▶ クローズド・ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”の特許一覧
特表2023-501524細菌パスツレラ・ニューモトロピカ（Рａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）由来Ｃａｓ９タンパク質の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-18
(54)【発明の名称】細菌パスツレラ・ニューモトロピカ（Рａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）由来Ｃａｓ９タンパク質の使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230111BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20230111BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N9/10 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022527121
(86)(22)【出願日】2020-07-02
(85)【翻訳文提出日】2022-07-07
(86)【国際出願番号】 RU2020050145
(87)【国際公開番号】W WO2021096391
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】2019136164
(32)【優先日】2019-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516261966
【氏名又は名称】ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】セベリノフ，コンスタンチン・ビクトロビッチ
(72)【発明者】
【氏名】シュマコフ，セルゲイ・アナトリエビッチ
(72)【発明者】
【氏名】アルタモノーバ，ダリア・ニコラエフナ
(72)【発明者】
【氏名】ゴリャニン，イグナティ・イゴーレビッチ
(72)【発明者】
【氏名】ムシャローバ，オルガ・セルゲーフナ
(72)【発明者】
【氏名】アンドリーバ，ユリア・バレレフナ
(72)【発明者】
【氏名】ジュブコ，タティアナ・イゴレフナ
(72)【発明者】
【氏名】フェドロバ，イアナ・ビタリエフナ
(72)【発明者】
【氏名】ホドルコフスキー，ミクハイル・アレクセービッチ
(72)【発明者】
【氏名】ポベガロフ，ゲオルゲ・エフゲネビッチ
(72)【発明者】
【氏名】アルセニエフ，アナトリー・ニコラエビッチ
(72)【発明者】
【氏名】セルコワ，ポリーナ・アナトレフナ
(72)【発明者】
【氏名】バシリエバ，アレクサンドラ・アンドレエフナ
(72)【発明者】
【氏名】アルタモノーバ，タチアナ・オレゴフナ
(72)【発明者】
【氏名】アブラモバ，マリーナ・ビクトロフナ
【テーマコード（参考）】
4B050
【Ｆターム（参考）】
4B050CC01
4B050DD02
4B050LL10
(57)【要約】
本発明は、細菌Ｐ．ニューモトロピカ由来ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の新規の細菌ヌクレアーゼ、およびＤＮＡ分子に厳密に特異的な二本鎖切断を形成するためのその使用について記載する。このヌクレアーゼは独自の特性を有し、単細胞生物または多細胞生物の細胞においてゲノムＤＮＡ配列を修飾するためのツールとして使用されうる。したがって、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の汎用性は増大し、その事実は、様々な生物のゲノムまたはプラスミドＤＮＡをさらに多くの特異的部位および／もしくは様々な条件で切断するためのＣａｓ９ヌクレアーゼの様々なバリアントの使用を可能にする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＮＡ分子内でヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’の直前に位置する二本鎖切断を前記ＤＮＡ分子内に形成するための、配列番号１のアミノ酸配列を含む、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、保存されていないアミノ酸残基においてのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質の使用。
【請求項2】
請求項１に記載のタンパク質の使用であって、前記ＤＮＡ分子の前記二本鎖切断が、温度３５℃～４５℃で形成されることを特徴とする、前記タンパク質の使用。
【請求項3】
請求項１に記載のタンパク質の使用であって、前記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質の使用。
【請求項4】
請求項１に記載のタンパク質の使用であって、前記ＤＮＡ分子内の前記二本鎖切断が、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ内に形成されることを特徴とする、前記タンパク質の使用。
【請求項5】
請求項４に記載のタンパク質の使用であって、前記ＤＮＡ分子内の前記二本鎖切断が、前記哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡの修飾をもたらすことを特徴とする、前記タンパク質の使用。
【請求項6】
ゲノムＤＮＡを含む単細胞または多細胞生物の細胞のゲノムＤＮＡ配列を修飾する方法であって、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、およびｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’の直接隣にある生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を生物の前記細胞へ導入する工程を含み、ガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’と前記タンパク質の相互作用が、配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’のすぐ隣のゲノムＤＮＡ配列に二本鎖切断の形成をもたらす、方法。
【請求項7】
請求項６に記載の方法であって、前記ガイドＲＮＡと同時に外来性ＤＮＡ配列を導入する工程をさらに含む、前記方法。
【請求項8】
請求項６に記載の方法であって、前記細胞が、哺乳動物細胞であることを特徴とする、前記方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物工学、特に、様々な生物のＤＮＡを切断し、ゲノムを編集するために使用される新規の酵素、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓヌクレアーゼに関する。本技術は、遺伝性ヒト疾患の遺伝子治療ならびに他の生物のゲノム編集に将来使用されうる。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡ配列修飾は、今日の生物工学分野における話題の問題の１つである。真核生物および原核生物のゲノムを編集および修飾し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡを操作するには、ＤＮＡ配列に二本鎖切断を標的として導入する必要がある。
【0003】
この問題を解決するために、以下の技術：ジンクフィンガー型ドメインを含有する人工ヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系および細菌ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系がこれまでに使用されている。最初の２つの技術は、特定のＤＮＡ配列を認識するためにヌクレアーゼアミノ酸配列の面倒な最適化を必要とする。それに対し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の場合、ＤＮＡ標的を認識する構造は、タンパク質ではなく短いガイドＲＮＡである。特定のＤＮＡ標的の切断は、ヌクレアーゼまたはその遺伝子のｄｅ ｎｏｖｏ合成を必要としないが、標的配列に相補的なガイドＲＮＡを使用することによって行われる。それは、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を様々なＤＮＡ配列を切断するための簡便かつ効果的な手段にする。本技術は、異なる配列のガイドＲＮＡを使用していくつかの領域におけるＤＮＡの同時切断を可能にする。この手法は、真核生物においていくつかの遺伝子を同時に修飾するためにも使用される。
