特表 2023-501837 微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-20

(54)【発明の名称】微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/82 20060101AFI20230113BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20230113BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20230113BHJP

   G01N 30/04 20060101ALI20230113BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20230113BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20230113BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20230113BHJP

【ＦＩ】

G01N33/82

G01N30/88 E

G01N30/72 C

G01N30/04 P

G01N30/06 Z

G01N30/86 J

G01N27/62 V

G01N27/62 X

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2020573538

(86)(22)【出願日】2020-09-29

(85)【翻訳文提出日】2020-12-28

(86)【国際出願番号】 CN2020118947

(87)【国際公開番号】W WO2022067533

(87)【国際公開日】2022-04-07

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521001870

【氏名又は名称】北京和合医学診断技術股▲フン▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＡＲＭＯＮＹ ＨＥＡＬＴＨ ＭＥＤＩＣＡＬ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】趙 金 宝

(72)【発明者】

【氏名】賈 永 娟

(72)【発明者】

【氏名】▲ニ▼ 君 君

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA09

2G041DA18

2G041EA04

2G041EA12

2G041FA10

2G041FA21

2G041GA09

2G041HA01

2G041JA05

2G041LA09

2G045AA13

2G045BA13

2G045BB10

2G045BB60

2G045CA25

2G045CA26

2G045DA57

2G045FA40

2G045FB06

(57)【要約】

本発明は、微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法を提供し、２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を構築して分析方法を確立し、構築した２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて少なくとも３種の混合標準溶液を検出し、第１検出結果を取得することと、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２にそれぞれ対応する検量線方程式をフィッティングすることと、抽出試薬および一定量の内部標準物質が加えられた血液サンプルを均一に混合して遠心し、上清を窒素ブローで乾燥して再溶解させた後、構築した２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置で検出し、第２検出結果を取得することと、血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の濃度を取得することとを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールの選択、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築、および２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立を含む血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する分析方法の確立と、
（２）標準溶液の標定であって、
（２ａ）少なくとも３種の混合標準溶液を調製し、前記混合標準溶液は、内部標準物質、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２を有する溶液であり、且つ、前記少なくとも３種の混合標準溶液中の内部標準物質の濃度は同じであり、
（２ｂ）２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ（１）で確立した分析方法により、前記少なくとも３種の混合標準溶液のそれぞれを検出し、前記少なくとも３種の混合標準溶液のそれぞれに対応する第１検出結果を取得し、
（２ｃ）それぞれの前記第１検出結果、前記混合標準溶液中の内部標準物質、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の濃度に基づき、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２にそれぞれ対応する検量線方程式をそれぞれフィッティングする、標準溶液の標定と、
（３）血液サンプルの測定であって、
（３ａ）血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質を加え、更に抽出試薬を加えて抽出した後、遠心処理を行い、遠心処理後の上清をブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、分析サンプルを取得し、
（３ｂ）２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ（１）で確立した前記分析方法により、前記血液サンプルを検出し、前記血液サンプルに対応する第２検出結果を取得し、
（３ｃ）前記ビタミンＫ１およびビタミンＫ２のそれぞれに対応する検量線方程式および前記第２検出結果に基づき、前記血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の濃度を取得する、血液サンプルの測定と、
を含む、血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法。

【請求項2】

ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールは、液体ポンプ、オートサンプラ、カラムインキュベーターおよび質量分析装置を含み、
前記液体ポンプは少なくとも２セットであり、そのうちの一方のセットの液体ポンプは前記オートサンプラに接続され、他方のセットの液体ポンプは独立してポンプ動作を行い、
前記オートサンプラは、サンプル注入動作を行うために用いられ、
前記カラムインキュベーターは、２次元液体のカラム切替動作を行うために少なくとも１セットの切替弁を含み、
前記切替弁のうちの各セットは、独立して六方弁または十方弁から選ばれる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築は、
一方のセットの液体ポンプがオートサンプラに直列に接続され、オートサンプラが第１次元カラムに接続されて切替弁にアクセスされ、他方のセットの液体ポンプが切替弁にアクセスされて第２次元カラムに接続され、第２次元カラムが質量分析装置にアクセスされ、且つ、切替弁により、サンプル注入、２次元転移、分析という３種の状態を含む前記システムの分析状態を制御することと、
前記サンプル注入時に、サンプルを第１次元カラムにより分析し、非目的分析物を切替弁の廃液から排出することと、
前記２次元転移時に、第１次元カラムと第２次元カラムとを直列に接続し、目的分析物を第１次元カラムから第２次元カラムに転移することと、
前記分析時に、サンプルを第２次元カラムにより分析し、質量分析装置を接続してデータ収集を行うことと、
を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立は、
２次元液体クロマトグラフィーの移動相の流速が０．５～２．０ｍＬ／ｍｉｎであることと、
前記移動相は超純水、メタノール、アセトニトリル、および任意の２種または３種の任意の割合の混合溶媒を含む極性溶媒であり、前記移動相に０．０１％～１％のギ酸が含まれることと、
２次元液体クロマトグラフィーのサンプル注入量は１～１００μＬであることと、
２次元液体クロマトグラフィーカラムインキュベーターのカラム温度は２０～６０℃であることと、
質量分析装置は、ＡＰＣＩ源、正イオンスキャンモードを採用し、霧化ガス流量が０．５～３Ｌ／ｍｉｎで、加熱ガス流量が３～２０Ｌ／ｍｉｎで、イオン源温度が１００～４００℃で、脱溶媒管温度が３０～３００℃で、ヒータブロック温度が３０～５００℃で、乾燥ガス流量が０～２０Ｌ／ｍｉｎで、インターフェース電圧が１～５ｋＶであることと、
を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立は、
２次元液体クロマトグラフィーの第１次元カラムはフェニルヘキシルであることと、第２次元カラムはＣ１８であることと、
を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記内部標準物質は、ビタミンＫ１同位体マーカー、ビタミンＫ２同位体マーカーを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ビタミンＫ１に対応する検量線方程式の２つの変数は、それぞれ、ビタミンＫ１のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ１に対応する内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンＫ１の濃度とビタミンＫ１に対応する内部標準物質の濃度との比であり、
前記ビタミンＫ２に対応する検量線方程式の２つの変数は、それぞれ、ビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ２に対応する内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンＫ２の濃度とビタミンＫ２に対応する内部標準物質の濃度との比である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ステップ（２ａ）に記載の少なくとも３種の混合標準溶液を調製する方法は、
標準混合中間液の調製であって、ビタミンＫ１標準原液、ビタミンＫ２標準原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、少なくとも３種の異なる濃度の標準混合中間液を得て、光を避けて保存する、標準混合中間液の調製と、
混合内部標準作動液の調製であって、ビタミンＫ１内部標準物質原液、ビタミンＫ２内部標準物質原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、混合内部標準作動液を得て、光を避けて保存する、混合内部標準作動液の調製と、
混合標準溶液の調製であって、同じ体積かつ異なる濃度の少なくとも３種の標準混合中間液をそれぞれ取り出し、同じ体積の前記混合内部標準作動液および同じ体積の前記希釈液をそれぞれ加え、１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで３０ｓ～１ｍｉｎ渦巻いて均一に混合し、少なくとも３種の異なる混合標準溶液を作成する、混合標準溶液の調製と、
を含み、
前記希釈液は、メタノールまたはメタノール水溶液、アセトニトリルまたはアセトニトリル水溶液、イソプロパノールまたはイソプロパノール水溶液を含み、前記メタノール水溶液、アセトニトリル水溶液、イソプロパノール水溶液の体積濃度は、独立して５０％～１００％から選ばれる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記標準混合中間液中のビタミンＫ１の濃度は０．０５～５００ｎｇ／ｍＬであり、ビタミンＫ２の濃度は０．０５～５００ｎｇ／ｍＬであり、
前記混合内部標準作動液中のビタミンＫ１内部標準物質の濃度は１０～３０ｎｇ／ｍＬであり、ビタミンＫ２内部標準物質の濃度は１０～３０ｎｇ／ｍＬである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記血液サンプルは、全血、血清、または血漿を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記血液サンプルの使用量は２０μＬ以上である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

