項に記載の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項19】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列が、配列番号３１において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号３１若しくは配列番号２９の少なくとも４０４７個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１８のポリヌクレオチド。

【請求項20】

請求項１８または１９に記載の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶ構築物。

【請求項21】

請求項２０に記載の組換えＡＡＶ構築物を含む、ＡＡＶウイルス粒子。

【請求項22】

請求項１から２１のいずれか一項に記載の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物またはＡＡＶウイルス粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。

【請求項23】

治療方法における使用のための、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物。

【請求項24】

血友病Ａを治療する方法における使用のための、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物であって、前記方法は、有効量の、請求項１から２２のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物ＡＡＶウイルス粒子または組成物を、患者に投与することを含む、ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物。

【請求項25】

血友病Ａを治療する方法であって、前記方法は、有効量の、請求項１から２２のいずれか一項の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物ＡＡＶ、ＡＡＶウイルス粒子または組成物を、患者に投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および組換えＡＡＶ構築物に関する。本発明はさらに、本発明の組換えＡＡＶ構築物を含むＡＡＶウイルス粒子、および本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物またはＡＡＶウイルス粒子を含む組成物に関する。本発明はまた、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子および／または組成物を使用する方法並びにそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏によって引き起こされる出血性障害である。それは、世界中で１：４，０００から１：５，０００の生きている男性の出生に影響を及ぼす。症例の大半は、Ｘ連鎖劣性形質として遺伝する。現在の治療法は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の頻繁な静脈内注射（週あたり２～３回）を含む。この治療法は、出血を止めるのに非常に効果的であるが、それは、治癒的ではなく、非常に高価であり（￡１５０，０００／患者／年）、すなわち、該治療法を世界中の血友病Ａ患者の大半によって手が届かないものとする。血友病Ａについての遺伝子治療は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子の機能するコピーの罹患した患者への導入に続く、第ＶＩＩＩ因子の持続的で内因性の産生を通した治癒についての可能性を提供する。

【0003】

第ＶＩＩＩ因子は、６つのドメイン、すなわちＡ１－Ａ２－Ｂ－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２からなる。第ＶＩＩＩ因子は、フォン・ヴィレブランド因子に結合しながら、不活性形態で血流中で循環する。傷害に応答して、第ＶＩＩＩ因子は、活性化され（しばしば次いで第ＶＩＩＩａ因子として呼ばれる）、フォン・ヴィレブランド因子から分離する。第ＶＩＩＩａ因子は、凝固カスケードにおいて第ＩＸａ因子と相互作用する。特に、ＦＶＩＩＩａ因子は、第Ｘ因子の活性化における第ＩＸａ因子についての補因子である。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、特定のアミノ酸置換（置換変異）を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに関する。第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１－Ａ２－Ｂドメイン、およびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからなるヘテロ二量体複合体として発現し、不活性形態で循環する。第ＶＩＩＩ因子は、トロンビンによるタンパク質分解切断によって活性化される。トロンビン切断に続き、第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、およびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからなるヘテロ三量体複合体を形成し、コンフォメーション変化を受け、それが、第ＩＸａ因子への結合および第Ｘ因子の活性化を可能にする。活性化に続き、第ＶＩＩＩａ因子は、さらなるタンパク質分解を受け得、および／またはヘテロ三量体複合体のそれぞれの成分は、互いに解離し得、それによって第ＶＩＩＩａ因子を不活性化し得る。本発明者らは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性を増加させる第ＶＩＩＩ因子のドメインのインターフェイスに位置する特定のアミノ酸の置換を同定した。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性を増加させることは、より少ない量の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが凝固が起こるために必要とされ得ることを意味する。

【0005】

第１の態様においては、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが提供され、ここで、該ＦＶＩＩＩアミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｉ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い比活性を有する。

【0006】

第２の態様においては、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが提供され、ここで、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｉ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する。

【0007】

第３の態様においては、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが提供され、ここで、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｉ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現される。

【0008】

第４の態様においては、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが提供され、ここで、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．配列番号１のＭ６６２若しくはＨ６９３に対応するアミノ酸の置換；または
ｂ．第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含む一対のアミノ酸のシステイン残基での置換であって、
１．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＭ１４７、Ｓ１４９若しくはＳ２８９に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＥ１９６９、Ｅ１９７０若しくはＮ１９７７に対応するか；
２．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＴ６６７、Ｔ６６９、Ｎ６８４、Ｌ６８７、Ｉ６８９、Ｓ６９５若しくはＦ６９７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＳ１７９１、Ｇ１７９９、Ａ１８００、Ｒ１８０３、Ｅ１８４４、Ｓ１９４９、Ｇ１９８１、Ｖ１９８２、若しくはＹ１９７９に対応するか；または
３．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＡ１０８、Ｔ１１８若しくはＶ１３７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＮ２１７２、Ｑ２３２９若しくはＹ２３３２に対応する、
置換
からなる群から選択される１つ以上の置換変異を含む。

【0009】

第５の態様においては、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供され、ここで、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0010】

第６の態様においては、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ構築物が提供され、ここで、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0011】

第７の態様においては、本発明の組換えＡＡＶ構築物を含むＡＡＶウイルス粒子が提供される。

【0012】

第８の態様においては、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物またはＡＡＶウイルス粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物が提供される。

【0013】

第９の態様においては、治療方法における使用のための、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物が提供される。

【0014】

第１０の態様においては、有効量の、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物を、患者に投与することを含む、治療方法が提供される。

【0015】

第１１の態様においては、治療方法における使用のための薬剤の製造における、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物の使用が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

図面の説明

【図1】図１は、アミノ酸の水相から非水相（オクタノール）への自由エネルギー（ΔＧ）移行についてのＷｉｍｌｅｙ－Ｗｈｉｔｅ疎水性スケールを示す。より負のΔＧ値は、水相から非水相中へのより好ましい移行と関連しており、より疎水性のアミノ酸を示す。

【図2】図２は、各変異体についての多くの代替置換残基を含む、いくつかの異なるアミノ酸置換変異変異体について、いかなる置換変異をも欠くＦＶＩＩＩ－ＳＱ（‘９５’）対照と比較した、ＳＡ（比活性）における倍率変化を示す。変異体６５（Ｈ６９３Ｗ）は、９５と比較してＳＡにおける上昇を示す。

【図3】図３は、いくつかの異なる二重システイン置換変異変異体について、いかなる置換変異をも欠くＦＶＩＩＩ－ＳＱ（‘９５’）対照と比較した、ＳＡにおける倍率変化を示す。多くの変異体は、９５と比較してＳＡにおける上昇を示す。

【図4】図４は、置換変異を含む一連の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子比活性を示す。比活性に対する置換変異の影響は、いかなる置換変異をも含まない第ＶＩＩＩ因子－ＳＱ対照と比較して、‘ＳＱ’および’９６－１０６’第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドにおいて評価した。エラーバーは、ＥＬＩＳＡおよび活性アッセイにおけるサンプル重複からの標準偏差を表す。

【図5】図５は、構築物ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９（２６－９６－１０６）－ＳｐＡ（配列番号２７）；ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９－ＳＱ－ＳｐＡ（配列番号３２）；または、天然のＦＶＩＩＩシグナルペプチド、ＳｐＡおよび肝臓特異的プロモーターを有する、コドン最適化されたＦＶＩＩＩ－ＳＱコード配列を含むコンパレーター構築物（配列番号３４）から作製した２×１０^１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８ウイルス粒子を静脈内注射したＣ７ＢＬ／６ ＦＶＩＩＩノックアウトマウスの血漿中の、注射６週間後の第ＶＩＩＩ因子比活性を示す。^＊＊Ｐ＝０．００３８。左側のパネルは、ナイーブ対照と比較したＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９（２６－９６－１０６）－ＳｐＡ（左側のカラム）およびコンパレーター構築物（中央のパネル）の比活性を示し；右側のパネルは、ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９－ＳＱ－ＳｐＡ（左側のカラム）およびコンパレーター構築物（右側のカラム）の比活性を示す。

【0017】

配列リストの説明

【0018】

【表1】

【0019】

【表2】

【発明を実施するための形態】

【0020】

詳細な説明
一般的な定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0021】

一般に、用語「含む」は、含むが限定されないことを意味することを意図している。例えば、句「第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」は、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を有するが、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはさらなるアミノ酸を含有し得ることを意味すると解釈されるべきである。同様に、句「第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド」は、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指すが、該ポリヌクレオチドは、追加のヌクレオチドを含有し得る。

【0022】

本発明のいくつかの実施態様においては、単語「含む」は、句「実質的にからなる」で置き換えられる。用語「実質的にからなる」は、特定のさらなる成分、すなわち主題の本質的な特性に実質的に影響を及ぼさないものが存在し得ることを意味する。

【0023】

本発明のいくつかの実施態様においては、単語「含む」は、句「からなる」で置き換えられる。用語「からなる」は、限定していることを意図している。例えば、句「第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列からなる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」は、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を有し、追加のアミノ酸を何も有さないことを意味すると解釈されるべきである。同様に、句「第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド」は、該ポリヌクレオチドが、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を有し、追加のヌクレオチドを何も有さないことを意味すると理解されるべきである。

【0024】

本発明のいくつかの実施態様においては、単語「有する」は、単語「含む」または句「からなる」で置き換えられ得る。

【0025】

用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書においては交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸の高分子鎖を指すことを意図している。

【0026】

用語「核酸分子」「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書においては交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドの高分子鎖を指すことを意図している。

【0027】

用語「置換変異」および「アミノ酸置換」は、本明細書においては交換可能に使用され、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸の異なるアミノ酸での置換を意味することを意図している。句、アミノ酸Ｘ「の置換」、または「置換されている（される）アミノ酸Ｘ」においては、アミノ酸Ｘは、アミノ酸配列内に存在し、置き換えられる元のまたは天然のアミノ酸である。例えば、メチオニンの置換は、天然のメチオニンアミノ酸が別のアミノ酸によって置き換えられることを意味する。句、アミノ酸Ｙ「での置換」においては、アミノ酸Ｙは、アミノ酸配列中の元のまたは天然のアミノ酸を置き換える異なるアミノ酸である。例えば、メチオニンでの置換は、天然の（非メチオニン）アミノ酸のメチオニンでの置換えを指す。置換変異を定義するために使用される標準的な略記法は、置換されるアミノ酸配列内のある位置での元のまたは天然のアミノ酸、および元のまたは天然のアミノ酸を置き換えるアミノ酸をリストする。例えば、置換変異Ｍ６６２Ｗを含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、位置６６２に対応する位置のメチオニン残基のトリプトファン残基での置換を含む（すなわち位置６６２にトリプトファン残基を含む）第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を指す。

【0028】

用語「保存的置換」は、アミノ酸が、同様の、サイズ、電荷または疎水性などの生化学的特性を有する別のアミノ酸で置換される置換変異を指す。アミノ酸は、それらの側鎖の構造に基づいてグループに分類し得る：脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）；ヒドロキシル／硫黄含有（セリン、スレオニン、システイン、メチオニン）；環式（プロリン）；芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；塩基性（ヒスチジン、リジン、アルギニン）；酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；および酸アミン（アスパラギン、グルタミン）。「保存的置換」はすなわち、アミノ酸が同じグループ中の別のアミノ酸で置換される置換変異を指す。逆に、用語「非保存的置換」は、アミノ酸が異なる生化学的特性を有する別のアミノ酸で置換される置換、すなわちアミノ酸が別のグループ中のアミノ酸で置換される置換変異を指す。例えば、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換は、「保存的置換」であると見なされ得、一方で、アスパラギン酸のバリンでの置換は「非保存的」置換であると見なされ得る。

【0029】

用語「野生型」および「天然の」は、本明細書においては交換可能に使用され、天然に存在しているものを説明することを意図している。例えば、「野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列」は、自然界に存在するアミノ酸第ＶＩＩＩ因子配列である。

【0030】

用語「Ｂドメイン」および「ベータドメイン」は、本明細書においては、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインに関して交換可能に使用される。野生型第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、配列番号１のアミノ酸７４１～１６４８に対応する領域からなる。

【0031】

用語「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶベクター」は、本明細書においては交換可能に使用される。

【0032】

ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の長さを説明する文脈において使用される用語「約」は、配列が、定義された数のヌクレオチドまたはアミノ酸、プラス若しくはマイナス１０％、より具体的にはプラス若しくはマイナス５％、またはより具体的にはプラス若しくはマイナス単一の整数を含み得るかまたはそれらからなり得ることを示す。例えば、長さが「約」４５のアミノ酸のアミノ酸配列への言及は、長さが４１～４９のアミノ酸、より具体的には４３～４７のアミノ酸、より具体的には４４～４６のアミノ酸のアミノ酸配列を指し得る。

【0033】

本発明の目的のために、２つの配列（２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列などの）のパーセント同一性を決定するために、該配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップは、第２の配列との最適なアラインメントのために第１の配列中に導入され得る）。各位置のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を、次いで比較する。第１の配列中のある位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸で占められているとき、そのときは、該ヌクレオチドまたはアミノ酸はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、該配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／参照配列中の位置の総数×１００）。

【0034】

典型的には配列比較は、参照配列の長さにわたって行う。例えば、ユーザーが所与の（「試験」）配列が配列番号３と９５％同一であるかどうかを決定したい場合、配列番号３が参照配列であろう。配列が配列番号３（参照配列の例）と少なくとも９５％同一であるかどうかを評価するために、当業者は、配列番号３の長さにわたってアラインメントを行い、試験配列中のどれだけ多くの位置が配列番号３のものと同一であるかを同定するであろう。位置の少なくとも９５％が同一である場合、試験配列は、配列番号３と少なくとも９５％同一である。配列が配列番号３より短い場合、ギャップまたは欠落した位置は、同一ではない位置であると見なすべきである。

【0035】

当業者は、２つの配列間の相同性または同一性を決定するために利用可能な種々のコンピュータプログラムを知っている。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。ある実施態様においては、２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重み、および１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で利用可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを使用して決定される。

【0036】

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に指示していない限り、複数の指示対象が含む。すなわち、例えば、「アミノ酸」への言及は、そのようなアミノ酸の２つ以上の例またはバージョンを含む。

【0037】

上記または下記のいずれであろうと、本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0038】

機能変異の獲得
活性化された第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体複合体のそれぞれの成分の解離（特に、Ａ１ドメインおよびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからのＡ２ドメインの解離）は、凝固カスケードの活性化に続く第ＶＩＩＩ因子活性の喪失の主要なメカニズムの１つであると考えられている。理論によって拘束されることを望まないが、本アミノ酸置換変異は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化に続く第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体複合体のそれぞれの成分の解離を防ぐまたは遅延させるのに役立ち得、それによって、活性なＦＶＩＩＩａが無傷である、すなわち活性である時間を延長し得ると考えられている。

【0039】

本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、対応する野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列と比較して、１つ以上の置換変異を含む。より具体的には、１つ以上の置換変異は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの２つのドメイン間のドメイン間インターフェイスに位置している。特に、１つ以上の置換変異は、Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス、Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス、またはＡ１／Ｃ２ドメインインターフェイスから選択されるドメイン間インターフェイスに位置している。第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は従って、Ａ１、Ａ２、Ａ３またはＣ２ドメイン中の置換変異を含む。第ＶＩＩＩ因子の３次元結晶構造が利用可能であり（例えば、ＰＤＢアクセッション番号２ＲＺＥまたは４ＢＤＶ）；従って、これらのドメイン内のアミノ酸、より具体的には、置換され得る特定のドメイン間インターフェイスに位置するアミノ酸を同定することは、定型的であろう。野生型第ＶＩＩＩ因子に関して、Ａ１ドメインは、配列番号１の位置１～３２９に対応するアミノ酸からなり；Ａ２ドメインは、配列番号１の位置３８０～７１１に対応するアミノ酸からなり；Ａ３ドメインは、配列番号１の位置１６９４～２０２１に対応するアミノ酸からなり；Ｃ１ドメインは、配列番号１の位置２０２１～２１６９に対応するアミノ酸からなり；Ｃ２ドメインは、配列番号１の位置２１７４～２３３２に対応するアミノ酸からなる。最後の６つのアミノ酸（配列番号１の位置２３２７から２３３２に対応する）は、Ｃ２ドメインの一部とは見なされない可能性がある。すなわち、任意に、Ｃ２ドメインは、配列番号１の位置２１７４～３２３６に対応するアミノ酸からなる。