【0004】
その性質により、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ウイルス遺伝物質内に切断を非常に特異的に導入できる原核生物の免疫系である（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ．Ｊ．Ｍ．らＩｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ／／Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、２００５年、第６０巻、第２号、１７４～１８２頁）。略語ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、「クラスター化された規則的な間隔のパリンドローム様短反復およびＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子」を表す（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第４３巻、第６号、１５６５～１５７５頁）。全てのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲカセットおよび様々なＣａｓタンパク質をコードする遺伝子からなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第４３巻、第６号、１５６５～１５７５頁）。ＣＲＩＳＰＲカセットは、それぞれ固有のヌクレオチド配列を有するスペーサー、および反復しているパリンドローム反復からなる（Ｊａｎｓｅｎ Ｒ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第４３巻、第６号、１５６５～１５７５頁）。ＣＲＩＳＰＲカセットの転写、それに続くプロセッシングにより、Ｃａｓタンパク質と共にエフェクター複合体を形成するガイドｃｒＲＮＡの形成を得られる（Ｂｒｏｕｎｓ Ｓ．Ｊ．Ｊ．ら、Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ／／Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、第３２１巻、第５８９１号、９６０～９６４頁）。ｃｒＲＮＡとプロトスペーサーと呼ばれる標的ＤＮＡ部位の間の相補的な対合により、ＣａｓヌクレアーゼはＤＮＡ標的を認識し、その中に極めて特異的に切断を導入する。
【0005】
単一のエフェクタータンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、系に含まれるＣａｓタンパク質に応じて６つの異なる型（Ｉ～ＶＩ型）に分類される。２０１３年に、ヒト細胞のゲノムＤＮＡを編集するためにＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用することが初めて提案された（Ｃｏｎｇ Ｌ、ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年２月１５日；３３９（６１２１）：８１９～２３頁）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、その単純な構成および活性の機序を特徴とし、すなわちその機能は、１つのＣａｓ９タンパク質と２つの短いＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）のみからなるエフェクター複合体の形成を必要とする。トレーサーＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ反復に由来するｃｒＲＮＡ領域と相補的に対になって、ＣａｓエフェクターへのガイドＲＮＡの結合に必要な二次構造を形成する。ガイドＲＮＡの配列の決定は、これまでに研究されていないＣａｓ相同分子種の特徴付けにおいて重要な工程である。Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、標的ＤＮＡの相補鎖に切断を導入し、したがって二本鎖ＤＮＡの切断を生じる２つのヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨおよびＲｕｖＣ）を持つＲＮＡ依存性ＤＮＡエンドヌクレアーゼである（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．らＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ／／Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、第４７１巻、第７３４０号、６０２頁）。
【0006】
これまでに、ＤＮＡに二本鎖切断を標的とし、特異的に導入できるいくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼが公知である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術は、菌株からヒト細胞まで様々な生物のＤＮＡに切断を導入するための最も新しい、急速に発展している技術の１つであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの適用も提供する（Ｓｏｎｇ Ｍ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ：Ｔｈｅｉｒ ｄｅｌｉｖｅｒｌｙ、ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｓｔａｒｔｕｐｓ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２０１７年７月；３３（４）：１０３５～１０４５頁）。
【0007】
Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖からなるエフェクターリボ核酸複合体は、ｃｒＲＮＡスペーサー－プロトスペーサーの相補性に加えて、ＤＮＡの認識およびその後の加水分解のためにＤＮＡ標的上にＰＡＭ（プロトスペーサー調整モチーフ）の存在を必要とする（Ｍｏｊｉｃａ Ｆ．Ｊ．Ｍ．ら２００９年）。ＩＩ型系においてＰＡＭは、オフターゲット鎖上のプロトスペーサーの３’末端の隣にまたは数ヌクレオチド離れて位置する数ヌクレオチドの厳密に定義された配列である。ＰＡＭの非存在下では、ＤＮＡ結合の加水分解とそれに続く二本鎖切断の形成は起こらない。標的上のＰＡＭ配列の存在の必要性は、認識特異性を増大させるが、切断を導入するための標的ＤＮＡ領域の選択を同時に拘束する。したがって、３’末端側からＤＮＡ標的に隣接する所望のＰＡＭ配列の存在は、あらゆるＤＮＡ部位でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用を限定する特徴である。
【0008】
異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、その活性のために異なる固有のＰＡＭ配列を使用する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を新規の様々なＰＡＭ配列と共に使用することが、ｉｎ ｖｉｔｒｏと生物のゲノム内の両方において任意のＤＮＡ領域を修飾することを可能にするのに必要である。真核生物ゲノムの修飾は、細胞へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＡＡＶ媒介性送達を実現するために、小さなサイズのヌクレアーゼの使用も必要とする。
【0009】
