▶ サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-18
(54)【発明の名称】操作された制御性Ｔ細胞の生成
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230111BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20230111BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20230111BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20230111BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230111BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230111BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20230111BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20230111BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20230111BHJP
C12N 5/0789 20100101ALN20230111BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20230111BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20230111BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20230111BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230111BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230111BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230111BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230111BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230111BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N9/12
A61K35/545
A61K35/28
A61K35/15 A
A61P37/06
C12N15/09 110
C12N5/0783
C12N5/0735
C12N5/0775
C12N5/0789
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N15/12
C07K19/00
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022526138
(86)(22)【出願日】2020-11-09
(85)【翻訳文提出日】2022-06-17
(86)【国際出願番号】 US2020059730
(87)【国際公開番号】W WO2021092581
(87)【国際公開日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】62/933,252
(32)【優先日】2019-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508241200
【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】コンウェイ，アンソニー
(72)【発明者】
【氏名】フォン，ヘレン
(72)【発明者】
【氏名】クォン，ジョージ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK07
4B050LL01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB08
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、制御性Ｔ細胞への分化能が向上した、遺伝子操作された哺乳類の幹細胞および前駆細胞を提供する。また、その製造方法および使用方法についても提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム内に異種配列を含む遺伝子操作された哺乳類細胞であって、異種配列は系列決定因子（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）をコードする導入遺伝子を含み、および系列決定因子は、細胞のＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞への分化を促進するか、または細胞のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞としての維持を促進する、哺乳類細胞。
【請求項2】
導入遺伝子の発現が遺伝子座の転写調節エレメントの制御下にあるように、異種配列がＴ細胞特異的な遺伝子座に組み込まれる、請求項１に記載の細胞。
【請求項3】
哺乳類細胞に（ｉ）異種配列および（ｉｉ）異種配列に隣接する第１相同領域（ＨＲ）および第２ＨＲを含む核酸構築物を接触させる工程であって、ここで、異種配列が導入遺伝子を含み、
第１および第２ＨＲが、哺乳類細胞のＴ細胞特異的遺伝子座またはゲノムのセーフハーバー遺伝子座における第１ゲノム領域（ＧＲ）および第２ＧＲとそれぞれ相同である、工程；および
Ｔ細胞特異的遺伝子座またはゲノムのセーフハーバー遺伝子座における第１ＧＲと第２ＧＲの間への異種配列の組み込みを可能にする条件下で細胞を培養する工程；
を含む、遺伝子操作された哺乳類細胞の製造方法。
【請求項4】
組み込みが、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタードメインヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって促進される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
核酸構築物が、レンチウイルス構築物、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物、プラスミド、ＤＮＡ構築物、またはＲＮＡ構築物である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
導入遺伝子がさらなるポリペプチドのコード配列を含み、ここで系列決定因子のコード配列とさらなるポリペプチドのコード配列が自己切断ペプチドをインフレームでコードする配列または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分断されている、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項7】
さらなるポリペプチドが別の系列決定因子、治療用タンパク質またはキメラ抗原受容体である、請求項６に記載の細胞または方法。
【請求項8】
異種配列が、Ｔ細胞特異的遺伝子座のエキソンに組み込まれ、かつ導入遺伝子のすぐ上流に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むかまたは導入遺伝子のすぐ上流にインフレームで自己切断ペプチドをコードする第２の配列を含む、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項9】
異種配列が、Ｔ細胞特異的遺伝子座が無傷のＴ細胞特異的遺伝子産物を発現し続けられるように、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドをコードする第２の配列のすぐ上流に、組み込み部位の下流に存在する全てのＴ細胞特異的遺伝子座のエキソン配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８に記載の細胞または方法。
【請求項10】
Ｔ細胞特異的遺伝子座がＴ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子座である、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項11】
異種配列がＴＲＡＣ遺伝子座のエキソン１、２または３に組み込まれる、請求項１０に記載の細胞または方法。
【請求項12】
導入遺伝子がＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、またはＴｈＰＯＫをコードする、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項13】
導入遺伝子がＦＯＸＰ３のコード配列およびＴｈＰＯＫのコード配列を含み、ここでこれら二つのコード配列はインフレームであり、かつ自己切断ペプチドをインフレームでコードする配列によって分断されている、請求項１２に記載の細胞または方法。
【請求項14】
細胞がヒト細胞である、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項15】
細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、リンパ系前駆細胞、またはＴ細胞前駆細胞から任意に選択される幹細胞または前駆細胞である、請求項１～１４の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項16】
細胞がＴ細胞、任意にはＴｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞から初期化される、請求項１５に記載の細胞または方法。
【請求項17】
細胞がＴｒｅｇ細胞である、請求項１～１４の何れか１項に記載の細胞。
【請求項18】
請求項１５または１６に記載の細胞を（ｉ）低用量のＩＬ－２、（ｉｉ）ＩＬ－７Ｒａ（ＣＤ２７）シグナル伝達阻害剤、（ｉｉｉ）ＣＣＲ７シグナル伝達阻害剤、を含む組織培養培地中で培養する工程を含む、請求項１７に記載のＴｒｅｇ細胞の製造方法。
【請求項19】
請求項１５または１６に記載の細胞を、ＭＳ５－ＤＬＬ１／４間質細胞；ＯＰ９またはＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞；またはＥｐＣＡＭ－ＣＤ５６＋間質細胞と共培養する工程を含む、請求項１７に記載のＴｒｅｇ細胞の製造方法。
【請求項20】
細胞が、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、
ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ遺伝子、
抗原の処理に関連するトランスポーター、
マイナー組織適合性抗原遺伝子、および
β２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、
から選択される遺伝子内にヌル変異を含む、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項21】
細胞が、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、シトクロムＰ４５０遺伝子またはカスパーゼ９遺伝子から任意に選択される自殺遺伝子を含む、前述の請求項の何れか１項に記載の細胞または方法。
【請求項22】
請求項１８または１９に記載の工程により生産される、遺伝子操作された哺乳類の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞。
【請求項23】
請求項１、２、６－１７および２０－２２の何れか１項に記載の細胞を患者に投与する事を含む、免疫抑制を必要とする患者を処置するための方法。
【請求項24】
免疫抑制を必要とする患者の処置における医薬の製造における、請求項１、２、６～１７、および２０～２２の何れか１項に記載の細胞の使用。
【請求項25】
免疫抑制を必要とする患者の処置における使用のための請求項１、２、６～１７、および２０～２２の何れか１項に記載の細胞。
【請求項26】
患者が自己免疫疾患を有する、請求項２３～２５の何れか１項に記載の使用のための方法、使用、または細胞。
【請求項27】
患者が組織移植を受けたことがある、または受ける予定である、請求項２３～２５の何れか１項に記載の使用のための方法、使用、または細胞。
【請求項28】
患者がヒトである、請求項２３～２７の何れか１項に記載の使用のための方法、使用、または細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は２０１９年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／９３３，２５２号の優先権を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
本願は２０１９年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／９３３，２５２号の優先権を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
【背景技術】
【0002】
背景
健康な免疫系とは、バランスのとれた免疫系の事である。適応性免疫にかかわる細胞としてはＢおよびＴリンパ球が含まれる。Ｔリンパ球には２つの一般的な種類がある－エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞および制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。Ｔｅｆｆ細胞にはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を含む。Ｔｅｆｆ細胞は抗原曝露後の細胞介在性免疫において中心的な役割を担う。Ｔｅｆｆ細胞およびその他の免疫細胞の重要な制御因子がＴｒｅｇ細胞であり、これは過剰な免疫応答および自己免疫を防ぐ（例えば、Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）１０，ａｒｔ．４３を参照。）
健康な免疫系とは、バランスのとれた免疫系の事である。適応性免疫にかかわる細胞としてはＢおよびＴリンパ球が含まれる。Ｔリンパ球には２つの一般的な種類がある－エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞および制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である。Ｔｅｆｆ細胞にはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を含む。Ｔｅｆｆ細胞は抗原曝露後の細胞介在性免疫において中心的な役割を担う。Ｔｅｆｆ細胞およびその他の免疫細胞の重要な制御因子がＴｒｅｇ細胞であり、これは過剰な免疫応答および自己免疫を防ぐ（例えば、Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）１０，ａｒｔ．４３を参照。）
【0003】
一部のＴｒｅｇ細胞は、胸腺で生成される；これらは内因性Ｔｒｅｇ細胞（ｎＴｒｅｇ細胞）または胸腺Ｔｒｅｇ細胞（ｔＴｒｅｇ細胞）として知られる。その他のＴｒｅｇ細胞は、抗原遭遇後に末梢で生成されるか、または細胞培養で生成され、誘導型Ｔｒｅｇ細胞（ｉＴｒｅｇ細胞）または適応型Ｔｒｅｇ細胞として知られている。Ｔｒｅｇ細胞は、特異的な細胞表面受容体が関与する細胞間接触や、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＩＬ－３５などの抑制性サイトカインの分泌を介して、寛容の誘導を含めて、その他の免疫細胞の増殖および活性化を積極的に制御する（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ－Ｖｉｌｌａｒ ａｎｄ Ｈａｆｌｅｒ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）１９：６６５－７３）。寛容の誘導に失敗すると自己免疫や慢性炎症を引き起こし得る。寛容性の喪失は、Ｔｒｅｇ細胞機能の欠陥やＴｒｅｇ細胞数の不足、またはＴｅｆｆ細胞の無反応または過剰な活性化によって引き起こされる（Ｓａｄｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）７：ｅ１０１１，ｄｏｉ：１０－１００２／ｃｔｉ２．１０１１）。
【0004】
