特表 2023-502062 細胞をリプログラミングするための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-20

(54)【発明の名称】細胞をリプログラミングするための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20230113BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20230113BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20230113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230113BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20230113BHJP

   A61K 35/50 20150101ALI20230113BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20230113BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

C12N5/074

C12N5/0789

C12N5/10

C12N5/0735

A61K35/50

A61P15/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022528048

(86)(22)【出願日】2020-11-13

(85)【翻訳文提出日】2022-07-12

(86)【国際出願番号】 AU2020051235

(87)【国際公開番号】W WO2021092657

(87)【国際公開日】2021-05-20

(31)【優先権主張番号】2019904283

(32)【優先日】2019-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】304044531

【氏名又は名称】モナシュ ユニバーシティー

(71)【出願人】

【識別番号】507335687

【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール

(71)【出願人】

【識別番号】506152885

【氏名又は名称】ナント ユニベルシテ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ジョセ ポロ

(72)【発明者】

【氏名】リウ シアオトン

(72)【発明者】

【氏名】キャスリン デイビッドソン

(72)【発明者】

【氏名】オーウェン ラッカム

(72)【発明者】

【氏名】ジョン エフ．オウヤン

(72)【発明者】

【氏名】ローラン ダビド

(72)【発明者】

【氏名】ガエル カステル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065BB34

4B065BB40

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB58

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA20

4C087ZA81

(57)【要約】

本発明は、ヒト体細胞を、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：ａ）体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現を増加させる工程であって、因子は、体細胞を多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；ｂ）細胞を多能性状態に向けてリプログラミングすることを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；ｃ）細胞を、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適した培養培地と接触させる工程と；ｄ）細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培地中で細胞を培養する工程、それによって体細胞をＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞に体細胞をリプログラミングする方法であって、以下の工程を：
ａ） 前記体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、前記因子は、前記細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう前記細胞の前記リプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で前記細胞を培養する工程と；
ｃ） 栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適したＴＳＣ培養培地と前記細胞を接触させる工程と；
ｄ） 前記細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、前記ＴＳＣ培地中で前記細胞を培養する工程、
の順番に含み、それによって前記体細胞をＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする、方法。

【請求項2】

体細胞から栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する方法であって、以下の工程を：
ａ） 前記体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、前記因子は、前記体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう前記細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で前記細胞を培養する工程と；
ｃ） 栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適したＴＳＣ培養培地と前記細胞を接触させる工程と；
ｄ） 前記細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、前記ＴＳＣ培養培地中で前記細胞を培養する工程、
の順番に含み、それによって前記体細胞からＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する、方法。

【請求項3】

前記ＴＳＣ培地が、成長因子及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記成長因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記成長因子がＥＧＦである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド（Ｙ－２７６３２）又はその塩である、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＴＳＣ培養培地が、以下の１つ以上：
－ ４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド（ＳＢ ４３１５４２）若しくはその塩；
－ ６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール＿２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル（ＣＨＩＲ ９９０２１）若しくはその塩；及び／又は
－ Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド）若しくはその塩；
をさらに含む、請求項３～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＴＳＣ培養物がＡＳＥＣＲｉＡＶであり、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、ＣＨＩＲ、ＲＯＣＫ阻害剤、アスコルビン酸及びバルプロ酸を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記体細胞が、線維芽細胞、表皮細胞、ケラチノサイト又は単球、好ましくは皮膚線維芽細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするための前記因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣのうちの１つ以上である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記因子がＬＩＮ２８及び／又はＮＡＮＯＧをさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするための前記因子のタンパク質発現又は量が、前記因子の発現を増加させる薬剤と前記細胞を接触させることによって増加する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記薬剤が、ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ薬剤及びペプチド核酸（ＰＮＡ）並びにそれらの類似体又は改変体からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記因子のタンパク質発現又は量が、前記因子をコードするか又は前記因子の機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を前記細胞に導入することによって増加する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするための１つ以上の因子の前記タンパク質発現又は量を増加させた後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日以上、前記体細胞を前記ＴＳＣ培地と接触させる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記リプログラミングプロセス中、及び多能性状態への前記細胞のリプログラミングの完了前に、前記体細胞を前記ＴＳＣ培地と接触させる、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記リプログラミングプロセス中、及び前記ＴＳＣ培地と接触させる前に、前記体細胞が非多能性培地中で培養される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

脱分化状態又は多能性状態に向かう前記細胞の前記リプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で前記細胞を培養する前記工程が、前記体細胞の成長を支持する培地中で前記細胞を少なくとも７日間及び２２日間以下の期間、培養することを含み、前記体細胞は、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適したＴＳＣ培養培地と接触させる前に多能性を達成していない、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記方法が以下：
ａ） 前記細胞中のＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣの量又は発現を増加させるための薬剤と体細胞と接触させる工程；
ｂ） リプログラミング中間体細胞の生成を可能にするのに十分な時間及び条件下で、前記体細胞の成長を支持する培地中で前記細胞を培養する工程；
ｃ） 前記リプログラミング中間体細胞を、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適したＴＳＣ培養培地と接触させる工程であって、好ましくは、前記培地がＡ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、ＣＨＩＲ、ＲＯＣＫ阻害剤、アスコルビン酸及びバルプロ酸を含む、工程、
を含み、それによって、体細胞からＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記体細胞を多能性状態にリプログラミングした後に、前記体細胞を前記ＴＳＣ培地と接触させる、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記体細胞が、前記細胞をＴＳＣ培地と接触させ及び培養する前に、ナイーブ培地又は拡張培地中でさらに培養される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ＴＳＣの前記少なくとも１つの特徴が、以下：
－ 未分化の二分化能状態；
－ 玉石状のコロニーの外観；
－ 絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）又は合胞体栄養膜（ＳＴ）の１つ以上の特徴を示す細胞に分化する能力；
－ バイサルファイトアッセイにより決定される胚盤胞由来ＴＳＣに類似したメチル化パターン；
－ 免疫組織化学及び／又はＰＣＲアッセイによって決定される、ＴＳＣの１つ以上の生化学マーカーの発現、好ましくは、前記マーカーがＣＤ４９ｆ（ｉＴＧＡ６）、ＣＤ２４９、核ＧＡＴＡ２／３、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｐ６３、及びＮＲ２Ｆ２からなる群から選択される
のうちの１つ以上を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞が、前記体細胞を特徴付ける前記マーカーの非存在を特徴とし、場合により、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す前記細胞が以下のマーカー：ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１とも呼ばれる）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＡＬＬ２、ＯＴＸ２、ＢＡＮＣＲ、ＫＬＦ１７、ＤＰＰＡ３、ＡＲＧＦＸ及びＤＮＭＴ３Ｌのうちの１つ以上を発現しない、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記体細胞が：
－ 絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）又は合胞体栄養膜（ＳＴ）の１つ以上の特徴を示す細胞に分化する能力を有する；
－ 核ＧＡＴＡ２／３、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｐ６３、及びＮＲ２Ｆ２からなる群から選択されるＴＳＣの１つ以上の生化学的マーカーを発現する
細胞にリプログラミングされる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

ＳＴの特徴が、ＳＤＣ１＋多核細胞のうちの１つ以上を含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

ＥＶＴの特徴が、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＲＧ２、及びＰＡＰＰＡ２の発現の増加のうちの１つ以上を含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞が、継代培養で維持された場合に、その未分化状態を保持する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する前記細胞が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも４０以上の細胞培養継代の間、ＴＳＣの前記少なくとも１つの特徴を保持する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す前記細胞を増殖させて、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す集団中の細胞の割合を増加させる工程をさらに含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法によって生成されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す単離された細胞。

【請求項32】

細胞の少なくとも５％がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法によって生成され、好ましくは、前記集団中の前記細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞集団。

【請求項33】

ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す前記細胞を分化させて、ＥＶＴ又はＳＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する工程をさらに含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を、再生医療に使用するために非胎盤細胞型に分化させる工程をさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

請求項３３又は３４に記載の方法によって生成された、単離された分化細胞又は分化細胞の集団。

【請求項36】

請求項３２に記載の細胞集団、又は請求項３５に記載の分化細胞集団に由来するオルガノイド。

【請求項37】

以下を含む医薬組成物又はサプリメント：
－ 請求項３１に記載の細胞；
－ 請求項３２に記載の細胞集団
－ 請求項３５に記載の分化細胞又は分化細胞集団；
－ 請求項３６に記載のオルガノイド又はその一部；
及び薬学的に許容される賦形剤。

【請求項38】

それを必要とする対象における栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害を治療及び／又は予防する方法であって、治療有効量の：
－ 請求項３１に記載の細胞；
－ 請求項３２に記載の細胞集団；
－ 請求項３５に記載の分化細胞又は分化細胞集団；
－ 請求項３６に記載のオルガノイド；又は
－ 請求項３７に記載の医薬組成物、
を前記対象に投与することを含み、それによって前記対象における栄養膜の前記発達及び／又は活性に関連する前記障害を治療及び／又は予防する、方法。

【請求項39】

胎盤又は胚盤胞に以下：
－ 請求項３１に記載の細胞；
－ 請求項３２に記載の細胞集団；又は
－ 請求項３５に記載の単離された分化細胞又は分化細胞集団
を導入することを含む、胎盤又は胚盤胞を増強する方法。

【請求項40】

栄養膜の前記発達及び／又は活性に関連する疾患又は障害を治療するための薬剤の製造における：
－ 請求項３１に記載の細胞；
－ 請求項３２に記載の細胞集団；又は
－ 請求項３５に記載の分化細胞又は分化細胞集団、
－ 請求項３６に記載のオルガノイド；
の使用。

【請求項41】

前記疾患又は障害が、反復流産、子癇前症、胎児発育遅延（ＦＧＲ）、ヒドラチホルム（ｈｙｄｒａｔｉｆｏｒｍ）奇胎及び絨毛癌からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法、又は請求項４０に記載の使用。

【請求項42】

栄養膜の発達及び／又は活性を調節することができる薬剤を同定する方法であって：
－ 請求項１～３０のいずれか１項によって得られたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を含む細胞又は細胞集団を候補薬剤と接触させること；
－ 前記薬剤との前記接触後の前記細胞又は細胞集団の前記発達及び／又は活性を、前記薬剤なしの前記細胞又は細胞集団の前記発達及び／又は活性と比較すること、
を含み、
前記薬剤なしの前記細胞又は細胞集団の前記発達と比較して所定のレベルを超える、前記細胞又は細胞集団の前記発達及び／又は活性に対する前記薬剤の効果は、前記薬剤が栄養膜の発達及び／又は活性を調節することを示す、方法。

【請求項43】

栄養膜によって生成された化合物を得るための方法であって、請求項１～３０のいずれか１項によって得られたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を含む細胞若しくは細胞集団、又は該細胞若しくは細胞集団を含む培養物を培養し、前記細胞によって分泌された化合物を培養培地から単離し、それによって前記栄養膜によって生成された前記化合物を得ることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞から誘導栄養膜幹細胞を生成するための方法及び組成物に関する。

【0002】

関連出願
本出願はオーストラリア仮特許出願第２０１９９０４２８３号からの優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

哺乳動物の胚発生は、内部細胞塊（ＩＣＭ）と胚体外栄養外胚葉（ＴＥ）によって分離された胚盤胞に発達可能な全能性接合子から始まる。ＩＣＭは、胚を適切に生成する胚盤葉上層と、卵黄嚢を生成する原始内胚葉に発達する。ＴＥは最終的に胎盤を発生させる。

【0004】

胎盤は、胎盤中の栄養膜細胞が胎児－母体境界面で胎児と母体との間の相互作用を媒介することができるため、ヒト胎児発達の重要な器官である。

【0005】

ヒト胎盤に見出すことができる栄養膜由来細胞には、３つの主要なタイプがある：絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）と合胞体栄養膜（ＳＴ）を生じることができる未分化細胞栄養膜（ＣＴ）。胚盤胞のＴＥ細胞から生じる全ての栄養膜細胞、及びそれらの十分に制御された増殖と分化は、胎児の発育に必須である。栄養膜の発達及び機能の障害は、流産、子癇前症及び子宮内胎児発育遅延を含む妊娠中の様々な合併症につながる可能性がある。

【0006】

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を含むヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の研究及び臨床適用の進歩にもかかわらず、栄養膜幹細胞を生成するための再現可能な方法の開発は不足している。さらに、ＴＳＣの誘導は達成されているが、着床前胚又は胎盤からのそれらの細胞の単離は、遺伝的多様性へのアクセスを与えない。

【0007】

ヒト栄養膜幹細胞、又は着床前胚若しくは胎盤を必要としない栄養膜幹細胞の特徴を示す細胞を作製するための新規及び／又は改良された方法が必要である。

【0008】

本明細書における先行技術への言及は、この先行技術が任意の管轄区域における共通の一般的知識の一部を形成すること、又はこの先行技術が当業者によって、他の先行技術と理解され、関連すると見なされ、及び／若しくは組み合わされることが合理的に期待され得ることの承認又は示唆ではない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

第１の態様において、本発明は栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞に体細胞をリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、因子は、体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；
ｃ） 栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適したＴＳＣ培養培地と細胞を接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培地中で細胞を培養する工程、
それによって体細胞をＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする。

【0010】

好ましくは、ＴＳＣ培地は、成長因子、好ましくはＥＧＦ、及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む。従って、本発明はまた、体細胞を栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、因子は、体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；
ｃ） 細胞を、成長因子、好ましくはＥＧＦ、及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＴＳＣ培養培地と接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培養培地中で細胞を培養する工程、
それによって体細胞をＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする。

【0011】

本発明はまた、体細胞から栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、因子は、体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；
ｃ） 成長因子、好ましくはＥＧＦ、及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＴＳＣ培養培地と細胞を接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培養培地中で細胞を培養する工程、
それによって体細胞からＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する。

【0012】

さらなる実施形態において、本発明は線維芽細胞をリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 線維芽細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、因子は、線維芽細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；
ｃ） 細胞を、成長因子、好ましくはＥＧＦ、及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＴＳＣ培養培地と接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培養培地中で細胞を培養する工程、
ここで線維芽細胞は、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すようにリプログラミングされる。

【0013】

体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするための任意の方法（即ち、本明細書に記載される方法の工程ａ）及びｂ）を行うための方法）が、本発明の方法に従って使用され得ることが理解される。従って、本発明は、体細胞が可塑性又は多能性に向かってリプログラミングを開始することを可能にするために、工程ａ）及びｂ）に従って使用され得る、関連因子のタンパク質発現若しくは量を増加させるための特定の方法、又は培養条件によって限定されない。このような方法は当技術分野で公知であり、本明細書にさらに記載される。

【0014】

好ましい実施形態において、体細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするための因子は、転写因子である。転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣの因子のうちの１つ以上を含み得るか、又はこれらの因子からなり得るか、又はこれらの因子から本質的になり得る。特に好ましい実施形態では、転写因子は因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の４つ全て、又はそれらの改変体を含む。

【0015】

従って、好ましい実施形態では、本発明は以下を提供する：

【0016】

さらなる実施形態において、本発明は線維芽細胞をリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 線維芽細胞における転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の１つ以上のタンパク質発現又は量を増加させる工程と；
ｂ） 脱分化又は多能性状態に向かう細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；
ｃ） 細胞を、ＥＧＦ及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＴＳＣ培養培地と接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培地中で細胞を培養する工程、
ここで線維芽細胞はＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すようにリプログラミングされる、

【0017】

さらなる実施形態において、体細胞、例えば線維芽細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするための転写因子はまた、因子ＬＩＮ２８及び／又はＮＡＮＯＧを含み得る。特定の実施形態において、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧのそれぞれのタンパク質発現は、体細胞において増加する。

【0018】

典型的には、本明細書に記載の転写因子のタンパク質発現又は量は、細胞を転写因子の発現を増加させる薬剤と接触させることによって増加する。好ましくは、薬剤は、ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ薬剤及びペプチド核酸（ＰＮＡ）並びにそれらの類似体又は改変体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は外因性である。本発明はまた、１つ以上の転写因子の発現を増加させるための転写活性化系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮのような遺伝子活性化系において使用するためのｇＲＮＡ）の使用を意図する。

【0019】

典型的には、本明細書に記載の転写因子のタンパク質発現又は量は、転写因子をコードするヌクレオチド配列又はその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を細胞に導入することによって増加する。

【0020】

本発明の好ましい実施形態において、転写因子タンパク質をコードする核酸配列は、プラスミドによって細胞に導入される。１つ以上の転写因子をコードする１つ以上の核酸が使用され得る。従って、１つ以上のプラスミドが、必要とされる１つ以上の転写因子の発現又は量を増加させる目的のために使用され得ることは明らかである。換言すれば、核酸配列は、単一のプラスミド中又は上にあってもよく、又は２つ以上のプラスミド中で体細胞に提供されてもよい。

【0021】

本発明の任意の実施形態において、本発明に従って使用するための１つ以上の転写因子をコードする核酸を含むプラスミドは、エピソームプラスミドであり得る。

【0022】

本発明の任意の実施形態において、検出可能なマーカーも、体細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すようにリプログラミングされたときを同定するために、体細胞に導入され得る。検出可能なマーカーは、プロモーター又はエンハンサー配列に作動可能に連結された蛍光レポーターであり得る。

【0023】

好ましくは、核酸は異種プロモーターをさらに含む。好ましくは、核酸はウイルスベクター又は非ウイルスベクターなどのベクター中にある。好ましくは、ベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれないゲノムを含むウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルス又はセンダイウイルスであり得る。

【0024】

本発明の任意の実施形態において、因子のタンパク質発現又は量は、体細胞を、細胞における前記因子の発現を増加させるための１つ以上の薬剤と接触させることによって、体細胞において増加する。特定の実施形態において、因子のタンパク質発現又は量は、体細胞を、前記転写因子をコードする１つ以上のベクターで形質導入又はトランスフェクションすることによって、体細胞において増加する。ベクターは、組み込み又は非組み込みウイルスベクターを含むウイルスベクターであってもよい。更なる実施形態では、ベクターはエピソームベクターであり得る。

【0025】

「多能性状態に向かうプログラミング」という言葉は、ＴＳＣ培地との接触時に細胞が多能性であることを必要としないことも理解されるであろう。換言すれば、体細胞は、細胞をＴＳＣ培地と接触させる工程の前に多能性状態へのリプログラミングを完了している必要はない。むしろ、細胞はＴＳＣ培地との接触時に、好ましくは中間状態にあり、分化状態から、より可塑性又はより成熟した状態（即ち、非分化又は脱分化状態に向かう）に転移している。

【0026】

従って、本発明はさらに、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞に体細胞をリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させる工程であって、因子は、細胞を脱分化又は多能性状態に向けてリプログラミングするためのものである、工程と；
ｂ） 分化と多能性との間のリプログラミング中間状態への細胞のリプログラミングを可能にするのに十分な時間及び条件下で細胞を培養する工程と；
ｃ） 栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）を維持するのに適したＴＳＣ培養培地と細胞を接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培地中で細胞を培養する工程、
それによって体細胞をＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする。

【0027】

本明細書で使用される場合、分化と多能性との間の中間状態へのリプログラミングはまた、より「成熟していない」細胞状態に向かうリプログラミングを指すと理解され得る。

【0028】

任意の実施形態において、因子のタンパク質発現又は量を増加させることと、細胞をＴＳＣ培養培地と接触させることとの間の期間は、体細胞に関連するマーカーの減少を可能にする限り、任意の期間であり得る。さらなる例において、因子のタンパク質発現又は量を増加させることと、細胞をＴＳＣ培養培地と接触させることとの間の期間は、細胞が間葉から上皮への転移状態を通って進行することを可能にする限り、任意の期間であり得る。さらなる又は代替の実施形態では、この期間は、細胞における栄養外胚葉（ＴＥ）関連転写因子の発現のアップレギュレーションを可能にする限り、任意の期間であり得る。このような転写因子には、ＴＦＡＰ２Ｃ及びＧＡＴＡ２が含まれる。

【0029】

特定の実施形態では、細胞が脱分化又は多能性状態に向かうリプログラミングを開始する培養期間は、１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させた少なくとも１日後である。期間は、１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させた後、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２５、２８、３０、３５、４２日以上であってもよい。任意の実施形態において、細胞が脱分化又は多能性状態に向かうリプログラミングを開始する培養期間は、体細胞に関連するマーカーの減少を可能にする限り、任意の期間であり得る。

