特表2023-502034ヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチド、特にヒドロゲナーゼ活性を有する組換えモノマーポリペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-20
(54)【発明の名称】ヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチド、特にヒドロゲナーゼ活性を有する組換えモノマーポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 9/02 20060101AFI20230113BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230113BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230113BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230113BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230113BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230113BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230113BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230113BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230113BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230113BHJP
【ＦＩ】
C12N9/02 ZNA
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 Z
C12N15/53
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022527726
(86)(22)【出願日】2020-11-12
(85)【翻訳文提出日】2022-06-28
(86)【国際出願番号】 EP2020081931
(87)【国際公開番号】W WO2021094465
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】19208856.5
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】2019/5783
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】BE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522183814
【氏名又は名称】アシュ２ウィン ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴドー、ダミアン
(72)【発明者】
【氏名】ロルジュ、フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】ギーゼル、バルト
(72)【発明者】
【氏名】ヨブ、ナタリー
(72)【発明者】
【氏名】フランク、ファブリース
(72)【発明者】
【氏名】カルダレッラ、ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】カルドル、ピエール
(72)【発明者】
【氏名】レマクル、クレア
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD02
4B050EE10
4B050LL05
4B064AG01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA54
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドであって、ヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドであって、ヒドロゲナーゼ活性を有する、モノマーポリペプチド。
【請求項2】
天然環境から単離され、特に天然の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質から単離されることを特徴とする、請求項１に記載のモノマーポリペプチド。
【請求項3】
組換え又は異種であることを特徴とする、請求項１に記載のモノマーポリペプチド。
【請求項4】
精製されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチド。
【請求項5】
その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチド。
【請求項6】
［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む前記サブユニットが、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＣＣＰ６８０３中の／由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質のＨｏｘＨサブユニットであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチド。
【請求項7】
少なくとも０．０１μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素、好ましくは少なくとも０．０５μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素、優先的には少なくとも１０μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素のヒドロゲナーゼ活性を有することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチド。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチドを含む宿主細胞。
【請求項9】
前記［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子を更に含み、前記少なくとも１つの成熟因子が、前記宿主細胞に対して内因性及び／又は前記宿主細胞に対して外因性であり、好ましくは、前記［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子は、成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択され、ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする、配列番号１９のヌクレオチド配列と、少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされることを特徴とする、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項10】
前記モノマーポリペプチド及び／又は前記少なくとも１つの成熟因子が、発現ベクターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現に由来し、前記発現ベクターが前記宿主細胞に含まれることを特徴とする、請求項８又は９に記載の宿主細胞。
【請求項11】
請求項１から７のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項12】
前記［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子を更に含み、前記少なくとも１つの成熟因子が、前記宿主細胞に対して内因性及び／又は前記宿主細胞に対して外因性であり、好ましくは、前記［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子は、成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択され、ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と、少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされることを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
前記モノマーポリペプチド及び／又は前記少なくとも１つの成熟因子が、発現ベクターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現に由来し、前記発現ベクターが前記宿主細胞に含まれることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の宿主細胞。
【請求項14】
以下の工程：・遺伝物質を含む物質、例えば、宿主細胞又は発現ベクターを、インビボ又はインビトロで遺伝子改変を行って、遺伝子改変された物質、例えば、遺伝子改変された宿主細胞又は遺伝子改変された発現ベクターを得る工程と、
・前記遺伝子改変された物質、例えば、前記遺伝子改変された宿主細胞又は前記遺伝子発現ベクターをインキュベートして、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを得る工程であって、前記モノマーポリペプチドが、ヒドロゲナーゼ活性を有する工程と、
を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得る方法。
【請求項15】
前記遺伝子改変工程が、インビボ又はインビトロで行われ、ａ）宿主細胞を、及び／又は［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを少なくとも一部がコードする外因性ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、遺伝子改変して、前記モノマーポリペプチドを産生するために前記外因性ポリヌクレオチドの発現を維持することを可能にするインキュベーション条件に従って実施される前記インキュベーション工程中に、インキュベートされる遺伝子改変された宿主細胞及び／又は遺伝子改変された発現ベクターを得ること、又は
ｂ）宿主細胞の少なくとも１つの遺伝子変異を誘導して、前記モノマーポリペプチドを産生するためにインキュベーション条件に従って実施される前記インキュベーション工程中に、インキュベートされる遺伝子改変された宿主細胞を得ることからなることを特徴とする、請求項１４に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得る方法。
【請求項16】
外因性ポリヌクレオチドを含めることによって前記宿主細胞を遺伝子改変する前記工程が、発現ベクター、特に、前記外因性ポリヌクレオチドを含む改変された発現ベクターを前記宿主細胞に含めることからなることを特徴とする、請求項１５に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得る方法。
【請求項17】
前記宿主細胞を遺伝子改変する前記工程が、少なくとも一部が前記モノマーポリペプチドをコードし、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４の配列のアミノ酸と、少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的には更に少なくとも６０％の同一性、より優先的には更に少なくとも８０％の同一性、より優先的には更に少なくとも９０％の同一性、より優先的には更に少なくとも９５％の同一性、より優先的には更に少なくとも９９％の同一性を有する前記外因性ポリヌクレオチドを、前記宿主細胞に含めることからなることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得るための方法。
【請求項18】
前記宿主細胞を遺伝子改変する前記工程が、前記［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子を前記宿主細胞に含めることを更に含み、前記少なくとも１つの成熟因子が、前記宿主細胞に対して内因性及び／又は前記宿主細胞に対して外因性であり、好ましくは、成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択される前記［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子を含めることを更に含み、ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする、配列番号１９のヌクレオチド配列と、少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされることを特徴とする、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得る方法。
【請求項19】
前記少なくとも１つの成熟因子が、発現ベクターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現に由来し、前記発現ベクターが前記宿主細胞に含まれることを特徴とする、請求項１８に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得る方法。
【請求項20】
前記モノマーポリペプチドを単離及び／又は精製する後続の工程を含むことを特徴とする、請求項１４から２０のいずれか一項に記載のヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得るための方法。
【請求項21】
前記モノマーポリペプチドが、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含み、前記モノマーポリペプチドが、ヒドロゲナーゼ活性を有し、細胞内に存在するか又は存在せず、水素の生成又は消費を確実にすることができるインキュベーション条件による前記モノマーポリペプチドのインキュベーションによって水素を生成又は消費するための、又は表面を被覆するための、特に導電体の表面を被覆するための、例えばアノード又はカソードの表面を被覆するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のモノマーポリペプチド又は請求項１４から２０に記載の方法により得られたモノマーポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチド、特にヒドロゲナーゼ活性を有する組換えモノマーポリペプチド、このモノマーポリペプチドを含む宿主細胞、及びこのモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、ヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得るための方法、特にヒドロゲナーゼ活性を有する組換えモノマーポリペプチドを得るための方法、及びそのようなモノマーポリペプチドの使用、特にそのような組換えモノマーポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
化石エネルギー源の利用可能性の減少及び劇的な気候変化の恐れは、クリーンで再生可能な技術の出現をもたらした。水素（Ｈ２）は、その高いエネルギー含有量、並びに燃料電池で使用される場合には温室効果ガス及びナノ粒子が存在しないため、推進力のある再生可能エネルギーキャリアと考えられている。Ｈ２の製造は、現在、化石炭化水素の化学的抽出、水の電気分解又はバイオマスの熱分解によって行われている。しかし、無公害で商業的に実現可能な生産システムがないことが大きな制約となっている。バイオ水素とも呼ばれるＨ２の生物工学的生成のための方法の使用は、解決策となり得る。バイオ水素生成に関する研究の数は、この１０年間で大幅に増加している。これには、主に細菌における発酵及び微細藻類における光合成のプロセスによる微生物産生が含まれるが、「電気酵素学」による水素の酵素的生成も含まれる。これらの方法は全て、ヒドロゲナーゼと呼ばれる特定の酵素に依存している。
【0003】
ヒドロゲナーゼは、化学反応：２Ｈ＋＋２ｅ－←→Ｈ２を触媒する金属酵素である。この酵素依存性水素生成又は消費反応は、ヒドロゲナーゼ活性と定義される。反応は可逆的であり、その方向は酵素と相互作用することができる成分の酸化還元電位に依存する。Ｈ２及び電子受容体の存在下では、ヒドロゲナーゼは水素を消費する。低電位電子供与体の存在下では、ヒドロゲナーゼは電子受容体としてプロトンを使用し、Ｈ２を生成する。ヒドロゲナーゼは、その多くがエネルギーキャリア又は供給源として水素を使用するため、微生物の間で広く普及している。これらの酵素は、細菌及び古細菌の分野に多くの代表的酵素を有し、一部の単細胞真核生物にも存在する。多くの点で多様であるにもかかわらず（宿主、サイズ、四次構造、電子供与体又は受容体）、ヒドロゲナーゼは、系統発生的に異なる３つのクラス：［Ｆｅ］－ヒドロゲナーゼ、［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼ及び［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼに分けられる。各クラスは、活性部位の特徴的な金属組成によって特徴付けられる。生理学的には、これらの酵素は、過剰な電子のためのバルブとして機能することが示されている。
【0004】
［Ｆｅ］－ヒドロゲナーゼの触媒中心は、ＦｅＳ又はＮｉ中心を含有せず、したがって、「鉄－硫黄中心を含まないヒドロゲナーゼ」又は［Ｆｅ］－ヒドロゲナーゼ（Ｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｔｈａｕｅｒ．２００７．Ａ ｔｈｉｒｄ ｔｙｐｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ Ｈ２ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｃ ７：３７－４６）と命名されている。［Ｆｅ］－ヒドロゲナーゼは、ある種のメタン生成微生物（Ｐｉｌａｋ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｒｏｎ－ｓｕｌｐｈｕｒ ｃｌｕｓｔｅｒ－ｆｒｅｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５８：７９８－８０９）に限られており、ニッケル欠乏時の増殖に必須である（Ｔｈａｕｅｒ．１９９８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ Ｍａｒｊｏｒｙ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ．１９９８ Ｍａｒｊｏｒｙ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｐｒｉｚｅ Ｌｅｃｔｕｒｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４４：２３７７－２４０６）。特定の補因子に関連して、これらの酵素は、他のタイプのヒドロゲナーゼとは非常に異なる触媒特性を有する。実際、これらの酵素は、可逆的Ｈ２生成反応を触媒しない（Ｖｉｇｎａｉｓ ａｎｄ Ｂｉｌｌｏｕｄ．２００７．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７：４２０６－４２７２）。このため、その低い分布と同様に、このクラスのヒドロゲナーゼはほとんど研究されていない。既知のヒドロゲナーゼの大部分は、他の２つのクラスに属する。