近年では、疾患の処置のためのＴｒｅｇ細胞の使用が注目されている。自己免疫疾患を処置することを目的として、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能を亢進するための、養子細胞療法を含む多数のアプローチが探求されてきた。活性化した、および増殖させたＴｒｅｇ細胞集団を送達するＴｒｅｇ細胞移植は、Ｉ型糖尿病、皮膚エリテマトーデス、クローン病などの自己免疫疾患を患う患者、および臓器移植をした患者において試験されている（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ－Ｖｉｌｌａｒ，同上；Ｓａｆｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）９：３５４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
現在では、細胞療法のためのＴｒｅｇ細胞の供給源は成人または青年期の一次血液（例えば、全血またはアフェレーシス産物）および組織（例えば胸腺）のみである。これらの供給源からのＴｒｅｇ細胞の単離は侵襲的でかつ時間がかかるが、わずかな数のＴｒｅｇ細胞しか得られない。さらに、これらのサンプルから得たＴｒｅｇ細胞は天然にはポリクローナルであるため、その潜在的な免疫抑制反応においてばらつきが生じ得る。単純にＴｒｅｇ細胞の数を増やしても疾患の抑制に十分でないという証拠も存在する（ＭｃＧｏｖｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１７）８，ａｒｔ．１５１７）。ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲなどの抗原特異的部位を持つ操作されたモノクローナルなＴｒｅｇ細胞は自己免疫活性部位または臓器移植部位における免疫調節反応を増強し得る。遺伝子操作されたモノクローナルなＴｒｅｇ細胞を大量に、効率的に入手する事の必要性が依然存在している。
【課題を解決するための手段】
【0006】
概要
本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および前駆細胞を含む幹細胞の制御性Ｔ細胞への分化を促進するための方法および組成物を提供する。好ましい実施形態では、操作された制御性Ｔ細胞は養子細胞療法のために調製される。
本開示は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および前駆細胞を含む幹細胞の制御性Ｔ細胞への分化を促進するための方法および組成物を提供する。好ましい実施形態では、操作された制御性Ｔ細胞は養子細胞療法のために調製される。
【0007】
１つの態様では、本開示はゲノム内に異種配列を含む遺伝子操作された哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）を提供し、ここで異種配列は系列決定因子（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）（本明細書において系統誘導因子とも呼ぶ）をコードする導入遺伝子を含み、および系列決定因子は細胞のＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化およびＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞としての細胞の維持を促進する。いくつかの実施形態では、異種配列は、操作された細胞のゲノム内のセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１遺伝子座）に組み込まれる。その他の実施形態では、異種配列はＴ細胞特異的な遺伝子座、すなわちＴ細胞、例えばＴｒｅｇ細胞において特異的に発現される遺伝子を含む遺伝子座（例えば、ＦＯＸＰ３部位およびＨｅｌｉｏｓ部位）に組み込まれる；これらの実施形態では、導入遺伝子は当該遺伝子座における転写調節エレメントの制御下にあり得る。
【0008】
他の態様では、本開示は、遺伝子操作された哺乳類細胞の製造方法であって、以下：哺乳類細胞を（ｉ）異種配列および（ｉｉ）異種配列に隣接する第１相同領域（ＨＲ）および第２ＨＲを含む核酸構築物と接触させる工程であって、ここで異種配列が導入遺伝子を含み、第１および第２ＨＲが哺乳類細胞のＴ細胞特異的遺伝子座またはゲノムのセーフハーバー遺伝子座における第１ゲノム領域（ＧＲ）および第２ＧＲとそれぞれ相同である、工程；およびＴ細胞特異的遺伝子座またはゲノムのセーフハーバー遺伝子座における第１ＧＲと第２ＧＲの間への異種配列の組み込みを可能にする条件下で当該細胞を培養する工程、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、異種配列の組み込みはジンクフィンガーヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタードメインヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって促進される。いくつかの実施形態では、核酸構築物はレンチウイルス構築物、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物、プラスミド、ＤＮＡ構築物、またはＲＮＡ構築物である。
【0009】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子はさらなるポリペプチドのコード配列を含み、ここで系列決定因子のコード配列とさらなるポリペプチドのコード配列は、自己切断ペプチドをインフレームでコードする配列または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分断されている。特定の実施形態では、当該さらなるポリペプチドは別の系列決定因子、治療用タンパク質、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【0010】
いくつかの実施形態では、異種配列はＴ細胞特異的遺伝子座のエキソンに組み込まれ、かつ導入遺伝子のすぐ上流に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、または導入遺伝子のすぐ上流にインフレームで、自己切断ペプチドをコードする第２の配列を含む。さらなる実施形態では、異種配列は、Ｔ細胞特異的遺伝子座が無傷のＴ細胞特異的遺伝子産物を発現し続けられるように、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドをコードする第２の配列のすぐ上流に、組み込み部位の下流に存在する全てのＴ細胞特異的遺伝子座のエキソン配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態ではＴ細胞特異的遺伝子座はＴ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子座であり、および異種配列は任意にはＴＲＡＣ遺伝子座のエキソン１、２、または３に組み込まれる。
【0011】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子はＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、またはＴｈＰＯＫをコードする。さらなる実施形態では、導入遺伝子はＦＯＸＰ３のコード配列およびＴｈＰＯＫのコード配列を含み、ここでこれら二つのコード配列はインフレームであり、かつ自己切断ペプチドをインフレームでコードする配列によって分断されている。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、リンパ系前駆細胞、またはＴ細胞前駆細胞から任意に選択される幹細胞または前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＣＤ８＋Ｔ細胞）から初期化される（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）。いくつかの実施形態では、操作された細胞はＴｒｅｇ細胞である。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示は操作されたＴｒｅｇ細胞の製造方法であって、本明細書に記載の操作された幹細胞または前駆細胞を、（ｉ）低用量のＩＬ－２、（ｉｉ）ＩＬ－７Ｒａ（ＣＤ２７）シグナル伝達阻害剤（例えば抗体）、（ｉｉｉ）ＣＣＲ７シグナル伝達阻害剤（例えば抗体）、を含む組織培養培地中で培養する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は操作されたＴｒｅｇ細胞の製造方法であって、本明細書に記載の操作された幹細胞または前駆細胞を、ＭＳ５－ＤＬＬ１／４間質細胞；ＯＰ９またはＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞；またはＥｐＣＡＭ－ＣＤ５６＋間質細胞と共培養することを含む、方法を提供する。本開示はまた、これらの方法によって得られたＴｒｅｇ細胞を提供する。
【0014】
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ遺伝子、抗原の処理に関連するトランスポーター、マイナー組織適合性抗原遺伝子、およびβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、から選択される遺伝子内にヌル変異をさらに含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、操作された細胞はＨＳＶ－ＴＫ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、シトクロムＰ４５０遺伝子またはカスパーゼ９遺伝子から任意に選択される自殺遺伝子をさらに含む。
【0016】
本開示は、本明細書において提供する操作された細胞（例えば、操作されたＴｒｅｇ細胞）を患者に投与する事を含む、免疫抑制を必要とする患者（例えばヒト患者）を処置する方法をさらに提供する。また、免疫抑制を必要とする患者（例えばヒト患者）の処置における医薬の製造における本明細書の操作された細胞の使用、および免疫抑制を必要とする患者（例えばヒト患者）の処置における使用のための、本明細書の操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、患者は自己免疫疾患を有するか、組織移植を受けたことがある、もしくは受ける予定である。
【0017】
その他の本発明の特徴、目的および利点は、以下の発明の詳細な説明において明らかになる。しかし詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すものの、例示のためにのみ与えられており、限定するものでない事を理解されたい。本発明の範囲内での様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになるはずである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
図面の簡単な説明
【図1】図１は、１つ以上のＴｒｅｇ細胞決定（誘導）因子（「ＴＦ」）をコードする導入遺伝子をヒトＴＲＡＣ遺伝子のエキソン２に組み込むためのゲノム編集アプローチを示す模式図である。導入されるｍＲＮＡから産生されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はエキソン２の特異的部位（稲妻記号）において二本鎖切断を生成する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）６ベクターによって導入されたドナー配列は５’末端から３’にかけて以下を含む：相同領域１；自己切断ペプチドＴ２Ａのコード配列；第１ＴＦ、自己切断ペプチドＰ２Ａ、第２ＴＦ２、自己切断ペプチドＥ２Ａおよび第３ＴＦ３の融合物のコード配列；ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列；および相同領域２。相同領域はＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域に対して相同である。組み込み部位の上流のＴＲＡＣ２部分、Ｔ２Ａコード配列、およびＴＦコード配列はそれぞれインフレームである。このアプローチでは、導入遺伝子の組み込みの結果として、ＴＲＡＣタンパク質の発現はノックアウトされる。組み込まれた配列の発現は内因性ＴＣＲアルファ鎖プロモーターによって制御される。
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【図10】図１０はｉＰＳＣをＴｒｅｇ細胞へと分化させるための複数の工程を示した模式図である。細胞は、リンパ球分化用コーティング剤（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｏａｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌ）上で培養するか（フィーダー細胞非依存）、またはＯＰ９間質細胞もしくはＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞（Ｎｏｔｃｈ ｌｉｇａｎｄ， Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ１を発現するＯＰ９細胞）間質細胞と共に培養する（フィーダー細胞依存）。細胞は、Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進するために、図８に示すようにさらに培養される。別の経路では、ｉＰＳＣをＭＳＳ－ＤＬＬ１／４またはＥｐＣＡＭ－ＣＤ５６＋間質細胞と共培養する事で３次元胚性中胚葉オルガノイド（ＥＭＯ）が形成される；ＥＭＯの造血系への誘導後、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）が形成され、その形成は胸腺で選択を受けたＴｒｅｇ細胞により近いＴＣＲレパトアを持つ成熟Ｔｒｅｇ細胞を生成するために誘導される。
【0028】
【0029】
【図12】図１２は、ナイーブ制御性、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するｉＰＳＣ（まとめてＴｉＰＳＣ）および３４＋細胞に由来するｉＰＳＣ間の、Ｔ細胞を生成する能力を比較したグラフのパネルである。パネルＡはＴｉＰＳＣおよびＣＤ３４由来ｉＰＳＣにおいて、分化の間でＣＤ３およびＴＣＲαβを共発現する生存／単細胞の割合を示す。パネルＢはｉＰＳＣから分化するＴ細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲαβの発現を示す代表的なフローサイトメトリープロットのパネルである。各ｉＰＳＣ株のＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞に由来する細胞の種類とその割合（パネルＣ）および生存／単細胞に由来する細胞の種類とその割合（パネルＤ）についても調べた。ＣＤ４ｓｐ：ＣＤ４シングルポジティブ。ＣＤ８ｓｐ：ＣＤ８シングルポジティブ。ＤＮ：ダブルネガティブ（ＣＤ４ーＣＤ８ー）。ＤＰ：ダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）。統計的有意性は、Ｗｅｌｃｈの補正を用いて対応の無いｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）をによって決定した。アスタリスクは統計的に有意であることを示す。
【0030】
【図13-1】図１３Ａは、図２に示したアプローチにおいてＴＲＡＣ遺伝子座のエキソン２が編集されたｉＰＳＣ株由来のＴ細胞における、ＦＯＸＰ３遺伝子および抗ＨＬＡ－Ａ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を示すフローサイトメトリープロットのパネルである。導入遺伝子はＦＯＸＰ３／Ｈｅｌｉｏｓ／ＣＡＲ、ＦＯＸＰ３／ＣＡＲ、ＦＯＸＰ３、またはＧＦＰである。
【図13-2】同上。
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
詳細な説明
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、際限なく増殖し、およびヒト生体内の任意の種類の細胞を生み出す事が可能である。ＰＳＣ（例えば、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞）は、医療用の多数の分化した細胞を製造するための理想的な出発材料の代表である。本開示は、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）などのＰＳＣからＴｒｅｇ細胞を生成する方法を提供する。また、本開示には中胚葉前駆細胞、造血幹細胞、およびリンパ系前駆細胞などの多分化能細胞からＴｒｅｇ細胞を生成する方法を含む。多分化能幹細胞および組織前駆細胞を含む多分化能細胞は、多能性細胞と比べて、異なる細胞種へと分化する能力が限定的である。
