▶ ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-25
(54)【発明の名称】腫瘍浸潤リンパ球の活性化及び増殖方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20230118BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230118BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230118BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20230118BHJP
A61P 37/04 20060101ALN20230118BHJP
A61K 35/17 20150101ALN20230118BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N5/10 ZNA
C12N15/09 110
A61P35/00
A61P37/04
A61K35/17 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022530237
(86)(22)【出願日】2020-11-24
(85)【翻訳文提出日】2022-07-22
(86)【国際出願番号】 US2020062094
(87)【国際公開番号】W WO2021108455
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】63/081,539
(32)【優先日】2020-09-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/940,035
(32)【優先日】2019-11-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520352311
【氏名又は名称】ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ベンソン， マイカ
(72)【発明者】
【氏名】コレッティ， ニコラス ジョン
(72)【発明者】
【氏名】トゥボ， ノア ジェイコブ
(72)【発明者】
【氏名】シュラバック， マイケル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065BB19
4B065BB40
4B065BD39
4B065BD50
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087CA04
4C087NA14
4C087NA20
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
一段階プロセスで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を活性化し増殖させる方法を提供する。フィーダー細胞を使用することなくＴＩＬを活性化し増殖させる方法もまた提供する。セントラルメモリーＴ細胞表現型が濃縮された、単離された増殖したＴＩＬの集団に加え、増殖したＴＩＬの集団の組成物もまた提供する。より合理化されたアプローチ、すなわち、一段階のアプローチ、より短い増殖期間を必要とするアプローチ、可溶性の刺激用試薬を使用するアプローチ、臨床的な製造により適したアプローチ、及びフィーダー細胞を使用しないアプローチ等を使用するＴＩＬの活性化及び増殖方法を提供する。セントラルメモリーＴ細胞表現型が豊富な単離された増殖したＴＩＬの集団に加えて、増殖したＴＩＬの集団の組成物もまた提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
解離した腫瘍サンプル中で腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を増殖させる方法であって、前記解離した腫瘍サンプルを培地中で培養することを含み、前記ＴＩＬを、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、及びＴ細胞刺激サイトカインと接触させる、前記方法。
【請求項2】
前記培地には、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で、前記Ｔ細胞刺激サイトカインが補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度が、１０Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｔ細胞刺激サイトカインが、ＩＬ－２である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記培地が、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で変更される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記培地の成分が維持される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記培地の３０％～９９％が、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で変更される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記腫瘍サンプルが、ＴＩＬの増殖用に腫瘍サンプルを以前に提出した対象に由来し、前記以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、前記ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの数が１０００ＴＩＬ未満であったものである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記腫瘍サンプルが、ＴＩＬの増殖用に腫瘍サンプルを以前に提出した対象に由来し、前記以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、前記ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの増殖倍率が５倍未満であったものである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記解離した腫瘍サンプルは、サイズが０．５～４ｍｍ３である腫瘍断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記解離した腫瘍サンプルが、消化された腫瘍断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法
【請求項12】
前記培地が、フィーダー細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記フィーダー細胞が、末梢血単核細胞または抗原提示細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記フィーダー細胞が、前記ＴＣＲアゴニスト、前記ＣＤ２８アゴニスト及び／または４－１ＢＢリガンドを発現する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＴＣＲアゴニスト、前記ＣＤ２８アゴニスト及び／または前記４－１ＢＢリガンドが、前記フィーダー細胞の表面で発現される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記フィーダー細胞が、前記ＴＣＲアゴニスト、前記ＣＤ２８アゴニスト及び／または前記４－１ＢＢリガンドを発現するように遺伝子改変される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＴＣＲアゴニストが、ＣＤ３アゴニストである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＣＤ３アゴニストが、ＯＫＴ３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＣＤ２８アゴニストが、ＣＤ８６である、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記フィーダー細胞が、抗原提示細胞である、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記抗原提示細胞が、Ｋ５６２細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記フィーダー細胞が、前記Ｔ細胞刺激サイトカインを発現するように遺伝子改変される、請求項１２～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記Ｔ細胞刺激サイトカインが、ＩＬ－２である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記培地が、フィーダー細胞を含まない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＣＤ２８アゴニストが、前記培地に溶解する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
前記ＴＣＲアゴニストが、ＣＤ３アゴニストである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＴＣＲアゴニスト及び／または前記ＣＤ２８アゴニストが、ポリマー鎖のマトリックスのコロイド懸濁液を含むナノマトリックスに連結され、各ナノマトリックスは、その最大の寸法が、１～５００ｎｍの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記ＴＣＲアゴニスト及び前記ＣＤ２８アゴニストが、同じポリマー鎖に結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ＴＣＲアゴニスト及び前記ＣＤ２８アゴニストが、異なるポリマー鎖に結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記ＴＣＲアゴニストが、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで前記ナノマトリックスに結合している、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記ＴＣＲアゴニストが、連結された２つの抗ＣＤ３抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＣＤ２８アゴニストが、連結された２つの抗ＣＤ２８抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む、請求項１～２６及び３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記培地が、ＣＤ２アゴニストを含む、請求項１～２６、３１、及び３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＣＤ２アゴニストが、連結された２つの抗ＣＤ２抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を増殖させる方法であって、前記ＴＩＬの集団を、ポリマー鎖のマトリックスのコロイド懸濁液を含むナノマトリックスと接触させることを含み、前記マトリックスが、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストに結合し、前記ナノマトリックスが、前記ＴＩＬの集団に活性化シグナルを提供し、それにより、前記ＴＩＬの集団を活性化してその増殖を誘導し、各マトリックスは、その最大の寸法が、１～５００ｎｍの長さであり、前記ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない、前記方法。
【請求項36】
前記ナノマトリックスと接触する前記ＴＩＬの集団が、さらに腫瘍細胞を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記ＴＩＬの集団が、対象から単離され、前記ナノマトリックスと接触し、前記ＴＩＬの集団を前記ナノマトリックスと接触させる前に前記ＴＩＬの集団のさらなる増殖プロセスを含まない、請求項３５または３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記ＣＤ３アゴニスト及び前記ＣＤ２８アゴニストが、同じポリマー鎖に結合している、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記ＣＤ３アゴニスト及び前記ＣＤ２８アゴニストが、異なるポリマー鎖に結合している、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ＣＤ３アゴニストが、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで前記ナノマトリックスに結合している、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記ナノマトリックスが、さらに、前記ポリマー鎖のマトリックス間にまたはその中に埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を含む、請求項２７～３０及び３５～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記ポリマー鎖のマトリックスが、デキストランのポリマーを含む、請求項２７～３０及び３５～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記ポリマー鎖が、コロイドポリマー鎖である、請求項２７～３０及び３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比が、１：５以上である、請求項２７～３０及び３５～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
マトリックスとＴＩＬの数の比が、１：５００以上である、請求項２７～３０及び３５～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記ＣＤ２８アゴニストが、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで前記ナノマトリックスに結合している、請求項２７～３０及び３５～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記アゴニストが、組み換えアゴニストである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記アゴニストが、抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項49】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記ＣＤ３アゴニストが、ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１である、請求項２７～３０及び３５～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記増殖させるＴＩＬが、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、、前記以前のＴＩＬの増殖が、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、前記ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの数が１０００ＴＩＬ未満であったものである、請求項３５～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記増殖させるＴＩＬが、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、、前記以前のＴＩＬの増殖が、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、前記ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの増殖倍率が５倍未満であったものである、請求項３５～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
ＴＩＬの集団を増殖させる方法であって、前記ＴＩＬの集団を、第一、第二、及び第三の可溶性単一特異性複合体を含む組成物と接触させることを含み、各可溶性単一特異性複合体が、連結された２つの抗体またはその断片を含み、各可溶性単一特異性複合体の各抗体またはその断片が、前記ＴＩＬの集団の同じ抗原に特異的に結合し、前記第一の可溶性単一特異性複合体が、抗ＣＤ３抗体を含み、前記第二の可溶性単一特異性複合体が、抗ＣＤ２８抗体を含み、前記第三の可溶性単一特異性複合体が、抗ＣＤ２抗体を含み、前記ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない、前記方法。
【請求項54】
前記組成物と接触する前記ＴＩＬの集団が、さらに腫瘍細胞を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記ＴＩＬの集団が、対象から単離され、前記組成物と接触し、前記ＴＩＬの集団を前記組成物と接触させる前に前記ＴＩＬの集団のさらなる増殖プロセスを含まない、請求項５３または５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記可溶性単一特異性複合体は、濃度が０．２～２５μｌ／ｍｌである、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記可溶性単一特異性複合体が、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）である、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
各ＴＡＣが、第一の動物種由来の２つの抗体を含み、これらが、前記第一の動物種由来の抗体のＦｃ部分に特異的に結合する第二の種由来の２つの抗体分子によって結合されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記抗ＣＤ３抗体が、ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１である、請求項５３～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記増殖させるＴＩＬが、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、前記以前のＴＩＬの増殖が、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、前記ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの数が１０００ＴＩＬ未満であったものである、請求項５３～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記増殖させるＴＩＬが、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、、前記以前のＴＩＬの増殖が、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、前記ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの増殖倍率が５倍未満であったものである、請求項５３～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
さらに、前記ＴＩＬの集団を、前記サイトカインＩＬ－２と接触させることを含む、請求項３５～４０及び５３～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
前記ＴＩＬを、前記サイトカインＩＬ－２と、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で接触させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記サイトカインＩＬ－２の最終濃度が、１００Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項65】
前記ＴＩＬを、最大９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日間増殖させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記ＴＩＬを、９～２５日間、９～２１日間、または９～１４日間増殖させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記ＴＩＬを、５００～５００，０００倍増殖させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
前記ＴＩＬの集団を、１００～１００，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
前記ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１，５００倍増殖させる、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１００，０００倍増殖させる、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１５，０００倍増殖させる、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大５００，０００倍増殖させる、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記ＴＩＬの集団の成員が、遺伝子改変される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項74】
前記ＴＩＬの集団の成員が、遺伝子調節系によって改変される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項75】
前記ＴＩＬの集団の前記成員が、ＲＮＡ干渉を使用して改変される、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記ＴＩＬの集団の前記成員が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して改変される、請求項７４に記載の方法。
【請求項77】
前記ＴＩＬの集団の前記成員が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して改変される、請求項７４に記載の方法。
【請求項78】
前記ＴＩＬの集団の前記成員が、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用して改変される、請求項７４に記載の方法。
【請求項79】
前記ＴＩＬの集団の成員が、Ｃａｓ酵素及び少なくとも１つのガイドＲＮＡを使用して改変される、請求項７４に記載の方法。
【請求項80】
前記Ｃａｓ酵素が、Ｃａｓ９である、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記ＴＩＬの集団の成員が、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択される１つ以上の遺伝子において改変される、請求項７４～８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項82】
前記１つ以上の遺伝子における改変が、１つ以上の核酸の挿入、欠失、または変異である、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記１つ以上の遺伝子における改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項８１または８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項84】
前記ＴＩＬの集団の成員が、エピジェネティックに改変される、請求項７４に記載の方法。
【請求項85】
前記エピジェネティックな改変が、ヒストン修飾である、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記ＴＩＬの集団の成員が、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択される１つ以上の遺伝子において改変される、請求項８４に記載の方法。
【請求項87】
前記１つ以上の遺伝子における改変が、１つ以上の核酸のメチル化である、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記１つ以上の遺伝子における改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項８６または８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項89】
前記ＴＩＬの集団の成員が、ＳＯＣＳ１遺伝子において改変される、請求項８６～８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項90】
前記ＳＯＣＳ１遺伝子の前記改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
前記ＴＩＬの集団の成員が、複数の遺伝子において改変される、請求項７４～９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項92】
前記ＴＩＬの集団の成員が、前記ＳＯＣＳ１遺伝子及びＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、ＮＦＫＢＩＡからなる群から選択される１つ以上のさらなる遺伝子において改変される、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
前記ＴＩＬの集団の成員が、前記ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子において改変される、請求項９１に記載の方法。
【請求項94】
前記ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の前記改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
前記ＴＩＬの集団の成員が、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢ遺伝子において改変される、請求項９１に記載の方法。
【請求項96】
前記ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢ遺伝子の前記改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項９３に記載の方法。
【請求項97】
前記ＴＩＬの集団の成員が、前記ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１遺伝子において改変される、請求項９１に記載の方法。
【請求項98】
前記ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１遺伝子の前記改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項９３に記載の方法。
【請求項99】
前記ＴＩＬの集団の成員が、前記ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡ遺伝子において改変される、請求項９１に記載の方法。
【請求項100】
前記ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡ遺伝子の前記改変により、前記遺伝子の発現及び／または前記遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される、請求項９３に記載の方法。
【請求項101】
前記ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖したＴＩＬの集団の少なくとも１０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する前記増殖した集団を産生する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項102】
前記ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖したＴＩＬの集団の少なくとも１５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する前記増殖した集団を産生する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項103】
前記ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖したＴＩＬの集団の５～５０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する前記増殖した集団を産生する、請求項１～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項104】
前記ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖したＴＩＬの集団の１０～２５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する前記増殖した集団を産生する、請求項１～１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項105】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法によって産生される増殖したＴＩＬの集団を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０，０３５号及び２０２０年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８１，５３９号の優先権を主張するものであり、当該出願の各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０，０３５号及び２０２０年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０８１，５３９号の優先権を主張するものであり、当該出願の各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、リンパ球集団、特に、腫瘍浸潤リンパ球の活性化及び増殖方法に関する。
【背景技術】
【0003】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入は、特に、予後不良患者において、巨大な難治性がんの治療に対する強力なアプローチである。免疫療法を成功させるためには、多数のＴＩＬが必要であり、強力かつ確実な拡大のためのプロセスが必要とされる。通常は、ＩＬ－２ベースのＴＩＬ増殖「ｐｒｅ－ＲＥＰ」に続いて「急速増殖プロトコル」（ＲＥＰ）を含む多段階プロセスが、治療有効数のＴＩＬを生成するその能力のためにＴＩＬ増殖用の好ましい方法となっているが、該プロセスは時間がかかるため、依然として制限がある。最大６週間続き得るｐｒｅ－ＲＥＰ段階の後、ＲＥＰにより、１４日間かけてＴＩＬの１，０００倍の増殖がもたらされ得る。ＲＥＰは、大量の抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及びＩＬ－２を必要とすることに加えて、ＴＩＬを活性化するために大過剰（例えば、２００倍）のフィーダー細胞を必要とする困難なプロセスである。
【0004】
現在存在するＲＥＰベースのＴＩＬの増殖方法の最も困難な側面の１つは、フィーダー細胞の獲得及び使用の必要性である。これらのＲＥＰベースの方法では、ＴＩＬの活性化は、フィーダー細胞の存在に左右される。フィーダー細胞の集団は、通常、同種異系の３～５ドナーから採集されるため、フィーダー細胞の集団の採集、照射、及び維持のプロセスの制御を高価かつ困難なものにしている。従って、フィーダー細胞の使用が高価かつ困難であるにもかかわらず、ＴＩＬの活性化及び増殖プロセスにはそれらが必須であると考えられている。
【0005】
従って、より合理化されたＴＩＬの増殖方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
より合理化されたアプローチ、すなわち、一段階のアプローチ、より短い増殖期間を必要とするアプローチ、可溶性の刺激用試薬を使用するアプローチ、臨床的な製造により適したアプローチ、及びフィーダー細胞を使用しないアプローチ等を使用するＴＩＬの活性化及び増殖方法を提供する。セントラルメモリーＴ細胞表現型が豊富な単離された増殖したＴＩＬの集団に加えて、増殖したＴＩＬの集団の組成物もまた提供する。
【0007】
本明細書に開示するように、意外にも、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト（例えば、ＣＤ３アゴニスト）及びＣＤ２８アゴニストの組み合わせを使用して、フィーダー細胞の非存在下でＴＩＬを活性化すること及び増殖させることができることが分かった。該ＴＣＲアゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、互いに連結もしくは複合化された、またはナノマトリックスに連結された抗体であり得る。驚くべきことに、本明細書に記載のフィーダー細胞を含まないＴＩＬの活性化及び増殖プロセスにより、１５０，０００倍のＴＩＬの増殖がもたらされ得るとともに、セントラルメモリーＴ細胞表現型が豊富になり得る。驚くべきことに、本明細書に記載のフィーダー細胞を含まないＴＩＬの活性化及び増殖プロセスはまた、一段階プロセスの１４日目までに、４，０００～１００，０００倍の増殖がもたらされ得る。この強力な増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ条件下で増殖しなかった複数のドナー由来のサンプルでも観察された。従って、本明細書に記載のプロセスは、現在の実務基準である２段階のＴＩＬの増殖方法が失敗する状況で、増殖したＴＩＬの生成が可能である。
【0008】
本明細書に開示するように、意外にも、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階及びＲＥＰ段階を分ける必要性をなくす一段階プロセスを使用して、ＴＩＬを活性化すること及び増殖させることができることも分かった。
【0009】
１つの態様では、本発明は、解離した腫瘍サンプル中でＴＩＬの集団を増殖させる方法に関し、該方法は、該解離した腫瘍サンプルを培地中で培養することを含み、該ＴＩＬを、その中でＴＣＲアゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、及びＴ細胞刺激サイトカインと接触させる。
【0010】
いくつかの実施形態では、該培地には、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で、Ｔ細胞刺激サイトカインが補充される。
【0011】
いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、１０Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、該培地は、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で変更される。
【0012】
いくつかの実施形態では、該培地の成分は、維持される。いくつかの実施形態では、該培地の３０％～９９％は、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で変更される。
【0013】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、以前に失敗したｐｒｅ－ＲＥＰ増殖からＴＩＬサンプルを取り返すことができる。いくつかの実施形態では、該腫瘍サンプルは、ＴＩＬの増殖用に腫瘍サンプルを以前に提出した対象に由来し、該以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの数が１０００ＴＩＬ未満であったものである。いくつかの実施形態では、該腫瘍サンプルは、ＴＩＬの増殖用に腫瘍サンプルを以前に提出した対象に由来し、該以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの増殖倍率が５倍未満であったものである。
【0014】
いくつかの実施形態では、該解離した腫瘍サンプルは、サイズが０．５～４ｍｍ３の腫瘍断片を含む。いくつかの実施形態では、該解離した腫瘍サンプルは、消化された腫瘍断片を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、該培地は、フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、末梢血単核細胞または抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト及び／または４－１ＢＢアゴニストを発現する。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト及び／または該４－１ＢＢアゴニストは、該フィーダー細胞の表面で発現される。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、該ＴＣＲアゴニスト、該ＣＤ２８アゴニスト及び／または該４－１ＢＢリガンドを発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、ＣＤ３アゴニストである。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニストは、ＯＫＴ３である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、該抗原提示細胞は、Ｋ５６２細胞を含む。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、該ＴＣＲアゴニスト及び／または４－１ＢＢアゴニストを発現する。いくつかの実施形態では、該４－１ＢＢアゴニストは、４－１ＢＢリガンドである。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、Ｔ細胞刺激サイトカインを発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインは、ＩＬ－２である。
【0016】
いくつかの実施形態では、該培地は、フィーダー細胞を含まない。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、該培地に溶解する。
【0017】
いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、ＣＤ３アゴニストである。
【0018】
いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト及び／または該ＣＤ２８アゴニストは、ポリマー鎖のマトリックスのコロイド懸濁液を含むナノマトリックスに連結され、各ナノマトリックスは、その最大の寸法が、１～５００ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、同じポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、異なるポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。
【0019】
いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、連結された２つの抗ＣＤ３抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、連結された２つの抗ＣＤ２８抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む。いくつかの実施形態では、該培地は、ＣＤ２アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２アゴニストは、連結された２つの抗ＣＤ２抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む。
【0020】
別の態様では、本発明は、ＴＩＬの集団を、ポリマー鎖のマトリックスのコロイド懸濁液を含むナノマトリックスと接触させることを含むＴＩＬの集団を増殖させる方法に関し、該マトリックスは、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストに結合し、該ナノマトリックスは、該ＴＩＬの集団に活性化シグナルを提供し、それにより、該ＴＩＬの集団を活性化してその増殖を誘導し、各マトリックスは、その最大の寸法が、１～５００ｎｍの長さであり、該方法は、該ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない。
【0021】
いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスと接触するＴＩＬの集団は、さらに腫瘍細胞を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、対象から単離され、該ナノマトリックスと接触し、該ＴＩＬの集団を該ナノマトリックスと接触させる前には該ＴＩＬの集団のさらなる増殖プロセスを含まない。
【0023】
いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、同じポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、異なるポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニストは、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。
【0024】
いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、さらに、該ポリマー鎖のマトリックス間にまたはその中に埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、該ポリマー鎖のマトリックスは、デキストランのポリマーを含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、該ポリマー鎖は、コロイドポリマー鎖である。
【0027】
いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００または１：５００である。
【0028】
いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該アゴニストは、組み換えアゴニストである。いくつかの実施形態では、該アゴニストは、抗体である。いくつかの実施形態では、該アゴニストは、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニストは、ＯＫＴ３またはＵＣＨＴ１である。
【0029】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、以前に失敗したｐｒｅ－ＲＥＰ増殖からＴＩＬサンプルを取り返すことができる。いくつかの実施形態では、増殖させるＴＩＬは、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、該以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの数が１０００ＴＩＬ未満であったものである。いくつかの実施形態では、該増殖させるＴＩＬは、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、該以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの増殖倍率が５倍未満であったものである。
【0030】
別の態様では、本発明は、ＴＩＬの集団を、第一、第二、及び第三の可溶性単一特異性複合体を含む組成物と接触させることを含むＴＩＬの集団を増殖させる方法に関し、各可溶性単一特異性複合体は、連結された２つの抗体またはその断片を含み、各可溶性単一特異性複合体の各抗体またはその断片は、該ＴＩＬの集団の同じ抗原に特異的に結合し、該第一の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ３抗体を含み、該第二の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ２８抗体を含み、該第三の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ２抗体を含み、該方法は、該ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない。
【0031】
いくつかの実施形態では、該組成物と接触するＴＩＬの集団は、さらに腫瘍細胞を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、対象から単離され、該組成物と接触し、該ＴＩＬの集団を該組成物と接触させる前には該ＴＩＬの集団のさらなる増殖プロセスを含まない。
【0033】
いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が０．２～２５μｌ／ｍｌである。
【0034】
いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）である。いくつかの実施形態では、各ＴＡＣは、第一の動物種由来の２つの抗体を含み、これらが、該第一の動物種由来の抗体のＦｃ部分に特異的に結合する第二の種由来の２つの抗体分子によって結合されている。
【0035】
いくつかの実施形態では、該抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３抗体またはＵＣＨＴ１抗体である。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、該ＴＩＬの集団をサイトカインＩＬ－２と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、１日、２日、３日、４日、５日、及び６日からなる群から選択される間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、１００Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである。
【0036】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、以前に失敗したｐｒｅ－ＲＥＰ増殖からＴＩＬサンプルを取り返すことができる。いくつかの実施形態では、増殖させるＴＩＬは、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、該以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの数が１０００ＴＩＬ未満であったものである。いくつかの実施形態では、該増殖させるサンプルは、増殖用にＴＩＬのサンプルを以前に提出した対象に由来し、該以前のＴＩＬの増殖は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含み、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から単離されたＴＩＬの増殖倍率が５倍未満であったものである。
【0037】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、９～２５日間、９～２１日間、または９～１４日間増殖させる。
【0038】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、５００～５００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、１００～１００，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、増殖から１４日目の時点で少なくとも１，５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、増殖から１４日目の時点で最大１００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、増殖から２１日目の時点で少なくとも１５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、増殖から２１日目の時点で最大５００，０００倍増殖させる。
【0039】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、遺伝子改変される。
【0040】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、遺伝子調節系で改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＲＮＡ干渉を使用して改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用して改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して改変される。１つの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用して改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、Ｃａｓ酵素及び少なくとも１つのガイドＲＮＡを使用して改変される。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９である。
【0041】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択される１つ以上の遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡからなる群から選択される１つ以上の遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該１つ以上の遺伝子における改変は、１つ以上の核酸の挿入、欠失、または変異である。いくつかの実施形態では、該１つ以上の遺伝子における改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、エピジェネティックに改変される。いくつかの実施形態では、該エピジェネティックな改変は、ヒストン修飾である。
【0042】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択される１つ以上の遺伝子において改変される。該１つ以上の遺伝子における改変は、１つ以上の核酸のメチル化である。いくつかの実施形態では、該１つ以上の遺伝子における改変は、１つ以上の核酸のメチル化である。いくつかの実施形態では、該１つ以上の遺伝子における改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。
【0043】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１遺伝子の改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。
【0044】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、複数の遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡからなる群から選択される２つ以上の遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該２つ以上の遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１遺伝子及び１つ以上のさらなる遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＰＴＰＮ２、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１またはＮＦＫＢＩＡからなる群から選択される１つ以上のさらなる遺伝子において改変される。特定の実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２遺伝子の改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢ遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢ遺伝子の改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１遺伝子の改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡ遺伝子において改変される。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの改変により、当該遺伝子の発現及び／または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能が低減もしくは阻害される。
【0045】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の５～５０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の１０～２５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。
【0046】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示する方法のいずれかによって産生される増殖したＴＩＬの集団を含む組成物に関する。
【0047】
本発明の前述の及び他の特徴及び利点は、添付の図面と合わせて以下の例示的な実施形態の詳細な説明からさらに十分に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】フィーダー細胞を使用するＴＩＬ産生のワークフローを示す略図である。
【図2】ＴＩＬの４つの製造方法を示す略図である。方法１（フィーダー細胞を使用するがｐｒｅ－ＲＥＰ段階を使用しない一段階ＲＥＰ（「ＲＥＰ様」）、方法２（抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体コンジュゲートＤｙｎａｂｅａｄｓを使用する（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」）、方法３（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、及び抗ＣＤ２８抗体ベースの四量体抗体複合体（ＴＡＣ）を使用する（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）、及び方法４（抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体コンジュゲートナノマトリックスを使用する（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）。
【図3】Ａは、１４日目のＴＩＬの増殖倍率を示すプロットを示す。Ｂは、２１日目のＴＩＬの増殖倍率を示すプロットを示す。各図のパネルにおいて、各々のドットは、独立した黒色腫ドナーを表す。方法１（ＲＥＰ様）、方法２（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェル）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）、及び対照（ＩＬ－２単独）を使用して生成したデータを示す。
【図4】細胞計数のためのゲーティング戦略を示す一連のＦＡＣＳ分析を示す。
【図5】Ａは、０、９、及び１４日目の培養中のＣＤ３＋Ｔ細胞である生細胞のパーセンテージを示すプロットを示す。Ｂは、１４日目のセントラルメモリー表現型（Ｔｃｍ、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＯ＋として定義される）を有するＴ細胞のパーセンテージを示すプロットを示す。方法１（ＲＥＰ様）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）、及び対照（ＩＬ－２単独）を使用して生成したデータを示す。
【図6】独立した３ドナー由来のセントラルメモリーＴ細胞表現型の１４日目のパーセンテージを示す一連のＦＡＣＳ分析を示す。
【図7】独立した３ドナー由来のＴＩＬ汎Ｔ細胞の増殖のＦＡＣＳ計数ビーズ分析を使用した１４日目の増殖倍率を示す棒グラフを示す。
【図8】合わせたドナー由来のＴＩＬ汎Ｔ細胞の増殖のＦＡＣＳ計数ビーズ分析を使用した１４日目の増殖倍率を示す棒グラフを示す。方法１（ＲＥＰ様）、方法２（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェル）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）、及び対照（ＩＬ－２単独）を使用して生成したデータを示す。
【図9】独立した３ドナー由来のＴＩＬ汎Ｔ細胞の増殖のＦＡＣＳ計数ビーズ分析を使用した２１日目の外挿の増殖倍率を示す棒グラフを示す。方法１（ＲＥＰ様）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、及び方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）を使用して生成したデータを示す。
【図10】播種密度の関数として、培養０日目に対する１４日目での経時的な増殖倍率を示すプロットを示す。
【図11】方法１（ＲＥＰ様）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、及び方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）を使用して産生されたＴＩＬドナーサンプル中のＩＦＮγ（Ａ）、ＩＬ－２（Ｂ）、ＩＬ－６（Ｃ）及びＴＮＦα（Ｄ）の発現の誘導倍率を示す棒グラフを示す。
【図12】電気穿孔の８日後のＴＩＬのＣＤ４５編集パーセント及び生存率を示す。このＴＩＬは、方法１（ＲＥＰ様）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、または方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）を使用して増殖させた。
【図13】方法１（ＲＥＰ様または「ＲＥＰ」）、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌまたは「Ｓｔｅｍ」）、方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔまたは「Ｔｒａｎｓ」）、方法５（ａＡＰＣ－ＯＫＴ３または「ＯＫＴ３」）、及び方法６（ａＡＰＣ－ＯＫＴ３－ＣＤ８６または「ＯＫＴ３＋ＣＤ８６」）を使用した、１０日目または１１日目の可溶性四量体及びａＡＰＣに関する増殖倍率を示す棒グラフを示す。
【図14】可溶性四量体及びａＡＰＣ編集ＴＩＬに関する１８日目（Ｄ３３９９）または２３日目（Ｄ６７５２及びＤ６７５５）の増殖倍率を示す棒グラフを示す。
【図15】編集されたＴＩＬに関する１８日目（Ｄ３３９９）または２３日目（Ｄ６７５２及びＤ６７５５）のセントラルメモリー表現型を示す棒グラフを示す。
【図16】１８日目（Ｄ３３９９）または２３日目（Ｄ６７５２及びＤ６７５５）の編集頻度の表を示す。
【図17】１４日目または２０日目のＴＩＬの腫瘍断片の外挿の細胞数を示す棒グラフを示す。
【図18】１４日目または２０日目のセントラルメモリー表現型（％）を示す棒グラフを示す。
【図19】１４日目または２０日目の編集頻度の表を示す。
【図20】１４日目または２０日目の編集頻度の表を示す。
【図21】腫瘍断片及び消化物から調製した異なるドナー由来のＴＩＬの生存率を示す棒グラフを示す。
【図22】腫瘍断片及び消化物から調製した異なるドナー由来のＴＩＬに関する細胞数を示す棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0049】
ＴＩＬの従来の活性化及び増殖プロセスは、少なくとも別々のｐｒｅ－ＲＥＰ段階及びＲＥＰ段階を含む複数の段階に加えて、フィーダー細胞の使用が必要である。両方の必要条件が、この従来のプロセスを時間及び費用のかかるものにしている。ＴＩＬの養子移入を使用する免疫療法を必要とする患者は、多くの場合、極めて予後不良であり、治療に利用可能な増殖及び分化したＴＩＬの集団をより迅速に有することは、生死の問題を構成し得る。
【0050】
概して遅いｐｒｅ－ＲＥＰ段階の後、概して速いＲＥＰ段階を行って、治療的使用に十分なＴＩＬの活性化及び増殖倍率を達成する必要性は、ともに時間及び費用がかかる。ある特定の用途では、従来法のｐｒｅ－ＲＥＰ段階は、２～６週間続く可能性があり、さらに１～３週間のＲＥＰを伴う。従って、フィーダー細胞の使用の有無にかかわらず、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を排除し、ＴＩＬの製造プロセスを一段階に合理化することが必要である。
【0051】
フィーダー細胞への依存は、特に少なくともいくつかの理由で困難である。第一に、生存能力のあるフィーダー細胞集団を得ることは、該細胞が同種異系の３～５ドナーから採取されるために極めて困難である。ドナー細胞の各集団は、ＴＩＬを増殖させるその能力について、個別に特定しなければならないため、このフィーダー細胞の異種供給源が、それらの使用を標準化できなくする。同様に、フィーダー細胞に固有のばらつきのため、フィーダー細胞を使用するＴＩＬの増殖は、再現性が低く予測しにくくなる。第二に、フィーダー細胞を使用する場合、ＴＩＬはフィーダー細胞の存在下では操作することができないため、ＴＩＬは、ＲＥＰ相の間ではなく、その前または後にのみ、操作または遺伝子改変され得る。第三に、ＲＥＰ段階を含むＴＩＬの製造方法では、フィーダー細胞が死滅するまで増殖したＴＩＬの集団を使用することができないため、ＲＥＰを短縮することはできない。第四に、ＴＩＬを刺激するためのフィーダー細胞の使用により、該刺激剤を洗い落とすこと及び／または除去することができなくなる。従って、場合によっては、従来のプロセスのｐｒｅ－ＲＥＰ及びＲＥＰ段階では、所望の数のＴＩＬを産生することができない。少なくとも上記の４つの理由で、フィーダー細胞への依存を排除する必要があり、これが、本発明で達成されたことであり、本明細書に開示される。フィーダー細胞を排除することで、ＴＩＬの増殖プロセスの高度な制御が可能になる。例えば、ＴＩＬの増殖プロセスを、必要数のＴＩＬが得られた時点で停止することができる。
【0052】
ＴＩＬを産生するための改善されたより速く単純な方法を提供するため、本開示は、より合理化されたアプローチ、すなわち、一段階のアプローチ、より短い増殖期間を必要とするアプローチ、可溶性の刺激用試薬を使用するアプローチ、及びフィーダー細胞を使用しないアプローチ等を使用するＴＩＬの活性化及び増殖方法を提供する。セントラルメモリーＴ細胞表現型が豊富な単離された増殖したＴＩＬの集団に加えて、増殖したＴＩＬの集団の組成物もまた提供する。
【0053】
いくつかの態様では、本開示は、フィーダー細胞を使用しない一段階プロセスでＴＩＬを活性化し増殖させる方法に関し、活性化は、ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストとの接触を介して生じる。ある特定の実施形態では、該ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストは、ポリマー鎖のナノマトリックスに結合している。ある特定の実施形態では、該ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストは、互いに連結または複合化された、抗体またはその断片である。ある特定の実施形態では、該増殖したＴＩＬは、フィーダー細胞ベースの方法を使用して単離されるＴＩＬよりセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する細胞のパーセンテージが高い。ある特定の実施形態では、該方法は、さらに、少なくとも１つの４－１ＢＢアゴニストを使用するＴＩＬの活性化を含む。いくつかの実施形態では、該４－１ＢＢアゴニストは、４－１ＢＢリガンドである。
【0054】
いくつかの態様では、本開示は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階ならびに別々の急速増殖プロトコル（「ＲＥＰ」）及びｐｒｅ－ＲＥＰの必要性をなくす一段階プロセスで、ＴＩＬを活性化し増殖させる方法に関する。
【0055】
通常、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。本明細書に提供する方法及び技術は、別段の指示がない限り、一般に、当技術分野で周知の従来法に従って、及び本明細書を通して引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参照に記載の通りに行われる。酵素反応及び精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるように、または本明細書に記載の通り、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品及び薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの検査法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用される。化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の治療には、標準的な技術が使用される。
【0056】
本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。潜在的な曖昧性の場合には、本明細書に提供する定義がいかなる辞書的定義にも外部定義にも優先される。文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。特に明記しない限り、「または」の使用は、「及び／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定するものではない。
【0057】
本明細書で使用される、「約」及び「およそ」という用語は、所与の値または範囲の５％以内である値を指す。
【0058】
本明細書で使用される、「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」という表現は、対象の血流を離れて腫瘍内に移行したリンパ球の集団を指す。ＴＩＬとしては、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＩＬは、一次及び二次ＴＩＬの両方を含む。「一次ＴＩＬ」とは、本明細書で説明する患者の組織サンプルから得られるものであり（「新たに採取したもの」と呼ばれることがある）、「二次ＴＩＬ」とは、本明細書で論じる通りに増殖させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）または増殖させた（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ）任意のＴＩＬ細胞集団であり、バルクＴＩＬ及び増殖したＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」または「ｐｏｓｔ－ＲＥＰ ＴＩＬ」）を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、一次ＴＩＬは、患者の末梢血から得られる腫瘍反応性Ｔ細胞を含む。ＴＩＬ細胞集団は、遺伝子改変されたＴＩＬを含み得る。「ＴＩＬ」はまた、対象の血流を離れ、腫瘍内に移行し、その後再度離れて血流に入ったリンパ球の集団も指す。
【0059】
本明細書で使用される、「細胞の集団」または「ＴＩＬの集団」という表現は、共通の特徴を共有する複数の細胞またはＴＩＬを指す。一般に、集団は、概して１×１０６～１×１０１０個の範囲であり、異なるＴＩＬの集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での一次ＴＩＬの初期成長により、おおよそ１×１０７細胞のバルクＴＩＬ集団を得ることができる。ＲＥＰ増殖は、一般に、注入用の１．５×１０９～１．５×１０１０細胞の集団を提供するために行われる。
【0060】
本明細書で使用される、「ＴＩＬの集団を増殖させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＩＬｓ）」という表現は、「ＴＩＬの集団を増殖させる（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＩＬｓ）」と同義であり、ＴＩＬの集団内の細胞数を増加させることを指す。
【0061】
本明細書で使用される、「増殖プロセス」という表現は、ＴＩＬの集団内の細胞数が増加するプロセスを指す。ＴＩＬの数が実質的に増加することなくＴＩＬが単に単離または濃縮されるプロセスは、増殖プロセスではない。
【0062】
本明細書で使用される、「マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）」または「可動性マトリックス」という用語は、別々の単離可能な三次元格子型構造を指し、該構造の骨格は、柔軟性または可動性の場合があり、ポリマー及びセラミック等の材料からなり得る。三次元構造のため、マトリックスは、最小の寸法及び最大の寸法、例えば、長さを有することができる。可動性マトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリックス組成物のものであり得る。多糖としては、例えば、セルロースエーテル、デンプン、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム、またはアルギネートが挙げられ得る。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマー、またはポリウレタンが挙げられ得る。該可動性マトリックスは、デキストランのポリマーを含み得る。「マトリックス（ｍａｔｒｉｃｅｓ）」は、複数のマトリックスの一群を指す。
【0063】
本明細書で使用される、マトリックスの文脈における「最大の寸法」という表現は、当該マトリックスの最長の長さを指す。
【0064】
本明細書で使用される、「アゴニスト」という用語は、細胞の表面でまたは可溶性の形態のいずれかで標的に結合する化学薬品、分子、高分子、分子の複合体、または高分子の複合体を指す。ある特定の実施形態では、アゴニストが細胞の表面で標的に結合する場合、該アゴニストは該標的を活性化して生物学的反応が生じる。アゴニストとしては、ホルモン、神経伝達物質、抗体、及び抗体の断片が挙げられる。
【0065】
本明細書で使用される、「ナノマトリックス」という用語は、ポリマー鎖の複数のマトリックスのコロイド懸濁液を指す。ナノマトリックスは、５００ｎｍ未満の寸法を有する多相材料であるか、または該材料を構成する異なる相間でナノスケールの反復距離を有する構造を有する多相材料である。ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、多糖、デキストラン、及び多くの繰り返しサブユニットから構成される他の高分子が挙げられ得る。ナノマトリックスはまた、その中に埋め込まれたさらなる機能性化合物、例えば、磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶も有し得る。さらに、機能性部分、例えば、リガンドまたはアゴニストを、特定の用途のためにポリマー鎖に共有結合または結合させてもよい。
【0066】
本明細書で使用される、「デキストラン」という用語は、複雑な分岐グルカン、すなわち、グルコースの縮合で得られる多糖を指す。デキストラン鎖は、３～２０００キロダルトンの様々な長さのものである。該ポリマーの主鎖は、グルコースモノマー間のα－１，６グリコシド結合からなり、α－１，３結合から分岐する。
【0067】
本明細書で使用される、「ナノマトリックスに結合したアゴニスト」という表現は、ナノマトリックス内でマトリックスを含むポリマー鎖に共有結合したアゴニストを指す。
【0068】
本明細書で使用される、「コロイド懸濁液」という表現は、１つの物質、例えば、マトリックスが、別の物質、例えば、液体全体に懸濁されている混合物を指す。コロイド懸濁液は従って、分散相、すなわち、懸濁された物質、及び連続相、すなわち、懸濁媒体、例えば、液体を有する。
【0069】
本明細書で使用される、「ＴＩＬの集団をナノマトリックスと接触させること」という表現は、ＴＩＬとナノマトリックスを一緒にすることを指し、その結果、該ＴＩＬは、ナノマトリックスに結合した機能性部分、例えば、リガンドもしくはアゴニスト、またはナノマトリックスに埋め込まれた機能性化合物、例えば、ナノ結晶と、イオン結合、水素結合、または他のタイプの物理的または化学的相互作用を介して会合することができる。
【0070】
本明細書で使用される、「対象」という用語は、腫瘍を有するヒト指し、この腫瘍内に該ヒトの血流を離れたリンパ球の集団が移行しＴＩＬに変換されている。このヒトは、患者自身のＴＩＬの増殖した集団に関連した免疫療法を必要とする患者の場合がある。
【0071】
本明細書で使用される、「ＣＤ３」という用語は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方の活性化を促進するＣＤ３（表面抗原分類３）Ｔ細胞共受容体を指す。ＣＤ３は、６つの明確なポリペプチド鎖（２つのＣＤ３ゼータ鎖、２つのＣＤ３イプシロン鎖、１つのＣＤ３ｅガンマ鎖、及び１つのＣＤ３デルタ鎖）から構成されるタンパク質複合体である。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及びベータ鎖（またはガンマ及びデルタ鎖）と会合し、Ｔリンパ球における活性化シグナルを生成する。ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖（またはガンマ及びデルタ鎖）、ならびにＣＤ３分子が一緒にＴＣＲ複合体を構成する。ヒトＣＤ３Ｅ遺伝子は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）遺伝子ＩＤ９１６で識別される。ヒトＣＤ３Ｅ遺伝子に関する例示的な核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００７３８３．１である。ヒトＣＤ３Ｅポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号８７６として提供される。
【表1】
【0072】
表１において、リーダー配列を有するタンパク質に対する推定リーダー配列は、下線付きで示される。
【0073】
本明細書で使用される、「ＣＤ２８」という用語は、表面抗原分類２８を指し、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを与えるＴ細胞で発現されるタンパク質の一種である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えて、ＣＤ２８を介したＴ細胞の刺激により、様々なサイトカイン、例えば、インターロイキンの産生のための強力なシグナルがもたらされ得る。ＣＤ２８は、ＣＤ８０及びＣＤ８６タンパク質の受容体である。トール様受容体リガンドによって活性化されると、ＣＤ８０の発現は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）で上方制御される。ヒトＣＤ２８遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９４０で識別される。ヒトＣＤ２８遺伝子に関する例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２９６１８．１である。ヒトＣＤ２８ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号８７７として提供される。
【0074】
本明細書で使用される、「ＣＤ２」という用語は、表面抗原分類２を指し、これは、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面で見出される細胞接着分子である。ＣＤ２は、他の接着分子と相互作用し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で共刺激分子として作用する。ヒトＣＤ２遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９１４で識別される。ヒトＣＤ２遺伝子に関する例示的な核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０５０９０８．１である。ヒトＣＤ２ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号８７８として提供される。
【0075】
本明細書で使用される、「４－１ＢＢ」という用語は、ＣＤ１３７を指し、これは、Ｔ細胞共刺激分子である。ヒト４－１ＢＢ遺伝子に関する例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００１．１１である。ヒト４－１ＢＢの例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１５５２．２（配列番号８８０）である。
【0076】
本明細書で使用される、「４－１ＢＢリガンド」という用語は、活性化されたＴリンパ球で発現され、４－１ＢＢに結合する２型膜貫通糖タンパク質を指す。ヒト４－１ＢＢリガンドに関する例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１９．１０である。ヒト４－１ＢＢリガンドの例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＡＡＡ５３１３４．１（配列番号：８８１）である。
【0077】
本明細書で使用される、アゴニストまたは抗体に関連して使用される、「断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持したアゴニストまたは抗体の断片を指す。抗体の断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらを、組み換え法を使用して、ＶＬ及びＶＨ領域が組み合わさって一価分子（単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質鎖として形成されるようにする合成リンカーによって接合させることができる。かかる短鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合タンパク質」という用語に包含されることが意図される。他の形態の短鎖抗体、例えば、ダイアボディもまた包含される。さらに、短鎖抗体としては、直列のＦｖセグメントの対（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「線状抗体」も挙げられ、これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成する。
【0078】
