ホーム > 特許ランキング > Ａｌｏｐｅｘｘ， Ｉｎｃ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-20
(54)【発明の名称】低汚染抗菌ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/385 20060101AFI20230113BHJP
A61K 39/08 20060101ALI20230113BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230113BHJP
【ＦＩ】
A61K39/385
A61K39/08
A61P31/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022527785
(86)(22)【出願日】2020-11-11
(85)【翻訳文提出日】2022-07-11
(86)【国際出願番号】 US2020059959
(87)【国際公開番号】W WO2021096921
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】62/934,925
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522172759
【氏名又は名称】アロペックス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ａｌｏｐｅｘｘ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ワイアンド，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】パテル，スマン
(72)【発明者】
【氏名】スウィス，ジェラルド エフ
【テーマコード（参考）】
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085AA27
4C085BA12
4C085BB24
4C085CC07
4C085EE01
4C085GG01
(57)【要約】
オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む抗菌ワクチンを開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
薬学的に許容される賦形剤と、リンカーを介して破傷風トキソイド担体に連結した、少なくとも１０、好ましくは約１０～約４０個のオリゴマーβ－（１→６）－グルコサミン基単位を含む有効量のワクチンとを含むワクチン組成物であって、前記オリゴマーは、３～１２個の繰り返しβ－（１→６）－グルコサミン単位を含み、ただし、そのような単位の総数の約４０数パーセント未満がＮ－アセチル化されており、前記ワクチン組成物は、約１００，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を約３パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な５パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み、
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、前記ワクチンにおける前記トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物。
【請求項2】
薬学的に許容される賦形剤と、リンカーを介して破傷風トキソイド担体に連結した、少なくとも２５、好ましくは約３０～約４０個のオリゴマーβ－（１→６）－グルコサミン基単位を含む有効量のワクチンとを含むワクチン組成物であって、前記オリゴ糖基は、３～１２個の繰り返しβ－（１→６）－グルコサミン単位を含み、ただし、そのような単位の総数の約４０数パーセント未満がＮ－アセチル化されており、前記ワクチン組成物は、それぞれが５０，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な５パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み、
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、前記トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物。
【請求項3】
薬学的に許容される賦形剤、および有効量の式Ｉ：（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは、以下の式：
【化1】
【化2】
式の左側はＣに付着し、右側はＡに付着しており；Ｃは破傷風トキソイドであり；
ｘは約１０から約４０までの整数であり；
ｙは、１から１０までの整数であり；
Ｒは水素またはアセチルであり、ただし、前記Ｒ基の４０％以下がアセチルである）
のワクチン化合物を含むワクチン組成物であって、
前記組成物は、約１００，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３パーセント未満含み、前記重量パーセントは、ワクチン化合物の重量に基づいており、
さらに、前記組成物は、検出可能な約５パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み、
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、前記トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物。
【請求項4】
式Ｉの前記化合物が、式ＩＩ：（Ａ’－Ｂ）ｘ－Ｃ ＩＩ
（式中、Ａ’は、以下の式：
【化3】
によって表される、請求項３に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１３日出願の米国特許仮出願第６２／９３４，９２５号に対する優先権を主張し、当仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月１３日出願の米国特許仮出願第６２／９３４，９２５号に対する優先権を主張し、当仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む組成物に関する。ポリマー中の前記Ｎ－アセチル基の最大約２０パーセントが脱アセチル化されているポリマーＮ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミン構造（「ＰＮＡＧ構造」）を含む細胞壁構造を有する微生物に対する免疫を提供するこれらのワクチン組成物。
【背景技術】
【0003】
リンカーを介してトキソイド担体に付着したオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン抗原を含むワクチンが公知である。これらのワクチンは、それらの細胞壁にＰＮＡＧ構造を含む微生物に対して細胞毒性を示す抗体をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で生成する。そのように生成された抗体は、免疫系の補体および他の成分と組み合わさって、これらの微生物を殺傷する。
【0004】
オリゴ糖の複数のコピーが結合した担体として破傷風トキソイドを使用するワクチンは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国シリアル番号１０／７１３，７９０に開示される。従来、オリゴ糖基のトキソイドへの付着は、トキソイド上の反応性アミノ基（例えば、リジン残基に見られる－ＮＨ２）への共有リンカーを介して行われる。化学は十分に確立されているが、トキソイド化学を扱う際には多くの複雑な問題がある。
【0005】
第１に、破傷風トキソイドは、破傷風毒素を、それを無毒にするが依然として抗原性にするホルムアルデヒドなどの化学物質で処理することによって調製される。ホルムアルデヒドは毒素の反応性アミノ基と反応する。さらに、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸を加えて、トキソイドを安定させ、毒素への復帰を抑制する。第２に、未反応量のグリシンとリジンに加えて、製造プロセスにより、毒素／トキソイドの断片がトキソイド組成物に排出される。これらの断片には、１つまたは複数のアミノ基が含まれている。
【0006】
次に、破傷風トキソイドは、２つの官能基を有するスペーサーアームと反応する－トキソイド上の反応性アミノ基と結合する第１の官能基と、アグリコン上の相補的官能基と反応する第１の官能基に直交する第２の官能基とである。さらに、スペーサーアームは、加えられるオリゴ糖とトキソイドの間の距離を広げる。次に、オリゴ糖アグリコンは、スペーサーアームが担持された破傷風トキソイドと組み合わさって、ワクチン化合物を形成する。これは、次の反応スキームに示される：
【0007】
【化1】
【0008】
上記の反応における１つの問題は、オリゴ糖アグリコンのトキソイドへのカップリング中に、トキソイド組成物中に汚染物質を含有するこれらのアミノ基が存在することから生じる。具体的には、これらのアミノ基はまた、スペーサーアームの第１の反応性官能基と反応する可能性があり、これにより、次いでスペーサーアームの第２の反応性官能基がアグリコンの相補的官能基と反応し、オリゴ糖アグリコンの喪失とワクチン組成物中の望ましくない不純物生成の両方が生じ得る。これは、以下の反応に示される：
【0009】
【化2】
【0010】
これらのオリゴ糖－リンカー－ＮＨ汚染物質は、特に分子量が約１００，０００以下のものは望ましくない。
【0011】
加えて、破傷風トキソイドは、トキソイドがモノマー、ダイマー、トリマーおよび高次オリゴマー形態（例えば、４～１０トキソイド単位）で存在することができるように、オリゴマー化する傾向がある。オリゴマー化が高次になると、オリゴマー化のためにモノマーベースごとに利用可能な表面積が減少するので、モノマーごとにトキソイドに結合できるオリゴ糖の数は減少する。したがって、トリマー以上などのトキソイドのオリゴマーはあまり望ましくない。面倒な精製プロセスによりモノマー破傷風トキソイドを提供することができるが、これらのプロセスは、モノマーが時間の経過とともに再びオリゴマー化する傾向があるという事実によって複雑になる。
【発明の概要】
【0012】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される賦形剤と、リンカーを介して破傷風トキソイド担体に連結した、少なくとも１０、好ましくは約１０～約４０個のオリゴマーβ－（１→６）－グルコサミン基単位を含む有効量のワクチンとを含むワクチン組成物であって、前記オリゴマーは、３～１２個の繰り返しβ－（１→６）－グルコサミン単位を含み、ただし、そのような単位の総数の約４０数パーセント未満がＮ－アセチル化されており、
前記ワクチン組成物は、それぞれが１００，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な１０パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み；
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物を提供する。
前記ワクチン組成物は、それぞれが１００，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な１０パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み；
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物を提供する。
【0013】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される賦形剤と、リンカーを介して破傷風トキソイド担体に連結した、少なくとも２５、好ましくは約３０～約４０個のオリゴマーβ－（１→６）－グルコサミン基単位を含む有効量のワクチンとを含むワクチン組成物であって、オリゴ糖基は、３～１２個の繰り返しβ－（１→６）－グルコサミン単位を含み、ただし、そのような単位の総数の約４０数パーセント未満がＮ－アセチル化されており、
前記ワクチン組成物は、５０，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３重量パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な５パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み；
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物を提供する。
前記ワクチン組成物は、５０，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３重量パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な５パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み；
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物を提供する。
【0014】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、および有効量の式Ｉ：
（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは、以下の式：
（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは、以下の式：
【0015】
【化3】
【0016】
【化4】
式の左側はＣに付着し、右側はＡに付着しており；Ｃは破傷風トキソイドであり；
ｘは約１０から約４０までの整数であり；
ｙは、１から１０までの整数であり；
Ｒは水素またはアセチルであり、ただし、Ｒ基の４０％以下がアセチルである）
のワクチン化合物を含むワクチン組成物であって、
前記組成物は、約１００，０００未満の分子量を有する検出可能な不純物を３パーセント未満含み；
さらに、前記組成物は、検出可能な約５パーセント未満の高次オリゴマーを含むモノマーおよびダイマートキソイドを含み、
なおさらに、前記組成物は、変性を誘発せずに、トキソイドのオリゴマー化を阻害するのに十分な温度に維持される、ワクチン組成物に関する。
【0017】
上記のワクチン組成物の一実施形態では、そこで使用されるワクチン化合物は、式ＩＩ：によって表され、
（Ａ’－Ｂ）ｘ－Ｃ ＩＩ
式中、Ａ’は、以下の式：
（Ａ’－Ｂ）ｘ－Ｃ ＩＩ
式中、Ａ’は、以下の式：
【0018】
【化5】
【0019】
一実施形態では、本発明のワクチンは、細胞壁に、ポリマーのＮ－アセチル基が最大２０パーセント脱アセチル化されているポリマーＮ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物からの患者に対する有効な免疫を提供する。
【0020】
一実施形態では、本発明は、細胞壁に、ポリマーのＮ－アセチル基が最大２０パーセント脱アセチル化されているポリマーＮ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物からの有効な免疫を患者に付与する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【0021】
本発明の代表的なワクチン化合物を以下の表に示す。
【0022】
【化6】
【0023】
【表1】
【0024】
一実施形態では、本発明の組成物は、１ミクロン未満の粒径を有するオリゴ糖結合汚染物質を約０．５重量パーセント以下含み、前記重量パーセントは、ワクチン化合物の重量に基づく。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
本発明は、オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む医薬組成物を提供する。
【0027】
本明細書に記載のワクチン組成物は、微生物感染に対し患者に有効な免疫を提供し、前記微生物は、その細胞壁にオリゴマーＮ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミン構造を含み、ポリマーの前記Ｎ－アセチル基が最大２０パーセント脱アセチル化されている。
【0028】
本発明をより詳細に説明する前に、以下の用語を最初に定義する。本明細書で使用される用語が定義されていない場合、それは一般的に受け入れられている科学的または医学的意味を有する。
【0029】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定する意図はない。本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形も含むことが意図される。
【0030】
「適宜の」または「適宜に」とは、その後に説明される事象または状況が発生してもよく、または発生しなくてもよいことを意味し、説明には、この事象または状況が発生する例および発生しない例が含まれる。
【0031】
数値指定の前に「約」という用語が使用される場合、例えば、温度、時間、量、濃度、および範囲を含むその他のものは、（＋）または（－）１０％、５％、１％、またはその間のいずれかの部分範囲もしくは部分値だけ変動し得る近似値を示す。好ましくは、用量に関して使用される場合の「約」という用語は、用量が＋／－１０％変動し得ることを意味する。
【0032】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、組成物および方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」とは、述べられた目的のために、組合せにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求された発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を除外しないであろう。「からなる」とは、微量元素を超える他の成分および実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【0033】
本明細書で使用される場合、「検出可能な不純物のパーセント」は、面積パーセントである。これには、高次オリゴマーは含まれない。面積パーセントを評価するためのアッセイは、以下の実施例６に記載されている。不純物は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー分析を使用して、不純物に起因する総面積の％として評価される。参照される不純物は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび他の分子量カットオフ濾過プロセスによって分離および制御することができる。緩衝液の塩、ｐＨおよびプロセス条件を使用して、所望の特性、品質および安定性を確保することができる。
【0034】
本明細書で使用される場合、「変性を誘発せずに、ワクチン中のトキソイドのオリゴマー化を阻害する」とは、部分的に、モノマーおよび／またはダイマートキソイドワクチンを扱うための操作パラメーターを指す。例えば、モノマーおよび／またはダイマートキソイドは、本明細書に開示されるワクチン組成物が約２℃～約８℃の範囲の温度で保存される場合、オリゴマー化に対して長期安定性を示し得る。本明細書に開示されるワクチン組成物の変性は、いくつかの実施形態では、組成物が０℃以下で保存される場合に起こり得る。同様に、モノマーおよび／またはダイマートキソイドのオリゴマー化は、ワクチン組成物が８℃超の温度で保存されている場合に発生する可能性があり、または２０℃超の温度で保存されている場合に発生する可能性がより高い。
【0035】
本明細書で使用される場合、「検出可能な不純物」は、トキソイド分解から生じる低分子量不純物（分子量１００，０００未満）を指し、検出器を用いたクロマトグラフィー分離によって測定することができる。実施形態では、クロマトグラフィー分離は、濾過、サイズ排除クロマトグラフィーなどによるものであり得る。検出器は、ＵＶ検出手段、屈折率などを使用することができる。同様に、「検出可能な高次オリゴマーのパーセント」は、検出と組み合わせたクロマトグラフィー技術によって同様の手法で決定することができる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「オリゴ糖連結およびアミノ含有汚染物質」は、微量の低分子量不純物の存在のために形成され得る汚染物質の２つの形態を指す。オリゴ糖連結汚染物質には、トキソイド調製物中に存在する分解不純物とトキソイドへのオリゴ糖付着に使用される連結試薬との間に形成される付加物が含まれる。したがって、オリゴ糖連結汚染物質には、分解生成物の１つまたは複数のアミノ基を介して、リンカーを構成するスペーサーアームに連結した、および汚染物質のアミノ基にてスペーサーアームの遠位に付着するオリゴ糖に連結した、トキソイド調製物からのアミン含有分解生成物が含まれる。これらの副生成物の付加物は、モノマーおよび／またはダイマートキソイドと反応することを目的とした試薬を消費し、したがって試薬の供給を枯渇させる。試薬が不足すると、第２の形態の汚染物質、つまり「アミノ含有汚染物質」が生じる可能性があり、これは、最終的なワクチン組成物のトキソイドに存在する未反応のアミノ基である。本明細書に記載の段階的濾過法によりこれらの生成物を最小化する本明細書の実施形態が提供される。
【0037】
「β－（１→６）－グルコサミン単位」または「グルコサミン単位」という用語は、以下のような個々のグルコサミン構造を指す：
【0038】
【化7】
【0039】
【化8】
【0040】
