(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-23
(54)【発明の名称】低免疫原性の筋肉前駆体細胞の遺伝子改変的調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230116BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20230116BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230116BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20230116BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230116BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230116BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0775
C12N15/12
A61K35/34
A61P21/00
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022529578
(86)(22)【出願日】2020-11-20
(85)【翻訳文提出日】2022-07-04
(86)【国際出願番号】 US2020061602
(87)【国際公開番号】W WO2021102324
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】62/938,053
(32)【優先日】2019-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522199262
【氏名又は名称】ヴィータ セラピューティクス インク．
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＴＡ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ダグラス フォーク
(72)【発明者】
【氏名】ピーター アンダーソン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB47
4C087NA14
4C087ZA94
(57)【要約】
本発明の複数の実施形態は、条件付き免疫回避能を有する幹細胞、細胞の調製方法及びこれら幹細胞を筋組織の修復に使用する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子、ＭＩＣ－２遺伝子、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の野生型幹細胞に対して調節された発現を有する筋原性幹細胞。
【請求項2】
前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子、前記ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、前記ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、前記β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子、前記ＣＤ７４遺伝子、前記ＴＡＰ１遺伝子、前記ＭＩＣ－１遺伝子及び前記ＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の調節された発現は野生型幹細胞に対して低減されている、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項3】
前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子、前記ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、前記ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、前記β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子、前記ＣＤ７４遺伝子、前記ＴＡＰ１遺伝子及び前記ＭＩＣ－１遺伝子の発現は阻害されている、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項4】
前記ＨＬＡ－Ａ遺伝子、前記ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、前記ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、前記β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子、前記ＣＤ７４遺伝子、前記ＴＡＰ１遺伝子、前記ＭＩＣ－１遺伝子及び前記ＭＩＣ－２遺伝子は欠失している、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項5】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種は野生型幹細胞に対して条件付きに過剰発現されている、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項6】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種は第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する、請求項５に記載の筋原性幹細胞。
【請求項7】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の発現は、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターにより制御される、請求項５に記載の筋原性幹細胞。
【請求項8】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子は野生型幹細胞に対して条件付きに過剰発現されている、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項9】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子は第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する、請求項８に記載の筋原性幹細胞。
【請求項10】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の発現は、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターにより制御される、請求項８に記載の筋原性幹細胞。
【請求項11】
ＣＤ４６遺伝子、ＣＤ５９遺伝子及びＣＤ５５遺伝子の少なくとも１種の野生型幹細胞に対して増加された発現を含む、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項12】
ＣＤ４６遺伝子、ＣＤ５９遺伝子及びＣＤ５５遺伝子の各々の野生型幹細胞に対して増加された発現を更に含む、請求項１１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項13】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種は、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位に挿入されている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の筋原性幹細胞。
【請求項14】
前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む、請求項１３に記載の筋原性幹細胞。
【請求項15】
前記筋原性幹細胞は衛星細胞である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の筋原性幹細胞。
【請求項16】
前記幹細胞は低免疫原性である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の筋原性幹細胞。
【請求項17】
ＨＬＡ－ＤＭＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子及びＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子の少なくとも１種の野生型幹細胞に対して低減された発現を更に含む、請求項１に記載の筋原性幹細胞。
【請求項18】
ＨＬＡ－ＤＭＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子及びＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子の少なくとも１種は欠損している、請求項１７に記載の筋原性幹細胞。
【請求項19】
低免疫原性幹細胞の調製方法であって、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の幹細胞における発現を低減させることと、
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞において条件付き発現させることを含み、
ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の発現の低減と、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現とによって低免疫原性幹細胞を得る調製方法。
【請求項20】
ＣＤ４６遺伝子、ＣＤ５９遺伝子及びＣＤ５５遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における発現を増加させることを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の発現の低減は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞のゲノムＤＮＡにおいて低減する、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞のゲノムＤＮＡからの欠失は、エンドヌクレアーゼの使用を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記幹細胞におけるＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の発現低減を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項24】
前記幹細胞におけるＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現は、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位へのＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の挿入を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項25】
前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における条件付き発現は、第１の細胞分化ステージ中のＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の過剰発現と、第２の細胞分化ステージ中のＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の発現の第１の細胞分化ステージに対する低減とを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における条件付き発現は、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターの使用を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の前記幹細胞における条件付き発現を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項29】
ＨＬＡ－ＤＭＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子及びＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における発現を低減することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項30】
治療を必要とする対象を治療する方法であって、請求項１～１８の何れかに記載の筋原性幹細胞を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項31】