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、際限なく増殖し、およびヒト生体内の任意の種類の細胞を生み出す事が可能である。ＰＳＣ（例えば、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞）は、医療用の多数の分化した細胞を製造するための理想的な出発材料の代表である。本開示は、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）などのＰＳＣからＴｒｅｇ細胞を生成する方法を提供する。また、本開示には中胚葉前駆細胞、造血幹細胞、およびリンパ系前駆細胞などの多分化能細胞からＴｒｅｇ細胞を生成する方法を含む。多分化能幹細胞および組織前駆細胞を含む多分化能細胞は、多能性細胞と比べて、異なる細胞種へと分化する能力が限定的である。
【0033】
本方法において、幹細胞および／または前駆細胞は遺伝子操作され、Ｔｒｅｇ細胞系列決定因子（例えばＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、Ｉｋａｒｏｓ）および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞系列決定因子（例えばＧａｔａ３およびＴｈＰＯＫ）を過剰発現する（すなわち細胞が通常発現するよりも高いレベルで発現する）。これらの因子は、操作された幹細胞および／または前駆細胞のＴｒｅｇ細胞への分化を容易にする。これらの因子はＴｒｅｇ細胞への分化過程の全体または一部の期間にわたって構成的に過剰発現される；またはＴｒｅｇ細胞への分化過程の特定の期間中に誘導的に発現され得る（例えば、ドキシサイクリン誘導性ＴｅｔＲ介在遺伝子発現によって）。
【0034】
いくつかの実施形態では、決定因子は、幹細胞または前駆細胞のゲノムに無作為に組み込まれる導入遺伝子によってコードされる（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンを使用することで）。
【0035】
あるいは、決定因子は、幹細胞または前駆細胞のゲノムに部位特異的なやりかたで組み込まれる導入遺伝子によってコードされる。例えば、導入遺伝子は、ゲノムのセーフハーバー部位、または、Ｔ細胞受容体アルファ鎖定常領域（すなわち、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域またはＴＲＡＣ）遺伝子などのＴ細胞特異的遺伝子のゲノム遺伝子座に組み込まれる。前者のアプローチでは、導入遺伝子は任意にはＴ細胞特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターの転写制御下に置かれ得る。後者のアプローチでは、導入遺伝子はＴ細胞特異的遺伝子の内因性プロモーターおよびその他の転写調節エレメント（例えばＴＣＲアルファ鎖プロモーター）の制御下で発現され得る。導入遺伝子をＴ細胞特異的プロモーターの制御下に置く利点は、導入遺伝子が意図される通りにＴ細胞においてのみ発現され、それにより操作された細胞の臨床的な安全性が向上する事である。
【0036】
いくつかの実施形態では、本方法はこの分化をさらに促進する組織培養工程をさらに含み得る。
【0037】
制御性Ｔ細胞は、免疫の恒常性を維持し、および免疫寛容をもたらす。操作されたＴｒｅｇ細胞は、自己または同種で有り得、臓器移植または同種細胞療法を受けた患者、または自己免疫疾患を患う患者など、免疫寛容の誘導または免疫恒常性の回復を必要とする患者を処置するための細胞ベースの治療法において使用され得る。本発明のＴｒｅｇ細胞は、モノクローナルであることができ、従来のＴｒｅｇ細胞療法におけるポリクローナルであることに起因するばらつきを避ける事ができるため、改善された治療有効性を有する。さらにＴｒｅｇ細胞をその抗原特異性に基づいて選択し得る。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ部位における抗原に対して特異的なＴＣＲまたは編集により組み込まれたＣＡＲの発現について選択され得、ここで当該ｉｎｖｉｖｏ部位は、該ＴＣＲまたはＣＡＲがＴｒｅｇ細胞を向かわせ、よって細胞の効力を増強し得るように、Ｔｒｅｇ細胞が望まれる部位（例えば、炎症部位）である。
【0038】
Ｉ．ＣＤ４
＋
Ｔｒｅｇ細胞決定因子をコードする導入遺伝子。
前駆細胞またはｉＰＳＣなどの幹細胞のＴｒｅｇ細胞への分化を促進するために、細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞へのおよび最終的にはＴｒｅｇ細胞への前駆細胞または幹細胞の系列決定を促進する１以上のタンパク質を発現するように操作される。本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」、「制御性Ｔリンパ球」および「Ｔｒｅｇ細胞」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、かつ一般にＴエフェクター細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御するＴ細胞の亜集団を意味する。Ｔｒｅｇ細胞の表現型は免疫抑制機能に必須の遺伝子ネットワークの発現を制御するマスター転写因子であるフォックスヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現に一部依存している（例えばＦｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００３）４（４）：３３０－６を参照）。Ｔｒｅｇ細胞はしばしばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＦＯＸＰ３＋の表現型で表される。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はまたＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、Ｈｅｌｉｏｓ＋、および／またはＧＩＴＲ＋である。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏで表される。
前駆細胞またはｉＰＳＣなどの幹細胞のＴｒｅｇ細胞への分化を促進するために、細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞へのおよび最終的にはＴｒｅｇ細胞への前駆細胞または幹細胞の系列決定を促進する１以上のタンパク質を発現するように操作される。本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」、「制御性Ｔリンパ球」および「Ｔｒｅｇ細胞」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、かつ一般にＴエフェクター細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御するＴ細胞の亜集団を意味する。Ｔｒｅｇ細胞の表現型は免疫抑制機能に必須の遺伝子ネットワークの発現を制御するマスター転写因子であるフォックスヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現に一部依存している（例えばＦｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００３）４（４）：３３０－６を参照）。Ｔｒｅｇ細胞はしばしばＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＦＯＸＰ３＋の表現型で表される。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はまたＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、Ｈｅｌｉｏｓ＋、および／またはＧＩＴＲ＋である。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏで表される。
【0039】
本方法では、Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進するために幹細胞または前駆細胞のゲノムに導入される導入遺伝子は、非限定的に、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、Ｈｅｌｉｏｓ、ＧＩＴＲ、Ｉｋａｒｏｓ、ＣＴＬＡ４、Ｇａｔａ３、Ｔｏｘ、ＥＴＳ１、ＬＥＦ１、ＲＯＲＡ、ＴＮＦＲ２、およびＴｈＰＯＫの内の１以上をコードするものである。これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋおよびその他の周知の遺伝子データベースから入手できる。これらのタンパク質の内の１以上の発現は分化の間において幹細胞または前駆細胞をＴｒｅｇ細胞へと分化する運命に拘束する（ｃｏｍｍｉｔ）事を助ける。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はＴｒｅｇ細胞系列決定因子ＦＯＸＰ３および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞系列決定因子ＴｈＰＯＫをコードする（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （２００５）４３３（７０２８）：８２６－３３）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はＴｒｅｇ細胞の亜集団において発現されるＨｅｌｉｏｓをコードする（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）４９（３）：３９８－４１２）。
【0040】
いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の多分化能を増強する系列決定因子を過剰発現するように操作され得る（Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （２０１７）５４５（７６５５）：４３２－３８を参照）。これらの因子は、非限定的に、ＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、ＬＣＯＲ、ＨＯＸＡ５、ＲＵＮＸ１、およびＭＹＢを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では幹細胞または前駆細胞は、ＨＳＣの多分化能を増強するために、操作される部位に特異的な転写抑制構築物（例えば、ＺＦＰ－ＫＲＡＢ、ＣＲＩＳＰＲｉなど）、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを介してＥＺＨＩを下方制御するように操作され得る。
【0042】
ＩＩ．決定因子をコードする導入遺伝子の組み込み
幹細胞または前駆細胞を遺伝子操作するために、目的の導入遺伝子を運ぶ異種ヌクレオチド配列を細胞に導入する。本明細書における「異種」という用語は、その配列が天然には生じないゲノム部位に配列が挿入されることを意味する。いくつかの実施形態では、異種配列はＴｒｅｇ細胞において特異的に活性なゲノム部位に導入される。このような部位の例は、Ｔ細胞受容体鎖（例えば、ＴＣＲアルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖、またはデルタ鎖）、ＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ、イプシロン、デルタ、またはガンマ鎖）、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ４、Ｉｋａｒｏｓ、ＴＮＦＲ２、またはＣＤ４をコードする遺伝子である。
幹細胞または前駆細胞を遺伝子操作するために、目的の導入遺伝子を運ぶ異種ヌクレオチド配列を細胞に導入する。本明細書における「異種」という用語は、その配列が天然には生じないゲノム部位に配列が挿入されることを意味する。いくつかの実施形態では、異種配列はＴｒｅｇ細胞において特異的に活性なゲノム部位に導入される。このような部位の例は、Ｔ細胞受容体鎖（例えば、ＴＣＲアルファ鎖、ベータ鎖、ガンマ鎖、またはデルタ鎖）、ＣＤ３鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ、イプシロン、デルタ、またはガンマ鎖）、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ４、Ｉｋａｒｏｓ、ＴＮＦＲ２、またはＣＤ４をコードする遺伝子である。
【0043】
例として、異種配列はゲノム内のＴＲＡＣアレルの１つまたは両方に導入される。ＴＲＡＣ遺伝子座のゲノム構造を図１および２に示す。ＴＲＡＣ遺伝子はＴＣＲアルファ鎖ＶおよびＪ遺伝子の下流である。ＴＲＡＣは３つのエキソンを含み、これらはＴＣＲアルファ鎖の定常領域に転写される。ヒトＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子配列およびエキソン／イントロン境界はＧｅｎｂａｎｋ ＩＤ ２８７５５または６９５５に見出すことができる。組み込みの標的部位は、例えばイントロン（例えばイントロン１または２）、ＴＲＡＣ遺伝子の最終エキソンの下流の領域、エキソン（例えば、エキソン１、２、または３）、またはイントロンとその隣接エキソンの接合部であり得る。
【0044】
図１および２は、遺伝子編集によってヒトＴＲＡＣ遺伝子座のエキソン２へと異種配列を標的化する２つの異なるアプローチを示す。両方のアプローチにおいて、導入遺伝子は、自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｔ２Ａ）によって分かたれた１以上のＴｒｅｇ細胞決定または誘導因子（例えばＦＯＸＰ３）を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＦＯＸＰ３導入遺伝子は、Ｔｒｅｇ細胞抑制性活性を増強するために、アセチル化される事が知られているリジン残基をアルギニン残基へと置換（例えば、Ｋ３１Ｒ、Ｋ２６３Ｒ、Ｋ２６８Ｒ）するために操作される（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）１８８（６）：２７１２－２１を参照）。
【0045】
図１に示すアプローチでは、操作された細胞におけるＴＣＲアルファ鎖の発現は異種配列の挿入によって妨害される。このアプローチでは、ゲノムに導入される異種配列は、５’から３’にかけて、（ｉ）自己切断ペプチドＴ２Ａのコード配列（または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列）、（ｉｉ）決定因子のコード配列、および（ｉｉｉ）ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）部位を含む。一旦組み込まれると、操作されたＴＲＡＣ遺伝子座は内因性プロモーターの下で決定因子を発現し、ここではＴ２Ａペプチドによって、第１決定因子から任意のＴＣＲアルファ鎖配列（すなわちエキソン１およびエキソン２の５’から組み込み部位までの部分によってコードされる任意のＴＣＲ可変ドメイン配列、および任意の定常領域配列）を取り除く事ができる。ＴＲＡＣ遺伝子は妨害されるので、操作された細胞において機能的なＴＣＲα鎖は産生できない。Ｐ２Ａのコード配列を導入遺伝子内に含むことで、操作された部位は全ての個々のＴｒｅｇ誘導因子を別々のポリペプチドとして発現し得る。このアプローチにおいて、幹細胞または前駆細胞は所望の抗原認識受容体（例えば目的の抗原を標的とするＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現するためにさらに操作され得る。
【0046】
図２に示すアプローチでは、異種配列は、５’から３’にかけて、（ｉ）３’から組み込み部位までのＴＲＡＣエキソン配列（すなわち、組み込み部位下流の残ったエキソン２配列、およびエキソン３配列全体）、（ｉｉ）自己切断ペプチドＴ２Ａ（またはＩＲＥＳ配列）のコード配列、（ｉｉｉ）１以上の決定因子のコード配列、および（ｉｖ）ポリＡ部位、を含み得る。異種配列にＴＲＡＣエキソン配列およびＴ２Ａを含むことで、無傷のＴＣＲアルファ鎖の産生が可能である。Ｐ２Ａを含むことで、決定因子を別々のポリペプチドとして産生し得る。ＴＣＲアルファ鎖、外因性に導入された決定因子の全ては内因性ＴＣＲアルファ鎖プロモーターの制御下で発現される。このアプローチは、再構成済みの自身のＴＣＲアルファおよびベータ鎖遺伝子座を有する成熟Ｔｒｅｇ細胞から初期化した操作されたｉＰＳＣに特に好適である（図７および以下の説明を参照）。このような遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化したＴｒｅｇ細胞は祖先のＴｒｅｇ細胞の抗原特異性を保持する。さらに、ＴＣＲシグナルは胸腺におけるＴ細胞およびＴｒｅｇ細胞の発達に統合的に関与しているため、ＴＣＲアルファ鎖の発現を保持することにより、Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞の分化が促進され得る。
