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特表2023-502330腫瘍におけるヒトＬ１－ＭＥＴ転写産物をサイレンシングするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-24
(54)【発明の名称】腫瘍におけるヒトＬ１－ＭＥＴ転写産物をサイレンシングするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230117BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230117BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230117BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230117BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230117BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P15/00
A61P11/00
A61P1/00
A61K31/7088
A61K48/00
A61K45/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525621
(86)(22)【出願日】2020-11-13
(85)【翻訳文提出日】2022-06-17
(86)【国際出願番号】 IT2020050282
(87)【国際公開番号】W WO2021095080
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】102019000021327
(32)【優先日】2019-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522172999
【氏名又は名称】フォンダツィオーネ デル ピエモンテ ペル ロンコロジア
【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＺＩＯＮＥ ＤＥＬ ＰＩＥＭＯＮＴＥ ＰＥＲ Ｌ’ＯＮＣＯＬＯＧＩＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ヴェネシオ， ティツィアーナ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC411
4C084ZC412
4C084ZC751
4C084ZC752
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA81
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、腫瘍細胞において特異的に転写される非コード転写産物であるヒトＬ１－ＭＥＴをサイレンシングすることによって、いくつかの種類のヒト癌細胞の死を誘導するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１によってコードされるＬ１－ＭＥＴ転写産物の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号２又は配列番号３によってコードされるＬ１－ＭＥＴ転写産物の領域を標的とする、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
７～５０ヌクレオチド、好ましくは１２～３０ヌクレオチド、より好ましくは１５～２３ヌクレオチドの配列を含む、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３又は配列番号１４、好ましくは配列番号４又は配列番号５、より好ましくは配列番号５を含むか、又はこれらからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれが、リボヌクレオチド、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合せ、並びに／又は修飾リボース及び／若しくはデオキシリボースを有するヌクレオチドを含み、リン酸基が任意選択で修飾されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
１つ又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントと共に、有効成分として請求項１～６のいずれか一項に記載のアンチセンスヌクレオチドのうちの１つ又は複数を含む、医薬組成物。
【請求項7】
１つ又は複数の抗癌剤をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項8】
Ｌ１－ＭＥＴ発現腫瘍、例えばトリプルネガティブ乳癌、肺腺癌又は結腸直腸癌の治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項７若しくは８に記載の医薬組成物。
【請求項9】
Ｌ１－ＭＥＴ発現腫瘍、例えばトリプルネガティブ乳癌の治療における別個の又は逐次的な使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つ又は複数の抗癌剤との組合せ。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍におけるヒトＬ１－ＭＥＴ転写産物をサイレンシングするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列に関する。
【0002】
特に、本発明は、腫瘍細胞において特異的に転写される非コード転写産物であるヒトＬ１－ＭＥＴをサイレンシングすることによって、いくつかの種類のヒト癌細胞の死を誘導するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
現在、癌治療のための新しい療法、特に癌細胞に対して選択的である新しい療法を見つけることが研究の焦点となっている。
【0004】
実際に、化学療法等の抗癌療法は、癌細胞と正常細胞の両方の死を引き起こすことはよく知られている。正常細胞の死は、いくつかの不快な副作用を引き起こし得る。
【0005】
この問題を解決するために、過去２０年間、癌細胞でより多く発現している特定の分子を標的とする新しい治療戦略が開発されてきた。患者個々の分子背景は、特定の薬物に対する物理学に対応し、オフターゲットを低減させる。しかし、この薬物が標的とする分子は、癌細胞膜上だけでなく、いくつかの正常細胞にも存在する。さらに、他の遺伝子の変異の存在は有効性の損失をもたらし得る、すなわち、結腸直腸癌では、ＫＲＡＳ遺伝子に変異が存在すると、ＥＧＦＲに結合して経路をブロックする薬物の使用が有効ではなくなる。肺癌では、ＥＧＦＲに変異が存在するとＥＧＦＲ阻害剤に対する応答はよくなり得るが、耐性変異が生じると薬物は有効ではなくなる。
【0006】
したがって、上記に鑑みれば、公知の抗癌療法の欠点を克服することができる新しい抗癌療法を提供する必要性があることが明らかである。
【0007】
長散在型反復配列（ＬＩＮＥ－１）は、ヒトゲノムの約２０％を占めるレトロ転移因子であることが知られている。Ｌｉｎｅ－１は、プロモーター領域に位置するＣｐＧアイランドの低メチル化によって活性化されると、新しい染色体領域部位へ自己を転移する能力を維持している［１］。通常非コード領域に位置するこれらの配列のうち、ごくわずかのみが、レトロ転移が可能であるが、一般的には一生のほとんどの間、不活性なままである［２］。ＬＩＮＥ－１プロモーターは、脱メチル化されると、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ－１及びＯＲＦ－２）の転写を導くセンスプロモーターとして、又はアンチセンスプロモーターとして作用することができる［３］。アンチセンスプロモーターの活性は、ＬＩＮＥ－１方向に対して反対側の鎖の転写を駆動し、近傍配列を含む転写の開始を引き起こすことができる［４］。この点に関して、近年、ＬＩＮＥ－１配列の５’ＵＴＲ内に発見された新しい霊長類特異的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ－０）が、２つのスプライシングドナー部位を用いて、近接エクソン融合転写産物の起源であることが示された［５］。Ｌ１－ＭＥＴとして知られる、ヒトＭＥＴ遺伝子のイントロン２に位置するＬＩＮＥ－１配列（図１）は、霊長類亜科に属し、レトロ転移をすることができない。しかしながら、プロモーター領域は完全に維持されているため、低メチル化によるアンセンスプロモーターの活性化が可能であり、ＯＲＦ－０領域に由来し、近傍のＭＥＴ配列を含む代替転写産物の生成を伴う。Ｌ１－ＭＥＴ転写産物は２００２年に初めて記述されたが［６］、その全長の特徴付けは、Ｍｉｇｌｉｏら、２０１８（図１）［７］によって記述されるように、２０１８年に達成されたのみである。後者の研究では、転写はＯＲＦ－０から始まり、ＭＥＴ ３’ＵＴＲで終わり、６つの異なるスプライシングバリアントが含まれ、それらは２つのスプライシングドナー部位と３つの異なるアクセプター部位との組合せに由来し、これらの２つはＭＥＴ遺伝子のイントロン２に位置することが示されている。Ｌ１－ＭＥＴ転写産物の長さ及び、コーディングオープンリーディングフレームの欠如は、長鎖非コードＲＮＡとしての機能を示唆している。また、Ｌ１－ＭＥＴは機能的なタンパク質をコードしていないが、３’ＵＴＲ及びポリＡ領域が存在することにより、転写産物は核から細胞質へ輸送されることが可能になっていることも示された。この性質は、その長さと共に、長鎖非コードＲＮＡとしての役割の可能性を示している。現在までに、Ｌ１－ＭＥＴの生物学的機能を調査しようとした研究は２件しかない。１件では、Ｗｅｂｅｒらは、ＤＮＡメチル基転移酵素タンパク質をノックダウンすることによってＬ１－ＭＥＴの発現を誘導し、低メチル化によって転写を促進した後、ＭＥＴタンパク質レベルの低下を観察した［８］。もう１件では、Ｗｏｌｆｆらは、Ｌ１－ＭＥＴを細胞株にトランスフェクトした後、切断型ＭＥＴアイソフォームが存在することを報告した［９］。しかし、Ｍｉｇｌｉｏら、２０１８［７］では、ウェスタンブロット及びインフォマティクス予測ツールの両方によって、切断型ＭＥＴタンパク質の根拠がないことが示された。