ステップ（３ａ）の前に、
血液サンプルを遠心速度１０００～３０００ｒ／ｍｉｎで１０～２０ｍｉｎ遠心し、遠心後の上清を前記血液サンプルとして－８０℃の条件で保存することを更に含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

ステップ（３ａ）は、
血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質を加え、抽出試薬を更に加えて抽出した後、１０００～２５００ｒ／ｍｉｎの回転速度で５～１５ｍｉｎ渦巻いて振動混合させてから、１００００～１５０００ｒ／ｍｉｎの回転速度で５～１５ｍｉｎ高速遠心し、遠心処理後の上清の一部または全てを窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、１０００～２５００ｒ／ｍｉｎの回転速度で１～５ｍｉｎ渦巻いて振動混合させ、分析サンプルを得ることを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記抽出試薬は極性抽出試薬と非極性試薬との組み合わせであり、
前記極性抽出試薬は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、またはイソプロパノールのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
前記非極性抽出試薬は、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ－オクタン、または石油エーテルのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
前記再溶解液は、メタノール、エタノール、またはアセトニトリルのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、生物検出の技術分野に関し、例えば、微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ビタミンＫ１（Ｐｈｙｌｌｏｑｕｉｎｏｎｅ）は天然の緑色の植物に広く存在している。空気および湿気に対して安定するが、日光の下で分解される。また、ビタミンＫ１は、生体の正常な血液凝固の維持に重要な役割を果たし、いくつかの血液凝固因子および抗凝固タンパク質の活性化に補助的な役割を果たす。

【0003】

ビタミンＫ２（Ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ－４）は、骨密度保護剤および人体代謝物としての作用を有し、潜在的な抗腫瘍活性を有し、糖尿病、骨粗鬆症、糖尿病前期状態および肝癌の治療の研究に用いられる。

【0004】

現在、文献で報告されている血液中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２を検出する方法は、主に、高速液体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を主としている。従来の文献で報告されている方法は、検出項目が単一であり、検出速度が遅く、分析時間が長く、採血量が多く、コストが高い等の問題があることが多い。その中でも、ビタミンＫ１の単項検出は特に多い。ビタミンＫ２は、人体内の含有量が低いため、従来の文献における報告では、いずれも前処理の血液使用量を増大することで検出の感度要求を満たし、臨床での大量検出に適しない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本願の目的は、操作しやすい、分析が速い、適用範囲が広い微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法を提供することを含む。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本願の実施形態は、
（１）２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールの選択、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築、および２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立を含む血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する分析方法の確立と、
（２）標準溶液の標定であって、
（２ａ）少なくとも３種の混合標準溶液を調製し、前記混合標準溶液は、内部標準物質、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２を有する溶液であり、且つ、前記少なくとも３種の混合標準溶液中の内部標準物質の濃度は同じであり、
（２ｂ）２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ（１）で確立した分析方法により、前記少なくとも３種の混合標準溶液のそれぞれを検出し、前記少なくとも３種の混合標準溶液のそれぞれに対応する第１検出結果を取得し、
（２ｃ）それぞれの前記第１検出結果、前記混合標準溶液中の内部標準物質、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の濃度に基づき、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２にそれぞれ対応する検量線方程式をそれぞれフィッティングする、標準溶液の標定と、
（３）血液サンプルの測定であって、
（３ａ）血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質および抽出試薬を加えて抽出した後、遠心処理を行い、遠心処理後の上清をブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、分析サンプルを取得し、
（３ｂ）２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ（１）で確立した前記分析方法により、前記血液サンプルを検出し、前記血液サンプルに対応する第２検出結果を取得し、
（３ｃ）前記ビタミンＫ１およびビタミンＫ２のそれぞれに対応する検量線方程式および前記第２検出結果に基づき、前記血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の濃度を取得する、血液サンプルの測定と、
を含む血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法を提供する。