【0047】
代替の実施形態では、導入遺伝子はＴＲＡＣエキソンよりもむしろＴＲＡＣイントロンに組み込まれ得る。例えば、導入遺伝子はエキソン２または３の上流のイントロンに組み込まれる。このような実施形態では、導入遺伝子を運ぶ異種配列は、５’から３’にかけて、スプライスアクセプター（ＳＡ）配列、１以上のＴｒｅｇ細胞決定因子をコードする導入遺伝子、およびポリＡ部位を含む。再構成されたＴＣＲアルファ鎖遺伝子を発現したい場合は、異種配列は、５’から３’にかけて、（ｉ）ＳＡ配列、（ｉｉ）異種配列組み込み部位の下流の任意のエキソン、（ｉｉｉ）自己切断ペプチドのコード配列またはＩＲＥＳ配列、（ｉｖ）１以上の決定因子をコードする導入遺伝子、および（ｖ）ポリＡ部位、を含み得る。一旦組み込まれると、ＳＡによって、無傷の（すなわち全長の）ＴＣＲアルファ鎖、自己切断ペプチド、および決定因子をコードするＲＮＡ転写産物の発現が可能である。このＲＮＡ転写産物の翻訳によって、２つ（またはそれ以上）の別々のポリペプチド産物－無傷のＴＣＲアルファ鎖および１以上の決定因子、を得られることになる。ＳＡ配列の例は、ＴＲＡＣエキソンのＳＡおよびその他の当分野で知られたＳＡ配列である。
【0048】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は操作された細胞のゲノムセーフハーバーに組み込まれる。ゲノムセーフハーバー部位には、非限定的に、ＡＡＶＳ１遺伝子座；ＲＯＳＡ２６遺伝子座；ＣＬＹＢＬ 遺伝子座；アルブミン、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４遺伝子座；および操作された細胞における内因性遺伝子がノックアウトされた遺伝子座（例えば、Ｔ細胞受容体アルファまたはベータ遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはβ２－マイクログロブリン遺伝子座）を含む。図３はこのようなアプローチを示す。この例では、異種配列はヒトＡＡＶＳ１遺伝子座の例えばイントロン１に組み込まれる。決定因子をコードする導入遺伝子の発現はドキシサイクリン誘導性プロモーターによって制御される。ドキシサイクリン誘導性プロモーターはＴｅｔ応答性エレメントの５ｍｅｒの反復を含み得る。組織培養培地にドキシサイクリンを導入すると、構成的に発現される誘導型のテトラサイクリン調節性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）がＴｅｔ応答性エレメント結合し、決定因子の転写が開始される。導入されるｍＲＮＡから産生されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はイントロン１の特定部位（稲妻記号）で二本鎖切断を生じる。プラスミドＤＮＡまたは線状化二本鎖ＤＮＡによって導入されるドナー配列は５’から３’にかけて、相同領域１、ＡＡＶＳ１エキソン１をスプライシングするためのスプライスアクセプター（ＳＡ）、自己切断ペプチド２Ａコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子コード配列、ポリＡシグナル配列、５’ゲノムインスレーター配列、ドキシサイクリン誘導性決定因子カセット、ＣＡＧＧプロモーターに駆動されるｒｔＴＡコード配列および続くポリＡ配列、そして３’ゲノムインスレーター配列および相同領域２を含む。ゲノムインスレーター配列は、それらの内側にある導入遺伝子が分化過程の間でエピジェネティックにサイレンシングされない事を確実にする。相同領域はＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域に対して相同である。標的化組み込み（ＴＩ）が成功した細胞を、培養培地にピューロマイシンを導入する事でポジティブに選択し得る。Ｔｒｅｇ細胞誘導因子の誘導性発現は、特定の因子が中胚葉、造血系、またはリンパ球の発達過程で毒性を示す可能性があるため、Ｔ細胞の発達過程でのみ因子をオンにしてＴｒｅｇ細胞系列へと分化を偏らせることは有利である。
【0049】
いくつかの実施形態では、異種配列はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原結合受容体の発現カセットを含む。図５および６はこのような実施形態の例を示す、図５において、異種配列は、プラスミドＤＮＡまたは線状化二本鎖ＤＮＡによって導入され、および５’から３’にかけて、相同領域１、ポリＡ部位を含み自身のプロモーターから駆動されるＣＡＲ発現カセット（ドナーに対してアンチセンス方向）、５’ＬｏｘＰ部位、ＡＡＶＳ１エキソン１をスプライシングするスプライスアクセプター、自己切断ペプチド２Ａコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子コード配列、自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫコード配列、ポリＡ部位、５’ゲノムインスレーター配列、ドキシサイクリン誘導性決定因子発現カセット、ＣＡＧＧプロモーターに駆動されるｒｔＴＡコード配列、２Ａペプチドを介してｒｔＴＡと連結した４－ヒドロキシ－タモキシフェン（４－ＯＨＴ）－誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼと続くポリＡ部位、３’ゲノムインスレーター配列、３’ＬｏｘＰ部位、および相同領域２を含む。ゲノムインスレーター配列は、それらの内側にある導入遺伝子が分化過程の間でエピジェネティックにサイレンシングされない事を確実にする。相同領域はＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域に対して相同である。標的化組み込み（ＴＩ）が成功した細胞を、培養培地にピューロマイシンを導入する事でポジティブに選択し得る。構成的に発現される４－ＯＨＴ－誘導型Ｃｒｅによって、培地に４－ＯＨＴを添加した後、ＬｏｘＰ部位間のカセット全体を切除できる。リコンビナーゼ介在性切除を受けていない細胞は依然ＨＳＶ－ＴＫを発現するため、組織培養培地にガンシクロビル（ＧＣＶ）を添加することでネガティブに選択（除去）することができる。ＧＣＶはＨＳＶ－ＴＫを発現する任意の細胞の細胞死をもたらす。このシステムによって、Ｔｒｅｇ誘導性カセットを完全に無痕で除去する一方で、操作されるＴｒｅｇ細胞における標的免疫抑制を可能にするために、ＣＡＲカセットは組み込んだままにしておくことができる。
【0050】
図６は、操作されたＴＲＡＣ遺伝子からのＣＡＲの発現を示す。この例では、異種配列はプラスミドＤＮＡまたは線状化二本鎖ＤＮＡによって導入され、５’から３’にかけて、相同領域１、ＣＡＲコード配列に直接融合した２Ａコード配列と続くポリＡ部位、５’ＬｏｘＰ部位、５’ゲノムインスレーター配列、ＡＡＶＳ１エキソン１をスプライシングするスプライスアクセプター、２Ａコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子コード配列にさらに２Ａペプチドで連結した自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫコード配列（ここで両者は自身のプロモーターで駆動され、およびポリＡシグナル配列が続く）、ドキシサイクリン誘導性Ｔｒｅｇ細胞誘導因子発現カセット、ＣＡＧＧプロモーターに駆動されるｒｔＴＡコード配列、２Ａペプチドを介してｒｔＴＡ配列と連結した４－ＯＨＴ－誘導型Ｃｒｅリコンビナーゼと続くポリＡ配列、３’ゲノムインスレーター配列、３’ＬｏｘＰ部位、および相同領域２を含む。ゲノムインスレーター配列は、それらの内側にある導入遺伝子が分化過程の間でエピジェネティックにサイレンシングされない事を確実にする。相同領域はＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域に対して相同である。標的化組み込み（ＴＩ）が成功した細胞を、培養培地にピューロマイシンを導入する事でポジティブに選択し得る（任意には、組み込まれていないドナーエピソームが希釈されるまで１週間またはそれ以上待つ）。構成的に発現される４－ＯＨＴ－誘導型Ｃｒｅによって、培地に４－ＯＨＴを添加した後、ＬｏｘＰ部位間のカセット全体を切除できる。リコンビナーゼ介在性切除を受けていない細胞は依然ＨＳＶ－ＴＫを発現するため、組織培養培地にＧＣＶを添加することでネガティブに選択（除去）することができる。このシステムによって、Ｔｒｅｇ誘導性カセットを完全に無痕で除去する一方で、操作されたＴｒｅｇ細胞における標的免疫抑制を可能にするために、内因性ＴＲＡＣプロモーターに駆動されるＣＡＲカセットは組み込んだままにしておくことができる。
【0051】
図１１は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターによって駆動される、各々がＶＰＨ活性化ドメインまたはＫＲＡＢ阻害ドメインとそれぞれ融合したｄｅａｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）または阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）ライブラリーのいずれをヒトＡＡＶＳ１遺伝子のイントロン１に組み込むためのゲノム編集アプローチを示した模式図である。培養培地にドキシサイクリンを導入すると、構成的に発現される誘導型のテトラサイクリン調節性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）がＴｅｔ応答性エレメント結合し、組み込まれたＣＲＩＳＰＲａまたはＣＲＩＳＰＲｉ構築物の転写が開始される。これらのライブラリーはヒトゲノムにおける全てのコード遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含むが、ｄＣａｓ９－ｇＲＮＡ構築物は細胞当たり最大で１つまたは２つのみ組み込まれる（モノ－またはｂ－アレル標的化組み込み）。導入されるｍＲＮＡから産生されるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）はイントロン１の特定部位（稲妻記号）で二本鎖切断を生じる。プラスミドＤＮＡまたは線状化二本鎖ＤＮＡによって導入されるドナー配列は、５’から３’にかけて、相同領域１、ＡＡＶＳ１エキソン１をスプライシングするためのスプライスアクセプター（ＳＡ）、自己切断ペプチド２Ａコード配列、ピューロマイシン耐性遺伝子コード配列、ポリＡシグナル配列、５’ゲノムインスレーター配列、ドキシサイクリン誘導性ＣＲＩＳＰＲａまたはＣＲＩＳＰＲｉ構築物ライブラリー、ＣＡＧＧプロモーターに駆動されるｒｔＴＡコード配列および続くポリＡ配列、３’ゲノムインスレーター配列および相同領域２を含む。ゲノムインスレーター配列は、それらの内側にある導入遺伝子が分化過程の間でエピジェネティックにサイレンシングされない事を確実にする。相同領域はＺＦＮ切断部位に隣接するゲノム領域に対して相同である。標的化組み込み（ＴＩ）が成功した細胞を、培養培地にピューロマイシンを導入する事でポジティブに選択し得る。ＣＲＩＳＰＲａまたはＣＲＩＳＰＲｉ構築物の誘導性発現は、ライブラリー中における標的となる特定の遺伝子の上方制御または下方制御が中胚葉、造血系、またはリンパ球の発達過程で毒性を示すことがあるため、Ｔ細胞の発達過程（Ｔ細胞前駆細胞の段階の後）でのみ因子をオンまたはオフにしてＴｒｅｇ細胞系列へと分化を偏らせることは有利であり、新規のＴｒｅｇ細胞誘導因子および経路が見出され得る。
【0052】
上記で説明した図面は本発明のいくつかの実施形態を例示するのみである。例えば、図面で示したＴ２ＡおよびＰ２Ａの代わりにその他の自己切断ペプチドを使用してもよい。自己切断ペプチドは典型的には１８－２２アミノ酸長のウイルス由来ペプチドである。自己切断２ＡペプチドにはＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａを含む。さらに、コドンを多様化させたバージョンの２Ａペプチドを、１つの大きな組み込まれる導入遺伝子カセット上の複数のＴｒｅｇ誘導遺伝子と組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドのコード配列の代わりにＩＲＥＳが使用される。イントロンおよびエキソン両者共に標的となり得る。異種配列にはさらなるエレメントが含まれ得る。例えば、異種配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）などのＲＮＡ安定化エレメントを含み得る。
【0053】
ＩＩＩ．遺伝子編集技術
異種配列を特定のゲノム部位へと標的化組み込みするための任意の遺伝子編集技術が使用され得る。導入遺伝子の部位特異的な組み込みの正確性を高めるために、異種配列を運ぶ構築物は、標的ゲノム部位に対して相同である相同性領域を、自身の一端、または両端に含み得る。いくつかの実施形態では、異種配列はその５’および３’末端領域の両方に、Ｔ細胞特異的遺伝子座またはゲノムセーフハーバー遺伝子座における標的ゲノム部位に対して相同な配列を有する。異種配列中の相同領域の長さは、例えば、５０－１０００塩基対の長さであり得る。異種配列中の相同領域は、標的ゲノム配列と同一であり得るが、そうである必要はない。例えば、異種配列中の相同領域は、標的ゲノム配列（例えば、異種配列中の相同領域によって交換される配列）に対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上）相同であるか、または同一である。さらなる実施形態では、直鎖状の場合、構築物は一端に相同領域１、およびもう一端に相同領域２を含み、ここで、相同領域１および２は、ゲノム中の組み込み部位を挟むゲノム領域１およびゲノム領域２に対してそれぞれ相同である。
異種配列を特定のゲノム部位へと標的化組み込みするための任意の遺伝子編集技術が使用され得る。導入遺伝子の部位特異的な組み込みの正確性を高めるために、異種配列を運ぶ構築物は、標的ゲノム部位に対して相同である相同性領域を、自身の一端、または両端に含み得る。いくつかの実施形態では、異種配列はその５’および３’末端領域の両方に、Ｔ細胞特異的遺伝子座またはゲノムセーフハーバー遺伝子座における標的ゲノム部位に対して相同な配列を有する。異種配列中の相同領域の長さは、例えば、５０－１０００塩基対の長さであり得る。異種配列中の相同領域は、標的ゲノム配列と同一であり得るが、そうである必要はない。例えば、異種配列中の相同領域は、標的ゲノム配列（例えば、異種配列中の相同領域によって交換される配列）に対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上）相同であるか、または同一である。さらなる実施形態では、直鎖状の場合、構築物は一端に相同領域１、およびもう一端に相同領域２を含み、ここで、相同領域１および２は、ゲノム中の組み込み部位を挟むゲノム領域１およびゲノム領域２に対してそれぞれ相同である。
【0054】
異種配列を運ぶ構築物は、任意の周知技術、例えば、化学的手法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、およびリポフェクション）、非化学的手法（例えば、エレクトロポレーション法およびセルスクイーズ（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ））、微粒子ベースの方法（例えばマグネトフェクション）、およびウイルストランスダクション（例えば、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、およびハイブリッドウイルスベクター）によって標的細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、構築物はＡＡＶウイルスベクターであり、この構築物をゲノム中に含む組み換えＡＡＶビリオンによって標的ヒト細胞に導入され、ここで構築物は、昆虫細胞／バキュロウイルス生産システムおよび哺乳類細胞生産システム等の生産システムにおけるＡＡＶビリオンの生産を可能にするために、その両端にＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を有する事を含む。ＡＡＶは、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶｒｈ１０などの任意のセロタイプであり得、またはＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、またはＡＡＶ２／６などのシュードタイプであり得る。
【0055】