【0040】

特定の実施態様においては、本明細書において開示される、Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス、Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイスまたはＡ１／Ｃ２ドメインインターフェイスに１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い比活性を有し得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性を増加させる例示的な置換変異が、本明細書において開示されている。

【0041】

第ＶＩＩＩ因子は、凝固カスケードにおける第Ｘ因子についての補因子であり、いったん活性化されると、活性化された第ＩＸ因子と共同で作用し、第Ｘ因子を活性化する。第ＶＩＩＩ因子は、それ自体では、独立して酵素活性を有していない。すなわち、本明細書における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性または比活性への言及は、第Ｘ因子の活性を決定するための機能アッセイにおける観察された活性または比活性を指し、ここで、第ＶＩＩＩ因子は、第ＩＸ因子と共同で第Ｘ因子の補因子として作用し得る（すなわち第ＶＩＩＩ因子補因子活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ））。同様に、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドなどの）よりも高い活性または比活性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドへの言及は、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドについての前記アッセイにおける観察された第Ｘ因子の活性または比活性と比較して、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドについて増加した、機能アッセイにおける観察された第Ｘ因子の活性または比活性を指す。

【0042】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドなどの参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して増加した比活性を有するかどうかを決定する目的のために、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性を、２段階の発色性第Ｘａ因子アッセイによって測定し得る。例えば、適切な発色アッセイは、以下のとおりである。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、ヒト第Ｘ因子ポリペプチドおよび第ＩＸａ因子ポリペプチド、トロンビン、リン脂質並びにカルシウムと混合する。トロンビンは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを活性化して、第ＶＩＩＩａ因子ポリペプチドを形成する。トロンビンで活性化された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＩＸａ因子ポリペプチド、リン脂質およびカルシウムと酵素複合体を形成し、その酵素複合体は、第Ｘ因子ポリペプチドの第Ｘａ因子ポリペプチドへの変換を触媒し得る。第Ｘａ因子ポリペプチドの活性は、発色性基質（例えばＳＸａ－１１）の切断を触媒して、ｐＮＡを産生し得る。生成したｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍでの発色を決定することによって測定する（例えば吸光度によって測定する）ことができる。第Ｘ因子ポリペプチド、従って第Ｘａ因子ポリペプチドは、過剰に提供する。従って、制限因子は、第ＶＩＩＩａ因子ポリペプチドである。すなわち、生成するｐＮＡのレベルは、サンプル中のＦＶＩＩＩａ因子ポリペプチドによって生成する第Ｘａ因子ポリペプチドの量に比例し、これは、サンプル中のＦＶＩＩＩａ因子ポリペプチドの活性に比例する。サンプル中のＦＶＩＩＩａ因子ポリペプチドの活性は、該サンプル中のＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの補因子活性の尺度である。

【0043】

例えば、適切な発色アッセイは、実施例において使用する、ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄによって製造されるＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（参照：２２１４０６）である。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイを使用して測定し得る。より具体的には、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、実施例１において以下に記載するプロトコルに従って、ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイを使用して測定し得る。

【0044】

本出願の目的のために、用語「比活性」は、活性が、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの量または濃度を考慮して‘正規化’されるような、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの単位あたり（例えばμｇあたり、ＩＵあたり、または正常なヒト血漿中のレベルの％としての抗原レベルあたり）の活性（例えば凝固活性または内因性酵素活性）を指す。（典型的には、プールされた健康なヒト血漿は、０．２μｇ／ｍｌの第ＶＩＩＩ因子濃度を有することに注意されたい。）これは、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの濃度を測定することにより、例えば、実施例１において記載するアッセイなどの、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用し、活性を第ＶＩＩＩ因子濃度で割ることにより、行うことができる。発色アッセイは、「比活性」を測定するために使用し得る。発色アッセイは、活性を計算し、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの濃度で割ることにより、「比活性」を測定するために使用し得る。発色アッセイは、本明細書において記載される発色アッセイの任意の１つであり得る。

【0045】

ＥＬＩＳＡアッセイの実施例においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに結合する抗体を、プレートに結合させ得るであろう。未知の濃度の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含むサンプルを、プレート上を通過させ得るであろう。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに結合する二次検出抗体をプレートに適用し、いかなる過剰分をも洗い流し得るであろう。残っている（すなわち洗い流されていない）検出抗体は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに結合するであろう。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に連結させ得るであろう。プレート上の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに結合する検出抗体のレベルは、該検出抗体の量を測定することによって測定することができるであろう。例えば、検出抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼに連結している場合、該西洋ワサビペルオキシダーゼは、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）などの基質からの青色の反応生成物の産生を触媒することができ、青色の生成物のレベルは、４５０ｎｍでの吸光度によって検出することができる。青色の生成物のレベルは、洗浄工程後に残った検出抗体の量に比例し、それは、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの量に比例する。あるいは、例えば精製されたタンパク質を使用するときは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの量または濃度は、分光光度法で決定し得る。

【0046】

特定の実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを精製し、比活性は、精製した第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに対して行う発色アッセイによって測定する。いくつかの実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を生成し、マウスに該ＡＡＶ粒子を注入し、発色アッセイを使用して該マウスからの血漿中の比活性を検出することによって、測定する。いくつかの実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリペプチドを安定して発現する細胞を提供し、該細胞および／または培養培地から第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを取り出し、発色アッセイを使用して該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性を測定することによって、測定する。

【0047】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドなどの）の比活性よりも高い比活性を有し得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性よりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、または少なくとも５．５倍高い比活性を有し得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性よりも１．２倍と５．５倍との間、または１．５倍と５倍との間高い比活性を有し得る。活性の倍数変化に言及するとき、用語「間」は、指定された値を含む。すなわち、例えば、「１．２倍と５．５倍との間」は、値１．２および５．５を含む。

【0048】

さらなる実施態様においては、本明細書において開示されるＡ１／Ａ３ドメインインターフェイス、Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイスまたはＡ１／Ｃ２ドメインインターフェイスに１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドより高い安定性を有し得る。

【0049】

参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも、経時的にその第ＶＩＩＩ因子活性のより高い比率を保持する。本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化される前の参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有し得る、すなわち該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、その不活性形態の参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも、その不活性形態においてより高い安定性を有し得る。言い換えると、本発明の不活性な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、不活性な参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有し得る。あるいはまたはさらに、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたとき、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有し得る。言い換えると、本発明の活性な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性な参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有し得る。

【0050】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化前に参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有し得る。参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い割合の、活性化前に参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、長い期間、活性化されることができる状態を維持し得る。活性化前の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの安定性は、サンプル中の残留第ＶＩＩＩ因子活性を経時的に測定することによって決定し得る。不活性化された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含有するサンプルのアリコートを適切な時点で取り出し得、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド活性は、アリコート中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを活性化し、本明細書において記載される２段階の第Ｘ因子発色アッセイを実施することによって決定し得る。所与の時点での活性を、次いでサンプルの最初の第ＶＩＩＩ因子活性と比較し得（すなわち最初の時点での第ＶＩＩＩ因子活性を決定することによって）、残存する第ＶＩＩＩ因子活性を、最初の第ＶＩＩＩ因子活性のパーセンテージとして計算し得る。すなわち、活性化されるとき、活性化前に参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い残存活性（すなわち最初の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド活性のパーセンテージとして）を有するであろう。

【0051】

任意に、サンプル中の不活性な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの残存活性は、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５若しくは６０分の過程で、または２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間若しくは２４時間の過程で、または２日、３日、４日、５日、６日若しくは７日の過程で測定し得る。サンプルのアリコートは、最初の時点で該サンプルのアリコートを採取することに加えて、一連の時点、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の時点で採取し得、各アリコート中の第ＶＩＩＩ因子活性を決定し得る。各時点での第ＶＩＩＩ因子活性を最初の時点での第ＶＩＩＩ因子活性と比較することは、残存する第ＶＩＩＩ因子活性を決定することを可能にする。任意に、比活性は、各時点で決定し得る。

【0052】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたとき、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有し得る。活性化されたときに参照ＦＶＩＩＩポリペプチドよりも高い安定性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化に続き、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い割合の、その第ＶＩＩＩ因子活性を長い期間維持し得る。活性化に続く第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの安定性は、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド活性を経時的に測定することによって、すなわちＦＶＩＩＩａ活性減衰アッセイで決定し得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、トロンビンを使用して２３℃で１分間活性化し得、ヒルジンを使用して直ちにクエンチしてトロンビンを不活性化し得る。アリコートは、適切な時点で取り出し得、活性は、第Ｘ因子発色アッセイを使用して決定し得る。

【0053】

任意に、サンプル中の活性な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、活性化に続く５、１０、１５、２０、２５または３０分の過程で測定し得る。活性は、活性化に続いて（例えば活性化に続いて直ちに）サンプル中の第ＶＩＩＩ因子の活性を決定することに加えて、一連の時点、例えば活性化に続く２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の時点で決定し得る。代表的な例として、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子の活性は、活性化に続いて直ちに決定し得、さらなる測定を、活性化の２０分以内の一連の６つまでの時点で行い得る。任意に、比活性は、各時点で決定し得る。

【0054】

参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより長い半減期を有し得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化前に参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも長い半減期を有する。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたとき、参照第ＶＩＩＩ因子よりも長い半減期を有する。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．２、少なくとも２．５、少なくとも２．８または少なくとも３倍の半減期である半減期を有する。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたとき、活性化されたときの参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．２、少なくとも２．５、少なくとも２．８または少なくとも３倍の半減期である半減期を有する。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたとき、活性化されたときの参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの１．１と３との間、１．２と３との間、１．５と３との間、１．７と３との間、１．８と３との間、２と３との間、２．２と３との間、２．５と３との間、または２．８と３との間の倍の半減期である半減期を有する。

【0055】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、液体中で（すなわち溶液中であるときに）より高い安定性を有し得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、液体中でより長い半減期を有する。任意に、液体は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する宿主細胞が培養される馴化培地などの、馴化培地である。任意に、液体は、生物学的サンプルである。生物学的サンプルは、血液、血清または血漿であり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、血漿中でより高い安定性を有し得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、血漿中でより長い半減期を有し得る。

【0056】

さらにさらなる実施態様においては、本明細書において開示されるＡ１／Ａ３ドメインインターフェイス、Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイスまたはＡ１／Ｃ２ドメインインターフェイスに１つ以上のアミノ酸の置換を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現され得る。例えば、置換を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍または少なくとも５倍高く発現され得る。任意に、置換を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して、１．１倍と５倍との間、１．２倍と５倍との間、１．５倍と５倍との間、１．８倍と５倍との間、２倍と５倍との間、２．５倍と５倍との間、３倍と５倍との間、３．５倍と５倍との間、４倍と５倍との間または４．５倍と５倍の間高く発現され得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高いレベルで宿主細胞によって分泌される。

【0057】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベル（および従って第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが参照される野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現されるかどうか）は典型的には、サンプル中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルを測定することによって決定し得る。宿主細胞中の本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルは、宿主細胞中の参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルと比較し得る。これは、定量的に決定し得る。例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルは、上記のＥＬＩＳＡアッセイによって決定し得る。あるいは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルは、半定量的に、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によってまたはウエスタンブロットによって、決定し得る。特定の実施態様においては、血漿中の発現は、実施例において記載されるＡｓｓｅｒａｃｈｒｏｍアッセイによって決定し得る。

【0058】

宿主細胞によって分泌される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルは、典型的には、すなわち、宿主細胞によって細胞内に保持されている第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルとは対照的に決定する。これは、例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含有する液体（例えば血液、血清若しくは血漿などの、生物学的サンプル、または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養する馴化培地などの培養培地）から細胞（例えば宿主細胞）を分離し、該液体中の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルを決定することにより、決定し得る。細胞は、例えば、遠心分離若しくは濾過によって分離し得、および／または液体は、細胞から（例えばピペッティングによって）デカントし得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現のレベルは、血液、血清若しくは血漿などの、生物学的サンプル中で決定し得るか、または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養する馴化培地などの、培養培地中で決定し得る。

【0059】

宿主細胞は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（または参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド）を発現する任意の真核生物宿主細胞であり得る。任意に、宿主細胞は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する昆虫細胞であり得る。典型的には、宿主細胞は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現する哺乳類の宿主細胞であり得る。哺乳類の宿主細胞は、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、ハムスター、またはモルモットの細胞を含む。より具体的には、宿主細胞は、哺乳類の肝細胞であり得、より具体的にはヒトの肝細胞であり得る。任意に、宿主細胞は、Ｈｕｈ７細胞であり得る。任意に、宿主細胞は、生物内の宿主細胞であり得る。任意に、発現は、インビボ発現であり得る。任意に、発現はインビボ発現であり得、血漿中の発現を決定し得る。

【0060】

本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも、より高い比活性および／若しくは安定性を有し得、並びに／または宿主細胞中でより高いレベルで発現され得る。任意に、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得、すなわち参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得る。「参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」は、配列番号１の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドなどの、任意の野生型ＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得る。任意に、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ベータドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。任意に、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号３または５において記載されるアミノ酸配列を有する。任意に、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含むが、１つ以上の置換変異を含まない。

【0061】

１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスのアミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含み得る。生物物理学的研究が、２０の天然に存在するアミノ酸の疎水性、またはより具体的には、該アミノ酸の相対的な疎水性を確立するために実施され、疎水性スケールは、該アミノ酸のそれぞれの疎水性をリストする。１つのそのような例は、水相から非水相（オクタノール）へのアミノ酸の移行の自由エネルギーを計算する、Ｗｉｍｌｅｙ－Ｗｈｉｔｅ全残基疎水性スケールである。用語「より疎水性のアミノ酸」は、Ｗｉｍｌｅｙ－Ｗｈｉｔｅ疎水性スケールによる、水相からオクタノールへの移行についてより好ましい（より負のΔＧ）自由エネルギー値を有するアミノ酸を指す。水相からオクタノールへの移行についての自由エネルギーを、下の表２に示し、図１にグラフで示す。最も疎水性のアミノ酸から始めて、Ｗｉｍｌｅｙ－Ｗｈｉｔｅ疎水性スケールは、アミノ酸の疎水性を以下の順序でリストする：トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、メチオニン、バリン、システイン、グルタミン酸（非荷電）、ヒスチジン（非荷電）、プロリン、スレオニン、アスパラギン酸（非荷電）、セリン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、グリシン、アルギニン（正に荷電）、ヒスチジン（正に荷電）、リジン（正に荷電）、グルタミン酸（負に荷電）、アスパラギン酸（負に荷電）。

【0062】

【表3】

【0063】

本発明の置換変異は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのドメインの２つ以上の間の相互作用を安定化させ得る。例えば、ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の置換変異は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのそれぞれのドメイン間の相互作用を安定化させ得る。特に、Ａ１／Ａ３ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の置換変異は、Ａ１およびＡ３ドメインの相互作用を安定化させ得、Ａ２／Ａ３ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の置換変異は、Ａ２およびＡ３ドメインの相互作用を安定化させ得、Ａ１／Ｃ２ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の置換変異は、Ａ１およびＣ２ドメインの相互作用を安定化させ得る。任意に、本発明の１つ以上の置換変異は、活性化されたときに、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのそれぞれのドメインの相互作用を安定化させ得る。特に、本発明の１つ以上の置換変異は、活性化されたときに、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１およびＡ３ドメイン、Ａ２およびＡ３ドメイン、並びに／またはＡ１およびＣ２ドメインの（すなわちそれぞれのドメインの）相互作用を安定化させ得る。