【0030】

本発明のさらなる実施形態では、上記の方法は、細胞をＴＳＣ培地と接触させ、培養する前に、体細胞を培養するのに適した培地（例えば、線維芽細胞又は類似の培地）、プライミング多能性培地、ナイーブ多能性培地、又は拡張多能性培地（例えば、ＬＣＤＭ培地）から選択される培地中で、多能性状態に向かって細胞を培養することを含む。

【0031】

尚さらに、上記の方法は、プライミングされた培地中で多能性状態に向かって細胞を培養する工程と、続いて、ナイーブ培地又は拡張培地（例えば、ＬＣＤＭ培地）から選択される培地に細胞を移行する工程と、次いで、細胞をＴＳＣ培地と接触させ、培養する工程とを含み得る。

【0032】

本発明はまた、ナイーブ及び拡張多能性幹細胞からＴＳＣを得るための方法を提供する。

【0033】

従って、さらなる態様において、本発明は、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 樹立されたナイーブ多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は拡張誘導多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）を提供する工程と；
ｂ） ＥＰＳＣ又はナイーブｉＰＳＣを、成長因子、好ましくはＥＧＦ、及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＴＳＣ培養培地と接触させる工程と；
ｃ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培地中で細胞を培養する工程、
それによってＥＰＳＣ又はナイーブｉＰＳＣをＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする。

【0034】

上記の態様の任意の実施形態において、細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって体細胞をリプログラミングすることによって得られたｉＰＳＣである。好ましい実施形態において、ｉＰＳＣは、リプログラミングされた線維芽細胞から得られている。さらなる実施形態において、ｉＰＳＣは、線維芽細胞における転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の１つ以上の発現を増加させることによって、線維芽細胞をリプログラミングすることによって得られている。

【0035】

さらなる態様において、本発明は、栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を順番に含み：
ａ） 樹立されたプライミングされた拡張多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）又はナイーブ誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を提供する工程と；
ｂ） ＥＰＳＣ又はナイーブｉＰＳＣとナイーブ培地又はＬＣＤＭ培地とを接触させる工程と；
ｃ） ＥＰＳＣ又はｉＰＳＣを、成長因子、好ましくはＥＧＦ、及びＲＯＣＫ阻害剤を含むＴＳＣ培養培地と接触させる工程と；
ｄ） 細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示すことを可能にするのに十分な時間及び条件下で、ＴＳＣ培地中で細胞を培養する工程、
それによってＥＰＳＣ又はナイーブｉＰＳＣ細胞をＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞にリプログラミングする。

【0036】

上記の態様の任意の実施形態において、細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって体細胞をリプログラミングすることによって得られたナイーブｉＰＳＣ／ＥＰＳＣである。好ましい実施形態において、ナイーブｉＰＳＣ／ＥＰＳＣは、リプログラミングされた線維芽細胞又は他の体細胞型から得られている。さらなる実施形態において、ｉＰＳＣは、線維芽細胞における転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の１つ以上の発現を増加させることによって、線維芽細胞をリプログラミングすることによって得られた。

【0037】

本発明の任意の実施形態において、ＴＳＣ培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド（Ｙ－２７６３２）、又はその塩を含む。

【0038】

さらなる実施形態において、ＴＳＣ培養培地はさらに、以下のうちの１つ以上を含む：
－ ４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド（ＳＢ ４３１５４２）又はその塩；
－ ６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール＿２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ミコチノニトリル（ｍｉｃｏｔｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）（ＣＨＩＲ ９９０２１）又はその塩
－ Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド）又はその塩；

【0039】

さらなる実施形態において、ＴＳＣ培地はまた、Ｗｎｔを刺激するための薬剤及びＴＧＦβの１つ以上の阻害剤を含む。

【0040】

好ましい実施形態において、ＴＳＣ培地は、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、ＣＨＩＲ、ＲＯＣＫ阻害剤、アスコルビン酸及びバルプロ酸を含む。（培地は、ＡＳＥＣＲｉＡＶと呼ばれることもある）。

【0041】

本明細書で使用される場合、ＴＳＣの特徴は、以下を含むと理解される：
－ 未分化で二分化能な状態であり、絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）又は合胞体栄養膜（ＳＴ）の１つ以上の特徴を示す細胞に分化する能力；
－ 玉石状のコロニーの外観；
－ バイサルファイトアッセイ又はゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイリング技術により決定される胚盤胞由来ＴＳＣに類似したメチル化パターン；
－ 好ましくはマーカーがＣＤ２４９（アミノペプチダーゼＡ）、ＣＤ４９ｆ（ＩＴＧＡ６）；核ＧＡＴＡ２／３、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｐ６３及びＮＲ２Ｆ２からなる群から選択される、免疫組織化学及び／又はＰＣＲアッセイによって決定される、ＴＳＣの１つ以上の生化学マーカーの発現；
－ ＡＴＡＣ－ｓｅｑを用いて決定される胚盤胞由来ＴＳＣと同様のクロマチン到達性のレベル；
－ 胚盤胞由来ＴＳＣに類似したヒストン修飾プロファイル（例えば、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ遺伝子改変）；
－ 胚盤胞由来ＴＳＣに類似したプロテオーム又はメタボロームプロファイル。

【0042】

さらなる実施形態では、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞は、体細胞を特徴付けるマーカーが存在しないことを特徴とする。特定の実施形態において、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞は、以下のマーカー：ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１とも呼ばれる）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＡＬＬ２、ＯＴＸ２、ＢＡＮＣＲ、ＫＬＦ１７、ＤＰＰＡ３、ＡＲＧＦＸ及びＤＮＭＴ３Ｌのうちの１つ以上を発現しない。

【0043】

任意の実施形態において、本発明に従って作製されるＴＳＣ細胞は、本明細書に記載されるＴＳＣの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの特徴によって特徴付けられる。

【0044】

好ましい実施形態では、本明細書で定義される方法は、体細胞を：
－ 絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）又は合胞体栄養膜（ＳＴ）の１つ以上の特徴を示す細胞に分化する能力を有する；
－ 核ＧＡＴＡ２／３、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｐ６３及びＮＲ２Ｆ２からなる群から選択されるＴＳＣの１つ以上の生化学的マーカーを発現する
細胞にリプログラミングするためのものである。

【0045】

本明細書で使用される場合、ＳＴの特徴は、ＳＤＣ１＋多核細胞、並びにＴＳＣと比較してマーカーＣＧＡ、ＣＧＢ、ＰＳＧ１、ＣＳＨ１、ＨＳＤ３Ｂ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＳＤＣ１及びＩＮＨＡのうちの１つ以上の発現の増加：のうちの１つ以上を含む。

【0046】

本明細書で使用される場合、ＥＶＴの特徴は、ＴＳＣと比較して、マーカーＨＬＡ－Ｇ、ＰＲＧ２、ＰＡＰＰＡ２、ＭＭＰ２、ＩＴＧＡ５及びＡＴＧＡ１のうちの１つ以上の発現の増加のうちの１つ以上を含む。

【0047】

さらなる実施形態において、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞は、継代培養において維持される場合、その未分化状態を保持する。

【0048】

好ましくは、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも４０以上の細胞培養継代の間、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を保持する。

【0049】

体細胞は、疾患細胞を含む、本明細書に記載される任意の細胞型であり得る。体細胞は、成体細胞であってもよいし、成体又は非胚細胞の１つ以上の検出可能な特徴を示す成体由来の細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患又は状態の１つ以上の検出可能な特徴を示す細胞であってもよい。

【0050】

好ましい態様において、体細胞は線維芽細胞である。

【0051】

典型的には、体細胞のリプログラミングに適した条件には、細胞を十分な時間、適切な培地中で培養することが含まれる。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間であり得る。

【0052】

本明細書に記載される任意の方法において、方法は、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を増殖させて、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す集団中の細胞の割合を増加させる工程をさらに含み得る。細胞を増殖させる工程は、以下に記載されるように、細胞の集団を生成するための十分な時間及び条件下で細胞を培養することを含み得る。

【0053】

本明細書に記載される任意の方法において、方法は、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を分化させて、ＥＶＴ又はＳＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する工程をさらに含み得る。細胞を分化させる工程は、本明細書に記載されるように、ＥＶＴ又はＳＴの少なくとも１つの特徴を有する細胞を生成するのに十分な時間及び条件下で細胞を培養することを含み得る。

【0054】

尚さらに、方法は、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を、再生医療において使用するために、胎盤外細胞型に分化させることをさらに含み得る。

【0055】

本発明はまた、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する哺乳動物の未分化前駆細胞を提供し、ここで、細胞は、本明細書に定義される任意の方法によって得られる。

【0056】

本発明はまた、本明細書に記載される方法によって生成されるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を提供する。

【0057】

本明細書に記載される任意の方法において、方法は、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を単離する工程をさらに含み得る。

【0058】

従って、さらなる実施形態では、本明細書に記載の任意の方法によって得ることができる、又は得られる、単離されたＴＳＣが提供される。

【0059】

本発明はまた、本発明の方法に従って得られる、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞に由来するか又はそれから分化した単離されたＥＶＴ又はＳＴを提供する。

【0060】

本発明はまた、少なくとも５％の細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が本明細書に記載される方法によって生成される、細胞の集団を提供する。好ましくは、集団中の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す。

【0061】

本発明はまた、少なくとも５％の細胞が、本明細書に記載される方法によって生成されるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から分化したＳＴ又はＥＶＴである細胞の集団を提供する。好ましくは、集団中の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の細胞が、本発明に従って得られるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を分化させることによって得られるＳＴ又はＥＶＴである。

【0062】

本発明はまた、以下を含む医薬組成物を提供する：
－ ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞であって、本発明の方法に従って得られるか又は得ることができる、細胞、及び
－ 薬学的に許容される賦形剤。

【0063】

本発明はまた、以下を含む医薬組成物を提供する：
－ ＳＴ又はＥＶＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞であって、本発明の方法に従って得られる又は得ることができるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞を分化させることによって得られる又は得ることができる、細胞、及び
－ 薬学的に許容される賦形剤。

【0064】

本発明はまた、以下を含むホメオパシー又は栄養補助食品を含む組成物を提供する：
－ ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞若しくは細胞集団であって、該細胞は、本発明の方法に従って得られるか若しくは得ることができる、細胞若しくは細胞集団、及び／又は
－ ＳＴ若しくはＥＶＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞若しくは細胞集団であって、該細胞は、本発明の方法に従って得られるか若しくは得ることができるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞を分化させることによって得られるか若しくは得ることができる、細胞若しくは細胞集団、及び／又は
－ ＳＴ若しくはＥＶＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞若しくは細胞集団に由来するオルガノイドであって、該細胞は、本発明の方法に従って得られるか若しくは得ることができるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞を分化させることによって得られるか若しくは得ることができる、オルガノイド；
並びに
－ 薬学的に許容される賦形剤。

【0065】

本発明はさらに、以下に由来するホメオパシー又は栄養補助食品を含む組成物を提供する：
－ ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞又は細胞集団であって、該細胞は、本発明の方法に従って得られるか又は得ることができる、細胞又は細胞集団、及び
－ ＳＴ又はＥＶＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞又は細胞集団であって、該細胞は、本発明の方法に従って得られるか又は得ることができるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞を分化させることによって得られるか又は得ることができる、細胞又は細胞集団、及び
－ －ＳＴ又はＥＶＴの少なくとも１つの特徴を示す細胞又は細胞集団に由来するオルガノイドであって、該細胞は、本発明の方法に従って得られるか又は得ることができるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞を分化させることによって得られるか又は得ることができる、細胞又は細胞集団。

【0066】

使用
本明細書に記載される任意の方法において、この方法は、それを必要とする対象に、以下を投与する工程をさらに含み得る：
－ 本明細書に記載される方法に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞、又は
－ 本明細書に記載される方法に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を含む細胞集団、又は
－ 本発明に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から得られる、分化した細胞又は分化した細胞の集団。

【0067】

いくつかの実施形態では、胎盤又は胚盤胞に以下を導入することを含む、胎盤又は胚盤胞を増強する方法が提供される：
－ 本明細書に記載される方法に従って生成されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞；
－ 本明細書に記載される方法に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を含む細胞集団
－ 本発明に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から得られる、分化した細胞又は分化した細胞の集団。

【0068】

本発明はまた、本明細書に記載される方法に従って作製されるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から得られるオルガノイド、及び／又は本明細書に記載される方法に従って作製されるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から得られる分化細胞（例えば、ＳＴ又はＥＶＴ）を提供する。

【0069】

さらなる態様において、それを必要とする対象における栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害を治療及び／又は予防する方法であって、本明細書に記載される方法に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞又は細胞集団、本明細書に記載される方法に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から得られた分化したＳＴ又はＥＶＴ、又は本発明による医薬製品の治療有効量を対象に投与することを含み、それによって対象における栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害を治療及び／又は予防する方法が提供される。

【0070】

本発明はまた、胎盤の疾患／障害の治療のための薬剤の製造における、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す、本発明に従って生成された細胞、又は細胞を含む細胞集団の使用を提供する。例えば、本発明のリプログラミングされた細胞は、胎盤の疾患又は状態を改善するために個体に導入（移植）され得る。或いは、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞は、本明細書に記載される薬剤の製造における使用の前に分化され得る。

【0071】

上記の態様の任意の実施形態において、疾患は、反復流産、子癇前症、胎児発育遅延（ＦＧＲ）、ヒドラチホルム（ｈｙｄｒａｔｉｆｏｒｍ）奇胎及び絨毛癌からなる群から選択される。本発明はまた、栄養膜の発達及び／又は活性を調節することができる薬剤を同定する方法を提供し、該方法は：
－ 本発明に従って作製された単離されたＴＳＣ又は胎盤を候補薬剤と接触させることと；
－ 薬剤との接触後の単離されたＴＳＣ又は胎盤の発達及び／又は活性を、薬剤なしのＴＳＣ又は胎盤の発達及び／又は活性と比較することと、を含み、
薬剤なしのＴＳＣ又は胎盤の発達及び／又は活性と比較して所定のレベルを超える、ＴＳＣ又は胎盤の発達及び／又は活性に対する薬剤の効果は、薬剤が栄養膜の発達及び／又は活性を調節することを示す。

【0072】

さらに、本発明は栄養膜によって生成された化合物を得るための方法を提供し、この方法は、本発明によるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を含む細胞若しくは細胞集団、又はそれを含む培養物を培養し、細胞によって分泌された化合物を培養培地から単離し、それによって栄養膜によって生成された化合物を得ることを含む。

【0073】

本発明はまた、ＥＶＴ又はＳＴによって分泌される化合物又は粒子を得るための方法を提供し、この方法は、本発明によるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を含む細胞を分化させることによって得られるＳＴ若しくはＥＶＴ、又はＳＴ若しくはＥＶＴの集団を培養し、細胞によって分泌される化合物又は粒子を培養培地から単離し、それによってＥＶＴ又はＳＴによって生成される化合物又は粒子を得ることを含む。

【0074】

化合物は、ホルモン又は成長因子であってもよい。細胞によって分泌される粒子は、エキソソームのような細胞外小胞であってもよい。

【0075】

本発明はまた、本明細書に開示されるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するためのキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示されるように、体細胞、リプログラミング因子、及びＴＳＣ培養培地を含む。好ましくは、キットは、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するために使用され得る。好ましくは、キットは、線維芽細胞である体細胞と共に使用され得る。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示される方法に従って、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞に体細胞をリプログラミングするための説明書をさらに含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載される本発明の方法において使用される場合のキットを提供する。

【0076】

キットはまた、ＥＶＴ若しくはＳＴ運命、又は他の非胎盤分化細胞型に向かってＴＳＣを分化させるのに適した１つ以上の薬剤を含み得る。

【0077】

本明細書に記載される任意の方法は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで行われる１つ以上又は全ての工程を有し得る。

【0078】

本明細書で使用される場合、文脈が特に必要とする場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び該用語の変形、例えば「含むこと」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加剤、成分、整数又は工程を除外することを意図しない。

【0079】

本発明のさらなる態様、及び前の段落に記載された態様のさらなる実施形態は、例として与えられる以下の記載から、添付の図面を参照して、明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0080】

【図1-1】栄養外胚葉（ＴＥ）シグネチャーは、ヒトリプログラミングの間にアップレギュレートされる。ａ）Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１６），Ｃｅｌｌ，１６５：１０１２－２６により定義された、線維芽細胞のナイーブｉＰＳＣへのリプログラミング中のＴＥ遺伝子シグネチャーの強度のヒートマップ。（ｂ）Ｍｏｎｏｃｌｅ３（黒線）を用いて構築された単一細胞軌跡と重ね合わされたＦＤＬ投影上のインビボＴＥシグネチャー。青色の矢印は、ＴＥ濃縮細胞集団を示す。（ｃ）プライミング及びいくつかのナイーブ培養条件下でリプログラミングされたリプログラミング中間体及びｉＰＳ細胞におけるＥＰＩ、ＰＥ及びＴＥ遺伝子シグネチャーの遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（方法）。（ｄ）ＡＴＡＣ－ｓｅｑクラスターピークに関連する遺伝子の標準化遺伝子発現（平均ｚスケーリング）。（ｅ）ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーククラスターの転写因子モチーフ濃縮分析。モチーフを特徴とするクラスター中の配列のパーセンテージである、色及びサイズによるモチーフ濃縮（－ｌｏｇ（Ｐ値））ヒートマップ。赤矢印は一過性ＡＴＡＣ－ｓｅｑクラスター（Ｃ３）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＫＬＦ４モチーフを指し、青矢印＝ＴＥ関連転写因子ＴＦＡＰ２Ｃ及びＧＡＴＡ２（Ｃ７及びＣ８）の濃縮を青矢印で示す。

【図1-2】栄養外胚葉（ＴＥ）シグネチャーは、ヒトリプログラミングの間にアップレギュレートされる。ａ）Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１６），Ｃｅｌｌ，１６５：１０１２－２６により定義された、線維芽細胞のナイーブｉＰＳＣへのリプログラミング中のＴＥ遺伝子シグネチャーの強度のヒートマップ。（ｂ）Ｍｏｎｏｃｌｅ３（黒線）を用いて構築された単一細胞軌跡と重ね合わされたＦＤＬ投影上のインビボＴＥシグネチャー。青色の矢印は、ＴＥ濃縮細胞集団を示す。（ｃ）プライミング及びいくつかのナイーブ培養条件下でリプログラミングされたリプログラミング中間体及びｉＰＳ細胞におけるＥＰＩ、ＰＥ及びＴＥ遺伝子シグネチャーの遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（方法）。（ｄ）ＡＴＡＣ－ｓｅｑクラスターピークに関連する遺伝子の標準化遺伝子発現（平均ｚスケーリング）。（ｅ）ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーククラスターの転写因子モチーフ濃縮分析。モチーフを特徴とするクラスター中の配列のパーセンテージである、色及びサイズによるモチーフ濃縮（－ｌｏｇ（Ｐ値））ヒートマップ。赤矢印は一過性ＡＴＡＣ－ｓｅｑクラスター（Ｃ３）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＫＬＦ４モチーフを指し、青矢印＝ＴＥ関連転写因子ＴＦＡＰ２Ｃ及びＧＡＴＡ２（Ｃ７及びＣ８）の濃縮を青矢印で示す。

【図1-3】栄養外胚葉（ＴＥ）シグネチャーは、ヒトリプログラミングの間にアップレギュレートされる。ａ）Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ （２０１６），Ｃｅｌｌ，１６５：１０１２－２６により定義された、線維芽細胞のナイーブｉＰＳＣへのリプログラミング中のＴＥ遺伝子シグネチャーの強度のヒートマップ。（ｂ）Ｍｏｎｏｃｌｅ３（黒線）を用いて構築された単一細胞軌跡と重ね合わされたＦＤＬ投影上のインビボＴＥシグネチャー。青色の矢印は、ＴＥ濃縮細胞集団を示す。（ｃ）プライミング及びいくつかのナイーブ培養条件下でリプログラミングされたリプログラミング中間体及びｉＰＳ細胞におけるＥＰＩ、ＰＥ及びＴＥ遺伝子シグネチャーの遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）（方法）。（ｄ）ＡＴＡＣ－ｓｅｑクラスターピークに関連する遺伝子の標準化遺伝子発現（平均ｚスケーリング）。（ｅ）ＡＴＡＣ－ｓｅｑピーククラスターの転写因子モチーフ濃縮分析。モチーフを特徴とするクラスター中の配列のパーセンテージである、色及びサイズによるモチーフ濃縮（－ｌｏｇ（Ｐ値））ヒートマップ。赤矢印は一過性ＡＴＡＣ－ｓｅｑクラスター（Ｃ３）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＫＬＦ４モチーフを指し、青矢印＝ＴＥ関連転写因子ＴＦＡＰ２Ｃ及びＧＡＴＡ２（Ｃ７及びＣ８）の濃縮を青矢印で示す。