前記対象は筋障害を患っている、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
請求項１～１８の何れかに記載の筋原性幹細胞を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１１月２０日出願の米国仮出願第６２／９３８，０５３号の優先権を主張するものであり、この全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本願は、２０１９年１１月２０日出願の米国仮出願第６２／９３８，０５３号の優先権を主張するものであり、この全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【0002】
ここに請求する本発明の複数の実施形態は、条件付き（コンディショナルな）免疫回避能を有する幹細胞、細胞の調製方法及びこれら幹細胞を筋組織の修復に使用する方法の各分野に関する。
【背景技術】
【0003】
多能性幹細胞（胚幹細胞や人工多能性幹細胞）等の幹細胞に基づく骨格筋細胞置換療法においては、傷害部位に移植された骨格筋細胞の一体化に限界があることが大きな障害の一つである。細胞移植の多くのケースでは、患者の生存中に継続的に新しい細胞が必要となるため、多数回の細胞注入が必須となる。次なる障壁は、被移植者の免疫系による拒絶のリスク及び／又は腫瘍発生のリスクである。従って、筋肉疾患及びその症候群を標的とする療法を創出するための新規な方法が求められている。
【0004】
文献の援用
本明細書で明らかにする全ての公開文書及び特許出願は、それらの各々があたかも具体的に且つ個々に援用されていると同程度に、それらの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本明細書で明らかにする全ての公開文書及び特許出願は、それらの各々があたかも具体的に且つ個々に援用されていると同程度に、それらの全内容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【発明の概要】
【0005】
本発明の一実施形態は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子、ＭＩＣ－２遺伝子、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の野生型幹細胞に対して調節された発現を有する筋原性幹細胞に関する。
【0006】
本発明の一実施形態は、低免疫原性幹細胞の調製方法に関し、該方法は、幹細胞におけるＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の発現を低減することと、前記幹細胞中でＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種を条件付きに発現させることにおいて、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の発現を少なくとも一種を低減すること及びＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種を条件付きに発現させることとよって低免疫原性幹細胞を得ることとを含む方法に関する。
【0007】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞を必要とする対象に投与することを含む、対象の治療方法に関する。
【0008】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞を含む組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の幾つかの実施形態を詳述する。各実施形態の説明においては、明瞭さを目的として具体的な用語を使用する。しかしながら、本発明はこれらの具体的用語に限定されることを意図しない。当業者であれば、本発明の広範な概念から逸脱することなく、他の等価な成分や方法を利用できることを理解するであろう。「従来技術」及び「発明の詳細な説明」の各項を含む本明細書のあらゆる箇所において引用される全ての参考文献は、夫々が個々に援用されるがごとくに援用される。
【0013】
本発明の主題と添付の請求の範囲を理解する目的で、次の各定義が本明細書に包含される。本明細書において使用される略語は、化学及び生化学の各分野における通常の意味を有する。
【0014】
本明細書においては種々の実施形態と様相を示すが、このような実施形態と様相が単に例示として提供されることは当業者には明白であろう。当業者であれば、本発明を逸脱することなく種々の改変、変更及び置換が可能であろう。本明細書に記載する本発明の実施形態の各種改変例は、本発明の実施において利用できることと理解されたい。
【0015】
特に定義しない限り、本明細書で用いる技術科学用語は、当業者に通常理解されると同様の意味を有する。例えば、Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照されたい。本明細書の記載内容と同様又は等価である方法、装置及び材料は全て、本発明の実施において利用することができる。本明細書で頻出する用語の理解を容易とするために次の各定義を提供するが、これらは本開示の範囲を制限するものではない。
【0016】
本明細書を通じて用いる、「条件付で（コンディショナルに）発現された」又は「条件付き（コンディショナルな）発現」とは、幹細胞において調節される遺伝子発現であって、この遺伝子が幹細胞の分化のある種のステージにおいてのみ、及び／又はある種の組織内のみに発現されるような遺伝子発現を意味する。このような場合、遺伝子の発現は、幹細胞分化の他のステージにおいて、及び／又は他の組織においては低減又は阻害される。幾つかの実施形態において、幹細胞の野生型又は非改変の遺伝子の発現レベルと比較して、幹細胞分化のある種のステージにおいて、及び／又はある種の組織内に高レベルで遺伝子発現されるか「過剰発現」するように幹細胞が改変される。
【0017】
幾つかの実施形態では、ある遺伝子を、ある幹細胞において、ネイティブ系の野生型幹細胞中での野生型又はネイティブレベルの遺伝子発現に対し、その遺伝子を条件付き過剰発現させる。幾つかの実施形態において、この条件付き過剰発現される遺伝子は、筋肉前駆体及び／又は筋肉特異的プロモーターによって調節される。このような実施形態において、このプロモーターは幹細胞の特定の分化ステージにおいて活性であり、幹細胞の他の分化ステージにおいて不活性である。非限定的な例として、このようなプロモーターは筋原性幹細胞／衛星細胞、筋芽細胞及び筋繊維を含む筋細胞において活性であり、線維芽細胞、脂肪細胞等を含む非筋肉系統において不活性である。このようなプロモーターを次の表１に示すがこれらに限定されない。
【0018】
【表1】
【0019】
本明細書を通じて使用する「調節された発現」という用語は、発現の増加（即ち、遺伝子が過剰に発現される）又は発現の減少（即ち、遺伝子が過少発現される）を含む「発現の変化」を意味する。遺伝子発現は遺伝子の欠損によっても減少し、これは調節された遺伝子発現と考えられる。
【0020】
本明細書を通じて使用する「低免疫原性」又は「免疫回避」という用語は、低下した免疫原性を有するように、又は免疫応答の誘発を避けるように改変された幹細胞を意味する。幾つかの実施形態において、改変された幹細胞の低免疫原性又は免疫回避の性質は条件付きであり、この幹細胞はある種の非筋肉分化ステージにおいてのみ低い免疫原性を有する。幾つかの実施形態において、幹細胞の条件付き免疫回避性は、当該幹細胞の適切な分化と成熟を伴って所望のタイプの細胞や組織にすることを助長する。このような実施形態においては、仮に幹細胞が分化又は成熟して所望のタイプの細胞や組織にならない場合、幹細胞はその免疫回避性を不活化するように更に改変され、免疫応答を幹細胞に与えることができる。この結果、意図しない幹細胞の分化及び異常な増殖が防止される。
【0021】
複数の実施形態において、「筋障害」、「筋疾患」、「筋症候群」、「筋症状」又は「ミオパチー」とは、経時的な骨格筋の弱化及び崩壊をもたらす障害である。例えば、筋ジストロフィー（ＭＤ）は、通常９種の主なカテゴリーやタイプに分類される少なくとも３０種の異なる遺伝的障害を含む。ＭＤは経時的な進行的筋肉弱化、筋タンパクの欠乏、筋繊維及び組織の破壊に特徴づけられる遺伝性、進行性、退化的障害の一群を意味する。多くの場合、組織学像には繊維径の変化、筋細胞の壊死と退化、結合組織と脂肪組織の頻繁な増殖が見られる。この疾患は主に骨格筋や随意筋に現れる。しかし、ある種の筋ジストロフィーでは、心筋と他の不随意筋も侵される。
【0022】
本発明は、退化的筋消耗障害及び筋体積損失の治療に利用することができる。退化的筋消耗障害の例としては筋ジストロフィー、ミオパチー、ミトコンドリア病、軟部肉腫、イオンチャンネル病、カヘキシア及びサルコペニアが挙げられる。筋体積の損失には外傷や手術による筋損失が含まれる。手術とは、例えば筋組織が除去されるいずれかの手順であり、例えば横紋筋肉腫等の癌の手術である。
【0023】
筋ジストロフィーは、進行性の弱化と筋量損失を起こす遺伝的疾患の一群である。筋ジストロフィーにおいては、健全な筋肉形成に必要なタンパク質の産生を異常遺伝子（変異）が妨害する。大抵、筋ジストロフィー患者の衛星細胞には筋肉生産に必要なタンパク質が欠乏している。本発明による衛星細胞又は筋原性幹細胞は完全に機能的であり健全である。これら細胞は非対称な細胞分裂をして筋芽細胞を生じる。これがホスト筋芽細胞と融合して損傷した筋肉を回復させ、新しい筋肉を創り出す。本発明の細胞は連続的な筋肉再生に対して長期間の治療効果を有する。筋ジストロフィーの例としては、肢ガードル型 筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）（例えば、ベスレムＣＭＤ、福山型ＣＭＤ、筋眼脳病（ＭＥＢｓ）、強直性脊椎症候群、ウルリッヒＣＭＤ、ウォーカー－ワルブルグ症候群（ＷＷＳ））、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリー－ドレフュス筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、肩甲骨上腕骨性筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）及び眼咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）が挙げられる。
【0024】
ミオパチーは、筋肉の機能と強度の損失を伴う遺伝的筋疾患の一群である。炎症性ミオパチーの原因は知られていないが、免疫系において何らかが悪くなり、筋細胞への攻撃につながると考えられている。原因には、感染症、薬剤による筋傷害、筋肉機能に影響を与える遺伝性疾患、電解質レベル障害、甲状腺疾患も含まれる。本発明の衛星細胞又は筋原性幹細胞は免疫系を回避する筋肉を産生する。従って、これらの細胞は免疫系の標的とはならず、患者の筋肉の機能と強度を修復することができる。本発明により治療可能なミオパチーには、先天性ミオパチー（例えば、Ｃａｐミオパチー、心核ミオパチー、繊維型不均衡を伴う先天性ミオパチー、コアミオパチー、セントラルコア病、マルチコアミオパチー、ミオシンストレージミオパチー、ミオチューブラーミオパチー及びネマリンミオパチー）、遠位型ミオパチー（例えば、ＧＮＥミオパチー／ノナカミオパチー／遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）、ライングミオパチー、マークスベルグ－グリッグス遅発性遠位型ミオパチー、ミヨシミオパチー、ウッドミオパチー／脛骨筋ジストロフィー、ＶＣＰミオパチー／ＩＢＭＰＦＤ、声帯・咽頭遠位型ミオパチー及びヴェランダー遠位型 ミオパチー）、内分泌性ミオパチー（甲状腺機能亢進ミオパチー、甲状腺機能低下ミオパチー等）、炎症性ミオパチー（皮膚筋炎、封入体筋炎及び多発性筋炎を含む）、代謝性ミオパチー（例えば、アシッドマルターゼ欠損症（ＡＭＤ、ポンペ病）、カルニチン欠損症、 カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、デブランシェ酵素欠損症（コリ病、フォーブス病）、ラクテートデヒドロゲナーゼ欠損症、ミオアデニレートデアミナーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（タルイ病）、ホスホグリセラートキナーゼ欠損症、ホスホグリセラートムターゼ欠損症及びホスホリラーゼ欠損症（マッカードル病））、筋原繊維性ミオパチー（ＭＦＭ）及び肩甲腓骨ミオパチーが含まれる。
【0025】
ミトコンドリア病は、身体が正常に機能するために十分なエネルギーをミトコンドリアが産生できない場合に疾患が発生するような遺伝性疾患の一群である。ミトコンドリア病は筋肉の弱化、筋肉痛及び筋肉緊張低下を招く。本発明の衛星細胞又は筋原性幹細胞は筋肉の機能と強度を回復することにより筋肉の弱化の低減を助長するため、ミトコンドリア病に罹患している患者のＱＯＬを有意に改善できる。ミトコンドリア病の例としては、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、及びカーンズ－サイレ症候群（ＫＳＳ）、レー症候群 （亜急性壊死性脳ミオパチー）、ミトコンドリアＤＮＡ欠損症候群、ミトコンドリア脳ミオパチー、乳酸アシドーシス脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）、ミトコンドリア神経消化管脳ミオパチー（ＭＮＧＩＥ）、ラッグド赤色線維を有するミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、ニューロパチー・運動失調症・網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群及び進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）等ミトコンドリアミオパチーが挙げられる。
