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特表2023-502138サークルｃＤＮＡ増幅によって遺伝子融合を同定するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-20
(54)【発明の名称】サークルｃＤＮＡ増幅によって遺伝子融合を同定するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20230113BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230113BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20230113BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20230113BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230113BHJP
C12Q 1/6853 20180101ALI20230113BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20230113BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C12Q1/02 ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6853 Z
C12N9/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022529558
(86)(22)【出願日】2020-11-16
(85)【翻訳文提出日】2022-07-11
(86)【国際出願番号】 US2020060712
(87)【国際公開番号】W WO2021101835
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】62/974,193
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507166520
【氏名又は名称】ワン，シャオ・ビン
(71)【出願人】
【識別番号】522198586
【氏名又は名称】リー シャオ フェイ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100212509
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 知子
(72)【発明者】
【氏名】ワン シャオ ビン
(72)【発明者】
【氏名】リー シャオ フェイ
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050LL03
4B063QA17
4B063QQ42
4B063QQ58
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
１つの実施形態は、ｃＤＮＡサークルを創出し、サークルｃＤＮＡを増幅またはシーケンシングによって分析することによって、公知のおよび未知の遺伝子融合を同定する方法を提供する。サークルｃＤＮＡは、２種の手法で創出される：１）標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートしてサークルｃＤＮＡを形成する、または２）標的ＲＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートしてサークルＲＮＡを形成し、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡをライゲートしてサークルｃＤＮＡを形成する。サークルｃＤＮＡは、ローリングサークル増幅またはＰＣＲ法によって、野生型標的遺伝子の公知の配列から設計されるプライマーを使用して増幅される。サークルｃＤＮＡにおける公知のまたは未知の融合遺伝子配列は、シーケンシング分析によって増幅および同定される。
【図１Ａ】
【図１Ａ】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
公知のおよび未知の遺伝子融合を検出する方法であって、ａ．標的とする核酸の３’末端またはポリＡテールにおける配列に相補的なＲＴプライマーを提供する工程；
ｂ．ＲＴプライマーを、標的とする核酸にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成する工程であって、ＲＴプライマーは、標的とする核酸の３’末端またはポリＡテールにおける配列に相補的である、工程；
ｃ．ＲＴによってｃＤＮＡを酵素的に合成する工程；
ｄ．ｃＤＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートして、環状ｃＤＮＡを形成する工程；
ｅ．ＲＴプライマーの下流にある標的とするｃＤＮＡの非融合配列に相補的な配列を有するサークル切断プライマーを提供する工程であって、前記プライマーは、エンドヌクレアーゼによって認識および切断され得る配列を含有する、工程；
ｆ．サークル切断プライマーを、環状ｃＤＮＡにおける遺伝子融合を有する疑いがある領域にハイブリダイズさせて、エンドヌクレアーゼ切断部位を形成する工程；
ｇ．エンドヌクレアーゼを用いて非融合サークルｃＤＮＡを切断する工程；
ｈ．ローリングサークル増幅またはＰＣＲ法を使用して、切断されていないサークルｃＤＮＡを増幅する工程；
ｉ．増幅または増幅産物のシーケンシング分析によって遺伝子融合を検出する工程
を含む、方法。
【請求項2】
公知のおよび未知の遺伝子融合を検出する方法であって、ａ．ｍＲＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートして、環状ｍＲＮＡを形成する工程；
ｂ．ＲＴプライマーを環状ｍＲＮＡにハイブリダイズさせて、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成する工程；
ｃ．逆転写によってＲＴプライマーを伸長させて、ｃＤＮＡを合成する工程；
