特表 2023-502448 グラム陰性病原菌を選択的に殺滅する新規抗生物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-24

(54)【発明の名称】グラム陰性病原菌を選択的に殺滅する新規抗生物質

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20230117BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230117BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20230117BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20230117BHJP

   C07K 1/34 20060101ALI20230117BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20230117BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

C12P21/02 C

C07K1/14

C07K1/16

C07K1/34

A61P31/04 171

A61P31/04

A61K38/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022529489

(86)(22)【出願日】2020-11-20

(85)【翻訳文提出日】2022-07-14

(86)【国際出願番号】 EP2020025531

(87)【国際公開番号】W WO2021098989

(87)【国際公開日】2021-05-27

(31)【優先権主張番号】19210353.9

(32)【優先日】2019-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508159123

【氏名又は名称】ユストゥス－リービッヒ－ウニヴェルジテート・ギーセン

(74)【代理人】

【識別番号】100118913

【弁理士】

【氏名又は名称】上田 邦生

(74)【代理人】

【識別番号】100142789

【弁理士】

【氏名又は名称】柳 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100201466

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 邦彦

(72)【発明者】

【氏名】シェバレ， ティル

(72)【発明者】

【氏名】リナレス－オトヤ， ルイス， ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ボーリナー， ニルス

(72)【発明者】

【氏名】ウイサン， ゼルリーナ， ジー．

【テーマコード（参考）】

4B064

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4C084AA02

4C084AA06

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA17

4C084BA25

4C084CA04

4C084CA53

4C084CA56

4C084DA43

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB351

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA14

4H045CA11

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、グラム陰性菌、例えばPseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Shigella sonnei、Salmonella enterica Typhimurium LT2、Enterobacter spp.、Bifidobacterium longum、Bacteroides fragilis、Lactobacillus reuteri、Enterococcus spp.、Yersinia pestis、および多数の他のグラム陰性菌によって引き起こされる感染症に罹っている脊椎動物またはヒトにおける使用のための二環式ヘプタペプチドを含む医薬製剤に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉの二環式ヘプタペプチド、

【化1】

および／またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、互変異性体または水和物であって、
式中、
－ Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が、互いに独立して、Ｈ、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ_２）、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＨ_２－ＳＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＨ_２、（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、ハロゲン化（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、－ＣＨ（ＣＨ_３）（Ｃ_２Ｈ_５）、－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２ＮＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、ハロゲン化－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、（１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、ハロゲン化（^１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、ハロゲン化（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、－ＣＨ－（ＣＨ_３）_２、１－ヒドロキシ－エチル、ヒドロキシ－メチル、ｓｅｃ－ブチル、１－アセトアミド、１－チオアセトアミド、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２を含むリストから選択され；
－ Ｘが、Ｘの任意の位置において、Ｘの他の任意の位置とは独立して、ＯまたはＳのいずれかであり；
－ Ｒ^５が、メチルスルホニル、ｐ－トルエンスルホニルを含むリストから選択され；
－ Ｒ^６が、メチルスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２を含むリストから選択され；
－ Ｚ^１、Ｚ^２が、それぞれ二重結合または単結合であり、ただし
ａ）Ｚ^１およびＺ^２がいずれも単結合であるか、または
ｂ）それらのうちの一方のみが単結合であると同時に他方が二重結合であり、ここで、
ｉ）Ｚ^１が単結合であり、Ｚ^２が二重結合であるか、または
ｉｉ）Ｚ^２が単結合であり、Ｚ^１が二重結合である；
－ Ｙ^１が、３，７－インドリレンまたはハロゲン化３，７－インドリレンであり；
－ Ｙ^２が、３，６－インドリレン、１，４－フェノキシレン、ハロゲン化３，６－インドリレン、ハロゲン化１，４－フェノキシレンのリストから独立して選択され；
－ ｎが、１または２である、
二環式ヘプタペプチド。

【請求項2】

ダロバクチンである、請求項１に記載の二環式ヘプタペプチド。

【請求項3】

請求項１に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法であって、
ｉ）二環式ヘプタペプチドを産生する微生物を使用し、二環式ヘプタペプチドおよび微生物細胞を含有する発酵ブロスを提供する発酵ステップであって、前記微生物が、Photorhabdus spp.、Photorhabdus laumondii、Photorhabdus khanii、Pseudoalteromonas spp.、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Vibrio sppを含む微生物のリストから選択される、発酵ステップ；
ｉｉ）前記発酵ブロスを、沈降および／または遠心分離および／またはろ過によって、微生物細胞および／または該微生物細胞の破片を含有する不溶性部分と、二環式ヘプタペプチドを含有する溶液とに分離する分離ステップであって、前記微生物細胞が、沈降および／または遠心分離および／またはろ過を前記発酵ブロスに適用する前に破壊されているか、または破壊されていない、分離ステップ；
ｉｉｉ）先の分離ステップｉｉ）から得られた前記溶液内に含有される二環式ヘプタペプチドを精製し、精製された二環式ヘプタペプチドの溶液を提供する精製ステップ
を含む、方法。

【請求項4】

請求項３に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法であって、請求項３の前記精製ステップｉｉｉ）が、
ａ）請求項３のステップｉｉ）から得られた前記溶液を減圧下での凍結乾燥および／または蒸留によって乾燥させ、残渣を提供するステップ、
ｂ）先のステップａ）の前記残渣をアルコールで洗浄し、洗浄した残渣を乾燥させ、乾燥させた残渣を脱イオン水に溶解し、二環式ヘプタペプチドの粗抽出物を提供するステップ、
ｃ）先のステップｂ）の前記粗抽出物の不溶性部分を沈降および／またはろ過および／または遠心分離によって除去し、固体を含まない粗抽出物を提供するステップ、
ｄ）先のステップｃ）から得られた前記固体を含まない粗抽出物をクロマトグラフィによって精製し、それにより二環式ヘプタペプチドの純粋な溶液を提供するステップ
を含む、方法。

【請求項5】

請求項３に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法であって、請求項３の前記精製ステップｉｉｉ）が、
ａ）請求項３のステップｉｉ）から得られた溶液を、二環式ヘプタペプチドが疎水性相互作用材料に吸着されるように、該疎水性相互作用材料と接触させるステップ、
ｂ）残りの透明な溶液を前記疎水性相互作用材料から分離し、吸着した二環式ヘプタペプチドがロードされた前記疎水性相互作用材料を水で洗浄するステップ、
ｃ）二環式ヘプタペプチドを、水と有機溶媒の混合物によって前記疎水性相互作用材料から溶出させるステップであって、前記有機溶媒が、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、アセトン、エタノール、プロパノールを含むリストから選択され、水と有機溶媒の前記混合物が、０．００１重量％から１重量％までの間の量の酸を含有してもよく、または含有しなくてもよい、ステップ、
ｄ）ステップｃ）から得られた溶出液を濃縮し、真空を適用することによって前記有機溶媒を除去し、水溶液を、二環式ヘプタペプチドがカチオンイオン交換材料に吸着されるように、該強カチオンイオン交換材料と接触させるステップ、
ｅ）二環式ヘプタペプチドがロードされた前記カチオンイオン交換材料を、０．００１重量％から１重量％までの間の濃度を有する酸で洗浄するステップ、
ｆ）ｐＨ５～ｐＨ１１のｐＨ値を有する水性緩衝溶液を適用することによって二環式ヘプタペプチドを溶出させ、二環式ヘプタペプチドを含有する分画を収集するステップ、
ｇ）ステップｆ）の分画から得られた二環式ヘプタペプチドを、ステップａ）に記載される様式と同一の様式で疎水性相互作用材料に吸着させるステップ、
ｈ）二環式ヘプタペプチドをＨ_２Ｏと有機溶媒の勾配によって溶出させるステップであって、前記有機溶媒が、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、アセトン、エタノール、プロパノールを含むリストから選択される、ステップ、
ｉ）Ｈ_２Ｏと有機溶媒の勾配を用いたＨＰＬＣを適用することによって、ステップｈ）から得られた二環式ヘプタペプチドを含有する分画を精製するステップであって、前記有機溶媒が、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、アセトン、エタノール、プロパノールを含むリストから選択される、ステップ
を含む、方法。

【請求項6】

請求項３に記載の二環式ヘプタペプチドまたは請求項４に記載の二環式ヘプタペプチドまたは請求項５に記載の二環式ヘプタペプチドが、化学修飾によってさらに処理される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記化学修飾が、二環式ヘプタペプチドを、ローソン試薬または塩化トシルまたは塩化メシルと反応させることである、請求項６に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法。

【請求項8】

グラム陰性菌によって引き起こされる哺乳類における感染症を処置するための医薬組成物であって、請求項１に記載の二環式ヘプタペプチド、または、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは立体異性体を治療有効量含む、医薬組成物。

【請求項9】

少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

局所投与、全身投与、非経口投与、皮下投与、または経皮投与、直腸投与、経口投与、膣内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、眼内投与、耳内投与、静脈内投与、筋肉内投与、または腹腔内投与の形態である、請求項８から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

細菌感染症に罹っている哺乳類に投与され、
前記哺乳類に有益な効果を提供するために十分な頻度で十分な期間にわたって、前記哺乳類に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

細菌感染症に罹っている哺乳類に投与され、
前記細菌感染症が、グラム陰性菌の少なくとも１つのタイプ／株を伴う感染症である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

細菌感染症に罹っている哺乳類に投与され、
前記細菌感染症が、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Shigella sonnei、Salmonella enterica Typhimurium LT2、Enterobacter cloacae、Bifidobacterium longum、Bacteroides fragilis、Lactobacillus reuteri、Enterococcus faecalisおよびYersinia pestis、Pseudomonas、fluorescens、Pseudomonas acidovorans、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas putida、Stenotrophomonas maltophilia、Burkholderia cepacia、Aeromonas hydrophilia、Escherichia coli、Citrobacter freundii、Salmonella typhimurium、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi、Salmonella enteritidis、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Enterobacter aerogenes、Enterobacter spp.、Klebsiella oxytoca、Serratia marcescens、Francisella tularensis、Morganella morganii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri、Providencia stuartii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter haemolyticus、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberculosis、Yersinia intermedia、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella bronchiseptica、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus ducreyi、Pasteurella multocida、Pasteurella haemolytica、Branhamella catarrhalis、Helicobacter pylori、Campylobacter fetus、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Borrelia burgdorferi、Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Legionella pneumophila、Listeria monocytogenes、Neisseria meningitidis、Kingella、Moraxella、Gardnerella vaginalis、Bacteroides distasonis、Bacteroides 3452Aホモロジー群、Bacteroides vulgatus、Bacteroides ovalus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bacteroides eggerthii、Bacteroides splanchnicusを伴う感染症である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

