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特表2023-502276ＰＮＡＧを含む微生物に対する持続的治療を提供するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-23
(54)【発明の名称】ＰＮＡＧを含む微生物に対する持続的治療を提供するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20230116BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230116BHJP
A61K 39/385 20060101ALI20230116BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230116BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 Q
A61P31/00
A61K39/395 N
A61K39/385
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022529715
(86)(22)【出願日】2020-11-20
(85)【翻訳文提出日】2022-07-19
(86)【国際出願番号】 US2020061594
(87)【国際公開番号】W WO2021102320
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】62/994,130
(32)【優先日】2020-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/939,331
(32)【優先日】2019-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522172759
【氏名又は名称】アロペックス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ａｌｏｐｅｘｘ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ワイアンド，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】スウィス，ジェラルド エフ
【テーマコード（参考）】
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085AA14
4C085AA27
4C085BB24
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE03
4C085GG01
(57)【要約】
オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む抗菌ワクチンを開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微生物感染に対する持続的防御を提供する方法であって、治療有効量のモノクローナル抗体Ｆ－５９８および式Ｉ：（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは３～１２個のβ－（１→６）－グルコサミン（炭水化物リガンド）基またはそれらの混合物を含み、前記ワクチンの前記オリゴ糖部分は以下の式Ａ：
【化1】
Ｂはリンカーであり；
ここで、Ａは上記で定義されたとおりであり、Ｃは破傷風トキソイドであり；
ｘは約３０から約３９までの整数であり；
ｙは、１から１０までの整数である）
のワクチンを前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項2】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８と同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８を投与してから約６時間以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８を投与してから約４時間以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８を投与してから約２時間以内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
Ｆ－５９８が、全処置期間中に同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記リンカーが、以下の式：【化2】
で表される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
Ｆ－５９８が、式Ｉの前記ワクチンによって、前記患者を効果的に処置するのに十分な抗体力価が生成される点まで同時投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物から患者に有効な免疫を提供するための方法であって、前記患者に、請求項７に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項10】
バイオフィルム形成を阻害する方法であって、治療有効量のモノクローナル抗体Ｆ－５９８および式Ｉ：（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは３～１２のβ－（１→６）－グルコサミン（炭水化物リガンド）基またはそれらの混合物を含み、前記ワクチンの前記オリゴ糖部分は以下の式Ａ：
【化3】
Ｂはリンカーであり；
ここで、Ａは上記で定義されたとおりであり、Ｃは破傷風トキソイドであり；
ｘは約３０から約３９までの整数であり；
ｙは、１から１０までの整数である）
のワクチンを患者に投与することを含む、方法。
【請求項11】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８と同時に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８を投与してから約６時間以内に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８を投与してから約４時間以内に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
式Ｉの前記ワクチンが、Ｆ－５９８を投与してから約２時間以内に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項15】
Ｆ－５９８が全処置期間中に同時投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項16】
前記リンカーが、以下の式：【化4】
で表される、請求項１０に記載の方法。
【請求項17】
Ｆ－５９８が、式Ｉの前記ワクチンによって、前記患者を効果的に処置するのに十分な抗体力価が生成される点まで同時投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物によって形成されるバイオフィルムに対する有効な防御を提供するための方法であって、前記患者に、請求項１６に記載のワクチンを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２２日出願の米国特許仮出願第６２／９３９，３３１号、および２０２０年３月２４日出願の同第６２／９９４，１３０号に対する優先権を主張し、当仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月２２日出願の米国特許仮出願第６２／９３９，３３１号、および２０２０年３月２４日出願の同第６２／９９４，１３０号に対する優先権を主張し、当仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ＰＮＡＧを含む微生物に対する持続的治療を提供するための方法に関する。特に、これらの方法は、ＰＮＡＧワクチンとモノクローナル抗体の組合せを利用する。モノクローナル抗体はＰＮＡＧを標的とし、そのような微生物に対する即時の治療を提供するが、一方、ＰＮＡＧワクチンは内因性免疫応答を生成し、それが有効になると、ワクチンによって生成される免疫応答が、抗体によって提供される治療の追加手段を提供する程度までモノクローナル抗体を補完する。これらの組合せにより、処置開始から持続的治療が可能になる。
【0003】
当技術分野は、オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む抗菌ワクチンを以前に開示しており、ここで、繰り返しグルコサミン単位の数は、１から最大３００までの範囲である。そのような例の１つは、米国特許仮出願第６２／８９２，４００号に提供されており、これは、通常の特許出願への転換を申請中であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0004】
これまでに生成されたデータは、これらのワクチンが、細胞壁にそのＮ－アセチルバージョンを含むそのようなオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を含む微生物に対する防御免疫を与えることを示している。しかし、接種後、処置を受けた患者では約４週間以上後に有効な免疫が始まる。この潜伏期間中、患者は微生物感染のリスクがある。このことは、この潜伏期間中に微生物感染をすでに経験しているか、または発症する重大なリスクがある患者にとって特に面倒である。
【0005】
微生物感染に対する即時の防御を必要とする患者を処置するために、細胞壁がオリゴ糖Ｎ－アセチル－β－（１→６）－グルコサミン構造を含む微生物を標的とするモノクローナル抗体が開発された。これらのモノクローナル抗体は、そのような微生物に対して有効性を示しており、注射後即時の抗菌防御を提供する。そのようなモノクローナル抗体の１つは、米国特許第７，７８６，２５５号に開示されているＦ－５９８であり、この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その抗体は、ＰＮＡＧのいくつかのＮ－アセチルグルコサミン基に結合すると認識されている。このモノクローナル抗体の単回投与によって与えられる有効性は、通常、注射後約４週間程度までの範囲である。
【0006】
しかし、即時および長期の免疫防御を必要とする患者、特に微生物感染を経験している患者またはそのような感染のリスクがある患者の処置には問題がある。これらには、高齢患者、火傷患者、未熟児、化学療法または放射線療法を受けている患者、およびその他の関連する状態が含まれる。しかし、主治医がモノクローナル抗体による能動的防御期間中にワクチンを投与した場合、モノクローナル抗体の少なくとも一部がワクチンのオリゴ糖構造と交差反応して、ワクチンとモノクローナル抗体の両方の効果を低下させるかまたは無効にするリスクがあるという懸念がある。
【0007】
したがって、この問題を回避するには、ワクチンを投与する前に、患者がモノクローナル抗体の存在に起因する能動免疫をもはや有していないことを確認する必要がある。さらに、ワクチン接種後の有効な免疫の達成には固有の遅延があるため、患者をモノクローナル抗体療法からワクチン接種によって提供される免疫防御に切り替えるには、かなりのインキュベーション期間が必要であり、その場合、患者には感染のリスクがあるか、または感染が、代替の、場合により効果の低い処置方法に委ねられる。ワクチン接種から生じる自然免疫は、モノクローナル抗体によって提供される免疫よりも持続可能であるため、そのような自然免疫の利点は、ワクチン接種に大いに有利となる。
【0008】
したがって、モノクローナル抗体とワクチン接種の両方を使用する場合、患者に持続的免疫防御を提供するための必要性が継続している。
【発明の概要】
【0009】
本発明は、モノクローナル抗体Ｆ－５９８が、ＰＮＡＧ系微生物の処置のために本明細書に開示されるワクチンに対する補完療法として機能することができるという発見に基づいている。したがって、本発明は、オリゴ糖β－（１→６）－グルコサミンワクチンおよびＦ－５９８モノクローナル抗体の同時投与により、ＰＮＡＧ系微生物に対する持続的免疫防御を提供するための方法に関する。一態様では、ワクチンは、特定のクラスのテトラ－、ペンタ－、およびヘキサβ－（１→６）－グルコサミン連結－破傷風トキソイドワクチンに関し、これらのワクチンは、微生物感染に対して患者に有効な免疫を提供し、前記微生物は、その細胞壁にＰＮＡＧ構造を含む。
【0010】
驚くべきことに、これらのワクチンは内因性免疫応答を生成するが、ワクチンのオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基はＦ－５９８抗体と感知できるほどには交差反応しない。この驚くべき結果により、ワクチンと抗体の両方の同時投与が可能になる。そのような同時投与によって、臨床医が患者に継続的な相補的免疫防御を提供することがさらに可能になる。いくつかの実施形態では、相補的免疫防御は相乗的である。
【0011】
したがって、一実施形態では、本発明は、微生物感染に対して患者に有効な免疫を提供するβ－（１→６）－グルコサミンオリゴ糖連結－破傷風トキソイドワクチンを含むワクチンを使用することにより、ＰＮＡＧ微生物に対する持続的免疫防御を提供する方法であって、前記微生物は、その細胞壁にβ－（１→６）－グルコサミン構造を含む、方法を提供する。一実施形態では、ワクチンに対する抗体は、β－（１→６）－グルコサミン構造に結合する。いくつかの実施形態では、前記ワクチンは、Ｆ－５９８モノクローナル抗体と交差反応せず、さらに、前記オリゴ糖は、３～１２個のβ－（１→６）－グルコサミン単位を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｆ－５９８に相補的な抗体を生成する。ここで、本明細書に開示されるワクチンは、β－（１→６）－グルコサミン構造に選択的に結合し、Ｆ－５９８は、アセチル化β－（１→６）－グルコサミン構造、すなわち、Ｎ－アセチルグルコサミンに選択的に結合する。
【0012】
一実施形態では、本発明は、細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を含む微生物に対するワクチンを提供し、ここで、前記ワクチンは、式Ｉ：
（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは３～１２のβ－（１→６）－グルコサミン（炭水化物リガンド）基またはそれらの混合物を含み、ワクチンの前記オリゴ糖部分は、以下の式：
（Ａ－Ｂ）ｘ－Ｃ Ｉ
（式中、Ａは３～１２のβ－（１→６）－グルコサミン（炭水化物リガンド）基またはそれらの混合物を含み、ワクチンの前記オリゴ糖部分は、以下の式：
【0013】
【化1】
Ｂは、式：
【0014】
【化2】
ここで、Ａは上記で定義されたとおりであり、Ｃは破傷風（ｔｅｔａｔｕｓ）トキソイドであり；
ｘは約３０から約３９までの整数であり；
ｙは、１から１０までの整数である）
で表される。
【0015】
一実施形態では、本発明は、細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を含む微生物に対するワクチンを提供し、ここで、前記ワクチンは、式ＩＩ：
（Ａ’－Ｂ）ｘ－Ｃ ＩＩ
（式中、Ａ’は、以下の式のペンタ－β－（１→６）－グルコサミン（炭水化物リガンド）基であり：
（Ａ’－Ｂ）ｘ－Ｃ ＩＩ
（式中、Ａ’は、以下の式のペンタ－β－（１→６）－グルコサミン（炭水化物リガンド）基であり：
【0016】
【化3】
で表される。
【0017】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される希釈剤と、有効量の式Ｉおよび／または式ＩＩのワクチンとを含む医薬組成物を提供する。
【0018】
一実施形態では、本発明は、細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物から患者に免疫を提供するための方法であって、前記患者に、式Ｉおよび／または式ＩＩの前記ワクチンを投与することを含む、方法を提供する。
【0019】
一実施形態では、本発明は、細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物から患者に有効な免疫を提供するための方法であって、前記患者に、本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0020】
本発明の代表的なワクチンを以下の表に示す。
【0021】
【化4】
【0022】
【表1】
【0023】
実施形態では、本発明は、細胞壁にオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む微生物から患者に免疫を提供するための方法であって、前記患者に、式Ｉおよび／または式ＩＩの前記ワクチンを、モノクローナル抗体Ｆ－５９８と同時に投与することを含む、方法を提供する。
【0024】
本明細書で使用される「同時に」は、前記ワクチンの投与前または投与中を含むことができる。いくつかの実施形態では、同時は、Ｆ－５９８を投与してから約±６時間以内、または±４時間以内、または±２時間以内の、式Ｉおよび／または式ＩＩのワクチンの投与を含み得る。実施形態では、この２つは、同じボーラス注射の一部として投与することができる。患者が個々の構成成分に基づいて免疫応答を開始することができる限り、投与は「同時」である。Ｆ－５９８と式ＩまたはＩＩのワクチンを投与する順序は重要ではない。同時投与は、２時間または６時間以外の任意の期間に対応することができるが、抗体の両セット（Ｆ－５９８からのものとワクチンから生成されたもの）が重複する期間、それぞれの標的に対し有効に抗体カバレッジを提供している限り、同時であり得る。
【0025】
理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示される方法は、Ｆ－５９８抗体および式ＩおよびＩＩのワクチンから生成される抗体のそれぞれの選択性のために、相補的かつ相乗的である。Ｆ－５９８は微生物の細胞壁ＰＮＡＧ構造のＮ－アセチルリッチ領域に特異的に結合することが見出されており、これは、"Structural basis for antibody targeting of the broadly expressed microbial polysaccharide poly-N-acetyl glucosamine," J. Biol. Chem. 293(14) 5079-5089 (2018)に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。式ＩおよびＩＩのワクチンは、ＰＮＡＧ細胞壁構造の非Ｎ－アセチル化領域に選択性を提供する。いくつかの実施形態では、抗体の両方の集団の存在は、交差反応性を最小限に抑え、ＰＮＡＧを有する細胞壁構造を有する微生物に対する完全な防御を提供し得る。
【0026】
いくつかの実施形態では、Ｆ－５９８は、全処置期間中に同時投与される。
【0027】
いくつかの実施形態では、Ｆ－５９８は、式Ｉおよび／または式ＩＩのワクチンによって、患者を効果的に処置するのに十分な抗体力価が生成される時点までのみ同時投与される。ワクチンによってそのような十分な抗体が産生される期間の後、Ｆ－５９８の投与を終了してもよい。
【0028】
いくつかの実施形態では、Ｆ－５９８は、ワクチンによって生成された抗体の十分な力価が測定された直後に、終了してもよい。実施形態では、Ｆ－５９８は、ワクチンによって生成された抗体の十分な力価が測定された１週間後に、終了してもよい。実施形態では、Ｆ－５９８は、ワクチンによって生成された抗体の十分な力価が測定された２週間後に、終了してもよい。実施形態では、Ｆ－５９８は、ワクチンによって生成された抗体の十分な力価が測定された１か月後に、終了してもよい。当業者は、患者の特定の状態／容態によって決定され得る正確な期間を理解するであろう。
【0029】
いくつかの実施形態では、式Ｉおよび／または式ＩＩの前記ワクチンの投与は、１～３回の投与のレジメンを含み得る。例えば、一部の患者では、１回の投与で十分な場合がある。一部の患者では、２回の投与が必要になる場合がある。一部の患者では、３回の投与が必要になる場合がある。投与回数に寄与し得る要因の中には、患者の年齢および状態があり得る。免疫系が新たに形成された非常に若い患者には、複数回の投与が必要になる場合がある。同様に、免疫系が低下している高齢の患者は、複数回の投与が必要になる場合がある。
【0030】
いくつかの実施形態では、処置レジメンは、Ｆ－５９８の枯渇および／または抗体力価に基づくワクチンの追加投与の必要性についての患者のモニタリングを含む。例えば、火傷の犠牲者は、創傷部位での抗体の分泌のために、Ｆ－５９８の追加投与を必要とする場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、抗体の血清濃度を、処置レジメン全体を通して適切な力価を維持するために定期的に評価する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
