特表2023-502010骨からコラーゲンペプチドを生成するための方法、及び生成されたコラーゲンペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-20
(54)【発明の名称】骨からコラーゲンペプチドを生成するための方法、及び生成されたコラーゲンペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20230113BHJP
A23J 1/10 20060101ALI20230113BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20230113BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78
A23J1/10
C07K1/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022526475
(86)(22)【出願日】2020-09-28
(85)【翻訳文提出日】2022-07-08
(86)【国際出願番号】 EP2020077092
(87)【国際公開番号】W WO2021089243
(87)【国際公開日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】102019130196.3
(32)【優先日】2019-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502084056
【氏名又は名称】ゲリタ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100182730
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 浩明
(72)【発明者】
【氏名】ラルフ ペルシュケ
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA01
4H045EA60
4H045FA70
4H045GA01
(57)【要約】
本発明は、以下のステップ：ａ）脊椎動物の骨を提供するステップと；ｂ）破砕の間、７０℃未満の温度で、骨を１０００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは３００μｍ未満の粒子径に機械的に破砕するステップと；ｃ）水性懸濁液中の破砕された骨を１～３０分、好ましくは２～１０分、より好ましくは４～８分の期間、１００℃より高い、好ましくは１２０℃より高い、より好ましくは１３０℃より高い温度まで加熱するステップと；ｄ）コラーゲンペプチドの水溶液を得るために、懸濁液に１種又は複数のプロテアーゼを添加するステップと；ｅ）破砕された骨からコラーゲンペプチドの水溶液を分別するステップと、を含む、骨からコラーゲンペプチドを生成するための方法であって、該方法が、酸による骨のマセレーション又は塩基による骨のライミングを含まず、ステップａ）で提供された骨が、マセレーション又はライミングを受けていない、方法に関する。本発明はさらに、この方法により生成されたコラーゲンペプチドに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のステップ：ａ）脊椎動物の骨を提供するステップと；
ｂ）破砕の間、７０℃未満の温度で、前記骨を１０００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは３００μｍ未満の粒子径に機械的に破砕するステップと；
ｃ）水性懸濁液中の前記破砕された骨を１～３０分、好ましくは２～１０分、より好ましくは４～８分の期間、１００℃より高い、好ましくは１２０℃より高い、より好ましくは１３０℃より高い温度まで加熱するステップと；
ｄ）コラーゲンペプチドの水溶液を得るために、前記懸濁液に１種又は複数のプロテアーゼを添加するステップと；
ｅ）前記破砕された骨からコラーゲンペプチドの前記水溶液を分別するステップと、
を含む、骨からコラーゲンペプチドを生成するための方法であって、
前記方法が、酸による前記骨のマセレーション又は塩基による前記骨のライミングを含まず、ステップａ）で提供された前記骨が、マセレーション又はライミングを受けていない、方法。
【請求項2】
前記骨が、哺乳動物、詳細にはウシに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記骨が、破砕される前、詳細には脱脂される前に浄化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記骨の前記浄化が、１種又は複数の酵素での、好ましくはプロテアーゼ及び／又はリパーゼでの処理を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