「抗体」という用語は、通常、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子のエピトープ結合性を保持するその機能的断片、突然変異体、バリアント、もしくは誘導体を指す。かかる断片、突然変異体、バリアント、または誘導体抗体の型は、当技術分野で既知である。完全長抗体の実施形態では、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。該重鎖可変領域（ドメイン）は、本開示ではＶＤＨとも指定される。該ＣＨは、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。該ＣＬは、単一のＣＬドメインから構成される。該軽鎖可変領域（ドメイン）は、本開示ではＶＤＬとも指定される。該ＶＨ及びＶＬは、さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に組み入れられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に分割される。一般に、各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、またはサブクラスのものでよい。
【0079】
本明細書で使用される、「選択的結合」または「選択的に結合する」という表現は、所定の抗原上のエピトープへのアゴニストの結合を指す。通常、該アゴニストは、親和性（ＫＤ）約１０－５Ｍ未満、例えば、約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはさらに低いＫＤで結合する。
【0080】
本明細書で使用される、「ＫＤ」という用語は、特定のアゴニスト・抗原相互作用の解離平衡定数を指す。通常、本明細書に記載のアゴニストは、標的に対して、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術をＢｉａｃｏｒｅ機器にて使用し、リガンドとして該アゴニスト及びアナライトとして該標的を使用して測定して、解離平衡定数（ＫＤ）約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはさらに低いＫＤで結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合に関する親和性より少なくとも１０倍低い、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１０００倍低い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低いＫＤに相当する親和性で標的タンパク質に結合する。該親和性の低下量は、アゴニストのＫＤに依存するため、当該アゴニストのＫＤが極めて低い（すなわち、該アゴニストが高度に特異的である）場合、当該抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低下する量は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
【0081】
本明細書で使用される、「ｋｄ」（秒－１）という用語は、特定のアゴニスト・抗原相互作用の解離速度定数を指す。該値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【0082】
本明細書で使用される、「ｋａ」（Ｍ－１×秒－１）という用語は、特定のアゴニスト・抗原相互作用の会合速度定数を指す。
【0083】
本明細書で使用される、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定のアゴニスト・抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
【0084】
本明細書で使用される、「ＫＡ」（Ｍ－１）という用語は、特定のアゴニスト・抗原相互作用の会合平衡定数を指し、ｋａをｋｄで除することによって得られる。
【0085】
本明細書で使用される、「活性化シグナル」という表現は、Ｔ細胞を活性化する１つ以上の非内因性刺激を指す。内因性過程では、Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示された場合に活性化する。活性化されると、該Ｔ細胞は、急速に分裂し、免疫反応を調節または支援するサイトカインを分泌する。該内因性Ｔ細胞活性化過程は、少なくとも（ａ）ＣＤ３を含むＴＣＲ複合体の活性化、及び（ｂ）ＡＰＣ表面でのタンパク質によるＣＤ２８または４－１ＢＢの共刺激を含む。当技術分野では、該内因性のＴ細胞活性化は、ＣＤ３、ＣＤ２８または４－１ＢＢアゴニスト（例えば、抗体）によるＴ細胞の刺激によって刺激され得ることが知られている。従って、ＣＤ３、ＣＤ２８及び／または４－１ＢＢは、一緒になってＴ細胞に活性化シグナルをもたらし得る。
【0086】
本明細書で使用される、「ＴＩＬの集団を活性化してその増殖を誘導すること」という表現は、ＴＩＬが数を増加させるかまたは増殖し、サイトカインの産生を開始して（活性化ＴＩＬ）免疫反応を強化することができるように、ＴＩＬの集団を活性化シグナルに供するプロセスを指す。
【0087】
本明細書で使用される、「ナノ結晶」という用語は、少なくとも１つの寸法が１００ｎｍ未満の材料分子を指し、量子ドットに基づき、単結晶または多結晶のいずれかの配置の原子から構成される。ナノ結晶のサイズは、より大きな結晶からそれらを区別する。
【0088】
本明細書で使用される、「磁性、常磁性、または超常磁性ナノ結晶」という表現は、磁場を使用して操作され得るナノ結晶を指す。かかるナノ結晶は、一般に、磁性材料、例えば、鉄、ニッケル、またはコバルトである少なくとも１つの成分からなる。
【0089】
本明細書で使用される、「腫瘍細胞」または「がん細胞」という表現は、制御されない方法で分裂し、固形腫瘍を形成するか、または異常な細胞で血液を満たす細胞を指す。健康な細胞は、さらなる娘細胞をもはや必要としない場合に分裂を停止するが、腫瘍細胞またはがん細胞は、コピーを産生し続ける。それらはまた、体の１つの部分から他の部分へ、転移として知られるプロセスで広がることができる。腫瘍細胞は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、黒色腫、中皮腫、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、ならびに甲状腺癌を含めた多くのがん型から単離され得る。腫瘍細胞は、原発腫瘍及び転移から単離され得る。
【0090】
本明細書で使用される、「腫瘍サンプル」という表現は、対象から単離された腫瘍細胞を指す。ある特定の実施形態では、腫瘍サンプルは、腫瘍を有する対象または患者から全体としてまたは部分的に単離される固形腫瘍の少なくとも一部である。腫瘍サンプルは、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、黒色腫、中皮腫、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、ならびに甲状腺癌を含めた多くのがん型から単離され得る。腫瘍サンプルは、原発腫瘍及び転移から単離され得る。
【0091】
本明細書で使用される、「解離した腫瘍サンプル」という表現は、「腫瘍断片」に断片化された腫瘍サンプルを指す。該断片化は、物理的断片化、機械的断片化、超音波断片化、酵素断片化、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。該断片化は、機械的に行われ得るとともに、任意にその後該腫瘍断片が単細胞懸濁液まで酵素消化され得る。機械的解離法は、該腫瘍をより小さい腫瘍断片にチョップ及びスライスすることを含み得る一方、酵素的解離法は、該腫瘍断片を特定の酵素、例えば、プロテアーゼで処理することを含み得る。
【0092】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、以前に失敗したｐｒｅ－ＲＥＰ増殖からＴＩＬサンプルを取り返すことができる。ある特定の実施形態では、該腫瘍サンプルは、以前にＴＩＬの増殖技術の対象となるサンプルを有していた対象から単離される。いくつかの実施形態では、該以前のＴＩＬの増殖技術は、ｐｒｅ－ＲＥＰ増殖から構成されるものであった。いくつかの実施形態では、該ｐｒｅ－ＲＥＰ増殖は、ＩＬ－２を該対象の解離した腫瘍サンプルに投与することを含む。いくつかの実施形態では、該ｐｒｅ－ＲＥＰ増殖で該腫瘍サンプルまたは該腫瘍サンプルから増殖させたＴＩＬに投与される唯一の免疫調節物質は、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、該以前のＴＩＬの増殖技術は、失敗したものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの増殖技術は、それが適切な数のＴＩＬを増殖しない場合は失敗である。いくつかの実施形態では、適切なＴＩＬの数は、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００ＴＩＬを超える。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの増殖技術は、それが適切なＴＩＬの増殖倍率を誘導しない場合は失敗である。いくつかの実施形態では、適切なＴＩＬの増殖倍率は、５０、１００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１０，０００倍を超える増殖倍率である。いくつかの実施形態では、該以前のＴＩＬの増殖技術と本明細書に開示するＴＩＬの増殖方法で同じ腫瘍サンプルの部分が使用される。いくつかの実施形態では、同じ対象から２つの異なるサンプルが単離される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、以前の増殖技術より多くの数または増殖倍率のＴＩＬを提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、臨床的に有用な数のＴＩＬを提供することができ、該以前の増殖技術では、その数のＴＩＬを提供することはできなかった。
【0093】
本明細書で使用される、「Ｔ細胞受容体アゴニスト」または「ＴＣＲアゴニスト」という表現は、Ｔ細胞受容体複合体のアゴニストを指す。適切なＴＣＲアゴニストとしては、ＣＤ３アゴニスト（例えば、抗ＣＤ３抗体）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0094】
本明細書で使用される、「培地」という用語は、人工的な環境で細胞の生存、成長、及び／または増殖を支持するように設計された液体またはゲルを指す。培地は、一般に、一連の明確な成分を含む。かかる成分としては、エネルギー源、成長因子、ホルモン、刺激物、活性化因子、糖、塩、ビタミン、及び／またはアミノ酸、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【0095】
本明細書で使用される、「培地の成分が維持される」という表現は、成分の同一性は一定のままであるが、該成分の１つ以上の濃度が変動することがある一連の明確な成分、例えば、特定の刺激物及び活性化因子を含む培地を指す。ある特定の実施形態では、該培地中の１つ以上の成分の濃度は、細胞が該培地で培養される間に経時的に変動する。しかしながら、該培地の変更時には、新たな培地は、変更ごとに同じ成分を有する。
【0096】
本明細書で使用される、「フィーダー細胞」という表現は、別の細胞型の増殖を促進する細胞外分泌をもたらすために使用される細胞を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で言及するフィーダー細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。
【0097】
本明細書で使用される、「組み換えアゴニスト」という表現は、遺伝子の発現及びｍＲＮＡの翻訳を支持する系でクローニングされた組み換え遺伝子によってコードされるアゴニストタンパク質を指す。該組み換え遺伝子は、十分に特徴づけられたプロモーターの制御下にあるように、また、選択された宿主細胞内で標的アゴニストタンパク質を発現し、高レベルのタンパク質発現を達成するように設計される。組み換えＤＮＡ技術による遺伝子の改変により、変異タンパク質の発現または大量のタンパク質の発現がもたらされ得る。
【0098】
本明細書で使用される、「コロイドポリマー鎖」という表現は、互いに共有結合で連結された場合または他の物理的または化学的相互作用により連結された場合にコロイド懸濁液を形成することができるポリマー鎖を指す。
【0099】
本明細書で使用される、「特異的に結合する」という表現は、タンパク質複合体がより低い会合親和性を有する他の抗原と比較して、高い特異性で特定の抗原と相互作用する該タンパク質複合体、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体または可溶性単一特異性複合体を指す。該特異的な結合相互作用は、イオン結合、水素結合、または他のタイプの化学的もしくは物理的会合によって媒介され得る。ある特定の実施形態では、タンパク質複合体は、それがその標的抗原をタンパク質及び／または高分子の複雑な混合物中で認識した場合に特定の抗原に特異的に結合する。２つ以上のアゴニスト、アンタゴニスト、抗体または可溶性単一特異性複合体は、該アゴニストが交差競合する（一方が他方の結合または調節作用を妨げる）場合、「同じエピトープに結合する」。
【0100】
本明細書で使用される、「セントラルメモリーＴ細胞表現型」という表現は、ヒトではＣＤ４５ＲＯ＋であり、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２ｈｉ）を発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型はまた、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）も含む。セントラルメモリーＴ細胞は、主にＩＬ－２及びＣＤ４０ＬをＴＣＲ誘発後にエフェクター分子として分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４コンパートメントで優勢であり、ヒトでは、相対的にリンパ節及び扁桃腺で豊富である。
【0101】
本明細書で使用される、「抗ＣＤ３抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラまたはマウス抗体を含む。抗ＣＤ３抗体としては、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が挙げられる。抗ＣＤ３抗体としてはまた、Ｔ３及びＣＤ３ｃとしても知られるＵＣＨＴ１クローンも挙げられる。他の抗ＣＤ３抗体としては、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブが挙げられる。
【0102】
本明細書で使用される、「抗ＣＤ２８抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ２８受容体に対するヒト、ヒト化、キメラまたはマウス抗体を含む。
【0103】
本明細書で使用される、「抗４－１ＢＢ抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指し、４－１ＢＢに対するヒト、ヒト化、キメラまたはマウス抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗４－１ＢＢ抗体は、４－１ＢＢリガンドとして使用され得る。
【0104】
本明細書で使用される、「抗ＣＤ２抗体」という表現は、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ２受容体に対するヒト、ヒト化、キメラまたはマウス抗体を含む。
【0105】
本明細書で使用される、「ＯＫＴ－３」（本明細書では、「ＯＫＴ３」とも呼ばれる）という用語は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡによって製造される抗ＣＤ３抗体、及びまたはそのバイオ後続品もしくはバリアント（例えば、ヒト化、キメラ、もしくは親和性成熟バリアント）を指す。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎで入手可能であり、ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）で入手可能であり、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
【0106】
本明細書で使用される、「ＵＣＨＴ１」という用語は、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ ａｎｄ Ｃａｌｌａｒｄ（１９８１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３２９－３３４に記載の抗ＣＤ３抗体、及びまたはそのバイオ後続品もしくはバリアント（例えば、ヒト化、キメラ、もしくは親和性成熟バリアント）を指す。例示的なＵＣＨＴ１を産生することができるハイブリドーマは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能であり、カタログ番号ＣＳＣ－Ｈ３０６８が割り当てられている。
【0107】
本明細書で使用される、「四量体抗体複合体」または「ＴＡＣ」という表現は、第一及び第二のアゴニストとして作用する抗体を結合する１つまたは２つのリンカー抗体によって連結された第一及び第二のアゴニストとして作用する２つの抗体を含むタンパク質複合体を指す。該リンカー抗体は、該アゴニスト抗体の定常領域に結合し得るとともに、該定常領域は異なるアイソタイプのものであり、アイソタイプごとに１つの結合領域を有する二重特異性抗体も使用され得る。これらの複合体への支持は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，８６８，１０９号に見出すこともできる。他の実施形態では、第一及び第二のリガンドとして作用する該抗体、またはその抗原結合断片は、１つ以上のリンカー分子によって共有結合される場合もあれば、非共有的に結合される場合もある。かかるリンカー分子の非限定的な例としては、アビジン及びストレプトアビジンが挙げられ、これらは、ビオチン化抗体、例えば、Ｆｃ領域にビオチン部分を有する抗体を接合するために使用され得る。さらなる実施形態では、四量体抗体複合体は、複合体の混合物として使用される場合もある。これには、複合体の混合物中の複数種の複合体の使用が含まれ、全混合物の複合体は、３つ以上の異なるリガンドと接触し得る。
【0108】
本明細書で使用される、「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」という表現は、標的ゲノム編集を行うために使用され得るプログラム可能なエンドヌクレアーゼである天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に基づく核酸／タンパク質複合体を指す。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、２つの成分、すなわち、５’末端の２０個の可変ヌクレオチドを使用して、標的ゲノムＤＮＡ配列と塩基対合する短い約１００ヌクレオチドのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び標的ＤＮＡを切断するヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼからなる。
【0109】
本明細書で使用される、「Ｃａｓ９」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９、すなわち、ある特定の細菌のＤＮＡウイルスに対する免疫学的防御に重要な役割を果たすタンパク質を指し、これは、遺伝子工学への応用に頻繁に利用されている。Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓにおけるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）の獲得免疫系に関連するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に相補的な部位を照合することにより、ＤＮＡのセクションを調べることができる。ＤＮＡ基質がｇＲＮＡに相補的である場合、Ｃａｓ９は、そのＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９の標的特異性は、ｇＲＮＡ：ＤＮＡ相補性に由来し、タンパク質自体に対する改変（ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガーのような）には由来しないため、新たなＤＮＡを標的とするようにＣａｓ９を操作することは容易である。同族ＤＮＡに結合するが切断はしないＣａｓ９の型を使用して、転写活性化因子または抑制因子と特定のＤＮＡ配列に設置し、転写活性化及び抑制を制御することができる。天然のＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に関連する２つの異なるＲＮＡから構成されるガイドＲＮＡを必要とする。Ｃａｓ９の標的化は、キメラ一本鎖ガイドＲＮＡの操作により単純化されている。
【0110】
本明細書で使用される、「不活性型Ｃａｓ９」または「ｄＣａｓ９」という表現は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼＤｅａｄを指し、これは、そのエンドヌクレアーゼドメインでの点突然変異によりエンドヌクレアーゼ活性が除去されているＣａｓ９の突然変異型である。その突然変異していない型と同様、ｄＣａｓ９は、ｇＲＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ系で使用され、Ｃａｓ９の結合を可能にするＰＡＭ配列を備えたｇＲＮＡと相補的な特定の遺伝子またはヌクレオチドを標的とする。Ｃａｓ９は通常、ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインと呼ばれる２つのエンドヌクレアーゼドメインを有する。点突然変異Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａは、エンドヌクレアーゼ活性にとって重要な２つの残基を変化させ、最終的にその不活性化をもたらす。ｄＣａｓ９はエンドヌクレアーゼ活性を欠いているが、そのガイドＲＮＡ及び標的とされるＤＮＡ鎖への結合は他のドメインによって管理されているため、かかる結合は依然として可能である。転写因子及びＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡにアクセスできないようにｇＲＮＡがｄＣａｓ９を配置する場合、標的遺伝子の転写を完全にブロックしない場合でも、これだけで多くの場合減弱には十分である。しかしながら、ｄＣａｓ９は、通常は該タンパク質のＮ末端及びＣ末端に転写活性化因子を結合するために使用され得る修飾可能な領域を有するため、ＤＮＡに結合するこの能力は、活性化にも利用され得る。
【0111】
本明細書で使用される、「サイトカイン」という用語は、細胞のシグナル伝達に重要な小タンパク質（約５～２０ｋＤａのサイズ）の広義のカテゴリーを指す。サイトカインはペプチドであり、細胞の脂質二重層を通過して細胞質に入ることはできない。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達、及び内分泌シグナル伝達に関与することが分かっている。用語はある程度重複しているが、サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が含まれ、一般にホルモンや成長因子は含まれない。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、及び様々な間質細胞を含めた広範囲の細胞によって産生される。サイトカインは、一般に、細胞表面の受容体への結合を介して作用し、また、それらは、特定の細胞集団の成熟、成長、及び反応性の調節に関与するため、特に免疫反応において重要である。
【0112】
本明細書で使用される、「Ｔ細胞刺激サイトカイン」という表現は、Ｔ細胞リンパ球を刺激及び／または活性化するサイトカインを指す。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインは、ＩＬ－２である。
【0113】
本明細書で使用される、「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも呼ばれる）という用語は、インターロイキン－２として知られるサイトカイン及びＴ細胞成長因子を指し、ＩＬ－２のすべての型、すなわち、ヒト及び哺乳類型、保存的アミノ酸置換を有する型、糖型、バイオ後続品、及びそれらのバリアント等を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、これらの開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２という用語は、ヒト、組み換え型のＩＬ－２、例えば、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）、及びＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）によって市販されている組み換え型ＩＬ－２ならびに他の供給業者からの他の市販の同等物を包含する。アルデスロイキン（ｄｅｓ－アラニル－１，セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、非グリコシル化ヒト組み換え型のＩＬ－２であり、分子量は約１５ｋＤａである。ＩＬ－２という用語はまた、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡより入手可能なペグ化ＩＬ－２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含めたＩＬ－２のペグ化型も包含する。本発明での使用に適したＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０６５０８６Ａ１号に記載されている。これら公開の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適した別の型のコンジュゲートＩＬ－２は、米国特許第４，７６６，１０６号、第５，２０６，３４４号、第５，０８９，２６１号及び第４，９０２，５０２号に記載されている。これら特許の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適したＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されている。その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。ヒトＩＬ２遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３５５８によって識別される。ヒトＩＬ２遺伝子に関する例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿０１６７７９．１である。ヒトＩＬ－２ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号８７９として提供される。
【0114】
本明細書で使用される、「可溶性単一特異性複合体」という表現は、互いに直接または間接的に連結され、同じ抗原に結合している２つの結合タンパク質を含む複合体を指す。該２つの結合タンパク質は、可溶性であり、表面、粒子、またはビーズに固定化されない。
【0115】
さらに、本開示によれば、当業者が備えている技能の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術が使用され得る。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書では、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、ｅｄｓ．（１９８４）］、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｅｄ．（１９８６）］、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）］、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。これら参考文献の各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0116】
特に明記しない限り、本明細書に提供する配列同一性／類似性の値は、ＢＬＡＳＴ２．０の一連のプログラムを使用し、デフォルトのパラメータを使用して得られた値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【0117】
本明細書で使用される、「核酸標的配列」及び「核酸結合配列」は同義で使用され、核酸に結合する及び／または核酸を標的とする配列を指す。
【0118】
本明細書で使用される、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」には、特定の比較ウィンドウにわたって最大の一致を得るようにアラインさせた場合に同一である２つの配列の残基への言及が含まれる。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されているため、当該分子の機能特性が変化しない保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多いことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、該置換の保存的性質を補正するために上方調整され得る。かかる保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。通常、これには、保存的置換を、完全な不一致ではなく部分的な不一致としてスコアし、それにより、配列同一性パーセンテージを高めることが含まれる。従って、例えば、同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にスコアゼロが与えられる場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）に実装されたＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１－１７のアルゴリズムに従って計算される。これらの参考文献の各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0119】
本明細書で使用される、「配列同一性パーセンテージ」とは、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較することによって特定される値を意味し、該比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのため、参照配列（付加も欠失も含まないもの）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を有してもよい。該パーセンテージは、両配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を特定して一致した位置の数を得、該一致した位置の数を比較ウィンドウ内の全位置数で除し、その結果に１００をかけることで配列同一性パーセンテージを得ることで計算される。
【0120】
ポリヌクレオチド配列の文脈における「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメータを使用して記載されるアライメントプログラムの１つを使用して参照配列と比較して、５０～１００％の配列同一性、好ましくは、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％及び最も好ましくは、少なくとも９５％を有する配列を含むことを意味する。当業者には、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームポジショニング等を考慮に入れて、２つのヌクレオチド配列によってコードされる対応するタンパク質の同一性を特定するために適切に調整され得ることが認識されよう。これらの目的のため、アミノ酸配列の実質的な同一性とは、通常、５５～１００％、好ましくは、少なくとも５５％、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％及び最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【0121】
Ｉ．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）
腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬは、元々、対象の血流を離れて腫瘍内に移行した白血球として得られた細胞の集団である。ＴＩＬとしては、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＩＬは、一次及び二次ＴＩＬの両方を含む。「一次ＴＩＬ」とは、本明細書で説明する患者の組織サンプルから得られるものであり（「新たに採取したもの」と呼ばれることがある）、「二次ＴＩＬ」とは、本明細書で論じる通りに増殖させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）または増殖させた（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ）任意のＴＩＬ細胞集団である。
腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬは、元々、対象の血流を離れて腫瘍内に移行した白血球として得られた細胞の集団である。ＴＩＬとしては、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＩＬは、一次及び二次ＴＩＬの両方を含む。「一次ＴＩＬ」とは、本明細書で説明する患者の組織サンプルから得られるものであり（「新たに採取したもの」と呼ばれることがある）、「二次ＴＩＬ」とは、本明細書で論じる通りに増殖させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）または増殖させた（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ）任意のＴＩＬ細胞集団である。
【0122】
ＴＩＬは一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義される場合もあれば、腫瘍に浸潤する能力及び治療をきたす能力によって機能的に定義される場合もある。ＴＩＬは、一般に、以下のバイオマーカーの１つ以上を発現するとして分類される：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５。さらに、及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入後に固形腫瘍に浸潤する能力によって機能的に定義され得る。ＴＩＬはさらに、有効性によって特徴づけられ得る。例えば、ＴＩＬは、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の放出がＴＣＲ刺激後に約５０ｐｇ／ｍＬを超える、約１００ｐｇ／ｍＬを超える、約１５０ｐｇ／ｍＬを超える、または約２００ｐｇ／ｍＬを超える場合に有効であると見なされ得る。
【0123】
従来のＴＩＬ製造プロセスによってエキソビボで培養されたＴＩＬを使用する養子細胞療法は、少なくとも２つの段階、すなわち、少なくとも１つの急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）段階とその前のｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含む。養子細胞療法は、黒色腫の患者において、宿主の免疫抑制後に治療の成功をもたらした。現在の注入受容パラメータは、ＴＩＬの組成の読み取り値（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８、またはＣＤ４陽性）ならびに増殖の数的倍率及びＲＥＰ産物の生存率に依存している。
【0124】
実験的発見は、制御性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を除去することによる腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇化が、治療効果を高めるために重要な役割を果たすことを示している。従って、本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＴＩＬの導入前の患者に対してリンパ球枯渇化段階（「免疫抑制前処置」とも呼ばれることがある）を使用し得る。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇化段階は使用されない。
【0125】
Ａ．ＴＩＬの増殖
本明細書で一般に説明するように、ＴＩＬは、一般に、患者のサンプルから採取され、患者への移植前にその数を増やすように操作される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬは、以下に論じるように遺伝子操作され得る。一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍サンプルから採取され（「一次ＴＩＬ」）、その後本明細書に記載のさらなる操作のためにより大きな集団に増殖し、任意に凍結保存及び再刺激され、任意に、ＴＩＬの健全性を示すような表現型及び代謝パラメータを評価される。
本明細書で一般に説明するように、ＴＩＬは、一般に、患者のサンプルから採取され、患者への移植前にその数を増やすように操作される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬは、以下に論じるように遺伝子操作され得る。一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍サンプルから採取され（「一次ＴＩＬ」）、その後本明細書に記載のさらなる操作のためにより大きな集団に増殖し、任意に凍結保存及び再刺激され、任意に、ＴＩＬの健全性を示すような表現型及び代謝パラメータを評価される。
【0126】
患者の腫瘍サンプルは、当技術分野で既知の方法を使用して、通常、外科的切除、針生検、または腫瘍とＴＩＬ細胞の混合物を含むサンプルを得るための他の手段を介して採取され得る。一般に、該腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍または転移を含めた任意の固形腫瘍に由来し得る。該固形腫瘍は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、黒色腫、中皮腫、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、神経芽細胞腫、多形神経膠芽腫、非黒色腫皮膚癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、小細胞肺癌、ならびに甲状腺癌が挙げられるがこれらに限定されない任意のがん型のものでよい。いくつかの実施形態では、有用なＴＩＬは、悪性黒色腫腫瘍から得られ、これらは特に高レベルのＴＩＬを有することが報告されている。原発黒色腫腫瘍またはその転移を使用してＴＩＬを採取することができる。
【0127】
いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、通常は嚢胞も液体領域も含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性の場合も悪性の場合もある。固形腫瘍がんは、悪性、新生物、またはがん性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍がんとしては、リンパ腫、肉腫、乳（トリプルネガティブ乳癌を含む）、膵臓、前立腺、結腸、直腸、膀胱、肺（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む）、脳、腎、胃、ならびに皮膚（扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含むがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該がんは、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、肝臓癌、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。固形腫瘍の組織構造は、実質（がん細胞）及び該がん細胞が分散され支持微小環境を提供し得る支持間質細胞を含めた相互依存組織コンパートメントを含む。