【0064】

任意に、本発明の１つ以上の置換変異は、活性化された第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体複合体のＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、およびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインの相互作用を安定化させ得る。任意に、１つ以上の置換変異は、活性化第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体複合体のＡ２ドメインのＡ１ドメインおよびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインとの相互作用を安定化させ得る。任意に、１つ以上の置換変異は、活性化された第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体複合体のＡ１ドメインおよびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからのＡ２ドメインの解離を防ぐかまたは遅延させ得る。

【0065】

第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、およびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインの相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、またはＢｉａｃｏｒｅ）によって決定し得る。異なる成分を別々に分離し得、ドメインの１つをＳＰＲチップの表面上に固定化し得；固定化に続き、他のドメインをフローセル中に注入し得、ドメインの相互作用についての結合および解離速度（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）を経時的にモニターし得る。あるいは、不活性な第ＶＩＩＩ因子をＳＰＲチップ上に固定化し得、トロンビンをフローセル中に注入して第ＶＩＩＩ因子を活性化し得；シグナルにおける低下を経時的にモニターし得、これは、第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体複合体のそれぞれの成分の解離（質量の減少）を表す（ｋ_ｏｆｆ）。いずれの手段によっても、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（例えば参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド）との比較は、ドメインの相互作用の安定性を決定することを可能にする。ＦＶＩＩＩａの安定性を決定するための表面プラズモン共鳴の使用は、Ｇａｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００６． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ４，１３１５－１３２２に記載されている。

【0066】

ポリペプチド内のドメイン間相互作用は典型的には、それぞれのドメインのそれぞれにおけるアミノ酸側鎖間の相互作用によって媒介される。それぞれのドメイン中のアミノ酸側鎖間の相互作用は、非共有結合相互作用であり得る。あるいは、それぞれのドメイン中のアミノ酸側鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合）を形成し得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのドメイン間の相互作用は従って、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのそれぞれのドメイン（例えばＡ１およびＡ３、Ａ２およびＡ３またはＡ１およびＣ２ドメイン）の相互作用を安定化させるアミノ酸置換（複数可）（置換変異）によって安定化され得る（すなわち参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して）。

【0067】

芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンおよびトリプトファンの側鎖は、パイスタッキング相互作用によってお互いと相互作用し得る。パイスタッキング相互作用においては、芳香族側鎖の対は典型的には、それらのそれぞれの芳香環を中心から外れた平行配向でアラインさせ得る。あるいは、芳香族側鎖の対は、それらのそれぞれの芳香環を互いにＴ字型の垂直配向でアラインさせ得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間のパイスタッキング相互作用を増加させる１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。

【0068】

疎水性アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびメチオニンの側鎖は典型的には、タンパク質の疎水性コア内で一緒にクラスターを形成する。水に曝される疎水性側鎖の数を最小化することは、タンパク質の折り畳みの背後の主要な推進力であり、疎水性パッキングは、タンパク質構造を安定化させることに貢献する。逆に、荷電したおよび極性のアミノ酸の側鎖は、タンパク質の水に曝された表面上に位置し、そこで、それらは、周囲の水分子と相互作用する。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間の疎水性パッキングを増加させる（すなわち互いに相互作用し、より効率的に水を排除する脂肪族／疎水性アミノ酸の側鎖についてより疎水性の環境を提供する）１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。

【0069】

任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでの荷電したまたは極性のアミノ酸の疎水性アミノ酸での置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでの荷電したまたは極性のアミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンまたはメチオニンでの置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでの疎水性アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含む。

【0070】

それぞれのドメイン中のアミノ酸側鎖は、それぞれのドメインの互いに対する配向のために、好ましくない方法で互いに相互作用し得る。例えば、アミノ酸側鎖は、それぞれのドメインの互いに対する配向のために、エネルギー的に好ましくないコンフォメーションを採用することを余儀なくされ得る（立体衝突）。あるいは、アミノ酸側鎖は、別のドメイン中の同様に荷電したアミノ酸側鎖の近くに配置され得る（好ましくない静電相互作用）。

【0071】

任意に、１つ以上の置換変異は、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間の好ましくない相互作用を排除し得る。任意に、１つ以上の置換変異は、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間の立体衝突を低下させ得る。任意に、立体衝突を低下させるための１つ以上の置換変異は、大きな疎水性アミノ酸のより小さなアミノ酸での置換を含み得る。任意に、１つ以上の置換変異は、大きな疎水性アミノ酸のイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンまたはグリシンでの置換を含み得る。任意に、大きな疎水性アミノ酸は、芳香族アミノ酸である。任意に、１つ以上の置換変異は、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間の好ましくない静電相互作用を低下させ得る。任意に、１つ以上の置換変異は、正に荷電したアミノ酸の置換を含み得る。任意に、１つ以上の置換変異は、正に荷電したアミノ酸の負に荷電したアミノ酸での置換を含み得る。任意に、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。任意に、１つ以上の置換変異は、負に荷電したアミノ酸の置換を含み得る。任意に、１つ以上の置換変異は、負に荷電したアミノ酸の正に荷電したアミノ酸での置換を含み得る。任意に、正に荷電したアミノ酸は、アルギニンまたはリジンである。任意に、１つ以上の置換変異は、荷電アミノ酸の非荷電アミノ酸での置換を含み得る。任意に、非荷電アミノ酸は、極性アミノ酸であり得る。任意に、非荷電アミノ酸は、アスパラギンまたはグルタミンであり得る。任意に、非荷電アミノ酸は、セリンまたはスレオニンであり得る。任意に、非荷電アミノ酸は、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニンまたはグリシンであり得る。

【0072】

任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の表面にアクセスできないアミノ酸の置換を含み得る。第ＶＩＩＩ因子の３次元結晶構造が利用可能であり（例えば、ＰＤＢアクセッション番号２ＲＺＥまたは４ＢＤＶ）；従って、表面にアクセスできない、ドメイン間インターフェイスでのアミノ酸を同定することは、定型的であろう。任意に、表面にアクセスできないアミノ酸は、活性化されたとき、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドにおいて表面にアクセスできない。

【0073】

本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１／Ａ３インターフェイス、Ａ２／Ａ３インターフェイス、またはＡ１／Ｃ２インターフェイスから選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得、ここで、置換されるアミノ酸は、メチオニンまたはヒスチジンである。これらのドメイン間インターフェイスでのメチオニンまたはヒスチジン残基は、例えば、第ＶＩＩＩ因子の三次元結晶構造から同定し得る。任意に、メチオニンまたはヒスチジンは、より疎水性のアミノ酸で置換し得る。任意に、メチオニン残基は、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンで置換し得る。任意に、ヒスチジン残基は、グルタミン酸、システイン、バリン、メチオニン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンで置換し得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、１つ以上の置換変異を含み得、ここで、置換されるアミノ酸は、配列番号１の位置６６２のアミノ酸に対応するメチオニン残基（Ｍ６６２）、または配列番号１の位置６９３のアミノ酸に対応するヒスチジン残基（Ｈ６９３）である。任意に、Ｍ６６２は、アラニン、システイン、グルタミン酸、グリシンまたはセリンで置換し得る。任意に、Ｈ６９３は、アルギニンで置換し得る。任意に、Ｍ６６２またはＨ６９３は、より疎水性のアミノ酸で置換し得る。任意に、Ｍ６６２は、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンで置換し得る。任意に、Ｈ６９３は、グルタミン酸、システイン、バリン、メチオニン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンで置換し得る。

【0074】

配列番号１の特定のアミノ酸「に対応する」残基を決定することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、当業者は単に、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのものなどの適切なアラインメントアルゴリズムを使用して、野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列の配列番号１との配列アラインメントを実施し、どの残基が配列番号１のアミノ酸とアラインするかを決定する必要があるだけである。

【0075】

任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでのアミノ酸の芳香族アミノ酸での置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでのアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンまたはトリプトファンでの置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでのメチオニン残基のフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンでの置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、ドメイン間インターフェイスでのヒスチジン残基のフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンでの置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｆ、Ｍ６６２ＷまたはＭ６６２Ｙ置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｈ６９３Ｆ、Ｈ６９３ＷまたはＨ６９３Ｙ置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｗ置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｈ６９３ＷまたはＨ６９３Ｙ置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｈ６９３Ｗ置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２ＷおよびＨ６９３Ｗ置換を含む。

【0076】

すなわち、特定の実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み、ここで、該１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｗ置換を含む。さらなる実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み、ここで、該１つ以上の置換変異は、Ｈ６９３Ｗ置換を含む。さらにさらなる実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み、ここで、該１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２ＷおよびＨ６９３Ｗ置換を含む。

【0077】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号２８、３０、３５、３６、４０若しくは４１のいずれか１つにおいて記載される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列、または配列番号２８、３０、３５、３６、４０若しくは４１のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0078】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２のより低い疎水性のアミノ酸での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｉを含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｃを含まない。

【0079】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｋを含まない。任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が配列番号１の位置１８２８に対応する位置（Ｄ１８２８）にアスパラギン酸残基を含む場合、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｋを含まない。任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が配列番号１の位置１８２３～１８３４に対応する位置に配列ＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡを含む場合、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２Ｋを含まない。

【0080】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ａ１０８の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ａ１０８のより疎水性のアミノ酸での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ａ１０８Ｉを含まない。

【0081】

任意に、１つ以上の置換変異は、負に荷電したアミノ酸の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、負に荷電したアミノ酸の非荷電アミノ酸での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｄ２７、Ｅ２７２、Ｅ２８７、Ｄ３０２、Ｄ５１９、Ｅ５４０、Ｅ６６５、Ｄ６６６、Ｅ６８３、Ｄ６９６、Ｄ１７９５、Ｅ１８２９、Ｅ１９８４の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｄ２７、Ｅ２７２、Ｅ２８７、Ｄ３０２、Ｄ５１９、Ｅ５４０、Ｅ６６５、Ｄ６６６、Ｅ６８３、Ｄ６９６、Ｄ１７９５、Ｅ１８２９、Ｅ１９８４の非荷電アミノ酸での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｄ２７、Ｅ２７２、Ｅ２８７、Ｄ３０２、Ｄ５１９、Ｅ５４０、Ｅ６６５、Ｄ６６６、Ｅ６８３、Ｄ６９６、Ｄ１７９５、Ｅ１８２９、Ｅ１９８４のアラニンまたはバリンでの置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｄ５１９Ｌ、Ｄ５１９Ｑ、Ｄ５１９ＴまたはＤ５１９Ｖを含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｄ５１９、Ｅ６６５およびＥ１９８４の２つ以上の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｄ５１９、Ｅ６６５およびＥ１９８４の２つ以上のアラニンまたはバリンでの置換を含まない。

【0082】

任意に、１つ以上の置換変異は、正に荷電したアミノ酸の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、正に荷電したアミノ酸の非荷電アミノ酸での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ３８０、Ｒ４９０、Ｋ５１２、Ｋ５２３、Ｒ５２７、Ｋ５５６、Ｒ５６２、Ｋ５７０またはＲ５７１の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ３８０、Ｒ４９０、Ｋ５１２、Ｋ５２３、Ｒ５２７、Ｋ５５６、Ｒ５６２、Ｋ５７０またはＲ５７１の非荷電アミノ酸での置換を含まない。

【0083】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ｓ３１３、Ｈ３１７、Ｔ５２２、Ｓ５２４、Ｒ５３１、Ｎ５３８、Ｓ６５０、Ｓ６５４、Ｎ６８４、Ｓ６９５、Ｓ１７９１、Ｑ１８２０、Ｓ１９４９、Ｎ１９５０またはＲ１９６６の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｓ３１３、Ｈ３１７、Ｔ５２２、Ｓ５２４、Ｒ５３１、Ｎ５３８、Ｓ６５０、Ｓ６５４、Ｎ６８４、Ｓ６９５、Ｓ１７９１、Ｑ１８２０、Ｓ１９４９、Ｎ１９５０またはＲ１９６６のアラニンでの置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｙ４７６、Ｙ６６４、Ｙ１７８６またはＹ１７９２の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｙ４７６、Ｙ６６４、Ｙ１７８６またはＹ１７９２のフェニルアラニンでの置換を含まない。

【0084】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ６５９の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ６５９の非保存的置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ６５９Ｄ、Ｋ６５９Ｅ、Ｋ６５９Ｙ、Ｋ６５９Ｎ、Ｋ６５９Ｑ、Ｋ６５９Ｔ、Ｋ６５９Ｓ、Ｋ６５９Ｃ、Ｋ６５９Ｗ、Ｋ６５９Ｆ、Ｋ６５９Ｐ、Ｋ６５９Ｍ、Ｋ６５９Ｖ、Ｋ６５９Ｌ、Ｋ６５９Ｉ、Ｋ６５９Ｙ、Ｋ６５９ＧまたはＫ６５９Ａを含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｅ６６５の置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｅ６６５の非保存的置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｅ６６５Ｖ、Ｅ６６５Ｉ、Ｅ６６５Ｍ、Ｅ６６５ＮまたはＥ６６５Ｙを含まない。

【0085】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ６５９の置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｋ６５９Ｑ、Ｋ６５９Ｇ、Ｋ６５９ＩまたはＫ６５９Ｆを含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｅ６６５の置換を含む。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｅ６６５Ｒ、Ｅ６６５Ｑ、Ｅ６６５Ｈ、Ｅ６６５Ｋ、Ｅ６６５Ｍ、Ｅ６６５Ｆ、Ｅ６６５ＷまたはＥ６６５Ｙを含む。

【0086】

特定の実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス、Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイスまたはＡ１／Ｃ２ドメインインターフェイスから選択されるドメイン間インターフェイスでの１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得、ここで、該１つ以上の置換変異の少なくとも１つは、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含む。言い換えると、少なくとも１つ以上の置換変異は、第１のドメイン（例えばＡ１またはＡ２ドメイン）中のシステイン残基の置換および第２のドメイン（例えばＡ３またはＣ２ドメイン）中のシステイン残基の置換を含み得る。一対のアミノ酸は従って、第１のアミノ酸（第１のドメイン中の）および第２のアミノ酸（第２のドメイン中の）を含み得る。言い換えると、少なくとも１つ以上の置換変異は、第１のアミノ酸（第１のドメイン中の）、および第２のアミノ酸（第２のドメイン中の）のシステイン残基での置換を含み得る。すなわち、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの２つのそれぞれのドメイン中の一対の同族アミノ酸のシステイン残基での置換を含む１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。

【0087】

任意に、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換は、システイン残基がそれぞれのドメイン間にジスルフィド結合を形成することを可能にする。ジスルフィド結合の形成は、質量分析によって、および特に、例えば、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１，１８３－２１６に概説されているように、任意に、限られたタンパク質分解に続いて、ジスルフィド結合を含有すると疑われるポリペプチドの断片化パターンを分析することによって、決定し得る。あるいは、ジスルフィド結合の形成は、ポリペプチドに対して限られたタンパク質分解を実施し、得られたタンパク質フラグメントを、任意にＮ末端配列決定と組み合わせて、還元および非還元条件下の両方でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析することによって、決定し得る。