【0005】
［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、その触媒中心が高度に保存されている単量体酵素である。それは、システイン架橋によって［４Ｆｅ－４Ｓ］中心に結合した二核鉄部位である。非タンパク質リガンドであるシアン化物（ＣＮ）及び一酸化炭素（ＣＯ）は、二核中心の鉄原子に結合している。鉄原子はまた、２つの硫黄配位子を共有する（Ｎｉｃｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２０００．Ａ ｎｏｖｅｌ ＦｅＳ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ Ｆｅ－ｏｎｌｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２５：１３８－１４３、Ｎｉｃｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｆｅ－ｏｎｌｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９１：１－８）。追加のドメインは、複数のＦｅＳ中心をホストし、外部電子源とこれらの単量体タンパク質に埋め込まれた活性部位との間の電子伝達鎖を提供する。更に、疎水性チャネルは、表面を活性部位に接続し、プロトンのアクセス及びＨ２分子の出口を提供する。ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ及びＨｙｄＧと命名された３つのシャペロンタンパク質は、［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼの正しい集合に必要であることが知られている（Ｖｉｇｎａｉｓ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２５：４５５－５０１）。これらの酵素は、嫌気性原核生物（クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属又はデスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属）に存在するが、嫌気性真菌又は単細胞微細藻類（クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属又はクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属）などの一部の下等真核生物にも存在する（Ｖｉｇｎａｉｓ ａｎｄ Ｂｉｌｌｏｕｄ．２００７．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７：４２０６－４２７２）。［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼは熱力学的に補助因子（フェレドキシン又はＮＡＤＨ）の再酸化を促進し、Ｈ２を生成する。したがって、これらの酵素は、一般に、例えば発酵の停止を回避するために、細胞内の過剰な還元当量の除去に関与する。それらはまた、限られた群の微細藻類の光合成鎖と相互作用して光合成鎖を酸化し、無酸素インキュベーション後に炭素固定を活性化することができる（Ｇｈｙｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｓｔａｔｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｉｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ６４１６１、Ｇｏｄａｕｘ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃａｒｂｏｎ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎｏｘｉａ Ｒｅｌｉｅｓ ｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｎ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｋｅ１－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｃｌｉｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｆｌｏｗ ｉｎ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６８：６４８－６５８）。
【0006】
［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、球状ヘテロ多量体を形成する（Ｖｏｌｂｅｄａ ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｉｃｋｅｌ－ｉｒｏｎ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｇｉｇａｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３７３：５８０－５８７）。二金属［ＮｉＦｅ］活性部位は、鉄原子に結合した４つのシステイン及び３つの非タンパク質リガンド、１つのＣＯ分子及び２つのＣＮによって配位されている大サブユニットに位置する（Ｈａｐｐｅ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３８５：１２６、Ｐｉｅｒｉｋ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｃｙａｎｉｄｅ ａｓ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｉｒｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．ＮｉＦｅ（ＣＮ）２ＣＯ，Ｂｉｏｌｏｇｙ’ｓ ｗａｙ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ Ｈ２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：３３３１－３３３７）。ヘテロ多量体の他のサブユニットは、活性部位と生理学的な電子供与体又は受容体との間で電子を伝導するいくつかの中央及び遠位ＦｅＳ中心を含む。活性部位の近くに位置する［４Ｆｅ－４Ｓ］基は、活性に必須であると考えられる（Ａｌｂｒａｃｈｔ．１９９４．Ｎｉｃｋｅｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１８８：１６７－２０４）。構造遺伝子に加えて、これらのヘテロ多量体の成熟と、活性部位へのＮｉ、Ｆｅ、ＣＯ及びＣＮの挿入に関与するいくつかのアクセサリー遺伝子が存在する。実際、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの成熟は、少なくとも７つの補助タンパク質（ＨｙｐＡ－Ｆ及びエンドペプチダーゼ）が関与する複雑な経路をたどる（Ｖｉｇｎａｉｓ ａｎｄ Ｂｉｌｌｏｕｄ．２００７．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７：４２０６－４２７２）。［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位の別の特徴は、水素に対する強い親和性である。したがって、これらの酵素は、ある種の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼが良好な水素生成能力を有する場合でも、主に宿主微生物中のＨ２を消費することによって作用する。［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼは原核生物の中でかなり広く普及している酵素であり、細菌及び古細菌に多くの酵素がある。［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの分類は、異なるサブユニットのアミノ酸配列アラインメントに基づいており、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼを４つの群に分ける。注目すべきことに、この分類は、生理学的機能に由来する群とよく一致している（Ｖｉｇｎａｉｓ ａｎｄ Ｂｉｌｌｏｕｄ．２００７．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １０７：４２０６－４２７２）。
【0007】
インビトロ及びインビボの両方でヒドロゲナーゼが極度に酸素に敏感であることは、工業レベルでの水素生成のためにこれらの酵素を考慮する場合に問題である。酸素は活性部位にリガンドとして結合し、電子を受け取り、酵素に捕捉された活性酸素種（ＲＯＳ）に還元される。これは、ＲＯＳが脆弱な触媒中心を攻撃するのに十分な時間生存する場合、永続的な損傷をもたらす可能性がある。［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、酵素が低濃度のＯ２に曝露されると不可逆的な損傷を受けるため、Ｏ２に対して強い感受性を示す（Ｇｈｉｒａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｌｇａｌ Ｈ２－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６３－６５：１４１－１５１）。しかし、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、酸素によって引き起こされる損傷に対して［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼよりも耐性があると記載されている。更に、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、Ｏ２によって可逆的に不活性化される。ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）などの一部の微生物は、酸素耐性活性部位を発達させ、空気の存在下でも水素を酸化することができる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｆｏｕｒ ｃｙａｎｉｄｅｓ ｉｎ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ，ｏｎｅ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏｗａｒｄｓ ｏｘｙｇｅｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ ９：６１６－６２６）。これらの多様な特徴は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼを工業的に実行可能な技術的使用のより良い候補にしている。
【0008】
ＨｏｘＥＦＵＹＨは、シアノバクテリウムであるシネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３に存在するよく特徴付けられた［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼである。ＨｏｘＥＦＵＹＨは、五量体で細胞質［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼである。ＨｏｘＹ及びＨｏｘＨは「ヒドロゲナーゼ」部分を形成し、ＨｏｘＥ、ＨｏｘＦ及びＨｏｘＵは酸化還元補因子と接触する部分を構成する（Ｃａｒｒｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ １０２：８３６８－８３７７）。ＨｏｘＨは、触媒活性を担うサブユニット、すなわち［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含むサブユニットである。ＨｏｘＨは、ニッケル原子と鉄原子との結合のための保存された残基を含む。ＨｏｘＹは、ＮｉＦｅ触媒中心付近に近位［４Ｆｅ－４Ｓ］基を含有する。ＨｏｘＦ及びＨｏｘＵは、基質（ＮＡＤＨ、フラボドキシン又は還元型フェレドキシン）とのインビボ相互作用を担う鉄－硫黄型タンパク質である。ＨｏｘＦＵは、電子をＨｏｘＹＨに輸送する中央及び遠位のＦｅＳ中心を含む。ＨｏｘＥの機能は不明であるが、膜固定サブユニットである可能性がある。成熟経路の変異分析により、ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷと呼ばれる７つの必須成熟因子が同定された（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｏｆ ｈｙｐＡ ａｎｄ ｈｙｐＢ ａｒｅ ｎｏｔ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ Ｊ ２７３：４５１６－４５２７）。ＨｏｘＥＦＵＹＨの成熟モデルが提案されている（Ｃａｒｒｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ １０２：８３６８－８３７７、Ｃａｓｓｉｅｒ－Ｃｈａｕｖａｔ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ６８０３．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １５：１９９３８－１９９５１）。ＨｏｘＨサブユニットは、ＨｏｘＷ特異的プロテアーゼによって処理され、［Ｎｉ－Ｆｅ］部位は、ＨｙｐＡＢＣＤＥＦ複合体によって触媒サブユニットに付加される。シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３の完全ゲノムが配列決定されている。ＨｏｘＥＦＵＹＨ遺伝子は、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）染色体に散在するｈｙｐＡＢＣＤＥＦ遺伝子とは異なり、オクタシストロン性オペロンにクラスター化していると同定された。ｈｏｘＥＦＵＹＨオペロンのプロモータはあまり活性ではない（Ｄｕｔｈｅｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｔｈｅ ＡｂｒＢ２ ａｕｔｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｐｅｒｏｎ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＰＣＣ６８０３．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９４：５４２３－５４３３）。そのプロモータは、水素、光、硝酸塩、ニッケル、酸素又は硫黄の利用可能性のような種々の環境条件によって調節される（Ｏｌｉｖｅｉｒａ ａｎｄ Ｌｉｎｄｂｌａｄ．２００９．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｈｏｘ－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ ９９９０－９９９６）。ｈｏｘ遺伝子は、酸素の存在下で構成的に発現されるが（Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ６８０３．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４２：３１－３７）、酸素に感受性の酵素は、したがって好気性条件下で不活性であることに留意することが重要である。正確な生理学的機能は依然として議論されているが、ＨｏｘＥＦＵＹＨは、好ましくない酸化還元条件下で過剰の電子を散逸させる安全弁として機能し、したがって発酵又は光合成中に細胞内の適切な酸化／還元バランスを維持する（Ｃａｒｒｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ １０２：８３６８－８３７７）。
【0009】
