▶ クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフトの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-18
(54)【発明の名称】ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230111BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230111BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230111BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20230111BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230111BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20230111BHJP
C07K 16/32 20060101ALN20230111BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230111BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20230111BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/864 100Z
C12N5/0783
C12N15/09 110
C07K16/30
C07K16/32
C07K19/00
C07K14/725
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022527817
(86)(22)【出願日】2020-11-13
(85)【翻訳文提出日】2022-07-06
(86)【国際出願番号】 IB2020060722
(87)【国際公開番号】W WO2021095012
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】62/934,999
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518370079
【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】ジュリー カーソン
(72)【発明者】
【氏名】デメトリオス カライツィディス
(72)【発明者】
【氏名】タン スーユアン
(72)【発明者】
【氏名】ユイ ホイ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA03
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本開示の態様は、従来の製造方法を上回るいくつかの改善を提供し、それにより臨床的に有用なＣＡＲ Ｔ細胞療法の強力な供給の生成を可能にする、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法であって、（ｉ）Ｔ細胞の第１の集団を提供する工程と；
（ｉｉ）前記Ｔ細胞の第１の集団に、第１のＣａｓ９酵素及びＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入して、Ｔ細胞の第２の集団を生成する工程であって、前記Ｔ細胞の第２の集団は、破壊された前記ＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；
（ｉｉｉ）前記Ｔ細胞の第２の集団に、第２のＣａｓ９酵素及びＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体並びに第３のＣａｓ９酵素及びβ２マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを含む第３のＲＮＰ複合体を導入して、Ｔ細胞の第３の集団を生成する工程であって、前記Ｔ細胞の第３の集団は、破壊された前記ＣＤ７０遺伝子、破壊された前記ＴＲＡＣ遺伝子及び破壊された前記β２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；
（ｉｖ）前記Ｔ細胞の第３の集団をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとインキュベートして、Ｔ細胞の第４の集団を生成する工程であって、前記ＡＡＶベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、前記ＴＲＡＣ遺伝子と相同な配列に隣接しており、前記Ｔ細胞の第４の集団は、前記ＣＡＲを発現し、且つ破壊された前記ＣＤ７０遺伝子、破壊された前記ＴＲＡＣ遺伝子及び破壊された前記β２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；
（ｖ）前記Ｔ細胞の第４の集団を増殖させ、それにより増殖されたＴ細胞集団を生成する工程と；
（ｖｉ）前記増殖されたＴ細胞集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を除去して、遺伝子操作されたＴ細胞集団を生成する工程であって、前記遺伝子操作されたＴ細胞集団は、前記ＣＡＲを発現し、且つ破壊された前記ＣＤ７０遺伝子、破壊された前記ＴＲＡＣ遺伝子及び破壊された前記β２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；
（ｖｉｉ）前記遺伝子操作されたＴ細胞集団を採取する工程と
を含む方法。
【請求項2】
前記Ｔ細胞の第１の集団は、ヒト血液細胞から濃縮された凍結保存Ｔ細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｔ細胞の第１の集団は、（ａ）ヒトドナーから血液細胞を得る工程と；（ｂ）前記血液細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する工程とを含むプロセスによって調製される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
工程（ｂ）は、抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８抗体と結合された磁気ビーズを使用して実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｔ細胞の第１の集団は、少なくとも約８０％の細胞生存率並びに／又は少なくとも約８０％のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
（ｃ）工程（ｂ）で生成された前記濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を凍結保存する工程を更に含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
工程（ｉｉ）は、エレクトロポレーションによって実施される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記第１のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、及び前記ＣＤ７０遺伝子を標的化する前記第１のｇＲＮＡの濃度は、約０．１６ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
工程（ｉｉ）の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約３５０×１０６細胞／ｍＬである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｉｉ）の前記細胞濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記増殖工程は、細胞容器において、約１５０，０００細胞／ｃｍ２～約６００，０００細胞／ｃｍ２、任意選択的に約３００，０００細胞／ｃｍ２～約５００，０００細胞／ｃｍ２の密度で前記Ｔ細胞を播種する工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程（ｉｉ）後且つ工程（ｉｉｉ）前に、細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下で前記Ｔ細胞の第２の集団をインキュベートして、活性化Ｔ細胞集団を生成する工程を更に含み、前記活性化Ｔ細胞集団は、破壊された前記ＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストを含み、前記ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、ナノマトリックス粒子に結合されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下で前記Ｔ細胞の第２の集団をインキュベートする工程は、約２×１０６／ｃｍ２の細胞播種密度及び約２×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で約７２時間にわたるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
混合物中の前記Ｔ細胞活性化剤対培地の比は、約１：１２．５（ｖ／ｖ）である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
活性化を減少させ、且つ工程（ｉｉｉ）前に細胞を回復させるために、Ｔ細胞活性化剤の存在下において、前記Ｔ細胞の第２の集団をインキュベートする工程後に前記活性化Ｔ細胞集団中で前記Ｔ細胞活性化剤を希釈する工程を更に含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
工程（ｉｉｉ）は、エレクトロポレーションによって実施される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
工程（ｉｉｉ）は、１つのエレクトロポレーションイベントを伴う、請求項１～１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項19】
前記第２のＲＮＰ複合体及び前記第３のＲＮＰ複合体は、１つのエレクトロポレーションイベントで前記活性化Ｔ細胞に導入される、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記第２のＲＮＰ複合体中の前記第２のＣａｓ９酵素の量は、第３のＲＮＡ複合体中の前記第３のＣａｓ９酵素の量と同じである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記第２のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、前記第３のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記第２のｇＲＮＡの濃度は、約０．０８ｍｇ／ｍＬであり、及び前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記第３のｇＲＮＡの濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬである、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
工程（ｖ）の前記増殖されたＴ細胞集団の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬである、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
工程（ｉｖ）の細胞数は、約３×１０８細胞である、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＡＡＶベクターは、約１０，０００～約８０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）値を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＡＡＶベクターの前記ＭＯＩは、約２０，０００である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）ベクターである、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、約６日～約１２日にわたって細胞培養容器で前記Ｔ細胞の第４の集団を培養することによって実施される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、約７日～約９日にわたって細胞培養容器で前記Ｔ細胞の第４の集団を培養することによって実施される、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記Ｔ細胞の第４の集団は、約３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で培養される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞培養容器は、培地交換なしで約１０日～約１２日にわたる細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器である、請求項２７又は２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞培養容器は、培地交換なしで約７日～約９日にわたる細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
工程（ｖｉ）は、前記増殖された細胞を、抗ＴＣＲαβ抗体が固定化されているビーズに接触させ、且つ結合されていない細胞を収集することによって実施される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記第１のＣａｓ９酵素、前記第２のＣａｓ９酵素及び／又は前記第３のＣａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｓｐＣａｓ９）である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記第１のＣａｓ９酵素、前記第２のＣａｓ９酵素及び前記第３のＣａｓ９酵素は、同じである、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記第１のＣａｓ９酵素、前記第２のＣａｓ９酵素及び前記第３のＣａｓ９酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記ＣＤ７０遺伝子を標的化する前記第１のｇＲＮＡは、配列番号４のスペーサー配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＣＤ７０遺伝子を標的化する前記第１のｇＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記第２のｇＲＮＡは、配列番号８のスペーサー配列を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記第２のｇＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記第３のｇＲＮＡは、配列番号１２のスペーサー配列を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記第３のｇＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ、前記第３のｇＲＮＡ及び／又はその組み合わせは、１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＣＡＲは、癌抗原を標的化する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａから誘導され、及び／又は前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢから誘導される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ｓｃＦｖ断片は、ＣＤ７０に結合する、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記ＣＡＲは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法によって生成される、遺伝子操作されたＴ細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９９９号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９９９号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、血液癌の治療において有望な治療効果を示している。典型的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者の免疫細胞（自己）又は無関係のヒトドナーからの免疫細胞（同種異系）のいずれかの遺伝子操作によって生成される。高品質の臨床用ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成は、この技術を幅広く適用するための必要条件である。従って、ＣＡＲ－Ｔ細胞の大規模生産のための効率的な製造プロセスを開発することは、非常に興味深いことである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示は、少なくとも部分的に、従来の製造方法を上回るいくつかの改善を提供する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法の開発に基づく。このような改善としては、本明細書に記載の遺伝子改変の一貫性及び効率の改善（例えば、トリプルゲノム編集の一貫性及び効率の改善）が挙げられるが、これらに限定されず、これにより臨床的に有用なＣＡＲ－Ｔ細胞療法の強力な供給の生成が可能になる。
【0004】
従って、本開示の一態様は、遺伝子操作されたＴ細胞を製造るための方法であって、（ｉ）Ｔ細胞の第１の集団を提供する工程と；（ｉｉ）Ｔ細胞の第１の集団に、第１のＣａｓ９酵素及びＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入して、Ｔ細胞の第２の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第２の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；（ｉｉｉ）Ｔ細胞の第２の集団に、第２のＣａｓ９酵素及びＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体並びに第３のＣａｓ９酵素及びβ２マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを含む第３のＲＮＰ複合体を導入して、Ｔ細胞の第３の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第３の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｉｖ）Ｔ細胞の第３の集団をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとインキュベートして、Ｔ細胞の第４の集団を生成する工程であって、ＡＡＶベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、ＴＲＡＣ遺伝子と相同な配列に隣接しており、Ｔ細胞の第４の集団は、ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｖ）Ｔ細胞の第４の集団を増殖させ、それにより増殖されたＴ細胞集団を生成する工程と；（ｖｉ）増殖されたＴ細胞集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を除去して、遺伝子操作されたＴ細胞集団を生成する工程であって、遺伝子操作されたＴ細胞集団は、ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｖｉｉ）遺伝子操作されたＴ細胞集団を採取する工程とを含む方法を提供する。
【0005】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第１の集団は、ヒト血液細胞から濃縮された凍結保存Ｔ細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第１の集団は、（ａ）ヒトドナーから血液細胞を得る工程と；（ｂ）血液細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する工程とを含むプロセスによって調製される。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８抗体と結合された磁気ビーズを使用して実施される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第１の集団は、少なくとも約８０％の細胞生存率並びに／又は少なくとも約８０％のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を有する。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）工程（ｂ）で生成された濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を凍結保存する工程を更に含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、エレクトロポレーションによって実施される。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、及びＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡの濃度は、約０．１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約３５０×１０６細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の細胞濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬである。
【0007】
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉｉ）後且つ工程（ｉｉｉ）前に、細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下でＴ細胞の第２の集団をインキュベートして、活性化Ｔ細胞集団を生成する工程を更に含み、活性化Ｔ細胞集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストを含み得、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、ナノマトリックス粒子に結合されている。細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下でＴ細胞の第２の集団をインキュベートする工程は、約２×１０６／ｃｍの細胞播種密度及び約２×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で約７２時間にわたるものであり得る。いくつかの実施形態では、混合物中のＴ細胞活性化剤対培地の比は、約１：１２．５（ｖ／ｖ）である。更に他の実施形態では、本明細書で開示される方法は、活性化を減少させ、且つ工程（ｉｉｉ）前に細胞を回復させるために、Ｔ細胞活性化剤の存在下において、Ｔ細胞の第２の集団をインキュベートする工程後に活性化Ｔ細胞集団中でＴ細胞活性化剤を希釈する工程を更に含み得る。
【0008】
いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、エレクトロポレーションによって実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、１つのエレクトロポレーションイベントを伴う。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、１つのエレクトロポレーションイベントで活性化Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第２のＲＮＰ複合体中の第２のＣａｓ９酵素の量は、第３のＲＮＡ複合体中の第３のＣａｓ９酵素の量と同じである。いくつかの実施形態では、第２のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．３ｍｇ／ｍＬであり、第３のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．３ｍｇ／ｍＬであり、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡの濃度は、約０．０８ｍｇ／ｍＬであり、及びβ２Ｍ遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡの濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）の細胞濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬである。他の実施形態では、工程（ｉｉｉ）（例えば、エレクトロポレーション）で使用される各容器の総細胞数は、約５×１０８～約２．５×１０９細胞、例えば、約７×１０８細胞であり得る。いくつかの例では、複数の容器、例えば約５～１０個の容器が工程（ｉｉｉ）（例えば、エレクトロポレーション）で使用され得る。具体例では、７個もの容器が工程（ｉｉｉ）で使用され得、これは、例えばエレクトロポレーションのために約１．５×１０９～約３×１０９細胞（例えば、約２．１×１０９細胞又は約２．７×１０９細胞）を含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１０，０００～約８０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）値を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）ベクターである。
【0010】
いくつかの実施形態では、工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、約７日～約１２日にわたって細胞培養容器でＴ細胞の第４の集団を培養することによって実施される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第４の集団は、約１５０，０００細胞／ｃｍ２～約６００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で細胞培養容器に播種され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第４の集団は、約３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、培地交換なしで約１０日～約１２日にわたる間細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器（本明細書では静置培養容器とも交換可能に呼ばれる）である。