【0026】
軟部肉腫は、局在化した軟部組織の癌の一群である。例えば、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）は、急速に進行し悪性度の高い癌の形態であり、完全分化しそこなった骨格（横紋筋）筋細胞から進展する。通常、外科手術か化学療法で治療され、高い生存率が得られる傾向にある。しかしその後、外科的切除又は局在放射線療法によるダメージがあるため、患者の影響を受けた部位において著しい筋肉低下が残る。本発明の衛星細胞又は筋原性幹細胞を注入すれば、これら病気に対して生存している患者の筋肉部位における筋肉再生の回復を促進すると思われる。筋肉の損失や除去を招き得る他の軟部肉腫には、血管肉腫、皮膚線維肉腫結節、類上皮肉腫，消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、粘液線維肉腫、多形性肉腫、横紋筋肉腫、孤在性繊維性腫瘍、滑膜肉腫及び未分化多形性肉腫が含まれる。
【0027】
イオンチャンネル病は、通常、筋肉弱化、筋緊張の無さ又は一時的な筋肉麻痺を特徴とするイオンチャンネルの欠陥を伴う疾患の一群である。本発明の衛星細胞又は筋原性幹細胞はこれら患者の機能性筋の回復を促進することができる。イオンチャンネル病の例としては、アンダーセン－トーヴィル症候群、高カリウム性周期性四肢麻痺、低カリウム性周期性四肢麻痺、先天性ミオトニア（例えば、ベッカーミオトニアやトムセンミオトニア）、先天性パラミオトニア及びカリウム増悪ミオトニアが挙げられる。
【0028】
カヘキシアは、体組成（筋肉喪失による）、ＱＯＬ、パフォーマンス状態、病的状態及び死亡率を変化させる病理学・生理学的変化を特徴とする複雑且つ多因子的な障害であり、癌患者の最大５０％までがカヘキシアを伴って死亡し、そのうち最大２０％がカヘキシアを死因とする。カヘキシアの増加を鑑み、カヘキシアは癌の併存症であると言われてきた。本発明の衛星細胞又は筋原性幹細胞は筋肉再生の回復を助長するため、カヘキシア患者のＱＯＬを有意に改善することができる。
【0029】
サルコペニアは骨格筋の量と機能を失うことを特徴とする病態である。この病気は基本的には老人の病気であるが、サルコペニアの進行には老人だけには見られない状態を伴うことがある。サルコペニアは、進行性で全身に亘る骨格筋の量と強度の喪失を特徴とする症候群であり、身体障害、ＱＯＬ低下及び死亡と強い相関がある。衛星細胞の経時的な損失はサルコペニアを起こす主たる原因の一つと考えられている。本発明の衛星細胞又は筋原性幹細胞を注入すると、サルコペニアの進行を有意に遅らせることができる。
【0030】
特に致死性型であるＭＤは、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）であり、通常４才位からの男性が罹患する。他のタイプとしては、ベッカー筋ジストロフィーや肩甲骨上腕骨性筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーが挙げられる。これらは筋タンパク質生成に関与する遺伝子の変異に起因する。また、親由来の障害の遺伝又は初期発達段階で起こる変異によっても発生する。疾患はＸ－リンク劣性、常染色体劣性又は常染色体優性であり得る。筋ジストロフィーの更なる例としては、肢ガードル型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、エメリー－ドレフュス筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、ミヨシミオパチー、ウルリッヒ先天性筋ジストロフィー及びシュタイナート筋ジストロフィーが挙げられる。
【0031】
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、最も一般的な遺伝性致死性の小児筋ジストロフィーであり、男性約３，０００人に１人が罹患する。ＤＭＤの子供は通常１１才から１２才になると車椅子生活となり、罹患者は通常２０年か３０年の人生で死亡する。ＤＭＤはＸ染色体（Ｘｐ２１）にあるジストロフィン遺伝子の変異から始まり、ジストロフィンタンパク質を失い、筋線維の崩壊を招く。ジストロフィンタンパク質の骨格筋線維の統合の維持における役割は良く認知されているが、筋線維破壊とジストロフィー筋の損失に至る正確な機構は完全には理解されていない。ジストロフィン遺伝子の発見と、それに続くタンパク産物の特性化によって、統合サルコレンマタンパク質としてのジストロフィンであることが確立された。このタンパク質は筋肉サルコメア及び細胞骨格を周囲の細胞外マトリックスに結合させる。ジストロフィンの局在化は筋統合の維持と同義であり、ジストロフィンが存在しなければ（ＤＭＤで証明されるように）、膜の脆化、収縮による筋線維損傷及び死に至る。
【0032】
現在のＤＭＤ治療：ＤＭＤに対する治療は知られておらず、継続的な医療の必要性は規制当局に認識されている。通常、治療の目的は症状の発症を制御してＱＯＬを最大化することにある。ＱＯＬは特定のアンケートを利用して評価することができる。治療には以下が含まれる。
【0033】
プレドニゾロンやデフラザコート等のコルチコステロイドは、最長で２年間、筋肉の強度と機能を短時間で改善する。コルチコステロイドが歩行を長続きさせることも報告されている。
【0034】
筋肉強度を増加させるが、疾患の進行を変化させないβ２アゴニスト（例えば、β２アゴニストであるサルブタモル（例えば、アルブテロール）を使用できる。）
【0035】
水泳等の穏やかで気持ち良い運動が推奨される。活動しないこと（ベッドレスト等）は筋疾患を悪化させ得る。
【0036】
理学療法は筋肉の強度、柔軟性及び機能の維持に役立つ。
【0037】
矯正装具（添木や車いす等）は運動性を改善し、セルフケア能力を向上させ得る。就寝中に足首を位置固定する形状フィットの取り外し可能な足用添木は、拘縮の始まりを遅くすることができる。
【0038】
疾患の進行に伴い適切な呼吸補助が重要である。
【0039】
心臓の問題にはペースメーカーを必要とする。
【0040】
アタルーレン等の投薬も可能である。
【0041】
「筋肉幹細胞」又は「筋原性幹細胞」又は「筋前駆細胞」とは、細胞間融合を経て多核筋線維を形成することになる子孫単核筋芽細胞を産生する自己再生単核細胞を意味する。筋原性幹細胞は衛星細胞を含む。この衛星細胞は、自己再生可能且つ筋芽細胞を生じる組織特異的筋原性幹細胞であり、筋芽細胞は骨格筋の「ビルディングブロック」として働く。本明細書では、骨格筋、平滑筋又は心筋を産生する幹細胞が包含される。「筋肉幹細胞」、「筋原性幹細胞」、「筋前駆細胞」及び「衛星細胞」の各用語は本明細書において交換可能に使用される。
【0042】
本明細書において用語「筋細胞」とは、筋組織を構成するいずれの細胞をも意味する。筋芽細胞、衛星細胞、筋管及び筋線維組織は全て筋組織を形成し、用語「筋細胞」に包含され得る。筋細胞の効果は骨格筋、心筋、平滑筋内に誘導される。脊椎動物成体の筋組織は衛星細胞から再生される。衛星細胞は筋組織に亘って分布し、傷害や疾患が無い状態では有糸分裂が休止状態にある。筋傷害の後、又は疾患からの回復期において、衛星細胞は再度細胞周期に入って増殖し、更に１）存在する筋線維に入るか、或いは２）分化することにより、新たな筋線維の束を形成する多核筋管となる。筋芽細胞は最終的には交替筋線維を生じるか、存在する筋線維に融合し、収縮器官成分が合成され、これにより線維周囲寸法を増加させる。このプロセスは、例えば、筋線維の退化後に哺乳類で起こるほぼ完全な再生によって説明される。即ち、筋線維の前駆細胞が増殖し、互いに融合して筋線維を再生する。
【0043】
本明細書において、「筋成長」とは線維サイズの増加及び／又は線維数の増加によって起こり得る筋肉の成長を意味する。本明細書における筋成長はＡ）湿潤重量の増加、Ｂ）タンパク含有量の増加、Ｃ）筋線維数の増加又はＤ）筋線維径の増加によって計測される。筋線維の成長の増加は、繊維径の増加として定義される。ここで、繊維径は繊維断面の楕円の短軸と定義する。
【0044】
本明細書において、「筋原性」細胞とは筋細胞又は筋線維の起源に関係がある細胞である。筋原性分化の中間又は最終ステージに対する種々の分子マーカーが知られている。例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞において、ミオシンとＭＲＦ４は筋形成の最終ステージをマークし、主に筋管に限定されるが、ミオジェニンとネスチンは筋形成の中間ステージをマークし、全ての筋管と関与する多くの筋芽細胞において見いだされる。
【0045】
本明細書において、筋肉の「萎縮」又は「消耗」とは、筋線維の周囲寸法の有意な減少を意味する。有意な萎縮とは、健全、無傷害又は正常に利用される組織に対して、不健全、有傷害又は使用されない筋組織において少なくとも１０％の筋線維径の減少を意味する。
【0046】
用語「疾患（病気）」は哺乳類の正常な健全さからの各種逸脱を意味し、病状が存在する状態だけでなく、逸脱（筋肉の機能不全や筋障害等）は起きているが、症状は未だ見られない状態も「疾患」に含まれる。
【0047】
「患者」又は「それを必要とする対象」とは、動物界に生存するメンバーであって、上に示した障害に罹っているか、罹る可能性があるメンバーを意味する。複数の実施形態において、この対象は自然にこの疾患に罹っている個体を含む種のメンバーである。複数の実施形態において、この対象は哺乳類である。哺乳類の非限定的な例としては、げっ歯類（マウス、ラット等）、霊長目（キツネザル、ガラゴ、サル、類人猿、ヒト等）、ウサギ、イヌ（コンパニオン犬、サービス犬、警察犬、軍用犬、競争犬、ショー用犬等の使役犬等）、ウマ（競争馬、使役馬等）、ネコ（飼い猫等）、家畜（ブタ、ウシ、ロバ、ラバ、バイソン、ヤギ、ラクダ、羊等）及びシカが挙げられる。複数の実施形態において、対象はヒトである。
【0048】
用語「対象」、「患者」、「個体」等は、特に限定されることを意図しておらず、一般に交換可能である。即ち、「患者」と記載された個体は必ずしも疾患を有しておらず、医学的アドバイスを求めるだけでも良い。
【0049】
本明細書と添付の請求項において、「少なくとも一の」又は「１以上の」等の表現は、それに続く要素や特性のリストを伴って現れる。用語「及び／又は」も、２以上の要素又は特性のリストにおいて発生する。それらが用いられるコンテキストによって暗黙的に或いは明確に否定されない限り、この種のフレーズは個々にリストされた要素又は特性、或いは引用された要素又は特性と他に引用された要素又は特性との組み合わせのいずれかを意味すること意図している。例えば、「Ａ及びＢの少なくとも一」、「Ａ及びＢの１以上」及び「Ａ及び／又はＢ」は各々「Ａ単独」、「Ｂ単独」又は「Ａ及びＢの両者」を意味することを意図している。同様な解釈は、３以上のアイテムを含むリストに対しても意図される。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも一」、「Ａ、Ｂ及びＣの１以上」及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」という表現はそれぞれ、「Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢと共に、ＡとＣと共に、ＢとＣと共に、ＡとＢとＣと共に」を意味することを意図している。更に、本明細書及び請求の範囲における「～基く」という表現は、記載されていない特性又は要素も許容されるように「少なくとも部分的に基づく」を意味することを意図している。
【0050】
本発明の複数の実施形態は、条件付き免疫回避能を有する幹細胞と、筋組織を修復するために該幹細胞を使用する方法とに関する。
【0051】
本発明の一実施形態は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子、ＭＩＣ－２遺伝子、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の野生型幹細胞に対して調節された発現を有する筋原性幹細胞に関する。
【0052】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の調節された発現が、野生型幹細胞に対して減じられている筋原性幹細胞に関する。
【0053】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子及びＭＩＣ－１遺伝子の発現が阻害されている筋原性幹細胞に関する。
【0054】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子が欠損している筋原性幹細胞に関する。
【0055】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種が、野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現されている筋原性幹細胞に関する。