【0007】

本願に係る上記分析方法は、血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出でき、検出時間を５．５ｍｉｎまで効果的に短縮し、検出コストを低減することを実現する。構築した２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置により、分析方法は感度が高くて特異性が強く、血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の同時検出に適用し、特に、指先血または踵血を含む微量（２０～２００μＬ）の血液サンプルの検出に適用し、患者の採血苦痛を低減することができ、前処理を操作しやすく、自動化操作を実現しやすく、検出干渉を大きく低減し、検出の感度を向上させ、分析が速く、検出時間が短く、検出コストを低減する。

【0008】

好ましい技術案として、ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールは、液体ポンプ、オートサンプラ、カラムインキュベーターおよび質量分析装置を含み、
前記液体ポンプは少なくとも２セットであり、そのうちの一方のセットの液体ポンプは前記オートサンプラに接続され、他方のセットの液体ポンプは独立してポンプ動作を行い、
前記オートサンプラは、サンプル注入動作を行うために用いられ、
前記カラムインキュベーターは、２次元液体のカラム切替動作を行うために少なくとも１セットの切替弁を含み、
前記切替弁のうちの各セットは、独立して六方弁または十方弁から選ばれる。

【0009】

好ましい技術案として、ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築は、
一方のセットの液体ポンプがオートサンプラに直列に接続され、オートサンプラが第１次元カラムに接続されて切替弁にアクセスされ、他方のセットの液体ポンプが切替弁にアクセスされて第２次元カラムに接続され、第２次元カラムが質量分析装置にアクセスされ、且つ、切替弁により、サンプル注入、２次元転移、分析という３種の状態を含む前記システムの分析状態を制御することと、
前記サンプル注入時に、サンプルを第１次元カラムにより分析し、非目的分析物を切替弁の廃液から排出することと、
前記２次元転移時に、第１次元カラムと第２次元カラムとを直列に接続し、目的分析物を第１次元カラムから第２次元カラムに転移することと、
前記分析時に、サンプルを第２次元カラムにより分析し、質量分析装置を接続してデータ収集を行うことと、
を含む。

【0010】

好ましい技術案として、ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立は、
２次元液体クロマトグラフィーの移動相の流速が０．５～２．０ｍＬ／ｍｉｎであることと、
前記移動相は超純水、メタノール、アセトニトリル、および任意の２種または３種の任意の割合の混合溶媒を含む極性溶媒であり、前記移動相に０．０１％～１％のギ酸が含まれることと、
２次元液体クロマトグラフィーのサンプル注入量は１～１００μＬであることと、
２次元液体クロマトグラフィーカラムインキュベーターのカラム温度は２０～６０℃であることと、
質量分析装置は、ＡＰＣＩ源、正イオンスキャンモードを採用し、霧化ガス流量が０．５～３Ｌ／ｍｉｎで、加熱ガス流量が３～２０Ｌ／ｍｉｎで、イオン源温度が１００～４００℃で、脱溶媒管温度が３０～３００℃で、ヒータブロック温度が３０～５００℃で、乾燥ガス流量が０～２０Ｌ／ｍｉｎで、インターフェース電圧が１～５ｋＶであることと、
を含む。

【0011】

好ましい技術案として、ステップ（１）に記載の２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立は、
２次元液体クロマトグラフィーの第１次元カラムはフェニルヘキシルであることと、第２次元カラムはＣ１８であることと、
を含む。

【0012】

フェニルヘキシルカラムを第１次元カラムとして選択し、Ｃ１８カラムを第２次元カラムとして選択するように特定することにより、血液中の内因性不純物の分離を最適に実現することができる。

【0013】

好ましい技術案として、前記内部標準物質は、ビタミンＫ１同位体マーカー、ビタミンＫ２同位体マーカーを含む。

【0014】

好ましい技術案として、前記ビタミンＫ１に対応する検量線方程式の２つの変数は、それぞれ、ビタミンＫ１のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ１に対応する内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンＫ１の濃度とビタミンＫ１に対応する内部標準物質の濃度との比であり、
前記ビタミンＫ２に対応する検量線方程式の２つの変数は、それぞれ、ビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ２に対応する内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンＫ２の濃度とビタミンＫ２に対応する内部標準物質の濃度との比である。

【0015】

好ましい技術案として、ステップ（２ａ）に記載の少なくとも３種の混合標準溶液を調製する方法は、
標準混合中間液の調製であって、ビタミンＫ１標準原液、ビタミンＫ２標準原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、少なくとも３種の異なる濃度の標準混合中間液を得て、光を避けて保存する、標準混合中間液の調製と、
混合内部標準作動液の調製であって、ビタミンＫ１内部標準物質原液、ビタミンＫ２内部標準物質原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、混合内部標準作動液を得て、光を避けて保存する、混合内部標準作動液の調製と、
混合標準溶液の調製であって、同じ体積かつ異なる濃度の少なくとも３種の標準混合中間液をそれぞれ取り出し、同じ体積の前記混合内部標準作動液および同じ体積の前記希釈液をそれぞれ加え、１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで３０ｓ～１ｍｉｎ渦巻いて均一に混合し、少なくとも３種の異なる混合標準溶液を作成する、混合標準溶液の調製と、
を含み、
前記希釈液は、メタノールまたはメタノール水溶液、アセトニトリルまたはアセトニトリル水溶液、イソプロパノールまたはイソプロパノール水溶液を含み、前記メタノール水溶液、アセトニトリル水溶液、イソプロパノール水溶液の体積濃度は、独立して５０％～１００％から選ばれる。