【0011】
いくつかの実施形態では、工程（ｖｉ）は、増殖された細胞を、抗ＴＣＲαβ抗体が固定化されているビーズに接触させ、且つ結合されていない細胞を収集することによって実施される。
【0012】
いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素、第２のＣａｓ９酵素及び／又は第３のＣａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９由来のＣａｓ９酵素（ｓｐＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素、第２のＣａｓ９酵素及び第３のＣａｓ９酵素は、同じである。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素、第２のＣａｓ９酵素及び第３のＣａｓ９酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡは、配列番号４のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡは、配列番号８のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡは、配列番号１２のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ、第３のｇＲＮＡ及び／又はその組み合わせは、１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、癌抗原を標的化する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａから誘導され、及び／又は共刺激ドメインは、４－１ＢＢから誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ断片は、ＣＤ７０に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。
【0018】
従って、本開示の一態様は、遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法であって、（ｉ）Ｔ細胞の第１の集団を提供する工程と；（ｉｉ）Ｔ細胞の第１の集団に、第１のＣａｓ９酵素及びＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を導入して、Ｔ細胞の第２の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第２の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；（ｉｉｉ）細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下でＴ細胞の第２の集団をインキュベートして、Ｔ細胞の第３の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第３の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｉｖ）Ｔ細胞の第３の集団に、第２のＣａｓ９酵素及びＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体並びに第３のＣａｓ９酵素及びβ２マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを含む第３のＲＮＰ複合体を導入して、Ｔ細胞の第４の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第４の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｖ）Ｔ細胞の第４の集団をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとインキュベートして、Ｔ細胞の第５の集団を生成する工程であって、ＡＡＶベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、核酸配列は、ＴＲＡＣ遺伝子と相同な配列に隣接しており、Ｔ細胞の第５の集団は、ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｖｉ）Ｔ細胞の第５の集団を増殖させ、それにより増殖されたＴ細胞集団を生成する工程と；（ｖｉｉ）増殖されたＴ細胞集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を除去して、遺伝子操作されたＴ細胞集団を生成する工程であって、遺伝子操作されたＴ細胞集団は、ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｖｉｉｉ）遺伝子操作されたＴ細胞集団を採取する工程とを含む方法を提供する。
【0019】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞集団である。
【0020】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が下記の説明に記載される。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明並びに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】小規模製造プロセスで調製されたＴ細胞の編集後のＴ細胞発現を示すグラフである。ＲＮＰ複合体は、括弧内に示される。２ｄ：２日間（４８時間）活性化されたＴ細胞；３ｄ：３日間（７２時間）活性化されたＴ細胞；１ｘＥＰ：単一のエレクトロポレーション；２ｘＥＰ：２段階のエレクトロポレーシ。
【図2A】転座率に対する単一エレクトロポレーション又は２段階エレクトロポレーションの効果を示すグラフを含む。図２Ａ：１１個の示された転座の転座パーセントを示すグラフ。図２Ｂ：８個の示された転座の転座パーセントを示すグラフ。
【図2B】転座率に対する単一エレクトロポレーション又は２段階エレクトロポレーションの効果を示すグラフを含む。図２Ａ：１１個の示された転座の転座パーセントを示すグラフ。図２Ｂ：８個の示された転座の転座パーセントを示すグラフ。
【図3A】抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、ＣＤ７０、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を遺伝子破壊したＣＴＸ１３０Ｔ細胞の作製方法のフローチャートを含む。図３Ａは、本明細書に記載の技術のいくつかの実施形態による、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製するための例示的な製造プロセスのフローチャートを含む。ＣＡＲ：キメラ抗原受容体；ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸；ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン；ＩＬ：インターロイキン；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｒＡＡＶ：組換えアデノ随伴ウイルス；ｓｇＲＮＡ：単一ガイドリボ核酸；ＴＣＲαβ：Ｔ細胞受容体アルファ鎖及びＴ細胞受容体ベータ鎖；補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５：５％男性ヒト血清ＡＢ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２及び１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ７を含むＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５。図３Ｂは、本明細書に記載の技術のいくつかの実施形態による、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞を含む製剤を作製するための例示的な製造プロセスのフローチャートを含む。
【図3B】抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、ＣＤ７０、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を遺伝子破壊したＣＴＸ１３０Ｔ細胞の作製方法のフローチャートを含む。図３Ａは、本明細書に記載の技術のいくつかの実施形態による、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製するための例示的な製造プロセスのフローチャートを含む。ＣＡＲ：キメラ抗原受容体；ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸；ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン；ＩＬ：インターロイキン；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｒＡＡＶ：組換えアデノ随伴ウイルス；ｓｇＲＮＡ：単一ガイドリボ核酸；ＴＣＲαβ：Ｔ細胞受容体アルファ鎖及びＴ細胞受容体ベータ鎖；補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５：５％男性ヒト血清ＡＢ、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２及び１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ７を含むＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５。図３Ｂは、本明細書に記載の技術のいくつかの実施形態による、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現するＴ細胞を含む製剤を作製するための例示的な製造プロセスのフローチャートを含む。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本開示は、少なくとも部分的に、ＣＡＲ－Ｔ細胞、特に同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための、製造プロセスの１つ以上の工程について改善された条件を含む改善された製造プロセスの開発に基づく。本明細書では、少なくとも以下の有利な結果につながる改善された製造プロセスが開示される：
（ａ）本明細書で提供されるＴ細胞活性化条件の改善から生じるエレクトロポレーション後の％ＣＡＲ＋発現の増加及び細胞喪失の減弱。
（ｂ）本明細書で提供される活性化Ｔ細胞条件のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集条件の改善から生じるＴ細胞におけるβ２Ｍ遺伝子破壊の一貫性の改善及び効率の改善。
（ｃ）本明細書で提供されるＴ細胞エレクトロポレーション条件の改善から生じるより低い転座率。
（ｄ）本明細書に記載の改善された製造プロセスによって提供される生産時間の短縮及び生産コストの減少から生じるＣＡＲ Ｔ細胞療法の供給の増加。
（ｅ）本明細書に記載の改善された製造プロセスを使用した均一で高品質のＣＡＲ Ｔ療法の生成から生じる製造された製剤の変動性の低減。
（ｆ）Ｔ細胞で高いＣＡＲ発現レベルを維持しながらのＡＡＶ形質導入条件の単純化。
（ａ）本明細書で提供されるＴ細胞活性化条件の改善から生じるエレクトロポレーション後の％ＣＡＲ＋発現の増加及び細胞喪失の減弱。
（ｂ）本明細書で提供される活性化Ｔ細胞条件のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集条件の改善から生じるＴ細胞におけるβ２Ｍ遺伝子破壊の一貫性の改善及び効率の改善。
（ｃ）本明細書で提供されるＴ細胞エレクトロポレーション条件の改善から生じるより低い転座率。
（ｄ）本明細書に記載の改善された製造プロセスによって提供される生産時間の短縮及び生産コストの減少から生じるＣＡＲ Ｔ細胞療法の供給の増加。
（ｅ）本明細書に記載の改善された製造プロセスを使用した均一で高品質のＣＡＲ Ｔ療法の生成から生じる製造された製剤の変動性の低減。
（ｆ）Ｔ細胞で高いＣＡＲ発現レベルを維持しながらのＡＡＶ形質導入条件の単純化。
【0023】
従って、本明細書では、癌抗原、例えば、ＣＤ７０を標的化し、ノックアウトされたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲコンストラクトなどのＣＡＲコンストラクトを発現する遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法が提供される。本明細書に記載される方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞集団及びその治療的使用も本開示の範囲内である。
【0024】
Ｉ．遺伝子操作されたＴ細胞の製造
本開示の態様は、破壊された表面抗原分類７０（ＣＤ７０）遺伝子のクラスター、破壊されたβ２－マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子及び破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする挿入された核酸を含む遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法が提供される。
本開示の態様は、破壊された表面抗原分類７０（ＣＤ７０）遺伝子のクラスター、破壊されたβ２－マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子及び破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする挿入された核酸を含む遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法が提供される。
【0025】
ＣＤ７０遺伝子の破壊は、遺伝子操作されたＴ細胞の製造中に細胞間フラトリサイドを防ぐ。代わりに又は加えて、ＣＤ７０遺伝子の破壊は、遺伝子操作されたＴ細胞の健康及び機能の向上（例えば、増殖の延長、疲弊の減少）を可能にする。β２Ｍ遺伝子及びＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、遺伝子操作されたＴ細胞を非同種異系反応性にし、同種異系間移植に適したものにする。ＣＡＲをコードする核酸の挿入は、遺伝子操作されたＴ細胞がその表面にＣＡＲを発現することを可能にし、そこで遺伝子操作されたＴ細胞を癌細胞に標的化する。
【0026】
従って、本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞を製造するための方法は、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用してＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子の発現を妨害し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入を使用してＣＡＲをコードする核酸を挿入することを伴う。
【0027】
一般に、本明細書で開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞を製造するための方法は、（ｉ）好適なヒト免疫細胞源からＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する工程と、（ｉｉ）濃縮されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する工程と、（ｉｉｉ）活性化Ｔ細胞を遺伝子操作して破壊されたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する工程と、治療的使用のために遺伝子操作されたＴ細胞を採取する工程とを含み得る。必要に応じて、濃縮されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞は、将来の使用のために凍結保存を介して保存され得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、採取前にｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ得る。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、このようにして生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団から枯渇させ得る。
【0028】
（ｉ）Ｔ細胞の濃縮
本明細書に開示される製造方法のいずれも出発物質としてヒト血液細胞を使用し得る。例えば、Ｔ細胞を、遠心沈降（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）などの当業者に公知の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。代わりに、遺伝子操作されたＴ細胞の作製に使用するためのＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して幹細胞（例えば、ＨＳＣ又はｉＰＳＣ）から誘導され得る。いくつかの実施形態では、血液細胞は個々のヒトドナーから得ることができる。他の実施形態では、血液細胞は、複数のヒトドナー（例えば、２、３、４又は５人のヒトドナー）から得ることができる。
本明細書に開示される製造方法のいずれも出発物質としてヒト血液細胞を使用し得る。例えば、Ｔ細胞を、遠心沈降（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）などの当業者に公知の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。代わりに、遺伝子操作されたＴ細胞の作製に使用するためのＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して幹細胞（例えば、ＨＳＣ又はｉＰＳＣ）から誘導され得る。いくつかの実施形態では、血液細胞は個々のヒトドナーから得ることができる。他の実施形態では、血液細胞は、複数のヒトドナー（例えば、２、３、４又は５人のヒトドナー）から得ることができる。
【0029】
いくつかの例では、好適なヒトドナーからのロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）サンプルを使用し得る。当技術分野において公知のとおり、ロイコパックサンプルは、末梢血から収集される濃縮された白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）製品である。ロイコパックサンプルには、典型的には、単球、リンパ球、血小板、血漿及び赤血球などの様々な血液細胞が含まれている。ヒトドナーは、好ましくは、健康なヒトドナーである。例えば、ヒトドナー候補は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＷＮＶ、クルーズトリパノソーマ及び／又はＣＭＶのスクリーニングの対象となり得る。スクリーニングで陰性の結果を示したヒト対象は、血液細胞のドナーとして使用され得る。
【0030】
本方法での使用が見出されるＴ細胞の供給源は特に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクからのＴ細胞は、本明細書に開示される製造方法のいずれかにおける出発物質として使用することができる。Ｔ細胞バンクは、細胞培養におけるＴ細胞の持続性を改善するために、特定の遺伝子（例えば、細胞の自己再生、アポトーシス及び／又はＴ細胞の疲弊又は複製老化に関与する遺伝子）の遺伝子編集を伴うＴ細胞を含み得る。Ｔ細胞バンクは、真正Ｔ細胞、例えば、非形質転換Ｔ細胞、最終分化Ｔ細胞、安定したゲノムを有するＴ細胞並びに／又は増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のためにサイトカイン及び成長因子に依存するＴ細胞から生成し得る。代わりに、このようなＴ細胞バンクは、造血幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）などの前駆細胞、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養物から生成され得る。いくつかの例では、Ｔ細胞バンク内のＴ細胞は、細胞の自己複製に関与する１つ以上の遺伝子、アポトーシスに関与する１つ以上の遺伝子及び／又はＴ細胞の疲弊に関与する１つ以上の遺伝子の遺伝子編集を含み得、そのような遺伝子の発現を破壊又は低減し、培養の持続性の改善をもたらす。Ｔ細胞バンクで編集された遺伝子の例としては、Ｔｅｔ２、Ｆａｓ、ＣＤ７０、Ｒｅｇｎａｓｅ－１又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。編集されていないＴ細胞と比較して、Ｔ細胞バンクのＴ細胞は、培養における増殖能力（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）の増強、増殖能力（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）の増強、Ｔ細胞の活性化の増大及び／又はアポトーシスレベルの低下を有し得る。
【0031】
好適なＴ細胞は、従来の方法又は本明細書に開示される方法を使用して、ヒト血液細胞から濃縮することができる。遺伝子操作されたＴ細胞の作製に使用するためのＴ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない１つ以上のＴ細胞マーカーを発現し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒト血液細胞から濃縮することができる。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮することができる。具体例では、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれもヒト血液細胞から精製される。
【0032】
ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、当技術分野で公知の任意の方法又は本明細書に開示されている方法を使用して、例えば、標的Ｔ細胞の特定の細胞表面バイオマーカーに結合することができる抗体、例えば、ＣＤ４に特異的な抗体及び／又はＣＤ８に特異的な抗体を使用して、本明細書に記載されているものなどの好適な血液細胞源から単離することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮は、磁気ビーズに結合した抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体を使用して実施することができる。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、好適な条件下で好適な期間、そのような磁気ビーズと共にインキュベートすることができ、ビーズに結合した抗体を介して標的Ｔ細胞を磁気ビーズに結合させることができる。非結合細胞は洗浄でき、ビーズに結合したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は通常の方法で収集できる。
【0033】
濃縮されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞）は、日常的な慣行に従って、細胞生存率及び／又は標的Ｔ細胞の純度などの特徴について評価され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される濃縮工程からのＴ細胞集団は、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超える）の細胞生存率を有し得る。代わりに又は加えて、濃縮されたＴ細胞集団は、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、約９８％又はそれを超える標的Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）の純度を有し得る。代わりに又は加えて、濃縮されたＴ細胞集団は、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、約９８％又はそれを超える標的Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）の純度を有し得る。
【0034】
「約」又は「およそ」という用語は、当技術分野の通常の技能の１つによって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、許容可能な標準偏差の範囲内を意味し得る。代わりに、「約」とは、所定の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、更に好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。代わりに、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、この文脈において、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する。
【0035】
濃縮されたＴ細胞集団（これも本開示の範囲内である）は、本明細書に開示されるように、更なる処理のために直ちに使用され得る。代わりに、濃縮されたＴ細胞集団は、例えば凍結保存を介して、将来の使用に好適な条件下で保存され得る。更なる処理前に凍結保存Ｔ細胞を通常の手順に従って解凍することができる。解凍した細胞の細胞生存率を評価して、解凍した細胞が更なる処理に好適であるかどうかを判断することができる。
【0036】
（ｉｉ）濃縮されたＴ細胞のＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９媒介遺伝子編集
本明細書で開示される手順のいずれかによって調製される濃縮されたＴ細胞は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して、ＣＤ７０をノックアウトするための遺伝子編集を受け得る。第１のエレクトロポレーション工程でのＣＤ７０遺伝子のノックアウトとそれに続く第２のエレクトロポレーション工程でのＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子のノックアウトは、編集効率を大幅に向上させ、遺伝子編集中に生成される転座の数を減少させた。以下の例を参照されたい。
本明細書で開示される手順のいずれかによって調製される濃縮されたＴ細胞は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して、ＣＤ７０をノックアウトするための遺伝子編集を受け得る。第１のエレクトロポレーション工程でのＣＤ７０遺伝子のノックアウトとそれに続く第２のエレクトロポレーション工程でのＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子のノックアウトは、編集効率を大幅に向上させ、遺伝子編集中に生成される転座の数を減少させた。以下の例を参照されたい。
【0037】