【0128】
採取された後、該腫瘍サンプルは、一般に鋭的剥離を使用して、約１～約８ｍｍ３、または約０．５～約４ｍｍ３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ３が特に有用である。該ＴＩＬは、酵素腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭのグルタミン酸、１０ｍｃｇ／ｍＬのゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーションに続いて、機械的な解離（例えば、組織解離機を使用）によって生成され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、該腫瘍を約１分間、機械的に解離し、続いて３７℃にて５％ＣＯ２中で３０分間インキュベーションの後、小組織片のみが含まれるまで機械的解離及び上記の条件下でのインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって生成され得る。このプロセスの最後に、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含んでいる場合、ＦＩＣＯＬＬの分岐親水性多糖を使用した密度勾配分離を行ってこれらの細胞が除去される場合もある。当技術分野で既知の別の方法、例えば、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載のものを使用してもよい。上記方法のいずれかを、ＴＩＬの増殖方法またはがんの治療方法に関する本明細書に記載の実施形態のいずれかに使用してもよい。
【0129】
一般に、採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。いくつかの実施形態では、断片化は、物理的断片化、例えば、剥離及び消化等を含む。いくつかの実施形態では、該断片化は、物理的断片化である。いくつかの実施形態では、該断片化は、剥離による。いくつかの実施形態では、該断片化は、消化による。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から採取された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。
【0130】
いくつかの実施形態では、腫瘍が固形腫瘍の場合、腫瘍サンプルが採取された後、該腫瘍は物理的断片化を受ける。いくつかの実施形態では、該断片化は、凍結乾燥前に行われる。いくつかの実施形態では、該断片化は、凍結乾燥後に行われる。いくつかの実施形態では、該断片化は、該腫瘍が採取された後、凍結乾燥をすることなく行われる。いくつかの実施形態では、該腫瘍は、断片化され、１０、２０、３０、４０またはそれを超える断片または片が第一の増殖用の各容器に配置される。いくつかの実施形態では、該腫瘍は、断片化され、３０または４０個の断片または片が第一の増殖用の各容器に配置される。いくつかの実施形態では、該腫瘍は、断片化され、４０個の断片または片が第一の増殖用の各容器に配置される。いくつかの実施形態では、該複数の断片は、約４～５０個の断片を含み、各断片は、体積が約２７ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該複数の断片は、約３０～約６０個の断片を含み、全体積は約１３００ｍ３～約１５００ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該複数の断片は、約５０個の断片を含み、全体積は、約１３５０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該複数の断片は、約５０個の断片を含み、全質量は、約１グラム～約１．５グラムである。いくつかの実施形態では、該複数の断片は、約４個の断片を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬは、腫瘍断片から得られる。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、鋭的剥離によって得られる。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約１ｍｍ３～１０ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約１ｍｍ３～８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約０．５ｍｍ３～４ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約１ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約２ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約３ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約４ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約６ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約７ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約８ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約９ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、約１０ｍｍ３である。
【0132】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬは、腫瘍消化物から得られる。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、酵素培地、例えば、これらに限定されないが、ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ中でのインキュベーションに続いて、機械的な解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．）によって生成される。該腫瘍を酵素培地に入れた後、該腫瘍は約１分間、機械的に解離され得る。該溶液はその後、３７℃にて５％ＣＯ２中で３０分間インキュベートされる場合があり、その後、再度約１分間、機械的に分断され得る。再度３７℃にて５％ＣＯ２中で３０分間インキュベートされた後、該腫瘍は、３回目の約１分間、機械的に分断され得る。いくつかの実施形態では、３回目の機械的分断後、大きな組織片が含まれる場合、１回または２回のさらなる機械的解離が、３７℃にて５％ＣＯ２中でさらなる３０分間のインキュベーションとともにまたはなしで、該サンプルに対して施される場合がある。いくつかの実施形態では、最終的なインキュベーションの最後に、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含んでいる場合、ＦＩＣＯＬＬを使用した密度勾配分離を行ってこれらの細胞が除去される場合がある。
【0133】
いくつかの実施形態では、細胞は、任意に、サンプルの採取後に冷凍または凍結保存される場合があり、増殖相に入る前に、冷凍保存され得る。
【0134】
１．従来のＴＩＬの増殖方法の要約
従来のＴＩＬの活性化及び増殖方法では、フィーダー細胞の使用に加えて多段階プロセスが採用されている。この多段階プロセスには、少なくとも急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）段階、それに先行する別のｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含む。
従来のＴＩＬの活性化及び増殖方法では、フィーダー細胞の使用に加えて多段階プロセスが採用されている。この多段階プロセスには、少なくとも急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）段階、それに先行する別のｐｒｅ－ＲＥＰ段階を含む。
【0135】
ａ．従来の多段階ＴＩＬ製造における第一の増殖段階：ｐｒｅ－ＲＥＰ
従来の多段階ＴＩＬ製造プロセスは、ｐｒｅ－ＲＥＰまたは第一の増殖から始まる。一般に、ｐｒｅ－ＲＥＰは、断片化された、及び／または酵素消化された腫瘍サンプルを使用して開始され、ここに、ＩＬ－２が添加されて、該腫瘍サンプル内で、サイトカインが緩やかなＴＩＬの成長を引き起こす。一般に、ＩＬ－２は、該ｐｒｅ－ＲＥＰに添加される唯一のサイトカイン、または免疫調節物質である。該ｐｒｅ－ＲＥＰまたは第一の増殖段階は、２週間～数か月かかる可能性がある。ｐｒｅ－ＲＥＰは、対象／患者への投与後に複製サイクルを増加させることができるため、古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与の前により多くの複製をさらに経ているＴＩＬ）と比較してさらなる治療的有用性を提供し得る新しいＴＩＬを採取することから始まる場合がある。
従来の多段階ＴＩＬ製造プロセスは、ｐｒｅ－ＲＥＰまたは第一の増殖から始まる。一般に、ｐｒｅ－ＲＥＰは、断片化された、及び／または酵素消化された腫瘍サンプルを使用して開始され、ここに、ＩＬ－２が添加されて、該腫瘍サンプル内で、サイトカインが緩やかなＴＩＬの成長を引き起こす。一般に、ＩＬ－２は、該ｐｒｅ－ＲＥＰに添加される唯一のサイトカイン、または免疫調節物質である。該ｐｒｅ－ＲＥＰまたは第一の増殖段階は、２週間～数か月かかる可能性がある。ｐｒｅ－ＲＥＰは、対象／患者への投与後に複製サイクルを増加させることができるため、古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与の前により多くの複製をさらに経ているＴＩＬ）と比較してさらなる治療的有用性を提供し得る新しいＴＩＬを採取することから始まる場合がある。
【0136】
いくつかの実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰの間に、腫瘍組織または腫瘍組織由来の細胞は、標準的な人工培地（ＲＰＭＩを含むがこれに限定されない）で成長し、照射されたフィーダー細胞及び抗ＣＤ３抗体等の試薬で処理されて、所望の効果、例えば、ＴＩＬの数の増加及び／または所望の細胞表面マーカーまたは他の構造的、生化学的もしくは機能的特性を含む細胞に関する集団の濃縮が達成される。ｐｒｅ－ＲＥＰは、ＴＩＬの産生を改善するための代替的な戦略を組み込むことを容易にする実験室グレードの試薬が使用され得る（実験室グレードの試薬が後のＲＥＰ段階で希釈されるという想定の下）。従って、いくつかの実施形態では、本開示のＴＬＲアゴニスト及び／またはペプチドもしくはペプチド模倣物を、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階の培地に含めることができる。該ｐｒｅ－ＲＥＰ培養は、いくつかの実施形態では、ＩＬ－２を含み得る。
【0137】
場合によっては、腫瘍断片の剥離または消化後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりＴＩＬを成長に有利な条件下でＩＬ－２を含む培地で培養される。腫瘍消化物は、不活性化ヒトＡＢ血清と６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む培地中、２ｍＬのウェル内でインキュベートされる。いくつかの例では、３００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が添加される。ｐｒｅ－ＲＥＰの間に、この一次細胞集団は、数日～数か月間培養され、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０８のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
【0138】
場合によっては、該ｐｒｅ－ＲＥＰまたは第一の増殖段階の間に、ＴＩＬ培養は、小（約２ｍｍ３）腫瘍断片の外植片によって開始されるか、または酵素消化腫瘍組織の単細胞懸濁液の１×１０６個の生存能力のある細胞を６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む２ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ１６４０系の培地に１０％ヒト血清を補充）にプレーティングすることによって開始される。該培養物は、細胞濃度５×１０５～２×１０６細胞／ｍｌで、数百万個のＴＩＬ細胞が利用可能になるまで、通常２～４週間維持される。複数の独立した培養物を、自己腫瘍細胞（可能な場合）及びＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞株の認識用のサイトカイン分泌アッセイによってスクリーニングする。最高のサイトカイン分泌を示す２～６つの独立したＴＩＬ培養物をその後さらに、細胞数が５×１０７個を超えるまで（この細胞数には、通常は、腫瘍切除から３～６週間後に達する）６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む完全培地で増殖させる。
【0139】
場合によっては、該ｐｒｅ－ＲＥＰの第一の増殖は、閉鎖系のバイオリアクター、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００で行われる。
【0140】
遺伝子改変ＴＩＬが治療に使用される場合は、該第一のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団とも呼ばれる）は、ＲＥＰ段階での第二の増殖の前に、遺伝子改変を受けることができる。
【0141】
該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を組み込む従来のプロセスでは、ｐｒｅ－ＲＥＰとＲＥＰの間の境界は、ＴＩＬがＩＬ－２の存在下での増殖を経て、ＲＥＰを開始するために必要な適切な細胞数に達した後、または所定の期間のｐｒｅ－ＲＥＰを経た後に生じる。様々な実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰは、得られたＴＩＬの数が、使用される製造プロトコルに応じて、１×１０６、１０×１０６、４×１０６または４０×１０６細胞の場合に完結し得る。別の実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰは、培養期間が、断片化が行われてから達した期間が３～１４日または最大９～１４日の場合に完結し得る。ＴＩＬは、その後、さらなる使用のために直接凍結保存される場合もあれば、ＲＥＰに移行する場合もある。
【0142】
場合によっては、該ｐｒｅ－ＲＥＰまたは第一の増殖段階から得られたＴＩＬは、選択用の表現型が決定されるまで保存される。場合によっては、該第一の増殖から得られたＴＩＬは、保存されず、第二の増殖またはＲＥＰ段階へ直接進む。場合によっては、該ｐｒｅ－ＲＥＰ段階から得られたＴＩＬは、第一の増殖後、第二の増殖またはＲＥＰ段階の前に凍結保存されない。
【0143】
ｂ．従来の多段階ＴＩＬ製造における第二の及び後続の増殖段階：ＲＥＰ
従来の多段階ＴＩＬ製造では、場合によっては、該ＴＩＬ細胞集団は、採取及び最初のバルクプロセス、すなわち、ｐｒｅ－ＲＥＰの後、数を増加させる。このさらなる増殖は、第二の増殖と呼ばれ、これは、当技術分野では一般に急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）と呼ばれる増殖プロセスを含み得る。該第二の増殖またはＲＥＰは、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含めたいくつかの成分を含む培地を使用し、気体透過性容器内で遂行される。場合によっては、該第二の増殖またはＲＥＰは、当業者に既知の任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行うことができ、７～１４日間またはそれ以上続けることができる。
従来の多段階ＴＩＬ製造では、場合によっては、該ＴＩＬ細胞集団は、採取及び最初のバルクプロセス、すなわち、ｐｒｅ－ＲＥＰの後、数を増加させる。このさらなる増殖は、第二の増殖と呼ばれ、これは、当技術分野では一般に急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）と呼ばれる増殖プロセスを含み得る。該第二の増殖またはＲＥＰは、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含めたいくつかの成分を含む培地を使用し、気体透過性容器内で遂行される。場合によっては、該第二の増殖またはＲＥＰは、当業者に既知の任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行うことができ、７～１４日間またはそれ以上続けることができる。
【0144】
場合によっては、該第二の増殖またはＲＥＰは、気体透過性容器内で、当技術分野で既知の方法を使用して行われ得る。例えば、ＴＩＬは、非特異的Ｔ細胞受容体刺激をインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で使用して急速に増殖し得る。該非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．もしくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）またはＵＣＨＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、該第二の増殖の間に、任意にベクターから発現され得るヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭのＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）等のがんの１つ以上の抗原を、その抗原性部分、例えば、エピトープ（複数可）を含めて取り入れることにより、任意にＴ細胞成長因子、例えば、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で、インビトロでさらに該ＴＩＬの刺激を誘導するために増殖させることができる。他の適切な抗原としては、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原性部分が挙げられ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２発現抗原提示細胞にパルスしたがんの同じ抗原（複数可）での再刺激によっても急速に増殖し得る。代替的に、該ＴＩＬは、さらに、例えば、照射された自己リンパ球で、または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２で再刺激され得る。いくつかの実施形態では、該再刺激は、該第二の増殖の一部として行われる。いくつかの実施形態では、該第二の増殖は、照射された自己リンパ球の存在下で、または照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２で行われる。
【0145】
場合によっては、該第二の増殖またはＲＥＰは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む補充細胞培地で行われ得る。場合によっては、該抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）である。場合によっては、該急速増殖及び／または第二の増殖でのＴＩＬのＰＢＭＣ及び／または抗原提示細胞に対する比は、１～２５及び１～５００である。場合によっては、ＲＥＰ及び／または該第二の増殖は、該バルクＴＩＬを、１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と１５０ｍｌの培地で混合したフラスコ内で行われる。培地交換は、細胞が別の成長チャンバーに移されるまで行われる（一般に、新鮮培地での呼吸を介した１／２または１／３培地交換）。別の成長チャンバーとしては、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及び気体透過性容器が挙げられる。
【0146】
場合によっては、該第二の増殖またはＲＥＰが行われ、これはさらに、ＴＩＬが優れた腫瘍反応性に関して選択される段階を含む。当技術分野で既知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号に記載の方法を使用して、ＴＩＬを優れた腫瘍反応性に関して選択してもよい。任意に、細胞生存アッセイを、該第二の増殖（ＲＥＰ増殖と呼ばれる増殖を含む）後に、当技術分野で既知の標準的なアッセイを使用して行うことができる。例えば、トリパンブルー色素排除アッセイを該バルクＴＩＬのサンプルで行うことができ、これにより、死細胞が選択的に標識され、生存の評価が可能になる。場合によっては、ＴＩＬサンプルを、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２自動細胞カウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍａｓｓ．）を使用して計数し、生存率を決定することができる。
【0147】
場合によっては、さらなる増殖段階を第二の増殖に加えて行うことができる。
【0148】
ｃ．フィーダー細胞
多くの場合、従来の多段階フィーダー細胞系ＴＩＬ増殖方法で使用されるフィーダー細胞は、健康な献血者に由来する標準的な全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。該ＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ－Ｐａｑｕｅ勾配分離等の標準的な方法を使用して得られる。一般に、該同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、ＲＥＰ手順で使用される。場合によっては、ＰＢＭＣは、該ＲＥＰの０日目及び／または該第二の増殖の０日目（すなわち、該第二の増殖の開始日）に培養に移された最初の生存細胞数より、１４日目の全生存細胞数が少ない場合に、複製能力がないと見なされ、ＴＩＬの増殖手順での使用に受け入れられる。
多くの場合、従来の多段階フィーダー細胞系ＴＩＬ増殖方法で使用されるフィーダー細胞は、健康な献血者に由来する標準的な全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。該ＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ－Ｐａｑｕｅ勾配分離等の標準的な方法を使用して得られる。一般に、該同種異系ＰＢＭＣは、照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、ＲＥＰ手順で使用される。場合によっては、ＰＢＭＣは、該ＲＥＰの０日目及び／または該第二の増殖の０日目（すなわち、該第二の増殖の開始日）に培養に移された最初の生存細胞数より、１４日目の全生存細胞数が少ない場合に、複製能力がないと見なされ、ＴＩＬの増殖手順での使用に受け入れられる。
【0149】
場合によっては、ＰＢＭＣは、ＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された全生存細胞数が、７日目及び１４日目に、該ＲＥＰの０日目及び／または該第二の増殖の０日目（すなわち、該第二の増殖の開始日）に培養に移された最初の生存細胞数から増加していない場合に、複製能力がないと見なされ、本明細書に記載のＴＩＬの増殖手順での使用に受け入れられる。場合によっては、該ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２の存在下で培養される。
【0150】
場合によっては、該第二の増殖またはＲＥＰ手順は、約２．５×１０９個のフィーダー細胞を、１２．５×１０６個のＴＩＬ～１００×１０６個のＴＩＬに対する比で必要とする。
【0151】
該第二の増殖段階またはＲＥＰの後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬは、１回、２回、３回、４回またはそれ以上の増殖段階の後、採取される。ＴＩＬは、例えば、遠心分離を含めた任意の適切な無菌の方法で採取され得る。ＴＩＬの採取方法は、当技術分野で周知であり、任意のかかる既知の方法が本プロセスとともに使用され得る。
【0152】
２．ＴＩＬの増殖及び活性化のための新たな一段階法
上記従来のＴＩＬの多段階フィーダー細胞依存性増殖及び活性化プロセスは、複数の段階及びフィーダー細胞を必要とし、両方が必要であることにより、該従来のプロセスを、時間及び費用がかかるものにしている。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を使用する免疫療法を必要とする患者は、多くの場合、極めて予後不良であり、増殖及び分化したＴＩＬの集団で迅速に治療することが、生死の問題を構成し得る。
上記従来のＴＩＬの多段階フィーダー細胞依存性増殖及び活性化プロセスは、複数の段階及びフィーダー細胞を必要とし、両方が必要であることにより、該従来のプロセスを、時間及び費用がかかるものにしている。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を使用する免疫療法を必要とする患者は、多くの場合、極めて予後不良であり、増殖及び分化したＴＩＬの集団で迅速に治療することが、生死の問題を構成し得る。
【0153】
一例を挙げれば、かかる治療を必要とする患者は、多くの場合瀕死の状態にあるため、該増殖の期間は困難であり、遅れにより、該治療が施される前に死に至る可能性がある。本明細書に記載の方法によるＴＩＬの増殖に必要な期間を短縮する能力により、従来の長期にわたるプロセスと比較して顕著な利点がもたらされる。さらに、本明細書に記載のエフェクター機能を増加させるように遺伝子操作されたＴＩＬは、より急速に増殖する能力のため、ひいては増殖のための時間を短縮するため、及び腫瘍細胞をより効果的に殺傷する能力のために有利である。
【0154】
さらに、フィーダー細胞への依存は、少なくともいくつかの理由で困難をもたらす。第一に、生存能力のあるフィーダー細胞集団を得ることは、該細胞が同種異系の３～５ドナーから採取されるために極めて困難である。ドナー細胞の各集団は、ＴＩＬを増殖させるその能力について、個別に特定しなければならないため、このフィーダー細胞の異種供給源が、それらの使用を標準化できなくする。同様に、フィーダー細胞における固有のばらつきのため、フィーダー細胞を使用するＴＩＬの増殖は、再現性が低く予測しにくくなる。第二に、フィーダー細胞を使用する場合、ＴＩＬはフィーダー細胞の存在下では操作することができないため、ＴＩＬは、ＲＥＰ相の間ではなく、その前または後にのみ、操作または遺伝子改変され得る。第三に、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）を含むＴＩＬの製造方法では、フィーダー細胞が死滅するまで増殖したＴＩＬの集団を使用することができないため、ＲＥＰを短縮することはできない。第四に、ＴＩＬを刺激するためのフィーダー細胞の使用により、該刺激剤を洗い落とすこと及び／または除去することができなくなる。従って、場合によっては、従来のプロセスのｐｒｅ－ＲＥＰ及びＲＥＰ段階では、所望の数のＴＩＬを産生することができない。少なくとも上記の３つの理由で、いくつかの実施形態では、フィーダー細胞への依存を排除する必要があり、これが、本発明で達成されたことであり、本明細書に開示される。フィーダー細胞を排除することで、ＴＩＬの増殖プロセスの高度な制御が可能になる。例えば、該ＴＩＬの増殖プロセスを、必要数のＴＩＬが得られた時点で停止することができる。
【0155】
本明細書に開示する方法の１つの態様では、従来のＴＩＬの増殖プロトコルのｐｒｅ－ＲＥＰ段階は、完全に省略される。驚くべきことに、この単一の増殖段階で、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階を使用することなく、すなわち、一段階のＴＩＬの活性化及び増殖プロセスにおいて、２１日以下で多数のＴＩＬを得ることができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、一段階ＲＥＰ様プロセスを使用し、フィーダー細胞によって増殖させる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ等の粒子を使用して一段階プロセスで増殖させる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ製等の四量体抗体複合体（ＴＡＣ）を使用して一段階プロセスで増殖させる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｔｒａｎｓａｃｔ）製等のナノマトリックスを使用して一段階プロセスで増殖させる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、該一段階ＴＩＬ増殖プロセスの間に操作または遺伝子改変する。
【0156】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬは、上記従来のｐｒｅ－ＲＥＰを使用した以前の失敗物に由来する。ある特定の実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗とは、ヒト対象から単離されたＴＩＬをｐｒｅ－ＲＥＰプロトコルを使用して２３日で４×１０７細胞まで増殖させられないことである。他の実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗とは、ヒト対象から単離されたＴＩＬを元の数の１００倍超まで増殖させられないことである。他の実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗とは、ヒト対象から単離されたＴＩＬをｐｒｅ－ＲＥＰプロトコルを使用して１×１０６または１×１０７細胞まで増殖させられないことである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する方法は、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗を取り返すこと、すなわち、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗を経験したサンプルから細胞を増殖させることができる。
【0157】
本明細書に開示する方法の１つの態様では、解離した腫瘍サンプル中でＴＩＬの集団を増殖させる方法は、該解離した腫瘍サンプルを培地中で培養することを含み、該ＴＩＬを、その中でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、及び／またはＴ細胞刺激サイトカインと接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、４－１ＢＢアゴニストと接触させる。
【0158】
いくつかの実施形態では、該解離した腫瘍サンプルは、サイズが０．５～４ｍｍ３の腫瘍断片を含む。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが０．５～１ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが０．５～１．５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが１．５～２ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが２～２．５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが２．５～３ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが３～３．５ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該腫瘍断片は、サイズが３．５～４ｍｍ３である。いくつかの実施形態では、該解離した腫瘍サンプルは、消化された腫瘍断片を含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、該培地には、１～２日、２～３日、３～４日、４～５日、または５～６日の間隔で、Ｔ細胞刺激サイトカインが補充される。いくつかの実施形態では、該間隔は１日である。いくつかの実施形態では、該間隔は２日である。いくつかの実施形態では、該間隔は３日である。いくつかの実施形態では、該間隔は４日である。いくつかの実施形態では、該間隔は５日である。いくつかの実施形態では、該間隔は６日である。
【0160】
いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、１０Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、１０Ｕ／ｍｌ～２００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、２００Ｕ／ｍｌ～３００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、３００Ｕ／ｍｌ～４００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、４００Ｕ／ｍｌ～５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、５００Ｕ／ｍｌ～６００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、６００Ｕ／ｍｌ～７００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、７００Ｕ／ｍｌ～８００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、８００Ｕ／ｍｌ～９００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、９００Ｕ／ｍｌ～１０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、１，０００Ｕ／ｍｌ～１，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、１，５００Ｕ／ｍｌ～２，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、２，０００Ｕ／ｍｌ～２，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、２，５００Ｕ／ｍｌ～３，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、３，０００Ｕ／ｍｌ～３，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、３，５００Ｕ／ｍｌ～４，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、４，０００Ｕ／ｍｌ～４，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、４，５００Ｕ／ｍｌ～５，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、５，０００Ｕ／ｍｌ～５，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、５，５００Ｕ／ｍｌ～６，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、６，０００Ｕ／ｍｌ～６，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインの最終濃度は、６，５００Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである。
【0161】
該Ｔ細胞刺激サイトカインは、Ｔ細胞を刺激するのに有効な任意のサイトカインであり得る。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞刺激サイトカインは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法はさらに、該解離した腫瘍サンプル及び／またはＴＩＬの集団を、該サイトカインＩＬ－２と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、該サイトカインＩＬ－２と１日おきに接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、２日、３日、４日、５日、または６日の間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、２日の間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、３日の間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、４日の間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、５日の間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、６日の間隔で、該サイトカインＩＬ－２と接触させる。
【0162】
いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、１００Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、１０Ｕ／ｍｌ～２００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、２００Ｕ／ｍｌ～３００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、３００Ｕ／ｍｌ～４００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、４００Ｕ／ｍｌ～５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、５００Ｕ／ｍｌ～６００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、６００Ｕ／ｍｌ～７００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、７００Ｕ／ｍｌ～８００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、８００Ｕ／ｍｌ～９００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、９００Ｕ／ｍｌ～１０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、１，０００Ｕ／ｍｌ～１，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、１，５００Ｕ／ｍｌ～２，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、２，０００Ｕ／ｍｌ～２，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、２，５００Ｕ／ｍｌ～３，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、３，０００Ｕ／ｍｌ～３，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、３，５００Ｕ／ｍｌ～４，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、４，０００Ｕ／ｍｌ～４，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、４，５００Ｕ／ｍｌ～５，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、５，０００Ｕ／ｍｌ～５，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、５，５００Ｕ／ｍｌ～６，０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、６，０００Ｕ／ｍｌ～６，５００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該サイトカインＩＬ－２の最終濃度は、６，５００Ｕ／ｍｌ～７，０００Ｕ／ｍｌである。