【0056】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種が第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する筋原性幹細胞に関する。
【0057】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターにより制御される筋原性幹細胞に関する。
【0058】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子が、野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現している筋原性幹細胞に関する。
【0059】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子が第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する筋原性幹細胞に関する。
【0060】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターにより制御される筋原性幹細胞に関する。
【0061】
本発明の一実施形態は、ＣＤ４６遺伝子、ＣＤ５９遺伝子及びＣＤ５５遺伝子の少なくとも１種の野生型幹細胞に対して増加された発現を更に含む、前記筋原性幹細胞に関する。
【0062】
本発明の一実施形態は、ＣＤ４６遺伝子、ＣＤ５９遺伝子及びＣＤ５５遺伝子の各々の、野生型幹細胞に対して増加された発現を更に含む、前記筋原性幹細胞に関する。
【0063】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレル（対立遺伝子）のセーフハーバー（安全領域）部位に挿入されている筋原性幹細胞に関する。
【0064】
本発明の一実施形態は、前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む、前記筋原性幹細胞に関する。
【0065】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞は低免疫原性である、前記筋原性幹細胞に関する。
【0066】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－ＤＭＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子及びＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子の少なくとも１種の野生型幹細胞に対して低減された発現を更に含む筋原性幹細胞に関する。
【0067】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－ＤＭＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子及びＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子の少なくとも１種が欠損している筋原性幹細胞に関する。
【0068】
本発明の一実施形態は、低免疫原性幹細胞の調製方法であって、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の幹細胞における発現を低減させることと、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞において条件付き発現させることとを含み、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の発現の低減と、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現とによって低免疫原性幹細胞を得る調製方法に関する。
【0069】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＣＤ４６遺伝子、ＣＤ５９遺伝子及びＣＤ５５遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における発現を増加させることを更に含む方法に関する。
【0070】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の発現の低減が、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞のゲノムＤＮＡにおいて低減する方法に関する。
【0071】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞のゲノムＤＮＡからの欠失はエンドヌクレアーゼの使用を含む方法に関する。
【0072】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＣＤ７４遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＭＩＣ－１遺伝子及びＭＩＣ－２遺伝子の発現の低減を更に含む方法に関する。
【0073】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位へのＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の挿入を含む方法に関する。
【0074】
本発明の一実施形態は、前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む前記方法に関する。
【0075】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における条件付き発現が、第１の細胞分化ステージ中のＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の過剰発現と、第２の細胞分化ステージ中のＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の発現の第１の細胞分化ステージに対する低減とを含む方法に関する。
【0076】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における条件付き発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターの使用を含む方法に関する。
【0077】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＣＤ２４遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子及びＨＬＡ－Ｅ遺伝子の前記幹細胞における条件付き発現を更に含む方法に関する。
【0078】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＨＬＡ－ＤＭＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＯＢ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＡ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱＢ２遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＡ遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子及びＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における発現を低減することを更に含む方法に関する。
【0079】
本発明の一実施形態は、対象を治療する方法であって、前記筋原性幹細胞のいずれかを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【0080】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記対象が筋障害を患っている方法に関する。
【0081】
本発明の一実施形態は、前記筋原性幹細胞のいずれかを含む組成物に関する。
【0082】
ある実施形態において、幹細胞は筋原性幹細胞であり、他の実施形態において幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。幾つかの実施形態においては、この幹細胞は、ａ）破壊されたヒト白血球抗原－Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、分化クラスター７４（ＣＤ７４）、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、抗原プロセシング１（ＴＡＰ１）に関連するトランスポーター、マクロファージ阻害サイトカイン－１（ＭＩＣ－１）及び／又はＭＩＣ－２、ｂ）過剰発現されたＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５及び／又はＣＤ２００、及びｃ）条件付きプロモーターの制御下におけるＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＣＤ２４の各遺伝子を有する。このような幾つかの実施形態において、条件付きプロモーターはＰａｘ－７プロモーターであるが、細胞分化ステージ中のあるステージのみで活性であるいずれかのプロモーターで有り得る。より具体的には、このプロモーターは衛星細胞ステージ及び筋芽細胞ステージでは活性であるが、一旦融合した筋芽細胞が筋線維へ分化することを止める。
【0083】
本発明の一実施形態は、ヒト白血球抗原－Ａ（ＨＬＡ－Ａ）、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）、分化７４クラスター（ＣＤ７４）、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、抗原プロセッシングを伴うトランスポーター１（ＴＡＰ１）、マクロファージ阻害性サイトカイン－１（ＭＩＣ－１）、ＭＩＣ－２、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ２４、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）及び／又はＣＤ２００の各遺伝子の野生型幹細胞に対して調節された発現を有する幹細胞に関する。
【0084】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子は欠失するか、さもなければ阻害され、且つＣＤ２４、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＰＤ－Ｌ１の各遺伝子は、ある細胞分化ステージ又は所定の細胞分化ステージ中に条件付き過剰発現される幹細胞に関する。
【0085】
本発明の一実施形態は、筋肉前駆体細胞である前記幹細胞に関する。
【0086】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の各遺伝子の発現は野生型幹細胞に対して低減されている幹細胞に関する。
【0087】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の各遺伝子の発現が阻害されている幹細胞に関する。
【0088】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の各遺伝子の少なくとも１種が欠失している幹細胞に関する。
【0089】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現されている幹細胞に関する。
【0090】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＰＤ－Ｌ１遺伝子は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する幹細胞に関する。
【0091】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現が、筋肉特異的プロモーター（例えば、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター、ｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーター）によって調節される幹細胞に関する。
【0092】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現されている幹細胞に関する。
【0093】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ及び／又はＨＬＡ－Ｅの各遺伝子は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する幹細胞に関する。