ＣＤ７０遺伝子は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーをコードし、且つその発現は、活性化Ｔリンパ球及びＢリンパ球並びに成熟樹状細胞に限定される。ＣＤ７０は、そのリガンドであるＣＤ２７との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性Ｔ細胞の生存に関与している。ＣＤ７０遺伝子の破壊は、遺伝子操作されたＴ細胞の製造中の細胞間フラトリサイドのリスクを最小限に抑え、製造された遺伝子操作されたＴ細胞の健康及び機能の向上を可能にする。
【0038】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を媒介遺伝子編集システム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの頭字語であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡの断片（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡの断片が原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ座位の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外来性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいくつかの種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの頭字語であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡの断片（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡの断片が原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ座位の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外来性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいくつかの種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
【0039】
ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ内の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’２０ｎｔの配列の変化は、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の標的化を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）の後にある場合、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔと一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。
【0040】
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いでこのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって標的ＤＮＡを切断することができる。
【0041】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終端する（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
【0042】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、以下の重要な工程は、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用する。
【0043】
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大部分の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位において１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような改変は、典型的には＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲは、内因的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、修復オペラントとしてＮＨＥＪを利用する。
【0044】
（ａ）Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書で開示されるような遺伝子操作されたＴ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるように、野生型Ｃａｓ９を使用し得るか、又はＣａｓ９の改変されたバージョン（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）を使用し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）を含むように改変されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵によって生成され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、本明細書では配列番号１として示される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書で開示されるような遺伝子操作されたＴ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書で提供されるように、野生型Ｃａｓ９を使用し得るか、又はＣａｓ９の改変されたバージョン（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）を使用し得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）を含むように改変されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵によって生成され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、本明細書では配列番号１として示される。
【0045】
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書で記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ、即ちｇＲＮＡを使用することを含む。本明細書で使用する場合、「ｇＲＮＡ」とは、特定の標的配列で遺伝子を編集するために、Ｃａｓ９をＣＤ７０遺伝子又はＴＲＡＣ遺伝子又はβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を意味する。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
本明細書で記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ、即ちｇＲＮＡを使用することを含む。本明細書で使用する場合、「ｇＲＮＡ」とは、特定の標的配列で遺伝子を編集するために、Ｃａｓ９をＣＤ７０遺伝子又はＴＲＡＣ遺伝子又はβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を意味する。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
【0046】
ＣＤ７０遺伝子を標的化する代表的なｇＲＮＡは、配列番号２に示される。国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットとして公開された２０１９年５月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号も参照され、その関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１９番染色体上に位置するＣＤ７０遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１９番染色体：６，５８３，１８３～６，６０４，１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００１２５７２６）。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＣＤ７０ゲノム領域に切断を生じさせてＣＤ７０遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、表１１の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＣＤ７０遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（配列番号２）により、表１１の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＣＤ７０遺伝子におけるインデルが生じる。
【0048】
ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する代表的なｇＲＮＡは、配列番号６に示される。国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号も参照され、その関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６－２２，５５２，１５４；．Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。
【0049】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＴＲＡＣゲノム領域に切断を生じさせてＴＲＡＣ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、表９の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡ（配列番号６）により、表９の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。
【0050】
β２Ｍ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号１０に示される。国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号も参照され、その関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計することができる（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７－４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。
【0051】
いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、β２Ｍゲノム領域に切断を生じさせてβ２Ｍ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、表１０の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、β２Ｍ遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（配列番号１０）により、表１０の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、β２Ｍ遺伝子におけるインデルが生じる。
【0052】
ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型のｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型のｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとで複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、この部位特異的ポリペプチドとの会合による複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
【0053】
当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
【0054】
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。
【0055】
二重分子ガイドＲＮＡは、２つの鎖のＲＮＡ分子を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
【0056】
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）を付与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
【0057】
「標的配列」とは、ＰＡＭ配列に隣接している標的遺伝子のことであり、Ｃａｓ９によって改変される配列のことである。「標的配列」は、「標的核酸」内のいわゆるＰＡＭ鎖上にあり、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含む二本鎖分子である。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。
【0058】
例えば、ＣＤ７０標的配列が５’－ＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＴＴＧＧＴＣＧＣ－３’（配列番号１５）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＵＵＧＧＵＣＣＣＡＵＵＧＧＵＣＧＣ－３’（配列番号５）である。別の例では、ＴＲＡＣ標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１７）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号９）である。更に別の例では、β２Ｍ標的配列が５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ３’（配列番号：１９）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ３’である（配列番号：１３）。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に応じて変化する。
【0059】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素によって認識可能なＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
【0060】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を有する。例えば、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ－３’を含む配列では、標的核酸は、Ｎ（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである）に対応する配列であり得る。
【0061】
ｇＲＮＡのスペーサー配列は、目的の標的遺伝子の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号４に示される。ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号８に示される。β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号１２に示される。
【0062】
本明細書で開示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列によって目的の任意の配列を標的化することができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的配列内の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的配列内の標的配列は、最大で１０個のミスマッチ、例えば最大で９個、最大で８個、最大で７個、最大で６個、最大で５個、最大で４個、最大で３個、最大で２個又は最大で１個のミスマッチを含有し得る。
【0063】
本明細書で提供される使用し得るｇＲＮＡの非限定的な例は、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開される、２０１８年５月１１日に出願のＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットとして公開される、２０１９年５月１０日に出願のＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号に提供されており、先の出願の各々の関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に提供されるｇＲＮＡ配列のいずれに対しても、明示的に修飾を示さないものは、非修飾配列及び任意の好適な修飾を有する配列の両方を包含することが意図される。
【0064】
本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び更に本明細書で開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列長を有する。従って、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は５０個超の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含み得る。
【0065】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり得、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長のスペーサー配列を含む。例を実施例５の表８に示す。
【0066】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７又は８個のウラシル残基を含むことができる。
【0067】
ｓｇＲＮＡのいずれかを含む、本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれも未改変であり得る。代わりに、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／又は修飾主鎖を含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡなどの改変ｇＲＮＡは、５’末端、３’末端のいずれか又は両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。
【0068】
特定の実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内での活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。
【0069】
２つ以上の好適なＣａｓ９及び２つ以上の好適なｇＲＮＡを本明細書に記載される方法、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される方法に使用することができることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、方法は、当技術分野において公知のＣａｓ９酵素及び／又はｇＲＮＡを含む。例は、例えば、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された、２０１８年５月１１日出願のＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットとして公開された、２０１９年５月１０日出願のＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号に見出すことができ、各先行出願の関連する開示は、本明細書で言及される目的及び主題に対して本明細書に参照として組み込まれる。
【0070】
ＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子の遺伝子編集
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される濃縮されたＴ細胞は、本明細書に開示される条件下で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を介して、ＣＤ７０遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子の遺伝子編集を受け得、これにより従来の条件によって提供されるものと比較してより高く、より一貫した遺伝子編集効率及びより低い転座率がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される濃縮されたＴ細胞は、本明細書に開示される条件下で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を介して、ＣＤ７０遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子の遺伝子編集を受け得、これにより従来の条件によって提供されるものと比較してより高く、より一貫した遺伝子編集効率及びより低い転座率がもたらされる。
【0071】
具体例では、ＣＤ７０遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９（例えば、配列番号１のＣａｓ９）及び約０．１６ｍｇ／ｍＬのＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ（例えば、ＣＤ７０－７のｇＲＮＡ）を含み得る。ＲＮＰは、少なくともそれらが、核酸が豊富な細胞環境中での乱雑な相互作用のリスクを最小化し、且つＲＮＡを分解から保護するため、遺伝子編集に有用である。ＲＮＰを形成するための方法は、当技術分野において知られている。
【0072】
本明細書に開示されるＣＤ７０を標的化するＲＮＰは、ＲＮＰを好適な量の濃縮されたＴ細胞と混合することによって濃縮されたＴ細胞に導入することができ、こうして形成された混合物は、ＲＮＰの細胞への送達を可能にする好適な条件下でエレクトロポレーションに供される。場合により、濃縮されたＴ細胞の好適な量は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬの範囲であり得る。例えば、第１のエレクトロポレーション工程用のＴ細胞の好適な量は、約２００×１０６細胞／ｍＬ～約３５０×１０６細胞／ｍＬの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、濃縮されたＴ細胞の濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、濃縮されたＴ細胞の濃度は、約２００×１０６細胞／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、濃縮されたＴ細胞の濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬ又は約３５０×１０６細胞／ｍＬであり得る。
【0073】
エレクトロポレーション後、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞は、回復に好適な期間、新鮮な培地で培養され得る。遺伝子編集効率は、日常的な慣行に従って実行し得る。このように生成される遺伝子編集されたＴ細胞は、下流での遺伝子編集効率及びＴ細胞増殖工程を改善するためのＴ細胞活性化工程を受け得る。
【0074】
ＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＣＲ複合体の構成要素をコードする。ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、この操作されたＴ細胞を非同種異系反応性にし、且つ同種異系間移植に好適なものにし、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。β２Ｍ遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ複合体の共通（不変）構成要素をコードする。β２Ｍ遺伝子を破壊すると、宿主対治療的同種Ｔ細胞応答を防ぐことができる。ＴＲＡＣ遺伝子とβ２Ｍ遺伝子の両方をノックアウトすると、細胞治療に使用する同種異系Ｔ細胞の産生がもたらされる。
【0075】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製造方法は、Ｔ細胞中の標的遺伝子（ＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ）を連続的に編集し、発現のためにＣＡＲをコードする核酸をＴ細胞に導入するための複数の遺伝子編集工程を含み得る。各遺伝子編集工程は、Ｔ細胞ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素（複数可）並びに／又は標的遺伝子（ＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ）の遺伝子編集及びＴ細胞におけるＣＡＲ発現のためのＣＡＲをコードする核酸を導入するためのエレクトロポレーション工程を伴い得る。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＣＤ７０は第１のエレクトロポレーションイベントで編集され、β２Ｍ／ＴＲＡＣは第２のエレクトロポレーションイベントで編集される。例えば、図３Ａを参照されたい。しかしながら、本明細書に記載の方法がその一連の工程に限定されることを意図するものではない。図２Ａ及び２Ｂは、第１のエレクトロポレーションで送達されたＣＤ７０及びβ２Ｍの両方のガイドが、より低い転座率を有益にもたらしたことを示唆している。従って、他の実施形態では、ＣＤ７０とβ２Ｍの両方を第１のエレクトロポレーションイベントで標的にすることができる。
【0077】
場合により、ＣＤ７０遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９酵素をＴ細胞に導入して、第１のエレクトロポレーション工程でＣＤ７０遺伝子を破壊し得、第１のエレクトロポレーション工程に続いて、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を標的化する１つ以上のガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９酵素並びにＣＡＲをコードする核酸を、第２のエレクトロポレーション工程でＴ細胞に導入して、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を破壊し、ＣＡＲをコードする核酸をＴ細胞に導入し得る。いくつかの実施例では、Ｔ細胞は、１つ以上のＴ細胞活性化剤、例えば、本明細書に記載されるものを使用して、第１のエレクトロポレーション工程後且つ第２のエレクトロポレーション工程前に活性化を受け得る。以下の実施例３で示すように、この設計により、第１のエレクトロポレーション工程から生じる破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞を高レベルに維持しながら、第２のエレクトロポレーション工程で少なくともβ２Ｍ遺伝子の効果的な遺伝子編集が可能になる。