本発明は、免疫原性タンパク質に連結された３～１２個のグルコサミン単位を有するオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基を含む抗菌ワクチンを提供する。
【0033】
本発明をより詳細に説明する前に、以下の用語を最初に定義する。本明細書で使用される用語が定義されていない場合、それは一般的に受け入れられている科学的または医学的意味を有する。
【0034】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定する意図はない。本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形も含むことが意図される。
【0035】
「適宜の」または「適宜に」とは、その後に説明される事象または状況が発生してもよく、または発生しなくてもよいことを意味し、説明には、この事象または状況が発生する例および発生しない例が含まれる。
【0036】
数値指定の前に「約」という用語が使用される場合、例えば、温度、時間、量、濃度、および範囲を含むその他のものは、（＋）または（－）１０％、５％、１％、またはその間のいずれかの部分範囲もしくは部分値だけ変動し得る近似値を示す。好ましくは、用量に関して使用される場合の「約」という用語は、用量が＋／－１０％変動し得ることを意味する。
【0037】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、組成物および方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するために使用される場合、「から本質的になる」とは、述べられた目的のために、組合せにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求された発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない他の材料または工程を除外しないであろう。「からなる」とは、微量元素を超える他の成分および実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【0038】
「β－（１→６）－グルコサミン単位」または「グルコサミン単位」という用語は、以下のような個々のグルコサミン構造を指す：
【0039】
【化5】
【0040】
【化6】
【0041】
「Ｎ－アセチル基を有するβ－（１→６）－グルコサミン単位」という用語は、以下の構造を指す：
【0042】
【化7】
【0043】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、破傷風トキソイドを本明細書に開示されるオリゴ糖ドメインに共有結合させる手段として機能する任意の有機断片を指す。当業者に知られている任意の好適なリンカーを使用することができるが、一般に、そのようなリンカーは、容易に切断できず、トキソイド構造への付着からオリゴ糖を分離させるように選択される。例えば、リンカーは、米国特許第４，６７１，９５８号；同４，８６７，９７３号；同５，６９１，１５４号；同５，８４６，７２８号；同６，４７２，５０６号；同６，５４１，６６９号；同７，１４１，６７６号；同７，１７６，１８５号；または同７，２３２，８０５号に開示されているリンカーの１つであり得、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。リンカーは、一般に、任意の数の介在するヘテロ原子、特に窒素、硫黄、および酸素を含むＣ２～Ｃ２０アルキレン（ａｌｋｙｅｎｅ）断片を含み得る。炭素原子は、アルキル、オキソなどで置換してもよい。オリゴ糖還元末端では、リンカーは、アノマー中心でＮ、Ｏ、またはＳ連結を介して付着することができるが、Ｃ連結も可能である。トキソイド末端で、リンカーを、トキソイド上のヘテロ原子に連結することができる。いくつかの実施形態では、連結は、トキソイドのアミン官能基を介している。いくつかのそのような実施形態では、リンカーを、トキソイドアミノ基にアミド結合を形成することによって付着させる。オリゴ糖末端の付着点とトキソイド末端の付着点の間に介在する原子は、オリゴ糖の抗原性を妨げない構造を有するのに有益である可能性があるが、一般にほとんど重要性がない。いくつかの実施形態では、リンカーはまた、分岐鎖であってもよく、それにより、リンカーを介して、トキソイド上の単位アミノ基ごとに２つ以上のオリゴ糖が付着することが可能になる。
【0044】
「β－（１→６）－グルコサミン基を含むオリゴ糖」という用語は、「β－（１→６）－グルコサミン構造」を含むオリゴ糖を含む細胞壁の一部を模倣するワクチン上のその基を指す（以下に定義されているように）。
【0045】
「β－（１→６）－グルコサミン構造を含むオリゴ糖」という用語は、微生物の細胞壁に見られる構造を指す。微生物壁には、多くの微生物系統にわたって保存されているこれらの構造が多数含まれている。これらの構造は微生物の細胞壁に見られ、それらの単位の大部分がβ－（１→６）－グルコサミンであるオリゴ糖が含まれる。
【0046】
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、細胞壁にβ－（１→６）－グルコサミン構造を有するオリゴ糖を含む任意の微生物に対して有効な免疫を提供する本発明の化合物（式ＩおよびＩＩ）の能力を指す。したがって、単一の細菌に対してワクチン接種する古典的なワクチンとは異なり、本明細書に記載のワクチンは、本明細書に記載のオリゴ糖構造を有する任意の微生物に対して有効な免疫を提供することができる。このような微生物には、そのような微生物がβ－（１→６）－グルコサミン構造を含むそのようなオリゴ糖を有する場合、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、抗生物質耐性細菌（例えば、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、真菌などが含まれるが、これらに限定されない。
【0047】
本明細書で使用される「有効な免疫」という用語は、微生物感染を処置、予防、または改善するのに十分なインビボでの抗体応答を生成する、有効量のワクチンの能力を指し、前記微生物は、その細胞壁にβ－（１→６）－グルコサミンを含むオリゴ糖を含有する。抗体応答を評価するためのアッセイは、当技術分野では従来のものであり、微生物に応答する抗体の力価を評価するアッセイを含む。
【0048】
本発明のワクチンおよび中間体（「化合物」）は、溶媒和物、特に水和物として存在し得る。化合物または化合物を含む組成物の製造中に水和物が形成される場合があり、または化合物の吸湿性のために水和物が時間とともに形成される場合がある。本発明の化合物は、とりわけＤＭＦ、エーテル、およびアルコール溶媒和物を含む、有機溶媒和物としても存在し得る。特定の溶媒和物の同定および調製は、合成有機または医薬品化学の当業者の技能の範囲内にある。
【0049】
「対象」とは、哺乳動物を指す。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト動物の哺乳動物であり得る。
【0050】
対象における疾患もしくは障害の「処置する」または「処置」とは、１）素因がある、または疾患もしくは障害の症状をまだ示していない対象において、疾患もしくは障害が発生するのを予防すること；２）疾患もしくは障害を阻害すること、またはその発症を阻止すること；あるいは３）疾患もしくは障害を改善することまたは疾患もしくは障害の退縮を引き起こすことを指す。
【0051】
「有効量」とは、対象を苦しめている疾患または障害を処置するのに、またはそのような疾患もしくは障害が前記対象もしくは患者に生じるのを予防するのに十分な、本発明のワクチンの量を指す。
【0052】
「持続的免疫防御」という用語は、その力価がＦ－５９８抗体、ワクチンによって生成されたポリクローナル抗体のみ、または両方の組合せを含むかどうかにかかわらず、患者が血清中に抗体の治療力価を有することを意味する。
【0053】
一般的な合成方法
本発明の化合物は、以下の一般的な方法および手順を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的または好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられている場合、特に明記しない限り、他のプロセス条件も使用することができることが理解されよう。最適な反応条件は、使用する特定の反応物または溶媒によって異なる場合があるが、そのような条件は、当業者が定型的な最適化手順によって決定することができる。
本発明の化合物は、以下の一般的な方法および手順を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的または好ましいプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられている場合、特に明記しない限り、他のプロセス条件も使用することができることが理解されよう。最適な反応条件は、使用する特定の反応物または溶媒によって異なる場合があるが、そのような条件は、当業者が定型的な最適化手順によって決定することができる。
【0054】
さらに、当業者には明らかであるように、ある特定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために、従来の保護基が必要な場合がある。種々の官能基に好適な保護基、ならびに特定の官能基を保護および脱保護するための好適な条件は、当技術分野において周知である。例えば、多数の保護基は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999、およびそこに引用されている参考文献に記載されている。
【0055】
以下の反応の出発物質は、一般に既知の化合物であるか、または既知の手順もしくはその明らかな改変によって調製することができる。例えば、出発材料の多くは、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、Ｅｍｋａ－Ｃｈｅｍｃｅ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）などの市販の業者から入手可能である。その他のものは、Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-15 (John Wiley, and Sons, 1991)、Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5, and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989)、Organic Reactions, Volumes 1-40 (John Wiley, and Sons, 1991)、March's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley, and Sons, 5th Edition, 2001)、およびLarock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)、などの標準的な参照テキストに記載されている手順またはその明らかな変更によって調製してもよい。
【0056】
本発明の代表的な化合物の合成
本発明のワクチンの一般的な合成は当技術分野で公知であり、米国特許出願第１０／７１３，７９０号ならびに米国特許第７，７８６，２５５号および第８，４９２，３６４号に開示されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「低汚染抗菌ワクチン」と題する同時係属中の米国特許出願第６２／９３４，９２５号に開示されているように、オリゴ糖をトキソイドにコンジュゲートさせる前に、トキソイド自体を精製して、段階的濾過によって低レベルの汚染物質を含めることができる。要約すると、トキソイドを、最初に段階的濾過によって精製し、ダイマートキソイドよりも高次のオリゴマーのトキソイドを除去する。モノマーおよびダイマーは、濾液を通過する。次に、低分子量不純物を、モノマーおよびダイマートキソイドを単離する小さなフィルターで分離し、小さな分子量の不純物が濾液とともに通過できるようになる。このようにして、主にモノマーおよびダイマートキソイドを含むコンジュゲートワクチンの良好な収量が良好な収量で調製される。
本発明のワクチンの一般的な合成は当技術分野で公知であり、米国特許出願第１０／７１３，７９０号ならびに米国特許第７，７８６，２５５号および第８，４９２，３６４号に開示されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、「低汚染抗菌ワクチン」と題する同時係属中の米国特許出願第６２／９３４，９２５号に開示されているように、オリゴ糖をトキソイドにコンジュゲートさせる前に、トキソイド自体を精製して、段階的濾過によって低レベルの汚染物質を含めることができる。要約すると、トキソイドを、最初に段階的濾過によって精製し、ダイマートキソイドよりも高次のオリゴマーのトキソイドを除去する。モノマーおよびダイマーは、濾液を通過する。次に、低分子量不純物を、モノマーおよびダイマートキソイドを単離する小さなフィルターで分離し、小さな分子量の不純物が濾液とともに通過できるようになる。このようにして、主にモノマーおよびダイマートキソイドを含むコンジュゲートワクチンの良好な収量が良好な収量で調製される。
【0057】
本明細書に記載の特定のワクチンの場合、β－（１→６）－グルコサミン基は、４～６単位、好ましくは５単位に制限される。リンカー基の形成は、限定されないが、米国特許第８，４９２，３６４号および以下の実施例に見られるものに例示される、当技術分野で認められている合成技術によって達成される。一実施形態では、アグリコンの第１の部分は、還元性β－（１→６）－グルコサミン単位に付着し、以下の式ＩＩＩ：
【0058】
【化8】
に示されるように、チオール（－ＳＨ）基を保持する。
【0059】
リンカーの第２の部分を、式ＩＶに示されるように、以下の方式で破傷風トキソイドに付着させる。
【0060】
【化9】
【0061】
この式では、破傷風トキソイドの別個の部分は波線で示されており、本質的に例示にすぎず、トキソイドの完全な構造を提供することを意図していない。二硫化物ブリッジは、部分を接続する１本の線で表される。明確にするために、リンカーの単一の第２の部分のみが示されるが、トキソイド上に見られるアミノ基に共有結合した複数のそのような第２の部分がある。
【0062】
リンカーの第１の部分と第２の部分とがカップリング条件下で化合すると、チオエーテル結合が形成される。反応は、生成された酸を除去するために、適宜塩基の存在下で不活性希釈剤中で行われる。チオエーテル結合は、リンカーの第１の部分と第２の部分を接続し、それによって、ｙが本明細書で定義されているワクチン構造について、以下に示すように、組合せリンカーを介して、破傷風トキソイドのオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン基への共有結合を提供する。
【0063】
【化10】
【0064】
破傷風（ｔｅｎｔａｔｕｓ）トキソイドに付着したβ－（１→６）－グルコサミン基－リンカー－部分の数は、そのような部分の所望の量がトキソイドに結合するように化学量論的に制御され、それにより、本発明のワクチンを提供することが理解される。
【0065】
方法、有用性および医薬組成物
本発明の組合せで使用されるワクチンは、細胞壁にＰＮＡＧオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を有し、前記オリゴ糖の最大約２０％がＮ－脱アセチル化されている、微生物に対して有効な免疫応答を開始することができる。患者への接種後、約４週間後に効果的な免疫応答が発生する。これにより、予防的または治療的にワクチンが無効になる潜伏期間が生じる。ワクチンが予防的に投与され、潜伏期間が許容可能である場合、本発明のワクチンは、問題の微生物がＰＮＡＧを含む細胞壁を有するその後の微生物感染を予防するのに有用である。
本発明の組合せで使用されるワクチンは、細胞壁にＰＮＡＧオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を有し、前記オリゴ糖の最大約２０％がＮ－脱アセチル化されている、微生物に対して有効な免疫応答を開始することができる。患者への接種後、約４週間後に効果的な免疫応答が発生する。これにより、予防的または治療的にワクチンが無効になる潜伏期間が生じる。ワクチンが予防的に投与され、潜伏期間が許容可能である場合、本発明のワクチンは、問題の微生物がＰＮＡＧを含む細胞壁を有するその後の微生物感染を予防するのに有用である。
【0066】
そのように使用される場合、本発明のワクチンは、そのような微生物から生じる微生物感染のリスクのある患者に投与される。そのような患者には、一例としてのみであるが、高齢者、火傷患者、特に体全体に２０％以上の範囲の火傷を負っている患者、待機手術を受ける患者、微生物感染が発生している目的地に旅行する患者などが含まれる。ワクチンは通常、免疫応答を強化するために好適なアジュバントとともに、免疫能力のある患者に筋肉内投与される。潜伏期間が経過した後、患者はそのような微生物に対する自然免疫を獲得する。
【0067】
別の実施形態では、本発明のワクチンは、特に微生物感染が限局性である場合および／または生命を脅かさない場合に、治療的に使用することができる。そのような場合、本発明のワクチンは、そのような微生物から生じる微生物感染に罹患している患者に投与される。ワクチンは通常、免疫応答を強化するために好適なアジュバントとともに、免疫能力のある患者に筋肉内投与される。投与すると、約４週間以内に有効な免疫が生成される。患者がまだ感染に罹患している場合は、ワクチンから生じる自然免疫が回復を促進する。
【0068】
明らかなように、抗菌療法を、特に抗生物質耐性感染のためのワクチンと組み合わせることができれば、それは有益であろう。これにより、潜伏期間後ではなく、患者の感染の即時の治療的処置が可能になる。ＰＮＡＧに対して生成されたモノクローナル抗体は治療上有効であることが知られている。そのような例の１つは、Ｆ－５９８として指定され、米国特許第７，７８６，２５５号に開示されているモノクローナル抗体であり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0069】
本明細書に記載のワクチンとともにそのようなモノクローナル抗体を使用すると、モノクローナル抗体がＰＮＡＧに結合するように設計されているという問題が生じる。そのため、ワクチンと一緒にモノクローナル抗体を投与すると、ワクチンのポリグルコサミン部分に抗体が結合し、両方が無効になる。
【0070】
驚くべきことに、本明細書に記載のワクチンは、患者に内因性免疫応答を誘導しながら、Ｆ－５９８モノクローナル抗体とは交差反応しない。このような組合せにより、ワクチンとＦ－５９８抗体の同時投与が可能になり、これにより潜伏期間中の抗体のみに基づく即時の治療と、その後の潜伏期間後の内因性抗体産生が可能になる。これにより、ワクチンの投与と有効な免疫の発達の間の潜伏期間中に、Ｆ－５９８モノクローナル抗体により患者を処置することができる。本実施形態では、細胞壁にＰＮＡＧを発現する微生物によって媒介される感染に罹患している患者の治療的処置を、抗体を用いて直ちに開始し、一方で同時に、微生物に対する自然免疫を発達させるために、患者にワクチンを投与することができる。完全を期すために、自然免疫とは、抗原に対する免疫応答を指し、それによって、単独で、または免疫系の他の構成成分と組み合わさって、問題の微生物を殺傷する抗体を生成する。
【0071】
そのように使用される場合、本発明のワクチンは、同様の有用性を提供する薬剤について許容される投与様式のいずれかによって、治療有効量で投与される。本発明のワクチン、すなわち有効成分の実際の量は、処置される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康、使用されるワクチンの効力、投与の経路および形態、ならびに当業者に周知の他の要因などの多くの要因に依存する。
【0072】
本発明の有効量または治療有効量のワクチンは、対象の症状または生存の延長を改善するために十分な力価の抗体をもたらすその量のワクチンを指す。そのようなワクチンの毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。
【0073】
本明細書に記載のワクチンは、典型的には、一例としてのみであるが、アジュバント、安定剤、防腐剤などを含む、当技術分野で周知の１つまたは複数の従来の成分を含む注射用滅菌水性組成物として投与される。
【0074】