グラム陰性菌によって引き起こされる感染症に罹っている脊椎動物またはヒトにおいて使用するためのダロバクチンまたはその誘導体を含む医薬製剤。

【請求項15】

前記グラム陰性菌が、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Shigella sonnei、Salmonella enterica Typhimurium LT2、Enterobacter cloacae、Bifidobacterium longum、Bacteroides fragilis、Lactobacillus reuteri、Enterococcus faecalis、およびYersinia pestisの群から選択される、請求項１４に記載の医薬製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グラム陰性病原菌に対する二環式ヘプタペプチド系抗生物質、その誘導体、およびそれらの製造（産生）、ならびに医薬における活性薬学成分（ＡＰＩ）としての使用に関する。

【背景技術】

【0002】

新規の抗生物質の現在のニーズは、薬物耐性グラム陰性病原菌に関して特に緊急である。これらの微生物は、ほとんどの化合物の浸透を制限する高度に制限的な透過性バリアを有する。結果的に、グラム陰性菌に対して作用する抗生物質のクラスの最新のものでも、前世紀の６０年間に開発されたものであった。

【0003】

グラム陰性菌に対して作用する化合物を発見することは難しい。グラム陰性菌は、望ましくない化合物から自身を保護するために外膜を有する。この膜は、負に帯電したリポ多糖（ＬＰＳ）の外膜で覆われており、これが大きい化合物および疎水性化合物に対するバリアとしての役目を果たす。内膜は、疎水性化合物による透過性を制限する。

【0004】

結果的に、複合バリア（外膜に加えて内膜）は、全ての分子を制限し、栄養は外膜ポリンおよび専用の輸送体を通して中に入る。バリアを通して漏れる薬物は、トランスエンベロープ多剤耐性ポンプ（ＭＤＲ）によって押し出され、このポンプは、細胞の親水性領域ならびに疎水性領域（例えば、膜）を通過する両親媒性化合物（ほとんどの薬物がそうである）を認識する。このように、技術水準では、グラム陰性菌の三重の防御機構（外膜、内膜、およびＭＤＲ）によって妨害されない異なる作用機序を有するＡＰＩが大いに必要である。

【発明の概要】

【0005】

ダロバクチンＡ（ＤＡＲ）は、リボソームによって合成され、翻訳後修飾を受けたペプチド（ＲｉＰＰ）系抗生物質であり、これはPhotorhabdus属に属する細菌から初めて同定された。加えて、対応する生合成遺伝子クラスタ（ＢＧＣ）が同定され、次いで、これはいくつかの細菌属において検出された。ＤＡＲは、新規の抗生物質治療剤の開発のための非常に有望なリード構造を表す。ＤＡＲは、外膜タンパク質ＢａｍＡを標的とし、したがってグラム陰性菌に対して特異的である。マウス感染症モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでの活性が証明されたことと共に、このことにより、ＤＡＲは今後の研究にとって特に有望な候補物質となる。ＤＡＲの今後の研究のための化合物供給を改善するために、および新規の誘導体の産生を可能にするために、これらのクラスのＲｉＰＰ抗生物質の有効かつ汎用性のある微生物産生プラットフォームを確立することが非常に望ましい。本明細書において、ＤＡＲおよび／またはその誘導体に関する異種産生および操作プラットフォームの設計および構築が明らかにされるが、これは、産生収量を確実にし、構造修飾アプローチを容易にする。公知の有用なグラム陰性菌であるEscherichia coliおよびVibrio natriegensを、異種宿主として試験した。それに加えて、ＤＡＲ産生株を生成し、発現構築物の最適化により、技術水準による製品説明と比較して濃度（力価）の約１０倍増加および発酵時間の５倍短縮を示すＤＡＲの産生力価を得た。同様に、ＲｉＰＰ（ダロバクチンおよび／またはその誘導体）の異種産生にとって必要であるのは２つの遺伝子に過ぎないことから、最小のＤＡＲ ＢＧＣを同定して明らかにする。

【0006】

ＤＡＲは、グラム陰性病原菌、例えばAcinetobacter baumannii（ＭＩＣ、８μｇ／ｍｌ）、Pseudomonas aeruginosa PAO1（ＭＩＣ、２μｇ／ｍｌ）、Escherichia coli野生型およびＭＤＲ株（ＭＩＣ、２～４μｇ／ｍｌ）、Klebsiella pneumoniae（ＭＩＣ、２～４μｇ／ｍｌ）、およびSalmonella enteritidis（ＭＩＣ、４μｇ／ｍｌ）を選択的に殺滅する新規の抗生物質であり、Photorhabdus khanii HGB1456において発見された。他の天然に存在する誘導体、例えばダロバクチンＢ、ならびに臭素化バリアントのそれぞれの誘導体は、E. coli野生型およびＭＤＲ株（ＭＩＣ、０．５～１μｇ／ｍｌ）、Klebsiella pneumoniae（ＭＩＣ、１μｇ／ｍｌ）、およびSalmonella enteritidis（ＭＩＣ、１μｇ／ｍｌ）に対して活性を示す。ＤＡＲがＯＭ β－バレルアセンブリ機構の中心成分であるＢａｍＡに結合することは、実験により証明された。ＢａｍＡは、ポリンなどのβ－バレルタンパク質のフォールディングおよびＯＭへの挿入を助ける。このシャペロン様機能が損なわれると、ＯＭ形成の破壊をもたらす。その良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に加えて、ＤＡＲは、マウス敗血症およびマウス大腿感染モデルにおいて、細胞傷害作用を示すことなく有望な有効性を示した。したがって、ＤＡＲは、有望な薬物リードとして出現している。

【0007】

本発明の目的は、グラム陰性菌に対して新規かつ予想外の方法で有効である医薬、およびそれ故にそれに対する耐性がグラム陰性菌に存在しない医薬の薬学的活性成分（ＡＰＩ）として使用することができる新規物質を提供することである。驚くべきことに、式Ｉによる二環式ヘプタペプチドは、特徴／細胞成分との相互作用を示し、これらの正の効果を提供する：これらは、魅力的であるが非常に珍しい標的でもあるＢａｍＡシャペロンおよびトランスロケータに対して作用する。ＢａｍＡシャペロンおよびトランスロケータは、ポリンなどのβ－バレルタンパク質のフォールディングおよび外膜への挿入を助ける。ＢａｍＡそのものは、外膜β－バレルタンパク質である。薬物全般、特に天然産物は通常、シャペロンではなくてこの十分に定義された触媒中心を有する酵素を標的とする。ダロバクチンは、ＢａｍＡとこの基質との間のタンパク質－タンパク質結合を妨害するためにおそらく必要である大きい分子である。表面上に標的が位置することは、グラム陰性菌の透過性バリアを超えて浸透するという難しい問題を解決するが、これはダロバクチンの場合ではいずれも必要ではない。外膜の表面上に露出された必須タンパク質は２つのみであり、ＢａｍＡおよびＬｐｔＤである。したがって、ＢａｍＡを標的とする二環式ヘプタペプチドは、グラム陰性菌の三重の防御機構（外膜、内膜およびＭＤＲ）を有効に迂回しており、抗生物質の活性に関する新規作用様式を提供する。

【0008】

【化1】

【0009】

スキーム１：二環式ヘプタペプチドの一般式Ｉ
スキームＩでは、置換基および指数は以下の値を有する：Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は、互いに独立して、Ｈ、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ_２）、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＨ_２－ＳＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＨ_２、（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、ハロゲン化（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、－ＣＨ（ＣＨ_３）（Ｃ_２Ｈ_５）、－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２ＮＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、ハロゲン化－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、（１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、ハロゲン化（１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、ハロゲン化（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、－ＣＨ－（ＣＨ_３）_２、１－ヒドロキシ－エチル、ヒドロキシ－メチル、ｓｅｃ－ブチル、１－アセトアミド、１－チオアセトアミド、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２を含むリストから選択される。Ｘは、Ｘの任意の位置において、Ｘの他の任意の位置から独立して、ＯまたはＳのいずれかである。Ｒ^５は、メチルスルホニル、ｐ－トルエンスルホニルを含むリストから選択され；Ｒ^６は、メチルスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２を含むリストから選択される。Ｚ^１、Ｚ^２はそれぞれ、二重結合または単結合であり、ただし、Ｚ^１およびＺ^２がいずれも単結合であるか、またはそれらのうちの一方のみが単結合であると同時に他方が二重結合であり、Ｚ^１が単結合かつＺ^２が二重結合であるか、またはその逆である。Ｙ^１は、３，７－インドリレンまたはハロゲン化３，７－インドリレンであり、Ｙ^２は、３，６－インドリレン、１，４－フェノキシレン、ハロゲン化３，６－インドリレン、ハロゲン化１，４－フェノキシレンのリストから独立して選択され、ｎは１または２である。

【0010】

ダロバクチンは、アミノ酸配列Ｗ^１－Ｎ^２－Ｗ^３－Ｓ^４－Ｋ^５－Ｓ^６－Ｆ^７を有する修飾ヘプタペプチドである。ＮＭＲ試験により、ダロバクチンにおいて２つの珍しい大員環架橋：Ｗ^１のＣ７インドールとＷ^３のβ－炭素との間の前例のない芳香族－脂肪族エーテル結合、およびＷ^３のＣ６インドールとＫ^５のβ－炭素との間の炭素－炭素結合が明らかとなった。トリプトファン－リシン結合が、２つの非活性化炭素の間で形成され、これは抗生物質にとってユニークなものである。この二環式構造は、ダロバクチンＡおよび本発明の全ての誘導体にとって特徴的かつ必須である。

【0011】

この７アミノ酸ペプチド（ダロバクチンＡ）の配列をP. temperataのゲノムと直接比較すると、５８アミノ酸長のペプチドをコードするオープンリーディングフレームのＣ末端付近で完全な一致が明らかとなる。ダロバクチンのリボソームによる合成は、アミノ酸骨格がＬ－立体配置であることを示唆している。大員環架橋は、ＮＯＥ相関に基づいてＲおよびＳ立体配置をそれぞれ有する、Ｗ３およびＫ５のβ－炭素で２つのキラル中心を生成する（図４）。ダロバクチン生合成をコードする推定のオペロン（図２）は、食品保存剤である抗生物質ナイシン、およびチオストレプトンを含む多様なリボソーム産生天然物をコードするＲｉＰＰの典型である。

