特表 2023-501387 ＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープ、及びＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-18

(54)【発明の名称】ＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープ、及びＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230111BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230111BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230111BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230111BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230111BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230111BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K14/705

C07K16/30

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K39/395 E

A61K39/395 T

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022526137

(86)(22)【出願日】2019-11-07

(85)【翻訳文提出日】2022-07-01

(86)【国際出願番号】 KR2019015080

(87)【国際公開番号】W WO2021090985

(87)【国際公開日】2021-05-14

(81)【指定国・地域】

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 開催日 ２０１８年１１月１３日 集会名 第１０回 アニュアル ピーイージーエス ヨーロッパ： プロテイン アンド アンティボディー エンジニアリング サミット 開催日 ２０１９年３月１８日 集会名 ケンブリッジ ヘルステック インスティテュート 第４回 アニュアル イミューノ‐オンコロジー サミット ヨーロッパ ２０１９ 開催日 ２０１９年４月１７日 集会名 バイオ コリア ２０１９ 開催日 ２０１９年９月３０日 集会名 イーエスエムオー ２０１９ コングレス 掲載日 ２０１９年１０月１日 掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｚ２５３．０２５ 掲載日 ２０１９年１１月６日 掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｊｉｔｃ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１０．１１８６／ｓ４０４２５－０１９－０７６３－１

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】506379781

【氏名又は名称】グリーン・クロス・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．

(71)【出願人】

【識別番号】504385351

【氏名又は名称】モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ

【氏名又は名称原語表記】ＭＯＧＡＭ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】オー， ミ‐ヨン

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジェ‐チョル

(72)【発明者】

【氏名】パク， ヘ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ヤム， へ イン

(72)【発明者】

【氏名】キム， ドン‐シク

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045BA10

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA20

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープ、及びＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片に関する。本発明のＣＥＡＣＡＭ１の立体エピトープは、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体への特異的結合のための重大な位置の全てのアミノ酸を含み、適切な三次元構造を維持するので、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体に対する高い親和性を示すことができる。更に、本発明に係る立体エピトープに特異的に結合する抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用及びＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ６相互作用を効果的に抑制することができる。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位に対応するアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープであって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、立体配座エピトープ。

【請求項2】

前記ＣＥＡＣＡＭ１が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の立体配座エピトープ。

【請求項3】

６３番目の前記アミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、６４番目の前記アミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、６６番目の前記アミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、６８番目の前記アミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）であり、７５番目の前記アミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７６番目の前記アミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）であり、７８番目の前記アミノ酸がグルタミン（Ｇｌｎ）であり、８３番目の前記アミノ酸がアラニン（Ａｌａ）であり、８６番目の前記アミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）であり、９０番目の前記アミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）であり、１２３番目の前記アミノ酸がグルタミン（Ｇｌｎ）であり、１２５番目の前記アミノ酸がイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、１２９番目の前記アミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）であり、１３１番目の前記アミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）である、請求項１に記載の立体配座エピトープ。

【請求項4】

ＣＥＡＣＡＭ１のアミノ酸位置６３、６４、６６、６８、７５、７６、７８、８３、８６、９０、１２３、１２５、１２９及び１３１のアミノ酸を含む、請求項１に記載の立体配座エピトープ。

【請求項5】

ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片であって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項6】

ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープに特異的に結合する、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片であって、前記立体配座エピトープが、６３、６４、６６、６８、７５、７６、７８、８３、８６、９０、１２３、１２５、１２９及び１３１位の前記アミノ酸を含む、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項7】

分子間距離が４．５Å以内でＣＥＡＣＡＭ１に結合する、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項8】

ファンデルワールス、疎水結合又は静電結合によってＣＥＡＣＡＭ１に結合する、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項9】

ＣＥＡＣＡＭ１に対する結合親和性が１×１０^－８ＫＤ未満（Ｍ）である、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項10】

請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド。

【請求項11】

請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載の発現ベクターが導入されている形質転換細胞。

【請求項13】

請求項１２に記載の形質転換細胞を培養するステップを含む、抗体又はその断片を作製するための方法。

【請求項14】

請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片を活性成分として含む抗がん剤。

【請求項15】

がんを予防又は処置するための、請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片の使用。

【請求項16】

がんを予防又は処置するための医薬の調製のための、請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片の使用。

【請求項17】

請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片を個体に投与するステップを含む、がんを予防又は処置するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１の立体配座エピトープ、及びＣＥＡＣＡＭ１の立体配座エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片に関する。

【背景技術】

【0002】

癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）は、癌胎児性抗原の群に属する膜貫通糖タンパク質のうちの１種である。ＣＥＡＣＡＭ１は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞において主に発現し、がん細胞においても高い発現を示す。

【0003】

ＣＥＡＣＡＭ１は、先天性免疫応答及び適応免疫応答を調節する役割を果たす。この点に関して、ＣＥＡＣＡＭ１が過剰発現するがん細胞の場合、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１は、ＣＥＡＣＡＭ１が発現するＴ細胞と相互作用する。ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用が生じると、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ－１（ＳＨＰ１）が、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）によってリン酸化されており、且つＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤ４終端に結合しているＣＥＡＣＡＭ１の免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）部分に結合する。更に、ＣＤ３ζ末端がＳＨＰ１タンパク質によって脱リン酸化される場合、ＲＡＳ－ＭＡＰＫシグナル伝達機序が活性化されないので、Ｔ細胞が活性化されないことにより、がん細胞が免疫応答を回避するという研究報告があった（Ｓｃｏｔｔ Ｄ．Ｇｒａｙ－Ｏｗｅｎ＆Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６巻、４３３～４４６頁、２００６年）。

【0004】

更に、ＣＥＡＣＡＭ１は、同種親和性相互作用だけでなく、ＣＥＡＣＡＭ５又はＣＥＡＣＡＭ６との異種親和性相互作用も有する。ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の中で、ＣＥＡＣＡＭ６は、様々な癌腫（例えば、乳房腫瘍、膵腫瘍、卵巣腺癌、肺腺癌等）で発現する（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ、２００７年１月３日；７：２）。活性化Ｔ細胞で発現するＣＥＡＣＡＭ１がＣＥＡＣＡＭ６に結合することによりＴＣＲシグナルを阻害することによって、Ｔ細胞がＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用における機序等の機序によって活性化されることが阻止され、その結果ＣＥＡＣＡＭ６発現がん細胞が免疫応答を回避するという研究報告があった（Ｗｉｔｚｅｎｓ－Ｈａｒｉｇら、Ｂｌｏｏｄ２０１３年５月３０日：１２１（２２）：４４９３～５０３）。

【0005】

したがって、がん細胞におけるＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用の阻害は、有望な抗がん治療として出現しており、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を効果的に阻害し得るＣＥＡＣＡＭ１に対する抗体を作製し、確認するようなＣＥＡＣＡＭ１の正確な立体配座エピトープの同定の必要性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

よって、ＣＥＡＣＡＭ１の立体配座エピトープを確認するために、本発明者らは、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及びＣＥＡＣＡＭ１がＸ線回折（ＸＲＤ）によってコンジュゲートされる複合体の構造を結晶化させ、立体配座エピトープに特異的に結合している抗体がＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用及びＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ６相互作用を阻害することを確認したことにより、本開示を完成させた。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の目的を達成するために、本開示の態様は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープであって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、立体配座エピトープを提供する。

