特表 2023-501611 ＣＤ７０を標的化する遺伝子操作されたＴ細胞を使用するＣＤ７０＋固形腫瘍療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-18

(54)【発明の名称】ＣＤ７０を標的化する遺伝子操作されたＴ細胞を使用するＣＤ７０＋固形腫瘍療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20230111BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20230111BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230111BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20230111BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230111BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230111BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230111BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

A61K35/17 Z

A61P35/00

C12N15/12 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N5/10

C12N5/0783

C07K19/00

C07K14/705

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022527794

(86)(22)【出願日】2020-11-13

(85)【翻訳文提出日】2022-07-07

(86)【国際出願番号】 IB2020060720

(87)【国際公開番号】W WO2021095011

(87)【国際公開日】2021-05-20

(31)【優先権主張番号】62/934,975

(32)【優先日】2019-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/034,563

(32)【優先日】2020-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518370079

【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン アレクサンダー テレット

(72)【発明者】

【氏名】マリー－リー デケアン

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス ビル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C085AA02

4C085BB11

4C085CC03

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示の態様は、ＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の集団を含む組成物、及びＣＤ７０＋固形腫瘍の治療のためにそれらを使用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ７０＋固形腫瘍を治療するための方法であって、
（ｉ）ＣＤ７０＋固形腫瘍を有するヒト患者を第１のリンパ球枯渇治療にかけること；及び
（ｉｉ）工程（ｉ）の後に前記ヒト患者に遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量を投与することを含み、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団が、ＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を発現するＴ細胞を含み、且つ前記ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、方法。

【請求項2】

工程（ｉ）における前記第１のリンパ球枯渇治療が、前記ヒト患者に１日当たり３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって静脈内で同時投与することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程（ｉ）の前に、前記ヒト患者が、以下の特徴：
（ａ）臨床状態の著しい悪化、
（ｂ）９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、
（ｃ）制御されない心不整脈、
（ｄ）血管収縮薬の支援を必要とする低血圧、
（ｅ）活動性感染症、及び
（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性
の１つ以上を示さない、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

工程（ｉ）が、工程（ｉｉ）の約２～７日前に実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

工程（ｉｉ）が、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団を、約１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞～約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞、任意選択により、約３×１０^７～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である前記第１の用量で前記ヒト患者の静脈内に投与することによって実施される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

工程（ｉｉ）の前及び工程（ｉ）の後に、前記ヒト患者が、以下の特徴：
（ａ）活動性の制御されない感染症、
（ｂ）工程（ｉ）前の臨床状態と比較した前記臨床状態の悪化、及び
（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性
の１つ以上を示さない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後の急性毒性の発症について前記ヒト患者をモニターすることをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

急性毒性が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性、腫瘍溶解症候群、ＧｖＨＤ、オンターゲット・オフ腫瘍毒性、及び制御されないＴ細胞増殖を含み、任意選択により、前記神経毒性が、免疫エフェクター細胞関連神経毒性（ＩＣＡＮＳ）であり、且つ任意選択により、前記オンターゲット・オフ腫瘍毒性が、活性化Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、骨芽細胞及び／又は腎尿細管様上皮に対する遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の活性を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

（ｉｖ）前記ヒト患者を第２のリンパ球枯渇治療にかけること、及び（ｖ）前記ヒト患者に遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の第２の用量を投与することをさらに含み、任意選択により、前記第２の用量が、前記第１の用量の約８週～約２年後、任意選択により、約８～１０週又は約１４～１８週間後に前記ヒト患者に投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

（ｖｉ）前記ヒト患者を第３のリンパ球枯渇治療にかけること、及び（ｖｉｉ）前記ヒト患者に遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の第３の用量を投与することをさらに含み、任意選択により、前記第３の用量が、前記第２の用量の約８週～約２年後、任意選択により、約８～１０週又は約１４～１８週間後である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ヒト患者が、工程（ｉｉ）の後及び／又は工程（ｖ）の後に、以下：
（ａ）用量規制毒性（ＤＬＴ）、
（ｂ）工程（ｉｉ）及び／又は工程（ｖ）の後の７２時間以内に≦グレード２に回復しないグレード≧３のＣＲＳ、
（ｃ）グレード＞１のＧｖＨＤ、
（ｄ）グレード≧３のＩＣＡＮＳ、
（ｅ）活動性感染症、
（ｆ）血行動態的に不安定、及び
（ｇ）臓器不全
のうちの１つ以上を示さない、請求項９又は請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

工程（ｉｖ）における前記第２のリンパ球枯渇治療、工程（ｖｉ）における前記第３のリンパ球枯渇治療、又は両方が、前記ヒト患者に１日当たり３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを１～３日間にわたって静脈内で同時投与することを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

工程（ｖ）が、工程（ｉｖ）の２～７日後に実施され、及び／又は工程（ｖｉｉ）が、工程（ｖｉ）の２～７日後に実施される、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

工程（ｖ）及び／又は工程（ｖｉｉ）が、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団を、約１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞～約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞である前記第２の用量及び／又は前記第３の用量で前記ヒト患者の静脈内に投与することによって実施される、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の用量及び／又は前記第３の用量が、約３×１０^７～約９×１０^８個のＣＡＲ＋細胞である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ヒト患者が、工程（ｉｉ）及び該当する場合工程（ｖ）の後に、部分奏効（ＰＲ）又は完全奏効（ＣＲ）に達し、その後２年以内に進行した、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ヒト患者が、工程（ｉｉ）及び該当する場合工程（ｖ）の後に、ＰＲ又は安定な疾患（ＳＤ）に達した、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ヒト患者が、工程（ｖ）及び該当する場合工程（ｖｉｉ）の前の再発（ｒｅｐｌａｓｅ）時に、ＣＤ７０^＋固形腫瘍を有すると確認される、請求項９～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ヒト患者が、安定な疾患又は疾患進行を示す、請求項９～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の前記第１の用量、前記第２の用量、及び／又は前記第３の用量が、１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞、３×１０^７個のＣＡＲ^＋細胞、１×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、又は１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞であり、任意選択により、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の前記第１の用量、前記第２の用量、及び／又は前記第３の用量が、１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、６×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、又は９×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の前記第１の用量が、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の前記第２及び／又は前記第３の用量と同じである、請求項９～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の前記第１の用量が、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団の前記第２及び／又は前記第３の用量より少ない、請求項９～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ヒト患者が、成人である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ヒト患者が、以前に抗癌療法を受けたことがある、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＣＤ７０＋固形腫瘍が、再発性又は難治性である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ヒト患者が、ＣＤ７０＋腫瘍細胞を有する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ヒト患者が、前記ヒト患者から得られる生体試料中にＣＤ７０＋腫瘍細胞を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記方法がさらに、工程（ｉ）の前に、ＣＤ７０＋腫瘍細胞を有するヒト患者を同定することを含む、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ヒト患者が、抗サイトカイン療法にかけられる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ヒト患者が、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団での治療後に自系又は同種異系造血幹細胞移植にかけられる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ヒト患者が、以下の特徴：
（ａ）カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）≧８０％、及び
（ｂ）十分な臓器機能、
（ｃ）以前に抗ＣＤ７０による治療又は養子性Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞療法がないこと、
（ｄ）リンパ球枯渇療法に対して禁忌がないこと、
（ｅ）悪性腫瘍の中枢神経系（ＣＮＳ）徴候がないこと、
（ｆ）以前の中枢神経系障害がないこと、
（ｇ）胸水又は腹水又は心臓周囲の注入がないこと、
（ｈ）不安定狭心症、不整脈、及び／又は心筋梗塞がないこと、
（ｉ）糖尿病がないこと、
（ｊ）制御されない感染症がないこと、
（ｋ）免疫抑制療法を必要とする免疫不全障害又は自己免疫障害がないこと、
（ｌ）肝臓ワクチン又は漢方薬がないこと、並びに
（ｍ）固形臓器移植又は骨髄移植がないこと
のうちの１つ以上を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ヒト患者が、遺伝子操作されたＴ細胞の前記集団のそれぞれの投与の後に毒性の発症に関して少なくとも２８日間モニターされる、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ヒト患者が、毒性の発症が観察される場合、毒性管理にかけられる、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

ＣＤ７０に結合する前記ＣＡＲが、細胞外ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含み、前記細胞外ドメインが、ＣＤ７０に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ｓｃＦｖが、配列番号４９を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び配列番号５０を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ｓｃＦｖが、配列番号４８を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ＣＡＲが、配列番号４６を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号８又は９のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号８又は９の前記スペーサー配列によって標的化される領域又はその一部の欠失を有する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号１２又は１３のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記破壊されたＣＤ７０遺伝子が、配列番号４又は５のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記ＣＤ７０＋固形腫瘍が、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、及び／又はそれらの組み合わせである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９７５号、及び２０２０年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／０３４，５６３号に対する優先権の利益を主張する。先行出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝子改変Ｔ細胞を使用して、癌細胞をより特異的且つ効率的に標的化して死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、この細胞は、その表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞が患者に注射されるとき、受容体は、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞が様々な皮下固形腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍量を減少させたという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。また、本明細書に記載される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞への再暴露後に腫瘍増殖を妨げた長期間のインビボ有効性を示すことが実証された。腫瘍量の著しい減少はまた、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与後に観察された。さらに、ＣＴＸ１３０細胞の分布、増殖、及び持続は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を受容するヒト対象において観察された。優れた治療有効性はまた、ＣＴＸ１３０細胞治療を受容したＲＣＣ（代表的なＣＤ７０＋固形腫瘍）を有するヒト患者においても観察された。

【0004】

したがって、本開示の態様は、ＣＤ７０＋固形腫瘍を治療するための方法であって、（ｉ）ＣＤ７０＋固形腫瘍を有するヒト患者をリンパ球枯渇治療にかけること、及び（ｉｉ）工程（ｉ）の後にヒト患者に遺伝子操作されたＴ細胞の集団を投与すること（ＣＡＲ Ｔ細胞療法とも称される）を含む方法を提供する。

【0005】

いくつかの実施形態では、本明細書において、ＣＤ７０＋固形腫瘍を治療するための方法であって、（ｉ）ＣＤ７０＋固形腫瘍を有するヒト患者を第１のリンパ球枯渇治療にかけること；及び（ｉｉ）工程（ｉ）の後にヒト患者に遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量を投与することを含み、遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、ＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を含み、且つ破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子、及び破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含み、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が挿入される方法が提供される。いくつかの例において、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、本明細書で開示されるとおりのＣＴＸ１３０細胞である。

【0006】

いくつかの実施形態では、工程（ｉ）における第１のリンパ球枯渇治療は、ヒト患者に１日当たり３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを３日間にわたって静脈内で同時投与することを含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、工程（ｉ）前に、ヒト患者は、以下の特徴：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）制御されない心不整脈、（ｄ）血管収縮薬の支援を必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。

【0008】

いくつかの実施形態では、工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）の約２～７日前に実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を、約１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞～約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞である第１の用量でヒト患者の静脈内に投与することによって実施される。いくつかの例において、第１の用量は、約３×１０^７～約９×１０^８個のＣＡＲ＋細胞の範囲であり得る。

【0009】

いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の前及び工程（ｉ）の後に、ヒト患者は、以下の特徴：（ａ）活動性の制御されない感染症、（ｂ）工程（ｉ）前の臨床状態と比較した臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。

【0010】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法はさらに、工程（ｉｉ）の後に急性毒性の発症に関してヒト患者をモニターすることを含む。いくつかの実施形態では、急性毒性は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、神経毒性（例えば、ＩＣＡＮＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）、ＧｖＨＤ、オンターゲット・オフ腫瘍毒性、及び／又は制御されないＴ細胞増殖を含む。オンターゲット・オフ腫瘍毒性は、活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、骨芽細胞及び／又は腎尿細管様上皮に対する遺伝子操作されたＴ細胞の集団の活性を含み得る。

【0011】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法はさらに、（ｉｖ）ヒト患者を第２のリンパ球枯渇治療にかけること、及び（ｖ）工程（ｉｉ）の数週後にヒト患者に遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第２の用量を投与することを含む。場合により、ヒト患者は、工程（ｉｉ）の後に以下の：（ａ）用量規制毒性（ＤＬＴ）、（ｂ）７２時間以内にグレード２に回復しないグレード４のＣＲＳ、（ｃ）グレード＞１のＧｖＨＤ、（ｄ）グレード≧３の神経毒性、（ｅ）活動性感染症、（ｆ）血行動態的に不安定、及び（ｇ）臓器不全のうちの１つ以上を示さない。遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第２の用量は、第１の用量の約８週～約２年後に対象に投与され得る。場合により、第２の用量は、第１の用量の約６～１０週後に対象に投与され得る。他の場合、第２の用量は、第１の用量の約１４～１８週後に対象に投与され得る。

【0012】

いくつかの実施形態では、工程（ｉｖ）における第２のリンパ球枯渇治療は、ヒト患者に１日当たり３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを１～３日間にわたって静脈内で同時投与することを含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）の２～７日後に実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｖ）は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を、約１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞～約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞である第２の用量でヒト患者の静脈内に投与することによって実施される。いくつかの例において、第１の用量は、約３×１０^７～約９×１０^８個のＣＡＲ＋細胞の範囲であり得る。

【0014】

いくつかの実施形態では、方法はさらに、（ｖｉ）ヒト患者を第３のリンパ球枯渇治療にかけること、及び（ｖｉｉ）ヒト患者に工程（ｉｉ）の約８週～約２年（例えば、約１４～１８週）後に遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第３の用量を投与することを含み得る。場合により、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第２の用量は、工程（ｉｉ）の約８週～約２年（例えば、約８～１０週）後に投与される。或いは又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第３の用量は、第２の用量の約８週～約２年後に対象に投与され得る。場合により、第３の用量は、第２の用量の約８～１０週後に対象に投与され得る。他の場合、第３の用量は、第２の用量の約１４～１８週後に対象に投与され得る。

【0015】

いくつかの例では、ヒト患者は、工程（ｖ）の後に以下の：（ａ）用量規制毒性（ＤＬＴ）、（ｂ）７２時間以内にグレード２に回復しないグレード４のＣＲＳ、（ｃ）グレード＞１のＧｖＨＤ、（ｄ）グレード≧３の神経毒性、（ｅ）活動性感染症、（ｆ）血行動態的に不安定、及び（ｇ）臓器不全のうちの１つ以上を示さない。

【0016】

いくつかの実施形態では、工程（ｖｉ）における第３のリンパ球枯渇治療は、ヒト患者に１日当たり３０ｍｇ／ｍ^２のフルダラビン及び５００ｍｇ／ｍ^２のシクロホスファミドを１～３日間静脈内で同時投与することを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、工程（ｖｉｉ）は、工程（ｖｉ）の２～７日後に実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｖｉｉ）は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を、約１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞～約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞であり得る第３の用量でヒト患者の静脈内に投与することによって実施される。いくつかの例において、第２の用量は、約３×１０^７～約９×１０^８個のＣＡＲ＋細胞の範囲であり得る。

【0018】

いくつかの実施形態では、ヒト患者は、安定な疾患又は疾患進行を示す。

【0019】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約１×１０^６個のＣＡＲ^＋細胞、約３×１０^７個のＣＡＲ^＋細胞、約１×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、又は約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約３×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約６×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約９×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞である。いくつかの例では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量、第２の用量、及び／又は第３の用量は、約１×１０^９個のＣＡＲ^＋細胞である。

【0020】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第２及び／又は第３の用量と同じである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第１の用量は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団の第２及び／又は第３の用量より少ない。

【0021】

いくつかの実施形態では、ヒト患者は、成人である。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、以前に抗癌療法を受けている。いくつかの実施形態では、以前の抗癌療法は、チェックポイント阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、血管内皮因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、又はその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０＋固形腫瘍は、再発性であるか又は難治性である。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、ＣＤ７０＋腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、ヒト患者から得られる生体試料中にＣＤ７０＋腫瘍細胞を有する。したがって、本明細書で開示される方法のいずれかは、場合により、工程（ｉ）の前に、ＣＤ７０＋腫瘍細胞を有するヒト患者を同定することをさらに含み得る。

【0022】

いくつかの実施形態では、ヒト患者は、抗サイトカイン療法にかけられる。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団による治療の後に自系又は同種異系造血幹細胞移植にかけられる。

【0023】

いくつかの実施形態では、ヒト患者は、以下の特徴：（ａ）カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）≧８０％、（ｂ）十分な臓器機能、（ｃ）以前に幹細胞移植（ＳＣＴ）がないこと、（ｄ）以前に抗ＣＤ７０薬剤又は養子性Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞療法がないこと、（ｅ）リンパ球枯渇療法に対して既知の禁忌がないこと、（ｆ）症候性であるか又は症候性であった現在又は過去の悪性貯留液を伴うＴ細胞又はＢ細胞リンパ腫がないこと、（ｇ）血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）がないこと、（ｈ）中枢神経系悪性腫瘍又は障害がないこと、（ｉ）不安定狭心症、不整脈、及び／又は心筋梗塞がないこと、（ｊ）糖尿病がないこと、（ｋ）制御されない感染症がないこと、（ｌ）免疫抑制性の療法を必要とする免疫不全障害又は自己免疫障害がないこと、並びに（ｍ）固形臓器移植又は骨髄移植がないことのうちの１つ以上を有する。

【0024】

いくつかの実施形態では、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団のそれぞれの投与の後に毒性の発症に関して少なくとも２８日間モニターされる。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、毒性の発症が観察される場合、毒性管理にかけられる。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７０に結合するＣＡＲは、細胞外ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含み、細胞外ドメインは、ＣＤ７０に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４９を含む重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び配列番号５０を含む軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号４８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４６を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号８又は９のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号８のスペーサー配列によって標的化される領域、又はその一部の欠失を有する。

【0027】

いくつかの実施形態では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号１２又は１３のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される。

【0028】

いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ７０遺伝子は、配列番号４又は５のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムによって生成される。

【0029】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７０＋固形腫瘍は、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、又は前立腺癌である。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋（すなわち、３Ｘ ＫＯ、ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋）Ｔ細胞における効率的な多重遺伝子編集を示すグラフを含む。

【図2】ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の正常な集団が、ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞集団の間で維持されることを示すグラフを含む。

【図3】ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞における強い細胞増殖を示すグラフを含む。生存細胞の総数は、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）及び２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞において定量化された。３Ｘ ＫＯ細胞は、ＣＤ７０ ｓｇＲＮＡ Ｔ７又はＴ８のいずれかにより生成された。

【図4】２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較した３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によるＡ４９８細胞の強い細胞の死滅を示すグラフを含む。

【図5】連続的な再チャレンジの後の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＡ４９８細胞の死滅を示すグラフを含む。３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－）及びＣＴＸ１３０細胞（ＣＴＸ１３０）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の開発ロットが利用された。

【図6A-6C】ＣＤ７０＋腎細胞癌細胞の存在下でのサイトカイン分泌に関するＣＴＸ１３０細胞の開発ロット（ロット０１）の試験からの結果を示すグラフを含む。ＣＴＸ１３０細胞は、ＣＤ７０＋（Ａ４９８；図６Ａ又はＡＣＨＮ；図６Ｂ）又はＣＤ７０－（ＭＣＦ７；図６Ｃ）標的細胞とともに指定の比率で共培養された。未編集のＴ細胞が対照Ｔ細胞として使用された。ＩＦＮ－γ（左）及びＩＬ－２（右）レベルが決定された。生物学的な三つ組の平均±標準偏差が示される。

【図7A-7C】複数のＴ細胞と標的細胞比でのＣＤ７０高（Ａ４９８；図７Ａ）、ＣＤ７０低（ＡＣＨＮ；図７Ｂ）、及びＣＤ７０陰性（ＭＣＦ７；図７Ｃ）細胞株に対する細胞死滅活性に関するＣＴＸ１３０細胞の開発ロット（ロット０１）の試験からの結果を示すグラフを含む。各データ点は、三つ組からのデータ±標準偏差を表す。負の値は、ゼロとして示される。

【図8A-8H】様々な型の癌細胞上でのＣＤ７０の発現及びそのようなものに対する抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を示すグラフを含む。図８Ａ：示されるとおりの５種の異なる癌細胞株における相対的なＣＤ７０発現。図８Ｂ：示されるとおりの３種の異なる癌細胞株における相対的なＣＤ７０発現。図８Ｃは、９種の異なる癌細胞株における相対的なＣＤ７０発現を示すグラフである。図８Ｄは、様々なレベルのＣＤ７０発現を有する追加の固形腫瘍細胞株に対して三重ノックアウトＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を使用して細胞死滅活性を示すグラフである（４：１、１：１、又は０．２５：１ エフェクター：標的細胞比）。図８Ｅは、２４時間又は９６時間の共培養期間の後の固形腫瘍細胞株に対して三重ノックアウトＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を使用して細胞死滅活性を示すグラフである。図８Ｆ～８Ｈは、様々なエフェクター：標的比でＣＤ７０欠損慢性骨髄性白血病（Ｋ５６２）細胞（図８Ｆ）、ＣＤ７０発現多発性骨髄腫（ＭＭ．１Ｓ）細胞（図８Ｇ）、及びＣＤ７０発現Ｔ細胞リンパ腫（ＨｕＴ７８）細胞（図８Ｈ）に対して三重ノックアウトＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞（３ＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ ＣＡＲ＋）を使用して細胞死滅活性を示すグラフを含む。

【図9A】様々な皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルにおいてＣＴＸ１３０細胞を試験した結果を示すグラフを含む。図９Ａ：皮下Ａ４９８－ＮＯＧモデル。腫瘍体積は、試験の期間に週に２回測定された。各点は、平均腫瘍体積±標準誤差を表す。

【図9B】様々な皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルにおいてＣＴＸ１３０細胞を試験した結果を示すグラフを含む。図９Ｂ：皮下７８６－Ｏ－ＮＳＧモデル。腫瘍体積は、試験の期間に週に２回測定された。各点は、平均腫瘍体積±標準誤差を表す。

【図9C】様々な皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルにおいてＣＴＸ１３０細胞を試験した結果を示すグラフを含む。図９Ｃ：皮下Ｃａｋｉ－２－ＮＳＧモデル。腫瘍体積は、試験の期間に週に２回測定された。各点は、平均腫瘍体積±標準誤差を表す。

【図9D】様々な皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルにおいてＣＴＸ１３０細胞を試験した結果を示すグラフを含む。図９Ｄ：皮下Ｃａｋｉ－１－ＮＳＧモデル。腫瘍体積は、試験の期間に週に２回測定された。各点は、平均腫瘍体積±標準誤差を表す。

【図10】腫瘍再チャレンジを伴う皮下Ａ４９８異種移植モデルにおいてＣＴＸ１３０細胞の有効性を試験した結果を示すグラフを含む。腫瘍はおよそ５１ｍｍ^３の平均サイズまで増殖させられ、その後担腫瘍マウスは、２つの群（Ｎ＝５／群）に無作為化された。群１は、未治療のままであったが、群２は、７×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞を受容し、群３は、８×１０^６個のＣＡＲ＋ＴＲＡＣ－Ｂ２Ｍ－抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容した。２５日目に、腫瘍の再チャレンジが開始され、５×１０^６個のＡ４９８細胞が治療されたマウスの左側腹部及び新たな対照群（群４）に注入された。腫瘍体積は、試験の期間に週に２回測定された。各点は、平均腫瘍体積±標準誤差を表す。

【図11】ＣＴＸ１３０細胞の再投与を伴う皮下Ａ４９８異種移植モデルにおいてＣＴＸ１３０細胞の有効性を試験した結果を示すグラフを含む。平均腫瘍サイズがおよそ４５３ｍｍ^３の平均サイズに達したとき、マウスは、未治療のままにされたか又はマウス当たり８．６×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞を静脈内注射された（Ｎ＝５）。群２のマウスは、それぞれ１７日目及び３６日目にマウス当たり８．６×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞の第２及び第３の用量で治療された。群３のマウスは３６日目にマウス当たり８．６×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞の第２の用量で治療された。腫瘍体積は、試験の期間に週に２回測定された。各点は、平均腫瘍体積±標準誤差を表す。

【図12A】３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞に暴露されたヒト卵巣腫瘍異種移植モデル（例えば、ＳＫＯＶ－３腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。

【図12B】３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞に暴露されたヒト非小細胞肺腫瘍異種移植モデル（例えば、ＮＣＩ－Ｈ１９７５腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。

【図12C】３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞に暴露されたヒト膵臓腫瘍異種移植モデル（例えば、Ｈｓ７６６Ｔ腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。

【図12D】３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞に暴露されたヒト胃腫瘍異種移植モデル（例えば、ＳＮＵ－１腫瘍細胞）における腫瘍体積の減少を評価するために設計された実験からの結果を示すグラフを含む。

【図13】ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する成人対象へのＣＴＸ１３０細胞投与を評価する例示的な臨床試験設計を示す模式図である。ＤＬＴ：用量規制毒性；Ｍ：月；ｍａｘ：最大；ｍｉｎ：最小。ＤＬＴ評価期間は、ＣＴＸ１３０注入後の最初の２８日である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細が以下の説明に記載される。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明並びに添付の特許請求の範囲からも明白になるであろう。

【0032】

ＣＤ７０は、ＩＩ型膜タンパク質及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーＣＤ２７のためのリガンド（Ｇｏｏｄｗｉｎ，（１９９３）Ｃｅｌｌ，７３，４４７－４５６）であり、健康な組織発現分布は、ヒト及びマウスの両方において活性化リンパ球並びに樹状細胞及び胸腺上皮細胞のサブセットに限定される（Ｈｉｎｔｚｅｎ，（１９９４）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２，１７６２－１７７３；Ｇｒｅｗａｌ，（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，１２，３４１－５１；Ｃｏｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２１０，７１５－７２８；Ｔｅｓｓｅｌａａｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７０，３３－４０）。ＣＤ２７を発現したＴ細胞と樹状細胞の表面上で発現されるＣＤ７０のライゲーションは、Ｔ細胞活性化及びＴＮＦ／ＴＮＦＲ対の増殖特性に寄与する共刺激シグナルを生成する（Ｗａｔｔｓ，（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３，２３－６８）。加えて、ＣＤ７０はそれ自体、活性化リンパ球上で上方制御されるシグナル伝達分子であり、制御されないＴ細胞増殖を制限するチェックポイントとして作用し得る（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９，３７００－３７１０）。ＣＤ２７は、構成的に発現されたＴ細胞表面受容体であり、リンパ球のＣＤ２７－ＣＤ７０に媒介される刺激は、ＣＤ７０の制限された空間的及び時間的発現パターンによって主に制御される。通常、ＣＤ７０は、活性化リンパ球の表面に最大で数日間残存する（Ｈｉｎｔｚｅｎ，（１９９４）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２，１７６２－１７７３；Ｌｅｎｓ，（１９９９）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１０６，４９１－５０３；Ｎｏｌｔｅ，（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２９，２１６－３１）。

【0033】

その堅固に制御された正常組織発現とは対照的に、ＣＤ７０は一般的に、多くの固形腫瘍において高いレベルで発現される（Ｆｌｉｅｓｗａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ，１１ １１６１，１－１３，２０１９；Ｇｒｅｗａｌ，（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，１２，３４１－５１；Ｗａｊａｎｔ，２０１６ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，２０，９５９－７３）。正常組織におけるＣＤ７０の限定的な発現パターン及び様々な悪性腫瘍におけるその広範な発現は、それを抗体に基づく療法のための魅力的な標的にする。

【0034】

驚くべきことに、本明細書で開示されるとおりの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、様々な皮下ＣＤ７０陽性固形腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍量を順調に減少させ、腫瘍細胞への再暴露後に腫瘍増殖を妨げた長期間のインビボ有効性を示した。具体的には、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、卵巣、肺、膵臓、及び胃の異種移植モデルにおいて腫瘍量を著しく減少させた。腫瘍量の著しい減少はまた、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与後に観察された。

【0035】

したがって、本開示は、いくつかの態様では、ＣＤ７０陽性固形腫瘍を治療するための抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の治療的使用を提供する。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞、そのようなものを生成する方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ手法を介して）、並びに本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を作製するための構成要素及びプロセス（例えば、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ手法及びそこで使用される構成要素）もまた、本開示の範囲内である。

【0036】

Ｉ．抗ＣＤ７０同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞
本明細書では、ＣＤ７０発現癌（例えば、ＣＤ７０＋固形腫瘍）を治療する際の使用のための抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）が開示される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子、又はそれらの組み合わせを有する同種異系Ｔ細胞である。特定の例では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、内在性ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ７０遺伝子が破壊されている。当技術分野で知られる任意の好適な遺伝子編集方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）を使用するヌクレアーゼ依存性標的化編集が、本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するために使用され得る。

【0037】

抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の例示的な遺伝子改変は、Ｔ細胞アルファ定常（ＴＲＡＣ）、β２Ｍ、ＣＤ７０、又はそれらの組み合わせの標的化された破壊を含む。ＴＲＡＣ座位を破壊することで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の減少がもたらされ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を低減させることが意図される一方、β２Ｍ座位を破壊することで、主要組織適合複合体タイプＩ（ＭＨＣ Ｉ）タンパク質の発現の減少がもたらされ、宿主拒絶反応の可能性を低減させることによって持続性を向上させることが意図される。ＣＤ７０の破壊は、ＣＤ７０の発現の減少をもたらし、これはＣＤ７０ ＣＡＲの挿入の前に起こり得る細胞と細胞の兄弟殺しを妨げる。抗ＣＤ７０ ＣＡＲを加えることにより、改変Ｔ細胞がＣＤ７０発現腫瘍細胞に誘導される。