【0012】

このｄａｒオペロンは、ｄａｒＡによってコードされるプロペプチド、化合物に対する宿主の耐性において役割を果たし得る小さいｒｅｌＥ型ＯＲＦ、ＡＢＣ型トランスエンベロープ輸送体をコードするｄａｒＢＣＤ、およびラジカルＳＡＭ酵素をコードするｄａｒＥからなる。ラジカルＳＡＭクラスの酵素は、非活性化炭素を連結可能なフリーラジカルに基づく反応を触媒する。これは、ダロバクチンおよびその誘導体におけるトリプトファン－リシンＣ－Ｃ結合の形成を説明する。そのようなＴｒｐ－Ｌｙｓ Ｃ－Ｃ結合は、Streptococcus thermophilusのペプチドフェロモンであるストレプチドにおいて最近報告された。２つの酵素の間には、全体的な相同性はほとんどないが、ＤａｒＥは、ＳＡＭおよびこの群に関して特徴的なＳＰＡＳＭドメインを含有する。オペロンは、第１環においてエーテル結合を作製するための個別の酵素を含有しない。ＲｉＰＰオペロンは、しばしば活性なペプチドを切断するプロテアーゼをコードするが、これはｄａｒオペロンには存在しなかった。したがって、全般的なタンパク質分解、自己切断、または産生株に存在する他のプロテアーゼは、プロペプチドの成熟に関与し得る。驚くべきことに、ＤａｒＥラジカルＳＡＭ酵素は、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ Ｃ－Ｃ結合およびＣ－Ｏ－Ｃ Ｔｒｐ－Ｔｒｐエーテル結合の両方の形成を触媒すると思われる。これらの２つの反応の化学は全く異なっており、ＤａｒＥ触媒の機序は明確に個別の調査を必要とする。推定のＢＧＣをダロバクチン産生と結びつけるために、本発明者らは、完全なＢＧＣ ｄａｒＡＢＣＤＥがダブルクロスオーバーによってPhotorhabdus khanii DSM3369から欠失したマーカーレスノックアウト変異体を生成した。ＤＡＲ産生は、得られた変異体株では消失した；対応する分子量を有する分子は、ＭＳによって検出できなかった（図１０）。重要なことに、ダロバクチンは、E. coliにクローニングされたｄａｒオペロンから異種で産生された（図１０）。このことは、ｄａｒオペロンがダロバクチンを作製するために十分であることを示している。本発明者らは、ｄａｒオペロンが、Photorhabdusにおいて一般的であることを発見し、本発明者らはこれをゲノム配列が利用可能な１６個の異なる種において検出した（図２ａ；図１０）。ｄａｒオペロンは、P. bodeiにのみ存在しなかった。ｄａｒ座を含有するゲノムとP. bodeiのゲノムとのシンテニーは、オペロンの境界を決定するために役立った（図２ａ）。本発明者らはまた、いくつかの異なるPhotorhabdusにおけるダロバクチンの産生も試験し、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ） culture collection由来のP. khanii DSM 3369の株においてダロバクチンの産生が最高であることを見出した。これは、ＢＧＣを持つ株が化合物を産生していることを示している。

【0013】

本発明者らは次に、プロペプチドおよびｄａｒコードペプチドをクエリとして使用し、細菌ゲノム配列データベース（ＮＣＢＩ）においてｄａｒ型オペロンに関する検索を拡大した。２つの検索により、４つのダロバクチンアナログをコードすると思われるｄａｒオペロンの相同体が同定された。したがって、本発明者らは、最初の化合物に名称ダロバクチンＡを提唱し、このクラスの抗生物質の予想されるアナログに関してダロバクチンＢ～Ｅを提唱した。Photorhabdus australisおよびPhotorhabdus asymbioticaでは、配列データは、Ｎ末端で２つのアミノ酸変化（ＳＫＳＦ→ＴＫＲＦ）を含有するダロバクチンＢの産生を示唆している。複数のYersinia種では、第２のアミノ酸（Ｎ→Ｓ）または第５のアミノ酸（Ｋ→Ｒ）のいずれか、または両方が修飾されている。本発明者らは、これらのアナログをダロバクチンＣ、Ｄ、およびＥと命名した。興味深いことに、ダロバクチンＣ配列は、ペストの原因菌であるYersinia pestis、およびヒト腸マイクロバイオーム由来のY. frederikseniiに（それぞれ）存在する。アミノ酸配列から推定されるダロバクチンＢ～Ｅの推定構造を図１０に示す。５つの化合物の中で、ダロバクチンＡは、最も一般的であり、対応するプロペプチド配列は、９つのシーケンシングしたPhotorhabdus種、７つのYersinia種、Vibrio crassostreae、およびPseudoalteromonas luteoviolaceaに存在し、その全てがγ－プロテオバクテリアである。このクラスの抗生物質の追加のメンバーは、より多くの細菌ゲノムがシーケンシングされると出現する可能性がある。

【0014】

これらの実験は、ダロバクチンが、グラム陰性病原菌に対する治療製剤または医薬製剤を開発するための有望なリード化合物であることを示唆している。本明細書に紹介した実験結果は、ＤＡＲに由来する二環式ヘプタペプチドが、グラム陰性病原菌に対する医薬製剤のための有効な化合物（ＡＰＩ）であることを示している。ダロバクチンおよび／または二環式ヘプタペプチドを含む医薬製剤は、グラム陰性菌によって引き起こされる感染症に罹っている鳥類、魚類、両生類、は虫類および哺乳類などの脊椎動物ならびにヒトにおいて有効である。グラム陰性菌は、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Shigella sonnei、Salmonella enterica Typhimurium LT2、Enterobacter cloacae、Bifidobacterium longum、Bacteroides fragilis、Lactobacillus reuteri、Enterococcus faecalis、およびYersinia pestisの群から選択される。この群は、本発明の範囲を制限することを意味せず、この群に属する他の多くのグラム陰性菌、例えばPseudomonas、fluorescens、Pseudomonas acidovorans、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas putida、Stenotrophomonas maltophilia、Burkholderia cepacia、Aeromonas hydrophilia、Escherichia coli、Citrobacter freundii、Salmonella typhimurium、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi、Salmonella enteritidis、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Enterobacter aerogenes、Enterobacter spp.、Klebsiella oxytoca、Serratia marcescens、Francisella tularensis、Morganella morganii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri、Providencia stuartii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter haemolyticus、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberculosis、Yersinia intermedia、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella bronchiseptica、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus ducreyi、Pasteurella multocida、Pasteurella haemolytica、Branhamella catarrhalis、Helicobacter pylori、Campylobacter fetus、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Borrelia burgdorferi、Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Legionella pneumophila、Listeria monocytogenes、Neisseria meningitidis、Kingella、Moraxella、Gardnerella vaginalis、Bacteroides distasonis、Bacteroides 3452Aホモロジー群、Bacteroides vulgatus、Bacteroides ovalus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bacteroides eggerthii、Bacteroides splanchnicusもまた存在する。

【0015】

二環式ヘプタペプチドおよび誘導体を製造／産生するために、本発明者らは、いくつかの異なる異種宿主を選択し、ＢＧＣの上流領域を含む、異なる種由来のそれぞれのＤＡＲ ＢＧＣをクローニングし、最後にＤＡＲ産生を強化するためにＤＡＲ耐性異種宿主を作製した。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】リボソームによって合成されるダロバクチン（ＤＡＲ）およびｄａｒオペロンによってコードされる翻訳後修飾ペプチド（ＲｉＰＰ）の図である。（ａ）ＤＡＲは、Ｗ^１とＷ^３との間にエーテル結合を有し、Ｗ^３とＫ^５との間にＣ－Ｃ結合を有する、７アミノ酸Ｗ^１－Ｎ^２－Ｗ^３－Ｓ^４－Ｋ^５－Ｓ^６－Ｆ^７からなる修飾ヘプタペプチドである。（ｂ）ｄａｒ ＢＧＣ（全体で長さ６．２ｋｂ）は、前駆体ペプチドをコードするｄａｒＡ；ＡＢＣ輸送体のサブユニットをコードするｄａｒＢＣＤ；およびラジカルＳ－アデノシルメチオニン酵素（ＲａＳ）をコードするｄａｒＥからなる。

【図2】選択された細菌株におけるダロバクチンの生合成遺伝子クラスタ（ＢＧＣ）の図である。（ａ）ＢＧＣは、構造遺伝子ｄａｒＡ（青色）、ｄａｒＢＣＤ（輸送体コード遺伝子、灰色）、およびｄａｒＥ（ラジカルＳＡＭ酵素をコードする、オレンジ）からなる。加えて、ｒｅｌＥ様遺伝子（黒色）ＯＲＦが、異なる位置でＢＧＣと共局在し得る。ＢＧＣは、ほとんどのPhotorhabdus株において保存された遺伝子領域で検出され得る。加えて、相同なＢＧＣ（関連する遺伝子は同一の色コードを示す）が、Yersinia、VibrioおよびPseudoalteromonas株に存在する。（ｂ）生合成仮説を示す。ｄａｒＡによってコードされるプロペプチドは、５８アミノ酸からなる。架橋はＤａｒＥによって線形のプロペプチドに導入される。次のステップでは、リーダーおよびテール領域が切断され、ダロバクチンは、ＡＢＣ輸送体ＤａｒＢＣＤによって分泌される。（ｃ）選択された細菌株由来のプロペプチドのアミノ酸配列を示す。ダロバクチンコアペプチドを、太字で強調し、架橋に関係するアミノ酸を太字の赤色で強調する。星印は、終止コドンを示す。配列番号３１は、Photorhabdus temperata由来のｄａｒＡであり、配列番号３２は、Photorhabdus khanii由来のｄａｒＡであり、配列番号３３は、Photorhabdus australis由来のｄａｒＡであり、配列番号３４は、Photorhabdus laumondii由来のｄａｒＡであり、配列番号３５は、Yersinia frederiksenii由来のｄａｒＡであり、配列番号３６は、Vibrio tasmaniensis由来のｄａｒＡであり、配列番号３７は、Pseudoalteromonas luteoviolacea由来のｄａｒＡである。枠は、式Ｉによる典型的なヘプタペプチドを形成する微生物由来のコンセンサス配列を示している。

【図3】本研究において作製された発現構築物の図である。ＤＡＲ ＢＧＣを、Ｔ７ｌａｃプロモータの制御下でｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１ベクターにクローニングした。ｐＺＷ－ＡＤＣ３は、全ての遺伝子間領域が除去されたP. khanii HGB1456由来の簡素化されたＤＡＲ ＢＧＣを有し、一方、ｐＺＷ－ＡＤＣ５およびｐＺＷ－ＡＤＣ６はそれぞれ、P. khanii HGB1456およびP. khanii DSM3369由来のネイティブクラスタを有する。ｐＺＷ－ＡＤＣ３およびｐＺＷ－ＡＤＣ５に第２のｄａｒＡコピーを追加し、ｐＺＷ－ＡＤＣ３．２およびｐＺＷ－ＡＤＣ５．２を作製した。プラスミドｐＺＷ－ＡＤＣ７は、ｄａｒＡの追加の２００ｂｐ上流領域を有するP. khanii HGB1456由来ＤＡＲ ＢＧＣを有し、ｐＺＷ－ＡＤＣ８は、６０５ｂｐ上流領域を持つ。プラスミドｐＺＷ－ＡＤＣ９は、P. khanii DSM3369由来ＤＡＲ ＢＧＣを持つが、ｄａｒＢＣＤを欠如し；およびｐＺＷ－ＹｅｒＡ４は、Yersinia frederiksenii ATCC 33641由来のＤＡＲ ＢＧＣを有する。黒色の矢印は、Ｔ７ｌａｃプロモータを示し、ｌａｃＩ、ＲＳＦおよびカナマイシン耐性カセット（Ｋａｎ^Ｒ）の色コードは、一定に保たれている。ｌａｃＩ遺伝子は、ｌａｃオペロンリプレッサーをコードし、ＲＳＦは、ＲＳＦ１０３０に由来した複製開始点であり、これによってプラスミドは細胞において高コピー数で維持することができる。