【0088】

任意に、システイン残基で置換されている一対のアミノ酸は、Ａ１およびＡ３ドメイン中にあり得る。任意に、第１のアミノ酸は、配列番号１のＭ１４７、Ｓ１４９またはＳ２８９に対応し得、第２のアミノ酸は、配列番号１のＥ１９６９、Ｅ１９７０またはＮ１９７７に対応し得る。任意に、１つ以上の置換変異は、（ｉ）Ｓ２８９ＣおよびＮ１９７７Ｃ、（ｉｉ）Ｍ１４７ＣおよびＥ１９７０Ｃ、並びに（ｉｉｉ）Ｓ１４９ＣおよびＥ１９６９Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含む。

【0089】

任意に、システイン残基で置換されている一対のアミノ酸は、Ａ２およびＡ３ドメイン中にあり得る。任意に、第１のアミノ酸は、配列番号１のＴ６６７、Ｔ６６９、Ｎ６８４、Ｌ６８７、Ｉ６８９、Ｓ６９５またはＦ６９７に対応し、第２のアミノ酸は、配列番号１のＳ１７９１、Ｇ１７９９、Ａ１８００、Ｒ１８０３、Ｅ１８４４、Ｓ１９４９、Ｇ１９８１、Ｖ１９８２、またはＹ１９７９に対応する。任意に、１つ以上の置換変異は、（ｉ）Ｔ６６９ＣおよびＶ１９８２Ｃ、（ｉｉ）Ｌ６８７ＣおよびＡ１８００Ｃ、（ｉｉｉ）Ｉ６８９ＣおよびＧ１７９９Ｃ、（ｉｖ）Ｆ６９７ＣおよびＳ１９４９Ｃ、（ｖ）Ｔ６６７ＣおよびＧ１９８１Ｃ、（ｖｉ）Ｔ６６９ＣおよびＹ１９７９Ｃ、（ｖｉｉ）Ｎ６８４ＣおよびＳ１７９１Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｌ６８７ＣおよびＲ１８０３Ｃ、並びに（ｉｘ）Ｓ６９５ＣおよびＥ１８４４Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含む。

【0090】

任意に、システイン残基で置換されている一対のアミノ酸は、Ａ１およびＣ２ドメイン中にあり得る。任意に、第１のアミノ酸は、配列番号１のＡ１０８、Ｔ１１８またはＶ１３７に対応し、第２のアミノ酸は、配列番号１のＮ２１７２、Ｑ２３２９またはＹ２３３２に対応する。任意に、１つ以上の置換変異は、（ｉ）Ａ１０８ＣおよびＱ２３２９Ｃ、（ｉｉ）Ｔ１１８ＣおよびＮ２１７２Ｃ、並びに（ｉｉｉ）Ｖ１３７ＣおよびＹ２３３２Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含む。

【0091】

任意に、１つ以上の置換変異は、配列番号１の位置６５６～６６７に対応するアミノ酸（ＹＴＦＫＨＫＭＶＹＥＤＴ）のいずれか１つのシステイン残基での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、配列番号１の位置１８２３～１８３４に対応するアミノ酸（ＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡ）のいずれか１つのシステイン残基での置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、配列番号１の位置６５６～６６７に対応するアミノ酸（ＹＴＦＫＨＫＭＶＹＥＤＴ）のいずれか１つのシステイン残基での置換を含む第１の置換変異、および配列番号１の位置１８２３～１８３４に対応するアミノ酸（ＭＡＰＴＫＤＥＦＤＣＫＡ）のいずれか１つのシステイン残基での置換を含む第２の置換変異を含まない。

【0092】

任意に、１つ以上の置換変異は、Ｙ６５６ＣおよびＡ１８３４Ｃ、Ｔ６５７ＣおよびＫ１８３３Ｃ、Ｋ６５９ＣおよびＤ１８３１Ｃ、Ｈ６６０ＣおよびＦ１８３０Ｃ、Ｋ６６２ＣおよびＥ１８２９Ｃ、Ｍ６６２ＣおよびＤ１８２８Ｃ、Ｖ６６３ＣおよびＫ１８２７Ｃ、Ｙ６６４ＣおよびＴ１８２６Ｃ、Ｅ６６５ＣおよびＰ１８２５Ｃ、Ｄ６６６ＣおよびＡ１８２４Ｃ、並びにＴ６６７ＣおよびＭ１８２３Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２ＣおよびＤ１８２８Ｃ、並びにＹ６６４ＣおよびＴ１８２６Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｒ１２１ＣおよびＬ２３０２Ｃ置換を含まない。任意に、１つ以上の置換変異は、Ｍ６６２ＣおよびＤ１８２８Ｃ、Ｓ２６８ＣおよびＦ６７３Ｃ、Ｉ３１２ＣおよびＰ６７２Ｃ、Ｓ３１３ＣおよびＡ６４４Ｃ、Ｍ６６２ＣおよびＫ１８２７Ｃ、Ｙ６６４ＣおよびＴ１８２６Ｃ、Ｐ２６４ＣおよびＱ６４５Ｃ、Ｒ２８２ＣおよびＴ５２２Ｃ、Ｓ２８５ＣおよびＦ６７３Ｃ、Ｈ３１１ＣおよびＦ６７３Ｃ、Ｓ３１４ＣおよびＡ６４４Ｃ、Ｓ３１４ＣおよびＱ６４５Ｃ、Ｖ６６３ＣおよびＥ１８２９Ｃ、Ｎ６９４ＣおよびＰ１９８０Ｃ、並びにＳ６９５ＣおよびＥ１８４４Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含まない。

【0093】

特定の実施態様においては、１つ以上の置換は、（ｉ）Ｌ６８７ＣおよびＡ１８００Ｃ；（ｉｉ）Ｎ６８４ＣおよびＳ１７９１Ｃ；並びに（ｉｉｉ）Ｓ６９５ＣおよびＥ１８４４Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号３７、３８、３９、４２、４３若しくは４４のいずれか１つにおいて記載される第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列、または配列番号３７、３８、３９、４２、４３若しくは４４のいずれか１つにおいて記載されるアミノ酸配列を含み得る。

【0094】

上で概説したように、第ＶＩＩＩ因子の活性化は、トロンビンによるタンパク質分解切断を必要とする。トロンビン切断に続いて、第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、およびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインからなるヘテロ三量体複合体を形成する。活性化の過程で、第ＶＩＩＩ因子は、コンフォメーション変化を受ける。より具体的には、活性化の過程で、Ａ１およびＡ３－Ｃ１－Ｃ２ドメインに対するＡ２ドメインの配向が変更される。活性化された第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインはすなわち、Ａ１、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインに関して、不活性な第ＶＩＩＩ因子とは異なる配向にある。Ａ２ドメインは従って、活性化の過程の間に、第ＶＩＩＩ因子の他のドメインに関してピボットするように見え得る。野生型第ＶＩＩＩ因子の最大活性は典型的には、活性化の約２分後に見られる。

【0095】

理論によって拘束されることを望まないが、Ａ２ドメインによって行われるコンフォメーション変化は、第ＶＩＩＩ因子活性化について必要とされ得ると考えられている。不活性な第ＶＩＩＩ因子の配向でコンフォメーションＡ２ドメインを安定化させる置換変異は従って、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化を阻害し得る。特定の実施態様においては、１つ以上の置換変異は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化を阻害しない。任意に、１つ以上の置換変異は、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化と比較して第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化を阻害しない。任意に、Ａ１／Ａ３、Ａ２／Ａ３またはＡ１／Ｃ２ドメインインターフェイスに１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりもゆっくりとは活性化されない。

【0096】

第ＶＩＩＩ因子活性化の阻害は、活性化に続く最大の第ＶＩＩＩ因子活性を達成するのにかかる時間を、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのそれと比較することによって、決定し得る。トロンビンは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含有するサンプルに加え得、第ＶＩＩＩ因子活性化は、適切な時点でサンプルのアリコートを採取し、各アリコートについてのＦＶＩＩＩ活性を決定することによって、モニターし得る。任意に、ＦＶＩＩＩ活性は、活性化に続く５、１０、１５または２０分の過程で、測定し得る。活性は、一連の時点、例えば活性化に続く２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の時点で、決定し得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子活性は、活性化の直前に、決定し得る。代表的な例として、第ＶＩＩＩ因子活性は、活性化に続いて直ちに決定し得、さらなる測定を、活性化に続く３０秒ごとに行い得る。任意に、相対的な第ＶＩＩＩ因子活性は、活性化に続く直後の第ＶＩＩＩ因子活性と比較した、所与の時点での第ＶＩＩＩ因子活性における倍数増加を計算することによって、決定し得る。任意に、比活性は、各時点で決定し得る。

【0097】

１つ以上の置換変異を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、本明細書において記載されているもののいずれかなどの、シグナルペプチドの全てまたは一部を含み得る。任意に、シグナルペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドであり得る。任意に、シグナルペプチドは、配列番号１５を含み得る。任意に、シグナルペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチド以外のシグナルペプチドであり得る。任意に、シグナルペプチドは、配列番号１８または２０を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、成熟した第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得る。「成熟した第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」は、シグナルペプチドを含まない第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。シグナルペプチドは、合成に続き切断されたか可能性がある。シグナルペプチドは、全く存在しなかった可能性がある。例えば、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、シグナルペプチドを全く含んでいなかった可能性がある。

【0098】

野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ｂドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含む。本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメインおよび／またはＣ２ドメインのそれぞれの全てまたは一部を含み得る。野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの配列は、配列番号１において記載する。

【0099】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、イヌ、ブタまたはヒトの第ＶＩＩＩ因子である。特定の実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩＩ因子である。ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列は、配列番号１において記載する。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。言い換えると、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは任意に、配列番号１内の対応する配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異によってのみ配列番号１において記載されるアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸を含み得る。

【0100】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列に対応する配列番号１内の配列を決定することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、当業者は単に、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのものなどの適切なアラインメントアルゴリズムを使用して、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列の配列番号１との配列アラインメントを実施し、配列番号１のどの領域が第ＶＩＩＩ因子アミノ酸に対応するか（すなわち配列番号１のどの配列が第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列にアラインするか）を決定する必要があるだけである。

【0101】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個の連続するアミノ酸と少なくとも９０％同一であり得る。あるいは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の５つまでの、４つまでの、３つまでの、または２つまでの領域からの少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１つの置換変異によって配列番号１の少なくとも１３４９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異によってのみ配列番号１の少なくとも１３４９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸を含み得る。

【0102】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、２０以下、１５個以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１つの置換変異によって配列番号１において記載されるアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異によってのみ配列番号１において記載されるアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸を含み得る。

【0103】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインの一部を含み得、または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインを含まない可能性がある。特定の実施態様によると、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインを含まない。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは従って、ベータドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得る。

【0104】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号３または５の少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号３または５の少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個の連続するアミノ酸と少なくとも９０％同一であり得る。あるいは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号３または５の５つまで、４つまで、３つまで、または２つまでの領域からの少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１つの置換変異によって配列番号３または５の少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異によってのみ配列番号３または５の少なくとも１３４９、少なくとも１３５７、少なくとも１３６８、少なくとも１３７６、少なくとも１３７７、少なくとも１３８５、少なくとも１３８６、少なくとも１３９１、少なくとも１３９４、少なくとも１４１８または少なくとも１４２１個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸を含み得る。

【0105】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号３または５において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１つの置換変異によって配列番号３または５において記載されるアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、１つ以上の置換変異によってのみ配列番号３または５において記載されるアミノ酸配列と異なる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸を含み得る。

【0106】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのドメインのいずれかまたは全ては、ドメインの第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列と比較したときに、本明細書において定義される１つ以上の置換変異に加えて、１つ以上の、置換、挿入および／または欠失などの改変を含み得る。

【0107】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメインの少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメインの少なくとも３００個のアミノ酸（任意に少なくとも３００個の連続するアミノ酸）と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメインと少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から３２９に対応するアミノ酸の少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から３２９に対応するアミノ酸の少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から３２９に対応するアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から３２９に対応するアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0108】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ２ドメインの少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ２ドメインの少なくとも３００個のアミノ酸（任意に少なくとも３００個の連続するアミノ酸）と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ２ドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ２ドメインと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置３８０から７１１に対応するアミノ酸の少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置３８０から７１１に対応するアミノ酸の少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置３８０から７１１に対応するアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置３８０から７１１に対応するアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0109】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ３ドメインの少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ３ドメインの少なくとも３００個のアミノ酸（任意に少なくとも３００個の連続するアミノ酸）と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ３ドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ３ドメインと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１６９４から２０２１に対応するアミノ酸の少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１６９４から２０２１に対応するアミノ酸の少なくとも３００個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１６９４から２０２１に対応するアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１６９４から２０２１に対応するアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0110】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ１ドメインの少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ１ドメインの少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸（任意に少なくとも１３０個の連続するアミノ酸）と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ１ドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ１ドメインと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２０２１から２１６９に対応するアミノ酸の少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２０２１から２１６９に対応するアミノ酸の少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２０２１から２１６９に対応するアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２０２１から２１６９に対応するアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0111】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ２ドメインの少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸（任意に少なくとも１３０個の連続するアミノ酸）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ２ドメインの少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ２ドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｃ２ドメインと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２１７４から２３２６に対応するアミノ酸の少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２１７４から２３２６に対応するアミノ酸の少なくとも１３０、少なくとも１３５または少なくとも１４０個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２１７４から２３２６に対応するアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置２１７４から２３２６に対応するアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0112】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、完全なまたは部分的なＢドメインを含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインの少なくとも８２０個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインの少なくとも８２０個のアミノ酸（任意に少なくとも８２０個の連続するアミノ酸）と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｂドメインと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置７４１から１６４８に対応するアミノ酸の少なくとも８００個のアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置７４１から１６４８に対応するアミノ酸の少なくとも８００個のアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置７４１から１６４８に対応するアミノ酸と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置７４１から１６４８に対応するアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。

【0113】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、改変ベータドメイン関連（ＢＤＲ）領域を含み得る。野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域に対応する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、最大８８個のアミノ酸を含む改変ＢＤＲ領域を含み得る。

【0114】

野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域に対応する。アミノ酸の位置を指すとき、用語「間」は、指定された位置を含まない。すなわち野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１４に対応する位置で始まり、配列番号１の位置１６９６に対応する位置で終わる。野生型ＢＤＲ領域は、第ＶＩＩＩ因子のベータドメインを含む。野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域であり得る。野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１４で始まり得、配列番号１の位置１６９６で終わり得る。野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域に対応する別の野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列からの領域であり得る。野生型ＢＤＲ領域は、配列番号１の位置７１４で始まり、配列番号１の位置１６９６で終わる領域に対応する別の野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列からの領域であり得る。

【0115】

配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域「に対応する」野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列の領域を決定することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、当業者は単に、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのものなどの適切なアラインメントアルゴリズムを使用して、野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列の配列番号１との配列アラインメントを実施し、野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列のどの領域が配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域とアラインするかを決定する必要があるだけである。例えば、当業者は、野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列のどの領域が配列番号１の位置７１４から１６９６とアラインするかを決定し得る。

【0116】

「改変ＢＤＲ領域」は、野生型ＢＤＲ領域と同一ではない。改変ＢＤＲ領域は、野生型ＢＤＲ領域よりも短い。当業者は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの改変ＢＤＲ領域が「野生型ＢＤＲ領域と比較して改変されている」かどうかを容易に決定することができる。例えば、当業者は単に、上記のＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのものなどの適切なアラインメントアルゴリズムを使用して、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列の、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列との配列アラインメントを実施し、配列番号１の位置７１３と１６９７との間の領域に対応する野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列の領域（野生型ＢＤＲ領域）とアラインする第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列における領域（改変ＢＤＲ領域）を決定し、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列における領域（改変ＢＤＲ領域）と該野生型第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列における領域（野生型ＢＤＲ領域）との間のアミノ酸配列を比較する必要があるだけである。何らかの違いがある場合、その場合は、該領域は、改変ＢＤＲ領域である。

