(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-20
(54)【発明の名称】フリードライヒ失調症の治療における金ナノクラスタ
(51)【国際特許分類】
A61K 31/28 20060101AFI20230113BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20230113BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230113BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230113BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230113BHJP
【ＦＩ】
A61K31/28
A61P39/06
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022526456
(86)(22)【出願日】2020-11-10
(85)【翻訳文提出日】2022-06-23
(86)【国際出願番号】 IB2020060579
(87)【国際公開番号】W WO2021094921
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】102019000020724
(32)【優先日】2019-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522179149
【氏名又は名称】ノヴィステム エスピーエイ
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＹＳＴＥＭ Ｓ．Ｐ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100173473
【弁理士】
【氏名又は名称】高井良 克己
(72)【発明者】
【氏名】アンジェロ マリア モングッチ
(72)【発明者】
【氏名】チアラ ヴィラ
(72)【発明者】
【氏名】イヴァン トレンテ
【テーマコード（参考）】
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206JB01
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA16
4C206ZC21
(57)【要約】
本発明は、酸化ストレスに関連する病態の治療における使用のための、金原子と少なくとも１つの配位子からなる超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸに関するものであり、クラスタ中の金原子の数が２～１００であるか、またはクラスタ寸法が２ｎｍより小さい。好ましい実施形態において、Ａｕ－ｐＸ超構造化金クラスタは、フリードライヒ失調症の治療に使用される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸化ストレスに関連する疾患の治療における使用のための、金原子と少なくとも１つの配位子からなる超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸであって、前記クラスタ中の金原子の数が２～１００に含まれるか、またはクラスタの寸法が２ｎｍより小さい、超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項2】
前記金原子が８個であり、前記超構造化クラスタはＡｕ８－ｐＸと呼ばれる、請求項１に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項3】
前記配位子は１１－メルカプトウンデカン酸である、請求項１または２に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項4】
前記病態は過剰なＲＯＳによって決定される、請求項１～３の一項に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項5】
前記病態はフリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）から選択される、請求項１～４の一項に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項6】
前記病態はフリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）である、請求項１～５の一項に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項7】
前記治療は静脈内投与である、請求項１～６の一項に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項8】
前記治療は１回の静脈内投与からなる、請求項１～５の一項に記載の使用のための超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸ。
【請求項9】
８個の金原子と少なくとも１つの配位子からなる超構造化金クラスタＡｕ－ｐＸと、薬学的に許容される静脈内投与用の賦形剤とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）は、フラタキシンをコードするＦＸＮ遺伝子（９ｑ２１．１１）のイントロン１に位置するＧＡＡトリプレットの不安定な伸長により引き起こされる神経変性疾患である。本疾患は、進行性の歩行および四肢の失調、構音障害、嚥下障害、眼球運動障害、深部腱反射の消失、錐体路徴候、側弯症、そして場合によっては心筋症、糖尿病、失明、および聴覚障害で主に特徴づけられる。
【背景技術】
【0002】
ＦＲＤＡを解決する治療法はなく、現在、症状的な枠組みは、典型的には理学療法、痙性制御のためのバクロフェンおよびボツリヌス毒素などの薬理剤、心筋症のための抗不整脈薬および抗凝固薬の支援により、集学的に治療が行われている。
【0003】
LIM F, et al. Mol Ther. 2007; 15: 1072-1078（非特許文献１）; Vyas PM, et al. HUM mol Genet. 2012; 21: 1230-47（非特許文献２）; Jones J, et al. Mol Ther. 2015; 23: 130-138（非特許文献３）; Perdomini M, et al. Mean NAT. 2014; 20: 542-547（非特許文献４）には、健康なフラタキシンのレベルを上昇させるために試験された、幹細胞または遺伝子治療による前臨床治療が記載されている。
【0004】
ハンチントン病（ＨＤ）は、第４染色体の短腕（４ｐ１６．３）上のハンチンチンをコードする遺伝子におけるＣＡＧトリプレットの不安定な伸長によって引き起こされる神経変性疾患である。本疾患は、筋協調性に影響をおよぼし、認知機能の低下および精神的な問題を引き起こす。現在までのところ、利用可能な薬物治療では、多数の症状の多くを軽減することはできていない。
【0005】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に身体に障害を引き起こす変性性認知症の最も一般的な形であり、主に初老期に発症する。アルツハイマー病を解決する治療法は現在、利用不可能である。
【0006】
パーキンソン病（ＰＤ）は、神経変性疾患である。この病気に特有の運動症状は、ドーパミンを合成および放出する細胞が死滅した結果である。薬物治療、手術、および集学的管理による症状の緩和は可能であるが、パーキンソン病の治療法は現在、利用不可能である。
【0007】
酸化ストレスは、ＦＲＤＡの病態形成の重要な構成要素であり、ＤＮＡ損傷および神経細胞変性を説明し得る（Yokota T, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98: 15185-15190（非特許文献５））。また、酸化ストレスはＨＤ（Kumara A, Ratana RR, J Huntington's Dis. 2016; 5(3): 217-237（非特許文献６））、ＡＤ（Markesbery WR, Free radical Biology and Medicine 1997; 23(1): 134-147(非特許文献７））、およびＰＤ（Henchcliffe C, Beal MF, Nature clinical practice 2008; 4(11):600-609（非特許文献８））の病因に関与していることが示されている。