ｄ．ｃＤＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートして、環状ｃＤＮＡを形成する工程；
ｅ．サークル切断プライマーを、環状ｃＤＮＡにおける遺伝子融合を有する疑いがある領域にハイブリダイズさせて、エンドヌクレアーゼ切断部位を形成する工程であって、サークル切断プライマーは、ＲＴプライマーの下流にある標的とするｃＤＮＡの非融合配列に相補的な配列を有し、前記プライマーは、エンドヌクレアーゼによって認識される配列を含有する、工程；
ｆ．エンドヌクレアーゼを用いて非融合サークルｃＤＮＡを酵素的に切断する工程；
ｇ．ローリングサークル増幅またはＰＣＲ法を使用して、切断されていないサークルｃＤＮＡを増幅する工程；および
ｈ．増幅または増幅産物のシーケンシング分析によって遺伝子融合を検出する工程
を含む、方法。
【請求項3】
標的核酸がＲＮＡまたはＤＮＡを含む、請求項１および２に記載の方法。
【請求項4】
前記プライマーが、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡキメラを含み、少なくとも６個またはそれよりも多いヌクレオチドを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
プライマーが１種または１群のプライマーであり得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
プライマーが、単離、ライゲーション、増幅、シーケンシング、および検出の目的のために、部分を用いて修飾される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
部分が、ビオチン、ジゴキシゲニン、タンパク質タグ、酵素、核酸のフラグメントからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
サークル切断プライマーが、ＲＴプライマーの下流における野生型のｃＤＮＡに相補的な配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項9】
サークル切断プライマーが、エンドヌクレアーゼによって認識され得、サークルｃＤＮＡとハイブリダイズした場合にエンドヌクレアーゼ切断部位を形成する配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項10】
エンドヌクレアーゼが、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキング酵素またはニック活性を有する酵素、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびｃｒｉｓｐｅｒ－ｃａｓ９系からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項11】
サークル切断プライマーが、標的ｃＤＮＡとミスマッチであり、サークルｃＤＮＡとミスマッチＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖を形成する配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項12】
ミスマッチＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖が、Ｔ４エンドヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、ＣＥＬヌクレアーゼを含むがそれらに限定されない、すべてのタイプのミスマッチ配列を認識および切断する酵素によって切断され得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項13】
サークル切断プライマーが、ＲＮＡサークルにハイブリダイズしてＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成し、ＲＮＡサークルが、ＲＮａｓｅ ＨのようなＤＮＡ依存的ＲＮａｓｅによる消化によって切断される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項14】
ｃＤＮＡ合成に使用される酵素が、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素およびＡＭＶ逆転写酵素を含むがそれらに限定されない、ＲＮＡ鋳型を使用してＤＮＡを合成し得る逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項15】
ライゲーションが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、耐熱性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、およびＲｔｃＢリガーゼのような、一本鎖核酸の３’末端をその５’末端にライゲートして環状核酸を形成し得る酵素によって実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項16】
増幅が、ｃＤＮＡの非融合配列に相補的なプライマーを用いたローリングサークル増幅によって実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項17】
増幅が、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔラージフラグメント、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのような、鎖置換活性を有するポリメラーゼによって実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
増幅が、標的とするｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに相補的なプライマーを使用するＰＣＲ法によって実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項19】
シーケンシング分析が、核酸の配列を同定することを可能にする任意のタイプのシーケンシング法であり得る、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９７４，１９３号に対する利益および優先権を主張する。
