特表 2023-502554 疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-25

(54)【発明の名称】疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20230118BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230118BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20230118BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALN20230118BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z ZNA

C12M1/34 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6886 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022507775

(86)(22)【出願日】2020-08-27

(85)【翻訳文提出日】2022-04-04

(86)【国際出願番号】 EP2020073960

(87)【国際公開番号】W WO2021037971

(87)【国際公開日】2021-03-04

(31)【優先権主張番号】19382730.0

(32)【優先日】2019-08-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＳＭＡＬＬＴＡＬＫ

(71)【出願人】

【識別番号】522049716

【氏名又は名称】フンダシオン パラ ラ インベスティガシオン ビオメディカ デル ホスピタル ウニベルシタリオ １２ デ オクトゥブレ

(71)【出願人】

【識別番号】522049727

【氏名又は名称】フンダシオン デル セクトール プブリコ エスタタル セントロ ナティオナル デ インベスティガシオン オンコロギカ カルロス テルセロ（エフ．エス．ピー．シーエヌアイオー）

(74)【復代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】バリオ ガルシア，サンティアゴ

(72)【発明者】

【氏名】アヤラ ディアス，ローザ マリア

(72)【発明者】

【氏名】ラパード マルティネス，マリア インマクラーダ

(72)【発明者】

【氏名】ガヒード マーティン，エヴァ マリア

(72)【発明者】

【氏名】パス－アレス ロドリゲス，ルイス

(72)【発明者】

【氏名】オネチャ デ ラ フエンテ，マリア エスター

(72)【発明者】

【氏名】マルティネス ロペス，ホアキン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA23

4B029BB20

4B029FA12

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX01

(57)【要約】

【解決手段】本発明は、増殖性疾患が処置された対象における最小残存病変の有無を求めるための方法、キット、およびシステムに焦点を当てるものであり、前記方法、キット、およびシステムは、
（Ａ）左から右へと読み取られる第１の文字の列記を得るために、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅して配列決定する工程と、
（Ｂ）左から右へと読み取られる第２の文字の列記を得るために、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅して配列決定する工程であって、ヌクレオチド配列は、突然変異したとき、前記増殖性疾患の遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度ＤＳを求める工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）Ｌ_ｃを得るために、閾値Ｔを超えるＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計する工程と、
（Ｆ）第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを合計する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程と、
（Ｈ）（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦ、（ｉｉ）前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、（ｉｉｉ）平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、および（ｉｖ）平均位置ノイズａｖＰｏｓを求める工程と、
（Ｉ）ｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方から、またはｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方から実験感度ＥＳを求める工程と、
（Ｊ）最小残存病変のレベルの値を、ＥＳの値、ｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓの値、またはｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔの値と比較することにより、前記対象における最小残存病変の有無を求める工程と
を含み、前記最小残存病変のレベルが、前記ＥＳ値、ｍｉｎＶＲＦ値、Ｄ－ｌｉｍｉｔ値、ａｖＭｕｔ値、またはａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法であって、前記疾患は増殖性疾患であり、前記方法は、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、工程（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程であって、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる、工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得する工程と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、工程と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）以下
Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２、
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）、
を使用してＳ２を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９である、繰り返すこと、および
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、算出すること
による平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、ならびに
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求める工程と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求める工程であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、工程と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、以下
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求める工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記増殖性疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子マーカーが前記疾患を引き起こす、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記疾患の処置前に前記対象から得た組織試料の前記ゲノムＤＮＡ中の前記遺伝子マーカーの変異読取り頻度ＶＲＦが、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるときに少なくとも５％、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるときに少なくとも２％
である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記遺伝子マーカーが、
（Ｐ）前記疾患を抱える前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの突然変異を特定し、このように特定した各突然変異の変異読取り頻度ＶＲＦを求める工程と、
（Ｑ）１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、１０％を超えるＶＲＦを有する工程（Ｐ）で特定された突然変異を選択する工程であって、１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、
（ｂ）工程（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有するインデル突然変異、または
（ｃ）工程（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異またはインデル突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有する一塩基変異型突然変異
である、工程と、
（Ｒ）前記対象中の遺伝子のヌクレオチド配列のうち工程（Ｑ）で選択した前記突然変異を含むものをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定する工程と
により選択され、前記工程（Ｑ）で選択された前記突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は、前記遺伝子マーカーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

工程（Ｐ）で特定した突然変異が、１０％を超えるＶＲＦを有していない場合、前記遺伝子マーカーは、さらなるｎ－１遺伝子マーカーと共に、以下の工程により選択され、
工程（Ｑ）は、
（ｉ）２％～１０％のＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、２％～１０％のＶＲＦを有する工程（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異であって、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、または
（ｂ）工程（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有していない場合、最高のＶＲＦを有するインデル突然変異
である突然変異を選択することを含む工程（Ｑ’）に置き換えられ、または
工程（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有し、工程（Ｐ）で特定したｎ個未満のインデル突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有する場合、工程（Ｑ’）は、
（ｉｉ）５％～１０％のＶＲＦを有する突然変異のうち一塩基変異型突然変異であるものを特定することにより、５％～１０％のＶＲＦを有する工程（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異
を選択することを含み、
工程（Ｒ）は、
（ｉ）工程（Ｑ’）で選択されたｎ個の突然変異のうち１つを選択し、選択した突然変異を含む前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定することであって、前記選択した突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は遺伝子マーカーである、特定すること、および
（ｉｉ）工程（Ｒ’）（ｉ）をｎ－１回繰り返すことであって、１回あたり、以前に工程（Ｒ’）（ｉ）で選択されていない工程（Ｑ’）で選択された残りのｎ－１個の突然変異のうち１つに対して行われる、繰り返すこと
を含む工程（Ｒ’）に置き換えられ、
前記方法はさらに、工程（Ａ）～（Ｉ）をさらにｎ－１回繰り返す工程であって、１回あたり、工程（Ｒ’）で特定した異なるプライマー対を使用する、工程と、工程（Ｊ）を、以下の工程（Ｊ’）：
（ｉ）最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと実験感度の平均値ａｖＥＳとを比較する工程であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、工程、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較する工程であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＭｕｔの平均値ａｖａｖＭｕｔとを比較する工程であって、
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＰｏｓの平均値ａｖａｖＰｏｓとを比較する工程であって、
（ｃ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較する工程であって、
（ｄ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値、ａｖａｖＭｕｔ値、ａｖａｖＰｏｓ値、およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、工程、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較する工程であって、
（ｆ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較する工程であって、
（ｇ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、工程
と置き換える工程とを含み、
ここで、ｎは２～５から選択される自然数である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記体細胞遺伝子再構成突然変異が、免疫グロブリン遺伝子再構成突然変異である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記疾患が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＡＳＸＬ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＡＬＲ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＬＮ１、ＥＰＡ１、ＥＰＯＲ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＲＡＤ２１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ２、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、およびＺＲＳＲ２からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記疾患が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＳＦ３Ｂ１、ＴＰ５３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＬＣＧ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、ＩＬ７、ＷＨＳＣ１、ＴＹＫ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＢＩＲＣ３、ＰＯＴ１、ＲＰＳ１５、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＴＭ、ＩＲＦ４、ＢＲＡ、ＸＰＯ１、ＣＸＣＲ４、ＢＣＬ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＤ８８、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＡＸ５、ＮＯＴＣＨ１、ＳＴＡＴ３、およびＢＴＫからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記疾患がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、またはホジキンリンパ腫（ＨＬ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ７Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＣＮＤ３、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＳＳ、ＣＸＣＲ４、ＥＰ３００、ＥＴＳ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＯ１、ＧＮＡ１３、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＮＲＮＰＫ、ＩＤ３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＰＫＢ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＦＨＡＳ１、ＭＵＭ１、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＸ５、ＰＣＢＰ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＲＤＭ１、ＲＲＡＧＣ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＣＳ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＰ５３、およびＸＰＯ１からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記疾患が多発性骨髄腫（ＭＭ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＣＲＢＮ、ＩＲＦ４、ＴＰ５３、ＮＦＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＧＦＲ３、ＤＩＳ３、ＴＲＡＦ３、ＡＴＭ、ＭＡＸ、ＲＢ１、ＣＹＬＤ、ＣＣＮＤ１、ＮＦ１、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＴＧ１、ＭＡＦ、ＺＮＦ２９２、ＲＯＢＯ１、ＥＧＲ１、ＦＡＴ３、ＰＲＫＤ２、ＨＵＷＥ１、ＴＲＡＦ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＲＡＳＡ２、ＵＢＲ５、ＺＦＨＸ４、ＤＵＳＰ２、ＳＰ１４０、ＢＩＲＣ２、ＣＲＢＮ、およびＬＴＢからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるシステムであって、前記疾患は増殖性疾患であり、前記システムは、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段と、
（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、手段と、
（Ｃ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求めるための手段であって、（Ｂ）で得た第２の文字の列記と（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる、手段と、
（Ｄ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択するための手段と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得するための手段と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する手段と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出するための手段であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、手段と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、および
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すための手段であって、ｍは少なくとも９である、手段、
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出するための手段であって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、手段
を用いての平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出するための手段を使用しての平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求めるための手段と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求めるための手段であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、および
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、手段と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、
（ｉ）（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求めるための手段と
を含む、システム。

【請求項13】

前記増殖性疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。

【請求項14】

前記遺伝子マーカーが前記疾患を引き起こす、請求項１２または１３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項15】

前記疾患の処置前に前記対象から得た組織試料の前記ゲノムＤＮＡ中の前記遺伝子マーカーの変異読取り頻度ＶＲＦが、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるときに少なくとも５％、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるときに少なくとも２％
である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項16】

前記遺伝子マーカーが、
（Ｐ）前記疾患を抱える前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの突然変異を特定し、このように特定した各突然変異の変異読取り頻度ＶＲＦを求めるための手段と、
（Ｑ）１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、１０％を超えるＶＲＦを有する（Ｐ）で特定された突然変異を選択するための手段であって、１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、
（ｂ）（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有するインデル突然変異、または
（ｃ）（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異またはインデル突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有する一塩基変異型突然変異
である、手段と、
（Ｒ）前記対象中の遺伝子のヌクレオチド配列のうち（Ｑ）で選択した前記突然変異を含むものをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定するための手段と
により選択され、（Ｑ）で選択された前記突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は、前記遺伝子マーカーである、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項17】

（Ｐ）で特定した突然変異が、１０％を超えるＶＲＦを有していない場合、前記遺伝子マーカーは、さらなるｎ－１遺伝子マーカーと共に、以下により選択され、
（Ｑ）は（Ｑ’）と置き換えられ、（Ｑ’）は、
（ｉ）２％～１０％のＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、２％～１０％のＶＲＦを有する（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異を選択するための手段であって、該突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、または
（ｂ）（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有していない場合、最高のＶＲＦを有するインデル突然変異
である、手段を含み、または
（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有し、（Ｐ）で特定したｎ個未満のインデル突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有する場合、（Ｑ’）は、
（ｉｉ）５％～１０％のＶＲＦを有する突然変異のうち一塩基変異型突然変異であるものを特定することにより、５％～１０％のＶＲＦを有する（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異
を選択するための手段を含み、および
（Ｒ）は（Ｒ’）と置き換えられ、（Ｒ’）は、
（ｉ）（Ｑ’）で選択されたｎ個の突然変異のうち１つを選択し、選択した突然変異を含む前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定するための手段であって、前記選択した突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は遺伝子マーカーである、手段、および
（ｉｉ）（Ｒ’）（ｉ）をｎ－１回繰り返すための手段であって、１回あたり、以前に（Ｒ’）（ｉ）で選択されていない（Ｑ’）で選択された残りのｎ－１個の突然変異のうち１つに対して行われる、手段
を含み、
前記システムはさらに、（Ａ）～（Ｉ）をさらにｎ－１回繰り返すことであって、１回あたり、（Ｒ’）で特定した異なるプライマー対を使用する、繰り返すこと、および、（Ｊ）を、以下の（Ｊ’）：
（ｉ）最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと実験感度の平均値ａｖＥＳとを比較するための手段であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、手段、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較するための手段であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＭｕｔの平均値ａｖａｖＭｕｔとを比較するための手段であって、
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＰｏｓの平均値ａｖａｖＰｏｓとを比較するための手段であって、
（ｃ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較するための手段であって、
（ｄ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値、ａｖａｖＭｕｔ値、ａｖａｖＰｏｓ値、およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、手段、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較するための手段であって、
（ｆ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較するための手段であって、
（ｇ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、手段
と置き換えることを含み、
ここで、ｎは２～５から選択される自然数である、請求項１６に記載のシステム。

【請求項18】

前記体細胞遺伝子再構成突然変異が、免疫グロブリン遺伝子再構成突然変異である、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項19】

前記疾患が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＡＳＸＬ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＡＬＲ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＬＮ１、ＥＰＡＳ１、ＥＰＯＲ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＲＡＤ２１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ２、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、およびＺＲＳＲ２からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項20】

前記疾患が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＳＦ３Ｂ１、ＴＰ５３，ＩＬ７Ｒ、ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＬＣＧ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、ＩＬ７、ＷＨＳＣ１、ＴＹＫ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＢＩＲＣ３、ＰＯＴ１、ＲＰＳ１５、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＴＭ、ＩＲＦ４、ＢＲＡ、ＸＰＯ１、ＣＸＣＲ４、ＢＣＬ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＤ８８、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＡＸ５、ＮＯＴＣＨ１、ＳＴＡＴ３、およびＢＴＫからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項21】

前記疾患がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、またはホジキンリンパ腫（ＨＬ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ７Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＣＮＤ３、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＳＳ、ＣＸＣＲ４、ＥＰ３００、ＥＴＳ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＯ１、ＧＮＡ１３、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＮＲＮＰＫ、ＩＤ３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＰＫＢ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＦＨＡＳ１、ＭＵＭ１、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＸ５、ＰＣＢＰ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＲＤＭ１、ＲＲＡＧＣ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＣＳ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＰ５３、およびＸＰＯ１からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項22】

前記疾患が多発性骨髄腫（ＭＭ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＣＲＢＮ、ＩＲＦ４、ＴＰ５３、ＮＦＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＧＦＲ３、ＤＩＳ３、ＴＲＡＦ３、ＡＴＭ、ＭＡＸ、ＲＢ１、ＣＹＬＤ、ＣＣＮＤ１、ＮＦ１、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＴＧ１、ＭＡＦ、ＺＮＦ２９２、ＲＯＢＯ１、ＥＧＲ１、ＦＡＴ３、ＰＲＫＤ２、ＨＵＷＥ１、ＴＲＡＦ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＲＡＳＡ２、ＵＢＲ５、ＺＦＨＸ４、ＤＵＳＰ２、ＳＰ１４０、ＢＩＲＣ２、ＣＲＢＮ、およびＬＴＢからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項23】

（Ａ）および（Ｂ）におけるポリメラーゼ連鎖反応により増幅するための手段は、ＰＣＲ機器を含み、
（Ａ）および（Ｂ）における前記少なくとも１つのヌクレオチド配列を配列決定するための手段は、超並列シーケンシングプラットフォームを含み、前記シーケンシングは、超並列シーケンシングであり、
（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれについて、（Ｂ）、（Ｃ）で得た第２の文字の列記それぞれとの類似度を求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｄ）において最高値のＤＳを選択するための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
第１の文字の列記のうちＩにおいて第２の文字の列記と同じであるものの総数Ｌ_ｃを得る手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｆ）において第１の文字の列記の総数Ｌ_ｔを得る手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｇ）において最小残存病変のレベルを算出するための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｈ）において、最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦ、検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、および平均位置ノイズａｖＰｏｓを求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｉ）において実験感度ＥＳを求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｊ）において最小残存病変の有無を求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含む、請求項１２から２２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項24】

疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるキットであって、前記疾患は増殖性疾患であり、前記キットは、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段と、
（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、手段と、
（Ｃ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求めるための手段であって、（Ｂ）で得た第２の文字の列記と（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる、手段と、
（Ｄ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択するための手段と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得するための手段と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する手段と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出するための手段であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、手段と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２、
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すための手段であって、ｍは少なくとも９である、手段、
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出するための手段であって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、手段
を用いての平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出するための手段を使用しての平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求めるための手段と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求めるための手段であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、および
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、手段と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、
（ｉ）（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、
比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求めるための手段と
を含み、
ここで、
（Ａ）および（Ｂ）におけるポリメラーゼ連鎖反応により増幅するための手段は、ＰＣＲ機器を含み、
（Ａ）および（Ｂ）における前記少なくとも１つのヌクレオチド配列を配列決定するための手段は、超並列シーケンシングプラットフォームを含み、前記シーケンシングは、超並列シーケンシングであり、
（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれについて、（Ｂ）、（Ｃ）で得た第２の文字の列記それぞれとの類似度を求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｄ）において最高値のＤＳを選択するための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
第１の文字の列記のうち第２の文字の列記と同じであるものの総数Ｌ_ｃを得る手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｆ）において第１の文字の列記の総数Ｌ_ｔを得る手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｇ）において最小残存病変のレベルを算出するための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｈ）において、最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦ、検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、および平均位置ノイズａｖＰｏｓを求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｉ）において実験感度ＥＳを求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含み、
（Ｊ）において最小残存病変の有無を求めるための手段は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を含む、キット。

【請求項25】

前記増殖性疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および固形腫瘍からなる群から選択される、請求項２４に記載のキット。

【請求項26】

前記遺伝子マーカーが前記疾患を引き起こす、請求項２４または２５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項27】

前記疾患の処置前に前記対象から得た組織試料の前記ゲノムＤＮＡ中の前記遺伝子マーカーの変異読取り頻度ＶＲＦが、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるときに少なくとも５％、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるときに少なくとも２％
である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項28】

前記遺伝子マーカーが、
（Ｐ）前記疾患を抱える前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの突然変異を特定し、このように特定した各突然変異の変異読取り頻度ＶＲＦを求めるための手段と、
（Ｑ）１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、１０％を超えるＶＲＦを有する（Ｐ）で特定された突然変異を選択するための手段であって、１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、
（ｂ）（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有するインデル突然変異、または
（ｃ）（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異またはインデル突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有する一塩基変異型突然変異
である、手段と、
（Ｒ）前記対象中の遺伝子のヌクレオチド配列のうち（Ｑ）で選択した前記突然変異を含むものをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定するための手段と
により選択され、（Ｑ）で選択された前記突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は、前記遺伝子マーカーである、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項29】

（Ｐ）で特定した突然変異が、１０％を超えるＶＲＦを有していない場合、前記遺伝子マーカーは、さらなるｎ－１遺伝子マーカーと共に、以下により選択され、
（Ｑ）は（Ｑ’）と置き換えられ、（Ｑ’）は、
（ｉ）２％～１０％のＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、２％～１０％のＶＲＦを有する（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異を選択するための手段であって、該突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、または
（ｂ）（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有していない場合、最高のＶＲＦを有するインデル突然変異
である、手段を含み、または
（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有し、（Ｐ）で特定したｎ個未満のインデル突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有する場合、（Ｑ’）は、
（ｉｉ）５％～１０％のＶＲＦを有する突然変異のうち一塩基変異型突然変異であるものを特定することにより、５％～１０％のＶＲＦを有する（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異
を選択するための手段を含み、および
（Ｒ）は（Ｒ’）と置き換えられ、（Ｒ’）は、
（ｉ）（Ｑ’）で選択されたｎ個の突然変異のうち１つを選択し、選択した突然変異を含む前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定するための手段であって、前記選択した突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は遺伝子マーカーである、手段、および
（ｉｉ）（Ｒ’）（ｉ）をｎ－１回繰り返すための手段であって、１回あたり、以前に（Ｒ’）（ｉ）で選択されていない（Ｑ’）で選択された残りのｎ－１個の突然変異のうち１つに対して行われる、手段
を含み、
前記キットはさらに、（Ａ）～（Ｉ）をさらにｎ－１回繰り返すことであって、１回あたり、（Ｒ’）で特定した異なるプライマー対を使用する、繰り返すこと、および、（Ｊ）を、以下の（Ｊ’）：
（ｉ）最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと実験感度の平均値ａｖＥＳとを比較するための手段であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、手段、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較するための手段であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＭｕｔの平均値ａｖａｖＭｕｔとを比較するための手段であって、
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＰｏｓの平均値ａｖａｖＰｏｓとを比較するための手段であって、
（ｃ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較するための手段であって、
（ｄ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値、ａｖａｖＭｕｔ値、ａｖａｖＰｏｓ値、およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較するための手段であって、
（ｆ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、手段、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較するための手段であって、
（ｇ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、手段
と置き換えることを含み、
ここで、ｎは２～５から選択される自然数である、請求項２８に記載のキット。

【請求項30】

前記体細胞遺伝子再構成突然変異が、免疫グロブリン遺伝子再構成突然変異である、請求項２４から２９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項31】

前記疾患が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＡＳＸＬ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＡＬＲ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＬＮ１、ＥＰＡＳ１、ＥＰＯＲ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＲＡＤ２１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ２、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、およびＺＲＳＲ２からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項32】

前記疾患が慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＳＦ３Ｂ１、ＴＰ５３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＬＣＧ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、ＩＬ７、ＷＨＳＣ１、ＴＹＫ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＢＩＲＣ３、ＰＯＴ１、ＲＰＳ１５、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＴＭ、ＩＲＦ４、ＢＲＡ、ＸＰＯ１、ＣＸＣＲ４、ＢＣＬ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＤ８８、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＡＸ５、ＮＯＴＣＨ１、ＳＴＡＴ３、およびＢＴＫからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項33】

前記疾患がびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、またはホジキンリンパ腫（ＨＬ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ７Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＣＮＤ３、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＳＳ、ＣＸＣＲ４、ＥＰ３００、ＥＴＳ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＯ１、ＧＮＡ１３、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＮＲＮＰＫ、ＩＤ３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＰＫＢ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＦＨＡＳ１、ＭＵＭ１、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＸ５、ＰＣＢＰ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＲＤＭ１、ＲＲＡＧＣ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＣＳ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＰ５３、およびＸＰＯ１からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項34】

前記疾患が多発性骨髄腫（ＭＭ）であるとき、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＣＲＢＮ、ＩＲＦ４、ＴＰ５３、ＮＦＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＧＦＲ３、ＤＩＳ３、ＴＲＡＦ３、ＡＴＭ、ＭＡＸ、ＲＢ１、ＣＹＬＤ、ＣＣＮＤ１、ＮＦ１、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＴＧ１、ＭＡＦ、ＺＮＦ２９２、ＲＯＢＯ１、ＥＧＲ１、ＦＡＴ３、ＰＲＫＤ２、ＨＵＷＥ１、ＴＲＡＦ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＲＡＳＡ２、ＵＢＲ５、ＺＦＨＸ４、ＤＵＳＰ２、ＳＰ１４０、ＢＩＲＣ２、ＣＲＢＮ、およびＬＴＢからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列である、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般的には医療分野、より具体的には疾患診断の分野に含めることができる。

【0002】

特に、本発明は、増殖性疾患が処置された対象における最小残存病変の有無を、対象中の突然変異を解析することにより求めるための方法、キット、およびシステムに焦点を当てるものである。加えて、本発明は、前記対象に特化した処置方法にも焦点を当てており、該方法は、前記対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるために、前述の方法、キット、あるいはシステムの使用後に、前記対象に治療を施す工程を含む。

【背景技術】

【0003】

現在の増殖性疾患の検出および処置の方法は、臨床レベルで多くの疾患を制御し、それによって疾患の痕跡をすべて消し去ることが可能であることを意味する。それにもかかわらず、一部の疾患が検出されない、または処置後に対象の回復が完全ではない場合がある。後者の場合、疾患は、クローン選択のプロセスにより処置の選択的圧力下で薬物耐性を発達させ、これにより疾患の拡大、最終的には疾患の常発（ｒｅｃｉｄｉｖｉｓｍ）または再発を生じさせる恐れがある。そのため、所与の組織中の罹患細胞数をモニタリングすることが、非常に重要である。具体的には、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）のレベルをモニタリングすることが、特に有益である。ＭＲＤは、疾患または罹患細胞（例えば癌細胞）に対して与えられた名称であり、この疾患の処置中または処置後に対象またはその特定組織に残存している。一般的に、ＭＲＤは、例えば化学療法による処置中または処置後に対象に残存する増殖性疾患を指す。