【0008】
しかし、細胞の酸化的ダメージを軽減するための、イデベノン、ＭｉｔｏＱ、ＣｏＱ１０、およびビタミンＥなどの抗酸化物質を用いた臨床研究は、限られた成功にとどまっている。
【0009】
Santiago-Gonzales B et al. Science 2016; 353-571-575（非特許文献９）には、Ａｕ－ｐＸと呼ばれる、金原子の集合体によって形成された安定した超構造が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】LIM F, et al. Mol Ther. 2007; 15: 1072-1078
【非特許文献2】Vyas PM, et al. HUM mol Genet. 2012; 21: 1230-47
【非特許文献3】Jones J, et al. Mol Ther. 2015; 23: 130-138
【非特許文献4】Perdomini M, et al. Mean NAT. 2014; 20: 542-547
【非特許文献5】Yokota T, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 15185-15190
【非特許文献6】Kumara A, Ratana RR, J Huntington’s Dis. 2016; 5(3): 217-237
【非特許文献7】Markesbery WR, Free radical Biology and Medicine 1997; 23(1): 134-147
【非特許文献8】Henchcliffe C, Beal MF, Nature clinical practice 2008; 4(11): 600-609
【非特許文献9】Santiago-Gonzales B et al. Science 2016; 353-571-575
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、現在までに利用可能な治療法の限界を超える、過剰な酸素ラジカルによって引き起こされる病態、特にＦＲＤＡを治療するための方法に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１のＡは、クラスタＡｕ８－ｐＸの非存在下でＨ２０２水溶液を添加する前（実線）と後（破線）のＰＢＳ電解質のサイクリックボルタモグラムを示す図である。図１のＢは、クラスタＡｕ８－ｐＸの存在下でＨ２０２水溶液を添加する前（実線）と後（破線）のＰＢＳ電解質のサイクリックボルタモグラムを示す図である。
【図5】図５は、Ａｕ８－ｐＸを注射したＹＧ８Ｒマウスの神経運動機能を示す図である。（Ａ）ＹＧ８ｓＲ－ＰＸ処置Ａｕ８マウスの後肢および前肢のフットプリントテストの代表的な写真。（Ｂ）フットプリントテストでは、対照動物（ＣＴＲ）と比較して、Ａｕ８－ｐＸ注射マウスのピッチ長（ストライド長）の増加が見られた。（Ｃ）トレッドミル試験（Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ Ｔｅｓｔ）により、Ａｕ８－ｐＸ注射マウスは、対照と比較して、パルス数（ショック数）で測定した運動耐性が増加していることが明らかになった。数値は平均値±ＳＥＭを表す。Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；Ｐ＜０．００１；ｎｓ＝有意でない（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）。ＣＴＲ＝対照動物。
【図6】図６は、Ａｕ８－ｐＸを注射したＹＧ８Ｒマウスの心機能を示す図である。（Ａ）Ａｕ８－ｐＸで処置したマウス（注射済み）と未処置のマウス（未処置）の代表的なＭモード心エコー画像。（Ｂ）心エコー解析により、Ａｕ８－ｐＸ注射マウスでは、対照に対して駆出率（ＥＦ）および短縮率（ＦＳ）が増加したことが明らかになった。数値は平均値±ＳＥＭを表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図7】図７は、後根神経節、皮質、小脳および基底核における抗酸化物質の発現レベルを示す図である。ＱＲＴ－ＰＣＲ解析により、Ａｕ８－ｐＸ注射マウスの後根神経節では、Ｐｒｄｘ２、Ｇｓｔｍ１、およびＮｒｆ２の発現が対照と比較して統計的に有意に優れていることが明らかになった。データはＧＡＰＤＨに正規化した。数値は平均値±ＳＥＭを表す。ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１。
【図8】図８は、Ａｕ８－ｐＸを注射したＹＧ８Ｒマウスの皮質、基底核、小脳、膵臓、心臓、および骨格筋における生化学的レドックスパラメータの解析を示す図である。（Ａ）Ａｕ８－ｐＸ注射マウスの小脳および膵臓を除くすべての組織において、対照動物と比較して、ミトコンドリアＡＴＰレベルが有意に増加する。（Ｂ）ミトコンドリアＲＯＳ解析により、前脛骨節と基底核を除き、注射動物と対照動物との間に統計的な有意差はないことが明らかになった。（Ｄ）Ａｕ８－ｐＸ注射マウスでは、皮質と心臓を除く試験したすべての組織において、対照と比較して、ミトコンドリアの脂質過酸化（ＯＨ－ノネナール）が減少した。（Ｅ）Ａｕ８－ｐＸ注射マウスでは、（ＤＮＡ損傷について）皮質、心臓、および膵臓を除く試験したすべての組織において、対照と比較して、ミトコンドリアＤＮＡの損傷（８－オキソグアニン）が減少した。（Ｆ）Ａｕ８－ｐＸ注射マウスの皮質、小脳、大腿四頭筋、前脛骨筋、およびヒラメ筋において、ミトコンドリアのＳＯＤレベルが有意に減少した。数値は、平均値±ＳＥＭを表す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、酸化ストレスの治療に使用するための、Ａｕ－ｐＸと呼ばれる超構造化金クラスタに関するものである。クラスタとは、Yamazoe Sら（Seiji Yamazoe, Kiichirou Koyasu, Tatsuya Tsukuda, Accounts of Chemical Research 2014 DOI: 10.1 021/ar400209a）が提示する定義に従って、２～１００に含まれる数の金属原子からなるか、または２ナノメートルより小さい寸法を維持する原子の集合体を意味する。
【0014】
好ましい実施形態において、前記超構造化金クラスタは、Santiago-Gonzalez et al. 2016, 353: 571-575に記載の方法に従って得られる。好ましい実施形態において、前記Ａｕ－ｐＸは、８個の金原子（Ａｕ８）からなるクラスタから出発して得られ、８個の金原子の集合体である。前記金クラスタは、Ａｕ８－ｐＸと呼ばれるコロイド超分子超構造体（直径４－５ナノメートル）の基本構成要素であり、閉鎖配位子の間に形成される水素結合によって互いに架橋される。
【0015】
好ましい実施形態において、前記配位子は、カルボキシ官能基を露出しチオール基を介して金原子を結合させる１１－メルカプトウンデカン酸である。
【0016】
好ましい実施形態において、前記Ａｕ－ｐＸの使用は、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）の治療におけるものである。さらなる実施形態では、前記使用は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および／またはハンチントン病（ＨＤ）の治療におけるものである。
【0017】
好ましい実施形態において、前記Ａｕ－ｐＸ超構造化金クラスタは、静脈内投与のための薬学的に許容される賦形剤も含む組成物中に含まれる。ＡＤ、ＰＤ、ＨＤなどの酸化ストレスに関連する病態に罹患した対象の治療方法についても記載される。
【0018】
前記方法は、本発明によるＡｕ－ｐＸ超構造金クラスタを含む組成物の静脈内投与を含む。好ましい実施形態において、前記方法は、１回の投与を含む。
【0019】
本発明による方法の利点は、ミトコンドリア活性に対する長期的な効果を誘発することによって神経、骨格筋および心臓系を含む複数の組織内の異なるタイプの細胞と相互作用する、Ａｕ－ｐＸの能力にある。ＲＯＳレベルは変化しないものの、Ａｕ８－ｐＸで処置したＹＧ８Ｒ動物の神経、骨格および心臓組織におけるミトコンドリア活性の増加を伴った酸化ストレスおよびＤＮＡ損傷の減少が、ここで驚くべきことに証明された。Ａｕ－ＰＸは犠牲的な役割を持たないため、１回の投与後その効果が長期間にわたって維持される。これにより、酸素ラジカル過剰症に罹患している対象の治療を１回の投与で行うことが可能になる。
