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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-20
(54)【発明の名称】改変カプシドタンパク質を備えるウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20230113BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230113BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230113BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20230113BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230113BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230113BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20230113BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230113BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230113BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230113BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230113BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230113BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230113BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230113BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20230113BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230113BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230113BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/11 Z
C12N15/34
C12N7/01
A61K35/761
A61P33/00
A61P31/12
A61P31/04
A61P35/00
A61P37/02
A61P37/04
A61P31/14
A61K47/64
A61K39/02
A61K39/00 H
A61K39/00 Z
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525775
(86)(22)【出願日】2020-11-02
(85)【翻訳文提出日】2022-06-29
(86)【国際出願番号】 GB2020052774
(87)【国際公開番号】W WO2021084282
(87)【国際公開日】2021-05-06
(31)【優先権主張番号】1915905.2
(32)【優先日】2019-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520429679
【氏名又は名称】スパイバイオテック・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ディックス，マシュー
(72)【発明者】
【氏名】ハワース，マーク
(72)【発明者】
【氏名】ビスワス，スミ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA45
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59Q
4C076FF65
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB07
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB33
4C084ZB35
4C084ZB37
4C085AA03
4C085BA01
4C085BB01
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB33
4C087ZB35
4C087ZB37
(57)【要約】
本発明は、改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターを含む調製物に関する。これらの改変カプシドタンパク質は、アデノウイルスベクターのカスタマイズ化可能な装飾が実施されることを可能にし、その結果、個別化されたがんワクチンから標的化遺伝子治療ベクターまでの多様な適用物、およびそれらの混合物を可能にする。具体的には、改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターは、ヘキソンカプシドタンパク質および／またはｐＩＸカプシドタンパク質において改変され得る。本発明はペプチドペアを使用して、装飾の準備ができている「プライムされた」アデノウイルスを提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カプシドタンパク質中に少なくとも１つの改変を含む、予防的または治療的組成物の調製のためのアデノウイルスベクターであって、前記改変はカプシドタンパク質中に第１のペプチドパートナーの包含を含み、前記第１のペプチドは、第２のペプチドパートナーと共有結合を形成することができる、
アデノウイルスベクター。
【請求項2】
前記第２のペプチドパートナーは、実体に、必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）抗原、ターゲティング部分または遮蔽実体に付着されている、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項3】
カプシドタンパク質中の少なくとも１つの改変はメジャーカプシドタンパク質中にまたはマイナーカプシドタンパク質中にある、請求項１または請求項２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項4】
メジャーカプシドタンパク質中の少なくとも１つの改変は、ヘキソンタンパク質中に、必要に応じてＨＶＲループ中にある、請求項１から３のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項5】
マイナーカプシドタンパク質中の少なくとも１つの改変はｐＩＸタンパク質中にある、請求項１から３のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項6】
カプシドタンパク質への少なくとも１つの改変は、カプシドタンパク質への前記第１のペプチドパートナーの挿入または融合である、請求項１から５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項7】
前記共有結合はイソペプチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項8】
第１のペプチドパートナーはＤｏｇＴａｇであり、第２のペプチドパートナーはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒもしくはＳｎｏｏｐＴａｇである、請求項４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項9】
ａ）第１のペプチドパートナーはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、必要に応じて第２のペプチドパートナーはＳｐｙＴａｇである；ｂ）第１のペプチドパートナーはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒであり、必要に応じて第２のペプチドパートナーはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇである；
ｃ）第１のペプチドパートナーはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒであり、必要に応じて第２のペプチドパートナーはＤｏｇＴａｇである；
ｃ）第１のペプチドパートナーはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒであり、必要に応じて第２のペプチドパートナーはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒである；または
ｄ）第１のペプチドパートナーはＳｐｙＴａｇであり、必要に応じて第２のペプチドパートナーはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、
請求項５に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項10】
第２のペプチドは、遺伝子融合を介して抗原に付着されているか、または抗原に化学的に付着されている、請求項２から９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項11】
前記抗原は、ネオエピトープまたはネオアンチゲンなどの腫瘍関連抗原、自己抗原、またはウイルス、細菌、寄生虫もしくは真菌などの病原体由来の抗原であり、必要に応じて、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、
請求項１０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項12】
実体に付着された前記第２のペプチドパートナーのサイズが、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａまたは１００ｋＤａを超えるサイズである、先行請求項のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項13】
実体に付着された前記第２のペプチドパートナーは、カプシドに結合する抗体からアデノウイルスを遮蔽する、請求項１２に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項14】
抗原に付着された第２のペプチドパートナーの前記アデノウイルスベクターへの付加を含む、ワクチンの製造に使用するための先行請求項のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項15】
抗原が第２のペプチドパートナーを介してアデノウイルスベクターに付着されている、先行請求項のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含むワクチン。
【請求項16】
前記抗原は、腫瘍もしくはがん細胞、またはウイルス、必要に応じてＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２上で特異的に発現される少なくとも１つの抗原を含む、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項17】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを生成する方法であって、－ 第１のペプチドパートナーをコードする核酸を、カプシドタンパク質をコードする核酸へと導入するステップと；
－ 改変カプシド遺伝子を適当なアデノウイルスのゲノムへと挿入するステップと；
－ 細胞に前記アデノウイルスを感染させるステップおよび放出された子孫ウイルスを収集するステップと、
を含む方法。
【請求項18】
疾患の処置または予防に使用するための、請求項１５または１６に記載のアデノウイルスベクターおよび付着された抗原を含むワクチン。
【請求項19】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含むキット。
【請求項20】
請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含むワクチンであって、ａ．前記第１のペプチドパートナーは、ｐＩＸカプシドタンパク質に融合されているＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、前記第２のペプチドパートナーは、抗原に付着されているＳｐｙＴａｇであり、ここで、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇはイソペプチド結合を通して共有結合されている；
ｂ．前記第１のペプチドパートナーは、ｐＩＸカプシドタンパク質に融合されているＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒであり、前記第２のペプチドパートナーは、抗原に付着されているＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇであり、ここで、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇは、イソペプチド結合を通して共有結合されている；または
ｃ．前記第１のペプチドパートナーは、ｐＩＸカプシドタンパク質に融合されているＤｏｇＣａｔｃｈｅｒであり、前記第２のペプチドパートナーは、抗原に付着されているＤｏｇＴａｇであり、ここで、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとＤｏｇＴａｇはイソペプチド結合を通して共有結合されている；または
ｄ．前記第１のペプチドパートナーは、ｐＩＸカプシドタンパク質に融合されているＳｎｏｏｐＴａｇＪｒであり、前記第２のペプチドパートナーは、抗原に付着されているＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒであり、ここでＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＳｎｏｏｐＣａｃｔｅｒはイソペプチド結合を通して共有結合されている；
ｅ．前記第１のペプチドパートナーは、ｐＩＸカプシドタンパク質に融合されているＳｐｙＴａｇであり、前記第２のペプチドパートナーは、抗原に付着されているＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、ここで、ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｃｔｅｒはイソペプチド結合を通して共有結合されている、
ワクチン。
【請求項21】
前記第１のペプチドパートナーは、ヘキソンタンパク質のＨＶＲループへと挿入されているＤｏｇＴａｇであり、前記第２のペプチドパートナーは、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒであり、前記第２のペプチドパートナーは抗原に付着されており、ここで、ＤｏｇＴａｇとＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒはイソペプチド結合を通して共有結合されている、請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含むワクチン。
【請求項22】
前記第２のペプチドパートナーは遮蔽実体またはターゲティング部分に付着されている、請求項１に記載のアデノウイルスベクターを含む腫瘍溶解性ウイルス調製物。
【請求項23】
前記アデノウイルスは、任意の血清型または種、必要に応じてヒトアデノウイルスである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項24】
前記アデノウイルスは複製可能であり、必要に応じて選択的細胞においてのみ複製するように改変されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項25】
前記アデノウイルスは複製不全である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項26】
前記アデノウイルスは、導入遺伝子をコードするように遺伝子修飾されており、必要に応じてイソペプチドリンケージを介して表面装飾されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項27】
改変カプシドタンパク質を介するイソペプチドリンケージを介する表面装飾が可能なアデノウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターを含む調製物に関する。本発明の改変カプシドタンパク質は、アデノウイルスベクターのカスタマイズ化可能な装飾が実施されることを可能にし、その結果、個別化されたがんワクチンから標的化遺伝子治療ベクターまでの多様な適用物、およびそれらの混合物を可能にする。
【0002】
具体的には、改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターは、ヘキソンカプシドタンパク質および／またはｐＩＸカプシドタンパク質において改変され得る。
さらに、本発明のアデノウイルスベクターは、先行技術のベクターよりも、中和抗体によるクリアランスの影響を受けにくい。したがって、有利には、本発明の改変アデノウイルスベクターは、宿主の免疫応答を逃れることができる。
さらに、本発明のアデノウイルスベクターは、先行技術のベクターよりも、中和抗体によるクリアランスの影響を受けにくい。したがって、有利には、本発明の改変アデノウイルスベクターは、宿主の免疫応答を逃れることができる。
【0003】
本発明の好ましい態様は、ワクチンの調製において改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターを使用することである。こういったワクチンは予防的であっても治療的であってもよい。本発明のこの態様では、改変カプシドタンパク質は、抗原のモジュール式共有結合提示を可能にし、それにより前記抗原への免疫応答を誘導するとともに、それらを含む組成物を可能にする。具体的には、上記態様は、疾患と闘うために、個別化されたワクチン療法の迅速なアセンブリを可能にする改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターに関する。本発明者らは、アデノウイルスベクターを使用する抗原の提示が、抗原への免疫応答を向上させることを示した。
【0004】
本発明の他の態様は、腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子治療ベクターおよび／またはアデノウイルス向性のリターゲティング（ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）の調製における、改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターの使用を含む。
【0005】
本発明のさらに別の態様は、がん抗原を発現する腫瘍溶解性ウイルスなどのいくつかの治療用途を同時に可能にするために、様々なタイプの改変の組み合わせを可能にする。
【背景技術】
【0006】
アデノウイルス（Ａｄ）は、線状二重鎖ゲノムを取り囲む正二十面体タンパク質カプシドを有する。脂質エンベロープは存在しない。カプシドは、構造タンパク質であるヘキソン、ファイバー、ペントン、ＩＩＩａ、ＶＩＩＩおよびＩＸを含む。ファイバーカプシドタンパク質は、ノブドメインを介して宿主細胞への付着を助けると考えられる。Ａｄは、宿主細胞の複製機構を使用して複製することができるようになるために、宿主感染に依存する。７つの「種」Ａ～Ｇに分類され得る、ヒトアデノウイルスの少なくとも５７の血清型、Ａｄ１～５７がある。同様に、イヌやウマのＡｄなどの、動物のＡｄも存在し、また種々の血清型および「種」へと分類可能である。血清型は一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の感染を中和する抗血清の能力によって定義される。これらのウイルスは、よく研究および理解されており、高力価で増殖させることができ、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができ、エピソームとして宿主細胞に維持することができる。こういった特徴はＡｄを良好な治療上の選択肢とするが、なぜなら、ほぼすべての試験がＡｄは安全で忍容性が高いことを示したからである。
【0007】
正二十面体カプシドはいくつかのタンパク質から構成される。ヘキソンは、ウイルスカプシドの２０の三角形状面を形成する主たるタンパク質である。ヘキソンタンパク質は三量体を形成し、各三量体は他の６つの三量体と相互作用する。１２の頂点は、ペントンカプソメアによって形成されており、３つのファイバータンパク質と５つのペントンタンパク質の複合体である。長いファイバーは、各頂点から伸長し、末端でノブを形成する同一の３つの鎖から構成される。カプシドはまた、マイナータンパク質も含み、そのなかでもとりわけｐＩＩＩａ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩＩおよびｐＩＸを含む。これらマイナーカプシドタンパク質は、カプシドの内面または外面に位置することができるとともに、構造的な機能を超えてさらなる機能を有することができる。例として、ｐＶＩはヘキソンタンパク質の核内移行を容易にする可能性があり、ｐＩＸはカプシドへのＤＮＡパッケージングおよび転写活性化に関与する可能性がある。
【0008】
Ａｄは、さらなる遺伝子配列の包含に関するその能力に起因して、遺伝子治療向けに、特に遺伝子送達ベクターとしてよく使用される。２，０００を超える遺伝子治療試験がＡｄを使用して実行されてきた。アデノウイルスベクターは、これらが運搬する導入遺伝子の宿主核への伝達を可能にするが、ウイルスＤＮＡを宿主染色体へと組み込まない。遺伝子治療ベクターとして使用する場合のＡｄのインサートサイズは大きく、この場合、８～３６ｋｂの容量が可能である。
【0009】
腫瘍溶解性アデノウイルスが、がんでの、とりわけ頭頸部がんの処置に使用するために調べられている。腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染しかつこれを殺滅するが、腫瘍溶解のプロセスは、新しい感染性アデノウイルスビリオンを放出するとともに宿主の免疫系を動員して抗がん応答を高める。腫瘍溶解性アデノウイルスのがん細胞へのターゲティングを確保するために種々の手段が使用されてきたが、これには、カプシドタンパク質への抗体を始めとした融合タンパク質などのアダプター分子の使用、ウイルスカプシドタンパク質を直接改変すること、または転写ターゲティング（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を使用することが含まれる。
【0010】
加えて、Ａｄは、強力な抗原特異的Ｂ細胞免疫応答およびＴ細胞免疫応答を誘導する能力を有し、自然免疫応答と適応免疫応答の両方を誘導する能力があるので、有望なワクチン送達媒体として浮上してきた。アデノウイルスベクターは免疫原性が高く、抗原を送達する上で効率的である。しかし、この可能性はまだ完全には実現されていない。アデノウイルスベクターベースのいくつかのワクチン候補が開発され、治験でさらに追求されたが、これらは成功しなかった。メルクによってＨＩＶ－１に対して開発された、ヒト血清型５（ＡｄＨｕ５）ベースのワクチンのアデノウイルスは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導したが、ＨＩＶ感染を防止することに失敗した。
【0011】
ヒトおよび動物の治療におけるアデノウイルスベースのベクターの成功に対する主たる障害とは、ウイルス特異的抗体による中和である。アデノウイルスによる自然感染は、ヒトおよび動物の集団において高く、したがって、適応免疫系は、中和抗体（ＮＡＢ）の分泌によって、アデノウイルスベクターの存在を認識しかつこれに応答することができる。同様に、自然免疫系もアデノウイルスベクターへの応答の補助の一因であり得る。例えば、成人人口の５０％～９０％がＡｄＨｕ５に対する既存の免疫を有すると推定される。かかる応答は、所望の効果が見られる前に、治療用アデノウイルスベクターを排除することができる。この問題を解決することは、アデノウイルス治療用ベクターがより日常的に使用されることを可能にすると思われる。
【0012】
アデノウイルスベクターの使用において宿主の免疫応答を逃れるために種々のアプローチが取られてきた。一アプローチは、「キメラ」を生成するように、ＡｄＨｕ５の超可変領域（ＨＶＲ）を別のアデノウイルス血清型由来の超可変領域と交換することであった。このことは、キメラがＡｄＨｕ５中和抗体を回避することを可能にすることができるが、別の血清型に対する中和抗体の非存在下のみで有効になる。免疫応答を逃れるための改善された手段が望ましい。
【0013】
Ａｄは、アデノウイルスゲノム内に宿主細胞内で発現される抗原の遺伝子配列を含めることにより、ワクチンとして、主にＤＮＡワクチンの送達ベクターとして使用されてきた。ワクチン組成物としてＡｄを使用することに関する別の方法として、抗原を提示するアデノウイルス粒子自体の使用が挙げられる。このアプローチは、遺伝子融合の使用、カプシドタンパク質に結合する改変抗体の使用、クリックケミストリーなどの装飾の性質に応じて、様々な度合いで成功してきた。免疫原性ペプチドをカプシドに組み込むことは、天然のカプシドタンパク質によって生成される応答と同様な、強力な液性応答を誘導する能力などの潜在的利点を提供する。
【0014】
一アプローチは、ウイルス表面での提示のための免疫原性ペプチドを含むようにアデノウイルスカプシドタンパク質を改変することである。「抗原カプシド組込み（ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｐｓｉｄ－ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）」戦略に対する主たる障害とは、抗原カプシド組込み戦略は、カプシドタンパク質の自然な折り畳みを妨害することも、カプシドタンパク質を一緒に保持する相互作用に影響を及ぼすこともあってはならないので、抗原カプシド組込み戦略が挿入のサイズに課す制限である。さらに、カプシドタンパク質内で抗原を直接コードすることの一欠点とは、個々の抗原それぞれごとにワクチンを最適化するのに必要とされる時間と作業の量である。カプシドタンパク質内への挿入の最適化が不要である、所望の任意の抗原の付着の準備ができた改変カプシドタンパク質を備えるアデノウイルスベクターを製剤化することが望ましいと思われる。かかる「プライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）」アデノウイルスワクチン組成物は、個別化されたワクチンの調製に関して言えば、特に有用であると思われ、この場合、ワクチンは、まさに一個体のためにオーダーメードの様式で調製される。後者は、個別化されたがんワクチンに当てはまる場合もあり、または特定の薬剤耐性微生物感染等への免疫応答を高めるのに当てはまる場合もある。
【0015】
実際、ウイルスの中和による、治療用送達媒体としてアデノウイルスを開発することに関する目下の難題、および最も豊富なカプシドタンパク質であるヘキソンを含むカプシドタンパク質の一部へと１００個よりも長いアミノ酸の配列を含めることができないことを考慮すると、アデノウイルスベクターの明らかな効果の活用を可能にし、治療薬の個別化を可能にするとともにまたベクターの免疫クリアランスを減少させることにもなるアプローチを開発する差し迫った必要性が依然としてある。抗原、免疫原性ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、抗体、ターゲティング分子、細胞表面マーカー、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質等などの実体（entity）による装飾を受け入れる準備ができている改変カプシドタンパク質を有する「プライムされた」アデノウイルスベクターを調製することが望ましいと思われる。「プライムされた」アデノウイルスの生成は、カプシドタンパク質の改変がすでに完了されており、この改変は達成される可能性のあるウイルスカプシドの装飾への制限を減少させることから、労力を要する試行錯誤なしに個別化された治療薬の調製を可能にすることができる。
【0016】
アデノウイルスカプシドタンパク質はこれまで改変されてきた；最も通例には、その作業は、ウイルスベースのベクターの中和に打ち勝つことではなく、ウイルスベクターの自然な向性を変更することである。向性を変更すること、すなわち、ウイルスの増殖をサポートする宿主の特定の細胞および／または組織を変更することが、ウイルスベクターが特定の適応症向けに標的である特定の細胞タイプに送り込まれ得るように行われる。例えば、遺伝子治療アデノウイルスベクターは、網膜細胞のみに方向付けられることを望むなら、適宜に向性は変更され得る。特にワクチンの用途の場合、ウイルスの自然な向性はあまり重要ではない可能性がある、なぜなら、特定の任意の細胞タイプに感染することではなくウイルスが提示している抗原への免疫応答を誘導することが、ウイルスワクチンベクターの目的であるからである。
【発明の概要】
【0017】
本発明は、装飾の付加の準備ができたベクターを調製するために、ペプチド挿入などの改変をアデノウイルスカプシドタンパク質へと組み込むことに関する。こういった挿入は、サイズが制限されていないモジュール式アセンブリおよびアデノウイルスの表面での外来性実体の提示を可能にする。本発明はまた、調製物の最少量をもって、ワクチン、例えば、個別化されたがんワクチンまたは腫瘍溶解性ウイルスなどのオーダーメードの治療法の調製を可能にする。本明細書に記載のウイルスベクターは柔軟なプラットフォームであり、その結果、同じベクターを使用して多数の様々な治療薬の調製を可能にする。このことは、ウイルスの表面に複数のペプチドパートナーおよびタンパク質パートナーのモジュール式共有結合提示を使用して、初めて実証された新規の技術である。アデノウイルスベクターは、本発明者らによって提案された技術をこれまで使用して首尾よく改変されることはなかった。
【0018】
本発明は、当技術分野にわたって著しい改善を提供する。本発明者らが示すところは、本発明の技術は、中和抗体の影響からアデノウイルスを効果的に遮蔽するタンパク質パートナーペアを通して、カプシドタンパク質への実体の付着を可能にすることである。このような改善は、抗原の付着をもって本明細書で実証されるが、実際には、この遮蔽する効果または遮断する効果を得るように、任意の実体が付着されることがあり得る。とりわけ、本発明者らは、本技術を使用して付加された実体の一部のサイズが大きいにもかかわらず、アデノウイルスの感染力が保持されることに、特に満足する。したがって、本技術は、単にカプシドタンパク質を改変することおよび遮蔽実体（shielding entity）を付加することによって、目下の遺伝子治療ベクターまたは腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを改善するために、使用されることがあり得る。
【0019】
ワクチン調製物に関連して、本発明は、提示された抗原に対して免疫応答が生成されることを可能にする。有利には、初めて、本発明者らが実証するところは、強力な中和モノクローナル抗体によるウイルスの中和を遮断するという有利な効果を有するより大きな抗原性タンパク質を用いて、ウイルスの表面が装飾され得るということである。したがって、ウイルスワクチンベクターは、様々な抗原タイプに使用され得るだけではなく、抗原が十分に大きい場合、提示される抗原は、ウイルスワクチンベクターを宿主抗体による中和から保護することもできる。このことは、ウイルスワクチンベクターがより長く持続して免疫応答を誘導することができることを確保することになるとともに、このことは、ベクターの中和に伴う有効性の減少無しで、同じベクターが多重免疫に使用されることを可能にすることもできるであろう。
【0020】
細菌由来の付着タンパク質に基づいた、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびＳｐｙＴａｇ（ＷＯ２０１１／０９８７７２）などのペプチド結合ペアの使用が、組換えタンパク質等を不可逆的にコンジュゲートする技術として確立されてきた。タンパク質間の遺伝子融合を通して達成するのは不可能であると思われる実体間のバイオコンジュゲーションが、ペプチド結合ペアを使用して機能することができる。種々のＣａｔｃｈｅｒとＴａｇのペアが現在利用可能であり、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇの改変に基づいているものもあれば、代替細菌タンパク質からの同様の物質に基づいているものもある。
【0021】
アデノウイルスに関連して、本発明者らは、特に抗原のための付着手段の手立てに関連して、アデノウイルスカプシドタンパク質内へのペプチドペアの包含が、想定されるようにルーチンではないことまたは簡単ではないことを見いだした。実際、本発明者らによる研究が示したところは、最もよく利用されるペプチドペア、この場合、ヘキソンカプシドタンパク質へのＳｐｙＴａｇの挿入は、機能性アデノウイルスベクター（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの効果的なカップリングを可能にし、細胞に感染することができるベクター）の形成を可能にしなかったことである。実際、ＳｐｙＴａｇが挿入後に反応性不良であったことを示すデータが、改変アデノウイルスの感染力の欠落に関するデータと一緒に、実施例に含まれる。したがって、ペプチドペアリングと、カプシドタンパク質へと挿入されたペプチドパートナーを介する改変カプシドタンパク質への実体の付着とを受け入れる準備ができている改変アデノウイルスベクターに関連して機能するシステムを開発する上で、多大な研究が費やされてきた。
【0022】
発明の概要
本発明の第１の態様によれば、カプシドタンパク質中に少なくとも１つの改変を含む、予防的または治療的アデノウイルス組成物の調製のためのアデノウイルスベクターであって、前記改変はカプシドタンパク質中に第１のペプチドパートナーの包含を含み、前記第１のペプチドは、実体に付着され得る第２のペプチドパートナーと共有結合を形成することができる、アデノウイルスベクターが提供される。
本発明の第１の態様によれば、カプシドタンパク質中に少なくとも１つの改変を含む、予防的または治療的アデノウイルス組成物の調製のためのアデノウイルスベクターであって、前記改変はカプシドタンパク質中に第１のペプチドパートナーの包含を含み、前記第１のペプチドは、実体に付着され得る第２のペプチドパートナーと共有結合を形成することができる、アデノウイルスベクターが提供される。
【0023】
改変は、第１のペプチドパートナーとの融合であっても、第１のペプチドパートナーのカプシドタンパク質への挿入であってもよい。
カプシドタンパク質は、いずれのカプシドタンパク質であってもよいが、ヘキソンタンパク質またはｐＩＸタンパク質であることが好ましい。
カプシドタンパク質は、いずれのカプシドタンパク質であってもよいが、ヘキソンタンパク質またはｐＩＸタンパク質であることが好ましい。
【0024】
第１のペプチドパートナーおよび第２のペプチドパートナーは、ペプチドパートナーペアを形成し、これは、イソペプチド結合またはエステル結合、好ましくはイソペプチド結合によって共有結合で連結され得る。
【0025】
一態様では、第１のペプチドパートナーは「タグ」パートナーであり、これは、「キャッチャー」である第２のペプチドパートナーにイソペプチド結合またはエステル結合によって共有結合で連結され得る。この態様では、カプシドタンパク質は、ヘキソンタンパク質であることが好ましい。したがって、ヘキソンを改変する第１のペプチドパートナーまたは「タグ」は、ＤｏｇＴａｇ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ、ＳｄｙＴａｇ、ＰｓＣｓＴａｇまたはＪｏであることが好ましい。第１のペプチドパートナーまたはタグはＳｐｙＴａｇではないことが好ましい。この実施形態では、ＳｐｙＴａｇは、ヘキソンタンパク質へのその挿入過程では未改変である。
【0026】
代替の態様では、第１のペプチドパートナーは「キャッチャー」パートナーであり、これは、「タグ」である第２のペプチドパートナーにイソペプチド結合またはエステル結合によって共有結合で連結され得る。この態様では、カプシドタンパク質はヘキソンタンパク質であることが好ましい。したがって、ヘキソンを改変する第１のペプチドパートナーまたは「キャッチャー」は、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、Ｐｉｌｉｎ－Ｃ、Ｐｉｌｉｎ－Ｎ、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒまたはＩｎとすることができる。
【0027】
一態様では、第１のペプチドパートナーは「キャッチャー」パートナーであり、これは、「タグ」である第２のペプチドパートナーにイソペプチド結合またはエステル結合によって共有結合で連結され得る。この態様では、カプシドタンパク質はｐＩＸタンパク質であることが好ましい。したがって、ｐＩＸを改変する第１のペプチドパートナーまたは「キャッチャー」は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、Ｐｉｌｉｎ－Ｃ、Ｐｉｌｉｎ－Ｎ、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒまたはＩｎであることが好ましい。
【0028】
代替の態様では、第１のペプチドパートナーは「タグ」パートナーであり、これは、「キャッチャー」である第２のペプチドパートナーにイソペプチド結合またはエステル結合によって共有結合で連結され得る。この態様では、カプシドタンパク質はｐＩＸタンパク質であることが好ましい。したがって、ｐＩＸタンパク質を改変する第１のペプチドパートナーまたは「タグ」は、ＳｐｙＴａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、ＤｏｇＴａｇ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ、ＳｄｙＴａｇ、ＰｓＣｓＴａｇまたはＪｏであることが好ましい。
【0029】
一態様では、第１のペプチドパートナーは、ヘキソンタンパク質へと挿入され得、必要に応じて（optionally）、ヘキソンタンパク質への挿入は、最大２００個、最大１５０個または最大１００個のアミノ酸の長さとすることができる。ヘキソンタンパク質への挿入は、適当な任意のポイントに、必要に応じて超可変ＨＶＲループのうちの任意の１つまたは複数中におけるものであってよい。ヘキソンタンパク質へと挿入された第１のペプチドパートナーは、ＤｏｇＴａｇとすることができる。ＤｏｇＴａｇは、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとの自発性の共有結合、または触媒であるＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを必要とする反応中にＳｎｏｏｐＴａｇＪｒもしくはＳｎｏｏｐＴａｇとの共有結合を形成することができる。したがって、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒもしくはＳｎｏｏｐＴａｇは、第２のペプチドパートナーとすることができる。したがって、ＤｏｇＴａｇまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒは第２のペプチドパートナーとすることができる。第２のペプチドパートナーは、抗原などの実体に連結されるかまたは付着されている。本発明者らにとって驚くべきことは、上記のように、ＳｐｙＴａｇの挿入が失敗であった後、ＤｏｇＴａｇをヘキソンカプシドタンパク質へと挿入して、タンパク質パートナーのカプシド提示のための機能性アデノウイルスベクターを形成することができたことである。実施例が示すように、ヘキソンへのＤｏｇＴａｇの挿入およびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとのペアリングは、カップリング後に、試験された細胞においてその感染能力を改変アデノウイルスが保持することを可能にする。広範囲のＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの融合タンパク質は、一部は５０ｋＤａを超えるサイズ、効率的にカップリングされ、ウイルス感染力を減少させることなくアデノウイルス上で提示された。アデノウイルスベクターの治療用途が、例えば遺伝子治療のためにまたは腫瘍溶解性ウイルスとして、細胞移入を必要とする場合、感染力の保持は重要である。
【0030】
１００個未満のアミノ酸の長さである、ヘキソンタンパク質内に含まれ得る他の第１のペプチドパートナーとしては：
Ｐｉｌｉｎ－ＣとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ
Ｐｉｌｉｎ－ＮとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ
ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒとペアになるＳｄｙＴａｇ
ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒとペアになるＰｓＣｓＴａｇ
ＩｎとペアになるＪｏ、または
ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ（本明細書では「ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」とも表示される）とペアになるＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇ
が挙げられる。
Ｐｉｌｉｎ－ＣとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ
Ｐｉｌｉｎ－ＮとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ
ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒとペアになるＳｄｙＴａｇ
ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒとペアになるＰｓＣｓＴａｇ
ＩｎとペアになるＪｏ、または
ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ（本明細書では「ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」とも表示される）とペアになるＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇ
が挙げられる。
【0031】
ヘキソンタンパク質内に含まれる、あり得るペプチドパートナーのうち、包含はＳｐｙＴａｇの挿入ではないことが好ましい。この実施形態では、ＳｐｙＴａｇは、ヘキソンの種々のＨＶＲ内に挿入されたが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとペアを組むと、感染力を不満足なレベルまでに減少させることが見いだされた。したがって、ウイルスの適合性が損なわれた。
【0032】
別の態様では、第１のペプチドパートナーは、必要に応じてＮ末端またはＣ末端で、好ましくはＣ末端で、ｐＩＸカプシドタンパク質に融合され得る。ｐＩＸカプシドタンパク質に融合された第１のペプチドパートナーは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとすることができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、第２のペプチドパートナーをここでは形成するＳｐｙＴａｇと共有結合を形成することができるので、その結果、抗原に付着され得る。ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒは、ＳｎｏｏｐＴａｇまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒのいずれかと共有結合を形成することができ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒはＤｏｇＴａｇと共有結合を形成することができ、第１のまたは第２のペプチドパートナーとしていずれかの方向性で結合ペアとして使用され得る。第１のペプチドパートナーはまた、ＤｏｇＴａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇとすることができ、ここで、マッチングする第２のペプチドパートナーは、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＴａｇ、またはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒである。いずれかの方向性でｐＩＸとの融合に適することができる他のペプチドパートナーペアは：ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ／Ｐｉｌｉｎ－Ｃ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ／Ｐｉｌｉｎ－Ｎ、ＳｄｙＴａｇ／ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、ＰｓＣｓＴａｇ／ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒならびにＪｏ／Ｉｎである。
【0033】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのｐＩＸへの挿入は、感染力を保持しながら、ＨＣＭＶ五量体を含めて、ＳｐｙＴａｇコンジュゲート実体のカップリングを可能にすることが実証されてきた。
【0034】
ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのｐＩＸへの挿入が特に好ましい可能性があるが、なぜなら、これらは両方とも、良好なアデノウイルス生存可能性を有すると、本明細書において実証されたからである。これらの挿入はさらに、３継代培養を超えて遺伝的に安定である。
【0035】
本発明のいずれかの態様について本明細書で使用される場合、第１のペプチドパートナーとは、適当な条件下でイソペプチド結合またはエステル結合などの共有結合を形成することができるペプチドのペアの一部である。こういったペプチドは、タンパク質タグとキャッチャーのペア、またはタンパク質タグと結合パートナーのペアとしても知られる。第１のペプチドパートナーは、第１のペプチドタグであってもよく、または第１のペプチドキャッチャーであってもよい。各パートナーペアは、タグとキャッチャーを含むことができる。形成される共有結合は、自発的に反応することができる場合があり、またはリガーゼなどの第３の実体の補助を必要とする場合がある。適切なペプチドペアに関する詳細情報は、下に含まれる。
【0036】
前記アデノウイルスベクターは、ワクチンの調製に使用され得る。ワクチンは予防的であっても治療的であってもよい。したがって、本発明は、ワクチンを調製する方法までおよび、かつ本明細書に記載のアデノウイルスベクターの使用を含む。本発明の方法は、第２のペプチドパートナーを介するアデノウイルスベクターへの抗原の付着を含む。前記第２のペプチドパートナーは、抗原に付着されるとともに、好ましくは前記抗原に融合されるとともに、免疫原性アデノウイルスベクター上に存在する第１のペプチドパートナーと共有結合を形成することができる。共有結合、したがって付着は、自発的に起こる場合もあれば、リガーゼなどの結合を容易にするために第３の実体の使用を必要とする場合もある。したがって、抗原はペプチドパートナーペアの手段によってアデノウイルスに付着されており、このペアの第１のパートナーは改変カプシドタンパク質内に含まれる。
【0037】
本発明の別の態様では、カプシドタンパク質中に少なくとも１つの改変を含むアデノウイルスベクターを含むワクチン組成物が提供され、ここで、前記改変は第１のペプチドパートナーの包含を含み、前記第１のペプチドパートナーは、抗原に付着された第２のペプチドパートナーに共有結合されている。前記アデノウイルスベクターは、本明細書に広範に記載される通りである。
【0038】
本発明の別の態様では、ヘキソンカプシドタンパク質中の少なくとも１つの改変から構成される免疫原性アデノウイルスベクターが提供され、ここで、前記改変は：
ａ． 第１のペプチドパートナー；および
ｂ． 抗原に付着された第２のペプチドパートナー
を含み、ここで、
第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーが共有結合を介してカップリングされる。
ａ． 第１のペプチドパートナー；および
ｂ． 抗原に付着された第２のペプチドパートナー
を含み、ここで、
第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーが共有結合を介してカップリングされる。
【0039】
本発明のこの態様の一実施形態では、ヘキソンカプシドタンパク質へと挿入された第１のペプチドパートナーは、２００個未満のアミノ酸の長さ、１５０個未満のアミノ酸の長さ、１００個未満のアミノ酸の長さであり、必要に応じて、前記第１のペプチドパートナーはＤｏｇＴａｇである。ＤｏｇＴａｇが第１のペプチドパートナーである場合、第２のペプチドパートナーはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒもしくはＳｎｏｏｐＴａｇとすることができる。ＤｏｇＴａｇとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇとの間の共有結合の形成を補助するために、リガーゼが活用され得る。
【0040】
ヘキソンへと挿入された第１のペプチドパートナーはまた、ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、Ｐｉｌｉｎ－Ｃ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ、Ｐｉｌｉｎ－Ｎ、ＳｄｙＴａｇ、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、ＰｓＣｓＴａｇ、ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ、ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２、ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、Ｊｏ、またはＩｎのいずれか１つとすることができる。