【0163】
いくつかの実施形態では、該培地の成分は、維持される。いくつかの実施形態では、該培地の３０％～９９％は、１～２日、２～３日、３～４日、４～５日、または５～６日の間隔で変更される。いくつかの実施形態では、該間隔は１日である。いくつかの実施形態では、該間隔は２日である。いくつかの実施形態では、該間隔は３日である。いくつかの実施形態では、該間隔は４日である。いくつかの実施形態では、該間隔は５日である。いくつかの実施形態では、該間隔は６日である。
【0164】
ａ．フィーダー細胞
いくつかの実施形態では、該培地は、フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト及び／または４－１ＢＢアゴニストを発現する。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＢａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ，５：１１７（２０１５）に記載の通り、４１ＢＢアゴニストを発現する。いくつかの実施形態では、該４－１ＢＢアゴニストは、４－１ＢＢリガンドである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト及び／または４－１ＢＢアゴニストは、該フィーダー細胞の表面で発現される。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、ＣＤ３アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニストは、ＯＫＴ３またはＵＣＨＴである。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、該培地に溶解する。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、ＡＰＣである。いくつかの実施形態では、該ＡＰＣは、Ｋ５６２細胞である。いくつかの実施形態では、該ＡＰＣは、上記のタンパク質を発現するように改変される。
いくつかの実施形態では、該培地は、フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト及び／または４－１ＢＢアゴニストを発現する。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＢａｒｔｋｏｗｉａｋ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ，５：１１７（２０１５）に記載の通り、４１ＢＢアゴニストを発現する。いくつかの実施形態では、該４－１ＢＢアゴニストは、４－１ＢＢリガンドである。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト及び／または４－１ＢＢアゴニストは、該フィーダー細胞の表面で発現される。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、ＣＤ３アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニストは、ＯＫＴ３またはＵＣＨＴである。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、該培地に溶解する。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、ＡＰＣである。いくつかの実施形態では、該ＡＰＣは、Ｋ５６２細胞である。いくつかの実施形態では、該ＡＰＣは、上記のタンパク質を発現するように改変される。
【0165】
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、もう１つの遺伝子の発現を低減するように遺伝子改変される。これらの遺伝子改変に関するさらなる開示を以下に提供する。
【0166】
いくつかの実施形態では、Ｋ５６２細胞は、ＯＫＴ３「ａＡＰＣ－ＯＫＴ３」を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、使用前に照射される（例えば、１５，０００ｒａｄで）。いくつかの実施形態では、Ｋ５６２細胞は、ＯＫＴ３及びＣＤ８６「ａＡＰＣ－ＯＫＴ３－ＣＤ８６」を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、使用前に照射される（例えば、１５，０００ｒａｄで）。いくつかの実施形態では、ｐｒｅ－ＲＥＰ失敗ＴＩＬを、可溶性活性化因子または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）で増殖させる。
【0167】
いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞は、該Ｔ細胞刺激サイトカインを発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、該フィーダー細胞が遺伝子改変されて発現するＴ細胞刺激サイトカインは、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態では、該培地は、フィーダー細胞を含まない。
【0168】
いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、Ｔ細胞刺激サイトカイン及びフィーダー細胞を使用して増殖させる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを、Ｔ細胞刺激サイトカインを使用し、フィーダー細胞を使用せずに増殖させる。
【0169】
ｂ．ナノマトリックス
可動性マトリックスを有し、刺激剤（複数可）またはアゴニストが結合した、１μｍまたは５００ｎｍ未満のナノマトリックスは、Ｔ細胞を刺激することができる。ある特定の実施形態では、５００ｎｍ未満のマトリックスは、同じサイズのビーズまたはミクロスフェアとは対照的に、固相表面を有さない（柔軟な可動相をもたらす）。該ナノマトリックスは、可動性ポリマー材料からなるメッシュまたはネットに類似している。ある特定の実施形態では、該ポリマー材料は、デキストランである。ある特定の実施形態では、該ナノマトリックスは、標的細胞、例えば、Ｔ細胞の細胞膜にアクセスする能力をもたらすプラスチックである。従って、該ナノマトリックスは、該細胞表面のそれぞれの標的（例えば、受容体）に、該可動性マトリックスに結合したそのアゴニストとともに結合し、それにより、該マトリックスの柔軟性が該結合パートナーとの最適な相互作用を可能にする。ある程度まで、該ナノマトリックスの形状は、該標的細胞表面に適合するため、ナノマトリックスと標的細胞の間の接触表面が拡大される。該マトリックスのサイズは１～５００ｎｍのため、細胞で摂動を引き起こすには小さすぎる。すなわち、該ナノマトリックスは、細胞の機能の変化に関しては生物学的に不活性である。サイズが１μｍ以上のビーズまたはミクロスフェアが使用される場合には、直接的な細胞／ビーズの接触によって引き起こされるかかる摂動は問題である。さらに、優先的には、該ナノマトリックスは、生分解性のポリマー材料、例えば、デキストランのポリマーからなる組成物のため、生分解性であり、細胞に対して毒性がない。その結果、該ナノマトリックスは、細胞機能の変化に関して完全に生物学的に不活性であるが、生分解性である実体である。従って、刺激及び増殖のためにＴ細胞と接触させた後に該ナノマトリックスを除去する必要がない。これらの細胞のその後の分析、実験、及び／または臨床応用に対して、活性化されたＴ細胞組成物におけるナノマトリックスの存在に起因する攪乱効果は生じない。
可動性マトリックスを有し、刺激剤（複数可）またはアゴニストが結合した、１μｍまたは５００ｎｍ未満のナノマトリックスは、Ｔ細胞を刺激することができる。ある特定の実施形態では、５００ｎｍ未満のマトリックスは、同じサイズのビーズまたはミクロスフェアとは対照的に、固相表面を有さない（柔軟な可動相をもたらす）。該ナノマトリックスは、可動性ポリマー材料からなるメッシュまたはネットに類似している。ある特定の実施形態では、該ポリマー材料は、デキストランである。ある特定の実施形態では、該ナノマトリックスは、標的細胞、例えば、Ｔ細胞の細胞膜にアクセスする能力をもたらすプラスチックである。従って、該ナノマトリックスは、該細胞表面のそれぞれの標的（例えば、受容体）に、該可動性マトリックスに結合したそのアゴニストとともに結合し、それにより、該マトリックスの柔軟性が該結合パートナーとの最適な相互作用を可能にする。ある程度まで、該ナノマトリックスの形状は、該標的細胞表面に適合するため、ナノマトリックスと標的細胞の間の接触表面が拡大される。該マトリックスのサイズは１～５００ｎｍのため、細胞で摂動を引き起こすには小さすぎる。すなわち、該ナノマトリックスは、細胞の機能の変化に関しては生物学的に不活性である。サイズが１μｍ以上のビーズまたはミクロスフェアが使用される場合には、直接的な細胞／ビーズの接触によって引き起こされるかかる摂動は問題である。さらに、優先的には、該ナノマトリックスは、生分解性のポリマー材料、例えば、デキストランのポリマーからなる組成物のため、生分解性であり、細胞に対して毒性がない。その結果、該ナノマトリックスは、細胞機能の変化に関して完全に生物学的に不活性であるが、生分解性である実体である。従って、刺激及び増殖のためにＴ細胞と接触させた後に該ナノマトリックスを除去する必要がない。これらの細胞のその後の分析、実験、及び／または臨床応用に対して、活性化されたＴ細胞組成物におけるナノマトリックスの存在に起因する攪乱効果は生じない。
【0170】
さらに、可溶性またはコロイドであるため、未結合のナノマトリックスは、Ｔ細胞の刺激プロセス後にＴ細胞の活性化閾値未満の有効濃度まで、繰り返される洗浄段階によって容易に希釈され得る。
【0171】
該ナノマトリックスの可動性マトリックスは、Ｔ細胞に活性化シグナル（複数可）を提供する１つ以上の刺激アゴニストが結合されているため、該Ｔ細胞が活性化され、増殖が誘導される。該アゴニストは、細胞表面構造に結合することができ、該細胞の多クローン性刺激を誘導することができる分子である。該ナノマトリックスの可動性マトリックスに結合する薬剤の一例は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、抗ＣＤ２８ｍＡｂ等の共刺激タンパク質の組み合わせである。
【0172】
滅菌フィルターを通過することが可能なナノマトリックスの特徴により、滅菌フィルター、例えば、細胞培養バッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂａｘｔｅｒ，ＣｅｌｌＧｅｎｉｃｓ）、Ｇ－Ｒｅｘ装置（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒ Ｔｅｃｈｎｉｋ ８５：１０３－１１０参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）を備えた、または備えることが可能な閉鎖細胞培養系に添加することが可能になる。該ナノマトリックスは、該フィルターを通して該ナノマトリックスを押すためのシリンジまたはバッグもしくはバイアル（通気孔付きのバイアルアダプターに接続されている）から該フィルターを通して該ナノマトリックスを引くポンプを使用して閉鎖細胞培養系に添加することができる。
【0173】
該接触は、例えば、インビトロで、細胞を保持することができる任意の容器内で、好ましくは、滅菌環境で行われ得る。かかる容器は、例えば、培養フラスコ、培養バッグ、バイオリアクターまたは細胞を成長させるために使用され得る任意の装置でよい（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２００９０７２００３のサンプルプロセッシングシステム、すなわち、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙシステム）。
【0174】
本発明で使用されるナノマトリックスは、少なくとも１つの第一の薬剤及び１つの第二の薬剤が同じ可動性マトリックスに結合したナノマトリックスであり得る。この種類のマトリックスをＴ細胞と接触させることにより、該Ｔ細胞を活性化してその増殖を誘導する。同じ柔軟性マトリックスに結合した該第一及び該第二の薬剤の比は、１００：１～１：１００、優先的には１０：１～１：１０、最も優先的には、２：１～１：２の比の範囲であり得る。
【0175】
さらに、本発明のナノマトリックスは、少なくとも１つの第一のアゴニスト及び１つの第二のアゴニストが、別々の可動性マトリックスに結合したナノマトリックスであり得る。これらのナノマトリックスの混合物をＴ細胞と接触させることにより、該Ｔ細胞を活性化してその増殖を誘導する。該第一の薬剤が結合した可動性マトリックスと、該第二の薬剤が結合した可動性マトリックスの比及び／または濃度は、使用されるＴ細胞及び／または使用される薬剤の種類に応じて、最適な刺激結果を得るように変化し得る。これは、該第一の薬剤が結合した可動性マトリックスと、該第二の薬剤が結合した可動性マトリックスの様々な濃度及び比を滴定することによる特殊なＴ細胞のサブセットに対する活性化条件の最適化を容易にする。
【0176】
ナノマトリックスは、溶媒蒸発、相分離、噴霧乾燥、または低温での溶媒抽出を含めた当技術分野で既知の様々な方法によって調製され得る。選択されるプロセスは、単純で、再現性があり、拡大可能であるべきである。得られるナノマトリックスは、均一で注射可能な懸濁液を生成するための流動性を有し、非凝集であるべきである。該ナノマトリックスは、無菌であるべきである。これは、例えば、濾過、最終滅菌段階によって及び／または無菌プロセスを介して確保され得る。ナノマトリックスの調製を実施例１に記載する。
【0177】
本明細書で使用される、「可動性ポリマー鎖のマトリックス」及び「可動性マトリックス」という用語は、交換可能な意味を有する。「可動性」という用語は、有機バイオポリマー、例えば、デキストランまたは他のもののナノ粒子上での一般的かつ十分に説明されている特徴を指す（Ｂｅｒｔｈｏｌｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００６，ｐｐ ４５４８５－５４９０参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。これらのポリマーは、可動性（運動性）、優先的には、高可動性（運動性）の鎖を含むため、該マトリックスは、該刺激剤、例えば、抗体のための結合点のような固体表面がないことを特徴とし、通常は柔軟性がなく堅い表面を有する現在使用されているビーズまたはミクロスフェアとは好対照をなす。結果として、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含む該ナノマトリックスは、柔軟であり、該細胞の表面の形状に調整可能である。さらに、結果として、該ナノマトリックスは、水溶液中で該ナノマトリックスの全体積の過半数（すなわち、５０％超）、優先的には、８０％超及びより優先的には９０％超ならびに最も優先的には、９９％超が、可動性ポリマー鎖からなるナノマトリックスである。
【0178】
１つ以上の刺激剤が共役したナノマトリックスと刺激される細胞との間の接触は、該ナノマトリックスが固定した、堅いまたは硬い表面を有さず、該ナノマトリックスを該細胞表面にアクセスさせるという事実から恩恵を受ける。ある特定の実施形態では、該ナノマトリックスは、親水性ポリマー鎖からなり、それにより、水溶液中での該鎖の水和に起因して最大の可動性が得られる。該可動性マトリックスは、結合する薬剤に関係なく、該ナノマトリックスの唯一の成分または少なくとも主成分である。
【0179】
アゴニストは、当技術分野で既知の利用可能な様々な方法によって該可動性マトリックスに結合または共役し得る。該結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、静電結合でも疎水結合でもよく、例えば、化学的、機械的、酵素的、またはある薬剤が該細胞を刺激することができる他の手段を含めた様々な結合手段によって達成され得る。例えば、細胞表面構造に対する抗体を、最初に該マトリックスに結合させる場合もあれば、ビオチン化薬剤への結合用にアビジンもしくはストレプトアビジンを該マトリックスに結合させる場合もある。該細胞表面構造に対する抗体は、該マトリックスに直接または間接的に、例えば、抗アイソタイプ抗体を介して結合され得る。別の例としては、プロテインＡもしくはプロテインＧ、または抗体を結合するためにマトリックスに結合した他の非特異的抗体結合分子の使用が挙げられる。代替的に、該薬剤は、該マトリックスに、化学的手段、例えば、該マトリックスへ架橋によって結合され得る。
【0180】
本明細書で使用される、「生物学的に不活性」という表現は、生細胞に毒性がなく、そのサイズが小さいことに起因して、結合しているリガンドまたは抗体の特異的リガンド／受容体の誘発機能を除いて、該細胞表面との物理的相互作用を介した該細胞機能の強い変化を誘導しないナノマトリックスの特性を指す。該ナノマトリックスは、さらに、生分解性であってもよく、例えば、酵素活性によって分解され得るか、または食細胞によって除去され得る。該生分解性材料は、生体液中、例えば、細胞培地及び血液中で分解する天然または合成材料に由来し得る。該分解は、酵素的方法を使用して行われる場合もあれば、酵素的方法なしで行われる場合もある。該生分解性材料は、暴露される環境条件による場合があるが、数日、数週間または数か月以内に分解する。該生分解性材料は、生細胞にとって、及びヒトにおいて毒性がなく、非抗原性であるべきである。該分解産物は、毒性のない副産物を生じる必要がある。生物学的に不活性であるという文脈での重要な側面は、該ナノマトリックスが、標識された細胞の構造にも、機能にも、活性状態にも、生存率にも強い変化を誘導しない、すなわち、該細胞の摂動を引き起こさず、その後の実験及び刺激された細胞の治療への応用を妨げないという事実である。該細胞の機械的または化学的刺激は、該ナノマトリックスが極めて小さく、すなわち、ナノスケールの範囲であり、該細胞表面の形状を変化させたり該細胞に対して強いせん断力を及ぼし、例えば、膜の破裂をもたらしたりするのではなく、該細胞表面に寄り添う可動性マトリックスを有する特性に起因して減少する。
【0181】
いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト及び／または該ＣＤ２８アゴニストは、ポリマー鎖のマトリックスのコロイド懸濁液を含むナノマトリックスに連結され、各ナノマトリックスは、その最大の寸法が、１～５００ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、１～５０ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、５０～１００ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、１００～１５０ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、１５０～２００ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、２００～２５０ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、２５０～３００ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、３００～３５０ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、３５０～４００ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、４００～４５０ｎｍの長さである。いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、その最大の寸法が、４５０～５００ｎｍの長さである。
【0182】
いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、同じポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、異なるポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約５μｇ～約１０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１０μｇ～約１５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１５μｇ～約２０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２０μｇ～約２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２５μｇ～約３０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３０μｇ～約３５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３５μｇ～約４０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４０μｇ～約４５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４５μｇ～約５０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、ＣＤ３アゴニストである。
【0183】
いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約５μｇ～約１０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１０μｇ～約１５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１５μｇ～約２０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２０μｇ～約２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２５μｇ～約３０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３０μｇ～約３５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３５μｇ～約４０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４０μｇ～約４５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４５μｇ～約５０μｇで該ナノマトリックスに結合している。
【0184】
いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、さらに、該ポリマー鎖のマトリックス間にまたはその中に埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を含む。いくつかの実施形態では、該ポリマー鎖のマトリックスは、デキストランのポリマーを含む。いくつかの実施形態では、該ポリマー鎖は、コロイドポリマー鎖である。
【0185】
いくつかの実施形態では、該解離した腫瘍サンプル中でのナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１０以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：２５以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５０以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：２００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：３００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：４００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：６００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：７００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：８００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：９００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１，０００以上である。
【0186】
いくつかの実施形態では、解離した腫瘍サンプル中のマトリックスとＴＩＬの数の比は、１：５００以上である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：５００～１：７５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：７５０～１：１，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，０００～１：１，２５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，２５０～１：１，５００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，５００～１：１，７５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，７５０～１：２，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，０００～１：２，２５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，２５０～１：２，５００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，５００～１：２，７５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，７５０～１：３，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：３，０００～１：３，５００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：３，５００～１：４，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：４，０００～１：５，０００である。
【0187】
いくつかの実施形態では、該アゴニストは、組み換えアゴニストである。いくつかの実施形態では、該アゴニストは、抗体である。いくつかの実施形態では、該抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニストは、ＯＫＴ３抗体またはＵＣＨＴ１抗体である。
【0188】
本明細書に開示する方法の別の態様では、ＴＩＬの集団を増殖させる方法は、ＴＩＬの集団を、ポリマー鎖のマトリックスのコロイド懸濁液を含むナノマトリックスと接触させることを含み、該マトリックスは、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストに結合し、該ナノマトリックスは、該ＴＩＬの集団に活性化シグナルを提供し、それにより、該ＴＩＬの集団を活性化してその増殖を誘導し、各マトリックスは、その最大の寸法が、１～５００ｎｍの長さであり、該方法は、該ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない。
【0189】
いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスと接触するＴＩＬの集団は、さらに腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、対象から単離され、該ナノマトリックスと接触し、該ＴＩＬの集団を該ナノマトリックスと接触させる前には該ＴＩＬの集団のさらなる増殖プロセスを含まない。
【0190】
いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、同じポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト及び該ＣＤ２８アゴニストは、異なるポリマー鎖に結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約５μｇ～約１０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１０μｇ～約１５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１５μｇ～約２０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２０μｇ～約２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２５μｇ～約３０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３０μｇ～約３５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３５μｇ～約４０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４０μｇ～約４５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４５μｇ～約５０μｇで該ナノマトリックスに結合している。
【0191】
いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約５μｇ～約１０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１０μｇ～約１５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約１５μｇ～約２０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２０μｇ～約２５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約２５μｇ～約３０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３０μｇ～約３５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約３５μｇ～約４０μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４０μｇ～約４５μｇで該ナノマトリックスに結合している。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニスト、またはその断片は、ナノマトリックス１ｍｇあたり約４５μｇ～約５０μｇで該ナノマトリックスに結合している。
【0192】
いくつかの実施形態では、該ナノマトリックスは、さらに、該ポリマー鎖のマトリックス間にまたはその中に埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を含む。いくつかの実施形態では、該ポリマー鎖のマトリックスは、デキストランのポリマーを含む。いくつかの実施形態では、該ポリマー鎖は、コロイドポリマー鎖である。
【0193】
いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１０以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：２５以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５０以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：２００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：３００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：４００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：５００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：６００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：７００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：８００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：９００以上である。いくつかの実施形態では、ナノマトリックスの体積とＴＩＬの体積の比は、１：１，０００以上である。
【0194】
いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：５００以上である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：５００～１：７５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：７５０～１：１，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，０００～１：１，２５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，２５０～１：１，５００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，５００～１：１，７５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：１，７５０～１：２，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，０００～１：２，２５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，２５０～１：２，５００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，５００～１：２，７５０である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：２，７５０～１：３，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：３，０００～１：３，５００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：３，５００～１：４，０００である。いくつかの実施形態では、マトリックスとＴＩＬの数の比は、１：４，０００～１：５，０００である。
【0195】
いくつかの実施形態では、該アゴニストは、組み換えアゴニストである。いくつかの実施形態では、該アゴニストは、抗体である。いくつかの実施形態では、該抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、該ＣＤ３アゴニストは、ＯＫＴ３抗体またはＵＣＨＴ１抗体である。
【0196】
ｃ．可溶性単一特異性複合体
本明細書に開示する方法の別の態様では、ＴＩＬの集団を増殖させる方法は、該ＴＩＬの集団を、第一、第二、及び第三の可溶性単一特異性複合体を含む組成物と接触させることを含み、各可溶性単一特異性複合体は、連結された２つの抗体またはその断片を含み、各可溶性単一特異性複合体の各抗体またはその断片は、該ＴＩＬの集団の同じ抗原に特異的に結合し、該第一の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ３抗体を含み、該第二の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ２８抗体を含み該第三の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ２抗体を含み、該方法は、該ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない。
本明細書に開示する方法の別の態様では、ＴＩＬの集団を増殖させる方法は、該ＴＩＬの集団を、第一、第二、及び第三の可溶性単一特異性複合体を含む組成物と接触させることを含み、各可溶性単一特異性複合体は、連結された２つの抗体またはその断片を含み、各可溶性単一特異性複合体の各抗体またはその断片は、該ＴＩＬの集団の同じ抗原に特異的に結合し、該第一の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ３抗体を含み、該第二の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ２８抗体を含み該第三の可溶性単一特異性複合体は、抗ＣＤ２抗体を含み、該方法は、該ＴＩＬの集団の増殖の過程でフィーダー細胞の使用を含まない。
【0197】
いくつかの実施形態では、該ＴＣＲアゴニストは、連結された２つの抗ＣＤ３抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２８アゴニストは、連結された２つの抗ＣＤ２８抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む。
【0198】
いくつかの実施形態では、該培地は、ＣＤ２アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、該ＣＤ２アゴニストは、連結された２つの抗ＣＤ２抗体を含む可溶性単一特異性複合体を含む。
【0199】
いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が０．２～２５μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が０．２～１μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が１～２μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が２～５μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が５～１０μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が１０～１５μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が１５～２０μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、濃度が２０～２５μｌ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、該可溶性単一特異性複合体は、四量体抗体複合体（ＴＡＣ）である。いくつかの実施形態では、各ＴＡＣは、第一の動物種由来の２つの抗体を含み、これらが、該第一の動物種由来の抗体のＦｃ部分に特異的に結合する第二の種由来の２つの抗体分子によって結合されている。いくつかの実施形態では、該抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３抗体またはＵＣＨＴ１抗体である。いくつかの実施形態では、可溶性単一特異性複合体は、セントラルメモリーＴ細胞表現型を増加させるのに特に有効である。
【0200】
ｄ．ＴＩＬの増殖