【0094】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子の発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって調節される幹細胞に関する。
【0095】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の両者が野生型幹細胞に対して過剰発現されている幹細胞に関する。
【0096】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の両者が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターに関する。
【0097】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位へ挿入されている幹細胞に関する。
【0098】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、前記セーフハーバー部位がＡＡＶＳＩ部位を含む幹細胞に関する。他のセーフハーバー部位はＲＯＳＡ２６部位とＣＣＲ５部位を含む。他のセーフハーバー部位は当業者に知られているであろう。
【0099】
本発明の一実施形態は、幹細胞が多能性幹細胞又は筋原性幹細胞の一である前記幹細胞に関する。
【0100】
本発明の一実施形態は、幹細胞が低免疫原性である前記幹細胞に関する。
【0101】
本発明の一実施形態は、低免疫原性幹細胞の調製方法であって、幹細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子の発現を低減する段階と、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞において条件付き発現させる段階とを含み、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現低減とＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現によって低免疫原性幹細胞を得る方法に関する。
【0102】
本発明の一実施形態は、前記方法において、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現低減が、前記幹細胞のゲノムＤＮＡからのＢ２Ｍ遺伝子の欠失を含む方法に関する。
【0103】
本発明の一実施形態は、前記方法において、Ｂ２Ｍ遺伝子の前記幹細胞のゲノムＤＮＡからの欠失がエンドヌクレアーゼの使用を含む方法に関する。
【0104】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位へのＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の挿入を含む方法に関する。
【0105】
本発明の一実施形態は、前記セーフハーバー部位がＡＡＶＳＩ部位を含む前記方法に関する。
【0106】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、第１の細胞分化ステージ中のＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の過剰発現と、第２の細胞分化ステージ中のＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の発現の第１の細胞分化ステージに対する低減とを含む方法に関する。
【0107】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の前記幹細胞における条件付き発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターの使用を含む方法に関する。
【0108】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の両者が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現されている幹細胞に関する。
【0109】
本発明の一実施形態は、筋芽細胞融合体を発生させる方法であって、破壊されたＨＬＡ及び／又はＢＬＡ遺伝子、及びＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ２４遺伝子を有するｉＰＳＣを条件付きプロモーターの制御下で改変又は単離する段階ａ）と；ｉＰＳＣを免疫系回避能を有する衛星細胞に分化させる段階ｂ）において衛星細胞はＨＬＡ及び／又はＢＬＡの低減された発現を有し且つＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ２４の増加された発現を有することと；衛星細胞を筋芽細胞に分化させることと；この筋芽細胞を筋芽細胞融合体が形成されるように他の筋芽細胞と融合させ、筋芽細胞融合体における筋芽細胞は衛星細胞と比較して低減されたＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ２４発現を有することとを含む方法に関する。
【0110】
ある実施形態において、幹細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２；ｂ）過剰発現ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５及びｃ）ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＣＤ２４遺伝子の野生型筋原性幹細胞に対して調節された発現を有する筋原性幹細胞である。
【0111】
一実施形態は前記筋原性幹細胞であって、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２；ｂ）過剰発現ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５及びｃ）ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＣＤ２４遺伝子の野生型筋原性幹細胞に対して調節された発現を有する筋原性幹細胞に関する。
【0112】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の各遺伝子の発現が野生型幹細胞に対して低減されている筋原性幹細胞に関する。
【0113】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の各遺伝子の発現が阻害されている筋原性幹細胞に関する。
【0114】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の各遺伝子の少なくとも１種が欠失している筋原性幹細胞に関する。
【0115】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＣＤ２４の各遺伝子が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現されている筋原性幹細胞に関する。
【0116】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＣＤ２４の各遺伝子は第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＰＤ－Ｌ１遺伝子が第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する筋原性幹細胞に関する。
【0117】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＣＤ２４の各遺伝子の発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって調節される筋原性幹細胞に関する。
【0118】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現されている筋原性幹細胞に関する。
【0119】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＰＤ－Ｌ１遺伝子は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する筋原性幹細胞に関する。
【0120】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＣＤ２４遺伝子の発現がｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって調節される筋原性幹細胞に関する。
【0121】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の両者が野生型幹細胞に対して過剰発現されている筋原性幹細胞に関する。
【0122】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の両者が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって調節される筋原性幹細胞に関する。
【0123】
一実施形態は、前記筋原性幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位に挿入されている筋原性幹細胞に関する。
【0124】
一実施形態は、前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む、前記筋原性幹細胞に関する。
【0125】
一実施形態は、筋原性幹細胞が衛星細胞である、前記筋原性幹細胞に関する。
【0126】
一実施形態は、筋原性幹細胞が低免疫原性である、前記筋原性幹細胞に関する。
【0127】
本発明の一実施形態は、低免疫原性幹細胞の調製方法であって、Ｂ２Ｍ遺伝子の幹細胞における発現を低減させる段階と、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞において条件付き発現させる段階とを含み、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現の低減と、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現とによって低免疫原性幹細胞を得る調製方法に関する。
【0128】
一実施形態は、前記方法において、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現の低減が、前記幹細胞のゲノムＤＮＡからのＢ２Ｍ遺伝子の欠失を含む方法に関する。
【0129】
一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞のゲノムＤＮＡからのＢ２Ｍ遺伝子欠失がエンドヌクレアーゼの使用を含む方法に関する。
【0130】
一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位へのＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の挿入を含む方法に関する。
【0131】
一実施形態は、前記セーフハーバー部位がＡＡＶＳＩ部位を含む、前記方法に関する。
【0132】
一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、第１の細胞分化ステージ中のＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の過剰発現と、第２の細胞分化ステージ中のＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の発現の第１の細胞分化ステージに対する低減とを含む方法に関する。
【0133】
一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターの使用を含む方法に関する。
【0134】
一実施形態は、前記方法において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ２４遺伝子の両者が条件付きに発現されている方法に関する。
【0135】
ある実施形態において、幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。幾つかの実施形態において、この幹細胞は筋原性幹細胞である。幾つかの実施形態においては、この幹細胞は、ａ）破壊されたＨＬＡ及び／又はＢＬＡ遺伝子及びｂ）条件付きプロモーターの制御下におけるＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ４７遺伝子を有する。このような幾つかの実施形態において、条件付きプロモーターはＰａｘ－７プロモーターであるが、細胞分化ステージのあるステージのみで活性であるプロモーターのいずれかでも可能である。より具体的には、このプロモーターは衛星細胞ステージ及び筋芽細胞ステージでは活性であるが、一旦融合した筋芽細胞が筋線維へ分化することを止める。
【0136】
本発明の一実施形態は、β－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の野生型幹細胞に対して調節された発現を有する幹細胞に関する。