異種配列は、任意の部位特異的な遺伝子ノックイン技術によってＴＲＡＣゲノム遺伝子座に組み込まれ得る。このような技術には、非限定的に、相同組み換え、ならびにジンクフィンガーヌクレアーゼまたはニッカーゼ（本明細書では、まとめて「ＺＦＮ」とする）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはニッカーゼ（本明細書では、まとめて「ＴＡＬＥＮ」とする）、クラスター化規則的散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１を用いたものもの）、メガヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、およびトランスポザーゼに基づく遺伝子編集技術を含む。下記の実施例に示すように、部位特異的な遺伝子編集では、典型的には、編集ヌクレアーゼが標的ゲノム配列内にＤＮＡ切断（例えば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断）を生成し、標的ゲノム配列に対する相同性を有するドナーポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の構築物）が、当該ＤＮＡ切断の修復のための鋳型として用いられることで、当該ドナーポリヌクレオチドが当該ゲノム部位へと導入される。
【0056】
遺伝子編集技術は、当技術分野でよく知られている。例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術について、米国特許第８，６９７，３５９号、８，７７１，９４５号、８，７９５，９６５号、８，８６５，４０６号、８，８７１，４４５号、８，８８９，３５６号、８，８９５，３０８号、８，９０６，６１６号、８，９３２，８１４号、８，９４５，８３９号、８，９９３，２３３号、８，９９９，６４１号、９，７９０，４９０号、１０，０００，７７２号、１０，１１３，１６７号、および１０，１１３，１６７号を参照する。例えば、ＺＦＮ技術ならびにＴ細胞および幹細胞の編集におけるその応用について、米国特許第８，７３５，１５３号、８，７７１，９８５号、８，７７２，００８号、８，７７２，４５３号、８，９２１，１１２号、８，９３６，９３６号、８，９４５，８６８号、８，９５６，８２８号、９，２３４，１８７号、９，２３４，１８８号、９，２３８，８０３号、９，３９４，５４５号、９，４２８，７５６号、９，５６７，６０９号、９，５９７，３５７号、９，６１６，０９０号、９，７１７，７５９号、９，７５７，４２０号、９，７６５，３６０号、９，８３４，７８７号、９，９５７，５２６号、１０，０７２，０６２号、１０，０８１，６６１号、１０，１１７，８９９号、１０，１５５，０１１号、および１０，２６０，０６２号を参照する。前述の特許の開示は、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。
【0057】
遺伝子編集技術では、遺伝子編集複合体を、その複合体のＤＮＡ結合特異性を変更する事により、特異的なゲノム部位を標的とするように仕立てることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術では、ガイドＲＮＡ配列は、特異的なゲノム領域に結合するように設計され得る；ＺＦＮ技術では、ＺＦＮのヌクレアーゼまたはニッカーゼドメインが部位特異的な方法でゲノムＤＮＡを切断できるように、ＺＦＮのジンクフィンガータンパク質ドメインは、特異的なゲノム領域に特異的なジンクフィンガーを有するように設計され得る。所望のゲノム標的部位によって、遺伝子編集複合体はそれに合わせて設計され得る。
【0058】
遺伝子編集複合体の成分は、導入遺伝子構築物と同時にまたは逐次的に、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ヴィロソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡまたはｍＲＮＡ、および人工ビリオンといった周知の方法で標的細胞に送達される。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を用いたソノポレーションもまた、核酸の送達に用いられ得る。特定の実施形態では、ヌクレアーゼまたはニッカーゼを含む遺伝子編集複合体の１以上の成分は、ｍＲＮＡとして編集するべき細胞に送達される。
【0059】
ＩＶ．Ｔｒｅｇ細胞の抗原特異性
いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原認識受容体をコードする導入遺伝子を含むためにさらに操作される（例えば、本明細書に記載の遺伝子編集方法を用いて）。あるいは、幹細胞または前駆細胞は、自身のＴＣＲアルファ／ベータ（またはデルタ／ガンマ）遺伝子座がすでに再構成済みの成熟Ｔｒｅｇ細胞から初期化した細胞であり、およびこのような幹細胞および前駆細胞から再分化したＴｒｅｇ細胞はその祖先であるＴｒｅｇ細胞の抗原特異性を保持するはずである。いずれにしても、Ｔｒｅｇ細胞は、特定の治療目標のための目的の抗原に対する特異性について選択され得る。
いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、ＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原認識受容体をコードする導入遺伝子を含むためにさらに操作される（例えば、本明細書に記載の遺伝子編集方法を用いて）。あるいは、幹細胞または前駆細胞は、自身のＴＣＲアルファ／ベータ（またはデルタ／ガンマ）遺伝子座がすでに再構成済みの成熟Ｔｒｅｇ細胞から初期化した細胞であり、およびこのような幹細胞および前駆細胞から再分化したＴｒｅｇ細胞はその祖先であるＴｒｅｇ細胞の抗原特異性を保持するはずである。いずれにしても、Ｔｒｅｇ細胞は、特定の治療目標のための目的の抗原に対する特異性について選択され得る。
【0060】
いくつかの実施形態では、目的の抗原は、例えば固形臓器移植における細胞で発現する、または細胞ベースの治療における細胞（例えば、骨髄移植、がんＣＡＲ Ｔ療法、または細胞ベースの再生医療）で発現する、多型同種ＭＨＣ分子である。標的とされるＭＨＣ分子には、非限定的に、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ；ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、またはＨＬＡ－ＤＲを含む。例として、目的の抗原はクラスＩ分子ＨＬＡ－Ａ２である。ＨＬＡ－Ａ２は移植において一般にミスマッチする組織適合性抗原である。ＨＬＡ－Ａのミスマッチは、移植後の予後不良と関連する。ＭＨＣクラスＩ分子に特異的なＣＡＲを発現する操作されたＴｒｅｇ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子が全ての組織で広く発現するために、移植組織の種類を問わず、臓器移植に対して使用できるという利点がある。ＨＬＡ－Ａ２に対するＴｒｅｇ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２がヒト集団のほとんどの割合において発現しており、したがって、多くのドナーの臓器で発現しているというさらなる利点を供する。Ｔｒｅｇ細胞におけるＨＬＡ－Ａ２ＣＡＲの発現が、移植拒絶反応の予防におけるＴｒｅｇ細胞の効力を増強する事を示す証拠がある（例えば、Ｂｏａｒｄｍａｎ，同上；ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１６）１２６（４）：１４１３－２４；およびＤａｗｓｏｎ，同上、を参照）。
【0061】
いくつかの実施形態では、目的の抗原は自己抗原、すなわち、生体内の特定の組織における自己免疫性の炎症部位で優勢に、または固有に発現する内因性抗原である。このような抗原に特異的なＴｒｅｇ細胞は、炎症組織に帰巣し、局所的な免疫抑制を引き起こすことで組織特異的な活性を示し得る。自己抗原の例は、アクアポリン水チャネル（例えば、アクアポリン－４ 水チャネル）、傍腫瘍（ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）抗原Ｍａ２、アンフィフィジン、電位依存性カリウムチャネル、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）、ａ－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソキサゾールプロプリオン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）、甲状腺ペルオキシダーゼ、サイログロブリン、抗－Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＲ１サブユニット）、Ｒｈ血液型抗原、デスモグレイン１または３（Ｄｓｇｌ／３）、ＢＰ１８０、ＢＰ２３０、アセチルコリン・ニコチン性シナプス後受容体、チロトロピン受容体、血小板インテグリン、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、カルパスタチン、シトルリン化タンパク質、アルファ－ベータ－クリスタリン、胃壁細胞の内因性因子、ホスホリパーゼＡ２受容体１（ＰＬＡ２Ｒ１）、およびトロンボスポンジンタイプ１ドメイン含有７Ａ（ＴＨＳＤ７Ａ）である。自己抗原のさらなる例は、多発性硬化症関連抗原（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質（ＯＭＧＰ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１１）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン関連神経突起伸長阻害剤ＮＯＧＯ Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）、２’３’－サイクリックヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、およびその断片；関節関連抗原（例えば、シトルリンで置換された環状および直鎖状のフィラグリンペプチド、ＩＩ型コラーゲンペプチド、ヒト軟骨糖タンパク質３９ペプチド、ケラチン、ビメンチン、フィブリノゲン、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型コラーゲンペプチド）；および眼関連抗原（例えば、網膜アレスチン、Ｓ－アレスチン、光受容体間レチノイド結合タンパク質、β－クリスタリンＢｌ、網膜タンパク質、脈絡膜タンパク質、およびそれらのフラグメント）である。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞に標的とされる自己抗原はＩＬ２３－Ｒ（例えば、クローン病、炎症性腸疾患または関節リウマチの処置のため）、ＭＯＧ（多発性硬化症の処置のため）、またはＭＢＰ（多発性硬化症の処置のため）である。いくつかの実施形態ではＴｒｅｇ細胞はその他の目的の抗原（（例えば、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９およびＣＤ２０）を標的とし得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、同種抗原ではなく外来ペプチド（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびＨＳＶ）を認識するＴｒｅｇ細胞は、同種抗原を認識して恒常的に活性化する危険性が無く、ＴＣＲ発現のノックアウトを必要とせずに、同種養子細胞移植の場面で用いることができる。
【0063】
Ｖ．ゲノム編集に使用するための細胞
本開示の操作された細胞は、ヒト細胞、家畜（例えば、ウシ、ブタ、またはウマ）由来の細胞、およびペット（例えば、ネコまたはイヌ）由来の細胞、などの哺乳類細胞である。ソース（ｓｏｕｒｃｅ）細胞、すなわちゲノム編集が行われる細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）であり得る。ＰＳＣは生体内で任意の細胞種を生じさせることができる細胞であり、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体細胞核移植によって得られるＰＳＣ、および人工（ｉｎｄｕｃｅｄ）ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）を含む。ｉＰＳＣからＴ細胞への分化については、Ｉｒｉｇｕｃｈｉ およびＫａｎｅｋｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．（２０１９）１１０（１）：１６-２２を参照のこと。本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」という用語は、初期胚から得られる多能性幹細胞を指す；いくつかの実施形態では、この用語は、以前に確立された胚性幹細胞株から得られるＥＳＣを指し、ヒト胚の最近の破壊によって得られる幹細胞を含まない。
本開示の操作された細胞は、ヒト細胞、家畜（例えば、ウシ、ブタ、またはウマ）由来の細胞、およびペット（例えば、ネコまたはイヌ）由来の細胞、などの哺乳類細胞である。ソース（ｓｏｕｒｃｅ）細胞、すなわちゲノム編集が行われる細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）であり得る。ＰＳＣは生体内で任意の細胞種を生じさせることができる細胞であり、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体細胞核移植によって得られるＰＳＣ、および人工（ｉｎｄｕｃｅｄ）ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）を含む。ｉＰＳＣからＴ細胞への分化については、Ｉｒｉｇｕｃｈｉ およびＫａｎｅｋｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．（２０１９）１１０（１）：１６-２２を参照のこと。本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」という用語は、初期胚から得られる多能性幹細胞を指す；いくつかの実施形態では、この用語は、以前に確立された胚性幹細胞株から得られるＥＳＣを指し、ヒト胚の最近の破壊によって得られる幹細胞を含まない。
【0064】
その他の実施形態では、ゲノム編集のためのソース細胞は、中胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞（例えば、骨髄または臍帯血から単離されたもの）、または造血系前駆細胞（例えば、リンパ系前駆細胞）などの多分化能細胞である。多分化能細胞は１以上の細胞種に発達し得るが、多能性細胞よりも細胞種分化能は限定的である。多分化能細胞は確立された細胞株に由来するか、またはヒト骨髄もしくは臍帯から単離され得る。例として、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、顆粒球コロニー形成刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ）（Ｇ－ＣＳＦ）誘導による細胞動員、プレリキサフォー誘導による細胞動員またはその組み合わせ、に続いて患者または健康なドナーから単離され得る。血液または骨髄からＨＳＣを単離するために、血液または骨髄中の当該細胞を、ＣＤ４およびＣＤ８（Ｔ細胞）、ＣＤ４５（Ｂ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）に対する抗体などの、望ましくない細胞と結合する抗体でパンニングしてもよい（例えば、Ｉｎａｂａ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１６９３－１７０２を参照）。その後、ＨＳＣはＣＤ３４に対する抗体によってポジティブに選択され得る。
【0065】
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、非同種抗原を標的とするＴＣＲを発現する成熟Ｔｒｅｇ細胞などの、成熟Ｔｒｅｇ細胞から初期化されたｉＰＳＣである（（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１－７２））。図７および以下のさらなる記載を参照のこと。
【0066】
以下に詳述するように、編集された幹細胞および／または前駆細胞は患者に移植する前にｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇ細胞に分化させられ得る。あるいは幹細胞および／または編集された前駆細胞は、患者に移植された後でＴｒｅｇ細胞への分化が誘導され得る。
【0067】
１．さらなるゲノム編集