【0078】
第１の遺伝子編集工程では、第１のＣａｓ９酵素及びＣＤ７０遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡを含む第１のＲＮＰ複合体を濃縮されたＴ細胞に導入して、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞を生成する。そのようなＴ細胞は、第２の遺伝子編集工程を実施する前に活性化されて、第１の遺伝子編集工程から生じる細胞喪失を弱め得る。
【0079】
第２の遺伝子編集工程では、第２のＣａｓ９酵素及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第２ｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体並びに第３のＣａｓ９酵素及びβ２Ｍ遺伝子を標的化する第３のｇＲＮＡを含む第３のＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入して、破壊されたＣＤ７０、ＴＲＡＣ、β２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞を生成する。Ｃａｓ９酵素並びにＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができ、これは、本明細書に開示されるように、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞に送達され得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、任意選択的に活性化され得る破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞に導入された第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、同じ量のＣａｓ９酵素を含有し得る。例えば、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体のいずれも、約０．１～０．３ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．１～０．２ｍｇ／ｍＬ）のＣａｓ９酵素（例えば、配列番号１のＣａｓ９酵素）を含み得る。いくつかの例では、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体の各々は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９酵素（これは、配列番号１のＣａｓ９酵素であり得る）を含み得る。
【0081】
他の実施形態では、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、異なる量のＣａｓ９酵素を含有し得る。いくつかの例では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第２のＲＮＰ複合体は、β２Ｍ遺伝子を標的化する第３のＲＮＰ複合体と比較してより多量のＣａｓ９酵素を含み得る。代わりに、β２Ｍ遺伝子を標的化する第２のＲＮＰ複合体は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第３のＲＮＰ複合体と比較してより多量のＣａｓ９酵素を含み得る。
【0082】
第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、同じ量のｇＲＮＡ（一方はＴＲＡＣを標的化し、他方はβ２Ｍを標的化する）を含み得る。代わりに、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、異なる量のｇＲＮＡを含み得る。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．０３５ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬの範囲であり得る。具体例では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．０８ｍｇ／ｍＬである。代わりに又は加えて、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．０７５ｍｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。具体例では、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．２ｍｇ／ｍＬである。
【0083】
具体例では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９（例えば、配列番号１のＣａｓ９）及び約０．０８ｍｇ／ｍＬのＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ（例えば、ＴＡ－１のｇＲＮＡ）を含み得る。代わりに又は加えて、β２Ｍ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９（例えば、配列番号１のＣａｓ９）及び約０．２ｍｇ／ｍＬのβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ（例えば、β２Ｍ－１のｇＲＮＡ）を含み得る。
【0084】
いくつかの実施形態では、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、連続的なエレクトロポレーシ、すなわち２つのエレクトロポレーションイベントにより活性化Ｔ細胞に導入され得る。代わりに、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、同時、すなわち１つのエレクトロポレーションイベントにより活性化Ｔ細胞に導入され得る。この場合、第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、エレクトロポレーションイベント前に組み合わせて混合物を形成し得る。
【0085】
本明細書に開示されるＲＮＰのいずれかは、ＲＮＰを好適な量の活性化Ｔ細胞と混合することによって活性化Ｔ細胞に導入することができ、こうして形成された混合物は、ＲＮＰの細胞への送達を可能にする好適な条件下でエレクトロポレーションに供される。場合により、活性化Ｔ細胞の好適な量は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約３００×１０６細胞／ｍＬの範囲であり得る。例えば、エレクトロポレーション工程用のＴ細胞の好適な量は、約２００×１０６細胞／ｍＬ～約３００×１０６細胞／ｍＬの範囲であり得る。いくつかの例では、活性化Ｔ細胞の濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の濃度は、約２００×１０６細胞／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬであり得る。
【0086】
いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の好適な量は、約１×１０８～約１×１０１０細胞、例えば、約５×１０８～約８×１０９細胞、約１×１０９～約５×１０９細胞又は約１×１０９～約３×１０９細胞の範囲であり得る。
【0087】
エレクトロポレーションにおいて使用するためのＴ細胞は、使用するエレクトロポレーション機器によっては、複数のセルカセットに入れ得る。好適なエレクトロポレーション機器は、当業者に公知であり、静的及び流動エレクトロポレーターを挙げることができ、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴ及びＭａｘＣｙｔｅ ＧＴｘが含まれる。場合により、複数のセルカセットを、エレクトロポレーションプロセスで使用し得る。更なる詳細は、以下の実施例６で提供される。
【0088】
具体例では、合計で約０．３ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９酵素（例えば、配列番号１のＣａｓ９酵素）、約０．０８ｍｇ／ｍＬのＴＡ－１のｇＲＮＡ及び約０．２ｍｇ／ｍＬのβ２Ｍ－１のｇＲＮＡを含む上記で開示される第２のＲＮＰ複合体及び第３のＲＮＰ複合体は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬ（例えば、約３００×１０６細胞／ｍＬ）の量の活性化Ｔ細胞と混合し得る。次に、混合物をエレクトロポレーションに供して、ＲＮＰをＴ細胞に送達する。
【0089】
いくつかの例では、第１のＣａｓ９酵素、第２のＣａｓ９酵素及び第３のＣａｓ９酵素は、同じであり、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）又は配列番号１のアミノ酸配列を含むＣａｓ９酵素である。
【0090】
エレクトロポレーション後、細胞は、回復に好適な期間、新鮮な培地で培養し得る。遺伝子編集効率は、日常的な慣行に従って決定し得る。このように生成される遺伝子編集されたＴ細胞は、ＣＡＲ発現用に構成された核酸の送達のためにウイルスベクター形質導入を受け得る。
【0091】
（ｉｉｉ）Ｔ細胞活性化
本明細書に開示されるＴ細胞のいずれか、例えば、第１のエレクトロポレーション工程から生じる破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞は、Ｔ細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及びＴ細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を可能にするために活性化工程に供され得る。本明細書に開示されるＴ細胞活性化条件は、高いＴ細胞活性化効率、高い％ＣＡＲ＋発現を提供し、ＣＤ７０遺伝子の編集から生じる細胞喪失を減弱させる。更に、本明細書に開示されるＴ細胞活性化条件は、従来の条件と比較して、より高い遺伝子編集効率及び編集後のより高い速度のＴ細胞増殖を提供した。以下の例を参照されたい。
本明細書に開示されるＴ細胞のいずれか、例えば、第１のエレクトロポレーション工程から生じる破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞は、Ｔ細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及びＴ細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を可能にするために活性化工程に供され得る。本明細書に開示されるＴ細胞活性化条件は、高いＴ細胞活性化効率、高い％ＣＡＲ＋発現を提供し、ＣＤ７０遺伝子の編集から生じる細胞喪失を減弱させる。更に、本明細書に開示されるＴ細胞活性化条件は、従来の条件と比較して、より高い遺伝子編集効率及び編集後のより高い速度のＴ細胞増殖を提供した。以下の例を参照されたい。
【0092】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性は、Ｔ細胞活性化剤、例えばＣＤ３／ＴＣＲ媒介性シグナル伝達経路及び／又は共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）媒介性シグナル伝達経路を刺激する薬剤を使用して達成することができる。例えば、Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト（例えば、アゴニスト抗ＣＤ３抗体）であり得、ＣＤ３／ＴＣＲ－媒介性細胞シグナル伝達経路を活性化する。代わりに又は加えて、Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗ＣＤ２８抗体）であり得、ＣＤ２８によって媒介される共刺激シグナル伝達経路を活性化する。本明細書に開示される方法で使用するためのＴ細胞活性化剤のいずれもナノマトリックス粒子などの支持部材に結合し得る。そのような状況では、Ｔ細胞活性化剤を同じ支持体に結合させ得る。代わりに、各Ｔ細胞活性化剤を異なる支持体に結合させ得る。具体例では、本明細書に開示される方法で使用するためのＴ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含み得、これらは、ナノマトリックス粒子に結合し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤は、ナノマトリックス粒子に結合したＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、同じナノマトリックス粒子に結合している。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、異なるナノマトリックス粒子に結合している。
【0093】
Ｔ細胞活性化を達成するために、本明細書で開示される破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞は、好適な細胞播種密度及び好適な細胞濃度で細胞培養容器に入れ、本明細書に開示されるＴ細胞活性化剤のいずれかの存在下で好適な期間インキュベートして、Ｔ細胞活性化を誘導し得る。
【0094】
場合により、細胞培養容器中のＴ細胞活性化剤対細胞培養培地の比は、約１：１０（ｖ／ｖ）～約１：１５（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの例では、細胞培養容器中のＴ細胞活性化剤対細胞培養培地の比は、約１：１０（ｖ／ｖ）、約１：１０．５（ｖ／ｖ）、約１：１１（ｖ／ｖ）、約１：１１．５（ｖ／ｖ）、約１：１２（ｖ／ｖ）、約１：１２．５（ｖ／ｖ）、約１：１３（ｖ／ｖ）、約１：１３．５（ｖ／ｖ）、約１：１４（ｖ／ｖ）、約１：１４．５（ｖ／ｖ）又は約１：１５（ｖ／ｖ）であり得る。具体例では、細胞培養容器中のＴ細胞活性化剤対培養培地の比は、約１：１２．５（ｖ／ｖ）である。
【0095】
代わりに又は加えて、好適な細胞播種密度は、約１．０×１０６～２．５×１０６（例えば、２×１０６／ｃｍ２）であり得、好適な細胞濃度は、約１．０×１０６～２．５×１０６（例えば、２×１０６／ｍＬ）であり得る。破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞は、Ｔ細胞活性化剤と約６０～８０時間、例えば約６６時間又は約７２時間インキュベートされ得る。
【0096】
代わりに又は加えて、好適な細胞播種密度は、約１．５×１０６～２．５×１０６（例えば、２×１０６／ｃｍ２）であり得、好適な細胞濃度は、約１．５×１０６～２．５×１０６（例えば、２×１０６／ｍＬ）であり得る。破壊されたＣＤ７０遺伝子を有するＴ細胞は、Ｔ細胞活性化剤と約６６～８０時間、例えば約７２時間インキュベートされ得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、静置培養容器であり得、これは、本明細書に開示されるように、遺伝子操作されたＴ細胞の比較的大規模な生産を可能にするであろう。従来の細胞培養フラスコと比較して、静置細胞培養容器は、混合又は振盪することなくＴ細胞に酸素と栄養素を供給する培地の下に沈められた高ガス透過性膜上にＴ細胞が存在することを可能にする。静置培養容器は、培地を交換することなくＴ細胞の製造を可能にする。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかにおけるＴ細胞活性化プロセスは、培地交換を伴わなくてもよい。
【0098】
必要に応じて、活性化剤を細胞培養容器から除去するか、又は下流の遺伝子編集イベント前に希釈し、活性化剤が遺伝子編集中に与える可能性のある任意の潜在的な影響を最小限に抑え得る。いくつかの実施形態では、活性化剤は、通常の方法、例えば遠心分離などを使用して細胞培養容器から除去することができる。代わりに、活性化剤は、遺伝子編集前に細胞培養容器で希釈、例えば、細胞培養容器に培地を添加することによって希釈し得る。
【0099】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴ細胞活性化プロセスのいずれかから誘導される破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞は、遺伝子編集前にＴ細胞を回復させるために一晩（例えば、約１６時間）培養し得る。場合により、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞の培養は、Ｔ細胞活性化剤がまだ含まれている可能性がある。他の場合、破壊されたＣＤ７０遺伝子を有する活性化Ｔ細胞の培養は、Ｔ細胞活性化剤がほとんど又は全く存在しない場合がある。
【0100】
（ｉｖ）Ｔ細胞の形質導入
ノックアウトされたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及び／又はβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子編集されたＴ細胞は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を生成するためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによる形質導入を受け得る。
ノックアウトされたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及び／又はβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子編集されたＴ細胞は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を生成するためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによる形質導入を受け得る。
【0101】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように改変されている人工の免疫細胞受容体を意味する。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ－Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞に発現する場合、有利には、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように改変されている人工の免疫細胞受容体を意味する。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ－Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞に発現する場合、有利には、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
【0102】
様々な世代のＣＡＲが存在し、その各々は、異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介して抗体に由来するｓｃＦｖをＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するための追加の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳを組み込んでいる。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲのＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組み合わせ）を含む。Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。様々な世代のＣＡＲコンストラクトは、いずれも本開示の範囲内である。
【0103】
一般に、ＣＡＲは、標的抗原（例えば、抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は別の抗体断片）を認識する細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであり、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含み、そのほとんどの場合に共刺激ドメインである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲコンストラクトは、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間にヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得、且つ表面に発現するためにＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号５２）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号５３）が挙げられる。他のシグナルペプチドを使用し得る。
【0104】
（ａ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、ＶＨ断片及びＶＬ断片は、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖ断片は、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖ断片が誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、完全ヒト型である。
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、ＶＨ断片及びＶＬ断片は、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖ断片は、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖ断片が誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、完全ヒト型である。
【0105】
抗原結合細胞外ドメインは、目的の標的抗原、例えば、腫瘍抗原などの病態抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、通常、全く発現されない場合があるか、又は低レベルでのみ発現される場合がある非腫瘍細胞より腫瘍細胞においてより高レベルで発現されるタンパク質などの免疫原性分子を参照する「腫瘍関連抗原」である。いくつかの実施形態では、腫瘍を内部に持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と呼ばれる。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、大部分のタイプの腫瘍によって広範に発現される場合、普遍的な腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異性抗原、過剰発現された細胞抗原又はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に固有のタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍特異抗原」又は「ＴＳＡ」である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞、例えば、特定のタイプの腫瘍細胞でのみ発現する。
【0106】
いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ７０に結合可能なｓｃＦｖ細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ１９に結合可能なｓｃＦｖ細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲコンストラクトは、ＢＣＭＡに結合可能なｓｃＦｖ細胞外ドメインを含む。抗ＣＤ７０ ＣＡＲの例は、以下の実施例で提供される。
【0107】
（ｂ）膜貫通ドメイン
本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜をまたがる疎水性のαヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含み得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞の細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を意味する。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらす。
本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜をまたがる疎水性のαヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含み得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞の細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を意味する。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらす。
【0108】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書に記載されているような他の膜貫通ドメインを使用し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧ ＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲ（配列番号５４）又はＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号５５）の配列を含有するＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。他の膜貫通ドメインが使用され得る。
【0109】
（ｃ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
【0110】
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの他の領域に１つ以上のヒンジドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであり得る。他のヒンジドメインを使用し得る。
【0111】
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲコンストラクトのいずれかは、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ及び任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。
ＣＡＲコンストラクトのいずれかは、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ及び任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。