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最初の腫瘍断片化または解離から最大で合計９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、合計で９～２５日間、９～２１日間、または９～１４日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計９日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１０日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１１日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１２日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１３日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１４日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１５日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１６日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１７日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１８日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１９日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２０日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２１日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２２日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２３日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２４日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２５日間増殖させる。
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最初の腫瘍断片化または解離から最大で合計９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、合計で９～２５日間、９～２１日間、または９～１４日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計９日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１０日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１１日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１２日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１３日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１４日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１５日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１６日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１７日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１８日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計１９日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２０日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２１日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２２日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２３日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２４日間増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬを、最大で合計２５日間増殖させる。
【0201】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、５００～５００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、５００～１，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、１，０００～２，５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、２，５００～５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、５，０００～１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、１０，０００～２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、２０，０００～３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、３０，０００～４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、４０，０００～５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、５０，０００～１００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、１００，０００～１５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、１５０，０００～２００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、２００，０００～２５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、２５０，０００～３００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、３００，０００～３５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、３５０，０００～４００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、４００，０００～４５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、４５０，０００～５００，０００倍増殖させる。
【0202】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、１００～１００，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、１００～１，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、１，０００～２，５００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、２，５００～５，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、５，０００～７，５００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、７，５００～１０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、１０，０００～２０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、２０，０００～３０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、３０，０００～４０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、４０，０００～５０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、５０，０００～６０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、６０，０００～７０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、７０，０００～８０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、８０，０００～９０，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、９０，０００～１００，０００個のＴＩＬの初期集団から増殖させる。
【0203】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも１５０倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも７５０倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも１０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも１５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも２０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも２５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも３０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも４０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも５０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも６０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも７０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも８０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも９０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１０日目の時点で少なくとも１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、１０日目でのこれらの増殖倍率はｐｒｅ－ＲＥＰの失敗に由来するＴＩＬで生じる。
【0204】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１，５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも７，５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも２５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも６０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも７０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも８０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも９０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で少なくとも１４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、１４日目でのこれらの増殖倍率は、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗に由来するＴＩＬで生じる。
【0205】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大７，５００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大２５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大６０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大７０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大８０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大９０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から１４日目の時点で最大１４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、１４日目でのこれらの増殖倍率は、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗に由来するＴＩＬで生じる。
【0206】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも２５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも６０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも７０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも８０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも９０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも１５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも２００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも３００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で少なくとも４００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、２１日目でのこれらの増殖倍率は、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗に由来するＴＩＬで生じる。
【0207】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大５００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大２５，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大６０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大７０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大８０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大９０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大１００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大１１０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大１２０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大１３０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大１４０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大１５０，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大２００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大３００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を、増殖から２１日目の時点で最大４００，０００倍増殖させる。いくつかの実施形態では、２１日目でのこれらの増殖倍率は、ｐｒｅ－ＲＥＰの失敗に由来するＴＩＬで生じる。
【0208】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用して遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、Ｃａｓ９及び少なくとも１つのガイドＲＮＡを使用して遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団の成員は、エピジェネティックに改変される。
【0209】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも２％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも３％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも４％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも６％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも７％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも８％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも９％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１１％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１２％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１３％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１４％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖した集団の少なくとも１５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。
【0210】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の５～５０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の１０～２５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の５～１０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の１０～１５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の１５～２０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の２０～２５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の２５～３０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の３０～３５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の３５～４０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の４０～４５％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、増殖から１４日目の時点で増殖した集団の４５～５０％がセントラルメモリーＴ細胞表現型を有する増殖したＴＩＬの集団を産生する。
【0211】
いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団を増殖させ、ＣＤ８＋細胞の存在度が増加した増殖したＴＩＬの集団を産生する。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に１０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に２０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に３０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に４０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に５０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に６０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に７０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に８０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に９０％濃縮される。いくつかの実施形態では、該ＴＩＬの集団は、ＴＩＬの開始集団と比較して、増殖後に１００％濃縮される。
【0212】
別の態様では、本明細書に開示する本発明は、本明細書に開示する方法のいずれかによって産生される増殖したＴＩＬの集団を含む組成物に関する。
【0213】
Ｂ．増殖したＴＩＬの表現型の特徴
場合によっては、該増殖したＴＩＬは、本明細書に記載のものを含めた多くの表現型マーカーの発現について分析される。場合によっては、該マーカーは、ＴＣＲα／β、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲから選択される。場合によっては、調節マーカー、すなわち、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４の群から１つ以上の発現が測定される。
場合によっては、該増殖したＴＩＬは、本明細書に記載のものを含めた多くの表現型マーカーの発現について分析される。場合によっては、該マーカーは、ＴＣＲα／β、ＣＤ５７、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２７、ＣＤ５６、ＣＤ８ａ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ８ａ、ＣＣＲ７、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ３８、及びＨＬＡ－ＤＲから選択される。場合によっては、調節マーカー、すなわち、ＣＤ１３７、ＣＤ８ａ、Ｌａｇ３、ＣＤ４、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＤ６９、ＣＤ８ａ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１５４の群から１つ以上の発現が測定される。
【0214】
場合によっては、メモリーマーカーは、ＣＣＲ７またはＣＤ６２Ｌである。場合によっては、再刺激されたＴＩＬはまた、サイトカイン放出について、サイトカイン放出アッセイを使用して評価され得る。場合によっては、ＴＩＬは、ＯＫＴ３でのまたは自己腫瘍消化物との共培養での刺激に反応したインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）の分泌について評価され得る。
【0215】
場合によっては、ＴＩＬは、様々な調節マーカー、例えば、ＴＣＲα／β、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ１２２について評価される。
【0216】
Ｃ．ＴＩＬの遺伝子改変
場合によっては、該ＴＩＬは、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１等の腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）もしくは系統限定細胞表面分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９もしくはＨＥＲ２）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられるがこれらに限定されないさらなる機能性を含めるために遺伝子操作される。
場合によっては、該ＴＩＬは、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１等の腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）もしくは系統限定細胞表面分子（例えば、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９もしくはＨＥＲ２）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が挙げられるがこれらに限定されないさらなる機能性を含めるために遺伝子操作される。
【0217】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下をもたらす１つ以上のゲノム修飾を含むＴＩＬならびに１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む免疫エフェクター細胞を包含する改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、これらの内在性遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａを含む（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、ＮＦＫＢＩＡを含む。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子は、ＳＯＣＳ１ならびにＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの遺伝子を含む。
【0218】
本明細書では、「改変ＴＩＬ」という用語は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下をもたらす非自然的な手段で生じる１つ以上のゲノム改変を含むＴＩＬ、ならびに１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる天然に存在しない遺伝子調節系を含むＴＩＬを包含する。「改変ＴＩＬ」という用語は、「操作されたＴＩＬ」または「ｅＴＩＬ（商標）」という用語と同義で使用される。
【0219】
本明細書では、「未改変のＴＩＬ」または「対照ＴＩＬ」とは、ゲノムが外因性の手段を使用して改変されておらず、外因性の遺伝子調節系を含まないか、または対照の遺伝子調節系を含む（例えば、空のベクター対照、非標的ｇＲＮＡ、スクランブルｓｉＲＮＡ等）細胞または細胞の集団を指す。ＴＩＬになされ得る例示的な改変は、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１に示されている。１つ以上の内在性遺伝子の発現及び／または機能が低下した天然に存在するＴＩＬは、未改変のＴＩＬまたは対照ＴＩＬという用語に含まれる。
【0220】
理論に拘束されることを望むものではないが、ＴＩＬは、腫瘍抗原に対する特異性が増加していると考えられており（Ｒａｄｖａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ Ｒｅｓ １８：６７５８－６７７０、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、それ故、腫瘍抗原特異的免疫反応（例えば、活性化、増殖、及びがん細胞に対する細胞傷害活性）を媒介することができ、外因性の操作された受容体を導入することなくがん細胞の破壊をもたらすと考えられる（Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ １５：３１－４６、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。従って、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、対象の腫瘍から単離され、エキソビボで増殖し、対象に再注入される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自己腫瘍抗原に特異的な１つ以上の外因性受容体を発現するように改変され、エキソビボで増殖し、該対象に再注入される。かかる実施形態は、マウスががん抗原（例えば、ＣＤ１９）を発現するがん細胞株を移植され、該がん抗原に特異的な外因性受容体を発現する改変Ｔ細胞で処理されたものであるインビボマウスモデルを使用して具現化され得る。
【0221】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に、該内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させる１つ以上の改変（例えば、１つ以上の核酸の挿入、欠失または変異）を含む。かかる改変は、本明細書では、「不活性化突然変異」と呼ばれ、不活性化突然変異を含む内在性遺伝子は、「改変内在性標的遺伝子」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、該不活性化突然変異は、ｍＲＮＡの転写を低減または阻害するため、コードされたｍＲＮＡ転写物及びタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、該不活性化突然変異は、ｍＲＮＡの翻訳を低減または阻害するため、コードされたタンパク質の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、該不活性化突然変異は、内在性タンパク質の未改変（すなわち、野生型）型と比較して機能が低下または変更された改変内在性タンパク質をコード（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）する。ＴＩＬになされ得る例示的な改変は、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１に示されている。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの改変されたＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性標的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、改変された内在性標的遺伝子ＳＯＣＳ１及び少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの改変されたＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性標的遺伝子を含む。
【0222】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、内在性標的遺伝子以外のゲノム位置に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させるか、または改変型の内在性タンパク質を発現させる１つ以上のゲノム改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子調節系をコードするポリヌクレオチド配列をゲノム内の１つ以上の位置に挿入することによって、該遺伝子調節系の発現の際に、内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変型の内在性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が、ゲノム内の１つ以上の位置に挿入されており、該改変型のタンパク質の機能が、非改変型または野生型のタンパク質と比較して低下する（例えば、下記のドミナントネガティブ変異体）。
【0223】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、１つ以上の改変内在性標的遺伝子を含み、該１つ以上の改変によって、該内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物またはタンパク質）の発現及び／または機能が、未改変のＴＩＬと比較して低下する。例えば、いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、ｍＲＮＡ転写物の発現の低下、及び／またはタンパク質の発現の低下を示す。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬにおける遺伝子産物の発現は、未改変のＴＩＬにおける遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも５％低下する。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬにおける遺伝子産物の発現は、未改変のＴＩＬにおける遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより多く低下する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、複数（例えば２つ以上）の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現及び／または機能の、未改変のＴＩＬにおける遺伝子産物の発現と比較した低下を示す。例えば、いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くの内在性標的遺伝子に由来する遺伝子産物の発現及び／または機能の、未改変のＴＩＬにおける遺伝子産物の発現と比較した低下を示す。
【0224】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＴＩＬがｍＲＮＡ転写物またはタンパク質を発現しないように１つ以上の内在性標的遺伝子、またはその一部が削除された（すなわち「ノックアウト」）改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、複数の内在性標的遺伝子、またはその一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多くの内在性標的遺伝子の欠失を含む。
【0225】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、１つ以上の改変内在性標的遺伝子を含み、該標的ＤＮＡ配列に対する１つ以上の改変によって、未改変のＴＩＬで発現される対応するタンパク質（例えば、「未改変内在性タンパク質」）の機能と比較して、機能が低下または変更されたタンパク質（例えば、「改変内在性タンパク質」）の発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くの改変内在性タンパク質をコードする２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くの改変内在性標的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、該改変内在性タンパク質は、該改変ＴＩＬによって発現されるかもしくは別の細胞によって発現される別のタンパク質に対する結合親和性の低下もしくは変化、シグナル伝達能の低下もしくは変化、酵素活性の低下もしくは変化、ＤＮＡ結合活性の低下もしくは変化、または足場タンパク質として機能する能力の低下もしくは変化を示す。
【0226】
いくつかの実施形態では、該改変内在性標的遺伝子は、１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む。本明細書で使用される、「ドミナントネガティブ変異」とは、コードされたタンパク質が、未改変の標的遺伝子によってコードされるタンパク質に対して拮抗的に作用するような標的遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入を指す。このネガティブな表現型は、対応する未改変の遺伝子のポジティブな表現型に対して、遺伝的に優位なため、該変異は、ドミナントネガティブである。１つ以上のドミナントネガティブ変異を含む遺伝子、及びその遺伝子によってコードされるタンパク質は、「ドミナントネガティブ変異体」、例えば、ドミナントネガティブ遺伝子及びドミナントネガティブタンパク質と呼ばれる。いくつかの実施形態では、該ドミナントネガティブ変異体タンパク質は、該ＴＩＬのゲノム内の１つ以上の位置に挿入された外因性導入遺伝子によってコードされる。
【0227】
様々なドミナントネガティブの機序が知られている。典型的には、ドミナントネガティブ変異体の遺伝子産物は、未改変の遺伝子産物の機能をいくつか保持しているが、未改変の遺伝子産物の他の重要な機能を１つ以上欠損している。これにより、ドミナントネガティブ変異体は、未改変の遺伝子産物を拮抗阻害する。例えば、例示的な実施形態として、転写因子のドミナントネガティブ変異体は、機能活性化ドメインを欠損しているが、機能性ＤＮＡ結合ドメインを保持し得る。この例では、ドミナントネガティブ転写因子は、未改変の転写因子のようにＤＮＡの転写を活性化することはできないが、該ドミナントネガティブ転写因子は、未改変の転写因子の転写因子結合部位への結合を阻止することによって、遺伝子の発現を間接的に阻害することができる。別の例示的な実施形態として、二量体として機能するタンパク質のドミナントネガティブ変異が知られている。かかる二量体タンパク質のドミナントネガティブ変異体は、未改変のタンパク質と二量体を形成する能力を保持し得るが、それ以外は機能できないことがある。ドミナントネガティブ単量体は、未改変の単量体と二量体を形成することによってヘテロ二量体を形成し、未改変の単量体の機能的なホモ二量体の形成を阻止する。ＳＯＣＳ１遺伝子のドミナントネガティブ変異は、当技術分野で既知であり、ヒト及びマウスＳＯＣＳ１のアミノ酸配列の配列アライメントによって特定されたマウスＦ５９Ｄ変異体（例えば、Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：４４：２（２００１），４０７４６－４０７５４及びＳｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９３：４（２００１），４７１－４８２参照）及びヒトＦ５８Ｄ変異体を含む。
【0228】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１ならびにＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの改変内在性標的遺伝子から選択される１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む。
【0229】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む。いくつかの実施形態では、該２つ以上の標的遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１ならびにＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの改変内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む。該遺伝子調節系は、該内在性標的遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を改変することによる（例えば、該ゲノムＤＮＡ配列の１つ以上の核酸の挿入、欠失、もしくは変異による）、該内在性標的遺伝子の転写を調節すること（例えば、ｍＲＮＡの転写の阻害もしくは抑制）による、及び／または該内在性標的遺伝子の翻訳を調節することによる（例えば、ｍＲＮＡ分解による）等の様々な機序によって、該内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる。