ＤＮＡを切断し、ゲノムＤＮＡ配列を修飾するための技術は多数公知であるが、様々な生物においてＤＮＡ配列の厳密に特異的な部位でＤＮＡを修飾する新規の有効な手段が今なお必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して単細胞または多細胞生物のゲノムＤＮＡ配列を修飾するための新規の手段を提供することである。修飾しようとするＤＮＡ領域の３’末端に存在しなければならない特定のＰＡＭ配列のため、現存の系は使用が限られている。他のＰＡＭ配列を持つ新規のＣａｓ９酵素の探索は、様々な生物のＤＮＡ分子において所望の、厳密に特異的な部位で二本鎖切断を形成するのに利用可能な手段の範囲を拡大することになる。この問題を解決するために、著者は、パスツレラ・ニューモトロピカ（Ｐ．ニューモトロピカ（Р．ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ））に対してこれまでに予測されていたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＰｐＣａｓ９を特徴付け、上記と他の生物の両方のゲノムへ指向性のある修飾を導入するためにそれは使用されうる。本発明は、必須の特徴：（ａ）他の公知のＰＡＭ配列と異なる短いＰＡＭ配列；（ｂ）１０５５アミノ酸残基（ａ．ａ．ｒ．）である比較的小さいサイズの特徴付けられたＰｐＣａｓ９タンパク質、を有することを特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記問題は、ＤＮＡ分子内でヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’の直前に位置する二本鎖切断を前記ＤＮＡ分子内に形成するための、配列番号１のアミノ酸配列を含む、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、保存されていないアミノ酸残基においてのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質の使用により解決される。本発明の一部の態様において、この使用は、ＤＮＡ分子の二本鎖切断が、温度３５℃～４５℃で形成されることを特徴とする。本発明の一部の態様において、この使用は、二本鎖切断が、哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡ内に形成されることを特徴とする。本発明の一部の態様において、この使用は、ＤＮＡ分子内の二本鎖切断の形成が、前記哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡの修飾をもたらすことを特徴とする。
【0012】
前記問題は、単細胞または多細胞生物の細胞のゲノムＤＮＡ配列を修飾する方法であって、有効量の：ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質または配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、およびｂ）ヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’の直接隣にある生物のゲノムＤＮＡ領域のヌクレオチド配列と二重鎖を形成し、二重鎖形成後に前記タンパク質と相互作用する配列を含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を生物の前記細胞へ導入する工程を含み、ガイドＲＮＡおよびヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’と前記タンパク質の相互作用が、配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’のすぐ隣のゲノムＤＮＡ配列に二本鎖切断の形成をもたらす、方法を提供することによってさらに解決される。
【0013】
本発明の一部の態様において、本方法は、ガイドＲＮＡと同時に外来性ＤＮＡ配列を導入する工程をさらに含むことを特徴とする。本発明の一部の態様において、本方法は、前記細胞が、哺乳動物細胞であることを特徴とする。
【0014】
標的ＤＮＡ領域ならびにＰｐＣａｓ９タンパク質と複合体を形成できるｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の混合物が、ガイドＲＮＡとして使用されてもよい。本発明の好ましい態様において、ｃｒＲＮＡおよびトレーサーＲＮＡに基づいて構築されるハイブリッドＲＮＡが、ガイドＲＮＡとして使用されてもよい。ハイブリッドガイドＲＮＡを構築する方法は、当業者に公知である（Ｈｓｕ ＰＤ、ら、ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年９月；３１（９）：８２７～３２頁）。ハイブリッドＲＮＡを構築する手法の１つは、下記の実施例に開示される。
【0015】
本発明は、標的ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断といくつかの生物のゲノムの修飾の両方に使用されうる。ゲノムＤＮＡは、直接的な方法、すなわち対応する部位でゲノムＤＮＡを切断する工程と、相同修復を用いて外来性ＤＮＡ配列を挿入する工程とによって修飾されうる。
【0016】
投与に使用される以外の生物のゲノムに由来する二本鎖または一本鎖ＤＮＡの任意の領域（またはそれら領域の中のおよび他のＤＮＡ断片との組成物）が、外来性ＤＮＡ配列として使用されてもよく、前記領域（または領域の組成物）が、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによって誘導される標的ＤＮＡ内の二本鎖切断の場所に組み込まれることを意図する。本発明の一部の態様において、ＰｐＣａｓ９タンパク質の導入に使用される生物のゲノムＤＮＡの二本鎖ＤＮＡの領域は、突然変異（ヌクレオチドの置換）、および１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入または欠失によってさらに修飾され、外来性ＤＮＡ配列として使用されてもよい。
【0017】
本発明の技術的結果は、利用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の汎用性を増大させて、さらに多くの特定の部位および特定の条件でゲノムまたはプラスミドＤＮＡを切断するためにＣａｓ９ヌクレアーゼを使用できるようにすることである。新規のヌクレアーゼは、細菌、哺乳動物または他の生物の細胞に使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＣＲＩＳＰＲ ＰｐＣａｓ９系の座位の概要を示す図である。ＤＲ（直列反復）は、ＣＲＩＳＰＲカセットの部分である規則的に反復される領域である。
【図2】ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭスクリーニングを示す図である。実験の概要。
【図3】異なる反応温度における７Ｎライブラリー断片のＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼ切断を示す図である。
【図4】図４Ａは、各ＰＡＭ（ＦＣ）位置における各特定のヌクレオチドの割合の対数変化の算出を使用したＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの結果の分析を示す図である。図４Ｂは、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼのＰＡＭロゴを示す図である。アデニン、シトシン、チミンおよびグアニンの出現率が、各位置について示される。文字の高さは、ＰＡＭ配列の所与の位置におけるヌクレオチドの出現率に対応する。
【図5】ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによってＤＮＡ標的を切断する効率に対するＰＡＭ １位における単一ヌクレオチド置換の効果の検証を示す図である。
【図6】ＰｐＣａｓ９ ＰＡＭ配列におけるヌクレオチド位置の有意性の検証を示す図である。
【図7】ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによってＤＮＡ標的を切断する効率に対するＰＡＭ ５位におけるＡからＧへの置換の効果の検証を示す図である。
【図8】ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによってＤＮＡ標的を切断する効率に対するＰＡＭ ７位における単一ヌクレオチド置換の効果の検証を示す図である。
【図9】ＰｐＣａｓ９タンパク質を使用する様々なＤＮＡ部位の切断を示す図である。レーン１および２は陽性対照である。
【図10】ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによるＰＡＭ配列ＣＡＧＣＡＴＴの認識の検証を示す図である。レーン１および２は陽性対照である。
【図11】ＤＮＡ切断ツールＰｐＣａｓ９の線図である。
【図12】ＤＮＡ標的の切断に対する実験を示す図である。異なる長さのハイブリッドガイドＲＮＡを使用した。