「Ｎ－アセチル基を有するβ－（１→６）－グルコサミン単位」という用語は、以下の構造を指す：
【0041】
【化9】
【0042】
「β－（１→６）－グルコサミン基を含むオリゴ糖」という用語は、病原性細菌の細胞壁の一部を模倣するワクチン化合物上のグルコサミン基を指し、これらは「オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造」と定義されている（以下に定義）。この場合も、そのような基は３～１２個のβ－（１→６）－グルコサミン単位に限定され、前記単位の最大４０％がＮ－アセチル基を有することができる。一実施形態では、前記β－（１→６）－グルコサミン単位の３０％未満がＮ－アセチル化されている。別の実施形態では、前記β－（１→６）－グルコサミン単位の２０％未満がＮ－アセチル化されている。さらに、別の実施形態では、前記β－（１→６）－グルコサミン単位の１０％未満がＮ－アセチル化されている。なおさらに、別の実施形態では、前記β－（１→６）－グルコサミン単位のいずれもＮ－アセチル化されていない。
【0043】
「Ｎ－アセチルβ－（１→６）－グルコサミン構造を含むオリゴ糖」または「Ｎ－アセチルβ－（１→６）－グルコサミン構造を含む多糖」という用語は、微生物の細胞壁に見られるそれらの構造を指し、ポリマーの前記Ｎ－アセチル基が最大２０パーセント脱アセチル化されている。微生物壁には、多くの微生物系統にわたって保存されているこれらの構造が多数含まれている。これらの構造は主にＮ－アセチルβ－（１→６）－グルコサミンであるが、ポリ－ベータ－１，６－Ｄ－グルコサミン－Ｎ－デアセチラーゼなどの酵素の作用により、脱アセチル化糖の領域が含まれる。したがって、本発明のワクチンは、そのような脱アセチル化オリゴ糖領域を標的とするものを含む抗体を生成する。いずれの理論にも限定されるものではないが、そのような脱アセチル化糖に対する抗体は、そのような微生物に対してインビボで細胞毒性を示す。
【0044】
本明細書で使用される「ワクチン組成物」または「医薬組成物」という用語は、アジュバントおよび医薬担体を含む上記の式ＩおよびＩＩの化合物を含む医薬組成物を指す。これらの組成物はまた、限定量のオリゴ糖連結およびアミノ含有汚染物質を含み、そのような汚染物質の量が３パーセント以下、好ましくは２パーセント未満、より好ましくは１パーセント未満であるものを含む。これらの組成物は、細胞壁にＮ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミン構造を有するオリゴ糖／多糖を含むあらゆる微生物に対して有効な免疫を提供する。したがって、単一の細菌に対してワクチン接種する古典的なワクチンとは異なり、本明細書に記載のワクチン組成物は、本明細書に記載のオリゴ糖構造を有する任意の微生物に対して有効な免疫を提供することができる。このような微生物としては、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、抗生物質耐性細菌（例えば、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、真菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0045】
本明細書で使用される「有効な免疫」という用語は、微生物感染を処置、予防、または改善するのに十分なインビボでの抗体応答を生成する、定義された量のワクチン組成物の能力を指し、前記微生物は、その細胞壁にＮ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミンを含むオリゴ糖／多糖を含有する。
【0046】
ワクチン化合物は、式ＩおよびＩＩの化合物を指す。これらの化合物は、溶媒和物、特に水和物として存在し得る。化合物または化合物を含む組成物の製造中に水和物が形成される場合があり、または化合物の吸湿性のために水和物が時間とともに形成される場合がある。本発明の化合物は、とりわけＤＭＦ、エーテル、およびアルコール溶媒和物を含む、有機溶媒和物としても存在し得る。特定の溶媒和物の同定および調製は、合成有機または医薬品化学の当業者の技能の範囲内にある。
【0047】
「トキソイド」という用語は、モノマーおよびオリゴマーの破傷風トキソイド形態を指す。オリゴマー化によってオリゴマー中の各モノマートキソイドの表面積が減少するため、オリゴマー破傷風トキソイド成分の存在により、曝露される反応アミノ基の平均数が減少する。したがって、これにより、トキソイドに結合したオリゴ糖の率が低くなる。本明細書に開示されるワクチン組成物は、モノマーおよび／またはダイマーの形態のトキソイドを含む。実施形態では、モノマーのダイマーに対する比は、約１０：１～約１：１０、または約５：１～約１：５、または約２：１～約１：２の範囲にある。
【0048】
「対象」とは、哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得るが、好ましくはヒトである。
【0049】
対象における疾患もしくは障害の「処置する」または「処置」とは、１）素因がある、または疾患もしくは障害の症状をまだ示していない対象において、疾患もしくは障害が発生するのを予防すること；２）疾患もしくは障害を阻害すること、またはその発症を阻止すること；あるいは３）疾患もしくは障害を改善することまたは疾患もしくは障害の退縮を引き起こすことを指す。
【0050】
「有効量」とは、対象を苦しめている疾患または障害を処置するのに、またはそのような疾患もしくは障害が前記対象もしくは患者に生じるのを予防するのに十分な、本発明のワクチン組成物の量を指す。
【0051】
「反応性アミノ官能基」とは、破傷風トキソイドのリジンおよびグアニジン側鎖に見られる一次アミノ基（－ＮＨ２）を指すが、グルタミンに見られるような、破傷風トキソイドのペプチド結合またはアミド側鎖に見られるアミド（－ＮＨＣ（Ｏ）－）基は含まれない。
【0052】
「低分子量アミノ化合物」とは、トキソイドの断片を含む、破傷風トキソイド組成物中に汚染物質として存在するアミノ含有化合物、アミノ基を含有する緩衝液、リジン、グリシン、硫酸アンモニウムなどの反応クエンチャー、ホルマリンなどの毒素解毒剤、および破傷風トキソイドと接触している他のアミノ含有試薬を指す。典型的には、そのような低分子量反応性アミノ化合物は、約１００，０００未満、好ましくは１０，０００未満の分子量を有する。
【0053】
一般的な合成方法
本発明の化合物は、以下の一般的な方法および手順を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的または好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられている場合、特に明記しない限り、他のプロセス条件も使用することができることが理解されよう。最適な反応条件は、使用する特定の反応物または溶媒によって異なる場合があるが、そのような条件は、当業者が定型的な最適化手順によって決定することができる。
本発明の化合物は、以下の一般的な方法および手順を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的または好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられている場合、特に明記しない限り、他のプロセス条件も使用することができることが理解されよう。最適な反応条件は、使用する特定の反応物または溶媒によって異なる場合があるが、そのような条件は、当業者が定型的な最適化手順によって決定することができる。
【0054】
さらに、当業者には明らかであるように、ある特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために、従来の保護基が必要な場合がある。種々の官能基に好適な保護基、ならびに特定の官能基を保護および脱保護するための好適な条件は、当技術分野において周知である。例えば、多数の保護基は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999、およびそこに引用されている参考文献に記載されている。
【0055】
以下の反応の出発物質は、一般に既知の化合物であるか、または既知の手順もしくはその明らかな改変によって調製することができる。例えば、出発材料の多くは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、Ｅｍｋａ－Ｃｈｅｍｃｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）などの市販の業者から入手可能である。その他のものは、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-15 (John Wiley, and Sons, 1991)、Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5, and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989)、Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley, and Sons, 1991)、March’s Advanced Organic Chemistry, (John Wiley, and Sons, 5th Edition, 2001)、およびLarock’s Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)、などの標準的な参照テキストに記載されている手順またはその明らかな変更によって調製してもよい。
【0056】
本発明の代表的なワクチン化合物の合成
本発明のワクチン化合物の一般的な合成は当技術分野で公知であり、米国特許出願第１０／７１３，７９０号ならびに米国特許第７，７８６，２５５号および第８，４９２，３６４号に開示されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明のワクチン化合物の一般的な合成は当技術分野で公知であり、米国特許出願第１０／７１３，７９０号ならびに米国特許第７，７８６，２５５号および第８，４９２，３６４号に開示されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0057】
本明細書に記載のワクチン化合物の一実施形態では、β－（１→６）－グルコサミン基は、４～６単位、および好ましくは５単位に制限され、例えば、式Ｉではｙ＝２～４である。
【0058】
いくつかの実施形態では、化合物は、ｙが、両端を含む１から１０までで選択される単一の整数であるという点で均質である。したがって、本明細書に開示される化合物は、ｙ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０により均質になるように設計することができる。いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、ｙ＝１および２、またはｙ＝２およびｙ＝３、またはｙ＝３およびｙ＝４、またはｙ＝４およびｙ＝５、またはｙ＝５およびｙ＝６、またはｙ＝６およびｙ＝７、またはｙ＝７およびｙ＝８、またはｙ＝８およびｙ＝９、またはｙ＝９およびｙ＝１０、の混合など、ｙの２つ以上の値により不均質であるように設計され得る。このようなｙのペアリングは、連続的である必要はない。したがって、化合物には、ｙ＝１およびｙ＝３、またはｙ＝１およびｙ＝４、またはｙ＝２およびｙ＝４、またはｙ＝２およびｙ＝５など、ｙについて２以上の異なる値の任意の組合せの混合が含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、化合物は、ｙについて３以上の値、またはｙについて４以上の値、またはｙについて５以上の値、ｙについて最大１０のすべての異なる値により不均質であり得る。いくつかの実施形態では、ｙの各発生は、式Ｉの化合物において独立している。
【0059】
いくつかの実施形態では、式Ｉの２種以上の化合物を、式Ｉの個々の化合物のそれぞれがｙにおいて均質であり、一方、式Ｉの他の化合物が異なるｙ値を有する（単数）／有する（複数）医薬組成物において使用することができる。そのような実施形態では、使用される均質な化合物は、定義された重量パーセンテージで単純に一緒に混合される。例えば、医薬組成物は、ｙが２である式Ｉの化合物との混合物中に、ｙ＝１である式Ｉの化合物を含み得る。医薬組成物または方法が式Ｉの化合物の不均質な混合物を含む場合、混合物は、式Ｉの各化合物の相対重量パーセンテージに関して定義されるものであり得る。例えば、混合物には、ｙが１に等しい式Ｉの化合物を５０重量パーセント、およびｙが２に等しい式Ｉの化合物を５０重量パーセント含めることができる。合計１００％の化合物の任意の組合せが考えられ、例えば、それぞれが異なるｙ値を有する１、２、３、４、５種以上の化合物を、合計１００％の既知の相対重量パーセントで混合することができる。したがって、式Ｉの化合物の重量パーセントの任意の組合せを、本明細書に開示される医薬組成物および方法で使用することができる。したがって、式Ｉの２つの化合物の組合せの場合、パーセンテージは２つの化合物の比率として表すことができ、両端を含む０．１：９９．９～９９．９：０．１の任意の範囲、および例えば１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０など～最大９９：１（分数値を含む）の間の任意の値にすることができる。同様に、医薬組成物中の式Ｉの３、４、５種、またはそれ以上の化合物が使用される場合、各化合物の相対重量パーセントは、式Ｉの異なる化合物の合計量が１００％になることを条件として、０．１重量パーセントから最大９９重量パーセントまで変化し得る。
【0060】
リンカー基の形成は、限定されないが、米国特許第８，４９２，３６４号および以下の実施例に見られるものに例示される、当技術分野で認められている合成技術によって達成される。一実施形態では、アグリコンの第１の部分は、還元性β－（１→６）－グルコサミン単位に付着し、以下の式ＩＩＩ：
【0061】
【化10】
（式中、ｙは、１から１０までの整数であり；アミノ基の４０％以下がＮ－アセチル基であってもよい）
に示されるように、チオール（－ＳＨ）基を保持する。
【0062】
破傷風トキソイドの調製
破傷風トキソイドは、様々な純度で市販されており、トキソイドには常にかなりの量のアミノ由来の汚染物質が含まれている。これらの汚染物質としては、アミノ官能基を含有する、酵素的または加水分解プロセスによって放出されたトキソイドの断片、および毒素のトキソイドへの変換中に加えられた未反応のグリシンおよびアルギニンからのアミノ由来の汚染物質が挙げられる。
破傷風トキソイドは、様々な純度で市販されており、トキソイドには常にかなりの量のアミノ由来の汚染物質が含まれている。これらの汚染物質としては、アミノ官能基を含有する、酵素的または加水分解プロセスによって放出されたトキソイドの断片、および毒素のトキソイドへの変換中に加えられた未反応のグリシンおよびアルギニンからのアミノ由来の汚染物質が挙げられる。
【0063】
低分子量の汚染物質に加えて、最初のトキソイド調製物は、様々な量のトキソイドモノマー、ダイマー、トリマーおよび高次オリゴマーを含み得る。トキソイド調製物に存在する場合、３つ以上のモノマー単位を含むオリゴマーは、オリゴ糖の高担持量を生成する能力を損なう。担持量は、所与のモノマーまたはダイマートキソイド単位に付着しているオリゴ糖の単位数である。驚くべきことに、破傷風トキソイドモノマーおよびダイマーの組成により、好適な担持量が可能になり、モノマートキソイドをダイマートキソイドから分離する必要がなくなることが見出された。しかし、高次オリゴマーは除去されるべきであり、実施形態では、高次オリゴマーは、５％未満の検出可能な高次オリゴマーを構成するべきである。高次オリゴマーおよび低分子量の汚染物質は、許容可能な担持量を有する生成物を提供しながら、段階的（または連続的）濾過によって除去することができる。実施形態では、本明細書に開示される精製トキソイド調製物は、少なくとも２５、好ましくは少なくとも３０の担持量を有する。より低い担持量は、オリゴ糖連結化学と反応する不純物の結果であることが多く、それにより、モノマーおよびダイマートキソイドでの反応に理論的に利用可能な部位に対して３５倍過剰の連結試薬を使用する化学量論に基づいて担持量が低減する。不純物の存在の問題は、非常に過剰な試薬を使用することによって簡単に解決されるわけではないことに留意されたい。これは、非常に過剰な試薬を使用することは経済的ではなく、オリゴ糖試薬がトキソイドに非特異的に結合するため、精製の問題が発生する可能性があるためである。
【0064】
実施形態では、トキソイドの高次オリゴマーを含む高分子量不純物およびトキソイド分解生成物を含む低分子量不純物の両方を最小化するために段階的濾過を使用する方法が提供される。実施形態では、段階的濾過の方法は、１つまたは複数の３～５ミクロンの孔径のフィルターによる濾過を含む。
これらのフィルターは、トキソイドのモノマーおよびダイマーを通過させながら、高次オリゴマーを捕捉する。実施形態では、そのような濾過は、例えば５ミクロンのフィルターを用いて第１の濾過を実施することができ、次に４ミクロンのフィルター、次に３ミクロンのフィルターに通して濾過を実施することができるという意味で段階的に行うことができる。３ミクロン以上では、トキソイドのダイマーおよびモノマーの大部分がフィルターを通過し、フィルター材料が高次オリゴマーをトラップすると予想される。理論に拘束されるものではないが、モノマーが長さ約２．５ミクロンおよび幅約０．５ミクロンであると特徴付けられているため、３ミクロン以上の孔径を有するフィルターによって、トキソイドモノマーまたはダイマーの一部の通過が可能になると仮定される。
これらのフィルターは、トキソイドのモノマーおよびダイマーを通過させながら、高次オリゴマーを捕捉する。実施形態では、そのような濾過は、例えば５ミクロンのフィルターを用いて第１の濾過を実施することができ、次に４ミクロンのフィルター、次に３ミクロンのフィルターに通して濾過を実施することができるという意味で段階的に行うことができる。３ミクロン以上では、トキソイドのダイマーおよびモノマーの大部分がフィルターを通過し、フィルター材料が高次オリゴマーをトラップすると予想される。理論に拘束されるものではないが、モノマーが長さ約２．５ミクロンおよび幅約０．５ミクロンであると特徴付けられているため、３ミクロン以上の孔径を有するフィルターによって、トキソイドモノマーまたはダイマーの一部の通過が可能になると仮定される。
【0065】
別の濾過段階では、孔径が２．５ミクロン以下のフィルターを使用することにより、低分子量不純物を除去することができる。実施形態では、低分子量不純物は、トキソイド混合物を、例えば、孔径が２．５ミクロンのフィルターに通すことによって除去され、トキソイドのモノマーおよびダイマー形態はフィルター上に残り、低分子量不純物はフィルターを通過する。実施形態では、低分子量不純物を除去するための第２の段階は、２ミクロンフィルター、または他の実施形態では１．５ミクロンフィルターの使用を含む。実施形態では、低分子量不純物を除去するための孔径は、孔径を２．５ミクロンから１．５ミクロンに縮小させるなど、段階的であることもできる。
【0066】
実施形態では、高分子量および低分子量の不純物を除去するための濾過の両方の段階は、オリゴ糖－トキソイド共有付加物を生成するための任意の官能化化学を実施する前に実施することができる。したがって、実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物を作製する方法は、トキソイド調製物を第１のフィルターに通して、高次オリゴマー不純物を除去することを含み、ダイマーおよびモノマートキソイドは第１のフィルターを通過し、次に第１のフィルターを通過した後、トキソイド調製物を第２のフィルターに通して低分子量不純物を除去し、モノマーおよびダイマートキソイドはフィルター上に保持され、より小さな分子量の不純物がフィルターを通過する。実施形態では、両方のフィルターを使用した後、モノマーおよびダイマートキソイド混合物がスペーサーアームと反応し、これによりリンカーが生成され、このリンカーにオリゴ糖が共有結合することができる。適切な孔径を有するフィルターは当技術分野で周知であり、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ、www.spherotech.com/contact.htm.から市販されている。
【0067】
実施形態では、低分子量不純物を、最初に、より小さなフィルター孔径を使用することによって除去してもよく、続いて、より大きなフィルターサイズにより高分子量不純物を除去してもよい。
【0068】
実施形態では、オリゴ糖を連結するための反応化学は、任意の濾過工程の間で実施することができる。例えば、実施形態では、第１の濾過を実施して小さな不純物を除去することができ、モノマーおよびダイマーとともに高次オリゴマーをスペーサーアームと反応させ、次にオリゴ糖を付着させることができる。次に、付加物に対して第２段階濾過を実行して、高次オリゴマーを除去することができる。同様に、高分子量の不純物のみを除去し、続いてオリゴ糖付加物を形成し、次に、低分子量の不純物の第２段階濾過により付加物を精製することができる。しかし、当業者は、オリゴ糖付着化学の前に低分子量および高分子量の不純物を除去することにより、それが望まれる場合、すなわち、モノマーおよび／またはダイマートキソイドのアミノ基に対する試薬反応の効率が最大化されることを理解するであろう。
【0069】
当業者がさらに理解するように、本明細書に記載のオリゴ糖付着は２工程で実施し、段階的濾過は、スペーサーアームを付着する第１の工程の前および／または後に実施してもよい。したがって、スペーサーアームは、高分子量濾過、低分子量濾過のいずれか、またはその両方の後に付着することができる。したがって、最終的なオリゴ糖付着化学は、介在する濾過工程の後に続く場合がある。汚染物質のアミノ基は、最初に上記のようにスペーサーと反応して、また上記のようにアグリコンと反応する中間体を形成し、オリゴ糖を含有するアミノ由来の汚染物質を形成する。これらの汚染物質は、トキソイドの重量に基づいて、通常最大２０重量パーセントの範囲の量でワクチン組成物の残留物を占める可能性がある。