【0008】

本開示の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片であって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片を提供する。

【発明の効果】

【0009】

本開示のＣＥＡＣＡＭ１の立体配座エピトープは、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体への特異的結合のために重要な位置のアミノ酸の全てを含むと共に適切な三次元構造を維持することによって、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体に対する高い親和性を示す。更に、本開示に係る立体配座エピトープに特異的に結合する抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用及びＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ６相互作用を効果的に阻害することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析による、実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂとＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとの複合体の結晶構造を示す図面。

【図2】実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の可変領域とＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとの複合体の構造（左）、及びＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインの間の二量体結合構造の構造（右）を示す図面。

【図3】実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂとＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとが結合している部分におけるアミノ酸を示す図面。

【図4】ＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインの間の二量体結合を形成しているアミノ酸を示す図面。

【図5A】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂとＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとの間の分子間距離が４．５Å以内であるアミノ酸を示す図面。

【図5B】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂとＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとの間の分子間距離が４．５Å以内であるアミノ酸を示す図面。

【図5C】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂとＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとの間の分子間距離が４．５Å以内であるアミノ酸を示す図面。

【図5D】抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂとＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインとの間の分子間距離が４．５Å以内であるアミノ酸を示す図面。

【図6】ｈＣＥＡＣＡＭ１細胞外ドメインのアミノ酸と前記アミノ酸をコードするＤＮＡとの配列情報を示す図面。

【図7】ｈＩｇＧ４ Ｆｃ領域におけるアミノ酸と前記アミノ酸をコードするＤＮＡとの配列情報を示す図面。

【図8】ＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの間の同種親和性相互作用を確認する図面。

【図9】実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの間の同種親和性相互作用に対する阻害効果を確認する図面。

【図10】ｈＣＥＡＣＡＭ６（ＥＣＤ）－ＦｃをコードするＤＮＡの配列情報を示す図面。

【図11】ＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃの間の異種親和性相互作用を確認する図面。

【図12】実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の濃度に応じたＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃの間の異種親和性相互作用に対する阻害効果を確認する図面。

【図13】ＣＥＡＣＡＭ１過剰発現ジャーカット細胞における、実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＺＡＰ７０リン酸化を増大させる効果を確認する図面。

【図14】ＮＦＡＴ及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現させるジャーカット細胞における、実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＮＦＡＴ発現を増大させる効果を確認する図面。

【図15】ＣＥＡＣＡＭ１過剰発現ジャーカット細胞における、実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＩＬ－２発現を増大させる効果を確認する図面。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本開示を詳細に説明する。

【0012】

本開示の態様は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープであって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、立体配座エピトープを提供する。

【0013】

癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）は、癌胎児性抗原の群に属する膜貫通糖タンパク質のうちの１種である。ＣＥＡＣＡＭ１は、活性化Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞において主に発現し、がん細胞においても高い発現を示す。ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸配列はＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインに対応し、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用又はＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ６相互作用に関与することが知られている。ＣＥＡＣＡＭ１はヒトＣＥＡＣＡＭ１であってもよく、ヒトＣＥＡＣＡＭ１のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列であってもよい。

【0014】

６３番目のアミノ酸はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、６４番目のアミノ酸はグリシン（Ｇｌｙ）であり、６６番目のアミノ酸はセリン（Ｓｅｒ）であり、６８番目のアミノ酸はチロシン（Ｔｙｒ）であり、７５番目のアミノ酸はグリシン（Ｇｌｙ）であり、７６番目のアミノ酸はアスパラギン（Ａｓｎ）であり、７８番目のアミノ酸はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、８３番目のアミノ酸はアラニン（Ａｌａ）であり、８６番目のアミノ酸はスレオニン（Ｔｈｒ）であり、９０番目のアミノ酸はスレオニン（Ｔｈｒ）であり、１２３番目のアミノ酸はグルタミン（Ｇｌｎ）であり、１２５番目のアミノ酸はイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、１２９番目のアミノ酸はロイシン（Ｌｅｕ）であり、１３１番目のアミノ酸はアスパラギン（Ａｓｎ）である。

【0015】

立体配座エピトープは、隣接するアミノ酸、又はタンパク質の三次元折り畳みによって隣接しないアミノ酸を含んでもよい。具体的には、立体配座エピトープは、独立空間の立体配座構造において少なくとも４個、５個、９個又は１０個のアミノ酸を含んでもよい。

【0016】

具体的には、立体配座エピトープは、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６３位、６４位、６６位及び６８位のアミノ酸を含んでもよい。更に、立体配座エピトープは、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸配列の７５位、７６位、７８位、８３位、８６位及び９０位のアミノ酸を含んでもよい。更に、立体配座エピトープは、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸配列の１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸を含んでもよい。

【0017】

更に、立体配座エピトープは、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６３位、６６位、６８位、７８位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸を含んでもよい。更に、立体配座エピトープは、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６４位、７５位、７６位、８３位、８６位及び９０位のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、立体配座エピトープは、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸で構成され、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸を含んでもよい。

【0018】

本発明において、ＣＥＡＣＡＭ１の新規な立体配座エピトープを同定するために、ＣＥＡＣＡＭ１及び実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体が結合している複合体の構造を、１．８Åの分解能で結晶化させた（図１～５Ｄ）。結果として、ＣＥＡＣＡＭ１の新規なエピトープと、実施形態に係る抗ＣＥＡＣＡＭ１のパラトープとを確認し、以下の表１に示す。

【0019】

【表1】

【0020】

表１に示されるように、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸に結合することが確認された。

【0021】

本開示の別の態様は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片であって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片を提供する。

【0022】

立体配座エピトープは、上記と同じである。

【0023】

具体的には、前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６３位、６４位、６６位及び６８位のアミノ酸を含む立体配座エピトープに特異的に結合してもよい。更に、前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸配列の７５位、７６位、７８位、８３位、８６位及び９０位のアミノ酸を含む立体配座エピトープに特異的に結合してもよい。更に、前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸を含む立体配座エピトープに特異的に結合してもよい。

【0024】

更に、前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６３位、６６位、６８位、７８位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸を含む立体配座エピトープに特異的に結合してもよい。更に、前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の６４位、７５位、７６位、８３位、８６位及び９０位のアミノ酸を含む立体配座エピトープに特異的に結合してもよい。好ましくは、前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸で構成され、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位のアミノ酸を含む立体配座エピトープに特異的に結合してもよい。

【0025】

前記抗体又はその断片は、分子間距離が４．５Å以内でＣＥＡＣＡＭ１に結合してもよい。前記抗体又はその断片は、ＣＥＡＣＡＭ１とのファンデルワールス結合、疎水結合又は静電結合を有してもよい。

【0026】

前記抗体又はその断片は、１×１０^－８ＫＤ（Ｍ）未満のＣＥＡＣＡＭ１に対する結合親和性を有してもよい。具体的には、前記抗体又はその断片は、９×１０^－９ＫＤ（Ｍ）未満、８×１０^－９ＫＤ（Ｍ）未満、７×１０^－９ＫＤ（Ｍ）未満、６×１０^－９ＫＤ（Ｍ）未満、５×１０^－９ＫＤ（Ｍ）未満、又は４×１０^－９ＫＤ（Ｍ）未満のＣＥＡＣＡＭ１に対する結合親和性を有してもよい。本開示の一実施形態、すなわち、上記の実施形態の抗体において、ＣＥＡＣＡＭ１に対する結合親和性は３．３６×１０^－９ＫＤ（Ｍ）であると測定された。