【図2】ｉＴＳＣの特徴付け。Ａ）免疫蛍光（ＩＦ）標識はｉＴＳＣがＴＥマーカーＣＫ７、ＧＡＴＡ３、核ＶＧＬＬ１及びＴＦＡＰ２Ｃを発現し、ＮＡＮＯＧ（ＰＳＣマーカー）を発現しないことを確認する。Ｂ）ｉＴＳＣ由来ＥＶＴはＨＬＡ－Ｇを発現し、ｉＴＳＣ－ＳＴはＳＤＣ１を発現し、多核化を示す（矢印）。ＤＡＰＩ核染色は青色である。

【図3-1】ヒトｉＴＳＣの誘導のためのナイーブリプログラミング中のＴＥシグネチャーの安定化。（ａ）ＴＳＣ培地中のナイーブ中間体を捕捉し、安定化するための実験デザインの概略図。（ｂ）生成されたｉＴＳＣの位相差画像。（ｃ）Ｐ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７による線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞の免疫染色、ｎ＝２。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）Ｐ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７によるｉＴＳＣｄ２１ｎの免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４からの代表的画像、（ｅ）線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ２１ｎ並びにヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳ細胞（ＴＳＣ）における栄養膜遺伝子の遺伝子発現、複製の平均、ｎ＝２。（ｆ）ｉＴＳＣｄ２１ｎから分化したＳＴ及びＥＶＴ細胞の位相差画像、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。（ｇ）それぞれｉＴＳＣｄ２１ｎから分化した合胞体栄養膜（ＳＴ）（左）及び絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）（右）細胞のＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇ免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４からの代表的な画像。（ｈ）ｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎの融合指数、ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｉ）ｉＴＳＣｄ２１ｎから分化したＳＴ細胞の培地及び対照培地に対する市販のｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｊ）ＥＬＩＳＡにより検出されたｉＴＳＣｄ２１ｎ－及びｉＴＳＣｄ２１ｎ－ＳＴ条件培地におけるｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｋ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの注射によるｉＴＳＣｄ２１ｎ生着アッセイの表現。尿、血清及び病変を注射から９日後に検査した（ｄ．ｐ．ｉ）。賦形剤対照と比較した、ｉＴＳＣｄ２１ｎ注射マウスから採取した尿サンプルからのｈＣＧ妊娠検査に対する代表的な陽性結果。ｎ＝３。（ｌ）ＥＬＩＳＡにより検出したマウス血清中のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｍ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ２１ｎから採取した病変、ｎ＝４。（ｎ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ２１ｎ生着物から採取した病変におけるＨ＆Ｅ染色、ＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。矢印はＨＬＡ－Ｇ陽性栄養膜細胞を示す。スケールバー、２００μｍ。ｎ＝４からの代表的な画像。

【図3-2】ヒトｉＴＳＣの誘導のためのナイーブリプログラミング中のＴＥシグネチャーの安定化。（ａ）ＴＳＣ培地中のナイーブ中間体を捕捉し、安定化するための実験デザインの概略図。（ｂ）生成されたｉＴＳＣの位相差画像。（ｃ）Ｐ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７による線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞の免疫染色、ｎ＝２。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）Ｐ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７によるｉＴＳＣｄ２１ｎの免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４からの代表的画像、（ｅ）線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ２１ｎ並びにヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳ細胞（ＴＳＣ）における栄養膜遺伝子の遺伝子発現、複製の平均、ｎ＝２。（ｆ）ｉＴＳＣｄ２１ｎから分化したＳＴ及びＥＶＴ細胞の位相差画像、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。（ｇ）それぞれｉＴＳＣｄ２１ｎから分化した合胞体栄養膜（ＳＴ）（左）及び絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）（右）細胞のＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇ免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４からの代表的な画像。（ｈ）ｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎの融合指数、ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｉ）ｉＴＳＣｄ２１ｎから分化したＳＴ細胞の培地及び対照培地に対する市販のｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｊ）ＥＬＩＳＡにより検出されたｉＴＳＣｄ２１ｎ－及びｉＴＳＣｄ２１ｎ－ＳＴ条件培地におけるｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｋ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの注射によるｉＴＳＣｄ２１ｎ生着アッセイの表現。尿、血清及び病変を注射から９日後に検査した（ｄ．ｐ．ｉ）。賦形剤対照と比較した、ｉＴＳＣｄ２１ｎ注射マウスから採取した尿サンプルからのｈＣＧ妊娠検査に対する代表的な陽性結果。ｎ＝３。（ｌ）ＥＬＩＳＡにより検出したマウス血清中のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｍ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ２１ｎから採取した病変、ｎ＝４。（ｎ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ２１ｎ生着物から採取した病変におけるＨ＆Ｅ染色、ＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。矢印はＨＬＡ－Ｇ陽性栄養膜細胞を示す。スケールバー、２００μｍ。ｎ＝４からの代表的な画像。

【図3-3】ヒトｉＴＳＣの誘導のためのナイーブリプログラミング中のＴＥシグネチャーの安定化。（ａ）ＴＳＣ培地中のナイーブ中間体を捕捉し、安定化するための実験デザインの概略図。（ｂ）生成されたｉＴＳＣの位相差画像。（ｃ）Ｐ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７による線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞の免疫染色、ｎ＝２。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）Ｐ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７によるｉＴＳＣｄ２１ｎの免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４からの代表的画像、（ｅ）線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ２１ｎ並びにヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳ細胞（ＴＳＣ）における栄養膜遺伝子の遺伝子発現、複製の平均、ｎ＝２。（ｆ）ｉＴＳＣｄ２１ｎから分化したＳＴ及びＥＶＴ細胞の位相差画像、ｎ＝４。スケールバー、１００μｍ。（ｇ）それぞれｉＴＳＣｄ２１ｎから分化した合胞体栄養膜（ＳＴ）（左）及び絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）（右）細胞のＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇ免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４からの代表的な画像。（ｈ）ｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎの融合指数、ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｉ）ｉＴＳＣｄ２１ｎから分化したＳＴ細胞の培地及び対照培地に対する市販のｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｊ）ＥＬＩＳＡにより検出されたｉＴＳＣｄ２１ｎ－及びｉＴＳＣｄ２１ｎ－ＳＴ条件培地におけるｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｋ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスへの注射によるｉＴＳＣｄ２１ｎ生着アッセイの表現。尿、血清及び病変を注射から９日後に検査した（ｄ．ｐ．ｉ）。賦形剤対照と比較した、ｉＴＳＣｄ２１ｎ注射マウスから採取した尿サンプルからのｈＣＧ妊娠検査に対する代表的な陽性結果。ｎ＝３。（ｌ）ＥＬＩＳＡにより検出したマウス血清中のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｍ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ２１ｎから採取した病変、ｎ＝４。（ｎ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ２１ｎ生着物から採取した病変におけるＨ＆Ｅ染色、ＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。矢印はＨＬＡ－Ｇ陽性栄養膜細胞を示す。スケールバー、２００μｍ。ｎ＝４からの代表的な画像。

【図4-1】ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑにより明らかになった線維芽細胞及びｉＴＳＣｄ８リプログラミング中間体の細胞不均一性。（ａ）２１日目の線維芽細胞、ナイーブ及びＴＳＣｄ８リプログラミング中間体の実験デザイン及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの調製。（ｂ）２１日目のリプログラミング中間体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーのＦＤＬ表示（１０，５１８細胞）。（ｃ）ＦＤＬ上のＥＰＩシグネチャーの強度（１０，５１８細胞）。ＥＰＩシグネチャーについて濃縮されていないが、ＴＥシグネチャーについて濃縮された細胞集団は紫色の矢印によって示される。（ｄ）ＦＤＬ投影上のＴＥシグネチャー。ＴＥ様集団がライブラリーによって強調され、着色されている。（ｅ）ＦＤＬ上に投影された教師なしクラスタリングからの１３細胞クラスターの表現、線維芽細胞培地細胞クラスター：Ｄ２１ｆｍ１－Ｄ２１ｆｍ７；ナイーブリプログラミング細胞クラスター：Ｄ２１ｎｒ１－Ｄ２１ｎｒ３；栄養膜リプログラミング細胞クラスター：Ｄ２１ｔｒ１－Ｄ２１ｔｒ３。（ｆ）細胞クラスターの組成に対する各ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの寄与（％）。Ｄ２１ｔｒ１クラスターは紫色の矢印で示されている。

【図4-2】ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑにより明らかになった線維芽細胞及びｉＴＳＣｄ８リプログラミング中間体の細胞不均一性。（ａ）２１日目の線維芽細胞、ナイーブ及びＴＳＣｄ８リプログラミング中間体の実験デザイン及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの調製。（ｂ）２１日目のリプログラミング中間体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーのＦＤＬ表示（１０，５１８細胞）。（ｃ）ＦＤＬ上のＥＰＩシグネチャーの強度（１０，５１８細胞）。ＥＰＩシグネチャーについて濃縮されていないが、ＴＥシグネチャーについて濃縮された細胞集団は紫色の矢印によって示される。（ｄ）ＦＤＬ投影上のＴＥシグネチャー。ＴＥ様集団がライブラリーによって強調され、着色されている。（ｅ）ＦＤＬ上に投影された教師なしクラスタリングからの１３細胞クラスターの表現、線維芽細胞培地細胞クラスター：Ｄ２１ｆｍ１－Ｄ２１ｆｍ７；ナイーブリプログラミング細胞クラスター：Ｄ２１ｎｒ１－Ｄ２１ｎｒ３；栄養膜リプログラミング細胞クラスター：Ｄ２１ｔｒ１－Ｄ２１ｔｒ３。（ｆ）細胞クラスターの組成に対する各ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの寄与（％）。Ｄ２１ｔｒ１クラスターは紫色の矢印で示されている。

【図5-1】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-2】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-3】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-4】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-5】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-6】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-7】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図5-8】ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導。（ａ）線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導の実験デザイン。（ｂ）ｉＴＳＣｄ８の位相差画像。スケールバー、１００μｍ。（ｃ）いくつかのＴＳ細胞マーカーに対するｉＴＳＣｄ８の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。（ｄ）陽性及び陰性対照を有するｉＴＳ細胞株におけるセンダイウイルス導入遺伝子、ｎ＝６。（ｅ）線維芽細胞、プライミングｉＰＳ細胞、ナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＣ、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎにおける栄養膜遺伝子の遺伝子発現を、ヒト胚盤胞（ＴＳＣｂｌａｓｔ）及び妊娠初期胎盤栄養膜（ＴＳＣＣＴ）に由来するＴＳＣと比較し、データを平均として提示する（ｎ＝２）。（ｆ）本研究からのトランスクリプトームと公表されたデータセットとのスピアマン相関。生物学的複製（ｎ≧２）を、相関を行う前に平均する。芽球、胚盤胞；芽球／ＣＴ、胚盤胞／細胞栄養膜；ＣＴ、細胞栄養膜。（ｇ、ｈ）栄養膜オルガノイドサンプルを用いて本研究で生成した線維芽細胞、プライミング及びナイーブｔ２ｉＬ ＧｏＹ ｉＰＳ細胞、ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ、ｉＴＳＣｄ８ ＳＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＳＴ、ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴのトランスクリプトームのスピアマン相関。（ｉ）示された細胞株において、１，０００×ｍｉＲ－１０３ａの表現に正規化された１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスターのｍｉＲＮＡの発現。平均値±ｓ．ｅ．ｍ．ＮＤ、検出されない。赤い点線は、プライミングｉＰＳ細胞におけるレベルを示す。ｎ＝２。（ｊ）示された細胞型におけるＥＬＦ５領域でのＡＴＡＣ－ｓｅｑシグナル。複製の平均値（ｎ＝２）。ＴＳ細胞のピークは灰色でマークされている。（ｋ，ｌ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ（ｋ）及びＥＶＴ（ｌ）細胞の位相差及び免疫染色。スケールバー、１００μｍ。ｎ＝４。（ｍ）ｉＴＳＣｄ８ ＳＴとｉＴＳＣｄ８の細胞融合指数。ｎ＝５、データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側不対スチューデントｔ検定によるＰ値。（ｎ）ｉＴＳＣｄ８から分化したＳＴ細胞の培地から得たｈＣＧ妊娠検査の代表的な結果、ｎ＝６。（ｏ）ＥＬＩＳＡによって検出されたｉＴＳＣｄ８－及びｉＴＳＣｄ８－ＳＴ条件培地のｈＣＧレベル、ｎ＝４。（ｐ）線維芽細胞及びＥＶＴにおける汎ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＣクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－Ｂｗ４及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析、ｎ＝４。（ｑ）ｉＴＳＣｄ８ ＥＶＴ及びｉＴＳＣｄ２１ｎ ＥＶＴにおける汎ＨＬＡクラスＩマーカー（Ｗ６／３２）及びＨＬＡ－Ｇの代表的なフローサイトメトリー分析。（ｒ、ｓ）ｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＳＴ細胞におけるＳＴ遺伝子の発現（ｒ）並びにｉＴＳＣｄ８及びｉＴＳＣｄ２１ｎ由来ＥＶＴ細胞におけるＥＶＴ遺伝子の発現（ｓ）。（ｔ）ｉＴＳＣｄ８注射マウスから採取した尿サンプルの代表的なｈＣＧ検査、ｎ＝３。（ｕ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの皮下に生着したｉＴＳＣｄ８から採取した病変、ｎ＝４。（ｖ）マウス血清サンプルを用いたｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、ｎ＝４。（ｗ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのｉＴＳＣｄ８生着物から採取した病変におけるヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色、ｎ＝４。ビヒクル対照では明らかな病変は認められなかった。スケールバー、２００μｍ。

【図6】２１日目のヒト線維芽細胞リプログラミング中間体からのｉＴＳＣの誘導。（ａ）プライミング、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの誘導のための２１日目の線維芽細胞リプログラミング中間体の可能性を検証するための実験デザイン。（ｂ）２１日目の線維芽細胞リプログラミング中間体から生成されたプライミング、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの位相差画像、ｎ＝２。スケールバー、５０μｍ。核染色のための、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、ＮＲ２Ｆ２、ＫＲＴ７及びＤＡＰＩを用いた、プライミング、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの免疫染色、ｎ＝２。スケールバー、２００μｍ。（ｃ）２１日目の線維芽細胞リプログラミング中間体から生成したプライミング、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣにおけるＮＡＮＯＧ、ＺＩＣ２、ＫＬＦ１７、ＤＰＰＡ３、ＧＡＴＡ２及びＫＲＴ７発現の逆転写ｑＰＣＲ分析、ｎ＝３。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。

【図7-1】部分的にリプログラミングされた中間体からのｉＴＳＣの誘導、ナイーブ及び拡張ｉＰＳＣのＴＳＣへの変換。（ａ）リプログラミングプロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。胎盤由来ｈＴＳＣを対照として示す。（ｂ）変換プロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。（ｃ）ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株並びにｈＴＳＣから分化したＳＴ及びＥＶＴのピアソン相関係数のヒートマップ。相関は、データセットの分散された遺伝子にわたる２７７０個の大部分の比較から決定される（方法を参照されたい）。サンプルは、Ｗａｒｄの方法を用いた階層的クラスタリングによって、相関のユークリッド距離からクラスタリングされる。（ｄ）示された系列マーカーの遺伝子発現レベルを、ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ並びに以前に樹立された胚－及び胎盤－由来ｈＴＳＣ株について示す。分化したＳＴ及びＥＶＴを対照として含める。発現レベルは、ｍＲＮＡ分子１００万当たりの転写物数として与えられる。胚及び胎盤由来ｈＴＳＣを参照群とし、ｈＰＳＣ及びｈＴＳＣの各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｅ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ２及びＮＲ２Ｆ２並びに多能性関連転写因子ＳＯＸ２について染色したｈＴＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ、ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ。（ｆ）ＥＶＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣのＥＶＴ子孫の明視野写真（右）。（ｇ）３Ｄ－ＳＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣに由来する３Ｄ－ＳＴ構造の明視野画像（右）。（ｈ）ＳＴ（ＣＧＡ、ＣＧＢ、ＳＤＣ１）、ＥＶＴ（ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ２、ＡＳＣＬ２）及びｈＴＳＣ（ＬＲＰ２、ＣＤＫＮ３）に関連するマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ定量化。ｈＴＳＣ及び分化細胞子孫の各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｉ）合胞体を強調する、ＧＡＴＡ３及び膜関連タンパク質デスモプラキン（ＤＳＰ）、並びに合胞体栄養膜関連マーカーＣＧＢについて染色したｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株に由来する３Ｄ－ＳＴ構造の免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。（ｊ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ３及び絨毛外栄養膜特異的表面マーカーＨＬＡ－Ｇについて染色した、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及び胎盤由来ｈＴＳＣ株から分化したＥＶＴの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー（ｆ－ｇ）：１００μｍ；（ｉ－ｊ）：３０μｍ。

【図7-2】部分的にリプログラミングされた中間体からのｉＴＳＣの誘導、ナイーブ及び拡張ｉＰＳＣのＴＳＣへの変換。（ａ）リプログラミングプロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。胎盤由来ｈＴＳＣを対照として示す。（ｂ）変換プロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。（ｃ）ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株並びにｈＴＳＣから分化したＳＴ及びＥＶＴのピアソン相関係数のヒートマップ。相関は、データセットの分散された遺伝子にわたる２７７０個の大部分の比較から決定される（方法を参照されたい）。サンプルは、Ｗａｒｄの方法を用いた階層的クラスタリングによって、相関のユークリッド距離からクラスタリングされる。（ｄ）示された系列マーカーの遺伝子発現レベルを、ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ並びに以前に樹立された胚－及び胎盤－由来ｈＴＳＣ株について示す。分化したＳＴ及びＥＶＴを対照として含める。発現レベルは、ｍＲＮＡ分子１００万当たりの転写物数として与えられる。胚及び胎盤由来ｈＴＳＣを参照群とし、ｈＰＳＣ及びｈＴＳＣの各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｅ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ２及びＮＲ２Ｆ２並びに多能性関連転写因子ＳＯＸ２について染色したｈＴＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ、ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ。（ｆ）ＥＶＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣのＥＶＴ子孫の明視野写真（右）。（ｇ）３Ｄ－ＳＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣに由来する３Ｄ－ＳＴ構造の明視野画像（右）。（ｈ）ＳＴ（ＣＧＡ、ＣＧＢ、ＳＤＣ１）、ＥＶＴ（ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ２、ＡＳＣＬ２）及びｈＴＳＣ（ＬＲＰ２、ＣＤＫＮ３）に関連するマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ定量化。ｈＴＳＣ及び分化細胞子孫の各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｉ）合胞体を強調する、ＧＡＴＡ３及び膜関連タンパク質デスモプラキン（ＤＳＰ）、並びに合胞体栄養膜関連マーカーＣＧＢについて染色したｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株に由来する３Ｄ－ＳＴ構造の免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。（ｊ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ３及び絨毛外栄養膜特異的表面マーカーＨＬＡ－Ｇについて染色した、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及び胎盤由来ｈＴＳＣ株から分化したＥＶＴの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー（ｆ－ｇ）：１００μｍ；（ｉ－ｊ）：３０μｍ。

【図7-3】部分的にリプログラミングされた中間体からのｉＴＳＣの誘導、ナイーブ及び拡張ｉＰＳＣのＴＳＣへの変換。（ａ）リプログラミングプロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。胎盤由来ｈＴＳＣを対照として示す。（ｂ）変換プロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。（ｃ）ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株並びにｈＴＳＣから分化したＳＴ及びＥＶＴのピアソン相関係数のヒートマップ。相関は、データセットの分散された遺伝子にわたる２７７０個の大部分の比較から決定される（方法を参照されたい）。サンプルは、Ｗａｒｄの方法を用いた階層的クラスタリングによって、相関のユークリッド距離からクラスタリングされる。（ｄ）示された系列マーカーの遺伝子発現レベルを、ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ並びに以前に樹立された胚－及び胎盤－由来ｈＴＳＣ株について示す。分化したＳＴ及びＥＶＴを対照として含める。発現レベルは、ｍＲＮＡ分子１００万当たりの転写物数として与えられる。胚及び胎盤由来ｈＴＳＣを参照群とし、ｈＰＳＣ及びｈＴＳＣの各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｅ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ２及びＮＲ２Ｆ２並びに多能性関連転写因子ＳＯＸ２について染色したｈＴＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ、ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ。（ｆ）ＥＶＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣのＥＶＴ子孫の明視野写真（右）。（ｇ）３Ｄ－ＳＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣに由来する３Ｄ－ＳＴ構造の明視野画像（右）。（ｈ）ＳＴ（ＣＧＡ、ＣＧＢ、ＳＤＣ１）、ＥＶＴ（ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ２、ＡＳＣＬ２）及びｈＴＳＣ（ＬＲＰ２、ＣＤＫＮ３）に関連するマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ定量化。ｈＴＳＣ及び分化細胞子孫の各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｉ）合胞体を強調する、ＧＡＴＡ３及び膜関連タンパク質デスモプラキン（ＤＳＰ）、並びに合胞体栄養膜関連マーカーＣＧＢについて染色したｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株に由来する３Ｄ－ＳＴ構造の免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。（ｊ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ３及び絨毛外栄養膜特異的表面マーカーＨＬＡ－Ｇについて染色した、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及び胎盤由来ｈＴＳＣ株から分化したＥＶＴの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー（ｆ－ｇ）：１００μｍ；（ｉ－ｊ）：３０μｍ。