【0004】

現在、例えば、ＭＲＤレベルの判定を介したモニタリングは、様々な技法により実行可能である。ゴールドスタンダードであるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）では、最大８つの異なるマーカーを使用して疾患の表現型を求めることができる。この目的のために使用される別の方法は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＡＳＯ－ＰＣＲ）であり、各患者または特定の分子マーカーに対して特異的なプライマーの設計が必要とされ、症例のわずか４０％にしか適用できない。

【0005】

ＥＰ３０１８２１４Ａ１は、次の式：ＭＲＤ＝Ｌ_ｃｘＤ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２によるＭＲＤの算出を開示している。対照的に、Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．（２００３）１７（１２）：２４７４－２４８６は、次の式：ＭＲＤ＝１０^{（（ΔＣｔ} _ＦＵＰ ^-ΔＣｔ _ＤＸ ^{）／-３：４）}およびＭＲＤ＝（ＦＧ_ＣＮ／ＣＧ_ＣＮ）_ＦＵＰ／（ＦＧ_ＣＮ／ＣＧ_ＣＮ）_ＤＸによるＭＲＤの算出を開示している。

【0006】

そのため、本発明の課題は、疾患が処置された対象における最小残留病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法を提供することであり、この方法は、感度の改善、より大きな解析的再現性、およびレベルのより正確な判定を示すものであり、完全に自動化することで容易に標準化することが可能であり、それにより、実験室間の変動を最小限に抑えることができる。本発明のさらなる課題は、疾患のマーカーの特徴にかかわらず、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めることが可能であり、こうして、再発の可能性がありさらなる処置を必要とする対象における疾患の存在の診断を可能にする、普遍的な方法を提供することである。加えて、本発明の課題は、対象に特異的であるとともに、対象集団から得たデータを含む外部データベースへのアクセスを必要としない方法を提供することである。

【0007】

さらに、本発明の課題は、患者に特異的であるとともに、最小残存病変を可能な限り排除するほど十分に疾患が処置されるのを確実とするほか、疾患の処置に必要な範囲を超える治療に患者を不必要にさらすことを回避する、疾患の処置方法を提供することである。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、増殖性疾患が処置された対象における実験的感度を示す閾値に対してＭＲＤ値を比較することで、前記対象における最小残存病変の有無を求めるための統計的に感度が高く特異的な手段を提供するという認識に基づくものである。従来より免疫グロブリン再構成データに依存している従来技術の方法と異なり、本方法は、対象における点突然変異（一塩基変異体、ＳＮＶ）および挿入－欠失突然変異（インデル）に関連するデータに基づき、最小残存病変の有無を確実に求めることも分かっている。

【0009】

本発明は、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法に関し、前記疾患は増殖性疾患であり、前記方法は、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、工程（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程であって、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記それぞれにおけるものと同じである、第１および第２の文字の列記それぞれにおける文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる、工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得する工程と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、工程と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式を使用してＳ２、
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９である、繰り返すこと、および
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、算出すること
による平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、ならびに
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求める工程と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求める工程であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、工程と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求める工程と
を含む。

【0010】

加えて、本発明は、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるシステムに関するものであり、前記疾患は増殖性疾患であり、前記システムは、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段と、
（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、手段と、
（Ｃ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求めるための手段であって、（Ｂ）で得た第２の文字の列記と（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出することにより求められる、手段と、
（Ｄ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択するための手段と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得するための手段と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する手段と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出するための手段であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、手段と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すための手段であって、ｍは少なくとも９である、手段、
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出するための手段であって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、手段
を用いての平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出するための手段を使用しての平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求めるための手段と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求めるための手段であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、および
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、手段と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、以下
（ｉ）（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求めるための手段と
を含む。

【0011】

さらに、本発明は、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるキットに関し、前記疾患は増殖性疾患であり、前記キットは、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段と、
（Ｂ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、手段、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、手段と、
（Ｃ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求めるための手段であって、（Ｂ）で得た第２の文字の列記と（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出することにより求められる、手段と、
（Ｄ）（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択するための手段と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得するための手段と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する手段と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２Ｄ
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出するための手段であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、手段と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させるための手段、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定するための手段であって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、手段、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すための手段であって、ｍは少なくとも９である、手段、および
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出するための手段であって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、手段
を用いての平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、ならびに
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出するための手段を使用しての平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求めるための手段と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求めるための手段であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、および
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、手段と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、以下
（ｉ）（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求めるための手段と
を含む。

【0012】

本発明はまた、疾患が処置された対象における前記疾患の処置方法に関するものであり、前記疾患は増殖性疾患であり、前記方法は、
（１）対象に治療を施す工程であって、該治療は、化学療法、免疫療法、または放射線療法、あるいはこれらの組合せから選択される、工程と、
（２）対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める工程と
を含み、前記方法はさらに、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、工程（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程であって、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出することにより求められる、工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得する工程と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、工程と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２、
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９である、繰り返すこと、および
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、算出すること
による平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、ならびに
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求める工程と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求める工程であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、工程と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、以下
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求める工程と
を含み、最小残存病変が前記対象に存在すると求められたとき、工程（１）および（２）が繰り返され、工程（１）の各繰返しは、以前に前記対象に施したものと同じ治療、または以前に前記対象に施したものとは異なる治療を施すことを含む。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】総じて１０のヘム悪質液（ｈｅｍｅ－ｄｙｓｃｒａｓｉａｓ）を含んだ４つの異なるパネルを含む腫瘍血液学的診断用の遺伝子マーカーを定義するベン図である。パネルは、リンパ性白血病（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ））、骨髄癌（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および骨髄増殖性新生物（ＭＮＰ））、多発性骨髄腫（ＭＭ）、ならびにリンパ腫（びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストロームリンパ腫（ＷＬ）、およびホジキンリンパ腫）における再発性遺伝子突然変異の重複性を示しており、結果として１３の異なる群の遺伝子マーカーがもたらされる。多くの遺伝子（イタリック体）のコーディング（エクソン）領域は、１より多くのパネルに開示される疾患において突然変異する。リンパ性白血病パネルは、４８個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域すべてに加えてＩｇＨとＩｇＫ再構成をカバーし、骨髄癌パネルは、４３個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域をカバーし、多発性骨髄腫パネルは、３８個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域に加えてＩｇＨとＩｇＫ再構成をカバーし、リンパ腫パネルは、５６個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディングをカバーしている。

【図1B】異なる固形腫瘍に関連する４つの異なるパネルを含む固形腫瘍診断用の遺伝子マーカーを定義するベン図である。パネルは、肺、乳房、結腸直腸、および膵臓の固形腫瘍における再発性遺伝子突然変異の重複性を示しており、結果として１２の異なる群の遺伝子マーカーがもたらされる。多くの遺伝子（イタリック体）のコーディング（エクソン）領域は、１より多くのパネルに開示される疾患において突然変異する。肺癌パネルは、２１個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域すべてをカバーし、乳癌パネルは、２０個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域すべてをカバーし、大腸癌パネルは、２０個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域すべてをカバーし、膵臓癌パネルは、２０個の頻繁に突然変異した遺伝子のコーディング領域すべてをカバーしている。

【図2】本発明による工程（ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ）を表す模式図であり、細い灰色の線

【0014】

【化1】

は、第１の文字の列記を表し、細い黒色の線

【0015】

【化2】

は、第２の文字の列記を表す。第１の文字の列記および第２の文字の列記において同じである文字または複数の文字の最も長く連続する配列の選択は、それぞれより太い線

【0016】

【化3】

および

【0017】

【化4】

により表され、これらは後に、前述の文字の列記から除外される。

【図3】本発明による工程（ｃ）のサブ工程（ｘｉ）～（ｘｖ）を表す模式図であり、細い灰色の線

【0018】

【化5】

は、第１の文字の列記を表し、細い黒色の線

【0019】

【化6】

は、第２の文字の列記を表す。第１の文字の列記および第２の文字の列記において同じである文字または複数の文字の最も長く連続する配列の選択は、それぞれより太い線

【0020】

【化7】

および

【0021】

【化8】

により表され、これらは後に、前述の文字の列記から除外される。

【図4】本発明の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）方法の、ＤＮＡ増幅、ライブラリ調製、およびシーケンシングの実験ワークフローを示す図である。具体的に、ｇＤＮＡは、特異的プライマーを用いたｑ－ＰＣＲにより増幅される。この産物は生成され、品質と特異性が測定される。ライブラリ調製は、末端修復、アダプターライゲーション、サイズ選択、ＰＣＲ増幅という４工程で行われる。次いで、この産物は生成され、品質と特異性が測定される。その後、ライブラリはＮＧＳにより配列決定される。カスタムバイオインフォマティックパイプライン（ｃｕｓｔｏｍ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）は、正確な位置に検索を集中させ、アンサンブルｐｅｒｌ ＡＰＩアノテーションを介して染色体領域を区切ることで、得られた配列を解析する。この手法は、特定の位置および特定の代替固定変異体における突然変異配列からの野生型配列を識別する。結果は、野生型配列間で突然変異した配列の比として表される。

【図5A】本発明の一実施形態による、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための一般化方法の一例を示すフローチャートである。ＭＲＤ、ｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、ａｖＰｏｓ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、およびＥＳのレベルは、本発明に従い求められる。ｍｉｎＶＲＦ＝最小変異読取り頻度、ａｖＭｕｔ＝平均突然変異ノイズ、ａｖＰｏｓ＝平均位置ノイズ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ＝検出限界、ＥＳ＝実験感度であり、ｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、ａｖＰｏｓ、およびＤ－ｌｉｍｉｔのうちより大きいものとして定義される。

【図5B】本発明の別の実施形態による、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための一般化方法の一例を示すフローチャートである。ＭＲＤ、ｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、ａｖＰｏｓ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、およびＥＳのレベルは、本発明に従い求められる。ｍｉｎＶＲＦ＝最小変異読取り頻度、ａｖＭｕｔ＝平均突然変異ノイズ、ａｖＰｏｓ＝平均位置ノイズ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ＝検出限界、ＥＳ＝実験感度であり、ｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、ａｖＰｏｓ、およびＤ－ｌｉｍｉｔのうちより大きいものとして定義される。

【図6】本発明の方法の一部による、最小残存病変（ＭＲＤ）のレベルを算出する方法の一例を示すフローチャートである。

【図7A】本発明の実施形態による類似度（ＤＳ）を求めるための工程の一例を示すフローチャートであり、突然変異は免疫グロブリン再構成である。

【図7B】本発明の別の実施形態による類似度（ＤＳ）を求めるための工程の一例を示すフローチャートであり、突然変異は免疫グロブリン再構成である。

【図8A】本発明の一実施形態による、遺伝子マーカーのｍｉｎＶＲＦ、前記遺伝子マーカーのＤ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓを求めるための工程の一例を示すフローチャートである。

【図8B】本発明の別の実施形態による、ＥＳを求めるための工程の一例を示すフローチャートである。

【図9-1】本発明の一実施形態による、最小残存病変（ＭＲＤ）を定量する方法の一例を示すフローチャートである。

【図9-2】本発明の一実施形態による、最小残存病変（ＭＲＤ）を定量する方法の一例を示すフローチャートである。

【図10A】本発明の実施形態による逆相補性度（ＤＳ_ｒｃｓ）を求めるための工程の一例を示すフローチャートであり、突然変異は免疫グロブリン再構成である。

【図10B】本発明の別の実施形態による逆相補性度（ＤＳ_ｒｃｓ）を求めるための工程の一例を示すフローチャートであり、突然変異は免疫グロブリン再構成である。

【図11A】本発明の一実施形態による、対象における疾患の処置のための一般化方法の一例を示すフローチャートである。

【図11B】本発明の別の実施形態による、対象における疾患の処置のための一般化方法の一例を示すフローチャートである。

【図12】３つのデータポイントの連続する組同士の間の最小二乗回帰を用いて遺伝子マーカーの検出限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）を求める一般化方法（本明細書中では、「傾きの違いを用いた（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｓｌｏｐｅ）方法」）を例示する希釈曲線を示す図である。所与の組は、連続して１０倍低下した濃度の遺伝子マーカーの第１、第２、および第３の組成物により表され、３つのデータポイントの連続する組は、連続して１０倍低下した濃度の遺伝子マーカーの前記第２、前記第３、および第４の組成物により表され、各データポイント（希釈点）は、所与の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその希釈の対数（濃度、体積／体積）（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を含んでおり、これにより、１つの組の回帰線が、連続する組の回帰線の少なくとも３０％であるとき、第３の組成物の濃度は、Ｄ－ｌｉｍｉｔとして確立される（本明細書では、３つのデータポイントの最終組の傾斜Ｓ２は０．３３６２であり、この値は、連続する組の傾斜Ｓ１（０．６３２２）の３０％未満であり、そのため、Ｄ－ｌｉｍｉｔはＬＯＧ＿ＤＩＬ＝－５の指数部である）。

【図13A】ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13B】ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13C】ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13D】ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13E】ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13F】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13G】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13H】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13I】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13J】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13K】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13L】ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13M】ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13N】ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｖに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13O】ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13P】ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13Q】ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13R】ＮＰＭ１ Ｉｎｓに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13S】ＩｇＫ再構成に関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図13T】ＩｇＫに関する希釈曲線である。希釈限界（Ｄ－ｌｉｍｉｔ）は、連続して１０倍増加する希釈（低下した濃度、体積／体積）の遺伝子マーカーを有する第１、第２、および第３の組成物から得た最後（第３、すなわち最大希釈）の希釈点を生じさせる遺伝子マーカーの組成物の濃度により表され、前記組の回帰線の勾配は、前記第２の組成物、前記第１の組成物、および前記第１の組成物よりも１０倍少なく希釈された組成物（黒点）から得られる３つの希釈点の回帰線の勾配から３０％未満逸脱し、各希釈点は、所与の組成物の前記遺伝子マーカーのＭＲＤのレベルの対数（ＬＯＧ＿ＭＲＤ）およびその濃度の対数（ＬＯＧ＿ＤＩＬ）を表す。各希釈点の勾配は、希釈点、および前の２つ（すなわち、希釈の少ない）希釈点により定義される。黒い四角は、範囲外の希釈点を表し、実線は、範囲外の第１の点を含めて算出された希釈曲線（線）を表す。

【図14A】２０１８年９月に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された対象（ＡＭＬ＿４０１）の最後の追跡訪問（２０１９年１月２５日）に関する、定量的ＭＲＤステータス（すなわち、ＭＲＤのレベル）対時間および実験感度（ＥＳ）の図である。診断時、対象には、ＭＲＤマーカー：ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄにおける１つのクローンＳＮＶ（Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔを適用した後の診断で定義された変異読取り頻度、ＶＲＦｄｉａｇ＝０．４７）、ＮＰ１における１つのサブクローン挿入（ＮＰＭ１＿Ｗ２９０Ｆｓ）（ＶＲＦｄｉａｇ＝０．２７）としての使用に適した２つの異なる体細胞変異を認めた。対象は、シタラビン＋イダルビシン（３＋７）［Ｃｙｔａ＋Ｉｄａ（３＋７）］、続いて高用量のシタラビンで処置された。自己幹細胞移植（自己移植）前の最後の追跡訪問では、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤにおけるＥＳは、Ｄ－ｌｉｍｉｔ曲線（６．８ｘ１０^－５）により定義され、ＮＰＭ１はｍｉｎＶＲＦ（１．０ｘ１０^－５）により定義される。

【図14B】ＡＭＬ＿４０１におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異に関するｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、およびａｖＰｏｓの値を示す図である。それぞれ本明細書で詳しく定義されるように、ｍｉｎＶＲＦは初期量のＤＮＡ（６５０ｎｇ）により定義され、ａｖＭｕｔは１０個の陰性対照の平均により定義され、Ｄ－ｌｉｍｉｔは、ｌｏｇ（ＭＲＤのレベル）対希釈（濃度、体積／体積）曲線の対数に関する第２の組の３つ連続するデータポイント（遺伝子マーカーの最低濃度の組成物を含む）間の回帰線の勾配が、前記曲線に関する第１の組の３つ連続するデータポイント（遺伝子マーカーの最高濃度の組成物を含む）のものより少なくとも３０％低いとき、連続して１０倍低下した濃度の遺伝子マーカー（体積／体積）を含む４つ一組の組成物の第３の組成物におけるマーカーの濃度により定義され、ａｖＰｏｓは、代替的な読取りに関するエラー率により定義される。

【図14C】ＡＭＬ＿４０１におけるＮＰＭ１ ｉｎｓ突然変異に関するｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、およびａｖＰｏｓの値を示す図である。それぞれ本明細書で詳しく定義されるように、ｍｉｎＶＲＦは初期量のＤＮＡ（６５０ｎｇ）により定義され、Ｄ－ｌｉｍｉｔは傾きの違いを用いた方法により定義され、ａｖＭｕｔとａｖＰｏｓはともに０である。

【図15A】２０１４年２月に多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断された対象（ＭＭ＿５７７）の最後の追跡訪問（２０１６年１月６日）における、定量的ＭＲＤ状態対時間および実験感度（Ｅｘｐ．感度、ＥＳ）を示す図である。診断時、対象には、ＭＲＤマーカー：Ｉｇｋにおける再構成（Ｉｇｋ ｒｅａｒｒ．）としての使用に適した突然変異を認めた。対象は、免疫調節因子＋プロテアソーム阻害剤（ＩＭＩＤ＋Ｐ Ｉ）で処理され、自己幹細胞移植が行われた。移植後の最後の追跡訪問では、ＩｇＫ ｒｅａｒ．におけるＥＳは、ｍｉｎＶＲＦ（１．００ｘ１０^－５）により定義される。

【図15B】ＭＭ＿５７７におけるＩｇＫ ｒｅａｒ．突然変異に関するｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、およびａｖＰｏｓの値を示す図である。それぞれ本明細書で詳しく定義されるように、ｍｉｎＶＲＦは初期量のＤＮＡ（６５０ｎｇ）により定義され、ａｖＭｕｔは１０個の陰性対照の平均により定義され、Ｄ－ｌｉｍｉｔは傾きの違いを用いた方法により定義され、ａｖＰｏｓは代替的な読取りに関するエラー率により定義される。

【図16】２０１５年１月に多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断された対象（ＭＭ＿６２８）の最後の追跡訪問（２０１６年１月８日）における、定量的ＭＲＤ状態対時間および実験感度（Ｅｘｐ．感度、ＥＳ）を示す図である。診断時、対象には、ＭＲＤマーカー：ＮＲＡＳ Ｑ６１ＨにおけるクローンＳＮＶとしての使用に適した体細胞突然変異を認めた。対象は、免疫調節因子＋プロテアソーム阻害剤（ＩＭＩＤ＋Ｐ Ｉ）で処理され、自己幹細胞移植が行われた。移植後の最後の追跡訪問では、ＮＲＡＳ Ｑ６１ＨにおけるＥＳは、ａｖＰｏｓ（１．４ｘ１０^－４）により定義される。

【図17】２０１７年１０月に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された対象（ＡＭＬ＿９８１）の最後の追跡訪問（２０１８年１１月１日）における、定量的ＭＲＤ状態対時間および実験感度（Ｅｘｐ．感度、ＥＳ）を示す図である。診断時、対象には、ＭＲＤマーカー：ＮＲＡＳ Ｑ６１ＲにおけるクローンＳＮＶとしての使用に適した体細胞突然変異を認めた。対象は、シタラビン＋イダルビシン（３＋７）［Ｃｙｔａ＋Ｉｄａ（３＋７）］、続いて高用量のシタラビンで処置された。自己幹細胞移植（自己移植）前の最後の追跡訪問では、ＮＲＡＳ Ｑ６１ＲにおけるＥＳは、ａｖＭｕｔ（６．０６ｘ１０^－５）により定義される。

【図18A】２０１４年１２月に多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断された対象（ＭＭ＿６０６）の最後の追跡訪問（２０１７年２月後半）における、定量的ＭＲＤ状態対時間および実験感度（Ｅｘｐ．感度、ＥＳ）を示す図である。診断時、対象には、ＭＲＤマーカー：ＩｇＨにおける再構成（ＩｇＨ ｒｅａｒｒ．）としての使用に適した突然変異を認めた。対象は、免疫調節因子＋プロテアソーム阻害剤（ＩＭＩＤ＋Ｐ Ｉ）で処理され、２年目と３年目の維持の前に自己幹細胞移植が行われた。移植後の最後の追跡訪問では、ＩｇＨ ｒｅａｒ．におけるＥＳ は、ｍｉｎＶＲＦ（１．００ｘ１０^－５）により定義される。

【図18B】ＭＭ＿６０６におけるＩｇＨ ｒｅａｒ．突然変異に関するｍｉｎＶＲＦ、ａｖＭｕｔ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、およびａｖＰｏｓの値を示す図である。それぞれ本明細書で詳しく定義されるように、ｍｉｎＶＲＦは初期量のＤＮＡ（６５０ｎｇ）により定義され、ａｖＭｕｔは１０個の陰性対照の平均により定義され、Ｄ－ｌｉｍｉｔは傾きの違いを用いた方法により定義され、ａｖＰｏｓは代替的な読取りに関するエラー率により定義される。

【図19A】様々な病因を持つ対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。特にＫＲＡＳ Ｔ５８Ｉ突然変異を用いた対象ＭＤＳ＿７１２における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）。

【図19B】様々な病因を持つ対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。特にＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を用いた対象ＭＤＳ＿５８１における多発性骨髄腫（ＭＭ）。

【図19C】様々な病因を持つ対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。特にＥＺＨ Ｙ６４６Ｓ突然変異を用いた対象ＦＬ＿７３９における濾胞性リンパ腫（ＦＬ）。

【図19D】様々な病因を持つ対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。特にＩＤＨ２Ｒ１７２Ｋ突然変異を用いた対象ＡＭＬ＿１０１における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）。

【図20A】ゴールドスタンダードのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ＭＲＤ）と比較した、４人の多発性骨髄腫対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ突然変異を用いて対象ＭＭ＿８２７において求められる。各例では、実験感度（ＥＳ）は、クローンＳＮＶ突然変異（ＳＮＶ＿ＥＳ）およびフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ＿ＥＳ）の両方を使用して求められる。

【図20B】ゴールドスタンダードのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ＭＲＤ）と比較した、４人の多発性骨髄腫対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ突然変異を用いて対象ＭＭ＿５６１において求められる。各例では、実験感度（ＥＳ）は、クローンＳＮＶ突然変異（ＳＮＶ＿ＥＳ）およびフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ＿ＥＳ）の両方を使用して求められる。

【図20C】ゴールドスタンダードのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ＭＲＤ）と比較した、４人の多発性骨髄腫対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｒ突然変異を用いて対象ＭＭ＿７００において求められる。各例では、実験感度（ＥＳ）は、クローンＳＮＶ突然変異（ＳＮＶ＿ＥＳ）およびフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ＿ＥＳ）の両方を使用して求められる。

【図20D】ゴールドスタンダードのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ＭＲＤ）と比較した、４人の多発性骨髄腫対象における定量的ＭＲＤ状態対時間の判定の例を示す図である。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ突然変異を用いて対象ＭＭ＿６２３において求められる。各例では、実験感度（ＥＳ）は、クローンＳＮＶ突然変異（ＳＮＶ＿ＥＳ）およびフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ＿ＥＳ）の両方を使用して求められる。

【図21A】ＴＳＣ２ ｐ．Ｌ２４８Ｖ突然変異を用いて対象腺癌＿００２、Ｂ．ＷＡＳ ｐ．Ｔ４５Ｍ突然変異を用いて対象腺癌＿００２において求められる肺癌（腺癌）対象における、定量的ＭＲＤ状態（破線）対時間の判定の例を示す図である。各例では、循環する遊離ＤＮＡは、遺伝物質の供給源として使用され、実験感度（点線）は、フローサイトメトリーを用いて求められる。

【図21B】ＷＡＳ ｐ．Ｔ４５Ｍ突然変異を用いて対象腺癌＿００２において求められる肺癌（腺癌）対象における、定量的ＭＲＤ状態（破線）対時間の判定の例を示す図である。各例では、循環する遊離ＤＮＡは、遺伝物質の供給源として使用され、実験感度（点線）は、フローサイトメトリーを用いて求められる。