【0027】

前記抗体又はその断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含んでもよい。

【0028】

前記抗体又はその断片は、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでもよい。

【0029】

前記抗体の断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖからなる群から選択されるいずれか１種であってもよい。抗体断片は、細胞、補体等に抗原結合性刺激を伝えるエフェクタ機能を有する結晶化可能断片領域（Ｆｃ領域）を除く抗原結合性ドメインを指し、第三世代抗体断片（例えば、単一ドメイン抗体、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）等）を含んでもよい。

【0030】

本発明の更に別の態様は、活性成分として前記抗体又はその断片を含む抗がん剤を提供する。

【0031】

活性成分として前記抗体又はその断片を含む抗がん剤は、ＣＥＡＣＡＭ１が過剰発現しているがん又は腫瘍を処置するために使用されてもよい。具体的には、がん細胞を除去する役割を果たす細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、がん細胞又は腫瘍細胞の抗原決定基を認識する場合、（ＴＣＲの成分のうちの１種である）表面抗原分類４（ＣＤ４）の末端に結合しているリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）タンパク質は、（ＴＣＲの別の成分である）表面抗原分類３ζ（ＣＤ３ζ）をリン酸化する。ゼータ鎖会合タンパク質キナーゼ７０（ＺＡＰ７０）タンパク質が、リン酸化されたＣＤ３ζ部分に結合する場合、ＺＡＰ７０タンパク質の末端がＬＣＫタンパク質によってリン酸化され、Ｒａｓ－ＭＡＰキナーゼシグナル形質導入が活性化されることによって、Ｔ細胞が活性化される。

【0032】

しかし、ＣＥＡＣＡＭ１が過剰発現しているがん細胞又は腫瘍細胞の場合、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ－１（ＳＨＰ１）タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用によりＴＣＲのＣＤ４末端に結合しているＬＣＫタンパク質によってリン酸化されたＣＥＡＣＡＭ１の免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）部分に結合する。更に、ＣＤ３ζ末端がＳＨＰ１タンパク質によって脱リン酸化され、結果として、ＲＡＳ－ＭＡＰＫシグナル伝達機序を活性化することができないので、Ｔ細胞は活性化されない。

【0033】

したがって、前記抗体又はその断片は、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞及びがん細胞において発現するＣＥＡＣＡＭ１に結合し、ＣＥＡＣＡＭ１－ＣＥＡＣＡＭ１相互作用のブロッキングをあらかじめ行うので、抗がん剤として使用され得る。

【0034】

更に、本明細書において使用される場合、「抗がん」という用語は、「予防」及び「処置」を含み、「予防」は、抗がん剤の投与によってがんの増殖を阻害するか、又はがんの進行を遅延させる全ての作用を指し、「処置」は、本開示の抗体の投与によってがんの病徴を改善するか、又は有益に変化させる全ての作用を指す。

【0035】

更に、本明細書において使用される場合、「がん」という用語は、膵がん、黒色腫、肺がん及び骨髄腫からなる群から選択されることを特徴としてもよいが、受容体としてＣＥＡＣＡＭ１を有し、免疫チェックポイント経路が異常に操作される限り特に限定されるものではなく、固形がん及び血液がんを含んでもよい。

【0036】

本発明の更に別の態様は、前記抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０及び／又は１１で表されるヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0037】

前記ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の塩基の置換、欠失、挿入又は組合せによって修飾されてもよい。前記ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列を化学的に合成することによって調製される場合、本技術分野でよく知られている合成方法（例えば、Ｅｎｇｅｌｓ及びＵｈｌｍａｎｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７：７３～１２７、１９８８年、に記載されている方法）を使用してもよく、前記合成方法としては、亜リン酸トリエステル法、ホスホラミダイト法及びＨ－ホスフェート法、ＰＣＲ法及び他の自動プライマー（ａｕｔｏｐｒｉｍｅｒ）法、固形担体におけるオリゴヌクレオチド合成法等が挙げられる。

【0038】

更に、本発明の更に別の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。前記発現ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等であってもよく、商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰ等）、大腸菌由来プラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来プラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来プラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等）及び昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルス等）であってもよい。前記発現ベクターは、宿主細胞に応じて異なる発現レベル及び発現修飾のタンパク質を示すので、目的のために最も適した宿主細胞を選択し、使用することが好ましい。

【0039】

本発明の更に別の態様は、前記発現ベクターが導入されている形質転換細胞を提供する。前記形質転換細胞の宿主細胞としては、哺乳動物起源、植物起源、昆虫起源、細菌起源又は細胞起源の細胞を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等があるが、それらに限定されるものではなく、哺乳動物宿主細胞として使用されることが当業者に知られているいずれの細胞も使用することができる。

【0040】

更に、発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、ＣａＣｌ_２沈殿法等の方法、ＣａＣｌ_２沈殿法においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と呼ばれる還元材料を使用することによって効率性を向上させたＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、原形質溶融法、炭化ケイ素繊維を使用する撹拌法、アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）媒介形質転換法、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミンを使用する形質転換法及び乾燥／阻害媒介形質転換法等を使用してもよい。

【0041】

本発明の更に別の態様は、前記形質転換細胞を培養することを含む、抗体又はその断片を作製する方法を提供する。具体的には、前記作製方法は、ｉ）前記形質転換細胞を培養することによって培養物を得るステップと、ｉｉ）前記培養物から前記抗体又はその断片を回収するステップと、を含む。

【0042】

前記形質転換細胞を培養する前記方法は、本技術分野でよく知られた方法を使用して行われてもよい。具体的には、前記培養物は、回分プロセス、供給回分プロセス（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）又は反復供給回分プロセス（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）によって連続して培養されてもよい。

【0043】

前記培養物から前記抗体又はその断片を回収する前記ステップは、本技術分野で知られている方法によって行われてもよい。具体的には、前記回収方法としては、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸留、沈澱、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫安沈殿）、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性及びサイズ排除）等が挙げられ、使用されもよい。

【0044】

本発明の更に別の態様は、がんを予防するか、又は処置するための前記抗体又はその断片の使用を提供する。

【0045】

本発明の更に別の態様は、がんを予防するか、又は処置するための医薬を調製するための前記抗体又はその断片の使用を提供する。

【0046】

本発明の更に別の態様は、前記抗体又はその断片を個体に投与することを含む、がんを予防するか、又は処置するための方法を提供する。

【実施例】

【0047】

以下、本開示を以下の実施例によって更に詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、例示的目的のためだけであり、本開示の範囲は、それらに限定されるものではない。

【0048】

Ｉ． ＣＥＡＣＡＭ１及び抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の結合構造の確認
実施例１． ＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインの作製
１０個のヒスチジンが連結するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグへの結合によってＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインに対応する３５～１４１位のアミノ酸配列を発現させるために、ｐＥＴ２８－ＭＢＰ－ＴＥＶベクターから誘導された１０Ｈｉｓ－ＭＢＰ－ＴＥＶ－Ｘ－ｐＪＡベクターにアミノ酸配列をクローニングした（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃６９９２９）。クローニングされたベクターを使用して大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬを形質転換し、１８℃でイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、２００μＭ）で処置することによって前記タンパク質を発現させた。前記タンパク質を発現させた大腸菌を１００ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液において音波破砕し、遠心分離し、前記大腸菌から溶解物だけを分離した。その後、コバルト樹脂を使用して１０Ｈｉｓタグのための親和性クロマトグラフィを行った。前記大腸菌から得られた溶出液をＴＥＶプロテアーゼで処置して、１０Ｈｉｓ－ＭＢＰタグを切断した。ＨｉｔｒａｐＱ陰イオン交換カラム及びＨｉｓｔｒａｐ親和性クロマトグラフィカラムを使用して、１０Ｈｉｓ－ＭＢＰタグを分離し、除去したことによって、純度が高いＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインを精製した。