ＨｏｘＥＦＵＹＨについては多数の研究がある。多くの特徴により、この酵素はバイオ水素生成の良好な候補となる。第１に、この［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、プロトン還元に対してバイアスがある（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｔｈｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３ ｗｏｒｋｓ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｂｉａｓ ｔｏ Ｈ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３３：１１３０８－１１３１９）。オペロン、したがって酵素は、好気性条件下でシネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３において弱く発現される。（Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ６８０３．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４２：３１－３７）。酸素の存在下でのＨｏｘＥＦＵＹＨの不活性化は、完全かつほぼ瞬時である。しかし、ＨｏｘＥＦＵＹＨは、酸化還元条件下で（例えば、水素による還元及び／又は酸素の脱離によって）迅速に再活性化することができる（１分程度の遅延）（Ａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３ ｗｏｒｋｓ ａｓ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｖａｌｖｅ ｄｕｒｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７３：３３３－３３８、Ｇｅｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ［ＮｉＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４：３６４６２－３６４７２、ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｔｈｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３ ｗｏｒｋｓ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｂｉａｓ ｔｏ Ｈ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３３：１１３０８－１１３１９）。電気化学におけるいくつかの精製プロトコル（Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２００２．ＨｏｘＥ－－ａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｔｍｅｒｉｃ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＨｏｘＥＦＵＹＨ）ｏｆ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５５４：６６－７４、Ｇｅｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ［ＮｉＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４：３６４６２－３６４７２）及び実施（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｔｈｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３ ｗｏｒｋｓ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｂｉａｓ ｔｏ Ｈ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３３：１１３０８－１１３１９）が利用可能である。水素の生成を効率的に触媒する能力、及び酸素に対する限定された感度により、ＨｏｘＥＦＵＹＨを良好な候補として同定することができた。
【0010】
目的のタンパク質を大量に産生するための一般的かつ効率的な方法は、異種宿主内でのこのタンパク質の組換え産生である。この生物工学的プロセスは、優れた純度で大量の目的のタンパク質を産生するために、宿主生物のゲノムへの目的の遺伝子の導入及び発現を含む。いくつかの組換え産生系が存在する。原核生物系は、依然として、目的のタンパク質を産生するための最も速く最も簡単な系であり、真核生物系は、実施するのがより遅く、より複雑である。各生物は、それ自体の利点及び欠点を有する。普遍的に適用可能な発現系は依然として存在しない。どの宿主が特定のタンパク質又は特定の最終用途に最もよく作用するかを予測することは非常に困難である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、組換え産生のための参照生物である。実際、この細菌は、遺伝子工学及び生理学的工学の観点から非常によく知られており、例えば、最適化された細胞（高生産性、コドンの使用、内因性プロテアーゼの阻害）、最適化された培養培地、短い倍加時間、低い汚染、多くの市販ベクターの利用可能性、工業規模の拡大、高い生産収率が挙げられる。
【0011】
一般に金属タンパク質などの組換えヒドロゲナーゼの産生及び操作は、限られた成功しか収めていない。文献は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において異種発現された［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼの例を提供する（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ［ＦｅＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８８：２１６３－２１７２、Ｙａｃｏｂｙ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｇａｌ ［ＦｅＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３５８８６、Ｋｕｃｈｅｎｒｅｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，ｃｙｓｔｅｉｎｅ，ａｎｄ Ｓ－ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［ＦｅＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ７５６５）。［ＦｅＦｅ］－ヒドロゲナーゼは、限られた数の成熟因子を必要とする単量体酵素である。
【0012】
［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの異種産生は困難であると記載されている（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｂａｓｉｃ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｈ２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ ９９７０－９９７８）。
【0013】
第１に、この困難は、［ＮｉＦｅ］活性部位アセンブリプロセスの複雑さ及び特異性に起因し、これは、理論的には、機能的アセンブリのために少なくとも７つの成熟因子を必要とする。
【0014】
第２に、ヘテロ多量体のサブユニットのそれぞれの正しい折り畳みが必要とされ、これは、異種産生中に制御及び確保することが特に困難である。
【0015】
第３に、ヘテロ多量体複合体における各サブユニットの正しいアセンブリが必須である。ミスフォールディングは、凝集現象をもたらし、したがって活性酵素の量の減少をもたらす可能性がある（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｄ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １４：４１）。正確な配列を得ることは、酵素活性を得るために必要であり、これは、異種宿主において制御及び確保することが困難である可能性がある。
【0016】
この全てが、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼが異種組換えによって産生されたときに必ずしも活性であるとは限らない理由を説明している。しかし、活性な［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生された文献にはいくつかの事例がある（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ－ｔｏｌｅｒａｎｔ Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｕｓ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５５：３１２－３１９、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ ｆｒｏｍ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＳＧ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９：１－８、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ａｎ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｘｙｇｅｎ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ６８８１２、Ｗｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃｌｅｏｄｉｉ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ３２２：１８０－１８７）。
【0017】
特に、Ｓｕｎ及び共同研究者の研究（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｂｉｏｆｕｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１０５２６）は、１３の異種遺伝子（４つの構造遺伝子及び９つの成熟因子）の同時発現を可能にする４つの発現ベクターを介して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における無酸素状態でのピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現を可能にした。より具体的には、Ｓｕｎらの研究は、ＰＦ０８９１、ＰＦ０８９２、ＰＦ０８９３及びＰＦ０８９４と呼ばれる４つのサブユニットを含む四量体組換え［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様酵素を得ることを可能にした。精製後、この四量体組換え酵素は、Ｐ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から精製された天然酵素と機能的に類似していることが見出された。
【0018】
ＨｏｘＥＦＵＹＨはシアノバクテリアであるシネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の原核生物タンパク質であるので、大腸菌系はその組換え産生に適している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのこの産生は既に成功している。この意味で、Ｍａｅｄａ及び共同研究者は、無酸素条件下でシアノバクテリアＨｏｘＥＦＵＹＨ酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における水素生成のインビボ増加を示した（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７：２５）。ＨｏｘＥＦＵＹＨの存在下でのこのような水素生成の増加は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における内因性Ｈ２消費ヒドロゲナーゼ１及び２の活性の阻害によるものである。
【0019】
ＨｏｘＥＦＵＹＨ遺伝子及びこれらの関連成熟因子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入したＷｅｌｌｓ及び共同研究者にも言及すべきである（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ａ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ［ＮｉＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ １３：４４５－４５３）。この研究は、内因性ヒドロゲナーゼのヌル宿主におけるＨｏｘＥＦＵＹＨを介したインビボ及びインビトロの両方での無酸素状態での水素の産生を実証した。それらは、発酵のような宿主電子伝達系との共役を示し、水素生成収率を改善するための代謝工学におけるＨｏｘＥＦＵＹＨの可能性を示す。
【0020】
先行技術分野の状況では、文献Ｄ２（Ｈｏｒｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔｉｖｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡＤ－ｌｉｎｋｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，Ｍａｓｓｏｎ，Ｐａｒｉｓ，ＦＲ，ｖｏｌ．６８（１），ｐａｇｅｓ １５－２４）及びＤ３（Ｐｒｚｙｂｙｌａ ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｎｉｃｋｅｌ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ８：１０９－１３５）が、そのように見えると考えているようであっても、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニット、［ＮｉＦｅ］特に－ヒドロゲナーゼ様複合体に由来し、それ自体ヒドロゲナーゼ活性を有する単離されたモノマーを含むモノマーポリペプチドの開示はない。
【0021】
文献Ｄ２は、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）Ｈ１６の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの天然サブユニットの特性決定を記載している。このペプチドは、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの触媒サブユニットを表し、酸化還元メディエータとしてのＮＡＤとは完全に不活性であるが、メチレンブルー、フェリシアン化物及びシトクロムＣとは非常に低い残存活性を有すると記載されている。
【0022】
文献Ｄ３には、ヒドロゲナーゼ活性を有する［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様モノマーの存在が示唆されている。例として、文献Ｄ３は、文献Ｄ２を引用して、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ）の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ－１について言及している。
【0023】
しかし、文献Ｄ１（Ｍａｓｓａｎｚ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｓｕｂｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＮＡＤ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｆ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８０：１０２３－１０２９）、Ｄ４（Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２：１１６７０－１１６８１）及びＤ５（Ｐｉｎｓｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｔｏ ｂｅｎｚｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ ｂｙ ｔｈｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｒｏｎ－ｓｕｌｆｕｒ ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ．ＡｒｃｈＭｉｃｒｏｂｉｏｌ １９３：８９３－９０３）に記載された研究を含む、その後に公開された研究は、文献Ｄ２及びＤ３の研究の結論が誤っていることを示した。
【0024】
文献Ｄ１に記載されている研究は、アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）Ｈ１６の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位含有サブユニットのみが、いくつかの酸化還元メディエータ、特にベンジルビオロゲンとヒドロゲナーゼ様活性を有さないことを実証した。文献Ｄ１には、ヒドロゲナーゼ活性を有する可能性が高いアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの最小物質が、［ＮｉＦｅ］中心を含む大サブユニットと、最小のＦｅＳ中心を有する小サブユニットとからなることが記載されている。同様に、文献Ｄ４及び文献Ｄ５に提示された研究は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ ｃｏｌｉ）の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ－１の単一の触媒サブユニットがヒドロゲナーゼ活性を有さないことを示すことによって、文献Ｄ３の教示と矛盾する。
【0025】
文献Ｄ１、Ｄ４及びＤ５の研究を含む、この主題で実施された研究の大部分は、小サブユニットに位置する［４Ｆｅ－４Ｓ］中心が、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの大サブユニットのヒドロゲナーゼ活性に必須かつ不可欠であると考えている（Ａｌｂｒａｃｈｔ．１９９４．Ｎｉｃｋｅｌ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１８８：１６７－２０４）。更に、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの構造分析は、活性部位を含む触媒サブユニットにＦｅＳ中心が存在しないことを大部分実証している（Ｌｕｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １１４：４０８１－４１４８）。
【0026】
したがって、文献Ｄ２で前述した結果は、低ヒドロゲナーゼ活性の測定を可能にする調製物中のＦｅＳ中心の強調によって証明されるように、小サブユニットによる触媒サブユニットの汚染によってのみ説明することができる。
【0027】
結論として、先行技術を構成する実施された全ての研究は、サブユニットの数の減少が、ヒドロゲナーゼの活性にも安定性にも有利ではなく、ＮｉＦｅ様ヒドロゲナーゼの多量体複合体から単離されたＮｉＦｅ中心含有サブユニットは、それ自体ヒドロゲナーゼ活性を有さないと考えている。
【0028】
残念なことに、特に上記の先行技術から明らかなように、商業的に利益のある水素のバイオ生産のための［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの使用、特にＨｏｘＥＦＵＹＨの使用を著しく妨げるいくつかの欠点が残っている。
【0029】
したがって、上記のように、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼは水素の生成の可能性が明らかに高いので、現在まで、水素生成のための［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの使用を妨げる障害を克服することが実際に必要とされている。
【発明の概要】
【0030】
これらの問題を解決するために、本明細書では、本発明に従って、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドであって、酵素活性、特にヒドロゲナーゼ様酵素活性、より具体的には触媒活性、更により具体的にはヒドロゲナーゼ様触媒活性を有する当該モノマーポリペプチドが提供される。