【0038】

抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、ＣＤ７０に特異的な抗ＣＤ７０単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に続いて、細胞内共シグナル伝達ドメイン（例えば、４－１ＢＢ共刺激ドメイン）及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合されるヒンジドメイン及び膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメイン）を含み得る。

【0039】

（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞によって発現される抗原を認識し、結合するように操作されている人工の免疫細胞受容体を指す。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ－Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。さらに、ＣＡＲは、Ｔ細胞に発現する場合、有利には、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。

【0040】

様々な世代のＣＡＲが存在し、その各々が異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介して抗体に由来するｓｃＦｖをＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するための追加の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳを組み込んでいる。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲのＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組み合わせ）を含有する。（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。様々な世代のＣＡＲコンストラクトは、いずれも本開示の範囲内である。

【0041】

一般に、ＣＡＲは、標的抗原（例えば、抗体の単鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）又は他の抗体フラグメント）を認識する細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであり、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含み、これは、ほとんどの場合に共刺激ドメインである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲコンストラクトはさらに、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間にヒンジ及び膜貫通ドメインを含む場合があり、表面に発現するためにＮ末端にシグナルペプチドを含む場合がある。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号５２）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号５３）が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用されてもよい。

【0042】

（ａ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、Ｖ_Ｈフラグメント及びＶ_Ｌフラグメントは、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖフラグメントは、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖフラグメントが誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化Ｖ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及び／又はＶ_Ｌドメインは、完全ヒト型である。

【0043】

抗原結合細胞外ドメインは、目的の標的抗原、例えば、腫瘍抗原などの病的抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、通常、全く発現されない場合があるか、又は低レベルでのみ発現される場合がある非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞中において高レベルで発現されるタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍関連抗原」である。いくつかの実施形態では、腫瘍を内部に持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と称される。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、ほとんどの種類の腫瘍によって広範に発現される場合、普遍的な腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異性抗原、過剰発現細胞抗原又はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に固有のタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍特異抗原」又は「ＴＳＡ」である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞中、例えば特定の種類の腫瘍細胞中のみで発現される。

【0044】

いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ７０に結合することができるｓｃＦｖ細胞外ドメインを含む。抗ＣＤ７０ ＣＡＲの例は、下の実施例で提供される。

【0045】

（ｂ）膜貫通ドメイン
本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜にまたがる疎水性αヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含有し得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を指す。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらし得る。

【0046】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが、本明細書に提供されるとおりに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧ ＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲ（配列番号５４）又はＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号５５）の配列を含有するＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。他の膜貫通ドメインが使用されてもよい。

【0047】

（ｃ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。

【0048】

いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの他の領域に１つ以上のヒンジドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであり得る。他のヒンジドメインが使用されてもよい。

【0049】

（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲコンストラクトのいずれも、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ及び任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。

【0050】

ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞が同種抗原と会合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。多くの場合、ＣＤ３ζは、初代Ｔ細胞の活性化シグナルを提供するが、十分に適格な活性化シグナルではなく、共刺激シグナル伝達を必要とする。

【0051】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲポリペプチドはさらに、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達とともにＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの共刺激ドメインを使用して、十分な増殖／生存シグナルを伝達し得る。いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子を含む。他の例では、本明細書に開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。さらに他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。

【0052】

本明細書に記載される方法は、ＣＡＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞、例えば当技術分野において知られるか又は本明細書で開示される遺伝子改変Ｔ細胞を生成するために使用することができる２つ以上の好適なＣＡＲを包含することが理解されるはずである。実施例は、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットにおいて見出すことができ、以前の出願の各々の関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題に関して参照により本明細書に組み込まれる。

【0053】

例えば、ＣＡＲは、ＣＤ７０（「ＣＤ７０ ＣＡＲ」又は「抗ＣＤ７０ ＣＡＲ」としても知られる）に結合する。ＣＤ７０に結合する例示的なＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号４６において提供される。

【0054】

【表1】

【0055】

【表2】

【0056】

【表3】

【0057】

【表4】

【0058】

【表5】

【0059】

【表6】

【0060】

【表7】

【0061】

（ｉｉ）ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及び／又はＣＤ７０遺伝子のノックアウト
本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞はさらに、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子、又はそれらの組み合わせを有し得る。ＴＲＡＣ座位を破壊することで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の減少がもたらされ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を低減させることが意図される一方、β２Ｍ座位を破壊することで、主要組織適合複合体タイプＩ（ＭＨＣ Ｉ）タンパク質の発現の減少がもたらされ、宿主拒絶反応の可能性を低減させることによって持続性を向上させることが意図される。ＣＤ７０遺伝子の破壊は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する際の兄弟殺しの影響を最小化することになる。さらに、ＣＤ７０遺伝子の破壊は、結果として生じる操作されたＴ細胞の活力及び活性を予想外に増大させた。抗ＣＤ７０ ＣＡＲを加えることにより、改変Ｔ細胞がＣＤ７０発現腫瘍細胞に誘導される。

【0062】

本明細書で使用する場合、「破壊された遺伝子」という用語は、コードされている遺伝子産物の活性を実質的に減少させるか又は完全に排除するように、野生型の対応物に対して１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失又はヌクレオチド置換など）を含む遺伝子を意味する。非コード領域、例えば、プロモーター領域、転写若しくは翻訳を調節する調節領域；又はイントロン領域に１つ以上の変異が位置し得る。或いは、コード領域に（例えば、エクソンに）１つ以上の変異が位置し得る。場合により、破壊された遺伝子は、コード化タンパク質を発現しないか、又は大幅に減少したレベルのコード化タンパク質を発現する。他の場合において、破壊された遺伝子は、機能的ではないか又は実質的に低減された活性を有する変異形態のコードされたタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、この遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体による、例えばフローサイトメトリーによる）のタンパク質を（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と称され得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍタンパク質が、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出できない場合、β２Ｍノックアウト細胞とみなされ得る。

【0063】

いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型の対応物に対して変異したフラグメントを含むものと説明され得る。変異したフラグメントは、欠失、ヌクレオチド置換、付加又はこれらの組み合わせを含み得る。他の実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型の対応物に存在するフラグメントに欠失があるものと説明することができる。場合により、欠失させたフラグメントの５’末端が、本明細書で開示されるような設計されたガイドＲＮＡ（オンターゲット配列として知られる）によって標的化される遺伝子領域内に位置してもよく、欠失させたフラグメントの３’末端が標的領域の範囲を超えてもよい。或いは、欠失させたフラグメントの３’末端が標的領域内に位置してもよく、欠失させたフラグメントの５’末端が標的領域の範囲を超えてもよい。

【0064】

場合により、本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、欠失、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１内のフラグメントの欠失を含み得る。いくつかの例では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＲＡＣのガイドＲＮＡ、ＴＡ－１の標的部位である、配列番号１７のヌクレオチド配列を含むフラグメントの欠失を含む。下記の配列表を参照されたい。いくつかの例では、配列番号１７のフラグメントは、抗ＣＤ７０ ＣＡＲをコードする核酸によって置換され得る。そのような破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４４のヌクレオチド配列を含み得る。

【0065】

本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊されたＢ２Ｍは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して作製され得る。いくつかの例では、下記の配列表に示されるＢ２ＭのｇＲＮＡを使用することができる。破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、配列番号３１～３６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。下記の表４を参照されたい。

【0066】

或いは又は加えて、本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊されたＣＤ７０遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を使用して作製され得る。いくつかの例では、下記の配列表で提供されるＣＤ７０ ｇＲＮＡを使用することができる。破壊されたＣＤ７０遺伝子は、配列番号３７～４２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。下記の表５を参照されたい。

【0067】

（ｉｉｉ）例示的な抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞
いくつかの例では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、及びＣＤ７０遺伝子を有するＣＤ７０指向性Ｔ細胞であるＣＴＸ１３０細胞である。ＣＴＸ１３０細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用するエクスビボでの遺伝子改変を介して生成され得る。

【0068】

また、本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ並びに破壊されたＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ７０遺伝子を発現する遺伝子操作された細胞（例えば、ＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９に媒介されて遺伝子編集された）を含む抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞の集団）も本開示の範囲内であり；且つ抗ＣＤ７０ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入される。

【0069】

遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、１つ以上のヌクレオチドを挿入するか又は欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用する）を介した遺伝子改変を包含することが理解されるはずである。本明細書で使用する場合、用語「破壊された遺伝子」は、コードされた遺伝子産物の活性を実質的に低減するか又は完全に消失させるために野生型対応物に対して１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失、又はヌクレオチド置換など）を含有する遺伝子を指す。非コード領域、例えばプロモーター領域、転写若しくは翻訳を調節する調節領域又はイントロン領域に１つ以上の変異が位置し得る。或いは、コード領域に（例えば、エクソンに）１つ以上の変異が位置し得る。場合により、破壊された遺伝子は、コード化タンパク質を発現しないか、又は大幅に減少したレベルのコード化タンパク質を発現する。他の場合において、破壊された遺伝子は、機能的ではないか又は実質的に低減された活性を有する変異形態のコードされたタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体によって、例えば、フローサイトメトリーによって）のタンパク質を、（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と称され得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍタンパク質が、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出できない場合、β２Ｍノックアウト細胞とみなされ得る。

【0070】

本明細書で提供される例は、編集されたＴ細胞を作製すること、及びＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように編集Ｔ細胞を操作し、それにより抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、内在性ＴＲＡＣ、β２Ｍ、及びＣＤ７０遺伝子が破壊された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成することについて記載する。

【0071】

特定の場合において、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、標的化された遺伝子を破壊するＣＲＩＳＰＲ技術、及びＣＡＲコンストラクトを送達するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入を使用して生成されるＣＴＸ１３０細胞である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集は、３つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む：ＣＤ７０遺伝子座を標的化するＣＤ７０－７ ｓｇＲＮＡ（配列番号２）、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号６）、及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ（配列番号１０）。ＣＴＸ１３０細胞の抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、ＣＤ７０に特異的な抗ＣＤ７０単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）に続く４－１ＢＢの細胞内共シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合されるＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメインで構成される。そのため、ＣＴＸ１３０は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用してエクスビボで遺伝子改変される同種異系のＴ細胞で構成されるＣＤ７０指向性Ｔ細胞免疫療法である。

【0072】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない可能性がある。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない可能性がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。

【0073】

或いは又は加えて、ＣＴＸ１３０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない可能性がある。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴＲＡＣ表面タンパク質を発現しない可能性がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴＲＡＣ表面タンパク質を発現しない。

【0074】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない可能性がある。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない可能性がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、９０％～１００％、又は９５％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。

【0075】

いくつかの実施形態では、かなりの割合のＣＴＸ１３０細胞の集団は、２つ以上の遺伝子編集を含んでもよく、これにより２つ以上の遺伝子及び／又はタンパク質を発現しない一定の割合の細胞がもたらされる。

【0076】

例えば、ＣＴＸ１３０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルの２つの表面タンパク質を発現しない可能性があり、例えば、検出可能なレベルのβ２Ｍ及びＴＲＡＣタンパク質、β２Ｍ及びＣＤ７０タンパク質、又はＴＲＡＣ及びＣＤ７０タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルの２つ表面タンパク質を発現しない。別の例では、ＣＴＸ１３０細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルの３つの標的表面タンパク質β２Ｍ、ＴＲＡＣ、及びＣＤ７０タンパク質の全てを発現しない可能性がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ、ＴＲＡＣ、及びＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。

【0077】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の集団は、本明細書に記載される編集であり得る２つ以上の遺伝子編集（例えば、２つ以上の遺伝子内における）を含み得る。例えば、ＣＴＸ１３０細胞の集団は、ガイドＲＮＡ ＴＡ－１（表２、配列番号６～７も参照のこと）を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を介して破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含み得る。或いは又は加えて、ＣＴＸ１３０細胞の集団は、Ｂ２Ｍ－１のガイドＲＮＡ（表２、配列番号１０～１１も参照のこと）を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を介して破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含み得る。そのようなＣＴＸ１３０細胞は、β２Ｍ遺伝子内にインデルを含む場合があり、これらは表４に列挙されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む。例えば、ＣＴＸ１３０細胞の集団は、ガイドＲＮＡ ＣＤ７０－７（表２、配列番号２～３も参照のこと）を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を介して破壊されたＣＤ７０遺伝子を含み得る。さらに、ＣＴＸ１３０細胞の集団は、ＣＤ７０遺伝子内にインデルを含む場合があり、これらは表５に列挙される１つ以上のヌクレオチド配列を含み得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子内に欠失を含み得る。例えば、ＣＴＸ１３０細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子、又はその一部においてフラグメントＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号１７）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個の連続した塩基対を含む配列番号１７のフラグメントの欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子内に配列番号１７のフラグメントを含む欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、配列番号１７の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において、配列番号１７を含む欠失を含む。

【0079】

さらに、ＣＴＸ１３０細胞の集団は、本明細書で開示されるもの（例えば、配列番号４６）などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現する細胞を含み得る。抗ＣＤ７０ ＣＡＲのコード配列は、例えば、ガイドＲＮＡ ＴＡ－１（表２、配列番号６～７も参照のこと）によって標的化される領域でＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され得る。そのような場合において、例示的な抗ＣＤ７０ ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の少なくとも３０％ 少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＣＡＲ＋細胞である。本明細書で参照される主題及び目的に対してその各々の関連する開示が参照により組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットも参照されたい。

【0081】

特定の例において、本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）は、≧３０％のＣＡＲ＋Ｔ細胞、≦０．４％のＴＣＲ＋Ｔ細胞、≦３０％のＢ２Ｍ＋Ｔ細胞、及び≦２％のＣＤ７０＋Ｔ細胞を有するＴ細胞の集団である。

【0082】

（ｉｖ）医薬組成物
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団のいずれか、例えば、ＣＴＸ１３０細胞を含む医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を提供する。そのような医薬組成物は、ヒト患者の癌治療に使用することができ、これも本明細書で開示される。

【0083】

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、適切な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に相当する、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症を伴わない、対象の組織、臓器、及び／又は体液と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。組成物としては、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩又は塩基付加塩を挙げることができる。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１－１９を参照されたい。

【0084】

いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、薬学的に許容される塩を含む。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、酸付加塩が挙げられる（無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などといった有機酸を含むポリペプチドの遊離アミノ基から形成される）。いくつかの実施形態では、遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄）又は有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される）。

【0085】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、凍結保存溶液（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｃ５５）中に懸濁させた、遺伝子操作された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の集団を含む。本開示に使用される凍結保存溶液は、アデノシン、ブドウ糖、デキストラン４０、ラクトビオン酸、ショ糖、マンニトール、Ｎ－）２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などの緩衝剤、１つ以上の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素カリウム、リン酸カリウムなど）、１つ以上の塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）又はこれらの組み合わせも含み得る。凍結保存溶液の構成成分は、滅菌水（注射品質）に溶解され得る。凍結保存溶液は、いずれも血清を実質的に含まない（常法では検出できない）ものであり得る。

【0086】

場合により、凍結保存溶液（例えば、血清を実質的に含まない）中に懸濁させた、ＣＴＸ１３０細胞などの遺伝子操作された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物は、保存バイアルに入れられ得る。

【0087】

本明細書で開示されるとおりの凍結保存溶液中に任意選択により懸濁され得る、本明細書でさらに開示されとおりの遺伝子操作された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の集団を含む、本明細書で開示される医薬組成物のいずれも、Ｔ細胞の生存及び生理活性に実質的に影響を及ぼさない環境において、例えば、細胞及び組織を保存するのに一般的に適用される条件下において、将来使用するために保存され得る。いくつかの例では、医薬組成物は、≦－１３５℃の液体窒素の気相中で保存され得る。細胞をそのような条件で一定期間保存した後、外観、細胞数、生存率、％ＣＡＲ^＋Ｔ細胞、％ＴＣＲ^＋Ｔ細胞、％Ｂ２Ｍ^＋Ｔ細胞、及び％ＣＤ７０^＋Ｔ細胞に関する著しい変化は、観察されなかった。

【0088】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、ＣＴＸ１３０細胞などの本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、注入のための懸濁液であり得る。いくつかの例では、懸濁液は、≧３０％のＣＡＲ＋Ｔ細胞、≦０．４％のＴＣＲ＋Ｔ細胞、≦３０％のＢ２Ｍ＋Ｔ細胞、及び≦２％のＣＤ７０＋Ｔ細胞とともに約２５～８５×１０^６細胞／ｍｌ（例えば、５０×１０^６細胞／ｍｌ）を含み得る。いくつかの例では、懸濁液は、約２５×１０^６個のＣＡＲ＋細胞／ｍｌを含み得る。特定の例では、医薬組成物は、それぞれＣＴＸ１３０細胞（例えば、生存細胞）などの約１．５×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を含むバイアル中に置かれ得る。他の例では、医薬組成物は、それぞれＣＴＸ１３０細胞（例えば、生存細胞）などの約３×１０^８個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を含むバイアル中に置かれ得る。

【0089】

ＩＩ．抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の調製
当技術分野で知られる任意の好適な遺伝子編集方法、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）が、本明細書で開示される遺伝子操作された免疫細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞などのＴ細胞）を作製するために使用され得る。特定の例では、ＣＴＸ１３０細胞などの遺伝子操作された免疫細胞は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＶＶ）をドナー鋳型として使用する相同組換えと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ技術によって生成される。

【0090】

（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集システム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの略称であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡのフラグメント（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡのフラグメントが原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外因性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの多数の種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。

【0091】

ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ内の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ内の５’ ２０ｎｔの配列を変更することにより、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を特定の遺伝子座に標的化させることが可能になる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）の後にある場合、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔと一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。

【0092】

ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いでこのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって標的ＤＮＡを切断することができる。

【0093】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終端する（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。

【0094】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の重要な工程は、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組み換え修復（ＨＤＲ）を使用する。

【0095】

ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大部分の細胞型において高度に活性であるように見える頑健な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位において１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような修飾は、典型的には、＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。或いは、ＨＤＲは、内因的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、ＮＨＥＪが修復オペラントとして利用される。

【0096】

（ａ）Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書に開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるとおり、野生型Ｃａｓ９が使用され得るか、又はＣａｓ９の改変されたバージョン（例えば、Ｃａｓ９の進化させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）が使用され得ることが理解されるはずである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）を含むように改変されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵によって生成され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、本明細書では配列番号１として示される。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）：

【0097】

【化1】

【0098】

（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書で記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に媒介される遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ、すなわちｇＲＮＡの使用を含む。本明細書で使用する場合、「ｇＲＮＡ」は、特定の標的配列で遺伝子を編集するために、Ｃａｓ９をＣＤ７０遺伝子又はＴＲＡＣ遺伝子又はβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を指す。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。

【0099】

ＣＤ７０遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号２において提供される。本明細書で参照される主題及び目的に対してその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットも参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１９番染色体上に位置するＣＤ７０遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：染色体１９：６，５８３，１８３－６，６０４，１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００１２５７２６）。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＣＤ７０ゲノム領域に切断を生じさせてＣＤ７０遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊する。

【0100】

ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号６において提供される。本明細書で参照される主題及び目的に対してその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットも参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；アンサンブル；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＴＲＡＣゲノム領域に切断を生じさせてＴＲＡＣ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。

【0101】

β２Ｍ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号１０において提供される。本明細書で参照される目的及び主題に対してその関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットも参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７～４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するβ２Ｍ遺伝子におけるインデルをもたらすβ２Ｍゲノム領域における切断をもたらす。

【0102】

【表8】

【0103】

【表9】

【0104】

ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。ＩＩ型のｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型のｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとが複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、この部位特異的ポリペプチドとの会合による複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。

【0105】

当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。

【0106】

いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。

【0107】

二重分子ガイドＲＮＡは、２つの鎖のＲＮＡ分子を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。

【0108】

ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）を付与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。

【0109】

「標的配列」とは、ＰＡＭ配列に隣接している標的遺伝子のことであり、Ｃａｓ９によって改変される配列のことである。「標的配列」は、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含有する二本鎖分子である「標的核酸」内のいわゆるＰＡＭ鎖上にある。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。

【0110】

例えば、ＣＤ７０標的配列が５’－ＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＴＣＧＣ－３’（配列番号１５）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＵＵＧＧＵＣＣＣＡＵＵＧＧＵＣＧＣ－３’（配列番号５）である。別の例では、ＴＲＡＣ標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１７）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号９）である。さらに別の例では、β２Ｍ標的配列が５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１９）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ－３’（配列番号１３）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて変化する。

【0111】

本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素によって認識可能なＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。

【0112】

いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を有する。例えば、

【0113】

【化2】

【0114】

を含む配列では、標的核酸は、Ｎに対応する配列であってもよく、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであってもよく、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである。

【0115】

ｇＲＮＡ中のスペーサー配列は、目的の標的遺伝子の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号４において提供される。ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号８において提供される。β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号１２において提供される。

【0116】

本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列によって目的の任意の配列を標的化し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的遺伝子内の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列は、最大で１０個のミスマッチ、例えば最大で９個、最大で８個、最大で７個、最大で６個、最大で５個、最大で４個、最大で３個、最大で２個、又は最大で１個のミスマッチを含有し得る。

【0117】

本明細書で提供されるとおりに使用され得るｇＲＮＡの非限定的な例は、本明細書で参照される目的及び主題に対して以前の出願の各々の関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット、及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットにおいて提供される。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれかに関して、修飾を明確に示していないものは、未修飾の配列と任意の好適な修飾を有する配列の両方を包含することを意味する。

【0118】

本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及びさらに本明細書に開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列長を有する。したがって、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又は５０個超の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含み得る。

【0119】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであってもよく、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長のスペーサー配列を含む。

【0120】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えばｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７又は８個のウラシル残基を含むことができる。

【0121】

ｓｇＲＮＡのいずれかを含む、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれも未修飾であり得る。或いは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド及び／又は修飾された主鎖を含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡなどの改変ｇＲＮＡは、５’末端、３’末端のいずれか又は両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。

【0122】

ある実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内での活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。

【0123】

２つ以上の好適なＣａｓ９及び２つ以上の好適なｇＲＮＡが、本明細書に記載される方法、例えば、当技術分野において知られるか又は本明細書で開示される方法に使用され得ることは理解されるはずである。いくつかの実施形態では、方法は、当技術分野において知られるＣａｓ９酵素及び／又はｇＲＮＡを含む。例は、例えば、本明細書で参照される目的及び主題に対して以前の出願の各々の関連する開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレット及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットにおいて見出され得る。

【0124】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、表３の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＴＲＡＣ遺伝子においてインデルを生成する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（例えば、配列番号６）は、表３の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＴＲＡＣ遺伝子においてインデルを生成する。

【0125】

【表10】

【0126】

いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、表４の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むβ２Ｍ遺伝子においてインデルを生成する。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（例えば、配列番号１０）は、表４の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むβ２Ｍ遺伝子においてインデルを生成する。

【0127】

【表11】

【0128】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、表５の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＣＤ７０遺伝子においてインデルを生成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、表５の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＣＤ７０遺伝子においてインデルを生成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（例えば、配列番号２）は、表５の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＣＤ７０遺伝子においてインデルを生成する。

【0129】

【表12】

【0130】

（ｉｉ）ＣＡＲコンストラクトをＴ細胞に送達するためのＡＡＶベクター
ＣＡＲコンストラクトをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組込み、したがって、ＣＡＲなどの導入遺伝子を送達することができる小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノム中には、転写されるとＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するか、したがって、いずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。

【0131】

アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型の選択を考慮に入れると、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組み込むことなしに宿主細胞中で残存し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この形質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。

【0132】

ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞内の目的のゲノム部位に挿入するように設計され得る。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー遺伝子座内にあり得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ぶことが可能なドナー鋳型を介して）遺伝子操作されたＴ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊してＣＡＲポリペプチドを発現させるために、ＴＲＡＣ遺伝子内の位置に挿入できるように設計され得る。ＴＲＡＣの破壊により、内在性ＴＣＲの機能の喪失がもたらされる。例えば、本明細書に記載されるものなどのエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、ＴＲＡＣ遺伝子における破壊を生じさせることができる。この目的のために、ＴＲＡＣ遺伝子及び標的部位に特異的なｇＲＮＡのいずれか、例えば本明細書で開示されるものを使用することができる。

【0134】

いくつかの例では、相同組換え修復、すなわちＨＤＲ（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用する）により、ＴＲＡＣ遺伝子内のゲノム欠失及びＣＡＲをコードするセグメントによる置換を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、且つＣＡＲをコードするセグメントをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。

【0135】

本明細書に開示されるとおりのドナー鋳型は、ＣＡＲのコード配列を含有し得る。いくつかの例では、ＣＡＲをコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、目的のゲノム位置、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子で効率的なＨＤＲを行うことができるように、２つの相同性領域に隣接し得る。この場合、標的遺伝子座に特異的なｇＲＮＡによって誘導されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により、ＤＮＡの両方の鎖を標的遺伝子座で切断することができる。続いて、ＨＤＲが発生して二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これを正しく発生させるために、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的に誤りのない機構とすることを可能にする。相同組み換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含むことができるか、又はゲノム配列と異なる配列を含むことができ、これによって配列編集が可能になる。

【0136】

或いは、ドナー鋳型は、ＤＮＡの標的化された位置と相同性のある領域がなくてもよく、標的部位で切断された後にＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。

【0137】

ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、直鎖状又は環状形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方若しくは両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性のポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、並びに、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

【0138】

ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性コード遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として細胞に導入することができるか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。

【0139】

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内在性プロモーターによって駆動することができるように、内在性プロモーターの近傍の部位（例えば、下流又は上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために、外因性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターが使用されてもよい。

【0140】

さらに、外因性の配列は、転写又は翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含み得る。

【0141】

ＩＩＩ．ＣＤ７０発現腫瘍の治療
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ７０を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により操作される。ＣＤ７０は、Ｔ細胞の増殖及び生存に関与する共刺激受容体であるＣＤ２７に対するリガンドとして最初に同定された。ＣＤ７０は、ウイルス感染中の流入領域リンパ節において少ないパーセンテージの活性化Ｔ細胞及び抗原提示細胞上においてのみ見出される。乳癌、胃癌、卵巣癌、及び神経膠芽腫などの固形癌を含むがこれらに限定されない多くのヒト腫瘍もまた、ＣＤ７０を発現する。正常組織におけるその限定的な発現パターン（Ｆｌｉｅｓｗａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ，（２０１９）１１：１６１１）及び多くの癌における過剰発現のために、ＣＤ７０は、魅力的な治療標的である。本明細書に提供されるとおりに治療され得る癌（例えば、固形腫瘍）の他の非限定的な例としては、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、リンパ腫、及び／又は黒色腫が挙げられる。

【0142】

いくつかの態様では、本明細書において、ＣＤ７０発現腫瘍（例えば、ＣＤ７０＋固形腫瘍）を有するヒト患者を、本明細書で開示されるとおりのＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの集団を使用して治療するための方法が提供される。

【0143】

そのような治療方法は、１回以上の用量の１つ以上のリンパ球枯渇剤を好適なヒト患者に与えることを含む、移植前処置（リンパ球枯渇治療）、及び本明細書で開示されるとおりのＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団のヒト患者への投与を含む治療レジメン（抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞療法）を含み得る。該当する場合、複数の用量の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞がヒト患者に与えられる場合があり、リンパ球枯渇治療は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の各投与の前にヒト患者に適用され得る。

【0144】

（ｉ）患者集団
ヒト患者は、診断、治療又は療法が望まれる任意のヒト対象であり得る。ヒト患者は、任意の年齢であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、成人である（例えば、少なくとも１８歳の人間）。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、小児であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、≧６０ｋｇの体重を有する。

【0145】

本明細書に記載される方法によって治療されることになるヒト患者は、ＣＤ７０＋固形腫瘍（例えば、肺癌、胃癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、及び／又はそれらの組み合わせ）を有するか、有することが疑われるか、又は有するリスクがあるヒト患者であり得る。ＣＤ７０＋固形腫瘍を有すると疑われる対象は、癌の１つ以上の症状、例えば、疲労、皮膚の下で感じられる場合がある肥厚のしこり若しくは領域、原因不明の体重減少若しくは体重増加を含む体重変化、皮膚の変化（例えば、皮膚の黄変、黒化若しくは発赤、治癒しない糜爛、又は既存のほくろに対する変化）、排便若しくは排尿習慣の変化、長引く咳若しくは呼吸困難、嚥下困難、嗄声、食後の遷延性の消化不良若しくは不快感、遷延性の原因不明の筋肉痛若しくは関節痛、遷延性の原因不明の熱若しくは寝汗、又は原因不明の出血若しくは内出血を示し得る。

【0146】

ＣＤ７０＋固形腫瘍のリスクがある対象は、ＣＤ７０＋固形腫瘍に関するリスク因子、例えば、年齢、喫煙、肥満、高血圧、日光への過剰な暴露、化学物質及び／若しくはウイルスへの暴露、家族歴、又は遺伝的条件の１つ以上を有する対象であり得る。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）治療を必要とするヒト患者は、通例の医学的試験、例えば、臨床検査、生検、画像検査（例えば、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン、超音波検査、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、及びＸ線）によって同定され得る。