【0049】

実施例２． 抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂの調製
実施例２．１． 重鎖がＩｇＧ１型で置換される抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の調製
抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂを調製するために、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＩｇＧ４重鎖（配列番号１２及び１３）をヒトＩｇＧ１（配列番号１４及び１５）に転化させた。ヒトＩｇＧ１型への転化のために、ヒトＩｇＧ１型のＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３断片をコードする遺伝子をＰＣＲによって得た。この時に使用したプライマーを以下の表２に示す。

【0050】

【表2】

【0051】

ＮｏｔＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ０１８９Ｌ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ０１０４Ｔ）のための制限部位を有するプライマーを使用して、ＰＣＲによって得たＩｇＧ１型のＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３断片をコードする遺伝子と、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子とのオーバーラップＰＣＲによって、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体－ＩｇＧ１型の重鎖をコードする遺伝子を得た。特に、使用したプライマーを以下の表３に示す。

【0052】

【表3】

【0053】

ＰＣＲによって得た遺伝子（ＤＮＡ）を１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８７０６）を使用して分離した。

【0054】

制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ０１８９Ｌ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ０１０４Ｔ）を単離したＤＮＡに加え、３７℃で４時間反応させ、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号２８１０６）を使用してＤＮＡを得た。

【0055】

更に、得られたＤＮＡ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０３Ｓ）を、ＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処置した線形化ｐＣＩＷベクターに加え、１６℃の温度で４時間反応させた。４時間後、１μＬの連結反応混合物を採取し、１００μＬのＸＬ１－Ｂｌｕｅエレクトロポレーション－コンピテント細胞に加え、混合し、エレクトロポレーションシステムを使用して形質転換した。

【0056】

形質転換が生じたプレートにおいて、単一のコロニーをＳＢ／ｃａｒ培地に接種し、一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２７１０６）を使用してＤＮＡを形質転換細胞から得て、外部の会社であるＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈに配列決定を依頼した。結果として、配列番号３３で表されるヌクレオチド配列で表される抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体－ＩｇＧ１型重鎖をコードする遺伝子を確認した。確認された形質転換細胞を培養した後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２９４５）を使用して大量のＤＮＡを得た。

【0057】

実施例２．２． 重鎖がＩｇＧ１型で置換される抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の作製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１４３５１０１）において、２．０×１０^６個／ｍＬの濃度で、トランスフェクションの１日前に播種した。２４時間、３７℃、８％ＣＯ_２及び１２５ｒｐｍの条件下のインキュベーションの後、２．５×１０^６個／ｍＬの濃度で２５．５ｍＬを調製した（生存率＝９５％）。

【0058】

得られたＣＥＡＣＡＭ１抗体－ＩｇＧ１型の３０μｇの重鎖ＤＮＡ（１５μｇのｐＣＩＷ＿ＭＧ１１２４ＨＣ＿ＩｇＧ１及び１５μｇのｐＣＩＷ＿ＭＧ１１２４ＬＣ）を、１．５ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２３０９０１９）において希釈し、室温で５分間反応させた。次いで、８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１４５２４）も１．５ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２３０９０１９）に加え、室温で５分間反応させた。その後、希釈したＤＮＡ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬をそれぞれよく混合し、３ｍＬの混合物を室温で３０分間反応させた。

【0059】

３ｍＬの混合物を２．５×１０^６個／ｍＬの濃度の３０ｍＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞に加えた（生存率＝９５％）。前記混合物を１６～１８時間インキュベートした後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３エンハンサ１（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１４５２４）及び１．５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３エンハンサ２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１４５２４）を前記混合物に加え、ＣＯ_２振盪インキュベータ（ＭＢ－２０６ＣＸＸＬ）において６日間培養した。

【0060】

培養が完了した後、前記細胞を４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細胞ペレットを除去し、上清を０．４５μｍのフィルタを通してフィルタ処理した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂である１００μＬのＣａｐｔｉｖＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＲＥＰＬＩＧＥＮ、ＣＡ－ＰＲＩ－０１００）を各培養物３０ｍＬ毎に調製し、１，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、保存緩衝液を除去し、各洗浄物について１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１００７）で３回洗浄した。

【0061】

調製した培養溶液にＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂を加えた。回転インキュベーションを室温で２時間行った後、混合物をＰｉｅｒｃｅ Ｓｐｉｎカラムスナップキャップ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号６９７２５）及びＱＩＡｖａｃ２４ｐｌｕｓ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１９４１３）に加え、真空マニホールドを使用して前記カラムに樹脂を充填した。前記樹脂に５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１００７）を加えることによって前記樹脂を洗浄し、前記樹脂に２００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１００９）を加えた。前記混合物を室温で２分間インキュベートし、次いで、１分間で１，０００ｒｐｍの条件下における遠心分離によって溶出した。

【0062】

実施例２．３． 抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂの単離及び精製
実施例２．２で調製された前記抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体－ＩｇＧ１型からＦａｂだけを精製するために、１：１００の比で前記抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体－ＩｇＧ１型においてパパインプロテアーゼを処置した。ＩｇＧ１重鎖のＦａｂ及びＦｃの間の配列を切断することによってＦａｂ及びＦｃを分離するためにパパインプロテアーゼを使用した。ＰＢＳ緩衝液においてパパインプロテアーゼ処置物を反応させ、次いで、０ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）による透析によって緩衝液条件を変更した。抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂ部分は理論的ｐＩ値が８．８であったので、ＨｉｔｒａｐＳＰ陽イオン交換カラムを使用してＦａｂ部分を分離し、精製した。抗ＣＥＡＣＡＭ１のＦｃを前記カラムに付着させることなく放出し、約５０ｍＭ～約７０ｍＭのＮａＣｌの条件下で高純度で抗ＣＥＡＣＡＭ１のＦａｂを分離し、精製した。精製した抗ＣＥＡＣＡＭ１ Ｆａｂ及び実施例１で分離したＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインを１：２の比で混合し、そしてＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル－濾過カラムによって精製した。

【0063】

実施例３． ＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメイン及び抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂ複合体の結晶化及び構造分析
結晶化条件を約８００の条件下のスクリーニングによって最適化した。

【0064】

そして、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂ及びＣＥＡＣＡＭ１のＮ－ドメインの複合体（３６．６ｍｇ／ｍＬ）を、０．１Ｍの硫酸リチウム一水和物、０．１ＭのＮ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）（ｐＨ６．５）、１４％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール４０００及び２％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールの条件下で結晶化させた。得られた結晶を、凍結の防止のために追加的に１７．５％のエチレングリコールがある条件下で処置した。