【0230】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、遺伝子調節系（例えば、核酸ベースの遺伝子調節系、タンパク質ベースの遺伝子調節系、または組み合わせタンパク質／核酸ベースの遺伝子調節系）を含む。かかる実施形態では、該改変ＴＩＬに含まれる該遺伝子調節系は、１つ以上の内在性標的遺伝子を改変することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、以下を含む遺伝子調節系を含む。
【0231】
ａ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
ｂ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
ｄ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｅ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｆ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｇ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｈ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｉ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
ｊ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｋ．ｇＤＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｌ．ｇＤＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｍ．内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡ、
ｎ．内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｏ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｐ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
ｑ．上記の任意の組み合わせ。
ｂ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
ｄ．１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること、もしくはその機能を改変することができるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｅ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｆ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｇ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｈ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｉ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
ｊ．内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｋ．ｇＤＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｌ．ｇＤＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｍ．内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡ、
ｎ．内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｏ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｐ．ｇＲＮＡと相互作用すること及び内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
ｑ．上記の任意の組み合わせ。
【0232】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、以下を含む遺伝子調節系を含む。
ａ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
ｂ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
ｄ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｅ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｆ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｇ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｈ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｉ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
ｊ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｋ．ｇＤＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｌ．ｇＤＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｍ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡ、
ｎ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｏ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｐ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
ｑ．上記の任意の組み合わせ。
ａ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子、
ｂ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質、
ｄ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｅ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｆ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｇ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｈ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｉ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
ｊ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｋ．ｇＤＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｌ．ｇＤＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｍ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡ、
ｎ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる１つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｏ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる１つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
ｐ．ｇＲＮＡと相互作用することならびにＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または
ｑ．上記の任意の組み合わせ。
【0233】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、以下を含む遺伝子調節系を含む。
ａ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子、
ｂ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質、
ｄ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｅ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｆ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｇ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
ｈ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｉ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＲＮＡ、
ｊ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｋ．上記の任意の組み合わせ。
ａ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子、
ｂ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質、
ｄ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させること及び／またはその機能を改変することができる２つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｅ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、
ｆ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｇ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、
ｈ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＤＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｉ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＲＮＡ、
ｊ．ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される２つ以上の内在性遺伝子によってコードされる標的ｍＲＮＡ配列に結合することができる２つ以上のｇＲＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｋ．上記の任意の組み合わせ。
【0234】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系をコードする１つ、２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドは、該ＴＩＬのゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームによって発現され、該ＴＩＬのゲノムには挿入されない。
【0235】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、１つ以上のゲノム遺伝子座に挿入された１つ以上の外因性導入遺伝子を含む（例えば遺伝子「ノックイン」）。いくつかの実施形態では、該１つ以上の外因性導入遺伝子は、検出可能なタグ、安全スイッチ系、キメラスイッチ受容体、及び／または操作された抗原特異的受容体をコードする。
【0236】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、検出可能なタグをコードする外因性導入遺伝子さらに含む。検出可能なタグの例としては、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ（例えば、６×Ｈｉｓ）、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ｃＭｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、アビジン、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質、及びリン光タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該蛍光タンパク質は、青色／ＵＶタンパク質（ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ等）、シアンタンパク質（ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、単量体Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、及びｍＴＦＰ１等）、緑色タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍｅＧＦＰ（Ａ２０８Ｋ変異）、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、及びｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ等）、黄色タンパク質（ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、及びＴａｇＹＦＰ等）、オレンジ色タンパク質（単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、及びｍＯｒａｎｇｅ２等）、赤色タンパク質（ＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、及びｍＲｕｂｙ２等）、遠赤色タンパク質（ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、及びＮｉｒＦＰ等）、近赤外タンパク質（ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、及びｉＲＦＰ等）、ストークスシフトの長いタンパク質（ｍＫｅｉｍａ Ｒｅｄ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ１、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２、及びｍＢｅＲＦＰ等）、光活性化可能なタンパク質（ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、及びＰＡＴａｇＲＦＰ等）、光変換可能なタンパク質（Ｋａｅｄｅ（ｇｒｅｅｎ）、Ｋａｅｄｅ（ｒｅｄ）、ＫｉｋＧＲ１（ｇｒｅｅｎ）、ＫｉｋＧＲ１（ｒｅｄ）、ＰＳ－ＣＦＰ２、ＰＳ－ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ２（ｒｅｄ）、ｍＥｏｓ３．２（ｇｒｅｅｎ）、ｍＥｏｓ３．２（ｒｅｄ）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、及びＰＳｍＯｒａｎｇｅ等）、ならびに光で切り替え可能なタンパク質（Ｄｒｏｎｐａ等）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該検出可能なタグは、ＡｍＣｙａｎ、ＡｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＨｃＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ Ｍｏｎｏｍｅｒ及び／またはＡｃＧＦＰから選択される場合があり、これらはいずれも、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。
【0237】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、安全スイッチ系をコードする外因性導入遺伝子をさらに含む。安全スイッチ系（当技術分野では、自殺遺伝子系とも呼ばれる）は、改変ＴＩＬを対象に投与した後に、該細胞を除去可能にする１つ以上のタンパク質をコードする外因性導入遺伝子を含む。安全スイッチ系の例は、当技術分野で既知である。例えば、安全スイッチ系は、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｈｓｖ－ｔｋ）及びガンシクロビル（ＧＣＶ）系（Ｈｓｖ－ｔｋ／ＧＣＶ）のような、毒性のないプロドラッグを毒性のある化合物に変換するタンパク質をコードする遺伝子を含む。Ｈｓｖ－ｔｋは、毒性のないＧＣＶを、細胞アポトーシスに導く細胞傷害性化合物に変換する。従って、Ｈｓｖ－ｔｋタンパク質をコードする導入遺伝子を含む改変ＴＩＬで処理された対象にＧＣＶを投与すると、該改変ＴＩＬを選択的に除去することができる一方で、内在性ＴＩＬをスペアする。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＢｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６（５３１９）：１７１９－１７２４、Ｃｉｃｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９（１１）：１８２８－１８３６、Ｂｏｎｄａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００６，１０７（５）：１８２８－１８３６を参照されたい。
【0238】
さらなる安全スイッチ系は、細胞表面マーカーをコードする遺伝子を含み、該細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体の投与によって、ＡＤＣＣを介した改変ＴＩＬの除去を可能にする。いくつかの実施形態では、該細胞表面マーカーは、ＣＤ２０であり、該改変ＴＩＬは、リツキシマブ等の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の投与によって除去され得る（例えば、Ｉｎｔｒｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０００，１１（４）：６１１－６２０、Ｓｅｒａｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１４，６３－７６、ｖａｎ Ｍｅｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００６，１３，７８９－７９７参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＥＧＦ－Ｒ及びセツキシマブまたはパニツムマブを用いる同様の系が、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８００６８８０号に記載されている。さらなる安全スイッチ系は、二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）に対する結合部位を１つ以上含むプロアポトーシス分子をコードする導入遺伝子を含み、該プロアポトーシス分子のオリゴマー化及びアポトーシス経路の活性化を誘導するＣＩＤの投与によって、改変ＴＩＬの除去を可能にする。いくつかの実施形態では、該プロアポトーシス分子は、Ｆａｓ（ＣＤ９５としても知られている）である（Ｔｈｏｍｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００１，９７（５），１２４９－１２５７、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該プロアポトーシス分子は、カスパーゼ－９である（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５（１１），４２４７－４２５４、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【0239】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、キメラスイッチ受容体をコードする外因性導入遺伝子をさらに含む。キメラスイッチ受容体は、内在性細胞表面受容体に由来する細胞外ドメイン、及び異種の細胞内シグナル伝達ドメインを含む操作された細胞表面受容体であり、該細胞外ドメインによってリガンドが認識されると、該細胞表面受容体の野生型によって活性化されるシグナル伝達カスケードとは異なるシグナル伝達カスケードが活性化される。いくつかの実施形態では、該キメラスイッチ受容体は、細胞内ドメインに融合された抑制性の細胞表面受容体の細胞外ドメインを含み、該細胞内ドメインは、該抑制性の細胞表面受容体によって通常伝達される阻害シグナルではなく、活性化シグナルを伝達させる。特定の実施形態では、ＴＩＬの活性化を阻害することが知られている細胞表面受容体に由来する細胞外ドメインは、細胞内の活性化ドメインに融合することができる。対応するリガンドが結合すると、該ＴＩＬの活性化を阻害するのではなく、該活性化を増大させるシグナル伝達カスケードが活性化する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＰＤ１－ＣＤ２８スイッチ受容体をコードする導入遺伝子を含み、ＰＤ１の細胞外ドメインが、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインに融合されている（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７６：６（２０１６），１５７８－１５９０及びＭｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（２０１４），Ｓ２０１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＣＤ２００Ｒの細胞外ドメイン及びＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする導入遺伝子を含む（Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １３０：２２（２０１７），２４１０－２４１９参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、本明細書では「改変受容体導入細胞」または「改変ＲＥ細胞」と呼ばれる、腫瘍細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）等の標的細胞によって発現されるタンパク質標的を認識する操作された抗原特異的受容体をさらに含む。「操作された抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）等の天然に存在しない抗原特異的受容体を指す。いくつかの実施形態では、該操作された抗原受容体は、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインを介して、シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態では、該ＣＡＲの細胞外ドメインは、標的細胞によって発現される抗原に、ＭＨＣに依存しない形で結合し、ＲＥ細胞を活性化及び増殖させる。いくつかの実施形態では、該ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体またはその抗原結合断片に融合されたタグを認識する。かかる実施形態では、該ＣＡＲの抗原特異性は、標識抗体の抗原特異性に依存しており、その結果、ある１つの抗体を別の抗体に置き換えることによって、単一のＣＡＲ構築物を用いて、複数の異なる抗原を標的とすることができる（例えば、米国特許第９，２３３，１２５号及び第９，６２４，２７９号、米国特許出願公開第２０１５０２３８６３１号及び第２０１８０１０４３５４号参照）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインは、抗体に由来する抗原結合断片を含んでよい。本開示において有用な抗原結合ドメインとしては、例えば、ｓｃＦｖ、抗体、抗体の抗原結合領域、重鎖／軽鎖の可変領域、及び短鎖抗体が挙げられる。
【0240】
いくつかの実施形態では、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ゼータ鎖ドメイン（ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン等）、ＦｃγＲＩＩＩドメイン、ＦｃεＲＩドメインまたはＴリンパ球活性化ドメインに由来し得る。いくつかの実施形態では、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメイン、またはＣＤ７０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、ＭｙＤ８８ドメイン、またはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つを含む。例示的なＣＡＲの構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは、当技術分野で既知である（例えば、ＷＯ２００９／０９１８２６、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１４／０５５６５７、及びＷＯ２０１５／０９０２２９参照、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0241】
様々な腫瘍抗原に特異的なＣＡＲが、当技術分野で既知であり、例えば、ＣＤ１７１特異的ＣＡＲ（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００７）１５（４）：８２５－８３３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２０１２）２３（１０）：１０４３－１０５３）、ＥＧＦ－Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｋｏｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０１４）１０７（１）：３６４）、炭酸脱水酵素Ｋ特異的ＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ（２０１６）４４（３）：９５１－９５９）、ＦＲ－α特異的ＣＡＲ（Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００６）１２（２０）：６１０６－６０１５）、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１５）３３（１５）１６８８－１６９６、Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１１）１９（１２）：２１３３－２１４３、Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００９）１７（１０）：１７７９－１７８７、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２０１６）２６（７）：８５０－８５３、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１０）１８（４）：８４３－８５１、Ｇｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）９（２）：３２）、ＣＥＡ特異的ＣＡＲ（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１５）２１（１４）：３１４９－３１５９）、ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｃｎｅｒ Ｒｅｓ（２０１５）２１（１８）：４０６２－４０７２）、ＧＤ２特異的ＣＡＲ（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１１）１１８（２３）：６０５０－６０５６、Ｃａｒｕａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１５）２１（５）：５２４－５２９）、ＥｒｂＢ２特異的ＣＡＲ（Ｗｉｌｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）３２（５）：１０５９－１０７０）、ＶＥＧＦ－Ｒ特異的ＣＡＲ（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１６）２２（２）：４３６－４４７）、ＦＡＰ特異的ＣＡＲ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ（２０１４）２（２）：１５４－１６６）、ＭＳＬＮ特異的ＣＡＲ（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０１１）１７（１４）：４７１９－３０）、ＮＫＧ２Ｄ特異的ＣＡＲ（ＶａｎＳｅｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２０１５）２３（１０）：１６００－１６１０）、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（アキシカブタジンシロルーセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））及びチサゲンレクルユーセル（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））である。腫瘍特異的ＣＡＲの臨床試験について論評しているＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌ（２０１８）１１（２２）も参照されたい。本開示に従う使用に適した例示的なＣＡＲを、下記の表２に記載する。
【表2】
【0242】
いくつかの実施形態では、該操作された抗原受容体は、組み換えＴＣＲである。組み換えＴＣＲは、特定の標的抗原を認識するＴ細胞集団から単離及びクローニングされたＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含む。例えば、ＴＣＲα遺伝子及び／またはＴＣＲβ遺伝子（すなわち、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ）は、特定の悪性腫瘍を有する個体から単離されたＴ細胞集団、または特定の腫瘍抗原もしくは腫瘍細胞で免疫化したヒト化マウスから単離されたＴ細胞集団からクローニングされ得る。組み換えＴＣＲは、その内在性対応物と同じ機序を通じて（例えば、標的細胞の表面に発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質との関連において提示されたその同種抗原を認識することによって）抗原を認識する。この抗原結合が、内在性シグナル伝達経路を刺激し、該ＴＣＲで操作された細胞の活性化及び増殖につながる。
【0243】
腫瘍抗原に特異的な組み換えＴＣＲは、当技術分野で既知であり、例えば、ＷＴ１特異的ＴＣＲ（ＪＴＣＲ０１６，Ｊｕｎｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、米国特許出願公開第２０１６００８３４４９号に記載のＷＴ１－ＴＣＲｃ４）、ＭＡＲＴ－１特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４（２００６）１２６－１２９に記載のＤＭＦ４Ｔクローン、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１４（２００９）５３５－５４６に記載のＤＭＦ５Ｔクローン、及びｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（２０１５）１５４１－１５５０に記載のＩＤ３Ｔクローンを含む）、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１４（２００９）５３５－５４６）、ＣＥＡ特異的ＴＣＲ（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１９（２０１１）６２０－６２６）、ＮＹ－ＥＳＯ及びＬＡＧＥ－１特異的ＴＣＲ（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（２０１１）９１７－９２４、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１（２０１５）１０１９－１０２７及びＲａｐｏｐｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１（２０１５）９１４－９２１に記載の１Ｇ４Ｔクローン）、ならびにＭＡＧＥ－Ａ３特異的ＴＣＲ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３６（２０１３）１３３－１５１及びＬｉｎｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２（２０１３）２２７－２４２）である（Ｄｅｂｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３（２０１６）１０－２１も参照されたい）。
【0244】
組み換えＴＣＲを生成するため、天然のＴＲＡＣ（配列番号８８２）及びＴＲＢＣ（配列番号８８３）のタンパク質配列が、目的のタンパク質またはペプチドに特異的なＴＣＲ－α及びＴＣＲ－β鎖の可変領域のＣ末端に融合される。例えば、該操作されたＴＣＲは、ＮＹ－ＥＳＯペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号８８４）、例えば、１Ｇ４ ＴＣＲまたは９５：ＬＹ ＴＣＲを認識し得る（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）。かかる例示的な実施形態では、１Ｇ４－ＴＣＲのα／β鎖の対は、それぞれ、配列番号８８５及び８８６を含み、９５：ＬＹ－ＴＣＲのα／β鎖の対は、それぞれ、配列番号８８７及び８８８を含む。該組み換えＴＣＲは、ＭＡＲＴ－１ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、配列番号８８９）、例えば、ＤＭＦ４及びＤＭＦ５ ＴＣＲを認識し得る（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）。かかる例示的な実施形態では、ＤＭＦ４－ＴＣＲのα／β鎖の対は、それぞれ、配列番号８９０及び８９１を含み、ＤＭＦ５－ＴＣＲのα／β鎖の対は、それぞれ、配列番号８９２及び８９３を含む。該組み換えＴＣＲは、ＷＴ－１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ、配列番号８９４）、例えば、ＤＬＴ ＴＣＲを認識し得る（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８ １８０：６１１６－６１３１）。かかる例示的な実施形態では、該高親和性ＤＬＴ－ＴＣＲのα／β鎖の対は、それぞれ、配列番号８９５及び８９６を含む。
【0245】
該組み換えＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、両方のＴＣＲ鎖の発現を化学量論的に単一のプロモーターから駆動させるようにして生成され得る。かかる実施形態では、該ＴＣＲβ及びＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列の間に、Ｐ２Ａ配列（配列番号８９７）を挿入して、該組み換えＴＣＲ鎖をコードする発現カセットが、ＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαという形態を含むようにすることができる。例示的な実施形態として、かかるカセットから発現されるＩＧ４ ＮＹ－ＥＳＯ特異的ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号８９８を含み、かかるカセットから発現される９５：ＬＹ ＮＹ－ＥＳＯ特異的ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号８９９を含み、かかるカセットから発現されるＤＭＦ４ ＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号９００を含み、かかるカセットから発現されるＤＭＦ５ ＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号９０１を含み、かかるカセットから発現されるＤＬＴ ＷＴ１特異的ＴＣＲのタンパク質配列は、配列番号９０２を含む。
【0246】
いくつかの実施形態では、該操作された抗原受容体は、表面抗原分類分子、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ７８、ＣＤ８０（Ｂ７－１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７－２としても知られている）、ＣＤ９６、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、及びＣＤ１３８、ＣＤ３７１（ＣＬＬ１としても知られている）、腫瘍関連表面抗原、例えば、５Ｔ４、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９及びＴＮＦＲＳＦ１７としても知られている、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ０２２２３）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水酵素９（ＣＡＩＸまたはＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシド、例えば、ＧＤ２、ＥＬＦ２Ｍ、導管上皮ムチン、エフリンＢ２、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＦＣＲＬ５（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ６８ＳＮ８）、ＦＫＢＰ１１（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＹＬ４）、神経膠腫関連抗原、スフィンゴ糖脂質、ｇｐ３６、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＤ１）、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、腸カルボキシルエステラーゼ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＩＴＧＡ８（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ５３７０８）、ＫＡＭＰ３、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ、メソセリン、好中球エラスターゼ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎｋｐ３０、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＡＰ、プロスターゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、プロステイン、ＲＡＧＥ－１、ＲＯＲ１、ＲＵ１（ＳＦＭＢＴ１）、ＲＵ２（ＤＣＤＣ２）、ＳＬＡＭＦ７（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９ＮＱ２５）、サバイビン、タグ－７２及びテロメラーゼ、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、腫瘍間質抗原、例えば、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）及び線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）、サイトカイン受容体、例えば、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＴＦＧβ－Ｒまたはその構成成分、例えば、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ウイルス特異的表面抗原、例えば、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶ ｇｐ１２０等）、ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、ＨＰＶ特異的抗原、ラッサウイルス特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原、ならびにこれらの表面抗原のいずれかの誘導体またはバリアントから選択される標的抗原に対するものである。