【0070】
リンカーの第２の部分を、式ＩＶに示されるように、以下の方式で破傷風トキソイドに付着させる。
【0071】
【化11】
【0072】
この式では、破傷風トキソイドの別個の部分は波線で示されており、本質的に例示にすぎず、トキソイドの完全な構造を提供することを意図していない。二硫化物ブリッジは、部分を接続する１本の線で表される。明確にするために、リンカーの単一の第２の部分のみが示されるが、トキソイド上に見られるアミノ基に共有結合した複数のそのような第２の部分がある。
【0073】
リンカーの第１の部分と第２の部分とがカップリング条件下で化合すると、チオエーテル結合が形成される。反応は、生成された酸を除去するために、適宜塩基の存在下で不活性希釈剤中で行われる。チオエーテル結合は、リンカーの第１の部分と第２の部分を接続し、それによって、ｙが本明細書で定義されるワクチン化合物について、以下に示すように、組合せリンカーを介して、破傷風トキソイドのオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基への共有結合を提供する。
【0074】
【化12】
【0075】
破傷風（ｔｅｎｔａｔｕｓ）トキソイドに付着したβ－（１→６）－グルコサミン基－リンカー－基の数は、そのような基の約３１～約３９がトキソイドに結合するように化学量論的に制御され、それにより、本発明のワクチン化合物を提供することが理解される。
【0076】
方法、有用性および医薬組成物
本発明のワクチン組成物は、細胞壁にＰＮＡＧオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を有する微生物に対して効果的な免疫応答を開始することができる。患者への接種後、約４週間後に効果的な免疫応答が発生する。有効な免疫応答が発生した後、患者には、問題の微生物がＰＮＡＧを含む細胞壁を有する後続の微生物感染に対する保護が提供される。
本発明のワクチン組成物は、細胞壁にＰＮＡＧオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を有する微生物に対して効果的な免疫応答を開始することができる。患者への接種後、約４週間後に効果的な免疫応答が発生する。有効な免疫応答が発生した後、患者には、問題の微生物がＰＮＡＧを含む細胞壁を有する後続の微生物感染に対する保護が提供される。
【0077】
そのように使用される場合、本発明のワクチン組成物は、そのような微生物から生じる微生物感染のリスクのある患者に投与される。そのような患者には、一例としてのみであるが、高齢者、待機手術を受ける患者、微生物感染が発生している目的地に旅行する患者などが含まれる。ワクチンは通常、免疫応答を強化するために好適なアジュバントとともに、免疫能力のある患者に筋肉内投与される。潜伏期間が経過した後、患者はそのような微生物に対する自然免疫を獲得する。そのような免疫能力のある患者は、抗原に対する免疫応答を生成することができる有効な免疫システムを有する。好ましくは、そのような患者は、マイクロリットルあたり少なくとも約１０００ＷＢＣ、好ましくはマイクロリットルあたり少なくとも約１５００ＷＢＣ、より好ましくはマイクロリットルあたり少なくとも約２０００ＷＢＣ、さらにより好ましくはマイクロリットルあたり約３０００ＷＢＣ、最も好ましくはマイクロリットルあたり約４０００ＷＢＣの活性白血球数（ＷＢＣ）を有する。
【0078】
別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、特に微生物感染が限局性である場合および／または生命を脅かさない場合に、治療的に使用することができる。そのような場合、本発明のワクチン組成物は、そのような微生物から生じる微生物感染に罹患している患者に投与される。ワクチンは通常、免疫応答を強化するために好適なアジュバントとともに、免疫能力のある患者に筋肉内投与される。投与すると、約４週間以内に有効な免疫が生成される。患者がまだ感染に罹患している場合は、ワクチンから生じる自然免疫が回復を促進する。
【0079】
そのように使用される場合、本発明のワクチン組成物は、同様の有用性を提供する薬剤について許容される投与様式のいずれかによって、治療有効量で投与される。本発明のワクチン化合物、すなわち有効成分の実際の量は、処置される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康、使用されるワクチン化合物の効力、投与の経路および形態、ならびに当業者に周知の他の要因などの多くの要因に依存する。
【0080】
本発明の有効量または治療有効量のワクチン化合物は、対象の症状または生存の延長を改善するために十分な力価の抗体をもたらすその量のワクチン化合物を指す。そのようなワクチン化合物およびワクチン組成物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。
【0081】
本明細書に記載のワクチン組成物は、典型的には、一例としてのみであるが、アジュバント、安定剤、防腐剤などを含む、当技術分野で周知の１つまたは複数の従来の成分を含む注射用滅菌水性組成物として投与される。
【0082】
組合せ
本発明のワクチン化合物および組成物は、主治医によって好適であるとみなされる他の治療化合物または他の適切な薬剤と組み合わせて使用することができる。選択された場合において、本発明のワクチン化合物は、細菌感染を処置するための抗生物質、ならびにワクチン化合物および／または組成物によって誘発される免疫応答を増強する薬剤と同時に投与することができる。抗生物質の場合、適切な抗生物質または抗生物質のカクテルの選択および患者に投与する量は、問題の細菌の詳細、細菌感染の程度、年齢、体重、その他の患者の相対的な健康状態に基づいて、十分に主治医のスキルの範囲内にある。必要に応じて、主治医は、免疫増強薬またはアジュバントを、本明細書に記載のワクチンと組み合わせて同時投与することができる。
本発明のワクチン化合物および組成物は、主治医によって好適であるとみなされる他の治療化合物または他の適切な薬剤と組み合わせて使用することができる。選択された場合において、本発明のワクチン化合物は、細菌感染を処置するための抗生物質、ならびにワクチン化合物および／または組成物によって誘発される免疫応答を増強する薬剤と同時に投与することができる。抗生物質の場合、適切な抗生物質または抗生物質のカクテルの選択および患者に投与する量は、問題の細菌の詳細、細菌感染の程度、年齢、体重、その他の患者の相対的な健康状態に基づいて、十分に主治医のスキルの範囲内にある。必要に応じて、主治医は、免疫増強薬またはアジュバントを、本明細書に記載のワクチンと組み合わせて同時投与することができる。
【0083】
本発明のワクチン組成物は、患者の抗原に対する免疫応答を増強するアジュバントとともに投与することができる。アジュバントとしては、ゲル、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物、およびフロイント完全または不完全アジュバント（例えば、抗原がパラフィン油エマルジョン中の安定化水の水相に組み込まれている）が挙げられるが、これらに限定されない。明らかなように、パラフィン油は、スクアレン油またはピーナッツ油などの他のタイプの油に置き換えることができる。アジュバント特性を備えた他の材料としては、ＢＣＧ（弱毒化結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））リン酸カルシウム、レバミゾール、イソプリノシン、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、レンチナン、百日咳毒素、リピドＡ、サポニン、ＱＳ－２１およびペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、および免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例としてＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。希土類塩、例えば、ランタンおよびセリウムをアジュバントとして使用することもできる。使用されるアジュバントの量は、処置される対象および使用される特定の抗原に依存し、当業者が容易に決定することができる。
【実施例】
【0084】
本発明は、純粋に例示的であることが意図される本発明の以下の実施例を参照することによってさらに理解される。本発明は、本発明の単一の態様の例示としてのみ意図される例示された実施形態によって範囲が限定されない。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内である。本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、前述の説明および付随する図から当業者には明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入る。
【0085】
以下の用語が本明細書で使用され、以下の意味を有する。定義されていない場合、略語には従来認識されている定義がある。
Å＝オングストローム
ａｑ．＝水溶液
Ｂｉｏｔａｇｅ＝Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｄｉｖ． Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ
ｂｐ＝沸点
ＣＡＤ＝帯電エアロゾル検出器
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ｄｅｇ＝度
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｅｑ．＝当量
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＦＥＰ＝フッ素化エチレンプロピレン
ｇ＝グラム
Ｈ１－ＮＭＲ＝プロトン核磁気共鳴
ｈ＝時間
ＨＤＰＥ＝高密度ポリエチレン
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ＝アセトニトリル
ｋｇ＝キログラム
ｍｂａｒ＝ミリバール
ＭｅＯＨ＝メタノール
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル濃度
ｍｍｏｌ＝ミリモル
Ｎ＝規定度
ＮＢＳ＝Ｎ－ブロモスクシンイミド
ＮＩＳ＝Ｎ－ヨードスクシンイミド
ＮＭＴ＝Ｎ－メチルトリプタミン
ＰＰ＝ポリプロピレン
ｑＨＮＭＲ＝定量的プロトン核磁気共鳴
ＲＢＦ＝丸底フラスコ
ＲＯ＝逆浸透
ＳＥＣ ＨＰＬＣ＝サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ
ＳＩＭ＝二次イオン質量
ＴＣＥＰ＝（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＯＴｆ＝メタンスルホン酸、１，１，１－トリフルオロ－、トリメチルシリルエステル
ＴＴ＝破傷風トキソイド
μＬ＝マイクロリットル
μｍ＝ミクロン
ｗ／ｗ＝重量対重量
ｗ／ｖ＝重量対体積
［実施例１］
Å＝オングストローム
ａｑ．＝水溶液
Ｂｉｏｔａｇｅ＝Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｄｉｖ． Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ
ｂｐ＝沸点
ＣＡＤ＝帯電エアロゾル検出器
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ｄｅｇ＝度
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｅｑ．＝当量
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＦＥＰ＝フッ素化エチレンプロピレン
ｇ＝グラム
Ｈ１－ＮＭＲ＝プロトン核磁気共鳴
ｈ＝時間
ＨＤＰＥ＝高密度ポリエチレン
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ＝アセトニトリル
ｋｇ＝キログラム
ｍｂａｒ＝ミリバール
ＭｅＯＨ＝メタノール
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル濃度
ｍｍｏｌ＝ミリモル
Ｎ＝規定度
ＮＢＳ＝Ｎ－ブロモスクシンイミド
ＮＩＳ＝Ｎ－ヨードスクシンイミド
ＮＭＴ＝Ｎ－メチルトリプタミン
ＰＰ＝ポリプロピレン
ｑＨＮＭＲ＝定量的プロトン核磁気共鳴
ＲＢＦ＝丸底フラスコ
ＲＯ＝逆浸透
ＳＥＣ ＨＰＬＣ＝サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ
ＳＩＭ＝二次イオン質量
ＴＣＥＰ＝（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＯＴｆ＝メタンスルホン酸、１，１，１－トリフルオロ－、トリメチルシリルエステル
ＴＴ＝破傷風トキソイド
μＬ＝マイクロリットル
μｍ＝ミクロン
ｗ／ｗ＝重量対重量
ｗ／ｖ＝重量対体積
［実施例１］
【0086】
破傷風トキソイド段階的濾過
モノマーおよびダイマートキソイドを含む粗破傷風トキソイド調製物の試料を、最初に３～５ミクロンフィルターに通して、高次オリゴマーを除去する。これは、段階的にフィルター孔径を縮小させて実施することができる。したがって、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。あるいは、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に４ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。５ミクロンの濾過の有効性は、高次オリゴマーの存在を検出するために使用できる光散乱技術によって評価される。必要に応じて、段階的な濾過を追加して、さらに高次のオリゴマーを除去する。得られた濾液には、モノマーおよびダイマートキソイドが含まれている。オリゴ糖の付着の化学的性質が完全に精製された後、濾液を２．５ミクロンのフィルターに通し、フィルターケーキとしてモノマーおよびダイマートキソイドを分離し、一方、低分子量の不純物は濾液とともに通過する。各濾過工程（高分子量および低分子量）で、フィルターケーキのすすぎを実施することができる。
［実施例２］
モノマーおよびダイマートキソイドを含む粗破傷風トキソイド調製物の試料を、最初に３～５ミクロンフィルターに通して、高次オリゴマーを除去する。これは、段階的にフィルター孔径を縮小させて実施することができる。したがって、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。あるいは、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に４ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。５ミクロンの濾過の有効性は、高次オリゴマーの存在を検出するために使用できる光散乱技術によって評価される。必要に応じて、段階的な濾過を追加して、さらに高次のオリゴマーを除去する。得られた濾液には、モノマーおよびダイマートキソイドが含まれている。オリゴ糖の付着の化学的性質が完全に精製された後、濾液を２．５ミクロンのフィルターに通し、フィルターケーキとしてモノマーおよびダイマートキソイドを分離し、一方、低分子量の不純物は濾液とともに通過する。各濾過工程（高分子量および低分子量）で、フィルターケーキのすすぎを実施することができる。
［実施例２］
【0087】
ＴＴモノマーへのＳＢＡＰの付着
工程１：Ｎ－ＢＡＢＡの調製：
工程１：Ｎ－ＢＡＢＡの調製：
【0088】
【化13】
【0089】
市販のベータアラニン、すなわち化合物１は、少なくとも化学量論量の市販のブロモアセチルブロミドと反応させることにより、Ｎ－ＢＡＢＡ（ブロモアセチル－β－アラニン）、すなわち化合物２に変換される。第１の容器中では、β－アラニンを重炭酸ナトリウムまたは他の好適な塩基と一緒に水に合わせて、反応中に生成される酸を除去する。溶液が得られるまで、水溶液を約２０±５℃で混合する。その後、溶液を約５±５℃に維持する。別の容器に、必要量の臭化ブロモアセチルを加えた後、ジクロロメタンを加える。両方の容器の内容物を合わせる。反応完了後、６Ｎ ＨＣｌを加え、ｐＨがおよそ２になるまで混合する。得られたＮ－ＢＡＢＡを、酢酸エチルなどの好適な溶媒によって溶液から抽出する。有機層を、６０℃などの高温で減圧下などの従来の条件下で濃縮する。次にヘプタンを加えてＮ－ＢＡＢＡを沈殿させ、フィルター上で収集して、４０℃の真空オーブン内で乾燥させる。本生成物を、次の工程でそのまま使用する。
【0090】
工程２：ＳＢＡＰの調製：
【0091】
【化14】
【0092】
あるいは、ＳＢＡＰは、米国特許第５，２８６，８４６号に記載される方式で調製することができ、この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、そこに記載される方法は、以下の合成スキームによって提供される。
【0093】
【化15】
【0094】
工程３－コンジュゲーション
上記のように、精製ＴＴモノマーは、遊離アミンアッセイによって定量化されるように、４３個のリジン残基／モルを含有する。ＴＴモノマーと濃度を０から１７０モル当量まで増加させたＳＢＡＰとの反応により、ＳＢＡＰの１５～１１０モル当量の範囲で遊離アミン含有量が対応して減少した。定常状態の変換は、＞１１０当量のＳＢＡＰを充填することにより達成した。遊離アミンの損失がＳＢＡＰリンカーの負荷に正比例すると仮定すると、飽和時のリンカー密度は４３モルのＳＢＡＰ／ＴＴモノマーであると推定された。リンカーＴＴ／モノマー中間体のモノマー／凝集体含有量および各滴定点でのタンパク質濃度も評価した。リンカー添加前のモノマー含有量は９９．７％であり、ＳＢＡＰリンカーの量を増加させても、モノマーレベルは大幅に変化しなかった（凝集体は検出されなかった）。また、滴定工程全体でのタンパク質の回収も同様であった。この集合的なデータに基づいて、周囲温度で１時間の１１０モル当量のＳＢＡＰの値を、その後のすべての合成の適切な反応条件として選択した。
［実施例３］
オリゴ糖の合成
上記のように、精製ＴＴモノマーは、遊離アミンアッセイによって定量化されるように、４３個のリジン残基／モルを含有する。ＴＴモノマーと濃度を０から１７０モル当量まで増加させたＳＢＡＰとの反応により、ＳＢＡＰの１５～１１０モル当量の範囲で遊離アミン含有量が対応して減少した。定常状態の変換は、＞１１０当量のＳＢＡＰを充填することにより達成した。遊離アミンの損失がＳＢＡＰリンカーの負荷に正比例すると仮定すると、飽和時のリンカー密度は４３モルのＳＢＡＰ／ＴＴモノマーであると推定された。リンカーＴＴ／モノマー中間体のモノマー／凝集体含有量および各滴定点でのタンパク質濃度も評価した。リンカー添加前のモノマー含有量は９９．７％であり、ＳＢＡＰリンカーの量を増加させても、モノマーレベルは大幅に変化しなかった（凝集体は検出されなかった）。また、滴定工程全体でのタンパク質の回収も同様であった。この集合的なデータに基づいて、周囲温度で１時間の１１０モル当量のＳＢＡＰの値を、その後のすべての合成の適切な反応条件として選択した。
［実施例３］
オリゴ糖の合成
【0095】
ビルディングブロックの合成
以下の反応スキームは、以下に詳述される化合物３、５および８を調製するために使用される合成工程について説明する。
以下の反応スキームは、以下に詳述される化合物３、５および８を調製するために使用される合成工程について説明する。
【0096】
【化16】
【0097】
化合物Ｄの合成：
市販の１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－Ｄ－グルコピラノシド、すなわち化合物Ｃ（１２０．６ｇ、２５２．６ｍｍｏｌ）およびトルエン（２００ｍＬ）を、１Ｌのビュッヒフラスコに入れ、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を蒸発させ、発泡体を得た。トルエン（２００ｍＬ）をフラスコに充填し、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を、乾燥するまで再び蒸発させた。結晶性固体が形成され、壁に固着した。ジクロロメタン（８００ｍＬ）をフラスコに入れ、溶解するまで周囲で回転させ；得られた暗褐色の溶液を５Ｌのジャケット付き反応器に充填し、フラスコを追加のジクロロメタン（２００ｍＬ）ですすいで反応させた。加熱／冷却ジャケットを２０℃に設定し、反応器の内容物を機械的に撹拌した。エタンチオール（４０ｍＬ、５４０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、容器に加え、フラスコを５０ｍｌのジクロロメタンですすいで容器に入れた。三フッ化ホウ素ジエチルジエチルエーテラート（５０ｍＬ、３９０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、反応器に加え、ジクロロメタン（５０ｍＬ）ですすぎ、容器に加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応を、ＴＬＣによって残留Ｃについてチェックした。移動相は、トルエン：酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）、生成物Ｒｆ約０．４５、Ｃ Ｒｆ約０．３、ＵＶ可視化、であった。かなりの量のＣが存在する場合、反応時間を延長する必要があった。