【0031】
好ましくは、本発明によれば、当該モノマーポリペプチドは、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含む。
【0032】
好ましくは、本発明によれば、当該モノマーポリペプチドは、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットからなる。
【0033】
好ましくは、本発明によれば、当該モノマーポリペプチドは、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットで作製される。
【0034】
換言すれば、優先的に、本明細書では、本発明に従って、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位のみを含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドであって、酵素活性、特にヒドロゲナーゼ様酵素活性、より具体的には触媒活性、更により具体的にはヒドロゲナーゼ様触媒活性を有する当該モノマーポリペプチドが提供される。
【0035】
本発明の文脈において、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含み、ヒドロゲナーゼ活性を有する単一サブユニットを含むそのようなモノマーポリペプチドは、水素生成のための［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの使用を妨げる障害を少なくとも部分的に解放することを可能にし、一方、少なくとも０．０１μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素、好ましくは少なくとも０．０５μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素のヒドロゲナーゼ活性を保証することが強調されている。
【0036】
実際、本発明によれば、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドであるため、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼが遭遇する困難性、特に活性部位の集合を確実にすること、関与するサブユニットのそれぞれの適切な折り畳みを確実にすること、及びヘテロ多量体複合体中の各サブユニットの正しい集合を確実にすることは、大幅に低減されるか、又は排除さえされる。これにより、１つのサブユニットのみが関与するので、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼを得るプロセス中の再現性を高めることができる。実際、単一のモノマーポリペプチドの産生は、二量体、四量体及び五量体酵素と比較して、折り畳みの複雑なプロセスを大幅に単純化し、そのために、活性部位、各サブユニット及び最終的には酵素全体の正確なアセンブリを制御及び保証することが特に困難であり、これはそれらの使用の障害となる。本発明によれば、単一サブユニットの適切な折り畳みが必要であり、ヘテロ多量体複合体を形成するために異なるサブユニット間の集合は必要ではない。
【0037】
更に、本発明によるそのようなモノマーポリペプチドを産生するための方法は、好気性条件下で完全に実施することができ（発現及び精製工程中の酸素に関して予防措置を必要としない）、これにより、先行技術分野で遭遇する組換え二量体、四量体及び五量体［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼを製造するための方法で遭遇する問題が回避され、その製造方法は無酸素状態で実施されることが強調されている。上述のように、バイオマスの蓄積が酸素の存在下で行われる場合であっても、組換えヒドロゲナーゼの産生段階は、それ自体、先行技術分野で公知の方法に従って無酸素状態で行われる（Ｓｕｎ ａｎｄ ａｌ．２０１０．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｂｉｏｆｕｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１０５２６，Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｎｏｎ－ｎａｔｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｖｉａ ａ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ［ＮｉＦｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ １３：４４５－４５３）。精製の様々なクロマトグラフィ工程中に酸素が存在しないことも報告されている（無酸素箱、緩衝液中の亜ジチオン酸ナトリウム）。方法の間にこのようなレベルの無酸素を維持することは、明らかに組換え産生に関連するコストの増加を伴い、これは本発明によって解決される。
【0038】
有利には、本発明によれば、本発明によるモノマーポリペプチドのサイズは、ヘテロ多量体と比較して明らかに小さく、酵素の質量活性（総タンパク質１ｍｇ当たりの触媒活性物質の数）の増加がこのようにして得られる。
【0039】
例えば、本発明によるモノマーポリペプチドの電気化学的実施中に、例えば燃料電池などで、酵素触媒のより良好な組込み及び緻密化も達成可能である。
【0040】
更に、本発明によるモノマーポリペプチドの三次元構造は、特にタンパク質の表面に露出した残基を決定するために、例えば界面に対する、例えば炭素電極に対する配向及び吸着を容易にするために容易にモデル化可能である。この特徴は、有利には、例えば、界面と酵素触媒との間の結合の安定性を改善することを可能にするだけでなく、界面と活性部位との間の直接電子伝達を最適化することも可能にする。したがって、エネルギー効率は、エネルギー損失を制限する追加の酸化還元リレーがない場合に改善される。
【0041】
本発明の文脈において、モノマーポリペプチドは、小サブユニット中に存在し、必須であると記載されている近位ＦｅＳ中心の存在を伴わずに、実際に活性であり、Ｈ２の触媒的産生（例えば、酸化還元メディエータとして還元メチル－ビオロゲンを使用するヒドロゲナーゼによる標準的なインビトロＨ２産生試験による）並びにＨ２の触媒的消費（例えば、酸化還元メディエータとして酸化ベンジルビオロゲンを使用するヒドロゲナーゼによる標準的なインビトロＨ２消費試験による）に適しており、更に他の酸化還元リレーにも適していることも実証されている。ヘテロ多量体酵素のこのような完全な単純化は、従来技術におけるヒドロゲナーゼ活性の強調を可能にしなかったので、これは非常に驚くべきことである。
【0042】
更に有利なことに、既知の組換え［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼでは現在限られたＨ２産生しか得られていないが（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＮＡＤＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｂｉｏｆｕｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１０５２６、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｓ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ａｎ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｘｙｇｅｎ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８：ｅ６８８１２、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ［ＮｉＦｅ］－ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ ｆｒｏｍ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＳＧ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９：１－８）、本発明によるモノマーポリペプチドは、既知の（組換え）［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼで得られる活性と少なくとも同等であるか、又はそれよりも高いヒドロゲナーゼ活性を有することが示された。
【0043】
本発明による一実施形態によれば、モノマーポリペプチドは、天然環境から単離され、特に［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様天然タンパク質から単離される。
【0044】
例として、本発明によれば、当該モノマーポリペプチドは、原核生物に由来／単離することができる。例としては、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のメンバー（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属のメンバー（例えば、デスルホビブリオ・ギガス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｇｉｇａｓ）など）、ハイドロゲノフィルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ）属のメンバー（例えば、ハイドロゲノフィルス・サーモルテオルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｏｌｕｓ）など）、デスルホミクロビウム（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属のメンバー（例えば、デスルホミクロビウム・バキュラタム（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｃｕｌａｔｕｍ）など）、シネコキスティス（例えば、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３）、フォルミジウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属のメンバー（例えば、フォルミジウム・アンビガム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ ａｍｂｉｇｕｕｍ）など）又はスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属のメンバー（例えば、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、当該モノマーポリペプチドは、細胞若しくは微生物に由来してもよいか、又はインビトロ若しくはインビボで産生することができる。
【0045】
本発明による一実施形態によれば、モノマーポリペプチドは組換え又は異種である。
【0046】
有利には、本発明によれば、モノマーポリペプチドが精製される。
【0047】
好ましくは、本発明によれば、モノマーポリペプチドは、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する。
【0048】
更により好ましくは、本発明によれば、モノマーポリペプチドは、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８１％の同一性、少なくとも８２％の同一性、少なくとも８３％の同一性、少なくとも８４％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８６％の同一性、少なくとも８７％の同一性、少なくとも８８％の同一性、少なくとも８９％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する。
【0049】
有利には、本発明によれば、当該モノマーポリペプチドは、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む当該サブユニットが、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３中の／由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質のＨｏｘＨサブユニットであることを特徴とする。
【0050】
好ましくは、本発明によれば、当該モノマーポリペプチドは、少なくとも０．０１μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素、好ましくは少なくとも０．０５μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素、優先的には少なくとも１０μｍｏｌ Ｈ２．ｍ１．ｍｇ－１の酵素のヒドロゲナーゼ活性を有する。
【0051】
本発明はまた、本発明によるモノマーポリペプチドを含む宿主細胞に関し、当該モノマーポリペプチドは、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含み、当該モノマーポリペプチドはヒドロゲナーゼ活性を有する。
【0052】
優先的には、本発明は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含むサブユニットが、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３中の／由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質のＨｏｘＨサブユニットである、本発明によるモノマーポリペプチドを含む宿主細胞に関する。
【0053】
例として、本発明によれば、特に当該モノマーポリペプチドの発現のための宿主細胞は、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）、ストレプロマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、ストレプロマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）など）、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属（例えば、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３など）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ＷＨ８１０２など）の宿主細菌細胞、又は任意の他の原核細胞、真核細胞、例えば、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）など）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）型（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）、又は別の型の真核細胞であってもよい。
【0054】
本発明によれば、当該宿主細胞に含まれる当該モノマーポリペプチドは、それ自体が、発現ベクターに含まれる遺伝子、例えば当該宿主細胞に挿入されたプラスミドの発現に由来し得るが、必ずしもそうではない。
【0055】
有利には、本発明によれば、当該宿主細胞に含まれる当該モノマーポリペプチドは、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する。
【0056】
好ましくは、本発明によれば、当該宿主細胞は、当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子、好ましくは成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択される当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子を含むことができ、
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
【0057】
本発明によれば、当該少なくとも１つの成熟因子は、宿主細胞に対して内因性及び／又は宿主細胞に対して外因性であってもよい。
【0058】
有利には、本発明による宿主細胞の場合、当該モノマーポリペプチド及び／又は当該少なくとも１つの成熟因子は、発現ベクターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現に由来し、当該発現ベクターは当該宿主細胞に含まれる。
【0059】
本発明はまた、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含む本発明によるモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、当該モノマーポリペプチドはヒドロゲナーゼ活性を有する。
【0060】
優先的には、本発明は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含むサブユニットが、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３中の／由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質のＨｏｘＨサブユニットであるモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【0061】
好ましくは、本発明によれば、モノマーポリペプチドをコードする当該ポリヌクレオチドは、配列番号１及び／又は配列番号３のヌクレオチド配列とそれぞれ少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0062】
例として、本発明によれば、本発明によるモノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、特に当該モノマーポリペプチドの発現に使用される宿主細胞は、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など）、ストレプロマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、ストレプロマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）など）の宿主細菌細胞、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属（例えば、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３など）又はシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ＷＨ８１０２など）の光合成細菌細胞、又は任意の他の原核細胞、真核細胞、例えば、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）など）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）型（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）、又は別の型の真核細胞であってもよい。