【図7-4】部分的にリプログラミングされた中間体からのｉＴＳＣの誘導、ナイーブ及び拡張ｉＰＳＣのＴＳＣへの変換。（ａ）リプログラミングプロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。胎盤由来ｈＴＳＣを対照として示す。（ｂ）変換プロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。（ｃ）ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株並びにｈＴＳＣから分化したＳＴ及びＥＶＴのピアソン相関係数のヒートマップ。相関は、データセットの分散された遺伝子にわたる２７７０個の大部分の比較から決定される（方法を参照されたい）。サンプルは、Ｗａｒｄの方法を用いた階層的クラスタリングによって、相関のユークリッド距離からクラスタリングされる。（ｄ）示された系列マーカーの遺伝子発現レベルを、ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ並びに以前に樹立された胚－及び胎盤－由来ｈＴＳＣ株について示す。分化したＳＴ及びＥＶＴを対照として含める。発現レベルは、ｍＲＮＡ分子１００万当たりの転写物数として与えられる。胚及び胎盤由来ｈＴＳＣを参照群とし、ｈＰＳＣ及びｈＴＳＣの各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｅ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ２及びＮＲ２Ｆ２並びに多能性関連転写因子ＳＯＸ２について染色したｈＴＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ、ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ。（ｆ）ＥＶＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣのＥＶＴ子孫の明視野写真（右）。（ｇ）３Ｄ－ＳＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣに由来する３Ｄ－ＳＴ構造の明視野画像（右）。（ｈ）ＳＴ（ＣＧＡ、ＣＧＢ、ＳＤＣ１）、ＥＶＴ（ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ２、ＡＳＣＬ２）及びｈＴＳＣ（ＬＲＰ２、ＣＤＫＮ３）に関連するマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ定量化。ｈＴＳＣ及び分化細胞子孫の各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｉ）合胞体を強調する、ＧＡＴＡ３及び膜関連タンパク質デスモプラキン（ＤＳＰ）、並びに合胞体栄養膜関連マーカーＣＧＢについて染色したｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株に由来する３Ｄ－ＳＴ構造の免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。（ｊ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ３及び絨毛外栄養膜特異的表面マーカーＨＬＡ－Ｇについて染色した、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及び胎盤由来ｈＴＳＣ株から分化したＥＶＴの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー（ｆ－ｇ）：１００μｍ；（ｉ－ｊ）：３０μｍ。

【図7-5】部分的にリプログラミングされた中間体からのｉＴＳＣの誘導、ナイーブ及び拡張ｉＰＳＣのＴＳＣへの変換。（ａ）リプログラミングプロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。胎盤由来ｈＴＳＣを対照として示す。（ｂ）変換プロトコルの概略図。位相差写真は細胞形態の変化を示している。（ｃ）ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株並びにｈＴＳＣから分化したＳＴ及びＥＶＴのピアソン相関係数のヒートマップ。相関は、データセットの分散された遺伝子にわたる２７７０個の大部分の比較から決定される（方法を参照されたい）。サンプルは、Ｗａｒｄの方法を用いた階層的クラスタリングによって、相関のユークリッド距離からクラスタリングされる。（ｄ）示された系列マーカーの遺伝子発現レベルを、ｈＰＳＣ、ｈＥＰＳ、ｈＮＰＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ並びに以前に樹立された胚－及び胎盤－由来ｈＴＳＣ株について示す。分化したＳＴ及びＥＶＴを対照として含める。発現レベルは、ｍＲＮＡ分子１００万当たりの転写物数として与えられる。胚及び胎盤由来ｈＴＳＣを参照群とし、ｈＰＳＣ及びｈＴＳＣの各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｅ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ２及びＮＲ２Ｆ２並びに多能性関連転写因子ＳＯＸ２について染色したｈＴＳＣ、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ、ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ。（ｆ）ＥＶＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣのＥＶＴ子孫の明視野写真（右）。（ｇ）３Ｄ－ＳＴ分化プロトコルの概略図（左）。ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣに由来する３Ｄ－ＳＴ構造の明視野画像（右）。（ｈ）ＳＴ（ＣＧＡ、ＣＧＢ、ＳＤＣ１）、ＥＶＴ（ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ２、ＡＳＣＬ２）及びｈＴＳＣ（ＬＲＰ２、ＣＤＫＮ３）に関連するマーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ定量化。ｈＴＳＣ及び分化細胞子孫の各タイプについてＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ統計検定を行った。星印は、差異の統計的有意性を示す：^＊ ｐ値＜０．０５；^＊＊ ｐ値＜０．０１；^＊＊＊ ｐ値＜０．００１。（ｉ）合胞体を強調する、ＧＡＴＡ３及び膜関連タンパク質デスモプラキン（ＤＳＰ）、並びに合胞体栄養膜関連マーカーＣＧＢについて染色したｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及びｈＴＳＣ株に由来する３Ｄ－ＳＴ構造の免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。（ｊ）栄養膜関連転写因子ＧＡＴＡ３及び絨毛外栄養膜特異的表面マーカーＨＬＡ－Ｇについて染色した、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及び胎盤由来ｈＴＳＣ株から分化したＥＶＴの免疫蛍光画像。核をＤＡＰＩで染色した。スケールバー（ｆ－ｇ）：１００μｍ；（ｉ－ｊ）：３０μｍ。

【発明を実施するための形態】

【0081】

ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照する。本発明を実施形態に関連して説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではないことが理解されるであろう。むしろ、本発明は特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、修正物、及び等価物を網羅することを意図している。

【0082】

当業者は、本明細書に記載される方法及び物質と類似するか若しくは等価である多くの方法及び物質を認識する。本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されない。本明細書に開示され、定義された本発明は、本文若しくは図面に言及され、又は本文若しくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の代替的な組み合わせの全てに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の様々な代替態様を構成する。

【0083】

本明細書を解釈する目的で、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。

【0084】

本発明は、核リプログラミングによって体細胞から直接ヒト栄養膜幹細胞（ｈＴＳＣ）を生成するための新規な方法に関する。これまでに公表されているＴＳＣを生成する方法は、初代組織（例えば、妊娠初期胎盤又は胚盤胞）からのＴＳＣの単離、又は「拡張潜在幹細胞」（ＥＰＳＣ）をＴＳＣに分化させることによるもののみである。本発明は、アクセスが容易な患者特異的供給源（例えば、線維芽細胞）からのヒト「誘導」栄養膜幹細胞（ｉＴＳＣ）の生成を可能にし、従って、このような細胞の組織供給源（例えば、胎盤）又は生成が困難なＥＰＳＣを得ることへの依存を排除する。

【0085】

線維芽細胞の異なる多能性状態へのリプログラミングを研究する一方で、本発明者らは、栄養外胚葉（ＴＥ）転写ネットワークを一時的にアップレギュレートする中間細胞集団を同定した。中間ＴＥ状態を安定化させ、リプログラミング細胞を多能性培地から、ＴＳＣを支持することができる培地に移すことによって、本発明者らは、体細胞から「誘導栄養膜幹細胞」（ｉＴＳＣ）を生成するための方法を考案した。

【0086】

本発明者らの方法に従って生成されたｉＴＳＣの特徴付けは、これらの細胞がヒトＴＥ及びＴＳＣを規定する重要な因子を発現することを示す。例えば、細胞は、ヒト胎盤におけるＰＣＮＡ＋増殖細胞の目印となる核ＮＲ２Ｆ２を発現する。本発明に従って生成されたＴＳＣは増殖性であり、成長速度を低下させることなく、複数の継代を通してＴＳＣの特徴を維持する。さらに、これらの細胞は、分子的にも機能的にも、ヒト胚盤胞又は妊娠初期胎盤に由来するＴＳＣに非常に似ている。本発明の方法に従って生成されたＴＳＣの機能的特徴付けは、これらの細胞が合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）又は絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）のいずれかに分化できることを示す。重要なことに、これらのアッセイは、本発明の方法に従って生成されたｉＴＳＣが実際に二分化能であり、ＳＴ細胞及びＥＶＴ細胞に分化し得ることを示す。

【0087】

初代胎盤組織又はヒト胚盤胞に由来するヒト栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）は、アクセスが困難であり、高度に調節されている。従って、成体細胞から誘導できる安定した自己複製ｉＴＳＣ株を有することは、ヒト栄養膜発達を研究するためのユニークな機会を提供するだけでなく、多能性細胞とのその関係、並びに現代の生化学的及び分子的技術が規模を拡大して適用できるインビトロ状況における初期ヒト胚発生に関連した事象を調整する際のその役割も提供する。ｉＴＳＣ株はまた、疾患モデリング、薬物スクリーニング及び再生医療に用いることができる。さらに、ｉＴＳＣは、胎盤に類似するオルガノイドを生成するために有用であり得る。

【0088】

本発明に従って生成された細胞はまた、生体異物、薬物及び病原体、タンパク質及びホルモンの母体－胎児伝播を研究するための栄養膜オルガノイドの生成を含む、多様な他の臨床用途に有用性を見出し得る。さらに、同じ健康な個人又は患者の体細胞に由来するヒトＴＳＣ／ｉＴＳＣ及びｉＰＳＣを用いて、ヒト胚盤胞様構造を組み立てることができる。これは、不妊症の治療及びＩＶＦの成功率を改善することを含む、大規模スクリーニング研究のための合成ヒト胚盤胞様オルガノイドの無限の供給源を提供する。尚さらに、本発明に従って生成されたｉＴＳＣは、再生医療に使用することができる。例えば、胎盤細胞は、最近、心臓組織を再生するのに有用であることが示されている。本発明のｉＴＳＣは、胎盤から直接細胞を得る必要なしに、このような胎盤細胞を生成するために使用され得る。

【0089】

ヒト胎盤又はヒト胚からヒトＴＳＣを誘導する現在の方法と比較して、ヒトｉＴＳＣを生成するための本発明のリプログラミングアプローチは、倫理的な制約なしに、よりアクセスしやすく、労力及び費用効率が高い。このアプローチは、患者から生成された疾患特異的ｉＴＳＣを用いた大規模スクリーニング研究のための同質遺伝子ｉＴＳＣの無限の供給を可能にする。

【0090】

細胞
本発明の方法に従って使用するための細胞は、体細胞又は疾患細胞を含む、本明細書に記載される任意の細胞型であり得る。体細胞は成体細胞であってもよいし、成体又は非胚細胞の１つ以上の検出可能な特徴を示す成体由来の細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患又は状態の１つ以上の検出可能な特徴を示す細胞であってもよい。

【0091】

本発明に従って使用するための体細胞は、ｉＰＳＣ又は他の胚性若しくは成体幹細胞に由来してもよく、又は対象由来の組織外植片に由来してもよい。

【0092】

好ましい実施形態において、体細胞は、線維芽細胞（好ましくは、皮膚線維芽細胞又は心臓線維芽細胞）、ケラチノサイト（好ましくは、表皮ケラチノサイト）、単球又は内皮細胞である。

【0093】

本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、最終的に分化されていない、即ち、より特定の特殊化された機能を有する他の細胞型に分化し得る細胞を指す。この用語は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞又は方向付けされた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）／前駆細胞を包含する。

【0094】

本明細書で使用される場合、「体細胞」は、最終的に分化された細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られる）は精子と卵子であり、これらは受精時に融合して接合子と呼ばれる細胞を生成し、そこから哺乳動物胚全体が発生する。哺乳動物の体内の他のあらゆる細胞型（精子及び卵子、そこから精子及び卵子が作られる細胞（配偶子母細胞）、及び未分化幹細胞を除いて）は、体細胞である。体内の器官、皮膚、骨、血液、結合組織は全て体細胞でできている。いくつかの実施形態において、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚中に存在しないか、又は胚から得られず、インビトロでのこのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの実施形態において、体細胞は「成体体細胞」であり、これは、胚又は胎児以外の生物中に存在するか、若しくはそれから得られる細胞、又はインビトロでのそのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。体細胞は例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることによって、細胞の無制限の供給を提供するために不死化され得る。例えば、ＴＥＲＴのレベルは、内因性遺伝子からのＴＥＲＴの転写を増加させることによって、又は任意の遺伝子送達方法若しくは系を介して導入遺伝子を導入することによって増加され得る。

【0095】

ヒト、個体を含む胎児、新生児、幼若又は成体霊長類由来の細胞を含む分化体細胞は、本発明の方法において適切な体細胞である。適切な体細胞は、骨髄細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸細胞、間葉細胞、骨髄前駆細胞及び脾臓細胞を含むがこれらに限定されない。或いは、体細胞は、それ自身が増殖し、血液幹細胞、筋肉／骨幹細胞、脳幹細胞及び肝臓幹細胞を含む他のタイプの細胞に分化し得る細胞であり得る。適切な体細胞は、受容性であるか、又は転写因子をコードする遺伝物質を含む転写因子を取り込むように、科学文献において一般に公知の方法を使用して受容性にされ得る。取り込み増強方法は、細胞型及び発現系に応じて変化し得る。適切な形質導入効率を有する受容性細胞を調製するために使用される例示的な条件は、当業者に周知である。出発体細胞は、約２４時間の倍加時間を有することができる。

【0096】

本明細書で使用される用語「単離された細胞」は、それが元々見出される生物から取り出された細胞又はそのような細胞の子孫を指す。場合により、細胞はインビトロで、例えば、他の細胞の存在下で培養されている。場合により、細胞は、後に第２の生物に導入されるか、又はそれが単離された生物（又はそれが由来する細胞）に再導入される。

【0097】

本明細書で使用される単離された細胞集団に関連する用語「単離された集団」は、細胞の混合又は不均一集団から取り出され及び分離された細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞が単離又は濃縮された異種集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団である。

【0098】

用語「実質的に純粋な」は、特定の細胞集団に関して、全細胞集団を構成する細胞に関連して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋な細胞の集団を指す。書き直せば、用語「実質的に純粋な」又は「本質的に精製された」は、標的細胞、即ちＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞の集団に関して、本明細書の用語によって定義される標的細胞又はその子孫ではない細胞を約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％、又は１％未満含む細胞の集団を指す。

【0099】

当業者は、体細胞の特徴をＴＳＣの特徴から区別する（換言すれば、体細胞表現型の消失を調べる）手段にも精通しているであろう。例えば、本明細書の実施例に提供されるように、ＴＳＣの生成のための適切な体細胞は、線維芽細胞を含む。当業者は、線維芽細胞とＴＳＣの特徴を容易に区別することができ、例えば、線維芽細胞は、典型的にはＣＤ４４について陽性である。当業者は、このマーカーの減少した発現を観察することによって、線維芽細胞からＴＳＣへの変換を決定することができる。

【0100】

体細胞から多能性状態への変換中に発現が変化した他のマーカーには、ＴＷＩＳＴ１、ＴＷＩＳＴ２、ＳＮＡＩ１、ＳＮＡＩ２、ＺＥＢ１及びＺＥＢ２が含まれる。

【0101】

当業者はまた、体細胞が、体細胞に典型的な形態学的特徴を失ったときに、多能性状態に向けたリプログラミングを開始した時を決定することができるであろう。再び、当業者は、線維芽細胞のものを含む様々な体細胞の形態学的特徴に精通している。

【0102】

体細胞はまた、それが多能性細胞の少なくとも１つの特徴を示す場合、多能性状態にリプログラミングされたと決定され得る。多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ又はＥＳＣ）の１つ以上の特徴は、任意の１つ以上のＥＳＣマーカーのアップレギュレーション及び／又は細胞形態の変化を含む。典型的には、ｉＰＳＣ／ＥＰＳＣ様細胞に変換された細胞は、ｉＰＳＣ／ＥＰＳＣの１、２、３、４、５、６、７、８以上の特徴を示す。

【0103】

体細胞は、それがＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す場合、ＴＳＣに変換されたと決定される。例えば、線維芽細胞は、本発明の方法に従って処理された線維芽細胞がＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す場合、ＴＳＣに変換されたと同定される。

【0104】

ＴＳＣの１つ以上の特徴は、任意の１つ以上の栄養膜マーカーのアップレギュレーション及び／又は細胞形態の変化を含む。典型的には、ＴＳＣに変換された細胞は、ＴＳＣの１、２、３、４、５、６、７、８以上の特徴を示す。

【0105】

本明細書で使用される場合、本発明に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞はまた、「誘導栄養膜幹細胞」又はｉＴＳＣと呼ばれ得る。

【0106】

本発明の任意の実施形態において、ＴＳＣ核ＣＤ４９ｆ（ｉＴＧＡ６）、ＣＤ２４９（アミノペプチダーゼＡ）、及び核ＮＲ２Ｆ２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２／３及びＰ６３に特徴的なタンパク質マーカー。

【0107】

さらなる実施形態において、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞は、以下のマーカーのうちの１つ以上を発現しない：ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＡＬＬ２、ＯＴＸ２、ＢＡＮＣＲ、ＫＬＦ１７、ＤＰＰＡ３、及びＤＮＭＴ３Ｌ。

【0108】

さらに、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞は、ＥＶＴ又はＳＴの１つ以上の特徴を示す細胞に分化する能力を有する。

【0109】

体細胞がリプログラミングされたか、又はＴＳＣに変換されたかを決定するために使用され得るさらなるマーカーは、当業者に公知である。適切なマーカーの例は、例えば、Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８） Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２：５０－６３，Ｄｅｇｌｉｎｃｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１６） Ｎａｔｕｒｅ，５３３：７５１－４，Ｓｈａｈｂａｚｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８：７００－７０８及びＮｉａｋａｎ＆Ｅｇｇａｎ（２０１３） Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３７５：５４－６４）に開示されており、これらの全内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0110】

当業者は、細胞形態の変化を観察することによる、線維芽細胞のＴＳＣへの変換を決定するための方法に精通している。例えば、成体線維芽細胞は、楕円形の斑点のある核を取り囲む、細長い、分岐した細胞質を有することを特徴とする。

【0111】

対照的に、ＴＳＣは、典型的には、大きな玉石状のコロニーを形成する。

【0112】

本発明の任意の態様において、ＴＳＣの特徴は、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、分化能力、又はそれらの組み合わせの分析によって決定され得る。特徴又はマーカーの例には、本明細書に記載されているもの及び当業者に知られているものが含まれる。

【0113】

リプログラミング
多能性状態に向かって体細胞をリプログラミングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。体細胞のリプログラミングは、典型的にはリプログラミング因子（転写因子を含む）の発現を含み、続いて、体細胞のマーカーの喪失（即ち、分化の喪失）を促進するための特定の条件での培養を含み、初期胚起源の細胞型となる可能性を得る。

【0114】

体細胞をリプログラミングするための適切な方法の例は、当技術分野において豊富であり、国際公開第２００９／１０１４０７号パンフレット、国際公開第２０１４／２０００３０号パンフレット、国際公開第２０１５／０５６８０４号パンフレット、国際公開第２０１４／２００１１４号パンフレット、国際公開第２０１４／０６５４３５号パンフレット、国際公開第２０１３／１７６２３３号パンフレット、国際公開第２０１２／０６０４７３号パンフレット、国際公開第２０１２／０３６２９９号パンフレット、国際公開第２０１１／１５８９６７号パンフレット、国際公開第２０１１／０５５８５１号パンフレット、国際公開第２０１１／０３７２７０号パンフレット、国際公開第２０１１／０９０２２１号パンフレット（これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に例示されている。