【0041】
ＳｐｙＴａｇは、第２のペプチドパートナーとしてのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともに、ヘキソンタンパク質中の第１のペプチドパートナーとして使用されないことが好ましい。
本発明の別の態様では、ｐＩＸカプシドタンパク質中の少なくとも１つの改変から構成される免疫原性アデノウイルスベクターが提供され、ここで、前記改変は：
ａ． 第１のペプチドパートナー；および
ｂ． 抗原に付着された第２のペプチドパートナー
を含み、ここで、
第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーが共有結合を介してカップリングされる。
本発明の別の態様では、ｐＩＸカプシドタンパク質中の少なくとも１つの改変から構成される免疫原性アデノウイルスベクターが提供され、ここで、前記改変は：
ａ． 第１のペプチドパートナー；および
ｂ． 抗原に付着された第２のペプチドパートナー
を含み、ここで、
第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーが共有結合を介してカップリングされる。
【0042】
一態様によれば、第１のペプチドパートナーはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質とすることができる。このような場合、第２のペプチドパートナーはＳｐｙＴａｇとすることができる。これらのパートナーペア間に形成する共有結合は自発性であり、補助を必要としない。ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒは、第１のペプチドパートナーとして同等に活用される可能性があり、この場合、それらのパートナーペアはそれぞれＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＤｏｇＴａｇである。ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇまたはＳｐｙＴａｇは、第１のペプチドパートナーとして同等に活用される可能性があり、それらのパートナーペアはそれぞれＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。
【0043】
同等に、以下のペアのいずれか１つが活用される可能性がある：Ｐｉｌｉｎ－ＣとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ
Ｐｉｌｉｎ－ＮとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ
ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒとペアになるＳｄｙＴａｇ
ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒとペアになるＰｓＣｓＴａｇ
ＩｎとペアになるＪｏ、または
ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ（ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ）とペアになるＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇ。
Ｐｉｌｉｎ－ＮとペアになるＩｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ
ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒとペアになるＳｄｙＴａｇ
ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒとペアになるＰｓＣｓＴａｇ
ＩｎとペアになるＪｏ、または
ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ（ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ）とペアになるＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇ。
【0044】
本明細書に記載の第１のペプチドパートナーを備えるアデノウイルスカプシドタンパク質への改変のいずれもが、アデノウイルスベクターの構築物を可能にするが、これは効果的に、予防的または治療的組成物を製造するための実体の付加に関して、例えばワクチンを製造するための抗原の付加に関して、「プライムされた」アデノウイルスベクターである。あるいは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスへの宿主抗体の認識および結合を遮断することが唯一の目的である遮蔽実体の付着を受け入れるように、プライムされる。
【0045】
実体は次いで、当該実体に付着された第２のペプチドパートナーとアデノウイルスベクターを接触させることによって、付加され得るが、これは、アデノウイルスベクター上の第１のペプチドパートナーと自発性のまたは補助された共有結合を形成することができる。この技術を使用して、任意の実体も付加され得る。したがって、抗体もしくはその断片、細胞表面マーカー結合剤またはパートナーペアなどの、ターゲティング実体または部分が使用され得る。あるいは、実体は遮蔽実体とすることができる。これらは、無害な、非反応性のまたは無害なタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖ペプチド、リポペプチド、多糖または脂質とすることができ、これらの唯一の機能とは、アデノウイルスカプシドを宿主免疫細胞の結合から遮蔽することである。これに関連して、無害な、とは、ワクチン用の抗原またはターゲティング部分などのさらなる機能を有さない実体を意味する。遮蔽実体が行うのは、宿主抗体の結合を可能にしない物理的な遮蔽をカプシドに提供することだけである。それにもかかわらず、本発明者らは、かかる付着とともに感染力を保持することが可能であることを示してきたが、これは驚きである。この効果は、ウイルスカプシドの主成分であるヘキソンへの改変によって特に見られた。
【0046】
アデノウイルスベクターは、複数の実体を付着することによって装飾され得る。アデノウイルスベクターは、多重の実体を付着している可能性がある。各実体は、個別の機能を、例えば、抗原およびターゲティング部分を有することができる。複数の実体が、それぞれ１つずつ別の第２のペプチドパートナーに、付着され得る。このことは単一のアデノウイルスベクターへの、複数の実体の付着を可能にする。様々な実体は、同じ適応症（例えば、同じ疾患向けの様々な抗原）向けであっても、様々な適応症（例えば、単一のアデノウイルスベクター上のはしか、おたふく風邪および風疹などの様々な疾患向けの複合ワクチン組成物）向けであってもよい。
【0047】
全体として、アデノウイルスの自然の向性を変更していることは、ワクチンに関連する本発明の目的ではない。なぜなら、本発明は、特定の細胞タイプにベクターをリターゲットさせることよりもむしろ、提示された抗原に対して抗体またはＴ細胞を産生させることを意図しているからである。ファイバー成分は、向性の主たる決定因子であると考えられる。本発明者らがヘキソンタンパク質におけるＤｏｇＴａｇ改変を使用していくつかの実施例に関して見てきたところは、カプシドタンパク質への改変は特定の標的細胞に形質導入する能力にほとんどまたは全く影響を及ぼさないことである。実際、実施例では、ＤｏｇＴａｇがヘキソンへと挿入され、抗原上のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとペアを組んだ場合、ＨＥＫ２９３細胞において感染力の低下はなかった。しかし、場合によっては、本発明者らは、改変がＨＥＫ２９３細胞に感染するウイルスの能力に影響を及ぼし得ることを示したが、本明細書では、このことは、ヘキソンへと挿入され、抗原上のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとペアを組んだ場合、ＳｐｙＴａｇをもってして実証された。ＳｐｙＴａｇ－挿入アデノウイルスについては、感染力の、１００分の１への低下が見られた。これは望ましくないことであり意外なことである。実際、ＳｐｙＴａｇは最もよく使用されるペプチドタグであり、ほとんどの用途にあたり頻繁に好まれることを考慮すると、本発明者らの見解は、パートナーペアを使用するカプシドタンパク質の改変に対して、アデノウイルスが頑固であり得るというものであった。多大な研究を通して初めて、上記のことはすべてのパートナーペアについては成り立たないこと、および特にＤｏｇＴａｇがヘキソンタンパク質の実行可能な改変であることが理解された。
【0048】
本明細書に記載の改変アデノウイルスベクターは、野生型カプシドタンパク質、例えば野生型ヘキソンまたは野生型ｐＩＸのカプシドタンパク質を備えるベクターに匹敵する生産量をもって容易に生成されるように、注意深く設計されてきた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでアデノウイルスを作り出す方法は、組換え遺伝子をアデノウイルスへと導入する方法とともに、当業者によく知られる。
【0049】
ウイルスカプシドタンパク質への改変および／または挿入を実施することは困難であり、多くの場合ウイルスの機能および複製にとって破壊的であることが当分野で広く理解される。改変は、アセンブリ過程で、カプシドタンパク質の正しい折り畳みまたはビリオンのカプシド構造内でのその組込みを阻害することがあってはならない。特に抗原提示の場合、提示された抗原の立体構造および位置は免疫系による認識を可能にするとともに、感染性ウイルス粒子の場合、ウイルスベクターが細胞に感染する能力を妨げないように、改変が実施される必要がある。以前の研究は、これらの要件の複雑性を実証してきた。ヘキソンＨＶＲループに関連して、Ｍａｔｔｈｅｗｓらは、ベクターの生存可能性が挿入のサイズに左右されることおよびどのＨＶＲループが標的とされるかを示した。［Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＱＬ、ら Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ－ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｏｒ ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２００８年８月２１日；５：９８．ｄｏｉ：１０．１１８６］。同研究はまた、提示されたエピトープによる免疫認識も、挿入された抗原の性質および位置に左右されることを実証した。Ｇｕらにおけるなどの他の研究は、効率的なエピトープ提示を容易にするためのリンカー配列の性質および長さの重要性について明らかにした。［Ｌｉｎｌｉｎ Ｇｕ、ら、Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｖ３ ｌｏｏｐ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０ ｉｎ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ 「Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃａｐｓｉｄ－Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ」 ｓｔｒａｔｅｇｙ、Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２０１４年６月１６日；１１：１１２．ｄｏｉ：１０．１１８６］。本願では、本発明者らは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＡｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇベクターへのカップリングが効率的ではなく、ベクターの感染力を実質的に妨げ（図２）、一方で、Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒへのカップリングは高度に効率的であり、ベクターの感染力を妨げない（図３）ことを示すことによって、この現象を再び実証する。アデノウイルスヘキソン挿入に関連してＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒカップリングと比較したＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒカップリングの優れた効率と有用性は意外であったが、なぜなら、ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒカップリングは、多種多様な他の状況で高度に効率的であることが示されてきたからである。実際、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ技術を使用する５００を超える文書化された構築物がある。
【0050】
ｐＩＸ改変に関連して、研究により、ｐＩＸタンパク質はＣ末端への様々な異なる伸長に耐えることができることを実証されている。しかし、生存可能性、カプシドの安定性、および抗原提示の効率は、融合体の性質と長さに高度に左右される［Ｉｇｏｒ Ｐ．Ｄｍｉｔｒｉｅｖ、ら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＸ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２年７月；７６（１４）：６８９３～９］［Ｎａｄｉｎｅ Ｃ．Ｓａｌｉｓｃｈ、ら、Ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｐｓｉｄ－ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ３５ ｖｉａ ｐＩＸ ｆｕｓｉｏｎ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（３）：ｅ０１７４７２８］。
【0051】
本発明のいずれかの態様の一部の実施形態では、ウイルスのカプシドタンパク質における少なくとも１つの改変は、メジャーカプシドタンパク質内またはマイナーカプシドタンパク質内にある。ビリオンの外表面にあるすべてのアデノウイルスタンパク質（ヘキソン、ファイバー、プロテインＩＸおよびペントン）が改変され得る。
【0052】
一実施形態では、メジャーカプシドタンパク質中の改変はヘキソンタンパク質中にある。
他の実施形態では、マイナーカプシドタンパク質中の改変はｐＩＸタンパク質中にある。
他の実施形態では、マイナーカプシドタンパク質中の改変はｐＩＸタンパク質中にある。
【0053】
本発明のいずれかの態様の場合、少なくとも１つの改変は、カプシドタンパク質への第１のペプチドパートナーの挿入または融合である。好ましくは、少なくとも１つの改変は、アデノウイルスゲノムの遺伝子修飾を介するカプシドタンパク質への第１のペプチドパートナーの挿入または融合である。適切には、改変は、好ましくはヘキソンタンパク質のＨＶＲループのうちの１つまたは複数への、ヘキソンタンパク質における第１のペプチドパートナーの挿入である。したがって、挿入は、第１のペプチドパートナーをＮ末端またはＣ末端に融合させることよりはむしろ、ヘキソンタンパク質の配列へと行われ得る。適切には、改変は、ｐＩＸタンパク質における第１のペプチドパートナーの融合である。ｐＩＸ融合の場合、第１のペプチドパートナーは、適切な任意の位置、必要に応じてＣ末端またはＮ末端、好ましくはＣ末端で融合され得る。アデノウイルスを改変する当業者であれば、本明細書で論議のようにウイルスコートタンパク質を改変するために遺伝子修飾を導入する方法を知っていると思われる。
【0054】
本発明のいずれかの態様の一部の実施形態では、共有結合はイソペプチドである。これは、第１のペプチドパートナーの第２のペプチドパートナーへの不可逆的なコンジュゲーションを可能にし、その結果、共有結合で安定化された多タンパク質複合体を形成する。このイソペプチド結合は、自発性であっても、すなわち補助なしであってもよく、補助を、すなわちリガーゼから、必要としてもよい。特定のペプチドパートナーペアは当技術分野でよく知られており、これには、網羅的ではないリスト：ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよびその派生物および改変物、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＴａｇ／ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／Ｄｏｇ Ｔａｇ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ／Ｐｉｌｉｎ－Ｃ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ－Ｎ／Ｐｉｌｉｎ－Ｎ、ＳｄｙＴａｇ／ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒ、ＰｓＣｓＴａｇ／ＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ、ＲｒｇＡＴａｇｏｒ ＲｒｇＡＴａｇ２／ＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒおよび／またはＪｏ／Ｉｎならびにこれらのパートナーペアのいずれかの改変物およびバリアントが含まれる。
【0055】
一実施形態では、第１のペプチドパートナーは、ＤｏｇＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとすることができる。あるいは、第１のペプチドパートナーはＳｐｙＴａｇとすることができる。ＤｏｇＴａｇを挿入されたアデノウイルスカプシドタンパク質は、「Ａｄ－ＤｏｇＴａｇ」という用語が割り当てられる。ＳｐｙＴａｇを挿入されたアデノウイルスカプシドタンパク質は、「Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ」という用語が割り当てられる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと融合されたアデノウイルスカプシドタンパク質は、「Ａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」という用語が割り当てられる。
【0056】
他の実施形態では、第２のペプチドパートナーは、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、またはＳｐｙＴａｇとすることができる。一例では、第１のペプチドパートナーが第２のペプチドパートナーにカップリングし、その結果イソペプチド結合を形成してペプチド：ペプチド結合ペアを作製する。
【0057】
本明細書に提示のデータに関連して、ヘキソンカプシドタンパク質へのＤｏｇＴａｇの挿入は、良好に機能するとともに良好な生産量が可能であることが示される（図１２）。
本明細書に提示のデータに関連して、ｐＩＸへの以下の第１のペプチドパートナーの挿入は実行可能であると実証された：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ。図１２では、ｐＩＸへのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの融合はある特定の状況下では遺伝的に不安定であり得、一方、同じカプシドタンパク質へと挿入されたＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒは、ある特定の状況下ではより遺伝的に安定であり、したがって好ましい可能性があることが実証される。しかし、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合は作動可能であり、図１１を参照されたいが、この場合、種々の実体が付着されており、一方でウイルスは感染力を保持している。図１４では、ｐＩＸへのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｐｙＴａｇの挿入は、抗原などの実体が第２のペプチドパートナーを使用してこれら第１のペプチドパートナーに付着される場合でも、感染生産量に悪影響を及ぼさないことが実証される。Ｓａｒｓ－ＣｏＶ２由来のスパイクタンパク質全体は、５００ＫＤａを超えているので、その結果、首尾よく付着された大きな付着物であることに留意されたい。したがって、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒが、第１のペプチドパートナーとしてｐＩＸへと挿入され得、最も好ましくは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒが第１のペプチドパートナーとしてｐＩＸへと挿入され得る。
本明細書に提示のデータに関連して、ｐＩＸへの以下の第１のペプチドパートナーの挿入は実行可能であると実証された：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ。図１２では、ｐＩＸへのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの融合はある特定の状況下では遺伝的に不安定であり得、一方、同じカプシドタンパク質へと挿入されたＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒは、ある特定の状況下ではより遺伝的に安定であり、したがって好ましい可能性があることが実証される。しかし、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合は作動可能であり、図１１を参照されたいが、この場合、種々の実体が付着されており、一方でウイルスは感染力を保持している。図１４では、ｐＩＸへのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｐｙＴａｇの挿入は、抗原などの実体が第２のペプチドパートナーを使用してこれら第１のペプチドパートナーに付着される場合でも、感染生産量に悪影響を及ぼさないことが実証される。Ｓａｒｓ－ＣｏＶ２由来のスパイクタンパク質全体は、５００ＫＤａを超えているので、その結果、首尾よく付着された大きな付着物であることに留意されたい。したがって、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒが、第１のペプチドパートナーとしてｐＩＸへと挿入され得、最も好ましくは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒが第１のペプチドパートナーとしてｐＩＸへと挿入され得る。
【0058】
本明細書に記載のペプチド：ペプチド結合ペアの例には、それらに限定されないが、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＴａｇおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ；ＲｒｇＡＴａｇ／ＲｒｇＡＴａｇ２／ＤｏｇＴａｇおよびＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒ、ＩｓｏｐｅｐＴａｇ／ＩｓｏｐｅｐＴａｇ－ＮおよびＰｉｌｉｎ－ＣまたはＰｉｌｉｎ－Ｎ、ＰｓＣｓＴａｇおよびＰｓＣｓＣａｔｃｈｅｒ；ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇおよびＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅにより媒介される）ならびにこれらの全システムのバリアント、派生物および改変物が含まれる。適切なペプチドタグ／結合パートナーのペアは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／０９８７７、ＷＯ２０１６／１９３７４６、ＷＯ２０１８／１８９５１およびＷＯ２０１８／１９７８５４に詳細に記載される。
【0059】
したがって、第２のペプチドパートナーは、実体に連結されていても、融合されていてもよい。この実体は、アデノウイルスベクターに付着されることが望まれ、第２のペプチドパートナーへの融合体として生成され得るものであれば何でもよい。実体のタイプは、アデノウイルスベクターが使用される予防的または治療的用途に依存することになる。実体は、リガンド結合ペアの一部、抗体もしくはその断片などのターゲティング部分であっても、細胞表面受容体によって特異的に認識されるその他の任意の実体であってもよい。かかるターゲティング部分は、腫瘍溶解性ウイルスおよび遺伝子治療の用途に有用であり得る。しかし、実体はまた、治療薬が投与される宿主に存在する抗体の結合からアデノウイルスを遮断または遮蔽する機能を単に有することもできる。かかる遮蔽実体は、それがクリアランスを逃れることを可能にする、アデノウイルスカプシドコアへの遮蔽の手立て以外にさらなる機能を有していなくてもよい。この遮蔽実体はアデノウイルスの向性（自然感染力）を変更しないことが好ましい。本発明者らは、付着された遮蔽実体を備える第２のペプチドパートナーのサイズが約１５ｋＤａを超える場合、その組み合わせは、改変アデノウイルスが免疫応答をエスケープするのを補助するように見えることを観察した。この観察は図８Ａに記録されており、図では、部分的な遮蔽効果がＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２について記される。ゲルの移動から、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２は約１５ｋＤａであると考えられる。この部分的な遮蔽効果は有利であり得る。しかし、付着された遮蔽実体とともに組み合わされた第２のペプチドパートナーのサイズが約２５ｋＤａよりも大きい場合、図８Ｂおよび８Ｃに示されるように、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ９（概２５～３０ｋＤａ）の結果に見られるように、より完全な遮蔽が観察される。ワクチンの場合、本発明者らは、抗原が、宿主における免疫応答を起こすこと、しかしまたアデノウイルス自体への宿主の免疫応答を逃れること、という二重の機能を有する可能性があることを示した。検討中のサイズの実体を共有結合で付着することは以前には不可能であったため、そういった効果は以前には観察されていなかった。
【0060】
したがって、第２のペプチドパートナーは、抗原に連結または融合されるか、または抗原を含むように合成される。抗原は、将来の疾患を予防するように（予防的）、または目下の疾患と闘う上で免疫応答を補助するように（治療的）付着され得る。抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖類、多糖等を含めて、適切な任意の組成物とすることができる。この抗原は、自己抗原、がん抗原、アレルゲンである抗原、細菌抗原、真菌抗原、ウイルス抗原、または任意の病原性生物由来の抗原を含めて、適切な任意の抗原とすることができる。抗原は、全（ｗｈｏｌｅ）抗原であっても完全な（ｅｎｔｉｒｅ）抗原であってもよく、または抗原は、エピトープなどのそれらの断片であってもよい。抗原は完全に天然であってもよく、改変されたものであってもよい。抗原は、ウイルス抗原であってもネオエピトープであってもネオアンチゲンであってもよい。抗原は、例えば、共有ネオエピトープなどの特定のタイプのがんに共通するものであってもよい。ネオエピトープまたはネオアンチゲンは患者特異的であってもよい。患者特異的抗原は、抗原中の突然変異、例えば、コード配列の変化、フレームシフト突然変異または変更された翻訳後修飾から生じ得る。例えば、野生型ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ配列は、ネオエピトープ配列を含むように融合ペプチドとして合成されてきた。別の例では、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒは抗原に連結されてＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合体を形成する。
【0061】
一実施形態では、第１のペプチドパートナーはＤｏｇＴａｇであり、第２のペプチドパートナーはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒである。第１のペプチドパートナーの付着は、例えば、ヘキソンカプシドタンパク質に付着されたＤｏｇＴａｇは、ベクターＡｄ－ＤｏｇＴａｇを形成する。抗原に連結された第２のペプチドパートナーであるＤｏｇＣａｔｃｈｅｒにカップリングすると、形成されたワクチンベクターはＡｄ－ＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－Ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれる。別の実施形態では、第１のペプチドパートナーはＤｏｇＴａｇであり、第２のペプチドパートナーはＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｎｏｏｐＴａｇである。ネオエピトープなどの抗原を備えるＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの合成は、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体をもたらす。ネオエピトープなどの抗原を備えるＳｎｏｏｐＴａｇの合成は、ＳｎｏｏｐＴａｇ融合体をもたらす。ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体またはＳｎｏｏｐＴａｇ融合体のいずれかのベクターＡｄ－ＤｏｇＴａｇへのカップリングは、それぞれ、Ａｄ－ＤｏｇＴａｇ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－融合体またはＡｄ－ＤｏｇＴａｇ：ＳｎｏｏｐＴａｇ－融合体と呼ばれるベクターをもたらす。この反応は、ＤｏｇＴａｇとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体またはＳｎｏｏｐＴａｇ融合体との間のカップリングを容易にするためにＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを必要とする。ＤｏｇＴａｇは、ヘキソンカプシドタンパク質に、必要に応じてＨＶＲループに付着されることが好ましいとし得る。一部の実施形態では、ＤｏｇＴａｇは、同じヘキソンタンパク質内の複数のＨＶＲループを改変するように、使用され得る。このことは、ウイルスカプシドへの付着の機会を向上させることができる。
【0062】
別の実施形態では、第１のペプチドパートナーはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり、第２のペプチドパートナーはＳｐｙＴａｇである。ＳｐｙＴａｇは抗原に連結されて、Ａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ－Ａｎｔｉｇｅｎを形成する。したがって、第１のペプチドパートナーは、当技術分野で「タグ」または「キャッチャー」と称されるもののいずれかとし得るが、この場合、第２のペプチドパートナー成分はこのペアのパートナー、それぞれ「キャッチャー」または「タグ」である、ことがわかり得る。本明細書では、両方とも、カプシドタンパク質を改変するか、または抗原に付着されたかのいずれかの方向性で提供され得るので、タンパク質パートナーに指定される。第１のペプチドパートナーの第２のペプチドパートナーへのカップリングは、免疫原性アデノウイルスウイルスタンパク質の表面での抗原の提示を可能にする。この実施形態では、カプシドタンパク質はｐＩＸであることが好ましい。ｐＩＸに関連して使用され得る他の「第１のペプチドパートナー」と「第２のペプチドパートナー」の組み合わせは、一次パートナーＳｎｏｏｐＴａｇＪｒと二次パートナーＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、一次パートナーＳｐｙＴａｇと二次パートナーＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、一次パートナーＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒと二次パートナーＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたは一次パートナーＤｏｇＣａｔｃｈｅｒと二次パートナーのＤｏｇＴａｇである。
【0063】
別の実施形態では、ｐＩＸへと挿入された第１のペプチドパートナーは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒのいずれか１つとすることができる。これらはすべて、良好な生産量の生存可能性を伴う効果的な挿入であることが実証されており、所望の実体でアデノウイルスの装飾を可能とするように、それらそれぞれの第２の結合ペアにとって利用可能である。本明細書全体を通して、それぞれの第２のペプチドパートナーが論議される。結果としてのアデノウイルスは、「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ」および「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」と称され得る。あるいは、これらは、「Ａｄ ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ」および「Ａｄ－ｐＩＸ ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」と命名され得る。
【0064】
一部の実施形態では、第２のペプチドパートナーと、抗原などの付着／装飾用の付着された実体との組み合わせは、著しいサイズであり、例えば、それは、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、または１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａを超えまたはそれよりも多く、例えば、２００ｋＤａを超える、３００ｋＤａを超えるまたは４００ｋＤａを超えるサイズである。改変アデノウイルスのかかる装飾は重要であり、なぜなら、カプシドタンパク質自体によって課せられるサイズ制限のせいで、このタイプの付加は、遺伝子融合を使用しては不可能であるからである。本発明者らが示したところは、少なくともおよそ２５～３０ｋＤａの第２のペプチドパートナー実体の付加が、中和抗体からアデノウイルスを遮蔽するという有益な効果を有することである。したがって、遮蔽効果を提供するために、第２のペプチドパートナーに付着された実体の組み合わせサイズは、１５ｋＤａよりも大きい、好ましくは２０ｋＤａよりも大きい、必要に応じて２５ｋＤａのサイズよりも大きい、必要に応じて少なくとも３０ｋＤａのサイズであることが好ましい。
【0065】
本発明者らが実証したところは、本発明の方法を使用するアデノウイルス粒子に付着されたより大きな実体（約３０ｋＤａを超える）を用いて、本発明の装飾されたアデノウイルスが、アデノウイルスへの通常の宿主免疫応答を逃れることができることである。なぜなら実体が宿主免疫系による抗体中和からアデノウイルスを遮蔽するからであると仮定される。アデノウイルス粒子自体に対する宿主免疫の逃避は、親アデノウイルス株に以前に曝露された個体においてさえアデノウイルスベクターが有効であることを可能にするので、有用であり得る。ヒト集団の大きな割合がアデノウイルスによって以前に感染されたと予想されることを考慮すると、逃避は従来技術を越えて有用な改善となると思われる。予防的または治療的アデノウイルスベクターの宿主免疫クリアランスは、現在の治療法が診療所まで届くことに対する主たる障害である。したがって、本発明は主に、任意のアデノウイルスベクターを宿主免疫系から遮蔽する方法として使用され得る。有利には、本発明の技術を使用して付着された実体はそれ自体、治療効果を、例えば、ワクチン用の抗原、または遺伝子治療もしくは腫瘍溶解性ウイルスにおける細胞ターゲティング用のターゲティング部分を有することができる。
【0066】
他の実施形態では、ＤｏｇＴａｇは、ヘキソンカプシドタンパク質の表面ループへと挿入される。ヘキソンは、ビリオンあたり概７２０コピーを備えるアデノウイルスカプシドタンパク質の主成分である。このことは、１００％のヘキソンタンパク質がペプチドタグとカップリングされると仮定すると、ビリオンあたり最大７２０個のリガンドの提示を可能にする。したがって、ＤｏｇＴａｇは一部の実施形態において第１のペプチドパートナーである。一実施形態では、ＤｏｇＴａｇはヘキソンの少なくとも１つのＨＶＲループへと挿入される。
【0067】
他の実施形態では、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端に融合される。ｐＩＸカプシドタンパク質に融合された第１のペプチドパートナー、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの付着は、ベクターＡｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを形成する。抗原に連結された第２のペプチドパートナーＳｐｙＴａｇにカップリングすると、形成されるワクチンベクターはＡｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ－Ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれる。
【0068】
別の実施形態では、ｐＩＸへと挿入された第１のペプチドパートナーは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、ＳｐｙＴａｇおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒのいずれか１つとすることができる。結果としてのアデノウイルスは、「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ」および「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」と称され得る。あるいは、これらは、「Ａｄ ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」、「Ａｄ ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ」および「Ａｄ－ｐＩＸ ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」と命名され得る。それぞれのペプチドペアにカップリングすると、これらは：「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：Ｓｎｏｏｐｔａｇ」、「Ａｄ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ：ＤｏｇＴａｇ」、「Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ：Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ」および「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇ」を形成することができる。任意の実体が、第２のペプチドパートナーに付着され得る、例えば、ワクチン組成物用の抗原である。
【0069】
本明細書で使用される場合、コロン「：」とは、ペプチドペア間の共有結合の存在を指す。
したがって、本発明の別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを含む組成物が提供される。組成物は、好ましくは免疫原性である。前記アデノウイルスベクターは、改変カプシドタンパク質を含み、ここで、前記改変は、実体の付着を受け入れるようにベクターをプライムする。改変カプシドタンパク質は、第１のペプチドパートナーの融合または挿入を伴う。次いで、治療用または予防用ウイルスが、抗原などの実体に付着されている不可欠な第２のペプチドパートナーを付加することによって調製され得る。一緒に第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーは、自発的にまたはリガーゼなどの第３の実体により補助されるかのいずれかで、共有結合を形成する。したがって、治療的または予防的組成物では、カプシドタンパク質は、抗原などの実体に付着された第２のペプチドパートナーに共有結合で連結された第１のペプチドパートナーの包含によって改変される。付着された実体が抗原である場合、組成物はワクチン組成物である。これは、本発明の技術の好ましい使用であり、なぜなら、アデノウイルス自体の免疫原性が高いという性質を活用するからである。実際、図１０では、抗原をベクター（この場合はペプチド抗原）に付着することは、ペプチドとアデノウイルスが別々の実体として一緒に提供される場合の結果と比較して、有利であることがわかる。
したがって、本発明の別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを含む組成物が提供される。組成物は、好ましくは免疫原性である。前記アデノウイルスベクターは、改変カプシドタンパク質を含み、ここで、前記改変は、実体の付着を受け入れるようにベクターをプライムする。改変カプシドタンパク質は、第１のペプチドパートナーの融合または挿入を伴う。次いで、治療用または予防用ウイルスが、抗原などの実体に付着されている不可欠な第２のペプチドパートナーを付加することによって調製され得る。一緒に第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーは、自発的にまたはリガーゼなどの第３の実体により補助されるかのいずれかで、共有結合を形成する。したがって、治療的または予防的組成物では、カプシドタンパク質は、抗原などの実体に付着された第２のペプチドパートナーに共有結合で連結された第１のペプチドパートナーの包含によって改変される。付着された実体が抗原である場合、組成物はワクチン組成物である。これは、本発明の技術の好ましい使用であり、なぜなら、アデノウイルス自体の免疫原性が高いという性質を活用するからである。実際、図１０では、抗原をベクター（この場合はペプチド抗原）に付着することは、ペプチドとアデノウイルスが別々の実体として一緒に提供される場合の結果と比較して、有利であることがわかる。
【0070】
本発明の別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを生成する方法が提供される。
別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを抗原に付着された第２のペプチドパートナーと混合することを含むワクチンを生成する方法が提供される。前記方法は、リガーゼなどの第３の実体またはヘルパー実体の使用を必要とする場合がある。
別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを抗原に付着された第２のペプチドパートナーと混合することを含むワクチンを生成する方法が提供される。前記方法は、リガーゼなどの第３の実体またはヘルパー実体の使用を必要とする場合がある。
【0071】
さらなる態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを、ターゲティング部分などの実体または遮蔽実体に付着された第２のペプチドパートナーと混合することを含む腫瘍溶解性ウイルスを生成する方法が提供される。前記方法は、リガーゼなどの第３の実体またはヘルパー実体の使用を必要とする場合がある。ターゲティング部分は、ウイルスが標的の細胞または組織タイプへと送り込まれることを可能にする適切な任意の実体とすることができる。有利には、前記部分はまた、改変アデノウイルスへの宿主抗体の結合を遮断する。あるいは、遮蔽実体は単に、すでに標的化された腫瘍溶解性ウイルスが免疫応答をエスケープする助けとなるだけである。
【0072】
さらなる態様では、本発明によるアデノウイルスベクターをターゲティング部分に付着された第２のペプチドパートナーと混合することを含む遺伝子治療ベクターを生成する方法が提供される。前記方法は、リガーゼなどの第３の実体またはヘルパー実体の使用を必要とする場合がある。ターゲティング部分は、ウイルスが標的の細胞または組織タイプへと送り込まれることを可能にする適切な任意の実体とすることができる。有利には、前記部分はまた、改変アデノウイルスへの宿主抗体の結合を遮断する。当業者であれば、アデノウイルスの多数の遺伝子治療の使用を知っている。本発明は、免疫系からベクターを遮蔽するために、および／またはベクターのターゲティングを補助するために使用され得る。
【0073】
本発明の別の態様では、疾患の予防および／または処置で使用するための、本発明による免疫原性アデノウイルスベクターを含むワクチンが提供される。適切には、前記ワクチンは、本発明のいずれかの態様または実施形態による免疫原性アデノウイルスベクターを含む。適切には、ワクチンは、ヒトおよび動物を含めて哺乳動物で使用するためのものである。適切には、ワクチンは、ヒト、例えば、小児、成人、生殖年齢にある女性または妊婦で使用するためのものである。別の態様では、本発明は、免疫原性応答を、例えば、防御免疫応答を誘導する方法を提供し、ここで、方法は、本発明のいずれかの態様または実施形態による組成物を投与することを含む。さらなる態様では、本発明は、１つまたは複数の腫瘍特異的突然変異を標的とするがんワクチンを提供し、したがって、がん細胞への免疫応答の特異的ターゲティングを可能にする。個別化されたがんワクチンも企図される。かかるワクチンは、その患者のがん細胞上に特異的に存在する１つまたは複数の抗原を含む。これは、ワクチンが、患者が有する特定のがんに合わせて個別化されることを意味する。これらの腫瘍関連またはがん関連抗原は、がん細胞によって新たに発現される抗原であるネオアンチゲンとすることができる。
【0074】
本発明の別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを含むキットが提供される。キットはまた、抗原に連結された第２のペプチドパートナー、抗原へのタンパク質融合の準備ができた第２のペプチドパートナー、または抗原用の遺伝子への第２のペプチドパートナーの遺伝子融合を可能にするための第２のペプチドパートナー用の遺伝子配列を含むことができる。
【0075】
本発明はまた、ワクチンの調製のためのキットにまでおよび、前記キットは本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む。また、前記キットには、抗原と融合する準備ができた、第２のペプチドパートナー用の遺伝子配列が存在し得る。さらなる構成要素は、使用のための取扱説明書とすることができる。また、ペプチドパートナーペア間の共有結合を容易にするのに必要な第３の実体も含まれ得る。
【0076】
本発明の別の態様では、本発明によるアデノウイルスベクターを含むキットが提供される。キットはまた、ターゲティング部分に連結された第２のペプチドパートナー、ターゲティング部分へのタンパク質融合の準備ができた第２のペプチドパートナー、またはターゲティング部分用の遺伝子への第２のペプチドパートナーの遺伝子融合を可能にする第２のペプチドパートナー用の遺伝子配列を含むことができる。
【0077】
本発明はまた、腫瘍溶解性ウイルスの調製のためのキットにまでおよび、前記キットは本明細書に記載のアデノウイルスベクターを含む。また、前記キットには、ターゲティング部分と融合する準備ができた、第２のペプチドパートナー用の遺伝子配列が存在し得る。さらなる構成要素は、使用のための取扱説明書とすることができる。また、ペプチドパートナーペア間の共有結合を容易にするのに必要な第３の実体も含まれ得る。この場合のアデノウイルスベクターは、複製可能となるはずであり、感染したがん細胞の破壊を確保する遺伝子を含むように改変され得る。
【0078】
本発明者らは、ペプチド結合パートナーが、特にウイルス様粒子での使用のために、ワクチン調製においてこれまで使用されてきたことを知っている。しかし、この技術は、ウイルスベクター自体が生み出す免疫応答に起因してワクチン調製において違った有用性を持つ可能性があるウイルスベクターの使用とはまったく別である。ウイルスベクターは、細胞質および多くの場合核への侵入を獲得する点でも効率的であり、このことは、ウイルス様粒子と比較して、ウイルスベクターへの細胞傷害性Ｔ細胞応答の増強をもたらす。多くの感染症の場合およびがんの場合、細胞傷害性Ｔ細胞応答は防御免疫の主たる成分である。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、そのサイズ（約２０～２００ｎｍ）、その形状およびその反復タンパク質配列においてウイルスに似ているが、病原体由来の任意の遺伝物質を欠く。したがって、その合成方法およびＶＬＰからワクチンを調製する上で直面する課題は、調製の方法およびウイルスベクターからワクチンを調製することで直面する課題とは極めて異なる。これらのペプチドパートナーペアは、免疫原性ウイルスベクター中のカプシドタンパク質を改変するためにこれまでには使用されておらずまたはそのための使用について提案されていなかった。
【0079】
さらに、本発明者らは、他の例は、他のウイルスの表面を改変するために、ペプチド結合パートナー、とりわけＳｐｙＴａｇを使用してきたことを知っている。他のグループによって改変向けに選択されたその他のウイルスは、アデノウイルスに伴う手元の課題とは異なる課題を提示する。第１に、以前に改変されたウイルスの大多数はエンベロープ型である。したがって、脂質エンベロープの一部であるタンパク質上で改変が行われている。アデノウイルスでは、本発明者らが見いだしたことは、非エンベロープ型ウイルスにおいてカプシドタンパク質を改変することは、予想されるほど簡単ではないこと、ならびに、構造上の制約とは、場合によっては、改変を含みかつ感染力を満足のいくレベルに保持することが不可能であることを意味することである。さらに、共有結合を形成するペプチドパートナーペアを用いてウイルスを改変するように実行された以前の研究は、ウイルスをリターゲティングすることまたは向性を変更することに焦点を合わせていた。このようなことは、免疫応答を起こすためにカプシド表面で抗原を正確に提示することであるという、本願の主たる焦点とは異にするものである。