本出願は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９７４，１９３号に対する利益および優先権を主張する。
【0002】
本発明の態様は、核酸アッセイの分野、特に生物学的サンプルに存在する特異的標的核酸の増幅および検出に関する。
【背景技術】
【0003】
遺伝子融合または転座は、様々な遺伝性障害を引き起こす染色体異常の１種である。他のタイプの変異とは異なり、遺伝子融合は「ホットスポット」特徴を示さず、それぞれの場合は、異なるエクソンにおいて異なる断裂点を有する異なる融合遺伝子パートナーまたは同じ融合パートナーを有する。融合遺伝子を検出するための一般的方法には、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。これらの方法は、公知の融合遺伝子から設計されるプライマーまたはプローブを要する。しかしながら、多くの場合、遺伝子は多様な融合パートナーを有し得、例えば白血病におけるＭＬＬ遺伝子は、１５０種を上回る同定された融合パートナーおよび潜在的に多くの未知の融合パートナーを有することが公知である。加えて、各融合パートナーは、異なる断裂点を有する。これらのパートナーのすべてを同定するためのプローブまたはプライマーを設計することは困難であろう。長距離インバースＰＣＲ（ＬＤＩ－ＰＣＲ）法は、公知の遺伝子由来のプライマーを使用して、未知の融合を同定することを可能にする代替法である。この方法は二本鎖ＤＮＡに限定され、それは、標的遺伝子および融合遺伝子における制限酵素切断部位に依存する。方法は、分析のために大量の非融合サークルを生み出し、長距離ＰＣＲは、増幅およびシーケンシングの失敗を引き起こすであろう。これらの制約は、臨床適用のための方法を制限する。
近年、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）が遺伝子融合の分析に使用されている；しかしながら、ＮＧＳ法は多くの工程を伴い、それが分析の複雑性を増加させ、人為的結果も生み出し得る。ＮＧＳ法は、融合分析に対して、時間がかかり、費用がかかり、かつ効率が悪い。
融合パートナーの同定は、疾患診断、治療モニタリング、および薬物開発に対する有用なマーカーであろう。しかしながら、短期間に簡単な試験を用いてこれらの融合パートナーを分析し得る方法はない。
それゆえ、簡単な試験で任意の公知のまたは未知の融合パートナーを分析し得る効率的な方法を提供することが本発明の目的である。
近年、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）が遺伝子融合の分析に使用されている；しかしながら、ＮＧＳ法は多くの工程を伴い、それが分析の複雑性を増加させ、人為的結果も生み出し得る。ＮＧＳ法は、融合分析に対して、時間がかかり、費用がかかり、かつ効率が悪い。
融合パートナーの同定は、疾患診断、治療モニタリング、および薬物開発に対する有用なマーカーであろう。しかしながら、短期間に簡単な試験を用いてこれらの融合パートナーを分析し得る方法はない。
それゆえ、簡単な試験で任意の公知のまたは未知の融合パートナーを分析し得る効率的な方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【0004】
１つの実施形態は、ｃＤＮＡサークルを創出し、サークルｃＤＮＡを増幅またはシーケンシングによって分析することによって、公知のおよび未知の遺伝子融合を同定する方法を提供する。サークルｃＤＮＡは、２種の手法で創出される：１）標的ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートしてサークルｃＤＮＡを形成する、または２）標的ＲＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートしてサークルＲＮＡを形成し、環状ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡをライゲートしてサークルｃＤＮＡを形成する。サークルｃＤＮＡは、野生型標的遺伝子の公知の配列から設計されるプライマーを使用して増幅される。サークルｃＤＮＡにおける公知のまたは未知の融合遺伝子配列は、シーケンシング分析によって増幅および同定される。
別の実施形態は、遺伝子を含有するサークルｃＤＮＡを濃縮する方法を提供する。方法は、環状ｃＤＮＡの野生型配列に相補的なプライマーを設計する工程を含む。プライマーは、エンドヌクレアーゼ認識配列を含有し、プライマーは、野生型サークルｃＤＮＡ内にエンドヌクレアーゼ切断部位を形成する。エンドヌクレアーゼは、野生型サークルｃＤＮＡを切断するが、融合含有サークルＤＮＡを切断しない。切断されていないサークルｃＤＮＡの増幅およびシーケンシング分析は、公知のまたは未知の遺伝子融合の存在を示すであろう。
別の実施形態は、遺伝子を含有するサークルｃＤＮＡを濃縮する方法を提供する。方法は、環状ｃＤＮＡの野生型配列に相補的なプライマーを設計する工程を含む。プライマーは、エンドヌクレアーゼ認識配列を含有し、プライマーは、野生型サークルｃＤＮＡ内にエンドヌクレアーゼ切断部位を形成する。エンドヌクレアーゼは、野生型サークルｃＤＮＡを切断するが、融合含有サークルＤＮＡを切断しない。切断されていないサークルｃＤＮＡの増幅およびシーケンシング分析は、公知のまたは未知の遺伝子融合の存在を示すであろう。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1A-1C】融合ｍＲＮＡの逆転写および環状ｃＤＮＡの形成を示した略図である。図１Ａは、遺伝子融合を有しない環状ｃＤＮＡを示している。図１Ｂは、３’末端遺伝子融合を有する環状ｃＤＮＡを示している。図１Ｃは、５’末端遺伝子融合を有する環状ｃＤＮＡを示している。図１Ｄは、ＲＮＡサークルからのサークルｃＤＮＡ形成を示している。
【図2A-2D】サークル切断プライマーを使用することによる環状ｃＤＮＡの切断を示した略図である。図２Ａは、融合遺伝子を有しないサークルｃＤＮＡの切断を示している。図２Ｂは、３’末端融合を有するサークルｃＤＮＡの切断なしを示している。図２Ｃは、融合遺伝子を有しないサークルｃＤＮＡの切断を示している。図２Ｄは、５’末端融合を有するサークルｃＤＮＡの切断なしを示している。