【0065】

Ｘ線回折（ＸＲＤ）データをＰｏｈａｎｇ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおける５Ｃビームラインで収集し、ＨＫＬ２０００ｓｕｉｔ（１）で処理した。ＰｈｅｎｉｘプログラムのＭｏｌｅｃｕｌａｒ置換（２）法を使用して複合体の構造を決定したが、前記構造のために使用されるモデルは、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体との高い配列相同性を有する構造（ＰＤＢエントリ：４ＥＶＮ）及びＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインに対応する構造（ＰＤＢエントリ：４ＷＨＤ）であった。前記構造の改善のために、Ｐｈｅｎｉｘ（３）のＲｅｆｉｎｅｍｅｎｔ機能、ＣＮＳプログラム（４）及びＣＯＯＴプログラム（５）を使用した。以下の表４に、結晶学的データの統計量を示す。

【0066】

【表4】

【0067】

結晶化プロセスを経た後、ＸＲＤデータを得て、そして、分解能が１．８Åである抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂ及びＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインの複合体の構造を同定した。結晶構造に基づいて、分子間距離が４．５Å以内で結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂのパラトープとＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインのエピトープとを同定した。

【0068】

結果として、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の重鎖可変領域は、軽鎖可変領域よりも高いＣＥＡＣＡＭ１への結合数を示した。前記重鎖可変領域の場合、アミノ酸Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｇｌｙ５４、Ｇｌｙ５６、Ｓｅｒ５７、Ａｓｎ７４、Ｐｒｏ１００、Ｔｈｒ１０１、Ｌｙｓ１０２、Ｔｙｒ１０４及びＡｌａ１０５が、ＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインに疎水性結合したか、又は静電結合した。前記軽鎖可変領域の場合、アミノ酸Ｔｙｒ３３、Ｔｙｒ５０、Ａｌａ５１及びＬｅｕ９４が、ＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインに疎水性結合したか、又は静電結合した。

【0069】

ＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインに基づいて、アミノ酸Ｐｈｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６６、Ｔｙｒ６８、Ｇｌｙ７５、Ａｓｎ７６、Ｇｌｎ７８、Ａｌａ８３、Ｔｈｒ８６、Ｔｈｒ９０、Ｇｌｎ１２３、Ｉｌｅ１２５、Ｌｅｕ１２９及びＡｓｎ１３１が、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体に結合した。抗原－抗体結合の総表面積は、７９１．９８Å^２であった（図１及び図２）。以前に知られているＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインの二量体の形成で重要な役割を果たすアミノ酸は、Ｐｈｅ６３、Ｓｅｒ６６、Ｔｙｒ６８、Ｇｌｎ７８、Ｇｌｎ１２３、Ｉｌｅ１２５、Ｌｅｕ１２９及びＡｓｎ１３１であり、図３及び図４に示される。このことによって、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体のＦａｂによりＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインが結合される可能性もあることが確認される（図５Ａ～図５Ｄ）。これらの結果から、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体が結合するＣＥＡＣＡＭ１ Ｎ－ドメインのエピトープが、ＣＥＡＣＡＭ１の二量体界面と重なるので、抗ＣＥＡＣＡＭ１はＣＥＡＣＡＭ１の活性を効果的に阻害する可能性があることが確認された。

【0070】

実験例４． 抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及びＣＥＡＣＡＭ１の間の結合力の測定
Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、ＣＥＡＣＡＭ１への抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の定量的結合力を測定した。抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を４００ｎＭの濃度で６倍の１／２濃度希釈に供し、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び６．２５ｎＭの濃度の抗体をそれぞれ２００μＬの量で一列にＧｒｅｉｎｅｒ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号６５５２０９）に加え、最後のウェルには０ｎＭの濃度で加えた。別の列で、ｈＣＥＡＣＡＭ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２４４－ＣＭ）を６．２５μｇ／μＬの濃度に希釈し、それぞれ２００μＬの量で一列に加えた。

【0071】

Ｒｅａｇｅｎｔ／Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液（１０×）（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－１０９２）で洗浄緩衝液、中和緩衝液及びベースライン緩衝液を１０倍で希釈し、各列において２００μＬの量で加え、再生緩衝液を２００μＬの量で一列に加えた。別々のＧｒｅｉｎｅｒ９６ウェルプレートを調製し、使用されるバイオセンサの数と同じだけのウェルにＲｅａｇｅｎｔ／Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液（１×）を２００μＬの量で加え、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ／Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（Ｈｉｓ１Ｋ）（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５１２０）Ｃａｓｓｅｔｔｅを載置した。

【0072】

会合及び解離の時間をそれぞれ３００秒及び６００秒に設定し、会合及び解離のＫＤ値を測定した。

【0073】

結果として、以下の表５に示されるように、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体はＣＥＡＣＡＭ１に対する親和（ＫＤ）値が３．９０ｎＭであったことを確認した。

【0074】

【表5】

【0075】

ＩＩ． 抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の活性の確認
実施例５．１． ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの調製
ＮｏｔＩ－ＳＳ－ＣＥＡＣＡＭ１フォワードプライマー及びＣＥＡＣＡＭ１－Ｈｉｎｇｅリバースプライマーを使用して、ヒトＣＥＡＣＡＭ１ ｃＤＮＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＤＣ０９５１）に由来するＣＥＡＣＡＭ１の細胞外ドメイン（Ｇｌｎ３５－Ｇｌｙ４２８）をＰＣＲに供した。特に、以下の表６に、使用したプライマーを示す。

【0076】

【表6】

【0077】

ＰＣＲによって得たＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キットを使用して、ｈＣＥＡＣＡＭ１細胞外ドメイン（図６及び配列番号２３）をコードするＤＮＡを得た。

【0078】

更に、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域の遺伝子を得るために、鋳型として配列番号１２の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の重鎖ＤＮＡを使用し、且つｈＩｇＧ４－Ｈｉｎｇｅフォワードプライマー及びｈＩｇＧ４－ＣＨ３－ｓｔｏｐ－ＨｉｎｄＩＩＩリバースプライマーを使用して、ＰＣＲを行った。特に、以下の表７に、使用したプライマーを示す。

【0079】

【表7】

【0080】

ＰＣＲによって得たＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キットを使用して、ｈＩｇＧ４ Ｆｃ領域（図７及び配列番号２６）をコードするＤＮＡを得た。ｈＣＥＡＣＡＭ１細胞外ドメインをコードするＤＮＡとｈＩｇＧ４ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡとを使用し、制限酵素切断部位を有するＮｏｔＩ－ＳＳ－ＣＥＡＣＡＭ１フォワードプライマーとｈＩｇＧ４－ＣＨ３－ｓｔｏｐ ＨｉｎｄＩＩＩリバースプライマーとを使用して、ＰＣＲを行った。

【0081】

ＰＣＲによって得られたＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キットを使用してｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ ＤＮＡを得た。得られたｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ ＤＮＡをＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処置し、３７℃で４時間反応させ、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ挿入ＤＮＡ断片を単離した。その後、調製されたｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ挿入ＤＮＡ断片をｐｃＩＷベクターにクローニングするために、ＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による処置によってｐｃＩＷベクターも線形ｐＣＩＷベクターに分離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを、ＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化させたｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ挿入ＤＮＡ断片並びに線形ｐｃＩＷベクターに加え、１６℃で４時間反応させた。４時間後、１μＬの連結反応混合物を収集し、１００μＬのＸＬ１－Ｂｌｕｅエレクトロポレーション－コンピテント細胞に加え、混合し、エレクトロポレーション法を使用して形質転換した。