【図面の簡単な説明】
【0080】
【図1-1】図１Ａ－Ｄは、ヘキソンＨＶＲループへのＳｐｙＴａｇまたはＤｏｇＴａｇの挿入を介するアデノウイルスカプシドのモジュール式共有結合装飾の図である。図１は、本発明の実施形態の４つの表現を示す図である。図１Ａ）イソペプチド結合を介するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＳｐｙＴａｇとの反応の図である。図１Ｂ）イソペプチド結合を介するＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのＤｏｇＴａｇとの反応の図である。図１Ｃ）ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって触媒されるＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＤｏｇＴａｇ間のカップリング反応の図である。
【図1-2】図１Ｄ）モジュール式ヘキソン装飾であり、ウイルスカプシド上のＤｏｇＴａｇの表面提示およびそれに続くＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを介するペプチドまたはタンパク質抗原のカップリングを示す図である。
【図1-3】図１Ｅ）超可変領域（ＨＶＲ）ループ１、２および５の位置を指示するアデノウイルスヘキソンタンパク質の多重配列アラインメントならびに各遺伝子座にてのＳｐｙＴａｇまたはＤｏｇＴａｇの挿入に先立つ挿入部位で生成された欠失の図である。影付きの残基は、Ａｄ５とは違う残基の同一性を示す。以下のヒトアデノウイルス血清型からのヘキソン配列が示される；Ａｄ５とＡｄ２（種Ｃ）、Ａｄ１２とＡｄ１８（種Ａ）、Ａｄ３とＡｄ３５（種Ｂ）、Ａｄ４（種Ｅ）、Ａｄ４０とＡｄ４１（種Ｆ）。指示された挿入部位は、試験された３つのＨＶＲのそれぞれにてのＳｐｙＴａｇとＤｏｇＴａｇの組換え体の間で同一であることに留意されたい。各遺伝子座で、ＳｐｙＴａｇ配列またはＤｏｇＴａｇ配列はＧＳＧＧＳＧ配列によって隣接される。ＳＧ配列によって隣接される。
【図2A】図２Ａ－Ｄは、Ａｄ５ ＨＶＲループへの挿入の後のＳｐｙＴａｇの反応性の図である。図２Ａ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともに４℃で１６時間インキュベートしたループＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）においてＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色解析の図である。
【図2C】図２（Ｃ－Ｄ）：ＨＶＲ１でＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ１－ＳｐｙＴａｇ）（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、示すように様々な条件下で１５μＭまたは４０μＭにてのビオチン化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともにインキュベートした。図２Ｃ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともに２０℃もしくは３７℃で３時間、または２０℃もしくは４℃で１６時間インキュベートしたＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５のＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色解析の図である。
【図3A】図３Ａ－Ｄは、Ａｄ５ ＨＶＲループへの挿入の後のＤｏｇＴａｇの反応性の図である。図３Ａ：ヘキソン表面（ＨＶＲ１、２、または５において）でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５ベクターと、未改変のヘキソン（ＷＴ）を備えるＡｄ５ベクターとの生産量比較の図である。各ベクターバッチのＰ：Ｉ比（ＵＶ分光光度法により算出された総ウイルス粒子のＧＦＰフォーカスアッセイにより算出された感染単位に対する比）は、各バーの上に指示される。
【図3B】図３Ｂ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（５μＭ）とともに４℃で１６時間インキュベートした、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色解析の図である。
【図4A】図４Ａ－Ｃは、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって方向付けられたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとのＡｄ５ ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇの反応性の図である。図４Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって評価された、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって触媒される、異なるＨＶＲループへと挿入されたＤｏｇＴａｇとの、ＨＥＲ２（ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２）へのアフィボディに融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの反応性の図である。
【図4B】図４Ｂ－Ｃ：Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇとのＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２の反応性の温度依存性の図である。図４Ｂ：ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって４℃または２０℃で触媒される、ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２とＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇの間の反応のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色解析の図である。
【図5A】図５Ａ－Ｂは、非蛍光組換えベクターの抗ヘキソン免疫染色アッセイを使用するベクター感染力の評価の図である。図５Ａ：ＷＴヘキソンタンパク質を備えるＡｄ５ベクターまたはＨＶＲ５でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５ベクターを感染させたＨＥＫ２９３Ａ細胞の抗ヘキソン免疫染色の図である。４×対物レンズを使用する明視野顕微鏡画像、ヘキソン陽性細胞は黒で示される。スケールバー＝１０００μｍ。
【図5B】図５Ｂ：ＧＦＰ蛍光とヘキソン免疫染色アッセイの両方を使用するＡｄ５（ＧＦＰ）ヘキソンＷＴとＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇとの感染力価の比較の図である。両アッセイは、同じプレート上の同じウェルを使用して実施した、ｎ＝４。両側ｔ検定を実施したが、群間で統計学的に有意な差は観察されなかった。バーは平均±ＳＤを示す；ドットは、個々のウェルからのスポットカウントを表す。
【図6A】図６Ａ－Ｆは、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒタグペプチドとのヘキソンループへと挿入されたＤｏｇＴａｇの反応性の図である。図６Ａ：ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＳｎＬ）によって触媒される、ヘキソン－ＤｏｇＴａｇ（ヘキソン－ＤＴ）へのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ペプチド（ＳｎＪｒ－ペプチド）カップリングの効率を評価するためのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ＤＣ）を使用する競合アッセイの例示の図である。
【図6C】図６Ｃ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ競合アッセイを使用するＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＰＥＰ１；ＳｎＪｒ－ＧＧＳ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ．ＰＥＰ２；ＳｎＪｒ－ＡＡＹ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ）のヘキソン－ＤＴへのカップリング効率のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー解析の図である。
【図6D】図６Ｄ：抗ヘキソン抗体を使用するウエスタンブロッティングによる一価ストレプトアビジン（ｍＳＡ）直接ゲルシフトアッセイを使用するヘキソン－ＤＴへのＳｎＪｒ－ペプチドカップリングの評価の例示の図である。煮沸後に添加した場合、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用はＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で安定である。
【図7A】図７Ａ－Ｃは、Ａｄ５ ＨＶＲ ＤｏｇＴａｇのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質へのカップリングの図である。図７Ａ：３つのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合構築物；熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）、アイソレート３Ｄ７、に由来するＮＡＮＰ９、ＮＡＮＰ１８、およびＮＡＮＰＤの例示の図である。ＮＤＶＰおよびＮＡＮＰのテトラペプチド反復が例示される。
【図7C】図７Ｃ：図７Ｂに示される同じ試料で実施されたベクター感染力アッセイの図である。バーは、２回重複のウェルの平均と範囲を示す。表面装飾のサイズ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ９（およそ２５～３０ｋＤａ）、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ１８（およそ３５～４０ｋＤａ）およびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰドメイン（およそ６０ｋＤａ）。
【図8A】図８Ａ－Ｃは、ウイルス中和抗体の効力を減少させる、ヘキソンを介するＡｄ５の表面へのイソペプチド結合を介するカップリングの図である。図８Ａ：ウイルス中和抗体の効力を減少させる、ヘキソンを介するＡｄ５の表面へのＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを介するカップリングの図である。アデノウイルスヘキソン（ｍＡｂ ９Ｃ１２）を標的とする、様々な濃度のモノクローナル抗体の存在下で、アデノウイルスを細胞に添加した。細胞内で発現したアデノウイルスコード化ＧＦＰの蛍光から、増殖性アデノウイルス感染が検出された。Ａｄ５－ＤＴ単独、Ａｄ５－ＤＴ＋ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２およびＡｄ５－ＤＴ＋ＳｎＬ＋ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２の蛍光の強度。図８Ｂ：図８Ａにおけるように解析された、ウイルス中和抗体の効力を減少させる、ヘキソンを介するＡｄ５の表面へのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎのカップリングの図である。Ａｄ５－ＤＴ単独、またはＡｄ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングされたＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎからの蛍光の強度。図８Ｃ：アデノウイルス中和血清の様々な希釈液の存在下で、アデノウイルスを細胞に添加した。細胞内で発現したアデノウイルスコード化ＧＦＰの蛍光から、増殖性アデノウイルス感染が検出された。Ａｄ５－ＤＴ単独、またはＡｄ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングされたＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎの蛍光の強度。Ａ～Ｃでは、バーは２回重複の値の平均と範囲を指示する。
【図9】図９：ＳＫＯＶ３細胞のヒト凝固第Ｘ因子依存性ベクターの形質導入の図である。Ａｄ５（ＧＦＰ）－ＤｏｇＴａｇ（Ａｄ５）またはＡｄ５（ＧＦＰ）－ＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ１８（Ａｄ５－ＮＡＮＰ１８）ベクター（２Ｅ＋９ウイルス粒子）を、無血清培地で３７℃で２時間ＳＫＯＶ３細胞上で、ヒト凝固第Ｘ因子（８μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でインキュベートした。次いで、培地を新鮮な完全培地に交換し、プレートをさらに４８時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡によるＧＦＰ陽性フォーカスの計数によって感染力価を算出した。試料は２回重複でプレーティングし、バーはデータ値の平均と範囲を示す。
【図10-1】図１０Ａ－Ｃは、カプシド提示ペプチドと内部コード化ＧＦＰ抗原の両方に対してＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を生み出す、カプシド表面でＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクターの図である。図１０Ａ：Ａｄ５表面提示のペプチド抗原へのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を評価するためのマウス免疫原性実験向けの設計および免疫スケジュールの図である。カプシド表面へのペプチドエピトープの物理的付着の重要性を確認するために、付着されたＳＩＩＮＦＥＫＬを備えるＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇ（Ａｄ５－ＤＴ：ＳＩＩＮＦＥＫＬ）の投与後の、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞応答を、遊離ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドとのＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇ（Ａｄ５－ＤＴ）の共投与（群１および２、ｖｓ群３）と、ならびに、ポリＩ：Ｃアジュバントを伴うＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（群４）と、比較した。
【図10-2】図１０Ｂ：ＳＩＩＮＦＥＫＬへの脾臓のエクスビボＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴ応答（１００万個の脾臓細胞あたりのスポット形成細胞）の図である。図１０Ｃ：エピトープＤＴＬＶＮＲＩＥＬ（ＥＧＦＰ１１８～１２６）への脾臓のエクスビボＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴ応答の図である。図１０Ｂおよび図１０Ｃでは、スポットは個々の動物における応答を表し、一方、バーは範囲とともに中央値を表す。
【図11A】図１１Ａ－Ｄは、ｐＩＸのＣ末端にてのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの融合を介するアデノウイルスカプシドのモジュール式共有結合装飾の図である。図１１Ａ：モジュール式アデノウイルスカプシド装飾の図であり、ｐＩＸへの融合を介するウイルスカプシド上のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの表面提示およびそれに続くＳｐｙＴａｇを介するペプチドまたはタンパク質抗原のカップリングを示す図である。
【図11B】図１１Ｂ：ＳｐｙＴａｇ－マルトース結合タンパク質（ＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰ、５μＭ）またはＳｐｙＴａｇ－ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）五量体（ＳｐｙＴａｇ－五量体、２．５μＭ）と４℃で１６時間カップリングされたＡｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の図である。ｇＨは、ＳｐｙＴａｇを含有する五量体サブユニットである。抗ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリクローナルマウス血清を使用してウエスタンブロッティングによって、タンパク質を検出した。
【図11C】図１１Ｃ：ＳｐｙＴａｇ－ペプチドにカップリングされたＡｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の図である。一価のストレプトアビジン（ｍＳＡ）を添加して、クリアなゲルシフトを誘導し、抗ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリクローナルマウス血清を使用してウエスタンブロッティングによってタンパク質を検出した。
【図12A】図１２Ａ－Ｂは、ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを備える、様々な組換えアデノウイルスベクターの生存可能性、遺伝的安定性、および生産量の図である。図１２Ａ：ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるベクターの生存可能性および遺伝的安定性（＞３継代培養後）に関する対応情報を伴う、ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのバージョンを備える様々なＡｄ５（ＧＦＰ）ベクターのｐＩＸアミノ酸配列の概略図である。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｄＮ１（デルタ Ｎ１）とは、本文書からのその他の図で使用されるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの同じＮ末端短縮化バージョンを指す。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｄＮ１ｄＣ２（デルタ Ｎ１、デルタ Ｃ２）とは、さらなるＣ末端短縮化を有するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのより短いバージョンを指す。
【図12B】図１２Ｂ：ｐＩＸのＣ末端にてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを提示する生存可能なＡｄ５ベクター（図１２Ａに指示される）の生産量比較の図である。ｐＩＸ－Ｃａｔｃｈｅｒ融合体を備えるベクターの生産量が、等量の培養細胞および同じベクター回収／精製プロトコルを使用して、Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇと比較される。ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの融合体の場合、バーはｎ＝２バッチの平均と範囲を指示する。
【図13A】図１３Ａ－Ｃは、ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの反応性の図である。図１３Ａ：ＳＡＲＳ ＣｏＶ２（Ｓｐｉｋｅ）からの全長スパイクタンパク質に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ｓｐｉｋｅの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとの、Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒベクターの反応性の図である。Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（３Ｅ＋９ウイルス粒子）を４℃で１６時間、単独でインキュベートするか、またはＳｐｉｋｅ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（０．７５μＭ）もしくはＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（５μＭ）とともに共インキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒに対して反応性を有するポリクローナルマウス血清を使用してウエスタンブロッティングを実施した。ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（ｐＩＸ－ＳｎＣ）、ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＲＢＤ（ｐＩＸ－ＳｎＣ：ＳｎＪｒ－ＲＢＤ）およびｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－Ｓｐｉｋｅ（ｐＩＸ－ＳｎＣ：ＳｎＪｒ－Ｓｐｉｋｅ）を表す種が指示される。
【図13C】図１３Ｃ：低分子ユビキチン修飾因子（ＳＵＭＯ）に融合されたＤｏｇＴａｇとのＡｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒベクターの反応性の図である。Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（１Ｅ＋９ウイルス粒子）を４℃で１６時間、単独でインキュベートするか、またはＳＵＭＯ－ＤｏｇＴａｇ（１７μＭ）とともに共インキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒに対して反応性を有するポリクローナルマウス血清を使用してウエスタンブロッティングを実施した。ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ｐＩＸ－ＤＣ）およびｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ：ＤｏｇＴａｇ－ＳＵＭＯ（ｐＩＸ－ＤＣ：ＤＴ－ＳＵＭＯ）を表す種が指示される。
【図14A】図１４Ａ－Ｃは、ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｐｙＴａｇの反応性の図である。図１４Ａ：ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５ベクターの生産量比較の図である。両ベクターは、ｐＩＸとＴａｇの間にＧＧＳ（ＥＡＡＡＫ）３ ＧＳリンカー配列を有する。ｐＩＸ－Ｃａｔｃｈｅｒ融合体を備える、ＨＥＫ２９３Ａ細胞におけるベクターの生産量が、等量の培養細胞および同じベクター回収／精製プロトコルを使用して、Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇと比較される。
【図14B】図１４Ｂ：ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＲＢＤに融合されたＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとのＡｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの反応性、およびＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＲＢＤに融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとのＡｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇの反応性の図である。ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を４℃で１６時間、単独でインキュベートするか、またはＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤもしくはＲＢＤ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（すべて３．５μＭ）とともに共インキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ポリクローナル抗ＲＢＤ抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した。ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ：ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤ（ｐＩＸ－ＳｎＪｒ：ＳｎＣ－ＲＢＤ）、ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤ（ｐＩＸ－ＳＴ：ＳＣ－ＲＢＤ）および非カップリングＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤ（ＳｎＣ／ＳＣ－ＲＢＤ）を表す種が指示され、ラベルが付される（＊）。
【発明を実施するための形態】
【0081】
アデノウイルス
アデノウイルス（Ａｄ）は、概３６キロベース（ｋｂ）のゲノムを持つ非エンベロープ型二本鎖ＤＮＡウイルスである。Ａ～Ｇ種に分類される６０を超えるヒトアデノウイルス血清型がある。各グループは、いくつかのアデノウイルス血清型から構成され、例えば、サブグループ種のＣはＡｄ５およびＡｄ２を含む。Ａｄ５は、最も広く研究された血清型であり、腫瘍溶解性ウイルスの開発に最も広く使用されるプラットフォームである。腫瘍溶解性ウイルスの開発では、特定の組織を標的にすることができることが望ましく、したがって、向性が変更され得る。医療現場でＡｄ５を含めて一部のアデノウイルス血清型を使用することに伴う主たる問題とは、ヒトにおいて既存する免疫である。アデノウイルスは通常、７０～９０ｎｍのサイズで、正二十面体のカプシド形状を有する。「カプシドタンパク質」としても知られる外部カプシド構造は、主たる３つのタイプのタンパク質（ヘキソン、ファイバーおよびペントンベース）を含む。外側のカプシドには、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２を始めとするさらなるマイナータンパク質が存在する。ヘキソンは、カプシドタンパク質の８３％超を占める、アデノウイルスカプシドの主成分である。ヘキソン改変は、異なる血清型からのＨＶＲの交換を含めて、一部の状況で既存の中和抗体の回避を可能にすることが示されてきた。
アデノウイルス（Ａｄ）は、概３６キロベース（ｋｂ）のゲノムを持つ非エンベロープ型二本鎖ＤＮＡウイルスである。Ａ～Ｇ種に分類される６０を超えるヒトアデノウイルス血清型がある。各グループは、いくつかのアデノウイルス血清型から構成され、例えば、サブグループ種のＣはＡｄ５およびＡｄ２を含む。Ａｄ５は、最も広く研究された血清型であり、腫瘍溶解性ウイルスの開発に最も広く使用されるプラットフォームである。腫瘍溶解性ウイルスの開発では、特定の組織を標的にすることができることが望ましく、したがって、向性が変更され得る。医療現場でＡｄ５を含めて一部のアデノウイルス血清型を使用することに伴う主たる問題とは、ヒトにおいて既存する免疫である。アデノウイルスは通常、７０～９０ｎｍのサイズで、正二十面体のカプシド形状を有する。「カプシドタンパク質」としても知られる外部カプシド構造は、主たる３つのタイプのタンパク質（ヘキソン、ファイバーおよびペントンベース）を含む。外側のカプシドには、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａおよびＩＶａ２を始めとするさらなるマイナータンパク質が存在する。ヘキソンは、カプシドタンパク質の８３％超を占める、アデノウイルスカプシドの主成分である。ヘキソン改変は、異なる血清型からのＨＶＲの交換を含めて、一部の状況で既存の中和抗体の回避を可能にすることが示されてきた。
【0082】
改変するためのアデノウイルス
アデノウイルスは複製欠損であり得る：アデノウイルスは治療薬として使用される場合にもはや複製できないということを確保するために、ある特定の遺伝子がゲノムから欠失される。これは、ゲノムからの一セットの遺伝子の欠失の結果生じ得るとともにアデノウイルスを扱う当業者の技能範囲内である。そのようなことは、ワクチンでの使用に有利であり得るが、この場合、アデノウイルスベクターの目的は、細胞傷害性を制限しつつ、抗原を高度に免疫原性なものとする形式で免疫系に抗原を提示することである。しかし、腫瘍溶解性ウイルスなどの他の用途の場合、複製可能であることがキーである。複製可能であるアデノウイルスは、例えばキー遺伝子の欠失によって、正常細胞での複製を防止するためにいくつかの改変をなおも含有することができる。腫瘍溶解性Ａｄベクターは、そのライフサイクルの終わりにがん細胞を溶解するが、子孫が正常組織に感染しないことが重要である。がん細胞は一般にアデノウイルス複製に対してより寛容であるが、一方、正常細胞は複製を補助するためにアデノウイルスが遺伝子の完全な相補を有することを必要とする。
アデノウイルスは複製欠損であり得る：アデノウイルスは治療薬として使用される場合にもはや複製できないということを確保するために、ある特定の遺伝子がゲノムから欠失される。これは、ゲノムからの一セットの遺伝子の欠失の結果生じ得るとともにアデノウイルスを扱う当業者の技能範囲内である。そのようなことは、ワクチンでの使用に有利であり得るが、この場合、アデノウイルスベクターの目的は、細胞傷害性を制限しつつ、抗原を高度に免疫原性なものとする形式で免疫系に抗原を提示することである。しかし、腫瘍溶解性ウイルスなどの他の用途の場合、複製可能であることがキーである。複製可能であるアデノウイルスは、例えばキー遺伝子の欠失によって、正常細胞での複製を防止するためにいくつかの改変をなおも含有することができる。腫瘍溶解性Ａｄベクターは、そのライフサイクルの終わりにがん細胞を溶解するが、子孫が正常組織に感染しないことが重要である。がん細胞は一般にアデノウイルス複製に対してより寛容であるが、一方、正常細胞は複製を補助するためにアデノウイルスが遺伝子の完全な相補を有することを必要とする。
【0083】
アデノウイルスは、アデノウイルスの任意の血清型由来であっても株由来であってもよい。したがって、改変に適したアデノウイルスは、以前の曝露の影響を最小にするために、ヒト以外の哺乳動物に感染するものに由来することができる。カプシド構造は強く保存され、したがって、アデノウイルスの血清型と種は互換性であり得る。
【0084】
アデノウイルスは任意の改変アデノウイルスとすることができる。したがって、改変アデノウイルスは、例えば抗原を付加的にコードすることができる。次いで、これらのコードされた抗原は感染後に発現すると思われる。このことは、ある抗原がウイルスの表面に提示され得るが、別の抗原は宿主細胞機構を使用するベクター形質導入の際に発現され得るように、多面性で予防的または治療的可能性を提供する。したがって、アデノウイルスは、例えば導入遺伝子を含むように、遺伝子修飾され得る。この導入遺伝子は、宿主細胞への送達向けに設計されており、例えば、抗原をコードする遺伝子とすることができる。
【0085】
アデノウイルス媒介性感染力
コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞におけるアデノウイルス感染力は、ファイバータンパク質を介して媒介される。ＣＡＲ受容体を発現する細胞株の例はＨＥＫ２９３細胞である。ファイバーは細胞表面のＣＡＲ受容体に結合し、これはウイルスの最初の付着を媒介する。しかし、最近実証されたところは、アデノウイルスのファイバー媒介性侵入の代わりに、第Ｘ因子（ＦＸ）－ヒト血清に存在する凝固因子が、一部のアデノウイルス血清型のヘキソンタンパク質に結合して、一部の細胞タイプにおいてウイルスの侵入を容易にすることができることである。ヘキソンタンパク質を介する感染を媒介する細胞株の例はＳＫＯＶ３である。アデノウイルスヘキソンを介するＦＸ媒介性感染は、ｉｎ ｖｉｖｏでのアデノウイルスベクターの肝臓向性を増強することができると考えられる。実施例で実証されるように、ＤｏｇＴａｇの挿入および抗原へのカップリングなどのヘキソンタンパク質の改変は、細胞のヘキソン媒介性感染力を減少させる。これは望ましい効果であり、なぜなら、静脈内注射された場合のアデノウイルスの自然な向性は、非常に高い用量にて患者において肝臓毒性を引き起こすおそれがあるからである。肝臓毒性を減少させるようなヘキソン媒介性感染力の減少は、本発明にとって有利であると思われる。
コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞におけるアデノウイルス感染力は、ファイバータンパク質を介して媒介される。ＣＡＲ受容体を発現する細胞株の例はＨＥＫ２９３細胞である。ファイバーは細胞表面のＣＡＲ受容体に結合し、これはウイルスの最初の付着を媒介する。しかし、最近実証されたところは、アデノウイルスのファイバー媒介性侵入の代わりに、第Ｘ因子（ＦＸ）－ヒト血清に存在する凝固因子が、一部のアデノウイルス血清型のヘキソンタンパク質に結合して、一部の細胞タイプにおいてウイルスの侵入を容易にすることができることである。ヘキソンタンパク質を介する感染を媒介する細胞株の例はＳＫＯＶ３である。アデノウイルスヘキソンを介するＦＸ媒介性感染は、ｉｎ ｖｉｖｏでのアデノウイルスベクターの肝臓向性を増強することができると考えられる。実施例で実証されるように、ＤｏｇＴａｇの挿入および抗原へのカップリングなどのヘキソンタンパク質の改変は、細胞のヘキソン媒介性感染力を減少させる。これは望ましい効果であり、なぜなら、静脈内注射された場合のアデノウイルスの自然な向性は、非常に高い用量にて患者において肝臓毒性を引き起こすおそれがあるからである。肝臓毒性を減少させるようなヘキソン媒介性感染力の減少は、本発明にとって有利であると思われる。
【0086】
ヘキソンカプシドタンパク質
ヘキソンカプシドタンパク質は概１００ｋＤａのサイズであり、ビリオンあたり７２０個のモノマーを有する。ヘキソンモノマーは、２０のファセットのそれぞれ上に１２個が存在するように三量体へと組織化され、その結果、ビリオンあたり２４０の三量体がもたらされる。ヘキソン配列は、ウイルス上の外表面のループに相当する超可変領域（ＨＶＲ）を含有しており、したがってウイルスの表面のほぼ全体を覆う。各モノマーは、血清型特異的であるＨＶＲ１～ＨＶＲ７として特定される７つのＨＶＲを有する。ループはウイルスの外面にあるので、ヘキソンループは主たる抗原認識部位であり、宿主の免疫応答の標的である。ヘキソンタンパク質は長さが様々であり、例えば、Ａｄ２は、９６８個のアミノ酸の長さを持つ最長の既知のヘキソンタンパク質である（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０３２７７）。遺伝子治療に最もよく使用されるアデノウイルスであるＡｄ５は、９５２個のアミノ酸の長さを有する（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０４１３３）。血清型特異的エピトープを含有するヘキソンＨＶＲを改変することは、宿主中和応答に打ち勝つための有望なアプローチであると思われる。ＨＶＲのいずれか１つが改変され得た。本明細書に例示のように、驚くべきことにＤｏｇＴａｇを使用して、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２およびＨＶＲ５に改変が首尾よく加えられた。ヘキソンタンパク質が本発明に従って改変され、抗原がペプチドパートナーペアを介して付着された場合、抗アデノウイルス中和抗体による中和が減少した。
ヘキソンカプシドタンパク質は概１００ｋＤａのサイズであり、ビリオンあたり７２０個のモノマーを有する。ヘキソンモノマーは、２０のファセットのそれぞれ上に１２個が存在するように三量体へと組織化され、その結果、ビリオンあたり２４０の三量体がもたらされる。ヘキソン配列は、ウイルス上の外表面のループに相当する超可変領域（ＨＶＲ）を含有しており、したがってウイルスの表面のほぼ全体を覆う。各モノマーは、血清型特異的であるＨＶＲ１～ＨＶＲ７として特定される７つのＨＶＲを有する。ループはウイルスの外面にあるので、ヘキソンループは主たる抗原認識部位であり、宿主の免疫応答の標的である。ヘキソンタンパク質は長さが様々であり、例えば、Ａｄ２は、９６８個のアミノ酸の長さを持つ最長の既知のヘキソンタンパク質である（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０３２７７）。遺伝子治療に最もよく使用されるアデノウイルスであるＡｄ５は、９５２個のアミノ酸の長さを有する（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０４１３３）。血清型特異的エピトープを含有するヘキソンＨＶＲを改変することは、宿主中和応答に打ち勝つための有望なアプローチであると思われる。ＨＶＲのいずれか１つが改変され得た。本明細書に例示のように、驚くべきことにＤｏｇＴａｇを使用して、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２およびＨＶＲ５に改変が首尾よく加えられた。ヘキソンタンパク質が本発明に従って改変され、抗原がペプチドパートナーペアを介して付着された場合、抗アデノウイルス中和抗体による中和が減少した。
【0087】
ｐＩＸカプシドタンパク質
ｐＩＸタンパク質は、概１４．３ｋＤａのサイズであるマイナーカプシドタンパク質である。ビリオンあたり概２４０のｐＩＸモノマーがある。ｐＩＸタンパク質は、ウイルス表面のヘキソンを安定化するように機能する。ｐＩＸタンパク質のＣ末端はウイルスの表面で露出しており、したがって、大小のペプチドの融合にとって望ましい部位である。Ａｄ５ ｐＩＸは、柔軟なリンカーによってつながれた２つのドメインを有する。Ａｄ５ ｐＩＸタンパク質は１９６個のアミノ酸の長さを有する（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ２ＫＳ０３）。
ｐＩＸタンパク質は、概１４．３ｋＤａのサイズであるマイナーカプシドタンパク質である。ビリオンあたり概２４０のｐＩＸモノマーがある。ｐＩＸタンパク質は、ウイルス表面のヘキソンを安定化するように機能する。ｐＩＸタンパク質のＣ末端はウイルスの表面で露出しており、したがって、大小のペプチドの融合にとって望ましい部位である。Ａｄ５ ｐＩＸは、柔軟なリンカーによってつながれた２つのドメインを有する。Ａｄ５ ｐＩＸタンパク質は１９６個のアミノ酸の長さを有する（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ２ＫＳ０３）。
【0088】
カプシドタンパク質への改変
カプシドタンパク質への改変は、遺伝子的であっても、化学物質を含めて非遺伝子的であってもよい。カプシドタンパク質は、カプシドへの抗原の組込みを通して遺伝子修飾され得る。あるいは、ウイルス粒子表面が直接改変され得る。３つのメジャーカプシドタンパク質すべての改変がこれまでに実証されてきた。しかし、これらの改変からの結果は雑多であり、特にヘキソンの改変に関して、最も有望なアプローチが提供するインサートのサイズにおいて大きな障害がある。
カプシドタンパク質への改変は、遺伝子的であっても、化学物質を含めて非遺伝子的であってもよい。カプシドタンパク質は、カプシドへの抗原の組込みを通して遺伝子修飾され得る。あるいは、ウイルス粒子表面が直接改変され得る。３つのメジャーカプシドタンパク質すべての改変がこれまでに実証されてきた。しかし、これらの改変からの結果は雑多であり、特にヘキソンの改変に関して、最も有望なアプローチが提供するインサートのサイズにおいて大きな障害がある。
【0089】
本明細書で使用される「少なくとも１つの改変」とは、適当な任意の手段を使用するウイルスカプシドタンパク質への第１のペプチドパートナー挿入の包含を指す。例えば、アデノウイルスヘキソンループへの第１のペプチドパートナーの挿入、またはアデノウイルスｐＩＸマイナーカプシドタンパク質への第１のペプチドパートナーの融合。この改変は、例えば、遺伝子融合を通して遺伝的に、または化学的に行われ得る。
【0090】
挿入
第１のペプチドパートナーは、関連するカプシドタンパク質へと直接に挿入され得る。本明細書で論議のように、かかる挿入は遺伝子操作によって行われる。あるいは、第１のペプチドパートナーは、第１のペプチドパートナーをカプシドタンパク質から隔てる適切な任意の長さのペプチド配列とともに挿入され得る。このペプチド配列は、リンカー配列、スペーサー配列、ヘリックスなどの構造配列、またはさらにはヒンジ配列とすることができる。リンカー配列またはスペーサー配列は、カプシドタンパク質と第１のペプチドパートナーを単に隔てることができ、２つの実体間の「リンク」として機能することができる。構造配列が、カプシドタンパク質からの第１のペプチドパートナーの物理的な分かれ目を提供することができる。ヒンジ配列は、カプシドタンパク質と第１のペプチドパートナーとの間のリンカーとして機能することができるが、第１のペプチドパートナーがカプシドタンパク質に対して動くことができるように、ある程度の動きが生じることを可能にすることができる。種々のリンカー、スペーサーおよびヒンジの各配列が本明細書で例示されており、とりわけ注目すべきものは図１２に図示される。
第１のペプチドパートナーは、関連するカプシドタンパク質へと直接に挿入され得る。本明細書で論議のように、かかる挿入は遺伝子操作によって行われる。あるいは、第１のペプチドパートナーは、第１のペプチドパートナーをカプシドタンパク質から隔てる適切な任意の長さのペプチド配列とともに挿入され得る。このペプチド配列は、リンカー配列、スペーサー配列、ヘリックスなどの構造配列、またはさらにはヒンジ配列とすることができる。リンカー配列またはスペーサー配列は、カプシドタンパク質と第１のペプチドパートナーを単に隔てることができ、２つの実体間の「リンク」として機能することができる。構造配列が、カプシドタンパク質からの第１のペプチドパートナーの物理的な分かれ目を提供することができる。ヒンジ配列は、カプシドタンパク質と第１のペプチドパートナーとの間のリンカーとして機能することができるが、第１のペプチドパートナーがカプシドタンパク質に対して動くことができるように、ある程度の動きが生じることを可能にすることができる。種々のリンカー、スペーサーおよびヒンジの各配列が本明細書で例示されており、とりわけ注目すべきものは図１２に図示される。
【0091】
挿入が配列のループへとする場合、第１のペプチドパートナーは、片側または両側上のカプシドタンパク質から隔てられ得る、すなわち、リンカー、スペーサー、構造物またはヒンジである配列によって隣接され得る。各隣接側は同じでも異なっていてもよい。
【0092】
ペプチドパートナーペア
自発性のイソペプチド結合形成ができるタンパク質（いわゆる「イソペプチドタンパク質」）は、互いに共有結合するとともに不可逆的な相互作用を提供するペプチドパートナーペア（すなわち、２パートのリンカー）を開発するのに効果的に使用されてきた（例えば、両方が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０９８７７２およびＷＯ２０１６／１９３７４６を、両方が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１８９５１７およびＷＯ２０１８／１９７８５４と一緒に、参照されたい）。この点で、自発性のイソペプチド結合形成を可能とするタンパク質は、個別の断片として発現されて、第１のペプチドパートナーと第１のペプチドパートナー向けのペプチド結合パートナーである第２のペプチドパートナーとを与え得ることができ、ここで、この２つの断片は、イソペプチド結合形成によって共有結合で再構成することができる。この共有結合による再構成は、第２のペプチドパートナーに融合された分子または成分と不可欠な第１のペプチドパートナーとを連結する。ペプチドパートナーペアによって形成されるイソペプチド結合は、非共有結合の相互作用が急速に解離することになる条件下で、例えば、長期間（例えば数週間）にわたり、高温にて（少なくとも９５℃まで）、高力にて、または過酷な化学処理で（例えばｐＨ２～１１、有機溶媒、洗剤または変性剤）安定である。
自発性のイソペプチド結合形成ができるタンパク質（いわゆる「イソペプチドタンパク質」）は、互いに共有結合するとともに不可逆的な相互作用を提供するペプチドパートナーペア（すなわち、２パートのリンカー）を開発するのに効果的に使用されてきた（例えば、両方が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０９８７７２およびＷＯ２０１６／１９３７４６を、両方が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１８９５１７およびＷＯ２０１８／１９７８５４と一緒に、参照されたい）。この点で、自発性のイソペプチド結合形成を可能とするタンパク質は、個別の断片として発現されて、第１のペプチドパートナーと第１のペプチドパートナー向けのペプチド結合パートナーである第２のペプチドパートナーとを与え得ることができ、ここで、この２つの断片は、イソペプチド結合形成によって共有結合で再構成することができる。この共有結合による再構成は、第２のペプチドパートナーに融合された分子または成分と不可欠な第１のペプチドパートナーとを連結する。ペプチドパートナーペアによって形成されるイソペプチド結合は、非共有結合の相互作用が急速に解離することになる条件下で、例えば、長期間（例えば数週間）にわたり、高温にて（少なくとも９５℃まで）、高力にて、または過酷な化学処理で（例えばｐＨ２～１１、有機溶媒、洗剤または変性剤）安定である。
【0093】
イソペプチド結合とは、カルボキシル／カルボキサミドとアミノ基の間に形成されるアミド結合であり、この場合、当該カルボキシル基またはアミノ基の少なくとも１つがタンパク質の主鎖（タンパク質の骨格）の外側にある。かかる結合は、通常の生物学的条件下では化学的に不可逆的であり、ほとんどのプロテアーゼに耐性である。イソペプチド結合は本質的に共有結合であるので、測定された最も強力なタンパク質間相互作用の一部をもたらす。
【0094】
手短に述べると、２パートのリンカー、すなわちペプチドパートナーペア（いわゆるペプチドタグ／結合パートナーまたはキャッチャーペア）は、イソペプチド結合を自発的に形成することができるタンパク質（イソペプチドタンパク質）に由来することができ、この場合、当該タンパク質のドメインが別々に発現されて、イソペプチド結合に関与する残基のうちの一方（例えば、アスパラギン酸もしくはアスパラギン、またはリジン）を含むペプチド「タグ」と、イソペプチド結合に関与する他方の残基（例えば、リジン、またはアスパラギン酸もしくはアスパラギン）、およびイソペプチド結合を形成するのに必要な少なくとも１つの他の残基（例えばグルタミン酸）を含むペプチドまたはペプチド結合パートナー（または「キャッチャー」）とを生成する。ペプチドタグと結合／キャッチャーパートナーを混合すると、タグと結合パートナーの間にイソペプチド結合の自発性の形成がもたらされる。したがって、ペプチドタグと結合パートナーを別の分子または成分、例えばタンパク質へと別々に組み込むことによって、ペプチドタグと結合パートナーとの間に形成されるイソペプチド結合を介して一緒に前記分子または成分を共有結合で連結させること、すなわち、ペプチドタグを組込み分子または成分と結合パートナーとの間にリンカーを形成することができる。
【0095】
イソペプチド結合の自発性の形成は単独であってもよく、他の任意の実体の添加を必要としない場合がある。一部のペプチドタグと結合／キャッチャーパートナーのペアの場合、イソペプチド結合を生じるために、リガーゼなどの第３の実体またはヘルパー実体の存在が必要とされる場合がある。
【0096】
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称されるペプチドタグ／結合パートナーペア（２パートのリンカー）は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＦｂａＢタンパク質のＣｎａＢ２ドメインに由来し（Ｚａｋｅｒｉら、２０１２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９、Ｅ６９０～６９７）、ワクチン開発を始めとする多様な用途で使用されてきた（Ｂｒｕｎｅら、２０１６、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６、１９２３４；Ｔｈｒａｎｅら、２０１６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、３０）。
【0097】
結合ペアのバリアント、派生物および改変物は、適切な任意の手段によって作製され得る。バリアント、派生物、および機能的に作動可能な改変物は、関連する結合パートナーとのイソペプチド結合を形成する能力に関して、同じ機能を保持するアミノ酸の付加、置換、変更または欠失を伴うことができる。
【0098】
一部の結合ペアの場合、酵素などの第３の実体による媒介が必要とされる。例えば、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＳｎｏｏｐＴａｇとＤｏｇＴａｇの間の結合形成を媒介するために、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅが使用され得る。したがって、ペアリングは、リガーゼなどの酵素の補助を必要とする場合がある。
【0099】
本明細書で使用される場合、第１のペプチドパートナーまたは第２のペプチドパートナーのいずれかがペプチド「タグ」とすることができ、他方が「結合パートナー／キャッチャー」であることが理解されよう。
【0100】