【0008】
Ｌ１－ＭＥＴアンチセンスプロモーターの活性化は腫瘍に特異的な機構であることが示されているが、この理由は、正常組織におけるＬ１－ＭＥＴの発現の根拠がないことが実験的な検討及びインシリコ解析の両方で明らかに示されているためである［７］。
【発明の概要】
【0009】
本発明によれば、今般、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物のサイレンシングにより、腫瘍細胞は顕著に死滅するが、正常細胞は死滅しないことが示され、このことは、Ｌ１－ＭＥＴが癌治療の有望な標的であることを示している。
【0010】
この配列を標的とする利用可能な治療戦略の中で、主に癌以外の疾患に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドがより適切であると考えられる［１０］。
【0011】
特に、本発明によれば、Ｌ１－ＭＥＴの特定の制御配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって行われるＬ１－ＭＥＴ転写産物のサイレンシングが、非形質転換細胞が影響を受けない一方で、異なる種類の癌細胞の選択的死を誘発することが示された。これらの結果は、腫瘍細胞死を誘導するためにこれらのオリゴヌクレオチド配列を使用することを支持する。
【0012】
特に、本発明によれば、ＭＥＴイントロン２の７６ｂｐをカバーし、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物の一部となる特定の配列が同定された。この配列は、ヒトＬ１－ＭＥＴ転写産物の早期分解を引き起こすために、都合の良いように標的化することができる。
【0013】
特に、本発明によれば、インシリコ解析により、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物を選択的にサイレンシングすることができる１１のアンチセンスオリゴヌクレオチドが同定されている。さらに、それらの３つはインビトロの実験で試験されている。
【0014】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独及び組合せの両方で薬理化合物として使用し得る。
【0015】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物の発現について陽性のヒト腫瘍細胞の大規模な選択的死を誘導するために好都合に使用することができる。腫瘍細胞に対する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの高い選択性は、正常組織におけるＬ１－ＭＥＴの発現の欠如、及び低メチル化による特異的な腫瘍転写活性化に起因するものである。
【0016】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ベクターなしで患者に投与するために化学的に修飾されていても、腫瘍細胞のトランスフェクション効率を上昇させるためにベクターとコンジュゲートされていてもよい。ＡＳＯを投与するために使用し得るベクターの例は、より急速な内在化を可能にするが、網膜内皮系による分解等、いくつかの制限を示し得るリポソーム又はナノ粒子である。
【0017】
過去には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、主に血中時間が短く、クリアランスが急速であることによる、いくつかの制限を示したが、近年では、化学的修飾（すなわち、ロック核酸－ＬＮＡ、ホスホロチオエート骨格、２’－リボース修飾）の導入により、化合物の直接投与が可能になる、有望な結果が得られている［１１］。これらの化学的変化により、血清タンパク質との結合が増加し、肝臓におけるクリアランスが減少し、標的細胞への取り込みに利用可能な時間が増加する。ここ数年、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、異なる疾患（すなわち、脊髄性筋萎縮症、ホモ接合型家族性高コレステロール血症）の治療についてＦＤＡに承認されている。
【0018】
したがって、本発明の具体的な目的は、ＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１）によってコードされるＬ１－ＭＥＴ転写産物の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0019】
本発明によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣ（配列番号２）又はＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号３）によってコードされるＬ１－ＭＥＴ転写産物の領域を標的とすることができる。
【0020】
さらに、本発明によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７～５０ヌクレオチド、好ましくは１２～３０ヌクレオチド、より好ましくは１５～２３ヌクレオチドの配列を含むことができる。例えば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、デオスシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む場合、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは１６ヌクレオチドを含むことができる。
【0021】
本発明によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物の標的領域に相補的であり、ＧＵＣＵＵＣＡＣＣＵＣＣＡＡＵＣ（配列番号４）、ＧＣＡＧＧＧＣＵＡＧＧＡＣＵＡＡ（配列番号５）、ＧＣＣＵＡＧＧＣＵＣＵＣＵＧＧＣ（配列番号６）、ＣＵＡＧＣＡＣＡＵＵＵＵＣＵＧＣ（配列番号７）、ＣＵＣＣＡＡＵＣＵＡＧＣＡＣＡＵ（配列番号８）、ＡＣＣＵＣＣＡＡＵＣＵＡＧＣＡＣ（配列番号９）、ＣＵＡＧＧＣＵＣＵＣＵＧＧＣＵＣ（配列番号１０）、ＣＵＡＡＧＣＣＵＡＡＧＧＣＵＣＵＣ（配列番号１１）、ＧＵＧＣＡＧＧＧＣＵＡＧＧＡＣＵ（配列番号１２）、ＡＧＵＧＣＡＧＧＧＣＵＡＧＧＡＣ（配列番号１３）又はＣＵＵＣＡＧＵＧＣＡＧＧＧＣＵＡ（配列番号１４）、好ましくは配列番号４又は配列番号５、より好ましくは配列番号５を含むか、又はこれらからなる。
【0022】
本発明によれば、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちの１つ、複数又は全てのヌクレオチドは修飾されていてもよいが、但し、アンチセンスオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドのみを含むことはないか、又は修飾デオキシリボースを有するヌクレオチドのみを含むことはない。特に、ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボース又はデオキシリボースを有するヌクレオチドであり得る。さらに、前記リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾リボース及び／若しくはデオキシリボースを有するヌクレオチドは、任意選択で、修飾リン酸基を有することができる。したがって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれは、リボヌクレオチド、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組合せ、並びに／又は修飾リボース及び／若しくはデオキシリボースを有するヌクレオチドを含むことができ、リン酸基が任意選択で修飾されている。
【0023】
特に、修飾オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、ＬＮＡ、（Ｓ）－ｃＥｔ、２’－Ｆ ＲＮＡ、モルホリノ（ＰＭＯ）等の糖修飾を有するヌクレオチド、及び／又は、ホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホロジチオエート、チオホスホラミデート等の、リン酸基に修飾を有するヌクレオチドを含み得る。リン酸基上の修飾は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は糖上の修飾を有するヌクレオチド等、任意のヌクレオチドに適用可能である。
【0024】
本発明の実施形態によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ修飾及びホスホロチオエート（ＰＳ）修飾の両方を有する修飾ヌクレオチドを含み得る。
【0025】
特定の実施形態によれば、本発明によるオリゴヌクレオチドは、分子の２つの末端にＬＮＡ及びＰＳの両方の修飾並びに分子の中央部のＤＮＡヌクレオチドを有する、フランキング修飾ヌクレオチドを含み得る。この種類の構造は、ＲＮａｓｅによるＡＳＯ関連標的分解を有利に増幅する。
【0026】
ＬＮＡ修飾は、ＲＮＡ標的への結合特異性を有利に上昇させ、ヌクレアーゼに対する耐性を付与する。
【0027】
ＰＳ修飾は、血清タンパク質（アルブミン）との結合を有利に増大させ、これは血流中での維持に好都合である。また、ＰＳ修飾は、腎クリアランスを低減させ、ＡＳＯが血流にある場合、腎臓による除去速度を低下させる。
【0028】
さらに、上記の修飾（ＬＮＡ及びＰＳ）の組合せは、改善されたトランスフェクション効率を提供し、ベクター（リポフェクタミン、リポソーム又はナノ粒子等）なしでもトランスフェクションが可能になる。