【0147】

本明細書で提供されるとおりに治療され得るＣＤ７０＋固形腫瘍の例としては、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、及び／又は黒色腫が挙げられる。

【0148】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって治療されることになるヒト患者は、当技術分野で知られる任意の方法によって、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はフローサイトメトリーなどの免疫アッセイによって同定され得るＣＤ７０発現腫瘍細胞（ＣＤ７０発現腫瘍）を含む腫瘍を有するヒト患者であり得る。

【0149】

本明細書で開示される方法のいずれかはさらに、患者におけるＣＤ７０＋腫瘍細胞の存在及び／又はレベルに基づく同種異系抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ療法に好適なヒト患者を同定する工程を含み得る。

【0150】

本明細書に記載される方法によって治療されることになるヒト患者は、進行性固形腫瘍、例えば、切除不能な又は転移性の固形腫瘍を有するヒト患者であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、治療後に再発し、且つ／又は治療に対して抵抗性になっており、且つ／又は治療に対して反応を示さない固形腫瘍を有し得る。本明細書に記載される方法によって治療されることになるヒト患者は、最近の前治療を有したヒト患者であり得る。或いは、ヒト患者は、前治療を受けていなくてもよい。

【0151】

本明細書で開示される方法を使用して治療されるヒト患者のいずれかは、それに続く治療を受ける場合がある。例えば、ヒト患者は、抗サイトカイン療法にかけられる。別の例では、ヒト患者は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団による治療の後に自系又は同種異系造血幹細胞移植にかけられる。

【0152】

いくつかの実施形態では、ヒト患者は、再発性又は難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する。本明細書で使用する場合、「難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍」は、治療に応答しないか又は抵抗性になるＣＤ７０＋固形腫瘍を指す。本明細書で使用する場合、「再発性ＣＤ７０＋固形腫瘍」は、完全奏効の期間の後に再発するＣＤ７０＋固形腫瘍を指す。いくつかの実施形態では、治療後に再発が起こる。他の実施形態では、治療中に再発が起こる。応答の欠如は、定期的な医療行為によって判断され得る。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、再発性ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する。

【0153】

患者が移植前処置（リンパ球枯渇治療）及び／又は治療レジメン（抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞療法）を受けるのに適格であるかどうかを判断するために、ヒト患者がスクリーニングされ得る。例えば、リンパ球枯渇治療に適格なヒト患者は、以下の特徴：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）制御されない心不整脈、（ｄ）血管収縮薬の支援を必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。別の例では、治療レジメンに適格なヒト患者は、以下の特徴：（ａ）活動性の制御されない感染症、（ｂ）リンパ球枯渇治療前の臨床状態と比較して臨床状態が悪化していること、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性（例えば、ＩＣＡＮＳ）の１つ以上を示さない。

【0154】

ヒト患者をスクリーニングして、そのようなスクリーニング結果に基づいて移植前処置及び／又は治療レジメンから除外してもよい。例えば、患者が以下の除外基準のいずれかを満たす場合、ヒト患者は、移植前処置及び／又は治療レジメンから除外され得る：（ａ）任意の抗ＣＤ７０標的化薬剤による前治療、（ｂ）任意のＣＡＲ Ｔ細胞又は任意の他の改変されたＴ若しくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による前治療、（ｃ）任意のリンパ球枯渇治療又は任意の治療レジメンの賦形剤のいずれかに対する前のアナフィラキシー反応、（ｄ）脳転移を示す脳脊髄液（ＣＳＦ）又は核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に由来する検出可能な悪性細胞、（ｅ）臨床的に意味のあるＣＮＳ病理の病歴又は存在、（ｆ）スクリーニング前の６ヶ月以内の不安定狭心症、不整脈、又は心筋梗塞、及び（ｇ）制御されない急性の生命を脅かす細菌、ウイルス、又は真菌感染症。場合により、ヒト患者は、６．５％又は４８ｍｍｏｌ／ｍｌのＨＢＡ１ｃレベルを有する糖尿病を有しない。

【0155】

リンパ球枯渇治療にかけられるヒト患者は、ＣＴＸ１３０細胞などの本明細書で開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の１つ以上の用量を受容することに対する適格性についてスクリーニングされ得る。例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞治療にとって適格なリンパ球枯渇治療にかけられるヒト患者は、以下の特徴の１つ以上を示さない：（ａ）活動性の制御されない感染症、（ｂ）臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性（例えば、ＩＣＡＮＳ）。

【0156】

抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の各投与の後、ヒト患者は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）、神経毒性、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、オンターゲット・オフ腫瘍毒性、及び／又は制御されないＴ細胞増殖などの急性毒性についてモニターされ得る。オンターゲット・オフ腫瘍毒性は、活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、骨芽細胞及び／又は腎尿細管様上皮に対する遺伝子操作されたＴ細胞の集団の活性を含み得る。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の各投与の後、ヒト患者は、毒性の発症に関して少なくとも２８日間モニターされ得る。

【0157】

ヒト患者が急性毒性の１つ以上の症状を示す場合、ヒト患者は毒性管理にかけられ得る。急性毒性の１つ以上の症状を示す患者に対する治療は、当技術分野において知られている。例えば、ＣＲＳの症状（例えば、心臓、呼吸器及び／又は神経的異常）を示すヒト患者に抗サイトカイン療法を施し得る。加えて、ＣＲＳの症状を示さないヒト患者に抗サイトカイン療法を施して、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を促進し得る。

【0158】

或いは又は加えて、ヒト患者が急性毒性の１つ以上の症状を示す場合、ヒト患者の治療を終了し得る。患者が１つ以上の有害事象（ＡＥ）の徴候を示す、例えば患者に異常な検査所見があり、且つ／又は患者が疾患進行の徴候を示す場合にも患者の治療を終了し得る。

【0159】

（ｉｉ）移植前処置（リンパ球枯渇療法）
本明細書で開示される治療方法に好適な任意のヒト患者は、対象の内在性リンパ球を減少又は枯渇させるためにリンパ球枯渇療法を受け得る。

【0160】

リンパ球枯渇は、内在性リンパ球及び／又はＴ細胞を破壊することを指し、一般に免疫移植療法及び免疫療法前に使用される。リンパ球枯渇は、放射線照射及び／又は化学療法によって達成することができる。「リンパ球枯渇剤」は、対象に投与したとき、内在性リンパ球及び／又はＴ細胞を減少、枯渇又は排除することが可能な任意の分子であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤は、薬剤を投与する前のリンパ球の数と比較して、リンパ球の数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％だけ減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤は、対象のリンパ球の数が検出限界以下となるような、リンパ球の数を減少させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ以上の）リンパ球枯渇剤が投与される。

【0161】

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇剤は、特異的にリンパ球を死滅させる細胞傷害性薬剤である。リンパ球枯渇剤の例としては、フルダラビン、シクロホスファミド、ベンダムスチン、５－フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ダカルバジン、メルファラン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、リン酸エトポシド、ミトキサントロン、クラドリビン、デニロイキンジフチトクス、又はＤＡＢ－ＩＬ２が挙げられるが、これらに限定されない。場合により、リンパ球枯渇剤は、低線量の放射線照射と併用され得る。移植前処置のリンパ球枯渇効果は、通常の診療でモニターされ得る。

【0162】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つ以上のリンパ球枯渇剤、例えば、フルダラビン及びシクロホスファミドを含む移植前処置を含む。本明細書に記載される方法によって治療を受けるヒト患者は、複数用量の１つ以上のリンパ球枯渇剤を移植前段階の適切な期間（例えば、１～５日間）に受容し得る。患者は、リンパ球枯渇期間中、リンパ球枯渇剤の１つ以上を１日当たり１回受容し得る。一例において、ヒト患者は、１日当たり約２０～５０ｍｇ／ｍ^２（例えば、３０ｍｇ／ｍ^２）のフルダラビンを２～４日間（例えば、３日間）及び１日当たり約３００～６００ｍｇ／ｍ^２（例えば、５００ｍｇ／ｍ^２）のシクロホスファミドを２～４日間（例えば、３日間）受容する。一例において、ヒト患者は、１日当たり約２０～５０ｍｇ／ｍ^２（例えば、２０ｍｇ／ｍ^２又は３０ｍｇ／ｍ^２）のフルダラビンを２～４日間（例えば、３日間）及び１日当たり約３００～６００ｍｇ／ｍ^２（例えば、５００ｍｇ／ｍ^２）のシクロホスファミドを２～４日間（例えば、３日間）受容する。別の例において、ヒト患者は、１日当たり約２０～３０ｍｇ／ｍ^２（例えば、２５ｍｇ／ｍ^２）のフルダラビンを２～４日間（例えば、３日間）及び１日当たり約３００～６００ｍｇ／ｍ^２（例えば、３００ｍｇ／ｍ^２又は４００ｍｇ／ｍ^２）のシクロホスファミドを２～４日間（例えば、３日間）受容する。必要があれば、シクロホスファミドの用量は、例えば、１，０００ｍｇ／ｍ^２まで増加されてもよい。

【0163】

次に、ヒト患者は、本明細書で開示されるとおりのリンパ球枯渇療法後の適切な期間内において、ＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを投与され得る。例えば、ヒト患者は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（例えば、例としてＣＴＸ１３０細胞）を投与する約２～７日（例えば、２、３、４、５、６、７日）前に１つ以上のリンパ球枯渇剤に晒され得る。

【0164】

ＣＴＸ１３０細胞などの同種異系抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、事前に調製することができるため、本明細書で開示されるとおりのリンパ球枯渇療法は、本明細書で開示される同種異系抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法にヒト患者が好適であると同定された後の短い期間内（例えば、２週間以内）において、ＣＤ７０＋腫瘍を有するヒト患者に適用され得る。

【0165】

本明細書に記載される方法は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を有するヒト患者に再投与することを包含する。そのような例において、ヒト患者は、再投与の前にリンパ球枯渇治療にかけられる。例えば、ヒト患者は、第１のリンパ球枯渇治療及びＣＴＸ１３０の第１の用量に続いて、第２のリンパ球枯渇治療及びＣＴＸ１３０の第２の用量にかけられ得る。別の例において、ヒト患者は、第１のリンパ球枯渇治療及びＣＴＸ１３０の第１の用量、第２のリンパ球枯渇治療及びＣＴＸ１３０の第２の用量、並びに第３のリンパ球枯渇治療及びＣＴＸ１３０の第３の用量にかけられ得る。

【0166】

リンパ球枯渇工程のいずれかの前に（例えば、最初のリンパ球枯渇工程の前又はＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与と関連するいずれかの後に続くリンパ球枯渇工程の前）、ヒト患者は、患者がリンパ球枯渇治療に適格であるかどうかを判断するための１つ以上の特徴についてスクリーニングされ得る。例えば、リンパ球枯渇前に、リンパ球枯渇治療に適格なヒト患者は、以下の特徴：（ａ）臨床状態の著しい悪化、（ｂ）９０％超の飽和レベルを維持するために酸素補給を必要とすること、（ｃ）制御されない心不整脈、（ｄ）血管収縮薬の支援を必要とする低血圧、（ｅ）活動性感染症、及び（ｆ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。

【0167】

リンパ球枯渇後、ヒト患者が抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療に適格であるかどうかを判断するために、ヒト患者は、１つ以上の特徴についてスクリーニングされ得る。例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞治療前及びリンパ球枯渇治療後、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞治療に適格なヒト患者は、以下の特徴：（ａ）活動性の制御されない感染症、（ｂ）臨床状態の悪化、及び（ｃ）グレード≧２の急性神経毒性の１つ以上を示さない。

【0168】

（ｉｉｉ）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与
本開示の態様は、ＣＤ７０＋固形腫瘍を治療する方法であって、ヒト患者をリンパ球枯渇治療にかけること及びある用量の本明細書に記載される遺伝子操作されたＴ細胞（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の集団をヒト患者に投与することを含む方法を提供する。

【0169】

抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与は、所望の効果を生じさせることができるように、腫瘍部位などの所望の部位に遺伝子操作されたＴ細胞集団の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、遺伝子操作されたＴ細胞集団のヒト患者への配置（例えば、移植）を含み得る。対象の所望の位置に送達をもたらす任意の適切な経路によって遺伝子操作されたＴ細胞集団を投与することができるが、この場合、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部は、生存したままである。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）という短い期間から数日、数年又はさらに対象の寿命（すなわち、長期の生着）という長さまでであり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団を、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与することができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団を全身に投与し、これは、細胞の集団を標的部位、組織又は臓器に直接投与するのではなく、代わりに対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様のプロセスを受けるように投与することを指す。好適な投与の様式としては、注射、注入、点滴又は経口摂取が挙げられる。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、並びに胸骨内注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。

【0171】

有効量は、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要な遺伝子操作されたＴ細胞集団の量を指し、所望の効果をもたらす、例えば、医学的状態を有する対象を治療するのに十分な量の遺伝子操作されたＴ細胞集団に関する。有効量としては、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量も挙げられる。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、通常の実験を使用して当業者により決定できることが理解される。

【0172】

遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効量は、約１×１０^６個の細胞～約１．０×１０^９個のＣＡＲ＋細胞、例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現する約３．０×１０^７個の細胞～約１．０×１０^９個の細胞（ＣＡＲ^＋細胞）、例えば、ＣＡＲ^＋ ＣＴＸ１３０細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現する約３．０×１０^７個のＣＡＲ＋細胞～約９×１０^８個の細胞、例えば、ＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団は、少なくとも３．０×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも４×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも５．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも６×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも６．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも７×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも８×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、少なくとも８．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞、又は少なくとも９×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞を含み得る。いくつかの例では、ＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞の量は、１×１０^９個の細胞を超えない場合がある。

【0173】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約３．０×１０^７～約３×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、例えば、約１×１０^７～約１×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞又は約１×１０^８～約３×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約１．５×１０^８～約３×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。

【0174】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約３．０×１０^８～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、例えば、約３．５×１０^８～約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞又は約３．５×１０^８～約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約４．５×１０^８～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約４．５×１０^８～約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約６×１０^８～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約７．５×１０^８～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。

【0175】

特定の例では、有効量の本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）は、約３．０×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含み得る。例えば、有効量の本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）は、約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含み得る。他の例では、有効量の本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）は、約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含み得る。いくつかの例では、有効量の本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）は、約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含み得る。さらに他の例では、有効量の本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）は、約９×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含み得る。

【0176】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約３×１０^８～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約３×１０^８～約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約３×１０^８～約６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりの遺伝子操作されたＴ細胞集団（例えば、ＣＴＸ１３０細胞）の有効量は、約３×１０^８～約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞の範囲であり得る。

【0177】

いくつかの実施形態では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団は、ある用量の遺伝子操作されたＴ細胞集団、例えば、約３．０×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞～約９×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞を含む用量、例えば、本明細書で開示される任意の用量又は用量の範囲を含み得る。いくつかの例では、有効量は、４．５×１０^６個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞である。いくつかの例では、有効量は、６×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞である。いくつかの例では、有効量は、７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞である。いくつかの例では、有効量は、９×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞である。

【0178】

いくつかの例では、進行性ＣＤ７０＋固形腫瘍（例えば、切除不能な又は転移性のＣＤ７０＋固形腫瘍）又は再発性／難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する患者は、好適な用量のＣＴＸ１３０細胞、例えば、約３×１０^７～約６×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が与えられ得る。そのような固形腫瘍患者は、約３×１０^７個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。或いは、固形腫瘍患者は、約１×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。別の例では、固形腫瘍患者は、約３×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。別の例では、固形腫瘍患者は、約４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。別の例では、固形腫瘍患者は、約６×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。別の例では、固形腫瘍患者は、約７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。別の例では、固形腫瘍患者は、約９×１０^８個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。

【0179】

いくつかの例では、進行性ＣＤ７０＋固形腫瘍（例えば、切除不能な又は転移性のＣＤ７０＋固形腫瘍）又は再発性／難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する患者は、好適な用量のＣＴＸ１３０細胞、例えば、約９×１０^９～約１．０×１０^９個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が与えられ得る。そのような固形腫瘍患者は、約９×１０^９個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。或いは、固形腫瘍患者は、約１．０×１０^９個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０細胞が投与され得る。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の好適な用量は、各々が約１．５×１０^８個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞を含む医薬組成物の１つ以上のバイアルから投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の好適な用量は、各々が約３×１０^８個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞を含む医薬組成物の１つ以上のバイアルから投与される。いくつかの実施形態では、対象に投与されるＣＴＸ１３０細胞の好適な用量は、１．５×１０^８の１倍以上のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又は６倍のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＴＸ１３０細胞の好適な用量は、医薬組成物の１つ以上の完全な又は部分的なバイアルから投与される。

【0181】

本明細書に記載される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞療法の有効性は、訓練された臨床医によって判断され得る。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状のＣＤ７０のレベルが有利な様式で変化する（例えば、少なくとも１０％減少する）場合又はＣＤ７０＋固形腫瘍の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善又は回復される場合、「有効」であるとみなされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価されるとおり、対象が悪化しないことによっても測定され得る（例えば、ＣＤ７０＋固形腫瘍の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、且つ／又は本明細書で記載される。治療は、ヒト患者におけるＣＤ７０＋固形腫瘍の任意の治療を含み、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を止めるか若しくは遅くすること；又は（２）疾患を軽減すること、例えば、症状の退行をもたらすこと；及び（３）症状の発症を予防するか若しくはその可能性を減少させることを含む。

【0182】

本明細書に記載される治療方法は、リンパ球枯渇を反復すること及び抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与を包含する。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞のそれぞれの再投与の前に、患者は、別のリンパ球枯渇治療にかけられる。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の用量は、第１、第２、及び第３の用量に関して同じであり得る。例えば、第１、第２、及び第３の用量の各々は、１×１０^６個のＣＡＲ＋細胞、１×１０^７個のＣＡＲ＋細胞、３×１０^７個のＣＡＲ＋細胞、１×１０^８個のＣＡＲ＋細胞、１．５×１０^８個のＣＡＲ＋細胞、４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、６×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋細胞、９．８×１０^８、又は１×１０^９個のＣＡＲ＋細胞である。他の場合、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の用量は、投与の数が増加するにつれてＣＡＲ＋細胞の数が増加する場合がある。例えば、第１の用量は、１×１０^６個のＣＡＲ＋細胞であり、第２の用量は、１×１０^７個のＣＡＲ＋細胞であり、第３の用量は、１×１０^８個のＣＡＲ＋細胞である。或いは、ＣＡＲ＋細胞の第１の用量は、ＣＡＲ＋細胞の第２及び／又は第３の用量より少なく、例えば、第１の用量は、１×１０^６個のＣＡＲ＋細胞であり、第２及び第３の用量は、１×１０^８個のＣＡＲ＋細胞である。いくつかの例では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の用量は、それぞれのその後の用量に関して１．５×１０^８ＣＡＲ＋細胞だけ増加し得る。

【0183】

患者は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞のそれぞれの投与の後に再投与について評価され得る。例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の第１の用量の後、ヒト患者は、患者が以下の１つ以上を示さない場合、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の第２の用量を受容するのに適格であり得る：（ａ）用量規制毒性（ＤＬＴ）、（ｂ）７２時間以内にグレード２に回復しないグレード４のＣＲＳ、（ｃ）グレード＞１のＧｖＨＤ、（ｄ）グレード≧３の神経毒性、（ｅ）活動性感染症、（ｆ）血行動態的に不安定、及び（ｇ）臓器不全。別の例では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の第２の用量の後、ヒト患者は、患者が以下の１つ以上を示さない場合、ＣＴＸ１３０の第３の用量を受容するのに適格であり得る：（ａ）用量規制毒性（ＤＬＴ）、（ｂ）７２時間以内にグレード２に回復しないグレード４のＣＲＳ、（ｃ）グレード＞１のＧｖＨＤ、（ｄ）グレード≧３の神経毒性、（ｅ）活動性感染症、（ｆ）血行動態的に不安定、及び（ｇ）臓器不全。

【0184】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるとおりのヒト患者は、複数の用量の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、本明細書で開示されるとおりのＣＴＸ１３０細胞）を与えられ得る、すなわち、再投与され得る。ヒト患者は、合計で最大３用量まで与えられ得る（すなわち、２回以下の再投与）。２つの連続した用量の間の間隔は、約８週～約２年であり得る。いくつかの例では、ヒト患者は、患者が、第１の用量（又は第２の用量）の後に部分奏効（ＰＲ）又は完全奏効（ＣＲ）に達し、その後最後の用量の２年以内に進行した場合、再投与され得る。他の例では、ヒト患者は、患者が直近の投与の後にＰＲ（ただしＣＲではない）又は安定な疾患（ＳＤ）に達したとき、再投与され得る。下の実施例１１も参照されたい。

【0185】

ＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の第１の用量の約８週～約２年後に行われ得る。例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の第１の用量の約８～１０週後に行われ得る。他の例では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再投与は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の第１の用量の約１４～１８週後に行われ得る。患者が２つの用量を投与されるとき、第２の用量は、前の用量の８週～２年（例えば、８～１０週又は１４～１８週）後に投与され得る。いくつかの例では、患者は、３つの用量が投与され得る。第３の用量は、第１の用量の１４～１８週後に投与されてもよく、第２の用量は、第１の用量の６～１０週後に投与されてもよい。場合により、２つの連続した用量の間の間隔は、約６週～１０週であり得る。

【0186】

抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の各投与の後、ヒト患者は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）、神経毒性（例えば、ＩＣＡＮＳ）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、オンターゲット・オフ腫瘍毒性、及び／又は制御されないＴ細胞増殖などの急性毒性についてモニターされ得る。オンターゲット・オフ腫瘍毒性は、活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、骨芽細胞及び／又は腎尿細管様上皮に対する遺伝子操作されたＴ細胞の集団の活性を含み得る。以下の潜在的な毒性の１つ以上もまたモニターされ得る：低血圧（ｈｙｔｏｔｅｎｓｉｏｎ）、腎不全、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、遷延性血球減少症、及び／又は薬物性肝障害。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の各投与の後、ヒト患者は、毒性の発症に関して少なくとも２８日間モニターされ得る。毒性の発症が観察される場合、ヒト患者は、毒性管理にかけられ得る。急性毒性の１つ以上の症状を示す患者に対する治療は、当技術分野において知られている。例えば、ＣＲＳの症状（例えば、心臓、呼吸器及び／又は神経的異常）を示すヒト患者に抗サイトカイン療法を施し得る。加えて、ＣＲＳの症状を示さないヒト患者に抗サイトカイン療法を施して、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を促進し得る。

【0187】

本明細書に記載される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞治療法は、以前に抗癌療法を受けたことがあるヒト患者に対して使用され得る。例えば、本明細書に記載されるとおりの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子阻害剤、又はそれらの組み合わせで以前に治療されたことがある患者に投与され得る。

【0188】

本明細書に記載される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞治療法はまた、組み合わせ療法において使用され得る。例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞治療法は、ＣＤ７０＋固形腫瘍を治療するか若しくは遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効性を高めるために、且つ／又は遺伝子操作されたＴ細胞集団の副作用を低減するために他の治療剤とともに使用され得る。

【0189】

ＩＶ．ＣＤ７０発現腫瘍を治療するためのキット
本開示はまた、ＣＤ７０＋固形腫瘍を治療するための方法において、本明細書で記載されるとおりのＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団の使用のためのキットを提供する。そのようなキットには、１つ以上のリンパ球枯渇剤を含む第１の医薬組成物、任意の核酸又は遺伝子操作されたＴ細胞の集団（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む第２の医薬組成物、及び薬学的に許容される担体を含む１つ以上の容器を含み得る。

【0190】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかにおける使用のための指示書を含み得る。添付される指示書は、ヒト患者において意図される活性を実現するために、第１及び／又は第２の医薬組成物を対象に投与することに関する説明を含み得る。キットはさらに、ヒト患者が治療を必要とするかどうかを同定することに基づいて、治療に好適なヒト患者を選択することに関する説明を含み得る。いくつかの実施形態では、指示書は、治療が必要なヒト患者に第１及び第２の医薬組成物を投与することに関する説明を含む。

【0191】

本明細書に記載されるＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の集団の使用に関する指示書は、一般に、意図される治療に関する投与量、投与スケジュール、及び投与経路などの情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）又は副単位用量であり得る。本開示のキットにおいて与えられる指示書は通常、ラベル又は添付文書上に記載された指示書である。ラベル又は添付文書は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団が、対象におけるＣＤ７０＋固形腫瘍を治療し、発症を遅らせ、且つ／又は軽減するために使用されることを示す。

【0192】

本明細書で提供されるキットは、好適な包装の中にある。好適な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装などが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、鼻腔投与器具、又は注入器具などの特定の器具と組み合わせて使用するための包装も考えられる。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針が貫通可能なストッパーのある静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。容器にも無菌のアクセスポートがあり得る。医薬組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書で開示されるようなＣＴＸ１３０細胞などの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団である。

【0193】

キットは、任意選択により、緩衝剤及び解説情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器及び容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製造物品を提供する。

【0194】

一般的技術
本開示の実施は、別段の指摘がない限り、当技術分野の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を利用することになる。こうした技術は、例えば下記の文献で十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６≫；及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。

【0195】

当業者であれば、さらなる詳述なしに、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、決して以下の本開示を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的のために又は主題に対して参照により組み込まれる。

【実施例】

【0196】

記載される発明がより十分に理解され得るようにするために、以下の実施例が記載される。本出願で記載される実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物を説明するために提供されるものであり、いかなる意味でもそれらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0197】

実施例１：多重遺伝子ノックアウトを有するＴ細胞の生成。
この実施例は、２つ又は３つの遺伝子の発現を同時に欠くヒトＴ細胞を生成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術の使用を記載する。具体的には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（ＴＣＲアルファ定常（ＴＲＡＣ）領域において編集された遺伝子）、β２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、及び表面抗原分類７０（ＣＤ７０）遺伝子が、列挙された遺伝子の２つ以上においてＴ細胞欠損を生成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって編集された。以下の略称が、簡潔さ及び明確さのために使用される：
２Ｘ ＫＯ：ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－
３Ｘ ＫＯ（ＣＤ７０）：ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－

【0198】

活性化された初代ヒトＴ細胞は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体で電気穿孔された。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、５×１０^６細胞、１μＭのＣａｓ９及び５μＭのｇＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（９）：９８５－９８９，ＰＭＩＤ：２６１２１４１５に記載される）を含有した。二重ノックアウトＴ細胞（２Ｘ ＫＯ）の生成のために、細胞は、各々が上に示される濃度でＣａｓ９タンパク質並びに以下のｓｇＲＮＡ：ＴＲＡＣ（配列番号６）及びβ２Ｍ（配列番号１０）の１つを含有する２つの異なるＲＮＰ複合体で電気穿孔された。三重ノックアウトＴ細胞（３Ｘ ＫＯ）の生成のために、細胞は、各ＲＮＰ複合体がＣａｓタンパク質並びに以下のｓｇＲＮＡ：（ａ）ＴＲＡＣ（配列番号６）、β２Ｍ（配列番号１０）、及びＣＤ７０（配列番号２又は６６）の１つを含有する３つの異なるＲＮＰ複合体で電気穿孔された。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３、７、１１、及び／又は６７）。表６における配列も参照されたい。

【0199】

【表13】

【0200】

エレクトロポレーションの約１週間後、細胞は、未処理のままであるか又は酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）／イオノマイシンで一晩処理された。翌日、細胞をフローサイトメトリーのために処理して（例えば、Ｋａｌａｉｔｚｉｄｉｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１７；１２７（４）：１４０５－１４１３を参照のこと）、編集された細胞集団の細胞表面でＴＲＡＣ、β２Ｍ、及びＣＤ７０の発現レベルを評価した。以下の一次抗体が使用された（表７）：

【0201】

【表14】

【0202】

表８は、非常に効率的な多重遺伝子編集を示す。三重ノックアウト細胞に関して、生存細胞の８０％が、ＴＣＲ、β２Ｍ、及びＣＤ７０の発現を欠いた（表８）。

【0203】

【表15】

【0204】

Ｔ細胞における三重遺伝子編集が細胞の増殖に影響するかどうかを評価するため、細胞数を、二重及び四重遺伝子編集されたＴ細胞（未編集のＴ細胞が、対照として使用された）の間で編集後２週間にわたって数え上げた。５×１０^６細胞が生成され、Ｔ細胞の各遺伝子型について蒔かれた。

【0205】

細胞増殖（拡大）は、エレクトロポレーション後の期間の試験にわたって継続した。同様の細胞増殖は、生存細胞の数によって示されるとおり、二重（β２Ｍ－／ＴＲＡＣ－）及び三重（β２Ｍ－／ＴＲＡＣ－／ＣＤ７０－）ノックアウトＴ細胞の間で観察された（データは示さず）。これらのデータは、多重遺伝子編集が、Ｔ細胞増殖によって測定されるとおりのＴ細胞の活力に影響を及ぼさないことを示唆する。

【0206】

実施例２：多重ノックアウトを有する抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の生成。
この実施例は、ＴＣＲ遺伝子、β２Ｍ遺伝子、及び／又はＣＤ７０遺伝子の発現を欠き、且つＣＤ７０を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する同種異系ヒトＴ細胞の産生を記載する。これらの細胞は、ＴＣＲ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋又は３Ｘ ＫＯ（ＣＤ７０）ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋と呼ばれる。