適切には、第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称されるペプチドパートナーペアを形成する。適切には、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ成分はＤｅｌｔａＮ１（ΔＮ１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒであり（Ｌｉ、Ｌ．、Ｆｉｅｒｅｒ、Ｊ．Ｏ．、Ｒａｐｏｐｏｒｔ、Ｔ．Ａ．＆Ｈｏｗａｒｔｈ、Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ａｎｄ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔａｇ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２６、３０９～３１７（２０１４）に記載の）、これは、「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」と比較して、Ｎ末端に２３個のアミノ酸短縮化を有する。
【0101】
他の実施形態では、第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーは、例えば、同時係属出願、ＧＢ１７０６４３０．４に記載のものなどのイソペプチド結合形成にあたり反応の速度上昇を提示するＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの突然変異バージョンであるペプチドパートナーペアを形成する。一部の実施形態では、これら突然変異型形態は、大タンパク質（例えば、本明細書で例示される＞１６０ｋＤａのＨＣＭＶ五量体タンパク質などの、＞５０ｋＤａまたは＞１００ｋＤａ）の付着にとって、および／またはこの場合、緩徐な反応または立体障害が問題となり得るが、有用であり得る。
【0102】
他の実施形態では、ペプチドパートナーペアを形成するイソペプチドタンパク質には、例えば、ＷＯ２０１６／１９３７４６に記載の、ＳｎｏｏｐＴａｇ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒが含まれ得る。
【0103】
一部の実施形態では、ペプチドパートナーペアを形成するイソペプチドタンパク質の一方または両方は、Ｎ末端短縮化またはＣ末端短縮化を有することができ、一方、イソペプチド結合の反応性をなおも保持する。
【0104】
例示的な第１のペプチドパートナーと第２のペプチドパートナーのペア（ペプチドタグ／結合パートナーペア；反応性ペア）を以下の表に記載する：
【0105】
【表1】
【0106】
結合ペアのバリアント、派生物および改変物は、適切な任意の手段によって作製され得る。バリアント、派生物、および機能的に作動可能な改変物は、関連する結合パートナーとのイソペプチド結合を形成する能力に関して、同じ機能を保持するアミノ酸の付加、置換、変更または欠失を伴うことができる。
【0107】
一部の結合ペアの場合、酵素などの第３の実体による媒介が必要とされる。例えば、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＤｏｇＴａｇの間の結合形成を媒介するために、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅが使用され得る。したがって、ペアリングは、リガーゼなどの酵素の補助を必要とする場合がある。
【0108】
抗原
本明細書で使用される抗原とは、免疫応答を誘導することができる任意の分子を指す。抗原は、自己抗原、がん抗原、アレルギー性抗原、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原または真菌抗原とすることができる。腫瘍抗原には、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原およびがん性細胞によって新たに形成された抗原であるネオアンチゲンが含まれる。「腫瘍特異的抗原」とは、腫瘍細胞上でのみ見いだされる抗原を指す。「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍細胞と正常細胞の両方によって提示される抗原を指す。「ネオアンチゲン」とは、腫瘍細胞によって新たに形成された抗原を指す。本明細書で使用される「抗原」には、ペプチドおよびエピトープ、それらのバリアントおよび派生物が含まれる。
本明細書で使用される抗原とは、免疫応答を誘導することができる任意の分子を指す。抗原は、自己抗原、がん抗原、アレルギー性抗原、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原または真菌抗原とすることができる。腫瘍抗原には、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原およびがん性細胞によって新たに形成された抗原であるネオアンチゲンが含まれる。「腫瘍特異的抗原」とは、腫瘍細胞上でのみ見いだされる抗原を指す。「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍細胞と正常細胞の両方によって提示される抗原を指す。「ネオアンチゲン」とは、腫瘍細胞によって新たに形成された抗原を指す。本明細書で使用される「抗原」には、ペプチドおよびエピトープ、それらのバリアントおよび派生物が含まれる。
【0109】
腫瘍関連抗原には、それらに限定されないが、以下が含まれる：アジポフィリン、ＡＩＭ－２、ＡＬＤＨ１Ａ１、アルファ－アクチニン－４、アルファ－フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＲＴＣ１、Ｂ－ＲＡＦ、ＢＡＧＥ－１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合タンパク質ｂ３ａ２、ベータ－カテニン、ＢＩＮＧ－４、ＣＡ－１２５、ＣＡＬＣＡ、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＧＥ１～８、ＣＡＳＰ－５、ＣＡＳＰ－８、ＣＤ２７４、ＣＤ４５、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ－１、ＣＰＳＦ、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＴＡＧ１、ＣＴＡＧ２、サイクリンＤｌ、サイクリン－Ａｌ、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＤＫＫ１、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＥＺＨ２、ＥｒｂＢ受容体、Ｅ６、Ｅ７、ＦＧＦ５、ＦＬＴ３－ＩＴＤ、ＦＮ１、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＧＡＧＥ－１、２、８、ＧＡＧＥ－３、４、５、６、７、ＧＡＳ７、グリピカン－３、ＧｎＴＶ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、へプシン、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ｈｓｐ７０－２、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７抗原、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、Ｋ－ｒａｓ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、ＫＫ－ＬＣ－１、ＫＫＬＣ１、ＫＭ－ＨＮ－１、ＣＣＤＣ１１０としても知られるＫＭＨＮ１、ＬＡＧＥ－１、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、リンゴ酸酵素、マンマグロビン－Ａ、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＣ１Ｒ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ－２、ＭＥ１、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、メロエ（Ｍｅｌｏｅ）、ミッドカイン、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ムチン、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン、ミオシンクラスＩ、Ｎ－ｒａｗ、ＮＡ８８－Ａ、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ＮＦＹＣ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－ｌ／ＬＡＧＥ－２、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＳ－９、Ｐポリペプチド、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ｐｍｌ－ＲＡＲアルファ融合タンパク質、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＢ３８／Ｎ Ｙ－ＭＥＬ－１、ＲＡＧＥ－１、ＲＢＡＦ６００、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、Ｒ Ｆ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＡＧＥ、セセルニン１、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＯＸ１０、Ｓｐｌ７、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－４、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＳＹＴ－ＳＳＸ１または－ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＡＧ－１、ＴＡＧ－２、テロメラーゼ、ＴＧＦ－ベータＲＩＩ、ＴＰＢＧ、ＴＲＡＧ－３、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＴＲＰ－ｌ／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＸＡＧＥ－ｌｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ。
【0110】
腫瘍関連抗原を特定する当業者であれば、ネオアンチゲンを含めて、新しい抗原が継続的に特定されること、したがってこのリストが網羅的ではないことを理解するであろう。
ウイルス抗原には、それらに限定されないが、以下のウイルスまたはウイルスのクラスの抗原が含まれる；ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ２／ＨＳＶ１）、インフルエンザウイルス（タイプＡ、ＢおよびＣ）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロータウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス群、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、バリセラ－ゾスターウイルス、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、エプスタイン－バーウイルス、アデノウイルス、ルベラウイルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ－Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。
ウイルス抗原には、それらに限定されないが、以下のウイルスまたはウイルスのクラスの抗原が含まれる；ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ２／ＨＳＶ１）、インフルエンザウイルス（タイプＡ、ＢおよびＣ）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロータウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス群、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、バリセラ－ゾスターウイルス、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、エプスタイン－バーウイルス、アデノウイルス、ルベラウイルス、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｉ型ウイルス（ＨＴＬＶ－Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。
【0111】
細菌抗原には、それらに限定されないが、以下の細菌の抗原が含まれる：結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、トレポネマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（タイプＡおよびＢ）、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、メニンゴコッカス属（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（ｂ型）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ｔｙｐｅ ｂ））、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）およびアクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）。
【0112】
真菌抗原にはそれらに限定されないが、以下の真菌病原体の抗原が含まれる：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）およびニューモシスティス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）。
【0113】
寄生虫抗原には、それらに限定されないが、以下の寄生虫病原体の抗原が含まれる：テニア属（Ｔａｅｎｉａ）、吸虫、回虫、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、アメーバ属（Ａｍｏｅｂａ）、ジャルディア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）および旋毛虫属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）。
【0114】
カップリングに先立ち抗原－第２ペプチドパートナーの発現を増強するために、リーダー配列が使用され得る。当業者であれば、発現を増強するための適当なリーダー配列を知っている。かかるものが本明細書に例示される。
【0115】
医薬組成物および用途
本発明の組成物は、ワクチンまたは治療用組成物に組み込まれ得る。適切には、ワクチンまたは免疫原性組成物は、免疫原性用量で本発明の粒子を含むことになる。
本発明の組成物は、ワクチンまたは治療用組成物に組み込まれ得る。適切には、ワクチンまたは免疫原性組成物は、免疫原性用量で本発明の粒子を含むことになる。
【0116】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体とともに供給される、本発明による粒子または組成物を含むことができる。適切な担体は当業者によく知られる。一実施形態では、医薬組成物は、緩衝剤、賦形剤または担体を含む。適切には、医薬組成物は、組成物の安定性を維持するために適切な賦形剤および製剤を含むことができる。適切には、製剤はアジュバントを含むことができる。一実施形態では、製剤は、ＡｄｄａＶａｘ（商標）またはＭＦ５９（登録商標）と類似の製剤を有する類似のスクアレンベースの水中油型ナノエマルジョンを含むことができる。他の適切なアジュバントには、Ｍａｔｒｉｘ ＭおよびＡＳ０１などのリポソームベースのアジュバントが含まれる。他の適切なアジュバントには、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ(登録商標)などのアルミニウムベースの製剤が含まれる。一実施形態では、製剤は、例えば５ｍＭの濃度でＥＤＴＡを含むことができる。適切な賦形剤または製剤は、粒子または免疫原性組成物の特性によって異なってもよい；例えば、発現系の選択は、組成物のタンパク質の安定性、グリコシル化または折り畳みに影響を及ぼす場合があり、それらは次いで、組成物の最適な製剤化に影響を及ぼす可能性がある。適切な賦形剤、製剤またはアジュバントを決定する方法は、当業者であれば知っているであろう。
ワクチン
ワクチンとはある断片または完全な実体を含む調製物であり、上記断片または完全な実体に対する免疫応答を起こすことができる。ワクチンとは、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質などの実体または免疫応答を誘導することができるそれらの断片である。例えば、ワクチンは、微生物または前記微生物に対する免疫応答を誘導することができるそれらの一部を含むことができる。本発明による免疫原性アデノウイルスベクターを含むワクチンは、免疫応答の誘導のために、提示された抗原が極めて重要である任意の病原体に対して使用され得る。さらに、ワクチンは、腫瘍関連抗原を提示する、本発明による免疫原性アデノウイルスベクターを含むことができる。これら腫瘍関連抗原は、改変された自己タンパク質等とすることができる。したがって、ワクチンは腫瘍細胞への免疫応答を起こすことができる。
ワクチン
ワクチンとはある断片または完全な実体を含む調製物であり、上記断片または完全な実体に対する免疫応答を起こすことができる。ワクチンとは、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質などの実体または免疫応答を誘導することができるそれらの断片である。例えば、ワクチンは、微生物または前記微生物に対する免疫応答を誘導することができるそれらの一部を含むことができる。本発明による免疫原性アデノウイルスベクターを含むワクチンは、免疫応答の誘導のために、提示された抗原が極めて重要である任意の病原体に対して使用され得る。さらに、ワクチンは、腫瘍関連抗原を提示する、本発明による免疫原性アデノウイルスベクターを含むことができる。これら腫瘍関連抗原は、改変された自己タンパク質等とすることができる。したがって、ワクチンは腫瘍細胞への免疫応答を起こすことができる。
【0117】
かかるワクチン組成物（または他の免疫原性）は、適切な送達媒体に製剤化される。一般に、免疫原性組成物の用量は、治療用組成物に対して定められた範囲内である。必要に応じて、本発明のワクチン組成物は、例えば、アジュバント、安定剤、ｐＨ調整剤、保存剤等を含めて、他の成分を含有するように製剤化され得る。かかる成分は、ワクチンの分野の当業者であればよく知られる。適切なアジュバントの例には、限定されないが、リポソーム、ミョウバン、モノホスホリルリピドＡ、およびサイトカイン、インターロイキン、ケモカインおよびそれらの最適な組み合わせなどの生物学的に活性な任意の因子が含まれる。
【0118】
本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸に、局部に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、膀胱内に、粘膜に、心膜内に、経口的に、局所に、ならびに／または、エアゾール、注射、輸注、持続輸注、標的細胞を直接にもしくはカテーテルを介して浸す局所かん流および／または洗浄を使用して、投与され得る。
【0119】
本明細書で使用される疾患の処置または予防のためのワクチンには、それらに限定されないが、以下が含まれる：泌尿生殖器がん（前立腺がん、腎細胞がん、膀胱がん等）、婦人科がん（卵巣がん、子宮頸部がん、子宮内膜がん等）、肺がん、胃腸がん（非転移性または転移性結腸直腸がん、膵がん、胃がん、食道がん、肝細胞がん、胆管細胞がん等）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、悪性神経膠芽腫、悪性中皮腫、非転移性または転移性乳がん（例えば、ホルモン不応性転移性乳がん）、悪性メラノーマ、メルケル細胞癌または骨軟部肉腫、ならびに多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および急性リンパ芽球性白血病等の血液学的新生物が含まれる。好ましい実施形態では、疾患は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん（例えば、ホルモン不応性転移性乳がん）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、ホルモン感受性もしくはホルモン不応性前立腺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、肝細胞がん、腎細胞がん、軟部組織肉腫または小細胞肺がんである。
【0120】
ワクチンは、上文に記載の疾患を引き起こす病原体のいずれか１つによる感染を処置または予防するために使用され得る。
Ａｄ－ＤｏｇＴａｇ
「Ａｄ－ＤｏｇＴａｇ」ウイルスベクターは、最大およそ７２０のリガンド／ビリオンの提示を可能にする、ヘキソンカプシドタンパク質の表面ループへのＤｏｇＴａｇの挿入を含む。ヘキソン－ＤｏｇＴａｇへの抗原のカップリングは、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－タグ抗原を使用して（触媒としてＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを使用して）、またはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ連結抗原を介して直接に、本発明者らによって達成された。以前の技術は、＜１００個のアミノ酸の長さを有する、免疫原性Ｔ細胞またはＢ細胞の小エピトープをアデノウイルスのヘキソンループへと挿入することしかできなかった。本発明が実証するところは、従来、達成することができなかった、ヘキソンへの１０～６０ｋＤａのペプチドのカップリングである。このことは、特にアデノウイルスをベースとするワクチンの開発における大きな前進を表す。
Ａｄ－ＤｏｇＴａｇ
「Ａｄ－ＤｏｇＴａｇ」ウイルスベクターは、最大およそ７２０のリガンド／ビリオンの提示を可能にする、ヘキソンカプシドタンパク質の表面ループへのＤｏｇＴａｇの挿入を含む。ヘキソン－ＤｏｇＴａｇへの抗原のカップリングは、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－タグ抗原を使用して（触媒としてＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを使用して）、またはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ連結抗原を介して直接に、本発明者らによって達成された。以前の技術は、＜１００個のアミノ酸の長さを有する、免疫原性Ｔ細胞またはＢ細胞の小エピトープをアデノウイルスのヘキソンループへと挿入することしかできなかった。本発明が実証するところは、従来、達成することができなかった、ヘキソンへの１０～６０ｋＤａのペプチドのカップリングである。このことは、特にアデノウイルスをベースとするワクチンの開発における大きな前進を表す。
【0121】
Ａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
「Ａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの融合を含む。最近の発明は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変することに成功した。
「Ａｄ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの融合を含む。最近の発明は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変することに成功した。
【0122】
Ａｄ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ
「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
【0123】
Ａｄ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ
「Ａｄ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
「Ａｄ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
【0124】
Ａｄ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ
「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
「Ａｄ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
【0125】
Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ
「Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｐｙＴａｇの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
「Ａｄ－ＳｐｙＴａｇ」ウイルスベクターは、アデノウイルスマイナーカプシドタンパク質ｐＩＸのＣ末端上へのＳｐｙＴａｇの融合を含む。本明細書の研究は、ウイルス感染力を喪失することなく、ｐＩＸマイナーカプシドタンパク質を改変する上での成功を示す。
【0126】
本明細書で記述されるすべての参考文献は、認められる場合、参照により組み込まれる。
【実施例】
【0127】
次に、本発明のある特定の態様および実施形態を、一例として、上記の図を参照して例示する。
実施例－材料および方法：
ＧＦＰを発現する、Ａｄ５の細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来の複製欠損分子クローンの生成
プラスミドｐＡｄ－ＰＬ－ＤＥＳＴ、すなわちＡｄ５のＥ１／Ｅ３欠失（したがって複製欠損）分子クローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を駆動する前初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）から構成される発現構築物を、シャトルベクターｐＥＮＴＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングした。次いで、ＣＭＶｐ ＥＧＦＰ発現構築物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ部位特異的組換え（ＬＲクロナーゼ）技術を使用してＡｄ５ Ｅ１遺伝子座へと挿入した。ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１（ＮＥＢ）からのＢＡＣ配列を、フォワード（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡｃｇｔｃｇａｃｃａａｔｔｃｔｃａｔｇ）およびリバース（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡｇｔｃｇａｃａｇｃｇａｃａｃａｃｔｔｇ）のプライマーを使用して増幅して、ＢＡＣカセットのいずれかの末端でＰａｃＩ部位を導入した。続いて、Ａｄ５（ＧＦＰ）ゲノム配列全体をＰａｃＩを含むＢＡＣへとクローニングして、ｐＢＡＣ－Ａｄ５（ＧＦＰ）を生成した。
実施例－材料および方法：
ＧＦＰを発現する、Ａｄ５の細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来の複製欠損分子クローンの生成
プラスミドｐＡｄ－ＰＬ－ＤＥＳＴ、すなわちＡｄ５のＥ１／Ｅ３欠失（したがって複製欠損）分子クローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現を駆動する前初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）から構成される発現構築物を、シャトルベクターｐＥＮＴＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングした。次いで、ＣＭＶｐ ＥＧＦＰ発現構築物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ部位特異的組換え（ＬＲクロナーゼ）技術を使用してＡｄ５ Ｅ１遺伝子座へと挿入した。ｐＢＥＬＯＢＡＣ１１（ＮＥＢ）からのＢＡＣ配列を、フォワード（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡｃｇｔｃｇａｃｃａａｔｔｃｔｃａｔｇ）およびリバース（５’－ＴＴＡＡＴＴＡＡｇｔｃｇａｃａｇｃｇａｃａｃａｃｔｔｇ）のプライマーを使用して増幅して、ＢＡＣカセットのいずれかの末端でＰａｃＩ部位を導入した。続いて、Ａｄ５（ＧＦＰ）ゲノム配列全体をＰａｃＩを含むＢＡＣへとクローニングして、ｐＢＡＣ－Ａｄ５（ＧＦＰ）を生成した。
【0128】
ＢＡＣ ＧａｌＫ組換え技術を使用して、プロテインスーパーグルー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ）技術をウイルスカプシドタンパク質へと挿入するためのｐＢＡＣ－Ａｄ５（ＧＦＰ）の遺伝子修飾
ＧａｌＫ組換え技術に必要な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であるＳＷ１０２を、米国のアメリカ国立衛生研究所の国立がん研究所から入手した。ＤＨ１０Ｂから改変したが、ＳＷ１０２細胞は、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）遺伝子（これは、ガラクトースを唯一の炭素源として使用する細菌の増殖に必要である）が欠損された状態で温度感受性リプレッサーの制御下にあるλ－Ｒｅｄコード化組換え遺伝子（ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍ）を含有する。ＧａｌＫ組換え技術システムは、ＧａｌＫ遺伝子がポジティブセレクションとネガティブセレクションの両方に使用されることを可能にするが、ＧａｌＫ組換え技術を、Ｗａｒｍｉｎｇら、２００５［Ｗａｒｍｉｎｇ Ｓ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ、Ｊｅｎｋｉｎｓ ＮＡ、Ｃｏｐｅｌａｎｄ ＮＧ．Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５；３３（４）：ｅ３６］に記載の通り、正確に実施した。組換え技術によるこれら特定の遺伝子座にてのＧａｌＫ遺伝子の挿入によって、これに続くＧａｌＫの存在についてのポジティブセレクションによって、ヘキソンＨＶＲループ（図１Ｅに記載のように）中にまたはｐＩＸのＣ末端に、挿入部位を創製した。ＳｐｙＴａｇ／ＤｏｇＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの各配列の挿入を、ＧａｌＫを置き換える組換え技術、２－デオキシガラクトースを使用するＧａｌＫ遺伝子の存在に対して続いて行う選択によって、実施した。
ＧａｌＫ組換え技術に必要な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であるＳＷ１０２を、米国のアメリカ国立衛生研究所の国立がん研究所から入手した。ＤＨ１０Ｂから改変したが、ＳＷ１０２細胞は、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）遺伝子（これは、ガラクトースを唯一の炭素源として使用する細菌の増殖に必要である）が欠損された状態で温度感受性リプレッサーの制御下にあるλ－Ｒｅｄコード化組換え遺伝子（ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍ）を含有する。ＧａｌＫ組換え技術システムは、ＧａｌＫ遺伝子がポジティブセレクションとネガティブセレクションの両方に使用されることを可能にするが、ＧａｌＫ組換え技術を、Ｗａｒｍｉｎｇら、２００５［Ｗａｒｍｉｎｇ Ｓ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ、Ｊｅｎｋｉｎｓ ＮＡ、Ｃｏｐｅｌａｎｄ ＮＧ．Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｇａｌＫ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５；３３（４）：ｅ３６］に記載の通り、正確に実施した。組換え技術によるこれら特定の遺伝子座にてのＧａｌＫ遺伝子の挿入によって、これに続くＧａｌＫの存在についてのポジティブセレクションによって、ヘキソンＨＶＲループ（図１Ｅに記載のように）中にまたはｐＩＸのＣ末端に、挿入部位を創製した。ＳｐｙＴａｇ／ＤｏｇＴａｇ／ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ／ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの各配列の挿入を、ＧａｌＫを置き換える組換え技術、２－デオキシガラクトースを使用するＧａｌＫ遺伝子の存在に対して続いて行う選択によって、実施した。
【0129】
プロテインスーパーグルー技術を組み込む組換えアデノウイルスのレスキュー
組換えアデノウイルス分子クローン由来のＢＡＣ ＤＮＡを、左右のウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を放出するように、ＰａｃＩを用いて線状化した。線状化ＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２５ｃｍ２フラスコ（Ｔ２５）中でＥ１－相補的Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフェクトした。細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した後、細胞を回収し、３サイクルの凍結融解に供し、ウイルスをＨＥＫ２９３Ａ細胞でさらに増幅させた。１０×１５０ｃｍ２フラスコ（Ｔ１５０）に感染させて、ウイルスを４８時間後に感染細胞から回収し、標準プロトコルに従ってＣｓＣｌ勾配超遠心分離によって精製した。精製ウイルスをショ糖保存緩衝剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、７．５％ｗ／ｖショ糖、ｐＨ７．８）に対して透析し、－８０℃で保存した。
組換えアデノウイルス分子クローン由来のＢＡＣ ＤＮＡを、左右のウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を放出するように、ＰａｃＩを用いて線状化した。線状化ＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２５ｃｍ２フラスコ（Ｔ２５）中でＥ１－相補的Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）２９３Ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフェクトした。細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した後、細胞を回収し、３サイクルの凍結融解に供し、ウイルスをＨＥＫ２９３Ａ細胞でさらに増幅させた。１０×１５０ｃｍ２フラスコ（Ｔ１５０）に感染させて、ウイルスを４８時間後に感染細胞から回収し、標準プロトコルに従ってＣｓＣｌ勾配超遠心分離によって精製した。精製ウイルスをショ糖保存緩衝剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、７．５％ｗ／ｖショ糖、ｐＨ７．８）に対して透析し、－８０℃で保存した。
【0130】
精製ウイルスベクター調製物のウイルス粒子カウントの推定
精製調製物中のアデノウイルス粒子の数を、Ｍａｉｚｅｌら、１９６８．［Ｊ．Ｍａｉｚｅｌ、Ｄ．Ｗｈｉｔｅ、Ｍ．Ｓｃｈａｒｆｆ、Ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ａｎｄ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ２、７Ａ、ａｎｄ １２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３６巻、１号、１９６８年９月、１１５～１２５頁］によって記載のように、２６０ｎｍにての分光光度吸収によりウイルスＤＮＡ含有量を測定することによって推定することができる。手短に述べると、試料を１％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有ウイルス保存緩衝剤で１：１０に希釈して、カプシドからウイルスＤＮＡを放出させ、分光光度計を使用して２６０ｎｍにての吸光度を測定した。２６０ｎｍにての１．００（ＡＵ、１ｃｍパス長）の吸光度は、１．１×１０１２ウイルス粒子／ｍＬに相当する。
精製調製物中のアデノウイルス粒子の数を、Ｍａｉｚｅｌら、１９６８．［Ｊ．Ｍａｉｚｅｌ、Ｄ．Ｗｈｉｔｅ、Ｍ．Ｓｃｈａｒｆｆ、Ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ａｎｄ ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅｓ ２、７Ａ、ａｎｄ １２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３６巻、１号、１９６８年９月、１１５～１２５頁］によって記載のように、２６０ｎｍにての分光光度吸収によりウイルスＤＮＡ含有量を測定することによって推定することができる。手短に述べると、試料を１％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有ウイルス保存緩衝剤で１：１０に希釈して、カプシドからウイルスＤＮＡを放出させ、分光光度計を使用して２６０ｎｍにての吸光度を測定した。２６０ｎｍにての１．００（ＡＵ、１ｃｍパス長）の吸光度は、１．１×１０１２ウイルス粒子／ｍＬに相当する。
【0131】
ＨＥＫ２９３Ａ細胞における組換えアデノウイルスの感染タイトレーション
ベクター調製物の感染力価を、ＨＥＫ２９３Ａ細胞での単一細胞感染力アッセイによって評価した。ＥＧＦＰを発現するベクターの場合、感染ＨＥＫ２９３細胞を可視化し、蛍光顕微鏡により直接計数した。蛍光マーカーのないベクター用の代替アッセイについても、ヘキソンカプシドタンパク質の発現を免疫染色することによって、試験した（図５）。完全培地（ダルベッコの改変イーグルス培地、プラス１×ＧｌｕｔａＭＡＸおよび１０％ｖ／ｖウシ胎児血清）でのウイルスの１０倍連続希釈を、滅菌９６ウェルディープウェルプレートで実施した。２または３の連続希釈をウイルスごとに行い、各希釈液５０μＬ（１０３～１０１０希釈）を、８０～９０％コンフルエンシーにて付着性ＨＥＫ２９３細胞を含有する９６ウェルプレートのウェルごとに添加した。ヘキソン免疫染色の場合、ポリ－Ｌ－リジンでプレコーティングした９６ウェルプレートを使用して、プレート表面への細胞接着を改善した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＥＧＦＰ発現ベクターのタイトレーションの場合、感染の４８時間後に、単一のＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡により計数し、感染力価を１ｍＬあたりの感染単位（ｉｆｕ）で算出した。ヘキソン免疫染色の場合、培地を細胞単層から吸引し、細胞を氷冷メタノールで固定した。次いで、プレートをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×、Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄した後、３％ｗ／ｖ低脂肪ミルク（Ｍａｒｖｅｌ）で１時間ブロックした。検出マウスモノクローナル抗ヘキソン抗体（Ｂ０２５／ＡＤ５１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖミルクで１：１０００希釈にて添加し、２５℃で１時間インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中の１％ｗ／ｖミルクでさらに３回洗浄し、これに続いて、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖミルクで１：１０００希釈にて二次ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）コンジュゲート抗体（ＳＴＡＲ１１７Ａ、ＢｉｏＲａｄ）を添加した。さらに１時間インキュベートした後、発色に先立ちプレートをＰＢＳ中で５回洗浄した。発色させるために、新たに調製したＳＩＧＭＡｆａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｓｉｇｍａ）１００μＬを各ウェルに添加し、単一の感染細胞を表す暗く染色されたフォーカスの出現までプレートを２５℃でインキュベートした。ＣｓＣｌ精製ベクター調製物のＰ：Ｉ比は、１ｍＬあたりのウイルス粒子の推定数を１ｍＬあたりの感染単位（ｉｆｕ）の数で割ることによって算出した。
ベクター調製物の感染力価を、ＨＥＫ２９３Ａ細胞での単一細胞感染力アッセイによって評価した。ＥＧＦＰを発現するベクターの場合、感染ＨＥＫ２９３細胞を可視化し、蛍光顕微鏡により直接計数した。蛍光マーカーのないベクター用の代替アッセイについても、ヘキソンカプシドタンパク質の発現を免疫染色することによって、試験した（図５）。完全培地（ダルベッコの改変イーグルス培地、プラス１×ＧｌｕｔａＭＡＸおよび１０％ｖ／ｖウシ胎児血清）でのウイルスの１０倍連続希釈を、滅菌９６ウェルディープウェルプレートで実施した。２または３の連続希釈をウイルスごとに行い、各希釈液５０μＬ（１０３～１０１０希釈）を、８０～９０％コンフルエンシーにて付着性ＨＥＫ２９３細胞を含有する９６ウェルプレートのウェルごとに添加した。ヘキソン免疫染色の場合、ポリ－Ｌ－リジンでプレコーティングした９６ウェルプレートを使用して、プレート表面への細胞接着を改善した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＥＧＦＰ発現ベクターのタイトレーションの場合、感染の４８時間後に、単一のＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡により計数し、感染力価を１ｍＬあたりの感染単位（ｉｆｕ）で算出した。ヘキソン免疫染色の場合、培地を細胞単層から吸引し、細胞を氷冷メタノールで固定した。次いで、プレートをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×、Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄した後、３％ｗ／ｖ低脂肪ミルク（Ｍａｒｖｅｌ）で１時間ブロックした。検出マウスモノクローナル抗ヘキソン抗体（Ｂ０２５／ＡＤ５１、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖミルクで１：１０００希釈にて添加し、２５℃で１時間インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中の１％ｗ／ｖミルクでさらに３回洗浄し、これに続いて、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖミルクで１：１０００希釈にて二次ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）コンジュゲート抗体（ＳＴＡＲ１１７Ａ、ＢｉｏＲａｄ）を添加した。さらに１時間インキュベートした後、発色に先立ちプレートをＰＢＳ中で５回洗浄した。発色させるために、新たに調製したＳＩＧＭＡｆａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｓｉｇｍａ）１００μＬを各ウェルに添加し、単一の感染細胞を表す暗く染色されたフォーカスの出現までプレートを２５℃でインキュベートした。ＣｓＣｌ精製ベクター調製物のＰ：Ｉ比は、１ｍＬあたりのウイルス粒子の推定数を１ｍＬあたりの感染単位（ｉｆｕ）の数で割ることによって算出した。
【0132】
ＳＫＯＶ３細胞の凝固第Ｘ因子媒介性ベクター形質導入の評価
ＳＫＯＶ３細胞（ヒト卵巣腺癌）は英国公衆衛生庁から入手し、２ｍＭグルタミンおよび１５％ｖ／ｖウシ胎児血清を含むマッコイ５ａ培地（完全マッコイ培地）で培養した。アッセイの場合、ＧＦＰ発現ベクターを無血清培地で連続的に希釈した（１：１０～１：１０７）。ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を、最終濃度８μｇ／ｍＬで希釈ベクターに添加した（ＦＸ無添加の対照試料を含めた）。ベクター－ＦＸ混合物を９６ウェルプレートのＳＫＯＶ３細胞の単層に（８０～９０％コンフルエント）添加し、細胞とともに３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。２時間後、ベクター－ＦＸ混合物の完全マッコイ培地を補充し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに４８時間インキュベートした。感染力を、上記のようにＧＦＰ陽性フォーカスの計数によって４８時間後に評価した。
ＳＫＯＶ３細胞（ヒト卵巣腺癌）は英国公衆衛生庁から入手し、２ｍＭグルタミンおよび１５％ｖ／ｖウシ胎児血清を含むマッコイ５ａ培地（完全マッコイ培地）で培養した。アッセイの場合、ＧＦＰ発現ベクターを無血清培地で連続的に希釈した（１：１０～１：１０７）。ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を、最終濃度８μｇ／ｍＬで希釈ベクターに添加した（ＦＸ無添加の対照試料を含めた）。ベクター－ＦＸ混合物を９６ウェルプレートのＳＫＯＶ３細胞の単層に（８０～９０％コンフルエント）添加し、細胞とともに３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。２時間後、ベクター－ＦＸ混合物の完全マッコイ培地を補充し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でさらに４８時間インキュベートした。感染力を、上記のようにＧＦＰ陽性フォーカスの計数によって４８時間後に評価した。
【0133】
タンパク質リガンドおよびペプチドリガンドの生成
ＳｐｙＴａｇ－融合ペプチドリガンドおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－融合ペプチドリガンドを、Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる固相合成技法を使用して＞９５％の純度で生成した。ペプチドについて、ＨＰＬＣおよび質量分析によって品質管理の試験を行った。
ＳｐｙＴａｇ－融合ペプチドリガンドおよびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－融合ペプチドリガンドを、Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる固相合成技法を使用して＞９５％の純度で生成した。ペプチドについて、ＨＰＬＣおよび質量分析によって品質管理の試験を行った。
【0134】
ポリヒスチジン－タグ組換えＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ融合タンパク質の発現用のＤＮＡ構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（ＮＥＢ）におけるタンパク質産生に向けて発現プラスミドｐＥＴ４５（＋）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へとクローニングした。ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒおよびマラリアの３Ｄ７株由来の熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質（ＰｆＣＳＰ）の各ＤＮＡ配列を、別々に合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、個々の構築物に必要なＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、制限クローニングによってｐＥＴ４５（＋）においてアセンブリした。組換えタンパク質を、以前に公開されたプロトコル［ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ Ｃａｔａｌｙｚｅｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｂｕｌｄｕｎ ＣＭ、Ｊｅａｎ ＪＸ、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＲ、Ｈｏｗａｒｔｈ Ｍ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１８年２月２８日；１４０（８）：３００８～３０１８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．７ｂ１３２３７］に従って、アフィニティーＮｉ－ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、ＰＢＳへと透析し、－８０℃で保存した。
【0135】