【0063】
本発明によれば、当該宿主細胞に含まれる当該ポリヌクレオチドは、それ自体であってもよいが、必ずしも当該宿主細胞に挿入される発現ベクター、例えばプラスミドに含まれていなくてもよい。
【0064】
有利には、本発明によれば、当該宿主細胞に含まれる当該ポリヌクレオチドによってコードされる当該モノマーポリペプチドは、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する。
【0065】
好ましくは、本発明によれば、モノマーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む当該宿主細胞は、当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子、好ましくは成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択される当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子を含むことができ、
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
【0066】
本発明によれば、当該少なくとも１つの成熟因子は、宿主細胞に対して内因性及び／又は宿主細胞に対して外因性であってもよい。
【0067】
有利には、本発明による宿主細胞の場合、当該モノマーポリペプチド及び／又は当該少なくとも１つの成熟因子は、発現ベクターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現に由来し、当該発現ベクターは当該宿主細胞に含まれる。
【0068】
本発明はまた、例えば宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））において、本発明によるヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得るための方法に関し、当該方法は、以下の工程、
・［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを少なくとも一部がコードする外因性ポリヌクレオチドをその中に含めることによる、発現ベクター、例えばプラスミドを改変すること、及び
・当該外因性ポリヌクレオチドの発現を持続させるインキュベーション条件に従って当該改変された発現ベクターをインキュベートして、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを産生することであって、当該モノマーポリペプチドがヒドロゲナーゼ活性を有することを含む。
・［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを少なくとも一部がコードする外因性ポリヌクレオチドをその中に含めることによる、発現ベクター、例えばプラスミドを改変すること、及び
・当該外因性ポリヌクレオチドの発現を持続させるインキュベーション条件に従って当該改変された発現ベクターをインキュベートして、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを産生することであって、当該モノマーポリペプチドがヒドロゲナーゼ活性を有することを含む。
【0069】
本発明による方法は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットの産生を実現することを可能にする。
【0070】
当業者は、当然ながら、必要かつ適切なインキュベーション条件を定義することができる。
【0071】
本発明によれば、宿主細胞を遺伝子改変する工程の間、ポリヌクレオチドは、それ自体が発現ベクター、例えばプラスミドに含まれることができるが、必ずしも含まれなくてもよい。
【0072】
有利には、本発明によれば、当該発現ベクターを改変する当該工程は、少なくとも一部が当該モノマーポリペプチドをコードし、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する、当該外因性ポリヌクレオチドを当該発現ベクターに含めることからなる。
【0073】
好ましくは、本発明によれば、当該発現ベクターを改変する当該工程は、当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子、好ましくは成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択される当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子を当該発現ベクターに含むことができ、
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
【0074】
本発明によれば、当該発現ベクターを改変する工程の間、当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の１つ又は複数の成熟因子をコードする配列は、それ自体が発現ベクター、例えばプラスミドに含まれることができるが、必ずしも含まれなくてもよい。
【0075】
有利には、本発明による方法は、当該モノマーポリペプチドの単離及び／又は精製の後続の工程を含む。
【0076】
特に好ましくは、本発明は、本発明によるヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得るための方法に関し、当該方法は、以下の工程、
・遺伝子改変された物質、例えば遺伝子改変された宿主細胞又は遺伝子改変された発現ベクターを得るために、遺伝物質を含む物質、例えば宿主細胞又は発現ベクターのインビボ又はインビトロで行われる遺伝子改変の工程、
・［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを得るために、当該遺伝子改変された物質、例えば当該遺伝子改変された宿主細胞又は当該遺伝子発現ベクターをインキュベートする工程であって、当該モノマーポリペプチドがヒドロゲナーゼ活性を有する工程を含む。
・遺伝子改変された物質、例えば遺伝子改変された宿主細胞又は遺伝子改変された発現ベクターを得るために、遺伝物質を含む物質、例えば宿主細胞又は発現ベクターのインビボ又はインビトロで行われる遺伝子改変の工程、
・［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを得るために、当該遺伝子改変された物質、例えば当該遺伝子改変された宿主細胞又は当該遺伝子発現ベクターをインキュベートする工程であって、当該モノマーポリペプチドがヒドロゲナーゼ活性を有する工程を含む。
【0077】
好ましくは、本発明によれば、インビボ又はインビトロで行われる遺伝子改変の当該工程は、
ａ）宿主細胞及び／又は［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを少なくとも一部がコードする外因性ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを遺伝子改変して、当該モノマーポリペプチドを産生するために当該外因性ポリヌクレオチドの発現を維持することを可能にするインキュベーション条件に従って実施される当該インキュベーション工程中に、インキュベートされる遺伝子改変された宿主細胞及び／又は遺伝子改変された発現ベクターを得ること、又は
ｂ）宿主細胞の遺伝物質において少なくとも１つの遺伝子変異を誘導して、当該モノマーポリペプチドを産生するために当該インキュベーション条件に従って実施される当該インキュベーション工程中に、インキュベートされる遺伝子改変された宿主細胞を得ることからなる。
ａ）宿主細胞及び／又は［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含むモノマーポリペプチドを少なくとも一部がコードする外因性ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを遺伝子改変して、当該モノマーポリペプチドを産生するために当該外因性ポリヌクレオチドの発現を維持することを可能にするインキュベーション条件に従って実施される当該インキュベーション工程中に、インキュベートされる遺伝子改変された宿主細胞及び／又は遺伝子改変された発現ベクターを得ること、又は
ｂ）宿主細胞の遺伝物質において少なくとも１つの遺伝子変異を誘導して、当該モノマーポリペプチドを産生するために当該インキュベーション条件に従って実施される当該インキュベーション工程中に、インキュベートされる遺伝子改変された宿主細胞を得ることからなる。
【0078】
当業者は、当然ながら、必要かつ適切なインキュベーション条件を定義することができる。
【0079】
例えば、本発明によれば、少なくとも１つの遺伝子変異の当該誘導は、当業者に周知の方法である相同組換えによって行われる。
【0080】
有利には、本発明によれば、外因性ポリヌクレオチドを含めることによる当該宿主細胞の遺伝子改変の当該工程は、発現ベクター、特に当該外因性ポリヌクレオチドを含む改変された発現ベクターを当該宿主細胞に含めることからなる。
【0081】
好ましくは、本発明によれば、当該宿主細胞の遺伝子改変の当該工程は、少なくとも一部が当該モノマーポリペプチドをコードし、その切断型又は非切断型アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列及び／又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する、当該外因性ポリヌクレオチドを当該宿主細胞に含めることからなる。
【0082】
有利には、本発明によれば、当該宿主細胞の遺伝子改変の当該工程は、当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子を当該宿主細胞に含めることを更に含み、当該少なくとも１つの成熟因子は、宿主細胞に対して内因性及び／又は宿主細胞に対して外因性であり、好ましくは、成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷからなる群から選択される当該［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の少なくとも１つの成熟因子を含めることを更に含み、
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
ａ）それぞれのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有し、又は
ｂ）これらの成熟因子の全てをコードする配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも１５％の同一性、好ましくは少なくとも２０％の同一性、より優先的には少なくとも４０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも６０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも８０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９０％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９５％の同一性、より優先的にはなお少なくとも９９％の同一性を有する連結ヌクレオチド配列によって一緒にコードされる。
【0083】
好ましくは、本発明によれば、当該少なくとも１つの成熟因子は、発現ベクターに含まれる少なくとも１つの遺伝子の発現に由来し、当該発現ベクターは当該宿主細胞に含まれる。
【0084】
優先的には、本発明によるヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチドを得るための方法は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含むサブユニットが、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３中のＨｏｘＥＦＵＹＨ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質のＨｏｘＨサブユニットであるモノマーポリペプチドの取得をもたらす。
【0085】
本発明はまた、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含む本発明によるモノマーポリペプチドの使用に関し、当該モノマーポリペプチドはヒドロゲナーゼ活性を有し、細胞内に存在するか又は存在せず、水素の生成又は消費を確実にすることができるインキュベーション条件により当該モノマーポリペプチドをインキュベートすることによって水素を生成又は消費する。
【0086】
本発明はまた、本発明によるモノマーポリペプチド、又は［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼ様タンパク質の活性部位を含む単一サブユニットを含む本発明による方法に従って得られたモノマーポリペプチドの使用に関し、当該モノマーポリペプチドはヒドロゲナーゼ活性を有し、細胞内に存在するか又は存在せず、特に導電体の表面を被覆するための、例えばアノード又はカソードの表面を被覆するための使用に関する。
【0087】
定義
「ポリペプチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、アミノ酸のカルボキシル基と次のアミノ酸のアミン基との間のペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸から構成される単鎖を指す。「ポリペプチド」という用語はまた、複数のポリペプチドを含有する分子を含み、これらは、例えばジスルフィド架橋によって一緒に連結されているか、又はポリペプチドの複合体であり、これらは、例えば非共有結合的又は共有結合的に一緒に連結されており、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体）を形成している。ポリペプチドはまた、無機鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄－硫黄中心（ＦｅＳ）、又は一酸化炭素（ＣＯ）、シアン化物（ＣＮ）若しくはフラビンなどの他の有機配位子などの非タンパク質配位子を含むことができる。ペプチド、ポリペプチド、酵素、サブユニット又はタンパク質という用語は、全てポリペプチドの定義に含まれ、これらの用語は交換可能であってもよい。「ポリペプチド」の定義は、当該ポリペプチドの長さも、当該ポリペプチドが産生される方法も考慮していない。
「ポリペプチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、アミノ酸のカルボキシル基と次のアミノ酸のアミン基との間のペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸から構成される単鎖を指す。「ポリペプチド」という用語はまた、複数のポリペプチドを含有する分子を含み、これらは、例えばジスルフィド架橋によって一緒に連結されているか、又はポリペプチドの複合体であり、これらは、例えば非共有結合的又は共有結合的に一緒に連結されており、多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体）を形成している。ポリペプチドはまた、無機鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄－硫黄中心（ＦｅＳ）、又は一酸化炭素（ＣＯ）、シアン化物（ＣＮ）若しくはフラビンなどの他の有機配位子などの非タンパク質配位子を含むことができる。ペプチド、ポリペプチド、酵素、サブユニット又はタンパク質という用語は、全てポリペプチドの定義に含まれ、これらの用語は交換可能であってもよい。「ポリペプチド」の定義は、当該ポリペプチドの長さも、当該ポリペプチドが産生される方法も考慮していない。
【0088】
「組換えポリペプチド」又は「異種ポリペプチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、環境中に天然には存在せず、及び／又はその産生に使用される宿主細胞、特に宿主細胞中に天然には存在せず、その産生が組換え技術によって、例えば遺伝物質を宿主細胞に添加することによって行われるポリペプチドを指す。
【0089】
「モノマーポリペプチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、アミノ酸のカルボキシル基と次のアミノ酸のアミン基との間のペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸から構成される単鎖を指す。「ポリペプチド」という用語とは対照的に、「モノマーポリペプチド」という用語は、１つのポリペプチドのみを含有する、すなわち他のポリペプチドと相互作用しない分子のみを含む。例えば、それは決して多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体など）ではない。モノマーポリペプチドはまた、無機鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄－硫黄中心（ＦｅＳ）、又は一酸化炭素（ＣＯ）、シアン化物（ＣＮ）若しくはフラビンなどの他の有機配位子などの非タンパク質配位子を含むことができる。「モノマーポリペプチド」の定義は、当該ポリペプチドの長さも、当該ポリペプチドが産生される方法も考慮していない。
【0090】
「組換えモノマーポリペプチド」又は「異種モノマーポリペプチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、モノマーポリペプチドが環境中、特に宿主細胞中に天然に存在せず、その産生が組換え技術によって、例えば遺伝物質を宿主細胞に添加することによって行われることを意味する。
【0091】
「ヒドロゲナーゼ活性を有するモノマーポリペプチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、モノマーポリペプチドが可逆的反応Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－を触媒することができることを意味する。ヒドロゲナーゼ活性のこの定義は、実験条件に関連せず、ヒドロゲナーゼの酵素活性による水素の生成又は消費のみに関連する。
【0092】