【図21C】ＫＭＴ２Ｄ ｐ．Ｑ２０１４^＊突然変異を用いて対象濾胞性リンパ腫＿５４７において求められる濾胞性リンパ腫対象における、定量的ＭＲＤ状態（破線）対時間の判定の例を示す図である。各例では、循環する遊離ＤＮＡは、遺伝物質の供給源として使用され、実験感度（点線）は、フローサイトメトリーを用いて求められる。

【図21D】ＫＲＡＳ ｐ．Ｇ１２Ａ突然変異を用いて対象濾胞性リンパ腫＿０６１において求められる濾胞性リンパ腫対象における、定量的ＭＲＤ状態（破線）対時間の判定の例を示す図である。各例では、循環する遊離ＤＮＡは、遺伝物質の供給源として使用され、実験感度（点線）は、フローサイトメトリーを用いて求められる。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための方法、システム、およびキットに関するものである。本発明はまた、最小残存病変の有無を求めるための前記方法を含む、前記疾患が処置された対象における疾患の処置方法にも関する。好ましくは、方法、システム、およびキット（図５Ａと５Ｂに例示される）、ならびに処置方法（図１１Ａと１１Ｂに例示される）は、生物学的技法とコンピュータプログラム製品を使用する。

【0023】

具体的に、本発明は、対照における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための方法、システム、およびキット、ならびに該疾患が処置された対象における疾患の処置方法に関するものであり、この方法は、最小残存病変の有無を求めるための前記方法を含んでおり、前記疾患は増殖性疾患である。このため、前記対象は、かかる任意の増殖性疾患が処置された個体である。

【0024】

ＭＲＤは、増殖性疾患の処置後に対象に残る疾患に与えられた名称である。このため、ＭＲＤの有無をもとめることとは、対象において増殖したまま残る罹患細胞の有無を求めること、または、前記増殖性疾患の処置後に対象における蔵相区性疾患に関連する遺伝物質の有無を求めることを意味する。好ましくは、ＭＲＤの有無を求めることとは、前記増殖性疾患の処置後に対象の生物学的試料または組織に増殖したまま残る罹患細胞の有無を求めること、あるいは、前記増殖性疾患の処置後に対象の生物学的試料または組織における増殖性疾患に関連する遺伝物質の有無を求めることを意味する。増殖性疾患の有無は、罹患細胞の上、中、または外側での遺伝子マーカーの発現または発現欠如に基づき特定することができる。

【0025】

増殖性疾患は、細胞の過剰増殖を特徴とする疾患である。好ましくは、前記増殖性疾患は、造血組織またはリンパ組織の腫瘍であり、より好ましくは、リンパ増殖性疾患、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、または固形腫瘍からなる群から選択される。前記白血病は、多数の異常な血液細胞をもたらす血液の癌、このましくは骨髄癌およびリンパ性白血病からなる群から選択されるものであり、前記骨髄癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）からなる群から選択され、一方で前記リンパ性白血病は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）からなる群から選択される。前記リンパ腫は、リンパ球から発達する血液の癌、このましくはホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、リンパ増殖性疾患から選択されるものであり、より好ましくは、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ワルデンストレームマクログロブリン血症、ＷＬ）、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）から選択される。前記固形腫瘍は、嚢胞を伴わない癌、好ましくは肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択され、より好ましくは、肺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、脳癌、腎臓癌、胃癌、子宮頸癌、前立腺癌、および精巣癌、さらに好ましくは肺癌、乳癌、大腸癌、および膵臓癌からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）からなる群から選択される骨髄癌、
多発性骨髄腫（ＭＭ）、
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）からなる群から選択されるリンパ性白血病、
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、およびホジキンリンパ腫からなる群から選択されるリンパ腫、
肺癌、乳癌、大腸癌、および膵臓癌からなる群から選択される固形腫瘍（液体生検）
からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＮＰ）、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される。本発明の特に好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、（図１にも示される）以下の４つの群のうち１つから選択される（本発明にも示される）：（１）慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）からなる群から選択されるリンパ性白血病、（２）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）からなる群から選択される骨髄性癌、（３）多発性骨髄腫（ＭＭ）、ならびに（４）ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、およびワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）からなる群から選択されるリンパ腫。本発明のより特に好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）からなる群から選択され、最も好ましくは、前記増殖性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

【0026】

疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための方法、システム、またはキットの工程（Ａ）、ならびに、最小残存病変の有無を求めるための前記方法を含む対象における疾患の措置方法の工程（Ａ）は、一連の工程（生物学的技法）として、
座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た組織試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程（図６のブロック（２００））、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程（図６のブロック（２０２））
を含む。

【0027】

同様に、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための方法、システム、またはキットの工程（Ｂ）は、以下の一連の工程（生物学的技法）として、
工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た組織試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程（図６のブロック（２０４））、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程（図６のブロック（２０６））
を含む。

【0028】

工程（Ａ）と（Ｂ）は、同時に、あるいは、工程（Ａ）に次いで工程（Ｂ）、またはその逆といったように連続して行うことができる。工程（Ａ）と（Ｂ）において増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドより短く（ゆえに、４００塩基対より短い）、好ましくは３５０ヌクレオチドより短く、より好ましくは３００ヌクレオチドより短い。前記ヌクレオチド配列は、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は突然変異すると、遺伝子マーカーである。

【0029】

本発明では、前記突然変異ヌクレオチド配列は、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む。ゆえに、本発明では、疾患は、遺伝子のヌクレオチド配列における少なくとも１つの体細胞突然変異の存在を特徴とするものであり、この突然変異は、一塩基変異型突然変異（ＳＮＶ）、挿入－欠失（インデル）突然変異、または体細胞遺伝子再構成突然変異である。一実施形態では、前記疾患は、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、または体細胞遺伝子再構成突然変異に起因するものである。好ましくは、前記体細胞遺伝子再構成突然変異は、免疫グロブリン遺伝子再構成突然変異である。より好ましくは、前記疾患は、高い対立遺伝子負荷および／または少なくとも１つの点突然変異（ＳＮＶ）または少なくとも１つのインデルを伴う少なくとも１つの腫瘍クローン型ヌクレオチド配列を特徴とする。

【0030】

好ましい実施形態では、前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であり、ＡＳＸＬ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＡＬＲ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＬＮ１、ＥＰＡＳ１、ＥＰＯＲ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＲＡＤ２１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ２、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、およびＺＲＳＲ２からなる群（パネル１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であり、以下
ＡＳＸＬ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＡＬＲ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＬＮ１、ＥＰＡＳ１、ＥＰＯＲ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＲＡＤ２１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ２、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、およびＺＲＳＲ２からなる群（パネル１．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＡＳＸＬ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＣＡＬＲ、ＣＢＬ、ＣＥＢＰＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＧＬＮ１、ＥＰＡＳ１、ＥＰＯＲ、ＥＴＶ６、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＩＴ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＰＬ、ＮＦ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＲＡＤ２１、ＲＵＮＸ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＦ３Ａ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＭＣ１Ａ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ２、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、ＴＰ５３、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＴ１、およびＺＲＳＲ２からなる群（パネル１．３）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0031】

またさらに好ましくは、前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であり、以下
ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＰＭ１、およびＮＲＡＳからなる群（パネル１．４）、またさらに好ましくはＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ、ＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋ、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ、ＫＩＴ Ｄ８１６Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｔ５８Ｉ、ＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ （ＮＰＭ１ ｉｎｓ）、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒからなる群（パネル１．４．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異
を特徴とする。

【0032】

別の好ましい実施形態では、前記疾患は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり、前記ヌクレオチド配列は、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＳＦ３Ｂ１、ＴＰ５３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＬＣＧ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、ＩＬ７、ＷＨＳＣ１、ＴＹＫ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＢＩＲＣ３、ＰＯＴ１、ＲＰＳ１５、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＴＭ、ＩＲＦ４、ＢＲＡ、ＸＰＯ１、ＣＸＣＲ４、ＢＣＬ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＤ８８、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＡＸ５、ＮＯＴＣＨ１、ＳＴＡＴ３、およびＢＴＫからなる群（パネル２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり、以下
ＩＧＨおよびＩＧＫからなる群（パネル２．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における体細胞遺伝子再構成突然変異、または
ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＳＦ３Ｂ１、ＴＰ５３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＬＣＧ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、ＩＬ７、ＷＨＳＣ１、ＴＹＫ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＢＩＲＣ３、ＰＯＴ１、ＲＰＳ１５、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＴＭ、ＩＲＦ４、ＢＲＡ、ＸＰＯ１、ＣＸＣＲ４、ＢＣＬ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＤ８８、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＡＸ５、ＮＯＴＣＨ１、ＳＴＡＴ３、およびＢＴＫからなる群（パネル２．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＥＺＨ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＨＦ６、ＳＦ３Ｂ１、ＴＰ５３、ＩＬ７Ｒ、ＰＴＥＮ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＥＧＲ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＰＬＣＧ２、ＪＡＫ３、ＪＡＫ１、ＩＬ７、ＷＨＳＣ１、ＴＹＫ２、ＦＢＸＷ７、ＩＫＺＦ１、ＢＩＲＣ３、ＰＯＴ１、ＲＰＳ１５、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＴＭ、ＩＲＦ４、ＢＲＡ、ＸＰＯ１、ＣＸＣＲ４、ＢＣＬ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＹＤ８８、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＡＸ５、ＮＯＴＣＨ１、ＳＴＡＴ３、およびＢＴＫからなる群（パネル２．３）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0033】

またさらに好ましくは、前記疾患は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）であり、以下
ＩＧＨおよびＩＧＫからなる群（パネル２．４）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における体細胞遺伝子再構成突然変異、または
ＪＡＫ２、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳからなる群（パネル２．５）、またさらに好ましくはＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、およびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒからなる群（パネル２．５．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中のインデル突然変異または一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0034】

別の好ましい実施形態では、前記疾患は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパ腫（ＷＬ）、またはホジキンリンパ腫（ＨＬ）であり、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ７Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＣＮＤ３、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＳＳ、ＣＸＣＲ４、ＥＰ３００、ＥＴＳ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＯ１、ＧＮＡ１３、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＮＲＮＰＫ、ＩＤ３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＰＫＢ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＦＨＡＳ１、ＭＵＭ１、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＸ５、ＰＣＢＰ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＲＤＭ１、ＲＲＡＧＣ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＣＳ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＰ５３、およびＸＰＯ１からなる群（パネル３）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパリンパ腫（ＷＬ）、またはホジキンリンパ腫であり、以下
ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ７Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＣＮＤ３、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＳＳ、ＣＸＣＲ４、ＥＰ３００、ＥＴＳ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＯ１、ＧＮＡ１３、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＮＲＮＰＫ、ＩＤ３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＰＫＢ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＦＨＡＳ１、ＭＵＭ１、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＸ５、ＰＣＢＰ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＲＤＭ１、ＲＲＡＧＣ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＣＳ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＰ５３、およびＸＰＯ１からなる群（パネル３．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、Ｂ２Ｍ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ７Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＣＡＲＤ１１、ＣＣＮＤ３、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＳＳ、ＣＸＣＲ４、ＥＰ３００、ＥＴＳ１、ＥＺＨ２、ＦＯＸＯ１、ＧＮＡ１３、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＮＲＮＰＫ、ＩＤ３、ＩＫＺＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ８、ＩＴＰＫＢ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＦＨＡＳ１、ＭＵＭ１、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＸ５、ＰＣＢＰ１、ＰＩＭ１、ＰＩＭ２、ＰＲＤＭ１、ＲＲＡＧＣ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＣＳ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＰ５３、およびＸＰＯ１からなる群（パネル３．３）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0035】

またさらに好ましくは、前記疾患は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、ワルデンストレームリンパリンパ腫（ＷＬ）、またはホジキンリンパ腫であり、以下
ＥＺＨ２、ＫＭＴ２Ｄ、およびＫＲＡＳからなる群（パネル３．４）、またさらに好ましくはＥＺＨ２Ｙ６４６Ｓ、ＫＭＴ２Ｄ Ｑ２０１４Ｆｓ（ＫＭＴ２Ｄ ｐ．Ｑ２０１４Ｆｓ）、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ（ＫＲＡＳ ｐ．Ｇ１２Ａ）からなる群（パネル３．４．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中のインデル突然変異または一塩基変異型突然変異
を特徴とする。さらにより好ましくは、前記疾患は濾胞性リンパ腫（ＦＬ）であり、以下
ＥＺＨ２、ＫＭＴ２Ｄ、およびＫＲＡＳからなる群、またさらに好ましくはＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｓ、ＫＭＴ２Ｄ Ｑ２０１４ｆｓ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ａからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中の一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0036】

また別の好ましい実施形態では、前記疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）であり、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＣＲＢＮ、ＩＲＦ４、ＴＰ５３、ＮＦＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＧＦＲ３、ＤＩＳ３、ＴＲＡＦ３、ＡＴＭ、ＭＡＸ、ＲＢ１、ＣＹＬＤ、ＣＣＮＤ１、ＮＦ１、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＴＧ１、ＭＡＦ、ＺＮＦ２９２、ＲＯＢＯ１、ＥＧＲ１、ＦＡＴ３、ＰＲＫＤ２、ＨＵＷＥ１、ＴＲＡＦ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＲＡＳＡ２、ＵＢＲ５、ＺＦＨＸ４、ＤＵＳＰ２、ＳＰ１４０、ＢＩＲＣ２、ＣＲＢＮ、およびＬＴＢからなる群（パネル４）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列の突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は多発性骨髄腫（ＭＭ）であり、以下
ＩＧＨおよびＩＧＫからなる群（パネル４．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における体細胞遺伝子再構成突然変異、または
ＣＲＢＮ、ＩＲＦ４、ＴＰ５３、ＮＦＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＧＦＲ３、ＤＩＳ３、ＴＲＡＦ３、ＡＴＭ、ＭＡＸ、ＲＢ１、ＣＹＬＤ、ＣＣＮＤ１、ＮＦ１、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＴＧ１、ＭＡＦ、ＺＮＦ２９２、ＲＯＢＯ１、ＥＧＲ１、ＦＡＴ３、ＰＲＫＤ２、ＨＵＷＥ１、ＴＲＡＦ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＲＡＳＡ２、ＵＢＲ５、ＺＦＨＸ４、ＤＵＳＰ２、ＳＰ１４０、ＢＩＲＣ２、ＣＲＢＮ、およびＬＴＢからなる群（パネル４．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列の突然変異、または
ＣＲＢＮ、ＩＲＦ４、ＴＰ５３、ＮＦＫＢ２、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＧＦＲ３、ＤＩＳ３、ＴＲＡＦ３、ＡＴＭ、ＭＡＸ、ＲＢ１、ＣＹＬＤ、ＣＣＮＤ１、ＮＦ１、ＫＬＨＬ６、ＰＴＰＮ１１、ＡＣＴＧ１、ＭＡＦ、ＺＮＦ２９２、ＲＯＢＯ１、ＥＧＲ１、ＦＡＴ３、ＰＲＫＤ２、ＨＵＷＥ１、ＴＲＡＦ２、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＲＡＳＡ２、ＵＢＲ５、ＺＦＨＸ４、ＤＵＳＰ２、ＳＰ１４０、ＢＩＲＣ２、ＣＲＢＮ、およびＬＴＢからなる群（パネル４．３）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列の一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0037】

さらにより好ましくは、前記疾患は多発性骨髄腫（ＭＭ）であり、以下
ＩＧＨおよびＩＧＫからなる群（パネル４．４）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における体細胞遺伝子再構成突然変異、または
ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳからなる群（パネル４．５）、またさらに好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＲＡＳ Ｇ１３Ｄ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ＮＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、およびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒからなる群（パネル４．５．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中のインデル突然変異または一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0038】

別の好ましい実施形態では、前記疾患は固形肺腫瘍であり、ＴＳＣ２、ＷＡＳ、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＭＥＴ、ＫＥＡＰ１、ＰＴＰＲＴ、ＦＡＴ１、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＥＲＢＢ２、ＮＦ１、ＦＡＴ４、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、 ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＲＩＤ１Ａ、およびＣＤＫＮ２Ａからなる群（パネル５）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中の突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は肺癌であり、以下
ＥＧＦＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＭＥＴ、ＫＥＡＰ１、ＰＴＰＲＴ、ＦＡＴ１、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＥＲＢＢ２、ＮＦ１、ＦＡＴ４、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、 ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＲＩＤ１Ａ、およびＣＤＫＮ２Ａからなる群（パネル５．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＴＳＣ２、ＷＡＳ、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＭＥＴ、ＫＥＡＰ１、ＰＴＰＲＴ、ＦＡＴ１、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＥＲＢＢ２、ＮＦ１、ＦＡＴ４、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＲＩＤ１Ａ 、およびＣＤＫＮ２Ａからなる群（パネル５．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。さらにより好ましくは、前記疾患は固形肺腫瘍であり、ＴＳＣ２ Ｌ２４８Ｖ（ＴＳＣ２ ｐ．Ｌ２４８Ｖ）、およびＷＡＳ Ｔ４５Ｍ（ＷＡＳ ｐ．Ｔ４５Ｍ）からなる群（パネル５）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異を特徴とする。

【0039】

別の好ましい実施形態では、前記疾患は、固形乳房腫瘍であり、ＣＤＨ１、ＡＫＴ１、ＧＡＴＡ３、ＮＣＯＲ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＢＸ３、ＲＵＮＸ１、ＥＳＲ１、ＭＥＤ１２、ＲＢ１、ＥＲＢＢ２、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、およびＡＲＩＤ１Ａからなる群（パネル６）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は乳癌であり、以下
ＣＤＨ１、ＡＫＴ１、ＧＡＴＡ３、ＮＣＯＲ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＢＸ３、ＲＵＮＸ１、ＥＳＲ１、ＭＥＤ１２、ＲＢ１、ＥＲＢＢ２、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、およびＡＲＩＤ１Ａからなる群（パネル６．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＣＤＨ１、ＡＫＴ１、ＧＡＴＡ３、ＮＣＯＲ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＴＢＸ３、ＲＵＮＸ１、ＥＳＲ１、ＭＥＤ１２、ＲＢ１、ＥＲＢＢ２、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、およびＡＲＩＤ１Ａからなる群（パネル６．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0040】

別の好ましい実施形態では、前記疾患は、固形大腸腫瘍であり、ＴＧＦＢＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲＮＦ４３、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＦＡＴ４、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、およびＰＴＥＮからなる群（パネル７）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は大腸癌であり、以下
ＴＧＦＢＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲＮＦ４３、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＦＡＴ４、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、およびＰＴＥＮからなる群（パネル７．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＴＧＦＢＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲＮＦ４３、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＦＡＴ４、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、およびＰＴＥＮからなる群（パネル７．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0041】

別の好ましい実施形態では、前記疾患は、固形膵臓腫瘍であり、ＴＧＦＢＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲＮＦ４３、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＭＥＮ１、ＧＮＡＳ、ＲＢＭ１０、ＡＴＲＸ、ＤＡＸＸ、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＲＩＤ１Ａ、およびＣＤＫＮ２Ａからなる群（パネル８）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。より好ましくは、前記疾患は膵臓癌であり、以下
ＴＧＦＢＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲＮＦ４３、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＭＥＮ１、ＧＮＡＳ、ＲＢＭ１０、ＡＴＲＸ、ＤＡＸＸ、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＲＩＤ１Ａ、およびＣＤＫＮ２Ａからなる群（パネル８．１）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異、または
ＴＧＦＢＲ２、ＣＴＮＮＢ１、ＲＮＦ４３、ＡＰＣ、ＳＭＡＤ４、ＭＥＮ１、ＧＮＡＳ、ＲＢＭ１０、ＡＴＲＸ、ＤＡＸＸ、ＴＰ５３、ＫＭＴ２Ｄ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＭＴ２Ｃ、ＡＴＭ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＲＩＤ１Ａ、およびＣＤＫＮ２Ａからなる群（パネル８．２）から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における一塩基変異型突然変異
を特徴とする。

【0042】

またさらに好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、および肺癌（腺癌）からなる群から選択され、
前記疾患は、急性骨髄性白血病であるとき、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＰＭ１、およびＩＤＨ２、より好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ（ＮＰＭ１ ｉｎｓ）、およびＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、多発性骨髄腫であるとき、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＩＧＫ、およびＩＧＨ、より好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、ＩＧＫ、およびＩＧＨからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、骨髄異形成症候群であるとき、ＫＲＡＳ、より好ましくは ＫＲＡＳ Ｔ５８Ｉからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、濾胞性リンパ腫であるとき、ＥＺＨ２、ＫＭＴ２Ｄ、およびＫＲＡＳ、より好ましくはＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｓ、ＫＭＴ２Ｄ Ｑ２０１４ｆｓ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ａからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、肺癌であるとき、ＴＳＣ２およびＷＡＳ、より好ましくはＴＳＣ２ Ｌ２４８ＶおよびＷＡＳ Ｔ４５Ｍからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。

【0043】

さらに好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）からなる群から選択され、
前記疾患は、急性骨髄性白血病であるとき、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＰＭ１、およびＩＤＨ２、より好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ（ＮＰＭ１ ｉｎｓ）、およびＩＤＨ２ Ｒ１７２Ｋからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、多発性骨髄腫であるとき、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＩＧＫ、およびＩＧＨ、より好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、ＩＧＫ、およびＩＧＨからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、骨髄異形成症候群であるとき、ＫＲＡＳ、より好ましくは ＫＲＡＳ Ｔ５８Ｉからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、骨髄異形成症候群であるとき、ＥＺＨ２、より好ましくはＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｓからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。

【0044】

特により好ましい実施形態では、前記増殖性疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）であり、
前記疾患は、急性骨髄性白血病であるとき、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＮＰＭ１、より好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ、およびＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ（ＮＰＭ１ ｉｎｓ）からなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とし、
前記疾患は、多発性骨髄腫であるとき、ＮＲＡＳ、ＩＧＫ、およびＩＧＨ、より好ましくはＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈ、ＩＧＫ、およびＩＧＨからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における突然変異を特徴とする。

【0045】

工程（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）における生物学的試料は、対象から採取した生物学的物質の試料を含む。組織試料は、少なくとも１つの細胞に含まれる遺伝子の領域に少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。好ましくは、前記生物学的試料は、組織、血液、尿、糞便、唾液、粘液、精子、骨、毛髪、および／または爪の中の少なくとも１つの細胞のゲノムＤＮＡにおける少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。工程（Ａ）における生物学的試料は、最小残存病変（ＭＲＤ）の有無が求められているとともに、処置前に疾患が診断されている対象から得た診断（あるいは較正または対照）試料である。工程（Ｂ）における生物学的試料は、最小残存病変の診断のために前記対象からも得られる試験（または追跡）試料である。工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）における生物学的試料は、
最小残存疾患（ＭＲＤ）の有無が求められている対象が処置を受けている疾患、および
疾患が特徴づけられる遺伝子マーカー（ゆえに突然変異）
のない、対象から得た対照試料である。工程（Ａ）の生物学的試料は、工程（Ｂ）の生物学的試料と同じ対象から疾患の処置前に採取されたものであり、好ましくは、高対立遺伝子負荷またはクローン負荷が伴う試料である。工程（Ｂ）で増幅されたヌクレオチド配列は、生物学的試料から得た一定量ＤのゲノムＤＮＡで構成される。工程（Ｂ）における生物学的試料は、二倍体細胞ごとのゲノムＤＮＡの平均重量ｋを有している。

【0046】

各生物学的試料中の前記ゲノムＤＮＡは、好ましくは循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）であり、さらにより好ましくは循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。

【0047】

ゲノムＤＮＡの各ヌクレオチド配列は、プライマー対を用いたＰＣＲにより増幅され、これにより、前記プライマー対は、前記ヌクレオチド配列に隣接するワトソンおよびクリック鎖上の異なる相補配列に結合する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含み、これにより前記ヌクレオチド配列の５’および３’限界が特定される。特に、ワトソン鎖のヌクレオチド配列の３’末端は、フォワードプライマーでアニーリングされた配列の５’末端にてヌクレオチドに隣接するヌクレオチドから始まる。逆に、ワトソン鎖のヌクレオチド配列の５’末端は、リバースプライマーでアニーリングされた配列の５’末端にてヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドから始まる。同様に、クリック鎖のヌクレオチド配列の３’末端は、リバースプライマーでアニーリングされた配列の５’末端にてヌクレオチドに隣接するヌクレオチドから始まる。逆に、クリック鎖のヌクレオチド配列の５’末端は、フォワードプライマーでアニーリングされた配列の５’末端にてヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドから始まる。したがって、ＤＮＡポリメラーゼは、前述のプライマーの５’末端に結合し、ヌクレオチド配列を複数回複製する。