【0020】
以下の例は、本発明をより良く説明することのみを目的としており、決して本発明を限定するものではない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
【実施例】
【0021】
実施例１：Ａｕ８金クラスタ（Ａｕ８－ｐＸ）をベースとするコロイド超構造体の合成。
Ａｕ８クラスタをベースとする超構造体は、Santiago-Gonzalez et al.に記載されているように得た。簡潔には、以下の手順に従った。
Ａｕ８クラスタをベースとする超構造体は、Santiago-Gonzalez et al.に記載されているように得た。簡潔には、以下の手順に従った。
【0022】
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の合成：ＡｕＮＰを、１ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ペレット＞９８％、無水）を９０ｍＬの超純水（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ ｐｌｕｓ、ＨＰＬＣグレード）に加えることによって得た。次に、２４ｍＬのＴＨＣＰを２ｍＬの水と混ぜることによって調製したテトラキス、ヒドロキシメチルホスホニウムクロリド（ＴＨＣＰ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液２ｍＬを加えた。混合物を５分間撹拌し、続いて３ｍＬの０．０３Ｍ ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，９９．９９９％微量の金属塩基）を加えた。得られた溶液の褐色は、Ａｕ＋３がＡｕ°に還元され、２－３ｎｍの金粒子が形成されたことを示す。
【0023】
Ａｕ８クラスタ超構造体（Ａｕ８－ｐＸ）の合成：このナノ材料は、先に合成したＡｕＮＰをエッチングすることによって得られる。２ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ７）を１０ｍＬのＡｕＮＰ（４℃で保存）に加えた。次に、当量のＮａＯＨを含む２ｍＬの１１－メルカプトウンデカン酸（ＭＵＡ）０．１Ｍ（２ｍＬの水とＭＵＡの分散液に０．２ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨを添加）を加えた。この溶液のｐＨをｐＨ２．５とｐＨ９のリン酸緩衝液１００ｍｍでｐＨ＝７．５に調整した。混合物を光から保護し、冷蔵庫で７２時間反応させた。得られた淡黄色の溶液を１１０００ｇで３０分間遠心分離して過剰のチオールを除去し、Ｗｈａｔｍａｎシリンジメンブランフィルタ（孔径０．２２μｍ）でろ過して溶液から残った粒子集合体を除去することによって数回精製した。得られた生成物がＡｕ８－ｐＸである。
【0024】
実施例２：水性媒体中の過酸化水素の解離に対してＡｕ８－ｐＸ過剰構造化金クラスタが発揮する触媒効果の測定
この実験の目的は、サイクリックボルタンメトリーによって、クラスタの非犠牲的な触媒活性を電気化学的に検証することであった。測定は、細胞環境の再現に一般に用いられる生理食塩水リン酸緩衝液ＰＢＳを電解質として用い、制御された一定分量の濃度３４５μＭの過酸化水素（Ｈ２０２）および／またはＡｕ８－ｐＸクラスタをシステムに導入し、できるだけ生物学的状況に近い状況で実行した。
この実験の目的は、サイクリックボルタンメトリーによって、クラスタの非犠牲的な触媒活性を電気化学的に検証することであった。測定は、細胞環境の再現に一般に用いられる生理食塩水リン酸緩衝液ＰＢＳを電解質として用い、制御された一定分量の濃度３４５μＭの過酸化水素（Ｈ２０２）および／またはＡｕ８－ｐＸクラスタをシステムに導入し、できるだけ生物学的状況に近い状況で実行した。
【0025】
電気化学的測定は、以下の特性を持つ３電極セルにおいて実行した。
【0026】
作用電極（ＷＥ）：金ピン電極、グラッシーカーボン、およびＦＴＯガラスピン、つまり、導電性透明酸化膜を蒸着したガラス上に、ドロップキャスティングによりＡｕ８－ｐＸの薄膜を蒸着したものから選択。
【0027】
参照電極（ＲＥ）：水性媒体での測定には飽和カロメル電極（ＳＣＥ）を用いた一方で、有機的環境にはＡｇ／ＡｇＣｌの擬似参照を用い、その後フェロセンで較正した。
【0028】
対極（ＣＥ）：水性媒体での測定にはグラッシーカーボンピンを用いた一方で、有機的環境には白金メッシュ電極を用いた。
【0029】
測定はすべて、ＰＡＲＳＴＡＴ２２７３ポテンショスタット／ガルバノスタット（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて行った。使用した開始電解液の量は３ｍＬである。
【0030】
得られた結果を図１で報告する。パネルＡは、２ｍＬのＨ２０２水溶液（０．３体積％）を添加する前（実線）と後（破線）のＰＢＳ電解液のサイクロボルトグラムを示す。
【0031】
ＰＢＳは全く活性がないことがわかる一方で、０．１Ｖ超の電圧では、過酸化水素の酸化によるピーク電流が明らかである。時間とともに信号強度は減少し、それは、溶液に加えた過酸化物がすべて酸化されると消滅する。パネルＢは、クラスタＡｕ８－ｐＸ ３４５μＭを含むＰＢＳ電解液の、２ｍＬのＨ２０２水溶液（０．３体積％）を加える前（実線）と後（破線）のサイクロボルトグラムを示したものである。実線は、Ａｕ８－ｐＸが存在するにもかかわらず、ＰＢＳのみの存在下で観察されたものに対して何の修正も加えず、クラスタが不活性であり、酸化または還元反応による電流ピークを示さないことを示す。逆に、破線はパネルＡとパネルＢで大きく修正されており、Ａｕ８－ｐＸクラスタが存在すると、Ｈ２０２の酸化に関連して電流ピークは完全に消失する。このデータは、過酸化水素の解離反応においてＡｕ８－ｐＸが触媒として役割を果たし、そのため過酸化水素が酸化反応に利用できなくなったことを示している。
【0032】
実施例３：異なる活性酸素種（ＲＯＳ）に対するＡｕ８－ｐＸクラスタの除去効果の測定
一重項酸素
一重項酸素１Ｏ２に対するクラスタの存在の効果を、市販の蛍光センサＳｉｎｇｌｅｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ（ＳＯＳＧ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＭ）を用いて、溶液中でフォトルミネセンス技術により測定した。ＳＯＳＧは共役有機分子であり、１Ｏ２の存在下で光学的に励起されると光酸化反応を起こし、発光する。したがって、ＳＯＳＧのフォトルミネセンス信号の強度は、溶液中に分散している１Ｏ２の濃度に比例する。本例の状況では、光増感剤としてＲｏｓｅ Ｂｅｎｇａｌ（ＲＢ）を用い、制御された方法で１Ｏ２を生成させる。
一重項酸素
一重項酸素１Ｏ２に対するクラスタの存在の効果を、市販の蛍光センサＳｉｎｇｌｅｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ（ＳＯＳＧ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＭ）を用いて、溶液中でフォトルミネセンス技術により測定した。ＳＯＳＧは共役有機分子であり、１Ｏ２の存在下で光学的に励起されると光酸化反応を起こし、発光する。したがって、ＳＯＳＧのフォトルミネセンス信号の強度は、溶液中に分散している１Ｏ２の濃度に比例する。本例の状況では、光増感剤としてＲｏｓｅ Ｂｅｎｇａｌ（ＲＢ）を用い、制御された方法で１Ｏ２を生成させる。
【0033】
１００μｇのＳＯＳＧを１ｍＬのメタノールに溶解させる。この溶液をＨＰＬＣ水で１：５に希釈し、２つのサンプルに分けた。そのうちの１つにＲＢ １０－５Ｍを加えた。金クラスタは、濃度３４５μＭの水溶液中で調製する。
【0034】
測定は、以下のように調製した４つのサンプルで行う。
－ＲＢ：ＳＯＳＧ水溶液１ｍＬ＋Ｈ２О １ｍＬ。
－ＲＢ：ＳＯＳＧ水溶液１ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液１ｍＬ。
－ＳＯＳＧ １ｍＬ＋Ｈ２０水溶液１ｍＬ。
－ＳＯＳＧ水溶液１ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液１ｍＬ。
－ＲＢ：ＳＯＳＧ水溶液１ｍＬ＋Ｈ２О １ｍＬ。