「活性部位」という用語は、本発明の意味の範囲内で、三次構造が形成されると、例えばヒドロゲナーゼ活性などの当該ポリペプチドの触媒活性を担うポリペプチドの部分を指す。ポリペプチドの一部は、例えば、アミノ酸配列のいくつかの部分及び／又は１つ又は複数の非タンパク質リガンドとの結合を含むことができる。
【0093】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、リボヌクレオチドであるかデオキシヌクレオチドであるかにかかわらず、例えば共有結合によって互いに連結された少なくとも２つのヌクレオチドで構成される単鎖を指す。したがって、これには、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ及びＤＮＡが含まれる。「ポリヌクレオチド」の定義は、当該ポリヌクレオチドの長さも、機能も、形状も、当該ポリヌクレオチドが産生される方法も考慮していない。ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミド、プラスミドの一部、遺伝子又は遺伝子断片であってもよい。
【0094】
「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、宿主細胞に通常存在しないポリヌクレオチドを指す。例えば、外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞又はプラスミドに天然には存在しないポリペプチドをコードする配列であってもよい。
【0095】
「連結」という用語は、本発明の意味の範囲内で、例えばポリヌクレオチド配列の１つのみ又はポリペプチド配列を形成するためのいくつかの配列のストレッチを指す。
【0096】
「プラスミド」という用語は、本発明の意味の範囲内で、それ自体の複製起点のために自律複製が可能な、外因性染色体ＤＮＡとは異なる二本鎖ＤＮＡの分子を指す。プラスミドはまた、目的の他の配列、例えば、選択因子（抗生物質に対する耐性など）をコードする遺伝子、ポリヌクレオチドの付加を可能にする多重クローニング部位、及び／又は転写調節配列を含むことができる。「プラスミド」又は「発現ベクター」という用語は交換可能である。
【0097】
「宿主細胞」という用語は、本発明の意味の範囲内で、改変を受けた細胞を指す。この改変は、例えば、外因性ポリヌクレオチドを、例えばプラスミドを介して細胞に導入することであってもよい。
【0098】
「成熟因子」という用語は、本発明の意味の範囲内で、別の生物学的分子、例えばタンパク質の構造の形成に関与する任意の生物学的又は非生物学的分子を指す。
【0099】
「内因性成熟因子」という用語は、本発明の意味の範囲内で、別の生物学的分子、例えばタンパク質の構造の形成に関与し、宿主細胞内に天然に存在する、すなわち当該宿主細胞の遺伝子改変を伴わない任意の生物学的又は非生物学的分子を指す。
【0100】
「外因性成熟因子」という用語は、本発明の意味の範囲内で、別の生物学的分子、例えばタンパク質の構造の形成に関与し、宿主細胞に天然には存在しない、すなわち、例えば発現ベクターを添加することによって、当該外因性成熟因子を当該宿主細胞に添加するために当該宿主細胞の遺伝子改変が必要である、任意の生物学的又は非生物学的分子を指す。
【0101】
「単離された」という用語は、本発明の意味の範囲内で、その天然環境から除去された、例えば天然の［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼから除去された任意の分子を指す。
【0102】
「精製された」という用語は、本発明の意味の範囲内で、生化学的技術によって分離された任意の分子を指す。この定義は、例えば天然又は組換え、化学的又は酵素的合成によって分子が生成される方法も、精製のために実施される生化学的技術、例えばアフィニティクロマトグラフィ又はモレキュラーシーブも考慮していない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はＨ２を精製することができる。好ましくは、物質は、それに関連する他の成分に対して少なくとも６０％、好ましくはそれに関連する他の成分に対して７５％、好ましくはそれに関連する他の成分に対して９０％を表す場合に精製されている。
【0103】
「見かけの均一性」という用語は、本発明の意味の範囲内で、それに関連する他の成分に対して少なくとも９０％を占める任意の精製分子を指す。
【0104】
「同一性」という用語は、本発明の意味の範囲内で、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の構造的類似性を指す。構造的類似性は、２つの配列間のアラインメント、すなわち配列に沿った同一のヌクレオチドの数又は同一のアミノ酸の数を最適化するアラインメントによって決定される。一方又は両方の配列のホールは、アラインメント、したがって構造的類似性を最適化するために許容される。しかし、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列は同じままでなければならない。
【0105】
「遺伝物質」という用語は、本発明の意味の範囲内で、物質のゲノム、より正確にはこの物質の全ての核酸、含まれるコード配列及び非コード配列を指す。
【0106】
「遺伝子変異」という用語は、本発明の意味の範囲内で、物質、例えば宿主細胞又は発現ベクターの遺伝物質の偶発的又は誘発された改変を指す。
【0107】
「遺伝物質を含む物質」という用語は、本発明の意味の範囲内で、上記の定義による遺伝物質、例えば宿主細胞又はプラスミドなどの発現ベクターを含む物質を指す。
【0108】
「遺伝子改変された物質」という用語は、本発明の意味の範囲内で、上記の定義による遺伝物質を含み、その遺伝物質の改変、例えば遺伝子変異又はプラスミドなどを介した細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を受けた物質を指す。
【0109】
「遺伝子改変された宿主細胞」という用語は、本発明の意味の範囲内で、上記の定義による宿主細胞、その遺伝物質の改変、例えば遺伝子変異又はプラスミドなどを介した細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を受けた宿主細胞を指す。
【0110】
「遺伝子改変された発現ベクター」という用語は、本発明の意味の範囲内で、上記の定義による発現ベクター又はプラスミド、その遺伝物質の改変、例えば特定のポリペプチドをコードする遺伝子などの目的の配列の付加を受けた発現ベクター又はプラスミドを指す。
【0111】
本発明の他の特徴、詳細及び利点は、限定するものではなく、添付の図面を参照して、以下に示す例から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0112】
【図1】プラスミドｐＥＴ－２６ｂ（＋）（５３６０ｂｐ）のマップを示す図である。
【図2】ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩ制限酵素による発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨの消化のアガロースゲル分析を示す図である。
【図3】プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１（４００８ｂｐ）のマップを示す図である。
【図4】ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの消化のアガロースゲル分析を示す図である。
【図5】ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩ制限酵素による、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーのプラスミドＤＮＡに由来する発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨの消化のアガロースゲル分析を示す図である。
【図6】ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーのプラスミドＤＮＡに由来する発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの消化のアガロースゲル分析を示す図である。
【図7】目的のＨｏｘＨ組換えタンパク質の精製方法を示す図である。ＮＡ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティカラムに吸収されなかった試料。洗浄、１０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄緩衝液で溶出した試料。５０ｍＭ、５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。１００ｍＭ、１００ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。１５０ｍＭ、１５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。２００ｍＭ、２００ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。２５０ｍＭ、２５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。
【図8】アフィニティクロマトグラフィ中に収集された様々な画分のタンパク質組成のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す図である。ロード、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティカラムに適用され、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の溶解に由来する上清；ＮＡ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティカラムに吸収されなかった試料。洗浄、１０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄緩衝液で溶出した試料。Ｍ、分子量マーカー。５０ｍＭ、５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。１００ｍＭ、１００ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。１５０ｍＭ、１５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。２００ｍＭ、２００ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。２５０ｍＭ、２５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。
【図9】アフィニティクロマトグラフィ中に収集された様々な画分中のＨｏｘＨの存在の免疫検出分析（ウェスタンブロット）を示す図である。Ｍ、分子量マーカー。ロード、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティカラムに適用され、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の溶解に由来する上清。ＮＡ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティカラムに吸収されなかった試料；５０ｍＭ、５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。２００ｍＭ、２００ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した試料。
【図10】シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの構造の概略図である。ＨｏｘＥ、１９ｋＤａ及び１ＦｅＳ中心；ＨｏｘＦ、５７．５ＫＤａ、２ＦｅＳ中心及びＦＭＮ中心；ＨｏｘＵ、２６ＫＤａ及び４ＦｅＳ中心；ＨｏｘＹ、２０ＫＤａ及びＦｅＳ中心；ＨｏｘＨ、５３ＫＤａ及び活性部位。
【図11】シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼにおける電子伝達（影付き矢印）並びにＮＡＤＰＨ及びメチルビオロゲン（ＭＶ）との予想される相互作用の概略図である。
【図12】ＨｏｘＨ組換えタンパク質の活性部位がＭＶから電子を直接受け取ることができ、したがって追加の酸化還元リレーの非存在下で水素を生成することができるか否かについての疑問を提起する概略図である。
【図13】酸素の非存在下で亜ジチオン酸ナトリウムによって予め還元されたメチルビオロゲンを含有する試薬へのＨｏｘＨ組換えタンパク質の添加から生じる水素の生成によるヒドロゲナーゼ活性の強調示す図である。ＨｏｘＨは、ヒドロゲナーゼ触媒反応を表す式Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－に従って水素を生成するために、予め還元されたメチルビオロゲンの電子を受け取り、それらをプロトン（緩衝液中に存在する）と組み合わせることができる。試薬に溶解した水素のレベルは、マイクロセンサ（ユニセンス（登録商標）、デンマーク）を用いて連続的に測定される。矢印は、ＨｏｘＨ組換えタンパク質の添加が行われた瞬間を示し、瞬間は、マイクロセンサによって検出された溶解水素のレベルの増加に付随する。
【図14】Ｈ２の存在下でのベンジルビオロゲン（ＢＶ）を含有する試薬へのＨｏｘＨ組換えタンパク質の添加から生じるベンジルビオロゲンの還元によるヒドロゲナーゼ活性の強調を示す図である。ＨｏｘＨは、ヒドロゲナーゼ触媒反応を表す式Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－によるプロトンの生成と同時に、水素から電子を受け取り、それらを酸化還元メディエータ、例えばベンジルビオロゲンに移動させることができる。消費される水素のレベルは、還元ベンジルビオロゲンのレベルと同等であり、５７８ｎｍの波長で分光光度法によって連続的に測定することができるレベルである。
【図15】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して外因性のＨｕｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷ成熟因子の非存在下で産生されたＨｏｘＨ組換えタンパク質を、酸素の非存在下で亜ジチオン酸ナトリウムによって予め還元されたメチルビオロゲンを含有する試薬への添加から生じる水素の産生によるヒドロゲナーゼ活性の強調を示す図である。ＨｏｘＨは、ヒドロゲナーゼ触媒反応を表す式Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－に従って水素を生成するために、予め還元されたメチルビオロゲンの電子を受け取り、それらをプロトン（緩衝液中に存在する）と組み合わせることができる。
【発明を実施するための形態】
【0113】
例
１．ＨｏｘＨ発現ベクターの構築
１．１．ＨｏｘＨの「単純」配列
ＨｏｘＨは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含む大サブユニットに対応する。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１８０９１．１である。ＨｏｘＨの理論等電点は、５２９９６．５３ダルトンの理論分子質量に対して５．８６である。ＨｏｘＨのヌクレオチド配列（１４２５ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１と命名されている。
１．ＨｏｘＨ発現ベクターの構築
１．１．ＨｏｘＨの「単純」配列
ＨｏｘＨは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含む大サブユニットに対応する。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１８０９１．１である。ＨｏｘＨの理論等電点は、５２９９６．５３ダルトンの理論分子質量に対して５．８６である。ＨｏｘＨのヌクレオチド配列（１４２５ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１と命名されている。
【化1】
【0114】
ＨｏｘＨのアミノ酸配列（４７４ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号２と命名されている。
【化2】
【0115】
図１は、ｐＥＴ２６ｂ（＋）に配列番号３を挿入することによってＨｏｘＨ発現ベクターを構築するために使用されるプラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）のマップを示す。ｐＥＴ２６ｂ（＋）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点、カナマイシン耐性遺伝子、多数の制限部位を含むマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、Ｔ７プロモータ及びＴ７転写ターミネータを有する５３６０ｂｐプラスミドである。また、転写リプレッサーをコードするｌａｃＩ遺伝子を含む。転写のこの抑制は、ＩＰＴＧを加えることによって解除することができる。
【0116】
１．２．ＨｏｘＨの「最適化された」配列
場合により、本発明の一実施形態によれば、配列番号１及び配列番号２の配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコドン使用について最適化されている。特に、ＮｄｅＩ（ｃａｔａｔｇ）及びＢｌｐＩ（ｇｃｔｎａｇｃ）制限部位が、プラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）におけるクローニングのためのヌクレオチド配列の最初及び最後にそれぞれ付加され、配列ｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｔｃａｃ（以下に下線を引く）も付加される（タンパク質のＮ末端に近いポリヒスチジンタグをコードする配列）。
場合により、本発明の一実施形態によれば、配列番号１及び配列番号２の配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコドン使用について最適化されている。特に、ＮｄｅＩ（ｃａｔａｔｇ）及びＢｌｐＩ（ｇｃｔｎａｇｃ）制限部位が、プラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）におけるクローニングのためのヌクレオチド配列の最初及び最後にそれぞれ付加され、配列ｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｔｃａｃ（以下に下線を引く）も付加される（タンパク質のＮ末端に近いポリヒスチジンタグをコードする配列）。
【0117】