同様に、Ｆ－５９８モノクローナル抗体は、同様の有用性を提供する薬剤について許容される投与様式のいずれかによって、治療有効量で投与される。抗体の実際の量は、処置される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康、投与の経路および形態、ならびに当業者に周知の他の要因などの多くの要因に依存する。
【0075】
本発明の有効量または治療有効量のワクチンは、対象の症状または生存の延長を改善するために十分な力価の抗体をもたらすその量の抗体を指す。抗体は、好ましくは、一例としてのみであるが、防腐剤などを含む、当技術分野で周知の１つまたは複数の従来の成分を含む注射用滅菌水性組成物として静脈内投与される。
【0076】
いくつかの実施形態では、処置される患者は火傷患者である。そのような患者は、火傷から体液が滲出することが知られており、そのような体液には抗体が含まれている。したがって、時間の経過とともに、抗体、特にＦ－５９８の力価が低下し、患者の抗体濃度が最適以下になる。このような場合、Ｆ－５９８に対する患者の抗体力価を監視し、必要に応じてＦ－５９８の定期投与または持続的投与によって調整することが好ましい。
【0077】
実施形態では、バイオフィルムを発症するリスクのある患者を処置する方法が提供され、この方法は、Ｆ－５９８抗体とともに本明細書に開示されるワクチンの組合せを患者に投与することを含む。実施形態では、方法は、バイオフィルムを発症するリスクのある患者を特定することを含み得る。このような患者集団には、膝または股関節の置換、ステントまたはカテーテルなどのある種の外科的移植を受けている患者が含まれるが、これらに限定されない。
【0078】
実施形態では、バイオフィルムを発症するリスクのある患者を処置する方法は、任意の手術の前にＦ－５９８抗体を投与することを含み得る。いくつかのそのような実施形態では、投与は、手術の少なくとも２４時間前、または手術の少なくとも７２時間前、または手術の少なくとも１週間前、または手術の少なくとも２週間前に行ってもよい。患者が緊急手術を迫られている場合、Ｆ－５９８抗体は手術の直前または手術中に投与することができる。バイオフィルムを発症するリスクのある患者の処置において、ＰＮＡＧワクチンを、Ｆ－５９８抗体と同時にまたは順次に投与することができる。順次に投与する場合、ＰＮＡＧワクチンは、Ｆ－５９８抗体の投与から２４時間以内に投与されることが好ましい。
【0079】
組合せ
本発明の組合せは、主治医によって好適であるとみなされる他の治療化合物または他の適切な薬剤と組み合わせて使用することができる。選択された場合において、本発明の組合せは、細菌感染を処置するための抗生物質、抗真菌剤などと同時に投与することができる。抗生物質の場合、適切な抗生物質または抗生物質のカクテルの選択および患者に投与する量は、問題の細菌の詳細、細菌感染の程度、年齢、体重、その他の患者の相対的な健康状態に基づいて、十分に主治医のスキルの範囲内にある。抗真菌療法の場合、有効量の抗真菌薬を同時に患者に投与することができる。
本発明の組合せは、主治医によって好適であるとみなされる他の治療化合物または他の適切な薬剤と組み合わせて使用することができる。選択された場合において、本発明の組合せは、細菌感染を処置するための抗生物質、抗真菌剤などと同時に投与することができる。抗生物質の場合、適切な抗生物質または抗生物質のカクテルの選択および患者に投与する量は、問題の細菌の詳細、細菌感染の程度、年齢、体重、その他の患者の相対的な健康状態に基づいて、十分に主治医のスキルの範囲内にある。抗真菌療法の場合、有効量の抗真菌薬を同時に患者に投与することができる。
【0080】
本発明のワクチンは、患者の抗原に対する免疫応答を増強する抗原とともに投与することができる。アジュバントとしては、ゲル、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物、およびフロイント完全または不完全アジュバント（例えば、抗原がパラフィン油エマルジョン中の安定化水の水相に組み込まれている）が挙げられるが、これらに限定されない。明らかなように、パラフィン油は、スクアレン油またはピーナッツ油などの他のタイプの油に置き換えることができる。アジュバント特性を備えた他の材料としては、ＢＣＧ（弱毒化結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））リン酸カルシウム、レバミゾール、イソプリノシン、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、レンチナン、百日咳毒素、リピドＡ、サポニン、ＱＳ－２１およびペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、および免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例としてＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。希土類塩、例えば、ランタンおよびセリウムをアジュバントとして使用することもできる。使用されるアジュバントの量は、処置される対象および使用される特定の抗原に依存し、当業者が容易に決定することができる。
【実施例】
【0081】
本発明は、純粋に例示的であることが意図される本発明の以下の実施例を参照することによってさらに理解される。本発明は、本発明の単一の態様の例示としてのみ意図される例示された実施形態によって範囲が限定されない。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内である。本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、前述の説明および付随する図から当業者には明らかであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入る。
【0082】
以下の用語が本明細書で使用され、以下の意味を有する。定義されていない場合、略語には従来認識されている定義がある。
Å＝オングストローム
ａｑ．＝水溶液
Ｂｉｏｔａｇｅ＝Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｄｉｖ． Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ
ｂｐ＝沸点
ＣＡＤ＝帯電エアロゾル検出器
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ｄｅｇ＝度
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｅｑ．＝当量
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＦＥＰ＝フッ素化エチレンプロピレン
ｇ＝グラム
Ｈ１－ＮＭＲ＝プロトン核磁気共鳴
ｈ＝時間
ＨＤＰＥ＝高密度ポリエチレン
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ＝アセトニトリル
ｋｇ＝キログラム
ｍｂａｒ＝ミリバール
ＭｅＯＨ＝メタノール
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル濃度
ｍｍｏｌ＝ミリモル
Ｎ＝規定度
ＮＢＳ＝Ｎ－ブロモスクシンイミド
ＮＩＳ＝Ｎ－ヨードスクシンイミド
ＮＭＴ＝Ｎ－メチルトリプタミン
ＰＰ＝ポリプロピレン
ｑＨＮＭＲ＝定量的プロトン核磁気共鳴
ＲＢＦ＝丸底フラスコ
ＲＯ＝逆浸透
ＳＥＣ ＨＰＬＣ＝サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ
ＳＩＭ＝二次イオン質量
ＴＣＥＰ＝（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＯＴｆ＝メタンスルホン酸、１，１，１－トリフルオロ－、トリメチルシリルエステル
ＴＴ＝破傷風トキソイド
μＬ＝マイクロリットル
μｍ＝ミクロン
ｗ／ｗ＝重量対重量
ｗ／ｖ＝重量対体積
［実施例１］
Å＝オングストローム
ａｑ．＝水溶液
Ｂｉｏｔａｇｅ＝Ｂｉｏｔａｇｅ、Ｄｉｖ． Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ
ｂｐ＝沸点
ＣＡＤ＝帯電エアロゾル検出器
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ｄｅｇ＝度
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｅｑ．＝当量
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＦＥＰ＝フッ素化エチレンプロピレン
ｇ＝グラム
Ｈ１－ＮＭＲ＝プロトン核磁気共鳴
ｈ＝時間
ＨＤＰＥ＝高密度ポリエチレン
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ＝アセトニトリル
ｋｇ＝キログラム
ｍｂａｒ＝ミリバール
ＭｅＯＨ＝メタノール
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル濃度
ｍｍｏｌ＝ミリモル
Ｎ＝規定度
ＮＢＳ＝Ｎ－ブロモスクシンイミド
ＮＩＳ＝Ｎ－ヨードスクシンイミド
ＮＭＴ＝Ｎ－メチルトリプタミン
ＰＰ＝ポリプロピレン
ｑＨＮＭＲ＝定量的プロトン核磁気共鳴
ＲＢＦ＝丸底フラスコ
ＲＯ＝逆浸透
ＳＥＣ ＨＰＬＣ＝サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ
ＳＩＭ＝二次イオン質量
ＴＣＥＰ＝（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＯＴｆ＝メタンスルホン酸、１，１，１－トリフルオロ－、トリメチルシリルエステル
ＴＴ＝破傷風トキソイド
μＬ＝マイクロリットル
μｍ＝ミクロン
ｗ／ｗ＝重量対重量
ｗ／ｖ＝重量対体積
［実施例１］
【0083】
破傷風トキソイド段階的濾過
モノマーおよびダイマートキソイドを含む粗破傷風トキソイド調製物の試料を、最初に３～５ミクロンフィルターに通して、高次オリゴマーを除去する。これは、段階的にフィルター孔径を縮小させて実施することができる。したがって、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。あるいは、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に４ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。５ミクロンの濾過の有効性は、高次オリゴマーの存在を検出するために使用できる光散乱技術によって評価される。必要に応じて、段階的な濾過を追加して、さらに高次のオリゴマーを除去する。得られた濾液には、モノマーおよびダイマートキソイドが含まれている。オリゴ糖の付着の化学的性質が完全に精製された後、濾液を２．５ミクロンのフィルターに通し、フィルターケーキとしてモノマーおよびダイマートキソイドを分離し、一方、低分子量の不純物は濾液とともに通過する。各濾過工程（高分子量および低分子量）で、フィルターケーキのすすぎを実施することができる。
モノマーおよびダイマートキソイドを含む粗破傷風トキソイド調製物の試料を、最初に３～５ミクロンフィルターに通して、高次オリゴマーを除去する。これは、段階的にフィルター孔径を縮小させて実施することができる。したがって、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。あるいは、トキソイド調製物を、５ミクロンフィルター、次に４ミクロンフィルター、次に３ミクロンフィルターに通すことができる。５ミクロンの濾過の有効性は、高次オリゴマーの存在を検出するために使用できる光散乱技術によって評価される。必要に応じて、段階的な濾過を追加して、さらに高次のオリゴマーを除去する。得られた濾液には、モノマーおよびダイマートキソイドが含まれている。オリゴ糖の付着の化学的性質が完全に精製された後、濾液を２．５ミクロンのフィルターに通し、フィルターケーキとしてモノマーおよびダイマートキソイドを分離し、一方、低分子量の不純物は濾液とともに通過する。各濾過工程（高分子量および低分子量）で、フィルターケーキのすすぎを実施することができる。
【0084】
一実施形態では、トキソイドにオリゴ糖β－（１→６）－グルコサミン構造を付着させる前に、主にモノマーおよびダイマーおよび３％未満の小分子量不純物を含有するようにトキソイドを調製することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６２／９３４，９２５を参照のこと。
［実施例２］
［実施例２］
【0085】
ＴＴモノマーへのＳＢＡＰの付着
工程１：Ｎ－ＢＡＢＡの調製：
工程１：Ｎ－ＢＡＢＡの調製：
【0086】
【化11】
【0087】
工程２：ＳＢＡＰの調製：
【0088】
【化12】
【0089】
あるいは、ＳＢＡＰは、米国特許第５，２８６，８４６号に記載される方式で調製することができ、この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、そこに記載される方法は、以下の合成スキームによって提供される。
【0090】
【化13】
【0091】
工程３：コンジュゲーション
上記のように、精製ＴＴモノマーは、遊離アミンアッセイによって定量化されるように、４３個のリジン残基／モルを含有する。ＴＴモノマーと濃度を０から１７０モル当量まで増加させたＳＢＡＰとの反応により、ＳＢＡＰの１５～１１０モル当量の範囲で遊離アミン含有量が対応して減少した。定常状態の変換は、＞１１０当量のＳＢＡＰを充填することにより達成した。遊離アミンの損失がＳＢＡＰリンカーの負荷に正比例すると仮定すると、飽和時のリンカー密度は４３モルのＳＢＡＰ／ＴＴモノマーであると推定された。リンカーＴＴ／モノマー中間体のモノマー／凝集体含有量および各滴定点でのタンパク質濃度も評価した。リンカー添加前のモノマー含有量は９９．７％であり、ＳＢＡＰリンカーの量を増加させても、モノマーレベルは大幅に変化しなかった（凝集体は検出されなかった）。また、滴定工程全体でのタンパク質の回収も同様であった。この集合的なデータに基づいて、周囲温度で１時間の１１０モル当量のＳＢＡＰの値を、その後のすべての合成の適切な反応条件として選択した。
［実施例３］
上記のように、精製ＴＴモノマーは、遊離アミンアッセイによって定量化されるように、４３個のリジン残基／モルを含有する。ＴＴモノマーと濃度を０から１７０モル当量まで増加させたＳＢＡＰとの反応により、ＳＢＡＰの１５～１１０モル当量の範囲で遊離アミン含有量が対応して減少した。定常状態の変換は、＞１１０当量のＳＢＡＰを充填することにより達成した。遊離アミンの損失がＳＢＡＰリンカーの負荷に正比例すると仮定すると、飽和時のリンカー密度は４３モルのＳＢＡＰ／ＴＴモノマーであると推定された。リンカーＴＴ／モノマー中間体のモノマー／凝集体含有量および各滴定点でのタンパク質濃度も評価した。リンカー添加前のモノマー含有量は９９．７％であり、ＳＢＡＰリンカーの量を増加させても、モノマーレベルは大幅に変化しなかった（凝集体は検出されなかった）。また、滴定工程全体でのタンパク質の回収も同様であった。この集合的なデータに基づいて、周囲温度で１時間の１１０モル当量のＳＢＡＰの値を、その後のすべての合成の適切な反応条件として選択した。
［実施例３］
【0092】
オリゴ糖の合成
ビルディングブロックの合成
以下の反応スキームは、以下に詳述される化合物３、５および８を調製するために使用される合成工程について説明する。
ビルディングブロックの合成
以下の反応スキームは、以下に詳述される化合物３、５および８を調製するために使用される合成工程について説明する。
【0093】
【化14】
【0094】
化合物Ｄの合成．
市販の１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－Ｄ－グルコピラノシド、すなわち化合物Ｃ（１２０．６ｇ、２５２．６ｍｍｏｌ）およびトルエン（２００ｍＬ）を、１Ｌのビュッヒフラスコに入れ、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を蒸発させ、発泡体を得た。トルエン（２００ｍＬ）をフラスコに充填し、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を、乾燥するまで再び蒸発させた。結晶性固体が形成され、壁に固着した。ジクロロメタン（８００ｍＬ）をフラスコに入れ、溶解するまで周囲で回転させ；得られた暗褐色の溶液を５Ｌのジャケット付き反応器に充填し、フラスコを追加のジクロロメタン（２００ｍＬ）ですすいで反応させた。加熱／冷却ジャケットを２０℃に設定し、反応器の内容物を機械的に撹拌した。エタンチオール（４０ｍＬ、５４０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、容器に加え、フラスコを５０ｍｌのジクロロメタンですすいで容器に入れた。三フッ化ホウ素ジエチルジエチルエーテラート（５０ｍＬ、３９０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、反応器に加え、ジクロロメタン（５０ｍＬ）ですすぎ、容器に加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応を、ＴＬＣによって残留Ｃについてチェックした。移動相は、トルエン：酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）、生成物Ｒｆ約０．４５、Ｃ Ｒｆ約０．３、ＵＶ可視化、であった。かなりの量のＣが存在する場合、反応時間を延長する必要があった。
市販の１，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－Ｄ－グルコピラノシド、すなわち化合物Ｃ（１２０．６ｇ、２５２．６ｍｍｏｌ）およびトルエン（２００ｍＬ）を、１Ｌのビュッヒフラスコに入れ、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を蒸発させ、発泡体を得た。トルエン（２００ｍＬ）をフラスコに充填し、溶解するまで４０℃で回転させた（＜５分）。溶媒を、乾燥するまで再び蒸発させた。結晶性固体が形成され、壁に固着した。ジクロロメタン（８００ｍＬ）をフラスコに入れ、溶解するまで周囲で回転させ；得られた暗褐色の溶液を５Ｌのジャケット付き反応器に充填し、フラスコを追加のジクロロメタン（２００ｍＬ）ですすいで反応させた。加熱／冷却ジャケットを２０℃に設定し、反応器の内容物を機械的に撹拌した。エタンチオール（４０ｍＬ、５４０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、容器に加え、フラスコを５０ｍｌのジクロロメタンですすいで容器に入れた。三フッ化ホウ素ジエチルジエチルエーテラート（５０ｍＬ、３９０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、反応器に加え、ジクロロメタン（５０ｍＬ）ですすぎ、容器に加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応を、ＴＬＣによって残留Ｃについてチェックした。移動相は、トルエン：酢酸エチル（３：１、ｖ／ｖ）、生成物Ｒｆ約０．４５、Ｃ Ｒｆ約０．３、ＵＶ可視化、であった。かなりの量のＣが存在する場合、反応時間を延長する必要があった。
【0095】
撹拌は、高速に設定して、４Ｍ 酢酸ナトリウム水溶液（１．２５Ｌ、５１００ｍｍｏｌ）を加えた。相を３０分間よく混合した。水層のｐＨをディップスティックでチェックし、約ｐＨ＝７であることを確認した。撹拌を止め、反応混合物を７０分間放置した。
【0096】
層を分離して収集した。有機層（下層、１．２Ｌ）およびエタノール（８４０ｍＬ、１４４００ｍｍｏｌ）を、反応器に充填した。ジャケットを６０℃に設定し、大気圧下で溶媒蒸留した（ジクロロメタンｂｐ ４０℃およびエタンチオールｂｐ ３５℃、氷浴中の受けフラスコ）。蒸留が遅くなると、ジャケットの温度を７０℃に上昇させた。１３００ｍＬの留出物を収集した後、容器の内容物の試料を収集し、ジクロロメタンのエタノールに対する比を１Ｈ－ＮＭＲで測定し、１０ｍｏｌ％未満のジクロロメタンであることを確認した。より多くのジクロロメタンが存在する場合は、さらに蒸留する必要がある。追加のエタノール（４００ｍＬ）を加え、続いてＤの種結晶を加えた。ジャケットを、３０分かけて５℃に冷却した。結晶スラリーを５℃で３日間撹拌した。固体を焼結漏斗に収集し、石油エーテル（６０～８０℃）で洗浄した：１×５００ｍＬスラリー、１ｘ３００ｍＬプラグ。固体を５００ｍＬ ＲＢＦに移し、ロータリーエバポレーター（浴温４５℃）で一定重量（約４時間超）まで乾燥させて、オフホワイトの固体を得た。予想収量：約８６ｇ（Ｃから７１％）。
【0097】
化合物１の合成