【図3A-3D】環状ｃＤＮＡの増幅を示した略図である。図３Ａは、ローリングサークル増幅による３’末端融合の増幅を示している。図３Ｂは、ローリングサークル増幅による５’末端融合の増幅を示している。図３Ｃは、インバースＰＣＲによる３’末端融合の増幅を示している。図３Ｄは、インバースＰＣＲによる５’末端融合の増幅を示している。
【図4】実施例において使用された核酸配列のリストである。
【図5A】ＡＢＬ１Ｒプライマー（△）、Ｂｃｒ Ｒプライマー（＊）、および対照を使用したローリングサークル増幅の結果を示した、蛍光対時間（分）の線グラフである。
【図5B】インバースＰＣＲによる増幅を示したゲルの写真である。
【図6】融合を含有するｃＤＮＡの濃縮を示したゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「核酸」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ－ＤＮＡキメラを指す。
Ｉ．定義
「核酸」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ－ＤＮＡキメラを指す。
【0007】
「ＲＴ」という用語は、逆転写を指す。
「ＲＴ酵素」という用語は、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素およびＡＭＶ逆転写酵素を含むがそれらに限定されない、ＲＮＡを鋳型として使用してｃＤＮＡを合成し得る酵素を指す。
「プライマー」という用語は、標的遺伝子に相補的な配列を含有し、逆転写または増幅に使用される、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡキメラのフラグメントを指す。
「ＲＴプライマー」という用語は、逆転写に使用されるプライマーを指す。
「ＲＴ酵素」という用語は、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素およびＡＭＶ逆転写酵素を含むがそれらに限定されない、ＲＮＡを鋳型として使用してｃＤＮＡを合成し得る酵素を指す。
「プライマー」という用語は、標的遺伝子に相補的な配列を含有し、逆転写または増幅に使用される、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡキメラのフラグメントを指す。
「ＲＴプライマー」という用語は、逆転写に使用されるプライマーを指す。
【0008】
「野生型遺伝子または配列」という用語は、変異または遺伝子融合配列を含有しない遺伝子または配列を指す。
「５’末端融合」という用語は、標的遺伝子の５’末端に位置する遺伝子融合パートナーを指す。
「３’末端融合」という用語は、標的遺伝子の３’末端に位置する遺伝子融合パートナーを指す。
「５’末端融合」という用語は、標的遺伝子の５’末端に位置する遺伝子融合パートナーを指す。
「３’末端融合」という用語は、標的遺伝子の３’末端に位置する遺伝子融合パートナーを指す。
【0009】
「部分」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｄＮＴＰを標識するまたは修飾するために使用される分子を指し、ビオチン、ジゴキシゲニン、タンパク質タグ、酵素、核酸のフラグメントを含むが、それらに限定されない。
【0010】
ＩＩ．遺伝子融合を検出する
１つの実施形態は、標的とする遺伝子における公知のおよび未知の遺伝子融合パートナーを検出する方法を開示する。標的とする遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡであり得、好ましくは標的とする遺伝子はｍＲＮＡである。ＲＴプライマーは、ｃＤＮＡを合成するように、標的とするｍＲＮＡの逆転写用に設計される。プライマーは、標的とするｍＲＮＡの３’末端またはｍＲＮＡのポリＡテールに相補的である配列を有する。一部の実施形態において、プライマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡキメラである。１つの実施形態において、プライマーは、少なくとも６個またはそれよりも多いヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、プライマーは１種または１群のプライマーである。複数のプライマーが使用される場合、プライマーは、標的とする遺伝子の異なる領域または異なるエクソンに相補的である。一部の実施形態において、プライマーは、同定、単離、ライゲーション、増幅、およびシーケンシングに使用され得る１種または複数の部分を用いて修飾される。一部の実施形態において、プライマーは、配列特異的領域（sequence specific portion）およびアダプター領域(adapter portion)という少なくとも２種の領域を含有する。配列特異的領域は標的とする遺伝子に相補的であり、アダプター領域は、同定、単離、増幅、およびシーケンシングに使用される１種または複数の配列を含有する。一部の実施形態において、方法は、１種または複数のＲＴプライマーを標的とする遺伝子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成する工程であって、ハイブリダイゼーションの箇所は、標的とするｍＲＮＡの３’末端またはポリＡテールにおけるエクソンに位置する、工程を含む。一部の実施形態において、方法は、ＲＴプライマーを酵素的に伸長させて、ｃＤＮＡ鎖を合成する工程を含む。この反応に使用される酵素は、逆転写酵素、またはＲＮＡ鋳型を使用してＤＮＡプライマーを伸長させ得る他の酵素であり、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素およびＡＭＶ逆転写酵素を含むが、それらに限定されない。ｃＤＮＡが合成された後、方法は、ＲＮａｓｅ Ｈまたはアルカリ性試薬を用いた処理等の酵素的または化学的方法を使用することによって、標的ｍＲＮＡ鋳型を除去する工程を含む。次いで、リガーゼを使用してｃＤＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートすることによって、ｃＤＮＡを使用して環状ｃＤＮＡを形成する。一部の実施形態において、環状ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの３’末端をその５’末端に直接ライゲートしてサークルＲＮＡを形成する代替法によって形成される。方法は、ＲＴプライマーを環状ＲＮＡにハイブリダイズし、次いで逆転写によってｃＤＮＡを合成する工程を含む。ＲＮＡ依存的リガーゼを使用して、ｃＤＮＡをライゲートして環状ｃＤＮＡを形成する。