最適化されたヌクレオチド配列（１４５３ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号３と命名される。
【化3】
【0118】
最適化されたアミノ酸配列（４８０ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号４と命名される。
【化4】
【0119】
プラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）を使用して、ｐＥＴ２６ｂ（＋）に配列番号３を挿入することによってＨｏｘＨ発現ベクターを構築する。
【0120】
図２は、ＮｄｅＩ及びＢｌｐＩ制限酵素による発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨ（配列番号３）の消化の分析を示す。約５３００ｂｐ（線状化ｐＥＴ２６ｂ（＋））及び約１５００ｂｐ（プラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）から切り出されたＨｏｘＨ配列）の２つのＤＮＡ断片が強調されている。これにより、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）中の目的のＨｏｘＨ配列の存在が確認される。
【0121】
２．少なくとも１つの成熟因子の発現ベクターの構築
本発明の文脈では、少なくとも以下の成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷが考慮される。
本発明の文脈では、少なくとも以下の成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷが考慮される。
【0122】
ＨｙｐＡは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現／形成タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１８３５７．１である。ＨｙｐＡの理論等電点は、１２７７３．４７ダルトンの理論分子量に対して４．９４である。ＨｙｐＡのヌクレオチド配列（３４２ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号５と命名されている。
【化5】
【0123】
ＨｙｐＡのアミノ酸配列（１１３ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号６と命名されている。
【化6】
【0124】
ＨｙｐＢは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現／形成タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１８３１２．１である。ＨｙＢの理論等電点は、３１２４２．９７ダルトンの理論分子量に対して５．７５である。ＨｙｐＢのヌクレオチド配列（８５８ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号７と命名されている。
【化7】
【0125】
ＨｙｐＢのアミノ酸配列（２８５ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号８と命名されている。
【化8】
【0126】
ＨｙｐＣは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現／形成タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１８１８０．１である。ＨｙｐＣの理論等電点は、７９８７．４２ダルトンの理論分子量に対して４．２０である。ＨｙｐＣのヌクレオチド配列（２３１ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号９と命名されている。
【化9】
【0127】
ＨｙｐＣのアミノ酸配列（７６ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１０と命名されている。
【化10】
【0128】
ＨｙｐＤは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現／形成タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１６６２２．１である。ＨｙｐＤの理論等電点は、４０６３２．９４ダルトンの理論分子質量に対して６．３１である。ＨｙｐＤのヌクレオチド配列（１１２５ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１１と命名されている。
【化11】
【0129】
ＨｙｐＤのアミノ酸配列（３７４ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１２と命名されている。
【化12】
【0130】
ＨｙｐＥは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現／形成タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１７４７８．１である。ＨｙｐＥの理論等電点は、３６４２５．６０ダルトンの理論分子質量に対して４．９３である。ＨｙｐＥのヌクレオチド配列（１０３８ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１３と命名されている。
【化13】
【0131】
ＨｙｐＥのアミノ酸配列（３４５ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１４と命名されている。
【化14】
【0132】
ＨｙｐＦは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの発現／形成タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１０１５４．１である。ＨｙｐＦの理論等電点は、８５３５８．２５ダルトンの理論分子質量に対して８．１９である。ＨｙｐＦのヌクレオチド配列（２３０４ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１５と命名されている。
【化15】
【0133】
ＨｙｐＦのアミノ酸配列（７６７ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１６と命名されている。
【化16】
【0134】
ＨｏｘＷは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３の仮説的タンパク質である。Ｇｅｎｂａｎｋのタンパク質の受託番号はＢＡＡ１７６８０．１である。ＨｏｘＷの理論等電点は、１７１２９．５３ダルトンの理論分子質量に対して４．９３である。ＨｏｘＷのヌクレオチド配列（４７４ｂｐ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１７と命名されている。
【化17】
【0135】
ＨｏｘＷのアミノ酸配列（１５７ａａ）は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１８と命名されている。
【化18】
【0136】
場合により、本発明による一実施形態によれば、成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷの全てが、連結ヌクレオチド配列（６５１５ｂｐ）の形態で組み立てられる。このヌクレオチド配列は、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１プラスミドにおいてクローニングを行うために、配列の最初にＮｃｏＩ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）を含み、配列の最後にＡｖｒＩＩ制限部位（ＣＣＴＡＧＧ）を含む。この連結ヌクレオチド配列は以下の通りであり、本発明の文脈において配列番号１９と命名されている。
【化19-1】
【化19-2】
【化19-3】
【0137】
図３は、配列番号５及び／又は配列番号７及び／又は配列番号９及び／又は配列番号１１及び／又は配列番号１３及び／又は配列番号１５及び／又は配列番号１７及び／又は配列番号１９をｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１に挿入することにより、成熟因子ＨｙｐＡ、ＨｙｐＢ、ＨｙｐＣ、ＨｙｐＤ、ＨｙｐＥ、ＨｙｐＦ及びＨｏｘＷの少なくとも１つの発現ベクターを構築するために使用したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１プラスミドのマップを表す。ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１は、４００８ｂｐのプラスミドであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点、クロラムフェニコール耐性遺伝子、多数の制限部位を含む２つの多重クローニング部位（ＭＣＳ）、Ｔ７プロモータ及びＴ７転写ターミネータを有する。また、転写リプレッサーをコードするｌａｃＩ遺伝子を含む。転写のこの抑制は、ＩＰＴＧを加えることによって解除することができる。
【0138】
図４は、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷ（連結配列の配列番号１９）の消化の分析を示す。発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷのこのような酵素消化について予想されるように、約６０００ｂｐ及び約４０００ｂｐの２つのＤＮＡ断片が強調される。これにより、発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１中の配列ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの存在が確認される。
【0139】
３．発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への導入。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコンピテント細胞（ＤＥ３）ＢＬ２１を、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのＨｏｘＨサブユニットの組換え発現に使用した。これらの細胞は、Ｔ７プロモータの制御下で組換えタンパク質の産生のために日常的に使用される。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコンピテント細胞（ＤＥ３）ＢＬ２１を、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのＨｏｘＨサブユニットの組換え発現に使用した。これらの細胞は、Ｔ７プロモータの制御下で組換えタンパク質の産生のために日常的に使用される。
【0140】
２つの発現ベクター「ｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨ」及び「ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷ」を、当業者に周知の従来のヒートショック法による共形質転換によってこれらの細胞に導入した。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）に対して二重耐性を有する形質転換体を、寒天培地上に４℃で保存した。
【0141】
４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における目的のＤＮＡ配列の存在の検証。
ただし、いくつかのコロニーは、目的のＤＮＡ配列、すなわちＨｏｘＨ及びＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷを有することなく、使用される選択マーカーに対する耐性を可能にする２つのプラスミドを有することが可能である。したがって、目的のこれらのＤＮＡ配列の存在を検証することが重要である。当業者に周知であり、コロニーからのプラスミドＤＮＡの抽出、続いてプラスミド中への目的のＤＮＡ配列の挿入の間に使用される制限酵素による、このプラスミドＤＮＡの酵素消化からなる実験を行った。
ただし、いくつかのコロニーは、目的のＤＮＡ配列、すなわちＨｏｘＨ及びＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷを有することなく、使用される選択マーカーに対する耐性を可能にする２つのプラスミドを有することが可能である。したがって、目的のこれらのＤＮＡ配列の存在を検証することが重要である。当業者に周知であり、コロニーからのプラスミドＤＮＡの抽出、続いてプラスミド中への目的のＤＮＡ配列の挿入の間に使用される制限酵素による、このプラスミドＤＮＡの酵素消化からなる実験を行った。
【0142】
したがって、プラスミドＤＮＡの抽出を、当業者に周知のプロトコルに従って、カナマイシン及びクロラムフェニコールに対する二重耐性を有するコロニーで行った。
【0143】
次いで、当業者に周知のプロトコルに従って酵素消化を行った。ＮｄｅＩ制限酵素及びＢｌｐＩ制限酵素による発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨの消化により、２つのＤＮＡ断片、それぞれ５３００ｂｐの線状化プラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）及び１５００ｂｐの目的のＨｏｘＨ ＤＮＡ断片が得られる（図５参照）。ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素による発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの消化により、２つのＤＮＡ断片、それぞれ４０００ｂｐの線状化プラスミドｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１及び６５００ｂｐの目的のＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷ ＤＮＡ断片が得られる（図６参照）。これにより、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）及びＰＡＣＹＣＤｕｅｔ－１においてそれぞれＨｏｘＨ及びＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷ配列の細菌コロニーにおける存在が確認される。
【0144】
５．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＨｏｘＨの組換え産生及びアフィニティクロマトグラフィによる精製。
シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのＨｏｘＨサブユニットの組換え形態を得るために、２つの発現ベクターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを使用して、それぞれ２５０ｍの体積を有する４つの三角フラスコに接種した。使用した培地は、１００μＭ ＦｅＡｍＣｉ、５０μＭ ＮｉＳＯ４、５０μＭシステイン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した２ＸＹＴ培地（１リットル当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ）である。１．２の光学密度（ＤＯ６００ｎｍ）で、ＨｏｘＨサブユニットの組換え産生を誘導するために、１８℃で２００ｒｐｍの撹拌（撹拌速度）下で０．２ｍＭ ＩＰＴＧを培養物に添加する。産生時間は１８℃で２０時間である。次いで、遠心分離（４５００ｒｐｍで１５分間）によって細胞を回収し、精製プロセスを開始する。
シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのＨｏｘＨサブユニットの組換え形態を得るために、２つの発現ベクターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを使用して、それぞれ２５０ｍの体積を有する４つの三角フラスコに接種した。使用した培地は、１００μＭ ＦｅＡｍＣｉ、５０μＭ ＮｉＳＯ４、５０μＭシステイン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した２ＸＹＴ培地（１リットル当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、５ｇのＮａＣｌ）である。１．２の光学密度（ＤＯ６００ｎｍ）で、ＨｏｘＨサブユニットの組換え産生を誘導するために、１８℃で２００ｒｐｍの撹拌（撹拌速度）下で０．２ｍＭ ＩＰＴＧを培養物に添加する。産生時間は１８℃で２０時間である。次いで、遠心分離（４５００ｒｐｍで１５分間）によって細胞を回収し、精製プロセスを開始する。
【0145】
シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのＨｏｘＨサブユニットの組換え型の産生を確認するために、精製方法を開発した。この方法（図７参照）は、単一のアフィニティクロマトグラフィ工程でＨｏｘＨを見かけの均一性まで精製する。この方法は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を含む。キレート剤は、不動相と金属イオンとの間の結合を可能にするニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）である。固定化金属は、ニッケル（Ｎｉ）である。このクロマトグラフィは、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質の非常に特異的な分離を可能にする。１８℃で２０時間のＨｏｘＨの組換え産生後、１リットルの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養物を遠心分離（４５００ｒｐｍで１５分）によって回収する。細胞を２５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＫＣｌ＋２μｌベンゾナーゼ＋５０μｌ ＭｇＣｌ２ １Ｍ＋ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤のカクテルからなる１ペレット）に再懸濁し、次いでフレンチプレスによって溶解する。上清（２５ｍｌ）を遠心分離（１５０００ｒｐｍで１５分間）によって回収し、濾過し（０．４５μｍ）、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭイミダゾール）中で予め平衡化したＮｉ－ＮＴＡカラム（１ｍｌ）に適用する。次いで、２８０ｎｍでの吸光度（タンパク質濃度を表す）が０に低下するまで、カラムを３５ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＫＣｌ＋１０ｍＭイミダゾール）で洗浄する。次いで、イミダゾールの濃度をそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ及び２５０ｍＭに増加させながら５段階で溶出を行う（図７参照）。