－ＲＢ：ＳＯＳＧ水溶液１ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液１ｍＬ。
－ＳＯＳＧ １ｍＬ＋Ｈ２０水溶液１ｍＬ。
－ＳＯＳＧ水溶液１ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液１ｍＬ。
【0035】
１Ｏ２を生成するため、非焦点５３２ｎｍＣＷレーザーを０．３ｍＷの出力で用いてＲＢを励起させる。ＳＯＳＧ検出器は、４７３ｎｍの非焦点ＣＷレーザーを０．３ｍＷの出力で用いてエネルギーを与える。溶液中の１Ｏ２濃度に比例するＳＯＳＧのフォトルミネセンス信号の強度は、Ｔｒｉａｘ１９０モノクロメーターに結合したＣＣＤ Ｓｐｅｃ２０００検出器（Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ－Ｙｖｏｎ）で記録する。
【0036】
図２に示す結果は、溶液中の１Ｏ２濃度の変化の割合を、調製した一連のサンプルにおける時間の関数として示すものである。ＲＢなしのサンプル（灰色線）では、有意な増加は記録されていない。ＲＢを含むサンプル（黒線）では、測定が行われた２５分間で１Ｏ２量が３００％増加している（十字線）。金クラスタの存在により（丸印線）１Ｏ２濃度は有意に低減し、最終的な増加は１５％にとどまり、これはＲＢなしのサンプルで観察されるものと完全に同等である。このデータから、クラスタによる１Ｏ２除去効果は、サンプル中のＲＯＳの最終濃度を２０分の１にまで低減させることがわかる。
【0037】
過酸化水素
Ｈ２０２過酸化水素に対するクラスタの存在の効果を、発光センサとしてジフェニル－１－ピレニルホスフィン（ＤＰＰＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＭ）を用いたフォトルミネセンス技術によって溶液中で測定した。ＤＰＰＰは、Ｈ２０２との相互作用によって酸化されるまでは発光しないホスフィンである。本形式では、ＤＰＰＰは近紫外で吸収ピークを示し、３８０ｎｍで発光を示す。したがって、ＤＰＰの発光強度は、溶液中のＨ２０２濃度に比例する。
Ｈ２０２過酸化水素に対するクラスタの存在の効果を、発光センサとしてジフェニル－１－ピレニルホスフィン（ＤＰＰＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＭ）を用いたフォトルミネセンス技術によって溶液中で測定した。ＤＰＰＰは、Ｈ２０２との相互作用によって酸化されるまでは発光しないホスフィンである。本形式では、ＤＰＰＰは近紫外で吸収ピークを示し、３８０ｎｍで発光を示す。したがって、ＤＰＰの発光強度は、溶液中のＨ２０２濃度に比例する。
【0038】
ＤＰＰＰを１０－４Ｍの濃度でエタノール溶液に溶解する。実験に用いた過酸化水素溶液は、３０体積％の過酸化水素溶液を１：１００で希釈して調製した。
【0039】
金クラスタは、３４５μＭの濃度で、水溶液中で調製した。
【0040】
測定は、以下のように調合した２つのサンプルで行った。
－ＤＰＰＰＰ溶液１．５ｍＬ＋Ｈ２０２ ０．２５ｍＬ。
－ＤＰＰＡ溶液１．５ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液０．２５ｍＬ。
－ＤＰＰＰＰ溶液１．５ｍＬ＋Ｈ２０２ ０．２５ｍＬ。
－ＤＰＰＡ溶液１．５ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液０．２５ｍＬ。
【0041】
測定は、出力３ｍＷの非焦点３５５ｎｍレーザーを連続照射し、出発溶液に加えたＨ２０２の量の関数としてＤＰＰのフォトルミネセンスの強度をモニタすることにより行った。ＤＰＰＰのフォトルミネセンス信号は、Ｔｒｉａｘ１９０モノクロメーターに結合したＣＣＤ Ｓｐｅｃ２０００検出器（Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ－Ｙｖｏｎ）を用いて記録した。
【0042】
図３に示す結果により、金クラスタがない場合（丸）、１７０ｍＬのＨ２０２を加えるとＲＯＳ濃度が５３０％増加することがわかる。金クラスタの存在は（三角）、Ｈ２０２の最終濃度に有意な影響を与えず、最終濃度は４４０％の相対的変動を示す。このデータは、例２でも示したように、金クラスタの過酸化水素に対する消化活性は存在するものの、一重項酸素に対する消化活性よりもはるかに低いことを示すものである。
【0043】
ラジカル酸素
ラジカル酸素Ｏ２・－に対する金クラスタの存在の影響を、市販の発光センサであるＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＭ）を用いて、フォトルミネセンス技術により溶液中で測定した。ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄは、スーパーオキシドラジカルとの反応時に選択的に発光する分子である。そのため、ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄの発光強度は、溶液中に分散しているＯ２・－の濃度に比例する。本例では、Environ. Ski. Technol.，you. 41, no.21, pp.7486-7490, 2007に記載されているように、ＲＯＳを、この種の発生源である過酸化水素の光分解を利用して生成させる。
ラジカル酸素Ｏ２・－に対する金クラスタの存在の影響を、市販の発光センサであるＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＭ）を用いて、フォトルミネセンス技術により溶液中で測定した。ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄは、スーパーオキシドラジカルとの反応時に選択的に発光する分子である。そのため、ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄの発光強度は、溶液中に分散しているＯ２・－の濃度に比例する。本例では、Environ. Ski. Technol.，you. 41, no.21, pp.7486-7490, 2007に記載されているように、ＲＯＳを、この種の発生源である過酸化水素の光分解を利用して生成させる。
【0044】
ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ５０μｇを０．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、Ｈ２０２を４．５ｍＬ加える。ラジカル酸素を発生させるために、３体積％の水溶液からＨ２０２を１０μＬ滴下した。金クラスタは、３４５μＭの濃度で水溶液中で調製する。
【0045】
測定は、以下のように調合した２つのサンプルで行った。
－ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ １ｍＬ＋Ｈ２０２溶液０．５ｍＬ。
－ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ溶液１ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液０．５ｍＬ。
－ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ １ｍＬ＋Ｈ２０２溶液０．５ｍＬ。
－ＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄ溶液１ｍＬ＋Ａｕ８－ｐＸ溶液０．５ｍＬ。
【0046】
測定は、出力２３．５ｍＷの４０５ｎｍ非焦点レーザーの連続照射下で、出発溶液に加えたＨ２０２の量の関数としてＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄのフォトルミネセンスの強度をモニタすることによって行った。使用した光源は、Ｏ２・－を生成するのに必要な過酸化水素の光分解と、光生成されたＯ２・－分子との相互作用によって活性化するＭＩＴＯＳＯＸＴＭ ｒｅｄの発光の両方を同時に活性化できる。フォトルミネセンス信号の強度は、Ｔｒｉａｘ１９０モノクロメーターに結合したＣＣＤ Ｓｐｅｃ２０００検出器（Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ－Ｙｖｏｎ）で記録した。
【0047】