【0137】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子が欠失するか、さもなければ阻害され、且つＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子は、ある細胞分化ステージ又は所定の細胞分化ステージ中に条件付き過剰発現される幹細胞に関する。
【0138】
本発明の一実施形態は、筋肉前駆体細胞である前記幹細胞に関する。
【0139】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現が野生型幹細胞に対して低減されている幹細胞に関する。
【0140】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現が阻害されている幹細胞に関する。
【0141】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、少なくとも一のＢ２Ｍ遺伝子が欠失している幹細胞に関する。
【0142】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現している幹細胞に関する。
【0143】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＰＤ－Ｌ１遺伝子は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する幹細胞に関する。
【0144】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって制御される幹細胞に関する。
【0145】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＣＤ４７遺伝子が野生型幹細胞に対して条件付き過剰発現している幹細胞に関する。
【0146】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＣＤ４７遺伝子が第１の細胞分化ステージ中に過剰発現され、且つＰＤ－Ｌ１遺伝子は第２の細胞分化ステージ中、第１の細胞分化ステージに対して低減された発現レベルを有する幹細胞に関する。
【0147】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＣＤ４７遺伝子の発現がｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって制御される幹細胞に関する。
【0148】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の両者が野生型幹細胞に対して過剰発現されている幹細胞に関する。
【0149】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の両者が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターによって制御される幹細胞に関する。
【0150】
本発明の一実施形態は、前記幹細胞において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位に挿入されている幹細胞に関する。
【0151】
本発明の一実施形態は、前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む、前記幹細胞に関する。
【0152】
本発明の一実施形態は、幹細胞が多能性幹細胞である、前記幹細胞に関する。
【0153】
本発明の一実施形態は、幹細胞が低免疫原性である、前記幹細胞に関する。
【0154】
本発明の一実施形態は低免疫原性幹細胞の調製方法であって、幹細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子の発現を低減する段階と、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種を前記幹細胞において条件付き発現させる段階とを含み、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現低減とＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現によって低免疫原性幹細胞を得る方法に関する。
【0155】
本発明の一実施形態は、前記方法において、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現低減が、前記幹細胞のゲノムＤＮＡからのＢ２Ｍ遺伝子の欠失を含む方法に関する。
【0156】
本発明の一実施形態は、前記方法において、Ｂ２Ｍ遺伝子の前記幹細胞のゲノムＤＮＡからの欠失がエンドヌクレアーゼの使用を含む方法に関する。
【0157】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、前記幹細胞の少なくとも１種のアレルのセーフハーバー部位へのＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の挿入を含む方法に関する。
【0158】
本発明の一実施形態は、前記セーフハーバー部位はＡＡＶＳＩ部位を含む前記方法に関する。他のセーフハーバー部位はＲＯＳＡ２６部位とＣＣＲ５部位を含む。他のセーフハーバー部位は当業者に知られているであろう。
【0159】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、第１の細胞分化ステージ中のＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の過剰発現と、第２の細胞分化ステージ中のＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の発現の第１の細胞分化ステージに対する低減とを含む方法に関する。
【0160】
本発明の一実施形態は、前記方法において、前記幹細胞におけるＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の少なくとも１種の条件付き発現が、ｐａｘ７プロモーター、ｐａｘ３プロモーター、ｍｙｈ４プロモーター、Ａｎｋｒｄ１プロモーター、ｍｙｏｄ１プロモーター及びｍｙｆ５プロモーター又はｍｙｏｇプロモーターの使用を含む方法に関する。
【0161】
本発明の一実施形態は、前記方法において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子及びＣＤ４７遺伝子の両者が条件付き発現している方法に関する。
【0162】
本発明の一実施形態は、筋芽細胞融合体を発生させる方法であって、破壊されたＨＬＡ及び／又はＢＬＡ遺伝子、及びＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ４７遺伝子を有するｉＰＳＣを条件付きプロモーターの制御下で改変又は単離する段階ａ）と；ｉＰＳＣを免疫系回避能を有する衛星細胞に分化させる段階ｂ）において衛星細胞はＨＬＡ及び／又はＢＬＡの低減された発現を有し且つＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ４７の増加された発現を有することと；衛星細胞を筋芽細胞に分化させることと；この筋芽細胞を筋芽細胞融合体が形成されるように他の筋芽細胞と融合させ、筋芽細胞融合体における筋芽細胞は衛星細胞と比較して低減されたＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ４７発現を有することとを含む方法に関する。
【0163】
本発明の幾つかの実施形態は筋原性前駆細胞集団生産のための方法、組成物及びキットを含む。更に、対象の筋肉疾患又は障害（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ））の治療又は予防のための方法及び組成物も含まれる。
【0164】
本発明は、インビボ環境のニッチエリアにおいて、静止状態及び機能している局所骨格筋幹細胞として生存可能なヒトＰＡＸ７：：ＧＦＰ＋細胞の発生への新しいアプローチを提供する。
【0165】
また、これら細胞をエクスビボで維持・増殖することも提供される。これら細胞をインビボ移植すると、筋線維への融合のみならず基底層下に存在する細胞を発現する単核ＰＡＸ７になることにより筋再生に関与する可能性がある。
【0166】
筋形成は、例えば、特に胚発生中の筋組織の形成である。通常、筋線維は筋管と呼ばれる筋芽細胞の多核線維への融合体を形成する。胚の初期発生においては、筋芽細胞は増殖又は筋管への分化のいずれかが可能である。インビボで何がこの選択を制御しているかは、全体としては不明である。細胞培養中であるとすれば、細胞を取り巻く媒体に十分量の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）又は他の成長因子が存在するならば、多くの筋芽細胞が増殖することになる。この成長因子が尽きれば、筋芽細胞は分割を止めて、筋管へ最終的に分化する。筋芽細胞の分化は段階的に進む。第１ステージは細胞周期の終了と、ある遺伝子の発現開始を伴う。分化の第２ステージは筋芽細胞相互のアラインメントを伴う。ラットとヒヨコの筋芽細胞でさえ互いを認識し整列し得ることが研究で示され、これは関与する機構の進化的な保存を示唆している。第３のステージは実際の細胞融合そのものである。このステージではカルシウムイオンの存在が重要である。マウスにおいては、細胞融合はメルトリンと呼ばれるメタロプロテイナーゼのセットと他のタンパク質各種とに助長されるが、今だ検討中である。細胞融合は原形質膜へのアクチンの動員と、それに続く近接配置と、後に素早く膨張する空孔形成を伴う。
【0167】
胚発生において、体節における皮筋板及び／又は筋板は、骨格筋に進化する予定の筋原性前駆細胞を含む。皮筋板及び筋板の決定は、Ｔ－ｂｏｘファミリー、ｔｂｘ６、ｒｉｐｐｌｙ１及びｍｅｓｐ－ｂａのメンバーを含む遺伝子制御ネットワークにより制御される。骨格筋形成は、筋形成前駆細胞を筋線維へ分化させるために各種遺伝子サブセットの厳格な制御に依存する。筋形成前駆細胞は転写因子ｐａｘ３及びｐａｘ７を発現する。塩基性ヘリックスループヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、ミオゲニン及びＭＲＦ４はこの生成に重要である。ＭｙｏＤとＭｙｆ５は筋形成前駆細胞を筋芽細胞へ分化させることができ、続いてミオゲニンが筋芽細胞を筋管へ分化させる。ＭＲＦ４は筋特異的プロモーターの転写をブロックするために重要であり、これによって分化以前に骨格筋前駆細胞が成長・増殖できる。
【0168】
筋原性前駆細胞
【0169】
哺乳類成体の骨格筋は成長、訓練及び怪我等の生理学的要求に対する適応能力を示す。これら適応が起こるプロセスは成体の骨格筋に存在する少量の単核細胞に基づき、衛星細胞と称される。衛星細胞は組織選択的な筋原性幹細胞であり、自己再生可能で、筋芽細胞として知られる筋肉前駆体を生じる。筋芽細胞は骨格筋の「ビルディングブロック」となる。骨格筋線維は最後に分化し、これら多核細胞の核にＤＮＡ合成と有糸分裂の能力はない。筋線維数又は筋線維核数の増加は、筋芽細胞の増殖及び後続の分化によるものである。成体骨格筋において、衛星細胞は有糸分裂休止期に留まり、筋肉の傷害に際しては、細胞周期に再度入り、非対称細胞分割して衛星嬢細胞と一過性増幅筋芽細胞を生じる。これらは数回の分割をすることができる。分化に際しては、筋芽細胞は互いに又は既存の筋線維と融合し、更に筋肉特異的筋線維タンパク質及び収縮性タンパク質のセットの発現を開始する。休止期の筋原性衛星細胞はサルコレンマと基底層の間の陥凹に存在するため、成体の筋線維とは物理的に区別される。筋肉の傷害の際、筋原性衛星細胞の一部は前駆細胞として残る一方で、他の細胞は新たな筋線維に分化する。筋肉外傷等の刺激に応答して、筋原性前駆細胞は活性化され、増殖し、筋原性マーカーを発現する。最後に、損傷した骨格筋の再生中、これら細胞は既存の筋線維に融合、或いは互いに融合して新たな筋線維を形成する。
【0170】
本発明の幾つかの実施形態は、筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）の集団の生産方法を含む。幾つかの実施形態において、この方法は対象（例えば、骨格細胞集団）から細胞集団を得ることと、この細胞集団から多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を生産することにおいてＰＳＣ集団は胚性幹細胞（ＥＳＣ）集団であることと、このＰＳＣ集団からＭＰＣ集団を生産することとを含む。
【0171】
複数の様相において、多能性細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞（即ちＥＳＣ）である。一実施形態において、多能性細胞は非ヒトＥＳ細胞である。一実施形態において、多能性細胞は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（即ちｉＰＳＣ）である。一実施形態において、ｉＰＳ細胞は線維芽細胞から誘導される。一実施形態において、ｉＰＳＣはヒト血液細胞から誘導される。一実施形態において、多能性細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態において、多能性細胞は神経幹細胞（ＮＳＣ）である。一実施形態において、多能性細胞はエピブラスト幹細胞である。一実施形態において、多能性細胞は組織特異的幹細胞又は発生的に制限された前駆細胞である。一実施形態において、多能性細胞はげっ歯類多能性細胞である。一実施形態において、げっ歯類多能性細胞はラット多能性細胞である。一実施形態において、ラット多能性細胞はラットＥＳ細胞である。一実施形態において、げっ歯類多能性細胞はマウス多能性細胞である。一実施形態において、多能性細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【0172】