【図13】ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴｐソフトウェア（初期設定パラメータ）を使用した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来ＰｐＣａｓ９とＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列の整列化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の説明に使用される用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「とりわけ、含む」ことを意味すると解釈されるものとする。前記用語は、「からのみなる」と解釈されることを意図しない。別途定義されない限り、本出願内の技術および科学的用語は、科学および技術的文献において一般に受け入れられる典型的な意味を有する。
【0020】
本明細書では、用語「２つの配列のパーセント相同性」は、用語「２つの配列のパーセント同一性」と等しい。配列同一性は、参照配列に基づいて決定される。配列分析用のアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３～１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴなど、当業者に公知である。ヌクレオチド配列同士ならびにアミノ酸配列同士の間の同一性および類似性レベルを決定する本発明の目的のために、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較が使用されてもよく、比較は、米国バイオテクノロジー情報センターによって提供されるＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）によって標準パラメータでギャップ整列化を使用して実行される。２つの配列のパーセント同一性は、これら２つの配列中の同一アミノ酸の位置の数によって決定され、整列化によって２つの配列の最適な比較のために入れられるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。パーセント同一性は、配列整列化を考慮し、所与の位置の同一アミノ酸の数を位置の総数で除算し、１００で乗算したものと同じである。
【0021】
用語「特異的にハイブリダイズする」とは、当業者に一般に使用される既定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にする２つの一本鎖核酸分子間または十分に相補的な配列間の会合のことを指す。
【0022】
熟語「ヌクレオチドＰＡＭ配列の直前に位置する二本鎖切断」は、標的ＤＮＡ配列内の二本鎖切断が、ヌクレオチドＰＡＭ配列の前の０～２５ヌクレオチド離れたところに作られることになることを意味する。
【0023】
ガイドＲＮＡと同時に導入される外来性ＤＮＡ配列とは、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断部位で二本鎖標的ＤＮＡを特異的に修飾するために特異的に調製されるＤＮＡ配列を指すものとする。そのような修飾は、例えば、標的ＤＮＡ内の切断部位における特定のヌクレオチドの挿入または欠失でもよい。外来性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域または標的ＤＮＡと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれでもよい。
【0024】
特定のアミノ酸配列を含むタンパク質とは、前記アミノ酸配列で構成されるアミノ酸配列および場合によりペプチド結合によって前記アミノ酸配列に連結された他の配列を有するタンパク質を指すものとする。他の配列の例は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）または前記アミノ酸配列の機能の増大をもたらす他の配列でもよい。
【0025】
ガイドＲＮＡと同時に導入される外来性ＤＮＡ配列とは、ガイドＲＮＡの特異性によって決定される切断部位で二本鎖標的ＤＮＡを特異的に修飾するために特異的に調製されるＤＮＡ配列を指すものとする。そのような修飾は、例えば、標的ＤＮＡ内の切断部位における特定のヌクレオチドの挿入または欠失でもよい。外来性ＤＮＡは、異なる生物由来のＤＮＡ領域または標的ＤＮＡと同じ生物由来のＤＮＡ領域のいずれでもよい。
【0026】
細胞に導入されるタンパク質およびＲＮＡの有効量とは、前記細胞に導入された場合に、機能的複合体、すなわち標的ＤＮＡに特異的に結合し、ガイドＲＮＡおよびＤＮＡ上のＰＡＭ配列によって決定される部位に二本鎖切断を生ずることになる複合体を形成できることになるタンパク質ならびにＲＮＡの量を指すものとする。この過程の効率は、当業者に公知の従来通りの技術を使用して前記細胞から単離される標的ＤＮＡを分析することによって評価されうる。
【0027】
タンパク質およびＲＮＡは、様々な技術によって細胞に送達されうる。例えば、タンパク質は、このタンパク質の遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド、細胞質においてこのタンパク質へ翻訳されるｍＲＮＡ、またはこのタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体として送達されてもよい。送達は、当業者に公知の様々な技術によって実行されうる。
【0028】
系の成分をコードする核酸は：当業者に公知の方法による細胞のトランスフェクションもしくは形質転換、組換えウイルスの使用、ＤＮＡマイクロインジェクションなどの細胞に対する操作、等によって直接または間接的に細胞に導入されうる。
【0029】
ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡならびに外来性ＤＮＡ（必要に応じて）からなるリボ核酸の複合体は、細胞に複合体をトランスフェクトするまたは細胞内に複合体を機械的に導入する、例えば、マイクロインジェクション、により送達されてもよい。
【0030】
細胞に導入されるタンパク質をコードする核酸分子は、染色体に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するＤＮＡでもよい。一部の態様において、細胞に導入されたＤＮＡによるタンパク質遺伝子の有効な発現を確実にするには、細胞型に応じて前記ＤＮＡの配列を修飾して発現のためのコドンを最適化することが必要であり、それは、様々な生物のゲノムのコード領域における同義コドンの出現頻度が不均等であるためである。コドンの最適化は、動物、植物、真菌または微生物細胞における発現を増大させるために必要である。
【0031】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を有するタンパク質の場合、真核生物細胞において機能させるには、このタンパク質が、最終的にこの細胞の核内に行くことが必要である。したがって、本発明の一部の態様において、標的ＤＮＡに二本鎖切断を形成するために、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、１つもしくは複数の核局在化シグナルの付加によって一方または両方の末端でさらに修飾された配列を有するタンパク質が使用される。例えば、ＳＶ４０ウイルス由来核局在化シグナルが、使用されてもよい。核への効果的な送達を提供するために、核局在化シグナルは、例えば、Ｓｈｅｎ Ｂ、ら「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｉｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３年５月；２３（５）：７２０～３頁に記載されているスペーサー配列によって主要なタンパク質配列から分離されてもよい。さらに、他の態様において、異なる核局在化シグナルまたは細胞核へ前記タンパク質を送達するための代替方法が使用されてもよい。
【0032】
本発明は、これまでに特徴付けられているＣａｓ９タンパク質に相同なＰ．ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ生物由来のタンパク質を使用して、厳密に指定された位置でＤＮＡ分子に二本鎖切断を導入することを包含する。ゲノムに標的とした修飾を導入するためにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用することは、多くの利点を有する。第１に、系の活性の特異性は、ｃｒＲＮＡ配列によって決定され、全ての標的座位に対して１つの型のヌクレアーゼを使用することが可能になる。第２に、本技術により、細胞内へ異なる遺伝子標的に相補的ないくつかのガイドＲＮＡを一度に送達することができ、それによりいくつかの遺伝子を一度に同時に修飾することが可能になる。