図４に示す結果は、４０５ｎｍの照射下でのラジカル酸素Ｏ２・－の濃度の変動率を、出発溶液に加えた光増感剤Ｈ２０２の量の関数として示すものである。金クラスタを含まないサンプル（黒丸）では、３００μＬのＨ２０２を加えると、ＲＯＳ濃度が４４０％増加する。金クラスタの存在は（三角）、Ｏ２・－の増加を有意に抑え、Ｏ２・－は最終的に４５％の相対的変動を示す。ラジカル酸素の場合、クラスタの除去効果により、サンプル中のＲＯＳの最終濃度は１０分の１に減少する。
【0048】
実施例４：ＦＲＤＡ患者の骨髄由来の間葉系幹細胞の増殖および間葉系幹細胞における活性酸素の産生についてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価
ＦＲＤＡ患者の骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離。
ＦＲＤＡ対象３名から、インフォームドコンセントを集めた後、サンプルを入手した。左後腸骨稜から６ｍＬの骨髄を局所麻酔で無菌的に吸引した。採取した骨髄をセルフィルタ（１００μｍ）で濾過して、骨片や血塊を除去した。ＭＳＣの抽出には赤血球を溶解する方法を用いた。採取したサンプルを５０ｍＬの円錐形遠心管に移し、赤血球溶解バッファー、ＡＣＫ溶液（ＮＨ４Ｃｌ １５０ｍＭ、ＫＨＣ０３ １０ｍＭおよびＮａ２ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ）を１：５（ｖ／ｖ）で加え、管を手動で１分間撹拌し、次に４８０ｇで５分間遠心分離をした。その後、沈殿した骨髄をそれぞれの培養液で１：１の割合で希釈した。ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（１．０７７ｇ／ｍＬ）を用いて勾配密度遠心分離により骨髄由来の単核細胞部分（ＭＮＣ）を分離した。ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ ２．５ｍＬを滅菌済み１５ｍＬ遠心管に採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ層と混合せずに希釈骨髄５ｍＬで層別化する（比率１：２）。その後、サンプルを１８００ｒｐｍで２０分間、室温（ＲＴ）で遠心分離した。血漿プレップリンパ間相、バフィーコート層に集積したＭＮＣを吸引により注意深く単離し、新しい１５ｍＬ遠心管に移し、培養液に懸濁させた。再懸濁したペレットの全量を１７５ｃｍ２の換気フラスコに移し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地において、５％Ｃ０２、３７℃の標準条件の下インキュベータ内で２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、非接着細胞を除去した。その後のＭＳＣの培養には、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ＵＳ）を含むＭＳＣ基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ＵＳ）を使用した。培地は、３～４日ごとに完全に交換した。接着細胞がコンフルエントになった際にＭＳＣをトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）で処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、カウントし、２×１０６細胞／フラスコの密度で新しい１７５ｃｍ２フラスコに分配し、標準条件（５％ＣＯ２、３７℃）の下インキュベータ内でインキュベートした。
ＦＲＤＡ患者の骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離。
ＦＲＤＡ対象３名から、インフォームドコンセントを集めた後、サンプルを入手した。左後腸骨稜から６ｍＬの骨髄を局所麻酔で無菌的に吸引した。採取した骨髄をセルフィルタ（１００μｍ）で濾過して、骨片や血塊を除去した。ＭＳＣの抽出には赤血球を溶解する方法を用いた。採取したサンプルを５０ｍＬの円錐形遠心管に移し、赤血球溶解バッファー、ＡＣＫ溶液（ＮＨ４Ｃｌ １５０ｍＭ、ＫＨＣ０３ １０ｍＭおよびＮａ２ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ）を１：５（ｖ／ｖ）で加え、管を手動で１分間撹拌し、次に４８０ｇで５分間遠心分離をした。その後、沈殿した骨髄をそれぞれの培養液で１：１の割合で希釈した。ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（１．０７７ｇ／ｍＬ）を用いて勾配密度遠心分離により骨髄由来の単核細胞部分（ＭＮＣ）を分離した。ＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ ２．５ｍＬを滅菌済み１５ｍＬ遠心管に採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ層と混合せずに希釈骨髄５ｍＬで層別化する（比率１：２）。その後、サンプルを１８００ｒｐｍで２０分間、室温（ＲＴ）で遠心分離した。血漿プレップリンパ間相、バフィーコート層に集積したＭＮＣを吸引により注意深く単離し、新しい１５ｍＬ遠心管に移し、培養液に懸濁させた。再懸濁したペレットの全量を１７５ｃｍ２の換気フラスコに移し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地において、５％Ｃ０２、３７℃の標準条件の下インキュベータ内で２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、非接着細胞を除去した。その後のＭＳＣの培養には、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ＵＳ）を含むＭＳＣ基本培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ＵＳ）を使用した。培地は、３～４日ごとに完全に交換した。接着細胞がコンフルエントになった際にＭＳＣをトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）で処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、カウントし、２×１０６細胞／フラスコの密度で新しい１７５ｃｍ２フラスコに分配し、標準条件（５％ＣＯ２、３７℃）の下インキュベータ内でインキュベートした。
【0049】
画像解析
各テスト条件について実験レプリカを３つにするため、健常なドナー（ｃｔｒ）または患者（ｆｔｘ）のいずれかに由来する骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を２４ウェルプレートに７５０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。播種から２４時間後、細胞のコンフルエンスが７０％の時点で、ＢＭ－ＭＳＣ ｃｔｒの３ウェルとＢＭ－ＭＳＣ ｆｔｘの３ウェルを、５および１０μＭのＡｕ８－ｐＸで処理した。画像は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｖｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて取得した。実験は２４時間続け、４時間ごとに各ウェルについて４枚の写真を１０倍の対物レンズで撮影した。結果は、ＩｎｃｕＢｙｔｅソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で解析し、試験したすべての異なる条件に最も適応するセルマスクを作成するように装置を設定し、ウェルごとの細胞の面積を時間と相関させた。
各テスト条件について実験レプリカを３つにするため、健常なドナー（ｃｔｒ）または患者（ｆｔｘ）のいずれかに由来する骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を２４ウェルプレートに７５０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。播種から２４時間後、細胞のコンフルエンスが７０％の時点で、ＢＭ－ＭＳＣ ｃｔｒの３ウェルとＢＭ－ＭＳＣ ｆｔｘの３ウェルを、５および１０μＭのＡｕ８－ｐＸで処理した。画像は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｖｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて取得した。実験は２４時間続け、４時間ごとに各ウェルについて４枚の写真を１０倍の対物レンズで撮影した。結果は、ＩｎｃｕＢｙｔｅソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で解析し、試験したすべての異なる条件に最も適応するセルマスクを作成するように装置を設定し、ウェルごとの細胞の面積を時間と相関させた。