【0029】
本発明のさらなる目的は、１つ又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントと共に、有効成分として、上記に定義されるアンチセンスヌクレオチドのうちの１つ又は複数を含む、医薬組成物である。
【0030】
本発明によれば、前記医薬組成物は、１つ又は複数の抗癌剤をさらに含むことができる。
【0031】
本発明はまた、Ｌ１－ＭＥＴ発現腫瘍、例えばトリプルネガティブ乳癌、肺腺癌又は結腸直腸癌の治療に使用するための、上記に定義されたアンチセンスオリゴヌクレオチド又は上記に定義された医薬組成物に関する。
【0032】
本発明のさらなる目的は、Ｌ１－ＭＥＴ発現腫瘍、例えばトリプルネガティブ乳癌の治療における別個の又は逐次的な使用のための、上記に定義された１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、１つ又は複数の抗癌剤との組合せである。
【0033】
本発明によれば、「別個の使用」は、本発明による組合せの２つの化合物を、別個の医薬形態で同時に投与することを意味すると理解される。
【0034】
「逐次的な使用」は、本発明による組合せの２つの化合物を、それぞれ別個の医薬形態で連続的に投与することを意味すると理解される。
【0035】
本発明において有用なアンチセンス化合物の具体例としては、修飾骨格又は非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を維持するもの、及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる。また、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドと考えることができる。
【0036】
他のオリゴヌクレオチド模倣物では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が新規の基で置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。このようなオリゴマー化合物の１つであり、優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖－骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換されている。核酸塩基は維持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合する。
【0037】
さらなる修飾としては、ロック核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、ここで、２’－ヒドロキシル基は、糖環の３’又は４’炭素原子に結合し、それによって二環糖部分を形成している。この結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ２－）ｎ基であってもよく、式中、ｎは１又は２である。
【0038】
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－アリル（２’－ＣＨ２－ＣＨ－ＣＨ２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ－ＣＨ２）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。
【0039】
修飾核酸塩基にはまた、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば７－デアザアデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドンで置換されているのも含まれ得る。いくつかの修飾核酸塩基は、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を上昇させるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン、例えば２－アミノプロピル－アデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンが挙げられる。
【0040】
本発明のオリゴヌクレオチドは、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成し得る。このようなオリゴヌクレオチドは、当技術分野では、ハイブリッド又はギャップマーとも呼ばれている。
【0041】
ここで、本発明を、その好ましい実施形態に従って、特に添付の図面を参照しながら、例示的に記載するが、これは限定的ではない：
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】ＭＥＴのイントロン２内に位置するＬ１エレメントから生じるＬ１－ＭＥＴ転写産物を示すグラフである［７］。
【図2】Ｌ１－ＭＥＴの７６ｂｐ標的断片に沿ったアンチセンスオリゴヌクレオチドのマッピング部位を示す図である。例示の目的で、図は、配列番号１５の７６ｂｐ標的断片の位置を示すために、配列番号１５のヌクレオチド１～４２０を示す。
【図3】インシリコ解析によって予測された、３つの設計アンチセンスオリゴヌクレオチドの二次構造を示す図である。
【図4】Ｌ１－ＭＥＴ配列の予測される二次構造を示す図である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的な領域は、ボルト線（ｂｏｌｔ ｌｉｎｅ）で強調されている。
【図5】解析した細胞株におけるＬ１－ＭＥＴ遺伝子発現のレベルを示す図である。
【図6】Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３でサイレンシングした後の解析した細胞株におけるＬ１－ＭＥＴ遺伝子発現解析を示す図である。
【図7】細胞生存率に対するＬ１－ＭＥＴサイレンシングの効果を示す図である。
【図8】癌細胞株におけるＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３を用いたＬ１－ＭＥＴサイレンシング後のアポトーシス細胞のパーセント比率を示す図である。
【図9】Ｌ１－ＭＥＴをサイレンシングした癌細胞に対するウェスタンブロット解析の結果を示す図である。
【実施例】
【0043】
実施例１：本発明によるＬ１－ＭＥＴを標的とするオリゴヌクレオチドのインシリコ特定及び特徴付け、並びにＬ１－ＭＥＴのインビトロサイレンシング。
【0044】
材料及び方法
本研究で使用したヒト生体試料は、研究室の内部協力者であり、血液試料の採取及び実験への使用について同意を与えた健常ドナーのものであった。
本研究で使用したヒト生体試料は、研究室の内部協力者であり、血液試料の採取及び実験への使用について同意を与えた健常ドナーのものであった。
【0045】
本明細書に記載の実験では、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）は使用しなかった。
癌細胞株
ＭＤＡ－ＭＢ２３１及びＭＣＦ－７細胞株はＮＣＩ－６０パネルから入手し、ＥＢＣ１（カタログＪＣＲＢ０８２０）はＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）から、そしてＡ５４９（カタログＣＣＬ－１８５）及びＭＲＣ５（カタログＣＣＬ－１７１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＥＢＣ１及びＡ５４９は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで増殖させ、ＭＤＡ－ＭＢ２３１には１０％ＦＢＳ添加高グルコースＤＭＥＭを使用し、ＭＣＦ７には１０％ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬインスリン添加高グルコースＤＭＥＭを使用し、一方、ＭＲＣ５は１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭで増殖させた。それらの遺伝的同一性は、ショートタンデムリピートプロファイリング（パワープレックス（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ）（登録商標）１６ ＨＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により確認し、最後に２０１９年６月に繰り返した。細胞はヴェノア（Ｖｅｎｏｒ）ＧＭキット（Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマイコプラズマ汚染について定期的に試験した。健常ドナーからの正常リンパ球は、リンパ球細胞分離培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を用いて遠心分離により末梢血から得た後、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで増殖させた。
癌細胞株