【0117】

本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの改変ＢＤＲ領域は最大８８個のアミノ酸を含むため、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列とアラインさせるとき、野生型ＢＤＲ領域と比較して、改変ＢＤＲ領域における第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列においては、１つ以上のギャップがあるであろう。すなわち、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの改変ＢＤＲ領域は、該改変ＢＤＲ領域を野生型ＢＤＲ領域と比較するとき、１つ以上の欠失を含む。改変ＢＤＲ領域はまた、該改変ＢＤＲ領域を野生型ＢＤＲ領域と比較するとき、置換および／または挿入などの１つ以上の改変を有し得る。改変ＢＤＲ領域は、野生型ＢＤＲ領域において見出される１つ以上のアミノ酸を含み得る。例えば、改変ＢＤＲ領域は、野生型ＢＤＲ領域において見出される１つ以上の一続きのアミノ酸を含み得る。

【0118】

改変ＢＤＲ領域は、「最大」指定された数のアミノ酸「を含む」。これは、改変ＢＤＲ領域が指定された数以下のアミノ酸を含むことを意味する。第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、さらなるアミノ酸を含み得るが、改変ＢＤＲ領域においてはそうではない。例えば、改変ＢＤＲ領域が「最大８８個のアミノ酸を含む」場合、該改変ＢＤＲ領域は、８８個以下のアミノ酸を含む。さらなる例として、改変ＢＤＲ領域が「最大７４個のアミノ酸を含む」場合、該改変ＢＤＲ領域は、７４個以下のアミノ酸を含む。

【0119】

「第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」は、機能的である。機能的な第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、トロンビンによって活性化されるとき、第ＩＸａ因子、リン脂質およびカルシウムと酵素複合体を形成し得、該酵素複合体は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を触媒し得る。

【0120】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが機能的であるかどうかを決定することは、当業者の能力の範囲内である。当業者は単に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性を決定する必要があるだけである。ポリペプチドの比活性が、配列番号１の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドなどの野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性の少なくとも２０％である場合、その場合は、それは、機能的である。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、補因子活性を測定する発色アッセイなどの、発色アッセイを使用して分析することができる。例えば、適切な発色アッセイは、以下のとおりである。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（ヒト第Ｘ因子ポリペプチドおよび第ＩＸａ因子ポリペプチド、トロンビン、リン脂質並びにカルシウムと混合されている）。トロンビンは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを活性化して、第ＶＩＩＩａ因子ポリペプチドを形成する。トロンビンで活性化された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＩＸａ因子ポリペプチド、リン脂質、およびカルシウムと酵素複合体を形成し、その酵素複合体は、第Ｘ因子ポリペプチドの第Ｘａ因子ポリペプチドへの変換を触媒し得る。第Ｘａ因子ポリペプチドの活性は、発色性基質（例えばＳＸａ－１１）の切断を触媒して、ｐＮＡを産生し得る。生成したｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍでの発色を決定することによって測定する（例えば吸光度によって測定する）ことができる。第Ｘ因子ポリペプチド、従って第Ｘａ因子ポリペプチドは、過剰に提供する。従って、制限因子は、第ＶＩＩＩａ因子ポリペプチドである。すなわち、生成するｐＮＡのレベルは、サンプル中のＦＶＩＩＩａ因子ポリペプチドによって生成する第Ｘａ因子ポリペプチドの量に比例し、これは、サンプル中のＦＶＩＩＩａ因子ポリペプチドの活性に比例する。サンプル中のＦＶＩＩＩａ因子ポリペプチドの活性は、該サンプル中のＦＶＩＩＩ因子ポリペプチドの補因子活性の尺度である。

【0121】

例えば、適切な発色アッセイは、実施例において使用する、ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄによって製造されるＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（参照：２２１４０６）である。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイを使用して測定し得る。

【0122】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、凝固アッセイを使用して分析することができる。アッセイは、一段階凝固アッセイであり得る。例えば、適切な凝固アッセイ（一段階凝固アッセイ）は、以下のとおりである。

【0123】

第ＶＩＩＩ因子は凝固カスケードの一部であるため、増加した活性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、より低い活性を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも速く血液凝固を触媒するであろう。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、血小板の少ない血漿と混合し、３７℃で培養する。次いで、リン脂質およびＫａｏｌｙｎまたはＳｙｎｔｈａＳＩＬ ＡＰＴＴ試薬などの接触活性化経路活性化因子を加える。カルシウムを次いで加え、ユーザーは、凝固が起こるのにかかる時間を測定する。血塊形成は、磁性鋼球法によって、直接評価することができる。血塊形成は、球の周りのフィブリンストランドの形成が動きを生じ、磁場における変化を検出することができるまで、鋼球が磁場中で静止したままである、回転キュベットアッセイを使用して測定し得る。あるいは、血塊形成は、球の周りのフィブリンストランドの形成がその回転を停止させる（これは、センサーによって検出することができる）まで磁石の影響下で鋼球を回転させる、回転鋼球アッセイを使用して測定し得る。いずれの場合においても、凝固時間を記録し得る。

【0124】

ヒト患者などの患者においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、該患者から血液サンプルを採取することによって、または該患者から採取された血液サンプルに対してアッセイを実施することによって、測定し得る。

【0125】

第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は、テールクリップアッセイを使用して分析することができる。適切なテールクリップアッセイは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、または遺伝子治療の文脈における第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、第ＶＩＩＩ因子に欠けたノックアウトマウスなどのマウスに投与することを含み得る。マウスの尾を次いで切り取り、尾における切り込みが凝固するのにかかる時間を測定する。出血の継続時間は、投与される第ＶＩＩＩ因子、例えば改変ＢＤＲ領域を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド対野生型第ＶＩＩＩ因子、または第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列の少なくとも一部分が野生型ではない第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド対野生型第ＶＩＩＩ因子の活性の相対的尺度を提供する。

【0126】

改変ＢＤＲ領域は、最大８８個のアミノ酸を含む。改変ＢＤＲ領域は、最大８７、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、または４５個のアミノ酸を含み得る。好ましくは、改変ＢＤＲ領域は、最大７４個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、最大５４個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、最大４７個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、最大４５個のアミノ酸を含み得る。

【0127】

改変ＢＤＲ領域は、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも２８、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも６０、または少なくとも６５個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、少なくとも２８個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、少なくとも３０個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、少なくとも５４個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、少なくとも５７個のアミノ酸を含み得る。改変ＢＤＲ領域は、少なくとも５８個のアミノ酸を含み得る。

【0128】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から７２２および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から７２２および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸からなる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から７３１および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から７３１および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸からなる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から７４３および１６３８から２３３２に対応するアミノ酸を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る（‘ＳＱ’第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド）。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１の位置１から７４３および１６３８から２３３２に対応するアミノ酸からなり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、ＳＱリンカー配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲを含み得る。

【0129】

任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号２８または３０において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号２８または３０において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列からなる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号２８または３０において記載されるアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号２８において記載されるアミノ酸配列からなる第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含み得る。

【0130】

第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
本発明は、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0131】

用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さの、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体の高分子鎖を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（デオキシリボヌクレオチド）またはＲＮＡ（リボヌクレオチド）を含み得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡからなり得る。ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチドはＲＮＡまたはＤＮＡを含み得るため、Ｔ（チミン）ヌクレオチドへの全ての言及は、Ｕ（ウラシル）で置き換え得る。

【0132】

第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。「コードする」「配列」は、コードされるアミノ酸配列をコードするコドンを含むヌクレオチド配列を指す。例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドンを含む。野生型第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に提供する。第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、１つ以上の、イントロンなどの非コードヌクレオチドの、１つ以上の領域を含み得る。非コードヌクレオチドの領域は、コードされるアミノ酸配列をコードするコドンの配列に割り込み得る。すなわちコードされるアミノ酸配列をコードするコドンの配列は、配列において連続し得るか、または非コードヌクレオチドの１つ以上の領域によって分離され得る。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、いかなる非コードヌクレオチドも含まない。本明細書においては、終止コドンは、非コードヌクレオチドと見なされないであろう。

【0133】

以下の表は、各アミノ酸をコードするコドンを説明する。

【0134】

【表4】

【0135】

対応するＲＮＡコドンは、上記の表におけるＴの代わりにＵを含有するであろう。

【0136】

第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、成熟した第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードし得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、シグナルペプチドの全てまたは一部分をコードしない。第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、本明細書において記載されるシグナルペプチドのいずれかまたはいずれかの一部などの、シグナルペプチドの全てまたは一部をコードし得る。

【0137】

本発明の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。上記したように、遺伝暗号は、縮重しており、多くのアミノ酸は、複数の代替コドンによってコードされ得る。しかしながら、種々の生物、組織または細胞の遺伝暗号は、特定のアミノ酸をコードすることについて１つの特定のコドンを使用する方向に偏らされ得る。「コドン最適化された」ヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞または生物における発現、例えばヒト肝細胞における発現について最適化され得る。好ましくは、コドン最適化された核酸配列は、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列に対して改変されているが、一方で、該ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、改変されていない。

【0138】

コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝細胞において、より高いレベルで発現され得る。

【0139】

すなわち第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、該配列がヒト肝細胞において発現されるとき、野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも高いレベルで発現され得る。例えば、コドン最適化された第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝細胞において、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍高く発現され得る。「参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列」は、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列などの、野生型コドンを使用して第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（それ自体が野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得るか、または改変ＢＤＲを含む本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドなどの改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得る）をコードする、任意の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列であり得る。任意に、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチドは、「同等の」第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列である、すなわち参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチドは、比較されている第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドと同じ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。

【0140】

ヌクレオチド配列を「コドン最適化された」として説明することによって、全てのコドンが最適化される必要はない。すなわち第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列のコドン最適化された一部分は、野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列の対応する一部分と比較したとき、野生型コドン（複数可）の代わりに１つ以上の代替コドンを含み得る。第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列がコドン最適化された一部分を含む場合、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも高いレベルで発現され得る。第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列のコドン最適化された一部分は、ヒト肝細胞における発現についてコドン最適化され得る。すなわち第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、該配列がヒト肝細胞において発現されるとき、同等のコドン最適化されていない（例えば野生型）第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドよりも高いレベルで発現され得る。「同等の」コドン最適化されていない第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするために使用されるコドンが配列番号２などの野生型第ＶＩＩＩ因子配列の対応するコドンに対応するであろうことを除いて、同一である（すなわち、同じ第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードし、同じ転写調節エレメントを含む等）。典型的には、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列のコドン最適化された一部分は、終止コドンを含まない。

【0141】

本発明の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、野生型コドン（複数可）の代わりに１つ以上の代替コドンを含み得、ここで、「代替」コドンは、野生型コドンと異なる配列を有するが、野生型コドンと同じアミノ酸をコードするコドン（すなわち縮重コドン）である。表３は、各アミノ酸をコードするコドンを説明する。

【0142】

コドン最適化されたヌクレオチド配列は、コドン最適化されていない対応するヌクレオチド配列よりも少なくとも１つ多くの「好ましい」コドンを含み得る。コドン最適化されたヌクレオチド配列は、コドン最適化されていない対応するヌクレオチド配列よりも高いパーセンテージの「好ましい」コドンを含み得る。コドン最適化されたヌクレオチド配列は、コドン最適化されていない対応するヌクレオチド配列よりも少なくとも１つ少ない「好ましくはない」コドンを含み得る。コドン最適化されたヌクレオチド配列は、コドン最適化されていない対応するヌクレオチド配列よりも低いパーセンテージの「好ましくはない」コドンを含み得る。ヒト肝細胞における第ＶＩＩＩ因子の発現についての好ましいコドンは、表３において下線を引いている。

【0143】

任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号４の少なくとも４０４７、少なくとも４０７１、少なくとも４１０４、少なくとも４１２８、少なくとも４１３１、少なくとも４１５５、少なくとも４１５８、少なくとも４１７３、少なくとも４１８２、少なくとも４２５４または少なくとも４２６３個のヌクレオチド（任意に、少なくとも４０４７、少なくとも４０７１、少なくとも４１０４、少なくとも４１２８、少なくとも４１３１、少なくとも４１５５、少なくとも４１５８、少なくとも４１７３、少なくとも４１８２、少なくとも４２５４若しくは少なくとも４２６３個の連続するヌクレオチド、または配列番号４の５つまで、４つまで、３つまで若しくは２つまでの領域からの少なくとも４０４７、少なくとも４０７１、少なくとも４１０４、少なくとも４１２８、少なくとも４１３１、少なくとも４１５５、少なくとも４１５８、少なくとも４１７３、少なくとも４１８２、少なくとも４２５４若しくは少なくとも４２６３個のヌクレオチド）を含むヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１つのヌクレオチドによって配列番号４の少なくとも４０４７、少なくとも４０７１、少なくとも４１０４、少なくとも４１２８、少なくとも４１３１、少なくとも４１５５、少なくとも４１５８、少なくとも４１７３、少なくとも４１８２、少なくとも４２５４または少なくとも４２６３個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、１つ以上の置換変異をコードする代替コドンによってのみ配列番号４の少なくとも４０４７、少なくとも４０７１、少なくとも４１０４、少なくとも４１２８、少なくとも４１３１、少なくとも４１５５、少なくとも４１５８、少なくとも４１７３、少なくとも４１８２、少なくとも４２５４または少なくとも４２６３個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含み得る。

【0144】

任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号６において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、４３以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１つのヌクレオチドによって配列番号６において記載されるヌクレオチドと異なるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、１つ以上の置換変異をコードする代替コドンによってのみ配列番号６において記載されるヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を含み得る。

【0145】

任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２９において記載されるヌクレオチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２９において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列からなり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２９において記載されるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２９において記載されるヌクレオチド配列からなり得る。

【0146】

任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号３１において記載されるヌクレオチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号３１の少なくとも４０４７個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号３１において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列からなり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号３１において記載されるヌクレオチド配列を含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号３１において記載されるヌクレオチド配列からなり得る。

【0147】

ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ構築物
本発明は、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ構築物を提供し、ここで、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドは、本発明の任意のポリヌクレオチドであり得る。第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、本発明の任意の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列であり得る。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、本発明の任意の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであり得る。

【0148】

組換えＡＡＶ構築物は、長さが４９００未満、４８５０未満、４８００未満、または４７５０未満のヌクレオチドであり得る。組換えＡＡＶ構築物は、長さが４７００と４９００との間、４７００と４８５０との間、４７００と４８００との間、４７００と４７５０との間または約４７１３のヌクレオチドであり得る。組換えＡＡＶ構築物は、長さが約４８４５のヌクレオチドであり得る。

【0149】

組換えＡＡＶ構築物は、長さが４８５０と４９００との間、または約４８４５のヌクレオチドであり得、任意に、長さが４３１８未満のヌクレオチドの第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、長さが４３１８と４０４６との間、４３１８と４０７０との間、４２６４と４１２７との間、４２１０と４１５１との間または約４１８２のヌクレオチドであり得る。

【0150】

組換えＡＡＶ構築物は、長さが４７００と４８５０との間、４７００と４８００との間、４７００と４７５０との間または約４７１３のヌクレオチドであり得、任意に、長さが４３１８未満のヌクレオチドの第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、長さが４３１８と４０４６との間、４２６４と４０７０との間、４２６４と４１０３との間、４２５５と４１２７との間、４２４６と４１３０との間、４２３７と４１５４との間、４２２８と４１５７との間、４２１９と４１６６との間、４２１０と４１６９との間、４２０１と４１７２との間、４１９２と４１７５との間または約４１８２のヌクレオチドであり得る。任意に、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、長さが約４１８２のヌクレオチドであり得る。