【0207】

配列番号４３のヌクレオチド配列を含む（配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ＣＡＲをコードする、配列番号４４におけるドナー鋳型を含む）組換えアデノ随伴アデノウイルスベクター、血清型６（ＡＡＶ６）（ＭＯＩ ５０，０００）が、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭ Ｃａｓ９、５μＭ ｇＲＮＡ）とともに活性化された同種異系ヒトＴ細胞に送達された。以下のｓｇＲＮＡを使用した：ＴＲＡＣ（配列番号６）、β２Ｍ（配列番号１０）、及びＣＤ７０（配列番号２又は６６）。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号３、７、１１、及び／又は６７）。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞をフローサイトメトリーのために処理して、編集された細胞集団の細胞表面でのＴＲＡＣ、β２Ｍ、及びＣＤ７０発現レベルを評価した。以下の一次抗体が使用された（表９）：

【0208】

【表16】

【0209】

Ｔ細胞比率アッセイ。次に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の比率が、以下の抗体（を使用するフローサイトメトリーによって、編集されたＴ細胞集団において評価された表１０）。

【0210】

【表17】

【0211】

高効率の遺伝子編集及びＣＡＲ発現は、編集された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞集団において達成された。加えて、編集は、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞集団を不利に変化させなかった。図１は、三重ノックアウトＣＡＲ Ｔ細胞における非常に効率的な遺伝子編集及び抗ＣＤ７０ ＣＡＲ発現を示す。５５％を超える生存細胞が、ＴＣＲ、β２Ｍ、及びＣＤ７０の発現を欠き、抗ＣＤ７０ ＣＡＲも発現した。図２は、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞サブセットの正常な比率が、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞において維持されたことを示し、これは、これらの多重遺伝子編集が、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞サブセットの比率によって測定されるとおり、Ｔ細胞の生態に影響を及ぼさないことを示唆している。

【0212】

実施例３：インビトロでの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞増殖に対するＣＤ７０ ＫＯの効果
ＣＡＲ Ｔ細胞においてＣＤ７０遺伝子を破壊することの影響をさらに評価するため、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、実施例２に記載されるとおりに生成された。具体的には、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、２つの異なるｇＲＮＡ（Ｔ７（配列番号２）及びＴ８（配列番号６６））を使用して生成された。エレクトロポレーションの後、細胞増殖は、編集後の２週間にわたって二重又は三重遺伝子編集されたＴ細胞を数え上げることによって評価された。５×１０^６細胞が生成され、Ｔ細胞の各遺伝子型について蒔かれた。増殖は、生存細胞の数を計数することによって決定された。図３は、Ｔ７又はＴ８ ｇＲＮＡのいずれかで生成された三重ノックアウトＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞が、二重ノックアウトＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と比較して高い細胞増殖を示したことを示す。これらのデータは、ＣＤ７０遺伝子をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞に細胞増殖の優位性をもたらすことを示唆する。

【0213】

実施例４：ＣＤ７０ノックアウトを有する抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞を死滅させる機能
細胞死滅アッセイを使用して、ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞及びＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のＣＤ７０^＋接着腎細胞癌（ＲＣＣ）由来細胞株（Ａ４９８細胞）を死滅させる能力を評価した。接着細胞を、ウェル当たり５０，０００細胞で９６ウェル中に播種し、３７℃で一晩置いた。翌日、編集された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を、指定の比率で標的細胞を含有するウェルに加えた。指定されたインキュベーション期間の後、ＣＡＲ Ｔ細胞を、吸引によって培養物から除去し、１００μＬのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をプレートの各ウェルに加えて、残留している生存細胞の数を評価した。次に、ウェル当たりの放出された光の量を、プレートリーダーを使用して定量化した。細胞は、２４時間の共インキュベーション後にＲＣＣ由来細胞の強力な細胞の死滅を示した（図４）。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ７０がノックアウトされた場合により高い効力を示したが、これは、低いＴ細胞：Ａ４９８比（１：１及び０．５：１）で明白に目に見え、ここで、細胞溶解は、ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞については９０％を超えたままであるが、ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞については細胞溶解が９０％未満に落ちる。このことは、ＣＤ７０遺伝子をノックアウトすることが、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞により高い細胞死滅の能力をもたらすことを示唆する。

【0214】

実施例５：ＣＤ７０のノックアウトは連続的な再チャレンジ時に抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の死滅を維持した。
上で生成された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、ＣＤ７０＋腎臓癌細胞株Ａ４９８で連続的に再チャレンジされ、それらのＣＤ７０＋腎臓癌細胞株Ａ４９８を死滅させる能力について評価された。

【0215】

Ａ４９８細胞は、Ｔ２５フラスコ中に蒔き、２つ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－）又は３つ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－）のｇＲＮＡ編集のいずれかを含有する１０×１０^６個の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞とともに２：１（Ｔ細胞対Ａ４９８）の比で混合された。３つの編集を有する抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＴＸ１３０とも称される。

【0216】

各チャレンジの２日又は３日後、細胞は計数され、洗浄され、新鮮なＴ細胞培地中で再懸濁され、１個のＡ４９８細胞当たり２個の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の同じ比（２：１、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞：標的）で翌日に再チャレンジされた。ＣＤ７０＋ Ａ４９８細胞による抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のチャレンジは、１３回繰り返された。Ａ４９８細胞に対するそれぞれの暴露の後の３～４日後（及び次の再チャレンジの前）、一定分量の培養物を採取し、２：１（ＣＡＲ Ｔ細胞：標的細胞）の比でＡ４９８標的細胞を死滅させるＣＡＲ Ｔ細胞の能力について分析した。細胞の死滅は、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定された。Ａ４９８による最初のチャレンジの前に、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－）及び３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－）を有する抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の各々が、１００％に近づいているＡ４９８細胞の標的細胞の死滅を示した。しかしながら、チャレンジ９によって、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、４０％未満のＡ４９８細胞の標的細胞の死滅を誘導した一方で、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞は、６０％を超える標的細胞死滅を示した（図５）。３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に関する標的細胞の死滅は、Ａ４９８細胞による１３回の再チャレンジ後でさえ６０％を超えたままであり、これらのＣＡＲ＋Ｔ細胞が枯渇に耐性であったことを実証している。

【0217】

実施例６：ＣＤ７０＋細胞の存在下での抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＴＸ１３０）によるサイトカイン分泌の測定
この試験の目的は、ＣＤ７０発現細胞の存在下でエフェクターサイトカインを分泌するＣＴＸ１３０の能力を評価することであった。

【0218】

標的癌細胞株（Ａ４９８、ＡＣＨＮ及びＭＣＦ７）は、ＡＴＣＣ（ＨＴＢ－４４、ＣＲＬ－１６１１及びＨＴＢ－２２）から得られた。標的細胞株上でのＣＤ７０の発現が評価された。簡潔には、ＣＴＸ１３０又は対照Ｔ細胞（未編集Ｔ細胞）を、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて０．１２５：１から最大４：１のＴ細胞と標的細胞の様々な比で標的細胞株と共培養した。細胞を、各実験において記載されるとおり、合計２００μＬの標的細胞培地中において２４時間培養した。アッセイを、ＩＬ－２及びＩＬ－７の添加を含有しない培地中で実施して、補助的なサイトカインの非存在下でのＴ細胞活性化を評価した。

【0219】

ＣＤ７０陽性又はＣＤ７０陰性標的細胞との共培養の後にＣＴＸ１３０又は対照Ｔ細胞（抗ＣＤ７０ ＣＡＲ発現を有しない未編集Ｔ細胞）がエフェクターサイトカインインターフェロン－γ（ＩＮＦγ）及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）を特異的に分泌する能力は、本明細書に記載されるとおりのＬｕｍｉｎｅｘに基づくＭＩＬＬＩＰＬＥＸアッセイを使用して評価された。Ａ４９８及びＡＣＨＮ細胞株をＣＤ７０^＋標的株として使用し、ＭＣＦ７細胞株をＣＤ７０－標的株として使用した。アッセイは、細胞傷害性アッセイと組み合わせて実施されたため、プロトコルは以下のとおりであった：標的細胞を、一晩播種し（９６ウェルプレート当たり５０，０００個の標的細胞）、続いて様々な比（０．１２５：１、０．２５：１、０．５：１、１：１、２：１及び４：１のＴ細胞と標的細胞）でＣＴＸ１３０又は対照Ｔ細胞と共培養した。２４時間後、プレートを遠心分離し、上清を回収し、さらに処理するまで－８０℃で保管した。ＩＬ－２及びＩＦＮγを、以下のとおりに定量化した：ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）を使用して、それぞれ磁性微粒子、ＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ）及びＨＩＬ２－ＭＡＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ＃ＨＩＬ２－ＭＡＧ）を使用してＩＦＮ－γ及びＩＬ－２分泌を定量化した。アッセイは、製造業者のプロトコルに従って実施された。要約すると、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）標準及び品質管理（ＱＣ）試料を再構成し、１０，０００ｐｇ／ｍＬ～３．２ｐｇ／ｍＬの実用標準の連続希釈を調製した。ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）標準、ＱＣ及び細胞上清を各プレートに添加し、アッセイ培地を用いて上清を希釈した。全ての試料を、ＨＣＹＩＦＮＧ－ＭＡＧ及びＨＩＬ２－ＭＡＧビーズとともに２時間インキュベートした。インキュベーションの後、自動磁気プレート洗浄機を使用してプレートを洗浄した。ヒトサイトカイン／ケモカイン検出抗体溶液を各ウェルに添加して１時間インキュベートし、続いてストレプトアビジン－フィコエリトリンで３０分間インキュベートした。続いてプレートを洗浄し、試料を１５０μＬのシース液で再懸濁させ、プレート振盪機上で５分間撹拌した。ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）ソフトウェアを備えたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００／２００（商標）機器を使用して試料を読み取り、データの取得及び分析を、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して完了させた。未知の試料中で測定されたサイトカイン濃度を計算するために、中央蛍光強度（ＭＦＩ）データが、５パラメーターのロジスティック曲線適合法を用いて自動的に分析される。

【0220】

ＣＴＸ１３０がＣＤ７０陽性及びＣＤ７０陰性細胞の存在下でサイトカインを分泌するかどうかを決定するために、開発ロット０１を、Ａ４９８、ＡＣＨＮ又はＭＣＦ７細胞と２４時間共培養した。ＣＴＸ１３０細胞は、ＣＤ７０＋細胞（Ａ４９８及びＡＣＨＮ）との共培養の後にＩＦＮγ及びＩＬ－２の両方を分泌したが、ＣＤ７０陰性細胞（ＭＣＦ７）と共培養したときはそれらを分泌しなかった（図６Ａ～６Ｃ、表１１～１６）。未編集の対照Ｔ細胞は、試験された細胞株に対して特異的なエフェクターサイトカイン分泌を示さなかった。

【0221】

【表18】

【0222】

【表19】

【0223】

【表20】

【0224】

【表21】

【0225】

【表22】

【0226】

【表23】

【0227】

これらの結果は、ＣＴＸ１３０細胞が、ＣＤ７０を発現する腎細胞癌の存在下でＩＦＮγ及びＩＬ－２を分泌することによってエフェクター機能を示すが、ＣＤ７０陰性細胞株ＭＣＦ７の存在下ではそれを示さないことを実証する。

【0228】

実施例７：抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＴＸ１３０）によるＣＤ７０＋細胞の選択的な死滅
この試験の目的は、インビトロでＣＤ７０発現細胞を選択的に溶解するＣＴＸ１３０の能力を評価することであった。

【0229】

ＣＤ７０陽性又はＣＤ７０陰性標的細胞を特異的に死滅させるＣＴＸ１３０又は対照Ｔ細胞（抗ＣＤ７０ ＣＡＲ発現を有しない未編集Ｔ細胞）の能力を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率に基づく細胞傷害性アッセイを使用して評価した。Ａ４９８及びＡＣＨＮ細胞株をＣＤ７０陽性標的株として使用し、ＭＣＦ７細胞株をＣＤ７０陰性標的株として使用した（全てがＡＴＣＣから得られた）。開発ロット０１からのＴ細胞を、これらの実験において使用した。

【0230】

不透明な壁で仕切られた９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）のウェル当たり５０，０００個のヒト標的細胞（ＣＤ７０陽性Ａ４９８及びＡＣＨＮ、ＣＤ７０陰性ＭＣＦ７）を、一晩蒔いた。翌日、細胞を、様々な比（０．１２５：１、０．２５：１、０．５：１、１：１、２：１及び４：１のＴ細胞と標的細胞）で２４時間Ｔ細胞と共培養した。標的細胞を、未編集Ｔ細胞（ＴＣＲ＋、Ｂ２Ｍ＋、ＣＡＲ－）、又はＣＴＸ１３０細胞とインキュベートした。Ｔ細胞をＰＢＳにより手動で洗い流した後、残留している生存標的細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ９２４２）を使用して定量化した。蛍光は、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して測定された。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ分析のために細胞を処理する前に、上清を、共培養の後のサイトカイン分泌の定量化のために回収した。

【0231】

次に、細胞溶解のパーセントを、相対発光単位（ＲＬＵ）を使用する以下の式を使用して計算した：
％細胞溶解＝（（エフェクターを有しない標的細胞のＲＬＵ－エフェクターを有する標的細胞のＲＬＵ））／（エフェクターを有しない標的細胞のＲＬＵ）×１００

【0232】

ＣＴＸ１３０の開発ロット（ロット０１）は、ＣＤ７０＋細胞株Ａ４９８及びＡＣＨＮに対する細胞死滅活性について試験された。ＣＴＸ１３０ロットは、高く（Ａ４９８；図７Ａ）及び低く（ＡＣＨＮ；図７Ｂ）ＣＤ７０を発現する細胞の両方に対して特異的に強力な細胞死滅活性を示したが、ＣＤ７０－ＭＣＦ７細胞（図７Ｃ）と共培養した場合はそれを示さなかった。ＣＡＲ発現がない場合、対照の未編集Ｔ細胞は、ＣＤ７０＋細胞を比較的低い効率で死滅させた。表１７～１９に示されるデータも参照されたい。

【0233】

【表24】

【0234】

【表25】

【0235】

【表26】

【0236】

これらの結果は、ＣＴＸ１３０細胞が、ＣＤ７０に特異的な様式でインビトロにおいて癌細胞株を溶解させることができたことを実証した。

【0237】

実施例８：ＣＤ７０ ＫＯは、複数の細胞型における細胞の死滅を増進する。
（ａ）様々な癌細胞株におけるＣＤ７０発現。
相対的なＣＤ７０発現を様々な癌細胞株において測定して、様々な癌型を死滅させる抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の能力をさらに評価した。ＣＤ７０発現は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＣＤ７０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５５１１５）を使用するＦＡＣＳ分析によって測定された。図８Ａは、他の腎臓癌細胞株Ａ４９８、７８６－Ｏ、ｃａｃｋｉ－１及びＣａｋｉ－２と比較した、ＦＡＣＳによって測定されるとおりのＡＣＨＮ細胞における相対的なＣＤ７０の発現を示す。さらに、非腎臓癌細胞株は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ヒトＣＤ７０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５５１１５；図８Ｂ）又はＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ７０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．Ｎｏ．３５５１０５；図８Ｃ）のいずれかを使用するＦＡＣＳ分析（表２０、図８Ａ～８Ｃ）によってＣＤ７０発現について評価された。ＳＮＵ－１（腸癌細胞）は、Ａ４９８と同様であった高レベルのＣＤ７０発現を示した（図８Ｂ）。ＳＫＯＶ－３（卵巣）、ＨｕＴ７８（リンパ腫）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５（肺）及びＨｓ－７６６Ｔ（膵臓）細胞株は、ＡＣＨＮと同様であるか又はより高いが、Ａ４９８より低いＣＤ７０発現のレベルを示した（表２０、図８Ｃ）。

【0238】

【表27】

【0239】

細胞死滅アッセイ。多重に遺伝子編集された抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞の様々な固形腫瘍を死滅させる能力は、細胞死滅アッセイを使用して判定された。細胞の死滅を定量するため、細胞は洗浄され、培地は、５ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地で置き換えられた（死／瀕死細胞を数え上げるため）。最後に、２５ｍＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、各ウェルに加えた。次に、細胞は、フローサイトメトリーによって処理された。
１）細胞／ｍＬ＝（（生存標的細胞イベントの数）／（ビーズイベントの数））×（（ロットの割り当てられたビーズカウント（ビーズ／５０μＬ））／（試料の体積））
２）合計の標的細胞は、細胞／ｍＬに細胞の総体積を掛けることによって計算された。
３）次に、細胞溶解のパーセントが、以下の式：
％細胞溶解＝（１－（（試験試料中の標的細胞の総数）／（対照試料中の標的細胞の総数））×１００
により計算された。

【0240】

実際に、ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋（３Ｘ ＫＯ（ＣＤ７０）、ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋）は、驚くべきことに、共培養のたった２４時間後に多数の固形腫瘍細胞株の強力な細胞死滅を示したことが見出された（図８Ｄは、３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋Ｔ細胞による死滅を示す）。３Ｘ ＫＯ、ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、４：１のエフェクター：標的細胞比で腎臓、膵臓、及び卵巣腫瘍細胞（Ａ４９８、ＡＣＨＮ、ＳＫ－ＯＶ－３、及びＨｓ－７６６Ｔ）の＞６０％を死滅させ、１：１のエフェクター：標的細胞比で＞５０％を死滅させた（図８Ｄ）。中程度から低いＣＤ７０発現を有した癌細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５、Ｃａｌｕ－１及びＤＵ １４５）の細胞の死滅は、共培養の２４時間以内で４：１のエフェクター：標的細胞比で＞３０％の死滅を有して依然として効率的であった（図８Ｅ）。３Ｘ ＫＯ ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞に対するより長い暴露（すなわち、９６時間）は、全ての細胞型、特に、ＳＫＯＶ－３、Ｈｓ－７６６Ｔ、及びＮＩＣ－Ｈ１９７５細胞全体にわたって癌細胞死滅の増加をもたらし、死滅は、１：１のエフェクター：標的細胞比で＞８０％であった（図８Ｅ）。

【0241】

（ｂ）さらなるＣＤ７０発現細胞株の選択的な死滅
ＣＤ７０発現細胞を選択的に死滅させる抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力が判定された。フローサイトメトリーアッセイを設計して、３Ｘ ＫＯ（ＣＤ７０）（ＴＲＡＣ^－／Ｂ２Ｍ^－／ＣＤ７０^－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞によって、癌細胞懸濁液株（例えば、「標的細胞」と呼ばれるＫ５６２、ＭＭ．１Ｓ及びＨｕＴ７８癌細胞）の死滅を試験した。使用された標的細胞株のうちの２つは、ＣＤ７０発現癌細胞（例えば、ＭＭ．１Ｓ及びＨｕＴ７８）であったが、陰性対照癌細胞として使用された３つ目は、ＣＤ７０発現を欠く（例えば、Ｋ５６２）。ＴＲＡＣ^－／Ｂ２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ＣＤ７０発現ＭＭ．１Ｓ若しくはＨｕＴ７８細胞株又はＣＤ７０陰性Ｋ５６２細胞株のいずれかと共培養された。標的細胞は、５μＭ ｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、９６ウェルＵ底プレートにおいて１ウェル当たり５０，０００標的細胞の密度で播種された。標的細胞は、様々な比（０．５：１、１：１、２：１及び４：１ ＣＡＲ＋Ｔ細胞対標的細胞）でＴＲＡＣ^－／Ｂ２Ｍ^－／ＣＤ７０^－抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共培養され、一晩インキュベートされた。標的細胞の死滅は、２４時間の共培養後に判定された。細胞は洗浄され、５ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地が各ウェルに加えられた（死／瀕死細胞を数え上げるため）。次に、細胞は、フローサイトメトリーによって分析され、残留している生存標的細胞の量が定量化された。

【0242】

図８Ｆ～８Ｈは、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０－抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞による選択的な標的細胞の死滅を実証している。３Ｘ ＫＯ（ＣＤ７０）ＣＡＲ＋Ｔ細胞との２４時間の共培養は、０．５：１の低いＣＡＲ＋Ｔ細胞とＣＤ７０発現標的細胞比でさえ、Ｔ細胞リンパ腫細胞（ＨｕＴ７８）のほぼ完全な死滅をもたらした（図８Ｈ）。同様に、２４時間の共培養は、試験された全てのＣＡＲ＋Ｔ細胞と標的細胞の比で多発性骨髄腫細胞（ＭＭ．１Ｓ）のほぼ完全な死滅をもたらした（図８Ｇ）。標的細胞の死滅は、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞が、試験されたいずれのエフェクター：標的細胞比でも対照試料（例えば、癌細胞単独又はＲＮＰ Ｔ細胞を伴わない共培養物）のレベルを上回るＣＤ７０欠損Ｋ５６２細胞の死滅を誘導しなかったという点で選択的であることが見出された（図８Ｆ）。

【0243】

ＳＮＵ－１細胞の死滅は、視覚的な評価によって評価された。ＣＡＲ＋Ｔ細胞への長い暴露後の標的細胞の死滅もまた、ＳＮＵ－１癌細胞についての顕微鏡観察によって評価された。ＳＮＵ－１細胞は、６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１００万細胞の密度で蒔かれ、３Ｘ ＫＯ（ＣＤ７０）、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞と４：１のエフェクター：標的比で混合された。共培養物は、６日間インキュベートされ、生存癌細胞の存在が顕微鏡観察によって評価された。全ての胃癌標的細胞（ＳＮＵ－１）は、対照ウェルと比較して、ＴＲＡＣ^－／β２Ｍ^－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞を含有するウェルにおいて除去されたが、これは、癌細胞が、長期間の共培養により抗ＣＤ７０ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞によって完全に除去されたことを示している。

【0244】

実施例９：抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞の有効性：ＮＯＧマウスにおける皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルの治療。
高レベルのＣＤ７０を発現する腎癌細胞を除去するＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。これらのモデルは、皮下Ａ４９８－ＮＯＧモデル、皮下７８６－Ｏ－ＮＳＧモデル、皮下Ｃａｋｉ－２－ＮＳＧモデル、及び皮下Ｃａｋｉ－１－ＮＳＧモデルを含んだ。ＣＴＸ１３０細胞は、本明細書に記載されるとおりに生成された。

【0245】

それぞれの皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルに関して、５００万個の指定の細胞型の細胞を、ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスの右側腹部に皮下注射した。平均腫瘍サイズがおよそ１５０ｍｍ^３の平均サイズに達したとき、マウスは、治療されないままであったか又はマウス毎に８×１０^６個のＣＡＲ^＋ＣＴＸ１３０（ＴＲＡＣ^－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ７０^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞）細胞を静脈内注射された。皮下Ａ４９８－ＮＯＧモデルにおいて、マウスの追加の群は、マウス毎に７．５×１０^６個のＣＡＲ＋ＴＲＡＣ^－Ｂ２Ｍ^－抗ＣＤ７０ ＣＡＲ－Ｔ細胞が注射された。

【0246】

ＣＴＸ１３０細胞は、皮下Ａ４９８－ＮＯＧモデル（図９Ａ）及び皮下Ｃａｋｉ－２－ＮＳＧモデル（図９Ｃ）において腫瘍増殖を完全に除去した。ＴＲＡＣ^－／Ｂ２Ｍ^－／抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を注射されたマウスにおける腫瘍増殖は、未治療の対照マウスのものと同様であった（図９Ａ）。ＣＴＸ１３０細胞は、皮下７８６－Ｏ－ＮＳＧモデル（図９Ｂ）及び皮下Ｃａｋｉ－１－ＮＳＧモデル（図９Ｄ）において腫瘍増殖を著しく低減した。

【0247】

まとめると、これらの結果は、ＣＴＸ１３０細胞が皮下腎細胞癌腫瘍異種移植モデルの４つの型において腫瘍増殖を低減したことを実証している。

【0248】

腫瘍再チャレンジモデル腎細胞癌腫瘍異種移植モデル
ＣＴＸ１３０の有効性はまた、再チャレンジを伴う皮下Ａ４９８異種移植モデルにおいて試験された。簡潔には、５００万個のＡ４９８細胞が、ＮＯＤ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスの右側腹部において皮下注射された。腫瘍はおよそ５１ｍｍ^３の平均サイズまで増殖させられ、その後担腫瘍マウスは、２つの群（Ｎ＝５／群）に無作為化された。群１は、未治療のままであったが、群２は、７×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞を受容し、群３は、８×１０^６個のＣＡＲ＋ＴＲＡＣ－Ｂ２Ｍ－抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容した。２５日目に、腫瘍の再チャレンジが開始され、５×１０^６個のＡ４９８細胞が治療されたマウスの左側腹部及び新たな対照群（群４）に注入された。

【0249】

図１０に示されるとおり、ＣＴＸ１３０細胞で治療されたマウスは、左側腹部へのＡ４９８細胞の注射による再チャレンジ後に腫瘍増殖を示さなかったが、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療されたマウスは、左側腹部に注射されたＡ４９８細胞の腫瘍増殖を示した。これらの結果は、ＣＴＸ１３０細胞が、他の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞（ＣＡＲ＋ ＴＲＡＣ－ Ｂ２Ｍ－ 抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞）より腫瘍細胞への再暴露後により高いインビボ有効性を保持することを実証している。

【0250】

ＣＴＸ１３０再投与腎細胞癌腫瘍異種移植モデルの有効性
ＣＴＸ１３０の有効性はまた、再投与を伴う皮下Ａ４９８異種移植モデルにおいて試験された。簡潔には、５００万個のＡ４９８細胞が、ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスの右側腹部において皮下注射された。平均腫瘍サイズがおよそ４５３ｍｍ^３の平均サイズに達したとき、マウスは、未治療のままにされたか又はマウス当たり８．６×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞を静脈内注射された（Ｎ＝５）。群２のマウスは、それぞれ１７日目及び３６日目にマウス当たり８．６×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞の第２及び第３の用量で治療された。群３のマウスは３６日目にマウス当たり８．６×１０^６個のＣＡＲ＋ＣＴＸ１３０細胞の第２の用量で治療された。

【0251】

図１１において示されるとおり、ＣＴＸ１３０細胞を１日目に投与され、続いて１７日目及び３６日目に再投与されたマウスは、３６日目に１回のみ再投与されたマウスより少ない腫瘍増殖を示した。これらの結果は、ＣＴＸ１３０細胞の再投与が、腫瘍増殖の抑制を増強したことを実証している。

【0252】

実施例１０：抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞の有効性：ＮＯＧマウスにおけるＣＤ７０＋固形腫瘍異種移植モデルにおける治療
ＣＤ７０を発現する腫瘍細胞を除去する抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウス皮下腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

【0253】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を、上のとおりに使用して（例えば、実施例３を参照のこと）、ＣＤ７０を標的化するＣＡＲコンストラクト（配列番号４５；配列番号４６）を使用してＴＲＡＣ遺伝子座からの同時の発現を伴ってＴＣＲ、β２Ｍ、ＣＤ７０の発現を欠くヒトＴ細胞を作製した。この実施例において、活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣ（配列番号６）、β２Ｍ（配列番号１０）、及びＣＤ７０（配列番号２）を標的化するｓｇＲＮＡを含有する３種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ遺伝子座でのＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現に関する－／＋調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ座位に対して右及び左の相同性アームを含有するドナー鋳型（配列番号４３；配列番号４４）（配列番号４６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ＣＡＲをコードする）を含むＡＡＶ６に送達されるＤＮＡ鋳型による相同組換え修復によって修復された。

【0254】

得られた改変Ｔ細胞は、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞である。ＣＤ７０＋腫瘍細胞株によって引き起こされる疾患を回復させる抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、本明細書に記載される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。

【0255】

卵巣腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する卵巣腺癌細胞を除去する抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下卵巣癌（ＳＫＯＶ－３）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

【0256】

ＣＤ７０＋卵巣癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させる抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、（１２頭の）５～８週齢雌、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５～７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＳＫＯＶ－３卵巣癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５～７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２１に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２１に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

【0257】

【表28】

【0258】

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後９日目までに、抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、未治療の動物における腫瘍と比較して、腫瘍体積の減少を示し始めた。注射後１７日目までに、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療されたマウスにおけるＣＤ７０＋卵巣癌腫瘍は、完全に除去された。腫瘍増殖のこの完全退縮は、注射後４４日間を通して治療された動物において維持され、その後、抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞で治療された５頭のマウスのうちの４頭は、最後の観察（６９日目）まで腫瘍がないままであった（図９Ａ）。これらのデータは、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞が、ヒト卵巣腫瘍を治療するのにインビボで非常に強力であることを実証している。

【0259】

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する肺腺癌細胞を除去するＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下肺癌（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

【0260】

ＣＤ７０＋肺癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５～８週齢雌、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５～７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＮＣＩ－Ｈ１９７５肺癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５～７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２２に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２２に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