【0016】

好ましい技術案として、前記標準混合中間液中のビタミンＫ１の濃度は０．０５～５００ｎｇ／ｍＬであり、ビタミンＫ２の濃度は０．０５～５００ｎｇ／ｍＬであり、
前記混合内部標準作動液中のビタミンＫ１内部標準物質の濃度は１０～３０ｎｇ／ｍＬであり、ビタミンＫ２内部標準物質の濃度は１０～３０ｎｇ／ｍＬである。

【0017】

好ましい技術案として、前記血液サンプルは、全血、血清、または血漿を含む。
本願に係る分析方法は、全血、血清、または血漿を含む血液サンプルに適用でき、適用範囲が広い。

【0018】

好ましい技術案として、前記血液サンプルの使用量は２０μＬ以上である。
本願に係る分析方法は、指先血または踵血を含む非常に微量の血液サンプルだけで検出することができ、患者の採血苦痛を減少することができる。

【0019】

好ましい技術案として、ステップ（３ａ）の前に、
血液サンプルを遠心速度１０００～３０００ｒ／ｍｉｎで１０～２０ｍｉｎ遠心し、遠心後の上清を前記血液サンプルとして－８０℃の条件で保存することを更に含む。

【0020】

好ましい技術案として、ステップ（３ａ）は、
血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質を加え、抽出試薬を更に加えて１０００～２５００ｒ／ｍｉｎの回転速度で５～１５ｍｉｎ渦巻いて振動混合させてから、１００００～１５０００ｒ／ｍｉｎの回転速度で５～１５ｍｉｎ高速遠心し、遠心処理後の上清の一部または全てを窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、１０００～２５００ｒ／ｍｉｎの回転速度で１～５ｍｉｎ渦巻いて振動混合させ、分析サンプルを得ることを含む。

【0021】

好ましい技術案として、前記抽出試薬は極性抽出試薬と非極性試薬との組み合わせであり、
前記極性抽出試薬は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、またはイソプロパノールのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
前記非極性抽出試薬は、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ－オクタン、または石油エーテルのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
前記再溶解液は、メタノール、エタノール、またはアセトニトリルのうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。

【発明の効果】

【0022】

本発明の実施形態において、２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて少なくとも３種の濃度の混合標準溶液をそれぞれ検出し、ここで、混合標準溶液は、内部標準物質を有するビタミンＫ１およびビタミンＫ２の溶液であり、且つ、少なくとも３種の濃度の混合標準溶液中の内部標準物質の濃度は一致する。少なくとも３種の濃度の混合標準溶液の検出結果に基づき、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の検量線方程式をそれぞれフィッティングする。血液サンプルに混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質作動液を加え、更に抽出試薬を加え、十分に均一に混合して抽出した後、高速遠心を行い、遠心処理後の上清を窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、溶液を均一に混合させて干渉物が除去された上清を取得する。構築した２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて該上清を検出し、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の検出結果および検量線方程式に基づき、血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の濃度を得る。顕著な有益な効果は以下のとおりである。血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出することができ、検出時間を５．５ｍｉｎまで効果的に短縮し、検出コストを低減することを実現する。構築した２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置により、分析方法は感度が高く、特異性が強く、検出干渉を大きく低減し、血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の同時検出に適用され、特に、指先血または踵血を含む微量（２０～２００μＬ）の血液サンプルの検出に適用され、患者の採血苦痛を減少することができ、前処理を操作しやすく、自動化操作を実現しやすく、分析が速く、検出時間が短く、検出コストを低減する。

【0023】

本発明の実施例または従来技術における技術案をより明らかに説明するために、以下、実施例または従来技術の説明に使用する必要のある図面について簡単に説明し、明らかに、以下の説明における図面は本発明のいくつかの実施例であり、当業者は、創造的な労働を行わない前提で、これらの図面に基づいて他の図面を更に取得することができる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の一実施例に係る混合標準溶液中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図2】本発明の一実施例に係る混合標準溶液中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図3】本発明の一実施例に係る混合標準溶液中のビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラムである。

【図4】本発明の一実施例に係る混合標準溶液中のビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラムである。

【図5】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図6】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図7】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラムである。

【図8】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラムである。

【図9】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図10】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図11】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図12】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図13】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図14】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図15】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図16】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図17】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図18】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図19】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図20】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【図21】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムである。

【図22】本発明の一実施例に係る血液サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明の実施例の目的、技術案および利点をより明らかにするために、以下、本発明の実施例における図面を参照しながら、本発明の実施例における技術案について明確かつ完全に説明し、明らかに、説明する実施例は本発明の一部の実施例に過ぎず、全ての実施例ではなく、本発明における実施例に基づき、当業者は、創造的な労働を行わない前提で取得する全ての他の実施例は、いずれも本発明の保護範囲に属する。

【0026】

本発明の実施例は、微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法を提供し、以下のステップを含む。

【0027】

ステップ１０１において、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を構築し、微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法を確立し、検出条件を予め設定する。

【0028】

ステップ１０２において、少なくとも３種の濃度の混合標準溶液を調製し、ここで、前記混合標準溶液は、内部標準物質、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２を有する溶液であり、且つ、前記少なくとも３種の濃度の混合標準溶液中の内部標準物質の濃度は同じである。

【0029】

ステップ１０３において、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法を用いて所定の検出条件で、各種の前記混合標準液をそれぞれ検出し、前記少なくとも３種の濃度にそれぞれ対応する第１検出結果を取得する。

【0030】

ステップ１０４において、各前記第１検出結果、前記混合標準溶液中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２および内部標準物質の濃度に基づき、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２にそれぞれ対応する検量線方程式をそれぞれフィッティングする。

【0031】

ステップ１０５において、血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ濃度の内部標準物質および抽出試薬を加え、十分に均一に混合して抽出した後、高速遠心処理を行い、遠心処理後の上清を窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、均一に混合した後、分析サンプルを得る。