【図4-1】ダロバクチンＢのＮＭＲケミカルシフト（ｐｐｍ）および追加のＮＭＲ実験データの図である。

【図4-2】ダロバクチンＢのＮＭＲケミカルシフト（ｐｐｍ）および追加のＮＭＲ実験データの図である。

【図4-3】ダロバクチンＢのＮＭＲケミカルシフト（ｐｐｍ）および追加のＮＭＲ実験データの図である。

【図4-4】ダロバクチンＢのＮＭＲケミカルシフト（ｐｐｍ）および追加のＮＭＲ実験データの図である。

【図4-5】ダロバクチンＢのＮＭＲケミカルシフト（ｐｐｍ）および追加のＮＭＲ実験データの図である。

【図5A】ダロバクチンＢのＮＭＲ帰属の図である。ダロバクチンＢの構造をＮＭＲ帰属の番号付けと共に示す。

【図5B】ダロバクチンＢのＮＭＲ帰属の図である。基本的なＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹ相関（曲がった両側の矢印はＣＯＳＹ相関を示し、太い結合はＴＯＣＳＹ相関を示す）を示す。

【図5C】ダロバクチンＢのＮＭＲ帰属の図である。基本的なＨＭＢＣ相関（曲がった両側の矢印はＨＭＢＣ相関を示し、太い結合はＣＯＳＹ／ＴＯＣＳＹ相関を示す）を示す。

【図6】本発明に係る追加の例示的に提示される二環式ヘプタペプチドの図であり；これらは、本発明の範囲を制限すると理解されるものではない（二環式ヘプタペプチドＩＩＩ～ＶＩ）。

【図7】本発明に係る追加の例示的に提示される二環式ヘプタペプチドの図であり；これらは、本発明の範囲を制限すると理解されるものではない（二環式ヘプタペプチドＶＩＩ～Ｘ）。

【図8】本発明に係る追加の例示的に提示される二環式ヘプタペプチドの図であり；これらは、本発明の範囲を制限すると理解されるものではない（二環式ヘプタペプチドＸＩ～ＸＩＶ）。

【図9】本発明に係る追加の例示的に提示される二環式ヘプタペプチドの図であり；これらは、本発明の範囲を制限すると理解されるものではない（二環式ヘプタペプチドＸＶ～ＸＶＩＩＩ）。

【図10A】ダロバクチンノックアウト株および異種発現、ならびにダロバクチンＡ～Ｅの推定構造および産生株の図である。ダブルクロスオーバーノックアウトベクターｐＮＢ０２および標的化ゲノム領域のスキームである。

【図10B】ダロバクチンＢＧＣ発現プラスミドのスキームである。

【図10C】ダロバクチンＢＧＣの喪失を証明する、P. khanii DSM3369 ΔｄａｒＡＢＣＤＥの試験ＰＣＲの図であり；左：ｄａｒＡの増幅（プライマｄａｒＡ＿ｆ／ｒ）によって、ＷＴでは１７７ｂｐ断片が得られる、変異体では断片が得られない；右：ＢＧＣが欠失している場合（プライマＤＳＭｋｏ＿ｆ／ｒ）、ｐＮＢ０２の喪失後（Ｋａｎに対する感受性によって示される）、４５０ｂｐ断片が増幅される；ポジティブコントロール：それぞれｐＮＢ０３－ｄａｒＡ～ＥおよびｐＮＢ０２であり；プライマの位置をスキームａにおいて青色で示す。

【図10D】ｍ／ｚ＝４８３．７０８９±０．００１でのＬＣ－ＭＳ抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の図であり、黄色：P. khanii DSM3369 ΔｄａｒＡＢＣＤＥ＋ｐＮＢ０３、赤色：P. khanii DSM3369 ΔｄａｒＡＢＣＤＥ＋ｐＮＢ０３－ｄａｒＡ～Ｅ、茶色：E. coli BW25113＋ｐＮＢ０３－ｄａｒＡ～Ｅ、青色：P. khanii DSM3369 WT、挿入図：ダロバクチンに対応する二重荷電［Ｍ＋２Ｈ］^２＋イオンを示すイオンピークのＨＲＭＳスペクトル。

【図10E】ダロバクチンＢＧＣに存在するアミノ酸配列に基づき、推定のダロバクチンアナログＢ～Ｅを描いた図である。提唱される産生生物はダロバクチンＡの７アミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ検索によって同定され、プロペプチドの下流のｄａｒＢＣＤＥの存在が確認された。ダロバクチンＡからのアミノ酸変化を赤色で強調する。

【図10F】様々なダロバクチンアナログのプロペプチド配列を示す表である。

【図11】本発明に係る追加の例示的に提示される二環式ヘプタペプチドの図であり；これらは、本発明の範囲を制限すると理解されるものではない（二環式ヘプタペプチドＩＸＸ～ＸＸＩ）。

【図12】本発明に係る追加の例示的に提示される二環式ヘプタペプチドの図であり；これらは、本発明の範囲を制限すると理解されるものではない（二環式ヘプタペプチドＸＸＩＩ）。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の以下の実施形態は、好ましい実施形態の例であり、本発明の範囲を決して限定しないことを意味する。本明細書で明らかにした株と類似の微生物株もまた、本発明の範囲から外れることなく使用することができることは、当業者に明白である。同じことが、以下の本明細書で明らかにした化学修飾、製造プロセスのステップ、ならびに提示される医薬製剤および適用方法にも当てはまる。

【0018】

（二環式ヘプタペプチドの産生のためのPhotorhabdus種の発酵の全般的説明）
Photorhabdus種の株を、適した成長培地（例えば、lysogeny broth ３ｍＬ：トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ）に接種し、インキュベートして成長を促進させる。この前培養物のアリコートを使用して、振とうフラスコ中の主培養（例えば、ＬＢ培地）培地に接種し、インキュベートして採取するまで成長を促進させる。

【0019】

（二環式ヘプタペプチドの産生のためのPseudoalteromonas株の発酵の全般的説明）
二環式ヘプタペプチドの発現に対応する生合成遺伝子クラスタ（例えば、プロペプチド、修飾ラジカルＳＡＭ酵素およびＦＡＤ依存的ハロゲナーゼをコードする８つの遺伝子、機能不明の１つの遺伝子、ならびに４つの輸送体遺伝子で構成される）を含有するPseudoalteromonas株、例えばPseudoalteromonas luteoviolacea H33およびH33Sを、適した培地中で培養する。適した培地は、例えば、マリンブロス、または、緩衝された人工海水処方、適した炭素源、例えば糖（例えば、グルコース、ラムノース）、適した窒素源、例えばアンモニウム含有塩（ＮＨ_４Ｃｌ）、または複合炭素窒素源、例えばカシトンまたは酵母抽出物を含有する類似の培地等である。培養物を適した温度（４℃～４０℃）で２０ｍＬ～２Ｌの体積中、振とうしながら、または振とうせずに（または振とう／混合しながら、または振とう／混合せずに生産規模の発酵器中で）、および低分子誘導剤、例えばＮ－アシルホモセリンラクトン誘導体を加えてまたは加えずに１～７日間インキュベートする。培養培地を、例えば遠心分離によって細胞から分離し、清澄化した培地を精製のためにさらに処理する。Photorhabdus ＢＧＣに加えてＦＡＤ依存的ハロゲナーゼを有するＢＧＣおよび機能不明の１つの遺伝子を有する株から、ハロゲン化（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ）および非ハロゲン化二環式ヘプタペプチド、および追加の二重結合を有するまたは有しないバリアント（例えば、デヒドロ誘導体）を単離することができる。ハロゲン化誘導体を生成するために、適した酵素を、Pseudoalteromonas luteoviolacea H33およびH33SのＢＧＣにおいてコードされるＦＡＤ依存的ハロゲナーゼとしてｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することができる。当業者に公知であるように、芳香環内のハロゲンの位置は、特定の位置でのハロゲン化を触媒している異なるハロゲナーゼを使用することによって変化させることができる。

【0020】

同様に、例えば海洋生物によって産生された、天然に存在するポリハロゲン化（例えば、ポリ臭素化、ポリ塩素化）化合物も存在することもまた、技術水準において周知である。したがって、本発明の範囲は、ポリハロゲン化二環式ヘプタペプチドも明白に含む。スキーム１は、モノハロゲン化またはポリハロゲン化され得る二環式ヘプタペプチドの芳香族およびヘテロ芳香族部分構造を示す。

【0021】

【化2】

【0022】

スキーム２：式Ｉによる二環式ヘプタペプチドの可能なハロゲン化部分構造ＩＩａ～ＩＩｆ、式中、置換基Ｒ^２０、Ｒ^２１、Ｒ^２２、Ｒ^２３、Ｒ^２４、Ｒ^２５、Ｒ^２６、Ｒ^２７、Ｒ^２８、Ｒ^２９、Ｒ^３０、Ｒ^３１、Ｒ^３２、Ｒ^３３、Ｒ^３４、Ｒ^３５、Ｒ^３６、Ｒ^３７、Ｒ^３８は、互いに独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉである。

【0023】

部分構造ＩＩａは、式ＩのＹ^１としてのハロゲン化３，７－インドリレンを表し、部分構造ＩＩｂは、式ＩのＹ^２としてのハロゲン化３，６－インドリレンを表し、部分構造ＩＩｃは、式ＩのＹ^２としてのハロゲン化１，４－フェノキシレンを表し、部分構造ＩＩｄ、ＩＩｅ、ＩＩｆおよび部分構造ＩＩｃは、式Ｉの任意のハロゲン化芳香族またはヘテロ芳香族置換基Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４を表し、特にハロゲン化（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、ハロゲン化－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、ハロゲン化（１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、ハロゲン化（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、ハロゲン化ベンジルを表している。