【0261】

【表29】

【0262】

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後１２日目までに、抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、未治療の動物における腫瘍と比較して、腫瘍体積の減少を示し始めた。治療された動物における腫瘍のこの完全退縮は、注射後３３日間を通して継続する。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞による治療は、注射後４０日目までの間、確立されたＨ１９７５肺癌異種移植片に対して強力な活性をもたらした（＜１００ｍｍ^３の腫瘍サイズを有する４０日目までの全てのマウスにおいて、腫瘍再増殖が抑制された）が、その後、腫瘍が増殖し始めた。（図９Ｂ）。これらのデータは、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞が、インビボでヒトＣＤ７０＋肺癌腫瘍に対して強力な活性を有することを実証している。

【0263】

膵臓腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する膵臓癌細胞を除去するＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下膵臓癌（Ｈｓ ７６６Ｔ）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

【0264】

ＣＤ７０＋膵臓癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５～８週齢雌、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５～７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＨｓ７６６Ｔ膵臓癌細胞の皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５～７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２３に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２３に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

【0265】

【表30】

【0266】

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後１５日目までに、抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、全ての未治療の動物において腫瘍体積の減少を示し始めた。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞による治療は、試験された全てのマウスにおいてＣＤ７０＋膵臓癌腫瘍のサイズを効率的に減少させ（＜３７ｍｍ^３）、試験の期間（６７日目まで）にさらなる増殖の形跡を有しなかった（図９Ｃ）。これらのデータは、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞が、確立されたＨｓ７６６Ｔ膵臓癌異種移植片に対する強力な活性及び治療開始後６０日を超える耐久性のある応答を有してインビボでヒトＣＤ７０＋膵臓癌腫瘍の退縮を誘導することを実証している。

【0267】

胃腫瘍モデルにおける治療
中程度のレベルのＣＤ７０を発現する卵巣腺癌細胞を除去する抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞の能力は、マウスにおける皮下胃癌（ＳＮＵ－１）腫瘍異種移植モデルを使用してインビボで評価された。

【0268】

ＣＤ７０＋卵巣癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させるこれらの抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、（１２頭の）５～８週齢雌、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩ１２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、試験の開始の５～７日前に病原体を含まない条件下で維持された、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育された。マウスは、右後側腹部において５×１０^６個のＳＮＵ－１胃癌細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５～７５ｍｍ^３（約５０ｍｍ^３の標的）に達したとき、マウスはさらに、表２４に示されるとおりの２つの治療群に分けられた。１日目、治療群２は、表２４に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞を受容した。

【0269】

【表31】

【0270】

腫瘍体積は、治療開始日から週に２回測定された。注射後１０日目までに、抗ＣＤ７０ ＣＡＲＴ細胞で治療された腫瘍は、腫瘍体積の減少を示し始めた。注射後２０日目までに、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療されたマウスにおけるＣＤ７０＋胃癌腫瘍は、腫瘍サイズのさらなる著しい減少を経た。注射後６０日目までに、ＣＤ７０＋胃癌腫瘍は、腫瘍増殖の完全な退縮を示した（図９Ｄ）。これらのデータは、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ７０－）抗ＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞が、ヒト胃腫瘍を治療するのにインビボで非常に強力であることを実証している。

【0271】

実施例１１：ＣＤ７０発現癌を有する成人対象における同種異系ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作されたＴ細胞（ＣＴＸ１３０）の安全性及び有効性の第１相非盲検多施設用量漸増及びコホート拡大試験。
ＣＴＸ１３０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（単一のガイドＲＮＡ［ｓｇＲＮＡ］及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、エクスビボで遺伝子改変された同種異系Ｔ細胞で構成されるＣＤ７０指向性Ｔ細胞免疫療法である。改変は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びＣＤ７０遺伝子座の標的化された破壊並びにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現カセットを介するＴＲＡＣ遺伝子座への抗ＣＤ７０キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）導入遺伝子の挿入を含む。抗ＣＤ７０ ＣＡＲ（配列番号４６）は、以前に特徴付けられた抗ＣＤ７０ハイブリドーマＩＦ６に由来する抗ＣＤ７０単鎖可変フラグメント（配列番号４８）、ＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号５４）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号５７）、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号６１）で構成される。

【0272】

１．試験概要
１．１ 試験集団
用量漸増及びコホート拡大は、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性であり得るＣＤ７０発現癌、例えば、ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する成人対象を含む。

【0273】

用量漸増及びコホート拡大は、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性であり得るＣＤ７０発現膵臓癌を有する成人対象を含む。

【0274】

用量漸増及びコホート拡大は、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性であり得るＣＤ７０発現胃癌を有する成人対象を含む。

【0275】

用量漸増及びコホート拡大は、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性であり得るＣＤ７０発現肺癌を有する成人対象を含む。

【0276】

用量漸増及びコホート拡大は、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性であり得るＣＤ７０発現卵巣癌を有する成人対象を含む。

【0277】

用量漸増及びコホート拡大は、ＣＤ７０発現前立腺癌を有する成人対象を含む。

【0278】

場合により、対象は、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性であり得る腎細胞癌（ＲＣＣ）、例示的なＣＤ７０＋固形腫瘍を有する。

【0279】

１．２ 投与の様式
対象は、リンパ球枯渇（ＬＤ）化学療法後にＣＴＸ１３０の静脈内（ＩＶ）注入を受けた。

【0280】

１．３ 対象参加の期間
対象は、およそ５年間この研究に参加する。本試験の完了後、安全性及び生存期間を評価するために、全ての対象はさらに１０年間、別の長期の追跡調査試験に参加することが必要となる。

【0281】

２．試験の目的
第１相用量漸増試験の目的は、ＣＤ７０＋固形腫瘍、例えば、進行性（例えば、切除不能又は転移性）、再発性、又は難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する対象において抗ＣＤ７０同種異系ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９操作されたＴ細胞（ＣＴＸ１３０）の安全性及び有効性を評価することである。

【0282】

ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、ヒト悪性腫瘍を治療するために使用される養子性Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）である。ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、再発性／難治性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する患者及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する小児患者における長続きする寛解を含む非常に大きい臨床的成功をもたらしたが、固形腫瘍の徴候におけるそれらの治験使用は、まだ妥当な臨床効果を示していない。加えて、最近承認されたＡＣＴは自系であり、患者に特異的な細胞の回収及び製造を必要とし、操作されたＴ細胞からの残りの混入している腫瘍細胞の再導入をもたらした（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２４，１４９９－１５０３）。さらに、それぞれの自系の製品の異質な性質は、研究される疾患徴候の大部分においてＣＡＲ Ｔ細胞の用量、毒性、及び／又は応答の間の相関を実証することを困難にした（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｂｌｏｏｄ １３０，２３１７－２３２５）。また、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者における低い奏効率及び自系ＣＡＲ Ｔ細胞療法で治療されたＢ細胞ＡＬＬを有する患者における奏効の欠如は、消耗したＴ細胞表現型に部分的に起因している（Ｆｒａｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２４，５６３－５７１；Ｒｉｃｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，１６１２－２１；Ｍａｃｋａｌｌ，（２０１９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＡＣＲ ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ＰＬ０１－０５；Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ Ｍｅｄ，２１，５８１－９０；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２５，２１８９－２２０１；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２３，１１７５－１１８２）。

【0283】

最終的に、回収、輸送、製造、及び患者の担当医への輸送は、多くの時間がかかり、結果として、一部の患者は、治療を待つ間に疾患進行又は死亡を経験した。同種異系の既製のＣＡＲ Ｔ細胞製品は、即時の可用性、製造の失敗がないこと、及び健康なドナーからの化学療法未処置のＴ細胞などの利点を提供することができ、したがって、自系ＣＡＲ Ｔ細胞療法と比較してより一貫した製品である。

【0284】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集により、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質の破壊が達成され得る。ＴＣＲノックアウトは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを著しく低減するか又は除去することが意図されるが、ＭＨＣノックアウトは、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続を増大させるように設計される。ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する対象におけるこのファースト・イン・ヒューマン試験は、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で改変された同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞手法の安全性及び有効性を評価する。

【0285】

ＣＴＸ１３０は、ＣＤ７０指向性の遺伝子改変された同種異系Ｔ細胞免疫療法であり、健康なドナーの細胞から製造される。したがって、結果として生じる製造された細胞は、一貫した信頼性の高い品質の最終生成物を各対象に提供することを目的としている。さらに、ＡＡＶ及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用してＴＲＡＣ部位にＣＡＲを正確に送達及び挿入することによるＣＴＸ１３０の製造には、レンチウイルス及びレトロウイルスベクターのランダムな挿入に関連するリスクが存在しない。

【0286】

ＣＴＸ１３０に適用される４つの編集工程は、以下の様式において安全性及び有効性に対処する：
●安全性：内在性ＴＣＲを破壊するＴＲＡＣ遺伝子座の欠失及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制する宿主ＭＨＣシステムとその相互作用。
●Ｔ細胞活性：ＣＤ７０標的化ＣＡＲコンストラクトの挿入、Ｂ２Ｍ遺伝子座の欠失、及びＣＤ７０遺伝子座の欠失。

【0287】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、相同組換えを介して欠失された遺伝子座としてＣＡＲコンストラクトの導入の連関を可能にする。ＡＡＶで送達されるＤＮＡドナー鋳型及びＨＤＲを使用するＴＲＡＣゲノム遺伝子座でのＣＡＲの送達及び正確な挿入は、レンチウイルス及びレトロウイルス形質導入などの他の一般的な形質導入方法を使用するランダムな遺伝物質の挿入とは対照的である。ＴＲＡＣ遺伝子座でのＣＡＲ遺伝子の挿入は、ＣＡＲを発現するほぼ全ての細胞でのＴＣＲの除去をもたらす。内在性ＴＣＲのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に媒介される破壊は、ＧｖＨＤのリスクを著しく低減できるか又は除去できるが、ＭＨＣクラスＩタンパク質の破壊は、ＣＡＲ Ｔ細胞の持続を増大させると仮定される。ＣＤ７０遺伝子座の欠失は、ＣＴＸ１３０の持続を増大させ、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞上での発現の上昇を介して潜在的な相互作用を低減することが意図される。

【0288】

ＣＴＸ１３０は、ＣＤ７０指向性の遺伝子改変された同種異系Ｔ細胞免疫療法であり、健康なドナーの細胞から製造される。したがって、結果として生じる製造された細胞は、一貫した信頼性の高い品質の最終生成物を各対象に提供することを目的としている。さらに、ＡＡＶ及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用してＴＲＡＣ部位にＣＡＲを正確に送達及び挿入することによるＣＴＸ１３０の製造には、レンチウイルス及びレトロウイルスベクターのランダムな挿入に関連するリスクが存在しない。ＣＡＲ Ｔ細胞で形質導入された悪性Ｂ細胞で再発したＡＬＬを有する対象の最近報告された症例はさらに、ＣＡＲの挿入がＴＣＲ破壊と連関しないレンチウイルスの手法のこの潜在的なリスクを強調している（Ｒｕｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４，１４９９－５０３）。個々の対象の製造の失敗、スケジュール管理の複雑さ、ブリッジング化学療法と関連する毒性、及び対象に対する白血球除去のリスクは、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞製品に適用されない。ＣＴＸ１３０を直ちに投与する能力によって、対象は時宜を得て製品を受容することが可能になり、対象がブリッジング化学療法の必要性を回避する助けとなる。

【0289】

最後に、ＣＤ７０は、ＣＤ２７受容体の膜結合型リガンドであり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する。ＣＤ７０は、いくつかの血液悪性腫瘍において発現される。ＣＤ７０はまた、腎細胞癌及び神経膠芽腫などの非造血系の悪性腫瘍によって高度に発現される。

【0290】

３．試験の目的
主要目的、パートＡ（用量漸増）：推奨されるパートＢの用量（ＲＰＢＤ）を決定するためにＣＤ７０＋固形腫瘍を有する対象においてＣＴＸ１３０の用量漸増により安全性を評価すること。

【0291】

主要目的、パートＢ（コホート拡大）：固形癌効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ １．１）に従う奏効率（ＯＲＲ）によって測定されるとおりにＣＤ７０＋固形腫瘍を有する対象においてＣＴＸ１３０の有効性を評価すること。

【0292】

副次的目的（パートＡ及びＢ）：経時的な奏効までの期間（ＴＴＲ）、奏効期間（ＤｏＲ）、無増悪生存（ＰＦＳ）、全生存期間（ＯＳ）、病勢コントロール率（ＤＣＲ）、無増悪期間（ＴＴＰ）を含むＣＴＸ１３０の活性を評価すること；経時的なＣＴＸ１３０の有効性をさらに特徴付けること；さらにＣＴＸ１３０の安全性を評価し、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍溶解症候群及びＧｖＨＤを含む特記される有害事象（ＡＥＳＩ）を記載し、評価すること；及び血中のＣＴＸ１３０の薬物動態（ＰＫ）（増殖及び持続）を特徴付けること。

【0293】

探索的目的（パートＡ及びＢ）：疾患、臨床効果、抵抗性、安全性、又は薬力学的（ＰＤ）活性と関連するゲノム、代謝、及び／又はプロテオミクスバイオマーカーを同定すること；さらにＣＴＸ１３０の有効性のキネティクスを記載すること、及び患者報告アウトカム（ＰＲＯ）に対するＣＴＸ１３０の影響を記載すること。

【0294】

４．試験適格性
４．１ 組み入れ基準
本試験に参加するのに適格であるとみなすには、対象は以下に列挙される組み入れ基準を満たさなければならない：
１．≧１８歳及び体重≧６０ｋｇ。
２．治験実施計画書に必要とされる試験手順を理解して遵守することができ、自発的に書面のインフォームドコンセント文書に署名することができる。
３．進行性、再発性、又は難治性ＣＤ７０＋固形腫瘍と診断されている
ｏ腫瘍組織が入手可能であること。
ｏＲＥＣＩＳＴｖ１．１に従って施設の放射線科医によって評価されるとおりの測定可能な疾患を有すること。ｏ以前に放射線を照射された領域に位置している標的病変は、進行がそのような病変において示される場合、測定可能であるとみなされる。
ｏ生検に好適な少なくとも１つの非標的病変を有する。
４．スクリーニング期間に評価されるとおりのカルノフスキー・パフォーマンス・ステータス（ＫＰＳ）≧８０％。
５．本明細書に記載されるＬＤ化学療法及びＣＡＲ Ｔ細胞注入を受けるために治験実施計画書に指定される判定基準を満たす。
６．十分な臓器機能：
●腎臓：クレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）≧５０ｍＬ／分
●肝臓：
ｏアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）＜３×正常範囲上限（ＵＬＮ）；
ｏ総ビリルビン＜２×ＵＬＮ（ジルベール症候群、総ビリルビン＜３ｍｇ／ｄＬ）；及び正常な抱合ビリルビン、
ｏ正常の下限の＞９０％のアルブミン。
●心臓：血行動態的に安定しており、心エコー像による左室駆出率（ＬＶＥＦ）≧４５％。
●肺：パルスオキシメトリーによる室温での酸素飽和レベルが＞９０％であること。
●血液学：スクリーニング前に血液細胞の注入を伴わずに血小板数＞１００，０００／ｍｍ^３、好中球絶対数＞１５００／ｍｍ^３、及びヘモグロビン（ＨｇＢ）＞９ｇ／ｄＬ
●凝固：活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）又はＰＴＴ≦１．５×ＵＬＮ
７．妊娠可能な女性患者（初経後、正常な子宮及び少なくとも１つの卵巣を有し、閉経後１年未満である）は、登録から最後のＣＴＸ１３０注入後の少なくとも１２ヵ月にわたって、高い効果のある避妊方法（治験実施計画書において指定される）を使用することに同意しなければならない。
８．男性患者は、登録から最後のＣＴＸ１３０注入後の少なくとも１２ヶ月にわたって、効果的な避妊方法（治験実施計画書において指定される）を使用することに同意しなければならない。

【0295】

４．２ 除外基準
本試験に参加するのに適格となるためには、対象は以下に列挙される除外基準のいずれも満たさないことが必要となる：
１．任意の抗ＣＤ７０標的化薬剤による以前の治療。
２．ＣＡＲ Ｔ細胞又は任意の他の改変されたＴ若しくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による以前の治療。
３．いずれかのＬＤ化学療法剤又はＣＴＸ１３０製品の賦形剤のいずれかに対する既知の禁忌。
４．陽性スクリーニングＭＲＩ又は既往歴によって証明されるとおりのそれらの悪性度の中枢神経系（ＣＮＳ）症状を有する対象。
５．てんかん発作、脳卒中、重度の脳損傷、小脳疾患、以前の療法による可逆性白質脳症（ＰＲＥＳ）の病歴、又はＣＡＲ Ｔ細胞に関連する毒性を増加させる可能性のある別の状態などの臨床的に意味のあるＣＮＳ病態の病歴又は存在。
６．進行中の臨床的に意義のある胸水若しくは腹水若しくは心臓周囲の注入又は過去２ヶ月の胸水若しくは腹水の病歴。
７．スクリーニング前の６ヵ月以内の不安定狭心症、臨床的に重大な不整脈又は心筋梗塞。
８．７．０％又は４８ｍｍｏｌ／ｍＬの目下のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルを有する糖尿病。
９．制御されない急性の生命を脅かす細菌、ウイルス、又は真菌感染症。
１０．ヒト免疫不全ウイルス１型若しくは２型、又は活動性Ｂ型肝炎ウイルス若しくはＣ型肝炎ウイルス感染の存在について陽性である。ウイルス量が検出できない（定量的ポリメラーゼ連鎖反応又は核酸試験による）と記録されている、Ｂ型又はＣ型肝炎感染症の前病歴を有する対象は容認される。
１１．全身療法を必要としない治癒手法で治療され、１２ヶ月を超えて寛解しているもの、又は転移性疾患に発展するリスクの低い任意の他の局所的な悪性腫瘍を除く、以前の又は同時的な悪性腫瘍。
１２．ステロイド及び／又は任意の他の免疫抑制療法を必要とする原発性免疫不全障害又は活動性自己免疫疾患。
１３．以前の固形臓器移植又は骨髄移植。
１４．登録前の１４日以内の放射線療法を含む抗腫瘍又は治験薬の使用。ステロイドの生理的用量の使用は、臨床的に必要な場合及びメディカルモニターと協議してステロイドの使用歴のある対象について許容される。
１５．登録前２８日以内に生ワクチン又は漢方医学の一部として漢方薬を受容したか又は市販の漢方薬以外のものを受容した。
１６．対象が試験に参加する能力を深刻に妨害し得る重大な精神障害の診断。
１７．妊娠中又は授乳中の女性。

【0296】

５．試験デザイン
５．１ 治験計画
これは、ＣＤ７０＋固形腫瘍を有する対象においてＣＴＸ１３０の安全性及び有効性を評価する単アーム非盲検多施設第１相試験である。試験は、用量漸増（パートＡ）、その後のコホート拡大（パートＢ）の２つのパートに分かれている。

【0297】

パートＡにおいて、用量漸増は、例えば、切除不能又は転移性のＣＤ７０＋固形腫瘍を有する成人対象において始まる。対象は、ＣＰＩ及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤の両方に進行した可能性がある。用量漸増は、本明細書に記載される判定基準に従って実施される。

【0298】

パートＢにおいて、拡大コホートは、最適なサイモン２段階デザインを使用してＣＴＸ１３０の安全性及び有効性をさらに評価するために開始される。第１段階において、対象は、パートＢコホート拡大のためにＣＴＸ１３０の推奨用量で治療される（パートＡにおいて決定されるＭＴＤ又はＭＴＤ未満）。

【0299】

５．１．１ 試験デザイン
試験は、用量漸増（パートＡ）、その後のコホート拡大（パートＢ）の２つのパートに分かれている。試験の両方のパートは、３つの主要な段階：スクリーニング、治療、及び追跡調査からなる。試験スキームの概略図を図１３に示す。

【0300】

３つの主要な段階は、以下のとおりである：
段階１ － 治療に対する適格性を判断するためのスクリーニング（最大１４日間）。
段階２ － ＬＤ化学療法及びＣＴＸ１３０の注入。
段階２Ａ － ＬＤ化学療法：１日当たりフルダラビン３０ｍｇ／ｍ^２及びシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ^２を静注（ＩＶ）で３日間の同時投与。両方の薬剤は、同じ日に開始され、３日間連続して投与される。ＬＤ化学療法は、ＣＴＸ１３０注入の前に少なくとも４８時間（ただし７日以下）で完了されなければならない。
段階２Ｂ － ＣＴＸ１３０注入
臨床的適格性－ＬＤ化学療法の開始及びＣＴＸ１３０の注入の両方の前に、対象の臨床的適格性を再確認する必要がある。
段階３－追跡調査（最後のＣＴＸ１３０注入の５年後）。
ＣＴＸ１３０注入期間後の間、対象は、ＣＲＳ、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）、ＧｖＨＤ、及び他のＡＥを含む急性毒性（１～２８日目）についてモニターされる。毒性管理のガイドラインは、本明細書に記載される（第８節を参照のこと）。パートＡ（用量増量）中、全対象は、ＣＴＸ１３０注入後最初の７日間入院するが、現地の規制又は現場の慣習により必要とされる場合、それより長期間入院する。パートＡ及びパートＢの両方において、対象は、ＣＴＸ１３０注入後の２８日間、治験現場の近辺の範囲内（すなわち、１時間の移動時間）に留まる必要がある。

【0301】

対象は、最大５年間この試験に参加する。本試験の完了後、長期安全性及び生存期間を評価するために、対象はさらに１０年間、別の長期の追跡調査試験に参加することが必要となる。

【0302】

５．２ ＣＴＸ１３０の用量漸増
ＣＴＸ１３０の以下の用量は、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞の数に基づいて、用量レベル１（ＤＬ１）で開始してこの試験（表２５）において評価され得る。全ての用量レベルに１×１０^５個のＴＣＲ^＋細胞／ｋｇの用量制限が課せられ得る。

【0303】

【表32】

【0304】

用量漸増は、標準的な３＋３デザインを使用して実施され、その中で３～６名の対象は、本明細書に記載されるとおり、最初の投与の後に用量規制毒性（ＤＬＴ）の発生に応じて各用量レベルで登録される。ＤＬＴ評価期間は、最初のＣＴＸ１３０注入とともに開始し、２８日間継続する。用量レベル１（及び必要があれば、用量レベル－１）において、対象は、ずらされた様式で治療されることになり、その結果、対象は、前の対象がＤＬＴ評価期間を完了してから（例えば、２８日間ずらされる）ＣＴＸ１３０のみを受容することになる。用量レベル－１への用量の減少が必要となる用量レベル１でのＤＬＴの場合には、用量レベル－１での全ての対象の投与もまた、２８日間ずらされることになる。ＤＬＴが用量レベル１で発生しない場合、用量漸増は、用量レベル２に進行することになり、それぞれの対象間の投与は、１４日間ずらされることになる。ＤＬＴが最初の２つの用量レベル（用量レベル１及び２）で発生しない場合、次の用量レベル（用量レベル３及び４）で、投与は、それぞれの対象間で７日間ずらされることになる。

【0305】

用量漸増は、以下の規則に従って実施される：
○３名の対象のうちの０名がＤＬＴを経験する場合、次の用量レベルに漸増する。
○３名の対象のうちの１名がＤＬＴを経験する場合、目下の用量レベルを６名の対象に拡大する。
○６名の対象のうちの１名がＤＬＴを経験する場合、次の用量レベルに漸増する。
○６名の対象のうちの２名以上がＤＬＴを経験する場合：
■用量レベル－１の場合、代替的な投薬計画を評価するか又はパートＢコホート拡大のための推奨用量を決定できないことを申告する。
■用量レベル１の場合、用量レベル－１に漸減する。
■用量レベル２又は３の場合、以前の用量レベルをＭＴＤであると申告する。
○３名の対象のうちの２名以上がＤＬＴを経験する場合：
○用量レベル－１の場合、代替的な投薬計画を評価するか又はパートＢコホート拡大のための推奨用量を決定できないことを申告する。
○用量レベル１の場合、用量レベル－１に減少させる。
○用量レベル２又は３の場合、以前の用量レベルをＭＴＤであると申告する。
○ＤＬ２とＤＬ３の間の中間の用量、例えば、１．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞が許容され得る。
○ＤＬ３とＤＬ４の間の中間の用量、例えば、４．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、６×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞、又は７．５×１０^８個のＣＡＲ^＋Ｔ細胞が許容されてもよく、これは、ＤＬ４の安全性及び有効性データの審査に基づき得る。
○この試験において表２５に列挙される最も高い用量を超える用量漸増はない。

【0306】

５．２．１ 最大耐用量の定義
ＭＴＤは、ＤＬＴが対象の３３％未満において観察される最も高い用量である。ＭＴＤは、この試験において決定され得ない。パートＢの拡大コホートに移行する決定は、ＭＴＤの非存在下でなされてもよいが、用量が、試験のパートＡにおいて試験された最大用量（又はＭＡＤ）であるか又はそれ未満であることを条件とする。

【0307】

５．２．２ ＤＬＴの定義
毒性は、ＣＲＳ（ＡＳＴＣＴ判定基準；米国移植細胞治療学会判定基準；Ｌｅｅ判定基準）、神経毒性（ＩＣＡＮＳ判定基準；免疫エフェクター細胞に関連する神経毒性症候群の判定基準、ＣＴＣＡＥバージョン５．０；Ｌｅｅ判定基準）、及びＧｖＨＤ（ＭＡＧＩＣ判定基準；Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ａｃｕｔｅ ＧｖＨＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ判定基準；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２２，４－１０）を除いて、国立癌研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン５．０に従って等級分けされ、記録される。ＣＴＸ１３０との妥当な因果関係のないＡＥは、ＤＬＴであるとみなさない。

【0308】

ＤＬＴは、
Ａ．７日以内にステロイド治療（例えば、１ｍｇ／ｋｇ／日）に応答しない場合、グレード＞２のＧｖＨＤ（ＧｖＨＤの等級分けは、表３１に提供される）。
Ｂ．ＣＴＸ１３０の注入の直後の２８日以内に発生するＣＴＸ１３０に関連するグレード３～５の毒性であるが、以下の一覧は例外である：
以下は、ＤＬＴであるとみなされない：
○７２時間以内の適切な医療介入によりグレード≦２まで改善するＣＲＳの等級分け方式に従うグレード３又は４のＣＲＳ
○適切な医療介入により７２時間以内に解決するグレード３又は４の発熱
○７日未満続くグレード３の疲労
○１４日以内にグレード≦２まで改善するグレード３又は４の肝機能異常試験。
○７日以内にグレード≦２まで改善する心臓以外の重要な臓器（例えば、肺、腎臓）に関するグレード３の毒性
○７２時間以内にグレード≦２まで改善するグレード３の心臓毒性
○７２時間以内にグレード≦２まで解決するグレード３の神経毒性
○疾患進行に起因する死亡
○ステロイド抵抗性ではなく且つ１４日以内にグレード１まで解決するＧｖＨＤ

【0309】

５．３ パートＡ及びパートＢにおけるＣＴＸ１３０による反復投与
この試験は、ＣＴＸ１３０細胞による対象の２回以下の再投与を可能にすることになる。再投与に関して検討されるために、対象は、１）最初又は２回目のＣＴＸ１３０注入後に部分奏効（ＰＲ）又は完全奏効（ＣＲ）を達成し、最後の投与から２年以内に、進行に関する公式のＲＥＣＩＳＴ判定基準を満たすことなく引き続いて進行していなければならなかったか又は２）直近のＣＴＸ１３０注入の後の３ヶ月目の試験来院時にＰＲ（ただしＣＲではない）又は安定な疾患（ＳＤ）を達成しなければならなかった（再投与の決定は、局所的なＣＴスキャン／評価に基づくことになる）。

【0310】

対象が再投与され得る最も早い時点は、最初又は２回目のＣＴＸ１３０注入の２ヶ月後である。

【0311】

ＣＴＸ１３０により再投与されるために、対象は、以下の判定基準を満たすこととする：
■生検に受け入れられる病変が利用可能である場合、再発時に、腫瘍は、ＣＤ７０＋であると確認される（現地又は中央での評価に基づく）
■用量漸増の間にＤＬＴの前歴がない（該当する場合）
■ＣＴＸ１３０注入後の７２時間以内にグレード≦２まで回復しないグレード≧３のＣＲＳの前歴がない
■ＣＴＸ１３０注入後にグレード＞１のＧｖＨＤの前歴がない
■ＣＴＸ１３０注入後にグレード≧２のＩＣＡＮＳの前歴がない
■本明細書（第４節を参照のこと）に記載されるとおりの最初の試験の組み入れ基準（＃１、＃２、＃４～８）及び除外基準（＃２［ＣＡＲ Ｔ細胞による前治療を除く］～１７）を満たす。
■この実施例に記載されるとおりのＬＤ化学療法及びＣＴＸ１３０注入に関する判定基準を満たす。

【0312】

再投与される対象は、最初の投与と同様に追跡されるべきである。脳ＭＲＩを含む全てのスクリーニング評価が繰り返されなければならない。

【0313】

追加の再投与の考慮事項は、以下のものを含む：
■疾患再発／進行を示すＣＴスキャンは、腫瘍効果判定に関する新たなベースラインとして役立つことになる。再投与は、そのスキャンの２８日以内に行われる必要がある。
■対象が３ヶ月目来院時にＰＲのままであり、再投与される場合、最初のベースラインスキャンは、腫瘍効果判定のために使用され続けることになる。
■再投与を経る用量漸増コホートにおける対象は、安全であるとみなされている最も高いＣＴＸ１３０用量を受容することになる。
■拡大コホートにおける対象は、推奨されるパートＢの用量で再投与されることになる。