【0151】

任意に、組換えＡＡＶ構築物は、長さが約４７１３のヌクレオチドであり得、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、長さが４２２８と４１５７との間、４２１９と４１６６との間、４２１０と４１６９との間、４２０１と４１７２との間、４１９２と４１７５との間または約４１３１、約４１３４、約４１５５、約４１５８、約４１６１、約４１６７、約４１７３若しくは約４１８２のヌクレオチドであり得る。任意に、組換えＡＡＶ構築物は、長さが約４７１３のヌクレオチドであり得、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、長さが４１３１、４１３４、４１５５、４１５８、４１６１、４１６７、４１７３または４１８２のヌクレオチドであり得る。任意に、組換えＡＡＶ構築物は、長さが４７１３のヌクレオチドであり得、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２７であり得る。

【0152】

いくつかの場合においては、組換えＡＡＶ構築物の文脈における上記の節における第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列の長さへの言及は、‘終止’コドンを含まない－終止コドンを含む第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、上記のヌクレオチド配列より３ヌクレオチド長いであろう。いくつかの実施態様においては、第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、終止コドンを含み得る。

【0153】

組換えＡＡＶ構築物は、転写調節エレメント（ＴＲＥ）および／またはポリＡ配列に作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含む。

【0154】

組換えＡＡＶ構築物はさらに、転写調節エレメント（ＴＲＥ）を含み得る。転写調節エレメントは、肝臓特異的プロモーターを含み得る。転写調節エレメントは、長さが２７０未満のヌクレオチドであり得る。ＴＲＥは任意に、配列番号１３において記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含むかまたはそれからなり得る。本発明者らは、驚くべきことに、既知のＨＬＰ２ ＴＲＥからの相当な数のヌクレオチドが、ＴＲＥの有効性に有意に影響を与えることなく欠失しまたは改変され得ることを決定した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、短い転写調節エレメントＦＲＥ ７２が、かなりより短い長さであるにもかかわらず、ＨＬＰ２ ＴＲＥと同等の有効性（すなわち比較により少なくとも５０％以上の活性）を有することを見出した。任意に、転写調節エレメントは、２００ヌクレオチドよりも短く、任意に１５０ヌクレオチドよりも短く、任意に１２５ヌクレオチドよりも短い。任意に、転写調節エレメントは、長さが少なくとも８５のヌクレオチド、任意に長さが少なくとも１００のヌクレオチド、任意に長さが少なくとも１１０のヌクレオチドである。任意に、転写調節エレメントは、配列番号１４において記載される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含むかまたはそれからなり得る。

【0155】

組換えＡＡＶ構築物はさらに、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。シグナルペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドであり得る。シグナルペプチドは、配列番号１５において記載される野生型ＦＶＩＩＩシグナルペプチドを含み得る。任意に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６または１７と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。任意に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６または１７を含む。

【0156】

任意に、シグナルペプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドではない。シグナルペプチドは、配列番号１８または２０の配列と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含み得る。シグナルペプチドは、配列番号１８と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含み得る。シグナルペプチドは、配列番号２０と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である配列を含み得る。シグナルペプチドは、配列番号１８を含み得る。シグナルペプチドは、配列番号２０を含み得る。

【0157】

好ましくは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、長さが５７未満のヌクレオチドである。より好ましくは、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、長さが約５４のヌクレオチドである。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、長さが約５４のヌクレオチドであり得、配列番号１８の配列をコードし得る。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、長さが約５４のヌクレオチドであり得、配列番号２０の配列をコードし得る。任意に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。配列番号１８において記載されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列を有する。配列番号２０において記載されるシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２１の配列を有する。任意に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９または２１と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。任意に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９または２１を含む。

【0158】

組換えＡＡＶ構築物はさらに、ポリＡヌクレオチド配列を含み得る。ポリＡヌクレオチド配列は、合成であり得る。ポリＡヌクレオチド配列は、長さが５０未満のヌクレオチドであり得る。ポリＡヌクレオチド配列は、長さが１６と５０との間のヌクレオチドであり得る。ポリＡヌクレオチド配列は、長さが約４９のヌクレオチドであり得る。ポリＡヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含み得る。

【0159】

組換えＡＡＶ構築物はさらに、１つまたは２つのＩＴＲを含み得る。そのまたは各（Ｔｈｅ ｏｒ ｅａｃｈ）ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。任意に、組換えＡＡＶ構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４および／またはＡＡＶ６に由来するＩＴＲ配列を含む。そのまたは各ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり得る。そのまたは各ＩＴＲのヌクレオチド配列は、長さが１５７未満、または１５４未満のヌクレオチドであり得る。そのまたは各ＩＴＲのヌクレオチド配列は、長さが約１４５のヌクレオチドであり得る。５’ＩＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含み得る。３’ＩＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列を含み得る。

【0160】

組換えＡＡＶ構築物は、一本鎖であり得る。組換えＡＡＶ構築物は、ＡＡＶゲノムであり得る。

【0161】

第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、配列番号２７の配列を含み得、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９を含み得る。組換えＡＡＶ構築物は、肝臓特異的プロモーターである転写調節エレメントを含み得、該肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み得る。組換えＡＡＶ構築物は、２つのＩＴＲおよびポリＡヌクレオチド配列を含み得、ここで、５’ＩＴＲのヌクレオチド配列は、配列番号２３であり、３’ＩＴＲの配列は、配列番号２４であり、ポリＡヌクレオチド配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。ＡＡＶ構築物は、配列番号２７の配列を有し得る。

【0162】

構築物を含むウイルス粒子
本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶ構築物を含むＡＡＶウイルス粒子を提供する。

【0163】

本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えゲノムを含むウイルス粒子を提供する。本発明の目的のために、用語「ウイルス粒子」は、ビリオンの全てまたは一部を指す。例えば、ウイルス粒子は、組換えゲノムを含み、さらにカプシドを含み得る。ウイルス粒子は、遺伝子治療ベクターであり得る。本明細書においては、用語「ウイルス粒子」および「ベクター」は、交換可能に使用される。本出願の目的のために、「遺伝子治療」ベクターは、遺伝子治療において使用し得るウイルス粒子、すなわち、投与後の宿主細胞中で、第ＩＸ因子ヌクレオチド配列などの導入遺伝子を発現するために必要とされる全ての機能的要素を含むウイルス粒子である。

【0164】

適切なウイルス粒子は、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスまたは単純ヘルペスウイルスを含む。パルボウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。ウイルス粒子は好ましくは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。より好ましくは、ウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子である。用語ＡＡＶおよびｒＡＡＶは、本明細書においては交換可能に使用される。

【0165】

全ての既知のＡＡＶ血清型のゲノム構成は、非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００未満のヌクレオチドである線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造（ＶＰ）タンパク質の固有のコーディングヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、－２および－３）は、カプシドを形成する。末端１４５ｎｔは、自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖が形成され得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製についての起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体についてのプライマーとして役立つ。哺乳類細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続き、Ｒｅｐ遺伝子（すなわちＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードする）は、それぞれＰ５プロモーターおよびＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製において機能を有する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシングイベントは、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳類細胞におけるＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクターの産生について十分であることが示されてきた。また、昆虫細胞においては、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質は、ＡＡＶベクターの産生に十分である。

【0166】

ＡＡＶベクターの産生のために本発明において使用し得るＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、同一の遺伝的機能のセットを提供し、本質的に物理的におよび機能的に同等であるビリオンを産生し、実際的に同一のメカニズムによって複製し組み立てる。さまざまなＡＡＶ血清型のゲノム配列およびゲノム類似性の概要については、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，１９９９；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，１９９８；およびＷｕ ｅｔ ａｌ，２０００を参照されたい。本発明においては、ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２を使用し得る。ＡＡＶ血清型からの配列は、遺伝子治療ベクターの産生において使用されているとき、変異させまたは改変し得る。

【0167】

任意に、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４および／またはＡＡＶ６に由来するＩＴＲ配列を含む。好ましくはＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。本明細書においては、用語ＡＡＶｘ／ｙは、ＡＡＶｘからのいくつかの成分（ここで、ｘは、ＡＡＶ血清型番号である）およびＡＡＶｙからのいくつかの成分（ここで、ｙは、同じまたは異なる血清型の番号である）を含むウイルス粒子を指す。例えば、ＡＡＶ２／８ベクターは、ＡＡＶ２株からの、ＩＴＲを含むウイルスゲノムの一部分、およびＡＡＶ８株に由来するカプシドを含み得る。

【0168】

ある実施態様においては、ウイルス粒子は、カプシドを含むＡＡＶウイルス粒子である。ＡＡＶカプシドは、一般的に３つのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から形成される。ＶＰ１のアミノ酸配列は、ＶＰ２の配列を含む。ＶＰ２の一部を形成しないＶＰ１の一部分は、ＶＰ１ ｕｎｉｑｕｅまたはＶＰ１Ｕとして呼ばれる。ＶＰ２のアミノ酸配列は、ＶＰ３の配列を含む。ＶＰ３の一部を形成しないＶＰ２の一部分は、ＶＰ２ ｕｎｉｑｕｅまたはＶＰ２Ｕとして呼ばれる。ウイルス粒子は、カプシドを含み得る。カプシドは、
（ｉ）配列番号２５と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％または１００％同一である配列を含むカプシド；
（ｉｉ）配列番号２６と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または１００％同一である配列を含むカプシド；
（ｉｉｉ）肝臓向性カプシド；および
（ｉｖ）ＡＡＶ５カプシド
からなる群から選択し得る。
カプシドは、
（ｉ）配列番号４７と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％または１００％同一である配列を含むカプシド；
（ｉｉ）配列番号４８と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％または１００％同一である配列を含むカプシド；および
（ｉｉｉ）ＡＡＶ６カプシド
からなる群から選択し得る。

【0169】

本発明のウイルス粒子は、ウイルスＩＴＲおよびウイルスカプシドが、異なるＡＡＶ血清型などの、異なるパルボウイルスに由来する、「ハイブリッド」粒子であり得る。好ましくは、ウイルスＩＴＲおよびカプシドは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し、その場合において、そのようなウイルス粒子は、カプシド転換されたものまたは疑似型のものとして知られている。同様に、パルボウイルスは、「キメラ」カプシド（例えば、異なるパルボウイルス、好ましくは異なるＡＡＶ血清型からの配列を含有する）または「標的を定めた」カプシド（例えば、標的指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒｏｐｉｓｍ））を有し得る。

【0170】

組成、方法および使用
本発明のさらなる態様においては、本発明のポリヌクレオチドまたは構築物／ウイルス粒子および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。

【0171】

薬学的に許容される賦形剤は、担体、希釈剤および／または他の医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｇｅｎｔｓ）、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ）若しくはアジュバント等を含み得る。任意に、薬学的に許容される賦形剤は、生理食塩水を含む。任意に、薬学的に許容される賦形剤は、ヒト血清アルブミンを含む。

【0172】

本発明はさらに、治療方法における使用のための、本発明のポリヌクレオチド、構築物／ウイルス粒子または組成物を提供する。任意に、治療方法は、有効量の、本発明のポリヌクレオチドまたは構築物／ウイルス粒子を、患者に投与することを含む。

【0173】

本発明はさらに、治療方法における使用のための薬剤の製造における、本発明のポリヌクレオチド、構築物／ウイルス粒子または組成物の使用を提供する。任意に治療方法は、有効量の、本発明のポリヌクレオチドまたは構築物／ウイルス粒子を、患者に投与することを含む。

【0174】

任意に治療方法は、遺伝子治療である。「遺伝子治療」は、それが投与される宿主中で導入遺伝子（第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列などの）を発現することができる、本発明の構築物／ウイルス粒子を投与することを含む。

【0175】

任意に、治療方法は、血友病（例えば血友病ＡまたはＢ）またはフォン・ヴィレブランド病などの凝血障害を治療する方法である。好ましくは、凝血障害は、増加する出血および／または低下する凝固によって特徴付けられる。任意に、治療方法は、血友病、例えば血友病Ａを治療する方法である。いくつかの実施態様においては、患者は、血友病Ａに罹患している患者である。任意に患者は、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体または阻害剤を有する。任意に、ポリヌクレオチドおよび／または構築物／ウイルス粒子は、静脈内投与する。任意に、ポリヌクレオチドおよび／または構築物／ウイルス粒子は、患者への１回のみの投与（すなわち単回投与）用である。

【0176】

任意に、本発明の方法はさらに、遺伝子治療ベクターの投与によって、患者が部分的にまたは完全に治療されたかどうかを決定する（例えば、患者が血友病Ａの症状について部分的にまたは完全に治療されたことを決定する）工程を含み得る。血友病Ａを部分的にまたは完全に治療することは、血友病Ａに罹患している患者の凝固を改善すること、および制御不能な出血イベントのリスクを低下させることを指し得る。血友病Ａを部分的にまたは完全に治療することは、例えば関節における制御不能な出血イベント若しくは内出血の数および／または頻度を低下させることを指し得る。部分的にまたは完全に治療されている患者は、１年あたりでより少ない制御不能な出血イベントに罹患し得る。血友病Ａが上記の方法で「治療され」るとき、これは、血友病の１つ以上の症状が改善されることを意味する。それは、血友病の症状が、患者においてもはや存在しないように完全に治療されることは意味しないが、一部の方法では、そうなる場合があり得る。治療方法は、治療前よりも重症度が低い、血友病Ａの症状の１つ以上をもたらし得る。血友病Ａを部分的にまたは完全に治療することは、患者の血漿中に存在するＦＶＩＩＩの量または活性を増加させることを指し得る。任意に、投与前の状況と比較して、治療方法は、患者の血液中の循環する第ＶＩＩＩ因子の量／濃度、および／または所与の量の患者の血液内の検出可能な第ＶＩＩＩ因子活性の全体的なレベル、および／または患者の血液中の第ＶＩＩＩ因子の比活性（第ＶＩＩＩ因子タンパク質の量あたりの活性）における増加をもたらす。血友病を部分的に治療することは、重度の（＜１％の正常な血液凝固因子活性）または中程度に重篤の血友病（＜２％の正常な血液凝固因子活性）の患者を軽度の血友病（５～４０％の正常な血液凝固因子活性）の患者に転換することを指し得る。血友病を完全に治療することは、重度の、中程度に重篤のまたは軽度の血友病の患者の血液凝固因子活性を正常範囲内（５０％～１５０％の正常な血液凝固因子活性）に増加させることを指し得る。

【0177】

部分的にまたは完全に治療されている患者は、より低い用量の第ＶＩＩＩ因子が投与されることを必要とし得る。任意に、部分的にまたは完全に治療されている患者は、ＦＶＩＩＩの進行中の投与を必要としない可能性がある。任意に、該方法はさらに、血友病について部分的にまたは完全に治療された患者がもはや進行中の治療を必要としないか、または第ＶＩＩＩ因子での進行中の治療の低下したレベルを必要とするかどうかを評価し、例えば投与されるべき第ＶＩＩＩ因子の用量または用量頻度を低下させるように、または第ＶＩＩＩ因子の投与を停止するように、患者の治療計画を適切に調整する工程を含み得る。

【0178】

「治療有効量」は、投与量でおよび必要な期間の間に（血友病Ａの症状を改善するのに十分なレベルでの機能的第ＶＩＩＩ因子産生につながるように）対象における機能的第ＶＩＩＩ因子のレベルを上げるなどの所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。