ＭＤＡ－ＭＢ２３１及びＭＣＦ－７細胞株はＮＣＩ－６０パネルから入手し、ＥＢＣ１（カタログＪＣＲＢ０８２０）はＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）から、そしてＡ５４９（カタログＣＣＬ－１８５）及びＭＲＣ５（カタログＣＣＬ－１７１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。ＥＢＣ１及びＡ５４９は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで増殖させ、ＭＤＡ－ＭＢ２３１には１０％ＦＢＳ添加高グルコースＤＭＥＭを使用し、ＭＣＦ７には１０％ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬインスリン添加高グルコースＤＭＥＭを使用し、一方、ＭＲＣ５は１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭで増殖させた。それらの遺伝的同一性は、ショートタンデムリピートプロファイリング（パワープレックス（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ）（登録商標）１６ ＨＳ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により確認し、最後に２０１９年６月に繰り返した。細胞はヴェノア（Ｖｅｎｏｒ）ＧＭキット（Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマイコプラズマ汚染について定期的に試験した。健常ドナーからの正常リンパ球は、リンパ球細胞分離培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を用いて遠心分離により末梢血から得た後、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩで増殖させた。
【0046】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの選択
最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を特定するために、以前に報告された選択基準に従って、インシリコ解析によってＬ１－ＭＥＴ転写産物の特定の７６ｂｐ配列を選択及び検討した［１２］。５つの異なるＡＳＯ設計ツールを使用して、ＡＳＯに最もアクセス可能な配列を特定した。
最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を特定するために、以前に報告された選択基準に従って、インシリコ解析によってＬ１－ＭＥＴ転写産物の特定の７６ｂｐ配列を選択及び検討した［１２］。５つの異なるＡＳＯ設計ツールを使用して、ＡＳＯに最もアクセス可能な配列を特定した。
【0047】
ここで以下に、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物の完全なＤＮＡ配列（配列番号１５）を示し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の７６ｂｐ断片標的を強調する（ボルト及び下線）。
【0048】
【化1】
【0049】
５つのアンチセンスオリゴヌクレオチド設計ツールに問い合わせて、特定のＬ１－ＭＥＴ領域を標的とすることができる１１のＡＳＯを、下記に報告する表１に示すように特定した。
【0050】
【表1】
ＡＳＯの質的性質（例えば、構造、化学、及び配列組成）のほとんどは、標的ｍＲＮＡのアクセス可能性に強く依存している［１３、１４］。最適なパラメーターを有するオリゴを検討するために、ｓＦＯＬＤウェブツールを用いて、ＡＳＯ候補の二次構造を次いで特徴付けた。さらに、標的領域のフォールディング性質を視覚的に確認するために、Ｌ１－ＭＥＴのｍＲＮＡ全体の二次構造も特徴付けた。Ｅｘｉｑｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により合成されたＬＮＡ－ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）（Ｌ１ＭＥＴ＿ＡＳ１、Ｌ１ＭＥＴ＿ＡＳ２、Ｌ１ＭＥＴ＿ＡＳ３）は、各塩基対に付加されたロック核酸修飾及びホスホロチオエート骨格を含む、２つのフランキングＲＮＡ配列を有するＤＮＡコア領域により特徴付けられる。図２には、７６ｂｐの配列上のＡＳＯのマッピング部位が示されている。
【0051】
一過性トランスフェクション
全ての細胞を完全培地で培養した後、製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＡＳＯにより一過性トランスフェクトした。対照として、スクランブルＬＮＡギャップマーをトランスフェクトした。トランスフェクションの当日、細胞を回収して数えた後、リポフェクタミン及び最終濃度２５ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成されるトランスフェクション混合物の存在下で、適切な培養培地を用いて１０ｃｍの組織培養ディッシュに６００．０００細胞／ディッシュで播種した。トランスフェクションから２４時間後に、細胞からＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。
全ての細胞を完全培地で培養した後、製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＡＳＯにより一過性トランスフェクトした。対照として、スクランブルＬＮＡギャップマーをトランスフェクトした。トランスフェクションの当日、細胞を回収して数えた後、リポフェクタミン及び最終濃度２５ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで構成されるトランスフェクション混合物の存在下で、適切な培養培地を用いて１０ｃｍの組織培養ディッシュに６００．０００細胞／ディッシュで播種した。トランスフェクションから２４時間後に、細胞からＲＮＡ及びタンパク質を抽出した。
【0052】
ＲＮＡ抽出及びｑＲＴ－ＰＣＲ解析
ＲＮＡは、マックスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ組織キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の指示に従い、細胞株から抽出した。ＲＮＡの定量化は、デノビックス（ＤｅＮｏｖｉｘ）分光光度計を使用して行った。逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて逆転写した後、以前に報告されているプライマー及びＰＣＲ条件を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、Ｌ１－ＭＥＴの遺伝子発現を検討した［７］。反応混合物は、簡潔には、Ｌ１－ＭＥＴの７６ｂｐ領域に位置するフォワードプライマー及びＭＥＴのエクソン３に位置するリバースプライマーの存在下で、１Ｘ緩衝剤、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭ各プライマー、２×エバグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）色素、０．０４Ｕ／μＬタックポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＨ２Ｏで、最終容量２５μＬになるように構成されていた。相対発現定量化（ＲＱ）は、ＧＡＰＤＨを内因性対照として、以下の式に従って算出した：ＲＱ＝２－（ΔＣｔ）、式中、ΔＣｔ＝（Ｃｔ Ｌ１－ＭＥＴ－Ｃｔ ＧＡＰＤＨ）。
ＲＮＡは、マックスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）ＲＳＣ ｍｉＲＮＡ組織キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の指示に従い、細胞株から抽出した。ＲＮＡの定量化は、デノビックス（ＤｅＮｏｖｉｘ）分光光度計を使用して行った。逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて逆転写した後、以前に報告されているプライマー及びＰＣＲ条件を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、Ｌ１－ＭＥＴの遺伝子発現を検討した［７］。反応混合物は、簡潔には、Ｌ１－ＭＥＴの７６ｂｐ領域に位置するフォワードプライマー及びＭＥＴのエクソン３に位置するリバースプライマーの存在下で、１Ｘ緩衝剤、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２μＭ各プライマー、２×エバグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）色素、０．０４Ｕ／μＬタックポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＨ２Ｏで、最終容量２５μＬになるように構成されていた。相対発現定量化（ＲＱ）は、ＧＡＰＤＨを内因性対照として、以下の式に従って算出した：ＲＱ＝２－（ΔＣｔ）、式中、ΔＣｔ＝（Ｃｔ Ｌ１－ＭＥＴ－Ｃｔ ＧＡＰＤＨ）。
【0053】
ＲＮＡｓｅｑ解析