破砕する前に、前記骨が、４重量％未満、好ましくは１重量％未満、より好ましくは０．５重量％未満の脂肪量を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
【請求項6】
破砕する前に、前記骨が、総タンパク質量に対して少なくとも５５％、好ましくは７０～９０％のコラーゲン量を有し、前記コラーゲン量が、７．３の係数を掛けたヒドロキシプロリン量から決定され、前記総タンパク質量が、６．２５の係数を掛けたケルダール窒素量から決定される、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記機械的破砕が、前記骨の乾式粉砕又は湿式粉砕を含み、好ましくは水性懸濁液中での湿式粉砕を含む、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
水性懸濁液中での前記加熱が、０．０５～０．５ｋｇ／ｌ、好ましくは０．１～０．３ｋｇ／ｌ、より好ましくは０．１５～０．２ｋｇ／ｌの、重量による破砕された骨の量で実行される、請求項１～７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
５．６を超える等電点を有するコラーゲンペプチドを得るために、加熱する前に、前記水性懸濁液のｐＨ値が、５～７、好ましくは６～７の範囲に調整される、又は５．６未満の等電点を有するコラーゲンペプチドを得るために、加熱する前に、前記水性懸濁液のｐＨ値が、７～９、好ましくは７．９～８．６の範囲に調整される、請求項１～８の何れか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記水性懸濁液が、前記１種又は複数のプロテアーゼの添加前に、４０～６０℃の範囲内の温度に冷却される、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記水性懸濁液を加熱した後に添加される前記１種又は複数のプロテアーゼが、微生物エンドプロテアーゼ、好ましくは特定の枯草菌のセリンプロテアーゼから選択される、請求項１～１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記１種又は複数のプロテアーゼが、前記破砕された骨の乾燥質量に対して０．０１～０．５重量％、好ましくは０．０２～０．２重量％、より好ましくは０．０３～０．１重量％の量で添加される、請求項１～１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記１種又は複数のプロテアーゼの前記添加の後、前記酵素反応が、好ましくは０．５～４時間、より好ましくは１～３時間の期間、実行される、請求項１～１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項14】
コラーゲンペプチドの前記水溶液が、分別されたら、前記破砕された骨が、さらなる時間にステップｃ）～ｅ）を受ける、請求項１～１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項15】
コラーゲンペプチドの前記水溶液を分別することが、濾過、詳細には膜濾過を含む、請求項１～１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項16】
詳細には噴霧乾燥により、コラーゲンペプチド粉末を得るためにコラーゲンペプチドの前記水溶液を乾燥することをさらに含む、請求項１～１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項17】
請求項１～１６の何れか一項に記載の方法により生成されるコラーゲンペプチド。
【請求項18】
２５０００Ｄａ未満、好ましくは１００００Ｄａ未満、より好ましくは５０００Ｄａ未満の重量平均分子量を有する、請求項１７に記載のコラーゲンペプチド。
【請求項19】
５００～５０００Ｄａ、詳細には２０００～４０００Ｄａの重量平均分子量を有する、請求項１８に記載のコラーゲンペプチド。
【請求項20】
５．６を超える、詳細には６．０を超える等電点を有する、請求項１７～１９の何れか一項に記載のコラーゲンペプチド。
【請求項21】
５．６未満、詳細には５．２～５．６の等電点を有する、請求項１７又は１８に記載のコラーゲンペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨からコラーゲンペプチドを生成するための方法に関する。