【0048】

プライマーは、工程（Ａ）において生物学的試料に存在し得るヌクレオチド配列の特定の突然変異または変異（すなわち遺伝子マーカー）を特定するように選択された座位特異的プライマーであり、前記突然変異は、前記対象が処置を受けている疾患を示す。ゆえに、本発明の方法は、アンプリコンシーケンシング手法を使用して検出可能な増殖性疾患の遺伝子マーカーに適用される。

【0049】

疾患の処置前に対象から得た生物学的試料に存在するヌクレオチド配列の突然変異または変異は、前記疾患の指標であるとともに、好ましくは前記生物学的試料において最大比率で（すなわち、最大の変異読取り頻度ＶＲＦで）特定される、遺伝子マーカーである。変異読取り頻度は、本明細書で定義されるように、遺伝子マーカーの相対頻度であり、割合として（または前記割合に１００を乗じたパーセンテージとして）表される。要するにこれは、座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーにより増幅されるゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列における突然変異の相対頻度であり、ヌクレオチド配列から得られるすべての文字の列記のうち、前記遺伝子マーカーを含むヌクレオチド配列から得られる文字の列記の割合を求めることにより算出される。

【0050】

好ましくは、前記プライマー対は、表１、２、および３に開示される配列番号１～配列番号１３０の配列の対のうち、いずれかから選択される。より好ましくは、突然変異が体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、ＩｇＨ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーは、表１に示される配列番号１～配列番号２８のうちいずれかであり（配列番号２８は、配列番号１～２７のうちいずれかと組み合わせることができる）、一方、ＩｇＫ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマーは、表２に示される配列番号２９～配列番号３８のうちいずれかである（配列番号２９～３４は、配列番号３５または３６のいずれかと組み合わせてプライマー対を形成することができ、配列番号３７と３８は対である）。

【0051】

【表1】

【0052】

【表2】

【0053】

さらにより好ましくは、突然変異が一塩基変異型突然変異またはインデル突然変異であるとき、表３に列記される遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するために使用されるプライマー対は、その中に示される配列番号３９～配列番号１３０を有するプライマーにより表される４６個の対のうちいずれかである。

【0054】

【表3-1】

【0055】

【表3-2】

【0056】

【表3-3】

【0057】

【表3-4】

【0058】

このように、工程（Ａ）および（Ｂ）において、ヌクレオチド配列の少なくとも１つの特異的変異が特定されるという事実の結果として、工程（Ａ）および（Ｂ）は、少なくとも１つのヌクレオチド配列（すなわち１つ以上のヌクレオチド配列）を生物学的試料中において特定、増幅、および配列決定することを含み、ゆえに、これに対応する文字の少なくとも１つの列記（すなわち、これに対応する文字の１つ以上の列記）が与えられる。

【0059】

このように、各生体試料に存在する少なくとも１つのヌクレオチド配列の増幅は、少なくとも１つの関心領域（すなわち、対象が処置されている疾患を示す少なくとも１つの特異的突然変異）を特定する特定のプライマーを用いて行われ、その後に、超並列シーケンシングプラットフォーム上でそれぞれが処理される。したがって、この少なくとも１つの関心領域上の試験試料は、予想される感度カバレッジ以上で増幅されるとともに配列決定された。試験試料の増幅では、前記試験（追跡）試料のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の量ＤをＰＣＲに使用し、所望の感度でのシーケンシングに十分な量が得られるまで増幅を繰り返すのが好ましい。好ましくは、前記試験試料のｇＤＮＡの量Ｄは、所与の細胞数をサンプリングすることで入手可能なものと同等の感度が得られることを確実にするべく、ＰＣＲに使用される。感度は、疾患および残りの循環する腫瘍細胞に対する試験への適用のためのあらゆる例において求められる。

【0060】

ＰＣＲにて所望の感度（Ｓ）で配列決定するために使用される試験（追跡）試料のゲノムＤＮＡの量Ｄ（ｎｇ）は、先ず前記疾患の処置後に対象から得られる生物学的試料（試験試料）におけるＤＮＡ濃度（［ＤＮＡ］、ｎｇ／μｌ）を測定し、これに前記試料の体積（μｌ）を乗算することにより確立される。次いで、この値を使用して、ＰＣＲに使用される試験試料の等価細胞数（Ｎ）を以下の式
Ｎ＝Ｄ／ｋ
に従い求める。式中、ＮとＤは上記で定義したとおりであり、ｋは、試験試料の二倍体細胞ごとのゲノムＤＮＡの平均重量であり、これによりｋは、細胞ごとに６．４９ｘ１０^－３ナノグラムの値を呈することが好ましい。続いて、試験試料のＰＣＲに使用される等価細胞数（Ｎ）は、以下の式
Ｖ＝１／（ＮｘＳ）
に従い所望の感度（Ｓ）に達するために、ＰＣＲでの使用が必要な試料の体積（Ｖ、μＬ）の算出を可能とする。

【0061】

１０^－５の感度は、少なくとも１００，０００個の等価細胞のゲノムＤＮＡの使用により達成可能な感度と一致する。試験試料の体積（Ｖ）は、シーケンシングに十分な量（Ｄ、ｎｇ）のゲノムＤＮＡを得るのに必要なＰＣＲ実験の数を決定し、加えて、以下の式
Ｄ＝［ＤＮＡ］ｘＶ
に従いＰＣＲに使用される試験試料のゲノムＤＮＡの量（Ｄ）を算出するために使用される。

【0062】

増幅は、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ－ＰＣＲから選択される以下のＰＣＲ技法のいずれか１つ、および１対のプライマーを用いたｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲにより行うことができる。増幅は、マルチプレックスＰＣＲにより行うことが好ましい。

【0063】

任意選択で、工程（Ａ）と（Ｂ）は、当該技術分野における通常の方法を用いて配列決定する工程の前に、前記少なくとも１つの増幅されたヌクレオチド配列をさらに単離する工程を含んでもよい。このため、工程（Ａ）と（Ｂ）の第１の工程は、少なくとも１つの長いヌクレオチド配列上での少なくとも１つのヌクレオチド配列の選択的増幅により前記少なくとも１つの長いヌクレオチド配列から得られる前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の増幅を含み、長いヌクレオチド配列はそれぞれポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは好ましくは、二本鎖または一本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ、より好ましくは二本鎖ＤＮＡ、さらに好ましくは二本鎖ゲノムＤＮＡから選択される。前記ポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡであると、そこから相補的配列を合成して、その後に工程（Ａ）または（Ｂ）を実施して二本鎖ＤＮＡを得る。前記ポリヌクレオチドがＲＮＡであると、そこから相補的二本鎖ＤＮＡを合成（レトロ転写）して、その後に工程（Ａ）または（Ｂ）を実施する。

【0064】

こうして増幅かつ任意選択で単離される、工程（Ａ）と（Ｂ）それぞれの少なくとも１つのヌクレオチド配列は、後に配列決定される。工程（Ａ）のヌクレオチド配列の配列決定は、これに相当する左から右へ読み取る第１の文字の列記をもたらし、第１の文字の列記はそれぞれ、文字の合計数Ｃ_ｔを有している。さらに、第１の文字の列記の総数（Ｌ_ｔ）は、工程（Ａ）における異なるヌクレオチド配列の総数に相当する。工程（Ｂ）のヌクレオチド配列のシーケンシングは同様に、これに相当する左から右へ読み取る第２の文字の列記をもたらす。

【0065】

シーケンシングは、多重および／または高スループットヌクレオチドシーケンシング技法である。シーケンシングは、好ましくは次世代技法、より好ましくは超並列シーケンシング（例えば、超並列シグネチャシーケンシング（ＭＰＳＳ））により行われる。本発明の一実施形態では、複数のプライマーがシーケンシングに使用されるとき、工程（Ａ）と（Ｂ）におけるシーケンシング工程は、使用される様々なプライマーを特定するためのバーコードを使用して実施される。本発明の特に好ましい一実施形態では、シーケンシングは、ｅｍｕｌｓｉｏｎ－ＰＣＲを使用する超並列シーケンシングにより実施される。

【0066】

工程（Ａ）と（Ｂ）における前記少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅および配列決定する別個の工程はそれぞれ、別個の手段（すなわち別の機器）により実施されてもよい。代わりに、これら別個のステップの２つまたは全てが、同じ機器によって実行されてもよい。

【0067】

工程（Ａ）と（Ｂ）におけるヌクレオチド配列のシーケンシングは、対応する文字の列記をもたらし、これにより、文字の各列記中の各文字は、１つの文字（ｌｅｔｔｅｒ）を含む。本発明の一実施形態では、工程（Ａ）と（Ｂ）におけるヌクレオチド配列のシーケンシングは、対応する文字のリストをもたらし、これによって、文字の各列記中の各文字は、数（または記号）に関連する文字を含む。より好ましくは、各文字は、配列決定方法の限界内で最高品質（Ｑ）を有するヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表し、これに関連する数または記号は品質（Ｑ）であり、Ｑは、ヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表す文字が不正確である確率の整数マッピングである。このため、本発明の工程（Ａ）と（Ｂ）で得られる文字の列記はそれぞれ、好ましくはシーケンス形式ファイル、より好ましくは．ｆａｓｔｑファイルに含まれる。

【0068】

代替的に、各文字は、最高比率でヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表すことがより好ましい。この代替例のさらに好ましい一実施形態では、前記文字に関連する文字は、最高比率でヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表し、これに関連する数または記号は、その中で特定される前記ヌクレオチドの比率（例えば、百分率、分数、または比として）である。

【0069】

文字の連続配列は、別の文字または文字の不在により途切れていない列記であり、前記文字の連続配列は、途切れていないヌクレオチドの連続配列を表す。上記のものと同様に、文字の連続配列中の各文字は、１つ以上の文字、好ましくは数または記号に関連付けられる１つ以上の文字を含み、より好ましくは、各文字は、シーケンシング方法の限界内の最高品質（Ｑ）を有するヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表し、これに関連する数または記号は、品質（Ｑ）であり、Ｑは、ヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表す文字が不正確である確率の整数マッピングである。このため、この本発明のより好ましい実施形態では、文字の連続配列中の各文字が、シーケンシング方法の限界内の最高品質（Ｑ）を有する対応位置にて特定されるヌクレオチドを表すとき、前記文字の連続配列は、ヌクレオチドの連続配列を表す文字の連続配列を含む。

【0070】

代替的に、文字の連続配列中の各文字は、好ましくは、数字または記号に関連付けられる文字を含み、より好ましくは、各文字は、最高比率でヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表す。このより好ましい代替例の一実施形態では、文字の連続配列中の前記文字に関連する文字は、最高比率でヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表し、これに関連する数または記号は、その中で特定される前記ヌクレオチドの比率（例えば、百分率、分数、または比として）である。このため、このより好ましい代替的実施形態では、前記文字の連続配列は、ヌクレオチドの連続配列を表す文字の連続配列を含み、前記文字の連続配列中の各文字は、最高比率でヌクレオチドの連続配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表す。

【0071】

文字の各列記中の各文字は、前記ヌクレオチド配列中の１つのヌクレオチドに対応し、前記列記中の文字の順序は、前記ヌクレオチド配列中のヌクレオチドの順序に対応する。このように、前記列記の左端の文字は、前記ヌクレオチド配列のワトソン鎖の３’末端でのヌクレオチドまたはヌクレオチドの比率に対応し、前記列記の右端の文字は、前記ヌクレオチド配列のワトソン鎖の５’末端でのヌクレオチドまたはヌクレオチドの比率に対応する。同様に、前記ヌクレオチド配列の各クリック鎖を表す、文字の補完的（または部分上補完的）な列記が得られ、これにより、前記列記の左端の文字は、前記ヌクレオチド配列のクリック鎖の３’末端でのヌクレオチドまたはヌクレオチドの比率に対応し、前記列記の右端の文字は、前記ヌクレオチド配列のクリック鎖の５’末端でのヌクレオチドまたはヌクレオチドの比率に対応する。

【0072】

続いて、工程（Ａ）で得た各第１の文字の列記と、工程（Ｂ）で得た各第２の文字の列記との比較が行われる。前記比較は、最終的に第１の文字の列記の総数Ｌ_ｃを求めるように行われ、これは、第２の文字の列記と同じである。言い換えれば、この比較は、第２の文字の列記と同一である（すなわち一致する）Ｌ_ｃを求めるように行われる。Ｌ_ｃを求めるために、工程（Ａ）で得た各第１の文字の列記と、工程（Ｂ）で得た各第２の文字の列記との類似度を求める必要があり、類似度ＤＳは、工程（Ｂ）で得た各第２の文字の列記と、工程（Ａ）で得た各第１の文字の列記とに対して求められる。比較工程を実行し、何とか「生物学的知識」を実装するために、外部データ（例えば、集団由来の遺伝子データベース）にアクセスするバイオインフォマティクスに適した方法が知られているが、本発明の方法は、外部データにアクセスする必要なく（すなわち、工程（Ａ）または（Ｂ）で取得したデータ以外のデータにアクセスする必要なく）作用する。このために、実施が必須と考えられる第１の特徴は、ファジィ論理である。配列が等しいまたは異なるだけである古典的バイナリ論理を使用するシーケンサの失敗率は、非常に高く、有用なものではない。異なると評価される高比率（ほぼすべて）のヌクレオチド配列は等しいものであるが、シーケンサのエラーに起因して異なるものと考えられる。したがって、任意の文字の２つの列記間の類似度を評価するための比較プロセスが、実施される。

【0073】

本発明の一実施形態では、文字の列記中の各文字は、文字が第１および第２の文字の列記中で同じであるとき、第１の文字の列記中の文字が第２の文字の列記中の文字と同じであると求められるような文字（すなわち、文字が各列記中で同じであるとき、ある文字の列記中の文字が、別の文字の列記中の文字と同じであると求められる）。本発明の好ましい一実施形態では、文字の列記中の各文字は、数字または記号に関連する文字を含み、より好ましくは、各文字は、シーケンシング方法の限界内で最高品質（Ｑ）のヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表し、数または記号はそれぞれ、品質（Ｑ）を表す。このため、前記本発明の方法のより好ましい実施形態では、第１の文字の列記中の各文字と第２の文字の列記中の各文字は、数または記号に関連する文字を含み、前記数または記号は、品質（Ｑ）を表し、前記文字は、最高品質（Ｑ）を有するヌクレオチド配列中の対応する位置にて特定されるヌクレオチドを表し、最高品質を有する文字が第１および第２の文字の列記中で同じであるとき、第１の文字の列記中の文字は、第２の文字の列記中の文字と同じであると求められる（すなわち、文字が各列記中で同じであるとき、ある文字の列記中の文字は、別の文字の列記中の文字と同じであると求められる）。これに加えて、文字だけでなく、これに関連する数字または記号も、列記間で比較されてもよく、好ましくは、文字と、各列記中の各文字についてこれに関連する品質（Ｑ）を表す数または記号とを比較することにより比較される。このため、本発明の方法のさらにより好ましい実施形態では、品質（Ｑ）に関連する文字を含む文字の１つの列記中の文字は、最高品質を有する文字が各列記中で同じであり、文字の品質（Ｑ）が、カットオフ限界またはエラー、より好ましくはカットオフ限界内の各列記中で同じであるとき、品質（Ｑ’）に関連する文字を含む別の文字の列記中の文字と同じであると求められる。例えば、品質が１．００（すなわち１００％）のＴとして割り当てられる所与の位置にある文字は、カットオフ限界値を０．９９に設定（すなわち、エラーを１％に設定）したときに、品質が０．９９（すなわち９９％）のＴとして割り当てられる所与の位置にある文字と同じとみなすことができる。このため、以下の工程（ｃ）では、第１および第２の文字の列記、あるいはその部分においてカットオフ限界内で同じである文字またはその最長連続配列を選択する各工程は、１つ以上の文字または文字の１つ以上の連続配列が比較により最長と特定されるときに、先ず第１の文字の列記と第２の文字の列記、あるいはその部分間で前述の比較を行うこと、次いで以下に与えられる基準に基づき文字またはその最長連続配列を選択することを含む。この方法では、カットオフ限界は、好ましくは０．９９、より好ましくは０．９９９、さらに好ましくは０．９９９９、最も好ましくは０．９９９９９の品質（Ｑ）に設定され、および／またはエラーは、最大１％、より好ましくは０．１％、さらに好ましくは０．０１％、最も好ましくは０．００１％に設定される。本発明の方法のさらに好ましい一実施形態では、第１の文字の列記中の文字は、最高品質（Ｑ）を有する文字が第１および第２の文字の列記中で同じであるとき、第２の文字の列記中の文字と同じであると判定され、第１の文字の列記中の文字の品質は、第２の文字の列記中の文字の品質の０．０１（１％）以内、さらに好ましくは０．００１（０．１％）以内、より好ましくは０．０００１（０．０１％）以内、最も好ましくは０．００００１（０．００１％）以内である。

【0074】

代替的に、比較は、各文字の列記中に最高品質（Ｑ）または最高比率で存在する各文字を含む文字を比較することにより行われる。このため、本発明の方法では、文字の１つの列記中の文字は、好ましくは文字が同じであるときに、別の文字の列記中の文字と同じであると求められる。

【0075】

代替的に、比較は、各文字を含む１つ以上の文字それぞれの比率を比較することにより行われる。このため、比較は、ヌクレオチド配列中の各位置にて特定される１つ以上のヌクレオチドそれぞれの比率を比較することにより行われる。この方法では、ある文字の列記中の文字は、文字の比率がエラー内で同じであるとき、別の文字の列記中の文字と同じであると求められる。例えば、所与の位置にあるＡの比率が０．１１であり、所与の位置にあるＴの比率が０．８９である（すなわち、Ａ：Ｔ比が０．１１：０．８９である）文字は、エラーが５％エラーに設定されるとき、所与の位置にあるＡの比率が０．１であり、所与の位置にあるＴの割合が０．９である（すなわち、Ａ：Ｔ比が０．１：０．９である）文字と同じであるとみなすことができる。このため、以下の工程（Ｃ）では、第１の文字の列記および第２の文字の列記、あるいはその部分において同じである文字またはその最長連続配列を選択する各工程は、１つ以上の文字または文字の１つ以上の連続配列が比較により最長と特定されるときに、先ず第１の文字の列記と第２の文字の列記、あるいはその部分間で前述の比較を行うこと、次いで以下に与えられる基準に基づき文字またはその最長連続配列を選択することを含む。この方法では、エラーは最大１％、より好ましくは０．１％、さらに好ましくは０．０１％、最も好ましくは０．００１％に設定される。

【0076】

このため、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度は、続いて工程（Ｃ）において求められ、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる。

【0077】

特定の好ましい実施形態では、突然変異が免疫グロブリン再構成であるとき、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記と工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記との類似度ＤＳは、サブ工程（ｉ）～（ｘ）（図２に概略的に表されるサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ））または（ｘｉ）～（ｘｖｉｉｉ）（図３に概略的に表されるサブ工程（ｘｉ）～（ｘｖ））により求められる。図７Ａと７Ｂは、このような特に好ましい実施形態による、類似度（ＤＳ）を求めるための工程（方法）（２０８）の例を示すフローチャートを開示している。前記特に好ましい実施形態では、工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳを、
（ｉ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図７Ａのブロック（３００））、
（ｉｉ）工程（ｉ）で選択した文字またはその最長連続配列を、第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図７Ａのブロック（３０２））、
（ｉｉｉ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである、工程（ｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること、および
第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである、工程（ｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も左側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図７Ａのブロック（３０４））、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で選択した各文字および／またはその各最長連続配列を、第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図７Ａのブロック（３０６））、
（ｖ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである、先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ左側にある文字の連続配列に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること、および
第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである、先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ右側にある文字の連続配列に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も左側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図７Ａのブロック（３０８））、
（ｖｉ）工程（ｖ）で選択した各文字および／またはその各最長連続配列を、第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図７Ａのブロック（３１０））、
（ｖｉｉ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列が選択されなくなるまで、工程（ｖ）と（ｖｉ）を繰り返すこと（図７Ａのブロック（３１２）にて決定）、
（ｖｉｉｉ）工程（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかにて除外した第１の文字の列記中の文字数、および
工程（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかにて除外した第２の文字の列記中の文字数
を合計することで、それぞれ第２および第１の文字の列記と同じである、第１および第２の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｃを取得すること（図７Ａのブロック（３１４））、
（ｉｘ）Ｃ_ｃ、
第１の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（ｃ）の（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかにて除外されなかった第１の文字の列記中の文字の総数、および
第２の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（ｃ）の（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかにて除外されなかった第２の文字の列記中の文字の総数
を合計することで、第１および第２の列記における文字の総数Ｃ_ｔを得ること（図７Ａのブロック（３１６））、ならびに
（ｘ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること（図７Ａのブロック（３１８））、あるいは
（ｘｉ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図７Ｂのブロック（４００））、
（ｘｉｉ）工程（ｘｉ）で選択した文字またはその最長連続配列を、第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図７Ｂのブロック（４０２））、
（ｘｉｉｉ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである、工程（ｘｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること、および
第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである、工程（ｘｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、文字の列記の最も左側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図７Ｂのブロック（４０４））、
（ｘｉｖ）工程（ｘｉｉｉ）で選択した各文字および／またはその各最長連続配列を、第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図７Ｂのブロック（４０６））、
（ｘｖ）第１の文字の列記および第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列が選択されなくなるまで、工程（ｘｉｉｉ）と（ｘｉｖ）を繰り返すこと（図７Ｂのブロック（４０８）にて決定）、
（ｘｖｉ）工程（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて除外した第１の文字の列記中の文字数、および
工程（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて除外した第２の文字の列記中の文字数
を合計することで、それぞれ第２および第１の文字の列記と同じである、第１および第２の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｃを取得すること（図７Ｂのブロック（４１０））、
（ｘｖｉｉ）Ｃ_ｃ、
第１の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（ｃ）の（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて除外されなかった第１の文字の列記中の文字の総数、および
第２の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（ｃ）の（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて除外されなかった第２の文字の列記中の文字の総数
を合計することで、第１および第２の列記における文字の総数Ｃ_ｔを得ること（図７Ｂのブロック（４１２））、ならびに
（ｘｖｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること（図７Ｂのブロック（４１４））
により求めることを含む。

【0078】

前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）では、第１および第２の文字の列記において同じである文字を選択するサブ工程（ｉ）と（ｘｉ）は、前述の比較基準に従い、第１および第２の文字の列記における個々の文字を比較することを含む。さらに、第１および第２の文字の列記において同じである文字の最長連続配列を選択する前記サブ工程（ｉ）と（ｘｉ）は、前述の比較基準に従い、第１および第２の文字の列記における連続する個々の文字を比較することを含む。前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｉｖ）および（ｘｉ）～（ｘｉｖ）は、同一であることに留意されたい。

【0079】

前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）では、第１および第２の文字、またはそれらの部分と同じである文字またはその最長連続配列を選択する各工程の後、こうして選択された前記文字またはその最長連続配列を除外する工程が行われ、除外する各工程は、こうして選択された文字またはその最長連続配列を、第１および第２の文字の列記において同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程における考慮から除外することを含む。除外する各工程は、こうして除外された文字またはその最長連続配列に隣接する各文字間の点にて途切れている文字の非連続配列をもたらすことに留意されたい。そのため、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｖ）～（ｖｉｉ）において、第１および第２の文字の列記またはその部分において同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程は、以前に除外した文字またはその最長連続配列を超えて延在する配列の代わりに、先の工程にて除外した各文字またはその各最長連続配列に隣接して位置する文字の連続配列を考慮する。さらに、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｘｉｉｉ）～（ｘｖ）において、第１および第２の文字またはその部分において同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程は、除外した文字またはその最長連続配列の両側にて文字を乗り越える（ｂｒｉｄｇｅｓ）配列を考慮しない。