Ａ５４９、ＥＢＣ１、ＭＤＡＭＢ－２３１、及びＭＣＦ７癌細胞株について、遺伝子発現プロファイルのためのＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。詳細には、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１又はスクランブルギャップマーで処理した細胞から精製したＲＮＡを、独立した３回の繰り返し実験において、合計２４サンプルについて解析した。全てのライブラリー調製は、トゥルーセックストランド（ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｍＲＮＡキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ＲＩＮ＞８の１μｇの総ＲＮＡから開始して行った。簡潔には、低サンプルワークフローに従って、ポリＴオリゴ付着磁気ビーズを用いてポリＡ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を精製した後、ｃＤＮＡを合成し、その後、インデックス付きアダプターのライゲーションを可能にするために３’末端を末端修復及びアデニル化した。次いで、プールされたライブラリーは、シングルエンド７５ｂｐシーケンシングのためにイルミナネクストセック（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ）５００／５５０機器に最終濃度１．１ｐＭでロードされた。標準的なイルミナネクストセック５００の手順に従って、フィルターを通過しないリードは廃棄した。フィルターを通過したリードは、ジーンコード（ＧＥＮＣＯＤＥ）（バージョン２９）［１５］からダウンロードしたＧＲＣｈ３８プライマリーアセンブリゲノム（ｐｒｉｍａｒｙ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｇｅｎｏｍｅ）にスター（ＳＴＡＲ）（バージョン２．５．４ａ、カスタムパラメーター－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ１０－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＳｃｏｒｅＲａｎｇｅ１－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ９９９－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＬｍａｘ０．０８を使用）［１６］を使用してアライメントした。遺伝子発現の定量化には、サブリードフィーチャーカウンツ（ｓｕｂｒｅａｄ ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ）ｖ１．６．３を用いてリードをエクソンに割り当て、マルチマッピングリード及びあいまいなリードを廃棄し、遺伝子名でまとめた［１７］。参照転写産物アノテーションとしてジーンコードの基本アノテーション（バージョン２９）を使用し、Ｍｉｇｌｉｏら、２０１８［７］に記載されたＬ１－ＭＥＴ転写産物のカスタムトラックで補完した。同一の補完された転写産物アノテーションは、スターインデックスを構築するために使用した。
Ａ５４９、ＥＢＣ１、ＭＤＡＭＢ－２３１、及びＭＣＦ７癌細胞株について、遺伝子発現プロファイルのためのＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。詳細には、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１又はスクランブルギャップマーで処理した細胞から精製したＲＮＡを、独立した３回の繰り返し実験において、合計２４サンプルについて解析した。全てのライブラリー調製は、トゥルーセックストランド（ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ）ｍＲＮＡキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、ＲＩＮ＞８の１μｇの総ＲＮＡから開始して行った。簡潔には、低サンプルワークフローに従って、ポリＴオリゴ付着磁気ビーズを用いてポリＡ ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を精製した後、ｃＤＮＡを合成し、その後、インデックス付きアダプターのライゲーションを可能にするために３’末端を末端修復及びアデニル化した。次いで、プールされたライブラリーは、シングルエンド７５ｂｐシーケンシングのためにイルミナネクストセック（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ）５００／５５０機器に最終濃度１．１ｐＭでロードされた。標準的なイルミナネクストセック５００の手順に従って、フィルターを通過しないリードは廃棄した。フィルターを通過したリードは、ジーンコード（ＧＥＮＣＯＤＥ）（バージョン２９）［１５］からダウンロードしたＧＲＣｈ３８プライマリーアセンブリゲノム（ｐｒｉｍａｒｙ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｇｅｎｏｍｅ）にスター（ＳＴＡＲ）（バージョン２．５．４ａ、カスタムパラメーター－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ１０－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＳｃｏｒｅＲａｎｇｅ１－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ９９９－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＬｍａｘ０．０８を使用）［１６］を使用してアライメントした。遺伝子発現の定量化には、サブリードフィーチャーカウンツ（ｓｕｂｒｅａｄ ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ）ｖ１．６．３を用いてリードをエクソンに割り当て、マルチマッピングリード及びあいまいなリードを廃棄し、遺伝子名でまとめた［１７］。参照転写産物アノテーションとしてジーンコードの基本アノテーション（バージョン２９）を使用し、Ｍｉｇｌｉｏら、２０１８［７］に記載されたＬ１－ＭＥＴ転写産物のカスタムトラックで補完した。同一の補完された転写産物アノテーションは、スターインデックスを構築するために使用した。
【0054】
タンパク質抽出及びウェスタンブロット解析
トランスフェクションから２４時間後の細胞株から、ホットリシスプロトコルを用いてタンパク質を抽出した。細胞はＰＢＳで３回洗浄した後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、及びＨ２Ｏで構成される溶解溶液を最終容量に達するように添加した。溶解物を１．５ｍＬチューブに回収し、９５℃で１５分間インキュベートした。超音波処理及び１６，０００ｇの５分間の遠心分離により細胞残渣を除去した後、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分光光度計でタンパク質を定量化した。５０ｎｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ボルト（Ｂoｌｔ）４－１２％ビス－トリスプラスゲル（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ｇｅｌ））（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、トランス－ブロットターボ（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ）ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にブロットした。膜は、使用した抗体に応じて、１０％ＢＳＡ又は５％無脂肪乾燥乳を含むＴＢＳ－Ｔで４５分間ブロッキングした。その後、膜を以下の抗体と共に４℃で一晩中インキュベートした。抗ＡＫＴ（２９７２）、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（９１０２）抗リン酸化ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（９２７１）、抗リン酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（９１０１）、抗リン酸化ＥＧＦＲ（３７７７）、抗リン酸化ＭＥＴ（３０７７）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＭＥＴ（ＤＬ２１）自家製抗体及び抗ＥＧＦＲ（１００５ ｓｃ－０３）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。全ての一次抗体は、１：１０００に希釈した。適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：１００００－Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．）を、クラリティウェスタン（Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ）ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた化学発光による検出のために使用した。
トランスフェクションから２４時間後の細胞株から、ホットリシスプロトコルを用いてタンパク質を抽出した。細胞はＰＢＳで３回洗浄した後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、及びＨ２Ｏで構成される溶解溶液を最終容量に達するように添加した。溶解物を１．５ｍＬチューブに回収し、９５℃で１５分間インキュベートした。超音波処理及び１６，０００ｇの５分間の遠心分離により細胞残渣を除去した後、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分光光度計でタンパク質を定量化した。５０ｎｇのタンパク質をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ボルト（Ｂoｌｔ）４－１２％ビス－トリスプラスゲル（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ｇｅｌ））（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、トランス－ブロットターボ（Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ）ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にブロットした。膜は、使用した抗体に応じて、１０％ＢＳＡ又は５％無脂肪乾燥乳を含むＴＢＳ－Ｔで４５分間ブロッキングした。その後、膜を以下の抗体と共に４℃で一晩中インキュベートした。抗ＡＫＴ（２９７２）、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（９１０２）抗リン酸化ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３（９２７１）、抗リン酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（９１０１）、抗リン酸化ＥＧＦＲ（３７７７）、抗リン酸化ＭＥＴ（３０７７）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＭＥＴ（ＤＬ２１）自家製抗体及び抗ＥＧＦＲ（１００５ ｓｃ－０３）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。全ての一次抗体は、１：１０００に希釈した。適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：１００００－Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．）を、クラリティウェスタン（Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ）ＥＣＬ基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた化学発光による検出のために使用した。