【0115】

本発明の方法に従って体細胞（例えば、線維芽細胞）をリプログラミングするために使用され得る、特に好ましい転写因子及びその核酸配列は、以下の表１に示される。しかしながら、本発明は、体細胞をリプログラミングするために、表１に列挙される転写因子の使用に限定されないことが理解されるであろう。

【0116】

本明細書に言及される転写因子及び他のタンパク質因子は、ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ）記号によって言及される。表１は、本明細書に列挙される転写因子についての例示的なアンサンブル遺伝子ＩＤ及びＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤを提供する。ヌクレオチド配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（Ｆｌｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ ４２，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１．Ｐｐ．Ｄ７４９－Ｄ７５５）バージョン８３に由来する。本明細書に言及される転写因子の任意のホモログ、オルソログ又はパラログもまた、本発明での使用が意図される。

【0117】

当業者はまた、ナイーブ多能性状態（プライミングされた多能性状態と比較して）に向かって体細胞をリプログラミングする能力に精通することになる。本発明の方法は、ナイーブ又はプライミングされた多能性状態に向かうリプログラミングを促進するように処理される細胞に適用されることが理解されるであろう。本発明の好ましい実施形態において、この方法は、ナイーブ多能性状態に向かって体細胞をリプログラミングするために、体細胞における１つ以上の因子のタンパク質発現を増加させることを含む。

【0118】

当業者は、この情報が例えば、体細胞において増加した量の転写因子を提供する目的のために、又は体細胞において転写因子を組換え的に発現するための核酸などを提供する目的のために、本発明の方法を実施する際に使用され得ることを理解するであろう。

【0119】

【表1】

【0120】

用語「改変体」は、全長ポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを指す。本発明は、本明細書に記載される転写因子の改変体の使用を意図する。改変体は、全長ポリペプチドの断片又は天然に存在するスプライスバリアントであり得る。改変体は、ポリペプチドの断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一のポリペプチドであり得、ここで断片は、全長野生型ポリペプチド又はそのドメインが、体細胞型の標的細胞型への変換を促進する能力などの目的の機能的活性を有する限り、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％である。いくつかの実施形態では、ドメインは、配列中の任意のアミノ酸位置から始まり、Ｃ末端に向かって延びる少なくとも１００、２００、３００、又は４００アミノ酸長である。タンパク質の活性を除去又は実質的に低下させることが当該技術分野で公知の変動は、好ましくは回避される。いくつかの実施形態では、改変体は、全長ポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端部分を欠き、例えば、いずれかの末端から１０、２０、又は５０アミノ酸まで欠く。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは成熟（全長）ポリペプチドの配列を有し、これは、シグナルペプチドなどの１つ以上の部分が、正常な細胞内タンパク質分解プロセシングの間（例えば、同時翻訳プロセシング又は翻訳後プロセシングの間）に除去されたポリペプチドを意味する。タンパク質がそれを天然に発現する細胞からそれを精製すること以外で生成されるいくつかの実施形態では、タンパク質はキメラポリペプチドであり、これは、それが２つ以上の異なる種からの部分を含むことを意味する。タンパク質がそれを天然に発現する細胞からそれを精製すること以外で生成されるいくつかの実施形態では、タンパク質は誘導体であり、これは、タンパク質が、タンパク質の生物学的活性を実質的に低下させない限り、タンパク質に関連しないさらなる配列を含むことを意味する。当業者は、当技術分野で公知のアッセイを用いて、特定のポリペプチド改変体、断片、又は誘導体が機能的であるかどうかを認識し、又は容易に確認することができるであろう。例えば、転写因子の改変体が体細胞を標的細胞型に変換する能力は、本明細書の実施例に開示されるアッセイを用いて評価することができる。他の簡便なアッセイは、ルシフェラーゼなどの検出可能なマーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された転写因子結合部位を含むレポーター構築物の転写を活性化する能力を測定することを含む。本発明の特定の実施形態では、機能的改変体又は断片は、全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上を有する。

【0121】

転写因子の量を増加させることに関連した用語「量を増加させる」は、目的の細胞（例えば、線維芽細胞などの体細胞）中の転写因子の量を増加させることを指す。いくつかの実施形態では、転写因子の量が、対照（例えば、発現カセットのいずれも導入されていない線維芽細胞）と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれを超える場合、転写因子の量は、目的の細胞（例えば、１つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現を指示する前記発現カセットが導入されている細胞）において「増加」している。しかしながら、転写因子（又はそれをコードするｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡ）の転写、翻訳、安定性又は活性の量、速度又は効率を増加させる任意の方法を含む、転写因子の量を増加させる任意の方法が意図される。さらに、転写発現の負の調節因子のダウンレギュレーション又は干渉、既存の翻訳の効率の増加（例えば、ＳＩＮＥＵＰ）も考慮される。

【0122】

本明細書で使用される用語「薬剤」は、限定されるものではないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物又は物質を意味する。「薬剤」は、合成及び天然に存在するタンパク質性及び非タンパク質性の実体を含むが、これらに限定されない、任意の化学物質、実体又は部分であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、並びにこれらの修飾及び組み合わせなどを含むがこれらに限定されない、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、又は炭水化物である。特定の実施形態では、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、非置換又は置換アルキル、芳香族、又は複素環部分（マクロライド、レプトマイシン、及び関連する天然産物又はその類似体を含む）を含んだ。化合物は、所望の活性及び／若しくは特性を有することが公知であり得るか、又は多様な化合物のライブラリーから選択され得る。

【0123】

用語「外因性」は、細胞又は生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、若しくはポリヌクレオチドに関して使用される場合、人工的若しくは天然の手段によって細胞若しくは生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、若しくはポリヌクレオチドを指し；又は細胞に関して使用される場合、単離され、その後、人工的若しくは天然の手段によって他の細胞若しくは生物に導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物若しくは細胞に由来し得るか、又は生物若しくは細胞内で天然に存在する核酸の１つ以上のさらなるコピーであり得る。外因性細胞は、異なる生物由来であり得るか、又は同じ生物由来であり得る。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある核酸、又は天然に見出される核酸配列とは異なる核酸配列に隣接する核酸である。外因性核酸はまた、エピソームベクターなどの染色体外であってもよい。

【0124】

体細胞型を多能性状態にリプログラミングするために必要な１つ以上の転写因子の量を増加させる能力について１つ以上の候補因子をスクリーニングすることは、転写因子の生成物又は発現を可能にする系を候補因子と接触させる工程と、転写因子の量が増加したかどうかを決定する工程とを含み得る。系はインビボ、例えば、生物中の組織若しくは細胞、又はインビトロ、生物から単離された細胞、若しくはインビトロ転写アッセイ、又は細胞若しくは組織中のエクスビボであり得る。転写因子の量は、タンパク質又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体）の量を測定することによって、直接的に又は間接的に測定される。候補薬剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写における任意の工程を増加させることにより、又は対応するｍＲＮＡの翻訳を増加させることにより、転写因子の量を増加させるように機能し得る。或いは、候補薬剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写のリプレッサーの阻害活性、又は転写因子をコードするｍＲＮＡ若しくは転写因子のタンパク質自体の分解を引き起こす分子の活性を低下させてもよい。

【0125】

適切な検出手段としては、放射性ヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、染料などの標識の使用が挙げられる。このような標識試薬は、多様な周知のアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイなど）において使用され得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号明細書、同第３，７９１，９３２号明細書、同第３，８１７，８３７号明細書及び同第４，２３３，４０２号明細書を参照されたい。

【0126】

本発明の方法は、ハイスループットスクリーニング適用を含む。例えば、転写因子の生成物又は発現を可能にする系のアリコートが、マルチウェルプレートの異なるウェル内の複数の候補薬剤に曝露される、本発明によるアッセイのいずれかを含むハイスループットスクリーニングアッセイが使用され得る。さらに、本開示によるハイスループットスクリーニングアッセイは、任意の種類の小型化アッセイシステムにおいて複数の候補薬剤に曝露される転写因子の生成物又は発現を可能にする系のアリコートを含む。

【0127】

本開示の方法は、プレート当たり２４、４８、９６又は３８４ウェルなどのマルチウェルプレート、マイクロチップ又はスライドを含むがこれらに限定されない、任意の許容可能な小型化方法によって、アッセイシステムにおいて「小型化」され得る。アッセイはマイクロチップ支持体上で実施されるようにサイズを縮小することができ、有利には、より少量の試薬及び他の材料を含む。ハイスループットスクリーニングを助長するプロセスの小型化のいずれも、本発明の範囲内である。

【0128】

本発明の任意の方法において、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞を、体細胞が得られたのと同じ哺乳動物に移すことができる。換言すれば、本発明の方法において使用される体細胞は自己細胞であり得、即ち、標的細胞が投与される同じ個体から得られ得る。或いは、標的細胞は、別の個体に同種異系的に移され得る。好ましくは、細胞は、個体における医学的状態を治療又は予防する方法において、対象に対して自己である。

【0129】

培養培地
本明細書で言及する用語「細胞培養培地」（本明細書では「培養培地」又は「培地」とも呼ばれる）は、細胞生存率を維持し、増殖を支持する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下のいずれかを適切な組み合わせで含み得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコース又は他の糖、抗生物質、血清又は血清代替物、及びペプチド成長因子などの他の成分。特定の細胞型のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。本発明の方法において使用するための例示的な細胞培養培地を表２に示す。

【0130】

【表2】

【0131】

【表3】

【0132】

本発明の重要な発見は、一旦リプログラミングプロセスが開始されたら、リプログラミングを受けている（しかしリプログラミングを完了していない）体細胞をＴＳＣの成長及び増殖を支持する培地に移行し得ることである。本発明者らは、細胞をこのような培地と接触させると、安定なＴＳＣ様細胞（これは、互換的に誘導栄養膜幹細胞又はｉＴＳＣとも呼ばれ得る）を生成することが可能であることを見出した。

【0133】

従って、本発明者らは、リプログラミングプロセスの間に細胞をＴＳＣ培地に曝露することによって、体細胞から直接ヒトＴＳＣを生成するための新規な方法を開発した。

【0134】

本発明の方法によれば、一旦リプログラミングプロセスが開始されたら、体細胞を任意の時間にＴＳＣ培地と接触させ得ることが理解される。例えば、接触は、多能性運命に向かったリプログラミングの開始後、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、１０日以上（１４、２１、２８、３５日以上を含む）であり得る。

【0135】

リプログラミングの初期段階の間に使用される初期培地はまた、多能性培地である必要はない。例えば、本発明の好ましい方法において、細胞は、その後の段階でＴＳＣ培地に移行される前であるが、リプログラミングの完了前に、線維芽細胞培地（又は体細胞の成長を支持する他の培地）中のリプログラミング薬剤に曝露される。

【0136】

或いは、一旦リプログラミングが開始されたら、体細胞を本明細書に記載されるように、ナイーブ若しくはプライミング培地、又は拡張培地中で、ある期間培養して（これはリプログラミングプロセスの完了を含み又は含み得ない）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣを生成し得る。この時間の後、細胞をＴＳＣ培地に移行し得る。

【0137】

ＴＳＣ及びその増殖を支持するために適切な培養培地は、好ましくはＯｋａｅ（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、及び国際公開第２０１６／１４３８６６号パンフレット（これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような培養培地である。

【0138】

ＴＳＣの基本培地組成は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０などを含む、一般に使用される任意の基本培地であり得る。培地には、血清、成長因子、ピルビン酸、アミノ酸、抗生物質等を適宜含有させることができる。

【0139】

ＴＳＣ培養物は、好ましくは少なくとも１つの成長因子及び少なくとも１つのＲＯＣＫ阻害剤を含む。

【0140】

本明細書で使用される場合、成長因子は任意の成長因子であり得るが、好ましくは上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）から選択される１つである。成長因子の量は、任意の量、例えば０．１～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0141】

本明細書で使用される場合、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ結合キナーゼの阻害剤を指す。このような阻害剤の例には、（（１Ｒ，４ｒ）－４－（（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、Ａｂｃａｍ）（ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミドとしても知られる）、１－（５－イソキノルニル）（スルホニル）ホモピペラジン（１－（５－イソキノリニルスルホニル）ホモピペラジン）が含まれる。典型的には、ＲＯＣＫ阻害剤の量は、約０．１～５０μＭ、好ましくは約１～１０μＭとなる。

【0142】

特定の好ましい実施形態において、ＴＳＣ培養物は、Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．に記載されるＡＳＥＣＲｉＡＶ培地であり、Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、ＣＨＩＲ、ＲＯＣＫ阻害剤、アスコルビン酸及びバルプロ酸を含む。

【0143】

最も好ましくは、ＴＳＣ培地は、以下を含む：
－ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、
－ ０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）
－ ０．２％ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．５％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １．５μｇ／ｍｌ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、
－ ５μＭ Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）－４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、Ａｂｃａｍ）、
－ ２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（６－（（２－（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリルＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、
－ ０．５μＭ Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、Ｓｉｇｍａ）、
－ １μＭ ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）
－ ５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び
－ ０．８ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ、Ｓｉｇｍａ）。

【0144】

分化
本発明はまた、分化細胞を生成する方法を含み、この方法は、本発明に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞を分化条件に供することを含む。特定の実施形態によれば、本発明に従って作製されたＴＳＣ細胞は、系列特異的細胞、例えばＳＴ及びＥＶＴを単離するために使用することができる。

【0145】

当業者は、本発明に従って生成されたＴＳＣを分化させるための標準的な方法に精通しているであろう。手短には、ＴＳＣは、ＴＳＣをＭＥＦＢＡＰ処理（ＭＥＦ条件培地、ＢＭＰ４、ＴＧＦβｉ、ＦＧＦＲｉ、Ａｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１３ ＰＮＡＳ，１１０：Ｅ１２１２－１２２１に記載されているように）に供することによって、合胞体栄養膜（ＳＴ）に分化させることができる。或いは、ＴＳＣのフォルスコリン処理への曝露も、ＴＳＣをＳＴ運命に分化させるために使用され得る。

【0146】

分化のためのさらなる方法は、Ｋｉｄｄｅｒ（２０１４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１１５０－２０１－１２；Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１７） Ｐｌａｃｅｎｔａ，２８：１４－１２；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４３１；１７９－２０２に開示されている。この方法は、ＧＦＧ４及びヘパリンを欠く培地中で細胞を培養することを含み得る。この方法はまた、分化因子を含む培地中での細胞の遺伝子改変を含み得る。

【0147】

ＳＴへの分化の成功は、基礎β－ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）分泌、及びヒト胎盤性ラクトゲン遺伝子の発現を測定することによって決定され得る。或いは、ＳＴへの分化の成功は、ＳＤＣ１＋多核細胞の存在によって決定され得る。

【0148】

ＥＶＴ運命に向かう分化の成功は、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＲＧ２及びＰＡＰＰ２から選択される１つ以上のマーカーのタンパク質発現を決定することによって確認することができる。

【0149】

核酸及びベクター
本明細書に記載される核酸又は核酸を含むベクターは、上記の表１に言及される配列の１つ以上を含み得る。

【0150】

用語「発現」は、適用可能な場合、例えば転写、翻訳、フォールディング、改変及びプロセシングを含むがこれらに限定されないＲＮＡ及びタンパク質の生成、並びに必要に応じてタンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指す。

【0151】

本明細書で使用される用語「単離された」又は「部分的に精製された」は、核酸又はポリペプチドの場合、その天然の供給源において見出される核酸若しくはポリペプチドと共に存在する、及び／又は細胞によって発現され、若しくは分泌ポリペプチドの場合、分泌されるときに核酸若しくはポリペプチドと共に存在する、少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸又はポリペプチド）から分離された核酸又はポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸若しくはポリペプチド、又はインビトロ転写／翻訳を用いて合成された核酸若しくはポリペプチドは、「単離された」と見なされる。

【0152】

用語「ベクター」は、宿主又は体細胞への導入のためにＤＮＡ配列が挿入され得る担体ＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、それらが連結される核酸の自律的複製及び／又は発現が可能なベクターである。それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。従って、「発現ベクター」とは、宿主細胞における目的の遺伝子の発現に必要な、必要な調節領域を含む特殊化されたベクターである。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、ベクター中の別の配列に作動可能に連結される。ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターが使用される場合、ウイルスベクターは複製欠損であることが好ましく、これは、例えば、複製をコードする全てのウイルス核酸を除去することによって達成され得る。複製欠損ウイルスベクターは、依然としてその感染性を保持し、複製アデノウイルスベクターと同様の方法で細胞に侵入するが、一旦細胞に入ると、複製欠損ウイルスベクターは複製も増殖もしない。ベクターはまた、リポソーム及びナノ粒子、並びにＤＮＡ分子を細胞に送達するための他の手段を包含する。

【0153】

用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中のコード配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結エレメント）の配置に適用されることがある。用語「作動可能に連結された」は、発現されるべきポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有することと、発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現、及びポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの生成を可能にするために正確なリーディングフレームを維持することを含む。

【0154】

用語「ウイルスベクター」は、細胞中への核酸構築物の担体としてのウイルス又はウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、細胞への感染又は形質導入のために、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、若しくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のような非複製性の欠陥ウイルスゲノム、又はレトロウイルス及びレンチウイルスベクターを含むその他に組み込まれ及びパッケージされ得る。ベクターは、細胞のゲノムに組み込まれていても、組み込まれていなくてもよい。構築物は、所望される場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。或いは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶベクター及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。

【0155】

本明細書で使用される場合、用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａ）のウイルスを指す。アデノウイルスは、ヌクレオカプシド及び二本鎖線状ＤＮＡゲノムから構成された中型（９０～１００ｎｍ）の無エンベロープ（裸）の正二十面体ウイルスである。

【0156】

本明細書で使用される場合、用語「非組み込みウイルスベクター」は、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターを指し、ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現が一時的である。宿主ゲノムへの組込みはほとんどないか全くないので、非組み込みウイルスベクターは、ゲノム中のランダムな地点に挿入することによるＤＮＡ変異の生成がないという利点を有する。例えば、非組み込みウイルスベクターは染色体外に留まり、潜在的に内在性遺伝子の発現を破壊するその遺伝子を宿主ゲノムに挿入しない。非組み込みウイルスベクターは、以下を含み得るがこれらに限定されない：アデノウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、及びワクシニアウイルス。これらのウイルスベクターは、それらのいずれかが、いくつかのまれな状況において、ウイルス核酸を宿主細胞のゲノムに組み込む可能性があるにもかかわらず、本明細書で使用される用語として、「非組み込み」ウイルスベクターである。重要なことは、本明細書に記載される方法において使用されるウイルスベクターが、原則として、又は使用される条件下でのそれらのライフサイクルの主要部分として、それらの核酸を宿主細胞のゲノムに組み込まないことである。

【0157】

本明細書に記載されるベクターは、治療における使用のためのそれらの安全性を増加させるために、所望される場合に選択及び濃縮マーカーを含ませるために、並びにそこに含まれるヌクレオチド配列の発現を最適化するために、科学文献において一般に公知の方法を用いて構築及び操作され得る。ベクターは、ベクターが体細胞型において自己複製することを可能にする構成要素を含むべきである。例えば、公知のＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｏｒｉＰ／Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－１（ＥＢＮＡ－Ｉ）の組み合わせ（例えば、Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ｂ．Ｓｕｇｄｅｎ，Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｃｅｎｓｅｄ，ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｐｌａｓｍｉｄ ５８：１（２００７）参照）は、ベクター自己複製を支持するのに十分であり、また哺乳動物、特に霊長類細胞において機能することが公知の他の組み合わせも使用することができる。本発明における使用に適した発現ベクターの構築のための標準的な技術は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，（３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１）（その全体があたかも記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる）などの刊行物に見出すことができる。

【0158】

本発明の方法において、変換に必要な関連する転写因子をコードする遺伝物質は、１つ以上のリプログラミングベクターを介して体細胞に送達される。各転写因子は、体細胞中のポリヌクレオチドの発現を駆動することができる異種プロモーターに作動可能に連結された転写因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子として体細胞に導入することができる。