【0032】

ステップ１０６において、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析法を用いて前記検出条件で分析サンプルを検出し、前記血液サンプルに対応する第２検出結果を得る。

【0033】

ステップ１０７において、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２にそれぞれ対応する検量線方程式および前記第２検出結果に基づき、前記血液サンプル中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２の濃度を得る。

【0034】

本発明の実施例に係る検出方法に使用される２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置の検出過程は以下のとおりであってもよい。混合標準溶液中の標準目的物のクロマトグラフピーク面積と標準目的物の濃度との間の関係に基づいて標準目的物のクロマトグラフピーク面積と標準目的物の濃度との間の検量線方程式を構築でき、更に血液サンプル中の目的物のクロマトグラフピーク面積を検量線方程式に代入すれば、血液サンプル中の目的物の濃度を計算することができる。

【0035】

上記第１検出結果とは、各濃度の混合標準溶液のグラフにおけるビタミンＫ１、ビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積を意味することが理解できる。

【0036】

しかし、血液サンプルの処理過程および検出誤差により、上記標準目的物のクロマトグラフピーク面積および標準目的物の濃度に基づいて構築された検量線方程式に一定の偏差が存在し、これにより、該検量線方程式に基づいて計算される血液サンプル中の目的物の濃度にも偏差が存在する。好ましくは、検出方法に使用される２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置の検出過程は以下のとおりであってもよい。目的物のクロマトグラフピーク面積と内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比を第１引数とし、目的物の濃度と内部標準物質の濃度との比を第２引数とし、少なくとも３グループ（第１引数および第２引数）で線形回帰を行って検量線方程式をフィッティングし、また、血液サンプル内の目的物のクロマトグラフピーク面積と内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比を上記検量線方程式に代入することにより、血液サンプル中の血液サンプルの目的物のクロマトグラフピーク面積および内部標準物質の濃度を得て、血液サンプル中の目的物の濃度と内部標準物質の濃度との比を計算することができ、内部標準物質の濃度が既知であるため、血液サンプル中の目的物の濃度を計算することができる。

【0037】

好ましくは、上記標準目的物および血液サンプル中の目的物はいずれもビタミンＫ１、ビタミンＫ２である。

【0038】

好ましくは、内部標準物質は、ビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）である。

【0039】

ここで、ビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）はビタミンＫ１に対応し、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）はビタミンＫ２に対応する。

【0040】

好ましくは、ビタミンＫ１に対応する検量線方程式の２つの変数は、それぞれ、ビタミンＫ１のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンＫ１の濃度とビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）の濃度との比である。

【0041】

ビタミンＫ２に対応する検量線方程式の２つの変数は、それぞれ、ビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンＫ２の濃度とビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）の濃度との比である。

【0042】

以上から分かるように、血液サンプルの処理方式は最終的な検出結果に影響を与え、本発明の実施例は、血液サンプルに混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質および抽出試薬を加え、十分に均一に混合して抽出した後、高速遠心処理を行い、遠心処理後の上清を窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、均一に混合した後、分析サンプルを得ることにより、血液サンプル中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２を最大限に保留するとともに干渉物を除去することができ、前処理のステップが簡単で、自動化前処理を実現しやすいため、血液サンプルの前処理の時間を大きく短縮し、更に検出時間長を短縮し、血液サンプルの検出効率を向上させることができる。

【0043】

一般的には、混合標準溶液の調製方式は検出の正確性に直接影響を与え、本発明の実施例に使用される混合標準溶液の調製方式は検出結果の正確性を確保することができる。本発明の一実施例において、前記少なくとも３種の濃度の混合標準溶液の調製は以下を含む。

【0044】

標準混合中間液の調製：ビタミンＫ１標準原液、ビタミンＫ２標準原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、少なくとも３種の異なる濃度の標準混合中間液を得て、－８０℃で光を避けて保存する。

【0045】

混合内部標準作動液の調製：ビタミンＫ１内部標準物質原液、ビタミンＫ２内部標準物質原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、混合内部標準作動液を得て、－８０℃で光を避けて保存する。

【0046】

混合標準溶液の調製：同じ体積かつ異なる濃度の少なくとも３種の標準混合中間液をそれぞれ取り出し、取り出した各濃度の前記標準混合中間液内に同じ体積の前記混合内部標準作動液および同じ体積の前記希釈試薬を加え、１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで３０ｓ～１ｍｉｎ渦巻いて均一に混合し、少なくとも３種の異なる濃度の混合標準溶液を作成する。

【0047】

前記血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ濃度の内部標準物質を加え、更に２種の抽出試薬を加え、十分に均一に混合して抽出した後、高速遠心処理を行い、遠心処理後の上清を窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、均一に混合した後、分析サンプルを得る。本発明の実施例に係る血液サンプルは血液そのものであってもよく、全血、血清、血漿等のような血液の関連サンプルであってもよい。

【0048】

以下のいくつかの実施例は、当社が選択したボランティアに由来する血清（２０μＬ）を例として微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する方法について詳細に説明する。

【0049】

実施例１：２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を構築して検出条件を予め設定した。

【0050】

２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を構築し、そのシステムモジュールは、
一方のセットが前記オートサンプラに接続され、他方のセットが独立してポンプ動作を行う２セットの液体ポンプと、
サンプル注入動作を行うための１台のオートサンプラと、
六方弁である２セットの切替弁を含む１台のカラムインキュベーターと、
を備え、
前記質量分析装置はＡＰＣＩイオン源を備えた。