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＤ５０６３７．１）およびＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃３５０５０）を、大腸菌で発現させ、記載される通りに正確にＮｉ－ＮＴＡによって精製した（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｒａｐｉｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ ｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎ．Ｚａｋｅｒｉ Ｂ、Ｆｉｅｒｅｒ ＪＯ、Ｃｅｌｉｋ Ｅ、Ｃｈｉｔｔｏｃｋ ＥＣ、Ｓｃｈｗａｒｚ－Ｌｉｎｅｋ Ｕ、Ｍｏｙ ＶＴ、Ｈｏｗａｒｔｈ Ｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２年３月２０日；１０９（１２）：Ｅ６９０～７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１５４８５１０９）。
【0136】
一価ストレプトアビジン（ｍＳＡ）を、大腸菌で発現させ、封入体から再フォールディングし、記載される通りに正確にイオン交換クロマトグラフィーによって精製した（Ｐｌｕｇ－ａｎｄ－ｐｌａｙ ｐａｉｒｉｎｇ ｖｉａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｉｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｓ．Ｆａｉｒｈｅａｄ Ｍ、Ｋｒｎｄｉｊａ Ｄ、Ｌｏｗｅ ＥＤ、Ｈｏｗａｒｔｈ Ｍ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４年１月９日；４２６（１）：１９９～２１４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１３．０９．０１６．）。
【0137】
ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＶＤ９７７８３．１）、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２、およびＳＵＭＯ－ＤｏｇＴａｇ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＧ８６７３７６）を大腸菌で発現させ、記載される通りに正確にＮｉ－ＮＴＡによって精製した（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ Ｃａｔａｌｙｚｅｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｂｕｌｄｕｎ ＣＭ、Ｊｅａｎ ＪＸ、Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＲ、Ｈｏｗａｒｔｈ Ｍ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１８年２月２８日；１４０（８）：３００８～３０１８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．７ｂ１３２３７）。
【0138】
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（以前は、特許「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（融合タンパク質を合成するための方法および製品）」Ｈｏｗａｒｔｈ Ｍ、Ｖｅｇｇｉａｎｉ Ｇ、Ｇａｙｅｔ Ｒ．２０１５、英国特許出願ＷＯ２０１６１９３７４６号Ａ１ではＲｒｇＡＣａｔｃｈｅｒと称されていた）を大腸菌で発現させ、標準プロトコルに従ってＮｉ－ＮＴＡによって精製した（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇ ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｒａｐｉｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ ｔｏ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎ．Ｚａｋｅｒｉ Ｂ、Ｆｉｅｒｅｒ ＪＯ、Ｃｅｌｉｋ Ｅ、Ｃｈｉｔｔｏｃｋ ＥＣ、Ｓｃｈｗａｒｚ－Ｌｉｎｅｋ Ｕ、Ｍｏｙ ＶＴ、Ｈｏｗａｒｔｈ Ｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２年３月２０日；１０９（１２）：Ｅ６９０～７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１１１５４８５１０９）。
【0139】
ＨＣＭＶ五量体（ＳｐｙＴａｇ－ｇＨを含む）は、特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１２４５に記載される。タンパク質を、５つの別々のプラスミド（配列が提供される）を使用する一過性トランスフェクションによって懸濁液２９３Ｆ細胞で発現させた。タンパク質を回収し、タンジェンシャルフローろ過によって濃縮し、Ｃ－タグアフィニティーレジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でアフィニティー精製し、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥ）を使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
【0140】
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＳｐｉｋｅとＲＢＤの融合タンパク質の発現用のＤＮＡ構築物を、哺乳動物タンパク質発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．４へとクローニングした。ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＳｐｉｋｅおよびＲＢＤの各ＤＮＡ配列を別々に合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰＣＲ増幅および制限クローニングによってＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、またはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとともにフレーム中でアセンブリした。ＲＢＤ融合構築物の分泌を容易にするために、リーダー配列をＮ末端で導入した（ＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、ＲＢＤ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、およびＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒの場合、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ｓｐｉｋｅ ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣからのリーダー配列を使用し、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤの場合、ＩｇＫリーダー配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤを使用した）。Ｓｐｉｋｅ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒのタンパク質を懸濁液Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現させ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＲＢＤ、ＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＲＢＤ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのタンパク質は懸濁液ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞で発現させた。培養上清からタンパク質を回収し、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥ）を使用するＣ－タグアフィニティーレジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してアフィニティー精製し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．４へと透析した。
【0141】
カップリング反応
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとＤｏｇＴａｇ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、およびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって触媒される）の各パートナー間のカップリング反応を、図の説明文に記載の濃度にての個々の成分を用いて、２０～２５μＬの総体積での自発的に反応する成分の共インキュベーションによって実施した。Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇとＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇまたはＡｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ（ＳｐｙＴａｇ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとＤｏｇＴａｇ（ＤｏｇＴａｇ融合体を含む）の間、およびＡｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ融合体を含む）の間、の各反応を４℃で１６時間インキュベートした。ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって触媒されるＡｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体を含む）の間の反応を４℃で４８時間インキュベートした。ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ触媒の反応を、カップリングの効率を向上させるために、最終濃度が１５％ｖ／ｖグリセロールおよび最小限の塩を含有する緩衝剤で実施した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとＤｏｇＴａｇ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ、およびＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＤｏｇＴａｇ（ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって触媒される）の各パートナー間のカップリング反応を、図の説明文に記載の濃度にての個々の成分を用いて、２０～２５μＬの総体積での自発的に反応する成分の共インキュベーションによって実施した。Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇとＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇまたはＡｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとＳｐｙＴａｇ（ＳｐｙＴａｇ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体を含む）の間、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとＤｏｇＴａｇ（ＤｏｇＴａｇ融合体を含む）の間、およびＡｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒとＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ融合体を含む）の間、の各反応を４℃で１６時間インキュベートした。ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅによって触媒されるＡｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇとＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合体を含む）の間の反応を４℃で４８時間インキュベートした。ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ触媒の反応を、カップリングの効率を向上させるために、最終濃度が１５％ｖ／ｖグリセロールおよび最小限の塩を含有する緩衝剤で実施した。
【0142】
総体積４００μＬ中で、３５μＭ ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬ、３０μＭ ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ、および１５％ｖ／ｖグリセロールとともにＡｄ５（ＧＦＰ）－ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇの５Ｅ＋１１ウイルス粒子を４℃で４８時間、共インキュベートすることによって、免疫研究用のペプチド装飾のベクターバッチを調製した。過剰なペプチドおよびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（図１０Ａ、群１）を除去するために、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ透析カセット（１００ｋＤａ ＭＷＣＯ）を使用して、カップリングしたベクターをショ糖保存緩衝剤へと透析した。クマシー染色のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で、過剰なペプチドは透析後に検出されなかった。ペプチド装飾のベクターを－８０℃で保存し、エンドトキシン試験を行い、免疫に先立ち保存バッチの感染タイトレーションを繰り返した。
【0143】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるカップリング効率の評価
カップリング反応を上記のように実施し、ＳＤＳローディング緩衝剤（ＢｉｏＲａｄ、３１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノールブルー、３００ｍＭ ＤＴＴ）の添加によって停止させた。試料を９５℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル上にロードした。Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇまたはＡｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇへのリガンドのカップリングを評価する直接ゲルシフトアッセイの場合、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（２００Ｖ、４０～５５分）により分離し、クマシー染色により視覚化した［Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）での１６時間染色、水で脱染］。カップリング効率を、ＩｍａｇｅＪを使用して非カップリングのヘキソン－ＤｏｇＴａｇ／ヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ／ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと比較することによって評価した（ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒカップリング効率の場合、カップリングしたヘキソンの％＝ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと非カップリングのヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度の合計で割ったヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのバンド強度、これに１００を乗じる）。
カップリング反応を上記のように実施し、ＳＤＳローディング緩衝剤（ＢｉｏＲａｄ、３１．５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノールブルー、３００ｍＭ ＤＴＴ）の添加によって停止させた。試料を９５℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル上にロードした。Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇまたはＡｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇへのリガンドのカップリングを評価する直接ゲルシフトアッセイの場合、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（２００Ｖ、４０～５５分）により分離し、クマシー染色により視覚化した［Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）での１６時間染色、水で脱染］。カップリング効率を、ＩｍａｇｅＪを使用して非カップリングのヘキソン－ＤｏｇＴａｇ／ヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ／ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと比較することによって評価した（ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒカップリング効率の場合、カップリングしたヘキソンの％＝ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと非カップリングのヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度の合計で割ったヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのバンド強度、これに１００を乗じる）。
【0144】
Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合ペプチドへのカップリングの評価の場合、直接ゲルシフトアッセイを使用して低分子量ペプチドのカップリングを正確に評価することができなかったという事実により、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ＤＣ）タンパク質を使用する競合アッセイを実施した。カップリング後、過剰のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒタンパク質（３０μＭ）を反応に添加し、試料を４℃でさらに２４時間インキュベートした。ＤＣは、Ａｄ５の表面の遊離（非カップリング）ヘキソン－ＤｏｇＴａｇ分子のおよそ１００％と結合するので（図３Ｂを参照されたい）、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ペプチドにカップリングされたヘキソン－ＤｏｇＴａｇの割合を、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとのインキュベーション後のクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥでのおよそ２０ｋＤａ（ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの分子量）のゲルシフトを生じない、ヘキソンの割合であると推定され得る。
【0145】
直接ゲルシフトによるヘキソン－ＤｏｇＴａｇへのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ペプチドカップリングの評価を可能にする、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ競合アッセイの代替アッセイにより、高アフィニティービオチン：ストレプトアビジン相互作用（室温のＳＤＳローディング緩衝剤中で安定）を開発した。ビオチン化ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ペプチドを、前記のようにＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅおよびＡｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇとともにインキュベートした。４８時間後、ＳＤＳローディング緩衝剤中で煮沸することによりカップリング反応を停止させて、すべてのタンパク質およびビリオン構造を変性させた。試料を氷上で短時間冷却した後、過剰の一価ストレプトアビジン（ｍＳＡ、ビオチンペプチドの２倍超過）とともに２５℃で３０分間インキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ニトロセルロースに転写し、抗ヘキソン一次マウスモノクローナル抗体（クローン６５Ｈ６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してウエスタンブロッティングを実施した。ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ二次（１：１０００希釈）、これに続いて発色用のＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ヘキソンタンパク質の移動を視覚化した。ｍＳＡとビオチン間の相互作用により、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ビオチンにカップリングされたヘキソン－ＤｏｇＴａｇタンパク質について、ゲルシフト（およそ５０ｋＤａ）が観察された。
【0146】
タンパク質リガンドのＡｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ、Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇまたはＡｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒへのカップリングの評価の場合、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、次いでウエスタンブロッティング用にニトロセルロースに転写した。ｐＩＸ融合体に共有結合でカップリングされたタンパク質種を、図の説明文に記載のように、一次抗体またはマウス抗血清およびアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体を使用して検出した。上記のようにウエスタンブロットを発色させた。
【0147】
抗体中和アッセイ
強力な中和マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）９Ｃ１２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）によるベクター中和の評価の場合、Ａｄ５（ＧＦＰ）ベクターを完全培地中１：１の比で連続的に希釈したｍＡｂ ９Ｃ１２抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ベクター－抗体混合物を、９６ウェルプレートフォーマットのＨＥＫ２９３Ａ細胞の８０％コンフルエントな単層に添加した（細胞に２００ｉｆｕ／細胞の感染多重度で感染させた）。細胞をベクター－抗体混合物とともに３７℃ ５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、混合物に新鮮な培地を補充し、プレートを３７℃ ５％ＣＯ２にさらに２４時間戻した。２４時間後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞内のＧＦＰ発現をベクター感染力のリードアウトとして使用した；バルク蛍光を、３９５ｎｍの励起波長と５０９ｎｍの発光波長を使用して蛍光光度計（Ｔｅｃａｎ）で測定した。
強力な中和マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）９Ｃ１２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）によるベクター中和の評価の場合、Ａｄ５（ＧＦＰ）ベクターを完全培地中１：１の比で連続的に希釈したｍＡｂ ９Ｃ１２抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ベクター－抗体混合物を、９６ウェルプレートフォーマットのＨＥＫ２９３Ａ細胞の８０％コンフルエントな単層に添加した（細胞に２００ｉｆｕ／細胞の感染多重度で感染させた）。細胞をベクター－抗体混合物とともに３７℃ ５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、混合物に新鮮な培地を補充し、プレートを３７℃ ５％ＣＯ２にさらに２４時間戻した。２４時間後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞内のＧＦＰ発現をベクター感染力のリードアウトとして使用した；バルク蛍光を、３９５ｎｍの励起波長と５０９ｎｍの発光波長を使用して蛍光光度計（Ｔｅｃａｎ）で測定した。
【0148】
Ａｄ５陽性血清によるベクター中和の評価の場合、血清試料を、オバルブミンを発現するＡｄ５ベクターの１Ｅ＋８ｉｆｕでマウスを免疫することによって得た（ベクターは未改変のヘキソンを有した）。免疫の２週間後に血清を採取し、－８０℃で保存し、次いで、中和アッセイ向けに連続的に希釈した（２倍希釈液を完全培地中１：８から１：１０２４までで調製して、細胞単層上に最終範囲１：１６～１：２０４８を与えた）。希釈血清をＡｄ５（ＧＦＰ）ベクターとともにインキュベートし、混合物をＨＥＫ２９３細胞上でインキュベートし、上記の通りに正確に２４時間後にバルクＧＦＰ蛍光を読み取った。
【0149】
マウスの免疫
すべてのマウスの手順は、イギリスにおける動物実験の法規制（ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ）プロジェクトライセンス（ＰＡ７Ｄ２０Ｂ８５）の条項に従って実施されたものであり、オックスフォード大学の倫理審査機関（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｄｙ）によって承認されたものである。特定病原体除去環境に収容された雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、チャールズリバー）を、エンドトキシンフリーＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で製剤化されたワクチン５０μＬを各動物の両後肢へと注射（合計１００μＬ）することにより筋肉内免疫した。アデノウイルスベクターは５Ｅ＋９ウイルス粒子の用量で投与し、ペプチドは５μｇの用量で投与し、ポリＩ：Ｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は１０μｇの用量で投与した。エンドトキシン用量はマウス１匹あたり＜１ＥＵとした。実験はオックスフォード大学のＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓで実施し、免疫の２週間後に完了した。
すべてのマウスの手順は、イギリスにおける動物実験の法規制（ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ）プロジェクトライセンス（ＰＡ７Ｄ２０Ｂ８５）の条項に従って実施されたものであり、オックスフォード大学の倫理審査機関（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｄｙ）によって承認されたものである。特定病原体除去環境に収容された雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、チャールズリバー）を、エンドトキシンフリーＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で製剤化されたワクチン５０μＬを各動物の両後肢へと注射（合計１００μＬ）することにより筋肉内免疫した。アデノウイルスベクターは５Ｅ＋９ウイルス粒子の用量で投与し、ペプチドは５μｇの用量で投与し、ポリＩ：Ｃ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は１０μｇの用量で投与した。エンドトキシン用量はマウス１匹あたり＜１ＥＵとした。実験はオックスフォード大学のＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓで実施し、免疫の２週間後に完了した。
【0150】
エクスビボＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＰＯＴ
脾臓エクスビボインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）ＥＬＩＳｐｏｔを、以前に記載のように標準プロトコルに従って実施した［Ｌａｒｓｅｎ ＫＣ、Ｓｐｅｎｃｅｒ ＡＪ、Ｇｏｏｄｍａｎ ＡＬ、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ Ａ、Ｆｕｒｚｅ Ｊ、Ｒｏｌｌｉｅｒ ＣＳ、Ｋｉｓｓ－Ｔｏｔｈ Ｅ、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＳＣ、Ｂｒｅｇｕ Ｍ、Ｓｏｉｌｌｅｕｘ ＥＪ、Ｈｉｌｌ ＡＶ、Ｗｙｌｌｉｅ ＤＨ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｋ１ ａｎｄ ｔｒａｍ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９年９月１８日；２７（４１）：５５８９～９８］。抗原特異的応答を測定するために、細胞を最終濃度５μｇ／ｍＬにてのペプチドで１８～２０時間再刺激した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的応答を測定するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。ＧＦＰ特異的応答の場合、ＥＧＦＰペプチドＤＴＬＶＮＲＩＥＬ（ＥＧＦＰ１１８～１２６）（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって合成）を使用した。スポット形成細胞（ＳＦＣ）を、自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステム（ＡＩＤ）を使用して測定した。
脾臓エクスビボインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）ＥＬＩＳｐｏｔを、以前に記載のように標準プロトコルに従って実施した［Ｌａｒｓｅｎ ＫＣ、Ｓｐｅｎｃｅｒ ＡＪ、Ｇｏｏｄｍａｎ ＡＬ、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ Ａ、Ｆｕｒｚｅ Ｊ、Ｒｏｌｌｉｅｒ ＣＳ、Ｋｉｓｓ－Ｔｏｔｈ Ｅ、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＳＣ、Ｂｒｅｇｕ Ｍ、Ｓｏｉｌｌｅｕｘ ＥＪ、Ｈｉｌｌ ＡＶ、Ｗｙｌｌｉｅ ＤＨ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｋ１ ａｎｄ ｔｒａｍ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９年９月１８日；２７（４１）：５５８９～９８］。抗原特異的応答を測定するために、細胞を最終濃度５μｇ／ｍＬにてのペプチドで１８～２０時間再刺激した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的応答を測定するために、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。ＧＦＰ特異的応答の場合、ＥＧＦＰペプチドＤＴＬＶＮＲＩＥＬ（ＥＧＦＰ１１８～１２６）（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって合成）を使用した。スポット形成細胞（ＳＦＣ）を、自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステム（ＡＩＤ）を使用して測定した。
【0151】
改変アデノウイルス配列：
Ａｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇ配列
Ａｄ５－ＨＶＲ１－ＳｐｙＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号１）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAGSGGSGAHIVMVDAYKPTKGSGGSGTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGGCAGCGGAGGATCCGGCGCCCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGCTCTGGCGGAAGCGGCACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ２－ＳｐｙＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号３）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVGSGGSGAHIVMVDAYKPTKGSGGSGPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGGCAGCGGAGGATCCGGCGCCCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ５－ＳｐｙＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号５）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSGSGGSGAHIVMVDAYKPTKGSGGSGPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAGGCAGCGGAGGATCCGGCGCCCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇ配列
Ａｄ５－ＨＶＲ１－ＤｏｇＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号７）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAGSGGSGDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGSGGSGTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号８）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGGCAGCGGAGGATCCGGCgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaGGCTCTGGCGGAAGCGGCACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ２－ＤｏｇＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号９）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVGSGGSGDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGSGGSGPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１０）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGGCAGCGGAGGATCCGGCgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号１１）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSGSGGSGDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGSGGSGPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１２）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAGGCAGCGGAGGATCCGGCgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列
ｐＩＸ－（ＥＡＡＡＫ３）－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列：
アミノ酸（配列番号１３）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１４）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
本特許に記載のカプシド装飾用のリガンド：
組換えタンパク質：
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号１５）：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQ
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１６）：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGTAA
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ９
アミノ酸（配列番号１７）：
MAHHHHHHVGTGKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQGSGGSGGSNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１８）：
ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGGGTACCGGTAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCggatccAATGCGAACCCTAATGCGAATCCCAATGCAAATCCCAATGCGAACCCTAACGCAAATCCGAACGCAAACCCTAACGCGAACCCTAATGCTAATCCTAACGCCAATCCTtaa
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ１８
アミノ酸（配列番号１９）：
MAHHHHHHVGTGKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQGSGGSGGSNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２０）：
ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGGGTACCGGTAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCggatccAATGCTAACCCTAACGCTAACCCCAACGCCAATCCGAATGCGAATCCTAACGCCAATCCAAATGCCAATCCGAACGCGAACCCAAACGCTAATCCAAACGCGAATCCAAATGCGAACCCTAATGCGAATCCCAATGCAAATCCCAATGCGAACCCTAACGCAAATCCGAACGCAAACCCTAACGCGAACCCTAATGCTAATCCTAACGCCAATCCTtaa
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰドメイン
アミノ酸（配列番号２１）：
MAHHHHHHVGTGKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQGSGGSGGSNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２２）：
ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGGGTACCGGTAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCGGATCCAATGCAAATCCGAATGTTGATCCGAACGCGAACCCGAACGTGGACCCTAACGCCAATCCTAATGTGGACCCAAATGCGAATCCAAATGCTAACCCAAACGCAAACCCGAATGCGAACCCCAATGCCAATCCGAACGCTAATCCCAATGCTAATCCTAATGCAAATCCAAACGCGAATCCGAACGCCAATCCTAACGCAAACCCGAACGCAAATCCAAATGCAAACCCAAATGCTAATCCTAATGCGAACCCGAATGCTAACCCGAATGCAAACCCTAACGTTGACCCTAATGCTAACCCTAACGCTAACCCCAACGCCAATCCGAATGCGAATCCTAACGCCAATCCAAATGCCAATCCGAACGCGAACCCAAACGCTAATCCAAACGCGAATCCAAATGCGAACCCTAATGCGAATCCCAATGCAAATCCCAATGCGAACCCTAACGCAAATCCGAACGCAAACCCTAACGCGAACCCTAATGCTAATCCTAACGCCAATCCTTAA
ＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰ
アミノ酸（配列番号２３）：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGAHIVMVDAYKPTKGSGESGKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSS
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２４）：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGAGCCCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCGACGAAGggtagtggtgaaagtggtAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGTAA
ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ
アミノ酸（配列番号２５）：
MGSWSHHHHHHSSGGSGVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPPGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPPGVPATYEFT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２６）：
atgggcagctggagccatcatcatcatcatcacagctctggtggtagtggtgtgaataagaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccccgggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgccgggtgtgccggctacatatgaatttacctaa
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２
アミノ酸（配列番号２７）：
MGSSHHHHHHSSGGKLGSIEFIKVNKGSGESGSGASMTGGQQMGRDPGVDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGLE
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２８）：
atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcgggaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaggcagtggtgagtcgggatccggagctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatccgggcgtggacaacaaattcaacaaagaaatgaggaacgcttactgggagatagctcttttacccaacttaaacaatcaacagaaaagggctttcataaggtcgttatacgatgacccaagccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctcaggcgccgaaaggcctcgagtaa
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号２９）：
MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号３０）：
ATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGACATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGCCATGGTTGATACCTTATCAGGTTTATCAAGTGAGCAAGGTCAGTCCGGTGATATGACAATTGAAGAAGATAGTGCTACCCATATTAAATTCTCAAAACGTGATGAGGACGGCAAAGAGTTAGCTGGTGCAACTATGGAGTTGCGTGATTCATCTGGTAAAACTATTAGTACATGGATTTCAGATGGACAAGTGAAAGATTTCTACCTGTATCCAGGAAAATATACATTTGTCGAAACCGCAGCACCAGACGGTTATGAGGTAGCAACTGCTATTACCTTTACAGTTAATGAGCAAGGTCAGGTTACTGTAAATGGCAAAGCAACTAAAGGTGACGCTCATATTTAA
ＨＣＭＶ五量体
ＨＣＭＶ ｇＨ－ＳｐｙＴａｇ
アミノ酸（配列番号３１）：
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSRLLGSGGSGAHIVMVDAYKPTKHHHHHH
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号３２）：
ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCATCCTCGCCGTCTGTCTCTTCAGCCACCTACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCGTATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTCACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAATACCACCCAGTGTACCTACAACAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATCAGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTCTTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCCTGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCCAGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAAGACAGCCTAGGTGAACAGCCCACCACTGTGCCACCGCCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCAAACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCACACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCACACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAACACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCTGCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTTTTCAAAGCGCCCTATCAACGCGACAACTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATCAACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACTTCAACTACCTAGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGGATGTACTCAAGAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCCTTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCAAGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATTTATGATCACATGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCACGGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCACCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCCCCCAATGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCACCTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCACGCCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCGTCCACTCCATGCTGGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACGGGCCTCTGTTCATTGGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGTTAGCTCATCCACACCACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCACTCGCTCGAACGCCTCACGCGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCGCTACCGTTCCCGCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTGGAAACCTTCCCCGACCTGTTTTGCTTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCAGTTATATCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCACCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAACTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGTGGCGCTCAACATTTCGCTAGAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTGCTAGAATACGACGACACGCAAGGCGTCATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTACAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGGTACGGTACTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCCACCGACAGTCGTCTCCTCGGAAGCGGAGGCTCTGGTGCCCATATCGTGATGGTGgacgCCTACAAGCCTACCAAACATCATCACCATCACCACTAA
ＨＣＭＶ ｇＬ
アミノ酸（配列番号３３）：
MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号３４）：
ATGTGCCGCCGCCCGGATTGCGGCTTCTCTTTCTCACCTGGACCGGTGATACTGCTGTGGTGTTGCCTTCTGCTGCCCATTGTTTCCTCAGCCGCCGTCAGCGTCGCTCCTACCGCCGCCGAGAAAGTCCCCGCGGAGTGCCCCGAACTAACGCGCCGATGCTTGTTGGGTGAGGTGTTTGAGGGTGACAAGTATGAAAGTTGGCTGCGCCCGTTGGTGAATGTTACCGGGCGCGATGGCCCGCTATCGCAACTTATCCGTTACCGTCCCGTTACGCCGGAGGCCGCCAACTCCGTGCTGTTGGACGAGGCTTTCCTGGACACTCTGGCCCTGCTGTACAACAATCCGGATCAATTGCGGGCCCTGCTGACGCTGTTGAGCTCGGACACAGCGCCGCGCTGGATGACGGTGATGCGCGGCTACAGCGAGTGCGGCGATGGCTCGCCGGCCGTGTACACGTGCGTGGACGACCTGTGCCGCGGCTACGACCTCACGCGACTGTCATACGGGCGCAGCATCTTCACGGAACACGTGTTAGGCTTCGAGCTGGTGCCACCGTCTCTCTTTAACGTGGTGGTGGCCATACGCAACGAAGCCACGCGTACCAACCGCGCCGTGCGTCTGCCCGTGAGCACCGCTGCCGCGCCCGAGGGCATCACGCTCTTTTACGGCCTGTACAACGCAGTGAAGGAATTCTGCCTGCGTCACCAGCTGGACCCGCCGCTGCTACGCCACCTAGATAAATACTACGCCGGACTGCCGCCCGAGCTGAAGCAGACGCGCGTCAACCTGCCGGCTCACTCGCGCTATGGCCCTCAAGCAGTGGATGCTCGCTAA
ＨＣＭＶ ＵＬ１３１Ａ
アミノ酸（配列番号３５）：
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ） － イントロンを含有する（ボールド体）（配列番号３６）：
Ａｄ５－ＨＶＲ－ＳｐｙＴａｇ配列
Ａｄ５－ＨＶＲ１－ＳｐｙＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号１）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAGSGGSGAHIVMVDAYKPTKGSGGSGTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGGCAGCGGAGGATCCGGCGCCCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGCTCTGGCGGAAGCGGCACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ２－ＳｐｙＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号３）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVGSGGSGAHIVMVDAYKPTKGSGGSGPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGGCAGCGGAGGATCCGGCGCCCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ５－ＳｐｙＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号５）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSGSGGSGAHIVMVDAYKPTKGSGGSGPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAGGCAGCGGAGGATCCGGCGCCCATATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ－ＤｏｇＴａｇ配列
Ａｄ５－ＨＶＲ１－ＤｏｇＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号７）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAGSGGSGDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGSGGSGTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号８）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGGCAGCGGAGGATCCGGCgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaGGCTCTGGCGGAAGCGGCACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ２－ＤｏｇＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号９）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVGSGGSGDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGSGGSGPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSTTEATAGNGDNLTPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１０）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGGCAGCGGAGGATCCGGCgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAACTACTGAGGCGACCGCAGGCAATGGTGATAACTTGACTCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇヘキソン配列
アミノ酸（配列番号１１）：
MATPSMMPQWSYMHISGQDASEYLSPGLVQFARATETYFSLNNKFRNPTVAPTHDVTTDRSQRLTLRFIPVDREDTAYSYKARFTLAVGDNRVLDMASTYFDIRGVLDRGPTFKPYSGTAYNALAPKGAPNPCEWDEAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQKTHVFGQAPYSGINITKEGIQIGVEGQTPKYADKTFQPEPQIGESQWYETEINHAAGRVLKKTTPMKPCYGSYAKPTNENGGQGILVKQQNGKLESQVEMQFFSGSGGSGDIPATYEFTDGKHYITNEPIPPKGSGGSGPKVVLYSEDVDIETPDTHISYMPTIKEGNSRELMGQQSMPNRPNYIAFRDNFIGLMYYNSTGNMGVLAGQASQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDSIGDRTRYFSMWNQAVDSYDPDVRIIENHGTEDELPNYCFPLGGVINTETLTKVKPKTGQENGWEKDATEFSDKNEIRVGNNFAMEINLNANLWRNFLYSNIALYLPDKLKYSPSNVKISDNPNTYDYMNKRVVAPGLVDCYINLGARWSLDYMDNVNPFNHHRNAGLRYRSMLLGNGRYVPFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGSYTYEWNFRKDVNMVLQSSLGNDLRVDGASIKFDSICLYATFFPMAHNTASTLEAMLRNDTNDQSFNDYLSAANMLYPIPANATNVPISIPSRNWAAFRGWAFTRLKTKETPSLGSGYDPYYTYSGSIPYLDGTFYLNHTFKKVAITFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRSVDGEGYNVAQCNMTKDWFLVQMLANYNIGYQGFYIPESYKDRMYSFFRNFQPMSRQVVDDTKYKDYQQVGILHQHNNSGFVGYLAPTMREGQAYPANFPYPLIGKTAVDSITQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGALTDLGQNLLYANSAHALDMTFEVDPMDEPTLLYVLFEVFDVVRVHRPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１２）：
ATGGCTACCCCTTCGATGATGCCGCAGTGGTCTTACATGCACATCTCGGGCCAGGACGCCTCGGAGTACCTGAGCCCCGGGCTGGTGCAGTTTGCCCGCGCCACCGAGACGTACTTCAGCCTGAATAACAAGTTTAGAAACCCCACGGTGGCGCCTACGCACGACGTGACCACAGACCGGTCCCAGCGTTTGACGCTGCGGTTCATCCCTGTGGACCGTGAGGATACTGCGTACTCGTACAAGGCGCGGTTCACCCTAGCTGTGGGTGATAACCGTGTGCTGGACATGGCTTCCACGTACTTTGACATCCGCGGCGTGCTGGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCACTGCCTACAACGCCCTGGCTCCCAAGGGTGCCCCAAATCCTTGCGAATGGGATGAAGCTGCTACTGCTCTTGAAATAAACCTAGAAGAAGAGGACGATGACAACGAAGACGAAGTAGACGAGCAAGCTGAGCAGCAAAAAACTCACGTATTTGGGCAGGCGCCTTATTCTGGTATAAATATTACAAAGGAGGGTATTCAAATAGGTGTCGAAGGTCAAACACCTAAATATGCCGATAAAACATTTCAACCTGAACCTCAAATAGGAGAATCTCAGTGGTACGAAACTGAAATTAATCATGCAGCTGGGAGAGTCCTTAAAAAGACTACCCCAATGAAACCATGTTACGGTTCATATGCAAAACCCACAAATGAAAATGGAGGGCAAGGCATTCTTGTAAAGCAACAAAATGGAAAGCTAGAAAGTCAAGTGGAAATGCAATTTTTCTCAGGCAGCGGAGGATCCGGCgatattccggctacatatgaatttaccgatggtaaacattatatcaccaatgaaccgataccgccgaaaGGCTCTGGCGGAAGCGGCCCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAAGATGTAGATATAGAAACCCCAGACACTCATATTTCTTACATGCCCACTATTAAGGAAGGTAACTCACGAGAACTAATGGGCCAACAATCTATGCCCAACAGGCCTAATTACATTGCTTTTAGGGACAATTTTATTGGTCTAATGTATTACAACAGCACGGGTAATATGGGTGTTCTGGCGGGCCAAGCATCGCAGTTGAATGCTGTTGTAGATTTGCAAGACAGAAACACAGAGCTTTCATACCAGCTTTTGCTTGATTCCATTGGTGATAGAACCAGGTACTTTTCTATGTGGAATCAGGCTGTTGACAGCTATGATCCAGATGTTAGAATTATTGAAAATCATGGAACTGAAGATGAACTTCCAAATTACTGCTTTCCACTGGGAGGTGTGATTAATACAGAGACTCTTACCAAGGTAAAACCTAAAACAGGTCAGGAAAATGGATGGGAAAAAGATGCTACAGAATTTTCAGATAAAAATGAAATAAGAGTTGGAAATAATTTTGCCATGGAAATCAATCTAAATGCCAACCTGTGGAGAAATTTCCTGTACTCCAACATAGCGCTGTATTTGCCCGACAAGCTAAAGTACAGTCCTTCCAACGTAAAAATTTCTGATAACCCAAACACCTACGACTACATGAACAAGCGAGTGGTGGCTCCCGGGTTAGTGGACTGCTACATTAACCTTGGAGCACGCTGGTCCCTTGACTATATGGACAACGTCAACCCATTTAACCACCACCGCAATGCTGGCCTGCGCTACCGCTCAATGTTGCTGGGCAATGGTCGCTATGTGCCCTTCCACATCCAGGTGCCTCAGAAGTTCTTTGCCATTAAAAACCTCCTTCTCCTGCCGGGCTCATACACCTACGAGTGGAACTTCAGGAAGGATGTTAACATGGTTCTGCAGAGCTCCCTAGGAAATGACCTAAGGGTTGACGGAGCCAGCATTAAGTTTGATAGCATTTGCCTTTACGCCACCTTCTTCCCCATGGCCCACAACACCGCCTCCACGCTTGAGGCCATGCTTAGAAACGACACCAACGACCAGTCCTTTAACGACTATCTCTCCGCCGCCAACATGCTCTACCCTATACCCGCCAACGCTACCAACGTGCCCATATCCATCCCCTCCCGCAACTGGGCGGCTTTCCGCGGCTGGGCCTTCACGCGCCTTAAGACTAAGGAAACCCCATCACTGGGCTCGGGCTACGACCCTTATTACACCTACTCTGGCTCTATACCCTACCTAGATGGAACCTTTTACCTCAACCACACCTTTAAGAAGGTGGCCATTACCTTTGACTCTTCTGTCAGCTGGCCTGGCAATGACCGCCTGCTTACCCCCAACGAGTTTGAAATTAAGCGCTCAGTTGACGGGGAGGGTTACAACGTTGCCCAGTGTAACATGACCAAAGACTGGTTCCTGGTACAAATGCTAGCTAACTACAACATTGGCTACCAGGGCTTCTATATCCCAGAGAGCTACAAGGACCGCATGTACTCCTTCTTTAGAAACTTCCAGCCCATGAGCCGTCAGGTGGTGGATGATACTAAATACAAGGACTACCAACAGGTGGGCATCCTACACCAACACAACAACTCTGGATTTGTTGGCTACCTTGCCCCCACCATGCGCGAAGGACAGGCCTACCCTGCTAACTTCCCCTATCCGCTTATAGGCAAGACCGCAGTTGACAGCATTACCCAGAAAAAGTTTCTTTGCGATCGCACCCTTTGGCGCATCCCATTCTCCAGTAACTTTATGTCCATGGGCGCACTCACAGACCTGGGCCAAAACCTTCTCTACGCCAACTCCGCCCACGCGCTAGACATGACTTTTGAGGTGGATCCCATGGACGAGCCCACCCTTCTTTATGTTTTGTTTGAAGTCTTTGACGTGGTCCGTGTGCACCGGCCGCACCGCGGCGTCATCGAAACCGTGTACCTGCGCACGCCCTTCTCGGCCGGCAACGCCACAACATAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列
ｐＩＸ－（ＥＡＡＡＫ３）－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列：
アミノ酸（配列番号１３）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１４）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
本特許に記載のカプシド装飾用のリガンド：
組換えタンパク質：
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号１５）：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQ
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１６）：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGTAA
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ９
アミノ酸（配列番号１７）：
MAHHHHHHVGTGKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQGSGGSGGSNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号１８）：
ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGGGTACCGGTAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCggatccAATGCGAACCCTAATGCGAATCCCAATGCAAATCCCAATGCGAACCCTAACGCAAATCCGAACGCAAACCCTAACGCGAACCCTAATGCTAATCCTAACGCCAATCCTtaa
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ１８
アミノ酸（配列番号１９）：
MAHHHHHHVGTGKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQGSGGSGGSNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２０）：
ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGGGTACCGGTAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCggatccAATGCTAACCCTAACGCTAACCCCAACGCCAATCCGAATGCGAATCCTAACGCCAATCCAAATGCCAATCCGAACGCGAACCCAAACGCTAATCCAAACGCGAATCCAAATGCGAACCCTAATGCGAATCCCAATGCAAATCCCAATGCGAACCCTAACGCAAATCCGAACGCAAACCCTAACGCGAACCCTAATGCTAATCCTAACGCCAATCCTtaa
ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰドメイン
アミノ酸（配列番号２１）：
MAHHHHHHVGTGKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQGSGGSGGSNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANP
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２２）：
ATGGCACATCACCACCACCATCACGTGGGTACCGGTAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCGGATCCAATGCAAATCCGAATGTTGATCCGAACGCGAACCCGAACGTGGACCCTAACGCCAATCCTAATGTGGACCCAAATGCGAATCCAAATGCTAACCCAAACGCAAACCCGAATGCGAACCCCAATGCCAATCCGAACGCTAATCCCAATGCTAATCCTAATGCAAATCCAAACGCGAATCCGAACGCCAATCCTAACGCAAACCCGAACGCAAATCCAAATGCAAACCCAAATGCTAATCCTAATGCGAACCCGAATGCTAACCCGAATGCAAACCCTAACGTTGACCCTAATGCTAACCCTAACGCTAACCCCAACGCCAATCCGAATGCGAATCCTAACGCCAATCCAAATGCCAATCCGAACGCGAACCCAAACGCTAATCCAAACGCGAATCCAAATGCGAACCCTAATGCGAATCCCAATGCAAATCCCAATGCGAACCCTAACGCAAATCCGAACGCAAACCCTAACGCGAACCCTAATGCTAATCCTAACGCCAATCCTTAA
ＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰ
アミノ酸（配列番号２３）：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGAHIVMVDAYKPTKGSGESGKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSS
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２４）：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGAGCCCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCGACGAAGggtagtggtgaaagtggtAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGTAA
ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ
アミノ酸（配列番号２５）：
MGSWSHHHHHHSSGGSGVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPPGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPPGVPATYEFT
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２６）：
atgggcagctggagccatcatcatcatcatcacagctctggtggtagtggtgtgaataagaacgataaaaagccgctgcgtggtgccgtgtttagcctgcagaaacagcatcccgactatcccgatatctatggcgcgattgatcagaatgggacctatcaaaatgtgcgtaccggcgaagatggtaaactgacctttaagaatctgagcgatggcaaatatcgcctgtttgaaaatagcgaacccccgggctataaaccggtgcagaataagccgattgtggcgtttcagattgtgaatggcgaagtgcgtgatgtgaccagcattgtgccgccgggtgtgccggctacatatgaatttacctaa
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２
アミノ酸（配列番号２７）：
MGSSHHHHHHSSGGKLGSIEFIKVNKGSGESGSGASMTGGQQMGRDPGVDNKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKGLE
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号２８）：
atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcgggaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaggcagtggtgagtcgggatccggagctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatccgggcgtggacaacaaattcaacaaagaaatgaggaacgcttactgggagatagctcttttacccaacttaaacaatcaacagaaaagggctttcataaggtcgttatacgatgacccaagccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgctcaggcgccgaaaggcctcgagtaa
ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号２９）：
MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号３０）：
ATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGACATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGCCATGGTTGATACCTTATCAGGTTTATCAAGTGAGCAAGGTCAGTCCGGTGATATGACAATTGAAGAAGATAGTGCTACCCATATTAAATTCTCAAAACGTGATGAGGACGGCAAAGAGTTAGCTGGTGCAACTATGGAGTTGCGTGATTCATCTGGTAAAACTATTAGTACATGGATTTCAGATGGACAAGTGAAAGATTTCTACCTGTATCCAGGAAAATATACATTTGTCGAAACCGCAGCACCAGACGGTTATGAGGTAGCAACTGCTATTACCTTTACAGTTAATGAGCAAGGTCAGGTTACTGTAAATGGCAAAGCAACTAAAGGTGACGCTCATATTTAA
ＨＣＭＶ五量体
ＨＣＭＶ ｇＨ－ＳｐｙＴａｇ
アミノ酸（配列番号３１）：
MRPGLPSYLIILAVCLFSHLLSSRYGAEAVSEPLDKAFHLLLNTYGRPIRFLRENTTQCTYNSSLRNSTVVRENAISFNFFQSYNQYYVFHMPRCLFAGPLAEQFLNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDLASYRSFSQQLKAQDSLGEQPTTVPPPIDLSIPHVWMPPQTTPHGWTESHTTSGLHRPHFNQTCILFDGHDLLFSTVTPCLHQGFYLIDELRYVKITLTEDFFVVTVSIDDDTPMLLIFGHLPRVLFKAPYQRDNFILRQTEKHELLVLVKKDQLNRHSYLKDPDFLDAALDFNYLDLSALLRNSFHRYAVDVLKSGRCQMLDRRTVEMAFAYALALFAAARQEEAGAQVSVPRALDRQAALLQIQEFMITCLSQTPPRTTLLLYPTAVDLAKRALWTPNQITDITSLVRLVYILSKQNQQHLIPQWALRQIADFALKLHKTHLASFLSAFARQELYLMGSLVHSMLVHTTERREIFIVETGLCSLAELSHFTQLLAHPHHEYLSDLYTPCSSSGRRDHSLERLTRLFPDATVPATVPAALSILSTMQPSTLETFPDLFCLPLGESFSALTVSEHVSYIVTNQYLIKGISYPVSTTVVGQSLIITQTDSQTKCELTRNMHTTHSITVALNISLENCAFCQSALLEYDDTQGVINIMYMHDSDDVLFALDPYNEVVVSSPRTHYLMLLKNGTVLEVTDVVVDATDSRLLGSGGSGAHIVMVDAYKPTKHHHHHH
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号３２）：
ATGCGGCCAGGCCTCCCCTCCTACCTCATCATCCTCGCCGTCTGTCTCTTCAGCCACCTACTTTCGTCACGATATGGCGCAGAAGCCGTATCCGAACCGCTGGACAAAGCGTTTCACCTACTGCTCAACACCTACGGGAGACCCATCCGCTTCCTGCGTGAAAATACCACCCAGTGTACCTACAACAGCAGCCTCCGTAACAGCACGGTCGTCAGGGAAAACGCCATCAGTTTCAACTTTTTCCAAAGCTATAATCAATACTATGTATTCCATATGCCTCGATGTCTTTTTGCGGGTCCTCTGGCGGAGCAGTTTCTGAACCAGGTAGATCTGACCGAAACCCTGGAAAGATACCAACAGAGACTTAACACTTACGCGCTGGTATCCAAAGACCTGGCCAGCTACCGATCTTTTTCGCAGCAGCTAAAGGCACAAGACAGCCTAGGTGAACAGCCCACCACTGTGCCACCGCCCATTGACCTGTCAATACCTCACGTTTGGATGCCACCGCAAACCACTCCACACGGCTGGACAGAATCACATACCACCTCAGGACTACACCGACCACACTTTAACCAGACCTGTATCCTCTTTGATGGACACGATCTACTATTCAGCACCGTCACACCTTGTTTGCACCAAGGCTTTTACCTCATCGACGAACTACGTTACGTTAAAATAACACTGACCGAGGACTTCTTCGTAGTTACGGTGTCCATAGACGACGACACACCCATGCTGCTTATCTTCGGCCATCTTCCACGCGTACTTTTCAAAGCGCCCTATCAACGCGACAACTTTATACTACGACAAACTGAAAAACACGAGCTCCTGGTGCTAGTTAAGAAAGATCAACTGAACCGTCACTCTTATCTCAAAGACCCGGACTTTCTTGACGCCGCACTTGACTTCAACTACCTAGACCTCAGCGCACTACTACGTAACAGCTTTCACCGTTACGCCGTGGATGTACTCAAGAGCGGTCGATGTCAGATGCTGGACCGCCGCACGGTAGAAATGGCCTTCGCCTACGCATTAGCACTGTTCGCAGCAGCCCGACAAGAAGAGGCCGGCGCCCAAGTCTCCGTCCCACGGGCCCTAGACCGCCAGGCCGCACTCTTACAAATACAAGAATTTATGATCACATGCCTCTCACAAACACCACCACGCACCACGTTGCTGCTGTATCCCACGGCCGTGGACCTGGCCAAACGAGCCCTTTGGACACCGAATCAGATCACCGACATCACCAGCCTCGTACGCCTGGTCTACATACTCTCTAAACAGAATCAGCAACATCTCATCCCCCAATGGGCACTACGACAGATCGCCGACTTTGCCCTAAAACTACACAAAACGCACCTGGCCTCTTTTCTTTCAGCCTTCGCACGCCAAGAACTCTACCTCATGGGCAGCCTCGTCCACTCCATGCTGGTACATACGACGGAGAGACGCGAAATCTTCATCGTAGAAACGGGCCTCTGTTCATTGGCCGAGCTATCACACTTTACGCAGTTGTTAGCTCATCCACACCACGAATACCTCAGCGACCTGTACACACCCTGTTCCAGTAGCGGGCGACGCGATCACTCGCTCGAACGCCTCACGCGTCTCTTCCCCGATGCCACCGTCCCCGCTACCGTTCCCGCCGCCCTCTCCATCCTATCTACCATGCAACCAAGCACGCTGGAAACCTTCCCCGACCTGTTTTGCTTGCCGCTCGGCGAATCCTTCTCCGCGCTGACCGTCTCCGAACACGTCAGTTATATCGTAACAAACCAGTACCTGATCAAAGGTATCTCCTACCCTGTCTCCACCACCGTCGTAGGCCAGAGCCTCATCATCACCCAGACGGACAGTCAAACTAAATGCGAACTGACGCGCAACATGCATACCACACACAGCATCACAGTGGCGCTCAACATTTCGCTAGAAAACTGCGCCTTTTGCCAAAGCGCCCTGCTAGAATACGACGACACGCAAGGCGTCATCAACATCATGTACATGCACGACTCGGACGACGTCCTTTTCGCCCTGGATCCCTACAACGAAGTGGTGGTCTCATCTCCGCGAACTCACTACCTCATGCTTTTGAAAAACGGTACGGTACTAGAAGTAACTGACGTCGTCGTGGACGCCACCGACAGTCGTCTCCTCGGAAGCGGAGGCTCTGGTGCCCATATCGTGATGGTGgacgCCTACAAGCCTACCAAACATCATCACCATCACCACTAA
ＨＣＭＶ ｇＬ
アミノ酸（配列番号３３）：
MCRRPDCGFSFSPGPVILLWCCLLLPIVSSAAVSVAPTAAEKVPAECPELTRRCLLGEVFEGDKYESWLRPLVNVTGRDGPLSQLIRYRPVTPEAANSVLLDEAFLDTLALLYNNPDQLRALLTLLSSDTAPRWMTVMRGYSECGDGSPAVYTCVDDLCRGYDLTRLSYGRSIFTEHVLGFELVPPSLFNVVVAIRNEATRTNRAVRLPVSTAAAPEGITLFYGLYNAVKEFCLRHQLDPPLLRHLDKYYAGLPPELKQTRVNLPAHSRYGPQAVDAR
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号３４）：
ATGTGCCGCCGCCCGGATTGCGGCTTCTCTTTCTCACCTGGACCGGTGATACTGCTGTGGTGTTGCCTTCTGCTGCCCATTGTTTCCTCAGCCGCCGTCAGCGTCGCTCCTACCGCCGCCGAGAAAGTCCCCGCGGAGTGCCCCGAACTAACGCGCCGATGCTTGTTGGGTGAGGTGTTTGAGGGTGACAAGTATGAAAGTTGGCTGCGCCCGTTGGTGAATGTTACCGGGCGCGATGGCCCGCTATCGCAACTTATCCGTTACCGTCCCGTTACGCCGGAGGCCGCCAACTCCGTGCTGTTGGACGAGGCTTTCCTGGACACTCTGGCCCTGCTGTACAACAATCCGGATCAATTGCGGGCCCTGCTGACGCTGTTGAGCTCGGACACAGCGCCGCGCTGGATGACGGTGATGCGCGGCTACAGCGAGTGCGGCGATGGCTCGCCGGCCGTGTACACGTGCGTGGACGACCTGTGCCGCGGCTACGACCTCACGCGACTGTCATACGGGCGCAGCATCTTCACGGAACACGTGTTAGGCTTCGAGCTGGTGCCACCGTCTCTCTTTAACGTGGTGGTGGCCATACGCAACGAAGCCACGCGTACCAACCGCGCCGTGCGTCTGCCCGTGAGCACCGCTGCCGCGCCCGAGGGCATCACGCTCTTTTACGGCCTGTACAACGCAGTGAAGGAATTCTGCCTGCGTCACCAGCTGGACCCGCCGCTGCTACGCCACCTAGATAAATACTACGCCGGACTGCCGCCCGAGCTGAAGCAGACGCGCGTCAACCTGCCGGCTCACTCGCGCTATGGCCCTCAAGCAGTGGATGCTCGCTAA
ＨＣＭＶ ＵＬ１３１Ａ
アミノ酸（配列番号３５）：
MRLCRVWLSVCLCAVVLGQCQRETAEKNDYYRVPHYWDACSRALPDQTRYKYVEQLVDLTLNYHYDASHGLDNFDVLKRINVTEVSLLISDFRRQNRRGGTNKRTTFNAAGSLAPHARSLEFSVRLFAN
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ） － イントロンを含有する（ボールド体）（配列番号３６）：
【0152】
【化1】
【0153】
ＨＣＭＶ ＵＬ１２８
アミノ酸（配列番号３７）：
MSPKDLTPFLTALWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ） － イントロンを含有する（ボールド体）（配列番号３８）：
アミノ酸（配列番号３７）：
MSPKDLTPFLTALWLLLGHSRVPRVRAEECCEFINVNHPPERCYDFKMCNRFTVALRCPDGEVCYSPEKTAEIRGIVTTMTHSLTRQVVHNKLTSCNYNPLYLEADGRIRCGKVNDKAQYLLGAAGSVPYRWINLEYDKITRIVGLDQYLESVKKHKRLDVCRAKMGYMLQ
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ） － イントロンを含有する（ボールド体）（配列番号３８）：
【0154】
【化2】
【0155】
ＨＣＭＶ ＵＬ１３０
アミノ酸（配列番号３９）：
MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIVGGGGSGGGGSGGGGSEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４０）：
ATGCTGCGGCTTCTGCTTCGTCACCACTTTCACTGCCTGCTTCTGTGCGCGGTTTGGGCAACGCCCTGTCTGGCGTCTCCGTGGTCGACGCTAACAGCAAACCAGAATCCGTCCCCGCCATGGTCTAAACTGACGTATTCCAAACCGCATGACGCGGCGACGTTTTACTGTCCTTTTCTCTATCCCTCGCCCCCACGATCCCCCTTGCAATTCTCGGGGTTCCAGCGGGTATCAACGGGTCCCGAGTGTCGCAACGAGACCCTGTATCTGCTGTACAACCGGGAAGGCCAGACCTTGGTGGAGAGAAGCTCCACCTGGGTGAAAAAGGTGATCTGGTACCTGAGCGGTCGGAACCAAACCATCCTCCAACGGATGCCCCGAACGGCTTCGAAACCGAGCGACGGAAACGTGCAGATCAGCGTGGAAGACGCCAAGATTTTTGGAGCGCACATGGTGCCCAAGCAGACCAAGCTGCTACGCTTCGTCGTCAACGATGGCACACGTTATCAGATGTGTGTGATGAAGCTGGAGAGCTGGGCTCACGTCTTCCGGGACTACAGCGTGTCTTTTCAGGTGCGATTGACGTTCACCGAGGCCAATAACCAGACTTACACCTTCTGCACCCATCCCAATCTCATCGTTGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGATCTGAGCCCGAGGCCTAA
ペプチド（固相合成された － アミノ酸配列のみ）：
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ｈＴＥＲＴ（配列番号４１）：ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫＧＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＧＧＳ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＰＥＰ１）（配列番号４２）：ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫＧＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬ
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡＡＹ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＰＥＰ２）（配列番号４３）：ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫＧＡＡＹＳＩＩＮＦＥＫＬ
ビオチン－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（配列番号４４）：ビオチン－ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫ（Ｎ末端ビオチン）
ビオチン－ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号４５）：ビオチン－ＧＳＲＧＶＰＨＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫ（Ｎ末端ビオチン）
改変アデノウイルス配列：
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（リンカー無し）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号４６）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４７）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＡＡＡＫ３－ＧＳリンカー）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号４８）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４９）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＧＧＳ－ＥＡＡＡＫ３リンカー）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５０）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５１）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＡＡＡＫ３リンカー、ＧＧＳまたはＧＳヒンジ無し）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５２）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVEAAAKEAAAKEAAAKDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５３）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＧＧＳ－ＥＡＡＡＫ５－ＧＳリンカー）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５４）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５５）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAGGCTCCGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGAGGCCGCAGCTAAGGAAGCCGCCGCTAAGGGATCCGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（デルタＮ１デルタＣ２）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５６）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５７）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccGACAGCGCCACCCACATCAAGTTCAGCAAGAGGGACGAGGACGGCAAGGAGCTGGCCGGCGCAACAATGGAGCTGAGGGACAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCAGCGACGGCCAGGTGAAGGACTTCTACCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAGACCGCCGCCCCCGACGGCTACGAGGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAACGAGCAGGGCCAGGTGACCGTGAACGGCTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５８）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSHMKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５９）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccCACATGAAGCCCCTGAGGGGCGCCGTGTTCAGCCTGCAGAAGCAGCACCCCGACTACCCCGACATCTACGGCGCCATCGACCAGAACGGCACCTACCAGAACGTGAGGACCGGCGAGGACGGCAAGCTGACCTTCAAGAACCTGAGCGACGGCAAGTACAGGCTGTTCGAGAACAGCGAGCCCGCCGGCTACAAGCCCGTGCAGAACAAGCCCATCGTGGCCTTCCAGATCGTGAACGGCGAGGTGAGGGACGTGACCAGCATCGTGCCCCAGGACATCCCCGCCACCTACGAGTTCACCAACGGCAAGCACTACATCACCAACGAGCCCATCCCCCCCAAGTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号６０）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQ
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６１）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号６２）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSAHIVMVDAYKPTK
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６３）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAGGCTCCGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGGATCCGCCCACATCGTTATGGTGGATGCCTACAAGCCCACCAAATAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号６４）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSKLGSIEFIKVNK
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６５）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAGGCTCCGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGGATCCaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaTAA
本願に記載のカプシド装飾用のリガンド：
組換えタンパク質：
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ
アミノ酸（配列番号６６）：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGSASSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEGSGGSGKLGSIEFIKVNKEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６７）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTGTGAACCTGACCACCAGAACACAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATATCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGCAATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCATTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGTGTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAAACAGCCCTGGCAGCGCCTCTTCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAATGTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCCCGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAAGTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCTATGCAGATGGCCTACAGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACCAGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCTCCTGAGGCCGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACAGGCAGACTGCAGAGCCTCCAGACATACGTGACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACATATGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGACAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGTACGAGCAAGGCTCTGGAATTGTGCAGCAGCAAAACAATCTGCTGCGGGCCATCGAGGCTCAGCAGCATCTGCTGCAGCTGACCGTGTGGGGAATCAAGCAGCTCCAGGCCAGAATCCTGGCTGGTGGATCTGGCGGCCATACCACCTGGATGGAATGGGACAGAGAGATCAACAACTACACCAGCCTGATCCACAGCCTGATTGAGGAATCCCAGAATCAGCAAGAGAAGAACGAGCAAGAACTGCTGGAAGGAAGCGGAGGCTCTGGTaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaGAGCCCGAAGCCTAA
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ
アミノ酸（配列番号６８）：
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNGSGGSGKLGSIEFIKVNKEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６９）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGGAAGCGGAGGCTCTGGTaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaGAGCCCGAAGCCTAA
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号７０）：
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNGSGGSGGSGGSGHMKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPKEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号７１）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGGAAGCGGAGGCTCTGGTGGATCCGGTGGATCTGGACACATGAAGCCTCTGAGAGGCGCCGTGTTCAGCCTGCAGAAACAGCACCCTGACTACCCCGATATCTACGGCGCCATCGACCAGAACGGCACCTACCAGAATGTTCGGACAGGCGAGGATGGCAAGCTGACCTTCAAGAACCTGAGCGACGGCAAGTACCGGCTGTTCGAGAATTCTGAGCCTGCCGGCTACAAGCCCGTGCAGAACAAACCTATCGTGGCCTTCCAGATCGTGAACGGCGAAGTGCGGGATGTGACCAGCATCGTGCCTCAGGATATCCCCGCCACCTACGAGTTCACCAACGGCAAGCACTACATCACCAACGAGCCCATTCCTCCAAAAGAGCCCGAAGCCTAA
ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ
アミノ酸（配列番号７２）：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGHMKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPKGSGGSGGSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号７３）：
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacGGTCACATGAAGCCCCTGAGGGGCGCCGTGTTCAGCCTGCAGAAGCAGCACCCCGACTACCCCGACATCTACGGCGCCATCGACCAGAACGGCACCTACCAGAACGTGAGGACCGGCGAGGACGGCAAGCTGACCTTCAAGAACCTGAGCGACGGCAAGTACAGGCTGTTCGAGAACAGCGAGCCCGCCGGCTACAAGCCCGTGCAGAACAAGCCCATCGTGGCCTTCCAGATCGTGAACGGCGAGGTGAGGGACGTGACCAGCATCGTGCCCCAGGACATCCCCGCCACCTACGAGTTCACCAACGGCAAGCACTACATCACCAACGAGCCCATCCCCCCCAAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCggatccCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGAGCCCGAGGCCTAA
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号７４）：
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNGSGGSGGSGGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号７５）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGGAAGCGGAGGCTCTGGTGGATCCGGTGGATCTGGCGATTCTGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGCGCGACGAGGACGGCAAAGAACTGGCTGGCGCTACCATGGAACTGAGAGACAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTGAGCCCGAAGCCTAA
アミノ酸（配列番号３９）：
MLRLLLRHHFHCLLLCAVWATPCLASPWSTLTANQNPSPPWSKLTYSKPHDAATFYCPFLYPSPPRSPLQFSGFQRVSTGPECRNETLYLLYNREGQTLVERSSTWVKKVIWYLSGRNQTILQRMPRTASKPSDGNVQISVEDAKIFGAHMVPKQTKLLRFVVNDGTRYQMCVMKLESWAHVFRDYSVSFQVRLTFTEANNQTYTFCTHPNLIVGGGGSGGGGSGGGGSEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４０）：
ATGCTGCGGCTTCTGCTTCGTCACCACTTTCACTGCCTGCTTCTGTGCGCGGTTTGGGCAACGCCCTGTCTGGCGTCTCCGTGGTCGACGCTAACAGCAAACCAGAATCCGTCCCCGCCATGGTCTAAACTGACGTATTCCAAACCGCATGACGCGGCGACGTTTTACTGTCCTTTTCTCTATCCCTCGCCCCCACGATCCCCCTTGCAATTCTCGGGGTTCCAGCGGGTATCAACGGGTCCCGAGTGTCGCAACGAGACCCTGTATCTGCTGTACAACCGGGAAGGCCAGACCTTGGTGGAGAGAAGCTCCACCTGGGTGAAAAAGGTGATCTGGTACCTGAGCGGTCGGAACCAAACCATCCTCCAACGGATGCCCCGAACGGCTTCGAAACCGAGCGACGGAAACGTGCAGATCAGCGTGGAAGACGCCAAGATTTTTGGAGCGCACATGGTGCCCAAGCAGACCAAGCTGCTACGCTTCGTCGTCAACGATGGCACACGTTATCAGATGTGTGTGATGAAGCTGGAGAGCTGGGCTCACGTCTTCCGGGACTACAGCGTGTCTTTTCAGGTGCGATTGACGTTCACCGAGGCCAATAACCAGACTTACACCTTCTGCACCCATCCCAATCTCATCGTTGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGATCTGAGCCCGAGGCCTAA
ペプチド（固相合成された － アミノ酸配列のみ）：
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ｈＴＥＲＴ（配列番号４１）：ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫＧＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＧＧＳ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＰＥＰ１）（配列番号４２）：ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫＧＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬ
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡＡＹ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＰＥＰ２）（配列番号４３）：ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫＧＡＡＹＳＩＩＮＦＥＫＬ
ビオチン－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（配列番号４４）：ビオチン－ＧＫＬＧＳＩＥＦＩＫＶＮＫ（Ｎ末端ビオチン）
ビオチン－ＳｐｙＴａｇ００３（配列番号４５）：ビオチン－ＧＳＲＧＶＰＨＩＶＭＶＤＡＹＫＲＹＫ（Ｎ末端ビオチン）
改変アデノウイルス配列：
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（リンカー無し）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号４６）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４７）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＡＡＡＫ３－ＧＳリンカー）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号４８）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号４９）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＧＧＳ－ＥＡＡＡＫ３リンカー）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５０）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５１）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＥＡＡＡＫ３リンカー、ＧＧＳまたはＧＳヒンジ無し）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５２）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVEAAAKEAAAKEAAAKDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５３）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＧＧＳ－ＥＡＡＡＫ５－ＧＳリンカー）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５４）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５５）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAGGCTCCGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGAGGCCGCAGCTAAGGAAGCCGCCGCTAAGGGATCCGACAGCGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGAGAGATGAGGACGGCAAAGAGCTGGCTGGCGCAACAATGGAACTGAGAGATAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（デルタＮ１デルタＣ２）ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５６）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５７）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccGACAGCGCCACCCACATCAAGTTCAGCAAGAGGGACGAGGACGGCAAGGAGCTGGCCGGCGCAACAATGGAGCTGAGGGACAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCAGCGACGGCCAGGTGAAGGACTTCTACCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAGACCGCCGCCCCCGACGGCTACGAGGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAACGAGCAGGGCCAGGTGACCGTGAACGGCTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号５８）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSHMKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPK
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号５９）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccCACATGAAGCCCCTGAGGGGCGCCGTGTTCAGCCTGCAGAAGCAGCACCCCGACTACCCCGACATCTACGGCGCCATCGACCAGAACGGCACCTACCAGAACGTGAGGACCGGCGAGGACGGCAAGCTGACCTTCAAGAACCTGAGCGACGGCAAGTACAGGCTGTTCGAGAACAGCGAGCCCGCCGGCTACAAGCCCGTGCAGAACAAGCCCATCGTGGCCTTCCAGATCGTGAACGGCGAGGTGAGGGACGTGACCAGCATCGTGCCCCAGGACATCCCCGCCACCTACGAGTTCACCAACGGCAAGCACTACATCACCAACGAGCCCATCCCCCCCAAGTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号６０）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSKLGDIEFIKVNKNDKKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQ
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６１）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAggctccGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGggatccAAACTGGGCGATATTGAATTTATTAAAGTGAACAAAAACGATAAAAAGCCGCTGCGTGGTGCCGTGTTTAGCCTGCAGAAACAGCATCCCGACTATCCCGATATCTATGGCGCGATTGATCAGAATGGGACCTATCAAAATGTGCGTACCGGCGAAGATGGTAAACTGACCTTTAAGAATCTGAGCGATGGCAAATATCGCCTGTTTGAAAATAGCGAACCCGCTGGCTATAAACCGGTGCAGAATAAGCCGATTGTGGCGTTTCAGATTGTGAATGGCGAAGTGCGTGATGTGACCAGCATTGTGCCGCAGTAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号６２）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSAHIVMVDAYKPTK
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６３）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAGGCTCCGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGGATCCGCCCACATCGTTATGGTGGATGCCTACAAGCCCACCAAATAA
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ配列
Ａｄ５－ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ ｐＩＸ配列
アミノ酸（配列番号６４）：
MSTNSFDGSIVSSYLTTRMPPWAGVRQNVMGSSIDGRPVLPANSTTLTYETVSGTPLETAASAAASAAAATARGIVTDFAFLSPLASSAASRSSARDDKLTALLAQLDSLTRELNVVSQQLLDLRQQVSALKASSPPNAVGGSEAAAKEAAAKEAAAKGSKLGSIEFIKVNK
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６５）：
ATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATATTTGACAACGCGCATGCCCCCATGGGCCGGGGTGCGTCAGAATGTGATGGGCTCCAGCATTGATGGTCGCCCCGTCCTGCCCGCAAACTCTACTACCTTGACCTACGAGACCGTGTCTGGAACGCCGTTGGAGACTGCAGCCTCCGCCGCCGCTTCAGCCGCTGCAGCCACCGCCCGCGGGATTGTGACTGACTTTGCTTTCCTGAGCCCGCTTGCAAGCAGTGCAGCTTCCCGTTCATCCGCCCGCGATGACAAGTTGACGGCTCTTTTGGCACAATTGGATTCTTTGACCCGGGAACTTAATGTCGTTTCTCAGCAGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTTTCTGCCCTGAAGGCTTCCTCCCCTCCCAATGCGGTTGGAGGCTCCGAAGCCGCCGCTAAAGAAGCTGCTGCCAAAGAGGCCGCTGCAAAGGGATCCaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaTAA
本願に記載のカプシド装飾用のリガンド：
組換えタンパク質：
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ
アミノ酸（配列番号６６）：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGSASSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDPPEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQGSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAGGSGGHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEGSGGSGKLGSIEFIKVNKEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６７）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTGTGAACCTGACCACCAGAACACAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTACCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATATCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGCAATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCATTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGTGTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAAACAGCCCTGGCAGCGCCTCTTCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAATGTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCCACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCCCGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAAGTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCCTCCTCTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCTATGCAGATGGCCTACAGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACCAGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACCCTCCTGAGGCCGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACAGGCAGACTGCAGAGCCTCCAGACATACGTGACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACATATGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGACAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGTACGAGCAAGGCTCTGGAATTGTGCAGCAGCAAAACAATCTGCTGCGGGCCATCGAGGCTCAGCAGCATCTGCTGCAGCTGACCGTGTGGGGAATCAAGCAGCTCCAGGCCAGAATCCTGGCTGGTGGATCTGGCGGCCATACCACCTGGATGGAATGGGACAGAGAGATCAACAACTACACCAGCCTGATCCACAGCCTGATTGAGGAATCCCAGAATCAGCAAGAGAAGAACGAGCAAGAACTGCTGGAAGGAAGCGGAGGCTCTGGTaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaGAGCCCGAAGCCTAA
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ
アミノ酸（配列番号６８）：
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNGSGGSGKLGSIEFIKVNKEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号６９）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGGAAGCGGAGGCTCTGGTaaactgggctctattgaatttattaaagtgaacaaaGAGCCCGAAGCCTAA
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号７０）：
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNGSGGSGGSGGSGHMKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPKEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号７１）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGGAAGCGGAGGCTCTGGTGGATCCGGTGGATCTGGACACATGAAGCCTCTGAGAGGCGCCGTGTTCAGCCTGCAGAAACAGCACCCTGACTACCCCGATATCTACGGCGCCATCGACCAGAACGGCACCTACCAGAATGTTCGGACAGGCGAGGATGGCAAGCTGACCTTCAAGAACCTGAGCGACGGCAAGTACCGGCTGTTCGAGAATTCTGAGCCTGCCGGCTACAAGCCCGTGCAGAACAAACCTATCGTGGCCTTCCAGATCGTGAACGGCGAAGTGCGGGATGTGACCAGCATCGTGCCTCAGGATATCCCCGCCACCTACGAGTTCACCAACGGCAAGCACTACATCACCAACGAGCCCATTCCTCCAAAAGAGCCCGAAGCCTAA
ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ－ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ
アミノ酸（配列番号７２）：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGHMKPLRGAVFSLQKQHPDYPDIYGAIDQNGTYQNVRTGEDGKLTFKNLSDGKYRLFENSEPAGYKPVQNKPIVAFQIVNGEVRDVTSIVPQDIPATYEFTNGKHYITNEPIPPKGSGGSGGSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号７３）：
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacGGTCACATGAAGCCCCTGAGGGGCGCCGTGTTCAGCCTGCAGAAGCAGCACCCCGACTACCCCGACATCTACGGCGCCATCGACCAGAACGGCACCTACCAGAACGTGAGGACCGGCGAGGACGGCAAGCTGACCTTCAAGAACCTGAGCGACGGCAAGTACAGGCTGTTCGAGAACAGCGAGCCCGCCGGCTACAAGCCCGTGCAGAACAAGCCCATCGTGGCCTTCCAGATCGTGAACGGCGAGGTGAGGGACGTGACCAGCATCGTGCCCCAGGACATCCCCGCCACCTACGAGTTCACCAACGGCAAGCACTACATCACCAACGAGCCCATCCCCCCCAAGGGCTCTGGCGGAAGCGGCggatccCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGAGCCCGAGGCCTAA
ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ ＲＢＤ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ
アミノ酸（配列番号７４）：
MFVFLVLLPLVSSQCRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNGSGGSGGSGGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIEPEA
ＤＮＡ（ｉｎｃｌ．ＳＴＯＰ）（配列番号７５）：
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATGGAAGCGGAGGCTCTGGTGGATCCGGTGGATCTGGCGATTCTGCCACACACATCAAGTTCAGCAAGCGCGACGAGGACGGCAAAGAACTGGCTGGCGCTACCATGGAACTGAGAGACAGCAGCGGCAAGACCATCAGCACCTGGATCTCCGACGGCCAAGTGAAGGACTTCTATCTGTACCCCGGCAAGTACACCTTCGTGGAAACCGCCGCTCCTGACGGATATGAAGTGGCCACCGCCATCACCTTCACCGTGAATGAGCAGGGACAAGTGACCGTGAACGGCAAGGCCACAAAAGGCGACGCCCACATTGAGCCCGAAGCCTAA
【実施例1】
【0156】
実施例１－ＳｐｙＴａｇまたはＤｏｇＴａｇのヘキソンＨＶＲループへの挿入を介するアデノウイルスカプシドのモジュール式共有結合装飾。
アデノウイルスカプシドのヘキソンタンパク質を改変するために、配列アラインメントを行って、図１Ｅの超可変領域（ＨＶＲ）のループ１、２および５の位置を特定した［次のアデノウイルスの配列比較；Ａｄ５とＡｄ２（種Ｃ）、Ａｄ１２とＡｄ１８（種Ａ）、Ａｄ３とＡｄ３５（種Ｂ）、Ａｄ４（種Ｅ）、Ａｄ４０とＡｄ４１（種Ｆ）］。図１Ｅに指示されるＨＶＲループの挿入部位に欠失を生成した。ＳｐｙＴａｇおよびＤｏｇＴａｇを各遺伝子座で挿入した。指示された挿入部位は、試験された３つのＨＶＲのそれぞれで、ＳｐｙＴａｇ組換え体とＤｏｇＴａｇ組換え体の間で同一である。各遺伝子座で、ＳｐｙＴａｇ配列またはＤｏｇＴａｇ配列は各側でＧＳＧＧＳＧ配列によって隣接される。
アデノウイルスカプシドのヘキソンタンパク質を改変するために、配列アラインメントを行って、図１Ｅの超可変領域（ＨＶＲ）のループ１、２および５の位置を特定した［次のアデノウイルスの配列比較；Ａｄ５とＡｄ２（種Ｃ）、Ａｄ１２とＡｄ１８（種Ａ）、Ａｄ３とＡｄ３５（種Ｂ）、Ａｄ４（種Ｅ）、Ａｄ４０とＡｄ４１（種Ｆ）］。図１Ｅに指示されるＨＶＲループの挿入部位に欠失を生成した。ＳｐｙＴａｇおよびＤｏｇＴａｇを各遺伝子座で挿入した。指示された挿入部位は、試験された３つのＨＶＲのそれぞれで、ＳｐｙＴａｇ組換え体とＤｏｇＴａｇ組換え体の間で同一である。各遺伝子座で、ＳｐｙＴａｇ配列またはＤｏｇＴａｇ配列は各側でＧＳＧＧＳＧ配列によって隣接される。
【実施例2】
【0157】
実施例２－ＨＶＲループへと挿入されたＳｐｙＴａｇとのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのカップリング
ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの間のカップリング反応を評価するために、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５でＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５ベクターを、１５μＭまたは４０μＭにてのビオチン化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともにインキュベートした。図２Ａに示されるように、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、タンパク質をクマシー染色によって可視化した。カップリング効率を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、非カップリングのヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと比較することによって評価した（カップリングしたヘキソンの％＝ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと非カップリングのヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度の合計で割ったヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのバンド強度、これに１００を乗じる）。
ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの間のカップリング反応を評価するために、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５でＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５ベクターを、１５μＭまたは４０μＭにてのビオチン化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともにインキュベートした。図２Ａに示されるように、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、タンパク質をクマシー染色によって可視化した。カップリング効率を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、非カップリングのヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと比較することによって評価した（カップリングしたヘキソンの％＝ヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと非カップリングのヘキソン－ＳｐｙＴａｇのバンド強度の合計で割ったヘキソン－ＳｐｙＴａｇ：ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのバンド強度、これに１００を乗じる）。
【0158】
図２Ａに記載のカップリング反応の直後に、同じ試料を用いてベクター感染力アッセイを行った（図２Ｂ）。試料を連続的に希釈し、９６ウェルプレートのＨＥＫ２９３Ａ細胞の単層に適用し、５％ＣＯ２と３７℃で４８時間インキュベートした。感染力価を、蛍光顕微鏡によるＧＦＰ蛍光フォーカスの計数によって算出した。感染力価は１ｍＬあたりの感染単位（ｉｆｕ）の数として算出した。
【0159】
ＨＶＲ１でＳｐｙＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ１ ＳｐｙＴａｇ）（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、様々な条件下で１５μＭまたは４０μＭにてのビオチン化ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとともにインキュベートした（図２Ｃ）。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、タンパク質をクマシー染色によって可視化した。ベクター感染力アッセイを図２Ｃに示される同じ試料で実施した（図２Ｄ）。
【0160】
結果が実証するところは、ＳｐｙＴａｇがＡｄ５ ＨＶＲループへの挿入後に反応性不良であること、およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒがウイルスカプシド上のヘキソンタンパク質の＞５０％にカップリングすると、ベクターの感染力が大幅に減少する（１００分の１を下回る）ことである。
【実施例3】
【0161】
実施例３－ＨＶＲループへと挿入されたＤｏｇＴａｇとのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのカップリング
ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、野生型Ａｄ５（ＧＦＰ）（天然のヘキソンタンパク質）またはＨＶＲ１（ＨＶＲ１ＤＴ）、ＨＶＲ２（ＨＶＲ２ＤＴ）もしくはＨＶＲ５（ＨＶＲ５ＤＴ）へと挿入されたＤｏｇＴａｇのいずれかを感染させた。ヘキソン表面でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５を感染させた付着性ＨＥＫ２９３Ａ細胞の１５００ｃｍ２からのベクター生産量は、未改変のヘキソンＡｄ５によるベクター生産量と同等である（図３Ａ）。
ＨＥＫ２９３Ａ細胞に、野生型Ａｄ５（ＧＦＰ）（天然のヘキソンタンパク質）またはＨＶＲ１（ＨＶＲ１ＤＴ）、ＨＶＲ２（ＨＶＲ２ＤＴ）もしくはＨＶＲ５（ＨＶＲ５ＤＴ）へと挿入されたＤｏｇＴａｇのいずれかを感染させた。ヘキソン表面でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５を感染させた付着性ＨＥＫ２９３Ａ細胞の１５００ｃｍ２からのベクター生産量は、未改変のヘキソンＡｄ５によるベクター生産量と同等である（図３Ａ）。
【0162】
ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５のいずれかでＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、５μＭ ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとともにインキュベートした。図３Ｂに示されるように、反応を４℃で１６時間実施した。カップリング効率を、実施例２に記載のように、ＩｍａｇｅＪを使用して非カップリングのヘキソン－ＤｏｇＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒと比較することによって評価した。図３Ｃに、図３Ｂと同じ試料で実施された感染力アッセイを示す。
【0163】
図３Ｄに示されるように、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５のいずれかでＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、２０μＭまたは８０μＭにてのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒとともに４℃で０．１、１または１６時間インキュベートした。カップリング効率を上記のように評価した。
【0164】
データが示すところは、ＤｏｇＴａｇがＡｄ５ ＨＶＲループへの挿入後に高反応性であること、および＞９０％のカプシドヘキソンのカバレッジにもかかわらず、ベクターの感染力がＤｏｇＣａｔｃｈｅｒへのカップリングによって阻害されないことである。
【実施例4】
【0165】
実施例４－ＨＶＲループへと挿入されたＤｏｇＴａｇとのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒの反応性。
ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５のいずれかでＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２（８０μＭ）およびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（７０μＭ）とともにインキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、タンパク質をクマシー染色によって可視化した。カップリング効率を、ＩｍａｇｅＪを使用して非カップリングのヘキソン－ＤｏｇＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＤｏｇＴａｇ：ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２と比較することによって定量化した（図４Ａ）。
ＨＶＲ１、ＨＶＲ２またはＨＶＲ５のいずれかでＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２（８０μＭ）およびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（７０μＭ）とともにインキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、タンパク質をクマシー染色によって可視化した。カップリング効率を、ＩｍａｇｅＪを使用して非カップリングのヘキソン－ＤｏｇＴａｇのバンド強度をヘキソン－ＤｏｇＴａｇ：ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２と比較することによって定量化した（図４Ａ）。
【0166】
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２へのヘキソン－ＤｏｇＴａｇカップリングの温度依存性を評価するために、ＨＶＲ５でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２（８０μＭ）およびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（７０μＭ）とともに２０℃または４℃のいずれかで１６時間でインキュベートした（図４Ｂ）。図４Ｂに使用された試料に関して、実施例３に記載のように、ベクター感染力アッセイを実施した（図４Ｃ）。
【0167】
ＨＶＲ５でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２（８０μＭ）およびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（７０μＭ）とともに４℃で１６時間、インキュベートした（図４Ｄ）。異なる濃度のＮａＣｌを１５０ｍＭまたは７５ｍＭのいずれかで添加し、グリセロールを１５％（ｖ／ｖ）で指示されるように添加した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって解析した。
【実施例5】
【0168】
実施例５－非蛍光組換えベクターのベクター感染力の評価。
ベクター感染力を評価するためにヘキソン免疫染色アッセイを、Ａｄ５（ＧＦＰ）（ＷＴヘキソンを用いて）およびＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇを用いて実施した。両ベクターを連続的に希釈し、各希釈液５０μｌをポリ－Ｌ－リジンコーティング９６ウェルプレートのＨＥＫ２９３Ａ細胞の単層に移した。５％ＣＯ２との３７℃での４８時間インキュベーション後、ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡によってカウントした。免疫染色の場合、同じプレート上の細胞を氷冷メタノールで固定し、抗ヘキソンマウスモノクローナル抗体（クローン６５Ｈ６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して感染細胞内のヘキソンタンパク質を検出した。続いて、アルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液を使用してヘキソン陽性細胞を染色した。結果が実証したところは、ＷＴヘキソンタンパク質を伴うＡｄ５ベクターを感染させたＨＥＫ２９３Ａ細胞とＨＶＲ５でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５ベクターを感染させたＨＥＫ２９３Ａ細胞とは、同等の強度のヘキソン免疫染色を示したことである。
ベクター感染力を評価するためにヘキソン免疫染色アッセイを、Ａｄ５（ＧＦＰ）（ＷＴヘキソンを用いて）およびＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇを用いて実施した。両ベクターを連続的に希釈し、各希釈液５０μｌをポリ－Ｌ－リジンコーティング９６ウェルプレートのＨＥＫ２９３Ａ細胞の単層に移した。５％ＣＯ２との３７℃での４８時間インキュベーション後、ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡によってカウントした。免疫染色の場合、同じプレート上の細胞を氷冷メタノールで固定し、抗ヘキソンマウスモノクローナル抗体（クローン６５Ｈ６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して感染細胞内のヘキソンタンパク質を検出した。続いて、アルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液を使用してヘキソン陽性細胞を染色した。結果が実証したところは、ＷＴヘキソンタンパク質を伴うＡｄ５ベクターを感染させたＨＥＫ２９３Ａ細胞とＨＶＲ５でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５ベクターを感染させたＨＥＫ２９３Ａ細胞とは、同等の強度のヘキソン免疫染色を示したことである。
【0169】
Ａｄ５（ＧＦＰ）（ヘキソンＷＴ）およびＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇの感染力価を、ＧＦＰ蛍光とヘキソン免疫染色アッセイの両方を使用して比較した。両アッセイを、同じプレート上の同じウェルを使用して実施した、ｎ＝４。バーは平均＋ＳＤを示し、ドットは個々のウェルからのスポットカウントを表す。両側ｔ検定によって計算して、結果は有意には異なっていなかった（ｎｓ）。
【実施例6】
【0170】
実施例６－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒタグペプチドとの、ヘキソンループへと挿入されたＤｏｇＴａｇの反応性
Ｔ細胞エピトープに融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ配列から構成されるペプチドを合成した。これらのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒタグペプチドを、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを使用してＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングした。クマシー染色を用いるゲルシフトアッセイは、これらの短いペプチドの分子量が低いことに起因して（およそ３ｋＤａ）、カップリング効率を評価するには適切ではなかった。代わりに、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを用いる競合アッセイを使用して、ペプチドカップリングの効率を評価した（図６Ａに記載）。ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ペプチド（ＳｎＪｒ－ペプチド）とヘキソン－ＤｏｇＴａｇ（ヘキソン－ＤＴ）を、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＳｎＬ）を使用してカップリングする。カップリング後、過剰のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ＤＣ）タンパク質を反応に添加する。ＤＣは、Ａｄ５の表面の遊離（非カップリング）ヘキソン－ＤＴ分子の＞９０％と結合し（図３Ｂを参照されたい）、したがって、ＳｎＪｒ－ペプチドにカップリングしたヘキソン－ＤＴの割合は、ＤＣとのインキュベーション後にＳＤＳ－ＰＡＧＥでおよそ２０ｋＤａのゲルシフトを生じないヘキソンの割合であると推定することができる。