本願の操作された細胞は、より効果的に、より広範な患者集団に使用できるように、および／またはより安全にするために、上記のゲノム編集の前または後でさらに遺伝子操作され得る。この遺伝子操作は、例えば、目的の異種配列の無作為な挿入（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンを用いて）、または標的化ゲノム組み込み（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、部位特異的な操作されたリコンビナーゼ、またはメガヌクレアーゼ介在性ゲノム編集を用いて）によって行われる。
本願の操作された細胞は、より効果的に、より広範な患者集団に使用できるように、および／またはより安全にするために、上記のゲノム編集の前または後でさらに遺伝子操作され得る。この遺伝子操作は、例えば、目的の異種配列の無作為な挿入（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはトランスポゾンを用いて）、または標的化ゲノム組み込み（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、部位特異的な操作されたリコンビナーゼ、またはメガヌクレアーゼ介在性ゲノム編集を用いて）によって行われる。
【0068】
例えば、細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲ導入遺伝子の細胞のゲノムへの部位特異的な組み込みによって、１以上の外因性ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作され得る。外因性ＣＡＲまたはＴＣＲは、上記のように目的の抗原を標的とし得る。
【0069】
細胞はまた、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を促進する１以上の治療剤をコードするように編集され得る。治療剤の例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０）、ケモカイン（例えば、ＣＣＲ７）、成長因子（例えば、多発性硬化症の処置のための再ミエリン化因子）、およびシグナル伝達因子（例えば、アンフィレグリン）を含む。
【0070】
さらなる実施形態では、細胞は、サイトカイン放出症候群および／または神経毒性などの細胞療法の重篤な副作用および／または毒性を抑制する因子（例えば、抗ＩＬ－６ｓｃＦｖまたは分泌可能ＩＬ－１２）を発現するためにさらに操作される（例えば、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１４）２５７（１）：８３－９０を参照）。
【0071】
いくつかの実施形態では、操作された細胞において、それらのリンパ系への拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）を増強するために、ＥＺＨ１シグナルが妨害される（例えば、Ｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （２０１８）５５３（７６８９）：５０６－１０を参照）。
【0072】
いくつかの実施形態では、編集された細胞は患者の同種細胞であり得る。このような場合、これらの細胞への宿主の拒絶反応（移植拒絶反応）および／またはこれらの細胞の宿主への攻撃の可能性（移植片対宿主病）を抑制するために、細胞はさらに操作され得る。さらに操作された同種細胞は適合性の問題なしに複数の患者において使用することができるため特に有用である。よってこの同種細胞は、「ユニバーサル」と呼ばれ、かつ「既製品（ｏｆｆ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）」として使用され得る。「ユニバーサル」細胞を使用することで、養子細胞療法の効率を大きく向上させ、費用を削減することができる。
【0073】
「ユニバーサル」な同種細胞を生成するために、細胞は、例えば、以下の内の１つ以上について、ヌル遺伝子型を有するように操作され得る：（ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲアルファ鎖またはベータ鎖）；（ｉｉ）多型の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子、（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ；ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、またはＨＬＡ－ＤＲ；またはβ２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ））；（ｉｉｉ）抗原の処理に関連するトランスポーター（例えば、ＴＡＰ－１またはＴＡＰ－２）；（ｉｖ）クラスＩＩ ＭＨＣトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）；（ｖ）マイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ；例えば、ＨＡ－１／Ａ２、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－８、ＨＢ－１Ｈ、またはＨＢ－１Ｙ）；（ｖｉ）ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント阻害因子；および（ｖｉ）任意のその組み合わせ。
【0074】
同種の操作された細胞はまた、抗移植片拒絶反応に関与する宿主のナチュラルキラー細胞またはその他の免疫細胞に対する当該操作された細胞（特にＨＬＡクラスＩノックアウトまたはノックダウンのもの）の抵抗性を向上させるために、不変型（ｉｎｖａｒｉａｎｔ）ＨＬＡまたはＣＤ４７を発現し得る。例えば、決定因子の導入遺伝子を運ぶ異種配列は、不変型ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、およびＨＬＡ－Ｆ）またはＣＤ４７のコード配列をさらに含み得る。不変型ＨＬＡまたはＣＤ４７コード配列は、自己切断ペプチドのコード配列またはＩＲＥＳ配列を通じて異種配列内の第１の導入遺伝子と連結され得る。
【0075】
２．操作された細胞における安全性スイッチ
細胞療法において、移植される細胞が、患者におけるそれらの存在がもはや望ましくなくなった際に細胞増殖を停止できるように、そのゲノム内に「安全性スイッチ」を含む事が望ましいであろう（例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．（２０１７）９：１１８３－９７を参照）。例えば、安全性スイッチは自殺遺伝子であり得、これは、医薬化合物を患者に投与した際に細胞がアポトーシスへと移行するように、活性化または不活性化される。自殺遺伝子は、ヒト細胞内で無害な基質を有毒な代謝産物に変換する、ヒトにおいて見られない酵素（例えば、細菌またはウイルスの酵素）をコードし得る。
細胞療法において、移植される細胞が、患者におけるそれらの存在がもはや望ましくなくなった際に細胞増殖を停止できるように、そのゲノム内に「安全性スイッチ」を含む事が望ましいであろう（例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．（２０１７）９：１１８３－９７を参照）。例えば、安全性スイッチは自殺遺伝子であり得、これは、医薬化合物を患者に投与した際に細胞がアポトーシスへと移行するように、活性化または不活性化される。自殺遺伝子は、ヒト細胞内で無害な基質を有毒な代謝産物に変換する、ヒトにおいて見られない酵素（例えば、細菌またはウイルスの酵素）をコードし得る。
【0076】
いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子であり得る。ＴＫは、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ファムシクロビルまたは別の類似の抗ウイルス薬を、ＤＮＡ複製を阻害する毒性化合物へと代謝し、細胞のアポトーシスをもたらし得る。よって、このような抗ウイルス薬の内の１つを患者に投与する事で、宿主細胞におけるＨＳＶ－ＴＫ遺伝子をオンにし、細胞を傷害する事ができる。
【0077】
その他の実施形態では、自殺遺伝子は、例えば別のチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ（またはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｕｒａｃｉｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；これは抗真菌剤５－フルオロシトシンを５－フルオロウラシルに変換する酵素）、ニトロレダクターゼ（これはＣＢ１９５４［５－（アジリジン－１－イル）－２，４－ジニトロベンズアミド］を毒性化合物４－ヒドロキシルアミンに変換する）、およびシトクロムＰ４５０（これはイホスファミドをアクロレン（ナイトロジェンマスタード）に変換する）（Ｒｏｕａｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．（２０１７）１８（６）：Ｅ１２３１）、または誘導性カスパーゼ９（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１４）５：２５４）である。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は細胞内抗体、テロメラーゼ、別のカスパーゼ、またはＤＮＡａｓｅをコードし得る。例えば、Ｚａｒｏｇｏｕｌｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｓｙｎｄｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２０１３）ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５７－７４１２．１０００１３９を参照のこと。
【0078】
安全性スイッチは、「オン」、または「アクセラレーター（ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）」スイッチであり得、細胞の生存に必須な細胞タンパク質の発現を妨害する低分子干渉ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスであり得る。
【0079】
安全性スイッチには、任意の好適な哺乳類の、およびその他の必要な転写調節配列を利用し得る。安全性スイッチは、無作為な組み込みによって、または本明細書に記載の遺伝子編集技術もしくはその他の当分野で周知の技術を用いた部位特異的な組み込みによって細胞に導入され得る。操作された細胞の遺伝的安定性および臨床的安全性が維持されるように、安全性スイッチがゲノムセーフハーバーに組み込まれることは望ましいだろう。本開示で用いられるようなセーフハーバーの例は、ＡＡＶＳ１遺伝子座；ＲＯＳＡ２６遺伝子座；ＣＬＹＢＬ遺伝子座；アルブミン、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４遺伝子座；および操作された細胞において内因性遺伝子がノックアウトされた遺伝子座（例えば、Ｔ細胞受容体アルファまたはベータ鎖遺伝子座、ＨＬＡ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはβ２－マイクログロブリン遺伝子座）である。
【0080】
ＶＩ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の初期化および分化
本開示の細胞は、組織培養において、当分野で知られた方法を用いて、成熟Ｔｒｅｇ細胞から初期化され、および／またはＴｒｅｇ細胞へと分化され得る。以下に記載する方法は単に例示であり、限定するものではない。
本開示の細胞は、組織培養において、当分野で知られた方法を用いて、成熟Ｔｒｅｇ細胞から初期化され、および／またはＴｒｅｇ細胞へと分化され得る。以下に記載する方法は単に例示であり、限定するものではない。
【0081】
１．Ｔｒｅｇ細胞のｉＰＳＣへの初期化
ある実施形態では、遺伝子操作のソース細胞は成人、青年または胎児のＴｒｅｇ細胞から初期化された人工多能性幹細胞である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ （２００７）１３１（５）：８６１－７２）。これらの実施形態では、初期化した幹細胞は自身の元となるＴｒｅｇ細胞表現型のエピジェネティックな記憶を保持するであろうため（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （２０１０）４６７（７３１３）：２８５－９０）、異なる細胞種から初期化された幹細胞などのその他の幹細胞よりも高い効率でＴｒｅｇ細胞に再分化し得る。Ｔｒｅｇ細胞から初期化した幹細胞はまた、Ｖ（Ｄ）Ｊ－再構成がなされたＴＣＲ遺伝子座も保持し、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えはＴ細胞の個体発生期間における発達のハードルであるため、幹細胞のＴｒｅｇ細胞への分化可能性をさらに向上させ得る（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ （２０１３）１２（１）：１１４－２６を参照）。
ある実施形態では、遺伝子操作のソース細胞は成人、青年または胎児のＴｒｅｇ細胞から初期化された人工多能性幹細胞である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ （２００７）１３１（５）：８６１－７２）。これらの実施形態では、初期化した幹細胞は自身の元となるＴｒｅｇ細胞表現型のエピジェネティックな記憶を保持するであろうため（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （２０１０）４６７（７３１３）：２８５－９０）、異なる細胞種から初期化された幹細胞などのその他の幹細胞よりも高い効率でＴｒｅｇ細胞に再分化し得る。Ｔｒｅｇ細胞から初期化した幹細胞はまた、Ｖ（Ｄ）Ｊ－再構成がなされたＴＣＲ遺伝子座も保持し、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えはＴ細胞の個体発生期間における発達のハードルであるため、幹細胞のＴｒｅｇ細胞への分化可能性をさらに向上させ得る（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ （２０１３）１２（１）：１１４－２６を参照）。
【0082】
初期化に用いるＴｒｅｇ細胞は、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、または脾臓組織など、多くの供給源から単離され得る。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離、赤血球の溶解および単球の除去に続くＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離、逆流遠心分離による水簸、白血球アフェレーシス、およびその後の細胞表面マーカーベースの磁気またはフローサイトメトリーによる単離、などの周知の技術を用いて対象から回収した血液単位から単離され得る。
【0083】
フローサイトメトリー細胞選択および／またはコンジュゲートしたビーズを用いた磁気免疫粘着（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）などの技術を用いた、固有の表面マーカー指向性の抗体の組み合わせによるポジティブおよび／またはネガティブな選択によって、単離された白血球細胞からＴｒｅｇ細胞をさらに濃縮し得る。例えば、ネガティブな選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するためにモノクローナル抗体のカクテルには、典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含み得る。Ｔｒｅｇ細胞の濃縮またはポジティブな選択には、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲ、および／またはＣＤ１２７に対する抗体が使用され得る。
【0084】