【0002】
本発明はさらに、この方法により生成されるコラーゲンペプチドに関する。
【背景技術】
【0003】
コラーゲンペプチドは、動物の構造タンパク質であるコラーゲンの加水分解により、詳細には酵素的加水分解により生成される。したがって別の名称は、コラーゲン加水分解産物又は加水分解コラーゲンである。動物の骨が、出発原料である場合、これは詳細にはＩ型コラーゲンである。
【0004】
コラーゲンペプチドは、一方での食品サプリメント又はいわゆる機能性食品おける生理学的作用のためでなく、食品加工の観点からも、例えば乳化剤、安定化剤、結合剤ほかとして、詳細には食品業界において、様々な方法で用いられる。コラーゲンペプチドの特徴的性質は、冷水であっても可溶であること、及び極わずかのゲル形成能である。このことが、コラーゲンペプチドを、少ない程度しか加水分解されない変性コラーゲンであるゼラチンと識別させる。コラーゲンペプチドは、２５０００Ｄａ未満、実際には通常１００００Ｄａ未満の分子量を有し、ゼラチンの分子量が、有意により高い。
【0005】
コラーゲンペプチドは、正常には中間体生成物としてのゼラチンと共に生成される（例えば、Ｒ Ｓｃｈｒｉｅｂｅｒ ａｎｄ Ｈ Ｇａｒｅｉｓ：Ｇｅｌａｔｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００７，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２．２．１１参照）。先行技術において、骨からのゼラチンの生成は、一部では、その後に高温で（典型的には５０～１００℃の間）で複数の段階でゼラチンを抽出することができるように、本質的ステップとして、強酸性媒体中での骨の脱ミネラル化（マセレーション）と、続く強アルカリ媒体での処理（ライミング）を含む多段階手順で実施される（Ｇｅｌａｔｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２．２．５参照）。
【0006】
マセレーションの間、骨組織からミネラル成分（炭酸カルシウム及びリン酸カルシウム）を溶出するために、大まかに粉砕された骨が、希塩酸での向流工程でおよそ１週間の期間、処理される（Ｇｅｌａｔｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２．２．１．１参照）。この工程により得られた生成物は、オセインと呼ばれる。化学薬品の他にマセレーションに関連するコスト要因が、塩酸とカルシウムミネラルとの発熱反応により要求される冷却である。さらなる欠点は、廃水中の高い塩化物負荷である。
【0007】
次のオセインのライミングは、ゼラチンの効果的抽出を可能にするために必要である。典型的にはライミング工程は、数か月の期間の水酸化カルシウム懸濁液（１２より高いｐＨ値）での処理を含む（Ｇｅｌａｔｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２．２．４．１参照）。処理時間は、より強いアルカリを用いることにより（例えば、水酸化ナトリウムが用いられる場合には２、３日に）短縮され得るが、これは、収率の減損をもたらす。
【0008】
先に記載された方法は、５．６未満、典型的には４．８～５．５の範囲内の等電点（ＩＥＰ）を特徴とするＢタイプ骨ゼラチンを与える。このＩＥＰは、ゼラチン（又はそれから生成されたコラーゲンペプチド）のポリペプチド鎖が中性の全体的電荷を有する場合のｐＨ値に対応する。Ｂタイプゼラチンの相対的に低いＩＥＰは、アミノ酸のアスパラギン及びグルタミンをライミングする間に、ほぼ全体がそれぞれアスパラギン酸及びグルタミン酸に変換するという事実からもたらされる。
【0009】
同じゲル強度では、Ｂタイプゼラチンは、Ａタイプゼラチンより有意に高い粘度を有し、それゆえほとんどの適用分野に好ましい。この理由から、オセインが、ライミングなしに酸性媒体で抽出されるＡタイプ骨ゼラチンの生成は、二次的役割しか担わない。Ａタイプゼラチンは、６を超えるＩＥＰを有し、Ａタイプ骨ゼラチンの場合には、典型的には６～８の間の範囲内（豚皮ゼラチンの場合には８～９の範囲内）のＩＥＰを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、Ｂタイプ骨ゼラチンを中間体生成物として用いる先に記載された方法の欠点が、全体的又は部分的に回避され得る、コラーゲンペプチドを生成するための別の方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
この目的は、以下のステップ：
ａ）脊椎動物の骨を提供するステップと；