Ｔ細胞エピトープに融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ配列から構成されるペプチドを合成した。これらのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒタグペプチドを、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを使用してＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングした。クマシー染色を用いるゲルシフトアッセイは、これらの短いペプチドの分子量が低いことに起因して（およそ３ｋＤａ）、カップリング効率を評価するには適切ではなかった。代わりに、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを用いる競合アッセイを使用して、ペプチドカップリングの効率を評価した（図６Ａに記載）。ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ペプチド（ＳｎＪｒ－ペプチド）とヘキソン－ＤｏｇＴａｇ（ヘキソン－ＤＴ）を、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＳｎＬ）を使用してカップリングする。カップリング後、過剰のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ＤＣ）タンパク質を反応に添加する。ＤＣは、Ａｄ５の表面の遊離（非カップリング）ヘキソン－ＤＴ分子の＞９０％と結合し（図３Ｂを参照されたい）、したがって、ＳｎＪｒ－ペプチドにカップリングしたヘキソン－ＤＴの割合は、ＤＣとのインキュベーション後にＳＤＳ－ＰＡＧＥでおよそ２０ｋＤａのゲルシフトを生じないヘキソンの割合であると推定することができる。
【0171】
ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ｈＴＥＲＴペプチド（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫからのＴ細胞エピトープに融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ）のヘキソン－ＤＴへのカップリング効率を、上記のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ競合アッセイを使用して評価した。Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇ（Ａｄ５－ＤＴ、１Ｅ＋１０ウイルス粒子）を、ＳｎＬ（７０μＭ）とＳｎＪｒ－ｈＴＥＲＴ（８０μＭ）との様々な組み合わせとともにインキュベートし、一部の試料ではＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（２０μＭ、過剰）をペプチド－ペプチドカップリング反応後に添加して、カップリング効率を評価した（図６Ｂ）。すべての反応を４℃で実施した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、続いてクマシー染色を行った（図６Ｂ）。ヘキソン－ＤＴ：ＤＣ（最初のＳｎＬ触媒反応後の遊離ヘキソン－ＤＴを表す）と比較したカップリングヘキソン－ＤＴ：ＳｎＪｒ－ｈＴＥＲＴの比率を、指示されるようにバンド強度を比較することによって評価した。ヘキソン－ＤＴ：ＳｎＪｒ－ｈＴＥＲＴ反応向けの最適時間間隔は４８時間であると決定した。
【0172】
図６Ｃに、上記のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ競合アッセイを使用する、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬはオバルブミンに由来するマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープである）のヘキソン－ＤＴへのカップリング効率の評価を示す。ＰＥＰ１はペプチド配列ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬに相当し、ＰＥＰ２はペプチド配列ＳｎＪｒ－ＡＡＹＳＩＩＮＦＥＫＬに相当する。Ａｄ５－ＤＴ（１Ｅ＋１０ウイルス粒子）をＳｎＪｒ－ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（ＰＥＰ１またはＰＥＰ２、８０μＭ）およびＳｎＬ（７０μＭ）とともに４℃で４８時間インキュベートした。その後、ＤＣ（２０μＭ）を添加した。次いで、試料を４℃でさらに２４時間インキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ペプチドカップリング効率を上記のように評価した。
【0173】
あるいは、図６Ｄに記載のように、一価ストレプトアビジン（ｍＳＡ）を使用する直接ゲルシフトアッセイを使用して、短いペプチドのカップリング効率を評価することもできる。ビオチン化ＳｎＪｒ－ペプチドを、先に記載のようにＳｎＬおよびＡｄ５－ＤＴとともにインキュベートした。４８時間後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む試料緩衝剤中で煮沸によりカップリング反応を停止させて、すべてのタンパク質およびビリオン構造を変性させた。試料を氷上で短時間冷却した後、過剰の一価ストレプトアビジン（ｍＳＡ）とともに２０℃で３０分間インキュベートした。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ニトロセルロースに転写し、抗ヘキソン一次マウスモノクローナル抗体（クローン６５Ｈ６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してウエスタンブロッティングを実施した。ｍＳＡとビオチン間の強力な相互作用により、ＳｎＪｒ－ビオチンにカップリングされたヘキソン－ＤＴタンパク質（ヘキソン－ＤＴ：ＳｎＪｒ－ビオチン／ｍＳＡ）について、ゲルシフト（およそ５０ｋＤａ）が観察される。図６Ｅに、さらなる対照とともに上記のｍＳＡ直接ゲルシフトアッセイのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。ヘキソン－ＤＴ：ＳｎＪｒ－ビオチン／ｍＳＡ種およびヘキソン－ＤＴ種に相当するバンドが指示される。図６Ｆに、図６Ｃに示される同じ試料で実施されたベクター感染力アッセイ（実施例５で記載のようにＧＦＰフォーカス計数による）を示す。結果が実証するところは、Ａｄ５－ＤＴの感染力がＳｎＪｒ－ペプチドの表面提示によって影響を受けないことである。
【実施例7】
【0174】
実施例７－Ａｄ５ ＨＶＲ ＤｏｇＴａｇのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質へのカップリング。
熱帯熱マラリア原虫（Ｐｆ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）は、マラリアワクチン候補抗原として広く研究されてきた。上記タンパク質は、主に配列ＮＡＮＰの反復から構成される、免疫原性の高い反復領域を含有する。この領域からの様々な長さの反復配列をＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのＣ末端に融合させ、生成する融合タンパク質をＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングさせた。３つのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合構築物；ＮＡＮＰ９、ＮＡＮＰ１８、およびＮＡＮＰＤ（３Ｄ７株由来のＰｆＣＳＰのＮＡＮＰ反復ドメイン全体から構成される）を図７Ａに示す。
熱帯熱マラリア原虫（Ｐｆ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）は、マラリアワクチン候補抗原として広く研究されてきた。上記タンパク質は、主に配列ＮＡＮＰの反復から構成される、免疫原性の高い反復領域を含有する。この領域からの様々な長さの反復配列をＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのＣ末端に融合させ、生成する融合タンパク質をＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングさせた。３つのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ融合構築物；ＮＡＮＰ９、ＮＡＮＰ１８、およびＮＡＮＰＤ（３Ｄ７株由来のＰｆＣＳＰのＮＡＮＰ反復ドメイン全体から構成される）を図７Ａに示す。
【0175】
ヘキソンＨＶＲ５ループへと挿入されたＤｏｇＴａｇとのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎの反応性を評価した。ＨＶＲ５でＤｏｇＴａｇを提示するＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（１Ｅ＋９ウイルス粒子）を、１５μＭにての異なるＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎ融合体（指示される）とともにインキュベートした。反応を４℃で１６時間実施した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、タンパク質をクマシー染色によって可視化した（図７Ｂ）。カップリング効率を上記のように評価した。図７Ｂに示される同じ試料で、ベクター感染力アッセイ（上記のようにＧＦＰフォーカス計数による）を実施した（図７Ｃ）。
【実施例8】
【0176】
実施例８－ヘキソンを介するＡｄ５の表面へのＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎのカップリングは、ウイルス中和抗体の効力を減少させる。
Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇベクター（Ａｄ５－ＤＴ、１Ｅ＋１０ウイルス粒子）をＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＳｎＬ）およびＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２（またはＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２単独）とともに４℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ヘキソンの概６０～６５％がＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２にカップリングした（図４Ｂに示される実験と同等のカップリング効率）。カップリングしたベクターを、連続的に希釈したウイルス中和マウスモノクローナル抗ヘキソン抗体ｍＡｂ ９Ｃ１２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）とともに３７℃で１時間インキュベートした後、ベクター－抗体混合物を、９６ウェルプレートフォーマットのＨＥＫ２９３Ａ細胞の８０％コンフルエントな単層に添加した（細胞を２００ｉｆｕ／細胞の感染多重度で感染させた）。細胞をベクター－抗体混合物とともに５％ＣＯ２と３７℃で２時間インキュベートした後、混合物に新鮮な培地を補充し、プレートを５％ＣＯ２と３７℃でさらに２４時間戻した。２４時間後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞内のＧＦＰ発現を感染力のリードアウトとして用いた － バルク蛍光を、３９５ｎｍの励起と５０９ｎｍの発光を使用して蛍光光度計で測定した。図８Ａに示されるデータが実証するところは、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２がＡｄ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングする場合の、強力な中和抗ヘキソンモノクローナル抗体のＩＣ５０の上昇である。ｍＡｂ ９Ｃ１２中和のＩＣ５０が、２．５ｎｇ／ｍｌ（Ａｄ５－ＤＴ単独、およびＡｄ５－ＤＴ＋ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２のみ）からカップリングされたベクター（Ａｄ５－ＤＴ＋ＳｎＬ＋ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２）による７ｎｇ／ｍｌまでに上昇した。
Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇベクター（Ａｄ５－ＤＴ、１Ｅ＋１０ウイルス粒子）をＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＳｎＬ）およびＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２（またはＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２単独）とともに４℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ヘキソンの概６０～６５％がＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２にカップリングした（図４Ｂに示される実験と同等のカップリング効率）。カップリングしたベクターを、連続的に希釈したウイルス中和マウスモノクローナル抗ヘキソン抗体ｍＡｂ ９Ｃ１２（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）とともに３７℃で１時間インキュベートした後、ベクター－抗体混合物を、９６ウェルプレートフォーマットのＨＥＫ２９３Ａ細胞の８０％コンフルエントな単層に添加した（細胞を２００ｉｆｕ／細胞の感染多重度で感染させた）。細胞をベクター－抗体混合物とともに５％ＣＯ２と３７℃で２時間インキュベートした後、混合物に新鮮な培地を補充し、プレートを５％ＣＯ２と３７℃でさらに２４時間戻した。２４時間後、ＨＥＫ２９３Ａ細胞内のＧＦＰ発現を感染力のリードアウトとして用いた － バルク蛍光を、３９５ｎｍの励起と５０９ｎｍの発光を使用して蛍光光度計で測定した。図８Ａに示されるデータが実証するところは、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２がＡｄ５ ＤｏｇＴａｇにカップリングする場合の、強力な中和抗ヘキソンモノクローナル抗体のＩＣ５０の上昇である。ｍＡｂ ９Ｃ１２中和のＩＣ５０が、２．５ｎｇ／ｍｌ（Ａｄ５－ＤＴ単独、およびＡｄ５－ＤＴ＋ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２のみ）からカップリングされたベクター（Ａｄ５－ＤＴ＋ＳｎＬ＋ＳｎＪｒ－ＡｆｆｉＨＥＲ２）による７ｎｇ／ｍｌまでに上昇した。
【0177】
図８Ｂでは、図７Ａに記載のＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎ融合体を使用して、上記のものと同様の実験を実施した。Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５ ＤｏｇＴａｇベクター（Ａｄ５－ＤＴ、１Ｅ＋９ウイルス粒子）を、図７に記載の通り正確に、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎ構築物とともに４℃で１６時間インキュベートした。構築物それぞれのＡｄ５－ＤＴへのカップリング効率は図７Ｂに示されるものと同様であった。上記のように、ベクターをｍＡｂ ９Ｃ１２とともに１時間インキュベートし、混合物を２００ｉｆｕ／細胞の感染多重度で２時間細胞に添加し、ベクターに新鮮な培地を補充し、その後、さらなる２４時間後にＧＦＰ蛍光を読み取った。ｍＡｂ ９Ｃ１２についてＩＣ５０の大幅な上昇が、Ａｄ５－ＤＴ単独と比較してＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰｎカップリングベクターを用いて観察されたが、これは、中和モノクローナル抗体からのヘキソンの遮蔽を暗示する（図８Ｂ）。Ａｄ５－ＤＴ：ＤＣ－ＮＡＮＰ１８は、ＩＣ５０の最高の上昇を呈し、Ａｄ５－ＤＴ単独と比較して＞１０倍であった。
【0178】
図８Ｃでは、Ａｄ５陽性マウス血清（ｍＡｂ ９Ｃ１２の代わりに）を用いた中和アッセイを、カップリングしたＡｄ５－ＤＴ：ＤＣ－ＮＡＮＰｎベクターで実施した。Ａｄ５陽性マウス血清を生成するために、マウスを１Ｅ＋８ｉｆｕ Ａｄ５（オバルブミン）（ＷＴヘキソン）ベクター（Ｅ１遺伝子座でコードされる構成的ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰの代わりにオバルブミンを発現する未改変ヘキソンを備えるＡｄ５のＥ１欠失のおよびＥ３欠失のベクター）で筋肉内に免疫し、免疫の２週間後に血清を採取した。中和アッセイの結果が実証したところは、中和抗血清のＩＣ５０は、Ａｄ５－ＤＴ単独と比較してＡｄ５－ＤＴ：ＮＡＮＰ９およびＡｄ５－ＤＴ：ＮＡＮＰ１８を用いると上昇することである（図８Ｃ）。
【実施例9】
【0179】
実施例９－ＳＫＯＶ３細胞のヒト凝固第Ｘ因子依存性ベクター形質導入
特に静脈内投与後、Ａｄ５を始めとする一部の血清型のアデノウイルスは、ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）とウイルスのヘキソンタンパク質との相互作用を介して肝細胞に形質導入することができることが実証されてきた［Ｓｉｍｏｎ Ｎ．Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｈ．ＭｃＶｅｙ、Ｄａｖｉｄ Ｂｈｅｌｌａ、Ｍｅｎｚｏ Ｊ．Ｅ．Ｈａｖｅｎｇａ、Ｓｔｕａｒｔ Ａ．Ｎｉｃｋｌｉｎ、Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｂａｋｅｒ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ Ｈｅｘｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｌｉｖｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｃｅｌｌ、２００８、１３２巻、３号、Ｐ３９７～４０９］。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ＦＸ媒介性感染は、ＦＸの存在下または非存在下で、ヒト卵巣がん細胞株であるＳＫＯＶ３細胞のベクター形質導入を測定することによって評価され得る。
特に静脈内投与後、Ａｄ５を始めとする一部の血清型のアデノウイルスは、ヒト凝固第Ｘ因子（ＦＸ）とウイルスのヘキソンタンパク質との相互作用を介して肝細胞に形質導入することができることが実証されてきた［Ｓｉｍｏｎ Ｎ．Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｊｏｈｎ Ｈ．ＭｃＶｅｙ、Ｄａｖｉｄ Ｂｈｅｌｌａ、Ｍｅｎｚｏ Ｊ．Ｅ．Ｈａｖｅｎｇａ、Ｓｔｕａｒｔ Ａ．Ｎｉｃｋｌｉｎ、Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．Ｂａｋｅｒ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ Ｈｅｘｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｌｉｖｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｃｅｌｌ、２００８、１３２巻、３号、Ｐ３９７～４０９］。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ＦＸ媒介性感染は、ＦＸの存在下または非存在下で、ヒト卵巣がん細胞株であるＳＫＯＶ３細胞のベクター形質導入を測定することによって評価され得る。
【0180】
Ａｄ５（ＧＦＰ）－ＤｏｇＴａｇ（Ａｄ５）またはＡｄ５（ＧＦＰ）－ＤｏｇＴａｇ：ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ１８（Ａｄ５－ＮＡＮＰ１８）ベクター（２Ｅ＋９ウイルス粒子）を、ヒト凝固第Ｘ因子（８μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で、無血清培地で３７℃で２時間ＳＫＯＶ３細胞上でインキュベートした。次いで、培地を新鮮な完全培地と交換し、プレートをさらに４８時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡によるＧＦＰ陽性フォーカスの計数によって感染力価を算出した。
【0181】
データが指示するところは、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ－ＮＡＮＰ１８のＡｄ５ヘキソンへのカップリングは、おそらくウイルスカプシドをＦＸとの相互作用から遮蔽することによって、ＳＫＯＶ３細胞のＦＸ依存性感染を減少させることである。
【実施例10】
【0182】
実施例１０－Ａｄ５表面提示ペプチド抗原へのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を評価するためのマウス免疫原性実験。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４匹／群）を、以下のいずれかで筋肉内免疫した（図１０Ａ）：表面提示ベクターＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５－ＤＴ：ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬ（５Ｅ＋９ウイルス粒子、過剰なペプチドおよびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを除去するために透析した）（群１）、群１におけるのと同じＳＩＩＮＦＥＫＬ表面提示ベクターであるが、過剰なペプチドおよびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを除去するための透析無し（５Ｅ＋９ウイルス粒子、過剰なＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド０．７μｇ）（群２）、ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（０．７μｇ、ベクターにカップリングされていない）とともに共投与されたＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（５Ｅ＋９ ウイルス粒子）（群３）、または、ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（５μｇ、ポリＩ：Ｃ １０μｇとともに共投与された）（群４）。ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬの分子量、８０％のヘキソンカバレッジのカップリング効率（図６Ｃを参照されたい、ＰＥＰ１）、ビリオンあたり７２０コピーのヘキソン、およびワクチン１用量あたり５Ｅ＋９ビリオンを考慮した場合、群１からのカップリングベクター上で提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの有効用量を概１０ｎｇであると算出した。群４のペプチドの用量は群１におけるよりも５００倍である。免疫後１４日後、マウスを犠牲にし、脾臓のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、一晩、エクスビボＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４匹／群）を、以下のいずれかで筋肉内免疫した（図１０Ａ）：表面提示ベクターＡｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５－ＤＴ：ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬ（５Ｅ＋９ウイルス粒子、過剰なペプチドおよびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを除去するために透析した）（群１）、群１におけるのと同じＳＩＩＮＦＥＫＬ表面提示ベクターであるが、過剰なペプチドおよびＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅを除去するための透析無し（５Ｅ＋９ウイルス粒子、過剰なＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド０．７μｇ）（群２）、ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（０．７μｇ、ベクターにカップリングされていない）とともに共投与されたＡｄ５（ＧＦＰ）ベクター（５Ｅ＋９ ウイルス粒子）（群３）、または、ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（５μｇ、ポリＩ：Ｃ １０μｇとともに共投与された）（群４）。ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬの分子量、８０％のヘキソンカバレッジのカップリング効率（図６Ｃを参照されたい、ＰＥＰ１）、ビリオンあたり７２０コピーのヘキソン、およびワクチン１用量あたり５Ｅ＋９ビリオンを考慮した場合、群１からのカップリングベクター上で提示されたＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの有効用量を概１０ｎｇであると算出した。群４のペプチドの用量は群１におけるよりも５００倍である。免疫後１４日後、マウスを犠牲にし、脾臓のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、一晩、エクスビボＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。
【0183】
マウスＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープであるＳＩＩＮＦＥＫＬへの脾臓エクスビボＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴ応答を図１０Ｂに示す。群１および群２のＳＩＩＮＦＥＫＬ応答は、群３における応答よりも高かったが、これが実証するところは、強力なＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｔ細胞応答を達成するには、ＳｎＪｒ－ＧＧＳＳＩＩＮＦＥＫＬのベクターカプシドへの付着が必要とされることである。細胞形質導入の際にベクターによって発現されるコードされたＧＦＰ導入遺伝子に存在するマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ、すなわちＤＴＬＶＮＲＩＥＬ（ＥＧＦＰ１１８～１２６）への脾臓エクスビボＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴ応答を、図１０Ｃに示す。群１～３の間のＥＧＦＰ１１８～１２６応答に有意差はなかったが、これが実証するところは、ベクターカプシドの表面装飾は、コードされたＧＦＰ導入遺伝子抗原へのＴ細胞応答を損なうことはなかったことである。
【実施例11】
【0184】
実施例１１－ｐＩＸのＣ末端にてのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの融合を介するアデノウイルスカプシドのモジュール式共有結合装飾。
図１１Ａに示されるように、ウイルスの首尾よいレスキューおよび効率的なカプシドの提示を容易にするために、ウイルスｐＩＸのＣ末端とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒΔＮ１のＮ末端の間に（ＥＡＡＡＫ）３リンカーを挿入した。
図１１Ａに示されるように、ウイルスの首尾よいレスキューおよび効率的なカプシドの提示を容易にするために、ウイルスｐＩＸのＣ末端とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒΔＮ１のＮ末端の間に（ＥＡＡＡＫ）３リンカーを挿入した。
【0185】
Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒベクター（３Ｅ＋９ウイルス粒子）を、ＳｐｙＴａｇ－マルトース結合タンパク質（ＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰ、５μＭ）またはＳｐｙＴａｇ－ヒトサイトメガロウイルス五量体（ＳｐｙＴａｇ－五量体、２．５μＭ）とともに４℃で１６時間インキュベートした（図１１Ｂ）。ＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰまたはＳｐｙＴａｇ－五量体単独を含有する試料を対照として含めた。コンジュゲーション後、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ウエスタンブロッティング用にニトロセルロースに転写した。ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ－ＭＢＰ、およびｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ－ｇＨ（ＨＣＭＶ五量体から）の各種を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質で免疫されたマウス由来の抗血清を使用して検出した（図１１Ｂ）。
【0186】
Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒベクター（３Ｅ＋９ウイルス粒子）をビオチン化ＳｐｙＴａｇペプチド（５μＭ）とともに４℃で１６時間インキュベートした（図１１Ｃ）。ゲルシフトアッセイによりｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒへのペプチドカップリング効率を評価するために、図６Ｄに記載のように、ベクター材料を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とＤＴＴを含む試料緩衝剤中で変性させ、煮沸した後、冷却し、一価ストレプトアビジン（ｍＳＡ）とともにインキュベートした。ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ種およびｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ：ＳｐｙＴａｇ－ビオチン／ｍＳＡ種を、Ｂに記載のようにＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ抗血清を用いたウエスタンブロッティングによって検出した。
【0187】
図１１Ｂおよび１１Ｃに示される同じ試料で、ベクター感染力アッセイ（先に記載のようにＧＦＰフォーカス計数による）を実施した（図１１Ｄ）。結果が実証したところは、Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの感染力が、ＳｐｙＴａｇ－タンパク質融合体またはペプチドの表面提示によって影響を受けないことである。
【実施例12】
【0188】
実施例１２－ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒまたはＤｏｇＣａｔｃｈｅｒを備える様々な組換えアデノウイルスベクターの生存可能性、遺伝的安定性、および生産量
さらなる研究が実証したところは、実施例１１に記載のベクター構築物（ＥＡＡＡＫ３リンカーを介してｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）は反応性ではあったが、一方、遺伝的に安定していなかったことである。代替リンカー配列（ＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（ＧＳＧ３）、ＧＧＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＧＳ（ＥＡＡＡＫ３）、もしくはＧＧＳＰＡＮＬＫＡＬＥＡＱＫＱＫＥＱＲＱＡＡＥＥＬＡＮＡＫＫＬＫＥＱＬＥＫＧＳ（リボソームタンパク質Ｌ９由来のらせん配列、Ｖｅｇｇｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１６年２月２日；１１３（５）：１２０２～７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１９２１４１１３）（ＨＥＬＩＸ））、リンカーのいずれかの側のＧＳヒンジ配列、または代替Ｃａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｄＮ１、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｄＮ１ｄＣ２、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ）を備える、様々な代替構築物を構築した（図１２Ａ）。各ベクターＤＮＡ構築物を、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へのトランスフェクションに先立ち、ＰａｃＩ制限消化によって線状化してウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を放出させた。各構築物での生存可能性を、組換えウイルスの首尾よいレスキューを指示するはずである細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生に関して細胞単層を検査することによって評価した。生存可能なウイルスベクター調製物を継代培養してウイルス力価を向上させたが、この場合、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離による精製に十分な材料を得るのに典型的には３回の継代培養が必要であった（最初のトランスフェクションから）。各生存可能ベクターの第２のバッチを得るには第４の継代培養が必要であり、第３の継代培養と第４の継代培養後にｐＩＸ遺伝子座の配列決定によって遺伝子の安定性について評価した。ベクター生産量を評価するために、生存可能なベクターを合計１０×Ｔ１５０フラスコ（総表面積１５００ｃｍ２ ＨＥＫ２９３Ａ細胞）から増幅し、ＣｓＣｌ超遠心分離によって精製し、感染力価を先に記載のようにＧＦＰ感染力アッセイによって算出した（図１２Ｂ）。
さらなる研究が実証したところは、実施例１１に記載のベクター構築物（ＥＡＡＡＫ３リンカーを介してｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）は反応性ではあったが、一方、遺伝的に安定していなかったことである。代替リンカー配列（ＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（ＧＳＧ３）、ＧＧＳＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＧＳ（ＥＡＡＡＫ３）、もしくはＧＧＳＰＡＮＬＫＡＬＥＡＱＫＱＫＥＱＲＱＡＡＥＥＬＡＮＡＫＫＬＫＥＱＬＥＫＧＳ（リボソームタンパク質Ｌ９由来のらせん配列、Ｖｅｇｇｉａｎｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１６年２月２日；１１３（５）：１２０２～７．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１９２１４１１３）（ＨＥＬＩＸ））、リンカーのいずれかの側のＧＳヒンジ配列、または代替Ｃａｔｃｈｅｒ（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｄＮ１、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ ｄＮ１ｄＣ２、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ）を備える、様々な代替構築物を構築した（図１２Ａ）。各ベクターＤＮＡ構築物を、ＨＥＫ２９３Ａ細胞へのトランスフェクションに先立ち、ＰａｃＩ制限消化によって線状化してウイルス逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を放出させた。各構築物での生存可能性を、組換えウイルスの首尾よいレスキューを指示するはずである細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生に関して細胞単層を検査することによって評価した。生存可能なウイルスベクター調製物を継代培養してウイルス力価を向上させたが、この場合、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離による精製に十分な材料を得るのに典型的には３回の継代培養が必要であった（最初のトランスフェクションから）。各生存可能ベクターの第２のバッチを得るには第４の継代培養が必要であり、第３の継代培養と第４の継代培養後にｐＩＸ遺伝子座の配列決定によって遺伝子の安定性について評価した。ベクター生産量を評価するために、生存可能なベクターを合計１０×Ｔ１５０フラスコ（総表面積１５００ｃｍ２ ＨＥＫ２９３Ａ細胞）から増幅し、ＣｓＣｌ超遠心分離によって精製し、感染力価を先に記載のようにＧＦＰ感染力アッセイによって算出した（図１２Ｂ）。
【実施例13】
【0189】
実施例１３－ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの反応性
Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合リガンドとの反応性を評価するために、Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒベクターを、タグ完全長ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ（Ｓｐｉｋｅ）またはＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質とともにインキュベートした。両方の組換えタンパク質を、哺乳動物の懸濁液２９３Ｆ細胞で産生させたが、この場合、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒをＣ末端で融合させた。４℃で１６時間のカップリング反応後、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒに対して反応性を有するマウス血清（ＩＭＸ３１３－ＤｏｇＴａｇ：ＳｎｏｏｐＴａｇ－ＣＩＤＲ：ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅで免疫したマウス由来の血清、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、 Ａ．Ｃ．、Ｂｕｌｄｕｎ、 Ｃ．Ｍ．、Ｐａｔｔｉｎｓｏｎ、Ｄ．Ｊ．らＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｏｄｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９、４６２５（２０１９））を使用してウエスタンブロットを実施した（図１３Ａ）。対照は、ベクター単独（Ｖｅｃｔｏｒ）、Ｓｐｉｋｅ単独（Ｓｐｉｋｅ）およびＲＢＤ単独（ＲＢＤ）を含んだ。ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（ｐＩＸ－ＳｎＣ）、ならびに共有結合カップリングのｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－Ｓｐｉｋｅ（ｐＩＸ－ＳｎＣ：ＳｎＪｒ－Ｓｐｉｋｅ）およびｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＲＢＤ（ｐＩＸ－ＳｎＣ：ＳｎＪｒ－ＲＢＤ）を始めとする種が指示される。図１３Ａに記載のカップリング反応の直後に、同じ試料を用いてベクター感染力アッセイ（ＧＦＰフォーカス）を行った（図１３Ｂ）。データが指示するところは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒは、ｐＩＸのＣ末端に融合される場合には反応性があること、およびリガンドのｐＩＸへのカップリングはｉｎ ｖｉｔｒｏでのベクター感染力を損なうことはないこと（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ三量体のサイズが５００ｋＤａを超えるにもかかわらず）である。
Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒのＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ融合リガンドとの反応性を評価するために、Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒベクターを、タグ完全長ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ（Ｓｐｉｋｅ）またはＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）タンパク質とともにインキュベートした。両方の組換えタンパク質を、哺乳動物の懸濁液２９３Ｆ細胞で産生させたが、この場合、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒをＣ末端で融合させた。４℃で１６時間のカップリング反応後、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒに対して反応性を有するマウス血清（ＩＭＸ３１３－ＤｏｇＴａｇ：ＳｎｏｏｐＴａｇ－ＣＩＤＲ：ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅで免疫したマウス由来の血清、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、 Ａ．Ｃ．、Ｂｕｌｄｕｎ、 Ｃ．Ｍ．、Ｐａｔｔｉｎｓｏｎ、Ｄ．Ｊ．らＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｍｏｄｕｌａｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ９、４６２５（２０１９））を使用してウエスタンブロットを実施した（図１３Ａ）。対照は、ベクター単独（Ｖｅｃｔｏｒ）、Ｓｐｉｋｅ単独（Ｓｐｉｋｅ）およびＲＢＤ単独（ＲＢＤ）を含んだ。ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（ｐＩＸ－ＳｎＣ）、ならびに共有結合カップリングのｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－Ｓｐｉｋｅ（ｐＩＸ－ＳｎＣ：ＳｎＪｒ－Ｓｐｉｋｅ）およびｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ：ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ－ＲＢＤ（ｐＩＸ－ＳｎＣ：ＳｎＪｒ－ＲＢＤ）を始めとする種が指示される。図１３Ａに記載のカップリング反応の直後に、同じ試料を用いてベクター感染力アッセイ（ＧＦＰフォーカス）を行った（図１３Ｂ）。データが指示するところは、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒは、ｐＩＸのＣ末端に融合される場合には反応性があること、およびリガンドのｐＩＸへのカップリングはｉｎ ｖｉｔｒｏでのベクター感染力を損なうことはないこと（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ Ｓｐｉｋｅ三量体のサイズが５００ｋＤａを超えるにもかかわらず）である。
【0190】
Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒのＤｏｇＴａｇ融合リガンドとの反応性を評価するために、Ａｄ５（ＧＦＰ）ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒベクターを、Ｃ末端で融合されたＤｏｇＴａｇを備える大腸菌発現性の低分子ユビキチン修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質とともにインキュベートした。４℃で１６時間のカップリング反応後、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒに対して反応性を有するマウス血清を使用してウエスタンブロットを実施した（図１３Ｃ）。ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒはＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒとかなりの程度の配列同一性を共有するので、図１３Ａに記載のウエスタンブロットに使用したのと同じマウス血清を図１３Ｃでも使用した。対照は、ベクター単独（Ｖｅｃｔｏｒ）およびＳＵＭＯ単独（ＳＵＭＯ）を含んだ。ｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ（ｐＩＸ－ＤＣ）種およびｐＩＸ－ＤｏｇＣａｔｃｈｅｒ：ＤｏｇＴａｇ－ＳＵＭＯ（ｐＩＸ－ＤＣ：ＤＴ－ＳＵＭＯ）種が指示される。
【実施例14】
【0191】
実施例１４－ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｐｙＴａｇの反応性
図１２Ａに示されるＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの融合構築物と同様に、ｐＩＸとＧＧＳヒンジおよびＧＳヒンジが隣接するタグとの間にＥＡＡＡＫ３リンカーを用いて、ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｐｙＴａｇとともに、Ａｄ５（ＧＦＰ）ベクターを構築した。Ａｄ５ ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒベクターとＡｄ５ ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇベクターの両方をＨＥＫ２９３Ａ細胞へとトランスフェクトし、継代培養し、１０×Ｔ１５０ｃｍ２フラスコへと増幅した。両方のベクターの感染生産量は高く、Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇに匹敵した（図１４Ａ）。
図１２Ａに示されるＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒおよびＤｏｇＣａｔｃｈｅｒの融合構築物と同様に、ｐＩＸとＧＧＳヒンジおよびＧＳヒンジが隣接するタグとの間にＥＡＡＡＫ３リンカーを用いて、ｐＩＸのＣ末端に融合されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＳｐｙＴａｇとともに、Ａｄ５（ＧＦＰ）ベクターを構築した。Ａｄ５ ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒベクターとＡｄ５ ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇベクターの両方をＨＥＫ２９３Ａ細胞へとトランスフェクトし、継代培養し、１０×Ｔ１５０ｃｍ２フラスコへと増幅した。両方のベクターの感染生産量は高く、Ａｄ５（ＧＦＰ）ＨＶＲ５－ＤｏｇＴａｇに匹敵した（図１４Ａ）。
【0192】
ｐＩＸ融合体として提示されたＳｎｏｏｐＴａｇＪｒおよびＳｐｙＴａｇの反応性を評価するために、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒ（ＲＢＤ－ＳｎＣもしくはＳｎＣ－ＲＢＤ、それぞれＲＢＤへのＣ－もしくはＮ末端融合体）またはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ＲＢＤ－ＳＣ、Ｃ末端融合体）のいずれかに融合されたＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＲＢＤタンパク質を発現した組換え哺乳動物（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ、ＣＨＯ）細胞とともに、Ａｄ５ ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒ（Ａｄ５ ｐＩＸ－ＳｎＪｒ）ベクターまたはＡｄ５ ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇ（Ａｄ５ ｐＩＸ－ＳＴ）ベクターを、共インキュベートした。４℃で１６時間のカップリング反応後、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥでランさせ、抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＲＢＤポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用してウエスタンブロットを実施した（図１４Ｂ）。ＴａｇモジュールとＣａｔｃｈｅｒモジュール間のカップリングを表すタンパク質種が指示される（＊）。図１４Ｂに記載のカップリング反応の直後に、同じ試料を用いてベクター感染力アッセイ（ＧＦＰフォーカス）を行った（図１４Ｃ）。リガンドのカップリングはＡｄ５ ｐＩＸ－ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒまたはＡｄ５ ｐＩＸ－ＳｐｙＴａｇの感染力どちらも損ねることはなかった。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【配列表】
【国際調査報告】