例示的および非限定的なプロトコルにおいて、Ｔｒｅｇ細胞は以下のようにして取得され得る（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．（２０１９）４（６）：ｅ１２３６７２を参照）。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１５０６２）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトのドナーから単離し、そしてＣＤ２５＋細胞を濃縮し、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０９２－９８３）その後、ＭｏＦｌｏ Ａｓｔｒｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、生存ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ Ｔｒｅｇ細胞またはＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏＣＤ２５ｈｉＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ細胞を選別する。選別されたＴｒｅｇ細胞は、ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１６）１２６（４）：１４１３－２４に記載のように、１０００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を添加したＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増殖培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０９８１）中で、Ｌ細胞および抗ＣＤ３モノクローナル抗体（例えば、ＯＫＴ３、ＵＢＣ ＡｂＬａｂ；１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激され得る。１日以上経過後、このＴｒｅｇ細胞を、下記に記載するように幹細胞へと初期化（脱分化）し得る。表現型分析のために、細胞は、ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ （ＦＶＤ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６５－０８６５－１４；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２３１０２）で染色され、および表面マーカーについて固定および透過処理の前にｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＦＯＸＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、００－５５２３－００）を用いて染色され、および細胞内タンパク質について染色し得る。サンプルは、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取った。
【0085】
そしてＴｒｅｇ細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ－ＭＹＣ （またはＬ－ＭＹＣ）などの初期化因子を用いてｉＰＳＣに初期化し得る（例えば、Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ Ｔｈｅｒ．（２０１８）９：７１－８を参照）。初期化因子は非組み込み的方法（例えば、センダイウイルス、プラスミド、ＲＮＡ、ミニサークル、ＡＡＶ、ＩＤＬＶなど）または組み込み的方法（例えば、レンチウイルス、レトロウイルスおよびヌクレアーゼ介在性標的化組み込み）によって送達され得る。
【0086】
図７は、成熟Ｔｒｅｇ細胞をｉＰＳＣへ初期化し、それを増殖し、かつ高い効率でＴｒｅｇ細胞へと再分化させる工程を示す。この工程は、単一のＴｒｅｇ細胞から増殖し、「若返った（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ）」Ｔｒｅｇ細胞プールを提供する。
【0087】
２．幹細胞のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞系列への偏向分化
操作された幹細胞は、そのゲノム中に決定因子をコードする導入遺伝子が存在するため、Ｔｒｅｇ細胞へと分化する潜在能力が向上している。図８は、ｉＰＳＣがＴｒｅｇ細胞へと分化する、段階的な分化過程を示す：ｉＰＳＣ、中胚葉系幹（前駆）細胞、ＨＳＣ、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、未成熟シングルポジティブ（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）Ｔ細胞、ダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）Ｔ細胞、成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞および最終的にＴｒｅｇ細胞となる。これらの幹細胞の分化をＣＤ４＋Ｔ細胞および最終的なＴｒｅｇ細胞へと偏らせるために、組織培養技術を用いることができる。
操作された幹細胞は、そのゲノム中に決定因子をコードする導入遺伝子が存在するため、Ｔｒｅｇ細胞へと分化する潜在能力が向上している。図８は、ｉＰＳＣがＴｒｅｇ細胞へと分化する、段階的な分化過程を示す：ｉＰＳＣ、中胚葉系幹（前駆）細胞、ＨＳＣ、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、未成熟シングルポジティブ（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）Ｔ細胞、ダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）Ｔ細胞、成熟ＣＤ４＋Ｔ細胞および最終的にＴｒｅｇ細胞となる。これらの幹細胞の分化をＣＤ４＋Ｔ細胞および最終的なＴｒｅｇ細胞へと偏らせるために、組織培養技術を用いることができる。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞系列へと分化を歪めるために、Ｔ細胞の発達後期の間、幹細胞はＩＬ－７Ｒａ（ＣＤ１２７）シグナル遮断の対象となる（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）８（１０）：７８８－８０１；図８および図９を参照）。その他の実施形態では、Ｔ細胞の発達中においてＣＣＲ７シグナルが遮断される。ＣＣＲ７はＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞において上方制御され、Ｔ細胞前駆細胞のＣＤ８＋の運命への拘束を促進することが示されている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００７）１７９（１１）：７３５８－６４を参照）。ある実施形態では、ＩＬ－２の濃度は、高親和性ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）を高いレベルで発現するＴｒｅｇ細胞に増殖成長の優位性を供するために、低くされる（Ｓｉｎｇｅｒ，同上；図８）。ある実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に促進する活性化ビーズを用いて、エフェクターＴ細胞よりも優先的にＴｒｅｇ細胞を活性化および増殖させる（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＴｒｅｇ Ｘｐａｎｄｅｒ ｂｅａｄｓ）。
【0089】
図１０は、採用され得るさらなる組織培養技術を示す。ここで示されるいくつかの実施形態では、操作された幹細胞は間葉系間質細胞と共培養される（Ｄｉ Ｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００８）３６（３）：３０９－１８を参照）。このような間質細胞の例には、ＯＰ９またはＯＰ９－ＤＬＬ１間質細胞を含み、これはリンパ系への拘束を促進する（Ｈｕｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２００９）８５（３）：４４５－５１；図１０を参照）。その他の実施形態では、多能性幹細胞から胚性中胚葉前駆細胞が形成され、およびこれらはＭＳ５－ＤＬＬ１／４細胞またはＥｐＣＡＭ－ＣＤ５６＋間質細胞との共培養を介して三次元胚性中胚葉オルガノイド中で培養される（図１０）。そしてこれらの胚性中胚葉前駆細胞は、胸腺での発達過程をより正確に再現するために、人工胸腺オルガノイドへと分化される（Ｍｏｎｔｅｌ－Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ （２０１９）２４（３）：３７６－８９．ｅ８；Ｓｅｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１７）１４（５）：５２１－３０）。
【0090】
３．Ｔｒｅｇ細胞表現型の維持
可塑性はほとんど全ての種類の免疫細胞に元々備わっている性質である。Ｔｒｅｇ細胞は、炎症および環境条件下でＴｅｆｆ細胞に移行（「ドリフト」）し得るようである（Ｓａｄｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）７（２）：ｅ１０１１を参照）。操作されたＴｒｅｇ細胞においてＴｒｅｇ細胞表現型を維持する、および／または導入遺伝子（例えば、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、および／またはＴｈＰＯＫ）の発現を増加させるために、細胞は、ラパマイシンおよび／または高濃度のＩＬ－２を含む組織培養培地中で培養され得る（例えば、ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１３２９７を参照）。いくつかの実施形態では、Ｔｅｆｆ細胞と比較してＴｒｅｇ細胞を優先的に増殖させるために、細胞は、低用量ＩＬ－２を含む組織培養培地中で培養され得る（例えば、Ｃｏｎｇｘｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇ Ｔｈｅｒ．（２０１８）３（２）：１－１０を参照）。
可塑性はほとんど全ての種類の免疫細胞に元々備わっている性質である。Ｔｒｅｇ細胞は、炎症および環境条件下でＴｅｆｆ細胞に移行（「ドリフト」）し得るようである（Ｓａｄｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８）７（２）：ｅ１０１１を参照）。操作されたＴｒｅｇ細胞においてＴｒｅｇ細胞表現型を維持する、および／または導入遺伝子（例えば、ＦＯＸＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、および／またはＴｈＰＯＫ）の発現を増加させるために、細胞は、ラパマイシンおよび／または高濃度のＩＬ－２を含む組織培養培地中で培養され得る（例えば、ＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１３２９７を参照）。いくつかの実施形態では、Ｔｅｆｆ細胞と比較してＴｒｅｇ細胞を優先的に増殖させるために、細胞は、低用量ＩＬ－２を含む組織培養培地中で培養され得る（例えば、Ｃｏｎｇｘｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ Ｔａｒｇ Ｔｈｅｒ．（２０１８）３（２）：１－１０を参照）。
【0091】
ＶＩＩ．操作されたＴｒｅｇ細胞の使用
本開示の遺伝子的に操作されたＴｒｅｇ細胞は、免疫寛容の誘導または免疫恒常性の回復を必要とする患者（例えば、ヒト患者）を処置するための細胞療法において使用され得る。「処置する」および「処置」という用語は、処置された病状の１つ以上の症状の緩和または除去、症状の発生または再発の予防、組織損傷の回復または治癒、および／または疾患の進行の遅延、を指す。
本開示の遺伝子的に操作されたＴｒｅｇ細胞は、免疫寛容の誘導または免疫恒常性の回復を必要とする患者（例えば、ヒト患者）を処置するための細胞療法において使用され得る。「処置する」および「処置」という用語は、処置された病状の１つ以上の症状の緩和または除去、症状の発生または再発の予防、組織損傷の回復または治癒、および／または疾患の進行の遅延、を指す。
【0092】
本明細書の患者は、自己免疫疾患などの望まない炎症状態を有する、またはその危険性があるものであり得る。自己免疫疾患の例は、アジソン病、ＡＩＤＳ、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜病自己免疫性肝炎、皮膚炎、グッドパスチャー症候群、ポリアンギエーシスを伴う肉芽腫症、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・ショーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎など）、多発性筋炎、肺胞蛋白症、多発性硬化症、重症筋無力症、視神経脊髄炎、ＰＡＮＤＡＳ、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、リューマチ性関節炎、シェーグレン症候群、全身性強皮症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、血管炎、尋常性白斑、およびヴォークト・小柳・原田病、である。
【0093】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（多発性硬化症）、ミエリンタンパク質ゼロ（自己免疫性末梢神経障害）、ＨＩＶ ｅｎｖまたはｇａｇタンパク質（ＡＩＤＳ）、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症）、ＣＤ３７（全身性エリテマトーデス）、ＣＤ２０（Ｂ細胞介在性自己免疫疾患）、およびＩＬ－２３Ｒ（クローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患）などの自己免疫疾患に関連する自己抗原を標的とする抗原結合受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現する。
【0094】
本明細書の患者は、同種組織もしくは固体臓器移植、または同種細胞療法などの同種移植を必要とする患者であり得る。１以上の同種ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を標的とするＣＡＲを発現するＴｒｅｇ細胞などの本開示のＴｒｅｇ細胞は、患者に導入されてよく、患者において該Ｔｒｅｇ細胞は移植部に帰巣し、そして宿主の免疫系に賦活された同種移植片拒絶反応および／または移植片対宿主拒絶反応を抑制する。組織もしくは臓器移植、または同種細胞療法を必要とする患者には、例えば、腎移植、心臓移植、肝臓移植、すい臓移植、腸移植、静脈移植、骨髄移植、および皮膚移植を必要とする患者；再生細胞療法を必要とする患者；遺伝子療法（ＡＡＶベース遺伝子療法）を必要とする患者；およびがんＣＡＲ Ｔ療法を必要とする患者を含む。
【0095】
所望により、本明細書の操作されたＴｒｅｇ細胞を受け取る患者（ｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇ細胞に分化する予定の操作された多能性細胞または多分化能細胞を受け取る患者を含む）は、細胞移植片の導入前に軽度の骨髄破壊処理（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ）によって処置される、または強力な骨髄破壊的前処置（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）レジメンによって処置される。
【0096】
本開示の操作された細胞は、この細胞および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物中において提供され得る。例えば、医薬組成物は、滅菌水、生理食塩水、または中性の緩衝生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、塩、抗生物質、等張剤、およびその他の賦形剤（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール；タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）；アミノ酸（例えば、グリシンおよびアルギニン）；抗酸化剤（例えば、グルタチオン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；および保存剤）を含む。医薬組成物は、さらにＴｒｅｇ細胞の表現型および増殖を支持する因子（例えば、ＩＬ－２およびラパマイシンまたはその誘導体）、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－３５）および細胞療法のためのその他細胞（例えば、がん治療のためのＣＡＲ Ｔエフェクター細胞、または再生治療のための細胞）、を含み得る。保存および輸送のために、当該細胞は、任意には冷凍保存され得る。使用前に、当該細胞は解凍され、医薬的に許容できる担体中に希釈される。
【0097】
本開示の医薬組成物は、全身投与（例えば、静脈注射または輸液）、または目的の組織への局所的な注射または輸液（例えば、肝動脈を介した輸液、および脳、心臓、または筋肉への注射）によって、治療有効量で患者に投与される。「治療有効量」とは、患者に投与された際に、処置効果を示すのに十分な医薬組成物の量、または細胞の数を指す。