ｂ）破砕の間、７０℃未満の温度で、骨を１０００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは３００μｍ未満の粒子径に機械的に破砕するステップと；
ｃ）水性懸濁液中の破砕された骨を１～３０分、好ましくは２～１０分、より好ましくは４～８分の期間、１００℃より高い、好ましくは１２０℃より高い、より好ましくは１３０℃より高い温度まで加熱するステップと；
ｄ）コラーゲンペプチドの水溶液を得るために、懸濁液に１種又は複数のプロテアーゼを添加するステップと；
ｅ）破砕された骨からコラーゲンペプチドの水溶液を分別するステップと、
を含む、冒頭で述べられたタイプの方法を有する本発明により実現され、
該方法は、酸による骨のマセレーション又は塩基による骨のライミングを含まず、ステップａ）で提供された骨は、マセレーション又はライミングを受けていない。
ａ）脊椎動物の骨を提供するステップと；
ｂ）破砕の間、７０℃未満の温度で、骨を１０００μｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは３００μｍ未満の粒子径に機械的に破砕するステップと；
ｃ）水性懸濁液中の破砕された骨を１～３０分、好ましくは２～１０分、より好ましくは４～８分の期間、１００℃より高い、好ましくは１２０℃より高い、より好ましくは１３０℃より高い温度まで加熱するステップと；
ｄ）コラーゲンペプチドの水溶液を得るために、懸濁液に１種又は複数のプロテアーゼを添加するステップと；
ｅ）破砕された骨からコラーゲンペプチドの水溶液を分別するステップと、
を含む、冒頭で述べられたタイプの方法を有する本発明により実現され、
該方法は、酸による骨のマセレーション又は塩基による骨のライミングを含まず、ステップａ）で提供された骨は、マセレーション又はライミングを受けていない。
【0012】
本発明の状況において、驚くべきことに、コラーゲンペプチドが骨ゼラチンを生成することを手段とする間接的方法を用いずにプロテアーゼでの骨材料の直接的酵素処理により生成され得ることが見出された。したがって本発明による方法は明確に、骨のマセレーション及び／又はライミングを行わずに済み、その結果、コラーゲンペプチドが得られるまでの該方法の全期間が劇的に低減され、極端な例ではマセレーション及びライミングは数か月かかり、少なくとも数日かかるが、本発明による方法は、２、３時間内で実行され得る。エネルギー必要量及び廃水汚染もまた、先行技術よりも本発明による方法では有意に少ない。
【0013】
本明細書の文脈において、用語「マセレーション」は、１未満のｐＨ値の酸での処理を意味すると理解され、用語「ライミング」は、１２を超えるｐＨ値の塩基での処理を意味すると理解される。
【0014】
本発明による方法のための出発原料としては、原則として任意の脊椎動物の骨、したがって鳥又は魚の骨などが用いられてもよい。しかし好ましくは、該方法は、哺乳動物の骨、詳細にはウシの骨で実行される。
【0015】
骨が、破砕される前、詳細には脱脂される前に浄化されれば、好適である。出発原料を浄化することが、酵素的加水分解の効率的実施に好都合であり、それにより高品質のコラーゲンペプチドを生成することができる。
【0016】
好ましくは骨の浄化は、１種又は複数の酵素での、好ましくはプロテアーゼ及び／又はリパーゼでの処理を含む。リパーゼは、脱脂に役立ち、非コラーゲン性タンパク質は、プロテアーゼを利用して分解及び除去され得る。骨が適当に破砕される前に、プロテアーゼが、コラーゲンを無視できる程度にまで加水分解する。
【0017】
破砕する前に、骨は、好適には４重量％未満、好ましくは１重量％未満、より好ましくは０．５重量％未満の脂肪量を有する。
【0018】
非コラーゲン性タンパク質の除去に関しては、破砕する前に骨が総タンパク質量に対して少なくとも５５％、好ましくは７０～９０％のコラーゲン量を有すれば、有利である。この場合、コラーゲン量は、７．３の係数を掛けたヒドロキシプロリン量から決定され、総タンパク質量は、６．２５の係数を掛けたケルダール窒素量から決定される。前記係数は、コラーゲン中のヒドロキシプロリン及び窒素の割合を考慮しており、タンパク質全体での対応する割合と異なる。
【0019】
１０００μｍ未満の粒子径を与えるための好ましくは浄化された骨の機械的破砕は、本発明による方法の本質的特色である。小さな粒子径が、マセレーション又はライミングなどの先行技術から知られる前処理を必要とせずに骨材料中のコラーゲンの直接の酵素的加水分解を可能にする。機械的破砕は、骨の乾式粉砕又は湿式粉砕を含んでいてもよく、水性懸濁液中での湿式粉砕が、好ましい。破砕の間、温度は、材料の局所的過熱を回避するために７０℃未満で保持される。