無水メタノール（３３ｍＬ）を５０ｍＬの丸底フラスコに充填した。メタノール中のナトリウムメトキシド（３０％溶液、２５μＬ、０．１３５ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を周囲温度で５分間撹拌した。エチル３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－チオ－Ｄ－グルコピラノシド（化合物Ｄ）（３．０９ｇ、６．４４ｍｍｏｌ）を、添加中に固体が溶解することができる速度で、１０分にわたって少しずつ加えた（約２００ｍｇ）。反応物を周囲温度で２．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）は、化合物Ｄ（Ｒｆ＝０．９）の完全な消費および１つのより極性の高いスポットの形成を示した：Ｒｆ＝０．５。試料を採取し、ＨＰＬＣによる反応完了ＩＰＣ（０．８ｍＬのアセトニトリルおよび０．２ｍＬの水中の２．５μＬの反応混合物）にかけ、合格条件はＮＭＴ １．００面積％化合物Ｄであった。酢酸を加えた（８μＬ、０．１３９７ｍｍｏｌ）。ｐＨをディップスティックでチェックし、約ｐＨ＝５～６であることを確認した。混合物をロータリーエバポレーター（５０℃）でほぼ乾固するまで濃縮した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を加え、大部分を蒸発させた。残留物を１５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解／スラリー化し、ロータリーエバポレーターから取り出した。２ｍＬの石油エーテルを加え、混合物を周囲温度で撹拌した。結晶スラリーを一晩撹拌した。固体を焼結漏斗に収集し、ガソリン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で恒量になるまで乾燥させた。予想収量：１．９４ｇ（化合物Ｄから８５％）。
無水メタノール（３３ｍＬ）を５０ｍＬの丸底フラスコに充填した。メタノール中のナトリウムメトキシド（３０％溶液、２５μＬ、０．１３５ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を周囲温度で５分間撹拌した。エチル３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－２－Ｎ－フタルイミド－β－チオ－Ｄ－グルコピラノシド（化合物Ｄ）（３．０９ｇ、６．４４ｍｍｏｌ）を、添加中に固体が溶解することができる速度で、１０分にわたって少しずつ加えた（約２００ｍｇ）。反応物を周囲温度で２．５時間撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）は、化合物Ｄ（Ｒｆ＝０．９）の完全な消費および１つのより極性の高いスポットの形成を示した：Ｒｆ＝０．５。試料を採取し、ＨＰＬＣによる反応完了ＩＰＣ（０．８ｍＬのアセトニトリルおよび０．２ｍＬの水中の２．５μＬの反応混合物）にかけ、合格条件はＮＭＴ １．００面積％化合物Ｄであった。酢酸を加えた（８μＬ、０．１３９７ｍｍｏｌ）。ｐＨをディップスティックでチェックし、約ｐＨ＝５～６であることを確認した。混合物をロータリーエバポレーター（５０℃）でほぼ乾固するまで濃縮した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を加え、大部分を蒸発させた。残留物を１５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解／スラリー化し、ロータリーエバポレーターから取り出した。２ｍＬの石油エーテルを加え、混合物を周囲温度で撹拌した。結晶スラリーを一晩撹拌した。固体を焼結漏斗に収集し、ガソリン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で恒量になるまで乾燥させた。予想収量：１．９４ｇ（化合物Ｄから８５％）。
【0098】
化合物２の合成
化合物１（２．０４０ｇ）をピリジン（２８ｍＬ）に溶解し、溶液を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターにて約半分の体積（約１４ｍＬ）に濃縮して、黄色の溶液を得た。さらにピリジンを加え（１４ｍＬ）、同じ方式で溶液をおよそ１４ｍＬに濃縮した。溶液をアルゴン下に置き、塩化トリチル（２．２９９ｇ、１．３６当量）を加えた後、空冷式冷却管を取り付け、溶液を撹拌しながら５０℃に加熱した。４時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物１ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を１０～１５℃に冷却した。塩化ベンゾイル（１．６０ｍＬ、２．３４当量）を、反応温度を２０℃未満に保ちながら、２０分間かけて滴加した。添加が完了したら、反応物を周囲温度まで温め、少なくとも３時間撹拌した。この時点で、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１５００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、化合物１の残留モノＢｚ誘導体 合計ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を０℃に冷却し、メタノール（０．８ｍＬ）をゆっくりと加えることによってクエンチし、反応温度が２０℃未満に保たれるようにする。次に、クエンチした反応物を周囲温度に温めた。
化合物１（２．０４０ｇ）をピリジン（２８ｍＬ）に溶解し、溶液を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターにて約半分の体積（約１４ｍＬ）に濃縮して、黄色の溶液を得た。さらにピリジンを加え（１４ｍＬ）、同じ方式で溶液をおよそ１４ｍＬに濃縮した。溶液をアルゴン下に置き、塩化トリチル（２．２９９ｇ、１．３６当量）を加えた後、空冷式冷却管を取り付け、溶液を撹拌しながら５０℃に加熱した。４時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物１ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を１０～１５℃に冷却した。塩化ベンゾイル（１．６０ｍＬ、２．３４当量）を、反応温度を２０℃未満に保ちながら、２０分間かけて滴加した。添加が完了したら、反応物を周囲温度まで温め、少なくとも３時間撹拌した。この時点で、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１５００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、化合物１の残留モノＢｚ誘導体 合計ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが満たされるとすぐに、反応物を０℃に冷却し、メタノール（０．８ｍＬ）をゆっくりと加えることによってクエンチし、反応温度が２０℃未満に保たれるようにする。次に、クエンチした反応物を周囲温度に温めた。
【0099】
生成物の混合物をトルエン（２０ｍＬ）で希釈し、周囲温度で１時間撹拌した後、焼結漏斗により濾過して沈殿物を除去した。次に、トルエン溶液をクエン酸（２０％ｗ／ｗ、４×２０ｍＬ）で洗浄し、続いて飽和ＮａＨＣＯ３（９％ｗ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄すると、存在する残留クエン酸との反応はわずかであった。次に、トルエン（上）層をブライン（２０ｍＬ）で洗浄した後、ロータリーエバポレーターで４０℃の浴温で蒸発させて、黄色／オレンジ色のシロップ（６．８３３ｇ）を得た。シロップはＩＰＣにかけた（Ｈ１ ＮＭＲ、合格条件ＮＭＴ ３０ｗｔ％残留トルエン）。予想収量：約６．８３３ｇ（１４７％）。
【0100】
化合物３の合成
氷酢酸（６４８ｍＬ）および超純水（７２ｍＬ）を一緒に混合して、９０％酢酸溶液を得た。酢酸溶液の一部（７１０ｍＬ）を、撹拌棒とともに粗化合物２（１１１ｇ）に加えた。空冷冷却管をフラスコに取り付け、次に混合物を７０℃に加熱した。２は粘稠であるため、混合物は１時間２０分後にようやく完全に溶解し、その時点で撹拌を開始した。２時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物２ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが仕様を満たすとすぐに、反応物を周囲温度に冷却した。混合物を焼結漏斗に移し、沈殿したトリチルアルコール（３１．０９ｇ）をハウスバキュームを使用して濾別した。フラスコをさらに９０％酢酸（４０ｍＬ）ですすぎ、洗浄液全体を混合容器に移した。トルエン（７００ｍＬ）と水（７００ｍＬ）を加えて完全に混合した。水（下）層は濁った白い溶液であり、ｐＨについて試験した（＜２であると予想された）。水でさらに２回洗浄を繰り返した（２×７００ｍＬ；それぞれ約２．４および約３のｐＨ、無色透明溶液）。飽和ＮａＨＣＯ３（９％ｗ／ｖ、７００ｍＬ）を混合容器に加えると、わずかな反応（ガスの放出）が発生した。次に、トルエン（上）層をブライン（７００ｍＬ）で洗浄した後、ロータリーエバポレーターで４０℃の浴温にて蒸発させて、黄色／オレンジ色の固液混合物（８６ｇ）を得た。この混合物を、４００ｍＬのトルエン（３００ｍＬ＋１００ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル：トルエン（１：１、ｖ：ｖ）で平衡化されたシリカカラム（４５０ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（７９０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の４ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の８ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１２ＣＶ）
石油エーテル中の１５ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の２０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、（４ＣＶ）
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１ＣＶ）
氷酢酸（６４８ｍＬ）および超純水（７２ｍＬ）を一緒に混合して、９０％酢酸溶液を得た。酢酸溶液の一部（７１０ｍＬ）を、撹拌棒とともに粗化合物２（１１１ｇ）に加えた。空冷冷却管をフラスコに取り付け、次に混合物を７０℃に加熱した。２は粘稠であるため、混合物は１時間２０分後にようやく完全に溶解し、その時点で撹拌を開始した。２時間後、ＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；８００μＬのＭｅＣＮに５μＬ、残留化合物２ ＮＭＴ ３．００面積％）。ＩＰＣが仕様を満たすとすぐに、反応物を周囲温度に冷却した。混合物を焼結漏斗に移し、沈殿したトリチルアルコール（３１．０９ｇ）をハウスバキュームを使用して濾別した。フラスコをさらに９０％酢酸（４０ｍＬ）ですすぎ、洗浄液全体を混合容器に移した。トルエン（７００ｍＬ）と水（７００ｍＬ）を加えて完全に混合した。水（下）層は濁った白い溶液であり、ｐＨについて試験した（＜２であると予想された）。水でさらに２回洗浄を繰り返した（２×７００ｍＬ；それぞれ約２．４および約３のｐＨ、無色透明溶液）。飽和ＮａＨＣＯ３（９％ｗ／ｖ、７００ｍＬ）を混合容器に加えると、わずかな反応（ガスの放出）が発生した。次に、トルエン（上）層をブライン（７００ｍＬ）で洗浄した後、ロータリーエバポレーターで４０℃の浴温にて蒸発させて、黄色／オレンジ色の固液混合物（８６ｇ）を得た。この混合物を、４００ｍＬのトルエン（３００ｍＬ＋１００ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル：トルエン（１：１、ｖ：ｖ）で平衡化されたシリカカラム（４５０ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（７９０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の４ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の８ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１２ＣＶ）
石油エーテル中の１５ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、４ＣＶ）
石油エーテル中の２０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、（４ＣＶ）
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル：トルエン（１：１ ｖ：ｖ、１ＣＶ）
【0101】
生成物を、１４画分にわたって溶出した。ＴＬＣを使用して、画分を含有する生成物の位置を特定した。すべての画分を、ＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、１０．１４分でのＮＭＴ １．５０面積％のピークおよび１０．９４分でのＮＭＴ １．５０面積％のピーク）。ＩＰＣを満たさない画分は、化合物４への処理のために取っておいた。合わせた画分を４５℃の浴温でロータリーエバポレーターで蒸発させ、無色のシロップを得た。予想収量：約６０ｇ（７８％）。
【0102】
化合物４の合成
粗化合物３（３９．５４ｇ、約２１ｇの化合物３、約３７ｍｍｏｌを含有、３のクロマトグラフィーの直前に採取）をトルエン（７．２ｍＬ）に溶解し、乾燥ピリジン（１４．２ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ、約４．８当量）を加え、均質な溶液を得た。無水酢酸７．２ｍＬ（７６ｍｍｏｌ、約２．１当量）を加え、混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応固体の沈殿中に、この沈殿物の一部は化合物４である可能性が高かった。反応をＩＰＣ用にサンプリングし、検出された化合物３の量が＞１．００面積％である場合は、乾燥ピリジン（１．４ｍＬ、１７当量）をさらに充填し、残留化合物３が液相で≦１．００面積％になるまで反応を続けた。
粗化合物３（３９．５４ｇ、約２１ｇの化合物３、約３７ｍｍｏｌを含有、３のクロマトグラフィーの直前に採取）をトルエン（７．２ｍＬ）に溶解し、乾燥ピリジン（１４．２ｍＬ、１７６ｍｍｏｌ、約４．８当量）を加え、均質な溶液を得た。無水酢酸７．２ｍＬ（７６ｍｍｏｌ、約２．１当量）を加え、混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応固体の沈殿中に、この沈殿物の一部は化合物４である可能性が高かった。反応をＩＰＣ用にサンプリングし、検出された化合物３の量が＞１．００面積％である場合は、乾燥ピリジン（１．４ｍＬ、１７当量）をさらに充填し、残留化合物３が液相で≦１．００面積％になるまで反応を続けた。
【0103】
反応物をジクロロメタン（１１２ｍＬ）で希釈し、次に水（２．８ｍＬ）およびメタノール（２．８ｍｌ）を加えた。混合物を２５℃で３時間撹拌した。この撹拌期間は、過剰な無水酢酸をクエンチするのに十分であることが示された。混合物を、クエン酸一水和物／水２０／８０ｗ／ｗ（１１２ｍＬ）で洗浄した。水相をジクロロメタン（５０ｍＬ）で逆抽出した。逆抽出に使用されたジクロロメタンは取っておき、残りのクエン酸洗浄液から水相を逆抽出するために使用した。主なジクロロメタン抽出物を容器に戻し、水相のｐＨが≦２になるまでクエン酸洗浄プロセスを繰り返した（通常はさらに２回洗浄する）。合わせたクエン酸洗浄液を逆抽出した。次に、逆抽出物と主なジクロロメタン抽出物を合わせた。得られたジクロロメタン溶液を５％ｗ／ｖ ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）で洗浄し、ジクロロメタン相を採取し、水（１００ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン相を蒸発容器に移し、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、溶液をシロップに濃縮した。
【0104】
酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加え、撹拌しながら５５℃に加熱することにより生成物を溶解させた。石油エーテル６０－８０（２００ｍＬ）を加え、溶液を５５℃に再加熱して５分間保持した。溶液を４５℃に冷却し、種結晶（３０ｍｇ）を加え、次に撹拌しながら３時間かけて１８℃に冷却し、１８℃で少なくとも１時間保持した。結晶を濾過により収集し、酢酸エチル／石油エーテル（１／２ｖ／ｖ、６０ｍＬ）で洗浄した。減圧下で乾燥させると、化合物４（１６．０４ｇ、２から７７％）が得られた。予想収量：１６．０ｇ（化合物２から７７％）。
【0105】
化合物３．１の合成
３－アミノプロパン－１－オール（７．０１ｇ、９３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。クロロギ酸ベンジル（５．４０ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、内部反応温度を１０℃未満に保ちながら滴加した。完了したら、フラスコを室温で２時間撹拌した。ＮＭＲ分析のために取り出された試料（ＩＰＣ：２０μＬ＋０．６ｍＬ ｄ６－ＤＭＳＯ）は、クロロギ酸ベンジル試薬が消費されたことを示していた。次に、生成物の混合物をクエン酸（１０％ｗ／ｗ、２×９０ｍＬ）、水（９０ｍＬ）、およびブライン（９０ｍＬ）で洗浄した。次に、ＤＣＭ（下）層を４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させ、わずかに濁った油／液体（６．４５５ｇ）を得た。この油を酢酸エチル（７ｍＬ）に溶解し、必要に応じて４０℃に温めて沈殿した固体を溶解し、次に室温まで冷却した。石油エーテル（４ｍＬ）を種結晶と一緒に撹拌溶液にゆっくりと加え、その時点で生成物はゆっくりと結晶化し始めた。生成物の大部分が沈殿したら、石油エーテルの最後の部分（１７ｍＬ）をゆっくりと加えた（加えた全溶媒： 酢酸エチル：石油エーテル１：３、２１ｍＬ）。次に、生成物を減圧下にて濾過し、石油エーテル（５ｍＬ）で洗浄して、生成物を微細な白色の粉末（４．７２ｇ）として得た。予想収量：約４．７ｇ（６１％）。
３－アミノプロパン－１－オール（７．０１ｇ、９３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。クロロギ酸ベンジル（５．４０ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、内部反応温度を１０℃未満に保ちながら滴加した。完了したら、フラスコを室温で２時間撹拌した。ＮＭＲ分析のために取り出された試料（ＩＰＣ：２０μＬ＋０．６ｍＬ ｄ６－ＤＭＳＯ）は、クロロギ酸ベンジル試薬が消費されたことを示していた。次に、生成物の混合物をクエン酸（１０％ｗ／ｗ、２×９０ｍＬ）、水（９０ｍＬ）、およびブライン（９０ｍＬ）で洗浄した。次に、ＤＣＭ（下）層を４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させ、わずかに濁った油／液体（６．４５５ｇ）を得た。この油を酢酸エチル（７ｍＬ）に溶解し、必要に応じて４０℃に温めて沈殿した固体を溶解し、次に室温まで冷却した。石油エーテル（４ｍＬ）を種結晶と一緒に撹拌溶液にゆっくりと加え、その時点で生成物はゆっくりと結晶化し始めた。生成物の大部分が沈殿したら、石油エーテルの最後の部分（１７ｍＬ）をゆっくりと加えた（加えた全溶媒： 酢酸エチル：石油エーテル１：３、２１ｍＬ）。次に、生成物を減圧下にて濾過し、石油エーテル（５ｍＬ）で洗浄して、生成物を微細な白色の粉末（４．７２ｇ）として得た。予想収量：約４．７ｇ（６１％）。
【0106】
化合物５の合成