【0112】
ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞が同種抗原と会合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。多くの場合、ＣＤ３ζは、一次Ｔ細胞の活性化シグナルを提供するが、十分に適格な活性化シグナルではなく、共刺激シグナル伝達を必要とする。
【0113】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達と共に、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの共刺激ドメインを使用して、十分な増殖シグナル／生存シグナルを伝達し得る。いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子を含む。他の例では、本明細書で開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。更に他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【0114】
本明細書に記載される方法は、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞を生成するために使用することができる２つ以上の好適なＣＡＲを包含することが理解されるであろう。例は、例えば、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された、２０１８年５月１１日出願のＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号及び２０１９年５月１０日出願のＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号に見出すことができ、各先行出願の関連する開示は、本明細書で言及される目的及び主題に対して本明細書に参照として組み込まれる。
【0115】
例えば、ＣＡＲはＣＤ７０に結合する（「ＣＤ７０ ＣＡＲ」又は「抗ＣＤ７０ ＣＡＲ」としても知られている）。ＣＤ７０に結合する例示的なＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号４６に提供されている（以下の実施例５の表１２を参照されたい）。
【0116】
ＣＡＲコンストラクトをＴ細胞に送達するためのＡＡＶベクター
ＣＡＲコンストラクトをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込まれ、これによってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達することができる小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写されるとＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するのか、従っていずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するのかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
ＣＡＲコンストラクトをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込まれ、これによってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達することができる小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写されるとＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するのか、従っていずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するのかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
【0117】
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物に投与する際、免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型の選択を考慮に入れる場合、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組み込みを伴わずに宿主細胞において存続し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この特質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
【0118】
ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞内の目的のゲノム部位に挿入するように設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー座位内に存在し得る。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ぶことが可能なドナー鋳型を介して）遺伝子操作されたＴ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊してＣＡＲポリペプチドを発現させるために、ＴＲＡＣ遺伝子内の位置に挿入することができるように設計することができる。ＴＲＡＣの破壊により、内在性ＴＣＲの機能の喪失がもたらされる。例えば、本明細書に記載されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。この目的のために、ＴＲＡＣ遺伝子及び標的部位に特異的なｇＲＮＡのいずれか、例えば本明細書で開示されるものを使用することができる。
【0120】
いくつかの実施例では、相同組換え修復、即ちＨＤＲ（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用した）により、ＴＲＡＣ遺伝子内のゲノム欠失と、ＣＡＲをコードするセグメントによる置換とを生じさせることができる。いくつかの例では、ｇＲＮＡ標的配列又はその一部が削除される（例えば、配列番号１７）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、且つＣＡＲをコードするセグメントをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。
【0121】
本明細書で開示されるようなドナー鋳型は、ＣＡＲのコード配列を含有し得る。いくつかの実施例では、ＣＡＲをコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、目的の遺伝子位置、例えばＴＲＡＣ遺伝子で効率的なＨＤＲを行うことができるように、２つの相同性領域に隣接し得る。この場合、標的座位に特異的なｇＲＮＡによって誘導されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により、ＤＮＡの両方の鎖を標的座位で切断することができる。次いで、ＨＤＲが発生して二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これを正しく発生させるために、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的に誤りのない機構とすることを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含むことができるか、又はゲノム配列と異なる配列を含むことができ、これによって配列編集が可能になる。
【0122】
代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡの標的化された位置と相同性のある領域がなくてもよく、標的部位で切断された後にＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
【0123】
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得、直鎖状又は環状の形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方又は両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法として、末端アミノ基の付加並びに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0124】
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として細胞に導入することができるか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。
【0125】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内在性プロモーターによって駆動することができるように、内在性プロモーターの近傍の部位（例えば、下流又は上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外来性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターを使用し得る。
【0126】
更に、外来性配列は、転写又は翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含み得る。
【0127】
Ｔ細胞の形質導入
本明細書に開示されるＣＡＲコンストラクト（例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ）をコードするＡＡＶベクターなどの任意の好適な量のウイルスベクターは、好適な量のＴ細胞、例えば、本明細書に開示される遺伝子編集されたＴ細胞と、ウイルスベクターのＴ細胞への侵入を可能にするために好適な期間インキュベートし得る。例えば、形質導入プロセスは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合を増加させる一連の最適化された感染多重度（ＭＯＩ）の使用を伴い得る。場合により、形質導入プロセスにおけるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００～約１５０，０００、例えば約１０，０００～約８０，０００などの範囲であり得る。いくつかの例では、形質導入プロセスで使用されるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００～約１５０，０００、約５，０００～約１００，０００、約１０，０００～約１００，０００、約１０，０００～約９０，０００、約１０，０００～約８０，０００、約１０，０００～約７０，０００、約１０，０００～約６０，０００、約１０，０００～約５０，０００、約１０，０００～約４０，０００、約１０，０００～約３０，０００、約１０，０００～約２０，０００、約２０，０００～約８０，０００、約３０，０００～約８０，０００、約４０，０００～約８０，０００、約５０，０００～約８０，０００、約６０，０００～約８０，０００又は約７０，０００～約８０，０００であり得る。いくつかの例では、形質導入プロセスで使用されるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００、約２，５００、約５，０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約３１，０００、約３２，０００、約３３，０００、約３４０００、約３５，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約１１０，０００、約１２０，０００、約１３０，０００、約１４０，０００又は約１５０，０００であり得る。
本明細書に開示されるＣＡＲコンストラクト（例えば、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ）をコードするＡＡＶベクターなどの任意の好適な量のウイルスベクターは、好適な量のＴ細胞、例えば、本明細書に開示される遺伝子編集されたＴ細胞と、ウイルスベクターのＴ細胞への侵入を可能にするために好適な期間インキュベートし得る。例えば、形質導入プロセスは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合を増加させる一連の最適化された感染多重度（ＭＯＩ）の使用を伴い得る。場合により、形質導入プロセスにおけるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００～約１５０，０００、例えば約１０，０００～約８０，０００などの範囲であり得る。いくつかの例では、形質導入プロセスで使用されるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００～約１５０，０００、約５，０００～約１００，０００、約１０，０００～約１００，０００、約１０，０００～約９０，０００、約１０，０００～約８０，０００、約１０，０００～約７０，０００、約１０，０００～約６０，０００、約１０，０００～約５０，０００、約１０，０００～約４０，０００、約１０，０００～約３０，０００、約１０，０００～約２０，０００、約２０，０００～約８０，０００、約３０，０００～約８０，０００、約４０，０００～約８０，０００、約５０，０００～約８０，０００、約６０，０００～約８０，０００又は約７０，０００～約８０，０００であり得る。いくつかの例では、形質導入プロセスで使用されるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００、約２，５００、約５，０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約３１，０００、約３２，０００、約３３，０００、約３４０００、約３５，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約１１０，０００、約１２０，０００、約１３０，０００、約１４０，０００又は約１５０，０００であり得る。
【0128】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは抗ＣＤ７０ ＣＡＲ（例えば、以下の実施例５の表１２で開示される）をコードし、形質導入プロセスで使用するためのこのようなＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードし、形質導入プロセスで使用するためのこのようなＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードし、形質導入プロセスで使用するためのこのようなＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。
【0129】
形質導入後、Ｔ細胞は、回復のために好適な期間、好適な細胞培養培地で培養し得る。ノックアウトされたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有し、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞は、以下に開示されるとおり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ得る。
【0130】
（ｖ）Ｔ細胞の増殖
本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、好適な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を臨床的に適切な規模で生成し得る。この増殖工程で使用される細胞培養条件は、少なくとも部分的には、より短いインキュベーション期間でより高い最終細胞密度を達成し（それにより製造コストを削減し）、細胞治療で使用するためのより強力なＴ細胞を達成することを意図している。効力は、様々なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞殺傷、サイトカイン産生、活性化、遊走及びそれらの組み合わせによって示され得る。
本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、好適な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を臨床的に適切な規模で生成し得る。この増殖工程で使用される細胞培養条件は、少なくとも部分的には、より短いインキュベーション期間でより高い最終細胞密度を達成し（それにより製造コストを削減し）、細胞治療で使用するためのより強力なＴ細胞を達成することを意図している。効力は、様々なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞殺傷、サイトカイン産生、活性化、遊走及びそれらの組み合わせによって示され得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖工程は、細胞容器中約１５０，０００細胞／ｃｍ２～約６００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団（例えば、本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞）を、細胞培養容器に播種することによって実施され得る。例えば、Ｔ細胞は、細胞容器中約３００，０００細胞／ｃｍ２～約５００，０００細胞／ｃｍ２で播種され得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞増殖は、少なくとも約６０，０００細胞／ｃｍ２、少なくとも約６２，５００細胞／ｃｍ２又は少なくとも約８３，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団を細胞培養容器に播種することによって実施される。いくつかの態様では、Ｔ細胞増殖は、少なくとも約１５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約２５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約３００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約４００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約５００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約６００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団を細胞培養容器に播種することによって実施される。いくつかの態様では、播種密度は、約２５０，０００細胞／ｃｍ２である。他の態様では、播種密度は、約５００，０００細胞／ｃｍ２である。他の態様では、播種密度は、約６００，０００細胞／ｃｍ２である。
【0132】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖工程は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団（例えば、本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞）を、細胞培養容器に播種し、約６日～約１２日にわたって細胞を培養することによって実施され得る。いくつかの例では、Ｔ細胞増殖は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約４×１０５細胞／ｃｍ２、２×１０５細胞／ｃｍ２～約３×１０５細胞／ｃｍ２、３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２又は４×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団を細胞培養容器に播種し、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１２日、約８日～約９日、約９日～約１２日、約１０日～約１２日又は約１１日～約１２日にわたって細胞を培養することによって実施される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖は、約３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、細胞培養容器でＴ細胞集団を播種し、約７日～約９日にわたって細胞を培養することによって実施される。
【0133】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖工程は、細胞培養物を再プレーティングすること（すなわち細胞培養物を新しい培養容器に分割すること）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、編集後３、４、５、６又は７日目に１：４の比率（１つの容器を４つの新しい容器に分割）で再プレーティングして、更に増殖させることができる。
【0134】
Ｔ細胞増殖は静置培養容器で行うことができ、これは、培地を交換することなくＴ細胞を増殖させることができる。例えば、Ｔ細胞は、静置培養容器内で、培地を交換せずに、約７日～約１２日又は約７日～約９日にわたって増殖させることができる。
【0135】
（ｖｉ）ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇
いくつかの実施形態では、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、本明細書に開示される増殖したＴ細胞集団から枯渇して、細胞治療で使用するための同種異系Ｔ細胞の集団を生成し得る。本明細書で使用する場合、「ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇」は、そのようなものを含む細胞の集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を枯渇させることを指す。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇に続いて、得られたＴ細胞集団は、実質的に低レベルのＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を有し得る（例えば、全細胞集団の３％未満又は２％未満、１％未満又は全細胞集団の０．５％未満）。いくつかの例では、得られたＴ細胞集団はＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を含まなくてもよく、すなわち、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の存在は、従来の方法（例えば、ＴＣＲαβ＋に結合する抗体を使用するイムノアッセイ又はフローサイトメトリー）では日付が与えられない。
いくつかの実施形態では、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、本明細書に開示される増殖したＴ細胞集団から枯渇して、細胞治療で使用するための同種異系Ｔ細胞の集団を生成し得る。本明細書で使用する場合、「ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇」は、そのようなものを含む細胞の集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を枯渇させることを指す。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇に続いて、得られたＴ細胞集団は、実質的に低レベルのＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を有し得る（例えば、全細胞集団の３％未満又は２％未満、１％未満又は全細胞集団の０．５％未満）。いくつかの例では、得られたＴ細胞集団はＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を含まなくてもよく、すなわち、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の存在は、従来の方法（例えば、ＴＣＲαβ＋に結合する抗体を使用するイムノアッセイ又はフローサイトメトリー）では日付が与えられない。
【0136】
ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇は、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を認識してＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を捕捉する薬剤を使用して実施し、それにより、例えば、磁気細胞分離を実施することにより、ＴＣＲαβ＋を欠くものからそれらを分離し得る。このような方法は、上記で開示された増殖したＴ細胞を、抗ＴＣＲαβ抗体が固定化されているビーズに接触させることと、未結合細胞を収集することとによって実施され得る。このように収集された非結合細胞（ＴＣＲαβ＋を欠くもの）は、事前に細胞を回復させるために培養することができ、例えば、未結合細胞を一晩培養して細胞を回復させ得る。
【0137】
（ｖｉｉ）遺伝子操作されたＴ細胞の採取
次いで、本明細書で開示される方法のいずれかにより生成される遺伝子操作されたＴ細胞は、当技術分野で公知の従来の方法を使用して治療的使用のために採取することができる。例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の採取は、ＴＣＲαβ＋が枯渇した細胞の収集を含み得る。採取した遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、原薬として使用し得る。本明細書で使用する場合、「原薬」は、患者に投与され得る遺伝子操作されたＴ細胞の集団を指す。原薬は、治療的使用のために製剤化、例えば、保存培地（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５）中で製剤化され、将来の使用のために凍結保存され得る。
次いで、本明細書で開示される方法のいずれかにより生成される遺伝子操作されたＴ細胞は、当技術分野で公知の従来の方法を使用して治療的使用のために採取することができる。例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の採取は、ＴＣＲαβ＋が枯渇した細胞の収集を含み得る。採取した遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、原薬として使用し得る。本明細書で使用する場合、「原薬」は、患者に投与され得る遺伝子操作されたＴ細胞の集団を指す。原薬は、治療的使用のために製剤化、例えば、保存培地（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５）中で製剤化され、将来の使用のために凍結保存され得る。
【0138】
原薬は、１つ以上の汚染物質、例えばマイコプラズマ、ヒトウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ）及び細菌内毒素について試験される場合がある。代わりに又は加えて、原薬は、滅菌について試験される場合がある。汚染のない原薬は、個々の患者の用量に分取され得る。代わりに又は加えて、汚染のない原薬は、治療的使用のために保存され得る。
【0139】