【0050】
図１０のグラフＡに示す得られた結果は、ＦＲＤＡ骨髄由来のＭＳＣ（ＭＳＣ ｆｔｘ）が、５または１０μＭのＡｕ８－ｐＸの存在下では、処理しない場合の増殖と比較して顕著に高い増殖を示すことを示す。達成された増殖の程度は、ＭＳＣ ｃｔｒで観察されたものと同等である。
【0051】
ＲＯＳ試験
培養中に生成される可能性のある活性酸素種(ＲＯＳ)を評価するため、画像解析試験と同様に細胞を播種した。解析は、培養液にＡｕ８－ｐＸを加えてから２４時間後に実行した。ＲＯＳ－Ｇｌｏ ＴＭ Ｈ２０２（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを、製造者のプロトコルに従って使用した。非リチウムアッセイを実行し、相対発光単位をプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ ｄｉｓｃｏｖｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
培養中に生成される可能性のある活性酸素種(ＲＯＳ)を評価するため、画像解析試験と同様に細胞を播種した。解析は、培養液にＡｕ８－ｐＸを加えてから２４時間後に実行した。ＲＯＳ－Ｇｌｏ ＴＭ Ｈ２０２（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを、製造者のプロトコルに従って使用した。非リチウムアッセイを実行し、相対発光単位をプレートリーダー（ＧｌｏＭａｘ ｄｉｓｃｏｖｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
【0052】
図１０のグラフＢに示す得られた結果は、５または１０μＭのＡｕ８－ｐＸに曝露したＭＳＣ ｆｔｘについて、ＲＯＳ産生が未処理のＭＳＣ ｆｔｘで観察されるよりも低いことを示す。
【0053】
この結果は、Ａｕ８－ｐＸが、固有の細胞毒性を有することなくＲＯＳレベルを低下させ、結果としてその細胞毒性を制限する能力を有することを示す。
【0054】
実施例５：ＦＲＤＡマウスモデルにおけるＡｕ８－ｐＸの効果の評価
動物モデル
フラタキシンＹＧ８Ｒマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＃０２４１１３）は、承認されたフリードライヒ失調症のマウスモデルである（Anjomani Virmouni et al., 2015 Mol Neurodegener.10:22 ）。特に、フラタキシンＹＧ８ｓＲマウスは、９ヶ月齢で心筋症および運動不全の兆候を示し始め、また、グルコース耐性およびインスリン抵抗性の欠陥ならびに脳、筋肉、ＤＲＧにおける細胞損傷の組織学的徴候も示す。この動物はおおむね正常に見え、自身で摂取することが可能であるが、繁殖は困難である。この動物は、混合遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ６／Ｊで維持した。
動物モデル
フラタキシンＹＧ８Ｒマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＃０２４１１３）は、承認されたフリードライヒ失調症のマウスモデルである（Anjomani Virmouni et al., 2015 Mol Neurodegener.10:22 ）。特に、フラタキシンＹＧ８ｓＲマウスは、９ヶ月齢で心筋症および運動不全の兆候を示し始め、また、グルコース耐性およびインスリン抵抗性の欠陥ならびに脳、筋肉、ＤＲＧにおける細胞損傷の組織学的徴候も示す。この動物はおおむね正常に見え、自身で摂取することが可能であるが、繁殖は困難である。この動物は、混合遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ６／Ｊで維持した。
【0055】
Ａｕ８－ｐＸの調製および注射
各実験群について、１２ヶ月齢のフラタキシンＹＧ８Ｒマウス１０匹を評価した（オス５匹、メス５匹）。すべての動物に、細い針のついた注射器を用いて尾静脈にＡｕ８－ｐＸの静脈内(ＩＶ)注射を行った（クラスタの沈殿を避ける）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの証拠に基づいてＡｕ８－ｐＸの治療量を１０μＭと推定したが、これは体重２０ｇのマウス１匹あたり３００μｇのクラスタに相当する。静脈内注射時のクラスタの生体内凝集と肺の損傷を避けるため、動物には１週間あたり１００μＬの生理食塩水に懸濁したＡｕ８－ｐＸ １００μｇの用量を３週間にわたって与えた。
各実験群について、１２ヶ月齢のフラタキシンＹＧ８Ｒマウス１０匹を評価した（オス５匹、メス５匹）。すべての動物に、細い針のついた注射器を用いて尾静脈にＡｕ８－ｐＸの静脈内(ＩＶ)注射を行った（クラスタの沈殿を避ける）。ｉｎ ｖｉｔｒｏの証拠に基づいてＡｕ８－ｐＸの治療量を１０μＭと推定したが、これは体重２０ｇのマウス１匹あたり３００μｇのクラスタに相当する。静脈内注射時のクラスタの生体内凝集と肺の損傷を避けるため、動物には１週間あたり１００μＬの生理食塩水に懸濁したＡｕ８－ｐＸ １００μｇの用量を３週間にわたって与えた。
【0056】
運動試験
フットプリント：フィンガープリントを得るため、マウスの脚を無毒の水性食用色素に浸した。マウスに、床を白紙で覆った長さ４０ｃｍ、幅９．５ｃｍ（側壁の高さ７ｃｍ）の通路を歩かせた。すべてのマウスに訓練走行をさせ、その後３つの試験を受けさせた。各走行の中央部分の３歩を、後ピッチと前左ピッチの長さ、後ピッチと前右ピッチの長さ、前肢つけ根の幅（右前肢と左前肢の幅）、および後肢つけ根の幅（右後肢と左後肢の幅）について、マウス１匹につき合計９歩で測定した。
フットプリント：フィンガープリントを得るため、マウスの脚を無毒の水性食用色素に浸した。マウスに、床を白紙で覆った長さ４０ｃｍ、幅９．５ｃｍ（側壁の高さ７ｃｍ）の通路を歩かせた。すべてのマウスに訓練走行をさせ、その後３つの試験を受けさせた。各走行の中央部分の３歩を、後ピッチと前左ピッチの長さ、後ピッチと前右ピッチの長さ、前肢つけ根の幅（右前肢と左前肢の幅）、および後肢つけ根の幅（右後肢と左後肢の幅）について、マウス１匹につき合計９歩で測定した。
【0057】
トレッドミル：トレッドミルを用いて、運動に対する耐性を試験した。マウスを透明なトレッドミルベルト（ＣｌｅｖｅｒｙＳｙｓ Ｉｎｃ）に乗せ、傾斜を１０％に一定にし、回転速度を徐々に上昇させた。以下のプログラムを使用した：速度１８ｃｍ／秒、０～１０分；速度２８ｃｍ／秒、１０～２０分、速度３８ｃｍ／秒、２０～２５分、速度４２ｃｍ／秒、２５～３０分。マウスは登録前に１週間のセッションを３回訓練した。データ収集は速度３８ｃｍ／秒で開始する。各時点で累積エラー数を記録し；試験終了前に明らかに肉体的疲労が見られる場合、動物を装置から取り出し、総移動距離に基づいて任意の値を割り当てる。試験は１週間間隔で繰り返した。
【0058】
心エコー検査
経胸壁心エコーを、２２－５５ＭＨｚのトランスデューサ（ＭｉｃｒｏＳｃａｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ，ＭＳ５００Ｄ）を備えた動物用の小型高解像度イメージングシステム（ＶｅＶｏ２１００，ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ，カナダ、トロント）を用いて実行した。イソ尿素（２％）の吸入により麻酔し、マスク換気（イソ尿素１％）で維持したマウスを、生理的条件を最適化し血行動態の変動を抑えるために、厳密な体温調節（３７±１℃）をして左側低位臥位姿勢で置いた。鮮明な画像を得るために、化粧クリームを塗布することにより胸部の毛を除去した。心エコーパラメータは、傍胸骨短軸断面（Ｍモード）において乳頭筋で測定した。ＬＶ短縮率を以下のように算出した：ＦＳ＝（ＬＶＥＤＤ－ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ）×１００、ＬＶＦＳはＬＶ短縮率を；ＬＶＥＤＤはＬＶ拡張末期径を；ＬＶＥＳＤはＬＶ収縮末期径を示す。ＬＶ駆出率は心エコーシステムにより自動的に算出された。すべての測定値は、１回の実験につき連続した５心周期の平均であり、心機能は心拍数が４５０～５００ｂｐｍのときに評価した。