【0033】
ＰｐＣａｓ９は、パスツレラ・ニューモトロピカＡＴＣＣ３５１４９に見られるＣａｓヌクレアーゼであり、動物の肺に住んでいる齧歯目の病原菌である。パスツレラ・ニューモトロピカ（Ｐ．ニューモトロピカ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９系（以下ＣＲＩＳＰＲ ＰｐＣａｓ９と称する）は、ＩＩ－Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に属しており、配列５’ＡＴＴＡＴＡＧＣＡＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣ３’を持つ４つの直列反復（ＤＲ）を固有のスペーサーの配列によって間をあけて保有するＣＲＩＳＰＲカセットからなる。系のスペーサーのいずれも、現在公知のバクテリオファージまたはプラスミドと配列が一致せず、その事実が、バイオインフォマティクス分析によって対象のＰｐＣａｓ９ ＰＡＭを決定することを不可能にしている。ＣＲＩＳＰＲカセットには、エフェクターＣａｓ９タンパク質であるＰｐＣａｓ９の遺伝子、ならびに新たなスペーサーの適合および組み込みに関係するＣａｓ１およびＣａｓ２タンパク質の遺伝子が隣接して存在する。Ｃａｓ遺伝子の近傍で、直列反復に部分的に相補的であり、特徴的な二次構造に折りたたまれる配列がみつかり、その配列が、トレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であると考えられる（図１）。
【0034】
ＩＩ－Ｃ型系のＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体の特徴的な構成の知見により、ＣＲＩＳＰＲカセットの転写の方向を予測することを可能にした：前ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ遺伝子と反対方向に転写される（図１）。
【0035】
したがって、ＰｐＣａｓ９座位の配列の分析は、トレーサーおよびガイドＲＮＡの配列を予測することを可能にした（表１）。
【0036】
【表1】
【0037】
ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼの活性を検証し、対象のＰｐＣａｓ９ ＰＡＭを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡ切断反応を再現する実験を行った。ＰｐＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定するために、二本鎖ＰＡＭライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断が利用された。この目的のためには、ＰｐＣａｓ９エフェクター複合体の全ての成分：ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼを組換え形態で得ることが必要であった。ガイドＲＮＡ配列の決定により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を合成することが可能になった。合成は、ＮＥＢ ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＲＮＡ合成キットを使用して実施された。二本鎖ＤＮＡライブラリーは、３’末端側から無作為な７ヌクレオチド（５’－ＮＮＮＮＮＮＮ－３’）に隣接されるプロトスペーサー配列を含む３７４塩基対（ｂｐ）の断片：
【0038】
【化1】
【0039】
であった。
この標的を切断するために、以下の配列のガイドＲＮＡ：
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
この標的を切断するために、以下の配列のガイドＲＮＡ：
ｔｒａｃｒＲＮＡ：
【0040】
【化2】
【0041】
およびｃｒＲＮＡ：
【0042】
【化3】
【0043】
が使用された。
太字体は、プロトスペーサー（標的ＤＮＡ配列）に相補的なｃｒＲＮＡ配列を示す。
組換えＰｐＣａｓ９タンパク質を作製するために、その遺伝子がプラスミドｐＥＴ２１ａにクローニングされた。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成されたＤＮＡが、遺伝子をコードするＤＮＡとして使用された。配列は、Ｐ．ニューモトロピカゲノムに見られるレアコドンを除外するためにコドン最適化された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ロゼッタ細胞が、得られたプラスミドｐＥＴ２１ａ－６×Ｈｉｓ－ＰｐＣａｓ９で形質転換された。
太字体は、プロトスペーサー（標的ＤＮＡ配列）に相補的なｃｒＲＮＡ配列を示す。
組換えＰｐＣａｓ９タンパク質を作製するために、その遺伝子がプラスミドｐＥＴ２１ａにクローニングされた。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成されたＤＮＡが、遺伝子をコードするＤＮＡとして使用された。配列は、Ｐ．ニューモトロピカゲノムに見られるレアコドンを除外するためにコドン最適化された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ロゼッタ細胞が、得られたプラスミドｐＥＴ２１ａ－６×Ｈｉｓ－ＰｐＣａｓ９で形質転換された。
【0044】
終夜培養液５００μＬが、ＬＢ培地５００ｍＬに希釈され、光学密度Ｒｕ ０．６が得られるまで細胞は３７℃で増殖された。標的タンパク質の合成は、濃度１ｍＭにＩＰＴＧを添加することによって誘導され、次いで細胞は２０℃で６時間インキュベートされた。次いで、細胞は５０００ｇで３０分間遠心分離され、得られた細胞沈殿物は－２０℃で凍結された。
【0045】
沈殿物は、氷上で３０分間解凍され、１５ｍｇリゾチームを補充した溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ ５０ｍＭ、ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、β－メルカプトエタノール １ｍＭ、イミダゾール １０ｍＭ）１５ｍＬに再懸濁され、氷上で３０分間再インキュベートされた。細胞は、超音波処理によって次いで３０分間破壊され、１６０００ｇで４０分間遠心分離された。得られた上清は、０．２μｍフィルターに通され、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍＬ／分間でアプライされた。
【0046】
クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１ｍＬ／分で実行された。アプライされたタンパク質を含むカラムは、３０ｍＭイミダゾールを補充した溶解緩衝液２０ｍＬで洗浄され、その後タンパク質は、３００ｍＭイミダゾールを補充した溶解緩衝液で洗い落とされた。
【0047】
次いで、親和性クロマトグラフィーの過程で得られたタンパク質画分は、緩衝液：トリス－ＨＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム（２４ｍＬ）に通された。Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（３０ｋＤａフィルターを含む）を使用して、ＰｐＣａｓ９タンパク質の単量体形態に相当する画分が３ｍｇ／ｍＬまで濃縮され、その後、精製されたタンパク質は、１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、－８０℃で貯蔵された。
【0048】
直鎖状のＰＡＭライブラリーを切断するｉｎ ｖｉｔｒｏ反応は、以下の条件で、容量２０μＬで実施された。反応混合物は、１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）、５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｎＭ ＰＡＭライブラリー、２μＭ ｔｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ、４００ｎＭ ＰｐＣａｓ９タンパク質からなった。対照として、ＲＮＡを含有しない試料が類似の方法で調製された。試料は、異なる温度でインキュベートされ、２％アガロースゲル中のゲル電気泳動によって分析された。ＰｐＣａｓ９タンパク質によりＤＮＡが正しく認識され、特異的に切断された場合、約３２６および４８塩基対の２つのＤＮＡ断片が生成されるべきである（図２を参照のこと）。