１つの実施形態は、標的とする遺伝子における公知のおよび未知の遺伝子融合パートナーを検出する方法を開示する。標的とする遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡであり得、好ましくは標的とする遺伝子はｍＲＮＡである。ＲＴプライマーは、ｃＤＮＡを合成するように、標的とするｍＲＮＡの逆転写用に設計される。プライマーは、標的とするｍＲＮＡの３’末端またはｍＲＮＡのポリＡテールに相補的である配列を有する。一部の実施形態において、プライマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡキメラである。１つの実施形態において、プライマーは、少なくとも６個またはそれよりも多いヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、プライマーは１種または１群のプライマーである。複数のプライマーが使用される場合、プライマーは、標的とする遺伝子の異なる領域または異なるエクソンに相補的である。一部の実施形態において、プライマーは、同定、単離、ライゲーション、増幅、およびシーケンシングに使用され得る１種または複数の部分を用いて修飾される。一部の実施形態において、プライマーは、配列特異的領域（sequence specific portion）およびアダプター領域(adapter portion)という少なくとも２種の領域を含有する。配列特異的領域は標的とする遺伝子に相補的であり、アダプター領域は、同定、単離、増幅、およびシーケンシングに使用される１種または複数の配列を含有する。一部の実施形態において、方法は、１種または複数のＲＴプライマーを標的とする遺伝子にハイブリダイズさせて、ＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖を形成する工程であって、ハイブリダイゼーションの箇所は、標的とするｍＲＮＡの３’末端またはポリＡテールにおけるエクソンに位置する、工程を含む。一部の実施形態において、方法は、ＲＴプライマーを酵素的に伸長させて、ｃＤＮＡ鎖を合成する工程を含む。この反応に使用される酵素は、逆転写酵素、またはＲＮＡ鋳型を使用してＤＮＡプライマーを伸長させ得る他の酵素であり、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素およびＡＭＶ逆転写酵素を含むが、それらに限定されない。ｃＤＮＡが合成された後、方法は、ＲＮａｓｅ Ｈまたはアルカリ性試薬を用いた処理等の酵素的または化学的方法を使用することによって、標的ｍＲＮＡ鋳型を除去する工程を含む。次いで、リガーゼを使用してｃＤＮＡの３’末端をその５’末端にライゲートすることによって、ｃＤＮＡを使用して環状ｃＤＮＡを形成する。一部の実施形態において、環状ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの３’末端をその５’末端に直接ライゲートしてサークルＲＮＡを形成する代替法によって形成される。方法は、ＲＴプライマーを環状ＲＮＡにハイブリダイズし、次いで逆転写によってｃＤＮＡを合成する工程を含む。ＲＮＡ依存的リガーゼを使用して、ｃＤＮＡをライゲートして環状ｃＤＮＡを形成する。
【0011】
サークルｃＤＮＡ形成に使用されるリガーゼは、鋳型の有無にかかわらず、核酸の３’末端を５’末端にライゲートし得る任意の酵素である。例示的な酵素には、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、耐熱性５’Ａｐｐ ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、およびＲｔｃＢリガーゼが含まれるが、それらに限定されない。
【0012】
サークル切断プライマーは、融合配列を有するサークルｃＤＮＡを濃縮するように設計される。プライマーは、ＲＴプライマーの３’下流におけるｃＤＮＡの非融合領域に相補的である。一部の実施形態において、プライマーはエンドヌクレアーゼ認識配列を含有する。５’末端融合を有するサークルｃＤＮＡを濃縮するために、サークル切断プライマーは、標的とするｃＤＮＡの非融合配列の５’末端にハイブリダイズするように設計される。３’末端融合を有するサークルｃＤＮＡを濃縮するために、サークル切断プライマーは、標的とするｃＤＮＡの非融合配列の３’末端にハイブリダイズするように設計される。サークル切断プライマーは、サークルｃＤＮＡにハイブリダイズして、野生型サークルｃＤＮＡとともに二本鎖エンドヌクレアーゼ切断部位を形成し、次いで野生型サークルｃＤＮＡはエンドヌクレアーゼによって切断される。
環状ｃＤＮＡにおけるサークル切断プライマーの結合配列が、融合遺伝子によって置換された場合、サークル切断プライマーは、もはやサークルｃＤＮＡにハイブリダイズすることはなく、サークルｃＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによって切断されることはない。切断に使用される酵素は、二重鎖を認識および切断するエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、酵素は、特異的制限エンドヌクレアーゼおよびニッキング酵素を含むがそれらに限定されない、任意のエンドヌクレアーゼである。
環状ｃＤＮＡにおけるサークル切断プライマーの結合配列が、融合遺伝子によって置換された場合、サークル切断プライマーは、もはやサークルｃＤＮＡにハイブリダイズすることはなく、サークルｃＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによって切断されることはない。切断に使用される酵素は、二重鎖を認識および切断するエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、酵素は、特異的制限エンドヌクレアーゼおよびニッキング酵素を含むがそれらに限定されない、任意のエンドヌクレアーゼである。