化合物４（１．０５ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥アセトン（１２ｍＬ、０．０６％ｗ／ｗ水）および水（３９μＬ、２．１５ｍｍｏｌ、１．３当量）に周囲温度で溶解した。次に、溶液を－１０℃に冷却した。ＮＢＳ（０．６３９ｇ、３．５９ｍｍｏｌ、２．０８当量）を一度に加えた。およそ＋７℃の発熱が予想され、次いで溶液を直ちに－１０℃に再冷却した。ＮＢＳ添加の１５分後、反応混合物をＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、合格条件 ２．００面積％未満の化合物４が残っている）。反応が完了しなかった場合、１．００当量のＮＢＳ（０．３０７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．００当量）を一度に加え、－１０℃でさらに１５分間反応を保持し、さらにＩＰＣを実行した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えることにより反応をクエンチし、冷却を停止し、以下の添加中に混合物を１０～２０℃に温めた。３～５分間撹拌した後、さらにＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加え、撹拌を５分間続けた。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、１０ｍＬ）の最終アリコートを撹拌しながら加え、続いてチオ硫酸ナトリウム（２０％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えた。混合物を２０分間１０～２０℃で撹拌し、次に固体を濾過によって収集した。容器をＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）によりフィルターパッド上ですすぎ、このすすぎ液を濾別した。次に、フィルターケーキをＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）、次に水（２５ｍＬ）で連続的にすすいだ。（まだ湿っている）フィルターケーキをＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、２ロットのＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄し、次に水（２０ｍＬ）で１回洗浄した。ジクロロメタン層を回転蒸発により乾燥させた後、６５℃で酢酸エチル（３６ｍＬ）に溶解した。次に、石油エーテル６０－８０（１０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくりと加え、混合物を４５℃に冷却し、４５℃で３０分間撹拌した。追加の石油エーテル６０－８０（２２ｍＬ）を撹拌しながら加え、撹拌混合物を２時間かけて１５℃に冷却した。生成物を濾過により収集し、石油エーテル／酢酸エチル２／１ｖ／ｖ（２０ｍＬ）で洗浄し、次に減圧下にて乾燥させて、化合物５（０．８０５ｇ、８３％収量、ＨＰＬＣによるαおよびβアノマーの合計純度は９８％であった）を得た。
化合物４（１．０５ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥アセトン（１２ｍＬ、０．０６％ｗ／ｗ水）および水（３９μＬ、２．１５ｍｍｏｌ、１．３当量）に周囲温度で溶解した。次に、溶液を－１０℃に冷却した。ＮＢＳ（０．６３９ｇ、３．５９ｍｍｏｌ、２．０８当量）を一度に加えた。およそ＋７℃の発熱が予想され、次いで溶液を直ちに－１０℃に再冷却した。ＮＢＳ添加の１５分後、反応混合物をＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、合格条件 ２．００面積％未満の化合物４が残っている）。反応が完了しなかった場合、１．００当量のＮＢＳ（０．３０７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ、１．００当量）を一度に加え、－１０℃でさらに１５分間反応を保持し、さらにＩＰＣを実行した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えることにより反応をクエンチし、冷却を停止し、以下の添加中に混合物を１０～２０℃に温めた。３～５分間撹拌した後、さらにＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加え、撹拌を５分間続けた。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％ｗ／ｖ、１０ｍＬ）の最終アリコートを撹拌しながら加え、続いてチオ硫酸ナトリウム（２０％ｗ／ｖ、５ｍＬ）を加えた。混合物を２０分間１０～２０℃で撹拌し、次に固体を濾過によって収集した。容器をＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）によりフィルターパッド上ですすぎ、このすすぎ液を濾別した。次に、フィルターケーキをＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２５ｍＬ）、次に水（２５ｍＬ）で連続的にすすいだ。（まだ湿っている）フィルターケーキをＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、２ロットのＮａＨＣＯ３（５％ｗ／ｖ、２０ｍＬ）で洗浄し、次に水（２０ｍＬ）で１回洗浄した。ジクロロメタン層を回転蒸発により乾燥させた後、６５℃で酢酸エチル（３６ｍＬ）に溶解した。次に、石油エーテル６０－８０（１０ｍＬ）を撹拌しながらゆっくりと加え、混合物を４５℃に冷却し、４５℃で３０分間撹拌した。追加の石油エーテル６０－８０（２２ｍＬ）を撹拌しながら加え、撹拌混合物を２時間かけて１５℃に冷却した。生成物を濾過により収集し、石油エーテル／酢酸エチル２／１ｖ／ｖ（２０ｍＬ）で洗浄し、次に減圧下にて乾燥させて、化合物５（０．８０５ｇ、８３％収量、ＨＰＬＣによるαおよびβアノマーの合計純度は９８％であった）を得た。
【0107】
化合物７の合成
化合物４（５００ｍｇ）および中間体３．１（２１１ｍｇ、１．２当量）を乾燥フラスコに量り入れ、トルエン（５ｍＬ）を加え、溶液をロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で濃縮した。これをもう一度繰り返した後、出発材料を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）から濃縮した。すべての溶媒を除去したら、残りの固体を減圧下にて１０分間乾燥させた。乾燥後、出発材料をアルゴン下に置き、無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）に溶解し、活性化４Å分子篩（４５０ｍｇ、ペレット状）を加えた。この時点で、ＮＩＳ試薬を高減圧下に置いて乾燥させた。１０分後、乾燥ＮＩＳ（４００ｍｇ、２．０当量）を加え、溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、ＴＭＳＯＴｆ（８μＬ、５ｍｏｌ％）をすばやく加え、これにより、溶液が赤／オレンジから濃い赤／褐色に変化した。反応温度も２２℃から２７℃に上昇した。ＴＭＳＯＴｆを加えるとすぐに、参考までにＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮ－Ｈ２Ｏ（８：２）に１０μＬ）。次に、ピリジン（２０μＬ、０．２４５ｍｍｏｌ）を加えて反応をクエンチし、周囲温度で５分間撹拌した。ＤＣＭ溶液を濾過して分子篩を除去し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（３×５ｍＬ）、ブライン（５ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４０℃浴温）で濃縮して、粗化合物７を発泡状の黄色い油（６１６ｍｇ）として得た。予想収量：約６１６ｍｇ、（９９％）。
化合物４（５００ｍｇ）および中間体３．１（２１１ｍｇ、１．２当量）を乾燥フラスコに量り入れ、トルエン（５ｍＬ）を加え、溶液をロータリーエバポレーター（４５℃の浴温）で濃縮した。これをもう一度繰り返した後、出発材料を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）から濃縮した。すべての溶媒を除去したら、残りの固体を減圧下にて１０分間乾燥させた。乾燥後、出発材料をアルゴン下に置き、無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）に溶解し、活性化４Å分子篩（４５０ｍｇ、ペレット状）を加えた。この時点で、ＮＩＳ試薬を高減圧下に置いて乾燥させた。１０分後、乾燥ＮＩＳ（４００ｍｇ、２．０当量）を加え、溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、ＴＭＳＯＴｆ（８μＬ、５ｍｏｌ％）をすばやく加え、これにより、溶液が赤／オレンジから濃い赤／褐色に変化した。反応温度も２２℃から２７℃に上昇した。ＴＭＳＯＴｆを加えるとすぐに、参考までにＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮ－Ｈ２Ｏ（８：２）に１０μＬ）。次に、ピリジン（２０μＬ、０．２４５ｍｍｏｌ）を加えて反応をクエンチし、周囲温度で５分間撹拌した。ＤＣＭ溶液を濾過して分子篩を除去し、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（３×５ｍＬ）、ブライン（５ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーター（４０℃浴温）で濃縮して、粗化合物７を発泡状の黄色い油（６１６ｍｇ）として得た。予想収量：約６１６ｍｇ、（９９％）。
【0108】
化合物８の合成
粗化合物７（１６．６ｇ）を、トルエン（２×３０ｍＬ）から、次に無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）からの蒸発によって乾燥させて、黄色の発泡体／油を生成した。次に、フラスコをアルゴン雰囲気下に置いてから、無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）および乾燥ＭｅＯＨ（２６０ｍＬ）を加え、混合物を撹拌した。次に、フラスコを０℃に冷却した。内部温度を１０℃未満に維持しながら、塩化アセチル（３．３０ｍＬ、２．０当量）を滴加した。添加が完了すると、混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。この時点でＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮに２０μＬ、残留化合物７は３面積％以下）。次にフラスコを０℃に冷却し、Ｎ－メチルモルホリン（合計７．０ｍＬが必要）を加えることにより、生成物溶液のｐＨをｐＨ６．５～７．５に調整した。生成物の混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）で洗浄した。２回目のＨ２Ｏ洗浄物は濁っており、ＴＬＣによる標的材料が含まれていたため、これをＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。次に、合わせたＤＣＭ層をブライン（８ｍＬ）で洗浄した後、４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させて、オフホワイトの発泡体／油（約１６．８ｇ）を得た。この混合物を、１４０ｍＬのトルエン（１００ｍＬ＋４０ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチルで平衡化されたシリカカラム（８５ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（１４０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
石油エーテル中の３５ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の４０ｖｏｌ％酢酸エチル（９ＣＶ）
石油エーテル中の５０ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の６０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
生成物を、１２画分にわたって溶出した。すべての画分を、ＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、２３０ｎｍでのＮＭＴ１．５０面積％の不純物ピーク）。合わせた画分を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターで蒸発させ、オフホワイトの発泡体を得、これを固化させて８をカリカリした固体（１０．４５ｇ）として得た。予想収量：１０．４５ｇ（６６％）。
［実施例４］
粗化合物７（１６．６ｇ）を、トルエン（２×３０ｍＬ）から、次に無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）からの蒸発によって乾燥させて、黄色の発泡体／油を生成した。次に、フラスコをアルゴン雰囲気下に置いてから、無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）および乾燥ＭｅＯＨ（２６０ｍＬ）を加え、混合物を撹拌した。次に、フラスコを０℃に冷却した。内部温度を１０℃未満に維持しながら、塩化アセチル（３．３０ｍＬ、２．０当量）を滴加した。添加が完了すると、混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。この時点でＩＰＣを実行した（ＨＰＬＣ；１ｍＬ ＭｅＣＮに２０μＬ、残留化合物７は３面積％以下）。次にフラスコを０℃に冷却し、Ｎ－メチルモルホリン（合計７．０ｍＬが必要）を加えることにより、生成物溶液のｐＨをｐＨ６．５～７．５に調整した。生成物の混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）で洗浄した。２回目のＨ２Ｏ洗浄物は濁っており、ＴＬＣによる標的材料が含まれていたため、これをＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。次に、合わせたＤＣＭ層をブライン（８ｍＬ）で洗浄した後、４０℃の浴温にてロータリーエバポレーターで蒸発させて、オフホワイトの発泡体／油（約１６．８ｇ）を得た。この混合物を、１４０ｍＬのトルエン（１００ｍＬ＋４０ｍＬの洗浄液）に溶解し、３カラム容積（ＣＶ）の石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチルで平衡化されたシリカカラム（８５ｇシリカ）に充填した。カラムは段階的な勾配を使用して溶出され、１ＣＶ（１４０ｍＬ）の画分を収集した。使用した勾配は次のとおりである：
石油エーテル中の３０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
石油エーテル中の３５ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の４０ｖｏｌ％酢酸エチル（９ＣＶ）
石油エーテル中の５０ｖｏｌ％酢酸エチル（４ＣＶ）
石油エーテル中の６０ｖｏｌ％酢酸エチル（３ＣＶ）
生成物を、１２画分にわたって溶出した。すべての画分を、ＩＰＣにかけた（ＨＰＬＣ、２３０ｎｍでのＮＭＴ１．５０面積％の不純物ピーク）。合わせた画分を４０℃の浴温でロータリーエバポレーターで蒸発させ、オフホワイトの発泡体を得、これを固化させて８をカリカリした固体（１０．４５ｇ）として得た。予想収量：１０．４５ｇ（６６％）。
［実施例４］
【0109】
ジスルフィドの合成（化合物１７）
【0110】
【化15】
【0111】
化合物１７
化合物１７を合成するための全体的な合成手順は、以下の合成スキームに記載される。
化合物１７を合成するための全体的な合成手順は、以下の合成スキームに記載される。
【0112】
【化16】
【0113】
化合物９の合成
化合物５（１６２０ｇ、１．１８当量）およびトルエン（１８ｋｇ）を、この順序で５０Ｌのビュッヒボウルに充填した。ボウルを、５０±１０℃に設定された水浴にて３０分間温めた。溶媒が蒸留されなくなるまで、５０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。水浴を２０±１０℃に冷却した。トリクロロアセトニトリル（７．１ｋｇ、２１当量）および乾燥ＤＣＭ（６．５ｋｇ）を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。乾燥ＤＣＭ（２５０ｇ）中の水素化ナトリウム（５．６ｇ、０．０６０当量）の懸濁液を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。ボウルの内容物を、２０±１０℃の水浴温で１～２時間回転させて混合した。化合物５を、反応中に溶解させた。ボウルの内容物をサンプリングし、反応完了ＩＰＣ（Ｈ１ ＮＭＲ、６．３５ｐｐｍ（出発材料）のトリプレットと比較して６．４２ｐｐｍ（生成物）のトリプレットピークを統合；合格条件≦５％の残留出発材料）にかけた。化合物３（１３６０ｇ、２．３５ｍｏｌ）、乾燥ＤＣＭ（１２．３ｋｇ）、粉末分子篩４Å（１３６ｇ）をこの順序で５０Ｌ反応器に充填した。反応器の内容物を２４時間混合した。反応器の内容物をシリンジフィルターでサンプリングし、カールフィッシャー（ＡＭ－ＧＥＮ－０１１、合格条件≦０．０３％ｗ／ｗ）で分析した。水分閾値に達した後（約２４時間）、反応器の内容物を０±５℃に調整した。ビュッヒボウルの内容物を、容量が許す限り反応器ヘッダーに移した。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１００ｇ、０．１８当量）の溶液を、窒素雰囲気下で反応器に充填した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。添加には１５～２０分かかった。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）をビュッヒボウルに充填し、反応器ヘッダーに移した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。反応器の内容物を０±５℃で６０分間撹拌した。反応器の内容物を、ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格基準≦５％出発物質）を使用して反応完了のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（８５ｇ、０．３６当量）を反応器に充填することにより、反応をクエンチした。反応器の内容物を、ＩＰＣ（湿潤ｐＨ紙、合格基準≧ｐＨ７）を使用してクエンチ完了のためにサンプリングした。シリカゲル（４．９ｋｇ）をビュッヒボウルに充填した。反応器の内容物を、ビュッヒボウルに移した。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。シリカゲル（１．４ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、続いてジクロロメタン（７．０ｋｇ）を使用して反応器をすすいだ。ボウルの内容物を回転させて、固体がボウルの表面に付着しないようにした。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を、シリカゲルクロマトグラフィーのために３つの部分に分割した。１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（７．８ｋｇ）および石油エーテル（２２ｋｇ）を、シリカゲルに吸着した反応混合物の１／３とともに、５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合してから、Ｂｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。カラムは３つのバッチで実行して、それぞれを以下に説明するように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