市販の１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－Ｄ－グルコピラノシド、すなわち化合物Ｃ（１２０．６ｇ、２５２．６ｍｍｏｌ）およびトルエン（２００ｍＬ）を、１Ｌのビュッヒフラスコに入れ、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を蒸発させ、発泡体を得た。トルエン（２００ｍＬ）をフラスコに充填し、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を、乾燥するまで再び蒸発させた。結晶性固体が形成され、壁に固着した。ジクロロメタン（８００ｍＬ）をフラスコに入れ、溶解するまで周囲で回転させ；得られた暗褐色の溶液を５Ｌのジャケット付き反応器に充填し、フラスコを追加のジクロロメタン（２００ｍＬ）ですすいで反応させた。加熱／冷却ジャケットを２０℃に設定し、反応器の内容物を機械的に撹拌した。エタンチオール（４０ｍＬ、５４０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、容器に加え、フラスコを５０ｍｌのジクロロメタンですすいで容器に入れた。三フッ化ホウ素ジエチルジエチルエーテラート（５０ｍＬ、３９０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、反応器に加え、ジクロロメタン（５０ｍＬ）ですすぎ、容器に加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応を、ＴＬＣによって残留Ｃについてチェックした。移動相は、トルエン：酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）、生成物Ｒｆ約０．４５、Ｃ Ｒｆ約０．３、ＵＶ可視化、であった。かなりの量のＣが存在する場合、反応時間を延長する必要があった。
【0098】
撹拌は、高速に設定して、４Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（１．２５Ｌ、５１００ｍｍｏｌ）を加えた。相を３０分間よく混合した。水層のｐＨをディップスティックでチェックし、約ｐＨ＝７であることを確認した。撹拌を止め、反応混合物を７０分間放置した。
【0099】
層を分離して収集した。有機層（下層、１．２Ｌ）およびエタノール（８４０ｍＬ、１４４００ｍｍｏｌ）を、反応器に充填した。ジャケットを６０℃に設定し、大気圧下で溶媒蒸留した（ジクロロメタンｂｐ ４０℃およびエタンチオールｂｐ ３５℃、氷浴中の受けフラスコ）。蒸留が遅くなると、ジャケットの温度を７０℃に上昇させた。１３００ｍＬの留出物を収集した後、容器の内容物の試料を収集し、ジクロロメタンのエタノールに対する比を１Ｈ－ＮＭＲで測定し、１０ｍｏｌ％未満のジクロロメタンであることを確認した。より多くのジクロロメタンが存在する場合は、さらに蒸留する必要がある。追加のエタノール（４００ｍＬ）を加え、続いてＤの種結晶を加えた。ジャケットを、３０分かけて５℃に冷却した。結晶スラリーを５℃で３日間撹拌した。固体を焼結漏斗に収集し、石油エーテル（６０～８０℃）で洗浄した：１×５００ｍＬスラリー、１ｘ３００ｍＬプラグ。固体を５００ｍＬ ＲＢＦに移し、ロータリーエバポレーター（浴温４５℃）で一定重量（約４時間超）まで乾燥させて、オフホワイトの固体を得た。予想収量：約８６ｇ（Ｃから７１％）。
【0100】
化合物１の合成
無水メタノール（３３ｍＬ）を５０ｍＬの丸底フラスコに充填した。メタノール中のナトリウムメトキシド（３０％溶液、２５μＬ、０．１３５ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を周囲温度で５分間撹拌した。エチル３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－チオ－Ｄ－グルコピラノシド（化合物Ｄ）（３．０９ｇ、６．４４ｍｍｏｌ）を、添加中に固体が溶解することができる速度で、１０分にわたって少しずつ加えた（約２００ｍｇ）。反応物を周囲温度で２．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）は、化合物Ｄ（Ｒｆ＝０．９）の完全な消費および１つのより極性の高いスポットの形成を示した：Ｒｆ＝０．５。試料を採取し、ＨＰＬＣによる反応完了ＩＰＣ（０．８ｍＬのアセトニトリルおよび０．２ｍＬの水中の２．５μＬの反応混合物）にかけ、合格条件はＮＭＴ １．００面積％化合物Ｄであった。酢酸を加えた（８μＬ、０．１３９７ｍｍｏｌ）。ｐＨをディップスティックでチェックし、約ｐＨ＝５～６であることを確認した。混合物をロータリーエバポレーター（５０℃）でほぼ乾固するまで濃縮した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を加え、大部分を蒸発させた。残留物を１５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解／スラリー化し、ロータリーエバポレーターから取り出した。２ｍＬの石油エーテルを加え、混合物を周囲温度で撹拌した。結晶スラリーを一晩撹拌した。固体を焼結漏斗に収集し、ガソリン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で恒量になるまで乾燥させた。予想収量：１．９４ｇ（化合物Ｄから８５％）。
無水メタノール（３３ｍＬ）を５０ｍＬの丸底フラスコに充填した。メタノール中のナトリウムメトキシド（３０％溶液、２５μＬ、０．１３５ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を周囲温度で５分間撹拌した。エチル３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－チオ－Ｄ－グルコピラノシド（化合物Ｄ）（３．０９ｇ、６．４４ｍｍｏｌ）を、添加中に固体が溶解することができる速度で、１０分にわたって少しずつ加えた（約２００ｍｇ）。反応物を周囲温度で２．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）は、化合物Ｄ（Ｒｆ＝０．９）の完全な消費および１つのより極性の高いスポットの形成を示した：Ｒｆ＝０．５。試料を採取し、ＨＰＬＣによる反応完了ＩＰＣ（０．８ｍＬのアセトニトリルおよび０．２ｍＬの水中の２．５μＬの反応混合物）にかけ、合格条件はＮＭＴ １．００面積％化合物Ｄであった。酢酸を加えた（８μＬ、０．１３９７ｍｍｏｌ）。ｐＨをディップスティックでチェックし、約ｐＨ＝５～６であることを確認した。混合物をロータリーエバポレーター（５０℃）でほぼ乾固するまで濃縮した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を加え、大部分を蒸発させた。残留物を１５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解／スラリー化し、ロータリーエバポレーターから取り出した。２ｍＬの石油エーテルを加え、混合物を周囲温度で撹拌した。結晶スラリーを一晩撹拌した。固体を焼結漏斗に収集し、ガソリン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で恒量になるまで乾燥させた。予想収量：１．９４ｇ（化合物Ｄから８５％）。
【0101】
化合物２の合成
化合物１（２．０４０ｇ）をピリジン（２８ｍＬ）に溶解し、溶液を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターにて約半分の体積（約１４ｍＬ）に濃縮して、黄色の溶液を得た。さらにピリジンを加え（１４ｍＬ）、同じ方式で溶液をおよそ１４ｍＬに濃縮した。溶液をアルゴン下に置き、塩化トリチル（２．２９９ｇ、１．３６当量）を加えた後、空冷式冷却管を取り付け、溶液を撹拌しながら５０℃に加熱した。４時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物１ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を１０～１５℃に冷却した。塩化ベンゾイル（１．６０ｍＬ、２．３４当量）を、反応温度を２０℃未満に保ちながら、２０分間かけて滴加した。添加が完了したら、反応物を周囲温度まで温め、少なくとも３時間撹拌した。この時点で、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１５００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、化合物１の残留モノＢｚ誘導体 合計ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を０℃に冷却し、メタノール（０．８ｍＬ）をゆっくりと加えることによってクエンチし、反応温度が２０℃未満に保たれるようにする。次に、クエンチした反応物を周囲温度に温めた。
化合物１（２．０４０ｇ）をピリジン（２８ｍＬ）に溶解し、溶液を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターにて約半分の体積（約１４ｍＬ）に濃縮して、黄色の溶液を得た。さらにピリジンを加え（１４ｍＬ）、同じ方式で溶液をおよそ１４ｍＬに濃縮した。溶液をアルゴン下に置き、塩化トリチル（２．２９９ｇ、１．３６当量）を加えた後、空冷式冷却管を取り付け、溶液を撹拌しながら５０℃に加熱した。４時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物１ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を１０～１５℃に冷却した。塩化ベンゾイル（１．６０ｍＬ、２．３４当量）を、反応温度を２０℃未満に保ちながら、２０分間かけて滴加した。添加が完了したら、反応物を周囲温度まで温め、少なくとも３時間撹拌した。この時点で、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１５００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、化合物１の残留モノＢｚ誘導体 合計ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を０℃に冷却し、メタノール（０．８ｍＬ）をゆっくりと加えることによってクエンチし、反応温度が２０℃未満に保たれるようにする。次に、クエンチした反応物を周囲温度に温めた。
【0102】
生成物の混合物をトルエン（２０ｍＬ）で希釈し、周囲温度で１時間撹拌した後、焼結漏斗により濾過して沈殿物を除去した。次に、トルエン溶液をクエン酸（２０％ｗ／ｗ、４×２０ｍＬ）で洗浄し、続いて飽和ＮａＨＣＯ３（９％ｗ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄すると、存在する残留クエン酸との反応はわずかであった。次に、トルエン（上）層をブライン（２０ｍＬ）で洗浄した後、ロータリーエバポレーターで４０℃の浴温で蒸発させて、黄色／オレンジ色のシロップ（６．８３３ｇ）を得た。シロップはＩＰＣにかけた（Ｈ１ ＮＭＲ、合格条件ＮＭＴ ３０ｗｔ％残留トルエン）。予想収量：約６．８３３ｇ（１４７％）。
【0103】
化合物３の合成
氷酢酸（６４８ｍＬ）および超純水（７２ｍＬ）を一緒に混合して、９０％酢酸溶液を得た。酢酸溶液の一部（７１０ｍＬ）を、撹拌棒とともに粗化合物２（１１１ｇ）に加えた。空冷冷却管をフラスコに取り付け、次に混合物を７０℃に加熱した。２は粘稠であるため、混合物は１時間２０分後にようやく完全に溶解し、その時点で撹拌を開始した。２時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物２ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが仕様を満たすとすぐに、反応物を周囲温度に冷却した。混合物を焼結漏斗に移し、沈殿したトリチルアルコール（３１．０９ｇ）をハウスバキュームを使用して濾別した。フラスコをさらに９０％酢酸（４０ｍＬ）ですすぎ、洗浄液全体を混合容器に移した。トルエン（７００ｍＬ）と水（７００ｍＬ）を加えて完全に混合した。水（下）層は濁った白い溶液であり、ｐＨについて試験した（＜２であると予想された）。水でさらに２回洗浄を繰り返した（２×７００ｍＬ；それぞれ約２．４および約３のｐＨ、無色透明溶液）。飽和ＮａＨＣＯ３（９％ｗ／ｖ、７００ｍＬ）を混合容器に加えると、わずかな反応（ガスの放出）が発生した。次に、トルエン（上）層をブライン（７００ｍＬ）で洗浄した後、ロータリーエバポレーターで４０℃の浴温にて蒸発させて、黄色／オレンジ色の固液混合物（８６ｇ）を得た。この混合物を、４００ｍＬのトルエン（３００ｍＬ＋１００ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル：トルエン（１：１、ｖ：ｖ）で平衡化されたシリカカラム（４５０ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（７９０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の４ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の８ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１２ＣＶ）
石油エーテル中の１５ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の２０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、（４ＣＶ）
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１ＣＶ）
氷酢酸（６４８ｍＬ）および超純水（７２ｍＬ）を一緒に混合して、９０％酢酸溶液を得た。酢酸溶液の一部（７１０ｍＬ）を、撹拌棒とともに粗化合物２（１１１ｇ）に加えた。空冷冷却管をフラスコに取り付け、次に混合物を７０℃に加熱した。２は粘稠であるため、混合物は１時間２０分後にようやく完全に溶解し、その時点で撹拌を開始した。２時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物２ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが仕様を満たすとすぐに、反応物を周囲温度に冷却した。混合物を焼結漏斗に移し、沈殿したトリチルアルコール（３１．０９ｇ）をハウスバキュームを使用して濾別した。フラスコをさらに９０％酢酸（４０ｍＬ）ですすぎ、洗浄液全体を混合容器に移した。トルエン（７００ｍＬ）と水（７００ｍＬ）を加えて完全に混合した。水（下）層は濁った白い溶液であり、ｐＨについて試験した（＜２であると予想された）。水でさらに２回洗浄を繰り返した（２×７００ｍＬ；それぞれ約２．４および約３のｐＨ、無色透明溶液）。飽和ＮａＨＣＯ３（９％ｗ／ｖ、７００ｍＬ）を混合容器に加えると、わずかな反応（ガスの放出）が発生した。次に、トルエン（上）層をブライン（７００ｍＬ）で洗浄した後、ロータリーエバポレーターで４０℃の浴温にて蒸発させて、黄色／オレンジ色の固液混合物（８６ｇ）を得た。この混合物を、４００ｍＬのトルエン（３００ｍＬ＋１００ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル：トルエン（１：１、ｖ：ｖ）で平衡化されたシリカカラム（４５０ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（７９０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の４ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の８ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１２ＣＶ）
石油エーテル中の１５ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の２０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、（４ＣＶ）
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１ＣＶ）
【0104】
生成物を、１４画分にわたって溶出した。ＴＬＣを使用して、画分を含有する生成物の位置を特定した。すべての画分を、ＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、１０．１４分でのＮＭＴ １．５０面積％のピークおよび１０．９４分でのＮＭＴ １．５０面積％のピーク）。ＩＰＣを満たさない画分は、化合物４への処理のために取っておいた。合わせた画分を４５℃の浴温でロータリーエバポレーターで蒸発させ、無色のシロップを得た。予想収量：約６０ｇ（７８％）。
【0105】
化合物４の合成
粗化合物３（３９．５４ｇ、約２１ｇの化合物３、約３７ｍｍｏｌを含有、３のクロマトグラフィーの直前に採取）をトルエン（７．２ｍＬ）に溶解し、乾燥ピリジン（１４．２ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ、約４．８当量）を加え、均質な溶液を得た。無水酢酸７．２ｍＬ（７６ｍｍｏｌ、約２．１当量）を加え、混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応固体の沈殿中に、この沈殿物の一部は化合物４である可能性が高かった。反応をＩＰＣ用にサンプリングし、検出された化合物３の量が＞１．００面積％である場合は、乾燥ピリジン（１．４ｍＬ、１７当量）をさらに充填し、残留化合物３が液相で≦１．００面積％になるまで反応を続けた。
粗化合物３（３９．５４ｇ、約２１ｇの化合物３、約３７ｍｍｏｌを含有、３のクロマトグラフィーの直前に採取）をトルエン（７．２ｍＬ）に溶解し、乾燥ピリジン（１４．２ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ、約４．８当量）を加え、均質な溶液を得た。無水酢酸７．２ｍＬ（７６ｍｍｏｌ、約２．１当量）を加え、混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応固体の沈殿中に、この沈殿物の一部は化合物４である可能性が高かった。反応をＩＰＣ用にサンプリングし、検出された化合物３の量が＞１．００面積％である場合は、乾燥ピリジン（１．４ｍＬ、１７当量）をさらに充填し、残留化合物３が液相で≦１．００面積％になるまで反応を続けた。
【0106】
反応物をジクロロメタン（１１２ｍＬ）で希釈し、次に水（２．８ｍＬ）およびメタノール（２．８ｍｌ）を加えた。混合物を２５℃で３時間撹拌した。この撹拌期間は、過剰な無水酢酸をクエンチするのに十分であることが示された。混合物を、クエン酸一水和物／水２０／８０ｗ／ｗ（１１２ｍＬ）で洗浄した。水相をジクロロメタン（５０ｍＬ）で逆抽出した。逆抽出に使用されたジクロロメタンは取っておき、残りのクエン酸洗浄液から水相を逆抽出するために使用した。主なジクロロメタン抽出物を容器に戻し、水相のｐＨが≦２になるまでクエン酸洗浄プロセスを繰り返した（通常はさらに２回洗浄する）。合わせたクエン酸洗浄液を逆抽出した。次に、逆抽出物と主なジクロロメタン抽出物を合わせた。得られたジクロロメタン溶液を５％ｗ／ｖ ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で洗浄し、ジクロロメタン相を採取し、水（１００ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン相を蒸発容器に移し、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、溶液をシロップに濃縮した。
【0107】
酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、撹拌しながら５５℃に加熱することにより生成物を溶解させた。石油エーテル６０－８０（２００ｍＬ）を加え、溶液を５５℃に再加熱して５分間保持した。溶液を４５℃に冷却し、種結晶（３０ｍｇ）を加え、次に撹拌しながら３時間かけて１８℃に冷却し、１８℃で少なくとも１時間保持した。結晶を濾過により収集し、酢酸エチル／石油エーテル（１／２ｖ／ｖ、６０ｍＬ）で洗浄した。減圧下で乾燥させると、化合物４（１６．０４ｇ、２から７７％）が得られた。予想収量：１６．０ｇ（化合物２から７７％）。
【0108】
化合物３．１の合成
３－アミノプロパン－１－オール（７．０１ｇ、９３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。クロロギ酸ベンジル（５．４０ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、内部反応温度を１０℃未満に保ちながら滴加した。完了したら、フラスコを室温で２時間撹拌した。ＮＭＲ分析のために取り出された試料（ＩＰＣ：２０μＬ＋０．６ｍＬ ｄ６－ＤＭＳＯ）は、クロロギ酸ベンジル試薬が消費されたことを示していた。次に、生成物の混合物をクエン酸（１０％ｗ／ｗ、２×９０ｍＬ）、水（９０ｍＬ）、およびブライン（９０ｍＬ）で洗浄した。次に、ＤＣＭ（下）層を４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させ、わずかに濁った油／液体（６．４５５ｇ）を得た。この油を酢酸エチル（７ｍＬ）に溶解し、必要に応じて４０℃に温めて沈殿した固体を溶解し、次に室温まで冷却した。石油エーテル（４ｍＬ）を種結晶と一緒に撹拌溶液にゆっくりと加え、その時点で生成物はゆっくりと結晶化し始めた。生成物の大部分が沈殿したら、石油エーテルの最後の部分（１７ｍＬ）をゆっくりと加えた（加えた全溶媒： 酢酸エチル：石油エーテル１：３、２１ｍＬ）。次に、生成物を減圧下にて濾過し、石油エーテル（５ｍＬ）で洗浄して、生成物を微細な白色の粉末（４．７２ｇ）として得た。予想収量：約４．７ｇ（６１％）。