【0024】

ＦＡＤ依存的ハロゲナーゼを含有する製剤を、二環式ヘプタペプチドのハロゲン化のために使用することができる。酵素を、当業者に周知の手順によって異種で過剰発現させ、精製することができる。精製された酵素（１００μＬ）を、精製フラビンレダクターゼ（酵素は、当業者に周知の手順によって生成することができる）１０μＬ、１０μＭ ＦＡＤ、２．４ｍＭ ＮＡＤＨ、２５ｍＭ ＫＢｒ、０．１５ｍＭ基質（例えば、ダロバクチンＡ）および１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）と共に全量３００μＬ中でインキュベートした。反応物を、１８℃で２４時間インキュベートし、ＬＣ－ＭＳ分析の前に等量のメタノールを加えることによって停止させた。得られた産物は、臭素化ダロバクチンＡであった。

【0025】

（二環式ヘプタペプチドの精製のための全般的方法）
方法Ａ：
細胞を、１０，０００×ｇで５分間の遠心分離によって沈降させ、上清を、凍結乾燥のために丸底フラスコ内に収集する。乾燥させた上清をメタノールによって２回洗浄する。２回の洗浄ステップの後、メタノールを完全に除去し、脱イオン水を加えて粗抽出物を溶解する。１０，０００×ｇで５分間の遠心分離ステップを行って、不溶性部分を除去する。次に、粗抽出物を、逆相フラッシュクロマトグラフィ（Puriflash C18-HP30mmフラッシュカラムを備えたInterchim Puriflash 4125クロマトグラフィシステム、５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ～１００％ＭｅＯＨの１時間の勾配溶出）に供する。ＤＡＲを含有する分画をＨＰＬＣによってさらに精製する。Ｃ１８カラム（Macherey Nagel、EC 250/4.6 Nucleodur C18 Gravity-SB、５μｍ）を、以下の方法で使用する：

【0026】

【表1】

【0027】

溶媒Ａは、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液である。溶媒を、ＨＰＬＣシステムの中に流速１ｍＬ／分のポンプで送る。ＤＡＲは、１５．９０分～１７．１０分に分画収集器によって収集する。

【0028】

方法Ｂ：
清澄化した培地を疎水性相互作用材料（例えば、Ｃ１８シリカ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ－１６Ｎ）に適用し、Ｈ_２Ｏで洗浄し、有機溶媒（例えば、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ）と０．１％ギ酸を含むまたは含まないＨ_２Ｏとの混合物によって溶出した。溶出液を濃縮し、有機溶媒を真空下で除去し、水性の溶出液を、強カチオンイオン交換材料（例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ）にロードする。次いで、この材料を０．１％ギ酸で洗浄し、カラムに結合した材料を、適した緩衝系、例えばＮＨ_４ＣＨ_３ＣＯＯを使用してｐＨ５～ｐＨ１１で溶出する。分画を、ＬＣＭＳによって分析し、目的の化合物を含有する分画をプールして、疎水性相互作用材料（例えば、Ｃ１８シリカ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ－１６Ｎ）に結合させ、Ｈ_２Ｏおよび有機溶媒（例えば、ＭｅＣＮ）の勾配によって溶出する。ピークを、ＵＶ吸収に基づいて収集し、収集した分画をＬＣＭＳによって分析する。目的のペプチドを含有する分画を、Ｈ_２Ｏおよび適した有機溶媒（例えば ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ）の勾配を用いたＨＰＬＣによって分離する。ピークを収集して、目的の純粋な化合物を得る。

【0029】

上記の発酵プロセスによって産生された任意のタイプのペプチドを、例えばそれらを異なる当量のローソン試薬、Ｏ，Ｏ－ジエチルアンモニウムホスホロジチオエート塩、Ｐ_４Ｓ_１０／ジメチコン、ＰＳＣｌ_３／Ｈ_２Ｏ／Ｅｔ_３Ｎ、または他の試薬と反応させることによって、必要に応じて適した保護基戦略を行ってさらに化学修飾することができることは当業者に周知である。そうすることによって、１つまたはさらには全てのアミド結合のチオアミド結合への置換を獲得することが可能である。さらに、アミノ基のスルホンアミドへの変換は、塩化メシル、塩化トシルまたは他の適した試薬で（必要に応じて保護された基質を）処理することによって可能である。したがって、この方法または他の方法で化学修飾された二環式ヘプタペプチドもまた、本発明の範囲に含まれる。

【0030】

（異種ダロバクチンＡ発現および最小生合成遺伝子クラスタの同定）
本発明の範囲は、当業者に明らかであるように、生合成に必要な遺伝子を任意の技術水準の発現ベクターに移入することにより、例えば異なるプロモータ、リボソーム結合部位、および発現の調節のためのさらなるエレメントを適用する、発現構築物の生成を含む。したがって、以下の例は、本発明の範囲を限定しないことを意味する。

【0031】

ＤＡＲの異種発現に関するこのプロジェクトにおいて、例示的ないくつかの構築物を生成した（図３）。本例では、発現構築物のために使用したベクターバックグラウンドは、ｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１（Merck KGaA、Darmstadt、Germany）であった。ＤＡＲ ＢＧＣを増幅するための鋳型として使用した染色体ＤＮＡを、innuPREP Bacteria DNA Kit（Analytik Jena AG、Jena、Germany）を使用して単離した。一般的に、断片を、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Ipswich、USA）を使用して増幅し、Large Fragment DNA Recovery Kit（Zymo Research、Irvine、USA）を使用してアガロースゲルから精製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Biometra TRIOサーモサイクラ（Analytik Jena AG、Jena、Germany）において、以下のプログラムを使用して実施した。９５℃で２分間；９５℃で４５秒、６０～７０℃で４５秒（適用されるアニーリング温度はプライマ配列に依存）、７２℃で３０秒／ｋｂ（伸長時間は増幅される断片の長さに応じて変化）を３４サイクル、続いて７２℃で５分間の最後の伸長ステップ。

【0032】

本発明の範囲が、生合成遺伝子クラスタ（ＢＧＣ）を有する任意の生物の使用、ＢＧＣのネイティブまたはコドン最適化型（一部または全体）を増幅または合成すること、およびこれを発現ベクターにクローニングすることを含むことは、当業者に明白である。ベクターは、その後、発現宿主に移入される。したがって、以下の例は、本発明の範囲を限定しないことを意味する。

【0033】

配列番号２５は、Photorhabdus_namnaonensis由来のコドン最適化ｄａｒＥを示す。配列番号２６は、Photorhabdus_namnaonensis由来のコドン最適化ｄａｒＡを示す。配列番号２７は、Pseudoalteromonas_luteoviolacea由来のコドン最適化ｄａｒＡを示す。配列番号２８は、Pseudoalteromonas_luteoviolacea由来のコドン最適化ｄａｒＥを示す。配列番号２９は、Pseudoalteromonas_luteoviolacea＿ダロバクチン－ハロゲナーゼコドン最適化を示す。配列番号３０は、Pseudoalteromonas_luteoviolacea＿タンパク質＿ｗｏ＿相同性＿コドン最適化を示す。

【0034】

プラスミドｐＺＷ－ＡＤＣ３は、ｄａｒＡとｄａｒＢとの間に遺伝子間領域を有しないＤＡＲ ＢＧＣの遺伝子を有する。したがって、ｄａｒＡは、プライマ対を使用してPhotorhabdus khanii HGB1456から増幅され；およびｄａｒＢ～ｄａｒＥは、それぞれのプライマを使用して増幅され、これらの全ての増幅は当業者に公知である方法に従って実施される。ｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１を、ＮｄｅＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ England Biolabs、Ipswich、USA）を使用して線形化し、２つの精製された断片をＴ７ｌａｃプロモータの制御下でベクターの第２のマルチクローニングサイトに挿入した。これを行うために、Ｇｉｂｓｏｎによって記載された１ステップ等温ＤＮＡアセンブリプロトコールに従ったが、１０Ｕ／μＬのＴ５エキソヌクレアーゼを、０．６４μｌではなくて１．２μｌ加えたという軽微な変更を行った。したがって、Ｇｉｂｓｏｎ反応混合物の最終濃度は以下の通りであった：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、５％ＰＥＧ－８０００、１ｍＭ ＮＡＤ、７．５Ｕ／ｍＬ Ｔ５エキソヌクレアーゼ、２５Ｕ／ｍＬ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、４Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、０．０２～０．５ｐｍｏｌ ＤＮＡ断片。次に、この反応混合物を５０℃で１時間インキュベートした。等温アセンブリ後、反応物を、０．０２５μｍニトロセルロースメンブレン（Merck（商標）MF-Millipore（商標）、Ireland）を使用して透析し、次いで、Micropulser Electroporator（Bio-Rad、California、USA）を使用して０．２ｃｍ電気穿孔用キュベット中、２．５ｋＶの電圧での電気穿孔によって、プラスミド維持宿主としてのE. coli TOP10細胞に移入した。

【0035】

第２および第３の構築物はそれぞれ、Photorhabdus khanii HGB1456（ｐＺＷ－ＡＤＣ５）およびPhotorhabdus khanii DSM3369（ｐＺＷ－ＡＤＣ６）由来のネイティブＤＡＲ ＢＧＣを有する。両方の構築物に関して、それぞれのＢＧＣを、当業者に公知の方法に従ってＰＣＲによって増幅した；したがって、それぞれの細菌ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリは上記の通りに実施した。

【0036】

プラスミドｐＺＷ－ＡＤＣ３．２およびｐＺＷ－ＡＤＣ５．２は、ｐＺＷ－ＡＤＣ３およびｐＺＷ－ＡＤＣ５の制限酵素消化によって作製された。各プラスミドを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（New England Biolabs、Ipswich、USA）を使用して制限消化した。次に、Photorhabdus sp. darA（配列番号２６）の追加のコドン最適化型を、ＧｉｂｓｏｎアセンブリによってｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１に基づくベクターの第１のマルチクローニングサイトに挿入した。

【0037】

プラスミドｐＺＷ－ＡＤＣ７およびｐＺＷ－ＡＤＣ８はそれぞれ、ｄａｒＡの追加の２００ｂｐおよび６０５ｂｐ上流領域を有するP. khanii HGB1456由来のネイティブＤＡＲ ＢＧＣを有する。ＢＧＣを、当業者に公知の方法に従ってＰＣＲによって細菌ゲノムＤＮＡから増幅した。それぞれのインサートを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してＮｄｅＩ－ＡｖｒＩＩ線形化ｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１にアセンブルした。

【0038】

プラスミドｐＺＷ－ＡＤＣ９は、輸送体遺伝子を有しない、すなわち、ｄａｒＡおよびｄａｒＥのみのP. khanii DSM3369由来のＤＡＲ ＢＧＣを有する。両方の断片をＰＣＲによって増幅し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してＮｄｅＩ－ＡｖｒＩＩ線形化ｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１にアセンブルした。

【0039】

ｐＺＷ－ＹｅｒＡ４は、Yersinia frederiksenii ATCC 33641に由来するＤＡＲ ＢＧＣを有し、これをＰＣＲによって増幅した。増幅物をまた、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用してＮｄｅＩ－ＡｖｒＩＩ線形化ｐＲＳＦＤｕｅｔ（商標）－１にアセンブルした。