【0098】
いくつかの実施形態では、医薬組成物の単回投与単位には、１０４個以上の細胞（例えば、約１０５から約１０６個の細胞、約１０６から約１０１０個、約１０６から１０７個、約１０６から１０８個、約１０７から１０８個、約１０７から１０９個、または約１０８から１０９個の細胞）を含む。ある実施形態では、組成物の単回投与単位は、約１０６個、約１０７個、約１０８個、約１０９個、または約１０１０個またはそれ以上の細胞、を含む。患者には、２日に１回、３日に１回、４日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、または患者において操作されたＴｒｅｇ細胞の十分な細胞数を確立するために必要な別の頻度で、医薬組成物を投与してもよい。
【0099】
また、本明細書に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその他のヌクレアーゼおよびポリヌクレオチドの何れかを含む医薬組成物を提供する。
【0100】
本明細書で別段の定義がされない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を下記に記載するが、本明細書に記載するものと同様または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験において用いられ得る。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書が支配する。一般に、本明細書に記載の心臓学、医学、医薬化学、および細胞生物学に関連する命名法、およびその技術は、当技術分野で知られ、および一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に行われるように、または本明細書に記載するように、製造元の仕様に従って実行される。さらに、文脈における別段の求めが無い限り、単数形の用語は複数を含み、および複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書および実施形態を通して、「有する」および「含む」、または「有する」、「有する」、「含む」、または「含む」などの変形は、記載された整数または整数群を含むことを意味するが、その他の何れの整数または整数群を除外することも意味しないと理解されるであろう。本明細書に記載する全ての刊行物およびその他の参考文献は、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。本明細書では多数の文書を引用するが、この引用は、これらの文書の何れかが、当技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではない。本明細書で使用する場合、目的の１以上の値に適用する「約」または「約」という用語は、記載した参照値に類似する値を指す。ある実施形態では、この用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）において、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲に入る値の範囲を指す。
【0101】
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、説明のみを目的とするものであり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
【実施例】
【0102】
実施例
実施例１：ｉＰＳＣのＡＡＶＳ１遺伝子座への導入遺伝子の組み込み
この実施例では、図３に示すように、緑色蛍光タンパク質発現カセットをＡＡＶＳ１遺伝子座へと組み込んだ実験について記載する。ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびドナープラスミドを、－７日目にエレクトロポレーション法によってｉＰＳＣへ送達した。１週間後（０日目）にピューロマイシン（０．３μｇ／ｍＬ）を組織培養培地に添加し、標的化組み込みを受けた細胞のポジティブな選択を開始した。１５日目にドキシサイクリンを添加し、培養培地中のドキシサイクリンを３種類の用量（０．３、１、および３μｇ／ｍＬ）で維持し、Ｄｏｘ誘導性ＧＦＰ発現カセットの発現を誘導させた。コントロールの細胞には培養培地中にドキシサイクリンを添加しなかった。細胞をドキシサイクリンの存在下で１３日間維持した。この期間中、３μｇ／ｍＬ用量のドキシサイクリンで最も高いレベルの誘導性ＧＦＰ導入遺伝子の発現が得られた（９４％；図４）。この高レベルの発現はドキシサイクリンが培養培地中に存在する間、維持された。細胞はドキシサイクリンに加えピューロマイシンの存在下で１５日目から２８日目まで維持され、さらにポジティブに選択した（標的化組み込みをもつアレルは～５０％から～７０％へと増加した）。
実施例１：ｉＰＳＣのＡＡＶＳ１遺伝子座への導入遺伝子の組み込み
この実施例では、図３に示すように、緑色蛍光タンパク質発現カセットをＡＡＶＳ１遺伝子座へと組み込んだ実験について記載する。ＡＡＶＳ１ ＺＦＮ ｍＲＮＡおよびドナープラスミドを、－７日目にエレクトロポレーション法によってｉＰＳＣへ送達した。１週間後（０日目）にピューロマイシン（０．３μｇ／ｍＬ）を組織培養培地に添加し、標的化組み込みを受けた細胞のポジティブな選択を開始した。１５日目にドキシサイクリンを添加し、培養培地中のドキシサイクリンを３種類の用量（０．３、１、および３μｇ／ｍＬ）で維持し、Ｄｏｘ誘導性ＧＦＰ発現カセットの発現を誘導させた。コントロールの細胞には培養培地中にドキシサイクリンを添加しなかった。細胞をドキシサイクリンの存在下で１３日間維持した。この期間中、３μｇ／ｍＬ用量のドキシサイクリンで最も高いレベルの誘導性ＧＦＰ導入遺伝子の発現が得られた（９４％；図４）。この高レベルの発現はドキシサイクリンが培養培地中に存在する間、維持された。細胞はドキシサイクリンに加えピューロマイシンの存在下で１５日目から２８日目まで維持され、さらにポジティブに選択した（標的化組み込みをもつアレルは～５０％から～７０％へと増加した）。
【0103】
実施例２：ｉＰＳＣの分化をＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞系列へと偏らせる
ｉＰＳＣの分化をＣＤ４＋Ｔ細胞および最終的にはＴｒｅｇ細胞となるように偏らせるために、幹細胞は、ＩＬ－７受容体アルファユニット（ＩＬ－７Ｒａ）を標的とする抗体を用いた、ＩＬ－７受容体を介するシグナル伝達の遮断の対象とされた。Ｔ細胞の発達の後期において、抗ＩＬ－７Ｒａ抗体を細胞培養培地に濃度を上げながら添加した。二重の実験（実験１および実験２）共に、抗ＩＬ－７Ｒａ抗体の添加によって、ＣＤ４＋シングルポジティブ細胞の割合（右下の象限）は増加し、未処置の細胞の２．８１％または４．７８％と比較して６．９％（実験１）または７．７％（実験２）に達する、一方でＣ８＋シングルポジティブ細胞の割合は減少した（左上の象限）（図９）。
ｉＰＳＣの分化をＣＤ４＋Ｔ細胞および最終的にはＴｒｅｇ細胞となるように偏らせるために、幹細胞は、ＩＬ－７受容体アルファユニット（ＩＬ－７Ｒａ）を標的とする抗体を用いた、ＩＬ－７受容体を介するシグナル伝達の遮断の対象とされた。Ｔ細胞の発達の後期において、抗ＩＬ－７Ｒａ抗体を細胞培養培地に濃度を上げながら添加した。二重の実験（実験１および実験２）共に、抗ＩＬ－７Ｒａ抗体の添加によって、ＣＤ４＋シングルポジティブ細胞の割合（右下の象限）は増加し、未処置の細胞の２．８１％または４．７８％と比較して６．９％（実験１）または７．７％（実験２）に達する、一方でＣ８＋シングルポジティブ細胞の割合は減少した（左上の象限）（図９）。
【0104】
実施例３：ＴｉＰＳＣおよびＣＤ３４由来ｉＰＳＣからのＴ細胞の生成
この実施例は、成熟Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞）を初期化したｉＰＳＣ（ここでは「ＴｉＰＳＣ」と呼ぶ）から分化Ｔ細胞を得る効率と、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを初期化したｉＰＳＣから分化Ｔ細胞を得る効率とを比較する実験について記載する。
この実施例は、成熟Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞）を初期化したｉＰＳＣ（ここでは「ＴｉＰＳＣ」と呼ぶ）から分化Ｔ細胞を得る効率と、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを初期化したｉＰＳＣから分化Ｔ細胞を得る効率とを比較する実験について記載する。
【0105】
Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを初期化するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なヒトドナーから白血球アフェレーシスによって取得した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたバルクＴ細胞の磁気抗体による濃縮の後に、Ｔ細胞のサブセットをフローサイトメーター（Ｓｏｎｙ ＳＨ８００）でソーティングし、ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇ細胞、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞を得た。これらのＴ細胞の亜集団をセンダイウイルスベースの初期化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて初期化した。ＣＤ３４＋細胞はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）でＰＢＭＣから濃縮した。
【0106】
解析は、ナイーブＴｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ３４＋幹細胞に由来する少なくとも２つの異なるクローンにおいて、少なくとも２つの実験について行った。ｉＰＳＣは５６日間にわたってＴ細胞へと分化させた。
【0107】
図１２のデータは、ＴｉＰＳＣがＣＤ３およびＴＣＲαβの両者を発現する細胞へと効率的に分化する事を示す（パネルＡおよびＢ）。ＴｉＰＳＣ株では、両方のＴ細胞マーカーの共発現が２０％を超えていた。対照的に、ＣＤ３４由来ｉＰＳＣ株から分化した細胞の内、ＣＤ３およびＴＣＲαβを発現したのは僅か５％であった。Ｐ値は以下の通り：ナイーブＴｒｅｇ細胞＝０．０３、ＣＤ４＝０．４８、ＣＤ８＝０．０２。
【0108】
分化したｉＰＳＣは、生存／単細胞からゲーティングした際、様々なＴ細胞の亜集団を生成した（図１２、パネルＣ）。Ｔ細胞の亜集団はＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞であり、およびＣＤ４ｓｐ、ＣＤ８ｓｐ、ダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）、およびダブルネガティブ細胞を含む。データは、ナイーブＴｒｅｇ細胞およびＣＤ８由来ｉＰＳＣのみが、ＣＤ３４由来ｉＰＳＣよりもダブルネガティブ細胞を有意に少なく生成したことを示す。Ｐ値は以下の通り：ナイーブＴｒｅｇ細胞＝０．００４、ＣＤ８＝０．０３。
【0109】
対照的に、ＣＤ３４由来ｉＰＳＣからはＣＤ３およびＴＣＲαβを発現する亜集団は生成されなかった（図１２、パネルＤ）。データはＣＤ４由来ｉＰＳＣがＣＤ３４由来ｉＰＳＣよりも優位に、ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋でもあるＣＤ８ｓｐ細胞を生成した事を示す（Ｐ値＝０．０２）。
【0110】
実施例４：ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３および抗ＨＬＡ－Ａ２ＣＡＲの発現
この実施例は、図２に示されるアプローチを用いた遺伝子編集実験におけるデータを示す。この実験では、編集されたｉＰＳＣ ＴＲＡＣ遺伝子座は、５’から３’にかけて、（ｉ）３’から組み込み部位までのＴＲＡＣエキソン配列（すなわち、組み込み部位の下流の残ったエキソン２配列およびエキソン３配列全体）；（ｉｉ）Ｔ２Ａのコード配列；（ｉｉｉ）（ａ）ＦＯＸＰ３／Ｈｅｌｉｏｓ／ＣＡＲ、（ｂ）ＦＯＸＰ３／ＣＡＲ、（ｃ）ＦＯＸＰ３、または（ｄ）ＧＦＰ、のコード配列；（ｉｖ）ポリＡ部位を含む。ＴＣＲアルファ鎖および導入遺伝子は、内因性ＴＣＲアルファ鎖プロモーターの制御下で全て発現される。明確にするため、全ての導入遺伝子コード配列は、ポリシストロニック発現を可能にするため、隣接する導入遺伝子間に２Ａ自己切断ペプチドのコード配列をインフレームで含んでいた。
この実施例は、図２に示されるアプローチを用いた遺伝子編集実験におけるデータを示す。この実験では、編集されたｉＰＳＣ ＴＲＡＣ遺伝子座は、５’から３’にかけて、（ｉ）３’から組み込み部位までのＴＲＡＣエキソン配列（すなわち、組み込み部位の下流の残ったエキソン２配列およびエキソン３配列全体）；（ｉｉ）Ｔ２Ａのコード配列；（ｉｉｉ）（ａ）ＦＯＸＰ３／Ｈｅｌｉｏｓ／ＣＡＲ、（ｂ）ＦＯＸＰ３／ＣＡＲ、（ｃ）ＦＯＸＰ３、または（ｄ）ＧＦＰ、のコード配列；（ｉｖ）ポリＡ部位を含む。ＴＣＲアルファ鎖および導入遺伝子は、内因性ＴＣＲアルファ鎖プロモーターの制御下で全て発現される。明確にするため、全ての導入遺伝子コード配列は、ポリシストロニック発現を可能にするため、隣接する導入遺伝子間に２Ａ自己切断ペプチドのコード配列をインフレームで含んでいた。
【0111】
編集したｉＰＳＣを胚様体法（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ ｍｅｔｈｏｄ）を用いてＣＤ３４＋造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）へと分化させた後、続いてＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）Ｔ細胞生成キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＤＰ Ｔ細胞へと分化させた（ＬＤＣＭ上で２週間増殖および１週間成熟させた）。ＤＰ Ｔ細胞を可溶性ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２活性化因子でさらに刺激する事で分化させた。ＣＡＲの発現を、蛍光標識したＨＬＡ－Ａ２デキストラマーと細胞をインキュベートする事でアッセイした。
【0112】
データは、ＴＲＡＣ遺伝子座を編集されたｉＰＳＣ由来Ｔ細胞において、導入遺伝子構築物によって導入された部分的なＴＣＲコード配列はＴＣＲαβの発現を維持し得ること、およびＦＯＸＰ３およびＣＡＲ導入遺伝子はこれらの細胞においても過剰発現された事を示す（図１３Ａ）。
【0113】
ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞を、そのサイトカイン産生プロファイルについてさらに評価した。細胞を３日間、２００μＬ のＸ－ＶＩＶＯ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した後、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ（登録商標）装置上でサイトカイン分泌（ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２）を解析した。サイトカイン濃度は培養培地中に播種された全生存細胞に対して正規化した。データは、編集により導入されたＦＯＸＰ３またはＦＯＸＰ３－２Ａ－ＣＡＲ導入遺伝子構築物を含むｉＰＳＣ由来Ｔ細胞において、エフェクターＴ細胞の分化／活性化の阻害を通じて制御性Ｔ細胞の抑制機能に関連する免疫抑制性サイトカインであるＩＬ－１０の分泌が増加する事を示した（図１３Ｂ）。ＴＮＦ－αの分泌において大きな差は観察されなかったが、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌はＦＯＸＰ３およびＦＯＸＰ３－２Ａ－ＣＡＲ導入遺伝子構築物を含む細胞において減少した。ＩＬ－２はエフェクターＴ細胞の生存および増殖の促進に重要であり、ＩＬ－２の枯渇は、制御性Ｔ細胞がその抑制機能を達成するための１つのメカニズムである。活性化Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生が制御性Ｔ細胞によって抑制される事が示された。よって、ここに示す結果は、内因性ＴＲＡＣ遺伝子座に編集されたＦＯＸＰ３導入遺伝子からのＦＯＸＰ３の過剰発現は、編集されたＴ細胞にＴｒｅｇ細胞様の表現型を与える事ができる事を実証する。編集された細胞はＣＡＲに加えて内因性ＴＣＲの両者を発現し得る（ここでＣＡＲは導入遺伝子構築物の一部である）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【国際調査報告】