【0055】
細胞生存率及びアポトーシスアッセイ
細胞生存率はセルタイターグロー（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。トランスフェクションは、３０００細胞／ウェルを播種した９６ウェルプレートにおいて、各ギャップマーを２５ｎＭで６回の実験で行った。発光は、テカンスパーク（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ）１０Ｍ機器（ＴＥＣＡＮ）を用いて、トランスフェクションから２４時間後に取得した。
細胞生存率はセルタイターグロー（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。トランスフェクションは、３０００細胞／ウェルを播種した９６ウェルプレートにおいて、各ギャップマーを２５ｎＭで６回の実験で行った。発光は、テカンスパーク（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ）１０Ｍ機器（ＴＥＣＡＮ）を用いて、トランスフェクションから２４時間後に取得した。
【0056】
アポトーシスアッセイは、ヨウ化プロピジウム及びアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ ＡＰＣ－コンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてサイトフルオリメーターによって行った。細胞は、上記のように１０ｃｍプレートでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に細胞をトリプシンにより剥離し、ＰＢＳで３回洗浄し、アネキシンＶアポトーシス検出キットＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて結合緩衝剤溶液（０．５Ｍ Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５Ｍ ＣａＣｌ２）中でアネキシンＶ ＡＰＣ－コンジュゲート及びヨウ化プロピジウムと共にインキュベートした。取得はＣｙＡｎサイトフルオロメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行い、データ解析にはサミット（Ｓｕｍｍｉｔ）ｖ４．３ソフトウェア（Ｄａｋｏ Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＩＮＣ．）を使用した。アポトーシス指数はアポトーシス細胞のパーセント比率で表し、式：（初期アポトーシス細胞数＋後期アポトーシス細胞数）／総検出細胞数を用いて算出した。
【0057】
Ｌ１－ＭＥＴのサイレンシング
Ｌ１－ＭＥＴを標的とするＡＳＯのインシリコ特徴付け
上述のように、配列ＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１）によってコードされるＬ１－ＭＥＴ転写産物の特定の７６ｂｐ領域を特定した後、それよりもアクセス可能性がより高いその一部を検出した。トレーニングしたアルゴリズムを全て考慮すると、２つの「ＡＳＯホットターゲット」領域が明らかになり、これらはＬ１－ＭＥＴの特定の領域の端部に位置していた。配列番号１５について報告された番号付けの後、予測されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの３７％がヌクレオチド＋２３６～＋２６６の間に検出され、これは特定領域の最初の３１塩基を表し、同一配列の末端の予測されたＡＳＯの３６％（ヌクレオチド＋２８９～＋３１１の間）を表す。したがって、検出された「ＡＳＯホットターゲット」領域はＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣ（配列番号２）及びＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号３）である。
Ｌ１－ＭＥＴを標的とするＡＳＯのインシリコ特徴付け
上述のように、配列ＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号１）によってコードされるＬ１－ＭＥＴ転写産物の特定の７６ｂｐ領域を特定した後、それよりもアクセス可能性がより高いその一部を検出した。トレーニングしたアルゴリズムを全て考慮すると、２つの「ＡＳＯホットターゲット」領域が明らかになり、これらはＬ１－ＭＥＴの特定の領域の端部に位置していた。配列番号１５について報告された番号付けの後、予測されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの３７％がヌクレオチド＋２３６～＋２６６の間に検出され、これは特定領域の最初の３１塩基を表し、同一配列の末端の予測されたＡＳＯの３６％（ヌクレオチド＋２８９～＋３１１の間）を表す。したがって、検出された「ＡＳＯホットターゲット」領域はＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣ（配列番号２）及びＴＴＡＧＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号３）である。
【0058】
予測されたＡＳＯのうち、＋２６７～＋２８８の間に構成されるヌクレオチド位置をカバーするものは３つだけであった。ＡＳＯの評価を完了するために、ウェブソフトウェアｓＦＯＬＤのｓＲＮＡツールを適用して、設計したアンチセンスオリゴの二次構造を予測し、その熱安定性のレベルを決定した。文献によると、自己フォールディングＡＳＯの割合が高いことは、二次構造を形成する確率の低下と関連する標的結合が増加し、効率が低下すると考えることができることが知られている。そのため、ＡＳＯの有効性を決定するために、ギブス（Ｇｉｂｂｓ）自由エネルギー（ΔＧ）を算出した。ΔＧは、完全にアンフォールドした分子をフォールディングことによって放出されるエネルギーを表していた。低レベルのΔＧは、高率に自己フォールディングする分子の特性であるが、一方、単一のＡＳＯのヌクレオチドによる水素結合の生成が少ないほど、ＡＳＯは二次構造を形成しにくくなった。この文脈では、より安定なアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ΔＧが正の値のもの）が最も効率的であると考えることができる。文献では、ΔＧ≦－１．１というカットオフが定義されていた。さらに、ＡＳＯ及び標的ｍＲＮＡによって形成されるヘテロ二重鎖は、転写産物の二次フォールディングにも依存した。長いサイズのＲＮＡ分子は常にスーパーフォールディングされており、小さなＡＳＯとは反対に、二次構造を有する領域は、特に配列の末端に位置する場合、ハイブリダイゼーションへのアクセスがより容易であることが報告されている。Ｌ１－ＭＥＴの全配列のフォールディングを検討するために、ｓＦＯＬＤウェブページのｓＲＮＡアルゴリズムに問い合わせた。表２には、Ｌ１－ＭＥＴを標的とする１１の予測されたＡＳＯが、関連するΔＧ値と共に報告されている。
【0059】
【表2】
【0060】
Ｌ１－ＭＥＴサイレンシングの効果を評価するために、Ｅｘｉｑｏｎは、２つのホット領域と、アクセス可能性が低いと予測される７６ｂｐ領域の中央のヌクレオチドもカバーする３つの異なるＡＳＯの設計を委託された。詳細には、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１（配列番号４）はヌクレオチド＋２５１～ヌクレオチド＋２６６の間の領域に相補的であり、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２（配列番号５）は＋２８９～＋３０４の間の配列をカバーする。第３のＡＳＯ（Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３（配列番号６））は、配列のより中央部（＋２７３～＋２８８の間）に重複していた。図３は、本発明のＡＳＯの二次構造を表しており、２つの低フォールディング分子（Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１／２）の横で、明確なヘアピン構造を有するＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３は、非結合塩基３７．５％のみを示していた。ΔＧについては、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３が最も負の値（ΔＧ＝－２．７）であることが確認されており、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２のΔＧは０．６であった。この性質に関しては、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１がより優れた設計のＡＳＯであると評価された（ΔＧ＝２．５）。図４に、Ｌ１－ＭＥＴの二次構造の検討結果をまとめる。最初のパネルＡは、二次構造についての円グラフを示しており、Ｌ１－ＭＥＴは５０００ｂｐ超で構成されているため、このグラフは二次構造を図式化している。具体的な標的配列は、表の下側の半円部分に含まれており、これを図４Ｂにおいて拡大している。より詳細には、パネルＣに７６ｂｐの具体的な配列の二次構造を拡大したものを報告する。３つの設計されたＡＳＯと相補的な部分は丸で囲んだ。全ての標的領域は内部ループ（Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＡＳ２）又はヘアピン（Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３）を示し、予測結果が確認された。しかし、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＡＳ２は、自由端を有する二次構造によって特徴付けられる、最も好ましい領域を標的としていた。結論として、これまでの全てのデータを総合すると、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３は、ΔＧとは独立して含まれているが、潜在的な活性は低かった。