【0020】
酵素的加水分解のための調製の目的で、破砕された骨は、水性懸濁液中で１００℃より高い温度に加熱され、長くとも３０分の期間が、この予備的熱処理に充分である。この間、コラーゲンが変性されて、酵素的加水分解に利用可能になる。この場合、水性懸濁液中の重量による破砕された骨の量は、好ましくは０．０５～０．５ｋｇ／ｌ、好ましくは０．１～０．３ｋｇ／ｌ、より好ましくは０．１５～０．２ｋｇ／ｌである。
【0021】
場合により、破砕された骨の予備的熱処理は、キャビテーションの手段による追加的エネルギー投入により、例えば超音波又は高圧ホモジナーザにより、さらに加速及び／又は増強されてもよい。別の可能性は、懸濁液にＡＣ電場を印加することである。
【0022】
本発明による方法のさらなる利点は、生成されたコラーゲンペプチドの等電点が水性懸濁液中の破砕された骨の加熱の間に適当なｐＨ値に調整することによる簡単な手法で影響を及ぼされ得るという事実からなる。適用分野に応じて、高い又は低いＩＥＰを有するコラーゲンペプチドが、好ましくなり得、性質の差はこの場合、Ａタイプ及びＢタイプゼラチンの性質ほど顕著でない。
【0023】
５．６を超える高いＩＥＰを有するコラーゲンペプチドを得るためには、加熱する前に、水性懸濁液のｐＨ値が、５～７、好ましくは６～７の範囲に調整される。典型的には、ｐＨ値の調整が行われなくとも、高いＩＥＰが生成される。
【0024】
５．６未満の低いＩＥＰを有するコラーゲンペプチドを得るためには、加熱する前に、水性懸濁液のｐＨ値が、７～９、好ましくは７．９～８．６の範囲に調整される。
【0025】
予備的熱処理の後、水性懸濁液は、１種又は複数のプロテアーゼの添加前に、４０～６０℃の範囲内の温度に冷却される。コラーゲンの酵素的加水分解に典型的に用いられるプロテアーゼの最適活性値は、この温度範囲に存在する。
【0026】
好適には、水性懸濁液を加熱した後に添加される１種又は複数のプロテアーゼは、微生物エンドプロテアーゼ、好ましくは特定の枯草菌のセリンプロテアーゼから選択される。コラーゲンの加水分解のためのそのような酵素の使用は、先行技術から知られている。頻繁に用いられるプロテアーゼは、例えばサブチリシンである。
【0027】
典型的には、１種又は複数のプロテアーゼは、破砕された骨の乾燥質量に対して０．０１～０．５重量％、好ましくは０．０２～０．２重量％、より好ましくは０．０３～０．１重量％の量で添加される。
【0028】
１種又は複数のプロテアーゼの添加の後、酵素反応が、好ましくは０．５～４時間、より好ましくは１～３時間の期間、実行される。
【0029】
本発明の好ましい態様において、コラーゲンペプチドの水溶液が、分別されたら、破砕された骨は、さらなる時間にステップｃ）～ｅ）を受ける。粉砕された骨のこの二重の加熱及びプロテアーゼでの処理は、コラーゲンペプチドの収率を増加させ得る。
【0030】
好ましくは、破砕された骨からコラーゲンペプチドの水溶液を分別することは、濾過、詳細には膜濾過を含む。これは、破砕された骨及び他の固体の最小粒子さえも除去することができる。
【0031】
濾過の後、コラーゲンペプチドの水溶液は、好ましくはイオン交換手順、詳細には塩除去を受けてもよい。
【0032】
好ましい態様によれば、本発明による方法は、詳細には噴霧乾燥により、コラーゲンペプチド粉末を得るためにコラーゲンペプチドの水溶液を乾燥することをさらに含む。水溶液は、予めエバポレータを活用して濃縮されてもよい。
【0033】
本発明はまた、本発明による方法により生成されるコラーゲンペプチドに関する。
【0034】
本発明によるコラーゲンペプチドは、典型的には２５０００Ｄａ未満、好ましくは１００００Ｄａ未満、より好ましくは５０００Ｄａ未満の重量平均分子量を有する。５００～５０００Ｄａ、詳細には２０００～４０００Ｄａの重量平均分子量が、特に好適である。
【0035】
本発明の好ましい態様において、コラーゲンペプチドは、５．６を超える、詳細には６．０を超える高い等電点を有する。
【0036】
本発明のさらなる態様によれば、コラーゲンペプチドは、５．６未満、詳細には５．２～５．６の低い等電点を有する。
【0037】
本発明のこれら及びさらなる利点は、以下に記載される実施例から明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【実施例】
【0039】
実施例１：実験室規模での骨からのコラーゲンペプチドの生成