【0314】

それぞれの投与イベントの前に、対象は、別の用量のＬＤ化学療法を受けてもよい。

【0315】

６．試験手順
用量漸増及び試験の拡大パートの両方は、３つの別々の段階からなる：（１）スクリーニング及び適格性の確認、（２）ＬＤ化学療法及びＣＴＸ１３０注入、並びに（３）追跡調査。スクリーニング期間中、対象は、本明細書に記載される適格性の判定基準に従って評価される。登録の後、対象は、ＬＤ化学療法に続いてＣＴＸ１３０の注入を受ける。治療期間が完了した後、対象は、腫瘍応答、疾患進行、及び生存について評価される。全ての試験期間にわたって、対象は、安全性に関して定期的にモニターされる。

【0316】

評価の完全なスケジュールは、表２６及び表２７において提供される。欠損した評価は、予定を変更され、可能な限り最初に予定された日と近い日に実施されるべきである。ただし、予定の変更が、医師の見解により、次の評価予定日に近すぎるため、医学的に不必要又は安全でないと判断された場合は例外とする。その場合、欠損した評価は中止されるべきである。

【0317】

このプロトコルの目的のために、０日目はない。全ての来院日及び期間は、ＣＴＸ１３０注入の日としての１日目を使用して計算されることになる。

【0318】

【表33】

【0319】

【表34】

【0320】

【表35】

【0321】

【表36】

【0322】

【表37】

【0323】

【表38】

【0324】

６．１ 対象のスクリーニング
６．１．１ カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス
パフォーマンス・ステータスは、対象の全体的な幸福及び日々の活動を実施する能力を決定する０～１００の範囲のスコアを有するカルノフスキー尺度を使用して表２６において概説される時点で評価される。スコアが高いほど、日常動作を実行する能力がより良好であることを意味する。

【0325】

カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス尺度は、表２８に示され、目下の試験におけるパフォーマンス・ステータスを決定するために使用される（Ｐｅｕｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＢＭＣ Ｍｅｄ Ｉｎｆｏｒｍ Ｄｅｃｉｓ Ｍａｋ．，１３：７２）。

【0326】

【表39】

【0327】

６．１．２ 脳ＭＲＩ
ＣＮＳ転移を除外するために、脳ＭＲＩがスクリーニング時（すなわち、ＣＴＸ１３０注入前の２８日以内）に実施されることになる。このＭＲＩの取得、加工、及び転送の要件は、画像化マニュアルにおいて概説されることになる。

【0328】

６．１．３ 心エコー像
経胸壁心エコー像（左室駆出率の評価のための）は、適格性を確認するスクリーニング時に訓練された医療従事者によって実施され、読み取られることになる。ＣＲＳ中の心臓症状の場合、医学的に適切な評価が、施設のガイドラインに従って開始されるべきである。

【0329】

６．１．４．心電図
１２誘導心電図（ＥＣＧ）は、スクリーニング中、治療の１日目の各ＬＤ化学療法の前、１日目のＣＴＸ１３０投与の前、及び４２日目に得られる。ＱＴｃ及びＱＲＳ間隔は、ＥＣＧから決定される。追加のＥＣＧが得られてもよい。

【0330】

６．１．５ 疾患及び効果判定
疾患評価は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１判定基準（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００９） Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ４５，２２８－２４７）に従い且つ本明細書、例えば、第６．２節に記載される評価に基づく。有効性分析のために、疾患予後が、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１効果判定基準を使用して等級分けされる。疾患及び効果判定は、表２９及び表３０におけるスケジュールに従って実行されるべきであり、本明細書に記載される評価を含む。全ての応答カテゴリー（進行を含む）は、いずれかの新たな療法の開始の前の任意の時点で少なくとも１週間離れてなされた２つの連続した評価を必要とする。

【0331】

６．１．６ 放射線疾患評価（ＣＴ又はＭＲＩ）
可能な限り、同じＣＴ装置及び試験パラメーターが使用されるべきである。ＭＲＩは、ＣＴが禁忌の場合、メディカルモニターとの協議の後に実施される。

【0332】

ベースラインＣＴは、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１（例えば、第６．２節）により、表２６における評価のスケジュール毎にスクリーニング時（すなわち、ＣＴＸ１３０注入前の２８日以内）、ＣＴＸ１３０注入の６週間後（４２日目）、並びにＣＴＸ１３０注入後の３ヶ月目（８４日目）、６ヶ月目、９ヶ月目、１２ヶ月目、１５ヶ月目、１８ヶ月目、及び２４ヶ月目に、臨床的必要性に応じて、実施されることになる。スキャンは、目的の決定のために現地で且つ中央で評価される。

【0333】

ＣＴスキャンは、介在性のギャップを伴わずに（連続的に）５ｍｍのスライスで取得されるべきである。対象が造影剤注入によるＣＴ ＩＶに関して禁忌を有する場合、胸部の非造影ＣＴ並びに腹部及び骨盤の造影核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が得られてもよい。ＭＲＩは、ギャップがない（連続的な）５ｍｍのスライスの厚さで取得されなければならない。各対象を、全ての撮影時間において、同じスキャナーで同一の取得プロトコルを使用して画像化するようにあらゆる試みを行う必要がある。

【0334】

加えて、対象が試験外の理由のためにフルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）－ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）／ＣＴスキャンを受ける場合、スキャンのＣＴ成分を使用して、疾患応答を評価してもよい可能性がある。

【0335】

可能な限り、放射線疾患評価のために使用される画像化モダリティ、装置、及びスキャンパラメーターは、試験の間一貫して保持されるべきである。

【0336】

６．１．７ 腫瘍生検
対象は、スクリーニング時に腫瘍生検を受ける必要があるか、又は登録前の３ヶ月以内及び最後の全身療法若しくは標的化された療法後に進行後の生検が実施された場合、保存用の組織が提供され得る。保存用の組織が、中央検査機関の要件を満たすのに不十分な体積又は質のものである場合、生検は、スクリーニング中に実施される必要がある（この実施例における開示を参照のこと）。

【0337】

腫瘍生検もまた、７日目（＋２日；又は臨床的に実行可能である限りすぐ）及び４２日目（±２日）に実施されることになる。対象が試験中に再発が発生する場合、再発した腫瘍の生検を得て、中央検査機関に送るようにあらゆる試みがなされるべきである。

【0338】

生検は、ＲＥＣＩＳＴ １．１分析に従って、測定可能であるが標的ではない病変から得るべきである。複数の生検が得られるとき、同様の組織からそれらを得る試みがなされるべきである。肝臓転移は一般にあまり望ましくない。骨生検及び他の脱灰組織は、下流のアッセイとの干渉のために許容されない。この試料は、ＣＴＸ１３０の存在並びにＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び代謝産物の分析を含む腫瘍に固有の及びＴＭＥ特異的なバイオマーカーについて分析される。

【0339】

６．１．８ 患者報告アウトカム
４つの患者報告アウトカム（ＰＲＯ）調査が、表２６及び表２７におけるスケジュールに従って施される：欧州癌治療研究機構（ＥＯＲＴＣ）ＱＬＱ－Ｃ３０、ＥｕｒｏＱｏｌ－５ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ－５ Ｌｅｖｅｌ（ＥＱ－５Ｄ－５Ｌ）、及びＦＡＣＴ－Ｇｅｎｅｒａｌ（ＦＡＣＴ－Ｇ）質問票。質問票は、臨床評価が実施される前に完了されるべきである（対象が最も慣れ親しんでいる言語で自記式）。

【0340】

ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０は、癌患者の生活の質を測定するために設計された質問票である。それは、５つの多項目機能尺度（身体、役割、社会、感情、及び認知機能）、３つの症状尺度（疲労、嘔気、痛み）、及び追加の単一症状項目（経済的影響、食欲不振、下痢、便秘、睡眠障害、及び生活の質）から構成される。ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０は、検証され、癌患者の中で広く使用されてきた（Ｗｉｓｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９２，６０４－６１３；Ｗｉｓｌｏｆｆ ａｎｄ Ｈｊｏｒｔｈ，（１９９７）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９７，２９－３７）。それは、４段階の尺度（１＝全くない、２＝少し、３＝かなり、４＝極度）でスコア化される。ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０書類はまた、アンカーを伴う７段階の尺度を使用する２つの包括的尺度を含有する（１＝非常に悪い及び７＝良好）。

【0341】

ＥＱ－５Ｄ－５Ｌは、健康状態の一般的な尺度であり、移動性、自己ケア、日常生活、痛み／不快感、及び不安／抑うつを含む５つのドメインを評価する質問票と視覚的アナログスケールを含有する。

【0342】

ＦＡＣＴ－Ｇ質問票は、癌治療を経る患者において健康に関連する生活の質を評価するために設計される。それは、身体、社会／家族、感情、及び機能のドメインに分けられる（Ｃｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １１：５７０－７９）。

【0343】

６．１．９ 免疫エフェクター細胞関連脳症（ＩＣＥ）評価
認知神経科学的な評価は、ＩＣＥ評価を使用して実施される。ＩＣＥ評価ツールは、ＣＡＲＴＯＸ－１０スクリーニングツールのわずかに改変されたバージョンであり、これは現在、受容性失語症に関する試験を含む（Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５，４７－６２）。ＩＣＥ評価は、認知機能の様々な領域：見当識、命名、命令の追従、記述、及び注意力（表２９Ａ）を試験する。

【0344】

【表40】

【0345】

ＩＣＥ評価は、スクリーニング時、１日目のＣＴＸ１３０の投与前、並びに２日目、３日目、５日目、８日目、４２日目、及び５６日目に実施される。ＣＮＳ症状が４２日目を超えて持続する場合、ＩＣＥ評価は、症状のグレード１又はベースラインへの回復までおよそ２日毎に実施されるように継続するべきである。変動性を最小限に抑えるために、可能な限り、ＩＣＥ評価ツールの実施に精通しているか又は訓練を受けた同一の研究スタッフによって評価が実施されるべきである。

【0346】

６．１．１０．臨床検査
臨床検査試料は、この試験に開示されるとおりの評価のスケジュールに従って回収され、分析されることになる。適用可能な現地の要件（例えば、臨床検査改善修正法案）を満たす現地の検査機関は、以下の表２９Ｂに列挙される全ての試験を分析するために利用される。

【0347】

【表41】

【0348】

６．２ 固形癌効果判定基準バージョン１．１（ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１）
以下は、Ｅ．Ａ．Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ：Ｎｅｗ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ＲＥＣＩＳＴ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ４５（２００９）２２８－２４７から適応させられる。

【0349】

ベースライン時の病変の分類
測定可能な病変
少なくとも１つの観点で正確に測定され得る病変。
●ＣＴ又はＭＲＩ（スライス厚５～８ｍｍ）によって評価されるときに最長径がスライス厚の２倍であり且つ少なくとも１０ｍｍ以上の病変。
●胸部Ｘ線によって測定されるときに少なくとも２０ｍｍの最長径を有する病変。
●キャリパーによって測定されるときに１０ｍｍ以上の最長径を有する表面型病変。
●ＣＴによって測定されるときに１５ｍｍ以上の短軸を有する悪性リンパ節。
注記：最も短い軸は悪性リンパ節に関する直径として使用され、全ての他の測定可能な病変に関しては最も長い軸が直径として使用される。

【0350】

測定不能な疾患
測定不能な疾患としては、測定可能とみなすには小さすぎる病変（短軸が１０～１４．９ｍｍの結節を含む）及び胸水又は心膜液貯留、腹水、炎症性乳房疾患、軟髄膜疾患、皮膚又は肺のリンパ管性合併症、キャリパーで正確に測定できない臨床病変、再現性のある画像化技術によって測定不可能な身体検査によって同定される腹部腫瘤などの適切に測定不可能な疾患が挙げられる。
●骨疾患：骨疾患は、ＣＴ又はＭＲＩによって評価され得る軟組織成分を除いて測定不能であり、ベースライン時の測定可能性の定義を満たす。
●以前の局所治療：以前に放射線照射された病変（又は他の局所治療にかけられた病変）は、それが治療の完了後に進行していない限り、測定不能である。

【0351】

正常部位
●嚢胞性病変：単純嚢胞は、悪性病変としてみなされるべきではなく、標的又は非標的疾患のいずれかとして記録されるべきではない。嚢胞性転移となると考えられる嚢胞性病変は、それらが上の特定の定義を満たす場合、測定可能な病変であり得る。非嚢胞性病変もまた存在する場合、これらは標的病変として好ましい。
●正常なリンパ節：短軸が１０ｍｍ未満のリンパ節は正常とみなされ、測定可能又は測定不能な疾患のいずれかとして記録又は追跡されるべきではない。

【0352】

腫瘍評価の記録
疾患の全ての部位は、ベースライン時に評価されなければならない。ベースライン評価は、試験開始前のできるだけ近くになされるべきである。十分なベースライン評価のためには、必要な全てのスキャンが治療前２８日以内になされる必要があり、全ての疾患が適切に記録されなければならない。ベースライン評価が不十分である場合、その後の状態は一般に判定保留であるはずである。

【0353】

標的病変
１つの臓器当たり最大２つの病変まで、全ての関連する臓器を代表する合計５つの病変までの全ての測定可能な病変が、ベースライン時に標的病変として同定されるべきである。標的病変は、サイズ（最長の病変）及び正確な反復測定に関する適合性に基づいて選択されるべきである。短軸が記録されるべきである病理学的リンパ節の場合を除いて、各病変に関する最長径を記録する。ベースライン時の全ての標的病変に関する直径（非リンパ節病変に関しては最長径、リンパ節病変に関しては短軸）の合計は、試験時に実施される評価との比較のための基盤である。
●２つの標的病変が合体している場合、合体した質量の測定値が使用される。大きい標的病変が分裂している場合、部分の合計が使用される。
●小さくなる標的病変に関する測定値は、記録され続ける必要がある。標的病変が小さくなりすぎて測定できない場合、病変が消失したとみなされる場合は０ｍｍが記録されるべきであり；それ以外の場合は、５ｍｍのデフォルト値が記録されるべきである。
注記：リンパ節病変が１０ｍｍ未満（正常）に縮小するとき、実測値が依然として記録されるべきである。

【0354】

非標的疾患
全ての測定不能な疾患は、標的ではない。標的病変として同定されない全ての測定可能な病変もまた、非標的疾患として含まれる。測定値は必要ではないが、評価は、存在しない、判定保留、存在する／増加していない、増加したとして説明される。１つの臓器における複数の非標的病変が、症例報告書上の単一の項目として記録され得る（例えば、「複数の拡大した骨盤リンパ節」又は「複数の肝臓転移」）。

【0355】

各評価時の客観的応答状態。
疾患部位は、一貫した造影剤の投与及びスキャンのタイミングを含む、ベースラインと同じ手法を使用して評価されなければならない。変更が必要な場合は、放射線科医と相談して、代替が可能かどうかを判断しなければならない。そうでない場合、その後の客観的な状態は判定保留である。

【0356】

標的疾患
●完全奏効（ＣＲ）：リンパ節疾患を除く全ての標的病変の完全な消失。全ての標的リンパ節は、正常サイズに縮小しなければならない（短軸＜１０ｍｍ）。全ての標的病変が評価されなければならない。
●部分奏効（ＰＲ）：ベースラインより全ての測定可能な標的病変の直径の合計の３０％以上の縮小。短い直径が標的リンパ節に関する合計において使用されるが、全ての他の標的病変に関する合計においては、最長径が使用される。全ての標的病変が評価されなければならない。
●安定：ＣＲ、ＰＲ又は進行の対象にはならない。全ての標的病変が評価されなければならない。安定は、合計が最下点から２０％未満しか増大しない稀な場合にのみＰＲに続く可能性があるが、以前に記録された３０％の縮小はもはや維持されないほどである。
●客観的進行（ＰＤ）：測定可能な標的病変の直径の合計が観察された最小の合計より２０％増大し（療法中に合計の減少が観察されない場合はベースラインと比較して）、最小で５ｍｍの絶対的な増大を有する。
●判定保留。進行が記録されておらず、且つ
○１つ以上の測定可能な標的病変が評価されていないか
○又は使用される評価方法がベースライン時に使用されたものと一貫していなかったか
○又は１つ以上の標的病変を正確に測定できないか（例えば、小さすぎて測定できないためでない限り見えにくい）
○又は１つ以上の標的病変が切除されたか又は放射線照射され、再発しなかったか又は増大しなかった。

【0357】

非標的疾患
●ＣＲ：全ての非標的病変の消失及び腫瘍マーカーレベルの正常化。全てのリンパ節が「正常な」サイズにならなければならない（＜１０ｍｍ短軸）。
●非ＣＲ／非ＰＤ非標的病変の残存及び／又は正常範囲を超える腫瘍マーカーレベル。
●ＰＤ：先在している病変の明白な進行。一般に、全体的な腫瘍量は、療法の中断に値するほど十分に増大しなければならない。標的疾患におけるＳＤ又はＰＲの存在下で、非標的疾患における明白な増大に起因する進行は稀であるはずである。
●判定保留：進行が決定されておらず、１つ以上の非標的部位が評価されなかったか又は評価方法がベースライン時に使用されたものと一貫していなかった。

【0358】

新規の病変
いずれかの新規の明白な悪性病変の出現は、ＰＤを示す。例えば、そのサイズの小ささのために、新規の病変が不確かである場合、継続的な評価が原因を明らかにする。反復評価により病変が確認された場合、進行は、最初の評価日に記録されなければならない。以前にスキャンされなかった領域で同定される病変は、新規の病変であるとみなされる。

【0359】

補助的な調査
●ＣＲの判定が、サイズは縮小したが完全に消失しなかった残存病変に依存する場合、残存病変を生検又は穿刺吸引で調査することが推奨される。疾患が同定されない場合、客観的な状態はＣＲである。
●進行の判定が壊死による増加の可能性のある病変に依存する場合、病変は、状態を明らかにするために生検又は穿刺吸引で調査され得る。

【0360】

自覚的進行
疾患進行の客観的なエビデンスを伴わずに治療の中断を必要とする対象は、腫瘍評価ＣＲＦ上でＰＤとして報告されるべきではない。治療の中断後も客観的な進行を記録するように、あらゆる試みがなされるべきである（表３０を参照のこと）。

【0361】

【表42】

【0362】

非標的疾患のみを有する患者の登録に関しては、表３１が使用される。

【0363】

【表43】

【0364】

７．試験治療
７．１ リンパ球枯渇化学療法
全ての対象は、ＣＴＸ１３０の注入の前にＬＤ化学療法を受ける。
ＬＤ化学療法は、
・３回の投与に関して１日当たりフルダラビン３０ｍｇ／ｍ２ ＩＶ及び
・３回の投与に関して１日当たりシクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２ ＩＶ
からなる。

【0365】

腎機能の中程度の障害（クレアチニンクリアランス ５０ ７０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２）を有する成人対象は、少なくとも２０％又は現地の添付文書に従って減らされたフルダラビンの用量を受容するべきである。

【0366】

両方の薬剤は、同じ日に開始され、３日間連続して投与される。対象は、試験登録の７日以内にＬＤ化学療法を開始するべきである。ＬＤ化学療法は、ＣＴＸ１３０注入前に少なくとも４８時間（ただし７日以内）で完了されなければならない。

【0367】

ＬＤ化学療法は、以下の徴候又は症状のいずれかが存在する場合に遅延されることになる：
・ＬＤ化学療法に関連するＡＥの潜在的リスクを増大させる臨床状態の著しい悪化。
・飽和レベル＞９１％を維持するために酸素補給を必要とすること。
・新たな制御されない心不整脈。
・血管収縮薬の支援を必要とする低血圧。
・活動性感染症：治療に応答しない細菌、真菌、又はウイルスに関する血液培養が陽性であるか、又は活動性感染症が強く疑われるが培養は陰性である。
－ 以前に血液細胞の注入を伴わずに血小板数≦１００，０００／ｍｍ３、好中球絶対数≦１５００／ｍｍ３、及びヘモグロビン（ＨｇＢ）≦９ｇ／ｄＬ
・グレード≧２の急性神経毒性。

【0368】

リンパ球枯渇の目的は、注入後にＣＡＲ Ｔ細胞の大幅な増殖を可能にすることである。いくつかの自系ＣＡＲ Ｔ細胞治験では、様々な用量にわたるフルダラビン及びシクロホスファミドからなるＬＤ化学療法を利用することに成功している。ＬＤ化学療法を使用するための論理的根拠は、インターロイキン７（ＩＬ－７）及びインターロイキン１５（ＩＬ－１５）などのサイトカインの有効性を増強する制御性Ｔ細胞及び他の「サイトカインシンク」として機能する免疫系の競合要素を排除することにある（Ｄｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０，１８５－１９２；Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０２，９０７－９１２）。さらに、ナイーブＴ細胞の総数が特定の閾値未満に減少すると、ナイーブＴ細胞が増殖し、メモリー様Ｔ細胞に分化し始めると考えられている（Ｄｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０，１８５－１９２）。この治験実施計画書において使用される提案されたＬＤ化学療法投与量は、アキシカブタジンシロルーセルの承認申請目的の臨床試験において使用される用量と一貫している。

【0369】

７．２ ＣＴＸ１３０の投与
ＣＴＸ１３０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で改変された同種異系Ｔ細胞からなり、凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５）中で懸濁され、６ｍｌの注入バイアル中で供給される。ＣＴＸ１３０の均一用量（％ＣＡＲ^＋Ｔ細胞に基づく）は、単回のＩＶ注入として投与される。全体的な用量は、複数のバイアルに含有され得る。解凍して２０分以内に各バイアルの注入が行われるべきである。注入は、中心静脈カテーテルを通して行われることが好ましいはずである。白血球フィルターを使用してはならない。

【0370】

ＣＴＸ１３０注入の開始前に、現場の薬局は、治療される特定の対象毎に２用量のトシリズマブ及び緊急用具が確実に利用できるようにしなければならない。対象は、ＣＴＸ１３０注入のおよそ３０～６０分前の経口アセトアミノフェン（すなわち、パラセタモール又は現場の処方集に従うその同等品）及びＩＶ又は経口のジフェンヒドラミン塩酸塩（又は現場の処方集に従う別のＨ１－抗ヒスタミン）を用いて現場の実務標準に従って前投薬されるべきである。予防的な全身性のコルチコステロイドは、それらがＣＴＸ１３０の活性に支障をきたすため、投与されるべきではない。

【0371】

ＣＴＸ１３０の注入は、以下の徴候又は症状のいずれかが存在する場合に遅延され得る：
・新たな活動性の制御されない感染症。
・増大した毒性のリスクに対象を置くＬＤ化学療法の開始前の状態と比較した臨床状態の悪化。
・グレード≧２の急性神経毒性。

【0372】

ＣＴＸ１３０は、ＬＤ化学療法の完了後に少なくとも４８時間（ただし７日以内）投与される。

【0373】

７．３ ＣＴＸ１３０の注入後のモニタリング
ＣＴＸ１３０注入の後、対象の生命徴候は、注入後及びいずれかの潜在的な臨床症状の回復まで２時間の間３０分毎にモニターされるべきである。

【0374】

パートＡの対象は、ＣＴＸ１３０注入後に最小で７日間入院させられる。パートＡ及びパートＢの両方において、対象は、ＣＴＸ１３０注入後の少なくとも２８日間、治験現場の近辺（すなわち、１時間の移動時間）に留まる必要がある。急性のＣＴＸ１３０関連毒性の管理は、試験現場でのみ行われるべきである。

【0375】

対象は、評価のスケジュールに従ってサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、及び他の有害事象（ＡＥ）の徴候についてモニターされる（表２６及び表２７）。ＣＡＲ Ｔ細胞関連毒性の管理に関するガイドラインは、第８節に記載される。対象は、ＣＴＸ１３０に関連する非造血系の毒性（例えば、発熱、低血圧、低酸素、進行中の神経毒性）がグレード１に戻るまで入院したままでなければならない。対象は、医療管理者によって必要であるとみなされる場合、さらに長い期間入院したままである可能性がある。

【0376】

７．４ 以前及び同時の薬物療法
７．４．１ 許容される薬物療法及び手順（同時の治療）
本明細書に記載される禁止薬物を除く感染症を治療するためのＩＶ抗生物質、エリスロポエチン類似体、血液成分などを含む最適な医療のために必要な支援手段が、試験期間全体にわたって与えられる。

【0377】

処方箋及び非処方箋薬物療法、並びに医療処置を含む全ての同時の療法が、ＣＴＸ１３０注入後の３ヶ月にわたって署名されたインフォームドコンセントの日から記録されなければならない。ＣＴＸ１３０注入後の最初の３ヶ月間、以下の選択された同時の薬物療法のみが収集される：ワクチン接種、抗癌治療（例えば、化学療法、放射線照射、免疫療法）、免疫抑制剤（ステロイドを含む）、及び任意の治験薬。

【0378】

７．４．２ 禁止される／制限される薬物療法及び処置
以下の薬物療法は、下記のとおりの一定の試験期間に禁止される：
●登録前の２８日以内及びＣＴＸ１３０注入後の３ヶ月
－ 生ワクチン
－ 漢方医学の一部としての漢方薬又は市販の漢方薬以外のもの
●新規の抗癌療法の開始までの試験全体にわたって
－ ＣＲＳ又は免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）の治療のために本明細書に記載されるとおりに推奨される場合或いは以前にメディカルモニターと協議し承認された場合を除いて、いずれかの免疫抑制療法。
－ 薬理学的用量のコルチコステロイド療法（＞１０ｍｇ／日のプレドニゾン又は同じ用量の他のコルチコステロイド）及び他の免疫抑制剤は、新たな毒性の治療のため又は本明細書に記載されるとおりのＣＴＸ１３０と関連するＣＲＳ又は神経毒性の管理の一部として医学的に必要を示されない限り、ＣＴＸ１３０投与後に回避されるべきである。
－ 疾患進行前のＬＤ化学療法以外の任意の抗癌療法（例えば、化学療法、免疫療法、標的化療法、放射線照射、又は他の治験薬）症状管理のための対症的な放射線療法は、範囲、線量、及び部位に応じて許容され、その判断に関しては定義され、メディカルモニターに報告されるべきである。
●ＣＴＸ１３０注入後の最初の１ヶ月以内の禁止事項
－ ＣＲＳの症状悪化の可能性による顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ＣＴＸ１３０注入後の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）の投与には注意が必要であり、投与前にメディカルモニターに相談しなければならない。
●ＣＴＸ１３０注入後の最初の２８日以内の禁止事項（ＤＬＴ評価期間）
－ 解熱剤（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン）を用いた対象による自己薬物療法。

【0379】

８．毒性管理
８．１ 一般的なガイダンス
ＬＤ化学療法の前に、感染症予防（例えば、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤）が、免疫無防備状態の状況のｃｃＲＣＣ患者のために施設の標準治療に従って開始されるべきである。

【0380】

ＣＴＸ１３０注入後、少なくとも２８日間は対象を注意深くモニターしなければならない。著しい毒性が、自系ＣＡＲ Ｔ細胞療法により報告されている。

【0381】

自系ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞療法での以前の経験に基づいて、以下の一般的な推奨事項が提供される：
●発熱はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の最も一般的な初期症状である。しかしながら、対象は最初の症状として脱力感、低血圧又は錯乱を示す場合もある。
●ＣＲＳの診断は、臨床検査値ではなく臨床症状に基づいて行われるべきである。
●ＣＲＳに固有の管理に反応を示さない対象では、常に敗血症及び抵抗性感染症を考慮する。抵抗性又は緊急を要する細菌感染症並びに真菌又はウイルス感染症について対象を継続的に評価しなければならない。
●ＣＡＲ Ｔ細胞注入後、ＣＲＳ、ＨＬＨ、及びＴＬＳが同時に発生する可能性がある。全ての状態の徴候及び症状について対象を一貫して経過観察し、適切に管理しなければならない。
●神経毒性は、ＣＲＳの発症時、ＣＲＳの回復中、又はＣＲＳの回復後に発生する可能性がある。神経毒性の等級分け及び管理は、ＣＲＳとは別々に実施される。
●トシリズマブは指示を受けたときから２時間以内に投与されなければならない。

【0382】

自系ＣＡＲ Ｔ細胞で観察される毒性に加えて、ＧｖＨＤの徴候が、ＣＴＸ１３０の同種異系の性質のために注意深くモニターされる。

【0383】

ＣＴＸ１３０の安全性プロファイルは、試験全体にわたって継続的に評価される。

【0384】

８．２ 毒性に特有のガイダンス
８．２．１ ＣＴＸ１３０注入に関連する反応
投与後１２時間以内に最も一般的に発生する一過性の発熱、悪寒、及び／又は嘔気を含む注入に関連する反応が、自系Ｔ細胞治験において報告されている。ＣＴＸ１３０は、５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する十分に確立された凍結保存媒体であるＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５とともに製剤化される。ＤＭＳＯと関連するヒスタミン放出は、嘔気、嘔吐、下痢、潮紅、発熱、悪寒、頭痛、呼吸困難、又は発疹などの有害作用をもたらす可能性がある。最も重度の症例において、それはまた、気管支痙攣、アナフィラキシー、血管拡張及び低血圧、並びに精神状態の変化を引き起こす可能性がある。