複数の様相において、ＰＳＣ集団は塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）及び／又は線維芽細胞成長因子８を含む細胞培地で培養される。
【0173】
更なる様相において、ＭＰＣは筋原性マーカーを発現し、この筋原性マーカーはペアードボックスプロテイン（ＰＡＸ７）又はＭｙｏＤを含むことができる。更に、ＭＰＣは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。
【0174】
本ＭＰＣ集団の生産方法は、ＭＰＣ集団の細胞におけるＰＡＸ７発現の増加に有効である。例えば、対照と比べ発現を少なくとも０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５又は２００％増加させることができる。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＰＡＸ７発現は少なくとも１００％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＰＡＸ７発現レベルは少なくとも１２５％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＰＡＸ７発現レベルは少なくとも１５０％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＰＡＸ７発現レベルは少なくとも５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％、又は１２００％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＰＡＸ７発現レベルは約５０％～約１２００％増加する。
【0175】
ヒトＰＡＸ７のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿００２５７５．１として公的に入手可能である。
【0176】
ヒトＰＡＸ７をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００２５８４．２として公的に入手可能である。
【0177】
マウスＰＡＸ７のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿０３５１６９．１として公的に入手可能である。
【0178】
マウスＰＡＸ７をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿０１１０３９．２として公的に入手可能である。
【0179】
本ＭＰＣ集団の生産方法は、ＭＰＣ集団の細胞におけるＭｙｏＤ発現の増加に有効である。例えば、対照と比べ発現を少なくとも０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５又は２００％増加させることができる。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＭｙｏＤ発現は少なくとも１００％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＭｙｏＤ発現レベルは少なくとも１２５％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＭｙｏＤ発現レベルは少なくとも１５０％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＭｙｏＤ発現レベルは少なくとも５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％、又は１２００％増加する。複数の実施形態において、筋原性前駆細胞集団におけるＭｙｏＤ発現レベルは約５０％～約１２００％増加する。
【0180】
ヒトＭｙｏＤのアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿００２４６９．２として公的に入手可能である。
【0181】
ヒトＭｙｏＤをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００２４７８．５として公的に入手可能である。
【0182】
マウスＭｙｏＤのアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿０３４９９６．２として公的に入手可能である。
【0183】
マウスＭｙｏＤをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿０１０８６６．２として公的に入手可能である。
【0184】
他の様相において、本ＭＰＣ集団の生産方法は、細胞集団をエクスビボで少なくとも３０日間培養及び増殖することを含む。他の様相において、細胞集団はエクスビボで少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間培養及び増殖される。
【0185】
複数の様相において、細胞集団は培養することにより、その細胞数が増大する。例えば、その数は少なくとも０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５又は２００％増加することができる。複数の実施形態において、その数は少なくとも５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％又は１２００％増加することができる。複数の実施形態において、細胞集団は培養され、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％増殖される。
【0186】
追加的な例において、ＭＰＣ集団は対象（例えば、骨格細胞）より得られる細胞の集団から生産される。他の例において、ＰＳＣ集団はｉＰＳ細胞集団である。
【0187】
本発明はまた、本明細書記載の方法に従って生産される筋原性前駆細胞の集団を提供する。
【0188】
本発明の幾つかの実施形態は、必要とする対象における筋疾患又は障害の予防又は治療の方法を含む。更なる実施形態において、本方法は本明細書記載の方法に従って生産される筋原性前駆細胞集団の有効量を対象に投与することを含む。例えば、筋疾患又は障害の予防又は治療の方法は、生産された筋原性前駆細胞（ＭＰＣ）の集団を投与することにおいて、細胞集団を対象（例えば、骨格細胞集団）から得ることと；この細胞集団から多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を生産することにおいて、ＰＳＣ集団は胚性幹細胞（ＥＳＣ）集団であることと；ＰＳＣ集団からＭＰＣ集団を生産することとを含む。
【0189】
複数の実施形態において、筋疾患又は障害は退化的筋消耗障害又は筋体積損失を含む。幾つかの実施形態において、筋疾患は筋ジストロフィー又は筋消耗疾患である。筋ジストロフィーの例としては、デュシェンヌ筋ジストロフィーやベッカー筋ジストロフィー、肢ガードル型筋ジストロフィー、肩甲骨上腕骨性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、エメリー－ドレフュス筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、ミヨシミオパチー、ウルリッヒ先天性筋ジストロフィー、シュタイナート筋ジストロフィーが挙げられる。
【0190】
複数の実施形態において、筋ジストロフィーはデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含む。
【0191】
複数の様相において、細胞は対象における筋疾患（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）の開始前に単離される。他の様相において、細胞は対象における筋疾患（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）の開始後に単離される。
【0192】
複数の様相において、対象に投与する以前に細胞を培養して、細胞数を増大させる。複数の様相において、細胞集団は培養されることにより、その細胞数を増大する。例えば、その数は少なくとも０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５又は２００％増加することができる。複数の実施形態において、その数は少なくとも５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％又は１２００％増加することができる。複数の実施形態において、細胞集団は培養され、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％増殖される。
【0193】
複数の実施形態おいて、必要とする対象における初期筋原性マーカーのレベルを増加する方法が提供される。複数の実施形態において、本方法は本明細書記載の方法に従って生産される筋原性前駆細胞集団の有効量を対象に投与することを含む。
【0194】
他の実施形態において、筋疾患又は障害（例えば、デュシェンヌ筋ジストロフィー）のための本治療法は、本明細書記載の方法に従って生産される筋原性前駆細胞集団を対象に投与することと、症状の発症を制御する方法を組み合わせて含む。特に、この組み合わせ治療はコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロンやデフラザコート）、β２アゴニスト（例えば、サルブタノール（例えば、アルブテノール）の投与を含むことができる。更に、組み合わせ療法は、穏やかで気持ち良い運動（例えば水泳）、理学療法、矯正装具（添木や車いす等）、適切な呼吸補助手段を含むことができる。
【0195】
本発明の幾つかの実施形態は、筋原性前駆細胞を生産するためのキットを含む。複数の実施形態において、このキットは細胞培地、即ち多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団又は筋原性幹細胞集団の培養に適した細胞培地を含む。
【0196】
これら実施形態において、各種の代替試薬（例えば、コーティング剤や細胞分散試薬、刺激剤、分化剤、培地等の培養試薬）を用いることができる。ＰＳＣ、ＥＳ細胞及びｉＰＳＣ等の培養のために特定の試薬セットは必要でない。しかし、非限定的な例を以下に示す。
【0197】
複数の実施形態において、本キットはヒトｉＰＳ細胞及びｈＥＳ細胞の成長と増殖のための培地を含む。
【0198】
複数の実施形態において、本キットはＥＳ及び／又はｉＰＳ細胞の選択及び／又はパスのための試薬を含む。複数の実施形態において、この試薬はＲｅＬｅＳＲ（登録商標）パッシング試薬（ステムセルテクノロジーズ、カナダ・バンクーバー、カタログ番号：０５８７２又は０５８７３）である。複数の実施形態において、この試薬はｍＴｅＳＲ（登録商標）１（ステムセルテクノロジーズ、カナダ・バンクーバー、カタログ番号：８５８５０又は８５８５７）である。複数の実施形態において、この試薬はＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ＸＦ（登録商標）（ステムセルテクノロジーズ、カナダ・バンクーバー、カタログ番号；０７１８０又は０７１９０）である。複数の実施形態において、この試薬はＧｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（ステムセルテクノロジーズ、カナダ・バンクーバー、カタログ番号；０７１７４）である。多くのプレートコーティング試薬及びＥＳ／ｉＰＳＣ媒体は商業的に入手可能で、当業者に知られているであろう。複数の実施形態において、いかなるプレートコーティング試薬も使用できる。複数の実施形態において、このコーティング試薬はコーニング社（ニューヨーク、ＮＹ、米国）のＭａｔｒｉｇｅｌである。
【0199】
複数の実施形態において、本キットは１種以上の細胞分散酵素を含む試薬を含む。複数の実施形態において、この試薬はＴｒｙｐＬＥ（登録商標）細胞分散試薬（サーモフィシャー、カタログ番号：Ａ１２８５９０１）である。複数の実施形態において、この試薬はＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィシャーＳＫＵ、Ｎｏ：１２６０４－０１３）である。複数の実施形態において、この試薬はＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞分散試薬（サーモフィシャー、カタログ番号：Ａ１１１０５０１）である。種々の分散試薬が当業界で知られており使用できる。複数の実施形態において、培養表面（例えばプレート）から細胞を物理的に削り落とすことができる。
【0200】
複数の実施形態において、本キットは塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）及び／又は線維芽細胞成長因子８を含む。