【0049】
実験結果は、ＰｐＣａｓ９がヌクレアーゼ活性を有し、ＰＡＭライブラリー断片の一部を切断することを示した。温度勾配は、タンパク質が、３５～４５℃の温度範囲で活性があることを示した（図３）。本研究は、作業温度として４２℃の温度を次いで使用した。
【0050】
ライブラリー切断反応が、選択された条件下で繰り返された。反応産物は、１．５％アガロースゲルにアプライされ、電気泳動に供された。長さ３７４ｂｐの切断されていないＤＮＡ断片がゲルから抽出され、ＮＥＢ ＮｅｘｔＵｌｔｒａ ＩＩキットを使用して高スループット配列決定用として調製された。試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで配列決定され、次いで、配列の分析がバイオフォマティカル（ｂｉｏｆｏｒｍａｔｉｃａｌ）方法を使用して実施され：（Ｍａｘｗｅｌｌ ＣＳ、ら、Ａ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｃｉｐｈｅｒ ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８年７月１日；１４３：４８～５７頁）に記載の手法を使用して対照試料と比較してＰＡＭ（ＮＮＮＮＮＮＮ）の個々の位置におけるヌクレオチドの出現率の差異を決定した。さらに、ＰＡＭロゴが、結果を分析するために作られた（図４）。
【0051】
データ分析の両方の手法は、ＰＡＭ５、６および７位の有意性を示す（図４）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析により、ＰｐＣａｓ９に対する推定ＰＡＭ配列を、ＮＮＮＮＡＴＴと確立することができた。しかしながら、この配列は、ＰＡＭを決定するためのスクリーニング手法によって得られた不正確な結果を考慮すると推定でしかない。
【0052】
この点に関して、個々のＰＡＭ配列の位置の有意性が、配列をより正確に決定するために検証された。この目的のために、ＰＡＭ配列
【0053】
【化4-1】
【0054】
（またはその誘導体）に隣接されるＤＮＡ標的５’－ａｔｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｇａｇｃａｃ－３’を含有するＤＮＡ断片：
【0055】
【化4-2】
【0056】
の切断のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応を実行した。
全てのＤＮＡ切断反応は、以下の条件で実行された：
１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
４００ｎＭ ＰｐＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡ
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
インキュベーション時間３０分間、反応温度４２℃。
全てのＤＮＡ切断反応は、以下の条件で実行された：
１×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液
４００ｎＭ ＰｐＣａｓ９
２０ｎＭ ＤＮＡ
２μＭ ｃｒＲＮＡ
２μＭ ｔｒａｃｒＲＮＡ
インキュベーション時間３０分間、反応温度４２℃。
【0057】
考えうる４つ全てのヌクレオチドバリアントによるＰＡＭ １位の置換は、タンパク質活性の効率に影響を及ぼさなかった（図５）。
５および６位の予測された有意性が、ＰＡＭ位置のそれぞれにおける単一ヌクレオチド置換（ピリミジンによるプリンおよびその逆）によって実験的に確認された。置換が５および６位で起こった場合、タンパク質は、その活性を実質的に停止した。置換が７位で起こった場合、ＰｐＣａｓ９活性の効率は、２分の１に減少し、その事実は、この位置のヌクレオチドに対する要求の減少を反映している（図６）。したがって、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭスクリーニングの結果によると、ＰＡＭ ５位において最も可能性のあるヌクレオチドは、アデニンまたはグアニンであり、その事実が、実験的に確認された（図７）。ＡからＧへの置換は、断片を切断する効率を減少させなかった。
５および６位の予測された有意性が、ＰＡＭ位置のそれぞれにおける単一ヌクレオチド置換（ピリミジンによるプリンおよびその逆）によって実験的に確認された。置換が５および６位で起こった場合、タンパク質は、その活性を実質的に停止した。置換が７位で起こった場合、ＰｐＣａｓ９活性の効率は、２分の１に減少し、その事実は、この位置のヌクレオチドに対する要求の減少を反映している（図６）。したがって、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＭスクリーニングの結果によると、ＰＡＭ ５位において最も可能性のあるヌクレオチドは、アデニンまたはグアニンであり、その事実が、実験的に確認された（図７）。ＡからＧへの置換は、断片を切断する効率を減少させなかった。
【0058】
ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの結果によると、７位に「Ｔ」または「Ｓ」がある断片は、より効率的に認識されるべきである。さらなる実験を行って、この位置におけるヌクレオチドの有意性を最終的に検証した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果は、７位におけるヌクレオチド「Ｔ」の、ＡまたはＧによる置換が、切断効率を４０～５０％減少させることを示した（図８）。したがって、ＰＡＭ ７位は、５および６位と比較してあまり保存されておらず：７位のプリンは、認識効率を減少させるが、ＰｐＣａｓ９タンパク質がＤＮＡに二本鎖切断を導入することを妨げない。
【0059】
研究の結果は、以下の通りであった：ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭは、式５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’に対応する。７位は、あまり保存されていない。
【0060】
本方法の以下の例示的態様は、本発明の特徴を開示する目的で提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきでない。
実施例１
様々なＤＮＡ標的の切断におけるＰｐＣａｓ９タンパク質の活性の試験。
実施例１
様々なＤＮＡ標的の切断におけるＰｐＣａｓ９タンパク質の活性の試験。
【0061】
配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’に隣接される様々なＤＮＡ配列を認識するＰｐＣａｓ９の能力を調査するために、実験を、ヒトｇｒｉｎ２ｂ遺伝子配列由来のＤＮＡ標的のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断について行った（表２を参照のこと）。
【0062】
【表2】
【0063】
ＰＡＭ共通配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’によりＰｐＣａｓ９によっておそらく認識可能な認識部位（表２）を保有するｇｒｉｎ２ｂ遺伝子のＰＣＲ断片を、切断反応における標的として使用した。ＰｐＣａｓ９をこれら部位に仕向けるＣｒＲＮＡを合成して、これら配列を認識させた。
【0064】
【0065】
レーン６の標的は、ＰＡＭ配列ＣＡＧＣＡＴＴを有し、除去分析の結果に基づく予測によると、その配列は、タンパク質によって効率的に認識されるべきである。しかしながら、この断片の認識はこの実験において起こらなかった。
【0066】
したがって、ＰＡＭ ＣＡＧＣＡＴＴを、同じＰＡＭに制限される別のプロトスペーサー標的に対してさらに検証した（図１０）。この場合、ＰＡＭは効果的に認識され、ＤＮＡの切断をもたらした。したがって、タンパク質は、ＤＮＡ標的配列に対してなんらかのさらなる優先傾向を有する。優先傾向は、ＤＮＡの二次構造とおそらく関係がある。
【0067】
したがって、本研究は、ＰｐＣａｓ９においてヌクレアーゼ活性の存在を示し、さらに、そのＰＡＭ配列を決定し、ガイドＲＮＡの配列を検証することを可能にした。
ＰｐＣａｓ９リボ核タンパク質複合体は、プロトスペーサーの５’末端からＰＡＭ ５’－ＮＮＮＮＴＴ（Ａ／Ｇ）－３’に制限された標的に切断を特異的に導入する。ＰｐＣａｓ９／ＲＮＡ複合体の概要を、図１１に示す。