【0080】

第１および第２の文字リストにおいて同じである文字またはその最長連続配列を選択かつ除外する各サイクルは、第１および第２の文字の列記において同じである文字またはその最長連続配列が選択されなくなるまで、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）にて繰り返される。前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉｉ）および（ｘｉｉｉ）では、選択は、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉ）および（ｘｉｉ）にて除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字の連続配列に対して、または前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉ）および（ｘｉｉ）にて除した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字の連続配列に対して、それぞれ同時に繰り返されることが好ましい。代替的に選択は、先ず前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉ）および（ｘｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字の連続配列に対して、次いで前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉ）および（ｘｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字の連続配列に対して繰り返されてもよい。代替的に選択は、先ず前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉ）および（ｘｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字の連続配列に対して、次いで前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｉ）および（ｘｉｉ）で除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字の連続配列に対して繰り返されてもよい。

【0081】

同様に、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｖ）では、選択は、先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ左にある文字の連続配列に対して、および先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ右にある文字の連続配列に対して同時に行われることが好ましい。代替的に選択は、先ず先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ左にある文字の連続配列に対して、次いで先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ右にある文字の連続配列に対して行われてもよい代替的に選択は、先ず先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ右にある文字の連続配列に対して、次いで先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ左にある文字の連続配列に対して行われてもよい

【0082】

さらに、前記特に好ましい実施形態（すなわち、突然変異が免疫グロブリン再構成である）の工程（Ｃ）のより好ましい実施形態では、文字またはその最長連続配列を選択する各工程は、文字の最長連続配列を選択する工程であり、前記文字の最長連続配列は、最低でも２つの文字を含む。このため、第１および第２の文字リストにおいて同じである文字またはその最長連続配列を選択かつ除外する各サイクルは、第１および第２の文字の列記において同じである最低でも２つの文字を有する文字の最長連続配列が選択されなくなるまで、前記さらに特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）にて繰り返される。より好ましくは、前記文字の最長連続配列は、最低でも３つ、さらに好ましくは最低でも４つの文字を含む。

【0083】

（第１の文字の列記および第２の文字の列記において同じである文字またはその最長連続配列がすべて除外されているため）第１の文字の列記および第２の文字の列記において同じである文字またはその最長連続配列を選択することが一旦不可能となると、第１の文字の列記にて除外されかつ第２の文字の列記にて除外された文字の総数Ｃ_ｃは、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｖｉｉｉ）および／または（ｘｖｉ）により得られ、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ）および（ｘｉ）のいずれかにてそれぞれ除外された第１の文字の列記中の文字数、ならびに前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ）および（ｘｉ）のいずれかにてそれぞれ除外された第２の文字の列記中の文字数が、合計される。第１および第２の文字の列記にて除外された文字の総数Ｃ_ｃはまた、２ｘ（第１の文字の列記にて除外された文字数）、または２ｘ（第２の文字の列記にて除外された文字数）と考えられる場合がある。同様に、第１の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｔは、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉｘ）および／または（ｘｖｉｉ）により得られ、Ｃ_ｃ、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ）および（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて除外されなかった第１の文字の列記から除外された文字および／またはその最長連続配列間に位置する第１の文字の列記中の文字数、ならびに前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ）および（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて除外されなかった第２の文字の列記から除外された文字および／またはその最長連続配列間に位置する第２の文字の列記中の文字数が、合計される。

【0084】

このように、本発明の方法、システム、またはキットのほか、前記疾患が処置されている対象における疾患の処置方法に含まれる最小残存病変の有無を求める方法は、方法に対して引数として供給される特定のヌクレオチド配列を表す文字の列記を、バイオインフォマティクスの観点からランダムと考慮される場所にて断片化したヌクレオチド配列をそれぞれが表す文字の列記の組合せを伴うデータファイル内で検出することを意図したものである。したがって、組合せ中の少なくとも１つの文字の列記は、ランダムな長さを有しているため、（工程Ａにて）特定のヌクレオチド配列を表す文字の列記が少なくとも１つの文字の列記にてそれぞれ見出され得る場所は予め把握されない。このため、本発明の方法は、位置合わせと比較との組合せを含む。本発明の方法は位置合わせと比較との組合せ混合を含むため、本発明では、比較は、第１および第２の文字の列記において同じである最初の文字またはその最長連続配列、ならびに第１および第２の文字の列記において同じである最後の文字またはその最長連続配列（すなわち、第１および第２の文字の列記の極端に最も近い一致する文字またはその最長連続配列間を含む）からのみ行われ、これにより、Ｃ_ｃとＣ_ｔは、第１および第２の文字の列記において同じである最初の文字またはその最長連続配列、ならびに第１および第２の文字の列記において同じである最後の文字またはその最長連続配列の部分にわたって求められると考えられる。したがって、好ましい実施形態では、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｉ）～（ｖｉｉ）または（ｘｉ）～（ｘｖ）のいずれかにて取り除かれる文字またはその最長連続配列それぞれは、．ｄｎａファイルに入れられ、前記特に好ましい実施形態の工程（Ｃ）のサブ工程（ｖｉｉｉ）と（ｘｖｉ）は、－ｔｒｉｍオプションを使用してＣ_ｃを算出するために．ｄｎａファイル中のデータを使用することができ、そうすることで、第２の列記と同じである第１の列記中の最後の文字またはその最長連続配列間でのみ比較が行われる。

【0085】

工程（Ｃ）に続いて工程（Ｄ）が実行され、ここでは、工程（Ｂ）で得た各第２の文字の列記について、最高値のＤＳであるＤＳ_ＨＶが選択される（図６のブロック（２１０））。しかし、（本明細書中では任意でワトソン鎖として定義される）工程（Ａ）と（Ｂ）における各ヌクレオチド配列が、相補的ヌクレオチド配列（特に、本明細書中では任意でクリック鎖として定義される逆相補的配列）を有し、そのため工程（Ａ）で得た第１の文字の列記および工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記が、それぞれ対応する逆相補的な第１の文字の列記および対応する逆相補的な第２の文字の列記をさらに有するという事実により、好ましい実施形態では、前述の工程（Ａ）におけるヌクレオチド配列だけでなく相補的ヌクレオチド配列も、工程（Ｃ）と組み合わせて本発明の工程（Ａ）と（Ｂ）にかけることができる。

【0086】

図９は、以下の本発明の好ましい実施形態を例示する、対象における最小残存病変のレベルを定量する方法（５０４）のフローチャートを開示している。前記好ましい実施形態では、本発明は、対象における最小残存病変（ＭＲＤ）のレベルを定量するための方法に関連するものであり、工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、および（Ｇ）は、本発明の方法、システム、およびキットに開示されるとおりであるが（図９のブロック（６００）～（６０８）、（６２２）、（６２４）、および（２１６））、以下の工程：
（Ａ’）ＰＣＲ機器および一対のプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により、工程（Ａ）において少なくとも１つのヌクレオチド配列に対して相補的な逆相補的配列である少なくとも１つの各ヌクレオチド配列を増幅させ、超並列シーケンシングプラットフォーム上で前記少なくとも１つの逆相補的ヌクレオチド配列を配列決定して、左から右へと読み取られる少なくとも１つの逆相補的な第１の文字の列記を得る工程であって、前記一対のプライマーは、座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む、工程（図９のブロック（６１０）と（６１２））、
（Ｂ）ＰＣＲ機器、ならびに先の工程と同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により、工程（Ｂ）において少なくとも１つのヌクレオチド配列に対して相補的な逆相補的配列である少なくとも１つの各ヌクレオチド配列を増幅させ、超並列シーケンシングプラットフォーム上で前記少なくとも１つの逆相補的ヌクレオチド配列を配列決定して、左から右へと読み取られる少なくとも１つの逆相補的な第２の文字の列記を得る工程（図９のブロック（６１４）と（６１６））、ならびに
（Ｃ’）工程（Ｂ’）で得た逆相補的な第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ’）で得た逆相補的な第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程（図９のブロック（６１８））であって、工程（Ｂ’）で得た逆相補的な第２の文字の列記と工程（Ａ’）で得た逆相補的な第１の文字の列記との類似度ＤＳ_ｒｃｓは、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を用いて、
（ｉ）それぞれ逆相補的な第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、逆相補的な第２および第１の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃｒｃｓを数えること、
（ｉｉ）第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔｒｃｓを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ_ｒｃｓ＝Ｃ_ｃｒｃｓ／Ｃ_ｔｒｃｓ
に従いＤＳ_ｒｃｓを算出すること
により求められる、工程
も含まれ、工程（Ｄ）は、少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を用いて、工程（Ａ）で得た第２の文字の列記およびその対応する逆相補的な第２の文字の列記それぞれに対して、最高値のＤＳまたはＤＳ_ｒｃｓであるＤＳ_ＨＶを選択する工程（Ｄ’）（工程（図９のブロック（６２０））と置き換えられる。

【0087】

図１０Ａと１０Ｂは、前記特に好ましい実施形態の好ましい実施形態による、逆相補的類似度（ＤＳ_ｒｃｓ）を求める工程（６１８）のフローチャートを開示しており、突然変異は免疫グロブリン再構成であり、これにより、逆相補的類似度を求める前記工程の代案が例証される。ゆえに、前記特に好ましい実施形態の前記好ましい実施形態では、工程（Ｄ）は、
プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、工程（Ａ）において前記少なくとも１つのヌクレオチド配列に相補的な逆相補的配列である少なくとも１つの各ヌクレオチド配列を増幅し、前記少なくとも１つの逆相補的ヌクレオチド配列を配列決定して、左から右へと読み取られる少なくとも１つの逆相補的な第１の文字の列記を得ること、
先の工程と同じプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、工程（Ｂ）において前記少なくとも１つのヌクレオチド配列に相補的な逆相補的配列である少なくとも１つの各ヌクレオチド配列を増幅し、前記少なくとも１つの逆相補的ヌクレオチド配列を配列決定して、左から右へと読み取られる少なくとも１つの逆相補的な第２の文字の列記を得ること、および
工程（Ｂ）で得た逆相補的な第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た逆相補的な第１の文字の列記それぞれとの類似度を求めることであって、工程（Ｂ）で得た逆相補的な第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た逆相補的な第１の文字の列記との類似度ＤＳ_ｒｃｓは、
（ｘｉｘ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図１０Ａのブロック（９００））、
（ｘｘ）工程（ｘｉｘ）で選択した文字またはその最長連続配列を、逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図１０Ａのブロック（９０２））、
（ｘｘｉ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである、工程（ｘｘ）で除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること、および
逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである、工程（ｘｘ）で除外した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も左側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図１０Ａのブロック（９０４））、
（ｘｘｉｉ）工程（ｘｘｉ）で選択した各文字および／またはその各最長連続配列を、逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図１０Ａのブロック（９０６））、
（ｘｘｉｉｉ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである、先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ左側にある文字の連続配列に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること、および
逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである、先の工程で除外した各文字またはその各最長連続配列のすぐ右側にある文字の連続配列に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も左側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図１０Ａのブロック（９０８））、
（ｘｘｉｖ）工程（ｘｘｉｉｉ）で選択した各文字および／またはその各最長連続配列を、逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図１０Ａのブロック（９１０））、
（ｘｘｖ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列が選択されなくなるまで、工程（ｘｘｉｉｉ）と（ｘｘｉｖ）を繰り返すこと（図１０Ａのブロック（９１２）にて決定）、
（ｘｘｖｉ）工程（ｘｉｘ）～（ｘｘｖ）のいずれかにて除外した逆相補的な第１の文字の列記中の文字数、および
工程（ｘｉｘ）～（ｘｖｘ）のいずれかにて除外した逆相補的な第２の文字の列記中の文字数
を合計することで、それぞれ逆相補的な第２および第１の文字の列記と同じである、逆相補的な第１および第２の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｃｒｃｓを取得すること（図１０Ａのブロック（９１４）、Ｃ_ｃはＣ_ｃｒｃｓを指す）、
（ｘｘｖｉｉ）Ｃ_ｃｒｃｓ、
逆相補的な第１の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（Ｃ）の（ｘｉｘ）～（ｘｘｖ）のいずれかにて除外されなかった逆相補的な第１の文字の列記中の文字の数、および
逆相補的な第２の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（Ｃ）の（ｘｉｘ）～（ｘｘｖ）のいずれかにて除外されなかった逆相補的な第２の文字の列記中の文字の数
を合計することで、逆相補的な第１および第２の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｔｒｃｓを得ること（図１０Ａのブロック（９１６）、Ｃ_ｔ はＣ_ｔｒｃｓを指す）、ならびに
（ｘｘｖｉｉｉ）次の式
ＤＳ_ｒｃｓ＝Ｃ_ｃｒｃｓ／Ｃ_ｔｒｃｓ
に従いＤＳを算出すること（図１０Ａのブロック（９１８））
により求められる、あるいは
（ｘｘｉｘ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図１０Ｂのブロック（１０００））、
（ｘｘｘ）工程（ｘｘｉｘ）で選択した文字またはその最長連続配列を、逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図１０Ｂのブロック（１００２））、
（ｘｘｘｉ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである、工程（ｘｘｘ）で除外した文字またはその最長連続配列の左側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も右側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること、および
逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである、工程（ｘｘｘ）で除外した文字またはその最長連続配列の右側に位置する文字またはその最長連続配列を選択することであって、同じ長さの２つ以上の文字または２つ以上の最長連続配列が選択されるときに、逆相補的な文字の列記の最も左側にある文字またはその最長連続配列が選択される、選択すること（図１０Ｂのブロック（１００４））、
（ｘｘｘｉｉ）工程（ｘｘｘｉ）で選択した各文字および／またはその各最長連続配列を、逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列を選択する後の工程から除外すること（図１０Ｂのブロック（１００６））、
（ｘｘｘｉｉｉ）逆相補的な第１の文字の列記および逆相補的な第２の文字の列記にて同じである文字またはその最長連続配列が選択されなくなるまで、工程（ｘｘｘｉ）と（ｘｘｘｉｉ）を繰り返すこと（図１０Ｂのブロック（１００８）にて決定）、
（ｘｘｖｉ）工程（ｘｉｘ）～（ｘｘｖ）のいずれかにて除外した逆相補的な第１の文字の列記中の文字数、および
工程（ｘｉｘ）～（ｘｖｘ）のいずれかにて除外した逆相補的な第２の文字の列記中の文字数
を合計することで、それぞれ逆相補的な第２および第１の文字の列記と同じである、逆相補的な第１および第２の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｒｃｓを取得すること（図１０Ｂのブロック（１０１０）、Ｃ_ｃはＣ_ｃｒｃｓを指す）、
（ｘｘｖｉｉ）Ｃ_ｃｒｃｓ、
逆相補的な第１の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（Ｃ）の（ｘｉｘ）～（ｘｘｖ）のいずれかにて除外されなかった逆相補的な第１の文字の列記中の文字の数、および
逆相補的な第２の文字の列記から除外した文字および／またはその最長連続配列間に位置するとともに、工程（Ｃ）の（ｘｉｘ）～（ｘｘｖ）のいずれかにて除外されなかった逆相補的な第２の文字の列記中の文字の数
を合計することで、逆相補的な第１および第２の文字の列記中の文字の総数Ｃ_ｔｒｃｓを得ること（図１０Ｂのブロック（１０１２）、Ｃ_ｔはＣ_ｔｒｃｓを指す）、ならびに
（ｘｘｖｉｉｉ）次の式
ＤＳ_ｒｃｓ＝Ｃ_ｃｒｃｓ／Ｃ_ｔｒｃｓ
に従いＤＳ_ｒｃｓを算出することであって（図１０Ｂのブロック（１０１４））、
サブ工程（ｉ）～（ｘ）を用いて、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれに対してＤＳを求めるとき、サブ工程（ｘｉｘ）～（ｘｘｖｉｉｉ）を用いて対応する逆相補的な第１の文字の列記それぞれに対してＤＳ_ｒｃｓが求められ、および、工程（ｉ）～（ｘ）を用いて、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれに対してＤＳを求めるとき、サブ工程（ｘｘｉｘ）～（ｘｘｘｖｉ）を用いて対応する逆相補的な第１の文字の列記それぞれに対してＤＳ_ｒｃｓが求められる、算出すること、および
工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記およびその対応する逆相補的な第２の文字の列記に対して、最高値のＤＳまたはＤＳ_ｒｃｓであるＤＳ_ＨＶを選択すること（図１０Ｂのブロック（１０１４）から続くが、図中には示されない）
により求められる、求めること
を含む。

【0088】

ゆえに、０．０のＤＳまたはＤＳ_ｒｃｓは、第１の文字の列記中の文字が第２の文字の列記中の文字と同じではないことを意味し、１．０のＤＳまたはＤＳ_ｒｃｓは、第１の文字の列記中の文字がすべて第２の文字の列記中の文字と同じであることを意味する（すなわち、前記疾患を処置した後の対象からの生物学的試料のヌクレオチド配列は、前記疾患を処置する前の対象から得た生物学的試料の塩基配列と厳密に等しい）。このため、本発明の方法は、対象から得た生物学的試料中のどのくらいのヌクレオチド配列が、その元の（ワトソン）形態またはその逆補体（クリック）版のいずれかで引数配列（ａｒｇｕｍｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（前記疾患を抱える対象から得た生物学的試料のヌクレオチド配列）を包含するのかに関する情報を提供する。

【0089】

工程（Ｂ）で得た少なくとも１つの第２の文字の列記に対してＤＳ_ＨＶを求めると、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記のうち閾値Ｔを超えるＤＳ_ＨＶを有するものの数は、続いて工程（Ｅ）にて合計され、これにより、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃが得られる（図６のブロック（２１２））。同様に、工程（Ｆ）では、Ｌ_ｃ、およびＴを超えるＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数が合計され、Ｌ_ｔが得られる（図６のブロック（２１４））。Ｌ_ｔは、第２の文字の列記の総数に対応する。好ましくは、前記閾値Ｔは、前記ＤＳおよびＤＳ_ｒｃｓに対して０．９９、より好ましくは０．９９９、さらに好ましくは０．９９９９、最も好ましくは０．９９９９９に設定される。工程（Ｅ）と（Ｆ）は同時に行われてもよく、または工程（Ｅ）は、工程（Ｆ）の前または後に行われてもよく、好ましくは工程（Ｆ）は工程（Ｅ）の後に行われる。

【0090】

続いて、ＭＲＤのレベルを算出するために工程（Ｇ）が実行される（図６のブロック（２１６））。ＭＲＤレベルの算出は、以下の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い実行される。式中、Ｌ_ｃ、Ｄ、ｋ、およびＬ_ｔは、先に定義したとおりであり、かつ以下に定義されるとおりである。
Ｌ_ｃ＝第２の文字の列記と同じである第１の文字の列記の総数。
Ｄ＝疾患の処置後の対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの量Ｄ（ｎｇ）（そこから、少なくとも１つの第１の文字の列記が、シーケンシングにより得られる）。
ｋ＝疾患の処置後に対象から得た生物学的試料の二倍体細胞ごとのゲノムＤＮＡの平均重量ｋ（ｎｇ／細胞）。
Ｌ_ｔ＝第１の文字の列記の総数。
ｇ＝細胞ごとの遺伝子コピー数（二倍体細胞ではｇ＝２）。

【0091】

工程（Ｈ）は、
（ｉ）遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦ（ｍｉｎＶＲＦは初期細胞等価物を表す）であって、該遺伝子マーカーは、工程（Ａ）と（Ｂ）にて、工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーにより増幅されるヌクレオチド配列の突然変異形態である、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、
（ｉｖ）平均位置ノイズａｖＰｏｓ
を求めることを含む。これらの値は、それぞれ同時または段階的に求めることができ、これに加えて、工程（Ｇ）は工程（Ｈ）の前または後に実行されてもよく、好ましくは工程（Ｈ）は工程（Ｇ）の後に実行される。

【0092】

具体的には、工程（Ｈ）は、
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄはｎｇ／μＬの単位にあり、ｋはｎｇの単位にある、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）傾きの違いを用いた方法による、前記遺伝マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであって、該方法は、
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２、
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１より少なくとも３０％低いとき（すなわち、Ｓ２とＳ１との差がＳ１の値の３０％以上）、第３の組成物の濃度がＤ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低いとき（すなわち、Ｓ２とＳ１との差がＳ１の値の０～３０％未満）、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの前記溶液の代わりに前記第１の組成物を使用して繰り返される、比較すること
を含む、検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９、より好ましくは少なくとも９９である、繰り返すこと、および
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ａｖＭｕｔである、算出すること
による、平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ（増幅およびシーケンシング工程の平均エラー率を表す）、
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求めることを含む。

【0093】

工程（Ｈ）（ｉ）～（ｈ）（ｉｖ）では、遺伝子マーカーは、工程（ａ）と工程（Ｂ）にて、工程（ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーにより増幅されるヌクレオチド配列の突然変異形態である。したがって、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）、および（ｈ）にて求められるＭＲＤのレベルは、
（Ａ１）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの前記溶液中に含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（Ｂ１）工程（Ａ１）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、それぞれ第１、第２、第３、および第４の組成物に含まれるＤＮＡの量Ｄ１に含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（Ｃ１）各組成物に対して工程（Ｃ）～（Ｇ）を実行することにより、第１、第２、第３、および第４の組成物それぞれにおけるＭＲＤレベルを求めることであって、工程（Ｂ１）で得た各文字の列記は、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれと置き換えられ、所与の組成物に対して工程（Ａ１）で得た各文字の列記は、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれと置き換えられ、Ｄ１はＤと置き換えられ、ｋは定数（６．４９ｘ１０^－３ｎｇ）であり、工程（ｇ）で使用される式は、工程（Ａ）と（Ｂ）で得た文字の列記を用いたＭＲＤレベルの算出に用いられる式と同じである、求めること
によって求めることができる。第１、第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度は、前記遺伝子マーカーを含まないため希釈物と同等であるゲノムＤＮＡの溶液の単位体積当たりの、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の体積で測定され、これにより例えば、前記第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇｃ１は、前記第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの希釈物の平均対数と同じであることに留意されたい。

【0094】

遺伝子マーカーのｍｉｎＶＲＦの判定に続き、前記遺伝子マーカーのＤ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓを工程（Ｈ）、実験感度ＥＳを工程（Ｉ）で求める。実験感度ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である。

【0095】

最後に、工程（Ｊ）は、工程（Ｇ）でＭＲＤレベル、工程（Ｈ）で遺伝子マーカーのｍｉｎＶＲＦ、前記遺伝子マーカーのＤ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓ、ならびに工程（Ｉ）でＥＳのレベルを求めて、最小残存病変の有無が求められる工程である。工程（Ｊ）は、以下のように
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値と比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
の、３つの工程（Ｊ）（ｉ）、（Ｊ）（ｉｉ）、または（ｊ）（ｉｉｉ）のいずれかにより、前記対象における最小残存病変の有無を求めることを含む。

【0096】

しかし、本発明の処置方法では、工程（Ｊ）はさらに、前記対象に最小残存病変が存在すると求められたとき、工程（１）と工程（２）を繰り返すことを含み、工程（１）の各繰返しは、以前に前記対象に施したものと同じ治療、または以前に前記対象に施したものと異なる治療を施すことを含む。

【0097】

前述の方法、システム、キット、および処置方法の一実施形態では、前記疾患の処置前に前記対象から得た組織試料の前記ゲノムＤＮＡ中の遺伝子マーカーの変異読取り頻度ＶＲＦは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるときに少なくとも５％、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるときに少なくとも２％
である。

【0098】

本発明の別の実施形態では、最小残存病変（ＭＲＤ）の有無が求められている前記対象における前記疾患を示す遺伝子マーカーは、
（Ｐ）前記疾患を抱える前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる少なくとも１つの突然変異を特定し、このように特定した各突然変異の変異読取り頻度ＶＲＦを求める工程と、
（Ｑ）１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、１０％を超えるＶＲＦを有する工程（Ｐ）で特定された突然変異を選択する工程であって、１０％を超えるＶＲＦを有する突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、
（ｂ）工程（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有するインデル突然変異、または
（ｃ）工程（Ｐ）で特定した体細胞遺伝子再構成突然変異またはインデル突然変異が１０％超のＶＲＦを有していない場合、最高ＶＲＦを有する一塩基変異型突然変異である、工程と、
（Ｒ）前記対象中の遺伝子のヌクレオチド配列のうち工程（Ｑ）で選択した前記突然変異を含むものをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定する工程と
により選択される。前記工程（Ｑ）で選択された前記突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は、前記遺伝子マーカーであり、より好ましくは、前記疾患を示す遺伝子マーカーは、前記疾患が特徴づけられる前述の遺伝子パネルの遺伝子のうち１つに存在するヌクレオチド配列において特定される。