【0013】
サークル切断プライマーは、標的とする配列の野生型配列とミスマッチである１個または複数のヌクレオチドを含有するミスマッチプライマーでもあり得る。一部の実施形態において、プライマーは、野生型サークルｃＤＮＡとミスマッチ二重鎖を形成し、次いで二重鎖は、ミスマッチ配列を切断する酵素によって認識および切断される。この工程における使用のための例示的な酵素には、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ、ＣＥＬヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、およびエンドヌクレアーゼＶが含まれるが、それらに限定されない。
【0014】
一部の実施形態において、融合濃縮工程は、非融合領域でサークル切断プライマーを標的とするＲＮＡまたはサークルＲＮＡにハイブリダイズさせることによって、ＲＮＡまたはＲＮＡサークルに対しても実施され得る。一部の実施形態において、非融合サークルＲＮＡ配列は、次いで、ＲＮａｓｅ Ｈを含むがそれに限定されないＤＮＡ依存的ＲＮａｓｅを用いた消化によって切断される。
一部の実施形態において、サークル切断プライマーは、１種または複数のプライマーであり、標的とするｃＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な配列の少なくとも一部を有する。一部の実施形態において、サークル切断プライマーは、部分を用いて修飾され、プライマー伸長を遮断し、または単離および／もしくは検出を支援する。一部の実施形態において、環状ｃＤＮＡは、次いで、ローリングサークル増幅またはＰＣＲ法によって増幅される。一部の実施形態において、増幅用のプライマーは、標的とするｃＤＮＡの非融合領域（non-fusion portion)またはＲＴプライマーにハイブリダイズするように設計される。５’末端融合遺伝子を有するｃＤＮＡを検出するために、増幅プライマーはｃＤＮＡの３’末端非融合領域に位置する。３’末端融合遺伝子を有するｃＤＮＡを検出するために、増幅プライマーはｃＤＮＡの５’末端非融合領域に位置する。
一部の実施形態において、サークル切断プライマーは、１種または複数のプライマーであり、標的とするｃＤＮＡまたはＲＮＡに相補的な配列の少なくとも一部を有する。一部の実施形態において、サークル切断プライマーは、部分を用いて修飾され、プライマー伸長を遮断し、または単離および／もしくは検出を支援する。一部の実施形態において、環状ｃＤＮＡは、次いで、ローリングサークル増幅またはＰＣＲ法によって増幅される。一部の実施形態において、増幅用のプライマーは、標的とするｃＤＮＡの非融合領域（non-fusion portion)またはＲＴプライマーにハイブリダイズするように設計される。５’末端融合遺伝子を有するｃＤＮＡを検出するために、増幅プライマーはｃＤＮＡの３’末端非融合領域に位置する。３’末端融合遺伝子を有するｃＤＮＡを検出するために、増幅プライマーはｃＤＮＡの５’末端非融合領域に位置する。
【0015】
ローリングサークル増幅法に関して、プライマーは、ＲＴプライマー、または標的とするサークルｃＤＮＡの任意の非融合領域に相補的であるように設計される。ＰＣＲ法に関して、インバースプライマーのセットは非融合領域において設計され、順方向プライマーは、非融合ｃＤＮＡの配列に相補的であり、逆方向プライマーは、順方向プライマーに隣接し、非融合ｃＤＮＡと同一の配列を有し、ポリメラーゼは、サークルｃＤＮＡを鋳型として使用して順方向プライマーを伸長させ、伸長は、ライゲーション地点を交差し、順方向プライマーの５’末端で終わり、逆方向プライマーは、伸長した鎖の３’末端にハイブリダイズし、鎖を複製する。
【0016】
一部の実施形態において、増幅産物は、任意のシーケンシング法によって分析され、配列結果は、公知のまたは未知の遺伝子融合パートナーの存在を示す。シーケンシング分析を実施するために、ＲＴプライマーまたは増幅プライマーは、シーケンシングのためのアダプター配列を含有する領域を有するように設計される。ローリングサークル増幅産物は、ＲＴプライマーまたはローリングサークル増幅プライマー上のアダプター配列により、Ｎａｎｏｐｏｒｅ（登録商標）シーケンシング技法等の第３世代シーケンシング分析に直接適用され得る。ＰＣＲ産物は、ＲＴプライマーまたはローリングサークル増幅プライマーのアダプター配列により、次世代シーケンシングによって分析され得る。
別の実施形態は、本明細書に開示される方法を使用して遺伝子融合を検出するために必要とされるすべての試薬、例えば実施例において使用されるおよび本明細書に記載される試薬を含有するキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、容器内に、プライマー、逆転写酵素、蛍光標識等の検出標識、エンドヌクレアーゼ、およびバッファーを含む。１つの実施形態において、キットは、本明細書に開示される方法を使用して遺伝子融合を検出するための書面の使用説明書を含む。
別の実施形態は、本明細書に開示される方法を使用して遺伝子融合を検出するために必要とされるすべての試薬、例えば実施例において使用されるおよび本明細書に記載される試薬を含有するキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、容器内に、プライマー、逆転写酵素、蛍光標識等の検出標識、エンドヌクレアーゼ、およびバッファーを含む。１つの実施形態において、キットは、本明細書に開示される方法を使用して遺伝子融合を検出するための書面の使用説明書を含む。
【実施例】
【0017】
（実施例１）
ｃＤＮＡサークルライゲーションおよび増幅による融合の同定
材料および方法