ＰｐＣａｓ９リボ核タンパク質複合体は、プロトスペーサーの５’末端からＰＡＭ ５’－ＮＮＮＮＴＴ（Ａ／Ｇ）－３’に制限された標的に切断を特異的に導入する。ＰｐＣａｓ９／ＲＮＡ複合体の概要を、図１１に示す。
【0068】
実施例２
ＤＮＡ標的を切断するためのハイブリッドガイドＲＮＡの使用。
ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）とｃｒＲＮＡを融合させたガイドＲＮＡの一形態である。最適なｓｇＲＮＡを選択するためにこの配列の３つのバリアントを構築し、それらは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ二重鎖の長さが異なった。ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、それを含む実験をＤＮＡ標的の切断について行った（図１２）。
ＤＮＡ標的を切断するためのハイブリッドガイドＲＮＡの使用。
ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トレーサーＲＮＡ）とｃｒＲＮＡを融合させたガイドＲＮＡの一形態である。最適なｓｇＲＮＡを選択するためにこの配列の３つのバリアントを構築し、それらは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ二重鎖の長さが異なった。ＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、それを含む実験をＤＮＡ標的の切断について行った（図１２）。
【0069】
以下のＲＮＡ配列：
１－ｓｇＲＮＡ１ ２５ＤＲ：
１－ｓｇＲＮＡ１ ２５ＤＲ：
【0070】
【化5】
【0071】
２－ｓｇＲＮＡ２ ３６ＤＲ
【0072】
【化6】
【0073】
を、ハイブリッドＲＮＡとして使用した。
太字体は、ＤＮＡ標的との対合を提供する２０ヌクレオチド配列（ｓｇＲＮＡの可変部分）を示す。さらに、実験は、ＲＮＡを含まない対照試料およびｃｒＲＮＡ＋ｔｒＲＮＡを使用して標的を切断する陽性対照を使用した。
太字体は、ＤＮＡ標的との対合を提供する２０ヌクレオチド配列（ｓｇＲＮＡの可変部分）を示す。さらに、実験は、ＲＮＡを含まない対照試料およびｃｒＲＮＡ＋ｔｒＲＮＡを使用して標的を切断する陽性対照を使用した。
【0074】
認識部位５’ｔａｔｃｔｃｃｔｔｔｃａｔｔｇａｇｃａｃ３’を対応する共通配列ＰＡＭ ＣＡＡＣＡＴＴと共に含有する配列：
【0075】
【化7】
【0076】
をＤＮＡ標的として使用した。
太字体は、認識部位を示し、大文字は、ＰＡＭを表す。
反応を、以下の条件で実行した：ＰＡＭ（ＣＡＡＣＡＴＴ）を含有するＤＮＡ配列の濃度は２０ｎＭであり、タンパク質濃度は４００ｎＭであり、ＲＮＡ濃度は２μＭであり；インキュベーション時間は３０分間であり、インキュベーション温度は３７℃であった。
太字体は、認識部位を示し、大文字は、ＰＡＭを表す。
反応を、以下の条件で実行した：ＰＡＭ（ＣＡＡＣＡＴＴ）を含有するＤＮＡ配列の濃度は２０ｎＭであり、タンパク質濃度は４００ｎＭであり、ＲＮＡ濃度は２μＭであり；インキュベーション時間は３０分間であり、インキュベーション温度は３７℃であった。
【0077】
選択したｓｇＲＮＡ１およびｓｇＲＮＡ２は、天然のｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列と同程度に効果的であることが判明し：切断は、ＤＮＡ標的の８０％より多くで起こった（図１２）。
【0078】
これらハイブリッドＲＮＡバリアントを使用して、ＤＮＡ標的と直接対合する配列を修飾した後に他の任意の標的ＤＮＡを切断してもよい。
実施例３
Ｐ．ニューモトロピカに属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。
実施例３
Ｐ．ニューモトロピカに属する近縁生物由来のＣａｓ９タンパク質。
【0079】
現在まで、Ｐ．ニューモトロピカにおいてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９酵素は特徴付けられてこなかった。サイズが同程度である黄色ブドウ球菌由来のＣａｓ９タンパク質は、ＰｐＣａｓ９と２８％同一である（図１３、同一性の程度は、ＢＬＡＳＴｐソフトウェア、初期設定のパラメータで算出した）。同程度の同一性が、他の公知のＣａｓ９タンパク質に存在する（図示せず）。
【0080】
したがって、ＰｐＣａｓ９タンパク質は、そのアミノ酸配列において現在までに研究された他のＣａｓ９タンパク質と有意に異なっている。
遺伝子工学の当業者は、本説明において申請者によって得られ、特徴付けられたＰｐＣａｓ９タンパク質配列バリアントが、タンパク質自体の機能を変化させることなく修飾されうると認識することになる［例えば、機能的活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の定方向突然変異誘発（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８９年）、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、１５．３～１５．１０８頁）による］。特に、当業者は、保存されていないアミノ酸残基が、タンパク質機能に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく修飾されうることを認識することになる。そのような修飾の例には、保存されていないアミノ酸残基の、相同なアミノ酸による置換がある。保存されていないアミノ酸残基を含有する領域の一部を、図１２に示す。本発明の一部の態様において、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、保存されていないアミノ酸残基においてのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子内でヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’の直前に位置する二本鎖切断を前記ＤＮＡ分子内に形成することが可能である。相同タンパク質は、対応する核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）によって得られ、その後、本明細書に記載される機能的分析に従って、コードされている修飾Ｃａｓ９タンパク質をその機能の保持について試験してもよい。
遺伝子工学の当業者は、本説明において申請者によって得られ、特徴付けられたＰｐＣａｓ９タンパク質配列バリアントが、タンパク質自体の機能を変化させることなく修飾されうると認識することになる［例えば、機能的活性に直接影響を及ぼさないアミノ酸残基の定方向突然変異誘発（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８９年）、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、１５．３～１５．１０８頁）による］。特に、当業者は、保存されていないアミノ酸残基が、タンパク質機能に関与する（タンパク質機能または構造を決定する）残基に影響を及ぼすことなく修飾されうることを認識することになる。そのような修飾の例には、保存されていないアミノ酸残基の、相同なアミノ酸による置換がある。保存されていないアミノ酸残基を含有する領域の一部を、図１２に示す。本発明の一部の態様において、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、保存されていないアミノ酸残基においてのみ配列番号１と異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を使用して、ＤＮＡ分子内でヌクレオチド配列５’－ＮＮＮＮ（Ａ／Ｇ）ＴＴ－３’の直前に位置する二本鎖切断を前記ＤＮＡ分子内に形成することが可能である。相同タンパク質は、対応する核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）によって得られ、その後、本明細書に記載される機能的分析に従って、コードされている修飾Ｃａｓ９タンパク質をその機能の保持について試験してもよい。
【0081】
実施例４
ＰｐＣａｓ９を使用するヒト細胞のゲノムＤＮＡの修飾。