【0082】

形質転換プレートにおいて、単一コロニーをＳＢ／ｃａｒ培地に接種し、一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２７１０６）を使用して形質転換細胞からＤＮＡを得て、外部の会社であるＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈに配列決定を依頼した。結果として、配列番号３４のヌクレオチド配列で表されるｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃをコードする遺伝子を同定した。同定された形質転換細胞を培養した後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２９４５）を使用して大量のＤＮＡを得た。

【0083】

その後、実施例２．２．と同じ方法でＥｘｐｉ２９３Ｆ動物細胞を使用して一過性過剰発現系によってｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃタンパク質を作製し、単離した。

【0084】

実施例５．２． ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの間の相互作用の確認
実施例５．１で調製したｈＣＥＡＣＡＭ１－ＦｃをＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いで、得られたものの各々１００μＬをＮＵＮＣイムノモジュール（ＮＵＮＣ、４６８６６７）プレートに加え、４℃で一晩コーティングした。翌日、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）ＰＢＳで洗浄した後、コーティングされたプレートの各ウェルに３００μＬの（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳを加え、室温で２時間反応させることによってブロッキングを行った。

【0085】

更に、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）ＰＢＳで３回洗浄した後、ビオチン標識ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃを１５０μｇ／ｍＬの濃度から開始して３倍に連続的に希釈し、ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃでコーティングされたプレートにおける１１のウェルに加えた。１％のＢＳＡを加えたＰＢＳだけを最後のウェルに加えた。ウェルを３７℃で１時間反応させた。１時間後、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを加えることによって、各ウェルを３回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳにおいて１：５，０００の比で希釈し、得られたものの各々１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間反応させた。反応が完了した各ウェルを、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えることによって３回洗浄し、次いで、１００μＬのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、５０－７６－０３）を各ウェルに加え、５分間反応させた。反応を終了させるために、等量の硫酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、３３９７４１）を加え、ＥＬＩＳＡリーダを使用してＯＤ値を４５０ｎｍの波長で測定した。

【0086】

結果として、結合はｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃタンパク質の濃度に依存することが確認された。特に、ＥＣ５０値は０．２８６μｇ／ｍＬであった（図８）。

【0087】

実施例５．３． ｈＣＥＡＣＡＭ１－ｈＣＥＡＣＡＭ１相互作用の阻害に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の効果の確認
実施例５．１で調製したｈＣＥＡＣＡＭ１－ＦｃをＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いで、得られたものの各々１００μＬをＮＵＮＣイムノモジュール（ＮＵＮＣ、４６８６６７）プレートに加え、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートにおける各ウェルに３００μＬの（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳを加え、室温で２時間反応させることによってブロッキングを行った。

【0088】

別の９６ウェルプレートにおいて、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を６０μｇ／ｍＬの濃度から開始して２倍に連続的に希釈し、１１のウェルに加え、１％のＢＳＡを加えたＰＢＳだけを最後のウェルに加え、次いで、ビオチン標識ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃを（０．５μｇ／ｍＬに希釈した）抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体と同じ量で加え、室温で１時間反応させた。１時間後、ブロッキングを行ったプレートに、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及びビオチン標識ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの混合物の各々１００μＬを加え、室温で１時間再度反応させた。

【0089】

１時間後、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えることによって、各ウェルを３回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳにおいて１：５，０００の比で希釈し、得られたものの各々１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間反応させた。反応が完了した各ウェルを、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを加えることによって３回洗浄し、次いで、１００μＬのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、５０－７６－０３）を各ウェルに加え、５分間反応させた。反応を終了させるために、等量の硫酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、３３９７４１）を加え、ＥＬＩＳＡリーダを使用してＯＤ値を４５０ｎｍの波長で測定した。

【0090】

結果として、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の濃度が増加するにつれてｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの同種親和性相互作用が阻害されたことが分かった。特に、ＩＣ５０値は、１．０５５μｇ／ｍＬであった（図９）。

【0091】

実施例６．１． ｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃの調製
ＳＳ－ｈＣＥＡＣＡＭ６フォワードプライマー及びＣＥＡＣＡＭ６－Ｈｉｎｇｅリバースプライマーを使用して、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ ｃＤＮＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＤＣ０９５５）に由来するＣＥＡＣＡＭ６の細胞外ドメイン（Ｌｙｓ３５－Ｇｌｙ３２０）をＰＣＲに供した。特に、以下の表８に、使用したプライマーを示す。

【0092】

【表8】

【0093】

ＰＣＲによって得たＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キットを使用して、ｈＣＥＡＣＡＭ６細胞外ドメインをコードするＤＮＡを得た。

【0094】

更に、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の遺伝子を得るために、鋳型として抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体－ＩｇＧ１型の重鎖ベクターを使用し、且つｈｉｎｇｅ（ＨＩｇＧ１）フォワードプライマー及びＣＨ３（ＨＩｇＧ１）＿ＨｉｎｄＩＩＩリバースプライマーを使用して、ＰＣＲを行った。特に、以下の表９に、使用したプライマーを示す。

【0095】

【表9】

【0096】

ＰＣＲによって得たＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キットを使用して、ｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡを得た。制限酵素切断部位を有するＮｏｔＩ－ＳＳフォワードプライマーとＣＨ３（ＨＩｇＧ１）＿ＨｉｎｄＩＩＩリバースプライマーとを使用して、ｈＣＥＡＣＡＭ６細胞外ドメインをコードするＤＮＡ及びｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲに供した。特に、以下の表１０に、使用したプライマーを示す。

【0097】

【表10】

【0098】

ＰＣＲによって得たＤＮＡを１％アガロースゲルに載せ、ＤＮＡ Ｇｅｌ抽出キットを使用して、ｈＣＥＡＣＡＭ６（ＥＣＤ）－ＦｃをコードするＤＮＡを得た（図１０及び配列番号３２）。得られたｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃ ＤＮＡをＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処置し、３７℃で４時間反応させ、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃ挿入ＤＮＡ断片を単離した。その後、調製されたｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃ挿入ＤＮＡ断片をｐｃＩＷベクターにクローニングするために、ＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処置することによって線形ｐＣＩＷベクターにｐｃＩＷベクターも単離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを、ＮｏｔＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化させたｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃ挿入ＤＮＡ断片及び線形ｐｃＩＷベクターに加え、１６℃で４時間反応させた。４時間後、１μＬの連結反応混合物を収集し、１００μＬのＸＬ１－Ｂｌｕｅエレクトロポレーション－コンピテント細胞に加え、混合し、エレクトロポレーション法を使用して形質転換した。

【0099】

形質転換プレートにおいて、単一コロニーをＳＢ／ｃａｒ培地に接種し、一晩培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２７１０６）を使用して形質転換細胞からＤＮＡを得て、外部の会社であるＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈに配列決定を依頼した。結果として、ｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃをコードする遺伝子を同定した。同定された形質転換細胞を培養した後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２９４５）を使用して大量のＤＮＡを得た。

【0100】

その後、実施例２．２．と同じ方法でＥｘｐｉ２９３Ｆ動物細胞を使用して一過性過剰発現系によってｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃタンパク質を作製し、単離した。

【0101】

実施例６．２． ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃの間の相互作用の確認
実施例６．１で調製したｈＣＥＡＣＡＭ６－ＦｃをＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いで、得られたものの各々１００μＬをＮＵＮＣイムノモジュール（ＮＵＮＣ、４６８６６７）プレートに加え、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートにおける各ウェルに３００μＬの（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳを加え、室温で２時間反応させることによってブロッキングを行った。