従って、本開示の態様は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団（原薬）を提供する。遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、破壊されたＣＤ７０遺伝子、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及びＣＡＲをコードする核酸、例えば、本明細書に記載されるものを有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、病的な細胞上で発現される抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する。
【0140】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、ＣＡＲを発現する。他の態様では、ＣＡＲを発現するこれらの細胞は、検出可能なレベルの表面ＣＤ７０及び／又は検出可能なレベルの表面ＴＣＲ及び／又は検出可能なレベルの表面β２Ｍを更に発現しない。
【0141】
他の実施形態では、本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％がＣＡＲを発現する場合、細胞の集団は、約５％以下、約２％以下又は約１％以下の表面ＣＤ７０を発現するＴ細胞を含む。
【0142】
他の実施形態では、本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％がＣＡＲを発現する場合、細胞の集団は、約１．０％以下、約０．５％以下、約０．４％以下又は約０．１５％以下の表面ＴＣＲを発現するＴ細胞（例えば、ＴＣＲα／β＋細胞）を含む。
【0143】
他の実施形態では、本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％がＣＡＲを発現する場合、細胞の集団は、約５０％以下、約４０％以下又は約３０％以下の表面β２Ｍを発現するＴ細胞を含む。
【0144】
Ｃａｓ９酵素、ＣＤ７０遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ及びＣＡＲをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクター（例えば、ＣＤ７０ ＣＡＲ又はＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢＣＭＡ ＣＡＲ）を含む、本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団も本開示の範囲内である。
【0145】
ＩＩ．治療用途
本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、治療目的、例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の集団によって発現されるＣＡＲコンストラクトによって標的化される癌の治療のために対象に投与され得る。
本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、治療目的、例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の集団によって発現されるＣＡＲコンストラクトによって標的化される癌の治療のために対象に投与され得る。
【0146】
対象は、診断、処置又は治療が望まれている任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、この対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は、ヒトである。
【0147】
本明細書に記載された方法により生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団を使用して治療され得る癌の非限定的な例としては、多発性骨髄腫、白血病（例えば、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及び／又は慢性リンパ性白血病（Ｃ－ＣＬＬ））、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫）及び／又は明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、腎臓癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫及び／又は黒色腫が挙げられるがこれらに限定されない。
【0148】
投与は、望ましい効果（複数可）を生じさせることができるように、腫瘍部位などの所望の部位に遺伝子操作されたＴ細胞集団の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路により、遺伝子操作されたＴ細胞集団を、対象に配置する（例えば、移植する）ことを含み得る。対象の所望の位置に送達をもたらす任意の適切な経路によって遺伝子操作されたＴ細胞集団を投与することができるが、この場合、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部は、生存したままである。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）の短い期間から数日、数年又は更に対象の寿命（すなわち長期の生着）までであり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団を、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与することができる。
【0149】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団を全身に投与し、これは、細胞の集団を標的部位、組織又は臓器に直接投与するのではなく、代わりに対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様のプロセスを受けるように投与することを意味する。好適な投与の様式としては、注射、注入、点滴又は経口摂取が挙げられる。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内注射並びに注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
【0150】
有効量とは、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要な遺伝子操作されたＴ細胞集団の量を意味し、所望の効果をもたらす、例えば医学的状態を有する対象を治療するのに十分な量の遺伝子操作されたＴ細胞集団を意味する。有効量としては、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量も挙げられる。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、通常の実験により当業者によって決定することができることが理解される。
【0151】
有効量の遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、少なくとも１０２細胞、少なくとも５×１０２細胞、少なくとも１０３細胞、少なくとも５×１０３細胞、少なくとも１０４細胞、少なくとも５×１０４細胞、少なくとも１０５細胞、少なくとも２×１０５細胞、少なくとも３×１０５細胞、少なくとも４×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも６×１０５細胞、少なくとも７×１０５細胞、少なくとも８×１０５細胞、少なくとも９×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも６×１０６細胞、少なくとも７×１０６細胞、少なくとも８×１０６細胞、少なくとも９×１０６細胞又はその複合を含み得る。
【0152】
本明細書に記載されるように製造される遺伝子操作されたＴ細胞集団を用いた治療の有効性は、当業者によって決定することができる。治療は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）か、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善されるか又は緩和される場合、「有効」と見なされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価された場合、対象が悪化しないことによっても測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、且つ／又は本明細書で説明されている。治療は、対象における疾患の任意の治療を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば症状の進行を止めるか若しくは遅くすること、又は（２）疾患を軽減すること、例えば症状の退行をもたらすこと、及び（３）症状の発症の可能性を予防するか若しくは減少させることを含む。
【0153】
本明細書に記載されるように製造される遺伝子操作されたＴ細胞集団は、組み合わせ療法でも使用され得る。例えば、本明細書に記載されるように製造される遺伝子操作されたＴ細胞集団は、同じ適応症を治療するか若しくは遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効性を高め、且つ／又は遺伝子操作されたＴ細胞集団の副作用を低減させるために他の治療薬と併用され得る。
【0154】
一般的技術
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当技術分野の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で詳細に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当技術分野の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で詳細に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
【0155】
当業者であれば、更に詳細に述べることなく上記説明に基づいて本発明を最大限利用することができると考えられる。従って、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、決して以下の本開示を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、参照により本明細書で参照される目的又は主題に関して組み込まれる。
【実施例】
【0156】
記載されている本発明をより詳細に理解できるように、以下の実施例が説明される。本出願で記載される実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物を説明するために提供されており、それらの範囲を限定するものとしていかなる方法でも解釈されるべきではない。
【0157】
実施例１：Ｔ細胞濃縮のための最適化条件の特定
本実施例では、自動細胞処理システムを使用してロイコパックからＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮するための、Ｔ細胞濃縮のための最適化条件の特定について報告する。
本実施例では、自動細胞処理システムを使用してロイコパックからＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮するための、Ｔ細胞濃縮のための最適化条件の特定について報告する。
【0158】
方法
ロイコパック及びバッファー調製
ヒトロイコパックはＨｅｍａＣａｒｅ又はＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓから収集され、Ｔ細胞濃縮のために処理された。ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡを添加）に０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、Ｔ細胞選択中の処理、プライム化、洗浄及び溶出に使用した。
ロイコパック及びバッファー調製
ヒトロイコパックはＨｅｍａＣａｒｅ又はＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓから収集され、Ｔ細胞濃縮のために処理された。ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡを添加）に０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、Ｔ細胞選択中の処理、プライム化、洗浄及び溶出に使用した。
【0159】
ロイコパックドナーは、以下についてスクリーニングされた：
・Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ＥＩＡ）
・Ｃ型肝炎ウイルス抗体（抗ＨＣＶ ＥＩＡ）
・ヒト免疫不全ウイルス抗体（ＨＩＶ １／２ ｐｌｕｓ Ｏ）
・ヒトＴ－リンパ球向性ウイルス抗体（ＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩ）
・ＨＩＶ－１／ＨＣＶ／ＨＢＶ核酸試験
・ＷＮＶ核酸試験
・クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ Ｃｒｕｚｉ）抗体（選択的シャーガス病検査、ドナーごとに１回の生涯検査）
・ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ
・ＣＭＶ
・ＩＤＳ。
・Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ＥＩＡ）
・Ｃ型肝炎ウイルス抗体（抗ＨＣＶ ＥＩＡ）
・ヒト免疫不全ウイルス抗体（ＨＩＶ １／２ ｐｌｕｓ Ｏ）
・ヒトＴ－リンパ球向性ウイルス抗体（ＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩ）
・ＨＩＶ－１／ＨＣＶ／ＨＢＶ核酸試験
・ＷＮＶ核酸試験
・クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ Ｃｒｕｚｉ）抗体（選択的シャーガス病検査、ドナーごとに１回の生涯検査）
・ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ
・ＣＭＶ
・ＩＤＳ。
【0160】
上記のテストのいずれかで陽性の結果を示したドナーは除外された。本明細書に開示される実施例で使用されるドナーの個体群統計情報を表１に示す。
【0161】
【表1】
【0162】
Ｓｙｓｍｅｘによるロイコパック血液学分析
入ってくるロイコパックからのサンプルは、製造元の指示に従って、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＰ３００（Ｓｙｓｍｅｘ、シリアル番号Ｂ０６２８）を使用して血液学的分析のために処理された。白血球（ＷＢＣ）カウントを使用して、自動化細胞処理システムにロードされた総細胞量を計算した。
入ってくるロイコパックからのサンプルは、製造元の指示に従って、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＰ３００（Ｓｙｓｍｅｘ、シリアル番号Ｂ０６２８）を使用して血液学的分析のために処理された。白血球（ＷＢＣ）カウントを使用して、自動化細胞処理システムにロードされた総細胞量を計算した。
【0163】
Ｔ細胞の濃縮
処理バッファー、ロイコパック、ＣＤ４マイクロビーズ及びＣＤ８マイクロビーズを、実行を開始する前に自動化細胞処理システムにロードした。細胞を洗浄し、分離のためにチャンバ内でマグネットカラムに向けて標識した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉し、処理バッファー中のターゲットバッグに更に溶出した。
処理バッファー、ロイコパック、ＣＤ４マイクロビーズ及びＣＤ８マイクロビーズを、実行を開始する前に自動化細胞処理システムにロードした。細胞を洗浄し、分離のためにチャンバ内でマグネットカラムに向けて標識した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉し、処理バッファー中のターゲットバッグに更に溶出した。
【0164】
細胞数及び生存率
細胞数及び生存率の評価は、デフォルトのプロファイルを使用してＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ：ＡＭＱＡＸ１０００）で実施した。細胞（２０μＬ）を、気泡を導入せずに数回上下にピペッティングすることにより、トリパンブルー（２０μＬ）と混合した。細胞／トリパンブルー混合物（１０μＬ）をＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）ＩＩ細胞計数チャンバースライドにロードした。
細胞数及び生存率の評価は、デフォルトのプロファイルを使用してＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ：ＡＭＱＡＸ１０００）で実施した。細胞（２０μＬ）を、気泡を導入せずに数回上下にピペッティングすることにより、トリパンブルー（２０μＬ）と混合した。細胞／トリパンブルー混合物（１０μＬ）をＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）ＩＩ細胞計数チャンバースライドにロードした。
【0165】
フローサイトメトリー
約１×１０６の全核細胞を、９５μＬの染色バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＰＢＳ）中の５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）で室温（ＲＴ）において１０分間ブロックした。細胞を、Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ結合抗ヒトＣＤ４５抗体（１：５０）、ＢＶ５１０結合抗ヒトＣＤ３抗体（１：５０）、ＡＰＣ－Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ４抗体（１：５０）、ＰＥ－Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８抗体（１：５０）、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１９抗体（１：５０）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ５６抗体（１：５０）及びＰＥ結合抗ヒトＣＤ３３抗体（１：５０）で、４℃において３０分間更にインキュベートした。次いで、５μＬの７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）生存率染色液を含む１ｍＬの塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解バッファーを各サンプルに適用した。ＡＣＫ溶解バッファーをＲＴで１０分間インキュベートした後、ＮｏｖｏＣｙｔｅ－３０００フローサイトメーターで細胞を取得した。
約１×１０６の全核細胞を、９５μＬの染色バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＰＢＳ）中の５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）で室温（ＲＴ）において１０分間ブロックした。細胞を、Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ結合抗ヒトＣＤ４５抗体（１：５０）、ＢＶ５１０結合抗ヒトＣＤ３抗体（１：５０）、ＡＰＣ－Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ４抗体（１：５０）、ＰＥ－Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８抗体（１：５０）、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１９抗体（１：５０）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ５６抗体（１：５０）及びＰＥ結合抗ヒトＣＤ３３抗体（１：５０）で、４℃において３０分間更にインキュベートした。次いで、５μＬの７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）生存率染色液を含む１ｍＬの塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解バッファーを各サンプルに適用した。ＡＣＫ溶解バッファーをＲＴで１０分間インキュベートした後、ＮｏｖｏＣｙｔｅ－３０００フローサイトメーターで細胞を取得した。
【0166】
結果
ロイコパックサンプル中の白血球（ＷＢＣ）
試験したロイコパックのＷＢＣは、８．１４×１０９～２１．３６×１０９細胞の範囲であり、５．７７×１０９～１７．３２×１０９の範囲のリンパ球数を有した。
ロイコパックサンプル中の白血球（ＷＢＣ）
試験したロイコパックのＷＢＣは、８．１４×１０９～２１．３６×１０９細胞の範囲であり、５．７７×１０９～１７．３２×１０９の範囲のリンパ球数を有した。
【0167】
ＣＤ４及びＣＤ８の濃縮－純度、生存率、細胞回復率及び収率
試験された９つのバッチのうち、４つは、プログラムＡで評価され、５つはプログラムＢで評価された。全てのバッチで、純度が＞９０％、生存率が＞９０％のＴ細胞が得られた（表２）。プログラムＡからの細胞回復率は３１％であったが、プログラムＢからの細胞回復率は５５．６９％であった。
試験された９つのバッチのうち、４つは、プログラムＡで評価され、５つはプログラムＢで評価された。全てのバッチで、純度が＞９０％、生存率が＞９０％のＴ細胞が得られた（表２）。プログラムＡからの細胞回復率は３１％であったが、プログラムＢからの細胞回復率は５５．６９％であった。
【0168】
【表2】
【0169】
まとめると、これらの結果は、健康なドナー（ＨＤ）ロイコパックからのＴ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対して高純度（＞９０％）及び高生存率（＞９０％）で濃縮されたことを示している。
【0170】
実施例２：Ｔ細胞活性化のための最適化条件の特定
本実施例では、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを使用して、Ｔ細胞活性化のための最適化条件の特定について報告する。遺伝子編集及び／又はＣＡＲ発現レベルを異なる条件で活性化されたＴ細胞で調べて、優れた遺伝子編集及び／又はＣＡＲ発現レベルを達成する最適化されたＴ細胞活性化条件を特定した。要約すると、濃縮されたＴ細胞を解凍し、その後、活性化前に１回のエレクトロポレーション又は２回のエレクトロポレーションで４８時間又は７２時間活性化し、形質導入の７日後にフローサイトメトリーによって％ＣＡＲ＋発現を測定する小規模プロセスで、遺伝子操作されたＴ細胞を製造した。
本実施例では、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを使用して、Ｔ細胞活性化のための最適化条件の特定について報告する。遺伝子編集及び／又はＣＡＲ発現レベルを異なる条件で活性化されたＴ細胞で調べて、優れた遺伝子編集及び／又はＣＡＲ発現レベルを達成する最適化されたＴ細胞活性化条件を特定した。要約すると、濃縮されたＴ細胞を解凍し、その後、活性化前に１回のエレクトロポレーション又は２回のエレクトロポレーションで４８時間又は７２時間活性化し、形質導入の７日後にフローサイトメトリーによって％ＣＡＲ＋発現を測定する小規模プロセスで、遺伝子操作されたＴ細胞を製造した。
【0171】
小規模製造プロセスを開始するために、クライオバイアルを液体窒素保存から回収し、少量の凍結物質が残るまで水浴で解凍した。次いで、細胞を１０倍量の完全増殖培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５、５％のヒトＡＢ血清、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ７及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２）に滴下し、３００ｇで室温において１０分間遠心分離してペレット化した。細胞を１×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストを介した活性化に結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスに供し、下流の修飾を改善又はエレクトロポレーションしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集のための構成要素を導入した。
【0172】
単離されたＴ細胞は、コロイド状ポリマーナノマトリックスに共有結合した組換えＣＤ３及びＣＤ２８で活性化された。組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを、未処理のフラスコ内の１：１２．５の比率又は１×１０６細胞当たり４０μＬで細胞に適用した。細胞は、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスで、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで４８時間又は７２時間維持した。インキュベーション後、細胞を３００ｇで１０分間室温において遠心分離する。次いで、細胞ペレットを完全増殖培地に再懸濁し、遺伝子改変前に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で一晩培養した。
【0173】
エレクトロポレーションのために、トリパンブルーを添加し、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）サイトメーターでカウントすることにより、総細胞数及び細胞生存率を定量した。次いで、細胞を３００ｇで１０分間室温において遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍＬのエレクトロポレーションバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を遠心分離する間に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を調製した。ＲＮＰ複合体は別々に形成され、次いで複数の編集を実施する場合には一緒に合わせられる。示された濃度のｇＲＮＡ及びＣａｓ９を使用して、４つの別々のＲＮＰ複合体を形成した（表３）。各ＲＮＰ複合体を、配列番号１を含むＣａｓ９で形成した。Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ配列については、実施例５も参照されたい。
【0174】
【表3】
【0175】
フローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを使用して、細胞をエレクトロポレーションした。各個々のキュベットをエレクトロポレーションしたら、細胞及びＲＮＰ溶液を未処理の１２ウェルプレートに分注し、各ウェルに５００μＬのＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（ヒトＡＢ血清、ＩＬ２又はＩＬ７を含まない）を入れた。細胞をインキュベーター内で２０分間休止させた。トリパンブルーを添加し、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）サイトメーターでカウントすることにより、総細胞数及び細胞生存率を定量した。