ウシの骨が、高温水により、そしてプロテアーゼ支援によるデフレッシング（ｄｅｆｌｅｓｈｉｎｇ）及び脱脂により予め浄化され、その後、ｄ５０＜３５０μｍ及びｄ９０＜７００μｍの粒子径を有する骨粉に粉砕された。骨粉はその後、等しい質量の水と混合され、撹拌されながら電子レンジでおよそ１分間、１２０～１３０℃に加熱さた。１００℃未満に冷却された後（およそ２０分）、０．１重量％（骨粉質量に対して）のプロテアーゼサブチリシンが添加され、懸濁液が６０℃で撹拌された。可溶性コラーゲンペプチドの形成を伴う酵素反応により、表１に示される通り、水相の濃度が経時的に上昇した。濃度は、ショ糖を測定するためにブリックス単位に較正される屈折計を用いて測定された。
ウシの骨が、高温水により、そしてプロテアーゼ支援によるデフレッシング（ｄｅｆｌｅｓｈｉｎｇ）及び脱脂により予め浄化され、その後、ｄ５０＜３５０μｍ及びｄ９０＜７００μｍの粒子径を有する骨粉に粉砕された。骨粉はその後、等しい質量の水と混合され、撹拌されながら電子レンジでおよそ１分間、１２０～１３０℃に加熱さた。１００℃未満に冷却された後（およそ２０分）、０．１重量％（骨粉質量に対して）のプロテアーゼサブチリシンが添加され、懸濁液が６０℃で撹拌された。可溶性コラーゲンペプチドの形成を伴う酵素反応により、表１に示される通り、水相の濃度が経時的に上昇した。濃度は、ショ糖を測定するためにブリックス単位に較正される屈折計を用いて測定された。
【表1】
【0040】
骨粉の堆積の後、上清が濾過され、塩がそれから除去された。コラーゲンペプチドが、濃縮及び乾燥された。コラーゲンペプチドのＩＥＰは、６．２３であった。
【0041】
本発明によるこれらのコラーゲンペプチドの分子電荷の分布は、等電点電気泳動により決定され得る。図１は、対応するクロマトグラムを示しており、ゲルのｐＨ値が左に示され、３つの軌跡が以下の通り割り当てられる：
軌跡１：マーカペプチド
軌跡２：先行技術の（マセレーション及びライミングを含む）Ｂタイプ骨ゼラチンからのコラーゲンペプチド
軌跡３：先の実施例による、本発明によるコラーゲンペプチド
軌跡１：マーカペプチド
軌跡２：先行技術の（マセレーション及びライミングを含む）Ｂタイプ骨ゼラチンからのコラーゲンペプチド
軌跡３：先の実施例による、本発明によるコラーゲンペプチド
【0042】
分子の電荷は、両方の試料で概ね類似しており、この場合の本発明によるコラーゲンペプチドも、負の、つまりアルカリ性の分子のバンドを示している。変性でのｐＨ値が、バンドの位置を決定し、よってコラーゲンペプチドの等電点を決定する。
【0043】
実施例２：パイロットスケールでの骨からのコラーゲンペプチドの生成
ウシ骨粉からの１５重量％の浄化された骨（ｄ９０＜７００μｍ）の水性懸濁液が、撹拌容器に入れられ、実施例１のように骨が予め浄化された。コラーゲンに対する総タンパク質の比は、１．７であった（乾燥質量の低脂肪量（ｌｅｓｓ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ）に正規化）。懸濁液のｐＨ値が、６．５に調整された。
ウシ骨粉からの１５重量％の浄化された骨（ｄ９０＜７００μｍ）の水性懸濁液が、撹拌容器に入れられ、実施例１のように骨が予め浄化された。コラーゲンに対する総タンパク質の比は、１．７であった（乾燥質量の低脂肪量（ｌｅｓｓ ｆａｔ ｃｏｎｔｅｎｔ）に正規化）。懸濁液のｐＨ値が、６．５に調整された。
【0044】
懸濁液が、ポンプにより熱交換器に送り込まれ、こうして懸濁液を１３０℃に加熱した。この温度が、およそ６分間維持された。その後、懸濁液が熱交換器によりおよそ６０℃に冷却された、撹拌容器に回収された。０．０５重量％（乾燥骨質量に対して）の量のプロテアーゼサブチリシンが、添加された。２時間の反応時間の後、懸濁液を５分間、８５℃に加熱することにより、酵素的加水分解が終了された。
【0045】
水相が、デカンタ遠心分離を用いて分別され、容器に回収された。固相が、骨粉に関して先に記載された通り（懸濁液の生成、予備的熱処理、冷却、酵素的加水分解及びデカンティングによる水相の分別）二回目に同じ方法で処理された。
【0046】
２つの経路からの水相（コラーゲンペプチド溶液）が、ひとまとめにされ、さらなる精製を目的として濾過され、塩除去を受け、適切な方法により濃縮及び乾燥された。
【0047】
この方法からの収率は、用いられる骨質量に対しておよそ１６～１９重量％のコラーゲンペプチドである。
【0048】
コラーゲンペプチドの品質が、例えば２０重量％の濃度を有する水溶液の高い透過値を利用して４５０ｎｍ及び６２０ｎｍの波長で評価されてもよい。測定された値及び各々の品質基準が、表２に示される。
【表2】
【0049】
実施例２によるコラーゲンペプチドの重量平均分子量は、３０００±５００Ｄａの領域である。酵素の選択、酵素の量及び反応時間は、本発明によるコラーゲンペプチドの分子量分布に影響を及ぼすために用いられ得る。
【図1】
【国際調査報告】