【0061】
表２に報告されているように、他の全ての予測されたＡＳＯについてΔＧが算出され、より優れたΔＧを有する他のＡＳＯが存在したにもかかわらず、Ｅｘｉｑｏｎが設計した３つを、本明細書に記載する実験に使用したが、この理由は、独自の設計ツールを使用して生成されているためである。しかしながら、本発明で報告された他のＡＳＯの効率は除外されない。
【0062】
遺伝子発現解析
Ｌ１－ＭＥＴのサイレンシングは、Ｌ１－ＭＥＴ及びＭＥＴ ｍＲＮＡの発現が変動する細胞株をトランスフェクトして行った。実験は、肺癌（ＥＢＣ１、Ａ５４９：Ｌ１－ＭＥＴ＋／ＭＥＴ＋）、及び乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ２３１：Ｌ１－ＭＥＴ±／ＭＥＴ＋、ＭＣＦ７：Ｌ１－ＭＥＴ＋／ＭＥＴ－）において行った。また、正常対照として、非形質転換繊維芽細胞、すなわちＭＲＣ５と、健常ドナーから得た末梢血由来の正常リンパ球も使用した。Ｌ１－ＭＥＴの発現は、ＥＢＣ１、Ａ５４９、及びＭＣＦ７で通常高く、ＭＤＡ－ＭＢ２３１で弱いことが見出されたが、ＭＲＣ５及び正常リンパ球では転写が検出されなかった（図５）。トランスフェクションから２４時間後のｑＲＴ－ＰＣＲによって、全ての癌細胞株でＬ１－ＭＥＴの遺伝子発現が減少していたが、正常細胞（ＭＲＣ５及びリンパ球）では減少していないことが示され、サイレンシングの有効性が確認された。図６に示すように、３つのギャップマーについての低下サイレンシング効果が観察され、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２が最も有効であり、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１がそれに続いた。上記の予測通り、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３は、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物のサイレンシングについては、効果がより低かった。
Ｌ１－ＭＥＴのサイレンシングは、Ｌ１－ＭＥＴ及びＭＥＴ ｍＲＮＡの発現が変動する細胞株をトランスフェクトして行った。実験は、肺癌（ＥＢＣ１、Ａ５４９：Ｌ１－ＭＥＴ＋／ＭＥＴ＋）、及び乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ２３１：Ｌ１－ＭＥＴ±／ＭＥＴ＋、ＭＣＦ７：Ｌ１－ＭＥＴ＋／ＭＥＴ－）において行った。また、正常対照として、非形質転換繊維芽細胞、すなわちＭＲＣ５と、健常ドナーから得た末梢血由来の正常リンパ球も使用した。Ｌ１－ＭＥＴの発現は、ＥＢＣ１、Ａ５４９、及びＭＣＦ７で通常高く、ＭＤＡ－ＭＢ２３１で弱いことが見出されたが、ＭＲＣ５及び正常リンパ球では転写が検出されなかった（図５）。トランスフェクションから２４時間後のｑＲＴ－ＰＣＲによって、全ての癌細胞株でＬ１－ＭＥＴの遺伝子発現が減少していたが、正常細胞（ＭＲＣ５及びリンパ球）では減少していないことが示され、サイレンシングの有効性が確認された。図６に示すように、３つのギャップマーについての低下サイレンシング効果が観察され、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２が最も有効であり、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１がそれに続いた。上記の予測通り、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３は、Ｌ１－ＭＥＴ転写産物のサイレンシングについては、効果がより低かった。
【0063】
細胞生存率及びアポトーシスアッセイ
Ｌ１－ＭＥＴサイレンシングの生物学的効果を調べるために、細胞生存率アッセイを行った。Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２（ｐ＜０．０００１）及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１（ＥＢＣ１ ｐ＜０．０００１及びＡ５４９ ｐ＝０．０００１）で処理した場合、ＥＢＣ１及びＡ５４９細胞株で強い生存率の低下が観察されたが、一方、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３で処理したＥＢＣ１のみが対照と比較して低い生存率を示した（ｐ＝０．００２）（図８）。Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（ｐ＜０．０００１）及びＭＣＦ７（ｐ＝０．０２８）に対して有意に影響した。予想通り、対照細胞の生存率は、３つのギャップマーによるサイレンシングによって影響を受けなかった（図７）。
Ｌ１－ＭＥＴサイレンシングの生物学的効果を調べるために、細胞生存率アッセイを行った。Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２（ｐ＜０．０００１）及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１（ＥＢＣ１ ｐ＜０．０００１及びＡ５４９ ｐ＝０．０００１）で処理した場合、ＥＢＣ１及びＡ５４９細胞株で強い生存率の低下が観察されたが、一方、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３で処理したＥＢＣ１のみが対照と比較して低い生存率を示した（ｐ＝０．００２）（図８）。Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１（ｐ＜０．０００１）及びＭＣＦ７（ｐ＝０．０２８）に対して有意に影響した。予想通り、対照細胞の生存率は、３つのギャップマーによるサイレンシングによって影響を受けなかった（図７）。
【0064】
最後に、フローサイトメトリーを用いて行った、癌細胞について行ったアポトーシス評価により、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１又はＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２オリゴヌクレオチドを用いたＬ１－ＭＥＴサイレンシング後にＥＢＣ１及びＡ５４９細胞が顕著に細胞死を起こすことが明らかになった。Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２のサイレンシングはＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１＿で得られたものより強く、ＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞でも検出可能であった。Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３によるサイレンシングは、アポトーシスへの影響を示さなかった（図８）。
【0065】
ＲＮＡｓｅｑ解析
ＮＧＳ解析は、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１で処理した癌細胞について行い、他の２つのＡＳＯは、遺伝子型及び表現型への影響が正反対且つ極端であるため考慮しないこととした。ＲＮＡ－ｓｅｑ ｍＲＮＡ イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）キットを適用し、これは、Ｌ１－ＭＥＴもポリＡを維持するという論文、ｄｉ Ｍｉｇｌｉｏら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０１８で明らかになった根拠に基づき、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１で処理した上記細胞のポリＡ－テールＲＮＡを選択することを意味した。ａ）処理後のＬ１－ＭＥＴの低下を明確に確認するため、ｂ）処理後の遺伝子発現調節を評価し、処理後に影響を受けたより興味深い遺伝子を特定するため、ｃ）ＲＮＡ－ｓｅｑデータについてオフターゲット解析を行うために、３０００万リード深度に達することを決定した。ｑＲＴ－ＰＣＲでは、全ての細胞でＬ１－ＭＥＴの発現が検出されることが確認された。ＡＳＯで処理した細胞では、同じようにＬ１－ＭＥＴの減少が検出され、サイレンシングの有効性が確認された。差次的な遺伝子発現については、処理後２４時間時点で、明らかな遺伝子セットが特異的な調節を起こした。その中で、ＥＧＦＲ及びＭＥＴの癌遺伝子は、ＭＣＦ７を除く全ての処理細胞で減少した。本文脈において、オフターゲット配列となり得る配列を評価することが必須となった。ＢＬＡＳＴＮツールを用いたインシリコアライメントでは、オフターゲットとなり得る完全一致配列はごくわずかしか特定されなかったが、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１と全サンプルで得られたリードとの間の経験的完全一致－４塩基不一致アライメントを設定した。このアライメント手順により、オフターゲットと考えられる遺伝子が明らかになり、遺伝子調節を確認した。興味深いことに、予測されたオフターゲットはいずれもリード数が減少しておらず、望ましくない遺伝子発現の変化がないことが確認された。間接的には、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ遺伝子の調節は、サイレンシングの副作用ではないと考え得ることが確認された。