【0179】

任意に、構築物／ウイルス粒子は、患者の体重１ｋｇあたり１×１０^１１未満、１×１０^１２未満、５×１０^１２未満、２×１０^１２未満、１．５×１０^１２未満、３×１０^１２未満、１×１０^１３未満、２×１０^１３未満、または３×１０^１３未満の構築物ゲノムの用量で投与する。任意に、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子または組成物は、患者の体重１ｋｇあたり少なくとも４．５×１０^１１の、または４．５×１０^１１と１×１０^１２との間の構築物ゲノムの用量（ｖｇ／ｋｇ）で投与する。任意に、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子または組成物は、５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ未満の用量で投与する。任意に、ポリヌクレオチド、ウイルス粒子または組成物は、４．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇと５×１０^１１ｖｇ／ｋｇの間、または４．５×１０^１１ｖｇ／ｋｇと４．９×１０^１１ｖｇ／ｋｇとの間の用量で投与する。任意に、投与されるポリヌクレオチドまたはウイルス粒子は、哺乳類細胞から産生され、および／または哺乳類ウイルス構築物産生細胞の使用から生じ、昆虫ウイルス構築物産生細胞（例えばバキュロウイルス系）において産生される構築物とは区別する特徴を有する。

【0180】

任意に、－構築物ゲノムの数の観点で定量化された－構築物／ウイルス粒子の所与の用量の投与は、構築物ゲノムの力価測定をするためのｑＰＣＲを使用して達成される。

【0181】

ｑＰＣＲを実施する方法は、当業者に知られている。リアルタイムＰＣＲサイクラーおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのＤＮＡ結合色素を使用して、発生期の二本鎖アンプリコンの増幅を、リアルタイムで検出することができる。既知の量のｑＰＣＲテンプレート遺伝物質（例えばプロモーター領域）を、次いで段階的に希釈して検量線を作成し、サンプル構築物のゲノム力価を、検量線から補間する。

【実施例】

【0182】

実施例１－一般的な材料および方法
ＦＶＩＩＩ構築物
ＦＶＩＩＩ－ＳＱポリペプチドは、配列番号１）のアミノ酸１～７４３および１６３８～２３３２に対応するアミノ酸を含む（Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３２，１９－２７）（配列番号３）。

【0183】

内部で切断されたヒトＦＶＩＩＩポリペプチド（ＦＶＩＩＩ－９６～１０６）は、配列番号１）のアミノ酸７３２～１６６９に対応するアミノ酸の欠失を含み、配列番号１のアミノ酸１～７３１および１６７０～２３３２に対応するアミノ酸を含む（配列番号７）。

【0184】

ＡＡＶベクターの生成
ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ機能；アデノウイルスヘルパー機能；並びにＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩ発現カセットを含有する組換えゲノムをコードするプラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトリプルプラスミドトランスフェクションによって製造した。細胞ペレットおよび上清を、トランスフェクションの７２時間後に取り出し、ＡＡＶ粒子を、ＰＯＲＯＳ Ｃａｐｔｕｒｅ ＳｅｌｅｃｔおよびＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＡＡＶを、次いでＰＢＳ中で一晩透析し、４℃で保存し、ｑＰＣＲによって力価測定した。

【0185】

ＦＶＩＩＩ発色活性アッセイ
Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩＩ：Ｃ発色アッセイ（Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ，参照２２１４０６）は、ＦＶＩＩＩの補因子活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）を測定する。

【0186】

トロンビン活性化を通して、ＦＶＩＩＩ：Ｃポリペプチドは、ヒト第ＩＸａ因子、リン脂質およびカルシウムと複合体を形成する。これらの条件下で、特定の濃度でおよび過剰にこのアッセイにおいて提供される第Ｘ因子は、第Ｘａ因子に転換される（活性化される）。産生するこの第Ｘａ因子は、制限要因であるＦＶＩＩＩ：Ｃに正比例する。第Ｘａ因子は、発色基質であるＳｘａ－１１によって直接測定する。第Ｘａ因子は、発色基質を切断し、ｐＮＡを放出する。ｐＮＡの産生は、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性に直接関連する、第Ｘａ因子活性に比例する。放出されるｐＮＡのレベルは、４０５ｎｍでの発色を測定することによって決定することができ、これは、サンプル中のＦＶＩＩＩ：Ｃの活性に比例する、サンプル中の第ＶＩＩＩ：Ｃ因子によって生成される第Ｘａ因子ポリペプチドの量に関連する。

【0187】

アッセイは、製造元の指示に従って実施する。簡単には、３７℃でプレインキュベートしたマイクロプレートウェルに、５０μｌのキャリブレーター血漿、希釈した（試薬Ｒ４中）試験血漿若しくは細胞上清／ライセートまたは対照を加え、その後、試薬Ｒ１およびＲ２のそれぞれ５０μｌを加え、これを、６ｍＬの蒸留水で再構成し、３７℃に予熱する。混合後、これらの成分は、１５０μｌの反応物を形成し、これを、３７℃で５分間インキュベートする。引き続き、反応物に、試薬Ｒ３を補充し、これを、それ自体６ｍＬの蒸留水中に再懸濁し、３７℃に予熱し、２００μＬの混合物を、３７℃でさらなる５分間インキュベートする。反応を、５０μｌの２０％酢酸またはクエン酸（２０ｇ／ｌ）を加えることによって停止し、得られた２５０μｌの混合物の４０５ｎｍでの吸光度を測定する。

【0188】

試薬：
Ｒ１－フィブリン重合阻害剤の存在下で凍結乾燥した、ヒト第Ｘ因子。
Ｒ２－活性化試薬－ヒトトロンビン、カルシウムおよび合成リン脂質を含有する、凍結乾燥した、一定の最適化された濃度の、第ＩＸａ因子（ヒト）。
Ｒ３－ＳＸａ－１１－トロンビン阻害剤を有する、第Ｘａ因子に特異的な、凍結乾燥した、発色基質。
Ｒ４－Ｔｒｉｓ－ＢＳＡ緩衝液。１％ ＢＳＡ、ＰＥＧ、ＦＶＩＩＩ：Ｃ安定剤およびアジ化ナトリウム（０．９ｇ／Ｌ）を含有する。

【0189】

発色活性アッセイからの読み取り値に関連して、「％ＦＶＩＩＩ活性」（「％ＦＶＩＩＩ：Ｃ」とも呼ばれる）は、「％正常」であり、これは、例えばＨｕＨ－７細胞においてＦＶＩＩＩ発現カセットを発現させる文脈においては、１００％ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト血漿サンプルと比較して、ＨｕＨ－７細胞におけるＦＶＩＩＩ発現カセットの発現に続いて上清において検出されるＦＶＩＩＩ活性が、前記１００％ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト血漿サンプルにおいて検出されるＦＶＩＩＩ活性の特定の％であることを意味する。

【0190】

ＦＶＩＩＩサンドイッチＥＬＩＳＡ抗原アッセイ
Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩＩ：Ａｇキット（Ｓｔａｇｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，参照００２８０）は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による血漿中のＦＶＩＩＩの定量のための抗原アッセイである。アッセイするサンプル中のＦＶＩＩＩは、プラスチックマイクロプレートウェルの壁をプレコーティングする、マウスモノクローナル抗ヒトＶＩＩＩ：Ａｇ抗体によって捕捉される。非特異的結合を低下させるための十分なインキュベーションおよび洗浄に続き、ペルオキシダーゼに結合したマウス抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体は、捕捉されたＦＶＩＩＩの残りの遊離抗原決定基に結合する。結合したペルオキシダーゼは、次いでＴＭＢ基質によって明らかにされる。ＴＭＢによって誘導される発色は、強酸の添加によって停止する。発色の強さは、分析するサンプル中のＦＶＩＩＩ濃度に正比例し、４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定する。

【0191】

このアッセイからの読み取り値は、「％正常」として表し得、これは、例えばマウスにおいてＦＶＩＩＩ構築物を発現させる文脈においては、１００％ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト血漿サンプルと比較して、マウス血漿サンプルにおいて検出されるＦＶＩＩＩ分子（厳密には、エピトープ）の数が、前記１００％ＦＶＩＩＩ活性を有するヒト血漿サンプルにおいて検出されるＦＶＩＩＩ分子／エピトープの数の特定の％であることを意味する。

【0192】

上記の活性および抗原アッセイの両方において、ＦＶＩＩＩ（活性または抗原レベル）は、製造業者が推奨したかまたは含めた、既知の、ＷＨＯ国際規格（ＮＩＢＳＣコード０７／３１６）に対して較正されたＦＶＩＩＩ活性または抗原の凍結乾燥ヒト血漿サンプルを（必要に応じて）使用して、マウスサンプルまたはヒトの細胞上清サンプル中で定量化する。

【0193】

実施例２－ＦＶＩＩＩ置換変異変異体の相対比活性のインビトロ評価
インシリコモデリングを使用して、ＦＶＩＩＩの安定性を増加させ得るであろう、表面に露出していないドメイン間表面上での単一アミノ酸置換およびシステイン置換の対を予測した。しかしながら、任意の安定性への影響が必ずしも活性への有益な効果と等しいというわけではなく、いくつかの場合においては、増加した安定性は、有害作用を有するであろう（例えば、安定性を増加させるが、必要なＦＶＩＩＩドメインの活性型への再配列を可能にしない置換）。以下に説明するように、多数のそのような置換変異体を、インビトロで試験した。

【0194】

１つ以上のそのような置換を含むＦＶＩＩＩ－ＳＱ変異体をコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を、遺伝子合成し、市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ５－ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した。プラスミドＤＮＡを、９６Ｄｅｅｐｗｅｌｌプレート中のｅｘｐｉ２９３浮遊細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造元のプロトコルに従ってトランスフェクトし、加湿した８％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で、４００ｒｐｍで振とうしながら５日間インキュベートした。細胞培養物を１０００×ｇで５分間４℃で遠心分離し、上清を０．２μｌフィルターを通してろ過して、実施例１において記載する発色アッセイおよび抗原定量における即時試験を行った。

【0195】

ブランクサブトラクションに続き、発色アッセイからのＦＶＩＩＩ活性の読み取り値を、ＦＶＩＩＩ抗原定量化（ＥＬＩＳＡ）の読み取り値で割って、比活性（ＳＡ）値を得た。

【0196】

図２Ａは、各変異体についての多くの他に採り得る置換残基を含む、いくつかの異なる単一アミノ酸置換変異体について、いかなる置換変異をも欠くＦＶＩＩＩ－ＳＱ（‘９５’）対照と比較した、ＳＡにおける倍率変化を示す。以下の表は、番号付けした構築物のそれぞれに対応する置換の正体を示す。変異体６５（Ｈ６９３Ｗ）は、９５と比較してＳＡにおける上昇を示す。

【0197】

【表5】

【0198】

別の実験においては、置換Ｍ６６２Ｗ（‘２６’と呼ばれる）は、‘９５’と比較してＳＡにおける著しい増加を示した。位置Ｍ６６２については、全ての他に採り得る置換のＳＡをスクリーニングすることを決定した。結果を、図２Ｂに示し、これはまた、Ｍ６６２ＷをＨ６９３Ｗと組み合わせる二重置換を含む（図２Ａからの６５）。置換の正体については、再び以下の表を参照されたい。位置Ｍ６６２でのＣおよびＥでの置換は、９５と比較してＳＡにおけるいくらかの上昇を与えるように見える。ＳＡにおける最大の増加は、Ｍ６６２Ｗ＋Ｈ６９３Ｗの組合せについて観察された。

【0199】

【表6】

【0200】

実施例３－ジスルフィド架橋を形成すると予測される追加のＦＶＩＩＩ置換変異変異体の相対比活性のインビトロ評価
実施例２におけるインシリコ予測作業に基づいて、システイン置換の多くの対を、実施例２において記載する方法論を使用して試験した。

【0201】

結果－再びＦＶＩＩＩ－ＳＱ（‘９５’）（配列番号３）と比較した比活性における倍率変化として表す－を、図３に示す。以下の表は、図３に示す構築物番号に対応する置換対を示す。Ｃ－Ｃ置換変異体のいくつかは、対照と比較して比活性における数倍の増加を示す。

【0202】

【表7】

【0203】

実施例４－特定の有望な置換変異体の確認用インビトロ試験
図４は、実施例２および３の試験した置換変異体のサブセットについて、ＦＶＩＩＩ－ＳＱ（‘９５’）対照と比較したＳＡにおける倍数増加を確認する。置換は、２つのＦＶＩＩＩ‘バックグラウンド’において評価し、第１のバックグラウンドは、上記の実施例におけるようにＦＶＩＩＩ－ＳＱである。
・ＦＶＩＩＩ－ＳＱ－Ｍ６６２Ｗ（‘２６’）
・ＦＶＩＩＩ－ＳＱ－Ｈ６９３Ｗ（‘６５’）
・ＦＶＩＩＩ－ＳＱ－Ｍ６６２Ｗ－Ｈ６９３Ｗ（‘２６－６５’）
・ＦＶＩＩＩ－ＳＱ－Ｌ６８７Ｃ－Ａ１８００Ｃ（‘１２ＳＳ’）

【0204】

第２のＦＶＩＩＩバックグラウンドは、Ｂドメインを包含し、その両側上に広がる、より広範な内部欠失を含有する点においてＦＶＩＩＩ－ＳＱと異なる。欠失した領域はアミノ酸位置７３２～１６６９に対応し、変異体タンパク質は、ＦＶＩＩＩ－（９６～１０６）として呼ばれる。
・ＦＶＩＩＩ－（９６－１０６）－Ｍ６６２Ｗ（‘２６－９６－１０６’）
・ＦＶＩＩＩ－（９６－１０６）－Ｈ６９３Ｗ（‘６５－９６－１０６’）
・ＦＶＩＩＩ－（９６－１０６）－Ｍ６６２Ｗ－Ｈ６９３Ｗ（‘２６－６５－９６－１０６’）
・ＦＶＩＩＩ－（９６－１０６）－Ｌ６８７Ｃ－Ａ１８００Ｃ（‘１２ＳＳ－９６－１０６’）

【0205】

図４が示すように、試験した構築物の上記のサブセットのそれぞれは、ＦＶＩＩＩ－ＳＱ対照（９５）と比較して比活性における約２倍以上の増加を示した。

【0206】

実施例５－安定化置換変異を含有する内部欠失したＦＶＩＩＩ導入遺伝子構築物のインビボ評価
この研究においては、ＡＡＶ８ベクターを、以下の構築物から作製した。
・ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９（２６－９６－１０６）－ＳｐＡ（配列番号２７）
・ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９－ＳＱ－ＳｐＡ（配列番号３２）

【0207】

上記の構築物は、ＦＲＥ７２プロモーター、シグナルペプチド５、および合成ポリＡを含有する。それらは、一方がＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードし、一方で、他方が「９６～－１０６」内部欠失、並びに置換変異「２６」（＝Ｍ６６２Ｗ）を有するより短い変異体をコードする点で異なる。
・コンパレーターＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱ

【0208】

上記の構築物は、天然のＦＶＩＩＩシグナルペプチド、ＳｐＡ、および肝臓特異的プロモーターを有する、コドン最適化されたＦＶＩＩＩ－ＳＱをコードする配列を含む。構築物は、配列番号３４の配列を有する。

【0209】

ＡＡＶ８－コンパレーターＦＶＩＩＩｃｏ－ＳＱは、別個の実験においてＡＡＶ８－ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９（２６－９６－１０６）－ＳｐＡおよびＡＡＶ８－ＦＲＥ７２－ＳＰ５－ＦＶＩＩＩＣｏ１９－ＳＱ－ＳｐＡとそれぞれ比較した。

【0210】

６～８週齢のＣ７ＢＬ／６第ＶＩＩＩ因子ノックアウト（ＦＶＩＩＩ－ＫＯ）マウスに、上記のベクターのそれぞれの１つの２×１０^１２ｖｇ／ｋｇを静脈内注射した。この研究についての全てのＡＡＶ８ベクターは、同時にｑＰＣＲ法によって力価測定した。

【0211】

注射後６週時に、クエン酸塩（１：１０希釈）上のヘパリン処理されていない青い毛細管を用いた眼窩後方穿刺により、各マウスから１００μｌと２００μｌとの間の血液を収集した。血漿は、４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心分離によって調製した。