【0040】

アセンブリおよびE. coli TOP10細胞における増殖後、全ての構築物を試験ＰＣＲおよびその制限パターンによって確認した。

【0041】

ＤＡＲ耐性株を、１３００Ａ＞Ｇ、１３３４Ａ＞Ｃ、および２１１３Ｇ＞Ａである３つの点変異をｂａｍＡ遺伝子に導入することによって生成した。これらの３つの点変異がＤＡＲ耐性表現型をもたらすことは、過去の試験によって確認されており、ＤＡＲ耐性は１２８μｇ／ｍＬに増加した。この過去の試験は、当業者に公知である。耐性産生株を作製するための変異は、当業者に周知の手段によって生成することができる。この目的のために修飾される遺伝子は、例えばｂａｍＡであり得る。

【0042】

発現構築物を、維持宿主であるE. coli TOP10から異なる発現宿主へと電気穿孔によって移入した。E. coli発現宿主の形質転換は、E. coli TOP10に関して上述した通りに実施したが、V.natriegens Vmax（商標）の形質転換は、０．１ｃｍ電気穿孔用キュベット中、９００Ｖの電圧で行った。電気穿孔後、株をそれぞれの増殖培地および温度で１時間インキュベートした。次に、細胞を、選択剤としてカナマイシンを上記の濃度で含有するＬＢ（－ＡＳＷ）プレートに播種し、E. coli Rosetta（商標）（ＤＥ３）を宿主として使用する場合にはクロラムフェニコールを加えた。個々の単一コロニを選択プレートから採取し、それぞれの発現プラスミドの存在を、ＰＣＲによって確認した。次に、正確な構築物を有するコロニを、必要な抗生物質を含有するＬＢ（－ＡＳＷ）３ｍＬ中に接種し、３７℃または３０℃で一晩インキュベートした。この前培養物５００μＬを使用して、カナマイシンを含有する新しいＬＢ（－ＡＳＷ）培地５０ｍＬに接種し、ＯＤ_６００が０．４～０．６に達するまで３７℃または３０℃でインキュベートし、次にＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）によって誘導した。ＩＰＴＧ誘導後、培養物を１８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートした。当業者は、誘導型プロモータを発現のために使用する場合は、ある特定の細胞密度に達した場合に発現を誘導させることができることから、本発明の範囲を逸脱することなく、非耐性産生株を使用することができることを承知している。それによって、細胞は、抗生物質の産生によって殺滅されない。

【0043】

ＤＡＲ産生を、ＵＰＬＣ－ＨＲＭＳによって分析した。発現培養物から、１ｍＬアリコートを採取し、遠心分離して培地と細菌細胞とを分離した。培地を凍結乾燥させ、メタノール１ｍＬを加え、混合物をBandelin Sonorex RK255超音波浴（Berlin、Germany）中で３０分間超音波処理し、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。メタノールを除去し、ペレットを脱イオン水１ｍＬに再懸濁した。１０，０００ｇで５分間の最後の遠心分離後、試料は、ＵＰＬＣ－ＨＲＭＳシステムへの注入の準備ができた。細胞ペレットから試料を調製するために、メタノール５００μＬを加えた後に超音波処理を３０分間行った。次に、脱イオン水５００μＬを加え、超音波処理をさらに１５分間継続した。その後、溶液を遠心分離して不溶性部分を沈降させ、上清をＵＰＬＣ－ＨＲＭＳシステムに注入した。

【0044】

ＵＰＬＣ－ＨＲＭＳシステムは、Agilent Infinity 1290 UPLCシステムであり、このシステムは、Acquity UPLC BEH C18 1.7μm（２．１×１００ｍｍ）カラム（Waters、Eschborn、Germany）およびAcquity UPLC BEH C18 1.7μm VanGuardプレカラム（２．１×５ｍｍ；Waters、Eschborn、Germany）セットアップを備え、ＤＡＤ検出器およびmicrOTOFQ II質量分析計（Bruker、Bremen、Germany）に連結されていた。ＬＣ部分は、勾配（Ａ：Ｈ_２Ｏ、０．１％ＦＡ；Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＦＡ；流速：６００μＬ／分）：０分：９５％Ａ；０．８０分：９５％Ａ；１８．７０分：４．７５％Ａ；１８．８０分：０％Ａ；２３．００分：０％Ａ；２３．１０分：９５％Ａ；２５．００分：９５％Ａを使用して実施され、カラムオーブン温度を４５℃に設定した。ＭＳパラメータは以下の通りであった：ネブライザーガス１．６ｂａｒ；ガス温度、２００℃；ガス流速、８Ｌ／分；キャピラリ電圧、４５００Ｖ；エンドプレートオフセット、５００Ｖ；測定はポジティブイオンモードで行った。

【0045】

ＤＡＲ標準曲線を、抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）（４８３．７０８９および４７５．１９５６のｍ／ｚ±０．０１に関して）からのＤＡＲのピーク面積を、一連のＤＡＲ濃度（２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０ｍｇ／Ｌ）に対してプロットすることによって、作製した。異種の発現培養物からのＤＡＲ濃度を、ピーク面積を計算し、ＤＡＲ標準曲線にこれを補間することによって定量した。この定量化方法の線形範囲は、３μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬであった。したがって、境界よりも下のピーク面積は濃度に変換されなかった。標準曲線を、測定間の技術的な差を除外するために、ＵＰＬＣ－ＨＲＭＳによって分析した全てのバッチについて測定した。

【0046】

３つの遺伝子ｄａｒＢ、ｄａｒＣ、およびｄａｒＤは、ＡＢＣ輸送体のサブユニットをコードしている。これらの輸送体遺伝子がＤＡＲの生合成に対して追加の役割を果たすか否かという疑問に答えるために、また、最小のＤＡＲ ＢＧＣを定義するために、これらの遺伝子を発現構築物から除去した。したがって、ｐＺＷ－ＡＤＣ９、すなわちｄａｒＡおよびｄａｒＥのみを有する構築物を作製した。この実験は、ｄａｒＢＣＤが無くても、ＤＡＲはなおも産生され得ることを示した。さらに、ＤＡＲは、細胞の外部で検出された。

【0047】

輸送体コード遺伝子ｄａｒＢＣＤが異種ＤＡＲ発現にとって必須であるか否か、または前駆体ペプチドをコードするｄａｒＡおよびラジカルＳＡＭ修飾酵素をコードするｄａｒＥで十分であるか否かを評価した。ｄａｒＢＣＤの欠失は、ＤＡＲ産生を消失させなかった。しかし、収量は、輸送体遺伝子を含む構築物（ｐＺＷ－ＡＤＣ６）によって達成された収量よりも低かった（１．５倍）。最も興味深いことに、ＤＡＲは、輸送体コード遺伝子が無い場合においても培地中にも存在した。一方、このことは、ｄａｒＡおよびｄａｒＥのみからなる最小のＤＡＲ ＢＧＣを明確に定義する。他方では、E. coliではＤＡＲが、特異的異種輸送体遺伝子ｄａｒＢＣＤが無くても細胞の外部に存在することが明らかとなった。

【0048】

（他の二環式ヘプタペプチドの異種発現）
上記で例示された発現構築物に基づき、ヘプタペプチドのアミノ酸を交換することができる。これは、個々のアミノ酸について特異的に行うことができ、または、ヘプタペプチドの配列を修飾するためにプライマを使用する無作為化アプローチにおいて行うことができる。したがって、特異的または縮重プライマ（例えば、所定の位置で組み込まれる任意のタンパク質形成性アミノ酸に関するトリプレットＮＮＮまたはＮＮＫを使用して）を、コア（＝ヘプタ）ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸を修飾するように設計した。例として、５０μＬ規模の反応に適したＰＣＲ混合物は以下を含有した：水：３４～３４．５μＬ、ＤＭＳＯ：２．５μＬ、Ｑ５反応緩衝液：１０μＬ、ｄＮＴＰ：１μＬ、フォワードプライマ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）：０．５μＬ、リバースプライマ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）：０．５μＬ、鋳型ＤＮＡ：０．５μＬ、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ：０．５～１μＬ。ＰＣＲプログラムは、以下の通りであり得る：ステップ１、９８℃、１０分；ステップ２、９８℃、１０秒；ステップ３、６５℃、２０秒；ステップ４、７２℃、７分；ステップ２～４を３０サイクル；ステップ５、７２℃、１０分；ステップ６、４℃、∞。

【0049】

このようにして、式Ｉによるアミノ酸の全ての起こり得る組合せを、ヘプタペプチドに組み入れることができる。さらに、これらの誘導体はまた、式Ｉに従って、ハロゲン化させることができ、または二重結合の存在によって修飾することができる。

【0050】

（構造の解明）
全てのＮＭＲデータをBruker Avance III HD 600 MHz ＮＭＲ分光器（Bruker BioSpin MRI GmbH、Ettlingen、Germany）において記録した。全てのＮＭＲ実験に関して、重水（Deutero GmbH、Kastellaun、Germany）を溶媒として使用した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、文献による溶媒残留ピークを基準とした。^１３Ｃスペクトルの参照には、３－トリメチルシリル－ｄ_４－プロピオン酸（ＴＳＰＡ）を、当業者に公知であるように外部標準として使用した。ＣＯＳＹ（ｃｏｓｙｇｐｍｆｐｈｐｐ）、ＴＯＣＳＹ（ｍｌｅｖｅｔｇｐおよびｍｌｅｖｇｐｐｈ１９）、^１Ｈ－^１３Ｃ＿ＨＳＱＣ（ｈｓｑｃｅｄｅｔｇｐｓｉｓｐ２．３）、および^１Ｈ－^１３Ｃ＿ＨＭＢＣ（ｈｍｂｃｅｔｇｐｌ３ｎｄ）を含む２Ｄ実験を用いて、完全な帰属が得られた。^１Ｈ－^１３Ｃ＿ＨＭＢＣスペクトルの解像度を向上するために、ノンユニフォームサンプリング（ＮＵＳ）および／またはＨ_２Ｏ抑制を用いて追加の実験を実施した。Ｈ_２Ｏ抑制は、ＴＯＣＳＹスペクトルの記録にも適用した。ＮＭＲスペクトルの解析は、ソフトウェアＴｏｐＳｐｉｎ ３．６．０（Bruker BioSpin MRI GmbH、Ettlingen、Germany）を使用して実施した。