【0051】

２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を構築し、そのシステムの接続は、
一方のセットの液体ポンプがオートサンプラに直列に接続され、オートサンプラが第１次元カラムに接続されて切替弁にアクセスされ、他方のセットの液体ポンプが切替弁にアクセスされて第２次元カラムに接続され、第２次元カラムが質量分析装置にアクセスされ、且つ、切替弁により、サンプル注入、２次元転移、分析という３種の状態を含む前記システムの分析状態を制御することと、
サンプル注入時に、サンプルを第１次元カラムにより分析し、非目的分析物を切替弁の廃液から排出することと、
２次元転移時に、第１次元カラムと第２次元カラムとを直列に接続し、目的分析物を第１次元カラムから第２次元カラムに転移することと、
分析時に、サンプルを第２次元カラムにより分析し、質量分析装置を接続してデータ収集を行うことと、
を含んだ。

【0052】

構築した２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置に検出条件を予め設定し、以下を含んだ。

【0053】

血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置における２次元高速液体に対し、所定の検出条件における対応するクロマトグラフィー条件は、
２セットの液体ポンプは、移動相がメタノール（０．２％のギ酸を含む）で、流速が１．２ｍＬ／ｍｉｎで、定組成溶離が５．５０ｍｉｎであることと、
カラムインキュベーターは、カラム温度が５０℃で、カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍおよびＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであり、２つの六方弁を含み、０．００ｍｉｎ左弁位置１－２、１．４０ｍｉｎ左弁位置１－６、１．８５ｍｉｎ左弁位置１－２で、右弁位置は常に１－６であることと、
オートサンプラは、温度が１５℃で、プローブ洗浄液がメタノールで、サンプル注入量が３０μＬであることと、
を含んだ。

【0054】

血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置における質量分析に対し、所定の検出条件における対応する質量分析条件は、
ＡＰＣＩ源、正イオンスキャンモードを採用することと、
霧化ガス流量が１．５Ｌ／ｍｉｎで、イオン源温度が４００℃で、脱溶媒管温度が２００℃で、ヒータブロック温度が３００℃で、乾燥ガス流量が０Ｌ／ｍｉｎであることと、
インターフェース電圧が５ｋＶで、衝突ガスがアルゴンガスで、パラメータを２００ｋＰａとすることと、
を含んだ。

【0055】

更に、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置における質量分析の検出イオン対のパラメータは、以下の表１に示すとおりであった。

【0056】

【表1】

【0057】

実施例２：シリーズ濃度の混合標準溶液を調製した。
標準混合中間液の調製：同じ体積のビタミンＫ１標準原液、ビタミンＫ２標準原液を取り出した。

【0058】

取り出した濃度が１００μｇ／ｍＬのビタミンＫ１標準原液と、濃度が１００μｇ／ｍＬのビタミンＫ２標準原液とを混合させ、９０％のメタノール水溶液を用いて希釈し、９種の異なる濃度の標準混合中間液を得て、－８０℃で光を避けて保存した。

【0059】

ここで、異なる濃度の標準混合中間液において、ビタミンＫ１の各レベルの濃度は順に０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬであった。ビタミンＫ２の各レベルの濃度は順に０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬであった。

【0060】

混合内部標準作動液の調製：濃度が１００μｇ／ｍＬのビタミンＫ１内部標準物質原液、濃度が１００μｇ／ｍＬのビタミンＫ２内部標準物質原液を取り出して混合させ、更に、９０％のメタノール水溶液を用いて２０ｎｇ／ｍＬに希釈し、混合内部標準作動液を得た。

【0061】

混合標準溶液の調製：上記９種の異なる濃度の標準混合中間液をそれぞれ２０μＬ取り出し、取り出した各濃度の標準混合中間液に１０μＬの混合内部標準作動液および７０μＬのメタノールをそれぞれ加えて混合させ、２５００ｒ／ｍｉｎで１ｍｉｎ渦巻いて均一に混合し、９種の異なる濃度の混合標準溶液を作成した。

【0062】

実施例３：検量線方程式をフィッティングした。
構築した２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて上記実施例１で得られた各濃度の混合標準溶液を検出し、９種の異なる濃度の混合標準溶液のグラフを得た。

【0063】

上記各濃度の混合標準溶液のグラフから、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラフピーク面積をそれぞれ得た。

【0064】

上記９種の異なる濃度の混合標準溶液中のビタミンＫ１のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラフピーク面積との比をそれぞれ検量線方程式ｑ１の縦軸ｙ１とし、ビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラフピーク面積との比を検量線方程式ｑ２の縦軸ｙ２とした。

【0065】

上記９種の異なる濃度の混合標準溶液中のビタミンＫ１の濃度とビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）の濃度との比を検量線方程式ｑ１の横軸ｘ１とし、ビタミンＫ２の濃度とビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）の濃度との比を検量線方程式ｑ２の横軸ｘ２とした。

【0066】

上記９種の異なる濃度のデータを線形回帰し、重み係数を１／（ｘ＾２）にフィッティングし、ビタミンＫ１に対応する検量線方程式ｑ１がｙ１＝ａ＊ｘ１＋ｂで、ビタミンＫ２に対応する検量線方程式ｑ２がｙ２＝ｃ＊ｘ２＋ｄであることを得て、ただし、ａ、ｃはそれぞれの検量線方程式の傾きであり、ただし、ｂ、ｄはそれぞれの検量線方程式の切片であった。

【0067】

なお、該検量線方程式および重み係数は、毎回の検出の前に再測定する必要があった。即ち、該実施例３は、しばらくの間に血液中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２を検出するために実行する必要があるステップであった。該しばらくの間は、一般的に混合標準溶液の有効時間帯内にあった。

【0068】

上記実施例における混合標準溶液中のビタミンＫ１のクロマトグラムは図１に示すとおりであり、混合標準溶液中のビタミンＫ２のクロマトグラムは図２に示すとおりであった。混合標準溶液中のビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラム図３に示すとおりであり、混合標準溶液中のビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラムは図４に示すとおりであった。

【0069】

ここで、混合標準溶液中のビタミンＫ１の保留時間は４．７００ｍｉｎであり、ビタミンＫ２の保留時間は３．６００ｍｉｎであった。

【0070】

混合標準溶液中のビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）の保留時間は４．７００ｍｉｎであり、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）の保留時間は３．６００ｍｉｎであった。