３－アミノプロパン－１－オール（７．０１ｇ、９３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。クロロギ酸ベンジル（５．４０ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、内部反応温度を１０℃未満に保ちながら滴加した。完了したら、フラスコを室温で２時間撹拌した。ＮＭＲ分析のために取り出された試料（ＩＰＣ：２０μＬ＋０．６ｍＬ ｄ６－ＤＭＳＯ）は、クロロギ酸ベンジル試薬が消費されたことを示していた。次に、生成物の混合物をクエン酸（１０％ｗ／ｗ、２×９０ｍＬ）、水（９０ｍＬ）、およびブライン（９０ｍＬ）で洗浄した。次に、ＤＣＭ（下）層を４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させ、わずかに濁った油／液体（６．４５５ｇ）を得た。この油を酢酸エチル（７ｍＬ）に溶解し、必要に応じて４０℃に温めて沈殿した固体を溶解し、次に室温まで冷却した。石油エーテル（４ｍＬ）を種結晶と一緒に撹拌溶液にゆっくりと加え、その時点で生成物はゆっくりと結晶化し始めた。生成物の大部分が沈殿したら、石油エーテルの最後の部分（１７ｍＬ）をゆっくりと加えた（加えた全溶媒： 酢酸エチル：石油エーテル１：３、２１ｍＬ）。次に、生成物を減圧下にて濾過し、石油エーテル（５ｍＬ）で洗浄して、生成物を微細な白色の粉末（４．７２ｇ）として得た。予想収量：約４．７ｇ（６１％）。
【0109】
化合物５の合成
化合物４（１．０５ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥アセトン（１２ｍＬ、０．０６％ｗ／ｗ水）および水（３９μＬ、２．１５ｍｍｏｌ、１．３当量）に周囲温度で溶解した。次に、溶液を－１０℃に冷却した。ＮＢＳ（０．６３９ｇ、３．５９ｍｍｏｌ、２．０８当量）を一度に加えた。およそ＋７℃の発熱が予想され、次いで溶液を直ちに－１０℃に再冷却した。ＮＢＳ添加の１５分後、反応混合物をＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、合格条件 ２．００面積％未満の化合物４が残っている）。反応が完了しなかった場合、１．００当量のＮＢＳ（０．３０７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．００当量）を一度に加え、－１０℃でさらに１５分間反応を保持し、さらにＩＰＣを実行した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えることにより反応をクエンチし、冷却を停止し、以下の添加中に混合物を１０～２０℃に温めた。３～５分間撹拌した後、さらにＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加え、撹拌を５分間続けた。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、１０ｍＬ）の最終アリコートを撹拌しながら加え、続いてチオ硫酸ナトリウム（２０％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えた。混合物を２０分間１０～２０℃で撹拌し、次に固体を濾過によって収集した。容器をＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）によりフィルターパッド上ですすぎ、このすすぎ液を濾別した。次に、フィルターケーキをＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）、次に水（２５ｍＬ）で連続的にすすいだ。（まだ湿っている）フィルターケーキをＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、２ロットのＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄し、次に水（２０ｍＬ）で１回洗浄した。ジクロロメタン層を回転蒸発により乾燥させた後、６５℃で酢酸エチル（３６ｍＬ）に溶解した。次に、石油エーテル６０－８０（１０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくりと加え、混合物を４５℃に冷却し、４５℃で３０分間撹拌した。追加の石油エーテル６０－８０（２２ｍＬ）を撹拌しながら加え、撹拌混合物を２時間かけて１５℃に冷却した。生成物を濾過により収集し、石油エーテル／酢酸エチル２／１ｖ／ｖ（２０ｍＬ）で洗浄し、次に減圧下にて乾燥させて、化合物５（０．８０５ｇ、８３％収量、ＨＰＬＣによるαおよびβアノマーの合計純度は９８％であった）を得た。
化合物４（１．０５ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥アセトン（１２ｍＬ、０．０６％ｗ／ｗ水）および水（３９μＬ、２．１５ｍｍｏｌ、１．３当量）に周囲温度で溶解した。次に、溶液を－１０℃に冷却した。ＮＢＳ（０．６３９ｇ、３．５９ｍｍｏｌ、２．０８当量）を一度に加えた。およそ＋７℃の発熱が予想され、次いで溶液を直ちに－１０℃に再冷却した。ＮＢＳ添加の１５分後、反応混合物をＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、合格条件 ２．００面積％未満の化合物４が残っている）。反応が完了しなかった場合、１．００当量のＮＢＳ（０．３０７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．００当量）を一度に加え、－１０℃でさらに１５分間反応を保持し、さらにＩＰＣを実行した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えることにより反応をクエンチし、冷却を停止し、以下の添加中に混合物を１０～２０℃に温めた。３～５分間撹拌した後、さらにＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加え、撹拌を５分間続けた。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、１０ｍＬ）の最終アリコートを撹拌しながら加え、続いてチオ硫酸ナトリウム（２０％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えた。混合物を２０分間１０～２０℃で撹拌し、次に固体を濾過によって収集した。容器をＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）によりフィルターパッド上ですすぎ、このすすぎ液を濾別した。次に、フィルターケーキをＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）、次に水（２５ｍＬ）で連続的にすすいだ。（まだ湿っている）フィルターケーキをＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、２ロットのＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄し、次に水（２０ｍＬ）で１回洗浄した。ジクロロメタン層を回転蒸発により乾燥させた後、６５℃で酢酸エチル（３６ｍＬ）に溶解した。次に、石油エーテル６０－８０（１０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくりと加え、混合物を４５℃に冷却し、４５℃で３０分間撹拌した。追加の石油エーテル６０－８０（２２ｍＬ）を撹拌しながら加え、撹拌混合物を２時間かけて１５℃に冷却した。生成物を濾過により収集し、石油エーテル／酢酸エチル２／１ｖ／ｖ（２０ｍＬ）で洗浄し、次に減圧下にて乾燥させて、化合物５（０．８０５ｇ、８３％収量、ＨＰＬＣによるαおよびβアノマーの合計純度は９８％であった）を得た。
【0110】
化合物７の合成：
化合物４（５００ｍｇ）および中間体３．１（２１１ｍｇ、１．２当量）を乾燥フラスコに量り入れ、トルエン（５ｍＬ）を加え、溶液をロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で濃縮した。これをもう一度繰り返した後、出発材料を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）から濃縮した。すべての溶媒を除去したら、残りの固体を減圧下にて１０分間乾燥させた。乾燥後、出発材料をアルゴン下に置き、無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）に溶解し、活性化４Å分子篩（４５０ｍｇ、ペレット状）を加えた。この時点で、ＮＩＳ試薬を高減圧下に置いて乾燥させた。１０分後、乾燥ＮＩＳ（４００ｍｇ、２．０当量）を加え、溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、ＴＭＳＯＴｆ（８μＬ、５ｍｏｌ％）をすばやく加え、これにより、溶液が赤／オレンジから濃い赤／褐色に変化した。反応温度も２２℃から２７℃に上昇した。ＴＭＳＯＴｆを加えるとすぐに、参考までにＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮ－Ｈ２Ｏ（８：２）に１０μＬ）。次に、ピリジン（２０μＬ、０．２４５ｍｍｏｌ）を加えて反応をクエンチし、周囲温度で５分間撹拌した。ＤＣＭ溶液を濾過して分子篩を除去し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（３×５ｍＬ）、ブライン（５ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４０℃浴温）で濃縮して、粗化合物７を発泡状の黄色い油（６１６ｍｇ）として得た。予想収量：約６１６ｍｇ、（９９％）。
化合物４（５００ｍｇ）および中間体３．１（２１１ｍｇ、１．２当量）を乾燥フラスコに量り入れ、トルエン（５ｍＬ）を加え、溶液をロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で濃縮した。これをもう一度繰り返した後、出発材料を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）から濃縮した。すべての溶媒を除去したら、残りの固体を減圧下にて１０分間乾燥させた。乾燥後、出発材料をアルゴン下に置き、無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）に溶解し、活性化４Å分子篩（４５０ｍｇ、ペレット状）を加えた。この時点で、ＮＩＳ試薬を高減圧下に置いて乾燥させた。１０分後、乾燥ＮＩＳ（４００ｍｇ、２．０当量）を加え、溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、ＴＭＳＯＴｆ（８μＬ、５ｍｏｌ％）をすばやく加え、これにより、溶液が赤／オレンジから濃い赤／褐色に変化した。反応温度も２２℃から２７℃に上昇した。ＴＭＳＯＴｆを加えるとすぐに、参考までにＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮ－Ｈ２Ｏ（８：２）に１０μＬ）。次に、ピリジン（２０μＬ、０．２４５ｍｍｏｌ）を加えて反応をクエンチし、周囲温度で５分間撹拌した。ＤＣＭ溶液を濾過して分子篩を除去し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（３×５ｍＬ）、ブライン（５ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４０℃浴温）で濃縮して、粗化合物７を発泡状の黄色い油（６１６ｍｇ）として得た。予想収量：約６１６ｍｇ、（９９％）。
【0111】
化合物８の合成：
粗化合物７（１６．６ｇ）を、トルエン（２×３０ｍＬ）から、次に無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）からの蒸発によって乾燥させて、黄色の発泡体／油を生成した。次に、フラスコをアルゴン雰囲気下に置いてから、無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）および乾燥ＭｅＯＨ（２６０ｍＬ）を加え、混合物を撹拌した。次に、フラスコを０℃に冷却した。内部温度を１０℃未満に維持しながら、塩化アセチル（３．３０ｍＬ、２．０当量）を滴加した。添加が完了すると、混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。この時点でＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮに２０μＬ、残留化合物７は３面積％以下）。次にフラスコを０℃に冷却し、Ｎ－メチルモルホリン（合計７．０ｍＬが必要）を加えることにより、生成物溶液のｐＨをｐＨ６．５～７．５に調整した。生成物の混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）で洗浄した。２回目のＨ２Ｏ洗浄物は濁っており、ＴＬＣによる標的材料が含まれていたため、これをＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。次に、合わせたＤＣＭ層をブライン（８ｍＬ）で洗浄した後、４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させて、オフホワイトの発泡体／油（約１６．８ｇ）を得た。この混合物を、１４０ｍＬのトルエン（１００ｍＬ＋４０ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチルで平衡化されたシリカカラム（８５ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（１４０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
石油エーテル中の３５ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の４０ｖｏｌ％酢酸エチル（９ＣＶ）
石油エーテル中の５０ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の６０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
生成物を、１２画分にわたって溶出した。すべての画分を、ＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、２３０ｎｍでのＮＭＴ１．５０面積％の不純物ピーク）。合わせた画分を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターで蒸発させ、オフホワイトの発泡体を得、これを固化させて８をカリカリした固体（１０．４５ｇ）として得た。予想収量：１０．４５ｇ（６６％）。
［実施例４］
粗化合物７（１６．６ｇ）を、トルエン（２×３０ｍＬ）から、次に無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）からの蒸発によって乾燥させて、黄色の発泡体／油を生成した。次に、フラスコをアルゴン雰囲気下に置いてから、無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）および乾燥ＭｅＯＨ（２６０ｍＬ）を加え、混合物を撹拌した。次に、フラスコを０℃に冷却した。内部温度を１０℃未満に維持しながら、塩化アセチル（３．３０ｍＬ、２．０当量）を滴加した。添加が完了すると、混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。この時点でＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮに２０μＬ、残留化合物７は３面積％以下）。次にフラスコを０℃に冷却し、Ｎ－メチルモルホリン（合計７．０ｍＬが必要）を加えることにより、生成物溶液のｐＨをｐＨ６．５～７．５に調整した。生成物の混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）で洗浄した。２回目のＨ２Ｏ洗浄物は濁っており、ＴＬＣによる標的材料が含まれていたため、これをＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。次に、合わせたＤＣＭ層をブライン（８ｍＬ）で洗浄した後、４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させて、オフホワイトの発泡体／油（約１６．８ｇ）を得た。この混合物を、１４０ｍＬのトルエン（１００ｍＬ＋４０ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチルで平衡化されたシリカカラム（８５ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（１４０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
石油エーテル中の３５ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の４０ｖｏｌ％酢酸エチル（９ＣＶ）
石油エーテル中の５０ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の６０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
生成物を、１２画分にわたって溶出した。すべての画分を、ＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、２３０ｎｍでのＮＭＴ１．５０面積％の不純物ピーク）。合わせた画分を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターで蒸発させ、オフホワイトの発泡体を得、これを固化させて８をカリカリした固体（１０．４５ｇ）として得た。予想収量：１０．４５ｇ（６６％）。
［実施例４］
【0112】
ジスルフィドの合成（化合物１７）
【0113】
【化17】
【0114】
化合物１７
化合物１７を合成するための全体的な合成手順は、以下の合成スキームに記載される。
化合物１７を合成するための全体的な合成手順は、以下の合成スキームに記載される。
【0115】
【化18】
【0116】
化合物９の合成：
化合物５（１６２０ｇ、１．１８当量）およびトルエン（１８ｋｇ）を、この順序で５０Ｌのビュッヒボウルに充填した。ボウルを、５０±１０℃に設定された水浴にて３０分間温めた。溶媒が蒸留されなくなるまで、５０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。水浴を２０±１０℃に冷却した。トリクロロアセトニトリル（７．１ｋｇ、２１当量）および乾燥ＤＣＭ（６．５ｋｇ）を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。乾燥ＤＣＭ（２５０ｇ）中の水素化ナトリウム（５．６ｇ、０．０６０当量）の懸濁液を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。ボウルの内容物を、２０±１０℃の水浴温で１～２時間回転させて混合した。化合物５を、反応中に溶解させた。ボウルの内容物をサンプリングし、反応完了ＩＰＣ（Ｈ１ ＮＭＲ、６．３５ｐｐｍ（出発材料）のトリプレットと比較して６．４２ｐｐｍ（生成物）のトリプレットピークを統合；合格条件≦５％の残留出発材料）にかけた。化合物３（１３６０ｇ、２．３５ｍｏｌ）、乾燥ＤＣＭ（１２．３ｋｇ）、粉末分子篩４Å（１３６ｇ）をこの順序で５０Ｌ反応器に充填した。反応器の内容物を２４時間混合した。反応器の内容物をシリンジフィルターでサンプリングし、カールフィッシャー（ＡＭ－ＧＥＮ－０１１、合格条件≦０．０３％ｗ／ｗ）で分析した。水分閾値に達した後（約２４時間）、反応器の内容物を０±５℃に調整した。ビュッヒボウルの内容物を、容量が許す限り反応器ヘッダーに移した。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１００ｇ、０．１８当量）の溶液を、窒素雰囲気下で反応器に充填した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。添加には１５～２０分かかった。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）をビュッヒボウルに充填し、反応器ヘッダーに移した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。反応器の内容物を０±５℃で６０分間撹拌した。反応器の内容物を、ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格基準≦５％出発物質）を使用して反応完了のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（８５ｇ、０．３６当量）を反応器に充填することにより、反応をクエンチした。反応器の内容物を、ＩＰＣ（湿潤ｐＨ紙、合格基準≧ｐＨ７）を使用してクエンチ完了のためにサンプリングした。シリカゲル（４．９ｋｇ）をビュッヒボウルに充填した。反応器の内容物を、ビュッヒボウルに移した。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。シリカゲル（１．４ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、続いてジクロロメタン（７．０ｋｇ）を使用して反応器をすすいだ。ボウルの内容物を回転させて、固体がボウルの表面に付着しないようにした。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を、シリカゲルクロマトグラフィーのために３つの部分に分割した。１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（７．８ｋｇ）および石油エーテル（２２ｋｇ）を、シリカゲルに吸着した反応混合物の１／３とともに、５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合してから、Ｂｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。カラムは３つのバッチで実行して、それぞれを以下に説明するように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