経胸壁心エコーを、２２－５５ＭＨｚのトランスデューサ（ＭｉｃｒｏＳｃａｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ，ＭＳ５００Ｄ）を備えた動物用の小型高解像度イメージングシステム（ＶｅＶｏ２１００，ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ，カナダ、トロント）を用いて実行した。イソ尿素（２％）の吸入により麻酔し、マスク換気（イソ尿素１％）で維持したマウスを、生理的条件を最適化し血行動態の変動を抑えるために、厳密な体温調節（３７±１℃）をして左側低位臥位姿勢で置いた。鮮明な画像を得るために、化粧クリームを塗布することにより胸部の毛を除去した。心エコーパラメータは、傍胸骨短軸断面（Ｍモード）において乳頭筋で測定した。ＬＶ短縮率を以下のように算出した：ＦＳ＝（ＬＶＥＤＤ－ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ）×１００、ＬＶＦＳはＬＶ短縮率を；ＬＶＥＤＤはＬＶ拡張末期径を；ＬＶＥＳＤはＬＶ収縮末期径を示す。ＬＶ駆出率は心エコーシステムにより自動的に算出された。すべての測定値は、１回の実験につき連続した５心周期の平均であり、心機能は心拍数が４５０～５００ｂｐｍのときに評価した。
【0059】
リアルタイムｑＰＣＲ
ｍＲＮＡの発現を定量的に解析するために、注射後および犠牲時の対照動物（未注射）から単離および切片化した組織片を直ちにＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｒｏｃｈｅ）に浸し、製造者が示す通りに抽出を行った。ＲＮＡの質、プライマー効率、および正しい生成物のサイズをＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によって検証した。リアルタイムｑＰＣＲは、ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で行った。各反応に２μＬのｃＤＮＡを使用した。すべてのサンプルは３連でテストした。プライマー二量体の特異性と不在は、変性曲線によって制御し；調べた各ｍＲＮＡについては、変性ピークは１つだけ観察された。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア３．５．３を使用して計算した正規化に使用した。
ｍＲＮＡの発現を定量的に解析するために、注射後および犠牲時の対照動物（未注射）から単離および切片化した組織片を直ちにＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｒｏｃｈｅ）に浸し、製造者が示す通りに抽出を行った。ＲＮＡの質、プライマー効率、および正しい生成物のサイズをＲＴ－ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によって検証した。リアルタイムｑＰＣＲは、ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ＭａｓｔｅｒＰＬＵＳ ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で行った。各反応に２μＬのｃＤＮＡを使用した。すべてのサンプルは３連でテストした。プライマー二量体の特異性と不在は、変性曲線によって制御し；調べた各ｍＲＮＡについては、変性ピークは１つだけ観察された。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア３．５．３を使用して計算した正規化に使用した。
【0060】
細胞代謝の生化学的解析
組織を切片化し、液体窒素に浸漬して直ちに凍結した後、粉砕して－７０℃で保存した。ミトコンドリア画分を単離するために、組織粉末を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍＬのミトコンドリア溶解バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で溶解し、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦおよび２５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦで補った。サンプルを６５０ｇで３分間、＋４℃で遠心分離することにより清澄化し；上清を集め、１３０００ｇで５分間、＋４℃で遠心分離した。ペレット－ミトコンドリアを含む－を溶解バッファーで１回洗浄し、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ ショ糖、１５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰ０４、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡからなる再懸濁バッファー０．２５ｍＬに再懸濁した。５０μＬのアリコートを超音波処理し、タンパク質含有量の測定またはウェスタンブロットに使用した。抽出物中のミトコンドリアタンパク質の存在を確認するため、各音波サンプル１０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、抗ポリン抗体（Ａｂｃａｍ，英国，ケンブリッジ）で探索した。
組織を切片化し、液体窒素に浸漬して直ちに凍結した後、粉砕して－７０℃で保存した。ミトコンドリア画分を単離するために、組織粉末を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍＬのミトコンドリア溶解バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で溶解し、プロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦおよび２５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦで補った。サンプルを６５０ｇで３分間、＋４℃で遠心分離することにより清澄化し；上清を集め、１３０００ｇで５分間、＋４℃で遠心分離した。ペレット－ミトコンドリアを含む－を溶解バッファーで１回洗浄し、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ ショ糖、１５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰ０４、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡからなる再懸濁バッファー０．２５ｍＬに再懸濁した。５０μＬのアリコートを超音波処理し、タンパク質含有量の測定またはウェスタンブロットに使用した。抽出物中のミトコンドリアタンパク質の存在を確認するため、各音波サンプル１０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、抗ポリン抗体（Ａｂｃａｍ，英国，ケンブリッジ）で探索した。
【0061】
全細胞またはミトコンドリア抽出物中のＲＯＳ量を、ＲＯＳ ５－（Ｅ－６）－クロロメチル－２’，７’－ジクロロジヒドロ－フルオレセインジアセテート－アセトキシメチルエステル（ＤＣＦＤＡ－ＡＭ）感知蛍光プローブでサンプルを標識して測定した。結果はｎｍｏｌ／細胞タンパク質またはミトコンドリアタンパク質ｍｇとして表した。
【0062】
ミトコンドリア呼吸活性の指標とされる複合体Ｉから複合体ＩＩＩへの電子の流れを測定するため、５０μｇの非音波ミトコンドリアサンプルを０．２ｍＬのバッファーＡ（５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰ０４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、５ｗ／ｖ％ ＢＳＡ）に再懸濁し、石英分光光度計キュベットに移した。次に０．１ｍＬのバッファーＢ（２５ｗ／ｖ％ サポニン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰ０４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、５ｗ／ｖ％ ＢＳＡ、０．１２ｍｍｏｌ／Ｌ ｃ－酸化型シトクロム、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＮ３）を室温で５分間加えた。０．１５ｍｍｏｌ／ＬのＮＡＤＨで反応を開始させ、Ｐａｃｋａｒｄ ＥＬ３４０ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏоｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）で５５０ｎｍの吸光度を読みながら５分間経過を観察した。結果は、還元型シトクロムｃミトコンドリアタンパク質のナノモル／分／ｍｇで表した。ミトコンドリア抽出物中のＡＴＰ量は、生物発光ＡＴＰアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて測定した。結果は、ｎｍｏｌ／ミトコンドリアタンパク質ｍｇで表した。