化合物５（１６２０ｇ、１．１８当量）およびトルエン（１８ｋｇ）を、この順序で５０Ｌのビュッヒボウルに充填した。ボウルを、５０±１０℃に設定された水浴にて３０分間温めた。溶媒が蒸留されなくなるまで、５０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。水浴を２０±１０℃に冷却した。トリクロロアセトニトリル（７．１ｋｇ、２１当量）および乾燥ＤＣＭ（６．５ｋｇ）を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。乾燥ＤＣＭ（２５０ｇ）中の水素化ナトリウム（５．６ｇ、０．０６０当量）の懸濁液を、窒素雰囲気下でボウルに充填した。ボウルの内容物を、２０±１０℃の水浴温で１～２時間回転させて混合した。化合物５を、反応中に溶解させた。ボウルの内容物をサンプリングし、反応完了ＩＰＣ（Ｈ１ ＮＭＲ、６．３５ｐｐｍ（出発材料）のトリプレットと比較して６．４２ｐｐｍ（生成物）のトリプレットピークを統合；合格条件≦５％の残留出発材料）にかけた。化合物３（１３６０ｇ、２．３５ｍｏｌ）、乾燥ＤＣＭ（１２．３ｋｇ）、粉末分子篩４Å（１３６ｇ）をこの順序で５０Ｌ反応器に充填した。反応器の内容物を２４時間混合した。反応器の内容物をシリンジフィルターでサンプリングし、カールフィッシャー（ＡＭ－ＧＥＮ－０１１、合格条件≦０．０３％ｗ／ｗ）で分析した。水分閾値に達した後（約２４時間）、反応器の内容物を０±５℃に調整した。ビュッヒボウルの内容物を、容量が許す限り反応器ヘッダーに移した。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１００ｇ、０．１８当量）の溶液を、窒素雰囲気下で反応器に充填した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。添加には１５～２０分かかった。乾燥ＤＣＭ（１２５０ｇ）をビュッヒボウルに充填し、反応器ヘッダーに移した。ヘッダーの内容物を反応器に排出し、添加中、反応器の内容物を０±１０℃に維持した。反応器の内容物を０±５℃で６０分間撹拌した。反応器の内容物を、ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格基準≦５％出発物質）を使用して反応完了のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（８５ｇ、０．３６当量）を反応器に充填することにより、反応をクエンチした。反応器の内容物を、ＩＰＣ（湿潤ｐＨ紙、合格基準≧ｐＨ７）を使用してクエンチ完了のためにサンプリングした。シリカゲル（４．９ｋｇ）をビュッヒボウルに充填した。反応器の内容物を、ビュッヒボウルに移した。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。シリカゲル（１．４ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、続いてジクロロメタン（７．０ｋｇ）を使用して反応器をすすいだ。ボウルの内容物を回転させて、固体がボウルの表面に付着しないようにした。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を、シリカゲルクロマトグラフィーのために３つの部分に分割した。１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（７．８ｋｇ）および石油エーテル（２２ｋｇ）を、シリカゲルに吸着した反応混合物の１／３とともに、５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合してから、Ｂｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。カラムは３つのバッチで実行して、それぞれを以下に説明するように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
【0114】
酢酸エチル（１．６ｋｇ）および石油エーテル（４．４ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、完全に混合してから、カラムから溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0115】
酢酸エチル（２５ｋｇ）および石油エーテル（２６ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0116】
酢酸エチル（３１ｋｇ）および石油エーテル（２２ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を５Ｌのガラスラボボトルに収集した。
【0117】
酢酸エチル（１６ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0118】
乾燥負荷シリカの残りの２つの部分を用意して、上記のようにカラムを繰り返した。
【0119】
カラム画分を生成物純度（ＴＬＣ［トルエン中１０％アセトン、Ｒｆ ０．５］でサンプリングして、生成物を含む画分を同定した。受け入れられたカラム画分を合わせて、１００Ｌビュッヒボウルに入れた。トルエンを使用して、受け入れられた画分容器から結晶性材料をすすいでボウルに入れた。溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。トルエン（１．７ｋｇ）をボウルに充填し、固体が溶解するまで内容物を回転させた。ｔ－ブチルメチルエーテル（４．４ｋｇ）を、２０～４０分かけてボウルに充填した。ボウルの内容物を、２０±５℃の温度で１２～２４時間回転させた。ボウルの内容物を６Ｌ ヌッチェフィルターに移し、減圧濾過によって溶媒を除去した。ｔ－ブチルメチルエーテル（６２０ｇ）をボウルに充填し、ヌッチェフィルターに移し、フィルターケーキに通した。フィルターケーキをフィルター内で風乾した後、真空オーブンに移し、３０℃の設定で減圧下にて乾燥させて残留溶媒を除去した。分析および保持のために固体をサンプリングした。固体をねじ蓋付きナルゲン容器に移し、－１５℃以下で保存した。予想収量：１．６８～１．９４ｋｇ化合物９（６５～７５％）。
【0120】
化合物１０の合成
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミド（２４１ｇ、２．２０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（３０００ｇ）中の塩化ナトリウム（３００ｇ）溶液を、５Ｌのラボボトルで調製した。水（６０００ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（１１００ｇ）の溶液を、５０Ｌの反応器で調製し、２つの部分に分配した。
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミド（２４１ｇ、２．２０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（３０００ｇ）中の塩化ナトリウム（３００ｇ）溶液を、５Ｌのラボボトルで調製した。水（６０００ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（１１００ｇ）の溶液を、５０Ｌの反応器で調製し、２つの部分に分配した。
【0121】
化合物８（３５５ｇ、０．４８６ｍｏｌ）および化合物９（６３４ｇ、１．１０当量）を、２０Ｌビュッヒボウルに充填し、続いてトルエン（１５００ｇ）を入れ、溶解するまで４０±５℃で加熱した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。トルエン（１５００ｇ）をビュッヒボウルに充填した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。乾燥ジクロロメタン（４０００ｇ）をビュッヒボウルに充填した。固体が溶解するまでボウルを回転させ、溶液をジャケット温度２０℃±５℃の５Ｌ反応器に移した。乾燥ジクロロメタン（７１０ｇ）をビュッヒボウルに充填した。ボウルを回転させてボウル表面をすすぎ、溶液を５Ｌ反応器に移した。反応器の内容物を、試薬比ＩＰＣ（Ｈ１ ＮＭＲ）のためにサンプリングした。乾燥Ｎ－ヨードスクシンイミドを窒素雰囲気下で反応器に入れ、反応器を５～１５分間撹拌した。反応器の内容物を、２０℃±３℃に調整した。乾燥ＤＣＭ（６０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（５．９４ｇ、０．０５５当量）を、内容物の温度を２０℃±３℃に維持しながら５～１５分かけて反応器に充填した。反応混合物を、２０℃±３℃で２０±３分間撹拌した。反応器の内容物を、反応完了（ＨＰＬＣ）のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（９８ｇ、２当量）を反応器に充填し、完全に混合した。上で調製したチオ硫酸ナトリウム溶液の一部の１つを５０Ｌ反応器に充填した。５Ｌの反応器の内容物を、チオ硫酸ナトリウム溶液を含有する５０Ｌの反応器に移し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。
【0122】
ＤＣＭ（５７０ｇ）を、５０Ｌ反応器からの最上層とともに５Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶の前の最下層と合わせた。最上層を別のＨＤＰＥジェリー缶に移し、収量が確認されるまで保持した。合わせた有機相（下層）を５０Ｌの反応器に入れ、続いてチオ硫酸ナトリウムの別の部分を入れ、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。最上層を、収量が確認されるまでＨＤＰＥジェリー缶に保持した。塩化ナトリウム溶液を有機相（下層）とともに５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。シリカゲル（１３００ｇ）をビュッヒボウルに充填し、ロータリーエバポレーターを取り付けた。反応器の最下層を、ビュッヒボウルに充填した。ボウルの内容物を回転させてボウルへの吸着を防ぎ、固体が蒸留されなくなるまで４０±５℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を、２つの等しい部分に分割した。シリカゲル（２００ｇ）をビュッヒボウルに充填し、続いてジクロロメタン（７００ｇ）を充填した。ボウルの内容物を回転させて、固体がボウルの表面に付着しないようにした。溶媒が蒸留されなくなるまで、ボウルを、４０±１０℃の水浴温で減圧下にて蒸発させた。ボウルの内容物を、２つの部分に分割し、前のシリカゲル試料のそれぞれに一部を加えた。
【0123】
各部分を、以下の手順を使用してシリカゲル上で独立して精製した（精製を待つ間、試料を≦１５℃以下で保存した）：１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１６．５ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。上記からの乾燥充填シリカの一部をＢｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下のように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
【0124】
酢酸エチル（６．２ｋｇ）および石油エーテル（６．６ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0125】
酢酸エチル（１９．５ｋｇ）および石油エーテル（１９．２ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0126】
酢酸エチル（１３．６ｋｇ）および石油エーテル（１２．３ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0127】
酢酸エチル（１４．２ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0128】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．９ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を、画分１１まで２０Ｌのジェリー缶に、次に５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0129】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１１．０ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0130】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１３．２ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0131】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0132】
カラム画分を、生成物純度についてサンプリングした（生成物を含む画分を同定するためのＴＬＣ）。最初の２つのカラムからの７５～９５％の面積の化合物１０である画分を、シリカゲル（４００ｇ）を充填したビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。ボウルの内容物を以下のように精製した：１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステムに設置した。酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１６．５ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。ボウルの内容物をＢｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下のように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した：
【0133】
酢酸エチル（６．２ｋｇ）および石油エーテル（６．６ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0134】
酢酸エチル（１９．５ｋｇ）および石油エーテル（１９．２ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0135】
酢酸エチル（１３．６ｋｇ）および石油エーテル（１２．３ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0136】
酢酸エチル（１４．２ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0137】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．９ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を、画分１１まで２０Ｌのジェリー缶に、次に５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0138】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）および石油エーテル（１１．０ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0139】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１３．２ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次にカラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0140】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５ＬのＨＤＰＥジェリー缶に収集した。
【0141】
３つのカラムすべてから受け入れられたカラム画分をビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：４４０～５４０ｋｇ（５２～６４％の収量）。
【0142】
化合物１１の合成
ジクロロメタンを、化合物１０（６３５ｇ、０．３４５ｍｏｌ）（ＰＮ０６９９）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで３０±１０℃で加熱した。メタノール（３．２ｋｇ）をボウルに充填した。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。内容物の温度を０±１０℃に維持しながら、ジクロロメタン（６６０ｇ）中の塩化アセチル（５４．１ｇ、２当量）を、ボウルに充填した。ボウルの内容物を２０±３℃に調整し、混合物を４０～４８時間撹拌した。ボウルの内容物を、反応完了ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。Ｎ－メチルモルホリン（１３９ｇ、４当量）をボウルに充填し、完全に混合した。ボウルの内容物を、クエンチ完了ＩＰＣ（ｐＨ紙、合格≦ｐＨ７）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。酢酸エチル（４．８ｋｇ）および水（５．５ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、回転させてボウルの内容物を溶解させた。ボウルの内容物を、５０Ｌの反応器に移し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。ＨＤＰＥジェリー缶の最下層を、酢酸エチル（１．５ｋｇ）を入れた５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出し、収量が確認されるまで保持した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：５１８～６３３ｋｇ（９０～１１０％の収量）。
ジクロロメタンを、化合物１０（６３５ｇ、０．３４５ｍｏｌ）（ＰＮ０６９９）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで３０±１０℃で加熱した。メタノール（３．２ｋｇ）をボウルに充填した。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。内容物の温度を０±１０℃に維持しながら、ジクロロメタン（６６０ｇ）中の塩化アセチル（５４．１ｇ、２当量）を、ボウルに充填した。ボウルの内容物を２０±３℃に調整し、混合物を４０～４８時間撹拌した。ボウルの内容物を、反応完了ＩＰＣ（ＨＰＬＣ、合格）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、０±３℃に調整した。Ｎ－メチルモルホリン（１３９ｇ、４当量）をボウルに充填し、完全に混合した。ボウルの内容物を、クエンチ完了ＩＰＣ（ｐＨ紙、合格≦ｐＨ７）のためにサンプリングした。ボウルの内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。酢酸エチル（４．８ｋｇ）および水（５．５ｋｇ）をビュッヒボウルに充填し、回転させてボウルの内容物を溶解させた。ボウルの内容物を、５０Ｌの反応器に移し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。ＨＤＰＥジェリー缶の最下層を、酢酸エチル（１．５ｋｇ）を入れた５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、ＨＤＰＥジェリー缶に排出し、収量が確認されるまで保持した。最上層をロータリーエバポレーターを取り付けたビュッヒボウルに移し、内容物を、３５±１０℃の水浴で減圧下にて濃縮した。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：５１８～６３３ｋｇ（９０～１１０％の収量）。
【0143】
化合物１２の合成
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミドの２つの部分（１４３ｇ、３．９０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（１８５０ｇ）中の塩化ナトリウム（４５０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、２つのほぼ等しい部分に分配した。水（２０８０ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（２３０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、４つのほぼ等しい部分に分配した。
試薬を以下のように調製した：Ｎ－ヨードスクシンイミドの２つの部分（１４３ｇ、３．９０当量）を、３０℃に設定した真空オーブン内で減圧下にて２４時間乾燥させた。水（１８５０ｇ）中の塩化ナトリウム（４５０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、２つのほぼ等しい部分に分配した。水（２０８０ｇ）中のチオ硫酸ナトリウム（２３０ｇ）の溶液を、５Ｌのラボボトルで調製し、４つのほぼ等しい部分に分配した。
【0144】