転座ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１．２）によって特徴付けられるＣＭＬ患者由来の細胞株サンプルをこの実験に使用し、細胞株は、Ｂｃｒ（エクソン６）－ＡＢＬ１（エクソン２）融合と過去に判定されている。ＲＮＡを市販のＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して抽出し、最終溶出容量は５０μｌであった。１０μｌの最終溶出液を逆転写（ＲＴ）に使用した。ＲＴプライマーを、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２に相補的であるように設計した（図４）。２種の伸長遮断プライマー（ｅｂプライマー）を、ＢｃｒおよびＡＢＬ１遺伝子上でのＲＴプライマーのさらなる伸長を遮断するように設計した。ｅｂ－Ｂｃｒプライマーは、Ｂｃｒ遺伝子のエクソン４に相補的であり、ｅｂ－ＡＢＬ１プライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１に相補的である（図４）。ＲＴミックスにおけるプライマーの最終濃度は、ＲＴプライマーに関して３００ｎＭ、およびｅｂプライマーに関して６００ｎＭであった。ＲＴ反応を、市販のＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して３７℃で１時間実施した。
ｃＤＮＡサークルライゲーションおよび増幅による融合の同定
材料および方法
転座ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１．２）によって特徴付けられるＣＭＬ患者由来の細胞株サンプルをこの実験に使用し、細胞株は、Ｂｃｒ（エクソン６）－ＡＢＬ１（エクソン２）融合と過去に判定されている。ＲＮＡを市販のＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して抽出し、最終溶出容量は５０μｌであった。１０μｌの最終溶出液を逆転写（ＲＴ）に使用した。ＲＴプライマーを、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２に相補的であるように設計した（図４）。２種の伸長遮断プライマー（ｅｂプライマー）を、ＢｃｒおよびＡＢＬ１遺伝子上でのＲＴプライマーのさらなる伸長を遮断するように設計した。ｅｂ－Ｂｃｒプライマーは、Ｂｃｒ遺伝子のエクソン４に相補的であり、ｅｂ－ＡＢＬ１プライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１に相補的である（図４）。ＲＴミックスにおけるプライマーの最終濃度は、ＲＴプライマーに関して３００ｎＭ、およびｅｂプライマーに関して６００ｎＭであった。ＲＴ反応を、市販のＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して３７℃で１時間実施した。
【0018】
逆転写後、１μｌのＲＮａｓｅ Ｈ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を反応ミックスに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応ミックスを９５℃で５分間加熱することによって、酵素を不活性化した。サークルｃＤＮＡ形成をＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）を使用して実施し、総反応容量は、１５μｌのＲＴ反応ミックス、１×ライゲーションバッファー、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ、１０Ｕ Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ ＩＩ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（商標））を含んで２０μｌであった。次いで、混合液を６０℃で２時間インキュベートした。
【0019】
ライゲーション後、サークルｃＤＮＡを、ローリングサークル増幅およびＰＣＲ法によって増幅した。ローリングサークル増幅に関しては、単一プライマー（ローリングプライマー）を、ＡＢＬ１遺伝子に対してまたはＢｃｒ遺伝子に対して設計した。ＡＢＬ１ローリングプライマーは、ＡＢＬ１ ｃＤＮＡのエクソン２に相補的であり、Ｂｃｒローリングプライマーは、Ｂｃｒ ｃＤＮＡのエクソン６に相補的である。増幅を、ローリングプライマー、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）色素、ｄＮＴＰ、反応バッファー、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、および１０μｌの最終ライゲーション産物を含む５０μｌの反応ミックスにおいて実施した。反応を、リアルタイムサーモサイクラーにおいて３０℃で４５分間実施した。
【0020】
サークルｃＤＮＡをＰＣＲ法によっても増幅した。インバースプライマーセットを、サークルｃＤＮＡを特異的に増幅するように設計した。ＡＢＬ１プライマーセットの箇所は、ＡＢＬ１ ｃＤＮＡのエクソン２に位置し、順方向プライマーは、ＲＴプライマーの配列に相補的であった。逆方向プライマーは、ＲＴプライマーの隣接配列の下流にあるｃＤＮＡと同一の配列を有する。
【0021】
結果
両ローリングプライマーは増幅を示す。増幅産物は、一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ結合色素の蛍光強度によって表される。サークルｃＤＮＡの増幅を表すＡＢＬ１ローリングプライマーによる増幅は、ＡＢＬ１遺伝子のみを含有し、サークルは、ＡＢＬ－Ｂｃｒ融合遺伝子を含有する。Ｂｃｒローリングプライマーによって増幅されたシグナルは、Ｂｃｒ－ＡＢＬ１遺伝子融合の増幅を表す（図５Ａ）。ライゲートしていないｃＤＮＡを増幅対照として使用し、両プライマーからの増幅はなかった（図５Ａ）。結果は、方法が、標的遺伝子の公知の配列由来の単一プライマーを使用することによって融合遺伝子を増幅できることを示した。
両ローリングプライマーは増幅を示す。増幅産物は、一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ結合色素の蛍光強度によって表される。サークルｃＤＮＡの増幅を表すＡＢＬ１ローリングプライマーによる増幅は、ＡＢＬ１遺伝子のみを含有し、サークルは、ＡＢＬ－Ｂｃｒ融合遺伝子を含有する。Ｂｃｒローリングプライマーによって増幅されたシグナルは、Ｂｃｒ－ＡＢＬ１遺伝子融合の増幅を表す（図５Ａ）。ライゲートしていないｃＤＮＡを増幅対照として使用し、両プライマーからの増幅はなかった（図５Ａ）。結果は、方法が、標的遺伝子の公知の配列由来の単一プライマーを使用することによって融合遺伝子を増幅できることを示した。