【0071】

実施例４：血清サンプルを処理した。
混合標準溶液中と同じ量の混合内部標準作動液を１０μＬ取り出し、取り出した混合内部標準作動液に２０μＬの血清サンプルを加え、更に２種の抽出剤である１００μＬのメタノールおよび１０００μＬのｎ－ヘキサンを加え、２５００ｒ／ｍｉｎの回転速度で１０ｍｉｎ渦巻いて振動混合させてから、１４０００ｒ／ｍｉｎの回転速度で１０ｍｉｎ高速遠心した。遠心後の９００μＬの上清を窒素ブローで乾燥し、１００μＬのメタノールを用いて再溶解させ、２５００ｒ／ｍｉｎの回転速度で１ｍｉｎ渦巻いて振動混合した後、分析サンプルを得た。

【0072】

実施例５：実施例３で与えられた検量線方程式および実施例４で得られた上清に基づき、微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0073】

構築した２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて実施例４で得られた上清を検出し、血清サンプルのグラフを得た。

【0074】

血清サンプルのグラフから、血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラフピーク面積、ビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積、ビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラフピーク面積、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラフピーク面積を得た。

【0075】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラフピーク面積との比をｙ１としてｙ１＝ａ＊ｘ１＋ｂに代入し、血清サンプル中のビタミンＫ１の濃度とビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）の濃度との比ｘ１を得て、ビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）の濃度が既知であるため、血清サンプル中のビタミンＫ１の濃度を計算することができた。

【0076】

同様に、血清サンプル中のビタミンＫ２のクロマトグラフピーク面積とビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラフピーク面積との比をｙ２としてｙ２＝ｃ＊ｘ２＋ｄに代入し、血清サンプル中のビタミンＫ２の濃度とビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）の濃度との比ｘ２を得て、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）の濃度が既知であるため、血清サンプル中のビタミンＫ２の濃度を計算することができた。

【0077】

該実施例において、液体クロマトグラフィー－質量分析装置の高速液体のクロマトグラフィー条件および質量分析装置の質量分析条件は上記実施例３で与えられたものと一致し、ここで説明を省略する。

【0078】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図５に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図６に示すとおりであり、血清サンプル中のビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）のクロマトグラム図７に示すとおりであり、血清サンプル中のビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）のクロマトグラム図８に示すとおりであった。

【0079】

ここで、血清サンプル中のビタミンＫ１の保留時間は４．７００ｍｉｎであり、ビタミンＫ２の保留時間は３．６００ｍｉｎであった。

【0080】

血清サンプル中のビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）の保留時間は４．７００ｍｉｎであり、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）の保留時間は３．６００ｍｉｎであった。

【0081】

混合標準溶液中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２の保留時間と血清サンプル中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２の保留時間との比較により見られるように、混合標準溶液中の目的物と血清サンプル中の対応する目的物の保留時間が一致し、且つ、ビタミンＫ１同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ１）、ビタミンＫ２同位体マーカー（Ｄ７－ビタミンＫ２）を内部標準物質とすることで、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２の識別をより正確にし、分析時間が短く、干渉が小さく、内部標準定量特異性が強く、正確度および感度が高い。

【0082】

なお、図１～図８の横軸はいずれも収集時間であり、縦軸はいすれもイオン信号強度である。

【0083】

実施例６：血清中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する方法の線形関係および定量限界
上記実施例２で調製した９種の濃度の混合標準溶液を実施例３に従って実行してクロマトグラムを得た。クロマトグラフピーク面積－濃度でプロットして検量線を得た結果、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の線形範囲は以下のとおりである。

【0084】

（１）線形範囲：
ビタミンＫ１は０．０５ｎｇ／ｍＬ～５００．００ｎｇ／ｍＬの範囲内にあり、線形が良好であり、相関係数Ｒ２＞０．９９であった。

【0085】

ビタミンＫ２は０．０５ｎｇ／ｍＬ～５００．００ｎｇ／ｍＬの範囲内にあり、線形が良好であり、相関係数Ｒ２＞０．９９であった。

【0086】

ボランティアの血清サンプルからビタミンＫ１およびビタミンＫ２の含有量が低いサンプルを選別し、生理食塩水を溶媒として希釈して異なる希釈割合の希釈後の一連の血清サンプルを得て、実施例４に従って前処理を行った後、実施例５に従ってサンプル注入して検出結果およびクロマトグラムを得て、目的物の信号対雑音比を３として検出限界（ＬＯＤ）を得て、目的物の信号対雑音比を１０として定量限界（ＬＯＱ）を取得した結果、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）は以下のとおりであった。

【0087】

（２）検出限界（ＬＯＤ）：
ビタミンＫ１：０．０１１ｎｇ／ｍＬ。

【0088】

ビタミンＫ２：０．０３７ｎｇ／ｍＬ。
（３）定量限界（ＬＯＱ）：
ビタミンＫ１：０．０１３ｎｇ／ｍＬ。

【0089】

ビタミンＫ２：０．０４３ｎｇ／ｍＬ。
実施例７：微量の血清中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出する方法の回収率および精密度
実施例２における任意の３種の混合標準溶液を取って高、中、低という３種の濃度に作成してサンプル追加回収率実験および精密度実験を行い、実施例２～５の処理方式および検出条件に従って検出し、３バッチを繰り返し分析して測定し、得られた血清中のビタミンＫ１、ビタミンＫ２の回収率および精密度の結果は以下の表２に示すとおりであった。

【0090】

【表2】

【0091】

上記検証試験をまとめ、本実施例の平均回収率、検出限界および精密度等の各項目の技術指標はいずれも要求に合致し、本願の微量の血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出する方法は感度が高く、特異性が強く、再現性が良く、正確度が高いことが見られる。

【0092】

実施例８：１次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて血清中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0093】