化合物９（５０４ｇ、１．３０当量）を、化合物１１（６０７ｇ、０．３２７ｍｏｌ）、続いてトルエン（１５００ｇ）を含有する５０Ｌのビュッヒボウルに充填し、溶解するまで４０±５℃で加熱した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。トルエン（１５００ｇ）をビュッヒボウルに充填した。溶媒が蒸留されなくなるまで、３５±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。乾燥ＤＣＭ（２４００ｇ）を、ビュッヒボウルに充填した。固体が溶解するまでボウルを回転させ、溶液の半分をジャケット温度２０℃±５℃の５Ｌ反応器に移した。溶液の残りの半分を、５Ｌのラボボトルに移した。乾燥ＤＣＭ（７１０ｇ）を、ビュッヒボウルに充填した。ボウルを回転させてボウル表面をすすぎ、溶液の半分を５Ｌ反応器に移した。残りの半分を、上記の５Ｌラボボトルに充填し、第２のバッチで使用するために窒素下で保存した。乾燥Ｎ－ヨードスクシンイミドの一部を、窒素雰囲気下で反応器に充填した。反応器の内容物を、－４０℃±３℃に調整した。乾燥ジクロロメタン（９０ｇ）中のトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（９．０９ｇ、０．２５有効当量）を、内容物の温度を－４０℃±５℃に維持しながら１５分かけて反応器に充填した。反応混合物を、－４０℃±３℃で３０±５分間撹拌し、次に、－３０℃±３℃に調整し、１５０分間撹拌した。反応器の内容物を、反応完了のためにサンプリングした。Ｎ－メチルモルホリン（３３．１ｇ、２有効当量）を反応器に充填し、完全に混合した。上で調製したチオ硫酸ナトリウム溶液の部分の１つを５Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、５Ｌのラボボトルに排出した。ＤＣＭ（４００ｇ）を、５Ｌ反応器に充填し、完全に混合した。最下層を、５Ｌのラボボトルの前の最下層と合わせた。合わせた有機相を５Ｌの反応器に充填し、続いてチオ硫酸ナトリウムの別の部分を入れ、完全に混合した。最下層を、５Ｌのラボボトルに排出した。上の塩化ナトリウム溶液の部分を反応器に充填し、続いて前のラボボトルの内容物を入れた。反応器の最下層を、ビュッヒボウルに充填し、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発させた。反応器を洗浄して乾燥させた。
【0145】
化合物９と化合物１１の第２の部分を反応器に充填し、第１のバッチと同じように処理した。第２のバッチの有機抽出に続いて、反応混合物を反応器内で合わせた。塩化ナトリウム溶液の部分を反応器に充填し、完全に混合した。シリカゲル（１７００ｇ）をビュッヒボウルに充填し、ｒｏｔａｖａｐｏｒを取り付けた。反応器の最下層を、ビュッヒボウルに充填し、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発させた。ボウルの内容物を、２つの等しい部分に分割し、シリカゲルで独立して精製した。１５０ＬＫＰ－ＳＩＬカートリッジをＢｉｏｔａｇｅシステム（Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡの一部門であるＢｉｏｔａｇｅから市販されている）に設置した。酢酸エチル（７．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．０ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。上記からの乾燥充填シリカの一部をＢｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下のように酢酸エチル／石油エーテルで溶出した。
【0146】
酢酸エチル（１．５ｋｇ）および石油エーテル（４．４ｋｇ）をＨＤＰＥジェリー缶に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0147】
酢酸エチル（１８．６ｋｇ）および石油エーテル（８．８ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0148】
酢酸エチル（１９．２ｋｇ）および石油エーテル（８．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0149】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0150】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５Ｌのガラスラボボトルに収集した。
【0151】
カラム画分を、生成物純度についてサンプリングした（生成物を含む画分を同定するためのＴＬＣ）。最初の２つのカラムからの７５～９５％の面積の化合物１２である画分を、シリカゲル（４００ｇ）を充填したビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。酢酸エチル（７．７ｋｇ）および石油エーテル（２２．０ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次に２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集し、廃棄した。不純生成物を含有する乾燥充填シリカを、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ－Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）に充填し、以下に詳述するように溶出した：
【0152】
酢酸エチル（１．５ｋｇ）および石油エーテル（４．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0153】
酢酸エチル（１９．２ｋｇ）および石油エーテル（８．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0154】
酢酸エチル（１８．６ｋｇ）および石油エーテル（８．８ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0155】
酢酸エチル（２９．７ｋｇ）および石油エーテル（１１．９ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、２つのＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移し、次に、カラムに通して溶出した。カラムの流出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0156】
酢酸エチル（１５．５ｋｇ）をＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに充填し、次に、カラムから溶出した。カラムの流出液を５Ｌのガラスラボボトルに収集した。
【0157】
カラム画分を、生成物純度についてサンプリングした（生成物を含む画分を同定するためのＴＬＣ、ＨＰＬＣ合格基準≧９５％化合物１２、および＞２．５％ 単一不純物なし）。３つのカラムすべてから受け入れられたカラム画分をビュッヒボウル内で合わせ、溶媒が蒸留されなくなるまで、４０±１０℃の水浴温を使用して減圧下にて蒸発を行った。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。ボウルを密封し、≦－１５℃の保存場所に移した。予想収量：４９４～５８４ｋｇ（５２～６４％の収量）。
【0158】
化合物１３の合成
氷酢酸（７．５ｋｇ）および酢酸エチル（６．５ｋｇ）を、好適な容器内で合わせ、「ＧＡＡ／ＥＡ溶液」とラベル付けした。重炭酸ナトリウム（０．５ｋｇ）を、ＲＯ水（１０ｋｇ）に溶解し、「５％ｗ／ｗ重炭酸ナトリウム溶液」とラベル付けした。活性化炭素上のパラジウム（１００ｇ、具体的にはＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、製品番号Ａ４０２０２８－１０）およびＧＡＡ／ＥＡ溶液（３３５ｇ）を、この順序で反応容器に充填した。化合物１２（２７０ｇ）をＧＡＡ／ＥＡ溶液（１８４０ｇ）に溶解し、５０Ｌの反応容器に移した。溶液を窒素で１０バールまで加圧することにより酸素をパージし、次に解放した。これをさらに２回繰り返した。反応器の内容物を水素下で１０バールまで加圧し、次に解放した。反応混合物を１．５日間２０バールＨ２で水素化した。次に圧力を解放し、窒素で１０バールまで加圧して溶液から水素をパージし、次に解放した。これを１回繰り返した。反応混合物をセライトパッド（３００ｇ）で濾過した。セライトケーキをＧＡＡ／ＥＡ溶液（２×５．５ｋｇ）で洗浄した。濾液を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物を酢酸エチル（２．３ｋｇ）と２回に分けて共蒸発させた。粗生成物の予想重量は約３１６ｇであった。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０ＭＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。酢酸エチル（１０．６ｋｇ）および氷酢酸（１．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を廃棄した。粗生成物を酢酸エチル（４２２ｇ）および氷河酢酸（５５ｇ）に溶解した。得られた溶液をＳＩＭに充填し、カラムに通した。反応混合物を、以下のようにクロマトグラフ処理した：
氷酢酸（７．５ｋｇ）および酢酸エチル（６．５ｋｇ）を、好適な容器内で合わせ、「ＧＡＡ／ＥＡ溶液」とラベル付けした。重炭酸ナトリウム（０．５ｋｇ）を、ＲＯ水（１０ｋｇ）に溶解し、「５％ｗ／ｗ重炭酸ナトリウム溶液」とラベル付けした。活性化炭素上のパラジウム（１００ｇ、具体的にはＪｏｈｎｓｏｎ Ｍａｔｔｈｅｙ、Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、製品番号Ａ４０２０２８－１０）およびＧＡＡ／ＥＡ溶液（３３５ｇ）を、この順序で反応容器に充填した。化合物１２（２７０ｇ）をＧＡＡ／ＥＡ溶液（１８４０ｇ）に溶解し、５０Ｌの反応容器に移した。溶液を窒素で１０バールまで加圧することにより酸素をパージし、次に解放した。これをさらに２回繰り返した。反応器の内容物を水素下で１０バールまで加圧し、次に解放した。反応混合物を１．５日間２０バールＨ２で水素化した。次に圧力を解放し、窒素で１０バールまで加圧して溶液から水素をパージし、次に解放した。これを１回繰り返した。反応混合物をセライトパッド（３００ｇ）で濾過した。セライトケーキをＧＡＡ／ＥＡ溶液（２×５．５ｋｇ）で洗浄した。濾液を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物を酢酸エチル（２．３ｋｇ）と２回に分けて共蒸発させた。粗生成物の予想重量は約３１６ｇであった。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０ＭＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。酢酸エチル（１０．６ｋｇ）および氷酢酸（１．４ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を廃棄した。粗生成物を酢酸エチル（４２２ｇ）および氷河酢酸（５５ｇ）に溶解した。得られた溶液をＳＩＭに充填し、カラムに通した。反応混合物を、以下のようにクロマトグラフ処理した：
【0159】
酢酸エチル（１３．８ｋｇ）および氷酢酸（１．８ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0160】
溶媒リザーバーの内容物を、ＳＩＭを介してカラムに通して溶出して、溶出液を２０Ｌのジェリー缶に収集した。
【0161】
酢酸エチル（１０．３ｋｇ）、氷酢酸（１．３ｋｇ）およびメタノール（２０６ｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0162】
溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0163】
酢酸エチル（６．６ｋｇ）、氷酢酸（０．９ｋｇ）およびメタノール（３４０ｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0164】
溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、溶出液を約２．５Ｌの画分で５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0165】
酢酸エチル（３１．４ｋｇ）、氷酢酸（４．１ｋｇ）およびメタノール（３．４０ｋｇ）を５０Ｌ反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した。
【0166】
溶媒リザーバーの内容物を、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0167】
化合物１３を含む画分を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物を酢酸エチル（３．１ｋｇ）に溶解し、５％ｗ／ｗ重炭酸ナトリウム溶液（９．３ｋｇ）で洗浄して、水性媒体のｐＨが≧８になるようにした。酢酸エチル相を、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。予想収量：１８２～２０７ｇ（７１～８１％）。
【0168】
化合物１６の合成
乾燥ジクロロメタン（２．５ｋｇ）を、化合物１３（２１１ｇ、７６．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで加熱せずに回転させた。乾燥ジクロロメタン（２００ｇ）中の（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）４－アセチルスルファニルブタノエート（２５．８ｇ、９９．４ｍｍｏｌ、１．３０当量）溶液を、ビュッヒボウルに加えた。ボウルを周囲温度で１時間回転させた後、４０±５℃の水浴温で減圧下にて濃縮した。トルエン（０．８ｋｇ）をボウルに加え、４０±５℃の水浴温で２回減圧下にて除去した。残留物にトルエン（０．８ｋｇ）を加えて溶解させた。シリカゲル（５５７ｇ）を反応容器に入れ、４０±５℃の水浴温で減圧下にて溶媒を除去した。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０Ｍ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。トルエン（１０．１ｋｇ）およびアセトン（１．０ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ａ）。反応混合物を、以下のように精製した：
乾燥ジクロロメタン（２．５ｋｇ）を、化合物１３（２１１ｇ、７６．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を含有するビュッヒボウルに充填し、溶解するまで加熱せずに回転させた。乾燥ジクロロメタン（２００ｇ）中の（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）４－アセチルスルファニルブタノエート（２５．８ｇ、９９．４ｍｍｏｌ、１．３０当量）溶液を、ビュッヒボウルに加えた。ボウルを周囲温度で１時間回転させた後、４０±５℃の水浴温で減圧下にて濃縮した。トルエン（０．８ｋｇ）をボウルに加え、４０±５℃の水浴温で２回減圧下にて除去した。残留物にトルエン（０．８ｋｇ）を加えて溶解させた。シリカゲル（５５７ｇ）を反応容器に入れ、４０±５℃の水浴温で減圧下にて溶媒を除去した。Ｂｉｏｔａｇｅシステムに、５ＬのＳａｍｐｌｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＳＩＭ）を備えた１５０Ｍ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを取り付けた。トルエン（１０．１ｋｇ）およびアセトン（１．０ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ａ）。反応混合物を、以下のように精製した：
【0169】
溶媒Ａを、カラムに通して溶出して、カラムを調整した。溶出液を廃棄した。
【0170】
乾燥充填シリカゲルをＳＩＭに移した。
【0171】
トルエン（９．６ｋｇ）およびアセトン（１．５ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｂ）。
【0172】
溶媒Ｂを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0173】
トルエン（５３．６ｋｇ）およびアセトン（１２．２ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｃ）。
【0174】
溶媒Ｃを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集する。
【0175】
トルエン（８．４ｋｇ）およびアセトン（２．６ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｄ）。
【0176】
溶媒Ｄを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0177】
トルエン（２３．４ｋｇ）およびアセトン（９．２ｋｇ）を５０Ｌの反応器に充填し、完全に混合し、次にＢｉｏｔａｇｅ溶媒リザーバーに移した（溶媒Ｅ）。
【0178】
溶媒Ｅを、カラムに通して溶出して、溶出液を５Ｌのジェリー缶に収集した。
【0179】
化合物１６を含有する画分（合格基準≧９０％化合物１６および＞２．５％ 単一不純物なし）を合わせ、減圧下にて蒸発させた（浴温４０±５℃）。残留物をテトラヒドロフラン（４．４ｋｇ）に溶解し、４０±５℃の水浴温で減圧下にて濃縮した。分析および保持のために、ボウルの内容物をサンプリングした。予想収量：１６９～１９２ｇ（７６～８６％）。
【0180】
化合物１７の合成
反応器には、始動する前に、２．５Ｌ、３．５Ｌ、および３．９Ｌのレベルに印をつけ、これを真空コントローラに取り付けた。ジクロロメタンを１４０ｇの化合物１６を含有するビュッヒボウルに充填し、Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。ＤＣＭ（３３３ｇ）で２回すすいで、ビュッヒボウルの内容物をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。エタノール（２．５０ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加えた。反応混合物を２．５Ｌの印まで濃縮した（目標減圧 ２５０ｍｂａｒ）。エタノール（１．５８ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加え、３．５Ｌの印まで濃縮した。反応物を、エタノールで３．９Ｌの印まで希釈した。不完全真空を適用し、窒素を放出することにより、反応器の内容物を不活性ガス下に置いた。反応中、緩徐な窒素の流れを維持した。ヒドラジン一水和物（１．１３ｋｇ、１．１１Ｌ）を窒素雰囲気下で５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に充填した。温度勾配を、以下のように設定した：初期温度２０℃、最終温度６０℃、５０分（０．８度／分）を超える線形温度勾配、および反応器の内容物の能動制御。容器の温度を、６０℃で４５分間保持した。冷却勾配温度を－２度／分に設定し、最終温度は２０℃であった。内容物を、好適なＨＤＰＥジャグに排出し、重量を決定した。等量をＦＥＰカプセル化シール付きの８つのポリプロピレン遠心分離容器に移した。各遠心分離容器にエタノール（７５０ｇ）を充填し、周囲温度で３０分間撹拌した。容器を遠心分離にかけた（５３００ＲＣＦ、１５℃、３０分）。ヒュームフードから取り出す前に、ボトルの外側をアセトン、次に水ですすぐことにより、容器の外側にある残留ヒドラジンを除去した。遠心分離容器の上清をデカントし、残留ペレットを低エンドトキシン水（ＬＥ水）（１９６０ｇ）に溶解し、５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。１．５時間ごとにおよそ１５～２０分、分散管を使用して溶液に通気しながら内容物を中速で撹拌した。次に、反応物を密閉容器内で２０℃にて一晩撹拌した。ＩＰＣにより、遊離ペンタマー組成が３％（報告された全体の面積％）未満であると示されたら、反応は完了したとみなされた。反応混合物に不溶性材料が存在する場合は、濾過（Ｐ３焼結ガラス漏斗および５Ｌブフナーフラスコを使用）が必要であった。反応器の内容物を、２つのＬｙｏｇｕａｒｄトレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定した。凍結乾燥製品をＬＥ水（８４０ｇ）に溶解し、６つの遠心分離ボトルに均等に分けた。１５分間撹拌した各容器に、アセトン（６３０ｇ）を加えた。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１４０ｇ）を各容器に加え、ペレットが溶解するまでオービタルシェーカーを使用して周囲で混合物を撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。アセトン（６３０ｇ）を各容器に加え、１５分間撹拌した。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１００ｇ）を加えて周囲で撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。溶液をＬｙｏｇｕａｒｄトレイに移し、ボトルをさらにＬＥ水（各６６ｇ）ですすぎ、すすぎ液を同じトレイに移した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定して、生成物を凍結乾燥した。分析および保持のために凍結乾燥生成物をサンプリングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイは二重包装にして、ラベル付けし、冷凍庫（≦－１５℃）内で保存した。凍結乾燥生成物の効力を、ｑＨＮＭＲを使用して決定した。この手順により、粗ペンタダイマー（Ｐｅｎｔａ Ｄｉｍｅｒ）１７が得られた。予想収量：２６．１～３５．５ｇ（６１～８３％）。