【0201】
複数の実施形態において、本キットの細胞培地はＰＳＣ集団の培養に適している。
【0202】
複数の実施形態において、本キットの細胞培地は、それぞれ約５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％又は０．５％の血清を含む。複数の実施形態において、本キットはそれぞれ約５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％又は０．５％の血清或いはそれ以下の血清の使用のための構成されている。
【0203】
複数の実施形態において、本キットの細胞培地は、血清を含まない細胞培地である。
【0204】
複数の実施形態において、本キットは血清を含まない。
【0205】
前述のように、幹細胞に基づく細胞療法のための２種の主たるバリアーは、受容者の免疫系による拒絶のリスク及び／又は腫瘍形成のリスクとなる。
【0206】
これを克服するために、本発明は低免疫原性衛星細胞発生に対する免疫回避の方法を提供する。低免疫原性衛星細胞発生方法の一例は、親幹細胞ドナー株においてＣｒｉｓｐＲ／ｃａｓ９系を使用して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ７４、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ２、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＨＬＡ－ＤＲＢ５、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及び／又はＭＩＣ－２の発現を不活性化することを含む。これら発現物は、主な組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩの重要成分である。ＭＨＣクラスＩを欠乏する細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に認識され標的とされる。ＮＫ細胞は先天的リンパ球であり、細胞毒性分子を放出することによって自己性喪失（missing-self）認識を介してＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）をダウンレギュレートする細胞を死滅させる。しかし、ＮＫ細胞はレセプターＮＫＧ２Ｄ及びキラー細胞イムノグロブリン様レセプター（ＫＩＲ）を発現する。これらレセプターは、活性化された場合には、それぞれＮＫ細胞活性を活性化又は阻害し、細胞毒性分子を放出する。ＭＩＲ－１及びＭＩＲ－２はＮＫＧ２Ｄと相互作用してＮＫ細胞の細胞毒性放出を活性化する一方、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤ－Ｌ１は細胞毒性分子放出をブロックするＫＩＲと相互作用する。従って、ＭＩＣ－１及びＭＩＣ－２を欠き、表面にＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現している親ドナー細胞株から誘導される衛星細胞に基づく方法を採用した。この方法は、ＭＩＣ－１及びＭＩＣ－２を欠乏し、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ及び／又はＰＤ－Ｌ１を発現している低免疫原性細胞間の相互作用に際して、ＮＫ細胞からの細胞毒性放出を防止する。
【0207】
外来細胞の生着にネガティブな影響を与えうる他のプロセスは、マクロファージに媒介されるファゴサイトーシス（貪食）である。マクロファージは表面にＳＩＲＰαを発現しており、ＳＩＲＰαはマクロファージファゴサイトーシスの阻害的レセプターとなる。ＳＩＲＰαは、don't eat me シグナル表面のＣＤ２４分子との相互作用で活性化される
。そこで、親ドナー株から誘導される衛星細胞が表面にＣＤ２４を発現しているという追加的な方法を設計した。ランダムな統合とトランスジーン発現への位置効果を避けるため、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ２４をＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に打ち込む。ｐａｘ７：ｍｙｏｄ１融合プロモーターをＰＤ－Ｌ１及びＣＤ２４の前面に挿入して、衛星細胞にこれら因子のみを発現させた。このように、仮に衛星細胞が骨格筋以外の非筋肉系統に分化すると、これら細胞はｐａｘ７：ｍｙｏｄ１不活性化によってＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現をダウンレギュレートし、ＮＫ細胞やマクロファージによってより認識されやすくなる。
。そこで、親ドナー株から誘導される衛星細胞が表面にＣＤ２４を発現しているという追加的な方法を設計した。ランダムな統合とトランスジーン発現への位置効果を避けるため、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ２４をＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に打ち込む。ｐａｘ７：ｍｙｏｄ１融合プロモーターをＰＤ－Ｌ１及びＣＤ２４の前面に挿入して、衛星細胞にこれら因子のみを発現させた。このように、仮に衛星細胞が骨格筋以外の非筋肉系統に分化すると、これら細胞はｐａｘ７：ｍｙｏｄ１不活性化によってＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現をダウンレギュレートし、ＮＫ細胞やマクロファージによってより認識されやすくなる。
【0208】
Ｔ細胞による適合性免疫認識を回避するために、Ｂ２Ｍを欠失させる。細胞をＮＫ細胞から守るため、ｐａｘ７：ｍｙｏｄ１融合プロモーターでＣＤ２４を過剰発現させる。更に、マクロファージの貪食を阻害するため、ｐａｘ７：ｍｙｏｄ１融合プロモーターでＣＤ２４を過剰発現させる。
【0209】
ヒトＨＬＡ－Ｇのアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿００１３５０４９６として公的に入手可能である。
【0210】
ヒトＨＬＡ－Ｇをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００１３６３５６７として公的に入手可能である。
【0211】
ヒトＣＤ２４のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿０３７３６２として公的に入手可能である。
【0212】
ヒトＣＤ２４をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿０１３２３０として公的に入手可能である。
【0213】
ヒトＨＬＡ－Ｅのアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿００５５０７として公的に入手可能である。
【0214】
ヒトＨＬＡ－Ｅをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００５５１６として公的に入手可能である。
【0215】
ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿００１１５６８８４として公的に入手可能である。
【0216】
ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００１１６３４１２として公的に入手可能である。
【0217】
ヒトＣＤ２００のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＰ＿００５９３５．４として公的に入手可能である。
【0218】
ヒトＣＤ２００をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００５９４４．７として公的に入手可能である。
【0219】
ヒトＣＤ４６のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号 ＮＰ＿００２３８０．３として公的に入手可能である。
【0220】
ヒトＣＤ４６をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿００２３８９．４として公的に入手可能である。
【0221】
ヒトＣＤ５５のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号 ＮＰ＿０００５６５．１として公的に入手可能である。
【0222】
ヒトＣＤ５５をコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿０００５７４．５として公的に入手可能である。
【0223】
ヒトＣＤ５９のアミノ酸配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号 ＮＰ＿９７６０７５．１として公的に入手可能である。
【0224】
ヒトをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにて登録番号ＮＭ＿２０３３３０．２として公的に入手可能である。
【0225】
実施例
【0226】
【0227】
図１のＡ～Ｄは、本発明の一実施形態に従ってどのように免疫回避が達成されるかを概略的に示す。図１Ａは、正常で無変化の細胞がＭＨＣ１と潜在的にＭＨＣ２を発現することを示している。ＭＨＣ１とＭＨＣ２は共に適合性免疫応答の一部としてＴ細胞に認識されて、Ｔ細胞が介在する細胞破壊が起こる。図１Ｂは、ＭＨＣ１及びＭＨＣ２が欠失している場合、Ｔ細胞が細胞を認識できないことを示している。図１Ｃは、ＭＨＣ１及びＭＨＣ２の不在がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による自己性喪失認識と共に、先天的免疫応答の一部としてのマクロファージに基づくファゴサイトーシスを招くことを示している。図１Ｄは免疫調節因子ＣＤ２００、ＣＤ２４、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｇ／Ｅの発現で、ＮＫ細胞とマクロファージが阻害されることで先天的免疫の活性化が低減され、その結果免疫耐性となることを示している。
【0228】
図２は、本発明の一実施形態に従った遺伝子変化による方法と免疫性における役割を概略的に示す。図２は、ＣＤ７４、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＣＢ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＭＩＣ－１及びＭＩＣ－２の１種以上の遺伝子が欠失／阻害されていること；ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９の１種以上の遺伝子が過剰発現されていること；及びＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４及びＣＤ２００の１種以上の遺伝子が、組織特異的プロモ－ターを介して条件付き過剰発現されていることを示している。アスタリスク付きの遺伝子は、幾つかの実施形態においてクローキング（即ち、免疫回避）に必要な遺伝子を表す。
【0229】
図３のＡ～Ｃは、本発明の一実施形態に従う免疫調節因子の筋肉特異的な過剰発現を示す。図３Ａにおいて、筋肉特異的融合プロモーター（ＰＡＸ７：ＭＹＯＧ）は特異的免疫調節遺伝子ＨＬＡ－Ｇ／Ｅ、ＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を助長する。図３Ｂにおいて、筋原性幹細胞から分化した筋原性細胞はＣＤ２４、ＨＬＡ－Ｇ／Ｅ及びＰＤ－Ｌ１を発現し、ＣＤ２４、ＨＬＡ－Ｇ／Ｅ及び／又はＰＤ－Ｌ１の条件付き発現を経由して精製される。図３Ｃにおいて、筋芽細胞は融合して新たな（de novo）筋線維を生じるか、或いはホストに存在する筋線維と融合する。非筋細胞は筋肉特異的プロモーターを発現しないため、免疫調節因子ＨＬＡ－Ｇ／Ｅ、ＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１は、ホスト生来の免疫系（ＮＫ細胞及びマクロファージ）に細胞を認識させ、破壊標的とさせる。
【0230】
本明細書で詳述した各実施形態は、発明をどのように実施するかを当業者に教示することのみを目的とする。発明の実施形態の説明において、わかりやすさのために具体的な用語を使用している。しかしながら、本発明はこのように選択された具体的用語に限定することを意図していない。上述の本発明の実施形態は、本発明の範囲を逸脱することなく上の教示に照らし当業者に認識されるように、改変や変形が可能である。更に、上では詳細に述べていないものの、本発明の一実施形態と関連して記載された特徴は他の実施形態と合わせて使用することができる。従って、本発明の請求項及び均等の範囲において、本発明は具体的に記載された以外の別な方式で実施可能であると理解されたい。追加的なヒト幹細胞発生方法は米国特許出願第２０１８／０３６０８８７号に開示されており、この特許出願全体を、本発明を構成するものとしてここに援用する。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】