【0159】

適切なリプログラミングベクターは、感染性又は複製能力のあるウイルスを生じるのに十分なウイルスゲノムの全て又は一部をコードしないエピソームベクター（例えば、プラスミド）を含む、本明細書に記載される任意のものであるが、ベクターは１つ以上のウイルスから得られる構造エレメントを含み得る。リプログラミングベクターの１つ又は複数を、単一の体細胞に導入することができる。１つ以上の導入遺伝子が、単一のリプログラミングベクター上に提供され得る。１つの強力な構成的転写プロモーターは、発現カセットとして提供され得る複数の導入遺伝子の転写制御を提供し得る。ベクター上の別々の発現カセットは、別々の強力な構成的なプロモーターの転写制御下に置くことができ、これは、同じプロモーターのコピーであってもよく、別個のプロモーターであってもよい。様々な異種プロモーターが当技術分野で公知であり、転写因子の所望の発現レベルなどの因子に応じて使用され得る。以下に例示されるように、ｖ細胞において異なる強度を有する異なるプロモーターを使用して、別々の発現カセットの転写を制御することが有利であり得る。転写プロモーターを選択する際に考慮すべき別の点は、プロモーターがサイレンシングされる速度である。当業者は、遺伝子の産物がリプログラミング方法におけるその役割を完了したか、又は実質的に完了した後に、１つ以上の導入遺伝子又は導入遺伝子発現カセットの発現を減少させることが有利であり得ることを理解するであろう。例示的なプロモーターは、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター及びＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、並びに他の種由来の対応する相同プロモーターである。ヒト体細胞では、ＥＦ１αとＣＭＶは共に強力なプロモーターであるが、前者の制御下にある導入遺伝子の発現が後者の制御下にある導入遺伝子の発現よりも早くオフになるように、ＣＭＶプロモーターはＥＦ１αプロモーターよりも効率的にサイレンシングされる。転写因子は、体細胞において、リプログラミング効率を調節するために変化させることができる相対比で発現させることができる。好ましくは、複数の導入遺伝子が単一の転写物上にコードされる場合、内部リボソーム侵入部位は転写プロモーターから遠位の導入遺伝子の上流に提供される。因子の相対比は、送達される因子に応じて変化し得るが、本開示を所有する当業者は因子の最適比を決定することができる。

【0160】

当業者は、複数のベクターを介するのではなく単一のベクターを介して全ての因子を導入する有利な効率を理解するが、総ベクターサイズが増加するにつれて、ベクターを導入することがますます困難になることを理解するであろう。当業者はまた、ベクター上のポリシストロン性カセット内の転写因子の位置が、その時間的発現、及び得られるリプログラミング効率に影響し得ることを理解するであろう。従って、ベクターの組み合わせに対する因子の様々な組み合わせが使用され得る。本明細書では、リプログラミングを支持するために、いくつかのそのような組み合わせが示されている。

【0161】

リプログラミングベクターの導入後、及び体細胞がリプログラミングされている間、ベクターは、導入された転写遺伝子が転写及び翻訳される間、標的細胞中に存続することができる。導入遺伝子発現は、標的細胞型にリプログラミングされた細胞において、有利にダウンレギュレートされ得るか、又はオフにされ得る。リプログラミングベクターは、染色体外のまま残ることができる。極めて低い効率で、ベクターは細胞のゲノムに組み込まれることができる。以下の例は本発明を説明することを意図しているが、決して本発明を限定するものではない。

【0162】

本発明での使用のための細胞、組織又は生物の形質転換のための核酸送達に適した方法は、本明細書に記載されるように又は当業者に公知であるように、核酸（例えばＤＮＡ）を細胞、組織又は生物に導入することができる実質的に任意の方法を含むと考えられる（例えば、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３２９－３３０（２００９）；Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３６３－３６９（２００９）；Ｗｏｌｔｊｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８，７６６－７７０（９ Ａｐｒ．２００９））。そのような方法には、例えば、場合によりＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いたエクスビボトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４－１３４６，１９８９，Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：７１１－７１３，１９８７）による、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４－１０９９，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を含むインジェクションによる（米国特許第５，９９４，６２４号明細書、同第５，９８１，２７４号明細書、同第５，９４５，１００号明細書、同第５，７８０，４４８号明細書、同第５，７３６，５２４号明細書、同第５，７０２，９３２号明細書、同第５，６５６，６１０号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；エレクトロポレーションによる（米国特許第５，３８４，２５３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：７１６－７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１－７１６５，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６－４６７，１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５－２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９－６９５，１９９０）による；ＤＥＡＥ－デキストラン、続いてポリエチレングリコールを使用することによる（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１１８８－１１９０，１９８５５）；直接音波負荷による（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３－８４６７，１９８７）；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８－３３５２，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７－９４，１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５－３７８，１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１－３３６４，１９９１）及び受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７－８９２，１９８８；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９－４４３２，１９８７）によるＤＮＡの直接送達；並びにこれらの方法の任意の組み合わせ（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。

【0163】

関連分子の細胞への導入を媒介することができる多数のポリペプチドが以前に記載されており、本発明に適合させることができる。例えば、Ｌａｎｇｅｌ（２００２） Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓを参照されたい。膜を横切る輸送を増強するポリペプチド配列の例としては、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオタンパク質アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：１１２１－３４，１９９１；Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８６４－８，１９９１；Ｌｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：９１２０－４，１９９３）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３－３３，１９９７）；ＨＩＶ－１転写アクチベーターＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ ５５：１１７９－１１８８，１９８８；Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ ５５：１ ２８９－１１９３，１９８８）；カポジＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）；タンパク質形質導入ドメイン－４（ＰＴＤ４）；Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｍ９１８、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ－１０；核局在化配列、ＰＥＰ－Ｉペプチド；両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧペプチド）；米国特許第６，７３０，２９３号明細書に記載されるような送達増強トランスポーター（３０、４０、又は５０アミノ酸の連続セット中に少なくとも５～２５以上の連続アルギニン又は５～２５以上のアルギニンを含むペプチド配列を含むが、これらに限定されない；十分な、例えば少なくとも５、グアニジノ又はアミジノ部分を有するペプチドを含むが、これに限定されない）；及び商業的に入手可能なＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（商標）１ペプチド；並びにフランス、パリのＤａｉｔｏｓ Ｓ．Ａ．から入手可能なＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）プラットフォームのＤｉａｔｏｓペプチドベクター（「ＤＰＶ」）が挙げられるが、これらに限定されない。国際公開第２００５／０８４１５８号パンフレット及び国際公開第２００７／１２３６６７号パンフレット並びにそこに記載されるさらなる輸送体も参照されたい。これらのタンパク質は原形質膜を通過することができるだけでなく、本明細書に記載される転写因子などの他のタンパク質の付着が、これらの複合体の細胞取り込みを刺激するのに十分である。

【0164】

医薬組成物及び他の用途
特定の実施形態によれば、本発明は、本発明に従って作製されたＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞（即ち、ｉＴＳＣ）を使用して生成された任意の細胞、組織、及び／又は器官／オルガノイドの使用を意図する。本発明はさらに、本発明に従って作製されたＴＳＣによって分泌されるか、又は本発明に従って作製されたＴＳＣから分化したＥＶＴ若しくはＳＴによって分泌される任意の粒子又は化合物の使用を意図する。

【0165】

本発明の単離された細胞は、疾患モデリング、薬物スクリーニング及び患者特異的な細胞ベースの治療のためにさらに使用され得る。

【0166】

従って、本発明の特定の態様によれば、本発明の方法に従って作製されたＴＳＣを含む単離された胎盤様オルガノイド、又は胚盤胞様細胞が提供される。

【0167】

さらなる態様によれば、本発明に従って作製された細胞又は細胞集団を胎盤又は胚盤胞に導入することを含む、胎盤又は胚盤胞を増強する方法が提供される。細胞又は細胞集団は、本発明の方法に従って作製された、ＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞であってもよい。或いは、細胞又は細胞集団は、本発明のＴＳＣの少なくとも１つの特徴を示す細胞から作製された分化細胞又は分化細胞集団であってもよい。

【0168】

細胞の導入は、発達中の宿主胎盤又は胚内での直接注射又は凝集を介して、インビトロ又はエクスビボで行うことができる。

【0169】

本発明に従って作製されるＴＳＣの少なくとも１つの特徴を有する細胞はまた、栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害のためのモデル系を調製するために使用され得る。この系は、栄養膜の分化及び／若しくは活性において発現されるか、又はそれに必須な遺伝子のスクリーニング、栄養膜の発達及び／又は活性を達成する薬剤及び条件（培養条件及び操作など）のスクリーニング、特定の成長因子及びホルモンの生成、又は栄養膜の発達及び／若しくは活性に関連する障害の細胞療法としての有用性を見出す。

【0170】

従って、本発明の一態様によれば、栄養膜の発達及び／又は活性を調節することができる薬剤を同定する方法が提供され、この方法は：
（ｉ）本発明に従って作製されたＴＳＣ、又は前記ＴＳＣに由来するオルガノイド（胚盤胞様オルガノイド、又は胎盤様オルガノイドなど）を候補薬剤と接触させることと；
（ｉｉ）前記薬剤と接触させた後のＴＳＣ又はオルガノイドの発達及び／又は活性を、前記薬剤のない前記ＴＳＣ又は前記オルガノイドの発達及び／又は活性と比較することと、を含み、
前記薬剤のない前記ＴＳＣ又は前記オルガノイドの発達及び／又は活性と比較して所定のレベルを超える前記ＴＳＣ又は前記オルガノイドの発達及び／又は活性に対する前記薬剤の効果は、前記薬剤が栄養膜の発達及び／又は活性を調節することを示す。

【0171】

本明細書で使用される場合、用語「調節」は、阻害することによって、又は促進することによって、栄養膜の発達及び／又は活性を変化させることを指す。

【0172】

特定の実施形態によれば、調節は、発達及び／又は活性を阻害することである。

【0173】

特定の実施形態によれば、調節は、発達及び／又は活性を促進することである。

【0174】

同じ培養条件の場合、栄養膜の発達及び／又は活性に対する候補薬剤の効果は、一般に、同じ種であるが候補薬剤と接触していないか、又は対象とも呼ばれるビヒクル対照と接触した細胞における発達及び／又は活性と比較して表される。

【0175】

本明細書で使用される場合、表現「所定のレベルを超える効果」は、候補薬剤と接触させる前の発現レベルと比較して、所定のレベル、例えば約１０％よりも高い、例えば約２０％よりも高い、例えば約３０％よりも高い、例えば約４０％よりも高い、例えば約５０％よりも高い、例えば約６０％よりも高い、約７０％よりも高い、約８０％よりも高い、約９０％よりも高い、約２倍よりも高い、約３倍よりも高い、約４倍よりも高い、約５倍よりも高い、約６倍よりも高い、約７倍よりも高い、約８倍よりも高い、約９倍よりも高い、約２０倍よりも高い、約５０倍よりも高い、約１００倍よりも高い、約２００倍よりも高い、約３５０よりも高い、約５００倍よりも高い、約１０００倍よりも高い、又はこれを超える、薬剤と接触した後の栄養膜の発達及び／若しくは活性、又はオルガノイドの発達における変化を指す。

【0176】

特定の実施形態によれば、候補薬剤は、化学物質、小分子、ポリペプチド及びポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない任意の化合物であってもよい。

【0177】

特定の実施形態によれば、選択された薬剤は、さらに、栄養膜の発達又は活性の調節を必要とする様々な状態、例えば以下に記載される状態を治療するために使用され得る。

【0178】

反復流産及び胎児発育遅延（ＦＧＲ）は胎盤機能不全と関連し、ハンディキャップ及び重症例での死亡の一因となる。無傷及び健康なＴＳＣの細胞移植は、移植細胞が未発達／損傷胎盤を支持することによりこれらの胎児の一部を救うことができる可能性があるため、臨床において非常に有望である。

【0179】

本発明の別の態様によれば、それを必要とする対象における栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害を治療及び／又は予防する方法であって、本発明に従って作製された治療有効量のＴＳＣを対象に投与し、それによって対象における栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害を治療及び／又は予防することを含む方法が提供される。

【0180】

用語「治療する」又は「治療」は、病理（例えば、反復流産）の発生を阻害、予防若しくは停止し、及び／又は病理の減少、寛解、又は退行をもたらすことを指す。当業者は様々な方法論及びアッセイを用いて病理の発達を評価することができ、同様に、様々な方法論及びアッセイを用いて病理の減少、寛解又は退行を評価することができることを理解するであろう。

【0181】

本明細書で使用される場合、表現「それを必要とする対象」は、病理と診断された哺乳動物対象（例えば、ヒト）を指す。特定の実施形態では、この用語は、病理を発症する危険性がある個体を包含する。獣医学的使用も意図される。対象は、任意の性別、又は新生児、乳児、若年、青年、成人及び高齢成人を含む任意の年齢であり得る。特定の実施形態によれば、対象は女性である。

【0182】

本発明のこの態様は、栄養膜の発達及び／又は活性に関連する障害を治療することを意図した。特定の実施形態によれば、疾患は、反復流産、子癇前症、胎児発育遅延（ＦＧＲ）、ヒダチホルム（ｈｙｄａｔｉｆｏｒｍ）奇胎及び絨毛癌からなる群から選択される。

【0183】

栄養膜はいくつかの分泌成長因子及びホルモン、並びに本発明の別の態様によるエキソソームなどの粒子を生成するので、栄養膜によって生成される化合物又は粒子を得る方法であって、本発明のＴＳＣ又はＴＣＳ細胞培養物を培養し、細胞によって分泌される化合物又は粒子を培養培地から単離し、それによって栄養膜によって生成された化合物又は粒子を得ることを含む方法が提供される。

【0184】

特定の実施形態によれば、化合物は、成長因子又はホルモン、例えばヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）であるが、これに限定されない。粒子はエキソソームであってもよい。

【0185】

本発明の細胞は、それ自体で、又はそれらが適切な担体若しくは賦形剤と混合される医薬組成物中で、対象に移植されてもよい。同様に、本発明の構築物は、それ自体で、又は医薬組成物中で対象に投与されてもよい。

【0186】

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本明細書に記載される活性成分の１つ以上と、生理学的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

【0187】

本明細書において、用語「活性成分」は、生物学的効果に関与する本発明の細胞又はオルガノイドを指す。

【0188】

以下では、互換的に使用され得る表現「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」は、生物に有意な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。

【0189】

本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために、医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及びデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油並びにポリエチレングリコールが挙げられる。

【0190】

本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、粉砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。

【0191】

従って、本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬的に使用され得る調製物への活性成分の加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用する従来の様式で処方され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。

【0192】

注射のために、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理学的塩緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中で処方され得る。

【0193】

典型的には、医薬組成物は、全身的な様式ではなく局所的な様式で、例えば、医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することによって投与される。

【0194】

本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、場合により保存剤を添加して、アンプルで又は多用量容器で提供され得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンであってもよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含んでもよい。

【0195】

非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調製物の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液を、適切な油性又は水性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド又はリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる。場合により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、活性成分の溶解度を増加させる適切な安定剤又は薬剤を含むことができる。

【0196】

本発明の文脈での使用に適した医薬組成物は、活性成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0197】

本発明の組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つ以上の単位剤形を含み得る、パック又はディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キット）中に提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチック箔を含むことができる。パック又はディスペンサーのアドバイスは、注射器であってもよい。注射器は、細胞で予め充填されてもよい。パック又はディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を伴ってもよい。パック又はディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形態で容器に関連付けられた通知によって収容されてもよく、この通知は、組成物又はヒト若しくは獣医学的投与の形態の機関による承認を反映する。そのような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって処方薬又は承認された製品挿入物について承認されたラベルのものであってもよい。適合性医薬担体中に処方された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記でさらに詳述されるかのように、調製され、適切な容器中に配置され、示された状態の治療についてラベルされ得る。

【0198】

本発明は、以下の非限定的な実施例を含む。

【実施例】

【0199】

実施例１：体細胞リプログラミングから生成されたヒトｉＴＳＣ
初代成人ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。核リプログラミング実験のために、ＬＳＧＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充した培地１０６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＨＤＦａを増殖させた。次いで、初期継代（＜Ｐ６）線維芽細胞をウェル当たり５０，０００～７０，０００細胞で６ウェルプレートに播種した後、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含有する線維芽細胞培地中で形質導入した。

【0200】

４８時間後、１つのウェル中の細胞を計数のためにトリプシン処理して、形質導入に必要なウイルスの体積（ＭＯＩ）を決定した。形質導入は、４つの転写因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ、ＫＬＦ４（ＯＫＳＭ）からなるＣｙｔｏＴｕｎｅ ２．０ ｉＰＳＣ Ｓｅｎｄａｉ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。２４時間後、ウイルスを除去し、培地を１日おきに交換した。

【0201】

形質導入の７日後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を使用して細胞を回収し、線維芽細胞培地中の照射ＭＥＦフィーダーの層上に再播種した。翌日、以下にさらに記載するように、培地を、１）ｉＴＳＣ培地、２）ナイーブ培地、３）プライミング培地、又は４）ＬＣＤＭ培地に交換した。

【0202】

形質導入の７日後にｉＴＳＣ培地に移された細胞は、本明細書において、「ｉＴＳＣｄ８」リプログラミング中間体又は「Ｄ８線維芽細胞中間体」と呼ばれる。

【0203】

培地２～４（即ち、ナイーブ、プライミング、又はＬＣＤＭ培地）で培養した細胞については、ＴＳＣ培地に移す前に、細胞をこの培地中で５～１３日間培養した。８～２１日目にナイーブ培地中で培養された細胞は、「部分的にリプログラミングされた中間体」、「ナイーブリプログラミング中間体」又はＤ２１ナイーブ中間体と呼ぶことができる。８～２１日目にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ７（Ｅ７）培地中で培養された細胞も、「部分的にリプログラミングされた中間体」（又は「プライミングされたリプログラミング中間体」又はＤ２１プライミングされた中間体）と呼ばれ得る。

【0204】

ＴＳＣ培地中で培養した際、ｉＴＳＣがコンフルエント且つ明白になったら、ｉＴＳＣを１：２～１：４の比で３～４日毎に継代した。最初の４継代については、ｉＴＳＣをＴｒｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を使用してｉＭＥＦフィーダーに継代し、３７℃、５％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。継代５から開始して、ｉＴＳＣを、５μｇ／ｍｌのＣｏｌ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングした組織培養フラスコに継代し（３７℃で少なくとも１時間）、３７℃、２０％ Ｏ_２及び５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

【0205】

尚さらなる実施例において、細胞を２１日まで線維芽細胞培地中に保持した後、ＴＳＣ培地に移行した。これらの細胞は、本明細書ではｉＴＳＣｄ２８細胞とも呼ばれる（図６参照）。

【0206】

一般に、使用する培地にかかわらず、本発明の方法を利用して、部分的にリプログラミングされた中間体からｉＴＳＣを得ることが可能であることが理解されるであろう。

【0207】

この実施例で使用した培地：
１．ｉＴＳＣ培地は、Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８に記載されている通りであり、以下を含む：
－ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、
－ ０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．２％ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．５％ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １．５μｇ／ｍｌ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、
－ ５μＭ Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）－４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、Ａｂｃａｍ）、
－ ２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（６－（（２－（（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリルＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、
－ ０．５μＭ Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、Ｓｉｇｍａ）、
－ １μＭ ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）
－ ５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び
－ ０．８ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ、Ｓｉｇｍａ）。

【0208】

２．ナイーブ培地。
以下を含む、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１６） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６（４）：Ｐ４３７－４４６）に報告されているナイーブｔ２ｉＬＧｏＹ培地：
－ ２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ）とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）の５０：５０混合物
－ ０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、
－ ０．５％ Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、
－ １％ Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、
－ １％ Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、
－ １０ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦ（自家製）、
－ ２５０μＭ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、
－ １０μｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）、
－ １μＭ ＰＤ０３２５９０１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、
－ １μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、
－ ２．５μＭ Ｇｏｅ６９８３（Ｔｏｃｒｉｓ）、
－ １０μＭ Ｙ－２７６３２（Ａｂｃａｍ）。
ナイーブ培地の他の例には、５ｉＬＡＦ、ＲＳｅＴ及びＰＸＧＬが含まれる。

【0209】

３．プライミング培地。
例示的なプライミング培地は、以下を含む：
－ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ２０％ノックアウト血清置換（ＫＳＲ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。
－ １ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ５５μＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＦＧＦ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、
－ １％ Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。
培地ＫＳＲ／ＦＧＦ２、Ｅ８、ｍＴｅＳＲ、ＡＫＩＴ、Ｂ８は、プライミング培地のさらなる例である。

【0210】

４．ＬＣＤＭ培地：
－ ０．５％ Ｎ２サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の５０：５０混合物、
－ １％ Ｂ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １％ Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ ０．５％ ＫＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、
－ １０ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦ（自家製）、
－ １μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、
－ ２μＭ （Ｓ）－（＋）－ジメチンデンマレエート（Ｔｏｃｒｉｓ）、
－ ２μＭ塩酸ミノサイクリン（Ｔｏｃｒｉｓ）、
－ １μＭ ＩＷＲ－ｅｎｄｏ－１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）及び
－ ２μＭ Ｙ－２７６３２（Ａｂｃａｍ）。