【0146】
クロマトグラフィ中に得られた様々な画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ及び２５０ｍＭイミダゾールの濃度で溶出した画分中のＨｏｘＨサブユニットの予想サイズである５４ｋＤａに近い主なバンドを示す（図８を参照）。ＨｏｘＨはまた、１５０ｍＭ、２００ｍＭ及び２５０ｍＭのイミダゾールの濃度で溶出された画分に追加のバンドが見られないので、優れた純度を示す。これにより、ＨｏｘＨが単一のアフィニティクロマトグラフィ工程で見かけの均一性まで精製されたと結論付けることができる。
【0147】
実際にシネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含むＨｏｘＨサブユニットの組換え形態であることを確認するために、ポリヒスチジン抗タグ抗体を使用する免疫検出を行った（図９参照）。ポリヒスチジンタグで標識されたタンパク質を含む分子量マーカーを添加して陽性対照とした。ＨｏｘＨ組換えタンパク質は、ロード、すなわち大腸菌の細胞の溶解に由来し、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティカラムに適用された上清において十分に検出される。ＨｏｘＨ組換えタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡカラムによって吸収されない画分にも存在する。これは、Ｎｉ－ＮＴＡカラムのローディング容量を超え、ＨｏｘＨ組換えタンパク質の一部がカラムに結合できなかったことを示している。「５０ｍＭ溶出画分」にはシグナルは現れない。ＨｏｘＨ組換えタンパク質は、この低いイミダゾール濃度でＮｉ－ＮＴＡカラムに結合したままである。最後に、ＨｏｘＨ組換えタンパク質の存在は、予想されるサイズ、すなわち５４ｋＤａに近い２００ｍＭ画分での免疫検出によって確認される。これにより、単一のアフィニティクロマトグラフィ工程におけるＨｏｘＨ組換えタンパク質の精製が明確に確認される。ＨｏｘＨ組換えタンパク質が画分中の免疫検出によって強調される場合、低強度のいくつかのバンドも５４ｋＤａ未満の分子量で現れる。これはおそらく、Ｃ末端で部分的に分解されたＨｏｘＨ組換えタンパク質である。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析はこれらのバンドの存在を示さないので、分解されたＨｏｘＨ組換えタンパク質の割合は最小限のようである。注意すべきこととして、免疫検出は、非常に少量のタンパク質を強調する非常に高感度の方法である。
【0148】
６．ＨｏｘＨ組換えタンパク質におけるヒドロゲナーゼ活性の強調
［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼを組換え発現する能力は、天然の酵素とは非常に異なる特性を有する変異型を生成するという観点で、広範囲の可能性がある。図１０は、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの構造を示す。ＮＡＤＰＨは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるインビボでのＨｏｘＥＦＵＹＨの補因子である。メチルビオロゲン（ＭＶ）は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの標準的なインビトロ活性試験における酸化還元メディエータとして使用される。図１１は、電子伝達（影付き矢印）並びにＨｏｘＥＦＵＹＨとＮＡＤＰＨ及び／又はＭＶとの間の予想される相互作用の概略図である。
［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼを組換え発現する能力は、天然の酵素とは非常に異なる特性を有する変異型を生成するという観点で、広範囲の可能性がある。図１０は、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの構造を示す。ＮＡＤＰＨは、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３におけるインビボでのＨｏｘＥＦＵＹＨの補因子である。メチルビオロゲン（ＭＶ）は、［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの標準的なインビトロ活性試験における酸化還元メディエータとして使用される。図１１は、電子伝達（影付き矢印）並びにＨｏｘＥＦＵＹＨとＮＡＤＰＨ及び／又はＭＶとの間の予想される相互作用の概略図である。
【0149】
ＦＭＮを回避することによってＭＶが１つ又は複数のＦｅＳ中心に電子を直接伝達できることは、当業者であれば一般に習得していることである。しかし、図１２に示されるように、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含む単一のＨｏｘＨサブユニットが、ＭＶから電子を直接受け取ることができ、したがって追加の酸化還元リレーの非存在下で水素を生成することができるかどうかは現在知られていない。
【0150】
本発明の文脈において、この可能性を試験するために、亜ジチオン酸ナトリウムによって予め還元されたＨｏｘＨ組換えタンパク質及びＭＶの存在下での［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの標準的なインビトロ活性試験を実施する（図１３参照）。ＨｏｘＨは、ヒドロゲナーゼ触媒反応を表す式Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－に従って水素を生成するために、予め還元されたメチルビオロゲンから電子を受け取り、それらを緩衝液中に存在するプロトンと組み合わせることができる。当業者に周知のプロトコルによる［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのこの標準的なインビトロ活性試験は、気密及び窒素脱気セプタムによって閉鎖された２ｍｌフラスコの使用を含むものである。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８に溶解した１００ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム及び１０ｍＭ ＭＶから構成され、また窒素脱気した反応混合物１ｍｌを、シリンジを用いてフラスコに添加する。２００μｇのＨｏｘＨ組換えタンパク質も反応混合物に添加する。水素生成は、ＨｏｘＨ組換えタンパク質が添加された瞬間から始まる（瞬間は図１３の矢印で示される）。タンパク質含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ．１９７６．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７２：２４８－２５４）によって決定した。水素生成は、事前に較正された水素マイクロセンサ（デンマーク、オーフスのユニセンス社）を使用して連続的に監視される。
【0151】
したがって、ＨｏｘＨ組換えタンパク質の活性は、添加されたＨｏｘＨ組換えタンパク質の量（ｍｇ．ｍｌ－１中）が既知であり、添加されたこの特定量の組換えタンパク質の水素発生速度（μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１）も既知であるため、計算することができる。この比活性は、例えば、０．１μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素であってもよい。
【0152】
予想外かつ驚くべきことに、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含む単一の触媒性ＨｏｘＨサブユニットが、酸化還元リレーとして機能する追加のＦｅＳ中心を介さずに酸化還元メディエータ（例えば、メチルビオロゲン）から電子を受け取り、プロトンの還元を触媒することができるという事実が、本発明の文脈において強調されている。
【0153】
本発明の文脈において、ＨｏｘＨ組換えタンパク質、ベンジルビオロゲン及び水素の存在下での［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの標準的なインビトロ活性試験も実施する（図１４参照）。ＨｏｘＨは、式Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－により水素から電子を受け取って、それらをベンジルビオロゲンに供与し、その過程でプロトンを生成することができる。当業者に周知のプロトコルによる［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのこの標準的なインビトロ活性試験は、気密及び水素ガス飽和セプタムによって閉鎖された２ｍｌフラスコの使用を含むものである。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．６に溶解した４０μｍｏｌのベンジルビオロゲンから構成され、水素脱気した反応混合物２ｍｌを、シリンジを用いてフラスコに添加する。実験は４０℃で行う。３４０μｇのＨｏｘＨ組換えタンパク質も反応混合物に添加する。水素の消費、したがってベンジルビオロゲンの還元は、ＨｏｘＨ組換えタンパク質が添加された瞬間から始まる。タンパク質含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ．１９７６．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７２：２４８－２５４）によって決定した。ベンジルビオロゲンの還元を、５７８ｎｍの波長で分光光度法によって監視する。８，６００Ｍ－１ｃｍ－１のモル吸光係数を考慮に入れた。
【0154】
したがって、ＨｏｘＨ組換えタンパク質の活性は、添加されたＨｏｘＨ組換えタンパク質の量（ｍｇ．ｍｌ－１中）が既知であり、添加された特定の量の組換えタンパク質に対するベンジルビオロゲンの還元速度と同等である水素消費速度（μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１）も既知であるため、計算することができる。この比活性は、例えば、０．１μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素であってもよい。
【0155】
予想外かつ驚くべきことに、シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含む単一の触媒性ＨｏｘＨサブユニットが、酸化還元リレーとして機能する追加のＦｅＳ中心を介さずに、水素の酸化を触媒してプロトンを生成し、酸化還元メディエータ（例えば、ベンジルビオロゲン）に電子を供与することができるという事実が、本発明の文脈において強調されている。
【0156】
ＨｏｘＥＦＵＹＨ五量体の他のサブユニットの発現がない場合、先行技術に固有の問題は少なくとも部分的に解決され、ＨｏｘＨ組換えタンパク質は、単独でプロトンの還元を触媒し、酸化還元リレーとして機能する追加のＦｅＳ中心を介することなく酸化還元メディエータ（例えば、メチルビオロゲン）から電子を受け取ることができる。ＨｏｘＨタンパク質はまた、それ自体でＨ２の酸化を触媒することができ、酸化還元リレーとして機能する追加のＦｅＳ中心を介さずに酸化還元メディエータ（例えばベンジルビオロゲン）を還元する。この例外的な特徴は、本発明の大きな利点、特に［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を有し、触媒活性である単一サブユニットの組換え産生を実証する。
【0157】
７．外因性成熟因子の非存在下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換え生産されたＨｏｘＨ組換えタンパク質における組換え産生、アフィニティクロマトグラフィによる精製及びヒドロゲナーゼ活性の強調表示
上記の例３と同様の方法で、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨを、当業者に周知の熱ショックの従来の方法により、これを発現ベクターｐＡＣＹＣＤＵＥＴ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの非存在下で形質転換することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入する。形質転換体は、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性を有する。
上記の例３と同様の方法で、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）＋ＨｏｘＨを、当業者に周知の熱ショックの従来の方法により、これを発現ベクターｐＡＣＹＣＤＵＥＴ－１＋ＨｙｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの非存在下で形質転換することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入する。形質転換体は、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性を有する。
【0158】
上記の例４と同様の方法で、目的のＨｏｘＨ ＤＮＡ配列の存在を、プラスミドＤＮＡの抽出及び酵素消化である、当業者に周知の一連の実験によって検証した。
【0159】
上記の例５と同様の方法で、外因性成熟因子ＨｕｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷをコードするプラスミドｐＡＣＹＣＤＵＥＴ－１＋ＨｕｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの非存在下で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でＨｏｘＨタンパク質を組換え産生した。次いで、上記の例５と同様の方法で、ＨｏｘＨタンパク質をアフィニティクロマトグラフィによって精製した。
【0160】
上記の例６と同様の方法で、外因性成熟因子の非存在下で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え産生されたＨｏｘＨタンパク質のヒドロゲナーゼ活性を、ＭＶを含む、当業者に周知のプロトコルに従って強調した。
【0161】
本発明の文脈内で、亜ジチオン酸ナトリウムによって予め還元されたＨｏｘＨ組換えタンパク質及びＭＶの存在下での［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの標準的なインビトロ活性試験を実施した（図１５参照）。ＨｏｘＨは、ヒドロゲナーゼ触媒反応を表す式Ｈ２←→２Ｈ＋＋２ｅ－に従って水素を生成するために、予め還元されたメチルビオロゲンから電子を受け取り、それらを緩衝液中に存在するプロトンと組み合わせることができる。当業者に周知のプロトコルによる［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼのこの標準的なインビトロ活性試験は、気密及び窒素脱気セプタムによって閉鎖された２ｍｌフラスコの使用を含むものである。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．８に溶解した１００ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム及び１０ｍＭ ＭＶから構成され、また窒素脱気した反応混合物１ｍｌを、シリンジを用いてフラスコに添加する。７５０μｇのＨｏｘＨ組換えタンパク質も反応混合物に添加する。水素生成は、ＨｏｘＨ組換えタンパク質が添加された瞬間から始まる（瞬間は図１５の矢印で示される）。タンパク質含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ．１９７６．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７２：２４８－２５４）によって決定した。水素生成は、事前に較正された水素マイクロセンサ（デンマーク、オーフスのユニセンス社）を使用して連続的に監視される。
【0162】
したがって、ＨｏｘＨ組換えタンパク質の活性は、添加されたＨｏｘＨ組換えタンパク質の量（ｍｇ．ｍｌ－１中）が既知であり、添加されたこの特定量の組換えタンパク質の水素発生速度（μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１）も既知であるため、計算することができる。この比活性は、例えば、０．１μｍｏｌ Ｈ２．ｍｉｎ－１．ｍｇ－１の酵素であってもよい。
【0163】
シネコキスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）ＰＣＣ６８０３由来のＨｏｘＥＦＵＹＨ ［ＮｉＦｅ］－ヒドロゲナーゼの活性部位を含む単一の触媒性ＨｏｘＨサブユニットが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にとって外因性の成熟因子ＨｕｐＡＢＣＤＥＦＨｏｘＷの介入なしに酸化還元メディエータ（例えば、メチルビオロゲン）から電子を受け取り、プロトンの還元を触媒することができるという事実が、本発明の文脈において強調されている。
【0164】
本発明は、純粋に例示的な値を有する特定の実施形態に関連して説明されており、限定的であると見なされるべきではない。一般に、本発明が例示及び／又は上述の例に限定されないことは、当業者には明らかであろう。
【0165】
動詞「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、又は任意の他の変形、並びにそれらの活用形の使用は、言及されたもの以外の要素の存在を決して除外することはできない。
【0166】
要素を導入するための不定冠詞「ａ」、「ａｎ」、又は定冠詞「ｔｈｅ」の使用は、これらの要素の複数の存在を排除するものではない。
【配列表フリーテキスト】
【0167】
配列表３ ＜２２３＞最適化されたＮｉＦｅ－ヒドロゲナーゼＨｏｘＥＦＵＹＨ
配列表３ ＜２２３＞Ｎｄｅｌ制限部位
配列表３ ＜２２３＞ポリヒスチジンタグ
配列表３ ＜２２３＞ＢｌｐＩ制限部位
配列表１９ ＜２２３＞最適化された発現配列
配列表１９ ＜２２３＞ＮｃｏＩ制限部位
配列表１９ ＜２２３＞ＡｖｒＩＩ制限部位
配列表３ ＜２２３＞Ｎｄｅｌ制限部位
配列表３ ＜２２３＞ポリヒスチジンタグ
配列表３ ＜２２３＞ＢｌｐＩ制限部位
配列表１９ ＜２２３＞最適化された発現配列
配列表１９ ＜２２３＞ＮｃｏＩ制限部位
配列表１９ ＜２２３＞ＡｖｒＩＩ制限部位
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】