化合物５（１６２０ｇ、１．１８当量）およびトルエン（１８ｋｇ）を、この順序で５０Ｌのビュッヒボウルに充填した。ボウルを、５０±１０℃に設定された水浴にて３０分間温めた。溶媒が蒸留されなくなるまで、５０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。水浴を２０±１０℃に冷却した。トリクロロアセトニトリル（７．１ｋｇ、２１当量）および乾燥ＤＣＭ（６．５ｋｇ）を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。乾燥ＤＣＭ（２５０ｇ）中の水素化ナトリウム（５．６ｇ、０．０６０当量）の懸濁液を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。ボウルの内容物を、２０±１０℃の水浴温で１～２時間回転させて混合した。化合物５を、反応中に溶解させた。ボウルの内容物をサンプリングし、反応完了ＩＰＣ（Ｈ１ ＮＭＲ、６．３５ｐｐｍ（出発材料）のトリプレットと比較して６．４２ｐｐｍ（生成物）のトリプレットピークを統合；合格条件≦５％の残留出発材料）にかけた。化合物３（１３６０ｇ、２．３５ｍｏｌ）、乾燥ＤＣＭ（１２．３ｋｇ）、粉末分子篩４Å（１３６ｇ）をこの順序で５０Ｌ反応器に充填した。反応器の内容物を２４時間混合した。反応器の内容物をシリンジフィルターでサンプリングし、カールフィッシャー（ＡＭ－ＧＥＮ－０１１、合格条件≦０．０３％ｗ／ｗ）で分析した。水分閾値に達した後（約２４時間）、反応器の内容物を０±５℃に調整した。ビュッヒボウルの内容物を、容量が許す限り反応器ヘッダーに移した。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１００ｇ、０．１８当量）の溶液を、窒素雰囲気下で反応器に充填した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。添加には１５～２０分かかった。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）をビュッヒボウルに充填し、反応器ヘッダーに移した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。反応器の内容物を０±５℃で６０分間撹拌した。反応器の内容物を、ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格基準≦５％出発物質）を使用して反応完了のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（８５ｇ、０．３６当量）を反応器に充填することにより、反応をクエンチした。反応器の内容物を、ＩＰＣ（湿潤ｐＨ紙、合格基準≧ｐＨ７）を使用してクエンチ完了のためにサンプリングした。シリカゲル（４．９ｋｇ）をビュッヒボウルに充填した。反応器の内容物を、ビュッヒボウルに移した。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。シリカゲル（１．４ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、続いてジクロロメタン（７．０ｋｇ）を使用して反応器をすすいだ。ボウルの内容物を回転させて、固体がボウルの表面に付着しないようにした。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を、シリカゲルクロマトグラフィーのために３つの部分に分割した。１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（７．８ｋｇ）および石油エーテル（２２ｋｇ）を、シリカゲルに吸着した反応混合物の１／３とともに、５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合してから、Ｂｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。カラムは３つのバッチで実行して、それぞれを以下に説明するように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
【0117】
酢酸エチル（１．６ｋｇ）および石油エーテル（４．４ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、完全に混合してから、カラムから溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0118】
酢酸エチル（２５ｋｇ）および石油エーテル（２６ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0119】
酢酸エチル（３１ｋｇ）および石油エーテル（２２ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を５Ｌのガラスラボボトルに収集した。
【0120】
酢酸エチル（１６ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0121】
乾燥負荷シリカの残りの２つの部分を用意して、上記のようにカラムを繰り返した。
【0122】
カラム画分を生成物純度（ＴＬＣ［トルエン中１０％アセトン、Ｒｆ ０．５］でサンプリングして、生成物を含む画分を同定した。受け入れられたカラム画分を合わせて、１００Ｌビュッヒボウルに入れた。トルエンを使用して、受け入れられた画分容器から結晶性材料をすすいでボウルに入れた。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。トルエン（１．７ｋｇ）をボウルに充填し、固体が溶解するまで内容物を回転させた。ｔ－ブチルメチルエーテル（４．４ｋｇ）を、２０～４０分かけてボウルに充填した。ボウルの内容物を、２０±５℃の温度で１２～２４時間回転させた。ボウルの内容物を６Ｌ ヌッチェフィルターに移し、減圧濾過によって溶媒を除去した。ｔ－ブチルメチルエーテル（６２０ｇ）をボウルに充填し、ヌッチェフィルターに移し、フィルターケーキに通した。フィルターケーキをフィルター内で風乾した後、真空オーブンに移し、３０℃の設定で減圧下にて乾燥させて残留溶媒を除去した。分析および保持のために固体をサンプリングした。固体をねじ蓋付きナルゲン容器に移し、－１５℃以下で保存した。予想収量：１．６８～１．９４ｋｇ化合物９（６５～７５％）。
【0123】
化合物１０の合成：
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミド（２４１ｇ、２．２０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（３０００ｇ）中の塩化ナトリウム（３００ｇ）溶液を、５Ｌのラボボトルで調製した。水（６０００ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（１１００ｇ）の溶液を、５０Ｌの反応器で調製し、２つの部分に分配した。
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミド（２４１ｇ、２．２０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（３０００ｇ）中の塩化ナトリウム（３００ｇ）溶液を、５Ｌのラボボトルで調製した。水（６０００ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（１１００ｇ）の溶液を、５０Ｌの反応器で調製し、２つの部分に分配した。
【0124】
化合物８（３５５ｇ、０．４８６ｍｏｌ）および化合物９（６３４ｇ、１．１０当量）を、２０Ｌビュッヒボウルに充填し、続いてトルエン（１５００ｇ）を入れ、溶解するまで４０±５℃で加熱した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。トルエン（１５００ｇ）をビュッヒボウルに充填した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。乾燥ジクロロメタン（４０００ｇ）をビュッヒボウルに充填した。固体が溶解するまでボウルを回転させ、溶液をジャケット温度２０℃±５℃の５Ｌ反応器に移した。乾燥ジクロロメタン（７１０ｇ）をビュッヒボウルに充填した。ボウルを回転させてボウル表面をすすぎ、溶液を５Ｌ反応器に移した。反応器の内容物を、試薬比ＩＰＣ（Ｈ１ ＮＭＲ）のためにサンプリングした。乾燥Ｎ－ヨードスクシンイミドを窒素雰囲気下で反応器に入れ、反応器を５～１５分間撹拌した。反応器の内容物を、２０℃±３℃に調整した。乾燥ＤＣＭ（６０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（５．９４ｇ、０．０５５当量）を、内容物の温度を２０℃±３℃に維持しながら５～１５分かけて反応器に充填した。反応混合物を、２０℃±３℃で２０±３分間撹拌した。反応器の内容物を、反応完了（ＨＰＬＣ）のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（９８ｇ、２当量）を反応器に充填し、完全に混合した。上で調製したチオ硫酸ナトリウム溶液の一部の１つを５０Ｌ反応器に充填した。５Ｌの反応器の内容物を、チオ硫酸ナトリウム溶液を含有する５０Ｌの反応器に移し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。
【0125】
ＤＣＭ（５７０ｇ）を、５０Ｌ反応器からの最上層とともに５Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶の前の最下層と合わせた。最上層を別のＨＤＰＥジェリー缶に移し、収量が確認されるまで保持した。合わせた有機相（下層）を５０Ｌの反応器に入れ、続いてチオ硫酸ナトリウムの別の部分を入れ、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。最上層を、収量が確認されるまでＨＤＰＥジェリー缶に保持した。塩化ナトリウム溶液を有機相（下層）とともに５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。シリカゲル（１３００ｇ）をビュッヒボウルに充填し、ロータリーエバポレーターを取り付けた。反応器の最下層を、ビュッヒボウルに充填した。ボウルの内容物を回転させてボウルへの吸着を防ぎ、固体が蒸留されなくなるまで４０±５℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を、２つの等しい部分に分割した。シリカゲル（２００ｇ）をビュッヒボウルに充填し、続いてジクロロメタン（７００ｇ）を充填した。ボウルの内容物を回転させて、固体がボウルの表面に付着しないようにした。溶媒が蒸留されなくなるまで、ボウルを、４０±１０℃の水浴温で減圧下にて蒸発させた。ボウルの内容物を、２つの部分に分割し、前のシリカゲル試料のそれぞれに一部を加えた。
【0126】
各部分を、以下の手順を使用してシリカゲル上で独立して精製した（精製を待つ間、試料を≦１５℃以下で保存した）：１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１６．５ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。上記からの乾燥充填シリカの一部をＢｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下のように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
【0127】
酢酸エチル（６．２ｋｇ）および石油エーテル（６．６ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0128】
酢酸エチル（１９．５ｋｇ）および石油エーテル（１９．２ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0129】
酢酸エチル（１３．６ｋｇ）および石油エーテル（１２．３ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0130】
酢酸エチル（１４．２ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0131】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．９ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を、画分１１まで２０Ｌのジェリー缶に、次に５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0132】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１１．０ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0133】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１３．２ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0134】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0135】
カラム画分を、生成物純度についてサンプリングした（生成物を含む画分を同定するためのＴＬＣ）。最初の２つのカラムからの７５～９５％の面積の化合物１０である画分を、シリカゲル（４００ｇ）を充填したビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を以下のように精製した：１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１６．５ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。ボウルの内容物をＢｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下のように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した：
【0136】
酢酸エチル（６．２ｋｇ）および石油エーテル（６．６ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0137】
酢酸エチル（１９．５ｋｇ）および石油エーテル（１９．２ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0138】
酢酸エチル（１３．６ｋｇ）および石油エーテル（１２．３ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0139】
酢酸エチル（１４．２ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0140】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．９ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を、画分１１まで２０Ｌのジェリー缶に、次に５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0141】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１１．０ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0142】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１３．２ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0143】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0144】
３つのカラムすべてから受け入れられたカラム画分をビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：４４０～５４０ｋｇ（５２～６４％の収量）。
【0145】
化合物１１の合成
ジクロロメタンを、化合物１０（６３５ｇ、０．３４５ｍｏｌ）（ＰＮ０６９９）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで３０±１０℃で加熱した。メタノール（３．２ｋｇ）をボウルに充填した。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。内容物の温度を０±１０℃に維持しながら、ジクロロメタン（６６０ｇ）中の塩化アセチル（５４．１ｇ、２当量）を、ボウルに充填した。ボウルの内容物を２０±３℃に調整し、混合物を４０～４８時間撹拌した。ボウルの内容物を、反応完了ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。Ｎ－メチルモルホリン（１３９ｇ、４当量）をボウルに充填し、完全に混合した。ボウルの内容物を、クエンチ完了ＩＰＣ（ｐＨ紙、合格≦ｐＨ７）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。酢酸エチル（４．８ｋｇ）および水（５．５ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、回転させてボウルの内容物を溶解させた。ボウルの内容物を、５０Ｌの反応器に移し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。ＨＤＰＥジェリー缶の最下層を、酢酸エチル（１．５ｋｇ）を入れた５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出し、収量が確認されるまで保持した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：５１８～６３３ｋｇ（９０～１１０％の収量）。
ジクロロメタンを、化合物１０（６３５ｇ、０．３４５ｍｏｌ）（ＰＮ０６９９）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで３０±１０℃で加熱した。メタノール（３．２ｋｇ）をボウルに充填した。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。内容物の温度を０±１０℃に維持しながら、ジクロロメタン（６６０ｇ）中の塩化アセチル（５４．１ｇ、２当量）を、ボウルに充填した。ボウルの内容物を２０±３℃に調整し、混合物を４０～４８時間撹拌した。ボウルの内容物を、反応完了ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。Ｎ－メチルモルホリン（１３９ｇ、４当量）をボウルに充填し、完全に混合した。ボウルの内容物を、クエンチ完了ＩＰＣ（ｐＨ紙、合格≦ｐＨ７）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。酢酸エチル（４．８ｋｇ）および水（５．５ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、回転させてボウルの内容物を溶解させた。ボウルの内容物を、５０Ｌの反応器に移し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。ＨＤＰＥジェリー缶の最下層を、酢酸エチル（１．５ｋｇ）を入れた５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出し、収量が確認されるまで保持した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：５１８～６３３ｋｇ（９０～１１０％の収量）。
【0146】
化合物１２の合成：
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミドの２つの部分（１４３ｇ、３．９０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（１８５０ｇ）中の塩化ナトリウム（４５０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、２つのほぼ等しい部分に分配した。水（２０８０ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（２３０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、４つのほぼ等しい部分に分配した。