【0099】

好ましくは、１０％を超える変異読取り頻度ＶＲＦを有する遺伝子マーカーは、前記疾患の処置の前に前記対象から得た組織試料の前記ゲノムＤＮＡにおいて特定可能である。しかし、これがそうではない事象では、１０％を超える変異読取り頻度ＶＲＦを有する遺伝子マーカーが、前記疾患の処置の前に前記対象から得た組織試料の前記ゲノムＤＮＡにおいて特定されない場合、複数の遺伝子マーカーが、本発明の方法、システム、およびキットに使用するために必要となる。このため、本発明の好ましい実施形態では、前述の本発明の実施形態の工程（Ｐ）において特定される突然変異が１０％を超えるＶＲＦを有していない場合、遺伝子マーカーは、さらにｎ－１遺伝子マーカーとともに、以下の工程により選択され、
工程（Ｑ）は、
（ｉ）２％～１０％のＶＲＦを有する突然変異を特定することにより、２％～１０％のＶＲＦを有する工程（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異であって、該突然変異は、
（ａ）最高のＶＲＦを有する体細胞遺伝子再構成突然変異、または
（ｂ）工程（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有していない場合、最高のＶＲＦを有するインデル突然変異
を選択することを含む工程（Ｑ’）に置き換えられ、または
工程（Ｐ）で特定したｎ個未満の体細胞遺伝子再構成突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有し、工程（Ｐ）で特定したｎ個未満のインデル突然変異が２％～１０％のＶＲＦを有する場合、工程（Ｑ’）は、
（ｉｉ）５％～１０％のＶＲＦを有する突然変異のうち一塩基変異型突然変異であるものを特定することにより、５％～１０％のＶＲＦを有する工程（Ｐ）で特定したｎ個の突然変異
を選択することを含み、および
工程（Ｒ）は、
（ｉ）工程（Ｑ’）で選択されたｎ個の突然変異のうち１つを選択し、選択した突然変異を含む前記対象における遺伝子のヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅する座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを特定することであって、前記選択した突然変異を含む前記ヌクレオチド配列は遺伝子マーカーである、特定すること、および
（ｉｉ）工程（Ｒ’）（ｉ）をｎ－１回繰り返すことであって、１回あたり、以前に工程（Ｒ’）（ｉ）で選択されていない工程（Ｑ’）で選択された残りのｎ－１個の突然変異のうち１つに対して行われる、繰り返すこと
を含む工程（Ｒ’）に置き換えられ、
前記方法はさらに、工程（Ａ）～（Ｉ）をさらにｎ－１回繰り返す工程であって、１回あたり、工程（Ｒ’）で特定した異なるプライマー対を使用する、工程と、工程（Ｊ）を、工程（Ｊ’）：
（ｉ）最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと実験感度の平均値ａｖＥＳとを比較する工程であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、工程、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、（Ｇ）で算出された最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較する工程であって、
（ａ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＭｕｔの平均値ａｖａｖＭｕｔとを比較する工程であって、
（ｂ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＭｕｔ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、ａｖＰｏｓの平均値ａｖａｖＰｏｓとを比較する工程であって、
（ｃ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖａｖＰｏｓ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較する工程であって、
（ｄ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値、ａｖａｖＭｕｔ値、ａｖａｖＰｏｓ値、およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、工程、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、最小残存病変のレベルの平均値ａｖＭＲＤと、ｍｉｎＶＲＦの平均値ａｖｍｉｎＶＲＦとを比較する工程であって、
（ｆ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、工程、および
前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、最小残存病変レベルの平均値ａｖＭＲＤと、Ｄ－ｌｉｍｉｔの平均値ａｖＤ－ｌｉｍｉｔとを比較する工程であって、
（ｇ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ａｖＭＲＤ値が前記ａｖｍｉｎＶＲＦ値およびａｖＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、工程
と置き換える工程とを含み、ここで、ｎは、２～５から選択される自然数であり、より好ましくは、ｎは、２または３から選択される自然数である。ＶＲＦ値の比較により、マーカーとしての任意の所与の突然変異の有効性を、該マーカーが一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、または免疫グロブリン再構成突然変異であるかどうかとは独立して評価することが可能になる。このため、本発明はさらに、疾患が処置されている対象における最小残存病変の評価に適した遺伝子マーカーの有無を求めるための方法を含む。特に、本発明の工程（Ｐ）、（Ｑ）、（Ｑ’）、（Ｒ）、および（Ｒ’）自体は、好ましくは本明細書に記載の方法、キット、システム、および処置方法に使用するために、前記遺伝子マーカーを選択するための方法を含む。

【0100】

前述のように、本発明はまた、疾患がすでに処置されている対象を処置するための方法に関連するものであり、該方法は、前記対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求めるための前述の方法、システム、またはキットを使用した後に前記対象に治療を施す工程を含む。

【0101】

特に、本記述の処置方法では、前記対象にＭＲＤの存在が求められたとき（図１１Ａと１１Ｂのブロック（１０６）にて決定）、前記対象にＭＲＤの不在が求められるまで、前記対象に処置を施す工程が繰り返され、その後、前記対象におけるＭＲＤの有無が求められる（図１１Ａと１１Ｂのブロック（１０８））。要するに、本記述の処置方法は、対象の疾患を処置する工程と、前記処置の後に前記対象におけるＭＲＤの有無を求める工程とを含み、前記疾患が前記処置後に前記対象に残っている場合、前記対象の疾患を処置する工程、および続いて前記処置の後に前記対象におけるＭＲＤの有無を求める工程は、前記対象に疾患がこれ以上残らなくなるまで繰り返される。本記述の処置方法では、対象の疾患を処置する工程の各繰返しは、以前に前記対象に施したものと同じ治療、または以前に前記対象に施したものと異なる治療を施すことを含む。好ましくは、以前に前記対象に施したものと異なる治療は、その後の対象の疾患を処置する工程の繰返しすべてにおいて施される。

【0102】

本記述の処置方法では、対象の疾患を処置する工程、およびその後の前記処置後に前記対象におけるＭＲＤの有無を求める工程は、前記対象にＭＲＤが存在しないと求められるまで繰り返される。しかし、対象の疾患を処置する工程、およびその後の前記処置後に前記対象におけるＭＲＤの有無を求める工程は、処置の各サイクルの終わりに前記対象にＭＲＤが存在しないと求められる場合、好ましくは最大４サイクルの処置、より好ましくは最大３サイクルの処置、さらに好ましくは最大２サイクルの処置にわたり繰り返される。

【0103】

前記処置方法は、前記対象に治療を施す工程を含み、前記治療は、好ましくは化学療法である。より好ましくは、前記化学療法は、
プロテアソーム阻害剤および免疫調節剤、または
任意選択でシタラビンの投与後にシタラビンおよびアントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオン
の投与を含む。

【0104】

さらに好ましくは、前記化学療法は、
ボルテゾミブおよびプレドニゾン（ＶＭＰ）、または
任意選択でシタラビンの投与後にシタラビンおよびアントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオン
の投与を含む。

【0105】

さらにより好ましい実施形態では、多発性骨髄腫またはリンパ腫の場合、前記化学療法は、
各サイクルがボルテゾミブおよびプレドニゾン（ＶＭＰ）の投与を含む、９～１８サイクルの処置
からなり、または骨髄性癌、好ましくは急性骨髄性白血病の場合、前記化学療法は、
各サイクルが、７日間にわたるシタラビンの投与、および３日間にわたるアントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオンの投与を含む１または２サイクルの処置（導入後処置）、あるいは
各サイクルが、７日間にわたるシタラビンの投与、および３日間にわたるアントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオンの投与を含む１または２サイクルの処置（導入後処置）、続いて任意選択で、各サイクルがシタラビンの投与を含む１または２サイクルの処置（導入後処置）
からなる。

【0106】

本発明のさらに好ましい実施形態では、前記化学療法は、前記疾患が多発性骨髄腫であるとき、各サイクルがボルテゾミブおよびプレドニゾン（ＶＭＰ）の投与を含む９～１８サイクルの処置からなる。本発明の別の好ましい実施形態では、前記化学療法は、前記疾患が急性骨髄性白血病または任意の骨髄性新生物であるとき、各サイクルが、７日間にわたるシタラビンの投与、および続いて３日間にわたるアントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオンの投与を含む１または２サイクルの処置（サイクル間で３０～３５日）（導入後処置）からなる。本発明のまた別の好ましい実施形態では、前記化学療法は、前記疾患が急性骨髄性白血病または任意の骨髄性新生物であるとき、各サイクルが、７日間にわたるシタラビンの投与、および続いて３日間にわたるアントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオンの投与を含む１または２サイクルの処置（サイクル間で３０～３５日）、続いて各サイクルがシタラビンの投与を含む１または２サイクルの処置（硬化後（ｐｏｓｔ－ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）処置）からなる。本発明の処置方法の一実施形態では、アントラサイクリン系抗生物質またはアントラセンジオンは、イダルビシンである。

【0107】

本発明では、ＭＲＤレベルは、（図５Ａと５Ｂのブロック（１０４）において総じて例証される）７つの工程（Ａ）～（Ｇ）を含む方法により前記疾患が処置されている対象において定量され、図６のブロック（２００）と（２０２）の工程（Ａ）、ブロック（２０４）と（２０６）の工程（Ｂ）、ブロック（２０８）の工程（Ｃ）、ブロック（２１０）の工程（Ｄ）、ブロック（２１２）の工程（Ｅ）、ブロック（２１４）の工程（Ｆ）、およびブロック（２１６）の工程（Ｇ）を含む方法（１０４）に対してさらに例証される。これらの７工程は、好ましくは、対象集団から得たデータを含む外部データベースにアクセスすることなく実行される。前記工程は、生物学的技法および少なくとも１つのコンピュータプログラム製品を使用して実行される。

【0108】

さらに、遺伝子マーカーのｍｉｎＶＲＦ、前記遺伝子マーカーのＤ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓは、（図５Ａと５Ｂのブロック（１０５）において総じて例証される）追加の工程（Ｈ）において求められ、図８Ａのブロック（３００）と（３０２）の工程（Ｈ）（ｉ）、ブロック（３０４）と（３０６）の工程（Ｈ）（ｉｉ）、ブロック（３０８）の工程（Ｈ）（ｉｉｉ）、およびブロック（３１６）の工程（Ｈ）（ｉｖ）を含む方法（３０４）に対してさらに例証される。一方、ＥＳは、（図５Ｂのブロック（１０５）において総じて例証される）別の工程（Ｉ）において求められ、図８Ｂのブロック（４１６）における方法（４０４）に対してさらに例証される。

【0109】

本発明の特に好ましい実施形態は、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法に関し、前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される増殖性疾患であり、前記方法は、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、工程（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程であって、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる、工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得する工程と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、工程と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、ならびに第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９である、繰り返すこと、および
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、算出すること
による、平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、ならびに
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求める工程と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求める工程であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、工程と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求める工程と
を含み、ここで、前記増殖性疾患は、
（ｉ）ＫＲＡＳ、ＮＰＭ１、およびＮＲＡＳからなる群、より好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ（ＮＰＭ１ ｉｎｓ）、およびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異または一塩基変異型突然変異を特徴とする急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または
（ｉｉ）ＩＧＨおよびＩＧＫからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における体細胞遺伝子再構成突然変異、または
ＮＲＡＳからなる群、より好ましくはＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異または一塩基変異型突然変異
を特徴とする多発性骨髄腫（ＭＭ）
を含む。

【0110】

本発明の別の特に好ましい実施形態は、疾患が処置された対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める方法に関し、前記疾患は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）または肺癌（腺癌）から選択される増殖性疾患であり、前記方法は、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、工程（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異を含む遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程であって、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出することにより求められる、工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得する工程と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、工程と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）以下
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９である、繰り返すこと、
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、算出すること、
による、平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、
（ｉｖ）前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求める工程と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求める工程であって、ＥＳは、工程（Ｈ）で算出されるように、ｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ＡｖＭｕｔ、およびＡｖＰｏｓのうち大きい方である、工程と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求める工程と
を含み、ここで、前記増殖性疾患は、
（ｉ）ＥＺＨ２、ＫＭＴ２Ｄ、およびＫＲＡＳからなる群、またさらに好ましくはＥＺＨ２ Ｙ６４６Ｓ、ＫＭＴ２Ｄ Ｑ２０１４ｆｓ、およびＫＲＡＳ Ｇ１２Ａからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中の一塩基変異型突然変異を特徴とする濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、または
（ｉｉ）ＴＳＣ２およびＷＡＳからなる群、さらにより好ましくはＴＳＣ２Ｌ２４８ＶおよびＷＡＳ Ｔ４５Ｍからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列中の一塩基変異型突然変異を特徴とする肺癌（腺癌）
である。

【0111】

本発明の別の特に好ましい実施形態は、疾患が処置された対象における疾患を処置する方法に関し、前記疾患は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される増殖性疾患であり、前記方法は、
（１）対象に治療を施す工程であって、該治療は、化学療法、免疫療法、または放射線療法、あるいはこれらの組合せから選択される、工程と、
（２）対象における最小残存病変（ＭＲＤ）の有無を求める工程と
を含み、前記方法はさらに、
（Ａ）座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを含む一対のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置前に前記対象から得た生物学的試料からのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第１の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患の処置後に前記対象から得た生物学的試料からの一定量ＤのゲノムＤＮＡに含まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させる工程であって、前記ゲノムＤＮＡは、前記生物学的試料の二倍体細胞あたりの平均重量ｋを有している、工程、および
増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定する工程であって、これにより、左から右へと読み取られる第２の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られ、工程（Ａ）および（Ｂ）で増幅された各ヌクレオチド配列は、４００ヌクレオチドよりも短く、遺伝子の突然変異ヌクレオチド配列または非突然変異ヌクレオチド配列のいずれかであり、ヌクレオチド配列は、突然変異すると、一塩基変異型突然変異、インデル突然変異、および体細胞遺伝子再構成突然変異の群から選択される突然変異を含む遺伝子マーカーである、工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、工程（Ａ）で得た第１の文字の列記それぞれとの類似度を求める工程であって、工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記と工程（Ａ）で得た第１の文字の列記との類似度ＤＳは、
（ｉ）それぞれ第１および第２の文字の列記におけるものと同じである、第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｃを数えること、
（ｉｉ）前記第１および第２の文字の列記における文字の総数Ｃ_ｔを数えること、および
（ｉｉｉ）次の式
ＤＳ＝Ｃ_ｃ／Ｃ_ｔ
に従いＤＳを算出すること
により求められる、工程と、
（Ｄ）工程（Ｂ）で得た第２の文字の列記それぞれについて、最高値のＤＳ、すなわちＤＳ_ＨＶを選択する工程と、
（Ｅ）閾値Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有する第２の文字の列記の数を合計することで、第１の文字の列記と同じである第２の文字の列記の総数Ｌ_ｃを取得する工程と、
（Ｆ）以下
（ｉ）Ｌ_ｃおよび
（ｉｉ）Ｔより大きなＤＳ_ＨＶを有していない第２の文字の列記の数
を合計することで、第２の文字の列記の総数Ｌ_ｔを取得する工程と、
（Ｇ）次の式
ＭＲＤ＝（Ｌ_ｃｘｋ）／（Ｌ_ｔｘＤ）、
ＭＲＤ＝Ｌ_ｃ／Ｌ_ｔ、または
ＭＲＤ＝ｇｘＬ_ｃｘ（Ｄ／ｋ）／Ｌ_ｔ ^２
のいずれかに従い、最小残存病変ＭＲＤの値を算出する工程であって、式中、ｇは、細胞ごとの遺伝子コピー数であり、Ｄは、ｎｇの単位であり、ｋは、ｎｇ／細胞の単位である、工程と、
（Ｈ）以下
（ｉ）前記遺伝子マーカーの最小変異読取り頻度ｍｉｎＶＲＦであって、ｍｉｎＶＲＦは、次の式
ｍｉｎＶＲＦ＝ｋ／Ｄ
に従い算出され、式中、Ｄとｋは上記で定義したとおりである、ｍｉｎＶＲＦ、
（ｉｉ）以下
（ａ）前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第１の組成物を取得すること、
（ｂ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｃ）前記第１の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第２の組成物を取得すること、
（ｄ）前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｅ）前記第２の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第３の組成物を取得すること、
（ｆ）前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｇ）前記第３の組成物の１部分を、前記遺伝子マーカーを含まないゲノムＤＮＡの溶液の１０部分で希釈することにより第４の組成物を取得すること、
（ｈ）前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値を求めること、
（ｉ）第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ１、および第１、第２、および第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ１、ならびに
第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の平均対数ａｖｌｏｇＭＲＤ２、および第２、第３、および第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の平均対数ａｖｌｏｇＣ２
を算出すること、
（ｊ）前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ａ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｂ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ１との差Ｄ１Ｃ、
前記第１の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｄ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｅ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ１との差Ｄ１Ｆ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ａ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｂ、
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーのＭＲＤ値の対数と前記ａｖｌｏｇＭＲＤ２との差Ｄ２Ｃ、
前記第２の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｄ、
前記第３の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｅ、および
前記第４の組成物中の前記遺伝子マーカーの濃度の対数と前記ａｖｌｏｇＣ２との差Ｄ２Ｆ
を算出すること、
（ｋ）Ｄ１ＡとＤ１Ｄとの乗算によりＲ１、
Ｄ１ＢとＤ１Ｅとの乗算によりＲ２、
Ｄ１ＣとＤ１Ｆとの乗算によりＲ３、
Ｄ１ＡとＤ１Ａとの乗算によりＲ４、
Ｄ１ＢとＤ１Ｂとの乗算によりＲ５、
Ｄ１ＣとＤ１Ｃとの乗算によりＲ６、
Ｄ２ＡとＤ２Ｄとの乗算によりＲ７、
Ｄ２ＢとＤ２Ｅとの乗算によりＲ８、
Ｄ２ＣとＤ２Ｆとの乗算によりＲ９、
Ｄ２ＡとＤ２Ａとの乗算によりＲ１０、
Ｄ２ＢとＤ２Ｂとの乗算によりＲ１１、
Ｄ２ＣとＤ２Ｃとの乗算によりＲ１２、
を算出すること、
（ｌ）次の式
Ｓ１＝（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ４＋Ｒ５＋Ｒ６）
を使用してＳ１、
次の式
Ｓ２＝（Ｒ７＋Ｒ８＋Ｒ９）／（Ｒ１０＋Ｒ１１＋Ｒ１２）
を使用してＳ２
を算出すること、
（ｍ）Ｓ１とＳ２を比較することであって、これにより、
Ｓ２がＳ１よりも少なくとも３０％低い場合、第３の組成物の濃度は検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔであり、
Ｓ２がＳ１に等しい、またはＳ１より３０％低い場合、工程（Ｈ）（ｉｉ）（ａ）～（Ｈ）（ｉｉ）（ｌ）は、前記遺伝子マーカーを含むゲノムＤＮＡの溶液の代わりに前記第１の組成物を用いて繰り返される、比較すること
による、前記遺伝子マーカーの検出限界Ｄ－ｌｉｍｉｔ、
（ｉｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、
（ａ）工程（Ａ）におけるものと同じ座位特異的フォワードプライマーおよび座位特異的リバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により、前記疾患がなく前記遺伝子マーカーのない対象から得た生物学的試料のゲノムＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド配列を増幅させること、
（ｂ）増幅された各ヌクレオチド配列を配列決定することであって、これにより、左から右へと読み取られる第３の文字の列記が、このように配列決定された各ヌクレオチド配列から得られる、配列決定すること、
（ｃ）前記疾患がなく前記遺伝子マーカーがないｍ人の対象において工程（Ｈ）（ｉｉｉ）（ａ）および（Ｈ）（ｉｉｉ）（ｂ）を繰り返すことであって、ｍは少なくとも９である、繰り返すこと、
（ｄ）前記遺伝子マーカーの配列決定から得たものと同一である第３の文字の列記の平均画分を算出することであって、平均画分は平均突然変異ノイズａｖＭｕｔである、算出すること
による、平均突然変異ノイズａｖＭｕｔ、
（ｉｖ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列と同一の各ヌクレオチドに関する変異読取り頻度ＶＲＦを算出することによる平均位置ノイズａｖＰｏｓであって、前記遺伝子マーカー中の前記一塩基変異型突然変異を担うヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なり、前記ＶＲＦ値の平均はａｖＰｏｓである、平均位置ノイズ
を求める工程と、
（Ｉ）実験感度ＥＳを求める工程であって、ＥＳは、
（ｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦ、Ｄ－ｌｉｍｉｔ、ａｖＭｕｔ、およびａｖＰｏｓのうち大きい方、または
（ｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｈ）で算出されるようなｍｉｎＶＲＦおよびＤ－ｌｉｍｉｔのうち大きい方
である、工程と、
（Ｊ）前記対象における最小残存病変の有無を、
（ｉ）工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤレベルの値を、工程（Ｉ）で求めた実験感度ＥＳの値と比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＥＳ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉ）前記突然変異が一塩基変異型突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ａ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ＭｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＭｕｔの値とを比較することであって、
（ｂ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＭｕｔ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したａｖＰｏｓの値とを比較することであって、
（ｃ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ａｖＰｏｓ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｄ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｅ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値、ａｖＭｕｔ値、ａｖＰｏｓ値、およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること、または
（ｉｉｉ）前記突然変異がインデル突然変異または体細胞遺伝子再構成突然変異であるとき、工程（Ｇ）で算出された最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｉ）で算出したｍｉｎＶＲＦの値とを比較することであって、
（ｆ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在する、比較すること、および
前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値未満であるとき、工程（Ｇ）で算出した最小残存病変ＭＲＤのレベルの値と、工程（Ｈ）で算出したＤ－ｌｉｍｉｔの値とを比較することであって、
（ｇ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記Ｄ－ｌｉｍｉｔ値以上であるとき、前記対象には最小残存病変が存在し、および
（ｈ）前記ＭＲＤ値のレベルが前記ｍｉｎＶＲＦ値およびＤ－ｌｉｍｉｔ値未満であるとき、前記対象に最小残存病変は存在しない、比較すること
のいずれかにより求める工程と
を含む。最小残存病変が前記対象に存在すると求められたとき、工程（１）および（２）が繰り返され、工程（１）の各繰返しは、以前に前記対象に施したものと同じ治療、または以前に前記対象に施したものとは異なる治療を施すことを含み、
ここで、前記増殖性疾患は、
（ｉ）ＫＲＡＳ、ＮＰＭ１、およびＮＲＡＳからなる群、さらにより好ましくはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ（ＮＰＭ１ ｉｎｓ）、およびＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異または一塩基変異型突然変異を特徴とする急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であって、前記治療は、７日間にわたる少なくとも１サイクルのシタラビン投与とその後３日間にわたるイダルビシン投与、続いて処置がさらに１回必要とされる場合にシタラビンの投与を含む化学療法である、急性骨髄性白血病、あるいは
（ｉｉ）ＩＧＨおよびＩＧＫからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列における体細胞遺伝子再構成突然変異、または
ＮＲＡＳからなる群、より好ましくはＮＲＡＳ Ｑ６１Ｈからなる群から選択される遺伝子のヌクレオチド配列におけるインデル突然変異または一塩基変異型突然変異
を特徴とする多発性骨髄腫（ＭＭ）
であり、前記治療は、プロテアソーム阻害剤および免疫調節剤、好ましくはボルテゾミブおよびプレドニゾンの、少なくとも１サイクルの投与を含む化学療法である。

【0112】

コンピュータプログラム製品は、プロセッサに本発明の態様を実行させるためのコンピュータ可読プログラム命令を有するコンピュータ可読記憶媒体（または複数の媒体）を備えていてもよい。

【0113】

コンピュータ可読記憶媒体は、命令実行デバイスにより使用される命令を保持および記憶することができる有形デバイスであってもよい。コンピュータ可読記憶媒体として、電子記憶デバイス、磁気記憶デバイス、光記憶デバイス、電磁記憶デバイス、半導体記憶デバイス、または前述の任意の適切な組合せを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。コンピュータ可読記憶媒体のより具体的な例を非網羅的に列挙すると、携帯型コンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、静的ランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、携帯用コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、メモリスティック、フロッピーディスク、その上に命令が記憶された溝におけるパンチカードや隆起構造物などの機械的に符号化されたデバイス、および前述の任意の適切な組合せが挙げられる。