反応器には、始動する前に、２．５Ｌ、３．５Ｌ、および３．９Ｌのレベルに印をつけ、これを真空コントローラに取り付けた。ジクロロメタンを１４０ｇの化合物１６を含有するビュッヒボウルに充填し、Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。ＤＣＭ（３３３ｇ）で２回すすいで、ビュッヒボウルの内容物をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。エタノール（２．５０ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加えた。反応混合物を２．５Ｌの印まで濃縮した（目標減圧 ２５０ｍｂａｒ）。エタノール（１．５８ｋｇ）をＲｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙに加え、３．５Ｌの印まで濃縮した。反応物を、エタノールで３．９Ｌの印まで希釈した。不完全真空を適用し、窒素を放出することにより、反応器の内容物を不活性ガス下に置いた。反応中、緩徐な窒素の流れを維持した。ヒドラジン一水和物（１．１３ｋｇ、１．１１Ｌ）を窒素雰囲気下で５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に充填した。温度勾配を、以下のように設定した：初期温度２０℃、最終温度６０℃、５０分（０．８度／分）を超える線形温度勾配、および反応器の内容物の能動制御。容器の温度を、６０℃で４５分間保持した。冷却勾配温度を－２度／分に設定し、最終温度は２０℃であった。内容物を、好適なＨＤＰＥジャグに排出し、重量を決定した。等量をＦＥＰカプセル化シール付きの８つのポリプロピレン遠心分離容器に移した。各遠心分離容器にエタノール（７５０ｇ）を充填し、周囲温度で３０分間撹拌した。容器を遠心分離にかけた（５３００ＲＣＦ、１５℃、３０分）。ヒュームフードから取り出す前に、ボトルの外側をアセトン、次に水ですすぐことにより、容器の外側にある残留ヒドラジンを除去した。遠心分離容器の上清をデカントし、残留ペレットを低エンドトキシン水（ＬＥ水）（１９６０ｇ）に溶解し、５Ｌ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｒｅａｄｙ容器に移した。１．５時間ごとにおよそ１５～２０分、分散管を使用して溶液に通気しながら内容物を中速で撹拌した。次に、反応物を密閉容器内で２０℃にて一晩撹拌した。ＩＰＣにより、遊離ペンタマー組成が３％（報告された全体の面積％）未満であると示されたら、反応は完了したとみなされた。反応混合物に不溶性材料が存在する場合は、濾過（Ｐ３焼結ガラス漏斗および５Ｌブフナーフラスコを使用）が必要であった。反応器の内容物を、２つのＬｙｏｇｕａｒｄトレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定した。凍結乾燥製品をＬＥ水（８４０ｇ）に溶解し、６つの遠心分離ボトルに均等に分けた。１５分間撹拌した各容器に、アセトン（６３０ｇ）を加えた。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１４０ｇ）を各容器に加え、ペレットが溶解するまでオービタルシェーカーを使用して周囲で混合物を撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。アセトン（６３０ｇ）を各容器に加え、１５分間撹拌した。イソプロパノール（容器あたり６３０ｇ）を各容器に加え、２０分間撹拌を続けた。内容物を５３００ＲＣＦ、１５℃で１時間遠心分離にかけた。上清を廃棄し、ＬＥ水（１００ｇ）を加えて周囲で撹拌することにより、各ペレットを水に溶解した。溶液をＬｙｏｇｕａｒｄトレイに移し、ボトルをさらにＬＥ水（各６６ｇ）ですすぎ、すすぎ液を同じトレイに移した。棚温度は１６～２０時間－０．５℃に設定し、次に乾燥するまで２０℃に設定して、生成物を凍結乾燥した。分析および保持のために凍結乾燥生成物をサンプリングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイは二重包装にして、ラベル付けし、冷凍庫（≦－１５℃）内で保存した。凍結乾燥生成物の効力を、ｑＨＮＭＲを使用して決定した。この手順により、粗ペンタダイマー（Ｐｅｎｔａ Ｄｉｍｅｒ）１７が得られた。予想収量：２６．１～３５．５ｇ（６１～８３％）。
【0181】
化合物１７の同一性を、５００ＭＨｚ機器を使用する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲによって決定した。ｔ－ブタノールの参照溶液は、Ｄ２Ｏ中２５ｍｇ／ｍＬで調製した。試料は、Ｄ２Ｏ中１３ｍｇ／ｍＬで調製し、参照溶液を試料に加える。最終試験試料の組成は、ペンタダイマー１０ｍｇ／ｍＬおよびｔ－ブタノール５ｍｇ／ｍＬであった。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを取得し、統合した。得られた化学的シフトを、理論的シフトとの比較によって割り当てた。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１および２に示す。
［実施例５］
［実施例５］
【0182】
粗ペンタダイマーの遊離塩基形態への変換。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ９１（１．４６ｋｇ；４０ｇ／ｇの粗ペンタダイマー－効力を補正）を、大カラムに充填した。１０ＬのＳｃｈｏｔｔボトル内のＬＥ水（８．００ｋｇ）に、ＮａＯＨ（３２ｇ）を加えることにより、８Ｌの１．０Ｍ ＮａＯＨの溶液を調製した。この溶液を、１時間かけてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。ＬＥ水（４０．０ｋｇ）をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。フロースルーでｐＨが＜８．０になるまで、樹脂を追加のＬＥ水（約１０ｋｇのアリコート）でフラッシングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイに保存した粗ペンタダイマー（４９ｇ、ＰＮ０７０４）を、周囲温度まで温めた。ＬＥ水（４００ｇ）を、粗ペンタダイマー（４９ｇ）を含有するＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加え、完全に溶解させた後、１Ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトルに移した。トレイをさらに充填したＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これらの洗浄液をＳｃｈｏｔｔボトルの内容物に加えた。粗ペンタダイマー溶液を、樹脂の上部に注意深く注いだ。１ＬのＳｃｈｏｔｔボトルをＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これを樹脂に加えた。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅタップを開けて、粗ペンタダイマー溶液を約５分かけてゆっくりと樹脂に移動させた。タップを停止し、材料を樹脂上に約１０分間放置した。ＬＥ水を、樹脂の上部に注いだ。タップを開けてＬＥ水で溶出し、５００ｍＬのおよそ１６画分を収集した。各画分を、ＴＬＣ炭化（ｃｈａｒｒｉｎｇ）（ＥｔＯＨ中の１０％Ｈ２ＳＯ４）によって分析した。すべての炭水化物含有画分を合わせ、０．２μｍナイロンフィルターメンブレンを使用してＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過した。溶液を、５～６個のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに均等に分割した。濾過容器をＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、トレイ間で分割した。材料を、トレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。ＬＥ水（１５０ｇ）をＬｙｏｇｕａｒｄトレイの１つを除くすべてに充填し、これを、乾燥材料を含有する残りの１つのトレイに移した。空の各トレイをさらにＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、このすすぎ量を最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加えた。最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイを、凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。分析および保持のために生成物をサンプリングした。乾燥材料をＨＤＰＥまたはＰＰ容器に移し、≦－１５℃で保存した。予想収量：３１～３４ｇ（８６～９４％）。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＦＰＡ９１（１．４６ｋｇ；４０ｇ／ｇの粗ペンタダイマー－効力を補正）を、大カラムに充填した。１０ＬのＳｃｈｏｔｔボトル内のＬＥ水（８．００ｋｇ）に、ＮａＯＨ（３２ｇ）を加えることにより、８Ｌの１．０Ｍ ＮａＯＨの溶液を調製した。この溶液を、１時間かけてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。ＬＥ水（４０．０ｋｇ）をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂に通した。フロースルーでｐＨが＜８．０になるまで、樹脂を追加のＬＥ水（約１０ｋｇのアリコート）でフラッシングした。Ｌｙｏｇｕａｒｄトレイに保存した粗ペンタダイマー（４９ｇ、ＰＮ０７０４）を、周囲温度まで温めた。ＬＥ水（４００ｇ）を、粗ペンタダイマー（４９ｇ）を含有するＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加え、完全に溶解させた後、１Ｌ Ｓｃｈｏｔｔボトルに移した。トレイをさらに充填したＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これらの洗浄液をＳｃｈｏｔｔボトルの内容物に加えた。粗ペンタダイマー溶液を、樹脂の上部に注意深く注いだ。１ＬのＳｃｈｏｔｔボトルをＬＥ水（２００ｇ）ですすぎ、これを樹脂に加えた。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅタップを開けて、粗ペンタダイマー溶液を約５分かけてゆっくりと樹脂に移動させた。タップを停止し、材料を樹脂上に約１０分間放置した。ＬＥ水を、樹脂の上部に注いだ。タップを開けてＬＥ水で溶出し、５００ｍＬのおよそ１６画分を収集した。各画分を、ＴＬＣ炭化（ｃｈａｒｒｉｎｇ）（ＥｔＯＨ中の１０％Ｈ２ＳＯ４）によって分析した。すべての炭水化物含有画分を合わせ、０．２μｍナイロンフィルターメンブレンを使用してＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過した。溶液を、５～６個のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに均等に分割した。濾過容器をＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、トレイ間で分割した。材料を、トレイ内で凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。ＬＥ水（１５０ｇ）をＬｙｏｇｕａｒｄトレイの１つを除くすべてに充填し、これを、乾燥材料を含有する残りの１つのトレイに移した。空の各トレイをさらにＬＥ水（１００ｇ）ですすぎ、このすすぎ量を最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイに加えた。最終のＬｙｏｇｕａｒｄトレイを、凍結乾燥した。棚温度は１６～２０時間－１０℃に設定し、次に、材料が乾燥するまで＋１０℃に設定した。分析および保持のために生成物をサンプリングした。乾燥材料をＨＤＰＥまたはＰＰ容器に移し、≦－１５℃で保存した。予想収量：３１～３４ｇ（８６～９４％）。
【0183】
ダイマーにおける二硫化物結合のＴＣＥＰ還元は迅速で、かつ、ほぼ化学量論的である。ＴＣＥＰによる化学量論的還元を使用すると、約２当量のグルコサミン五糖モノマーが得られた。具体的には、五糖ダイマーを、１モル当量のＴＣＥＰを含有する反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０））に溶解した。周囲温度で１時間後、反応を、ＣＡＤ検出を用いたＨＰＬＣによって分析した。これらの条件下で、ペンタグルコサミンモノマーへの変換（ピークは約１０分）はほぼ完了した（ペンタグルカミンダイマーのピークは約１１．５分）－図４を参照のこと。残りの注釈のないピークを、試料マトリックスから得た。平衡化学方程式に基づいて、加えられたＴＣＥＰは主にＴＣＥＰ酸化物に変換され、残留ＴＣＥＰは、共役反応に加える前に、空気の酸化を阻害してダイマーに戻した。簡単にするために、グルコサミン五糖は、投入ダイマーに基づいて、これらの条件下でモノマーへの＞９５％の変換を想定して加えることができる。
【0184】
ペンタダイマーの同一性を、５００ＭＨｚ機器を使用する１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲによって決定した。ｔ－ブタノールの参照溶液は、Ｄ２Ｏ中２５ｍｇ／ｍＬで調製した。試料は、Ｄ２Ｏ中１３ｍｇ／ｍＬで調製し、参照溶液を試料に加えた。最終試験試料の組成は、ペンタダイマー１０ｍｇ／ｍＬおよびｔ－ブタノール５ｍｇ／ｍＬであった。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを取得し、統合した。得られた化学的シフトを、理論的シフトとの比較によって割り当てる。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１および２に示す。
［実施例５］
［実施例５］
【0185】
本発明のワクチン（化合物１８）を提供するための、実施例２のＴＴ－リンカーを用いた実施例４の五糖モノマーへの変換
実施例２のＴＴモノマー－リンカー中間体を、周囲温度で４時間、濃度を増加させた４～７０ペンタマーグルコサミンモル当量（２～３５五糖ダイマーモル当量）と反応させた。各滴定点からの粗コンジュゲートは、３０ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレンを介して分配することにより精製した。精製された各コンジュゲート試料について、タンパク質含有量、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによるペイロード密度、およびＳＥＣＨＰＬＣによるモノマー／凝集体含有量を分析した。データは、≧５０のペンタマーグルコサミン当量でペイロード密度の飽和を示した。ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析に基づくと、凝集体の含有量は、五糖モノマーの電荷が増加するにつれて増加し、３０のペンタマーグルコサミン当量から開始しておよそ４％の増加の定常状態レベルに達するように見えた。これらの結果に基づいて、その後の共役反応のために選択された五糖ダイマー電荷は、ペンタマーグルコサミンの理論電荷の５０モル当量に対応する２５モル当量であった。
実施例２のＴＴモノマー－リンカー中間体を、周囲温度で４時間、濃度を増加させた４～７０ペンタマーグルコサミンモル当量（２～３５五糖ダイマーモル当量）と反応させた。各滴定点からの粗コンジュゲートは、３０ｋＤａ ＭＷＣＯメンブレンを介して分配することにより精製した。精製された各コンジュゲート試料について、タンパク質含有量、ＳＥＣ－ＭＡＬＳによるペイロード密度、およびＳＥＣＨＰＬＣによるモノマー／凝集体含有量を分析した。データは、≧５０のペンタマーグルコサミン当量でペイロード密度の飽和を示した。ＳＥＣ ＨＰＬＣ分析に基づくと、凝集体の含有量は、五糖モノマーの電荷が増加するにつれて増加し、３０のペンタマーグルコサミン当量から開始しておよそ４％の増加の定常状態レベルに達するように見えた。これらの結果に基づいて、その後の共役反応のために選択された五糖ダイマー電荷は、ペンタマーグルコサミンの理論電荷の５０モル当量に対応する２５モル当量であった。
【0186】
一連の３つの試験合成とそれに続く化合物１８のＧＭＰ合成を、上記のように調製した。得られた各生成物の効力（ＥＬＩＳＡアッセイによる）およびペイロード密度（ペンタマーグルコサミンの破傷風トキソイドに対するモル比）を評価した。以下表に結果を示す。
【0187】
【表2】
【0188】
これらの結果は、本発明の化合物の非常に高い担持量を証明している。前述の説明は、単に本発明を説明するために記載されており、限定することを意味するものではない。本発明の精神および実体を組み込んだ記載された実施形態の改変が、当技術分野の当業者に起こり得るので、本発明は、特許請求の範囲およびその同等物の範囲内のすべての変形を含むと広く解釈されるべきである。
［実施例６］
［実施例６］
【0189】
モノクローナル抗体Ｆ－５９８
Ｆ－５９８として指定されているモノクローナル抗体は、米国特許第７，７８６，２５５号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、このモノクローナル抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡからＴＡＢ－７９９ＣＬおよびＡＦＣ－７６５ＣＬとして市販されている。Ｆ－５９８のアミノ酸配列は配列番号１～５に記載されている。
［実施例７］
Ｆ－５９８として指定されているモノクローナル抗体は、米国特許第７，７８６，２５５号に開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、このモノクローナル抗体は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡからＴＡＢ－７９９ＣＬおよびＡＦＣ－７６５ＣＬとして市販されている。Ｆ－５９８のアミノ酸配列は配列番号１～５に記載されている。
［実施例７］
【0190】
４５歳、体の４５％以上を火傷した１７５ポンドの消防士
患者は、敗血症を発症するリスクが高いと直ちに識別される。そのリスクを最小限に抑えるために、患者には最初に、治療用量のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ－５９８を投与する。この抗体は、患者に即時の免疫療法を与える。およそ２時間後、患者に、本明細書に開示される式Ｉのワクチンを投与する。
患者は、敗血症を発症するリスクが高いと直ちに識別される。そのリスクを最小限に抑えるために、患者には最初に、治療用量のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ－５９８を投与する。この抗体は、患者に即時の免疫療法を与える。およそ２時間後、患者に、本明細書に開示される式Ｉのワクチンを投与する。
【0191】
患者の血清中に治療レベルのモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が残っていることを確認するために、患者を監視する。必要に応じて、治療用血清濃度が維持されるように、モノクローナル抗体の追加処置を投与する。同様に、本明細書に記載の化合物によって生成されるポリクローナル抗体力価を測定する。必要に応じて、治療用血清濃度が維持されるように、追加のワクチンを患者に投与することができる。患者にそのようなリスクがなくなるまで、治療を継続する。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】