【0176】
休止後の総細胞数に基づいて、細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（ヒトＡＢ血清、ＩＬ２又はＩＬ７を含まない）で更に希釈し、所望の濃度に到達させる必要がある場合がある。形質導入を行うために必要なＡＡＶの量を計算するには、総細胞数が必要である。
必要なＡＡＶのμＬ＝（総細胞数）（所望のＭＯＩ（すなわち２０Ｋ））／（ウイルスｖｇｃ／ｍＬ（すなわち１．５×１０１３））
必要なＡＡＶのμＬ＝（総細胞数）（所望のＭＯＩ（すなわち２０Ｋ））／（ウイルスｖｇｃ／ｍＬ（すなわち１．５×１０１３））
【0177】
ＡＡＶ及び細胞懸濁液を混合し、未処理のフラスコ内で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ＡＡＶを含む全量を、１００ｍＬの完全培地を含む静置培養容器に添加した。静置培養容器を３日間インキュベートして細胞増殖させた。
【0178】
エレクトロポレーション後、静置培養容器の各ウェルに１００ｍＬの完全増殖培地を充填した。遺伝子改変細胞は、１００ｍＬの完全増殖培地に５×１０５細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬの濃度で播種された。静置培養容器を３～４日間インキュベートして細胞増殖させた。ＩＬ２及びＩＬ７は、３～４日ごとに１００Ｕ／ｍＬの最終作業濃度まで又は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ２及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ７まで補充された。総細胞数は、トリパンブルーを添加し、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）サイトメーターでカウントすることにより、３～４日ごとに定量された。エレクトロポレーション後、細胞を培養で９～１２日間維持し、最大の総細胞数を達成した。
【0179】
（ｉ）Ｔ細胞活性化のための最適化条件は％ＣＡＲ＋発現を増加させた
エレクトロポレーションを使用して、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をＴ細胞に導入し、ＣＤ７０、ＰＤ１、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を含む４つの標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集を行った。単一のエレクトロポレーションを実施して、一度に４つの遺伝子全てを標的化した。２回のエレクトロポレーションを実施する場合、ＣＤ７０及びＰＤ１遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第１のエレクトロポレーションでＴ細胞に導入され、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第２のエレクトロポレーションでそれらのＴ細胞に導入された。
エレクトロポレーションを使用して、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をＴ細胞に導入し、ＣＤ７０、ＰＤ１、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を含む４つの標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集を行った。単一のエレクトロポレーションを実施して、一度に４つの遺伝子全てを標的化した。２回のエレクトロポレーションを実施する場合、ＣＤ７０及びＰＤ１遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第１のエレクトロポレーションでＴ細胞に導入され、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第２のエレクトロポレーションでそれらのＴ細胞に導入された。
【0180】
表４で示されるように、１回のエレクトロポレーション又は２回のエレクトロポレーション前に４８時間活性化されたＴ細胞は、それぞれ５４．７％及び５７．５％の％ＣＡＲ＋発現を示した。７２時間活性化されたＴ細胞は、Ｔ細胞が１回又は２回エレクトロポレーションされたかどうかに関係なく、４８時間活性化されたＴ細胞よりも約１０％多い総％ＣＡＲ＋発現を示した（表４）。
【0181】
【表4】
【0182】
これらの結果は、７２時間のＴ細胞活性化が４８時間のＴ細胞活性化によって提供されるものと比較して％ＣＡＲ＋発現を増加させることを示した。ＰＤ１を標的化するＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションに含まれていなかった場合にも、同様の結果が観察された。
【0183】
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化のための最適化条件は、エレクトロポレーションからの細胞喪失を減弱させた
ＣＤ７０遺伝子及びＰＤ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存編集用の構成要素を導入するために、第１のエレクトロポレーション工程をＴ細胞で実施した。細胞数は、４８時間又は７２時間のＴ細胞活性化の前後に測定した。
ＣＤ７０遺伝子及びＰＤ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存編集用の構成要素を導入するために、第１のエレクトロポレーション工程をＴ細胞で実施した。細胞数は、４８時間又は７２時間のＴ細胞活性化の前後に測定した。
【0184】
表５で示されるように、Ｔ細胞を４８時間活性化した場合、第２のエレクトロポレーション前に得られた細胞数は、活性化のために最初に播種された細胞数よりも少なかった。対照的に、Ｔ細胞を７２時間活性化した場合、第２のエレクトロポレーション前に得られた細胞数は、活性化のために最初に播種された細胞数よりも多かった（表５）。
【0185】
【表5】
【0186】
これらの結果は、７２時間のＴ細胞活性化が、Ｔ細胞が４８時間活性化されたときのみに観察された第１のエレクトロポレーション後の細胞喪失を減弱させることを示した。ＰＤ１を標的化するＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションに含まれていなかった場合にも、同様の結果が観察された。
【0187】
実施例３：β２Ｍのノックアウトのための最適化条件の特定。
本実施例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集を使用したβ２Ｍのノックアウトのための最適化条件の特定を報告する。β２Ｍのノックアウトは、第１のエレクトロポレーション又は第２のエレクトロポレーションのいずれかで行うことができる。ＴＣＲのノックアウトは、一般に、第２のエレクトロポレーション中又は形質導入前に実施され、ＨＤＲが媒介したＣＤ７０ ＣＡＲの挿入を確実にする。ＣＤ７０のノックアウトは、一般に、ＣＤ７０ ＣＡＲを挿入する前に、細胞間のフラトリサイドの可能性を防ぐために、最初のエレクトロポレーション中に実施される。
本実施例では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集を使用したβ２Ｍのノックアウトのための最適化条件の特定を報告する。β２Ｍのノックアウトは、第１のエレクトロポレーション又は第２のエレクトロポレーションのいずれかで行うことができる。ＴＣＲのノックアウトは、一般に、第２のエレクトロポレーション中又は形質導入前に実施され、ＨＤＲが媒介したＣＤ７０ ＣＡＲの挿入を確実にする。ＣＤ７０のノックアウトは、一般に、ＣＤ７０ ＣＡＲを挿入する前に、細胞間のフラトリサイドの可能性を防ぐために、最初のエレクトロポレーション中に実施される。
【0188】
要約すると、β２Ｍを標的化するＲＮＰ複合体が形成され、単一のエレクトロポレーション又は２段階のエレクトロポレーションプロセスを介してＴ細胞に導入される小規模なプロセスで、遺伝子操作されたＴ細胞を製造した。詳細については上記実施例２を参照されたい。
【0189】
第１のエレクトロポレーション中にβ２Ｍをノックアウトする場合、ＣＤ７０及びβ２Ｍ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第１のエレクトロポレーションでＴ細胞に導入され、ＰＤ１及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第２のエレクトロポレーションでＴ細胞に導入された。第２のエレクトロポレーション中にβ２Ｍをノックアウトする場合、ＣＤ７０及びＰＤ１遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第１のエレクトロポレーションでＴ細胞に導入され、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体が第２のエレクトロポレーションでＴ細胞に導入された。Ｔ細胞は、ＣＤ７０、ＰＤ１、β２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体を用いた単一のエレクトロポレーションイベントでもエレクトロポレーションされた。
【0190】
表６で示されるとおり、β２Ｍを標的化するＲＮＰ複合体が第１のエレクトロポレーションに含まれる場合、Ｔ細胞が４８時間又は７２時間活性化されたかどうかに関係なく、形質導入後７日で残存β２Ｍ＋発現は約６０％であった。β２Ｍを標的化するＲＮＰ複合体が単一のエレクトロポレーション又は第２のエレクトロポレーションに含まれる場合、残存β２Ｍ＋発現は約２０％であった（表６）。残存ＣＤ７０＋発現は、形質導入後７日では検出できなかった（表７）。残存ＣＤ７０＋発現細胞は、ＣＤ７０を標的化するＲＮＰ複合体によるノックアウトによって排除されたか、又はＣＤ７０ ＣＡＲ＋細胞によって排除された可能性がある。試験したβ２Ｍノックアウト条件の各々について、同様のＴ細胞増殖及びＴ細胞生存率が観察された（図１）。
【0191】
【表6】
【0192】
【表7】
【0193】
これらの結果は、第２のエレクトロポレーション工程でβ２Ｍを標的化するＲＮＰ複合体を導入すると、ＣＤ７０の効率的なノックアウト又は細胞増殖及び細胞生存率を維持しながら、β２Ｍの優れたノックアウトを提供することを示した。ＰＤ１を標的化するＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションに含まれていなかった場合にも、同様の結果が観察された。
【0194】
実施例４：Ｔ細胞のエレクトロポレーションのための最適化条件の特定
本実施例では、エレクトロポレーションを介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集用の複数のＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入するための最適化条件の特定を報告する。
本実施例では、エレクトロポレーションを介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集用の複数のＲＮＰ複合体をＴ細胞に導入するための最適化条件の特定を報告する。
【0195】
要約すると、ＲＮＰ複合体が単一のエレクトロポレーション又は２段階のエレクトロポレーションプロセスを介してＴ細胞に導入される小規模なプロセスで、遺伝子操作されたＴ細胞を製造した。詳細については上記実施例２を参照されたい。転座率はｄｄＰＣＲによって決定された。
【0196】
１回のエレクトロポレーションで遺伝子操作されたＴ細胞は、ＰＤ１及びＣＤ７０を標的化するＲＮＰ複合体が第１のエレクトロポレーションで一緒に組み合わされた場合を除いて、２段階エレクトロポレーションされたものよりも有意に高い転座率を示した（図２Ａ）。ＣＤ７０を標的化するｇＲＮＡが第１のエレクトロポレーションで（ＲＮＰ複合体を介して）送達された場合、転座率は２％未満であった。図２Ａ及び２Ｂを参照されたい。４つのＲＮＰ複合体を一緒にエレクトロポレーションしたＴ細胞の細胞遺伝学的分析により、ＰＤ１（染色体２）、β２Ｍ（染色体１５）、ＴＣＲ（染色体１４）及びＣＤ７０（染色体１９）を収容する染色体で転座が発生した可能性が高いことが明らかになった（データは示さず）。
【0197】
まとめると、これらの結果は、２つの工程で実施されるエレクトロポレーションを介してＲＮＰ複合体を導入することにより、より低い転座率が達成される可能性があることを示している。ＰＤ１を標的化するＲＮＰ複合体がエレクトロポレーションに含まれていなかった場合にも、同様の結果が観察された。
【0198】
実施例５：抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、遺伝子破壊されたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子操作されたＴ細胞を作製するための製造プロセス開発（ＣＴＸ１３０）。
概略
ＣＴＸ１３０は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された同種Ｔ細胞で構成されるＣＤ７０指向性Ｔ細胞免疫療法である。
概略
ＣＴＸ１３０は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された同種Ｔ細胞で構成されるＣＤ７０指向性Ｔ細胞免疫療法である。
【0199】
改変には、Ｔ細胞受容体アルファ定数（ＴＲＡＣ）、β２Ｍ及びＣＤ７０の標的化破壊が含まれる。ＴＲＡＣ座位を破壊することで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の減少がもたらされ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を低減させることが意図される一方、β２Ｍ座位を破壊することで、主要組織適合複合体タイプＩ（ＭＨＣ Ｉ）タンパク質の発現の減少がもたらされ、宿主拒絶反応の可能性を低減させることによって持続性を向上させることが意図される。ＣＤ７０が破壊されると、ＣＤ７０の発現が失われ、ＣＤ７０ ＣＡＲを挿入する前に細胞間フラトリサイドが発生する可能性を防ぐ。抗ＣＤ７０ ＣＡＲを加えることにより、改変Ｔ細胞がＣＤ７０発現腫瘍細胞に誘導される。
【0200】
抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、ＣＤ７０に特異的な抗ＣＤ７０単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、それに続くＣＤ８ヒンジ並びに４－１ＢＢとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの細胞内共シグナル伝達ドメインに融合される膜貫通ドメインで構成されている。
【0201】
ＣＴＸ１３０の例示的な製造プロセスが図３Ａに示されている。
【0202】
製造プロセスの発展
実施例１～４に記載の最適化プロセスによって決定された条件に基づいて、ＣＴＸ１３０製造プロセスは、研究規模、開発規模及び臨床規模を含む３つの生産規模で実施された。研究規模プロセスは小規模で実施し、研究規模プロセスを規模拡大して、開発規模プロセス及び臨床規模プロセスに移行した。初期キャンペーン（４ロット）は、実現可能性及び操作パラメーターの調整のために、原薬の実験室グレードの出発物質を使用して実施した。その後、ＧＭＰ由来の出発物質（ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９及びｒＡＡＶ－１４５ｂ）の使用及び定量的許容基準を、開発規模プロセスと運用上同一である臨床規模プロセスに実装した。
実施例１～４に記載の最適化プロセスによって決定された条件に基づいて、ＣＴＸ１３０製造プロセスは、研究規模、開発規模及び臨床規模を含む３つの生産規模で実施された。研究規模プロセスは小規模で実施し、研究規模プロセスを規模拡大して、開発規模プロセス及び臨床規模プロセスに移行した。初期キャンペーン（４ロット）は、実現可能性及び操作パラメーターの調整のために、原薬の実験室グレードの出発物質を使用して実施した。その後、ＧＭＰ由来の出発物質（ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９及びｒＡＡＶ－１４５ｂ）の使用及び定量的許容基準を、開発規模プロセスと運用上同一である臨床規模プロセスに実装した。
【0203】
出発物質の選択
ＣＴＸ１３０の生成用出発物質は、以下のとおりである：
－ 健康なドナーから収集されたロイコパック、
－ 細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ、
－ ３つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＣＤ７０遺伝子座を標的化するＣＤ７０－７ｓｇＲＮＡ、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するＴＡ－１及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するβ２Ｍ－１、及び
－ 抗ＣＤ７０ ＣＡＲ遺伝子をコードする組換えＡＡＶ－６ベクター（ｒＡＡＶ－１４５ｂ）。
ＣＴＸ１３０の生成用出発物質は、以下のとおりである：
－ 健康なドナーから収集されたロイコパック、
－ 細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ、
－ ３つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＣＤ７０遺伝子座を標的化するＣＤ７０－７ｓｇＲＮＡ、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するＴＡ－１及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するβ２Ｍ－１、及び
－ 抗ＣＤ７０ ＣＡＲ遺伝子をコードする組換えＡＡＶ－６ベクター（ｒＡＡＶ－１４５ｂ）。
【0204】
ＣＴＸ１１０の遺伝子改変並びに編集されたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座の作製に使用される構成要素についての構造情報を以下に示す。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）：
Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）：
【化1】
【0205】
【表8】
【0206】
【表9】
【0207】
【表10】
【0208】
【表11】
【0209】
【表12】
【0210】
【表13】
【0211】
【表14】
【0212】
【表15】
【0213】
【表16】
【0214】
【表17】
【0215】
ＣＴＸ１３０の製造プロセスの説明
（ｉ）Ｔ細胞の濃縮
Ｔ細胞は、自動化細胞処理システムを使用して、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体でコーティングされた磁気ビーズの混合物を使用した磁気分離により、白血病アフェレーシス材料（ロイコパック）から濃縮した。濃縮前にロイコパックを細胞数及び生存率（≧８０％）についてサンプリングした。
（ｉ）Ｔ細胞の濃縮
Ｔ細胞は、自動化細胞処理システムを使用して、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体でコーティングされた磁気ビーズの混合物を使用した磁気分離により、白血病アフェレーシス材料（ロイコパック）から濃縮した。濃縮前にロイコパックを細胞数及び生存率（≧８０％）についてサンプリングした。
【0216】
濃縮した細胞を、ＨＳＡを含むＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーで単離し、次いで、細胞数、生存率（≧８０％）、Ｔ細胞純度（≧７０％ＣＤ３）及び無菌性についてサンプリングした。次いで、細胞を４±１℃で遠心分離し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５に５０×１０６生細胞／ｍＬの目標濃度で再懸濁させた。
【0217】
（ｉｉ）Ｔ細胞の凍結保存
細胞数、生存率（≧８０％）について細胞をサンプリングし、次いで２，５００×１０６細胞／バッグ（細胞懸濁液３０～７０ｍＬ）の標的細胞数でエチレン酢酸ビニルクライオバッグに分注した。１～２バッグのＴ細胞を生成するには１つのロイコパックで十分である場合がある。各バッグをヒートシールし、ラベルを付け、制御速度の冷凍庫に移すまで２～８℃で保管し、その後、保管のために気相液体窒素に移す。
細胞数、生存率（≧８０％）について細胞をサンプリングし、次いで２，５００×１０６細胞／バッグ（細胞懸濁液３０～７０ｍＬ）の標的細胞数でエチレン酢酸ビニルクライオバッグに分注した。１～２バッグのＴ細胞を生成するには１つのロイコパックで十分である場合がある。各バッグをヒートシールし、ラベルを付け、制御速度の冷凍庫に移すまで２～８℃で保管し、その後、保管のために気相液体窒素に移す。
【0218】
（ｉｉｉ）Ｔ細胞の解凍、第１のエレクトロポレーション及び活性化
濃縮されたＴ細胞の凍結バッグ１つを解凍し、３Ｌのバッグに移し、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５、５％ヒト血清、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ７）で希釈した。細胞を、細胞数及び生存率（≧７０％）についてサンプリングした。
濃縮されたＴ細胞の凍結バッグ１つを解凍し、３Ｌのバッグに移し、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５、５％ヒト血清、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ７）で希釈した。細胞を、細胞数及び生存率（≧７０％）についてサンプリングした。
【0219】
細胞を５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットをエレクトロポレーションバッファーに再懸濁させ、同一条件下で再度遠心分離した。細胞を、３００×１０６細胞／ｍＬの目標濃度になるまで、エレクトロポレーションバッファーに２回再懸濁させた。
【0220】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをマイクロ遠心チューブ内でＣＤ７０－７ ｓｇＲＮＡと混合し、室温で１０分以上インキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。次いで、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを細胞と混合し、Ｃａｓ９及びＣＤ７０－７ ｓｇＲＮＡの最終濃度をそれぞれ０．１５ｍｇ／ｍＬ及び０．１６ｍｇ／ｍＬにした。
【0221】
混合物を取り出し、ピペッティングによりエレクトロポレーションカセットにロードした。カセットに蓋をし、フローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを使用して順次エレクトロポレーションした。
【0222】
エレクトロポレーション後、細胞を各カセットから１２５ｍＬ三角フラスコにプールし、３７℃で２０分以上インキュベートした。細胞を、生存率（≧５０％）及び数についてサンプリングした。次いで、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合した可溶性コロイド状ポリマーナノマトリックス溶液を、１：１２．５（ｖ／ｖ）の比率で添加して、細胞を活性化した。
【0223】
約５００ｍＬの補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地／組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスの総量で各々、細胞を２×１０６生細胞／ｍＬの目標密度まで静置細胞培養容器に播種した。
【0224】
静置細胞培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で７２±４時間インキュベートした。プロセス全体を通して、静置細胞培養容器を取り扱うときはいつでも、裂け目及び漏れ並びに透明な黄色の培地の存在について検査した。
【0225】
（ｉｖ）希釈
３日後、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地を各静置細胞培養容器に５Ｌの最終容量まで添加した。細胞を更に３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
３日後、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地を各静置細胞培養容器に５Ｌの最終容量まで添加した。細胞を更に３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【0226】
（ｖ）第２のエレクトロポレーション及び形質導入
補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地の体積は、静置細胞培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して、約５００ｍＬの最終容量まで減少させた。
補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地の体積は、静置細胞培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して、約５００ｍＬの最終容量まで減少させた。
【0227】
静置細胞培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。細胞を、細胞数、生存率（≧７０％）についてサンプリングした。
【0228】
細胞を５００ｍＬの遠心分離管に移し、５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットをエレクトロポレーションバッファーに再懸濁させ、同一条件下で再度遠心分離した。細胞を、３００×１０６細胞／ｍＬの目標濃度になるまで、エレクトロポレーションバッファーに２回再懸濁させた。
【0229】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、別々のマイクロ遠心チューブでＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ及びβ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡと混合した。各溶液を室温で１０分以上インキュベートして、各リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。２つのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ混合物を組み合わせ、細胞と混合して、Ｃａｓ９、ＴＡ－１及びβ２Ｍ－１を、それぞれ最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬにした。
【0230】
混合物を取り出し、ピペッティングによりエレクトロポレーションカセットにロードした。カセットに蓋をし、フローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを使用して順次エレクトロポレーションした。
【0231】