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミドの２つの部分（１４３ｇ、３．９０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（１８５０ｇ）中の塩化ナトリウム（４５０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、２つのほぼ等しい部分に分配した。水（２０８０ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（２３０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、４つのほぼ等しい部分に分配した。
【0147】
化合物９（５０４ｇ、１．３０当量）を、化合物１１（６０７ｇ、０．３２７ｍｏｌ）、続いてトルエン（１５００ｇ）を含有する５０Ｌのビュッヒボウルに充填し、溶解するまで４０±５℃で加熱した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。トルエン（１５００ｇ）をビュッヒボウルに充填した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。乾燥ＤＣＭ（２４００ｇ）を、ビュッヒボウルに充填した。固体が溶解するまでボウルを回転させ、溶液の半分をジャケット温度２０℃±５℃の５Ｌ反応器に移した。溶液の残りの半分を、５Ｌのラボボトルに移した。乾燥ＤＣＭ（７１０ｇ）を、ビュッヒボウルに充填した。ボウルを回転させてボウル表面をすすぎ、溶液の半分を５Ｌ反応器に移した。残りの半分を、上記の５Ｌラボボトルに充填し、第２のバッチで使用するために窒素下で保存した。乾燥Ｎ－ヨードスクシンイミドの一部を、窒素雰囲気下で反応器に充填した。反応器の内容物を、－４０℃±３℃に調整した。乾燥ジクロロメタン（９０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（９．０９ｇ、０．２５有効当量）を、内容物の温度を－４０℃±５℃に維持しながら１５分かけて反応器に充填した。反応混合物を、－４０℃±３℃で３０±５分間撹拌し、次に、－３０℃±３℃に調整し、１５０分間撹拌した。反応器の内容物を、反応完了のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（３３．１ｇ、２有効当量）を反応器に充填し、完全に混合した。上で調製したチオ硫酸ナトリウム溶液の部分の１つを５Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、５Ｌのラボボトルに排出した。ＤＣＭ（４００ｇ）を、５Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、５Ｌのラボボトルの前の最下層と合わせた。合わせた有機相を５Ｌの反応器に充填し、続いてチオ硫酸ナトリウムの別の部分を入れ、完全に混合した。最下層を、５Ｌのラボボトルに排出した。上の塩化ナトリウム溶液の部分を反応器に充填し、続いて前のラボボトルの内容物を入れた。反応器の最下層を、ビュッヒボウルに充填し、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発させた。反応器を洗浄して乾燥させた。
【0148】
化合物９と化合物１１の第２の部分を反応器に充填し、第１のバッチと同じように処理した。第２のバッチの有機抽出に続いて、反応混合物を反応器内で合わせた。塩化ナトリウム溶液の部分を反応器に充填し、完全に混合した。シリカゲル（１７００ｇ）をビュッヒボウルに充填し、ｒｏｔａｖａｐｏｒを取り付けた。反応器の最下層を、ビュッヒボウルに充填し、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発させた。ボウルの内容物を、２つの等しい部分に分割し、シリカゲルで独立して精製した。１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステム（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡの一部門であるＢｉｏｔａｇｅから市販されている）に設置した。酢酸エチル（７．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．０ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。上記からの乾燥充填シリカの一部をＢｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下のように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
【0149】
酢酸エチル（１．５ｋｇ）および石油エーテル（４．４ｋｇ）をＨＤＰＥジェリー缶に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0150】
酢酸エチル（１８．６ｋｇ）および石油エーテル（８．８ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0151】
酢酸エチル（１９．２ｋｇ）および石油エーテル（８．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0152】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0153】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５Ｌのガラスラボボトルに収集した。
【0154】
カラム画分を、生成物純度についてサンプリングした（生成物を含む画分を同定するためのＴＬＣ）。最初の２つのカラムからの７５～９５％の面積の化合物１２である画分を、シリカゲル（４００ｇ）を充填したビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。酢酸エチル（７．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．０ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。不純生成物を含有する乾燥充填シリカを、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下に詳述するように溶出した：
【0155】
酢酸エチル（１．５ｋｇ）および石油エーテル（４．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0156】
酢酸エチル（１９．２ｋｇ）および石油エーテル（８．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0157】
酢酸エチル（１８．６ｋｇ）および石油エーテル（８．８ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0158】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0159】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５Ｌのガラスラボボトルに収集した。
【0160】
カラム画分を、生成物純度についてサンプリングした（生成物を含む画分を同定するためのＴＬＣ、ＨＰＬＣ合格基準≧９５％化合物１２、および＞２．５％ 単一不純物なし）。３つのカラムすべてから受け入れられたカラム画分をビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：４９４～５８４ｋｇ（５２～６４％の収量）。
【0161】
化合物１３の合成：
氷酢酸（７．５ｋｇ）および酢酸エチル（６．５ｋｇ）を、好適な容器内で合わせ、「ＧＡＡ／ＥＡ溶液」とラベル付けした。重炭酸ナトリウム（０．５ｋｇ）を、ＲＯ水（１０ｋｇ）に溶解し、「５％ｗ／ｗ重炭酸ナトリウム溶液」とラベル付けした。活性化炭素上のパラジウム（１００ｇ、具体的にはＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、製品番号Ａ４０２０２８－１０）およびＧＡＡ／ＥＡ溶液（３３５ｇ）を、この順序で反応容器に充填した。化合物１２（２７０ｇ）をＧＡＡ／ＥＡ溶液（１８４０ｇ）に溶解し、５０Ｌの反応容器に移した。溶液を窒素で１０バールまで加圧することにより酸素をパージし、次に解放した。これをさらに２回繰り返した。反応器の内容物を水素下で１０バールまで加圧し、次に解放した。反応混合物を１．５日間２０バールＨ２で水素化した。次に圧力を解放し、窒素で１０バールまで加圧して溶液から水素をパージし、次に解放した。これを１回繰り返した。反応混合物をセライトパッド（３００ｇ）で濾過した。セライトケーキをＧＡＡ／ＥＡ溶液（２×５．５ｋｇ）で洗浄した。濾液を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物を酢酸エチル（２．３ｋｇ）と２回に分けて共蒸発させた。粗生成物の予想重量は約３１６ｇであった。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０ＭＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。酢酸エチル（１０．６ｋｇ）および氷酢酸（１．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を廃棄した。粗生成物を酢酸エチル（４２２ｇ）および氷河酢酸（５５ｇ）に溶解した。得られた溶液をＳＩＭに充填し、カラムに通した。反応混合物を、以下のようにクロマトグラフ処理した：
氷酢酸（７．５ｋｇ）および酢酸エチル（６．５ｋｇ）を、好適な容器内で合わせ、「ＧＡＡ／ＥＡ溶液」とラベル付けした。重炭酸ナトリウム（０．５ｋｇ）を、ＲＯ水（１０ｋｇ）に溶解し、「５％ｗ／ｗ重炭酸ナトリウム溶液」とラベル付けした。活性化炭素上のパラジウム（１００ｇ、具体的にはＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、製品番号Ａ４０２０２８－１０）およびＧＡＡ／ＥＡ溶液（３３５ｇ）を、この順序で反応容器に充填した。化合物１２（２７０ｇ）をＧＡＡ／ＥＡ溶液（１８４０ｇ）に溶解し、５０Ｌの反応容器に移した。溶液を窒素で１０バールまで加圧することにより酸素をパージし、次に解放した。これをさらに２回繰り返した。反応器の内容物を水素下で１０バールまで加圧し、次に解放した。反応混合物を１．５日間２０バールＨ２で水素化した。次に圧力を解放し、窒素で１０バールまで加圧して溶液から水素をパージし、次に解放した。これを１回繰り返した。反応混合物をセライトパッド（３００ｇ）で濾過した。セライトケーキをＧＡＡ／ＥＡ溶液（２×５．５ｋｇ）で洗浄した。濾液を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物を酢酸エチル（２．３ｋｇ）と２回に分けて共蒸発させた。粗生成物の予想重量は約３１６ｇであった。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０ＭＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。酢酸エチル（１０．６ｋｇ）および氷酢酸（１．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を廃棄した。粗生成物を酢酸エチル（４２２ｇ）および氷河酢酸（５５ｇ）に溶解した。得られた溶液をＳＩＭに充填し、カラムに通した。反応混合物を、以下のようにクロマトグラフ処理した：
【0162】
酢酸エチル（１３．８ｋｇ）および氷酢酸（１．８ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0163】
溶媒リザーバーの内容物を、ＳＩＭを介してカラムに通して溶出して、溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0164】
酢酸エチル（１０．３ｋｇ）、氷酢酸（１．３ｋｇ）およびメタノール（２０６ｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0165】
溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0166】
酢酸エチル（６．６ｋｇ）、氷酢酸（０．９ｋｇ）およびメタノール（３４０ｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0167】
溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、溶出液を約２．５Ｌの画分で５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0168】
酢酸エチル（３１．４ｋｇ）、氷酢酸（４．１ｋｇ）およびメタノール（３．４０ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0169】
溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0170】
化合物１３を含む画分を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物を酢酸エチル（３．１ｋｇ）に溶解し、５％ｗ／ｗ重炭酸ナトリウム溶液（９．３ｋｇ）で洗浄して、水性媒体のｐＨが≧８になるようにした。酢酸エチル相を、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。予想収量：１８２～２０７ｇ（７１～８１％）。
【0171】
化合物１６の合成
乾燥ジクロロメタン（２．５ｋｇ）を、化合物１３（２１１ｇ、７６．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで加熱せずに回転させた。乾燥ジクロロメタン（２００ｇ）中の（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）４－アセチルスルファニルブタノエート（２５．８ｇ、９９．４ｍｍｏｌ、１．３０当量）溶液を、ビュッヒボウルに加えた。ボウルを周囲温度で１時間回転させた後、４０±５℃の水浴温で減圧下にて濃縮した。トルエン（０．８ｋｇ）をボウルに加え、４０±５℃の水浴温で２回減圧下にて除去した。残留物にトルエン（０．８ｋｇ）を加えて溶解させた。シリカゲル（５５７ｇ）を反応容器に入れ、４０±５℃の水浴温で減圧下にて溶媒を除去した。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０Ｍ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。トルエン（１０．１ｋｇ）およびアセトン（１．０ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ａ）。反応混合物を、以下のように精製した：
乾燥ジクロロメタン（２．５ｋｇ）を、化合物１３（２１１ｇ、７６．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで加熱せずに回転させた。乾燥ジクロロメタン（２００ｇ）中の（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）４－アセチルスルファニルブタノエート（２５．８ｇ、９９．４ｍｍｏｌ、１．３０当量）溶液を、ビュッヒボウルに加えた。ボウルを周囲温度で１時間回転させた後、４０±５℃の水浴温で減圧下にて濃縮した。トルエン（０．８ｋｇ）をボウルに加え、４０±５℃の水浴温で２回減圧下にて除去した。残留物にトルエン（０．８ｋｇ）を加えて溶解させた。シリカゲル（５５７ｇ）を反応容器に入れ、４０±５℃の水浴温で減圧下にて溶媒を除去した。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０Ｍ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。トルエン（１０．１ｋｇ）およびアセトン（１．０ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ａ）。反応混合物を、以下のように精製した：
【0172】
溶媒Ａを、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を廃棄した。
【0173】
乾燥充填シリカゲルをＳＩＭに移した。
【0174】
トルエン（９．６ｋｇ）およびアセトン（１．５ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｂ）。
【0175】
溶媒Ｂを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0176】
トルエン（５３．６ｋｇ）およびアセトン（１２．２ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｃ）。
【0177】
溶媒Ｃを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集する。
【0178】
トルエン（８．４ｋｇ）およびアセトン（２．６ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｄ）。
【0179】
溶媒Ｄを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0180】
トルエン（２３．４ｋｇ）およびアセトン（９．２ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｅ）。
【0181】
溶媒Ｅを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0182】
化合物１６を含有する画分（合格基準≧９０％化合物１６および＞２．５％ 単一不純物なし）を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物をテトラヒドロフラン（４．４ｋｇ）に溶解し、４０±５℃の水浴温で減圧下にて濃縮した。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。予想収量：１６９～１９２ｇ（７６～８６％）。
【0183】
化合物１７の合成
反応器には、始動する前に、２．５Ｌ、３．５Ｌ、および３．９Ｌのレベルに印をつけ、これを真空コントローラに取り付けた。ジクロロメタンを１４０ｇの化合物１６を含有するビュッヒボウルに充填し、Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。ＤＣＭ（３３３ｇ）で２回すすいで、ビュッヒボウルの内容物をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。エタノール（２．５０ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加えた。反応混合物を２．５Ｌの印まで濃縮した（目標減圧 ２５０ｍｂａｒ）。エタノール（１．５８ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加え、３．５Ｌの印まで濃縮した。反応物を、エタノールで３．９Ｌの印まで希釈した。不完全真空を適用し、窒素を放出することにより、反応器の内容物を不活性ガス下に置いた。反応中、緩徐な窒素の流れを維持した。ヒドラジン一水和物（１．１３ｋｇ、１．１１Ｌ）を窒素雰囲気下で５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に充填した。温度勾配を、以下のように設定した：初期温度２０℃、最終温度６０℃、５０分（０．８度／分）を超える線形温度勾配、および反応器の内容物の能動制御。容器の温度を、６０℃で４５分間保持した。冷却勾配温度を－２度／分に設定し、最終温度は２０℃であった。内容物を、好適なＨＤＰＥジャグに排出し、重量を決定した。等量をＦＥＰカプセル化シール付きの８つのポリプロピレン遠心分離容器に移した。各遠心分離容器にエタノール（７５０ｇ）を充填し、周囲温度で３０分間撹拌した。容器を遠心分離にかけた（５３００ＲＣＦ、１５℃、３０分）。ヒュームフードから取り出す前に、ボトルの外側をアセトン、次に水ですすぐことにより、容器の外側にある残留ヒドラジンを除去した。遠心分離容器の上清をデカントし、残留ペレットを低エンドトキシン水（ＬＥ水）（１９６０ｇ）に溶解し、５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。１．５時間ごとにおよそ１５～２０分、分散管を使用して溶液に通気しながら内容物を中速で撹拌した。次に、反応物を密閉容器内で２０℃にて一晩撹拌した。ＩＰＣにより、遊離ペンタマー組成が３％（報告された全体の面積％）未満であると示されたら、反応は完了したとみなされた。反応混合物に不溶性材料が存在する場合は、濾過（Ｐ３焼結ガラス漏斗および５Ｌブフナーフラスコを使用）が必要であった。反応器の内容物を、２つのＬｙｏｇｕａｒｄトレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定した。凍結乾燥製品をＬＥ水（８４０ｇ）に溶解し、６つの遠心分離ボトルに均等に分けた。１５分間撹拌した各容器に、アセトン（６３０ｇ）を加えた。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１４０ｇ）を各容器に加え、ペレットが溶解するまでオービタルシェーカーを使用して周囲で混合物を撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。アセトン（６３０ｇ）を各容器に加え、１５分間撹拌した。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１００ｇ）を加えて周囲で撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。溶液をＬｙｏｇｕａｒｄトレイに移し、ボトルをさらにＬＥ水（各６６ｇ）ですすぎ、すすぎ液を同じトレイに移した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定して、生成物を凍結乾燥した。分析および保持のために凍結乾燥生成物をサンプリングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイは二重包装にして、ラベル付けし、冷凍庫（≦－１５℃）内で保存した。凍結乾燥生成物の効力を、ｑＨＮＭＲを使用して決定した。この手順により、粗ペンタダイマー（Ｐｅｎｔａ Ｄｉｍｅｒ）１７が得られた。予想収量：２６．１～３５．５ｇ（６１～８３％）。