【0211】

実施例２：樹立されたヒト多能性幹細胞のＴＳＣへの変換：
樹立されたナイーブＥＰＳＣ／ｉＰＳＣを、上述したｔ２ｉｔＬＧｏＹ条件下で培養した。ナイーブｈＥＰＳＣ／ｈｉＰＳＣを、ＭＥＦフィーダー又はコラーゲンＩＶ被覆プレートの層上に播種した。ＴＳＣがコンフルエント且つ明白になったとき、ＴＳＣを１：２～１：４の比で３～４日毎に継代した。ＴＳＣを、ＴｒｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を使用して、ｉＭＥＦフィーダー又はＣｏｌ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ）に継代し、３７℃、２０％ Ｏ_２及び５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

【0212】

プライミングされたヒトＥＰＳＣ／ｉＰＳＣは、好ましくはＴＳＣ培地と接触させる前にナイーブ培地と接触させる。

【0213】

樹立されたヒトＬＣＤＭ ＥＰＳＣ又はｉＰＳＣ（「拡張」ＥＰＳＣ又はｉＰＳＣとも呼ぶことができる）を、上述したようにＬＣＤＭ培地中で培養した。細胞を、ＭＥＦフィーダー又はコラーゲンＩＶ被覆プレートの層上に播種した。ＴＳＣがコンフルエント且つ明白になったとき、ＴＳＣを１：２～１：４の比で３～４日毎に継代した。ＴＳＣを、ＴｒｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ）を使用して、ｉＭＥＦフィーダー又はＣｏｌ ＩＶ（Ｓｉｇｍａ）に継代し、３７℃、２０％ Ｏ_２及び５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

【0214】

プライミングされたヒトＥＰＳＣ／ｉＰＳＣは、好ましくはＴＳＣ培地と接触させる前にＬＣＤＭ培地と接触させる。

【0215】

実施例３：体細胞のｉＴＳＣへの直接変換
図３は、ヒトｉＴＳＣの誘導のためのナイーブリプログラミングの間のＴＥシグネチャーの安定化によって生成されたＴＳＣの特徴付けの結果を示す。

【0216】

図３ａは、ＴＳＣ培地中のナイーブ中間体を捕捉及び安定化するための実験デザインの概略図を提供する。

【0217】

手短には、結果は、線維芽細胞から脱分化状態へのリプログラミングの間に、ＴＳＣ培地中の中間体を捕捉及び安定化することが可能であり、ｉＴＳＣの生成を可能にすることを示す。

【0218】

このプロセスを介して生成された細胞の位相差画像は、細胞がＴＳＣと同様の形態を有することを示す（玉石状の外観、図３ｂ）。

【0219】

核染色のためのＰ６３、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＡＴＡ２、ＫＲＴ７及びＤＡＰＩによる、線維芽細胞、プライミング、ナイーブｔ２ｉＬｉＧｏＹ ｉＰＳＣの免疫染色は、ＴＳＣに特徴的なマーカーが図３ｃに示されることを示す。図３ｄは、ｄ２１ナイーブリプログラミング中間体から生成されたｉＴＳＣの免疫染色を示す。

【0220】

Ｄ２１プライミング及びナイーブ中間体から生成された細胞をフローサイトメトリーに供した。ＡＰＡ＋ＩＴＧＡ６＋二重陽性細胞は、ＴＲＡ－１－６０陰性細胞集団からゲートされ、バルクリプログラミング細胞からｉＴＳＣを精製するために選別された（図示せず）。図３ｄはまた、Ｄ２１プライミング及びナイーブリプログラミング中間体から生成されたＴＲＡ－１－６０陰性、ＡＰＡ陽性及びＩＴＧＡ６陽性ｉＴＳＣのパーセンテージを示す。

【0221】

ＴＳＣマーカーの発現レベルを、本発明に従って作製されたヒト線維芽細胞、プライミングされたｉＰＳＣ、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣにおいて決定し、胚盤胞から得られたＴＳＣＴ及びＴＳｂｌａｓｔと比較した（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。結果を図３ｅに示す。

【0222】

ＳＴ細胞は、標準的な方法を用いて、本発明に従って作製されたＴＳＣを分化させることによって得られた。分化した細胞の位相差画像及びＳＤＣ１免疫染色は、細胞がＳＴの特徴を示すことを示す。（図３ｆ及び３ｇ）

【0223】

図３ｉは、ｈＣＧ妊娠検査スティックを使用したｉＴＳＣから分化したＳＴ細胞についての陽性結果を示す。ＥＬＩＳＡもまた、本発明に従って作製されたＴＳＣによって、及びこれらのＴＳＣを分化させることによって得られたＳＴによって分泌されたｈＣＧのレベルを検出するために使用された（図３ｊ）。

【0224】

図３ｆは、本発明に従って作製されたｉＴＳＣから分化したＥＶＴ細胞の位相差画像を示す。ＨＬＡ－Ｇ免疫染色も行った（図３ｇ）。

【0225】

ｉＴＳＣ生着アッセイを、本発明に従って作製したｉＴＳＣをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに注射することによって行った。注射後９日目に尿、病変及び血清を検査した。図３ｋは、ｉＴＳＣ注射マウスから採取した尿サンプルが、ビヒクル対照と比較して、妊娠検査スティック上で陽性のｈＣＧ結果を示したことを示す。ｈＣＧレベルもまた、血清サンプルを用いてｈＣＧ ＥＬＩＳＡによって検出した（図３ｌ）。

【0226】

図３ｎは、ｉＴＳＣ生着ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスから採取された病変におけるヘマトキシリン及びエオシン並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色を示し、ビヒクル対照では明らかな病変は観察されなかった。

【0227】

図３ｍは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいて、本発明に従って作製されたＴＳＣの生着後に観察された結果を示す。手短には、８０％コンフルエンシーを有するｉＴＳＣをＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で解離させ、計数した。１０^７のｉＴＳＣを、０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及びＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１：２混合物２００μｌに再懸濁した。次いで、細胞混合物をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの背側腹部に皮下注射した（各側腹部に１００μｌの混合物）。注射後９日目に、尿、病変及び血清を分析のためにマウスから採取した。マウスの尿及び血清を、以下の節で詳述するように、ｈＣＧ分泌の検出及び測定に利用した。採取した病変を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ）で一晩固定し、続いてパラフィンに包埋した。パラフィン包埋組織を５μｍで切片化し、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又は上述したように免疫染色に進んだ。

【0228】

図４は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって明らかにされた線維芽細胞及びリプログラミング中間体（ｉＴＳＣｄ８）の細胞不均一性を示す。

【0229】

ｉＴＳＣがヒト線維芽細胞から直接誘導できるかどうかを試験するために、リプログラミング実験を開始した。８日目の中間体を、ＴＳＣ培地若しくはナイーブ培地に移行するか、又は線維芽細胞培地中に保持した。次いで、２１日目にｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを行って細胞不均一性を評価した（図４ａ）。ＴＥ様細胞の集団が観察され、より綿密な試験は、このＴＥ様集団が３つのリプログラミング条件全てからの細胞を含むことを明らかにした（図４ｂ～ｄ）。

【0230】

実施例４：ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣの直接誘導
線維芽細胞のリプログラミングを、実施例１に記載の方法に従って開始した。手短には、転写因子ＯＫＳＭを発現しているセンダイウイルスでのトランスフェクション後８日目に、本明細書に記載されるように、細胞をＴＳＣ培地に移した（図５ａ）。

【0231】

このプロセスを介して生成された細胞の位相差画像は、細胞がＴＳＣと同様の形態を有することを示す（玉石状の外観、図５ｂ）。

【0232】

図５ｃは、ｄ８線維芽細胞中間体から生成されたｉＴＳＣの免疫染色を示す。これらのｉＴＳＣは、導入遺伝子を含まない条件で自己再生することができる（図５ｄ）。

【0233】

ＴＳＣマーカーの発現レベルを、本発明に従って作製されたヒト線維芽細胞、プライミングされたｉＰＳＣ、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣにおいて決定し、胚盤胞から得られたＴＳＣＴ及びＴＳｂｌａｓｔと比較した（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。結果を図５ｅに示す。さらに、ｉＴＳＣ並びにｉＴＳＣ由来の合胞体栄養膜（ＳＴ）及び絨毛外栄養膜（ＥＶＴ）は、他の公表されたデータセットの対応する初代細胞型と共通のトランスクリプトームプロファイルを共有する（図５ｆ～ｈ）。

【0234】

ｉＴＳＣはまた、線維芽細胞及びｉＰＳ細胞と比較して、１９番染色体ｍｉＲＮＡクラスター由来のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の高い発現レベルを示す－これは初代栄養膜の独特な特徴である（図５ｉ）。

【0235】

ｉＴＳＣは、ＴＳＣＢＴ５（ヒト胚盤胞に由来する）に見られるように、ＥＬＦ５遺伝子座のプロモーター領域及び推定エンハンサー領域で特定のオープンクロマチン到達性を示す（図５ｊ）。

【0236】

ＳＴ細胞は、標準的な方法を用いて、本発明に従って作製されたｉＴＳＣを分化させることによって得られた。分化した細胞の位相差画像及びＳＤＣ１免疫染色は、細胞がＳＴの特徴を示すことを示す（図５ｋ）。

【0237】

図５ｎは、ｈＣＧ妊娠検査スティックを使用したｉＴＳＣから分化したＳＴ細胞についての陽性結果を示す。ＥＬＩＳＡもまた、本発明に従って作製されたＴＳＣによって、及びそれらのｉＴＳＣを分化させることによって得られたＳＴによって分泌されたｈＣＧのレベルを検出するために使用された（図５ｏ）。

【0238】

図５ｌは、本発明に従って作製されたｉＴＳＣから分化したＥＶＴ細胞の位相差画像を示す。ＨＬＡ－Ｇ免疫染色も行った（図５Ｉ）。さらに、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ汎マーカー（Ｗ６３２）の発現がｉＴＳ細胞において検出され、これまでに胚盤胞由来のＴＳ細胞で報告されているものと同様であった（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）（図５ｐ及び５ｑ）。

【0239】

図５ｒ及び５ｓは、ｉＴＳ細胞由来合胞体栄養膜及び絨毛外栄養膜が関連マーカー遺伝子の発現を示すことを示す。

【0240】

図５ｔは、本発明に従って作製されたｉＴＳＣをＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに注射することによって行われたｉＴＳＣ生着アッセイの概略図を示す。注射後９日目に尿、病変及び血清を検査した。図５ｔは、ｉＴＳＣ注射マウスから採取した尿サンプルが、ビヒクル対照と比較して、妊娠検査スティック上で陽性のｈＣＧ結果を示したことを示す。ｈＣＧレベルもまた、血清サンプルを使用してｈＣＧ ＥＬＩＳＡによって検出した（図５ｖ）。

【0241】

図５ｗは、ｉＴＳＣ生着ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスから採取された病変におけるヘマトキシリン及びエオシン並びにＫＲＴ７、ＳＤＣ１及びＨＬＡ－Ｇの免疫組織化学染色を示し、ビヒクル対照では明らかな病変は観察されなかった。

【0242】

図５ｕは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいて、本発明に従って作製されたＴＳＣの生着後に観察された結果を示す。手短には、８０％コンフルエンシーを有するｉＴＳＣをＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で解離させ、計数した。１０^７のｉＴＳＣを、０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及びＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の１：２混合物２００μｌに再懸濁した。次いで、細胞混合物をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの背側腹部に皮下注射した（各側腹部に１００μｌの混合物）。注射後９日目に、尿、病変及び血清を分析のためにマウスから採取した。マウスの尿及び血清を、以下の節で詳述するように、ｈＣＧ分泌の検出及び測定に利用した。採取した病変を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ）で一晩固定し、続いてパラフィンに包埋した。パラフィン包埋組織を５μｍで切片化し、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又は上述したように免疫染色に進んだ。

【0243】

実施例５：２１日目のヒト線維芽細胞リプログラミング中間体からのｉＴＳＣの誘導
線維芽細胞のリプログラミングを、実施例１に記載の方法に従って開始した。手短には、転写因子ＯＫＳＭを発現しているセンダイウイルスでのトランスフェクション後２１日目に、本明細書に記載されるように、細胞をＴＳＣ培地に移した。

【0244】

２１日目の線維芽細胞培地の中間体はまた、強いエピブラスト、プライミング、及びナイーブシグネチャーを有する細胞からなり、従って、これらの中間体は、多能性及びＴＳ細胞株を生じることができた（図６ａ～ｃ）。

【0245】

実施例６：部分的にリプログラミングされた中間体からのｉＴＳＣの誘導、並びに樹立されたナイーブ及び拡張ｉＰＳＣからＴＳＣへの誘導
リプログラミング中間体を得るための線維芽細胞のリプログラミングを、実施例１に記載の方法に従って開始した。手短には、転写因子ＯＫＳＭを発現しているセンダイウイルスでのトランスフェクション後７日目に、本明細書に記載されるように、細胞をＥ７培地に移した。図７ａは、各段階における細胞のリプログラミングプロトコル及び位相差画像の概略図を示す。

【0246】

樹立されたナイーブ及び拡張ｉＰＳＣから得られたＴＳＣを、実施例２に記載の方法に従って得た。各段階における細胞の変換プロトコル及び位相差画像の概略を図７ｂに示す。

【0247】

図７ｃは、（１）ナイーブｈＰＳＣ、（２）拡張及びプライミングｈＰＳＣ、並びに（３）栄養膜の３つの細胞群を規定した階層的クラスタリングを示す。誘導及び変換ｈＴＳＣの両方は、以前に樹立された胚及び胎盤由来のｈＴＳＣと共にクラスタリングされて栄養膜のグループを形成した。このグループは、樹立され、誘導され、変換されたｈＴＳＣ ＳＴ及びＥＶＴを含むいずれかのｈＴＳＣの間で細分された。ピアソン相関解析により、誘導され、変換された胚及び胎盤由来ｈＴＳＣの近接がさらに確認された。拡張及びプライミングｈＰＳＣは、ｈＴＳＣを形成する可能性の相対的差異にもかかわらず、高度の転写類似性を示した。

【0248】

さらなる解析により、誘導及び変換されたｈＴＳＣは重要な栄養膜系列マーカーを発現することが確認された。特に、ＧＡＴＡ３、ＫＲＴ７及びＶＧＬ１の発現レベルは、以前に樹立された胚及び胎盤由来ｈＴＳＣ（１０～３００ＵＰＭの範囲の絶対遺伝子発現）で認められたレベルと類似していた。本発明者らはまた、ＰＥＧ１０、ＮＲ２Ｆ２，ＬＲＰ２を含むｈＴＳＣの幹細胞性に関連する遺伝子を同定した。これらはｈＴＳＣ、ｈｉＴＳＣ及びｈｃＴＳＣにおいて同様のレベルで発現されたが、分化したＳＴ及びＥＶＴにおいては発現されなかった（ｈＴＳＣにおいて２０～２００ＵＰＭの範囲の絶対遺伝子発現、ｈＴＳＣ－ＳＴ及びｈＴＳＣ－ＥＶＴにおいて１０ＵＰＭ未満）（図７ｄ）。

【0249】

図７ｅは、ヒト胚盤胞の栄養外胚葉で発現する栄養膜マーカーＮＲ２Ｆ２及びＧＡＴＡ２に対するｈｉＴＳＣ及びｈｃＴＳＣの免疫染色を示す。ＮＲ２Ｆ２及びＧＡＴＡ２は高度に発現し、全ての細胞の核に局在していた。逆に、ＳＯＸ２はｈＰＳＣにおいて高度に発現されたが、ｈＴＳＣにおいては存在しなかった（図１ｅ）。これらの発現パターンは、ｈｉＴＳＣ、ｈｃＴＳＣ及び胎盤由来ｈＴＳＣの間で同等であった。これらの結果は、ｈｉ／ｃＴＳＣが以前に樹立されたｈＴＳＣと同様の発現プロファイルを共有することを確認する。

【0250】

図７ｆ～ｇは、ＳＴ／ＥＶＴアッセイ最適化プロトコルを示す。最適化されたＳＴ分化の際に、細胞は、ｈＴＳＣにおいて発現されないＣＧＡ、ＣＧＢ及びＳＤＣ１の発現をアップレギュレートした（１０～１３００倍の変化の範囲の相対遺伝子発現）。対照的に、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ２、及びＡＳＣＬ２はＥＶＴ分化条件で全体的に増加した（１０～７００倍の変化の範囲の相対遺伝子発現）。最後に、ｈＴＳＣで主に発現したＬＲＰ２及びＣＤＫＮ３は、分化時にダウンレギュレートした（２～７０倍の変化の範囲の相対遺伝子発現）。重要なことに、遺伝子発現パターンは胎盤細胞のそれと同等であり、これは統計解析によって確認された（図７ｈ）。

【0251】

図７ｉは、ＤＥＳＭＯＰＬＡＫＩＮ（ＤＳＰ）及びＣＧＢを発現し、典型的には６～１０個の核を含む、多核合胞体の構造を示す。

【0252】

ＧＡＴＡ３及びＨＬＡ－Ｇの免疫染色により、誘導され、変換された胎盤由来のｈＴＳＣから分化したＥＶＴの同一性が確認された（図７ｊ）

【0253】

実施例７：一般的な方法
細胞培養条件
３人の女性ドナーからの初代ヒト成人皮膚線維芽細胞を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（カタログ番号Ｃ－０１３－５Ｃ及び３８Ｆについてロット番号１０２９０００、５５Ｆについてロット番号１５２８５２６及び３２Ｆについてロット番号１５６９３９０）から得；細胞を回収し、増殖のために低血清成長サプリメント（ＬＳＧＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した培地１０６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中にプレーティングした。ヒト体細胞リプログラミングに用いた培養条件は、以前に記載されたように調製した。線維芽細胞培地：ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、５５μＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。プライミング培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０％ノックアウト血清置換（ＫＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＦＧＦ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。ナイーブ培地（ｔ２ｉＬＧｏＹ）：２ｍＭ ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ Ｎ２サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ Ｂ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０ｎｇ／ｍｌヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）（自家製）、２５０μＭ ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ ｍｌ組換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１μＭ ＰＤ０３２５９０１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、２．５μＭ Ｇｏｅ６９８３（Ｔｏｃｒｉｓ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ａｂｃａｍ）を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と神経基礎培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の５０：５０混合物。ナイーブヒト幹細胞培地（ＮＨＳＭ）：Ｇａｆｎｉ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔａｔｅ ｎａｉｖｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５０４，２８２－２８６から適合された培養条件、２０１４年のＪ．Ｈａｎｎａ研究所のウェブページから提案された修正を用いた。 １０ｍｇ／ｍｌ ＡｌｂｕＭＡＸ Ｉ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ ＫＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ Ｎ２サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１２．５μｇ／ｍｌ組換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇｍｌ ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＬＩＦ（自家製）、８ｎｇ／ｍｌＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２ｎｇ／ｍｌ組換えＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌヒトＬＲ３－ＩＧＦ１（Ｐｒｏｓｐｅｃ）及び小分子阻害剤：１μＭ ＰＤ０３２５９０１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、５μＭ ＳＰ６００１２５（Ｔｏｃｒｉｓ）、２μＭ ＢＩＲＢ７９６（Ａｘｏｎ）、０．４μＭ ＬＤＮ１９３１８９（Ａｘｏｎ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（毎日、新たに解凍したストックアリコートから培地に補充）（Ａｂｃａｍ）、及び１μＭ Ｇｏｅ６９８３（毎日、新たに解凍したストックアリコートから培地に補充）（Ｔｏｃｒｉｓ）。１％ Ｎ２サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２％ Ｂ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１μＭ ＰＤ０３２５９０１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、１μＭ ＩＭ－１２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、０．５μＭ ＳＢ５９０８８５（Ｔｏｃｒｉｓ）、１μＭ ＷＨ－４－０２３（Ａ Ｃｈｅｍｔｅｋ）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ａｂｃａｍ）、２０ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。８ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍｌヒトＬＩＦ（自社製）及び０．５％のＫＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と神経基礎培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の５０：５０混合物。ナイーブＲＳｅＴ培地：１００ｍｌのＲＳｅＴ ５×サプリメント、１ｍｌのＲＳｅＴ ５００×サプリメント、及び０．５ｍｌのＲＳｅＴ １，０００×サプリメントを、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充した３９８．５ｍｌのＲＳｅＴ基礎培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に入れる。ヒトＴＳ細胞培地７：ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．２％ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１．５μｇ／ｍｌ ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、５μＭ Ｙ２７６３２（Ａｂｃａｍ）、２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、０．５μＭ Ａ８３－０１（Ｓｉｇｍａ）、１μＭ ＳＢ４３１５４２、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．８ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｓｉｇｍａ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