【0114】

本明細書に記載のコンピュータ可読プログラム命令は、コンピュータ可読記憶媒体から各コンピューティングデバイス／処理デバイスへと、あるいはネットワーク、例えば、インターネット、ローカルエリアネットワーク、広域ネットワーク、および／または無線ネットワークを介して外部コンピュータまたは外部記憶デバイスへとダウンロード可能である。ネットワークは、銅伝送ケーブル、光伝送ファイバ、無線伝送、ルータ、ファイアウォール、スイッチ、ゲートウェイコンピュータ、および／またはエッジサーバを含む場合がある。各コンピューティングデバイス／処理デバイス中のネットワークアダプタカードまたはネットワークインターフェースは、ネットワークからコンピュータ可読プログラム命令を受信し、記憶のためにコンピュータ可読プログラム命令を各コンピューティングデバイス／処理デバイス内のコンピュータ可読記憶媒体に送る。

【0115】

本発明の操作を実行するためのコンピュータ可読プログラム命令は、アセンブラ命令、命令セットアーキテクチャ（ＩＳＡ）命令、機械命令、機械依存命令、マイクロコード、ファームウェア命令、状態設定データ、あるいはＳｍａｌｌｔａｌｋやＣ＋＋などのオブジェクト指向プログラミング言語、および「Ｃ」プログラミング言語や同様のプログラミング言語などの従来の手続き型プログラミング言語を含む１つ以上のプログラミング言語の任意の組合せで書かれたソースコードまたはオブジェクトコードのいずれかであってもよい。コンピュータ可読プログラム命令は、全体的にユーザーのコンピュータ上で、部分的にユーザーのコンピュータ上で、独立型ソフトウェアパッケージとして、部分的にユーザーのコンピュータ上で、部分的にリモートコンピュータ上で、または全体的にリモートコンピュータまたはサーバ上で実行可能である。後者のシナリオでは、リモートコンピュータは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）を含む任意のタイプのネットワークを介してユーザーのコンピュータに接続することができ、または接続は、（例えば、インターネット・サービス・プロバイダを使用するインターネットを介して）外部コンピュータに対して実行することができる。いくつかの実施形態では、例えば、プログラム可能な論理回路、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、またはプログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）を含む電子回路は、本発明の態様を実行するために、コンピュータ可読プログラム命令の状態情報を利用して電子回路を個別化することにより、コンピュータ可読プログラム命令を実行することができる。

【0116】

本発明の態様は、本発明の実施形態および／または工程による方法、装置（システム）、ならびにキットのフローチャート図および／またはブロック図を参照しつつ本明細書に記載される。フローチャート図および／またはブロック図の正方形または菱形のブロックそれぞれ、ならびにフローチャート図および／またはブロック図中のブロックの組合せは、生物学的技法またはコンピュータ可読プログラム命令、あるいはこれらの組合せにより実施可能であることを理解されたい。

【0117】

これらコンピュータ可読プログラム命令は、汎用コンピュータ、特殊目的コンピュータ、または他のプログラマブルデータ処理装置のプロセッサに提供され、コンピュータまたは他のプログラマブルデータ処理装置のプロセッサを介して実行される命令が、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックにおいて指定された機能／行為を実施するための手段を作成するように機械を製造することができる。これらコンピュータ可読プログラム命令は、コンピュータ、プログラマブルデータ処理装置、および／または他の装置が特定の方法で機能するように導くことができるコンピュータ可読記憶媒体に記憶されてもよく、そうすることで、中に命令が記憶されているコンピュータ可読記憶媒体は、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックにて指定された機能／行為の態様を実施する命令を含む製造品を備える。

【0118】

コンピュータ可読プログラム命令はまた、コンピュータ、他のプログラム可能な装置、または他の装置上で実行される一連の操作工程に、コンピュータ実装プロセスを行わせるために、コンピュータ、他のプログラマブルデータ処理装置、または他の装置にロードされてもよく、そうすることで、コンピュータ、他のプログラム可能な装置、または他の装置上で実行される命令は、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックにてブロックに指定された機能／行為を実施する。

【0119】

図中のフローチャートおよびブロック図は、本発明の様々な実施形態によるシステム、方法、およびキットの可能な実装のアーキテクチャ、機能性、および操作を例示するものである。これに関して、フローチャートまたはブロック図中の各ブロックは、指定された論理機能を実施するための１つ以上の実行可能命令を含むモジュール、セグメント、または命令の一部を表す場合がある。いくつかの代替的な実装では、ブロックに注記された機能は、図に注記された順序から外れて生じる場合がある。例えば、連続で示される２つのブロックは、実際には、ほぼ同時に実行されてもよく、または、関係する機能に応じて逆の順序で実行されてもよい。また、ブロック図および／またはフローチャート図の各ブロック、ならびにブロック図および／またはフローチャート図のブロックの組合せは、特定の機能または行為を実行するか、専用ハードウェアおよびコンピュータ命令の組合せを実行する専用ハードウェアベースのシステムにより実施することができる。

【0120】

以下の特許請求の範囲内の手段または工程すべてに加え、機能要素の対応する構造、材料、行為、および等価物は、具体的に請求されるように請求された他の要素と組み合わせて機能を実行するための任意の構造、材料、または行為を含むことが意図されている。本発明の記述は、例示および説明の目的のために提示されているが、開示された形態での本発明の実施形態に徹底または限定することは意図されていない。本発明の実施形態の範囲および趣旨から逸脱することなく、多くの修正と変形が当業者に明白であろう。実施形態は、本発明の実施形態の原理および実際の適用を最良に説明するために、かつ、様々な実施形態に関する本発明の実施形態が企図した特定の使用に適していると当業者が理解するのを可能とするために選択および記述された。

【実施例】

【0121】

以下の実施例は本発明を例示しており、本発明を限定するものではなく例示するものであるとみなされるべきである。

【実施例1】

【0122】

自己幹細胞移植のための選択前に患者から得た追跡試料中のＭＲＤレベルの判定（図１４）
ｉ）対象と試料
２０１８年９月１４日、対象ＡＭＬ＿４０１をＡＭＬと診断した（図１４に示すように、時点ＴＰ１での診断試料）。２つの異なる連続試料を採取して解析し、ＡＭＬにおける標準治療処置：シタラビン＋イダルビシン（３＋７）誘導（時点ＴＰ２、２０１８年１０月２２日）、続いて高用量シタラビン（時点ＴＰ３、２０１８年１２月１８日）に対する応答レベルを定めた。遺伝子マーカーを求めるために必要に応じて診断試料の解析内で、自己幹細胞移植（自己移植）前に採取した余剰時点（ＴＰ４、２０１９年１月２５日）での解析を、本実施例に記載する。

【0123】

ｉｉ）試料からのＤＮＡの抽出と定量化
ＤＮＡ抽出をＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＭＤｘ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｂｅｒｉｃａ，ＳＬ）上で行い、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＷＡ，ＵＳＡ）上で定量化した。診断試料は、溶出体積３０μＬで２０ｎｇ／μＬを提示した。ＴＰ４は、溶出体積３０μＬで４６ｎｇ／μＬを提示した（ＴＰ４で得られたＤＮＡの総量＝１３８０ｎｇ）。

【0124】

ｉｉｉ）診断時の遺伝子マーカーの判定
ＭＲＤの存在をさらに追跡するための遺伝子マーカーを定めることを目的として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）のほか、その他骨髄癌の対象において頻繁に突然変異する複数の遺伝子の骨髄腫パネルを用いて、カスタム次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による診断時に突然変異プロファイルスクリーニングを行った（表４を参照。ＮＧＳシーケンシングに関して前記骨髄腫パネルに含まれる遺伝子とこれが位置する染色体、前記パネルが各遺伝子に対して含むアンプリコンの数、パーセンテージで表されるアンプリコンすべてを包含する遺伝子の領域、およびエクソンの数が示されている）。診断試料ＴＰ１のライブラリ調製とＮＧＳシーケンシングは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．の定める標準プロトコルに従い、前記骨髄腫パネルを使用して行った。

【0125】

【表4-1】

【0126】

【表4-2】

【0127】

ｉｖ）ＭＲＤレベルの定量化と実験感度（ＥＳ）の判定
遺伝子マーカーを選択するための突然変異スクリーニングの後、２つの癌特異的（体細胞）突然変異を検出した。一方は２６．７％のＶＲＦをもってＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄに影響を及ぼす一塩基変異であり、他方は４７．２％のＶＲＦをもってアミノ酸Ｗ２９０に影響を及ぼすＮＰＭ１上のフレームシフト挿入（インデル）（ＮＰＭ１ Ｗ２９０ｆｓ、ＮＰＭ１ ｉｎｓ）である。続いて、診断時に検出したこれら特異的な突然変異を、追跡診断において試験した。

【0128】

予め、実験工程としてＤＮＡ増幅、ライブラリ調製、およびシーケンシングを含むプロトコル（図４）を、以下のように確立した。
（ａ）これら２つの突然変異を包含する特定のプライマーを表３から選択し、これを使用して時点ＴＰ４にて患者試料から得た６５０ｎｇのｇＤＮＡを増幅させ、自己移植前に採取した。ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量により、エラー補正アルゴリズムの第１のパラメータｍｉｎＶＲＦを次のように求めることが可能となった：
ｍｉｎＶＲＦ＝［二倍体細胞あたり６．４９×１０^－３ｎｇのＤＮＡ］／［ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量（ｎｇ）
＝６．４９×１０^－３／６５０ｎｇのｇＤＮＡ
＝１．０×１０^－５（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。
（ｂ）ｇＤＮＡは、選択したプライマーとＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いた第１のＰＣＲにより、最初の変性では９４℃で６０秒、続く変性では９４℃で１５秒を３５サイクル、アニーリングでは５８℃で３０秒、および伸張では６８℃で３０秒の条件で増幅させた。最終体積は１００μＬ（７９．６μＬのＤＮＡ－Ｈ_２Ｏ、１０μＬの１０×高忠実度ＰＣＲ緩衝液、４μＬの５０ｎＭ ＭｇＳＯ_４、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（ＮＺＹＴｅｃｈ，Ｌｄａ，Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ）、０．４μＬのＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、２μＬの１０μＭフォワードプライマー、および２μＬの１０μＭリバースプライマーであった。
（ｃ）ライブラリは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて構築した。増幅したＤＮＡおよび増幅したライブラリの両方に関する最終産物の特異性と定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。
（ｄ）最後に、推計１万の読取り深さをもってＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｙｓｔｅｍプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）上でライブラリを配列決定し、．ｆａｓｔｑファイルを作成した。これらのファイルを、標的突然変異配列および野生型配列を絶対値で特異的に検出する、本発明で利用されるＭＲＤレベルを定量化する方法により解析した。Ｅｎｓｅｍｂｌ ｐｅｒｌ ＡＰＩを使用して、突然変異配列とｗｔ配列を、４０ｂｐで境界を付けたＦＡＳＴＡ形式で位置づけた。最後に、名称識別子、実行およびバーコード識別子、染色体位置、変異体、調査されたＦＡＳＴＡでの特異的配列（突然変異フォワード、突然変異リバース、ｗｔ（野生型）フォワード、およびｗｔリバース）、これらそれぞれの絶対値での数と比（突然変異／ｗｔ）を伴う．ｃｓｖファイルを得た。
（ｅ）この方法はまた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄのような点突然変異に関するａｖＰｏｓを定量し、これにより、ａｖＰｏｓは、遺伝子マーカーおよび非突然変異配列と同一であるヌクレオチド配列（すなわち、各代替物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ））に関する平均変異読取り頻度ａｖＶＲＦであるが、前記遺伝子マーカーにおける一塩基変異型突然変異に寄与するヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なる。要するに、代替物は、突然変異配列に存在するもの（例えばＡ）および天然配列に存在するもの（例えばＧ）とは異なるヌクレオチド（例えばＣまたはＴ）をＳＮＶの位置にて有するという点で天然配列および突然変異配列とは異なる２つの異なる非天然配列を指す（天然配列のように、非天然の代替配列は疾患を引き起こさないが、非天然（突然変異）配列は疾患を引き起こす場合がある）。特に、２つの代替物の中央値（または平均）を算出し、これにより、エラー補正アルゴリズムのａｖＰｏｓパラメータを確立する。この方法を適用して、位置ｃｈｒ１：１１５２５８７４７に対するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄにおける一塩基変異（ＳＮＶ）の代替的な読取り数を得て、Ｇ＞Ａの実際の突然変異に関する突然変異配列の数は、６８３１１８の読取りのうち１１であり、非天然代替物の数は、Ｇ＞Ｔでは６８３１１８の読取りのうち２、Ｇ＞Ｃでは６８３１１８の読取りのうち０である（図１４Ｂ）。この対象において検出したＮＰＭ１におけるもののようなインデル、または免疫グロブリン再構成に関するａｖＰｏｓパラメータは、同じ位置かつ同じ順序で代替的な突然変異配列を正確に有している可能性がほぼ０であるため、本方法では算出も考慮も必要ない（図１４Ｃ）。
（ｆ）工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、健康なドナーから得た１０個の試料を対象に、ＫＲＡＳ遺伝子に影響を及ぼす突然変異なしに繰り返して、エラー補正アルゴリズムのａｖＭｕｔパラメータを４．３ｘ１０^－５と判定した（図１４Ｂ）。この対象において検出したＮＰＭ１におけるもののようなインデル、または免疫グロブリン再構成に関するａｖＭｕｔパラメータは、同じ位置かつ同じ順序で代替的な突然変異配列を正確に有している可能性がほぼ０であるため、本方法では算出も考慮も必要ない（図１４Ｃ）。
（ｇ）工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、分子の５０％に存在する突然変異を伴う初期の市販のＤＮＡのうち試験中のもの（ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＮＰＭ１ ｉｎｓ）から実施した１０倍希釈曲線において繰り返した。このように、最大７つの連続する１０倍希釈の希釈ライブラリを調製し、上述のように配列決定して、本明細書に記載の方法によりＤ－ｌｉｍｉｔパラメータを算出した（図１４Ｂと１４Ｃ）。

【0129】

ｖ）ＮＧＳの結果の解釈
対象ＡＭＬ＿４０１を対象に得たＭＲＤ値とＥＳデータの概要を図１４Ａに示す。これにより、時点ＴＰ４でのＫＲＡＳ Ｇ１２ＤマーカーのＥＳを、上述のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちＤ－ｌｉｍｉｔにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ）}＝６．８×１０^－５であった。本対象を対象に同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、ＭＲＤ_{（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ）}＝３．４×１０^－５であった。本マーカーではＥＳ＞ＭＲＤであったため、この対象におけるこの時点でのＭＲＤ状態は、ＭＲＤ陰性である。

【0130】

さらに、ＮＰＭ１ ｉｎｓのＥＳを、上記のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちｍｉｎＶＲＦにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＭＰＮ１ ｉｎｓ）}＝１．０×１０^－５である。この対象を対象に同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、０であった。本マーカーではＥＳ＞ＭＲＤであったため、この患者におけるこの時点でのＭＲＤ状態も、ＭＲＤ陰性であると認めた。

【0131】

このため、前記マーカーのいずれかでは、最小残存急性骨髄性白血病は前記対象には存在しないと結論づけることができる。

【実施例2】

【0132】

臨床試験に参加する骨髄腫患者から得た追跡試料におけるＭＲＤ状態の判定（図１５）
以下、大規模並列シーケンシング（ＭＰＳ）を介した、免疫グロブリン（Ｉｇ）の遺伝子のポリクローナルバックグラウンド再構成内の腫瘍クローン型配列の定量化のための方法を提示する。ＢおよびＴ細胞新生物におけるクローン再構成の検出により、これらの病状の進行（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）に対するモニタリングが可能となる。Ｂ細胞中のこれら再構成を定量化するために、表１と２に開示されるＩｇＨ、ＩｇＫ、およびＫＤＥＬに関するプライマーを使用した。これらの断片は症例の９０％以上をカバーするからである。これら特定の再構成の選択は、短い（２００ｂｐ未満）配列のみを増幅するプライマーの設計に起因するものであり、５４０のチップを備えて、ＩＯＮプラットフォームＳ５プラットフォームでのこれら断片の配列決定が可能となる。ＶＤＪ、ＩｇＨ、ＧＤＲ３、ＫＶＪ、ＫＤＥＬの診断での陰性患者は、ＩｇＨ、ＶＤＪ、ＣＤＲｌ、およびＩｇＬ ＤＪのようなＢＩＯＭＥＤプライマーの残部を用いて配列決定することができる。これらの断片のサイズは３００～４００塩基対（ｂｐ）であるため、４００ｂｐ用の反応キットを備えたＰＧＭプラットフォームや、この断片サイズをカバーすることができる５３０のチップを備えたＩＯＮ Ｓ５プラットフォームなどの他のプラットフォームを使用する必要がある。

【0133】

材料と方法
ｉ）対象試料
２０１３年１０月２８日（ＴＰ１）、対象（ＭＭ＿５７７）を多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断した。従来の治療による最初のサイクル後、２０１４年１月１４日（ＴＰ２）に、患者は完全な応答を達成した。２０１５年４月、患者を臨床試験に登録し、２０１５年６月２日（ＴＰ３）にボルテゾミブとサリドマイドを伴う治療による導入後に完全な反応を維持した。移植のために患者を選択し、選択後、２０１５年１０月８日（ＴＰ４）に完全寛解を呈した。臨床試験は２０１６年に終えたが、２０１６年１月１６日（ＴＰ５）でも患者は完全寛解状態にあった。

【0134】

ｉｉ）試料からのＤＮＡの抽出と定量化
ＤＮＡ抽出をＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＭＤｘ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｂｅｒｉｃａ，ＳＬ）上で行い、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＷＡ，ＵＳＡ）上で定量化した。診断試料は、溶出体積３０μＬで２１４ｎｇ／μＬを提示した。ＴＰ５は、溶出体積３０μＬで１４８ｎｇ／μＬを提示した（ＴＰ５で得られたＤＮＡの総量＝６４２０ｎｇ）。

【0135】

ｉｉｉ）試料のＰＣＲ
Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＣＲを行い、使用したプライマーは、ＩｇＨおよびＩｇＫに関するＢＩＯＭＥＤ－２プロトコルに記載されたものであった。ＩｇＨ遺伝子の前記断片を増幅するのに使用したプライマーは表１に示すが、ＩｇＫ遺伝子の前記断片を増幅するのに使用したプライマーは、表２に示す。

【0136】

試験試料の増幅は、試験試料の体積（Ｖ、μＬ）に基づき必要に応じて算出したＰＣＲ実験（すなわちＰＣＲチューブ）の数、前記試料のマイクロリットルごとの等価細胞数（ｍｉｎＶＲＦ）、達成が所望された感度（Ｓ）、および最終ＰＣＲチューブ体積を用いて行った。したがって、試験試料に対する各ＰＣＲ反応混合物の各成分（ＰＣＲチューブごと）の量は、次のとおりであった。
ａ）ＰＣＲ ＩｇＨ
８４μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ ＨＩＦＩマスターミックス
４μＬのＰｒｉｍｅｒｓ ＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３ミックス（チューブＡ、Ｂ、Ｃ）
４μＬのプライマーＪＨ５７
８μＬのｇＤＮＡ
ｂ）ＰＣＲ ＩｇＫ
８０μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ ＨＩＦＩマスターミックス
４μＬのＰｒｉｍｅｒｓ ＫＶｍｉｘ（チューブＦ）
４μＬのプライマーＪ_Ｋ５
４μＬのプライマーＪ_Ｋ１－４
８μＬのｇＤＮＡ
ｃ）ＰＣＲ ＤＨ
８４μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ ＨＩＦＩマスターミックス
４μＬのプライマーＤ_Ｈ１－６（チューブＤ）またはＤＨ７（チューブＥ）
４μＬのＪＨ５７
８μＬのｇＤＮＡ
ｄ）ＰＣＲ ＫＤＥＬ
８０μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ ＨＩＦＩマスターミックス
４μＬのＰｒｉｍｅｒｓ ＫＶｍｉｘ（チューブＧ）
４μＬのＩＮＴＲ（チューブＨ）
４μＬのＫＤＥＬ
８μＬのｇＤＮＡ

【0137】

診断試料は同じ反応をもって増幅させたが、１μＬのＤＮＡを使用した（１μＬのＤＮＡ＝約２０ｎｇのｇＤＮＡ、すなわち［ＤＮＡ］＝２０μｇ／ｍＬ）。診断試料において所与の感度を達成する必要がないためである。

【0138】

ｉｖ）断片化を伴わないアンプリコンライブラリの調製
両試料（診断と追跡）の増幅産物を使用し、Ｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＬｉｂｒａｒｙキットおよびＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて断片化を伴わないアンプリコンライブラリをそれぞれ調製した。Ｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔを用いた反応物すべての体積の半分を使用することが可能であると分かった。最終ライブラリ濃度は、Ｇｅｎｅｒｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）においてｑＰＣＲを用いて求めた。ライブラリは、各試料の特定のバーコードを使用して生成した。

【0139】

ｖ）超並列シーケンシング
表１および表２に記載のプライマーを使用して、ＩＧＨおよびＩＧＫ遺伝子の像副産物の超並列シーケンシングを介して、主要なクローンを診断試料において特定した。製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）の指示に従い、ＯｎｅＴｏｕｃｈ（商標）Ｉｏｎ ｖ２ Ｋｉｔ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ４００ ＤＬ、４００ Ｉｏｎ ＰＧＭ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ ｖ２、およびＩｏｎ Ｃｈｉｐ ３１８（商標）を使用して、ＰＧＭプラットフォーム（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅ（商標）^ＴＭプラットフォーム）上でＫｉｔ２５０ｂｐを超える断片を持つクローン試料を配列決定した。２５０ｂｐ未満の断片（主に再構成ＫＶＪおよびＫＤＥＬを持つサンプル由来）は、ＰＲＯＴＯＮプラットフォーム：Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）Ｉ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＯＴ２ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＫｉｔおよびシーケンシングＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して配列決定した。すべての試薬は、わずかな変更を伴ってそれらのプロトコルを使用してＬｉｆｅｔｅｃｈから購入した。ＰＧＭプラットフォーム技術では最大２５０ｂｐの断片を配列決定されるが、異なる化学を使用したＬｉｆｅｔｅｃｈの別の市販のキットを用いて最大４００ｂｐの断片を配列決定することが可能である。

【0140】

ｖｉ）バイオインフォマティクス解析
配列決定後、２つの試料の．ｆａｓｔｑファイルを、対応するバーコードに従いＴｏｒｒｅｎｔのブラウザから得た。各．ｆａｓｔｑファイルは、前記試料中に含まれるＤＮＡのヌクレオチド配列を表す、左から右へと読み取られる文字の列記を含むほか、前記文字の列記の各文字に対応する品質スコアをさらに含む。

【0141】

数学的およびコンピュータ方法（ＩＴツール）を使用して、すなわちＦｒｅｑｕｅｎｃｙＲａｎｋ．ｓｈ Ｂｏｕｒｎｅシェルスクリプト （ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＿ｒａｎｋ．ｓｈ）を使用して診断試料中の各クローン型配列の定量化を判定し、配列を降順の頻度順に並び替えた。一旦、診断試料中で追跡試料と同じであるクローン配列を判定したら、左から右へと読み取られる文字の列記として前記クローン配列それぞれを含むとともに、文字の総数を有する．ｄｎａファイルを作製した。

【0142】

引数配列（第２の文字の列記）と同じと見なした診断試料中で特定されたクローン配列（第１の文字の列記）の数を、－ｔｒｉｍオプションおよび０．９９の一致比（類似度）を用いる－ｔｒｉｍＳｅｑＳｅａｒｃｈＦａｓｔｑ．ｊａｖａプログラムを使用して計数し、値Ｌ_ｃを得た。第１の文字の列記の総数から、Ｌ_ｔを求めた。

【0143】

本発明の方法は、アライメントと比較の組合せを含むので、最初と最後の一致する位置間でのみ比較が行われ、－ｔｒｉｍオプションは、プロセスにこのように作用するように命じて、試料配列内の最初と最後の位置（一致に関係なく）に代わり、最初と最後の一致する位置からの比較を制限する。続いて、ＳｅｑＳｅａｒｃｈＦａｓｔｑ．ｊａｖａプログラムからの出力Ｌ_ｃを、Ｌ_ｔ、ｋ、およびＤに関する値とともに使用して、ＭＲＤを算出する。