【0102】

更に、ビオチン標識ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃを１５０μｇ／ｍＬの濃度から開始して３倍に連続的に希釈し、ｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃでコーティングされたプレートにおける１１のウェルに加え、（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳだけを最後のウェルに加え、前記ウェルを３７℃の温度で１時間反応させた。１時間後、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えることによって各ウェルを３回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳにおいて１：５，０００の比で希釈し、得られたものの各々１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間反応させた。反応が完了した各ウェルを、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えることによって３回洗浄し、次いで、１００μＬのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、５０－７６－０３）を各ウェルに加え、５分間反応させた。反応を終了させるために、等量の硫酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、３３９７４１）を加え、ＥＬＩＳＡリーダを使用してＯＤ値を４５０ｎｍの波長で測定した。

【0103】

結果として、ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃタンパク質の濃度が増加するにつれて、ｈＣＥＡＣＡＭ１－ＦｃがｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃに結合したことが確認された。特に、ＥＣ５０値は０．３０５μｇ／ｍＬであった（図１１）。

【0104】

実施例６．３． ｈＣＥＡＣＡＭ１－ｈＣＥＡＣＡＭ１相互作用の阻害に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の効果の確認
実施例６．１で調製したｈＣＥＡＣＡＭ６－ＦｃをＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、次いで、得られたものの各々１００μＬをＮＵＮＣイムノモジュール（ＮＵＮＣ、４６８６６７）プレートに加え、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートにおける各ウェルに３００μＬの（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳを加え、室温で２時間反応させることによってブロッキングを行った。

【0105】

別の９６ウェルプレートにおいて、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を６０μｇ／ｍＬの濃度から開始して２倍に連続的に希釈し、１１のウェルに加え、（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳだけを最後のウェルに加え、次いで、ビオチン標識ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃを０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈された抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体と同じ量で加え、室温で１時間反応させた。１時間後、ブロッキングを行ったプレートに抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体及びビオチン標識ｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃの混合物の各々１００μＬを加え、室温で１時間再度反応させた。

【0106】

１時間後、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えることによって、各ウェルを３回洗浄し、次いで、ストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を（１％のＢＳＡを加えた）ＰＢＳにおいて１：５，０００の比で希釈し、得られたものの各々１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４０分間反応させた。反応が完了した各ウェルを、（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えた）３００μＬのＰＢＳを各ウェルに加えることによって３回洗浄し、次いで、各々１００μＬのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、５０－７６－０３）を各ウェルに加え、５分間反応させた。反応を終了させるために、等量の硫酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、３３９７４１）を加え、ＥＬＩＳＡリーダを使用してＯＤ値を４５０ｎｍの波長で測定した。

【0107】

結果として、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の濃度が増加するにつれてｈＣＥＡＣＡＭ１－Ｆｃ及びｈＣＥＡＣＡＭ６－Ｆｃの間の結合が阻害されたことが分かった。特に、ＩＣ５０値は、０．７９５μｇ／ｍＬであった（図１２）。

【0108】

ＩＩＩ． ＴＣＲシグナル伝達の活性化に対する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の効果の確認
抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体がＣＥＡＣＡＭ１－ＣＡＥＣＡＭ１相互作用のためにＴ細胞活性化の阻害をブロックすることによってＴＣＲシグナル伝達を活性化するかどうかを確認するために、ＴＣＲシグナル伝達経路のうちの１つであるＺＡＰ７０のリン酸化の存在と、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）転写因子の核因子及びＩＬ－２発現レベルの核因子の増加とを検討した。

【0109】

実施例７．１． ＺＡＰ７０リン酸化の効果の確認
まず、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を調製するために、制限酵素を使用して、ＣＥＡＣＡＭ１をコードするヌクレオチド配列をｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１９７３）に挿入することによって、ｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１－ＣＣＭ１プラスミドを調製した。

【0110】

具体的には、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を有するＣＥＡＣＡＭ１フォワードプライマーとＳａｌＩ制限酵素切断部位を有するリバースプライマーとを使用して、ｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１－ＣＣＭ１プラスミドをヒトＣＥＡＣＡＭ１ ｃＤＮＡ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＲＤＣ０９５１）からＰＣＲに供した。特に、以下の表１１に、使用したプライマーを示す。

【0111】

【表11】

【0112】

ＰＣＲによって得たＤＮＡを０．８％のアガロースゲルに載せ、ＤＮＡゲル抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ９２８２）を使用してＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ ｈＣＥＡＣＡＭ１ ＤＮＡを得た。得られたｈＣＥＡＣＡＭ１ ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＳａｌＩ制限酵素で処置し、３７℃で２時間反応させ、次いで、Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ９２８２）を使用して、ｈＣＥＡＣＡＭ１挿入ＤＮＡ断片を単離した。その後、調製されたｈＣＥＡＣＡＭ１挿入ＤＮＡ断片をｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１９７３）にクローニングするために、ｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１ベクターもＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＳａｌＩ制限酵素で処置して、線形ｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１ベクターを単離した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを、線形ｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１ベクター並びにＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＳａｌＩ制限酵素で消化させたｈＣＥＡＣＡＭ１挿入ＤＮＡ断片に加え、１６℃で４時間反応させた。４時間後、１μＬの連結反応混合物を収集し、ＤＨ－５α大腸菌株の１００μＬのコンピテント細胞に形質転換した。形質転換されたプレートにおいて、単一コロニーを培地に接種し、一晩培養した。ＤＮＡプラスミドＳＶ（Ｇｅｎｅａｌｌ、カタログ番号１０１～１０２）を使用して形質転換細胞を得て、外部の会社であるＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈに配列決定を依頼した。

【0113】

結果として、配列番号３７のヌクレオチド配列で表されるｈＣＥＡＣＡＭ１をコードする遺伝子を同定した。同定された形質転換細胞を培養した後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号１２９４５）を使用して大量のＤＮＡを得た。

【0114】

その後、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（１，４００電圧／２０ｍｓ／２パルス）を使用して、１０μｇのｐＥＦ１α－ＡｃＧＦＰ－Ｎ１－ＣＣＭ１プラスミドを３×１０^６個のジャーカットＥ６．１細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。７２時間後、トランスフェクトしたジャーカット細胞を採取し、フローサイトメータ（ＦＡＣＳＡｒｉａ）を使用して、ＧＦＰを発現するジャーカット細胞を選別した。選別されたジャーカット細胞を、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ８１６８）を含有する培養培地で培養した。特に、使用した培養培地は、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１×）、ＮＥＡＡ（１×）、ピルビン酸ナトリウム（１×）及び１０％ＦＢＳを含有する完全ＩＭＤＭ（ｃＩＭＤＭ）培地であった。

【0115】

ジャーカット細胞及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を、１つのウェル当たり３×１０^６個の細胞の密度で分注し、１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４６３９）又は抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で５時間処置し、３７℃の温度で５％ＣＯ_２の条件下で培養した。その後、幾つかの培養されたジャーカット細胞及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５）及び抗ＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－０２８９－８５）で処置することによって１分間刺激した。