【0022】
サークルｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、２種の異なる増幅産物を示す。１９０ｂｐの産物は、エクソン２およびエクソン１の部分的配列を含む、野生型のＡＢＬ１遺伝子の増幅である。この増幅は、野生型サンプルおよびＢｃｒ－ＡＢＬ１融合サンプルによって確認される。２８５ｂｐの産物は、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２、ならびにＢｃｒ遺伝子のエクソン６、エクソン５、およびエクソン４の部分的配列を含む、Ｂｃｒ－ＡＢＬ１融合遺伝子の増幅である（図５Ｂ）。ＡＢＬ１ ＰＣＲによるＢｃｒ融合遺伝子の増幅は、Ｂｃｒ遺伝子のエクソン５に対して設計されたＢｃｒ特異的インバースＰＣＲプライマーを使用することによっても確認される。ライゲートしていないサンプルにおいて増幅は観察されない。ＡＢＬ１インバースプライマーセットの増幅は、ｃＤＮＡサークルがＢｃｒ－ＡＢＬ１融合遺伝子を含有することを示した。
【0023】
（実施例２）
融合ｃＤＮＡサークルの濃縮
材料および方法
サークルｃＤＮＡを、実施例１に開示される手順を使用して作出した。サークルライゲーションは、融合サンプルから２種の異なるタイプのサークルｃＤＮＡを作出した。一方のタイプは野生型配列（野生型サークル）のみを含有し、もう一方は融合遺伝子を含有する。融合遺伝子を有するサークルｃＤＮＡを濃縮するために、サークル切断プライマーを、野生型サークルを切断するように設計した。プライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１に相補的である。サークル形成後、１μｌのサークル切断プライマーを、１５μｌのサークルｃＤＮＡに添加し（最終濃度３００ｎＭ）、混合した。混合液を９５℃で３分間加熱した。プライマーを５０℃で１０分間アニールし、野生型サークルとの二重鎖を形成し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識部位を創出した。次いで、二重鎖を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）を含む反応ミックスにおいて３７℃で１時間消化して、野生型サークルを切断した。酵素消化を停止させるために、サンプルを９５℃で５分間加熱して、酵素を不活性化した。次いで、サークルｃＤＮＡミックスをインバースＰＣＲ増幅に供した。増幅に使用されたＰＣＲプライマーセットは、実施例１において使用された同じプライマーセットであった。
融合ｃＤＮＡサークルの濃縮
材料および方法
サークルｃＤＮＡを、実施例１に開示される手順を使用して作出した。サークルライゲーションは、融合サンプルから２種の異なるタイプのサークルｃＤＮＡを作出した。一方のタイプは野生型配列（野生型サークル）のみを含有し、もう一方は融合遺伝子を含有する。融合遺伝子を有するサークルｃＤＮＡを濃縮するために、サークル切断プライマーを、野生型サークルを切断するように設計した。プライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１に相補的である。サークル形成後、１μｌのサークル切断プライマーを、１５μｌのサークルｃＤＮＡに添加し（最終濃度３００ｎＭ）、混合した。混合液を９５℃で３分間加熱した。プライマーを５０℃で１０分間アニールし、野生型サークルとの二重鎖を形成し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識部位を創出した。次いで、二重鎖を、Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ）を含む反応ミックスにおいて３７℃で１時間消化して、野生型サークルを切断した。酵素消化を停止させるために、サンプルを９５℃で５分間加熱して、酵素を不活性化した。次いで、サークルｃＤＮＡミックスをインバースＰＣＲ増幅に供した。増幅に使用されたＰＣＲプライマーセットは、実施例１において使用された同じプライマーセットであった。
【0024】
結果
結果は、野生型ＡＢＬ１遺伝子の増幅が、酵素消化の後に消えたことを示している。しかしながら、Ｂｃｒ－ＡＢＬ１融合遺伝子の増幅は、影響を受けなかったまたは増強された。結果は、野生型サークルｃＤＮＡが、酵素処理によってｃＤＮＡミックスから除去されることを示す。サークルｃＤＮＡは、ｃＤＮＡミックスにおいて濃縮され、より効率的に増幅されたＢｃｒ－ＡＢＬ１融合遺伝子を含有する。
前述の明細書において、本発明は、そのある特定の実施形態との関連で記載されており、多くの詳細が例示の目的のために提示されているものの、本発明が、付加的な実施形態の影響を受けやすいこと、および本明細書に記載されるある特定の詳細は、本発明の基本的原理から逸脱することなく相当に変動し得ることは、当業者に明白であろう。
結果は、野生型ＡＢＬ１遺伝子の増幅が、酵素消化の後に消えたことを示している。しかしながら、Ｂｃｒ－ＡＢＬ１融合遺伝子の増幅は、影響を受けなかったまたは増強された。結果は、野生型サークルｃＤＮＡが、酵素処理によってｃＤＮＡミックスから除去されることを示す。サークルｃＤＮＡは、ｃＤＮＡミックスにおいて濃縮され、より効率的に増幅されたＢｃｒ－ＡＢＬ１融合遺伝子を含有する。
前述の明細書において、本発明は、そのある特定の実施形態との関連で記載されており、多くの詳細が例示の目的のために提示されているものの、本発明が、付加的な実施形態の影響を受けやすいこと、および本明細書に記載されるある特定の詳細は、本発明の基本的原理から逸脱することなく相当に変動し得ることは、当業者に明白であろう。
【0025】
本明細書において引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体として組み入れられる。本発明は、その精神または本質的属性から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得、したがって、本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書よりもむしろ添付の特許請求の範囲への参照がなされるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】