反応器には、始動する前に、２．５Ｌ、３．５Ｌ、および３．９Ｌのレベルに印をつけ、これを真空コントローラに取り付けた。ジクロロメタンを１４０ｇの化合物１６を含有するビュッヒボウルに充填し、Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。ＤＣＭ（３３３ｇ）で２回すすいで、ビュッヒボウルの内容物をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。エタノール（２．５０ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加えた。反応混合物を２．５Ｌの印まで濃縮した（目標減圧 ２５０ｍｂａｒ）。エタノール（１．５８ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加え、３．５Ｌの印まで濃縮した。反応物を、エタノールで３．９Ｌの印まで希釈した。不完全真空を適用し、窒素を放出することにより、反応器の内容物を不活性ガス下に置いた。反応中、緩徐な窒素の流れを維持した。ヒドラジン一水和物（１．１３ｋｇ、１．１１Ｌ）を窒素雰囲気下で５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に充填した。温度勾配を、以下のように設定した：初期温度２０℃、最終温度６０℃、５０分（０．８度／分）を超える線形温度勾配、および反応器の内容物の能動制御。容器の温度を、６０℃で４５分間保持した。冷却勾配温度を－２度／分に設定し、最終温度は２０℃であった。内容物を、好適なＨＤＰＥジャグに排出し、重量を決定した。等量をＦＥＰカプセル化シール付きの８つのポリプロピレン遠心分離容器に移した。各遠心分離容器にエタノール（７５０ｇ）を充填し、周囲温度で３０分間撹拌した。容器を遠心分離にかけた（５３００ＲＣＦ、１５℃、３０分）。ヒュームフードから取り出す前に、ボトルの外側をアセトン、次に水ですすぐことにより、容器の外側にある残留ヒドラジンを除去した。遠心分離容器の上清をデカントし、残留ペレットを低エンドトキシン水（ＬＥ水）（１９６０ｇ）に溶解し、５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。１．５時間ごとにおよそ１５～２０分、分散管を使用して溶液に通気しながら内容物を中速で撹拌した。次に、反応物を密閉容器内で２０℃にて一晩撹拌した。ＩＰＣにより、遊離ペンタマー組成が３％（報告された全体の面積％）未満であると示されたら、反応は完了したとみなされた。反応混合物に不溶性材料が存在する場合は、濾過（Ｐ３焼結ガラス漏斗および５Ｌブフナーフラスコを使用）が必要であった。反応器の内容物を、２つのＬｙｏｇｕａｒｄトレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定した。凍結乾燥製品をＬＥ水（８４０ｇ）に溶解し、６つの遠心分離ボトルに均等に分けた。１５分間撹拌した各容器に、アセトン（６３０ｇ）を加えた。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１４０ｇ）を各容器に加え、ペレットが溶解するまでオービタルシェーカーを使用して周囲で混合物を撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。アセトン（６３０ｇ）を各容器に加え、１５分間撹拌した。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１００ｇ）を加えて周囲で撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。溶液をＬｙｏｇｕａｒｄトレイに移し、ボトルをさらにＬＥ水（各６６ｇ）ですすぎ、すすぎ液を同じトレイに移した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定して、生成物を凍結乾燥した。分析および保持のために凍結乾燥生成物をサンプリングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイは二重包装にして、ラベル付けし、冷凍庫（≦－１５℃）内で保存した。凍結乾燥生成物の効力を、ｑＨＮＭＲを使用して決定した。この手順により、粗ペンタダイマー（Ｐｅｎｔａ Ｄｉｍｅｒ）１７が得られた。予想収量：２６．１～３５．５ｇ（６１～８３％）。
【0184】
化合物１７の同一性を、５００ＭＨｚ機器を使用する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲによって決定した。ｔ－ブタノールの参照溶液は、Ｄ２Ｏ中２５ｍｇ／ｍＬで調製した。試料は、Ｄ２Ｏ中１３ｍｇ／ｍＬで調製し、参照溶液を試料に加える。最終試験試料の組成は、ペンタダイマー１０ｍｇ／ｍＬおよびｔ－ブタノール５ｍｇ／ｍＬであった。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを取得し、統合した。得られた化学的シフトを、理論的シフトとの比較によって割り当てた。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１および２に示す。
［実施例５］
［実施例５］
【0185】
粗ペンタダイマーの遊離塩基形態への変換。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ９１（１．４６ｋｇ；４０ｇ／ｇの粗ペンタダイマー－効力を補正）を、大カラムに充填した。１０ＬのＳｃｈｏｔｔボトル内のＬＥ水（８．００ｋｇ）に、ＮａＯＨ（３２ｇ）を加えることにより、８Ｌの１．０Ｍ ＮａＯＨの溶液を調製した。この溶液を、１時間かけてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。ＬＥ水（４０．０ｋｇ）をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。フロースルーでｐＨが＜８．０になるまで、樹脂を追加のＬＥ水（約１０ｋｇのアリコート）でフラッシングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイに保存した粗ペンタダイマー（４９ｇ、ＰＮ０７０４）を、周囲温度まで温めた。ＬＥ水（４００ｇ）を、粗ペンタダイマー（４９ｇ）を含有するＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加え、完全に溶解させた後、１Ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトルに移した。トレイをさらに充填したＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これらの洗浄液をＳｃｈｏｔｔボトルの内容物に加えた。粗ペンタダイマー溶液を、樹脂の上部に注意深く注いだ。１ＬのＳｃｈｏｔｔボトルをＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これを樹脂に加えた。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅタップを開けて、粗ペンタダイマー溶液を約５分かけてゆっくりと樹脂に移動させた。タップを停止し、材料を樹脂上に約１０分間放置した。ＬＥ水を、樹脂の上部に注いだ。タップを開けてＬＥ水で溶出し、５００ｍＬのおよそ１６画分を収集した。各画分を、ＴＬＣ炭化（ｃｈａｒｒｉｎｇ）（ＥｔＯＨ中の１０％Ｈ２ＳＯ４）によって分析した。すべての炭水化物含有画分を合わせ、０．２μｍナイロンフィルターメンブレンを使用してＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過した。溶液を、５～６個のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに均等に分割した。濾過容器をＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、トレイ間で分割した。材料を、トレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。ＬＥ水（１５０ｇ）をＬｙｏｇｕａｒｄトレイの１つを除くすべてに充填し、これを、乾燥材料を含有する残りの１つのトレイに移した。空の各トレイをさらにＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、このすすぎ量を最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加えた。最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイを、凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。分析および保持のために生成物をサンプリングした。乾燥材料をＨＤＰＥまたはＰＰ容器に移し、≦－１５℃で保存した。予想収量：３１～３４ｇ（８６～９４％）。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ９１（１．４６ｋｇ；４０ｇ／ｇの粗ペンタダイマー－効力を補正）を、大カラムに充填した。１０ＬのＳｃｈｏｔｔボトル内のＬＥ水（８．００ｋｇ）に、ＮａＯＨ（３２ｇ）を加えることにより、８Ｌの１．０Ｍ ＮａＯＨの溶液を調製した。この溶液を、１時間かけてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。ＬＥ水（４０．０ｋｇ）をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。フロースルーでｐＨが＜８．０になるまで、樹脂を追加のＬＥ水（約１０ｋｇのアリコート）でフラッシングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイに保存した粗ペンタダイマー（４９ｇ、ＰＮ０７０４）を、周囲温度まで温めた。ＬＥ水（４００ｇ）を、粗ペンタダイマー（４９ｇ）を含有するＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加え、完全に溶解させた後、１Ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトルに移した。トレイをさらに充填したＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これらの洗浄液をＳｃｈｏｔｔボトルの内容物に加えた。粗ペンタダイマー溶液を、樹脂の上部に注意深く注いだ。１ＬのＳｃｈｏｔｔボトルをＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これを樹脂に加えた。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅタップを開けて、粗ペンタダイマー溶液を約５分かけてゆっくりと樹脂に移動させた。タップを停止し、材料を樹脂上に約１０分間放置した。ＬＥ水を、樹脂の上部に注いだ。タップを開けてＬＥ水で溶出し、５００ｍＬのおよそ１６画分を収集した。各画分を、ＴＬＣ炭化（ｃｈａｒｒｉｎｇ）（ＥｔＯＨ中の１０％Ｈ２ＳＯ４）によって分析した。すべての炭水化物含有画分を合わせ、０．２μｍナイロンフィルターメンブレンを使用してＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過した。溶液を、５～６個のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに均等に分割した。濾過容器をＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、トレイ間で分割した。材料を、トレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。ＬＥ水（１５０ｇ）をＬｙｏｇｕａｒｄトレイの１つを除くすべてに充填し、これを、乾燥材料を含有する残りの１つのトレイに移した。空の各トレイをさらにＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、このすすぎ量を最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加えた。最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイを、凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。分析および保持のために生成物をサンプリングした。乾燥材料をＨＤＰＥまたはＰＰ容器に移し、≦－１５℃で保存した。予想収量：３１～３４ｇ（８６～９４％）。
【0186】
ダイマーにおける二硫化物結合のＴＣＥＰ還元は迅速で、かつ、ほぼ化学量論的である。ＴＣＥＰによる化学量論的還元を使用すると、約２当量のグルコサミン五糖モノマーが得られた。具体的には、五糖ダイマーを、１モル当量のＴＣＥＰを含有する反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））に溶解した。周囲温度で１時間後、反応を、ＣＡＤ検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。これらの条件下で、ペンタグルコサミンモノマーへの変換（ピークは約１０分）はほぼ完了した（ペンタグルカミンダイマーのピークは約１１．５分）－図４を参照のこと。残りの注釈のないピークを、試料マトリックスから得た。平衡化学方程式に基づいて、加えられたＴＣＥＰは主にＴＣＥＰ酸化物に変換され、残留ＴＣＥＰは、共役反応に加える前に、空気の酸化を阻害してダイマーに戻した。簡単にするために、グルコサミン五糖は、投入ダイマーに基づいて、これらの条件下でモノマーへの＞９５％の変換を想定して加えることができる。
【0187】
ペンタダイマーの同一性を、５００ＭＨｚ機器を使用する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲによって決定した。ｔ－ブタノールの参照溶液は、Ｄ２Ｏ中２５ｍｇ／ｍＬで調製した。試料は、Ｄ２Ｏ中１３ｍｇ／ｍＬで調製し、参照溶液を試料に加えた。最終試験試料の組成は、ペンタダイマー１０ｍｇ／ｍＬおよびｔ－ブタノール５ｍｇ／ｍＬであった。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを取得し、統合した。得られた化学的シフトを、理論的シフトとの比較によって割り当てる。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１および２に示す。
［実施例５］
［実施例５］
【0188】
本発明のワクチン（化合物１８）を提供するための、実施例２のＴＴ－リンカーを用いた実施例４の五糖モノマーへの変換
実施例２のＴＴモノマー－リンカー中間体を、周囲温度で４時間、濃度を増加させた４～７０ペンタマーグルコサミンモル当量（２～３５五糖ダイマーモル当量）と反応させた。各滴定点からの粗コンジュゲートは、３０ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレンを介して分配することにより精製した。精製された各コンジュゲート試料について、タンパク質含有量、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによるペイロード密度、およびＳＥＣＨＰＬＣによるモノマー／凝集体含有量を分析した。データは、≧５０のペンタマーグルコサミン当量でペイロード密度の飽和を示した。ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析に基づくと、凝集体の含有量は、五糖モノマーの電荷が増加するにつれて増加し、３０のペンタマーグルコサミン当量から開始しておよそ４％の増加の定常状態レベルに達するように見えた。これらの結果に基づいて、その後の共役反応のために選択された五糖ダイマー電荷は、ペンタマーグルコサミンの理論電荷の５０モル当量に対応する２５モル当量であった。
実施例２のＴＴモノマー－リンカー中間体を、周囲温度で４時間、濃度を増加させた４～７０ペンタマーグルコサミンモル当量（２～３５五糖ダイマーモル当量）と反応させた。各滴定点からの粗コンジュゲートは、３０ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレンを介して分配することにより精製した。精製された各コンジュゲート試料について、タンパク質含有量、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによるペイロード密度、およびＳＥＣＨＰＬＣによるモノマー／凝集体含有量を分析した。データは、≧５０のペンタマーグルコサミン当量でペイロード密度の飽和を示した。ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析に基づくと、凝集体の含有量は、五糖モノマーの電荷が増加するにつれて増加し、３０のペンタマーグルコサミン当量から開始しておよそ４％の増加の定常状態レベルに達するように見えた。これらの結果に基づいて、その後の共役反応のために選択された五糖ダイマー電荷は、ペンタマーグルコサミンの理論電荷の５０モル当量に対応する２５モル当量であった。
【0189】
一連の３つの試験合成とそれに続く化合物１８のＧＭＰ合成を、上記のように調製した。得られた各生成物の効力（ＥＬＩＳＡアッセイによる）およびペイロード密度（ペンタマーグルコサミンの破傷風トキソイドに対するモル比）を評価した。以下表に結果を示す。
【0190】
【表2】
【0191】
これらの結果は、本発明の化合物の非常に高い担持量を証明している。前述の説明は、単に本発明を説明するために記載されており、限定することを意味するものではない。本発明の精神および実体を組み込んだ記載された実施形態の改変が、当技術分野の当業者に起こり得るので、本発明は、特許請求の範囲およびその同等物の範囲内のすべての変形を含むと広く解釈されるべきである。
［実施例６］
［実施例６］
【0192】
サイズ排除クロマトグラフィーによる破傷風トキソイド精製
濃縮破傷風トキソイドのアリコートを、２．０ｍＬ／分で、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３／１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２．６×６０ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。個々の画分（４．０ｍＬ）を、分析ＳＥＣ－ＨＰＬＣテストに基づいてプールした。これらの条件下で得られたＴＴモノマー調製物の純度（試料２．０ｍＬ／ベッドボリュームの０．６％）に基づいて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００の充填量を、分解能を大幅に変更することなく、２倍（試料４．０ｍＬ／ベッドボリュームの１．２％）で増加させることに成功した。この変更により、精製に必要なクロマトグラフィーサイクルの数が効果的に削減された。望ましい品質のＴＴモノマーを含有するＳＥＣプールは、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０ｋＤａ再生セルロース遠心フィルターを使用して濃縮／緩衝液交換した。精製ＴＴは、コンジュゲーション研究のために５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に緩衝液交換した。
濃縮破傷風トキソイドのアリコートを、２．０ｍＬ／分で、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３／１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）で溶出するＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２．６×６０ｃｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムでのクロマトグラフィーによって精製した。個々の画分（４．０ｍＬ）を、分析ＳＥＣ－ＨＰＬＣテストに基づいてプールした。これらの条件下で得られたＴＴモノマー調製物の純度（試料２．０ｍＬ／ベッドボリュームの０．６％）に基づいて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００の充填量を、分解能を大幅に変更することなく、２倍（試料４．０ｍＬ／ベッドボリュームの１．２％）で増加させることに成功した。この変更により、精製に必要なクロマトグラフィーサイクルの数が効果的に削減された。望ましい品質のＴＴモノマーを含有するＳＥＣプールは、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０ｋＤａ再生セルロース遠心フィルターを使用して濃縮／緩衝液交換した。精製ＴＴは、コンジュゲーション研究のために５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に緩衝液交換した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【国際調査報告】