【0385】

輸注反応が発生した場合、必要に応じてアセトアミノフェン（パラセタモール）及びジフェンヒドラミン塩酸塩（又は別のＨ１－抗ヒスタミン）が、ＣＴＸ１３０注入後の６時間毎に繰り返し与えられ得る。

【0386】

対象にアセトアミノフェンによって緩和されない発熱が続く場合、必要に応じて非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が処方され得る。全身性ステロイドは、この介入によってＣＡＲ Ｔ細胞に有害な影響を及ぼす可能性があるため、生命を脅かす緊急事態の場合を除いて投与されるべきではない。

【0387】

８．２．２ 感染症予防及び発熱反応
感染症予防は、施設の標準治療に従って免疫無防備状態のｃｃＲＣＣ患者に対して管理されるべきである。

【0388】

発熱反応がある場合、感染症の評価を開始し、治療する医師が医学的に指示し、決定されたとおりの抗生物質、輸液及び他の支持療法によって対象を適切に管理しなければならない。発熱が持続する場合、対象の医学的管理の全体を通してウイルス及び真菌の感染を考慮すべきである。ＣＴＸ１３０注入後に対象が敗血症又は全身性菌血症を発症した場合、適切な培養及び医学的管理を開始しなければならない。さらに、ＣＴＸ１３０注入後の２８日以内に発熱したいずれの場合にもＣＲＳを考慮に入れるべきである。

【0389】

ウイルス性脳炎（例えば、ヒトヘルペスウイルス［ＨＨＶ］－６脳炎）は、ＣＴＸ１３０を受容した後に認知神経科学的症状を経験する対象のための鑑別診断において考慮されなければならない。腰椎穿刺（ＬＰ）は、いずれかのグレード３以上の認知神経科学的毒性に関して必要であり、グレード１及びグレード２の事象に関して強く推奨される。腰椎穿刺が実施される場合は常に、感染症研究班が、（最小でも）以下の評価からのデータを調査することになる：ＨＳＶ １及び２、エンテロウイルス、ヒトパレコウイルス、ＶＺＶ、ＣＭＶ、及びＨＨＶ－６に関する定量的試験。腰椎穿刺は、症状発症後４８時間以内に実施されなければならず、対象を適切に管理するために、ＬＰから４日以内に感染症研究班からの結果が入手可能にならなければならない。

【0390】

８．２．３ 腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）
ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受ける対象は、腫瘍細胞が自発的又は療法に応答してその内容物を血流に放出して、高尿酸血症、高カリウム血症、高リン酸血症、低カルシウム血症、及び血液尿素窒素の上昇という特徴的所見をもたらすときに発生するＴＬＳのリスクが高まる可能性がある。これらの電解質及び代謝障害は、腎不全、心不整脈、てんかん発作、及び多臓器不全に起因する死を含む臨床的な毒性作用に進行する可能性がある（Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＴＬＳは、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍において報告されている。ほとんどの固形腫瘍は、ＴＬＳのリスクが低い。血液悪性腫瘍、特に、ＴＬＳのリスクが高い（＞５％）ＡＬＬ、急性骨髄性白血病、及びＣＬＬなどの白血病型、並びに非皮膚性Ｔ細胞リンパ腫、特に、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及びＤＬＢＣＬを有する患者において最も頻繁に観察されている（Ｃｏｉｆｆｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８）。追加のリスク因子としては、ＵＬＮより高い乳酸デヒドロゲナーゼレベル、高い腫瘍量、及び高い複製指数を有する腫瘍が挙げられる。腎機能障害を有する患者もまた、ＴＬＳを発症するリスクが高い。

【0391】

ＬＤ化学療法の開始からＣＴＸ１３０注入後２８日までは、臨床検査及び症状によりＴＬＳについて対象を注意深くモニターする必要がある。スクリーニング中及びＬＤ化学療法の開始前に、ＴＬＳのリスクが増大した対象は、予防的にアロプリノール（又はフェブキソスタットなどのアロプリノールでない代替薬）及び／又はラスブリカーゼを受容するべきであり、経口／ＩＶでの水分補給を増やす必要がある。ＣＴＸ１３０注入の２８日後又はＴＬＳのリスクが過ぎ去ってから予防を中止することができる。

【0392】

現場は、施設の標準治療により又は公表されたガイドラインに従ってＴＬＳをモニターし、ＴＬＳを治療するべきである（Ｃａｉｒｏ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，（２００４）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ，１２７，３－１１）。ラスブリカーゼの投与を含むＴＬＳの管理は、臨床的に必要である場合、直ちに開始すべきである。

【0393】

８．２．４ サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）
ＣＲＳは、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む免疫療法と関連する毒性であり、サイトカイン、特に、ＩＬ－６及びＩＬ－１の放出により引き起こされる（Ｎｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４（６）：７３９－７４８）。ＣＲＳは、ＣＡＲが標的抗原に結合したことに反応して免疫系が過剰に活性化するために生じるものであり、急激なＴ細胞の刺激及び増殖によりマルチサイトカインの上昇がもたらされる（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２４，２２９６）；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ ２０，１１９－１２２）。ＣＲＳは、ＣＤ１９－、ＢＣＭＡ－、ＣＤ１２３－、及びメソセリン－指向性ＣＡＲ Ｔ細胞、並びに抗ＮＹ－ＥＳＯ １及びＭＡＲＴ １－標的化ＴＣＲ改変Ｔ細胞を含む抗原標的化薬剤と無関係の臨床試験において観察されている（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｒａｊｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｔａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＣＲＳは、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法による初期相試験においても観察されている自系ＣＡＲ Ｔ細胞療法で報告される主要な毒性である（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0394】

ＣＲＳの臨床症状は、軽度であり、体温の上昇に限定される場合があるか又は１つ若しくは複数の臓器系（例えば、心臓、胃腸管、肺、皮膚、中枢神経）及び複数の症状（例えば、高熱、疲労、食欲不振、嘔気、嘔吐、発疹、低血圧、低酸素、頭痛、せん妄、錯乱）を含み得る。ＣＲＳは、生命を脅かす場合がある。臨床的には、ＣＲＳは、全身性の感染症、又は重症の場合、敗血症性ショックと間違われる場合がある。多くの場合、最も早い徴候は体温の上昇であり、これは直ちに鑑別診断の精密検査及び適切な治療の時宜を得た開始を促すべきである。

【0395】

ＣＲＳの管理の目的は、ＣＴＸ１３０の抗癌効果の可能性を維持しながら、生命を脅かす状態及び続発症を予防することである。症状は通常、血液悪性腫瘍における自系ＣＡＲ Ｔ細胞療法の１～１４日後に発生する。

【0396】

ＣＲＳは、臨床検査での測定値ではなく、臨床症状に基づいて同定され、治療されるべきである。ＣＲＳが疑われる場合、等級分けは、米国移植細胞治療学会（ＡＳＴＣＴ；以前は米国骨髄移植学会議、ＡＳＢＭＴとして知られる）のコンセンサス勧告（表３２Ａ；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に従って適用されるべきであり、管理は、公表されているガイドラインから適応される表３２Ｂの勧告に従って実施されるべきである（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。したがって、神経毒性の等級分けは、ＩＣＡＮＳに関するＡＳＴＣＴ判定基準により整列させられることになる。

【0397】

【表44】

【0398】

【表45】

【0399】

【表46】

【0400】

ＣＲＳの期間全体を通して、対象に解熱剤、ＩＶ輸液及び酸素からなる支持療法を施す必要がある。グレード≧２のＣＲＳを示す対象は、心電図テレメトリー及びパルスオキシメトリーによって継続的にモニターする必要がある。グレード３のＣＲＳを示す対象には、心機能を評価するために心エコー像の実施を検討する。グレード３又は４のＣＲＳに関しては、集中治療の支持療法を検討する。重度のＣＲＳの場合、症状（例えば、発熱、低血圧、低酸素）が類似しているため、潜在的な感染症の可能性が考慮され得る。ＣＲＳの回復は、発熱（体温≧３８℃）、低酸素、及び低血圧の回復として定義される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２５（４）：６２５－６３８）。

【0401】

低血圧及び腎不全
ＣＡＲ Ｔ細胞療法では、低血圧及び腎不全が報告されており、施設の診療ガイドラインに従って生理食塩水をＩＶでボーラス投与することによって治療する必要がある。適切であれば、透析を考慮する必要がある。

【0402】

８．２．５ 免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）
神経毒性は、自系ＣＡＲ Ｔ細胞療法で治療されるＢ細胞悪性腫瘍を有する対象において記録されている。したがって、対象は、現在の治験においてＣＡＲ Ｔ細胞療法と関連する神経毒性の徴候及び症状についてモニターされることになる。神経毒性は、ＣＲＳの発症時、ＣＲＳの回復中、又はＣＲＳの回復後に発生する可能性があり、その病態生理は不明である。最近のＡＳＴＣＴ（以前はＡＳＢＭＴとして知られる）コンセンサスはさらに、ＩＣＡＮＳを内在性の若しくは注入されたＴ細胞及び／又は他の免疫エフェクター細胞の活性化又は関与をもたらす任意の免疫療法の後にＣＮＳに関係する病的プロセスによって特徴付けられる障害として定義した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。神経毒性の病態生理は不明のままであるが；サイトカイン放出、ＣＡＲ ＴのＣＳＦへの輸送、及び血液脳関門の透過性の増大の組み合わせに起因する可能性があると考えられている（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0403】

徴候及び症状は進行性である可能性があり、失語症、意識レベルの変化、認知技能の機能障害、運動麻痺、てんかん発作、及び脳浮腫を含み得るが、これらに限定されない。ＩＣＡＮＳの等級分け（表３４）は、以前に自系ＣＡＲ Ｔ細胞の治験で使用されたＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＴＯＸｉｃｉｔｙ（ＣＡＲＴＯＸ）ワーキンググループの判定基準に基づいて開発された（Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５，４７－６２）。ＩＣＡＮＳでは、ＩＣＥ（免疫エフェクター細胞関連脳症）評価ツール（表２９）と呼ばれる改変されたツールを使用することにより、意識レベル、てんかん発作の有無、運動所見、脳浮腫の有無の評価及び神経性領域の全体的な評価を組み入れている。

【0404】

任意の新たに発症した神経毒性の評価は、神経学的検査（ＩＣＥ評価ツールを含む、表２９）、脳核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、及び臨床的に必要であればＣＳＦの検査を含むべきである。神経毒性の間に実施される腰椎穿刺については、ＣＳＦ試料は、サイトカイン分析及びＣＴＸ１３０の存在に関して中央検査機関に送られるべきである。余分な試料（入手可能であれば）は、探索的研究のために保管されることになる。感染原因は、可能な限り腰椎穿刺を実施することによって除外されるべきである（特に、グレード３又は４のＩＣＡＮＳを有する対象に関して）。脳ＭＲＩが可能ではない場合、脳内出血を除外するために、全ての対象に非造影コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを受けさせる必要がある。臨床的に必要であれば、脳波も考慮に入れる必要がある。重症例では、気道保護のために気管内挿管が必要になる場合がある。

【0405】

ＣＴＸ１３０注入後の少なくとも２８日間又は神経学的症状が回復した時点で、特に、てんかん発作の病歴を有する対象に非鎮静性型の抗てんかん発作予防（例えば、レベチラセタム）が検討され得る（抗てんかん発作薬物療法が有害な症状の要因となっていない限り）。グレード≧２のＩＣＡＮＳを示す対象は、心電図テレメトリー及びパルスオキシメトリーによって継続的にモニターする必要がある。重度又は生命を脅かす神経毒性に対しては、集中治療の支持療法を施すべきである。神経内科の受診を常に考慮すべきである。血小板及び凝固障害の徴候をモニターし、脳内出血のリスクを低減させるために血液製剤を適切に輸液すること。表３４は、神経毒性の等級分けを提供し、表３５は、管理ガイダンスを提供する。

【0406】

【表47】

【0407】

【表48】

【0408】

発熱状態又は化学療法後に生じる可能性のある頭痛は非特異的症状である。頭痛単独では必ずしもＩＣＡＮＳの症状ではない場合もあり、さらなる評価を行う必要がある。体調偏移及び筋力低下から生じる脱力感又は平衡感覚障害は、ＩＣＡＮＳの定義から除外されている。同様に、これらの対象では、随伴する浮腫の有無にかかわらず、凝固障害によって頭蓋内出血が発生する可能性があり、ＩＣＡＮＳの定義からも除外される。これらの及び他の神経毒性は、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従って記録しなければならない。

【0409】

８．２．６ 血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）
ＨＬＨは、自系ＣＡＲ Ｔ細胞による治療の後に報告されている（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒ，２６，４３－４９；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｌｏｏｄ，１２５，４０１７－４０２３；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，７，３０３ｒａ１３９；Ｔｅａｃｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｂｌｏｏｄ，１２１，５１５４－５１５７）。ＨＬＨは、活性化Ｔ細胞からのサイトカインの産生によって過剰なマクロファージの活性化をもたらす、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の炎症反応の結果として生じる臨床症候群である。ＨＬＨの徴候及び症状には、発熱、血球減少、肝脾腫、高ビリルビン血症を伴う肝障害、フィブリノーゲンが著しく低下する凝固障害並びにフェリチン及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の顕著な上昇が含まれ得る。神経学的所見も観察されている（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ，１１８，４０４１－４０５２；Ｌａ Ｒｏｓｅｅ，（２０１５）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ，１９０－１９６。

【0410】

ＣＲＳ及びＨＬＨは、臨床的特徴及び病態生理が重複した、類似する臨床症候群を有し得る。ＨＬＨは、ＣＲＳの発症時又はＣＲＳが回復しているときに発生する可能性が高い。他のＣＲＳのエビデンスの有無にかかわらず、原因不明の肝機能検査値の上昇又は血球減少がある場合、ＨＬＨを考慮すべきである。ＣＲＰ及びフェリチンをモニターすることは、診断の支援し、臨床経過を明確にし得る。可能であれば、余分な骨髄試料は通例の実施の後に中央検査機関に送られるべきである。

【0411】

ＨＬＨが疑われる場合、
●フィブリノーゲンを含む凝固パラメーターを頻繁にモニターする。これらの試験は、評価スケジュールで指示されたものよりも頻繁に行われてもよく、検査所見に基づいて頻度を促進する必要がある。
●出血のリスクを低減するため、フィブリノーゲンは≧１００ｍｇ／ｄＬに維持しなければならない。
●血液製剤によって凝固障害を補正しなければならない。
●ＣＲＳとの重複を考慮し、表３２ＢのＣＲＳ治療ガイダンスに従って適切なモニタリング強度でグレード３のＣＲＳに従って管理すること。ＨＬＨの追加の治療に関する施設のガイドラインに従うこと。

【0412】

８．２．７ 血球減少
場合によっては、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後に２８日を超えて続くグレード３の好中球減少症及び血小板減少症が、自系ＣＡＲ Ｔ細胞製品で治療された対象において報告されている（Ｋｙｍｒｉａｈ ＵＳ ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［ＵＳＰＩ］，２０１７；Ｒａｊｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３８０，１７２６－３７；Ｙｅｓｃａｒｔａ ＵＳＰＩ，２０１７）。したがって、ＣＴＸ１３０を受容する対象は、このような毒性についてモニターされ、適切な支援を受けなければならない。血小板及び凝固障害の徴候についてモニターし、内出血のリスクを低減させるために血液製剤を適切に輸液すること。長期間の好中球減少症の任意の対象に対して抗微生物及び抗真菌予防を検討しなければならない。

【0413】

活性化Ｔ及びＢリンパ球上でのＣＤ７０の一過性の発現に起因して、ウイルス再活性化などの日和見感染症が発生する可能性があり、臨床症状が生じたときは考慮する必要がある。

【0414】

用量漸増の間、Ｇ－ＣＳＦは、グレード４のＣＴＸ１３０注入後の好中球減少症の場合に考慮され得る。コホート拡大の間、Ｇ－ＣＳＦは、医師の判断に従って注意して投与され得る。

【0415】

８．２．８ 移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）
ＧｖＨＤは同種ＨＳＣＴの状態において見られるものであり、免疫適格性のドナーのＴ細胞（移植片）がレシピエント（宿主）を異物と認識した結果として生じるものである。その後の免疫反応では、ドナーのＴ細胞が活性化し、異物である抗原保有細胞を排除するためにレシピエントを攻撃する。ＧｖＨＤは、同種ＨＳＣＴからの時間及び臨床症状の両方に基づいて、急性症候群、慢性症候群及びオーバーラップ症候群に分けられる。急性ＧｖＨＤの徴候は、斑状丘疹状皮疹；胆汁うっ滞をもたらす小胆管の損傷に起因する黄疸を伴う高ビリルビン血症；悪心、嘔吐及び食欲不振；並びに水様性下痢又は血性下痢及び痙性腹痛を含み得る（Ｚｅｉｓｅｒ ａｎｄ Ｂｌａｚａｒ，（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３７７，２１６７－２１７９）。

【0416】

提案されている臨床試験を裏付けるために、非臨床の優良試験所基準（ＧＬＰ）に準拠したＧｖＨＤ及び忍容性試験が、２つのＩＶ用量：マウス当たり４×１０^７個のＣＴＸ１３０細胞の高用量（およそ１．６×１０^９個の細胞／ｋｇ）及びマウス当たり２×１０^７個の細胞（およそ０．８×１０^９個の細胞／ｋｇ）の低用量で治療される免疫無防備状態のマウスにおいて実施された。両方の用量レベルが、体重に正規化した場合、提案された最も高い臨床用量を１０倍を超えて上回る。ＣＴＸ１３０で治療されたどのマウスも、１２週の試験の間に致死的なＧｖＨＤを発症しなかった。剖検時に、単核細胞の浸潤が、一部の動物の腸間膜のリンパ節及び胸腺において観察された。最小から軽度の血管周囲の炎症もまた、一部の動物の肺において観察された。これらの所見は、軽度のＧｖＨＤと一貫しているが、これらのマウスにおける臨床症状において顕在化しなかった。

【0417】

さらに、ＴＲＡＣ遺伝子座でのＣＡＲの挿入の特異性により、Ｔ細胞がＣＡＲ＋及びＴＣＲ＋の両方である可能性は極めて低い。残りのＴＣＲ＋細胞を、製造プロセス中に抗ＴＣＲ抗体カラムの免疫親和性クロマトグラフィーにより除去し、最終生成物中≦０．４％のＴＣＲ＋細胞を得る。全ての用量レベルに１×１０^５個のＴＣＲ＋細胞／ｋｇの用量制限が課せられる。この制限値は、ハプロタイプ一致ドナーによるＳＣＴ中に重度のＧｖＨＤを引き起こすことができる同種異系細胞の数に関して公表された報告書に基づく（Ｂｅｒｔａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２４，８２２－８２６）。この特定の編集、精製、及び厳格な製品リリース基準によれば、ＣＴＸ１３０後のＧｖＨＤのリスクは低いはずであるが、真の発生率は未知である。しかしながら、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖は抗原に促進されるものであり、且つＴＣＲ－細胞でのみ起こる可能性が高いことを考えると、ＴＣＲ＋細胞の数が注入された数を上回り、認識可能な程度まで増加する可能性は低い。

【0418】

ＧｖＨＤの診断及び等級分けは、表３６に概説されるとおり、公表されている判定基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２２，４－１０）に基づくべきである。

【0419】

【表49】

【0420】

全体的なＧｖＨＤのグレードは、最も重度の標的臓器障害に基づいて決定され得る。
●グレード０：ステージ１～４の臓器がまったくない。
●グレード１：肝臓、上部ＧＩ又は下部ＧＩ障害を伴わないステージ１～２の皮膚。
●グレード２：ステージ３の発疹及び／又はステージ１の肝臓及び／又はステージ１の上部ＧＩ及び／又はステージ１の下部ＧＩ。
●グレード３：ステージ０～３の皮膚及び／又はステージ０～１の上部ＧＩを伴うステージ２～３の肝臓及び／又はステージ２～３の下部ＧＩ。
●グレード４：ステージ０～１の上部ＧＩを伴うステージ４の皮膚、肝臓又は下部ＧＩ障害。

【0421】

感染症及び薬剤に対する反応性などの、ＧｖＨＤを模倣する可能性のある潜在的な交絡因子を除外しなければならない。確認のため、治療を開始する前又は治療を開始した直後に皮膚生検及び／又はＧＩ生検を入手する必要がある。肝臓障害がある場合、臨床的に実行可能であれば、肝生検を試みるべきである。

【0422】

急性ＧｖＨＤの管理に関する推奨事項は、表３７で概説される。治験終了時に対象間の比較ができるように、これらの推奨事項は、それらに従うことによって対象を危険にさらす恐れのある特定の臨床シナリオを除いて追従され得る。

【0423】

【表50】

【0424】

より重度のＧｖＨＤの対象に対して、第二選択療法を開始するという判断を直ちに下さなければならない。例えば、ＧｖＨＤの症状が進行して３日後、グレード３のＧｖＨＤが持続して１週間後、又はグレード２のＧｖＨＤが持続して２週間後に二次療法が指示され得る。高用量のグルココルチコイド治療に忍容性のない可能性のある対象には、より早期の第二選択全身療法が指示され得る（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１８，１１５０－１１６３）。二次療法の選択及び開始時期は、臨床的判断及び現地における慣行に基づいてもよい。

【0425】

難治性の急性ＧｖＨＤ又は慢性ＧｖＨＤの管理は、施設のガイドラインに従ってもよい。免疫抑制剤（ステロイドを含む）によって対象を治療する場合、現地のガイドラインに従って抗感染症予防対策を導入する必要がある。

【0426】

８．２．９．オンターゲット・オフ腫瘍毒性
活性化Ｔ及びＢリンパ球、樹状細胞に対するＣＴＸ１３０の活性
活性化Ｔ及びＢリンパ球は、一過的にＣＤ７０を発現し、樹状細胞、及び胸腺上皮細胞は、一定の程度までＣＤ７０を発現する。したがって、これらの細胞は、活性化ＣＴＸ１３０に対する標的となる可能性がある。感染症及び血球減少の管理は、本明細書で開示される。

【0427】

骨芽細胞に対するＣＴＸ１３０の活性
ＣＴＸ１３０の活性は、ヒト初代骨芽細胞の細胞培養における非臨床試験において検出された。したがって、骨代謝回転は、カルシウムレベル並びに骨形成の評価において最も有用なマーカーであるとみなされる２つの骨芽細胞特異的マーカーであるＩ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（ＰＩＮＰ）及び骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）を介してモニターされることになる（Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０００）。血清中の両方のマーカーの評価に関する標準化されたアッセイが利用可能である。これらのペプチドマーカーの濃度は、骨芽細胞の活性及び新たな骨コラーゲンの形成を反映する。

【0428】

ＰＩＮＰ及びＢＳＡＰは、本明細書に開示されるとおりの試験のスクリーニング時、ベースライン、７日目、１５日目、２２日目、及び２８日目、並びに３ヶ月目、６ヶ月目、及び１２ヶ月目に中央検査機関の評価により測定されることになる。試料は、骨代謝回転に対する概日リズムの強い影響のために指定の回収日の同じ時間（±２時間）に回収されることになる。

【0429】

腎尿細管様上皮に対するＣＴＸ１３０の活性
腎尿細管様上皮細胞に対するＣＴＸ１３０の活性は、初代ヒト腎臓上皮におけるＣＴＸ１３０の非臨床試験において検出された。したがって、対象は、４８時間にわたって少なくとも０．３ｍｇ／ｄＬ（２６．５μｍｏｌ／Ｌ）及び／又は前の７日以内のベースライン値の１．５倍以上の血清クレアチニンの増加についてモニターすることによって、急性尿細管損傷に関してモニターされる必要がある。血清クレアチニンは、本明細書に開示されるとおり、ＣＴＸ１３０注入後の最初の７日間毎日、治療の８日目～１５日目に１日おきに、続いて２８日目まで１週間に２回評価されることになる。急性尿細管損傷が疑われる場合、尿沈渣分析及び尿中のナトリウムの排泄分画を含む追加の試験が実施される必要があり、腎臓病専門医による療法指導が開始される必要がある。

【0430】

８．２．１０．制御されないＴ細胞増殖
ＣＡＲ Ｔ細胞によるインビボでの標的腫瘍抗原の認識時に、活性化及び増殖が観察されている（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ ＮＥＪＭ ２０１３）。自系ＣＡＲ Ｔ細胞は、末梢血液、骨髄、脳脊髄液、腹水及び他の区画において検出されている（Ｂａｄｂａｒａｎ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０）。対象が制御されないＴ細胞増殖の徴候を発症する場合、臨床研究からの試料は、Ｔ細胞の起源を決定するハプロタイピングのために中央検査機関に提出される必要がある。

【0431】

９．安全性の評価
９．１ 有害事象パラメーターの定義
９．１．１ 有害事象
優良臨床試験基準（ＧＣＰ）Ｅ６（Ｒ２）に関する医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）ガイドラインは、
「医薬品が投与された患者又は臨床試験対象におけるあらゆる好ましくない医療上の出来事で、当該治療との因果関係の有無を問わない。したがって、ＡＥは、医薬品（治験薬）の使用と時間的に関連し、好ましくなく且つ意図しない徴候（例えば、異常な検査所見を含む）、症状又は疾患であってもよく、当該医薬品（治験薬）との関連の有無は問わない。」としてＡＥを定義する。

【0432】

ＡＥを定義する追加の判定基準はまた、対象の先在している状態の性質、重症度、頻度、又は期間のいずれかの臨床的に意義のある悪化を含む。有害事象は、治療の前、治療中又は治療後に発生する可能性があり、治療による発現（すなわち、ＣＴＸ１３０注入後に発生する）又は治療によらない発現のいずれかであり得る。治療によらない発現のＡＥは、書面のインフォームドコンセントが得られた後であるが、対象がＣＴＸ１３０を受容する前に発生するいずれかの新たな徴候若しくは症状、疾患、又は他の好ましくない医学的事象である。

【0433】

ベースラインから悪化しなかった記録された先在する状態のための緊急を要しない又は予め計画された治療又は医学的／外科的処置（試験に登録されている対象の前に計画された）は、ＡＥ（重篤又は重篤ではない）とみなされない。しかしながら、予め計画された緊急を要しない処置又は定期的に予定された治療中に発生する好ましくない医学的事象は、ＡＥ又はＳＡＥとして記録されるべきである。試験治療薬の注入のための入院又は施設の方針若しくはこの治験実施計画書で定義されるとおりの予防措置は、ＡＥとみなされない。さらに、対象がＣＴＸ１３０注入後に計画された入院を有する場合、他のＳＡＥ判定基準を満たす医学的に重要な事象と関連しない限り、観察のためのその入院の延長だけではＳＡＥとして報告されるべきではない。

【0434】

９．１．１．１ 異常な検査所見
臨床的に意義のあるとみなされる異常な検査所見は、有害事象として報告されるべきである。可能な限り、これらは、その異常値そのものではなく臨床診断として報告されるべきである。臨床的意義を有しない異常な検査結果は、ＡＥとしての報告を要求されない。

【0435】

９．１．１．２ 疾患進行
疾患進行は、転帰であり、ＡＥとして報告されるべきではない。対象が、ＡＥが重篤であると認定する入院又は介入を必要とする場合、症状は、ＳＡＥ（例えば、局所的進行に起因する脾臓破裂）として報告されるべきである。

【0436】

９．１．２ 重篤な有害事象
重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、いずれかの用量で：
●死亡をもたらす
●生命を脅かす
任意の好ましくない医療上の出来事である。

【0437】

この定義は、対象が、それが発生したときの事象からすぐに死に至るリスクがあることを意味する。より重度の形態で発生した場合に死亡を引き起こしたかもしれない事象は含まれない。
●入院又は目下の入院の延長を必要とする。
一般に、入院は、対象が、外来患者の環境では適切ではない観察及び／又は治療のための病院又は救急病棟（通常、少なくとも一泊の滞在を要する）にいることを示す。
●持続的な又は重大な能力障害／無能力をもたらす。
●先天性異常／出生時欠損をもたらす。
●他の重要な／重大な医学的事象

【0438】

他の状況、例えば、直ちに生命を脅かすか又は死亡若しくは入院に至ったりはしないが、対象を危険にさらす可能性のある重要な医学的事象或いは上の定義に列挙される他の転帰の１つを予防するための介入を必要とし得る状況において、迅速な報告が適切かどうかを判断するには、医学的及び科学的判断が行使されるべきである。

【0439】

９．１．３ 特記される有害事象
ＡＥＳＩ（重篤又は重篤ではない）は、進行中のモニタリング及び迅速なコミュニケーションが適切であり得る製品又はプログラムに特異的な科学的及び医学的懸念の１つである。

【0440】

同じ薬理学的クラスとみなされる自系ＣＡＲ Ｔ細胞の報告された臨床経験に基づいて、以下が、特記される有害事象（ＡＥＳＩ）として同定される：
１．ＣＴＸ１３０注入に関連する反応。
２．グレード≧３の感染症及び寄生
３．腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）。
４．サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）。
５．免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群（ＩＣＡＮＳ）。
６．血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）。
７．移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）。
８．制御されないＴ細胞増殖