ヒト細胞のゲノムＤＮＡを修飾するために、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子を、真核生物プラスミドベクター内にＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした。細胞核へのヌクレアーゼ送達を確実にする核局在化シグナルをコードする配列を、ＰｐＣａｓ９遺伝子の５’および３’末端に付加した。ｓｇＲＮＡ配列を、Ｕ６プロモーターの制御下でベクターにクローニングした。系の活性を試験するために、長さ２０および２４ヌクレオチドの標的ＤＮＡと相補的な配列を持つｓｇＲＮＡを使用した。最新技術から公知のＳｐＣａｓ９に基づくゲノムＤＮＡ修飾系を保有する類似のプラスミドを、陽性対照として使用した。トランスフェクションの有効性を評価するために、プラスミドはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子をさらに保有した。ヒトゲノムＤＮＡの以下の領域を、ＤＮＡ標的として使用した（表３）。
ＰｐＣａｓ９を使用するヒト細胞のゲノムＤＮＡの修飾。
ヒト細胞のゲノムＤＮＡを修飾するために、ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子を、真核生物プラスミドベクター内にＣＭＶプロモーターの制御下でクローニングした。細胞核へのヌクレアーゼ送達を確実にする核局在化シグナルをコードする配列を、ＰｐＣａｓ９遺伝子の５’および３’末端に付加した。ｓｇＲＮＡ配列を、Ｕ６プロモーターの制御下でベクターにクローニングした。系の活性を試験するために、長さ２０および２４ヌクレオチドの標的ＤＮＡと相補的な配列を持つｓｇＲＮＡを使用した。最新技術から公知のＳｐＣａｓ９に基づくゲノムＤＮＡ修飾系を保有する類似のプラスミドを、陽性対照として使用した。トランスフェクションの有効性を評価するために、プラスミドはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子をさらに保有した。ヒトゲノムＤＮＡの以下の領域を、ＤＮＡ標的として使用した（表３）。
【0082】
【表3】
【0083】
真核生物細胞におけるＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼの有効な活性のためには、真核生物細胞の核内にタンパク質を取り込む必要がある。これは、Ｓｈｅｎ Ｂ、ら「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３年５月；２３（５）：７２０～３頁に記載されるスペーサー配列を介してまたはスペーサー配列なしでＰｐＣａｓ９配列に連結されたＳＶ４０ Ｔ抗原由来核局在化シグナル（Ｌａｎｆｏｒｄら、Ｃｅｌｌ、１９８６年、４６：５７５～５８２頁）を使用することにより行われてもよい。
【0084】
所与の例において、ヒト細胞の核内に輸送されるヌクレアーゼの完全なアミノ酸配列は、以下の配列：
【0085】
【化8】
【0086】
であった。
この実験に使用されるプラスミドは、配列：
この実験に使用されるプラスミドは、配列：
【0087】
【化9-1】
【0088】
【化9-2】
【0089】
を有した。
以下の部分：Ｕ６プロモーター（第１の領域、大文字）、プロトスペーサーに相補的な配列（「ＸＸＸ－ＸＸＸ」）、ｓｇＲＮＡの保存されている部分（第３の領域、大文字）、ＰｐＣａｓ９遺伝子（太字体で強調）、ＧＦＰ遺伝子（最後の領域、大文字）を、プラスミド配列内で区別した。
以下の部分：Ｕ６プロモーター（第１の領域、大文字）、プロトスペーサーに相補的な配列（「ＸＸＸ－ＸＸＸ」）、ｓｇＲＮＡの保存されている部分（第３の領域、大文字）、ＰｐＣａｓ９遺伝子（太字体で強調）、ＧＦＰ遺伝子（最後の領域、大文字）を、プラスミド配列内で区別した。
【0090】
ＰｐＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９を持つプラスミドを、リポフェクタミン２０００試薬を使用してヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に細胞を溶解し、得られた溶解物をＰＣＲに供して、ゲノムＤＮＡの標的修飾部位を含む領域を生成した。得られたＰＣＲ断片を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に供して、ゲノムＤＮＡの標的部位における挿入および欠失の頻度を決定した。反応産物をアガロースゲルへアプライし、電気泳動に供した。図１４Ａは、先行技術に記載されるＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと類似の効率で、ＰｐＣａｓ９が、ＥＭＸ１およびＧＲＩＮ２ｂ遺伝子に修飾を能動的に導入することを示す。
【0091】
本実験は、ゲノムＤＮＡを効果的に修飾するには、ＰｐＣａｓ９がＳｐＣａｓ９と比較して伸長したｓｇＲＮＡを必要とすることを示した：所与の例において、長さ２４ヌクレオチドを有するＤＮＡ標的に相補的な配列を含むｓｇＲＮＡを使用した場合、遺伝的修飾の効率はより大きい（長さ２０ヌクレオチドと比較して）。
【0092】
高スループット配列決定により、標的ＤＮＡ部位に導入された修飾を確認した。図１４Ｂは、ＥＭＸ１遺伝子のヌクレオチド配列の検出可能な修飾の例を示す。
リボ核酸複合体の形態での送達を利用して、ヒト細胞にＮＬＳ＿ＰｐＣａｓ９＿ＮＬＳを送達してもよい。送達は、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）中でＰｐＣａｓ９ ＮＬＳの組換え形態をガイドＲＮＡとインキュベートすることによって実施される。組換えタンパク質を、親和性クロマトグラフィー（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）によって精製することによって細菌産生細胞から作製する。
リボ核酸複合体の形態での送達を利用して、ヒト細胞にＮＬＳ＿ＰｐＣａｓ９＿ＮＬＳを送達してもよい。送達は、ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（ＮＥＢ）中でＰｐＣａｓ９ ＮＬＳの組換え形態をガイドＲＮＡとインキュベートすることによって実施される。組換えタンパク質を、親和性クロマトグラフィー（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）によって精製することによって細菌産生細胞から作製する。
【0093】
タンパク質を、１：２（ＰｐＣａｓ９ ＮＬＳ：ｓｇＲＮＡ）の比でＲＮＡと混合し、混合物を室温で１０分間インキュベートし、次いで細胞にトランスフェクトする。
次に、そこから抽出されるＤＮＡを、標的ＤＮＡ部位における挿入／欠失について分析する（上記の通り）。
次に、そこから抽出されるＤＮＡを、標的ＤＮＡ部位における挿入／欠失について分析する（上記の通り）。
【0094】
本発明において特徴付けられた細菌パスツレラ・ニューモトロピカ由来ＰｐＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡを修飾するために標準的な手法および当業者に公知の方法を使用して様々な起源の細胞へ送達されうる。ＰｐＣａｓ９は、これまでに特徴付けられたＣａｓ９タンパク質に比べて多くの利点を有する。
【0095】
他の公知のＣａｓヌクレアーゼと異なり、ＰｐＣａｓ９は、系が機能するために必要とされる短い２文字のＰＡＭを有する。本発明は、プロトスペーサーから４ヌクレオチド離れて位置する短いＰＡＭ（ＲＴＴ）の存在が、ＰｐＣａｓ９がｉｎ ｖｉｖｏで成功裏に機能するために充分であることを示した。
【0096】
ＤＮＡに二本鎖切断を導入する能力があるこれまでに公知の多くの小さなサイズのＣａｓヌクレアーゼは、複雑な多くの文字のＰＡＭ配列を有し、切断に適した配列の選択肢を限定する。短いＰＡＭを認識する現在までに研究されているＣａｓヌクレアーゼの中で、ＰｐＣａｓ９だけがＲＴＴモチーフに隣接される配列を認識することができる。
【0097】
ＰｐＣａｓ９の第２の優位性は、小さいタンパク質サイズ（１０５５ａａｒ）である。現在まで、それは、３文字のＲＴＴ ＰАМ配列を有する唯一の研究されている小さなサイズのタンパク質である。
【0098】
ＰｐＣａｓ９は、現在公知の他のヌクレアーゼのＰＡＭ配列と異なる、短く、使いやすいＰＡＭを持つ新規の、小さなサイズのＣａｓヌクレアーゼである。ＰｐＣａｓ９タンパク質は、ヒト細胞のゲノムＤＮＡを含めた様々なＤＮＡ標的を３７℃で、高効率で切断し、新たなゲノム編集ツールの基礎になりうる。
【0099】
本発明は、開示された態様を参照して記載されてきたが、当業者は、詳細に記載されている特定の態様が、本発明を例示する目的で提供されたものであり、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されないことを認識することになる。様々な修飾が、本発明の趣旨を逸脱することなく作られうることは理解されよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】