【0144】

ｖｉｉｉ）ＭＲＤ定量化
先の方法はＩｇＫ 遺伝子においてクローンＩｇ再構成を特定した。このことは、配列決定した読取りが３９．５７％であることを表す。

【0145】

追跡細胞におけるＩｇ再構成のシーケンシングでは、診断時に定めたクローンＩｇＫ再構成に関連する読取りは明らかにならなかった。このことは、ＭＲＤレベル＝０を意味する。

【0146】

ｉｘ）実験感度の定義
ｍｉｎＶＲＦは前述のように定めた。これにより、次のとおりになる：
ｍｉｎＶＲＦ＝［二倍体細胞あたり６．４９×１０^－３ｎｇのＤＮＡ］／［ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量（ｎｇ）
＝６．４９×１０^－３／６５０ｎｇのｇＤＮＡ
＝１．０×１０^－５（図１５Ａおよび１５Ｂ）。

【0147】

同じ位置および同じ順序で突然変異の代替配列を正確に有している確率がほぼ０（約１００）であるため、免疫グロブリン再構成におけるａｖＰｏｓおよびａｖＭｕｔの値は、本方法では算出も考慮も必要とされない（図１５Ｂ）。

【0148】

ＩｇＫ再構成のＤ－ｌｉｍｉｔは、３．２ｘ１０^－６と算出した（図１５Ａと１５Ｂ）。

【0149】

ｘ）解釈
対象ＭＭ＿５７７を対象に得たＭＲＤ値とＥＳデータの概要を図１５Ａに示す。これにより、時点ＴＰ５でのＩｇＫ再構成マーカーのＥＳを、上述のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちｍｉｎＶＲＦにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＩｇＫ）}＝１．０ｘ１０^－５であった。この対象を対象に同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、ＭＲＤ_{（ＩｇＫ）}＝０であった。本マーカーではＥＳ＞ＭＲＤであったため、この対象におけるこの時点でのＭＲＤ状態は、ＭＲＤ陰性である。

【実施例3】

【0150】

臨床試験に参加するＡＭＬ患者から得た追跡試料におけるＭＲＤ状態の判定（図１７）
材料と方法
ｉ）対象と試料
２０１７年９月２３日、対象ＡＭＬ＿９８１をＡＭＬと診断した。３つの異なる連続試料を採取して解析し、シタラビン＋イダルビシン（３＋７）（時点ＴＰ２、２０１８年１１月２８日）、続いて高用量シタラビン（時点ＴＰ３、２０１８年２月２３日）での誘導後、ＡＭＬにおける標準治療処置に対する応答レベルを定めた。遺伝子マーカーを求めるために必要に応じて診断試料の解析内で、自己幹細胞移植（自己移植）前に採取した余剰時点（ＴＰ４、２０１８年１１月１日）での解析を、本実施例に記載する。

【0151】

ｉｉ）サンプルからのＤＮＡの抽出と定量化、および診断時の遺伝子マーカーの判定。
実施例１の項目ｉｉ）とｉｉｉ）それぞれに記載するように実施した。

【0152】

ｉｉｉ）ＭＲＤレベルの定量化と実験感度（ＥＳ）の判定
遺伝子マーカーを選択するための突然変異スクリーニング後、１つの癌特異的（体細胞）突然変異を検出し、これには４６．０％のＶＲＦを伴うＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒに影響を及ぼす１つの一塩基変異が含まれていた。続いて、診断時に検出したこの特異的な突然変異を追跡診断において試験した。

【0153】

実施例１と同様に、ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量により、エラー補正アルゴリズムの第１のパラメータｍｉｎＶＲＦを次のように求めることが可能となった：
ｍｉｎＶＲＦ＝［二倍体細胞あたり６．４９×１０^－３ｎｇのＤＮＡ］／［ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量（ｎｇ）
＝６．４９×１０^－３／６５０ｎｇのｇＤＮＡ
＝１．０×１０^－５

【0154】

続いて、実施例１で定めたものと同じプロトコルを実施した。

【0155】

ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒにおいて位置ｃｈｒ１：１１５２５６５２８に対する一塩基変異（ＳＮＶ）の代替的な読取り数を得た。Ａ＞Ｇの実際の突然変異における突然変異配列の数は１６１８９４１の読取りのうち１４であり、非天然代替物の数は、Ａ＞Ｔでは１６１８９４１の読取りのうち０、Ａ＞Ｃでは１６１８９４１の読取りのうち４であった。

【0156】

実施例１の項目ｉｖ）の工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、健康なドナーから得た１０個の試料を対象に、ＮＲＡＳ遺伝子に影響を及ぼす突然変異なしに繰り返して、エラー補正アルゴリズムのａｖＭｕｔパラメータを６．０６ｘ１０^－５と判定した。

【0157】

実施例１の項目ｉｖ）の工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、分子の５０％に存在する突然変異を伴う初期の市販のＤＮＡのうち試験中のもの（ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ）から実施した１０倍希釈曲線において繰り返した。このように、最大７つの連続する１０倍希釈の希釈ライブラリを調製し、上述のように配列決定して、本明細書に記載の方法によりＤ－ｌｉｍｉｔパラメータを１．９１ｘ１０^－５として算出した。

【0158】

ｉｖ）ＮＧＳの結果の解釈
時点ＴＰ４でのＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒマーカーの実験感度（ＥＳ）は、上記のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちａｖＭｕｔにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ）}＝６．０６ｘ１０^－５であった。本対象を対象に同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、ＭＲＤ_{（ＮＲＡＳ Ｑ６１Ｒ）}＝１．９１ｘ１０^－５であった。本マーカーではＥＳ＞ＭＲＤであったため、この対象におけるこの時点でのＭＲＤ状態は、ＭＲＤ陰性であった。

【0159】

このため、前記マーカーでは、最小残存急性骨髄性白血病は前記対象には存在しないと結論づけることができる。

【実施例4】

【0160】

臨床試験に参加する骨髄腫患者から得た追跡試料におけるＭＲＤ状態の判定（図１８）
材料と方法
ｉ）対象試料
２０１４年１２月２日（ＴＰ１）、対象（ＭＭ＿６０６）を多発性骨髄腫（ＭＭ）と診断した。従来の治療による最初のサイクル後、患者は完全な応答を達成した。２０１４年７月９日（ＴＰ２）では、患者は誘導後療法の下、完全応答を持続した。２０１４年１１月（ＴＰ３）、患者は自己移植後に完全寛解した。臨床試験は２０１６年に終えたが、２０１６年２月（ＴＰ４）でも患者は完全寛解状態にあった。１年後の２０１７年２月２３日、患者の症状が再発した（ＴＰ５およびＴＰ６）。

【0161】

ｉｉ）試料からのＤＮＡの抽出と定量化、試料のＰＣＲ、断片化を伴わないアンプリコンライブラリの調製、超並列シーケンシング、およびバイオインフォマティクス解析
実施例２の項目ｉｉ）～ｖｉｉ）それぞれに記載するように実施した。

【0162】

ｉｉｉ）ＭＲＤ定量化
先の方法はＩｇＨ遺伝子においてクローンＩｇ再構成を特定した。このことは、配列決定した読取りが５５．６％であることを表す。

【0163】

追跡試料におけるＩｇ再構成のシーケンシング（ＴＰ６）では、診断時に定めたクローンＩｇＨ再構成に関連する読取りが明らかになった。このことは、ＭＲＤレベル＝０．０４５を意味する。

【0164】

ｉｖ）実験感度の定義
ｍｉｎＶＲＦは前述のように定めた。これにより、次のとおりになる：
ｍｉｎＶＲＦ＝［二倍体細胞あたり６．４９×１０^－３ｎｇのＤＮＡ］／［ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量（ｎｇ）
＝６．４９×１０^－３／６５０ｎｇのｇＤＮＡ
＝１．０×１０^－５（図１８Ａおよび１８Ｂ）。

【0165】

同じ位置および同じ順序で突然変異の代替配列を正確に有している確率がほぼ０（約１００）であるため、免疫グロブリン再構成におけるａｖＰｏｓおよびａｖＭｕｔの値は、本方法では算出も考慮も必要とされない（図１８Ｂ）。

【0166】

ＩｇＨ再構成のＤ－ｌｉｍｉｔは、１ｘ１０^－５．４と算出した（図１８Ａと１８Ｂ）。

【0167】

ｖ）解釈
対象ＭＭ＿６０６を対象に得たＭＲＤ値とＥＳデータの概要を図１８Ａに示す。これにより、時点ＴＰ６でのＩｇＨ再構成マーカーのＥＳを、上述のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちｍｉｎＶＲＦにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＩｇＨ）}＝１．０ｘ１０^－５であった。この対象を対象に同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、ＭＲＤ_{（ＩｇＫ）}＝０．０４５であった。本マーカーではＥＳ＜ＭＲＤであったため、この対象におけるこの時点でのＭＲＤ状態は、ＭＲＤ陽性である。

【実施例5】

【0168】

肺葉切除および化学療処置療後の臨床試験における肺腺癌由来の追跡試料中のＭＲＤ状態の決定（図２１Ｂ）
材料と方法
ｉ）対象と試料
２０１８年１月１２日、対象ＡＣ＿００３を（ＡＣ）においてＩＶ期肺腺癌と診断した（図２１Ｂに示すように、時点ＴＰ１での診断試料）。３つの異なる連続試料を採取して解析し、応答のレベルを定めた。末梢血循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を肺葉切除前に採取した（ＴＰ２、２０１８年３月１２日）。１９サイクルおよび２８サイクルのペンブロリズマブ投与後、完全応答状態におけるｃｆＤＮＡを２つ以上の時点（ＴＰ３、２０１８年５月７日およびＴＰ４、２０１９年１０月１５日）。遺伝子マーカーを求めるために必要に応じて、診断試料の解析内の最後の時点（ＴＰ４、サイクル２９）のＭＲＤ状態を、本実施例に記載する。

【0169】

ｉｉ）試料からのＤＮＡの抽出と定量化
ｃｆＤＮＡ抽出をＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＭＤｘ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｂｅｒｉｃａ，ＳＬ）上で行い、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＷＡ，ＵＳＡ）上で定量化した。診断試料は、溶出体積３０μＬで２３．０８ｎｇ／μＬを提示した。ＴＰ４は、溶出体積３０μＬで２９．３ｎｇ／μＬを提示した（ＴＰ４で得られたＤＮＡの総量＝８８ｎｇ）。

【0170】

ｉｉｉ）診断時の遺伝子マーカーの判定
ＭＲＤの存在をさらに追跡するための遺伝子マーカーを定めることを目的として、１６０００個のアンプリコンを使用して、４０９個の遺伝子のコーディング領域すべてをカバーする市販の標的化シーケンシングパネル（Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ（商標）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｅｆ ４４７７６８５））を用いて、突然変異プロファイルスクリーニングを診断時に実施した。診断試料ＴＰ１のライブラリ調製とＮＧＳシーケンシングは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．の定める標準プロトコルに従い、前記市販のパネルを使用して行った。

【0171】

ｉｖ）ＭＲＤレベルの定量化と実験感度（ＥＳ）の判定
遺伝子マーカーを定めるための突然変異スクリーニング後、１つの癌特異的（体細胞）突然変異、すなわち２７．７％のＶＲＦを伴うＷＡＳ Ｔ４５Ｍに影響を及ぼす１つの一塩基変異を選択した。続いて、診断時に検出したこの特異的な突然変異を、追跡診断において試験した。

【0172】

予め、実験工程としてｃｆＤＮＡ増幅、ライブラリ調製、およびシーケンシングを含むプロトコル（図４）を、以下のように確立した。
（ａ）この突然変異をカバーする特定のプライマー対をデザインし、これを使用して、２９の治療サイクル後に採取した時点ＴＰ４での患者試料から６５ｎｇのｃｆＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ増幅に使用したｃｆＤＮＡの量により、エラー補正アルゴリズムの第１のパラメータｍｉｎＶＲＦを次のように求めることが可能となった：
ｍｉｎＶＲＦ＝［二倍体細胞あたり６．４９×１０^－３ｎｇのＤＮＡ］／［ＰＣＲ増幅に使用したｇＤＮＡの量（ｎｇ）
＝６．４９×１０^－３／６５ｎｇのｇＤＮＡ
＝１．０×１０^－４。
（ｂ）ｃｆＤＮＡは、選択したプライマーとＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いた第１のＰＣＲにより、次の条件で増幅させた：最初の変性では９４℃で６０秒、続く変性では９４℃で１５秒を３５サイクル、アニーリングでは５８℃で３０秒、および伸張では６８℃で３０秒。最終体積は１００μＬ（７９．６μＬのＤＮＡ－Ｈ_２Ｏ、１０μＬの１０×高忠実度ＰＣＲ緩衝液、４μＬの５０ｎＭ ＭｇＳＯ_４、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（ＮＺＹＴｅｃｈ，Ｌｄａ，Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ）、０．４μＬのＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、２μＬの１０μＭフォワードプライマー、および２μＬの１０μＭリバースプライマーであった。
（ｃ）ライブラリは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて構築した。増幅したＤＮＡおよび増幅したライブラリの両方に関する最終産物の特異性と定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。
（ｄ）最後に、推計１万の読取り深さをもってＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｙｓｔｅｍプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）上でライブラリを配列決定し、ｆａｓｔｑファイルを作成した。これらのファイルを、標的突然変異配列および野生型配列を絶対値で特異的に検出する、本発明で利用されるＭＲＤレベルを定量化する方法により解析した。Ｅｎｓｅｍｂｌ ｐｅｒｌ ＡＰＩを使用して、突然変異配列とｗｔ配列を、４０ｂｐで境界を付けたＦＡＳＴＡ形式で位置づけた。最後に、名称識別子、実行およびバーコード識別子、染色体位置、変異体、調査されたＦＡＳＴＡでの特異的配列（突然変異フォワード、突然変異リバース、ｗｔ（野生型）フォワード、およびｗｔリバース）、これらそれぞれの絶対値での数と比（突然変異／ｗｔ）を伴う．ｃｓｖファイルを得た。
（ｅ）この方法はまた、ＷＡＳ Ｔ４５Ｍのような点突然変異に関するａｖＰｏｓを定量した。これにより、ａｖＰｏｓは、遺伝子マーカーおよび非突然変異配列と同一であるヌクレオチド配列（すなわち、各代替物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ））に関する平均変異読取り頻度ａｖＶＲＦであるが、前記遺伝子マーカーにおける一塩基変異型突然変異に寄与するヌクレオチドは、前記遺伝子マーカーおよび前記非突然変異配列におけるものとは異なる。要するに、代替物は、突然変異配列に存在するもの（例えばＡ）および天然配列に存在するもの（例えばＧ）とは異なるヌクレオチド（例えばＣまたはＴ）をＳＮＶの位置にて有するという点で天然配列および突然変異配列とは異なる２つの異なる非天然配列を指す（天然配列のように、非天然の代替配列は疾患を引き起こさないが、非天然（突然変異）配列は疾患を引き起こす場合がある）。特に、２つの代替物の中央値（または平均）を算出し、これにより、エラー補正アルゴリズムのａｖＰｏｓパラメータを確立する。この方法を適用して、位置ｃｈｒＸ：４８５４２６７３に対するＷＡＳ Ｔ４５Ｍにおける一塩基変異（ＳＮＶ）の代替的な読取り数を得て、Ｃ＞Ｔの実際の突然変異に関する突然変異配列の数は、２６９２９５の読取りのうち６であり、非天然代替物の数は、Ｃ＞Ａでは２６９２９５の読取りのうち２、Ｃ＞Ｔでは２６９２９５の読取りのうち０である。この対象において検出したＮＰＭ１におけるもののようなインデル、または免疫グロブリン再構成に関するａｖＰｏｓパラメータは、同じ位置かつ同じ順序で代替的な突然変異配列を正確に有している可能性がほぼ０であるため、本方法では算出も考慮も必要ない。
（ｆ）工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、健康なドナーから得た１０個の試料を対象に、ＷＡＳ遺伝子に影響を及ぼす突然変異なしに繰り返して、エラー補正アルゴリズムのａｖＭｕｔパラメータを２．７ｘ１０^－５と判定した。
（ｇ）工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、分子の５０％に存在する突然変異を伴う初期の市販のＤＮＡのうち試験中のもの（ＷＡＳ Ｔ４５Ｍ）から実施した１０倍希釈曲線において繰り返した。このように、最大７つの連続する１０倍希釈の希釈ライブラリを調製し、上述のように配列決定して、本明細書に記載の方法によりＤ－ｌｉｍｉｔパラメータを２．２ｘ１０^－５として算出した。

【0173】

ｖ）ＮＧＳの結果の解釈
時点ＴＰ４でのＷＡＳ Ｔ４５ＭマーカーのＥＳは、上記のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちｍｉｎＶＲＦにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＷＡＳ Ｔ４５Ｍ）}＝１ｘ１０^－４であった。本対象を対象に同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、ＭＲＤ_{（ＷＡＳ Ｔ４５Ｍ）}＝２．２×１０^－５であった。本マーカーではＥＳ＞ＭＲＤであったため、この対象におけるこの時点でのＭＲＤ状態は、ＭＲＤ陰性であった。

【実施例6】

【0174】

従来の治療を受けている濾胞性リンパ腫（ＦＬ）患者由来の追跡試料におけるＭＲＤレベルの判定（図２１Ｄ）
材料と方法
ｉ）対象と試料
２０１９年９月、対象ＦＬ＿０６１をＦＬと診断した（図２１Ｄに示すように、時点ＴＰ１、２０／０９／２０１９での診断試料）。６つの異なる連続試料を採取して解析し、ＦＬにおける標準治療処置：リツキシマブ維持に続くアントラサイクリンベースのレジメン（ＴＰ２～７、１～６の処置サイクル）に対する応答のレベルを定めた。患者の症状再発を２０２０年８月（ＴＰ８）に検出し、救命処置としてレナリドミドを投与した。遺伝子マーカーを求めるために必要に応じて、診断試料の解析内で、再発前の最後のサイクルの解析（ＴＰ７、２０２０年３月３０日での処置サイクル６）を、本実施例に記載する。

【0175】

ｉｉ）試料からのｃｆＤＮＡの抽出と定量化
末梢血ｃｆＤＮＡ抽出をＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ＭＤｘ機器（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｂｅｒｉｃａ，ＳＬ）上で行い、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ＷＡ，ＵＳＡ）上で定量化した。診断試料は、溶出体積３０μＬで１２ｎｇ／μＬを提示した。ＴＰ７は、溶出体積３０μＬで３ｎｇ／μＬを提示した（ＴＰ７で得られたｃｆＤＮＡの総量＝６５ｎｇ）。

【0176】

ｉｉｉ）診断時の遺伝子マーカーの判定
ＭＲＤの存在をさらに追跡するための遺伝子マーカーを定めることを目的として、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびその他の種類のリンパ腫の対象において頻繁に突然変異する複数の遺伝子のリンパ腫特異的パネルを用いて、カスタム次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による診断時に突然変異プロファイルスクリーニングを行った（表５を参照。ＮＧＳシーケンシングに関して前記骨髄腫パネルに含まれる遺伝子とこれが位置する染色体、前記パネルが各遺伝子に対して含むアンプリコンの数、パーセンテージで表されるアンプリコンすべてを包含する遺伝子の領域、およびエクソンの数が示されている）。ｃｆＤＮＡ診断試料ＴＰ１のライブラリ調製とＮＧＳシーケンシングは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．の定める標準プロトコルに従い、前記リンパ腫パネルを使用して行った。

【0177】

【表5-1】

【0178】

【表5-2】

【0179】

ｉｖ）ＭＲＤレベルの定量化と実験感度（ＥＳ）の判定
遺伝子マーカーを選択するための突然変異スクリーニング後、１つの癌特異的（体細胞）突然変異を検出し、これには５７％のＶＲＦを伴うＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ 上に１つのフレームシフト挿入（インデル）が含まれていた。続いて、診断時に検出したこの癌特異的突然変異を追跡診断において試験した。

【0180】

予め、実験工程としてＤＮＡ増幅、ライブラリ調製、およびシーケンシングを含むプロトコル（図４）を、以下のように確立した。
（ａ）これら２つの突然変異を包含する特定のプライマーを表Ｘから選択し、これを使用して時点ＴＰ７にて患者試料から得た６５ｎｇのｃｆＤＮＡを増幅させ、サイクル６の処置後に採取した。ＰＣＲ増幅に使用したｃｆＤＮＡの量により、エラー補正アルゴリズムの第１のパラメータｍｉｎＶＲＦを次のように求めることが可能となった：
ｍｉｎＶＲＦ＝［二倍体細胞あたり６．４９×１０^－３ｎｇのＤＮＡ］／［ＰＣＲ増幅に使用したｃｆＤＮＡの量（ｎｇ）
＝６．４９×１０^－３／６５ｎｇのｇＤＮＡ
＝１．０×１０^－４
（ｂ）ｃｆＤＮＡは、選択したプライマーとＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いた第１のＰＣＲにより、次の条件で増幅させた：最初の変性では９４℃で６０秒、続く変性では９４℃で１５秒を３５サイクル、アニーリングでは５８℃で３０秒、および伸張では６８℃で３０秒。最終体積は１００μＬ（７９．６μＬのＤＮＡ－Ｈ_２Ｏ、１０μＬの１０×高忠実度ＰＣＲ緩衝液、４μＬの５０ｎＭ ＭｇＳＯ_４、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（ＮＺＹＴｅｃｈ，Ｌｄａ，Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇａｌ）、０．４μＬのＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、２μＬの１０μＭフォワードプライマー、および２μＬの１０μＭリバースプライマーであった。
（ｃ）ライブラリは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）用のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて構築した。増幅したＤＮＡおよび増幅したライブラリの両方に関する最終産物の特異性と定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。
（ｄ）最後に、推計１万の読取り深さをもってＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｙｓｔｅｍプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）上でライブラリを配列決定し、ｆａｓｔｑファイルを作成した。これらのファイルを、標的突然変異配列および野生型配列を絶対値で特異的に検出する、本発明で利用されるＭＲＤレベルを定量化する方法により解析した。Ｅｎｓｅｍｂｌ ｐｅｒｌ ＡＰＩを使用して、突然変異配列とｗｔ配列を、４０ｂｐで境界を付けたＦＡＳＴＡ形式で位置づけた。最後に、名称識別子、実行およびバーコード識別子、染色体位置、変異体、調査されたＦＡＳＴＡでの特異的配列（突然変異フォワード、突然変異リバース、ｗｔ（野生型）フォワード、およびｗｔリバース）、これらそれぞれの絶対値での数と比（突然変異／ｗｔ）を伴う．ｃｓｖファイルを得た。
（ｅ）この対象において検出したＫＲＡＳにおけるもののようなインデル、または免疫グロブリン再構成に関するａｖＰｏｓパラメータは、同じ位置かつ同じ順序で代替的な突然変異配列を正確に有している可能性がほぼ０であるため、本方法では算出も考慮も必要ない。
（ｆ）この対象において検出したＫＲＡＳにおけるもののようなインデル、または免疫グロブリン再構成に関するａｖＭｕｔパラメータは、同じ位置かつ同じ順序で代替的な突然変異配列を正確に有している可能性がほぼ０であるため、本方法では算出も考慮も必要ない。
（ｇ）工程（ａ）～（ｅ）に記載したものと同じ手法を、分子の５０％に存在する突然変異を伴う初期の市販のＤＮＡのうち試験中のもの（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ）から実施した１０倍希釈曲線において繰り返した。このように、最大７つの連続する１０倍希釈の希釈ライブラリを調製し、上述のように配列決定して、本明細書に記載の方法によりＤ－ｌｉｍｉｔパラメータを算出した。

【0181】

ｖ）ＮＧＳの結果の解釈
時点ＴＰ７でのＫＲＡＳ Ｇ１２ＡマーカーのＥＳは、上記のように算出した４つのパラメータのうち高いもの、すなわちｍｉｎＶＲＦにより定め、これにより、ＥＳ_{（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ）}＝１．０×１０^－４である。本対象における同じ時点で同じマーカーについて算出したＭＲＤレベルは、ＭＲＤ_{（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ）}＝５．５×１０^－１であった。本マーカーではＥＳ＜ＭＲＤであったため、この対象におけるこの時点でのＭＲＤ状態は、ＭＲＤ陽性である。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9-1】

【図9-2】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13A】

【図】

【図13B】

【図】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【図13I】

【図13J】

【図13K】

【図13L】

【図13M】

【図13N】

【図13O】

【図13P】

【図13Q】

【図13R】

【図13S】

【図13T】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【国際調査報告】