【0063】
酸化的リン酸化によって生成されたＡＴＰの量は、２０μｇのミトコンドリアタンパク質において、ＡＴＰ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＦＬ－ＡＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を使用して測定した。データは、あらかじめ設定した検量線を用いて、ｎｍｏｌ／ミトコンドリアタンパク質ｍｇに換算した。酸化的損傷の量は、２つの独立したアッセイによって全組織抽出物およびミトコンドリア抽出物において測定した：１）ＥＬＩＳＡによる過酸化脂質（ＯＨ－ノネナール）の定量測定（Ａｂｃａｍ，英国，ケンブリッジ）、結果はｎｍｏｌ／細胞タンパク質ｍｇまたは／ミトコンドリアタンパク質ｍｇで表す；２）ＥＬＩＳＡによる８－オキソ－デオキシ－グアニン（ＤＮＡ損傷）の定量測定（Ａｂｃａｍ，英国，ケンブリッジ）、結果はｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇで表す。
【0064】
ＳＯＤ１およびＳＯＤ２の活性を測定するため、ミトコンドリアを以前報告されたように（Riganti et al., 2013）単離した。細胞質ＳＯＤ１およびミトコンドリアＳＯＤ２の活性を、各抽出物１０μｇを用い、５０μｍｏｌ／Ｌ キサンチン、５Ｕ／ｍＬ キサンチンオキシダーゼ、１μｇ／ｍＬ 酸化型シトクロムＣと共にインキュベートして測定した。
【0065】
ＳＯＤの存在によって阻害されるシトクロムｃの還元速度を、Ｐａｃｋａｒｄ ＥＬ３４０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＭＴ）を用いて５５０ｎｍの吸光度を読むことによって、５分間モニタした。結果は、還元型シトクロムＣμｍｏｌ／分／細胞質またはミトコンドリアタンパク質ｍｇとして表した。
【0066】
総グルタチオン、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の含有量を、Ｐａｃｋａｒｄ ＥＬ３４０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、Riganti et al., 2006に詳細に記載されたように比色法で測定した。結果は、グルタチオンｐｍｏｌ／細胞タンパク質ｍｇとして表した。各サンプルについて、ＧＳＨは、総グルタチオンからＧＳＳＧを差し引くことによって得た。ＧＳＴ活性は、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）テストキット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｃｏ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。結果は、ＣＤＮＢ－ＧＳＨ付加物μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇで表した。
【0067】
脂質過酸化：全組織ホモジネートタンパク質１００μｇと抽出したミトコンドリアタンパク質５０μｇ（Riganti et al., 2013）を脂質過酸化キット（４－ＨＮＥ）で試験して、タンパク質の酸化指標である４－ヒドロキシノネナール（４－ＨＮＥ）量を調べた。結果は、ｎｍｏｌ／総タンパク質またはミトコンドリアタンパク質ｍｇで表した。
【0068】
ＤＮＡ損傷：全組織ホモジネートから抽出した５０ｎｇのＤＮＡと、単離したミトコンドリア（Riganti et al., 2013）から抽出した１０ｎｇのミトコンドリアＤＮＡを８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ，英国，ケンブリッジ）で評価して、ＤＮＡの酸化的損傷を検出した。結果はそれぞれ、ｎｍｏｌ／ミトコンドリアＤＮＡまたは全ＤＮＡμｇで表した。
【0069】
結果：
Ａｕ８－ｐＸを用いた処置は、高齢のＹＧ８Ｒマウスの神経運動機能と心機能を改善する。
Ａｕ８－ｐＸを用いた処置は、高齢のＹＧ８Ｒマウスの神経運動機能と心機能を改善する。
【0070】
未処置の高齢ＹＧ８Ｒマウス（ｎ＝１０；メス５匹、オス５匹）と処置したマウス（ｎ＝１０；メス５匹、オス５匹）において、フットプリントテストを用いた運動協調性とトレッドミル成績を用いた疲労時間および耐久時間の点から運動能力を総合的に評価した。Ａｕ８－ｐＸで処置したＹＧ８Ｒマウス（ｎ＝１０）は、協調および運動不全で臨床的に症状が出た時（１２ヶ月齢）に注射し、２ヶ月齢（無症状）から注射の６ヶ月後に犠牲になるまで（１８ヶ月齢）テストを行った。ＹＧ８Ｒマウスは、以前に記載されたように（Al-MaHDawi S, et al. Genomics.2006; 88: 580-590; Virmouni Anjoli S, et al. DIS Model Mech.2015; 8: 225-235）、自発運動活性の漸進的な低下と協調不全を示した。未処置マウスと比較して、処置したＹＧ８Ｒマウスでは、運動協調性に関するフットプリント試験において明らかな改善が見られた（図５Ａ、Ｂ）。特に、時点１、２および３で測定された耐久時間は、Ａｕ８－ｐＸで処置した高齢ＹＧ８Ｒマウスにおいて、未処置のＹＧ８Ｒ動物の耐久時間と比較して～４０％増加し、改善された（図５Ｃ）。図６に結果を示す、１８ヶ月齢のＹＧ８Ｒマウスにおける心エコー解析により、Ａｕ８－ｐＸ処置（ｎ＝１０）後の左心室駆出率（ＬＶ）の有意な改善を伴うＬＶ収縮末期／拡張末期容積の減少（ｎ＝１０）が明らかになった。（収縮末期ＬＶ容積：ｐ＝０．０１２３；拡張末期ＬＶ容積：ｐ＝０．０３６２；駆出率：ｐ＝０．０１３０）。さらに、スケールストローク（ＳＶ）の体積（ｐ＝０．００４９）、拡張期の左心室内径（ＬＶＩＤ；ｐ＝０．０１４８）、収縮期の直径（直径；ｓ）および拡張期の直径（直径；ｄ）の長さ（それぞれ、ｐ＝０．０３０９およびｐ＝０．０３９４）に、有意な減少が観察された。
【0071】
Ａｕ８－ｐＸはＹＧ８Ｒマウスのレドックス経路に影響を与える。
【0072】
酸化タンパク質の蓄積とミトコンドリア機能障害は、過去にＹＧ８Ｒマウスで記録されている（Shan Y., et al. 2013 10.1089/ars.2012.4537; Celine J. Rocca, et al. Ski Transl Med. 2017 9:413）。Ａｕ８－ｐＸで処置したＹＧ８Ｒの脳、脊髄、ＤＲＧ（図７）、膵臓および筋肉組織において、ペルオキシレドキシン、グルタレドキシン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼおよびＮｒｆ２の発現に有意な変化が見られた。全組織抽出物および単離ミトコンドリアの両方で、未処置と処理済みのＹＧ８Ｒマウスの間でＲＯＳレベルの差は見られなかった（データなし）。Ａｕ８－ｐＸを注射したマウスの神経筋組織サンプル（皮質、小脳、基底核）および骨格（ＴＡ、ＶＭおよびヒラメ筋）では、細胞質とミトコンドリアの過酸化脂質（ＯＨ－ノネナール、図８Ｄ）およびＲＯＳ依存性ＤＮＡ損傷（デオキシグアニン骨格、図８Ｅ）が減少した一方で、ＧＳＴ活性の増加を伴った、ＳＯＤ２およびＧＳＨレベルの増加とＧＳＳＧレベルの減少が観察された（図９）。これらのすべての組織および心臓において、ミトコンドリア電子伝達系（図８Ｃ）およびミトコンドリアＡＴＰレベル（図８Ａ）が、未処置のＹＧ８Ｒと比較して、Ａｕ８－ｐＸ処置で有意に増加した。総合すると、これらのデータは、Ａｕ８－ｐＸの注射はＹＧ８Ｒマウスの酸化的損傷を減らし、ミトコンドリア機能を改善することを示し、これは、神経運動および心臓の機能改善と一致した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】