【0212】

注射したおよびナイーブな動物からの血漿を、ＦＶＩＩＩ活性およびヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルについて分析し（実施例１において記載するアッセイ）、ＦＶＩＩＩ活性の抗原レベルに対する比（すなわち比活性）を計算した（図５）。

【0213】

本発明の番号付けした態様
１．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｉ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い比活性を有する、
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0214】

２．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｉ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも高い安定性を有する、
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0215】

３．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．Ａ１／Ａ３ドメインインターフェイス；
ｂ．Ａ２／Ａ３ドメインインターフェイス；または
ｃ．Ａ１／Ｃ２ドメインインターフェイス
からなる群から選択されるドメイン間インターフェイスに１つ以上の置換変異を含み、
（ｉ）該１つ以上の置換変異は、アミノ酸のより疎水性のアミノ酸での置換を含むか；または
（ｉｉ）該１つ以上の置換変異は、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、
該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現される、
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0216】

４．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドであって、該第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列は、
ａ．配列番号１のＭ６６２若しくはＨ６９３に対応するアミノ酸の置換；または
ｂ．第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含む一対のアミノ酸のシステイン残基での置換であって、
１．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＭ１４７、Ｓ１４９若しくはＳ２８９に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＥ１９６９、Ｅ１９７０若しくはＮ１９７７に対応するか；
２．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＴ６６７、Ｔ６６９、Ｎ６８４、Ｌ６８７、Ｉ６８９、Ｓ６９５若しくはＦ６９７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＳ１７９１、Ｇ１７９９、Ａ１８００、Ｒ１８０３、Ｅ１８４４、Ｓ１９４９、Ｇ１９８１、Ｖ１９８２、若しくはＹ１９７９に対応するか；または
３．該第１のアミノ酸は、配列番号１のＡ１０８、Ｔ１１８若しくはＶ１３７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＮ２１７２、Ｑ２３２９若しくはＹ２３３２に対応する、
置換
からなる群から選択される１つ以上の置換変異を含む、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0217】

５．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより高い比活性を有する、態様２から４のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0218】

６．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの比活性よりも少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、または少なくとも５．５倍高い比活性を有する、態様１または５の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0219】

７．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより高い安定性を有する、態様１または３から５のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0220】

８．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより長い半減期を有し、任意にここで、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、活性化されたときに、該参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較してより長い半減期を有する、態様２または７の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0221】

９．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．２、少なくとも２．５、少なくとも２．８若しくは少なくとも３倍の半減期であるより長い半減期を有する、および／または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、活性化されたときに、活性化されたときの参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも２．２、少なくとも２．５、少なくとも２．８若しくは少なくとも３倍の半減期である半減期を有する、態様８の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0222】

１０．より長い半減期が、血漿中のより長い半減期である、態様８または９の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0223】

１１．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも宿主細胞中でより高いレベルで発現される、態様１、２または４から６の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0224】

１２．発現される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルが、宿主細胞によって分泌されるＦＶＩＩＩポリペプチドのレベルである、態様１１の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0225】

１３．宿主細胞がヒト肝細胞である、態様１１または１２の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0226】

１４．ヒト肝細胞がＨｕｈ７細胞である、態様１３の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0227】

１５．発現される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルが、インビボ発現である、態様１１の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0228】

１６．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含むが、１つ以上の置換変異を含まない、参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドよりも、より高い比活性および／若しくはより高い安定性を有し並びに／または宿主細胞中でより高いレベルで発現される、態様１から１５のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0229】

１７．参照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、配列番号１、３または５の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、態様１６の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0230】

１８．ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の置換変異が、活性化されたときに、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのそれぞれのドメインの相互作用を安定化する、態様１から１７のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0231】

１９．１つ以上の酸置換変異の少なくとも１つが、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間のパイスタッキング相互作用を増加させる、態様１８の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0232】

２０．１つ以上の置換変異の少なくとも１つが、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間の疎水性パッキングを増加させる、態様１８または１９の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0233】

２１．１つ以上の置換変異の少なくとも１つが、それぞれのドメインのアミノ酸側鎖間の立体衝突および／または好ましくない静電相互作用を低下させる、態様１８から２０のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0234】

２２．１つ以上の置換変異が、ドメイン間インターフェイスでの１つ以上の表面にアクセスできないアミノ酸の置換を含む、態様１から３または５から２１のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0235】

２３．より疎水性のアミノ酸で置換されたアミノ酸が、メチオニンまたはヒスチジンである、態様１から３または５から２２のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0236】

２４．より疎水性のアミノ酸で置換されたアミノ酸が、配列番号１の位置６６２のアミノ酸に対応するメチオニンまたは配列番号１の位置６９３のアミノ酸に対応するヒスチジンである、態様１から３または５から２３のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0237】

２５．１つ以上の置換変異がＭ６６２Ｃ置換を含まない、態様１から２４のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0238】

２６．
ａ．１つ以上の置換変異が、メチオニンのチロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン若しくはトリプトファンでの置換を含む；および／または
ｂ．１つ以上の置換変異が、ヒスチジンのグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、システイン、バリン、メチオニン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン若しくはトリプトファンでの置換を含む、
態様１から２５のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0239】

２７．１つ以上の置換変異がアミノ酸の芳香族アミノ酸での置換を含む、態様１から２６のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0240】

２８．１つ以上の置換変異がＭ６６２Ｗ置換を含む、態様１から２７のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0241】

２９．１つ以上の置換変異がＨ６９３Ｗ置換を含む、態様１から２８のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0242】

３０．１つ以上の置換変異がＭ６６２ＷおよびＨ６９３Ｗ置換を含む、態様１から２９のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0243】

３１．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該システイン残基は、それぞれのドメイン間にジスルフィド結合を形成する、態様１から３０のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0244】

３２．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該一対のアミノ酸は、Ａ１およびＡ３ドメイン中にある、態様１から３１のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0245】

３３．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該一対のアミノ酸は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含み、ここで、該第１のアミノ酸は、配列番号１のＭ１４７、Ｓ１４９またはＳ２８９に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＥ１９６９、Ｅ１９７０またはＮ１９７７に対応する、態様１から３２のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0246】

３４．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該１つ以上の置換変異は、（ｉ）Ｓ２８９ＣおよびＮ１９７７Ｃ、（ｉｉ）Ｍ１４７ＣおよびＥ１９７０Ｃ、並びに（ｉｉｉ）Ｓ１４９ＣおよびＥ１９６９Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含む、態様１から３３のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0247】

３５．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該一対のアミノ酸は、Ａ２およびＡ３ドメイン中にある、態様１から３１のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0248】

３６．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該一対のアミノ酸は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含み、ここで、該第１のアミノ酸は、配列番号１のＴ６６７、Ｔ６６９、Ｎ６８４、Ｌ６８７、Ｉ６８９、Ｓ６９５またはＦ６９７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＳ１７９１、Ｇ１７９９、Ａ１８００、Ｒ１８０３、Ｅ１８４４、Ｓ１９４９、Ｇ１９８１、Ｖ１９８２、またはＹ１９７９に対応する、態様１から３１または３５のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0249】

３７．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該１つ以上の置換変異は、（ｉ）Ｔ６６９ＣおよびＶ１９８２Ｃ、（ｉｉ）Ｌ６８７ＣおよびＡ１８００Ｃ、（ｉｉｉ）Ｉ６８９ＣおよびＧ１７９９Ｃ、（ｉｖ）Ｆ６９７ＣおよびＳ１９４９Ｃ、（ｖ）Ｔ６６７ＣおよびＧ１９８１Ｃ、（ｖｉ）Ｔ６６９ＣおよびＹ１９７９Ｃ、（ｖｉｉ）Ｎ６８４ＣおよびＳ１７９１Ｃ、（ｖｉｉｉ）Ｌ６８７ＣおよびＲ１８０３Ｃ、並びに（ｉｘ）Ｓ６９５ＣおよびＥ１８４４Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含む、態様１から３１、３５または３６のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0250】

３８．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該一対のアミノ酸は、Ａ１およびＣ２ドメイン中にある、態様１から３１のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0251】

３９．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該一対のアミノ酸は、第１のアミノ酸および第２のアミノ酸を含み、ここで、該第１のアミノ酸は、配列番号１のＡ１０８、Ｔ１１８またはＶ１３７に対応し、該第２のアミノ酸は、配列番号１のＮ２１７２、Ｑ２３２９またはＹ２３３２に対応する、態様１から３１または３８のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0252】

４０．１つ以上の置換変異が、それぞれのドメイン中の一対のアミノ酸のシステイン残基での置換を含み、ここで、該１つ以上の置換変異は、（ｉ）Ａ１０８ＣおよびＱ２３２９Ｃ、（ｉｉ）Ｔ１１８ＣおよびＮ２１７２Ｃ、並びに（ｉｉｉ）Ｖ１３７ＣおよびＹ２３３２Ｃからなるリストから選択される一対の置換変異を含む、態様１から３１、３８または３９のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0253】

４１．１つ以上の置換変異が、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性化を阻害しない、態様１から４０のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0254】

４２．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号１、３若しくは５において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、または配列番号１、３若しくは５の少なくとも１３４９個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１から４１のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0255】

４３．第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドがベータドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、態様１から４２のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0256】

４４．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号１の位置１から７２２および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸を含む、態様１から４３のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0257】

４５．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号１の位置１から７３１および１６７０から２３３２に対応するアミノ酸を含む、態様４４の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0258】

４６．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号１において記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である、態様１から４３のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0259】

４７．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列が、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列、または配列番号２８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、態様１から４６のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。

【0260】

４８．第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、該第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列は、態様１から４７のいずれか１つに記載の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【0261】

４９．第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列がコドン最適化されている、態様４８のポリヌクレオチド。

【0262】

５０．第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列が、ヒト肝細胞における発現のためにコドン最適化されている、態様４８または４９のポリヌクレオチド。

【0263】

５１．第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝細胞においてより高いレベルで発現される、態様５０のポリヌクレオチド。

【0264】

５２．第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列によってコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが、参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列と比較して、ヒト肝細胞において、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍高く発現される、態様５０または５１のポリヌクレオチド。

【0265】

５３．参照野生型第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列が、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列である、態様５１または５２のポリヌクレオチド。

【0266】

５４．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列が、配列番号３１において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号３１の少なくとも４０４７個のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、態様４９から５３のいずれか１つのポリヌクレオチド。

【0267】

５５．第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をコードする第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列が、配列番号２９において記載されるヌクレオチド配列または配列番号２９において記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、態様４９から５４のいずれか１つのポリヌクレオチド。

【0268】

５６．態様４９から５５のいずれか１つに記載の第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶ構築物。

【0269】

５７．長さが４９００未満のヌクレオチドである、態様５６の組換えＡＡＶ構築物。

【0270】

５８．長さが４７００と４９００との間、４７００と４８５０との間、４７００と４８００との間、４７００と４７５０との間または約４７１３のヌクレオチドである、態様５７の組換えＡＡＶ構築物。

【0271】

５９．組換えＡＡＶ構築物が一本鎖である、態様５６～５８のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0272】

６０．第ＶＩＩＩ因子ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、転写調節エレメントおよび／またはポリＡ配列に作動可能に連結されている、態様５６から５９のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0273】

６１．転写調節エレメントが、配列番号１３または１４において記載される配列を有する、態様６０の組換えＡＡＶ構築物。

【0274】

６２．ポリＡ配列が配列番号２２において記載される配列を有する、態様６０または６１の組換えＡＡＶ構築物。

【0275】

６３．シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、態様５６から６２のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0276】

６４．シグナルペプチドが野生型第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドである、態様６３の組換えＡＡＶ構築物。

【0277】

６５．シグナルペプチドが配列番号１５を含む、またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号１６若しくは配列番号１７を含む、態様６４の組換えＡＡＶ構築物。

【0278】

６６．シグナルペプチドが野生型第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドではない、態様６３の組換えＡＡＶ構築物。

【0279】

６７．シグナルペプチドが配列番号１８若しくは２０を含む、またはシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が配列番号１９若しくは２１を含む、態様６６の組換えＡＡＶ構築物。

【0280】

６８．１つまたは２つのＩＴＲをさらに含む、態様５６から６７のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0281】

６９．そのまたは各ＩＴＲのヌクレオチド配列が、長さが１５７未満、１５４未満、または約１４５のヌクレオチドである、態様６８の組換えＡＡＶ構築物。

【0282】

７０．そのまたは各ＩＴＲが野生型ＩＴＲである、および／またはそのまたは各ＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである、態様６８または６９の組換えＡＡＶ構築物。

【0283】

７１．そのまたは各ＩＴＲのヌクレオチド配列が配列番号２３または２４のヌクレオチド配列を含む、態様６８から７０のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0284】

７２．ＡＡＶ構築物がＡＡＶゲノムである、態様５６から７１のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0285】

７３．ＡＡＶ構築物が、配列番号２７において記載される配列を含むかまたはそれからなる、態様５６から７２のいずれか１つの組換えＡＡＶ構築物。

【0286】

７４．態様５６から７３のいずれか１つに記載の組換えＡＡＶ構築物を含むＡＡＶウイルス粒子。

【0287】

７５．ウイルス粒子がカプシドを含む、態様７４のＡＡＶウイルス粒子。

【0288】

７６．カプシドが、
（ｉ）配列番号２５と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％または１００％同一である配列を含むカプシド；
（ｉｉ）配列番号２６と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、または１００％同一である配列を含むカプシド；
（ｉｉｉ）肝臓向性カプシド；および
（ｉｖ）ＡＡＶ５カプシド
からなる群から選択される、態様７５のＡＡＶウイルス粒子。

【0289】

７７．カプシドが、
（ｉ）配列番号４７と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％または１００％同一である配列を含むカプシド；および
（ｉｉ）配列番号４８と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％または１００％同一である配列を含むカプシド；および
（ｉｉｉ）ＡＡＶ６カプシド
からなる群から選択される、態様７５に記載のＡＡＶウイルス粒子。

【0290】

７７．態様１から７６のいずれか１つに記載の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、またはＡＡＶウイルス粒子、および薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。

【0291】

７８．治療方法における使用のための、態様１から７７のいずれか１つに記載のＦＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物。

【0292】

７９．態様７８に記載の使用のための第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物であって、該治療方法は、有効量の、態様１から７７のいずれか１つの第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物またはＡＡＶウイルス粒子を、患者に投与することを含む、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物。

【0293】

８０．有効量の、態様１から７７のいずれか１つに記載の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物またはＡＡＶウイルス粒子または組成物を、患者に投与することを含む、治療方法。

【0294】

８１．治療方法における使用のための薬剤の製造における、態様１から７７のいずれか１つに記載の第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物の使用。

【0295】

８２．治療方法が、有効量の、態様１から７７のいずれか１つに記載の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物ＡＡＶウイルス粒子または組成物を、患者に投与することを含む、態様８０の使用。

【0296】

８３．治療方法が血友病を治療する方法である、態様７８から８２のいずれか１つに記載の使用、方法または使用のための、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物ＡＡＶウイルス粒子または組成物。

【0297】

８４．治療方法が血友病Ａを治療する方法である、態様７８から８３のいずれか１つに記載の使用、方法または使用のための、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、組換えＡＡＶ構築物、ＡＡＶウイルス粒子または組成物。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図6-8】

【図6-9】

【図6-10】

【図6-11】

【図6-12】

【図6-13】

【図6-14】

【図6-15】

【図6-16】

【図6-17】

【図6-18】

【図6-19】

【図6-20】

【図6-21】

【図6-22】

【図6-23】

【図6-24】

【図6-25】

【配列表】

2023501263000001.app

【国際調査報告】