エレクトロポレーション後、細胞を各カセットから１２５ｍＬ三角フラスコにプールし、３７℃で２０分以上インキュベートした。細胞を、生存率（≧７０％）についてサンプリングした。細胞をＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で１×１０７細胞／ｍＬの目標まで希釈し、解凍したばかりのｒＡＡＶ－１４５ｂを２０，０００～５０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６０分以上の間、インキュベートした。
【0232】
（ｖｉ）細胞増殖
細胞を、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で希釈し、細胞生存率（≧７０％）及び細胞数についてサンプリングし、０．２×１０６生細胞／ｃｍ２～０．５×１０６生細胞／ｃｍ２の密度まで２つの静置細胞培養容器及び１つのより小さい静置細胞培養容器（細胞監視のためのサテライト培養として機能する）に播種した。静置細胞培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２でインキュベートした。
細胞を、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で希釈し、細胞生存率（≧７０％）及び細胞数についてサンプリングし、０．２×１０６生細胞／ｃｍ２～０．５×１０６生細胞／ｃｍ２の密度まで２つの静置細胞培養容器及び１つのより小さい静置細胞培養容器（細胞監視のためのサテライト培養として機能する）に播種した。静置細胞培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２でインキュベートした。
【0233】
細胞培養物を最大９日間インキュベートした。この間、培養物は３～４日ごとに１ｍＬの培養液用量当たり１００ＩＵのｒｈＩＬ２及びｒｈＩＬ７で補充した。
【0234】
サテライト細胞培養は、増殖全体の細胞数、生存率及びＴ細胞純度について試験した。サテライト培養内の細胞密度が約３０×１０６／ｃｍ２に達するとき、ＴＣＲαβの枯渇を実施した。サテライトの細胞密度が３０×１０６／ｃｍ２に達しない場合、９日目にメイン培養でＴＣＲαβの枯渇を実施した。
【0235】
（ｖｉｉ）ＴＣＲαβの枯渇
各静置細胞培養容器の培地は、静置細胞培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して、約５００ｍＬの最終容量まで減少させた。培地の大部分を除去した後、静置細胞培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。
各静置細胞培養容器の培地は、静置細胞培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して、約５００ｍＬの最終容量まで減少させた。培地の大部分を除去した後、静置細胞培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。
【0236】
細胞を、静置細胞培養容器に接続するディップチューブを備えた５００ｍＬの遠心分離チューブに移した。細胞を、生存率（≧７０％）、数及び％ＣＡＲについてサンプリングした。次いで、細胞を５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁させ、０．５％ＨＳＡを含む６５０ｍＬ未満のＰＢＳ／ＥＤＴＡにプールした。細胞懸濁液を、自動化細胞処理システムに接続されている滅菌バッグに移した。自動化細胞処理システムは、ビオチン結合抗ＴＣＲαβ抗体と共に細胞をインキュベートする。自動化細胞処理システムを使用してＴＣＲαβ＋細胞を枯渇させるために、細胞を洗浄し、抗ビオチン磁気ビーズと共にインキュベートした。
【0237】
細胞数、生存率（≧７０％）及び％ＣＡＲ細胞について細胞を試験した。
【0238】
（ｖｉｉｉ）細胞の回復
枯渇した細胞を補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に再懸濁させ、３Ｌバッグ（複数可）に移し、静置細胞培養容器（複数可）に播種し、３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
枯渇した細胞を補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に再懸濁させ、３Ｌバッグ（複数可）に移し、静置細胞培養容器（複数可）に播種し、３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【0239】
（ｉｘ）細胞採取（原薬）
細胞を採取するために、静置細胞培養容器をインキュベーターから取り外し、細胞沈降のために休ませた。成長培地は、ポンプを使用して各静置細胞培養容器から約５００ｍＬの最終容量まで除去した。除去した培地を、無菌のためにサンプリングした。
細胞を採取するために、静置細胞培養容器をインキュベーターから取り外し、細胞沈降のために休ませた。成長培地は、ポンプを使用して各静置細胞培養容器から約５００ｍＬの最終容量まで除去した。除去した培地を、無菌のためにサンプリングした。
【0240】
静置細胞培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。各静置細胞培養容器の内容物は、ポンプを使用して３Ｌの移送バッグに移送され、濃度、生存率及び原薬のロット放出テストのためにサンプリングした。次いで、細胞を重力によって４０μｍ輸血フィルターを通して別個の滅菌３Ｌバッグに濾過した。
【0241】
ＣＴＸ１３０の特性評価
ＣＴＸ１３０は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、且つ遺伝的に破壊されたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する同種異系Ｔ細胞で構成されるＣＤ７０指向性Ｔ細胞免疫療法である。非臨床薬理学及び毒物学研究は、ＣＴＸ１３０の非ＧＭＰ開発ロットの潜在的な有効性及び毒性を特性評価するために実施した。
ＣＴＸ１３０は、抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現し、且つ遺伝的に破壊されたＣＤ７０、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する同種異系Ｔ細胞で構成されるＣＤ７０指向性Ｔ細胞免疫療法である。非臨床薬理学及び毒物学研究は、ＣＴＸ１３０の非ＧＭＰ開発ロットの潜在的な有効性及び毒性を特性評価するために実施した。
【0242】
ＣＴＸ１３０の非ＧＭＰ開発ロットの生成及び特性評価
本研究の目的は、非ＧＭＰ ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再現性のある生成が本明細書に記載の方法を使用して達成されたかどうかを判断することであった。
本研究の目的は、非ＧＭＰ ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞の再現性のある生成が本明細書に記載の方法を使用して達成されたかどうかを判断することであった。
【0243】
３人の個々のヒトＴ細胞ドナーを編集して、最初の工程でＣａｓ９及びＣＤ７０に対するｇＲＮＡを含むＲＮＰ、続いてＣａｓ９並びにＴＲＡＣ及びβ２Ｍに対するｇＲＮＡを含むＲＮＰでＣＴＸ１３０の非ＧＭＰ開発ロットを作製し、続いて、第２の工程でＣＡＲをコードするドナー鋳型を含むＡＡＶ６による形質導入を行った。続いて、カラム精製を使用して、残存する残りのＴＣＲ＋細胞について細胞を枯渇させた。
【0244】
要約すると、３人の個々のドナーからのＴ細胞を解凍し、Ｃａｓ９及びＣＤ７０遺伝子座を標的化するｇＲＮＡを含むＲＮＰでエレクトロポレーションし、次いで組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを使用して３日間活性化した。４日目にビーズを希釈し、Ｔ細胞を更に１日間増殖させた。５日目に、細胞は、Ｃａｓ９並びにＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するｇＲＮＡを含むＲＮＰでエレクトロポレーションに供され、続いてＣＤ７０ ＣＡＲを含むＨＤＲ鋳型を含むＡＡＶ６とインキュベーションした。第２の遺伝子編集工程の１０日後、フローサイトメーターを使用して細胞を分析し、ＴＲＡＣ、β２Ｍ及びＣＤ７０のノックアウト効率並びにＣＡＲを発現している細胞の割合を評価した。染色はＴＲＡＣ、β２Ｍ及びＣＤ７０タンパク質に対する抗体を使用して実施し、ビオチンで標識した抗マウスＦａｂ２抗体で染色した後、蛍光ストレプトアビジンとインキュベートすることでＣＡＲの発現を検出した。
【0245】
編集された細胞の分析は、９９．７±０．１％のＴＲＡＣ陰性細胞、７９．４±１．１％のβ２Ｍ陰性細胞及び９８．９±０．３％のＣＤ７０－細胞を示した（表１３）。ＣＡＲ発現は、３人の試験されたドナーの細胞の８０．８±８．４％で検出された（表１３）。ＣＴＸ１３０の追加の研究ロットは、同じプロセスを使用して４番目のドナー（ドナー４）を使用して生成されたが、残存する残りのＴＣＲ＋細胞のために研究ロットが枯渇することはなかった。
【0246】
【表18】
【0247】
（ｉ）エフェクターサイトカインの放出
本研究の目的は、ＣＤ７０＋又はＣＤ７０－細胞と共培養した場合、ＣＴＸ１３０細胞がインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）を分泌する能力を評価することであった。
本研究の目的は、ＣＤ７０＋又はＣＤ７０－細胞と共培養した場合、ＣＴＸ１３０細胞がインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及びインターロイキン２（ＩＬ－２）を分泌する能力を評価することであった。
【0248】
ヒト標的細胞（ＣＤ７０＋細胞株Ａ４９８及びＡＣＨＮ並びにＣＤ７０－株ＭＣＦ７）は、９６ウェルプレートで２４時間、１ウェル当たり５０，０００個の標的細胞で様々な比率（０．１２５：１～４：１のＴ細胞対標的細胞）でＴ細胞と共培養された。標的細胞は、ＣＴＸ１３０細胞又は対照細胞（未編集のＴ細胞）のいずれかとインキュベートされた。培養培地上清中のＩＦＮγ及びＩＬ－２のレベルを測定し、ＣＤ７０＋と共培養した場合、ＣＴＸ１３０がＩＦＮγ及びＩＬ－２を分泌する能力を有しているが、ＣＤ７０－細胞と共培養した場合、分泌する能力を有さないことが示された。
【0249】
（ｉｉ）腫瘍細胞の細胞傷害性
本研究の目的は、ＣＴＸ１３０細胞がＣＤ７０＋細胞を死滅させる能力を評価することであった。要約すると、ヒト標的ＣＤ７０＋細胞（Ａ４９８及びＡＣＨＮ）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０，０００個の標的細胞で一晩プレーティングし、次いでＣＴＸ１３０又は未編集のＴ細胞のいずれかと様々な比率（０．１２５：１～４：１のＴ細胞対標的細胞）で２４時間共培養した。標的細胞の死滅が測定され、ＣＴＸ１３０細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ７０＋細胞株を死滅させたことが実証された。
本研究の目的は、ＣＴＸ１３０細胞がＣＤ７０＋細胞を死滅させる能力を評価することであった。要約すると、ヒト標的ＣＤ７０＋細胞（Ａ４９８及びＡＣＨＮ）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０，０００個の標的細胞で一晩プレーティングし、次いでＣＴＸ１３０又は未編集のＴ細胞のいずれかと様々な比率（０．１２５：１～４：１のＴ細胞対標的細胞）で２４時間共培養した。標的細胞の死滅が測定され、ＣＴＸ１３０細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ７０＋細胞株を死滅させたことが実証された。
【0250】
（ｉｉｉ）他の研究
他の研究は、腎細胞癌及びセザリー症候群の皮下モデルにおける腫瘍細胞増殖を制限するＣＴＸ１３０細胞の能力を示し、ＣＴＸ１３０治療が、生存、ＧｖＨＤの臨床的徴候及び体重を含む測定されたエンドポイントの各々に関して、マウスによって十分に許容されたことを示した。
他の研究は、腎細胞癌及びセザリー症候群の皮下モデルにおける腫瘍細胞増殖を制限するＣＴＸ１３０細胞の能力を示し、ＣＴＸ１３０治療が、生存、ＧｖＨＤの臨床的徴候及び体重を含む測定されたエンドポイントの各々に関して、マウスによって十分に許容されたことを示した。
【0251】
（ｉｖ）ヒト組織の交差反応性
本研究の目的は、免疫組織化学に基づく組織交差反応性研究において、ＣＴＸ１３０に含まれる抗ＣＤ７０ ＣＡＲの選択性を評価することであった。本研究で使用された試験物品は、ＣＴＸ１３０のｓｃＦｖ部分が由来する抗体であった。３２のヒト組織の標準パネルを２つの抗体濃度で評価した：ヒト組織への任意の潜在的な結合を捕捉するための、最適濃度（２．５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０．０μｇ／ｍＬ）。試験した各組織について、３人のドナーからの切片を評価した。一部のリンパ組織（リンパ節及び扁桃腺）では、正常なＣＤ７０発現パターンと一致して、最小から中程度の陽性染色が観察された。パネルの残りの組織では染色は観察されなかった。陽性対照（ヒト腎細胞癌腫瘍細胞）では強い染色が観察された。
本研究の目的は、免疫組織化学に基づく組織交差反応性研究において、ＣＴＸ１３０に含まれる抗ＣＤ７０ ＣＡＲの選択性を評価することであった。本研究で使用された試験物品は、ＣＴＸ１３０のｓｃＦｖ部分が由来する抗体であった。３２のヒト組織の標準パネルを２つの抗体濃度で評価した：ヒト組織への任意の潜在的な結合を捕捉するための、最適濃度（２．５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０．０μｇ／ｍＬ）。試験した各組織について、３人のドナーからの切片を評価した。一部のリンパ組織（リンパ節及び扁桃腺）では、正常なＣＤ７０発現パターンと一致して、最小から中程度の陽性染色が観察された。パネルの残りの組織では染色は観察されなかった。陽性対照（ヒト腎細胞癌腫瘍細胞）では強い染色が観察された。
【0252】
（ｖ）サイトカイン非依存性増殖
本研究の目的は、血清並びにサイトカインＩＬ－２及びＩＬ－７の非存在下で増殖するＣＴＸ１３０の能力を評価することである。要約すると、研究ロット及び非ＧＭＰ開発ロットからのＣＴＸ１３０細胞は、完全Ｔ細胞培地、血清を含むがＩＬ２若しくはＩＬ７サイトカインを含まない培地（血清のみ）又は血清若しくはサイトカインを含まない培地（基本培地）のいずれかで増殖させた。０日目はゲノム編集の１４日後に発生する。研究ロットと非ＧＭＰ開発ロットの両方で、サイトカインの非存在下での増殖は観察されなかった。これらの結果は、ゲノム編集後の血清及びサイトカインを含まない培地での成長及び増殖の欠如を示している。
本研究の目的は、血清並びにサイトカインＩＬ－２及びＩＬ－７の非存在下で増殖するＣＴＸ１３０の能力を評価することである。要約すると、研究ロット及び非ＧＭＰ開発ロットからのＣＴＸ１３０細胞は、完全Ｔ細胞培地、血清を含むがＩＬ２若しくはＩＬ７サイトカインを含まない培地（血清のみ）又は血清若しくはサイトカインを含まない培地（基本培地）のいずれかで増殖させた。０日目はゲノム編集の１４日後に発生する。研究ロットと非ＧＭＰ開発ロットの両方で、サイトカインの非存在下での増殖は観察されなかった。これらの結果は、ゲノム編集後の血清及びサイトカインを含まない培地での成長及び増殖の欠如を示している。
【0253】
実施例６：細胞増殖の改善
ＣＴＸ１３０細胞増殖アウトプットを増加させるために最適化されたエレクトロポレーション
本開示に記載される方法は、エレクトロポレーションを利用して、例えば、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡ複合体を含む様々なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む様々な核酸及びポリペプチドを、レシピエントＴ細胞に送達する。様々な製造業者からの任意の好適なエレクトロポレーション機器が、本明細書に記載の方法での使用を見つけることができるため、エレクトロポレーションプロセスで使用される機器は、特に限定されない。エレクトロポレーションで使用される細胞播種密度は、特に限定されない。
ＣＴＸ１３０細胞増殖アウトプットを増加させるために最適化されたエレクトロポレーション
本開示に記載される方法は、エレクトロポレーションを利用して、例えば、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡ複合体を含む様々なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む様々な核酸及びポリペプチドを、レシピエントＴ細胞に送達する。様々な製造業者からの任意の好適なエレクトロポレーション機器が、本明細書に記載の方法での使用を見つけることができるため、エレクトロポレーションプロセスで使用される機器は、特に限定されない。エレクトロポレーションで使用される細胞播種密度は、特に限定されない。
【0254】
本実施例では、効率的な編集を維持しながら、より多くの容量を保持できるカセット内の細胞の数を増やしてエレクトロポレーションできるエレクトロポレーション機器を使用する。より大きいエレクトロポレーション容量は、形質導入及び増殖のためにより多くの編集された細胞を提供することにより、例えば、任意の所与の操作されたＴ細胞、例えば、ＣＴＸ１３０の操作されたＴ細胞製品のアウトプットを２倍にするのと同じくらい増加する。この容量の増加は、プロセス期間及び又は細胞の倍増を延長する必要がないため、これは製造における利点である。
【0255】
例えば、２つ以上の更なる培養容器などの更なるＴ細胞培養容器（５０００ｍＬの培地容量で５００ｃｍ２のガス透過膜表面積）に播種するために更なる細胞を利用できる。例えば、細胞数の増加に伴い、最大４ｘの培養容器に播種することができ、ここで３００ｅ６≦ｘ≦６００ｅ６の細胞を２ｘの培養容器に播種でき、６００ｅ６≦ｘ≦８００ｅ６の細胞を３ｘの培養容器に播種できるか、又は≦８００ｅ６の細胞を４ｘ培養容器に播種することができる。
【0256】
いくつかの態様では、培養容器１つ当たり約４００，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種される。代わりに、培養容器１つ当たり約２５０，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は約３００，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は培養容器１つ当たり約１５０，０００細胞／ｃｍ２～２５０，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は培養容器１つ当たり約１５０，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は培養容器１つ当たり約１５０，０００細胞／ｃｍ２～６００，０００細胞／ｃｍ２が播種される。
【0257】
いくつかの態様では、標的播種密度は、少なくとも約１５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約２５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約３００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約４００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約５００，０００細胞／ｃｍ２である。
【0258】
いくつかの態様では、標的播種密度は、約２５０，０００細胞／ｃｍ２である。他の態様では、標的播種密度は、約５００，０００細胞／ｃｍ２である。
【0259】
最大１ｍＬの容量を保持できるエレクトロポレーションカセットを使用できる。このシステムを使用すると、２．７×１０９細胞を最大７個のＧ１０００カセットにエレクトロポレーションできる。３ｍＬシリンジに取り付けられた使い捨ての鈍い先端の針を備えたカセットから細胞を回収することで、マイクロピペットの先端が三角フラスコに放出されるリスクも排除される。
【0260】
より大きい容量を有するシステムを使用すると、細胞の形質導入工程も容易になる。形質導入のための現在の最大７ｅ８細胞を１．４ｅ９細胞に倍増すると、増殖のために最大４つの細胞培養容器に播種するのに十分な材料が生成される。従って、固定された９日目の枯渇を維持でき、同じ処理時間で１回の実行当たりのアウトプットを実質的に２倍にすることができる。
【0261】
ＣＴＸ１３０生成プロセスの他の工程は、上記の実施例で説明したとおりである。
【0262】
均等物
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定するものであり、こうした変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料及び構成は例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料及び／又は構成は、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解するものである。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を、日常の実験のみを用いて認識するか又は確認可能である。従って、上述の実施形態は単に例として提示されており、また、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態が、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定するものであり、こうした変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料及び構成は例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料及び／又は構成は、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解するものである。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を、日常の実験のみを用いて認識するか又は確認可能である。従って、上述の実施形態は単に例として提示されており、また、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態が、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【0263】
本明細書中で定義され用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義及び／又は定義される用語の普通の意味を超えて優先されるものと理解されたい。
【0264】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合により文献の全体を包含する場合がある。
【0265】
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【0266】
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「及び／又は」という表現は、等位結合される要素、すなわち一部の場合に接続的に提示され、他の場合に離接的に提示される要素の「いずれか又は両方」を意味するものとして理解されたい。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／又は」の節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定された要素に関連する又は関連しないにかかわらず、他の要素が任意選択的に提示され得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する参照は、「～を備える」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指し得る。
【0267】
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する際、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であり、すなわち要素のリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上の数及び任意選択的に追加的な列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。「～の１つのみ」若しくは「～の厳密に１つ」又は特許請求の範囲で使用されるときの「～からなる」など、反対を明らかに示す用語のみが、多数の要素又は要素のリストの厳密に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用する場合、「又は」という用語は、「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」又は「～の正確に１つ」などの排他的な用語の前に置かれた場合、排他的代替物を示すに過ぎない（即ち「一方又は他方、ただし両方ではない」）ものと解釈するべきである。特許請求の範囲で使用する場合、「～から本質的になる」とは、特許法の分野で使用されるような通常の意味を有するものとする。
【0268】
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における、１つ以上の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」という語句は、要素の列挙内の要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素であるが、要素の列挙内に具体的に列挙されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素の列挙内の要素の任意の組み合わせを必ずしも除外しないことを意味するものと理解すべきである。この定義により、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句が意味する要素の列挙内に具体的に特定される要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることも可能になる。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（換言すると「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、換言すると「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」は、一実施形態では、任意選択的に２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意選択的にＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態では、任意選択的に２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択的にＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、更に別の実施形態では、任意選択的に２つ以上のＡを含む少なくとも１つ、且つ任意選択的に２つ以上のＢを含む少なくとも１つ（及び任意選択的に他の要素を含む）を指すなどであり得る。
【0269】
同様に、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【配列表】
【国際調査報告】