ＮＧＳ解析は、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１で処理した癌細胞について行い、他の２つのＡＳＯは、遺伝子型及び表現型への影響が正反対且つ極端であるため考慮しないこととした。ＲＮＡ－ｓｅｑ ｍＲＮＡ イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）キットを適用し、これは、Ｌ１－ＭＥＴもポリＡを維持するという論文、ｄｉ Ｍｉｇｌｉｏら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０１８で明らかになった根拠に基づき、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１で処理した上記細胞のポリＡ－テールＲＮＡを選択することを意味した。ａ）処理後のＬ１－ＭＥＴの低下を明確に確認するため、ｂ）処理後の遺伝子発現調節を評価し、処理後に影響を受けたより興味深い遺伝子を特定するため、ｃ）ＲＮＡ－ｓｅｑデータについてオフターゲット解析を行うために、３０００万リード深度に達することを決定した。ｑＲＴ－ＰＣＲでは、全ての細胞でＬ１－ＭＥＴの発現が検出されることが確認された。ＡＳＯで処理した細胞では、同じようにＬ１－ＭＥＴの減少が検出され、サイレンシングの有効性が確認された。差次的な遺伝子発現については、処理後２４時間時点で、明らかな遺伝子セットが特異的な調節を起こした。その中で、ＥＧＦＲ及びＭＥＴの癌遺伝子は、ＭＣＦ７を除く全ての処理細胞で減少した。本文脈において、オフターゲット配列となり得る配列を評価することが必須となった。ＢＬＡＳＴＮツールを用いたインシリコアライメントでは、オフターゲットとなり得る完全一致配列はごくわずかしか特定されなかったが、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１と全サンプルで得られたリードとの間の経験的完全一致－４塩基不一致アライメントを設定した。このアライメント手順により、オフターゲットと考えられる遺伝子が明らかになり、遺伝子調節を確認した。興味深いことに、予測されたオフターゲットはいずれもリード数が減少しておらず、望ましくない遺伝子発現の変化がないことが確認された。間接的には、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ遺伝子の調節は、サイレンシングの副作用ではないと考え得ることが確認された。
【0066】
ウェスタンブロット解析
ＲＮＡｓｅｑから得られたデータを検証するために、ＭＥＴ及びＥＧＦＲタンパク質の発現並びにシグナル伝達経路の下流エフェクタ：ＡＫＴ及びＥＲＫを評価した。ウェスタンブロット解析結果を図９に示す。要約すると、ＥＢＣ１細胞におけるＬ１－ＭＥＴサイレンシング後、ＭＥＴ及びＥＧＦＲの両方並びに対応するリン酸化タンパク質のタンパク質発現の減少が、上記で観察された同じ有効性を有する３つのＡＳＯ全てについて観察され、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２が最も有効であり、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３がそれに続いた。ＥＢＣ１細胞株はＭＥＴのリン酸化に依存しているため、ＡＫＴ及びＥＲＫの活性化の減少も検出された。同様の結果は、ＥＲＫリン酸化の変化が観察されない限り、Ａ５４９でも見出された。ＭＤＡ－ＭＢ２３１では、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２の両方で、しかしＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３は使用しない、Ｌ１－ＭＥＴサイレンシングによってＥＧＦＲタンパク質の減少が誘導される。細胞をＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２で処理した場合のみ、ＭＥＴの発現が低下していることが確認された。ＭＣＦ７は文献に報告されているように、ＭＥＴもＥＧＦＲも発現しておらず、サイレンシングによる変化は誘導されなかった。正常細胞では、タンパク質の発現に違いは見られなかった。
ＲＮＡｓｅｑから得られたデータを検証するために、ＭＥＴ及びＥＧＦＲタンパク質の発現並びにシグナル伝達経路の下流エフェクタ：ＡＫＴ及びＥＲＫを評価した。ウェスタンブロット解析結果を図９に示す。要約すると、ＥＢＣ１細胞におけるＬ１－ＭＥＴサイレンシング後、ＭＥＴ及びＥＧＦＲの両方並びに対応するリン酸化タンパク質のタンパク質発現の減少が、上記で観察された同じ有効性を有する３つのＡＳＯ全てについて観察され、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２が最も有効であり、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３がそれに続いた。ＥＢＣ１細胞株はＭＥＴのリン酸化に依存しているため、ＡＫＴ及びＥＲＫの活性化の減少も検出された。同様の結果は、ＥＲＫリン酸化の変化が観察されない限り、Ａ５４９でも見出された。ＭＤＡ－ＭＢ２３１では、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２の両方で、しかしＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３は使用しない、Ｌ１－ＭＥＴサイレンシングによってＥＧＦＲタンパク質の減少が誘導される。細胞をＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２で処理した場合のみ、ＭＥＴの発現が低下していることが確認された。ＭＣＦ７は文献に報告されているように、ＭＥＴもＥＧＦＲも発現しておらず、サイレンシングによる変化は誘導されなかった。正常細胞では、タンパク質の発現に違いは見られなかった。
【0067】
全体として、これらの結果は、Ｌ１－ＭＥＴをＭＥＴ及び／又はＥＧＦＲと共に発現している細胞における、Ｌ１－ＭＥＴサイレンシングが有効であることを明らかに示している。さらに、３つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、それぞれ異なって細胞死を誘導することができることが見出された。詳細には、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ２によって得られる結果が最も有効であり、Ｌ１－ＭＥＴ＿ＡＳ１及びＬ１－ＭＥＴ＿ＡＳ３がそれに続いた。これらの根拠は、ヒトの癌に対する選択的な治療を開発するためにＬ１－ＭＥＴサイレンシングをインビボモデルに移行する可能性を示している。
【0068】
参考文献
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3. Swergold, G.D., Identification, characterization, and cell specificity of ahuman LINE-1 promoter. Mol Cell Biol, 1990. 10(12): p. 6718-29.
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5. Denli,A.M., et al., Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediateddiversity. Cell, 2015. 163(3): p. 583-93.
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14. Shao, Y., Y. Wu, C.Y. Chan, K. McDonough, and Y. Ding, Rational design andrapid screening of antisense oligonucleotides for prokaryotic gene modulation.Nucleic Acids Res, 2006. 34(19): p. 5660-9.
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16. Dobin, A., et al., STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics,2013. 29(1): p. 15-21.
17. Liao, Y., G.K. Smyth, and W. Shi, featureCounts: an efficient general purposeprogram for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics, 2014. 30(7): p. 923-30.
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】