【0441】

上に列挙されるＡＥＳＩに加えて、治験責任医師がＣＴＸ１３０と関連する可能性があるか又は関連すると判定するいずれかの新規の自己免疫障害は、ＣＴＸ１３０注入後に常に報告されるべきである。

【0442】

９．２ 有害事象の評価
９．２．１ 因果関係の評価
それぞれのＡＥ及びＣＴＸ１３０、ＬＤ化学療法、並びにいずれかの治験実施計画書に規定された試験処置の間の関連性（全てが個別に評価される）が、評価されるものとする。以下が、考慮されるものとする：（１）事象と治療又は処置の投与のタイミングの間の時間的関連、（２）もっともらしい生物学的機構、及び（３）因果関係の評価を行うときの事象（例えば、同時の療法、根底にある疾患）の他の潜在的な原因。

【0443】

関連性の評価は、以下の定義に基づいてなされる：
●関連する：試験治療又は処置とＡＥの間に明白な因果関係がある。
●関連する可能性がある：試験治療又は処置とＡＥの間に因果関係を示唆するいくつかのエビデンスがあるが、他の潜在的な原因も存在する。
●関連しない：試験治療又は処置とＡＥの間の明白な因果関係を示唆するエビデンスがない。

【0444】

ＡＥ／ＳＡＥとＣＴＸ１３０の間の関連性が、「起こり得る」と判定される場合、その事象は、規制報告の目的のためにＣＴＸ１３０に関連するとみなされる。

【0445】

以下の試験のいずれかが満たされる場合、事象は、ＣＴＸ１３０の使用と「関連しない」とみなされる：
●ＣＴＸ１３０の投与とその事象（例えば、製品に関連するとみなされるＡＥに関してＣＴＸ１３０の投与の前、又はかなり後のいずれかに発生した事象）の発生の間の不合理な時間的関連性。
●ＩＰと事象の間の因果関係が、生物学的にあり得ない
●事象に関する明らかにより可能性の高い代替の説明が存在する（例えば、併用薬物による典型的な有害反応及び／又は典型的な疾患関連事象）。

【0446】

個々のＡＥ／ＳＡＥの報告は、「関連しない」判定基準が満たされない場合、ＣＴＸ１３０の使用に「関連する」とみなされる。ＳＡＥが、いずれかの試験介入と関連しないと評価される場合、別の原因が、症例報告書（ＣＲＦ）において提供されなければならない。

【0447】

９．２．１．１ 治験実施計画書の処置及び／又は他の原因との関連性
ＳＡＥがＣＴＸ１３０又はＬＤ化学療法による治療と関連しないと判定される場合、治験実施計画書の処置に対するＳＡＥの関連性の評価が提供され得る。ＳＡＥ報告書に対する別の原因が、下に定義される判定基準に基づいて提供されるものとする：
・治験実施計画書に関連する処置／介入：試験中に必要とされる処置又は介入（例えば、採血、既存薬の休薬）の結果として発生した事象であって、対象の診療記録に別の原因が存在しないもの。これは、治療下で発現したＳＡＥと同様に、非治療下で発現したＳＡＥ（すなわち、ＣＴＸ１３０の投与前に発生するＳＡＥ）にも適用される。

【0448】

９．２．２ 重症度の評価
重症度は、ＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ、及びＧｖＨＤを除いて、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ５．０に従って等級分けされ、それぞれ表３２、表３４、及び表３６の判定基準に従って等級分けされる。ＣＴＣＡＥグレード又は治験実施計画書で指定された判定基準が利用可能ではない事象に関する重症度の判定は、表３８に記載されるとおりのグレード１～５の重症度分類を使用して、医学的判断に基づいてなされる（そして、ＣＲＦに記録する）べきである。

【0449】

９．２．３ 有害事象転帰
ＡＥ又はＳＡＥの転帰は、以下のとおりに分類され、報告される：
●致死的。
●未回復／未解決。
●回復／解決。
●続発症を伴う回復／解決。
●回復中／解決中。
●不明

【0450】

死亡及び致死的／グレード５の事象を記録し、報告する場合、死亡は対象の転帰であり、致死的は事象の転帰であることに留意し、死亡の原因であったＳＡＥを記載しなければならない。ＡＥのために試験を中止した対象は、転帰が決定されるまで追跡される。

【0451】

【表51】

【0452】

表３２Ａ、３２Ｂ、３４、及び３６、並びに、例えば、本明細書で開示されるＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ、及びＧｖＨＤに関する有害事象等級分け判定基準も参照されたい。

【0453】

１０．停止規則及び試験終了
１０．１ 治験に関する停止規則
試験は、以下の事象の１つ以上が発生する場合、中断され得る：
●ＣＴＸ１３０に起因する生命を脅かす（グレード４）毒性であって、管理不能であり、予想外であり、且つＬＤ化学療法に関連しないもの。
●注入の３０日以内のＣＴＸ１３０に関連する死亡。
●少なくとも１５名の対象がＣＴＸ１３０を受容した後、対象の＞２０％においてステロイド抵抗性であるグレード＞２のＧｖＨＤの発生。
●少なくとも１５名の対象が登録された後、対象の＞３５％において発生した対象に対して予想外の臨床的に意義のある又は許容されないリスクの判定（例えば、７日以内にグレード≦２まで回復しないグレード３の神経毒性）。
●新規の悪性腫瘍（以前に治療された悪性腫瘍の再発／進行とは異なる）。

【0454】

パートＢ（コホート拡大）は、最適なサイモン２段階デザインを使用して実施される単アーム試験である。第１段階において、２２名の対象は、ＣＴＸ１３０で治療されることになる。７名以上の対象が、ＣＴＸ１３０注入後に客観的応答（ＣＲ又はＰＲ）を達成する場合、第２段階において追加の４８名の治療される対象（合計７０名）を含むように登録者数を拡大することが決定され得る。第１段階の後に治験を終了することが決定された場合、登録は中止され、利用可能な全てのデータが審査され、必要に応じて保健当局に通知される。

【0455】

登録が永久に中止された場合、試験に既に登録されている対象は、ＬＤ化学療法及びＣＴＸ１３０の注入を続行してはならない。ＣＴＸ１３０による治療を既に受けている対象は、引き続き試験に参加し、治験実施計画書に従って追跡され続けるか、又は長期の安全性追跡調査試験への移行が必要となる。

【0456】

１０．２ 個々の対象に関する停止規則
個々の対象に関する停止規則は、以下のとおりである：
●試験関連治療又は追跡調査を続けている間に対象を危険にさらす任意の医学的状態。
●対象が、適格性判定基準を満たさなかったかことが見出されるか又はＬＤ化学療法の開始の前に主要な治験実施計画書の逸脱を有する場合。

【0457】

１０．３ 試験の終了の定義
試験の終了は、最後の対象が、６０ヶ月目の来院（治験実施計画書で定義された最後の評価）を完了するか又は追跡調査不能、同意の撤回、又は死亡とみなされる時点として定義される。

【0458】

１０．４ 試験終了
この試験は、安全性の懸念、予想される登録者数の目標を満たさないこと、及び／又は管理上の理由のために任意の時点で中断される場合がある。この試験が早期に終了される場合、ＣＴＸ１３０を受容した対象は、ＣＴＸ１３０注入後の最大１５年間別々の長期の追跡調査試験に参加することが要求される。

【0459】

１１．統計方法
１１．１ 一般的な方法
試験データは、体内動態、人口及びベースライン特性、安全性、並びに臨床的な抗腫瘍活性について要約される。

【0460】

カテゴリーデータは、度数分布（対象の数及びパーセンテージ）によって要約され、連続的なデータは、記述統計学（平均、標準偏差［ＳＤ］、中央値、最小値、及び最大値）によって要約されることになる。

【0461】

用量漸増期に治療される対象は、別段の指定がない限り、拡大期に同じ用量のＣＴＸ１３０を受容する対象とともにプールされることになる。全ての要約、リスト、図面、及び解析は、用量レベルによって実施されることになる。

【0462】

主要解析時間は、パートＢにおいて７１名の対象が３ヶ月の疾患効果判定を完了したとき又は追跡調査不能、試験からの棄権、又は死亡のいずれか最初に発生する（最大の解析対象集団［ＦＡＳ］において定義される）ときとして定義される。試験データは、主要解析時間に基づく主要な臨床試験報告書（ＣＳＲ）において解析され、報告されることになる。主要解析時間から試験の終了までに積み重ねられた追加のデータが報告されることになる。統計解析の完全な詳細は、統計解析計画書（ＳＡＰ）において指定されることになる。

【0463】

１１．２ 試験の目的及び仮説
パートＡの主要目的は、切除不能な又は転移性ｃｃＲＣＣを有する対象においてＣＴＸ１３０の漸増用量の安全性を評価することである。

【0464】

パートＢの主要目的は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に従ってＯＲＲによって測定されるとおり、切除不能な又は転移性ｃｃＲＣＣを有する対象においてＣＴＸ１３０の有効性を評価することである。

【0465】

１１．３ 試験評価項目
１１．３．１ 主要評価項目
パートＡ（用量漸増）：用量規制毒性（ＤＬＴ）の発生率、及びＲＰＢＤの定義。
パートＢ（コホート拡大）：固形癌効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ １．１）に従う完全奏効（ＣＲ）＋部分奏効（ＰＲ）として定義される奏効率（ＯＲＲ）。

【0466】

１１．２．２ パートＡ及びＢの副次的評価項目
１１．２．２．１ ＲＥＣＩＳＴ １．１効果判定基準に従う有効性
・ＯＲＲ：治験責任医師によって評価されるとおりのＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に従うＣＲ又はＰＲの最良総合効果を達成した対象の割合。
・最良総合効果：ＣＲ、ＰＲ、ＳＤ、進行性疾患（ＰＤ）、又は評価不能（ＮＥ）。
・奏効までの期間（ＴＴＲ）：ＣＴＸ１３０注入日から最初の放射線検査で記録された奏効（ＰＲ／ＣＲ）までの間の時間。
・奏効期間（ＤｏＲ）：ＰＲ／ＣＲの最初の客観的応答といずれかの原因による疾患進行又は死亡の日の間の時間。これは、ＰＲ／ＣＲ事象を有した対象についてのみ報告されることになる。
・無増悪生存期間（ＰＦＳ）：ＣＴＸ１３０注入日といずれかの原因による疾患進行又は死亡の日の間の差。進行せず、データカットオフ日においてもなお試験に参加している対象は、最後のＲＥＣＩＳＴ評価日をもって打ち切られることになる。
・全生存期間（ＯＳ）：ＣＴＸ１３０注入日といずれかの原因による死亡日の間の時間。データカットオフ日に生存している対象は、対象の生存が確認された最後の日をもって打ち切られることになる。

【0467】

１１．２．２．２ 安全性
ＡＥ及び臨床的に意義のある臨床検査値異常の発生率及び重症度は、Ｌｅｅ判定基準（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２４，１８８－１９５）に従って等級分けされるＣＲＳ、ＩＣＡＮＳ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２５（４）：６２５－６３８）及びＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従って等級分けされる神経毒性、並びにＭＡＧＩＣ判定基準（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２２，４－１０）に従って等級分けされるＧｖＨＤを除いて、ＣＴＣＡＥバージョン５．０に従って要約され、報告される。

【0468】

１１．２．２．３ 薬物動態
血液及び他の組織における経時的なＣＴＸ１３０のレベルは、μｇのＤＮＡ当たりのＣＡＲコンストラクトのコピーを測定するＰＣＲアッセイを使用して評価される。細胞表面上のＣＡＲタンパク質の存在を確認するためのフローサイトメトリーを使用する補完的な分析もまた実施され得る。

【0469】

そのような分析は、血液中のＣＴＸ１３０の存在を確認し、他の細胞性の免疫表現型をさらに特徴付けるために使用され得る。

【0470】

１１．２．３ パートＡ及びＢの探索的評価項目
●組織中のＣＴＸ１３０のレベル。腫瘍生検又はＣＳＦ中でのＣＴＸ１３０の増殖及び持続は、治験実施計画書に指定される試料採取に従って回収されるこれらの試料のいずれかにおいて評価され得る。
●抗ＣＴＸ１３０抗体の発生率。
●リンパ球集団の免疫プロファイリング。
●ＣＴＸ１３０製品の投与後のサイトカインプロファイル。
●抗サイトカイン療法がＣＲＳの治療効果、ＣＴＸ１３０の増殖、及び臨床効果に与える影響。
●次の（ＣＴＸ１３０の後）抗癌療法の発生率及び種類。
●ＣＲまでの時間：ＣＴＸ１３０注入日から記録されたＣＲまでの時間。
●ＣＴＸ１３０注入日から疾患進行の最初のエビデンスまでの時間として定義される疾患進行までの時間。
●第１又は第２の次の療法がない状態での生存：ＣＴＸ１３０注入日と第１の次の療法若しくはいずれかの原因による死亡の日の間、又はＰＦＳ。
●ＥＯＲＴＣ ＱＬＱ－Ｃ３０、ＥＱ－５Ｄ－５Ｌ、ＦＫＳＩ－１９、及びＦＡＣＴ－Ｇ質問票によって測定されるとおりのＰＲＯにおけるベースラインからの変化
●ＩＣＦによって測定されるとおりの認知転帰におけるベースラインからの変化
●他のゲノム、タンパク質、代謝、又は薬力学的評価項目。

【0471】

１１．３ 解析セット
以下の解析セットが、データの提示のために評価され、使用されることになる：
パートＡ（用量漸増）
●ＤＬＴが評価可能なセットは、ＣＴＸ１３０を受容し、最初の注入後のＤＬＴ評価期間を完了したか又はＤＬＴを経験した後に早期に中断した全ての対象を含むことになる。
パートＡ＋パートＢ
●安全性解析セット（ＳＡＳ）：登録され、試験治療の少なくとも１回の投与を受けた全ての対象。対象は、受けた治療に従って分類されることになり、受けた治療は、少なくとも１回受けた場合はその割り当てられた用量レベル／スケジュール、又は割り当てられた治療が受けられなかった場合は受けた最初の用量レベル／スケジュールとして定義される。ＳＡＳは、安全性データの解析のための主要なセットとなる。
●最大の解析対象集団（ＦＡＳ）：登録され、ＣＴＸ１３０注入を受け、少なくとも１回のベースライン及び１回のベースライン後スキャン評価を有する全ての対象。ＦＡＳは、臨床効果評価のための主要解析セットとなる。

【0472】

１１．４ 対象数及び検出力の考慮事項
パートＡ（用量漸増）対象数は、評価される用量レベルの数及びＤＬＴの発生率に応じておよそ６～１８名の評価可能な対象である。

【0473】

パートＢ（コホート拡大）は、最適なサイモン２段階デザインを使用して実施される単アーム試験となる。第１段階において、少なくとも２３名の対象が登録され、ＣＴＸ１３０で治療されることになる。５名以上の対象が、客観的応答（ＣＲ又はＰＲ）を達成する場合、第２段階において追加の４８名の治療される対象（合計７１名）を含むように試験を拡大することが決定され得る；そうでなければ、登録は休止されることになる。７１名の対象の対象数が、８０％の検出力（α＝０．０５、両側検定）を有して、ＯＲＲが１５％の過去の奏効率に等しいという帰無仮説を棄却することになり（Ｂａｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｎａｄａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｐｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、真のＯＲＲが３０％であると仮定する。

【0474】

１１．５ 統計解析
パートＡ
用量規制毒性は、医薬品規制用語集（ＭｅｄＤＲＡ）の主要な器官別大分類（ＳＯＣ）及び／又は基本語（ＰＴ）、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に基づく最悪のグレード、ＡＥの種類、並びに用量レベルによって列挙され、それらの発生率が要約されることになる。ＤＬＴが評価可能なセットは、パートＡにおいてＤＬＴを評価するための主要解析セットとなる。

【0475】

パートＢ
ＯＲＲの主要評価項目は、パートＡ及びＢの両方においてＲＰＢＤでＣＴＸ１３０を受容した対象について評価されることになる。ＦＡＳは、有効性のための主要解析セットとなる。奏効率が要約されることになり、９５％の信頼区間（ＣＩ）が計算されることになる。

【0476】

疾患評価の治験責任医師による審査に基づくＯＲＲの感受性解析もまた実施されることになる。

【0477】

一般的な有効性分析
生存時間評価項目は、適宜カプラン・マイヤー法を使用して分析されることになる。カプラン・マイヤー法に基づく中央値及び他の変位値（第１四分位数及び第３四分位数を含む）の推定値が計算されることになり、関連する９５％ＣＩが提供されることになる。カプラン・マイヤー法に基づく特定の時点での生存率が生成されることになる。分析されることになる生存時間評価項目としては、以下のものが挙げられる：
●奏効期間：レスポンダーのみの中で、ＤｏＲは、奏効の最初の発生日から疾患進行又は死亡が記録された日のいずれか早い日までとして計算されることになる。疾患進行又は死亡を伴わない対象は、最後の評価可能な効果判定日で打ち切られることになる。
●無増悪生存期間：試験治療の最初の日から客観的な腫瘍進行又は死亡が記録されるまでの期間として定義される。疾患進行又は死亡を伴わない対象は、最後の評価可能な効果判定日で打ち切られることになる。
●全生存期間：ＣＴＸ１３０注入日といずれかの原因による死亡日の間の時間として定義される。データカットオフ日に生存している対象は、対象の生存が確認された最後の日をもって打ち切られることになる。

【0478】

一般的な安全性解析
ＳＡＳは、安全性データの全てのリスト及び要約のために使用されることになる。安全性データは、用量レベルによって要約されることになる。

【0479】

有害事象
ＡＥは、ＣＲＳ（ＡＳＴＣＴ判定基準）、神経毒性（ＩＣＡＮＳ及びＣＴＣＡＥ ｖ５．０）、及びＧｖＨＤ（ＭＡＧＩＣ判定基準）を除いて、ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に従って等級分けされることになる。治療により発現した有害事象（ＴＥＡＥ）の発生率は、ＳＯＣ及び／又はＰＴによるＭｅｄＤＲＡ、重症度（ＣＴＣＡＥ ｖ５．０に基づく）、並びに試験治療との関連に従って要約されることになる。全てのＴＥＡＥの概要が作成されることになる。

【0480】

開始及び終了時間にかかわらず全てのＡＥが列挙されることになり、ＴＥＡＥかどうかを示す印が、リストにおいて提示されることになる。

【0481】

臨床検査値異常
●ＣＴＣＡＥ ｖ５．０によって網羅される臨床検査に関して、臨床検査データは適宜等級分けされることになる。ＣＴＣＡＥによって網羅される臨床検査に関して、グレード０は、１以上として等級分けされない全ての非欠測値に関して割り当てられることになる。
●以下の概要は、血液学及び化学の臨床検査に関して別々に作成されることになる：
－ 実測値（及び／又はベースラインからの変化）又は経時的な臨床検査パラメーターの度数に関する記述統計学
－ 最悪の治療中ＣＴＣＡＥグレードの表
－ 対応するＣＴＣＡＥグレード及び臨床検査正常範囲に対する分類を示すように目印を付けられた値を有する全ての臨床検査データのリスト

【0482】

上記の表及びリストに加えて、経時的な臨床検査における実測値又は変化の散布図又は箱ひげ図などの重要な安全性パラメーターの図示は、ＳＡＰにおいて指定され得る。

【0483】

１１．５ 中間解析
１１．５．１ 有効性の中間解析
無益性に関する１つの中間解析が実施され、ＤＳＭＢによって審査される。中間解析は、２２名の対象が治療され、３ヶ月間の評価可能な応答データを有するときまでに行われる。ＣＴＸ１３０に対する真の奏効率が、標準治療と異ならない場合、この分析時での無益性による中止の可能性は７０％である。

【0484】

１１．６．３ バイオマーカー分析
抗ＣＴＸ１３０抗体の発生率、血液中のＣＴＸ１３０ ＣＡＲ＋Ｔ細胞のレベル、及び血清中のサイトカインのレベルが要約される。

【0485】

腫瘍、血液、場合によっては骨髄及び吸引液（治療により発現したＨＬＨを有する対象においてのみ）、並びに場合によってはＣＳＦ試料（治療により発現した神経毒性を有する対象においてのみ）は、ＣＴＸ１３０の臨床効果、抵抗性、安全性、疾患、薬力学的活性、又は作用機序を示し得るゲノム、代謝、及び／又はプロテオミクスバイオマーカーを同定するために回収されることになる。

【0486】

ＣＴＸ１３０レベルの分析（薬物動態分析）
形質導入されたＣＤ７０指向性ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のレベルの分析は、表２６及び表２７に記載されるスケジュールに従って回収される血液試料に対して実施されることになる。ＣＲＳの徴候又は症状を経験している対象において、追加の血液試料は、計画された回収の間に４８時間毎に抜き取られる必要がある。血液中のＣＴＸ１３０の増殖及び持続の時間経過は、ＣＡＲコンストラクトのコピーを測定するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用して記載されることになる。より感受性のゲノム技術又は細胞表面上のＣＡＲタンパク質の存在を確認するためのフローサイトメトリーを使用する補完的な分析もまた実施され得る。

【0487】

血液、ＣＳＦ（治療により発現した神経毒性を有する対象においてのみ）、骨髄（治療により発現したＨＬＨを有する対象においてのみ）又はＣＴＸ１３０注入後に実施される腫瘍生検に由来するＣＴＸ１３０レベルの分析のための試料が、中央検査機関に送られるべきである。血液、ＣＳＦ、骨髄又は腫瘍組織中でのＣＴＸ１３０の増殖及び持続は、治験実施計画書に指定される試料採取に従って回収されるこれらの試料のいずれかにおいて評価され得る。

【0488】

サイトカイン
ＣＲＰ、ＩＬ－１β、ｓＩＬ－１Ｒα、ＩＬ－２、ｓＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７ａ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、及びＧＭ－ＣＳＦを含むがこれらに限定されないサイトカインが、中央検査機関において分析されることになる。複数の以前のＣＡＲ Ｔ細胞臨床試験において実施された相関分析が、近年の概説（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８）において要約されるとおり、重度のＣＲＳに関する潜在的な予測的マーカーとしてこれらのサイトカイン、及びその他のものを同定した。サイトカインのための血液は、表２６及び表２７に記載されるとおりの指定された時点で回収されることになる。ＣＲＳの徴候又は症状を経験する対象において、症状の発症時に行われる最初の試料回収、及び追加の試料が、回復まで１２時間毎（±５時間）に抜き取られる必要がある。

【0489】

抗ＣＴＸ１３０抗体
ＣＡＲコンストラクトは、ヒト化ｓｃＦｖから構成される。血液は、この試験で提供される開示に従って潜在的な免疫原性に関して評価するために試験全体にわたって回収される。

【0490】

探索的研究のバイオマーカー
探索的研究は、治療の臨床効果、抵抗性、安全性、疾患、薬力学的活性、及び／又は作用機序を示し得るか又は予測し得る分子（ゲノム、代謝、及び／又はプロテオミクス）バイオマーカー及び免疫表現型を同定するために実施され得る。試料は、表２６及び表２７に従って回収されることになる。探索的研究を支援するために、血液、腫瘍、骨髄、及びＣＳＦ試料の回収に対する指示に関する臨床検査マニュアルを参照されたい。

【0491】

追加のバイオマーカーの調査は、血液細胞及び製品、腫瘍組織、並びに他の対象に由来する組織の評価を含み得る。これらの評価は、それらの組織に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び他の生体分子を評価し得る。そのような評価により、患者の疾患、ＣＴＸ１３０に対する応答、及びＩＰの作用機序に関連する因子の理解を知らせる。

【0492】

結果
これまでに本試験に参加した対象全員が、１４日以内に段階１（適格性のスクリーニング）を完了している。適格性の判定基準を満たした後、３名の対象が、段階１を完了して２４時間以内にリンパ球枯渇療法を開始した。全ての適格な対象が、スクリーニング期間（段階１）を完了し、８日未満でＬＤ化学療法を受け、２名の対象はスクリーニングを完了し、７２時間以内にＬＤ化学療法の投与を開始した。ＬＤ化学療法を受ける全ての対象が、ＬＤ化学療法の完了後の２～３日以内にＣＴＸ１３０のＤＬ１用量の受容まで進行した。

【0493】

これまでこの試験において治療されたどの対象もＤＬＴを示さなかった。同様に、ＤＴＬは、Ｔ又はＢ細胞悪性腫瘍を有する対象をＣＴＸ１３０を使用して治療する並行した試験において観察されなかった。例えば、２０１９年１１月１３日に出願された米国特許出願第６２／９３４，９４５号明細書及び２０２０年６月４日に出願された米国特許出願第６３／０３４，５１０号明細書を参照されたい。さらに、同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、治療を受けたヒト対象において、注入後にＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び持続を含む所望の薬物動態特性を示した。著しいＣＡＲ Ｔ細胞の分布、増殖及び持続が、ＤＬ１という早期に観察されている。Ｔ_０に対して末梢血液中のＣＴＸ１３０の最大８７倍の増殖が、現在まで評価された１名のＲＣＣ対象において観察されており、ＣＴＸ１３０細胞の持続は、注入後の少なくとも２８日のＤＬ１の対象において検出され得る。ＣＡＲ Ｔ細胞の分布、増殖及び持続の同様のパターンは、対応するＴ又はＢ細胞悪性腫瘍試験において観察され、ＣＴＸ１３０の２０倍の増殖が観察されており、ＣＴＸ１３０細胞は、注入後１４日まで検出されている。

【0494】

この試験における適格な対象は、明細胞ＲＣＣを有し、一部は、サルコイド分化の少数の画分を有する。最初の２名のＲＣＣ対象から得られる結果が下に要約される。
●ＤＬ１用量を受容する第１の対象は、ＣＴＸ１３０注入後の４２日目のＣＴスキャンにより新規の病変又は既存の病変の進行を伴わずにそれらの腫瘍病変のＲＣＣ安定化を経験した。加えて、溶解性の骨転移は、同じＣＴスキャンにおいて再石灰化の明白な徴候を示した。対象は、１２週目において安定な疾患のままであった。
●ＤＬ１用量を受容する第２の対象は、４２日目にＲＥＣＩＳＴ １．１に従って少なくとも部分奏効を経験し、胸膜下の１つの標的病変及び胸郭内の３つの非標的病変が劇的に減少した。

【0495】

他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、均等な又は同様の目的に役立つ代替的な特徴へと置き換えてもよい。すなわち、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示される各特徴は、一般的な一連の均等な又は同様の特徴の単なる一例である。

【0496】

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明を各種の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更形態及び修正形態をなし得る。したがって、他の実施形態も請求項の範囲に含まれるものとする。

【0497】

均等物
いくつかの本発明の実施形態を本明細書で説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載される機能を実行し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るために、様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定するであろう。また、そのような変更形態及び／又は修正形態の各々は、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料及び構成が例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料及び／又は構成が、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解する。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多く均等物を、日常の実験のみを用いて認識するか又は確認することが可能である。したがって、上述の実施形態は、単に例として提示されており、また添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。

【0498】

本明細書中で定義され、用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義及び／又は定義される用語の普通の意味よりも優先されるものと理解されたい。

【0499】

本明細書に開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合により文献の全体を包含する場合がある。

【0500】

不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。

【0501】

本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「及び／又は」という表現は、等位結合される要素、すなわち一部の場合に接続的に提示され、他の場合に離接的に提示される要素の「いずれか又は両方」を意味するものとして理解されたい。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／又は」の節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定された要素に関連するか又は関連しないに関わらず、他の要素が任意選択的に提示され得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する参照は、「含む」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指し得る。

【0502】

本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する際、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であり、すなわち要素のリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上の数及び任意選択的に追加的な列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。「～の１つのみ」若しくは「～の厳密に１つ」又は特許請求の範囲で使用されるときの「～からなる」などの反対を明らかに示す用語のみが、多数の要素又は要素のリストの厳密に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用する時、用語「又は」は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうち１つのみ」、又は「～のうちの厳密に１つ」などの排他性の用語が先行する場合のみ、排他的代替用語（すなわち、「一方又は他方であるが両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。「本質的に～からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲内で使用される時、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

【0503】

本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における、１つ以上の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」という語句は、要素の列挙内の要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素であるが、要素の列挙内に具体的に列挙されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素の列挙内の要素の任意の組み合わせを必ずしも除外しないことを意味するものと理解すべきである。この定義により、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かに関わらず、「少なくとも１つ」という語句が意味する要素の列挙内に具体的に特定される要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることも可能になる。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（換言すると「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、換言すると「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」は、一実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意選択によりＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択によりＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、さらに別の実施形態では、任意選択により２つ以上のＡを含む少なくとも１つ、且つ任意選択により２つ以上のＢを含む少なくとも１つ（及び任意選択により他の要素を含む）を指すなどであり得る。

【0504】

用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣習による許容標準偏差内にあることを意味し得る。或いは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、さらにより好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。或いは、特に生物学的系又はプロセスに関して、その用語は、１桁以内、好ましくは２倍以内の値を意味する場合がある。本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に指示のない限り、用語「約」は、黙示的であり、これに関連して特定の値が許容誤差範囲内にあることを意味する。

【0505】

同様に、明確に反対に示されない限り、複数の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-6B】

【図6C】

【図7A-7C】

【図8A-8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【配列表】

2023501611000001.app

【国際調査報告】