【0051】

（生合成遺伝子クラスタの同定）
コアペプチド配列ＷＮＷＳＫＳＦの直接スクリーニングを、Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を使用して、公共のデータベースで利用可能な全てのPhotorhabdusゲノムについて行った。P. temperataでは、ダロバクチンの７アミノ酸配列は、ＡＢＣ輸送体およびラジカルＳＡＭ酵素の上流の５８アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームのＣ末端の近くに位置し、このことはＲｉＰＰオペロンを示唆する。この推定のＢＧＣは、他のダロバクチン産生株、例えばP. luminescens DSM-3368およびP. khanii DSM-3369においても同定された。クラスタの境界は、オペロンを含有しないP. bodeiゲノムとの比較によって決定された。さらに、ｄａｒクラスタのＧＣ含有量は、ゲノム中の他の平均ＧＣ含有量よりも明らかに低かった（３２％対４５％）。ダロバクチン様化合物を潜在的に産生する他の細菌種を同定するために、ＢＬＡＳＴにおいてラジカルＳＡＭタンパク質配列（ＤａｒＥ）をインプットとして使用して、相同な酵素を検索した。各ヒットのゲノムの内容を手動で分析し、ラジカルＳＡＭタンパク質の近傍にＤａｒＡ様プロペプチドが存在することを確認した。加えて、インプットとしてプロペプチドＤａｒＡを使用して検索を行ったところ、同一のヒットをもたらした。

【0052】

（ダロバクチン欠失変異体の生成および異種発現）
ｄａｒ ＢＧＣ（ｄａｒＡＢＣＤＥ）を、産生株Photorhabdus khanii DSM3369のゲノムから欠失させるために、プラスミドを、マーカーレスゲノム修飾を可能にする５つの断片のアセンブリによって構築した。したがって、染色体ＤＮＡを、innuprepBacteria DNA Kit（AnalytikJena、Jena、Germany）を使用して単離した。

【0053】

ＢＧＣの（ｉ）上流の断片および（ｉｉ）下流の断片を、以下のプライマ対を使用して増幅した（サイズ約１ｋｂ）。
配列番号１：
５’－ＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＣＧＴＧＴＴＡＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣ－３’、および
配列番号２：
５’－ＴＴＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＣＣＧＧＴＣＡＣＡＴＡＧＴＴＣＧ－３’、
ならびに
配列番号３：
５’－ＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＡＣＣ－３’、および
配列番号４：
５’－ＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＡＴＣＴＣ－３’
（ｉｉｉ）Bacillus subtilis由来のＲ６Ｋ複製開始点（ｏｒｉ）、接合伝達開始点（ｏｒｉＴ）およびレバンスクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを、以下のプライマを使用してベクターｐＮＰＴＳ１３８から一体として増幅した。
配列番号５：
５’－ＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＡ－３’、および
配列番号６：
５’－ＡＣＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＡＡ－３’
（ｉｖ）ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモータが隣接するｐＫＤ４６のアラビノース誘導型発現系を、以下のプライマを使用して増幅した。
配列番号７：
５’－ＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴ－３’、および
配列番号８：
５’－ＴＧＣＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣ－３’
（ｖ）カナマイシンに対する耐性を付与するｐＣＡＰ０３由来のａｐｈ遺伝子を、以下のプライマを使用して増幅した。
配列番号９：
５’－ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ－３’、および
配列番号１０：
５’－ＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧ－３’

【0054】

全ての断片を、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Ipswich、USA）によって増幅し、１％または２％ＴＡＥアガロースゲルによってゲル精製し、ＤＮＡをLarge Fragment DNA Recovery Kit（Zymo Research、Irvine、USA）を用いて回収した。次いで、全ての断片を、等温アセンブリによって融合し、プラスミドｐＮＢ０２を生成した。アセンブリ後、E. coli WM3064細胞を、電気穿孔によってｐＮＢ０２で形質転換し、正確なアセンブリを、標準的な手順に従うＰＣＲおよび制限解析によって確証した。E. coli WM3064とP. khanii DSM3369との間の接合を、両方の株をＯＤ_６００が約０．６になるまで成長させることによって、実施した。ＬＢ培地によって２回洗浄後、細胞を、E. coliとP. khaniiが１：３の比で混合し、ジアミノピメリン酸（０．３ｍＭ）を添加したＬＢ寒天上に播種し、３７℃で３時間インキュベートし、続いて０℃で一晩インキュベートした。菌叢を、ＬＢ培地に再懸濁させ、カナマイシン（５０μｇ ｍｌ^－１）を含むＬＢ寒天上に連続希釈して播種した。カナマイシン耐性のシングルクロスオーバー接合完了体をＬＢ培地中でＯＤ_６００が約０．６になるまで成長させた。次に、ＳａｃＢの発現を、アラビノース（０．２重量／体積％）を加え、続いて２時間インキュベートすることによって誘導した。

【0055】

次いで、培養物を、０．２％（重量／体積）アラビノースおよび１０％スクロースを添加したＬＢ寒天上に播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。個々の単一コロニを、ＬＢ_ＫａｎおよびＬＢ_{Ａｒａ／Ｓｕｃ}寒天上で採取した。カナマイシンに対する感受性は、プラスミドの喪失を示し、それによりダブルクロスオーバー事象の成功を示す。クローンを採取し、以下のプライマを使用したＰＣＲによってＢＧＣ喪失に関して分析した。
配列番号１１：
５’－ＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣ－３’、および
配列番号１２：
５’－ＣＣＧＣＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＡＡＴＣ－３’

【0056】

ノックアウト株は、P. khanii DSM3369 ΔdarABCDEと呼ばれる。
E. coliにおけるダロバクチンＡ ＢＧＣの異種発現のために、また、P. khanii DSM3369 ΔdarABCDEを補完するために、発現プラスミドｐＮＢ０３を使用した。プロペプチドと修飾酵素との間の制御系による問題を回避するために、全ての遺伝子間領域を除去し、遺伝子ｄａｒＡ～ｄａｒＥをアラビノース誘導型ａｒａＢプロモータの制御下で簡素化させて発現させた。

【0057】

ｐＮＢ０３は、
（ｉ）ｐＡＣＹＣ１７７由来のｐ１５Ａ ｏｒｉ
（プライマ配列番号１３：
５’－ＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＡＡＴＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＣＧＡＡＣ－３’、および
配列番号１４：
５’－ＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣ－３’）、
（ｉｉ）ｐＮＢ０２のアラビノース発現系およびカナマイシン耐性
（プライマ配列番号１５：
５’－ＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ－３’、および
配列番号１６：
５’－ＴＴＴＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣ－３’）、ならびに
（ｉｉｉ）ｏｒｉＴおよびｐＩＪ７７３由来のアプラマイシンに対する耐性を付与するａａｃ（３）遺伝子
（プライマ配列番号１７：
５’－ＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ－３’、および
配列番号１８：
５’－ＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴ－３’）
の増幅によって作製された。

【0058】

次いで、全ての断片をゲル精製し、上記のようにアセンブルした。E. coli TOP10細胞を、ベクターで形質転換し、正確なアセンブリを確証した。

【0059】

ｄａｒ ＢＧＣをP. khanii DSM3369 ΔdarABCDEに導入するために、
（ｉ）ｐＮＢ０３を、下記プライマを使用して線形化し、
配列番号１９：
５’－ＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧ－３’、および
配列番号２０：
５’－ＴＴＴＴＡＴＡＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＡ－３’
（ｉｉ）ｄａｒＡを、下記を使用して増幅し、
配列番号２１：
５’－ＧＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＣＣＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡ－３’、および
配列番号２２：
５’－ＡＡＴＡＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＴ－３’
（ｉｉｉ）ｄａｒＢ－ｄａｒＥを、下記を使用して増幅した。
配列番号２３：
５’－ＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴ－３’、および
配列番号２４：
５’－ＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＡＣＧＣＣＧＣＧＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴ－３’

【0060】

全ての断片をゲル精製し、上記のようにアセンブルした。得られたベクターｐＮＢ０３－ｄａｒＡＢＣＤＥを、E. coli TOP10細胞に移入し、正確なアセンブリを確証した。

【0061】

空のｐＮＢ０３およびｐＮＢ０３－ｄａｒＡＢＣＤＥを、三親接合（triparental conjugation）によってP. khanii DSM3369 ΔdarABCDEに移入した。簡単に説明すると、P. khanii DSM3369 ΔdarABCDE、発現プラスミドを有するE. coli TOP10、およびｐＵＢ３０７接合ヘルパープラスミドを持つE. coli ET pUB307の間の接合を、前記のように実施した（細胞比３：１：１）。P. khanii DSM3369はもともとカルベニシリンに対して耐性であり、カナマイシン耐性pUB307はｂｌａプロモータを欠如することから、最終選択は、カナマイシンおよびカルベニシリンを添加したＬＢ寒天上で行った。カナマイシン耐性接合完了体を、ＬＢ_Ｋａｎにおいて成長させ、プラスミドを単離し、ＰＣＲによって同一性を確認した。異種発現の場合、ベクターｐＮＢ０３－ｄａｒＡＢＣＤＥを、電気穿孔によってE. coli BW25113（アラビノース非利用体）に移入した。次いで、P. khanii DSM3369 WT、P. khanii DSM3369 ΔdarABCDE+pNB03、P. khanii DSM3369 ΔdarABCDE+pNB03‐darABCDE、およびE. coli+pNB03‐darABCDEを、ＬＢまたは０．２％（重量／体積）アラビノースを添加したＬＢ_Ｋａｎにおいて５～７日間成長させ、ＬＣＭＳによって分析した。

【0062】

（最小発育阻害濃度（ＭＩＣ））
ＭＩＣは、丸底９６ウェルプレートにおいてマイクロブロス希釈アッセイによって決定した。E. coli ATCC35218、E. coli NRZ14408 KPC-2、E. coli K0416 VIM-1、E. coli Survcare 052 NDM-5、E. coli MMGI1 OXA-48、P. aeruginosa PAO 1、P. aeruginosa PAO 750、A. baumanii ATCC19606、K. pneumoniae ATCC30104、およびS. enterica ATCC13076の一晩培養物を、マクファーランド１．０に調整し、次いで、ＭＨＩＩＢ中で５×１０^５ｃ．ｆ．ｕ．ｍＬ^－１に希釈した。ダロバクチン誘導体を、６４～０．０３μｇ ｍＬ^－１の範囲の１２濃度で３連でスクリーニングした。同一の濃度を、ポジティブコントロールとしてリファンピシン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンについて試験した。テトラサイクリン耐性E. coli株（NRZ14408、K0416およびMMGI1）およびE. coli Survcare 052については、テトラサイクリンをコリスチン希釈系列（１６～０．００７μｇ ｍＬ^－１）に置き換えた。

【0063】

標準的な抗生物質またはダロバクチンを添加していない細菌懸濁液をネガティブコントロールとして使用した。インキュベーション（１８時間、１８０ｒｐｍ、３７℃、８５％ｒ．Ｈ．）後、細胞の成長を、マイクロプレート分光光度計を使用し６００ｎｍでの混濁度を測定することによって決定した。ＭＩＣは、ネガティブコントロールと比較して少なくとも８５％の成長阻害が測定された最小濃度として定義された。