実施例１～５の内容を繰り返し、その区別は、２次元液体クロマトグラフィーを１次元液体クロマトグラフィーに置き換えることのみであり、ここで、カラムはＫｉｎｅｔｅｘ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであり、他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0094】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラムは図９に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図１０に示すとおりであり、図から分かるように、安定したベースラインおよび良好な分離が得られなかった。

【0095】

実施例９：１次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて血清中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0096】

実施例１～５の内容を繰り返し、その区別は、２次元液体クロマトグラフィーを１次元液体クロマトグラフィーに置き換えることのみであり、ここで、カラムはＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであり、他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0097】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図１１に示すように、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図１２に示すように、図から分かるように、安定したベースラインおよび良好な分離が得られなかった。

【0098】

実施例１０：１次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置を用いて血清中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0099】

実施例１～５の内容を繰り返し、その区別は、２次元液体クロマトグラフィーを１次元液体クロマトグラフィーに置き換えることのみであり、ここで、カラムはＫｉｎｅｔｅｘ Ｆ５ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであり、他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0100】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図１３に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図１４に示すとおりであり、図から分かるように、安定したベースラインおよび良好な分離が得られなかった。

【0101】

以上をまとめ、保留能力では、実施例９＞実施例８＞実施例１０であるが、血清サンプル中のＶＫ１およびＶＫ２の検出に１次元液体クロマトグラフィーの３種のカラムを使用しても、安定したベースラインおよび良好な分離はいずれも得られなかった。

【0102】

実施例１１：２次元液体クロマトグラフィー－質量分析装置における１次元カラムおよび２次元カラムの選択について検討した。

【0103】

（１）実施例１～５の内容を繰り返し、区別は、第１次元カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであり、第２次元カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであることのみであった。他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0104】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図１５に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図１６に示すとおりであり、図から分かるように、該カラムの組み合わせ方式で、安定したベースラインおよび良好な分離が得られた。

【0105】

（２）と（１）の区別は、２種のカラムの順序を入れ替えることのみであり、即ち、第１次元カラムはＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍで、第２次元カラムはＫｉｎｅｔｅｘ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであった。他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0106】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図１７に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図１８に示すとおりであり、図から分かるように、該カラムの組み合わせ方式のターゲットピーク前の不純物が多くとなり、クロマトグラフィーピーク前のベースラインの持ち上げは検出に影響を与えてしまった。

【0107】

以上をまとめ、本願に係る検出方法におけるカラムの順序は検出に重要な作用を果たす。

【0108】

（３）実施例１～５の内容を繰り返し、区別は、第１次元カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｆ５ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍで、第２次元カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであることのみであった。他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0109】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図１９に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図２０に示すとおりであり、図から分かるように、該カラムの組み合わせ方式で、安定したベースラインおよび良好な不純物分離が得られなかった。

【0110】

（４）実施例１～５の内容を繰り返し、区別は、第１次元カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍで、第２次元カラムがＫｉｎｅｔｅｘ Ｆ５ ２．６μｍ １００＊４．６ｍｍであることのみであった。他の前処理条件および検出条件はいずれも変わらなかった。微量の血清サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を検出した。

【0111】

血清サンプル中のビタミンＫ１のクロマトグラム図２１に示すとおりであり、血清サンプル中ビタミンＫ２のクロマトグラム図２２に示すとおりであり、図から分かるように、該カラムの組み合わせ方式で、安定したベースラインおよび良好な不純物分離が得られなかった。

【0112】

以上をまとめ、フェニルヘキシルカラムを第１次元カラムとして選択し、Ｃ１８カラムを第２次元カラムとして選択するように特定するのみで、血液中の内因性不純物の分離を最適に実現することができることが分かった。

【0113】

上記実施例の試験結果により、以下のことが分かった。
（１）本願は、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を構築し、２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用いて血液中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２を同時に検出することを実現し、微量の血液サンプルの検出に特に適用される。ここで、血液サンプルは血清、血漿、全血を含む。サンプル使用量は２０～２００μＬである。

【0114】

（２）本願において、ビタミンＫ１およびビタミンＫ２の検出は、１対の定量イオンおよび定性イオンを提供するとともに、内部標準としてビタミンＫ１およびビタミンＫ２の同位体マーカーを使用することにより、血液サンプル中のビタミンＫ１およびビタミンＫ２の識別および定量をより正確にする。

【0115】

（３）本願において、血液サンプルの前処理が簡単で、サンプル追加、サンプリング、均一混合、遠心、窒素ブロー、再溶解等の簡単なステップのみであり、生産中に自動化操作を実現しやすく、バッチサンプル分析時に前処理時間を大きく減少して検出効率を向上させることができる。

【0116】

（４）本願において、５．５ｍｉｎ内に単一のサンプルのビタミンＫ１およびビタミンＫ２の検出を完了することができ、構築した２次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置で分析することにより、分析が速く、感度が高いことを実に達成する。

【0117】

なお、本発明において、第１および第２等のような関係用語は、１つのエンティティまたは操作を別のエンティティまたは操作と区別するためのみに使用され、これらのエンティティまたは操作の間には、任意のこのような実際の関係または順序が存在することを要求または暗示するとは限らない。更に、「備える」、「含む」という用語、もしくはこれらの他の任意の変化形は、非排他的な包含を網羅することが意図され、それにより、一連の要素を含むプロセス、方法、物品または装置は、それらの要素を含むだけでなく、更に、明確に記載されていない他の要素も含み、または、このようなプロセス、方法、物品または装置のために固有する要素を更に含む。それ以上の制限がない場合、「１つの……を含む」という文で限定される要素は、前記要素を含むプロセス、方法、物品または装置に別の同じ要素が更に存在することを排除しない。

【0118】

最後に、上記は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明の技術案を説明するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。本発明の保護範囲は特許請求の範囲により限定される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【国際調査報告】