【0116】

ＲＩＰＡ緩衝液（氷冷溶解緩衝液）を使用して、ジャーカット細胞及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を各々溶解させた。その後、細胞溶解物を各々遠心分離し、６×のＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、ＭＥＳランニング緩衝液を使用して混合物をＮｏｖｅｘ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ勾配ゲルに載せ、混合物におけるタンパク質をニトロセルロース膜に移した。その後、得られたものを５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処置することによって非特異的反応をブロックし、一次抗体と、ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体とを使用してウエスタンブロットを行った。特に、使用した一次抗体は、抗リン酸化ＺＡＰ７０（Ｙ３１９、細胞シグナル伝達、カタログ番号２７１７Ｓ）、抗ＺＡＰ７０抗体（細胞シグナル伝達、カタログ番号２７０５Ｓ）、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体（ＯＲＩＧＥＮＥ、カタログ番号ＴＡ３５０８１７）及び抗アクチン抗体（細胞シグナル伝達、カタログ番号４９６７１）であった。

【0117】

特に、ＣＥＡＣＡＭ１を発現せず、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激しなかったジャーカット細胞を陰性対照として設定し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（ａｎｔｉｂｏｄｔ）で刺激し、ＣＥＡＣＡＭ１を発現せず、ｈＩｇＧ４で処置したジャーカット細胞を陽性対照として設定した。更に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激し、ｈＩｇＧ４又は抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で処置した、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を実験群として設定された。

【0118】

結果として、図１３に示されるように、陰性対照群の場合、ＺＡＰ７０はリン酸化されなかったが、陽性対照群の場合、ＺＡＰ７０はリン酸化された（ｐ－ＺＡＰ７０）ことが確認された。更に、ｈＩｇＧ４で処置した実験群の場合、リン酸化されたＺＡＰ７０の量は、陽性対照群の量よりも少なかった。対照的に、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で処置した実験群の場合、測定された、リン酸化されたＺＡＰ７０の量は、陽性対照群の量と同等であった。

【0119】

実施例７．２． ＮＦＡＴ転写因子の発現レベルの増加の確認
ＮＦＡＴ及びＣＥＡＣＡＭ１を発現するジャーカット細胞を調製するために、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（１４００電圧／２０ｍｓ／２パルス）を使用して、細胞数が３×１０^６個である、実施例７．１で調製されたＣＥＡＣＡＭ１を発現するジャーカット細胞を、１０μｇのｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］及び１μｇのｐＴｕｒｂｏ ＲＦＰ－Ｃプラスミドでトランスフェクトした。７２時間後、トランスフェクトされたジャーカット細胞を採取し、フローサイトメータ（ＦＡＣＳＡｒｉａ）を使用して、ＲＦＰを発現するジャーカット細胞を選別した。選別されたジャーカット細胞を、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ８１６８）及び０．５ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０６８７０１０）を含有する培養培地で培養した。特に、実施例７．１で使用された同じ培養培地を使用した。

【0120】

ＮＦＡＴ及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を、１つのウェル当たり３×１０^６個の細胞の細胞数で分注し、ｈＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４６３９）又は抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で処置し、次いで、０．０５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６－００３７－８５）で刺激した。特に、ｈＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ４６３９）又は抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体を、３０μｇ／ｍＬの濃度から開始して３倍に連続的に希釈し、使用した。２４時間後、１００μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６１０）で処置した。その後、ＧｌｏＭａｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒマルチモードマイクロプレートリーダを使用して、蛍光を測定した。

【0121】

特に、抗ＣＤ３抗体で刺激し、ｈＩｇＧ４で処置した、ＮＦＡＴ及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を対照群として設定し、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で処置した、ＮＦＡＴ及びＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を実験群として設定した。

【0122】

結果として、図１４に示されるように、蛍光強度は、実験群において濃度依存的に増加したが、この結果から、ＮＦＡＴの発現レベルが増加したことが確認された。

【0123】

実施例７．３． ＩＬ－２発現レベルの増加の確認
まず、９６ウェルプレートを４℃で１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３）で一晩コーティングした。細胞を加える前に、各ウェルを冷たいＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、実施例７．１で調製したＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を各ウェルに１×１０^５個の細胞数で分注し、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体の各々２００μＬを１０μｇ／ｍＬの濃度で各ウェルに加え、３日間培養した。その後、上清を収集し、ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５０６１１）を使用して、ＩＬ－２の発現レベルを測定した。

【0124】

特に、抗ＣＤ３抗体で刺激し、ｈＩｇＧ４で処置した、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を対照群として設定し、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体で処置した、ＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現するジャーカット細胞を実験群として設定した。

【0125】

結果として、図１５に示されるように、実験群におけるＩＬ－２発現レベルは、対照群と比較して有意に増加したことが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

2023501387000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-07-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位に対応するアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープであって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、立体配座エピトープ。

【請求項2】

前記ＣＥＡＣＡＭ１が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の立体配座エピトープ。

【請求項3】

６３番目の前記アミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、６４番目の前記アミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、６６番目の前記アミノ酸がセリン（Ｓｅｒ）であり、６８番目の前記アミノ酸がチロシン（Ｔｙｒ）であり、７５番目の前記アミノ酸がグリシン（Ｇｌｙ）であり、７６番目の前記アミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）であり、７８番目の前記アミノ酸がグルタミン（Ｇｌｎ）であり、８３番目の前記アミノ酸がアラニン（Ａｌａ）であり、８６番目の前記アミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）であり、９０番目の前記アミノ酸がスレオニン（Ｔｈｒ）であり、１２３番目の前記アミノ酸がグルタミン（Ｇｌｎ）であり、１２５番目の前記アミノ酸がイソロイシン（Ｉｌｅ）であり、１２９番目の前記アミノ酸がロイシン（Ｌｅｕ）であり、１３１番目の前記アミノ酸がアスパラギン（Ａｓｎ）である、請求項１に記載の立体配座エピトープ。

【請求項4】

ＣＥＡＣＡＭ１のアミノ酸位置６３、６４、６６、６８、７５、７６、７８、８３、８６、９０、１２３、１２５、１２９及び１３１のアミノ酸を含む、請求項１に記載の立体配座エピトープ。

【請求項5】

ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープに特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片であって、前記立体配座エピトープが、６３位、６４位、６６位、６８位、７５位、７６位、７８位、８３位、８６位、９０位、１２３位、１２５位、１２９位及び１３１位の前記アミノ酸並びにそれらの組合せからなる群から選択されるアミノ酸を含む、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項6】

ＣＥＡＣＡＭ１の３５～１４１位のアミノ酸の配列の４～６９個のアミノ酸からなる立体配座エピトープに特異的に結合する、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片であって、前記立体配座エピトープが、６３、６４、６６、６８、７５、７６、７８、８３、８６、９０、１２３、１２５、１２９及び１３１位の前記アミノ酸を含む、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項7】

分子間距離が４．５Å以内でＣＥＡＣＡＭ１に結合する、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項8】

ファンデルワールス、疎水結合又は静電結合によってＣＥＡＣＡＭ１に結合する、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項9】

ＣＥＡＣＡＭ１に対する結合親和性が１×１０^－８ＫＤ未満（Ｍ）である、請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片。

【請求項10】

請求項５に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド。

【請求項11】

請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載の発現ベクターが導入されている形質転換細胞。

【請求項13】

請求項１２に記載の形質転換細胞を培養するステップを含む、抗体又はその断片を作製するための方法。

【請求項14】

請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片を活性成分として含む抗がん剤。

【請求項15】

がんを予防又は処置するための組成物であって、請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片を含む、組成物。

【請求項16】

がんを予防又は処置するための医薬の調製のための、請求項５～９のいずれか一項に記載の抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体又はその断片の使用。

【国際調査報告】