【0064】

（発明の請求項）
本発明は、互いに密接に関連するいくつかの態様を含む。特許請求の範囲は、二環式ヘプタペプチド、その製造および医薬製剤、それぞれの医薬組成物におけるＡＰＩとしての使用を包含する。「医薬製剤」および「医薬組成物」という表現は、本明細書において同義語として使用される。このように本発明は、以下も含む：

【0065】

請求項１：式Ｉの二環式ヘプタペプチド、

【化3】

および／またはその薬学的に許容される塩、立体異性体、互変異性体または水和物であって、
式中、
－ Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が、互いに独立して、Ｈ、－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ_２）、－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＨ_２－ＳＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＯ－ＮＨ_２、（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、ハロゲン化（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－メチル、－ＣＨ（ＣＨ_３）（Ｃ_２Ｈ_５）、－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２ＮＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、ハロゲン化－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｈ_５、（１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、ハロゲン化（１Ｈ－インドール－３－イル）－メチル、（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、ハロゲン化（４－ヒドロキシフェニル）－メチル、－ＣＨ－（ＣＨ_３）_２、１－ヒドロキシ－エチル、ヒドロキシ－メチル、ｓｅｃ－ブチル、１－アセトアミド、１－チオアセトアミド、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２を含むリストから選択され；
－ Ｘが、Ｘの任意の位置において、Ｘの他の任意の位置とは独立して、ＯまたはＳのいずれかであり；
－ Ｒ^５が、メチルスルホニル、ｐ－トルエンスルホニルを含むリストから選択され；
－ Ｒ^６が、メチルスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、－（Ｃ＝ＮＨ）－ＮＨ_２を含むリストから選択され；
－ Ｚ^１、Ｚ^２が、それぞれ二重結合または単結合であり、ただし
ａ）Ｚ^１およびＺ^２がいずれも単結合であるか、または
ｂ）それらのうちの一方のみが単結合であると同時に他方が二重結合であり、ここで、
ｉ）Ｚ^１が単結合であり、Ｚ^２が二重結合であるか、または
ｉｉ）Ｚ^２が単結合であり、Ｚ^１が二重結合である；
－ Ｙ^１が、３，７－インドリレンまたはハロゲン化３，７－インドリレンであり；
－ Ｙ^２が、３，６－インドリレン、１，４－フェノキシレン、ハロゲン化３，６－インドリレン、ハロゲン化１，４－フェノキシレンのリストから独立して選択され；
－ ｎが、１または２である、
二環式ヘプタペプチド。

【0066】

請求項２：ダロバクチンである、請求項１に記載の二環式ヘプタペプチド。

【0067】

請求項３：請求項１に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法であって、
ｉ）二環式ヘプタペプチドを産生する微生物を使用し、二環式ヘプタペプチドおよび微生物細胞を含有する発酵ブロスを提供する発酵ステップであって、前記微生物が、Photorhabdus spp.、Photorhabdus laumondii、Photorhabdus khanii、Pseudoalteromonas spp.、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Pseudoalteromonas luteoviolacea、Yersinia spp.、Escherichia spp.、Vibrio sppを含む微生物のリストから選択される、発酵ステップ；
ｉｉ）発酵ブロスを、沈降および／または遠心分離および／またはろ過によって、微生物細胞および／または微生物細胞の破片を含有する不溶性部分と、二環式ヘプタペプチドを含有する溶液とに分離する分離ステップであって、微生物細胞が、沈降および／または遠心分離および／またはろ過を発酵ブロスに適用する前に破壊されているか、または破壊されていない、分離ステップ；
ｉｉｉ）先の分離ステップｉｉ）から得られた溶液内に含有される二環式ヘプタペプチドを精製し、精製された二環式ヘプタペプチドの溶液を提供する精製ステップ
を含む、方法。

【0068】

請求項４：請求項３に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法であって、請求項３の精製ステップｉｉｉ）が、
ａ）請求項３のステップｉｉ）から得られた溶液を減圧下での凍結乾燥および／または蒸留によって乾燥させ、残渣を提供するステップ、
ｂ）先のステップａ）の残渣をアルコールで洗浄し、洗浄した残渣を乾燥させ、乾燥させた残渣を脱イオン水に溶解し、二環式ヘプタペプチドの粗抽出物を提供するステップ、
ｃ）先のステップｂ）の粗抽出物の不溶性部分を、沈降および／またはろ過および／または遠心分離によって除去し、固体を含まない粗抽出物を提供するステップ、
ｄ）先のステップｃ）から得られた固体を含まない粗抽出物を、クロマトグラフィによって精製し、それにより二環式ヘプタペプチドの純粋な溶液を提供するステップ
を含む、方法。

【0069】

請求項５：請求項３に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法であって、請求項３の精製ステップｉｉｉ）が、
ａ）請求項３のステップｉｉ）から得られた溶液を、二環式ヘプタペプチドが疎水性相互作用材料に吸着されるように、該疎水性相互作用材料と接触させるステップ、
ｂ）残りの透明な溶液を疎水性相互作用材料から分離し、吸着した二環式ヘプタペプチドがロードされた疎水性相互作用材料を水で洗浄するステップ、
ｃ）二環式ヘプタペプチドを、水と有機溶媒の混合物によって疎水性相互作用材料から溶出させるステップであって、有機溶媒が、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、アセトン、エタノール、プロパノールを含むリストから選択され、水と有機溶媒の混合物が、０．００１重量％から１重量％までの間の量の酸を含有してもよく、または含有しなくてもよい、ステップ、
ｄ）ステップｃ）から得られた溶出液を濃縮し、真空を適用することによって有機溶媒を除去し、水溶液を、二環式ヘプタペプチドがカチオンイオン交換材料に吸着されるように、強カチオンイオン交換材料と接触させるステップ、
ｅ）二環式ヘプタペプチドがロードされたカチオンイオン交換材料を、０．００１重量％から１重量％までの間の濃度を有する酸で洗浄するステップ、
ｆ）ｐＨ５～ｐＨ１１のｐＨ値を有する水性緩衝溶液を適用することによって二環式ヘプタペプチドを溶出させ、二環式ヘプタペプチドを含有する分画を収集するステップ、
ｇ）ステップｆ）の分画から得られた二環式ヘプタペプチドを、ステップａ）に記載される様式と同一の様式で疎水性相互作用材料に吸着させるステップ、
ｈ）二環式ヘプタペプチドを、Ｈ_２Ｏと有機溶媒の勾配によって溶出させるステップであって、有機溶媒が、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、アセトン、エタノール、プロパノールを含むリストから選択される、ステップ、
ｉ）Ｈ_２Ｏと有機溶媒の勾配を用いたＨＰＬＣを適用することによって、ステップｈ）から得られた二環式ヘプタペプチドを含有する分画を精製するステップであって、有機溶媒が、ＭｅＯＨ、ＭｅＣＮ、ＴＨＦ、アセトン、エタノール、プロパノールを含むリストから選択される、ステップ
を含む、方法。

【0070】

請求項６：請求項３に記載の二環式ヘプタペプチドまたは請求項４に記載の二環式ヘプタペプチドまたは請求項５に記載の二環式ヘプタペプチドが、化学修飾によってさらに処理される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。

【0071】

請求項７：化学修飾が、二環式ヘプタペプチドを、ローソン試薬または塩化トシルまたは塩化メシルと反応させることである、請求項６に記載の二環式ヘプタペプチドを製造する方法。

【0072】

請求項８：グラム陰性菌によって引き起こされる哺乳類における感染症を処置するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１に記載の二環式ヘプタペプチド、または、その薬学的に許容される塩、溶媒和物もしくは立体異性体を含む、医薬組成物。

【0073】

請求項９：少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。

【0074】

請求項１０：局所投与、全身投与、非経口投与、皮下投与、または経皮投与、直腸投与、経口投与、膣内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、眼内投与、耳内投与、静脈内投与、筋肉内投与、または腹腔内投与の形態である、請求項８から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0075】

請求項１１：細菌感染症に罹っている哺乳類に投与され哺乳類に有益な効果を提供するために十分な頻度で十分な期間にわたって、哺乳類に医薬組成物を投与することを含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0076】

請求項１２：細菌感染症に罹っている哺乳類に投与され、細菌感染症が、グラム陰性菌の 少なくとも１つのタイプ／株を伴う感染症である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【0077】

請求項１３：細菌感染症に罹っている哺乳類に投与される、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、細菌感染症が、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Shigella sonnei、Salmonella enterica Typhimurium LT2、Enterobacter cloacae、Bifidobacterium longum、Bacteroides fragilis、Lactobacillus reuteri、Enterococcus faecalisおよびYersinia pestis、Pseudomonas、fluorescens、Pseudomonas acidovorans、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas putida、Stenotrophomonas maltophilia、Burkholderia cepacia、Aeromonas hydrophilia、Escherichia coli、Citrobacter freundii、Salmonella typhimurium、Salmonella typhi、Salmonella paratyphi、Salmonella enteritidis、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Enterobacter aerogenes、Enterobacter spp.、Klebsiella oxytoca、Serratia marcescens、Francisella tularensis、Morganella morganii、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri、Providencia stuartii、Acinetobacter calcoaceticus、Acinetobacter haemolyticus、Yersinia enterocolitica、Yersinia pseudotuberculosis、Yersinia intermedia、Bordetella pertussis、Bordetella parapertussis、Bordetella bronchiseptica、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus ducreyi、Pasteurella multocida、Pasteurella haemolytica、Branhamella catarrhalis、Helicobacter pylori、Campylobacter fetus、Campylobacter jejuni、Campylobacter coli、Borrelia burgdorferi、Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticus、Legionella pneumophila、Listeria monocytogenes、Neisseria meningitidis、Kingella、Moraxella、Gardnerella vaginalis、Bacteroides distasonis、Bacteroides 3452Aホモロジー群、Bacteroides vulgatus、Bacteroides ovalus、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bacteroides eggerthii、Bacteroides splanchnicusを伴う感染症である、医薬組成物。

【0078】

１．グラム陰性菌によって引き起こされる感染症に罹っている脊椎動物またはヒトにおいて使用するためのダロバクチンまたはその誘導体を含む医薬製剤。

【0079】

２．グラム陰性菌が、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis、Shigella sonnei、Salmonella enterica Typhimurium LT2、Enterobacter cloacae、Bifidobacterium longum、Bacteroides fragilis、Lactobacillus reuteri、Enterococcus faecalis、およびYersinia pestisの群から選択される、請求項１に記載の医薬製剤。このリストは、本発明の範囲を制限しないと意味される。

【0080】

３．脊椎動物が、鳥類、魚類、両生類、は虫類、および哺乳類を含む、請求項１または２に記載の医薬製剤。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】