【0254】

リプログラミング実験
ｔ２ｉｔＬＧｏＹ培地をナイーブリプログラミングに使用したが、これはこの培地を使用して、ナイーブ多能性の全ての特徴を有し、他の条件と比較した場合に、より安定な核型を維持するナイーブｉＰＳ細胞に線維芽細胞をリプログラミングすることができることが以前に示されているためである。プライミング及びナイーブ多能性状態へのヒト体細胞リプログラミング実験、並びにプライミング及びナイーブｉＰＳ細胞のその後の培養を、以前に記載されたように実施した。手短には、ヒト線維芽細胞のリプログラミングは、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｓｅｎｄａｉリプログラミングキットを使用して、製造業者の説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って行った。

【0255】

初代ヒト成人皮膚線維芽細胞を、線維芽細胞培地中に約５～１０×１０^４細胞の密度で播種した。細胞を、線維芽細胞培地中で、以下のような感染多重度（ＭＯＩ）でセンダイウイルスで形質導入した：ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、ＭＯＩ＝５又は１０；ＭＹＣ、ＭＯＩ＝５又は１０；及びＫＬＦ４ ＭＯＩ＝６又は１２。細胞を７日目にｉＭＥＦフィーダーの層上に再播種し、翌日に異なる培養培地（プライミング、ｔ２ｉｔＬＧｏＹ、ＮＨＭＳ、ＲＳｅＴ又は５ｉＬＡＦ）に移行した。１８～２１日後、ｉＰＳＣを継代し、以前に記載したように増殖させることができた。プライミング又はナイーブリプログラミング中のｉＴＳＣｄ２１ｎの誘導のために、２１日目のプライミング又はナイーブｔ２ｉＬＧｏＹリプログラミング中間体をＴＳ細胞培地に移行した。４～５日後、ＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１：２～１：４の比で３～４日毎に細胞を継代した。最初の４継代については、ｉＴＳＣをｉＭＥＦフィーダーに継代し、３７℃、５％ Ｏ_２、及び５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。

【0256】

継代５から開始して、ｉＴＳＣｄ２１ｎを、５μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングした組織培養フラスコに継代し（３７℃で少なくとも１時間）、３７℃、２０％ Ｏ_２及び５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。ヒト線維芽細胞からのｉＴＳＣｄ８の直接誘導のために、８日目の線維芽細胞リプログラミング中間体をＴＳＣ培地に移行した。１０～１３日後、ｉＴＳＣｄ８をｉＭＥＦフィーダーに継代し、ｉＴＳＣｄ２１ｎについて記載したように、３７℃、５％ Ｏ_２及び５％ ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。樹立されたｉＴＳＣ株におけるセンダイ検出は、センダイリプログラミングプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に記載されるように行った。２１日目の線維芽細胞リプログラミング中間体からのプライミング、ナイーブｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの誘導のために、２１日目の線維芽細胞リプログラミング中間体を、プライミング、ナイーブ又はＴＳＣ培地に移行し、次いで、記載されたように培養し及び増殖させた。

【0257】

図７に示すデータについては、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｓｅｎｄａｉリプログラミングキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を使用して、ヒト成人線維芽細胞をリプログラミングした。感染の２日前に、ウェル当たり３．０～４．０×１０^４の線維芽細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした１２ウェルプレート上に播種した。０日目に、細胞を３つのベクター：ポリシストロン性Ｋｌｆ４－Ｏｃｔ４－Ｓｏｘ２、Ｍｙｃ及びＫｌｆ４にそれぞれ５：５：３又は３：３：３の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染９日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥ（５分、３７℃、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））で解離させ、３５ｍｍ皿内にてＭＥＦ上に播種した。翌日、細胞をＥ７リプログラミング培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））に移行した。２１日目以降、細胞をｈＴＳＣ培地に移行した。誘導ｈＴＳＣ株（ｈｉＴＳＣ）を低酸素条件（５％ Ｏ_２，５％ＣＯ_２）で３７℃で日常的に培養した。ｈｉＮＰＳＣ、ｈｉＥＰＳ及びｈｉＰＳＣへの体細胞リプログラミングは、以前の報告（Ｋｉｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９：３６０； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ，１６９：２４３－２５７）に記載されているように行った。

【0258】

ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳのｈｃＴＳへの変換
ｈＮＰＳＣ及びｈＥＰＳをＴｒｙｐＬＥ（５分、３７℃、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））で解離させ、１皿当たり０．６～１．７×１０^５細胞の密度で３５ｍｍ皿内にてＭＥＦ上に播種した。細胞を、１０μＭのＹ２７６３２を補充したそれらの最初の培地中で１日間維持した。２日目以降、細胞をｈＴＳＣ培地に移行した。変換したｈＴＳＣ株（ｈｃＴＳＣ）を、低酸素条件（５％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２）で３７℃で日常的に培養した。変換実験に含まれるプライミングされたｈＰＳＣを、最初にＫＳＲ＋ＦＧＦ２又はｉＰＳ－ＢＲＥＷ中で培養した。１０個のコロニーを採取し（ＫＳＲ＋ＦＧＦ２）、又は細胞をＴｒｙｐＬＥ（ｉＰＳ－ＢＲＥＷ）で継代し、変換アッセイのためにＭＥＦでコーティングした３５ｍｍ皿内に、１皿当たり０．５～１．２５×１０^５細胞の密度で播種した。

【0259】

インビトロにおけるｉＴＳＣｄ２１ｎ及びｉＴＳＣｄ８のＳＴ及びＥＶＴへの分化
ｉＴＳＣのＳＴ及びＥＶＴへの分化は、以前に記載されたように行った（Ｏｋａｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２２，５０－６３）。ｉＴＳＣのＳＴへの分化のために、ｉＴＳＣをウェル当たり１×１０^５細胞の密度で、２．５μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングした６ウェルプレート上に播種し、０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、４％ ＫＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２．５μＭ Ｙ２７６３２（Ａｂｃａｍ）及び２μＭフォルスコリン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補充した２ｍｌのＳＴ分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。培地を最初の４日間毎日交換し、細胞を６日目に分析した。融合指数は細胞融合の効率を定量化するために使用され、これは、合胞体において計数された核の数から合胞体の数を引いたものを使用し、次いで、計数された核の総数で割ることによって計算される。ｉＴＳＣをＥＶＴに分化させるために、ｉＴＳＣをウェル当たり０．７５×１０^５細胞の密度で、１μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶ（Ｓｉｇｍａ）で予めコーティングした６ウェルプレート上に播種し、０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、４％ ＫＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２．５μＭ Ｙ２７６３２（Ａｂｃａｍ）、１００ｎｇ／ｍｌ ＮＲＧ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び７．５μＭ Ａ８３－０１（Ｓｉｇｍａ）を補充した２ｍｌのＥＶＴ分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。ＥＶＴ分化培地中に細胞を懸濁した直後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を２％の最終濃度までオーバーレイした。分化の３日目に、ヒトＮＲＧ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含まないＥＶＴ分化培地を０．５％の最終濃度まで添加した。分化の６日目に、ＥＶＴ分化培地を、ＮＲＧ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又はＫＳＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）なしで交換し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を０．５％最終濃度まで添加した。分析を行う前に、細胞をさらに２日間培養した。

【0260】

ｈｉ／ｃＴＳＣのＥＶＴ及びＳＴへの分化
少なくとも１５継代後、細胞を分化アッセイのために収集した。ＳＴ及びＥＶＴへの分化の前に、ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣ（最初はＭＥＦ上で培養）をフィブロネクチンに少なくとも３継代移行した。ＥＶＴ分化：継代の２～４日前に、ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣをＥＶＴ前培地［０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．３％ ＢＳＡ、１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント、４％ ＫＳＲ、７．５μＭ Ａ８３－０１（Ｔｏｃｒｉｓ（商標））、２．５μＭ Ｙ２７６３２、５μＭ ＩＷＲ－ｅｎｄｏ－１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（商標））を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２］に移行した。次いで、細胞を、０．８～３．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度までＴｒｙｐＬＥで継代した。処理を開始する前に、細胞を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）を補充した分化基礎培地［０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．３％ ＢＳＡ、１％ ＩＴＳ－Ｘを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２］中に置いた。６時間以内に、株に応じたタイミングで、細胞をＥＶＴ培地（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）［１００ｎｇ／ｍｌ ＮＲＧ１、７．５ｍＭ Ａ８３－０１、２．５ｍＭ Ｙ２７６３２、４％ノックアウト血清置換、２％ Ｍａｔｒｉｇｅｌを補充した分化基礎培地］に移行した。３日目に、培地を、ＮＲＧ１を含まない、０．５％ Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有するＥＶＴ培地で置き換えた。典型的には、ＥＶＴ形成は４～５日目までに観察された。６日目に、培地を、ＮＲＧ１及びＫＳＲを含まない、０．５％ Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有するＥＶＴ培地で置き換えた。細胞を、その後の分析のために８日目に収集した。２Ｄ－ＳＴ分化：ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣを、２．０～６．０×１０^４細胞／ｃｍ^２の密度までＴｒｙｐＬＥで継代した。処理を開始する前に、細胞を、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）を補充した分化基礎培地［０．１ｍＭメルカプトエタノール、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．３％ ＢＳＡ、１％ ＩＴＳ－Ｘを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２］中に置いた。３時間以内に、株に応じたタイミングで、細胞をＳＴ培地（Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）［２．５ｍＭ Ｙ２７６３２、２ｍＭ フォルスコリン、及び４％ ＫＳＲを補充した分化基礎培地］に移行した。３日目に培地を交換し、６日目に細胞を分析した。３Ｄ－ＳＴ分化アッセイ：３Ｄ分化アッセイの前に、ｈ（ｉ／ｃ）ＴＳＣを、わずかに修正した栄養膜オルガノイド培地（ＴＯＭ）に移行した（Ｔｕｒｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８）［５００ｎＭ Ａ８３－０１、１．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、８０ｎｇ／ｍｌヒトＲ－スポンジン１、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＨＧＦ、２μＭ Ｙ－２７６３２を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１Ｘ Ｎ２サプリメント、ビタミンＡを含まない１Ｘ Ｂ２７サプリメント、１．２５ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴＯＭ基礎培地）］。ＴｒｙｐＬＥで継代した０．４～１．０×１０^５細胞を、９６０ｎｇフィブロネクチン、５０ｎｇラミニン５２１及び５０μｌ ＴＯＭ基礎培地と共に、５０μｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び５０μｌ ＰＢＳ＋／＋を含む１５０μｌの液滴に包埋した。液滴を滅菌パラフィルムで覆われた皿上に注意深く堆積させ、３７℃で２０分間置いて固化させた。１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）を補充した完全ＴＯＭをさらに添加して、液滴を覆った。培地を３日毎にＴＯＭで置換した。３Ｄ構造は１週間以内に出現し、その後の分析のために１４日目に収集した。

【0261】

ｉＴＳＣｄ２１ｎ及びｉＴＳＣｄ８のインビボ生着アッセイ
プロトコル及びマウスの使用は、２００４年のオーストラリアの科学目的のための動物のケア及び使用に関する行動規範、並びにビクトリアの動物虐待防止法及び規制法律に従ったＭｏｎａｓｈ大学動物福祉委員会の承認を得て行われた。８０％のコンフルエンシーを有するｉＴＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で解離させ、計数した。１０００万個のｉＴＳ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）とＤＭＥＭ／Ｆ－１２の１：２混合物、０．３％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及び１％ ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）２００μｌに再懸濁した。次いで、５～２０週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ ＩＬ－２Ｒ－γノックアウトマウスの雄及び雌の背側腹部に細胞混合物を皮下注射した（各側腹部に１００μｌ）。マウスを対照とｉＴＳ細胞の間で無作為に割り付けたが、研究者は盲検化されなかった。注射の９日後に、尿、血液及び病変を分析のためにマウスから採取した。「妊娠検査及びｈＣＧ ＥＬＩＳＡ」で詳述されているように、ｈＣＧ分泌の検出及び測定にはマウスの尿及び血清を使用した。採取した病変を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）で一晩固定し、続いてパラフィンに包埋した。採取した病変の体積は１ｃｍ^３未満であった。パラフィン包埋組織を切片化し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、又はＫＲＴ７、ＨＬＡ－Ｇ及びＳＤＣ１の免疫組織化学染色に進んだ。

【0262】

妊娠検査及びｈＣＧ ＥＬＩＳＡ
ｉＴＳＣを、「インビトロにおけるｉＴＳＣｄ２１ｎ及びｉＴＳＣｄ８のＳＴ及びＥＶＴへの分化」に詳述されるように、ＳＴ分化のために１２ウェルプレート上に１ｍＬ当たり０．５×１０^５細胞の密度で播種した。ＳＴ細胞の培地を４日目に交換し、条件培地を６日目に収集し、－８０℃で保存した。対照として、１２ウェルプレート上に１ｍＬ当たり０．５×１０^５細胞の密度でｉＴＳＣを播種し、ＴＳＣ培地中で培養した。２日後、条件培地を収集し、－８０℃で保存した。次いで、市販のｈＣＧ妊娠検査スティック（Ｆｒｅｅｄｏｍ）を使用して、製造業者の推奨に従って、条件培地を試験した。さらに、ｈＣＧ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｎｏｖａ、ＡＢＮＯＫＡ４００５）を使用して、製造業者の説明書に従って、培地中のｈＣＧレベルも測定した。ｉＴＳＣ生着アッセイ後、収集したマウス尿を市販のｈＣＧ妊娠検査スティックを使用して試験し、血清中のｈＣＧレベルをｈＣＧ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。

【0263】

フローサイトメトリー分析及び蛍光活性化細胞選別
細胞をＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で解離させ、２％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ａｂｃａｍ）を補充したＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を抗体標識工程及びサンプルの最終再懸濁に使用した。ＨＬＡ実験のために、細胞をＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｗ６／３２）又はＨＬＡ－Ｂｗ４（１：１、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｌａｂ）で標識し、次いでＡＦ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１，０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、又は細胞を（１）ＨＬＡ－Ｇ ＭＥＧ－Ｇ／９（１：５００、Ａｂｃａｍ）；（２）ＡＦ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１，０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）；及び（３）ＰＥ－Ｃｙ７マウス抗ヒトＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＷＣ、Ｗ６／３２（１：２００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。

【0264】

ヒトリプログラミング中間体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験のために、０日目、３日目、７日目、１３日目プライミング、１３日目ナイーブ、２１日目プライミング、２１日目ナイーブ、ｉＰＳＣプライミング（継代３）、及びｉＰＳＣナイーブ（継代３）を収集し、凍結保存した。次いで、これらの収集されたサンプルをＦＡＣＳに供し、０日目、３日目、７日目、１３日目プライミング、１３日目ナイーブ、２１日目プライミング及び２１日目ナイーブについてサンプルをＰＩ－ＴＲＡ－１－８５＋細胞について選別して、視細胞及びｉＭＥＦ細胞を除去し、ｉＰＳＣプライミング（継代３）及びｉＰＳ細胞ナイーブ（継代３）サンプルをＰＩ－ＴＲＡ－１－８５＋ＣＤ１３－Ｆ１１Ｒ＋ＴＲＡ－１－６０＋ＥＰＣＡＭ＋細胞について選別して、死細胞及びｉＭＥＦ細胞、並びに分化細胞を除去した。その後のライブラリー調製のために拡張データ図１ｃで３つのサンプルを調製し、サンプル１は、０、３及び７日目から単離した細胞を含み、サンプル２及び３は、それぞれ、プライミング１３日目、２１日目及びｉＰＳＣ）の細胞と、ナイーブリプログラミング（１３日目、２１日目及びｉＰＳ細胞）を含み、少数の０、３及び７日目の細胞の混合をサンプル２及び３に加えて、完全なリプログラミング軌跡を獲得し、また潜在的なバッチ効果を説明した。収集した細胞を単離し、カプセル化し、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を製造業者の説明書（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ，１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ ＣＧ０００５２ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ３３）に従って使用してライブラリーを構築した。合計１２回のｃＤＮＡ増幅サイクルを用いた。合計１６サイクルのライブラリー増幅を用いた。配列決定は、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ （１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ ＣＧ０００５２ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ ３）によって概説される推奨に従って、高出力モードでＳＢＳ Ｖ２化学を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００を使用して、第２の読み取りが９８ｂｐの代わりに１１５ｂｐに拡張されたことを除いて実行された。ライブラリーを、製造業者の説明書（ＮｅｘｔＳｅｑ ５００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ １５０４６５６３ ｖ０２）に従って希釈し、１．８ｐＭでロードした。クロムバーコードを多重分離に使用し、ＦＡＳＴＱファイルを、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒプログラム（ｖ．２．１．０）を使用してｍｋｆａｓｔｑパイプラインから生成した。ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑに従ってｈｇ１９ゲノムに対してアラインメント及びＵＭＩ計数を行った（ただし、ｍＲＮＡ前駆体ではなく成熟ｍＲＮＡを使用し、ＵＭＩをエキソンに割り当てた）。

【0265】

２１日目の線維芽細胞、ナイーブ及びｉＴＳＣｄ８リプログラミング中間体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ
２１日目の線維芽細胞、ナイーブ及びｉＴＳＣｄ８リプログラミング中間体を収集し、ＰＩ－ＴＲＡ－１－８５＋細胞について選別して、死細胞及びｉＭＥＦ細胞を除去した。収集した細胞を単離し、カプセル化し、製造業者の説明書（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ３．３ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ）に従ってＣｈｒｏｍｉｕｍ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ （１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して構築した。配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００で、ペアードエンド（Ｒ１ ２８ｂｐ及びＲ２ ８７ｂｐ）配列決定戦略を用いて行い、細胞当たり２０，０００のリードペアを目指した。クロムバーコードを多重分離に使用し、ＦＡＳＴＱファイルを、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒプログラム（ｖ．３．１．０）を使用してｍｋｆａｓｔｑパイプラインから生成した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験に従ってｈｇ１９ゲノムに対してアラインメント及びＵＭＩ計数を行った。

【0266】

実施例８：考察
本結果は、体細胞のリプログラミング中に観察される一過性ＴＥ状態が多能性培地からＴＳＣ増殖を支持する培地（例えば、Ｏｋａｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８に記載されるＴＳＣ培地）へのリプログラミング中間体の移動を介して捕捉及び安定化され得ることを実証する。注目すべきことに、ヒト栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）は、リプログラミング中に生成された。このように、これは、ヒト体細胞からＴＳＣへの直接的なリプログラミングの最初の報告である。

【0267】

さらなる特徴付けは、本方法に従って生成されたＴＳＣがヒトＴＥ及びＴＳＣを規定する重要なマーカーを発現することを示す（図３）。これらのＴＳＣは、成長速度を低下させることなく、これまでに３０を超える継代を経ている。さらに、インビトロ及びインビボ分化アッセイを用いたＴＳＣの機能的特徴付けにより、ＴＳＣはａ）合胞体栄養膜（ＳＴ）、規定されたＳＤＣ１＋多核細胞、及びｂ）ＨＬＡ－Ｇ（胎盤で発現する重要な組織適合分子）のアップレギュレートされた発現により規定される絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）を生じることが実証された。重要なことに、これらのアッセイは、ＴＳＣが実際に二分化能であり、ＳＴ細胞及びＥＶＴ細胞に分化し得ることを実証する。まとめると、これらの結果は、リプログラミング中間体のこれまで決定されていなかった胚外の可能性を明らかにし、細胞運命の特定化は、ナイーブ状態へのヒト体細胞リプログラミングの間、非常に動的で可塑的であることを示唆した。

【0268】

成体細胞から誘導できる安定した自己複製性の真正同質遺伝子ヒトｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ株を有することは、現代の生化学的及び分子技術が大規模で適用できるインビトロ状況において、ヒト栄養外胚葉、栄養膜発達、多能性細胞とのその関係、並びに初期ヒト胚発生及び発達障害における細胞運命決定に関連する事象の調整におけるその役割を研究するための独特な機会を、全分野に提供するであろう。

【0269】

本明細書に開示及び定義された本発明は、本文若しくは図面に言及され、又は本文若しくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の代替的な組み合わせの全てに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせの全ては、本発明の様々な代替態様を構成する。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図5-5】

【図5-6】

【図5-7】

【図5-8】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【国際調査報告】