【0247】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、これらの内在性遺伝子としては、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａが挙げられる（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【0248】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0249】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0250】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＰＴＰＮ２及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0252】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0253】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0254】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＰＴＰＮ２及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0255】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0256】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0257】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＢＬＢ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＣＢＬＢ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＣＢＬＢ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0258】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＰＴＰＮ２及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0259】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0260】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0261】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＢＬＢ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＣＢＬＢ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＣＢＬＢ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0262】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬであるとともに、さらに、該細胞表面上で発現されるＣＡＲまたは組み換えＴＣＲを含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含み、さらに、ＣＡＲまたは組み換えＴＣＲをコードする組み換え発現ベクターを含む。
【0263】
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、これらの内在性遺伝子は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａを含む（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【0264】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＰＴＰＮ２の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0265】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0266】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0267】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0268】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0269】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＣＢＬＢの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0270】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0271】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0272】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0273】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＢＬＢ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含むか、またはＣＢＬＢ及びＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0274】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＴＰＮ２及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＰＴＰＮ２及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0275】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0276】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＳＯＣＳ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0277】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＢＬＢ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＣＢＬＢ及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0278】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含むか、またはＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系を含む改変ＴＩＬを提供し、ここで、免疫エフェクター細胞はＴＩＬである。
【0279】
Ｄ．エフェクター機能
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下（またはその発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系）を含み（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、１つ以上の免疫細胞のエフェクター機能の増加を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下（またはその発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系）を含み（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）、１つ以上の免疫細胞のエフェクター機能の増加を示す。
【0280】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下（またはその発現及び／または機能を低下させることができる遺伝子調節系）を含み、１つ以上の免疫細胞のエフェクター機能の増加を示す。本明細書では、「エフェクター機能」という用語は、免疫細胞の機能のうち、標的細胞または標的抗原に対する免疫応答の発生、維持及び／または増強に関連する機能を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、腫瘍への浸潤もしくは移動が増加する特徴、増殖が増加する特徴、細胞の生存が増加もしくは延長する特徴、周囲の微小環境における抑制因子耐性が向上して、該細胞の活性化状態が延長または増大する特徴、炎症誘発性免疫因子（例えば、炎症性サイトカイン、ケモカイン及び／または酵素）の産生が増加する特徴、細胞傷害性が増加する特徴、疲弊耐性が向上する特徴及び／またはＴｃｍのパーセンテージが増加する特徴のうちの１つ以上を示す。
【0281】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、腫瘍浸潤の増加を示す。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬによる腫瘍浸潤の増加とは、所定の期間に腫瘍に浸潤する改変ＴＩＬの数が、同じ期間に腫瘍に浸潤する未改変のＴＩＬの数と比較して増加することを指す。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、未改変の免疫細胞と比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高倍率の腫瘍浸潤の増加を示す。腫瘍浸潤は、対象から１つ以上の腫瘍を単離し、フローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって、該サンプル中の改変免疫細胞の数を評価することによって測定され得る。
【0282】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、細胞増殖の増加を示す。これらの実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変ＴＩＬの数が、未改変のＴＩＬと比較して増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、増殖速度の増加を示し、この場合、該改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬよりも速い速度で分裂する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、未改変の免疫細胞と比較して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高倍率の増殖速度の増加を示す。いくつかの実施形態では、改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、増殖期間の延長を示し、この場合、該改変ＴＩＬ及び未改変のＴＩＬは同じ速度で分裂するが、該改変ＴＩＬの方が長い期間にわたって増殖状態を維持する。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、未改変の免疫細胞よりも、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより長い時間、増殖状態を維持する。
【0283】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、細胞の生存の増加または延長を示す。かかる実施形態では、その結果は、所定の期間の経過後、存在する改変ＴＩＬの数が、未改変のＴＩＬと比較して増加することである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変の免疫細胞より１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより長い期間、生存を維持し、存続する。
【0284】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、抑制因子耐性の向上を示す。例示的な抑制因子は、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＩＤＯ）及び／または抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ）によるシグナル伝達を含む。
【0285】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変Ｔ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の増加を示す。Ｔ細胞疲弊とは、エフェクター機能が低下し、その後、抗原特異的Ｔ細胞が枯渇することを特徴とする抗原特異的Ｔ細胞機能障害の状態である。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、抗原に応答して増殖する能力が欠損し、サイトカインの産生の低下を示し、及び／または腫瘍細胞等の標的細胞に対する細胞傷害性の低下を示す。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、細胞表面マーカー及び転写因子の発現の変化、例えば、ＣＤ１２２及びＣＤ１２７の細胞表面での発現の減少、抑制性細胞表面マーカー、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３及び／またはＣＴＬＡ４の発現の増加、及び／または転写因子、例えば、Ｂｌｉｍｐ１、ＮＦＡＴ及び／またはＢＡＴＦの発現の増加によって特定される。いくつかの実施形態では、疲弊Ｔ細胞は、サイトカインのシグナル伝達に対する感受性の変化、例えば、ＴＧＦβのシグナル伝達に対する感受性の増加及び／またはＩＬ－７のシグナル伝達に対する感受性の低下を示す。Ｔ細胞疲弊は、例えば、該Ｔ細胞を標的細胞集団と共培養し、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解を測定することによって特定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬを標的細胞（例えば、標的腫瘍抗原を発現するように操作された自己腫瘍細胞または自己細胞株）の集団と共培養し、エフェクター細胞の増殖、サイトカインの産生及び／または標的細胞の溶解が測定される。その後、これらの結果は、標的細胞を対照の免疫細胞（未改変のＴＩＬ、または対照の改変が施された免疫エフェクター細胞等）の集団と共培養することによって得られた結果と比較される。
【0286】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、該改変ＴＩＬからの１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはＩＬ－２）の産生の、対照の免疫細胞集団で観察されるサイトカインの産生と比較した増加によって示される。いくつかの実施形態では、対照の免疫細胞集団からのサイトカインの産生と比較した該改変ＴＩＬからのサイトカインの産生の１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高倍率の増加は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の増加を示す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、該改変ＴＩＬの増殖の、対照の免疫細胞集団で観察される増殖と比較した増加によって示される。いくつかの実施形態では、対照の免疫細胞集団の増殖と比較した該改変ＴＩＬの増殖の１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高倍率の増加は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の増加を示す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞疲弊に対する耐性は、該改変ＴＩＬによる標的細胞の溶解の、対照の免疫細胞集団で観察される標的細胞の溶解と比較した増加によって示される。いくつかの実施形態では、対照の免疫細胞集団による標的細胞の溶解と比較した該改変ＴＩＬによる標的細胞の溶解の１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高倍率の増加は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性の増加を示す。
【0287】
いくつかの実施形態では、対照の免疫細胞集団と比較した改変ＴＩＬの疲弊は、インビトロまたはエキソビボでの製造プロセス中に測定される。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍断片から単離されたＴＩＬを、本明細書に記載の方法に従って改変し、その後１回以上の増殖で増殖させ、改変ＴＩＬ集団が生成される。かかる実施形態では、該改変ＴＩＬの疲弊は、採取直後及び第１回の増殖の前、第１回の増殖後かつ第２回の増殖の前、及び／または第１回及び第２回の増殖の後に判断され得る。いくつかの実施形態では、対照の免疫細胞集団と比較した該改変ＴＩＬの疲弊は、該改変ＴＩＬを対象に移入した後、１つ以上の時点で測定する。例えば、いくつかの実施形態では、該改変細胞は、本明細書に記載の方法に従って産生され、対象に投与される。移入後、サンプルを次いで様々な時点で対象から採取し、インビボでの該改変ＴＩＬの経時的な疲弊が判断され得る。
【0288】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、炎症誘発性免疫因子の発現または産生の増加を示す。炎症誘発性免疫因子の例としては、細胞溶解因子、例えば、グランザイムＢ、パーフォリン、及びグラニュライシン、ならびに炎症性サイトカイン、例えば、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－１７、ＣＸＣＬ８及び／またはＩＬ－６が挙げられる。
【0289】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、未改変のＴＩＬと比較して、標的細胞に対する細胞傷害性の増加を示す。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、未改変の免疫細胞と比較して、標的細胞に対する細胞傷害性の１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれより高倍率の増加を示す。免疫エフェクター機能を測定するためのアッセイは、当技術分野で既知である。例えば、腫瘍浸潤は、対象から腫瘍を単離し、該腫瘍に存在するリンパ球の総数及び／または表現型をフローサイトメトリー、免疫組織化学及び／または免疫蛍光法によって特定することによって測定され得る。細胞表面受容体の発現は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、及び／またはｑＰＣＲによって特定され得る。サイトカイン及びケモカインの発現及び産生は、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及び／またはｑＰＣＲによって測定され得る。細胞外の刺激（例えば、サイトカイン、抑制性リガンド、または抗原）に対する反応性または感受性は、該刺激に反応する細胞増殖及び／または下流のシグナル伝達経路の活性化（例えば、下流のシグナル伝達中間体のリン酸化）をアッセイすることによって測定され得る。細胞傷害性は、実施例全体を通じて説明されているような改変ＴＩＬと標的細胞とのインビトロまたはエキソビボでの共培養及びインビボマウス腫瘍モデルを含めた、当技術分野で既知の標的細胞溶解アッセイによって測定され得る。
【0290】
Ｅ．内在性の経路及び遺伝子の調節
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を示す。該内在性標的遺伝子のさらなる詳細を下記表３に示す。かかる実施形態では、該１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、該免疫細胞の１つ以上のエフェクター機能が増強される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を示す。該内在性標的遺伝子のさらなる詳細を下記表３に示す。かかる実施形態では、該１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、該免疫細胞の１つ以上のエフェクター機能が増強される。
【0291】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、サイトカインシグナル抑制因子ＳＯＣＳ １（ＳＯＣＳ１）遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。該ＳＯＣＳ１タンパク質は、Ｃ末端ＳＯＣＳボックスモチーフ、ＳＨ２ドメイン、ＥＳＳドメイン、及びＮ末端ＫＩＲドメインを含む。キナーゼ阻害領域（ＫＩＲ）と呼ばれる１２個のアミノ酸残基は、ＳＯＣＳ１が、ＪＡＫ１、ＴＹＫ２及びＪＡＫ２のチロシンキナーゼ機能を負に調節する能力に不可欠であることが分かっている。
【0292】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＰＴＰＮ２遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。タンパク質チロシンホスファターゼファミリー（ＰＴＰ）は、そのホスファターゼ触媒ドメインによって、ホスホチロシン残基を脱リン酸化する。ＰＴＰＮ２は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達複合体を通じてシグナル伝達を行うＴＣＲ及びサイトカインの両方に対するブレーキとして機能し、ひいては、シグナル１及びシグナル３の両方に対するチェックポイントとしての役割を果たす。Ｔ細胞が抗原と結合し、ＴＣＲの活性化後、チロシン残基のリン酸化によって、キナーゼＬｃｋ及びＦｙｎにより、ポジティブシグナルが下流で増幅される。ＰＴＰＮ２は、Ｌｃｋ及びＦｙｎの両方を脱リン酸化する働きをし、ひいてはＴＣＲシグナル伝達を減弱する。加えて、Ｔ細胞が、サイトカインと遭遇し、共通γ鎖受容体複合体を通じてシグナル伝達を行い、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を通じて、ポジティブシグナルを伝達した後、ＰＴＰＮ２は、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の脱リン酸化によっても減弱する。ＰＴＰＮ２の欠失が、Ｔ細胞の機能に及ぼす全体的な機能上の影響は、ＴＣＲを通じてＴ細胞を急激に活性化するのに必要な活性化閾値の低下、ならびに成長促進及び分化促進サイトカインに対する超感受性である。
【0293】
さらに、マウス全身のＰＴＰＮ２が欠失すると、サイトカインレベル、非リンパ組織でのリンパ球浸潤、及び関節リウマチ様症状の初期徴候が増大し、これらのマウスは、５週齢までしか生きられない。従って、ＰＴＰＮ２は、マウスの生後発育に欠かせないものとして同定されている。この自己免疫表現型と一致して、出生時から、Ｔ細胞系列のＰｔｐｎ２が欠失していても、非リンパ組織でのリンパ球浸潤が増大する。重要なことには、成体マウスＴ細胞でＰｔｐｎ２の誘導型ノックアウトを行っても、いかなる自己免疫発現も生じなかった。自己免疫におけるその役割の他に、Ｐｔｐｎ２の欠失は、ヒトにおいて、わずかな割合のＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）と関連すること、及び２段階で化学的に誘発した発がん性において皮膚腫瘍の成長を高めることが特定された。
【0294】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。Ｚｃ３ｈ１２は、ＭＣＰＩＰ１及びＲｅｇｎａｓｅ－１とも呼ばれ、ＣＣＣＨ型ジンクフィンガーモチーフのすぐ上流にＲＮａｓｅドメインを有するＲＮａｓｅである。そのヌクレアーゼ活性を介して、Ｚｃ３ｈ１２ａは、ＩＬ－６等の転写産物のｍＲＮＡを標的とし、それら遺伝子の３’ＵＴＲ内の保存されたステムループ構造と結合することによって不安定化する。Ｔ細胞では、Ｚｃ３ｈ１２ａは、ｃ－Ｒｅｌ、Ｏｘ４０及びＩＬ－２を含めたいくつかの炎症誘発性遺伝子の転写レベルを制御する。Ｒｅｇｎａｓｅ－１の活性化は一過性のものであり、プロテアソームが媒介する分解または粘膜関連リンパ組織１（ＭＡＬＴ１）が媒介する切断を含めたネガティブフィードバック機構の作用を受ける。Ｒｅｇｎａｓｅ－１の主な機能は、異なる細胞型における遺伝子のサブセットを特異的に標的とすることによって、そのリボヌクレアーゼ活性を介して、ｍＲＮＡ分解を促すことである。単球では、Ｒｅｇｎａｓｅ－１は、ＩＬ－６及びＩＬ－１２ＢのｍＲＮＡを下方制御し、ひいては炎症を緩和し、Ｔ細胞では、Ｒｅｇｎａｓｅ－１は、ｃ－Ｒｅｌ、Ｏｘ４０及びＩＬ－２の転写産物を標的とすることによって、Ｔ細胞の活性化を制限する。がん細胞では、Ｒｅｇｎａｓｅ－１は、Ｂｃｌ２Ｌ１、Ｂｃｌ２Ａ１、ＲｅｌＢ及びＢｃｌ３を含む抗アポトーシス遺伝子を阻害することによってアポトーシスを促進する。
【0295】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。この遺伝子は、ＲＮＦ５６、Ｎｂｌａ００１２７及びＣｂｌがん原遺伝子Ｂとも呼ばれるＣＢＬ－Ｂをコードする。ＣＢＬ－Ｂは、Ｅ３ユビキチン・タンパク質リガーゼであり、ＣＢＬ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＣＢＬ－Ｂは、Ｔ細胞活性化の負の調節因子として機能する。ＣＢＬ－ＢのＴ細胞での発現により、リガンドが誘導するＴ細胞受容体の下方調節が生じ、抗原提示の過程でＴ細胞の活性化の程度が制御される。ＣＢＬＢ遺伝子の突然変異は、自己免疫状態、例えば、１型糖尿病と関連している。
【0296】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。この遺伝子は、Ｒｏｑｕｉｎ－１とも呼ばれるＲｉｎｇフィンガー及びＣＣＣＨ型ドメイン１をコードする。Ｒｏｑｕｉｎ－１は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに存在するｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｄｅｃａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）を認識し、これに結合し、ｍＲＮＡの脱アデニル化及び分解をもたらす。選択的スプライシングにより、複数の転写バリアントが生じる。
【0297】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子の発現及び／または機能の低下を含む。この遺伝子は、ＮＦＫＢインヒビターアルファ、ＭＡＤ－３、ＮＦＫＢＩ及びＥＤＡＩＤ２とも呼ばれるＩκＢαをコードする。ＩκＢαは、ＮＦ－κＢ転写因子を阻害するように機能する細胞タンパク質のファミリーの一メンバーである。ＩκＢαは、ＮＦ－κＢタンパク質の核移行シグナル（ＮＬＳ）をマスクし、細胞質内にそれらを不活性状態で隔離しておくことによってＮＦ－κＢを阻害する。さらに、ＩκＢαは、ＮＦ－κＢの適切な機能に必要なＮＦ－κＢの転写因子がＤＮＡに結合する能力を遮断する。ＮＦＫＢＩＡ遺伝子は、いくつかのホジキンリンパ腫細胞では変異している。かかる突然変異は、ＩκＢαタンパク質を不活性化し、ひいてはＮＦ－κＢが該リンパ腫の腫瘍細胞において慢性的に活性にし、この活性が、これらの腫瘍細胞の悪性状態に寄与する。
【表3】
【0298】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１またはＮＦＫＢＩＡのうちの任意の１つまたは２つ以上の発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＣＢＬＢの発現及び／または機能の低下を含む。
【0299】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＳＯＣＳ１の発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＳＯＣＳ１の発現及び／または機能の低下を含む。
【0300】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＰＴＰＮ２の発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＰＴＰＮ２の発現及び／または機能の低下を含む。
【0301】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＺＣ３Ｈ１２Ａの発現及び／または機能の低下を含む。
【0302】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＲＣ３Ｈ１の発現及び／または機能の低下を含む。
【0303】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１から選択される少なくとも１つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含む。いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、ＣＢＬＢ、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ及びＲＣ３Ｈ１から選択される少なくとも２つの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能の低下を含み、さらに、ＮＦＫＢＩＡの発現及び／または機能の低下を含む。
【0304】
ＩＩ．遺伝子調節系
本明細書では、「遺伝子調節系」という用語は、細胞に導入された際に、内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせを指す。本開示の方法での使用に適した多くの遺伝子調節系が、当技術分野で既知であり、それらとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、遺伝子編集系である。本開示の方法での使用に適した遺伝子編集系は、当技術分野で既知であり、それらとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書では、「遺伝子調節系」という用語は、細胞に導入された際に、内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせを指す。本開示の方法での使用に適した多くの遺伝子調節系が、当技術分野で既知であり、それらとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、遺伝子編集系である。本開示の方法での使用に適した遺伝子編集系は、当技術分野で既知であり、それらとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が挙げられるがこれらに限定されない。
【0305】
本明細書で使用される、遺伝子調節系が内在性標的遺伝子に及ぼす作用に関連して使用される場合の「調節する」は、該内在性標的遺伝子の配列の任意の変化、該内在性標的遺伝子のエピジェネティックな状態の任意の変化、及び／または該内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは機能の任意の変化を包含する。
【0306】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、例えば、内在性標的配列において１つ以上の核酸を挿入するかまたは欠失させることによる等、１つ以上の変異を該内在性標的配列に導入することによって、該内在性標的遺伝子の配列の変化を媒介し得る。該内在性標的配列の変化を媒介することができる例示的な機序としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば古典的または代替的）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同配向型修復（例えば内在性ドナーテンプレート媒介性）、ＳＤＳＡ（合成依存的一本鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖侵入が挙げられるがこれらに限定されない。
【0307】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、該内在性標的配列のエピジェネティックな状態の変化を媒介し得る。例えば、いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、該内在性標的遺伝子のＤＮＡの共有結合の改変（例えば、シトシンのメチル化及びヒドロキシメチル化）、または関連ヒストンタンパク質の共有結合の改変（例えば、リシンのアセチル化、リシン及びアルギニンのメチル化、セリン及びトレオニンのリン酸化、ならびにリシンのユビキチン化及びＳＵＭＯ化）を媒介し得る。
【0308】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、該内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化を媒介し得る。かかる実施形態では、該遺伝子調節系は、該内在性標的ＤＮＡ配列を改変することによって、または該ＤＮＡ配列によってコードされるｍＲＮＡ産物に作用することによって、該コードされたタンパク質の発現を調節し得る。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系によって、改変内在性タンパク質が発現され得る。かかる実施形態では、該遺伝子調節系の媒介によって内在性ＤＮＡ配列が改変されると、未改変のＴＩＬにおける対応する内在性タンパク質と比較して機能の低下を示す内在性タンパク質が発現される。かかる実施形態では、該改変内在性タンパク質の発現レベルは、未改変の免疫細胞における対応する内在性タンパク質の発現レベルより増加する場合もあれば低下する場合もあり、対応する内在性タンパク質の発現レベルと同じの場合も実質的に同様の場合もある。
【0309】
Ａ．核酸ベースの遺伝子調節系
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される少なくとも１つ、２つ、またはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つまたはそれより多くの核酸を含む核酸遺伝子調節系を提供する（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つまたはそれより多くの核酸を含む核酸遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１ならびにＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる核酸を含む核酸遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。本明細書で使用される、核酸ベースの遺伝子調節系とは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節することができる１つ以上の核酸分子を含む系である。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、標的核酸配列と相補的であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される少なくとも１つ、２つ、またはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つまたはそれより多くの核酸を含む核酸遺伝子調節系を提供する（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つまたはそれより多くの核酸を含む核酸遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１ならびにＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１、及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる核酸を含む核酸遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。本明細書で使用される、核酸ベースの遺伝子調節系とは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節することができる１つ以上の核酸分子を含む系である。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、標的核酸配列と相補的であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
【0310】
「アンチセンスＲＮＡ分子」とは、長さを問わず、ｍＲＮＡ転写物と相補的であるＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子とは、細胞、組織、または対象に導入することができ、内在性遺伝子のサイレンシング経路に依存するのではなく、ＲＮａｓｅＨの媒介による、標的ｍＲＮＡ転写物の分解に依存する機序を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現を低下させる一本鎖ＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、改変された主鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野で既知のその他の主鎖を含むか、または天然に存在しないヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンス核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。
【0311】
本明細書で使用される、「ＲＮＡ干渉分子」とは、内在性遺伝子のサイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を通じて、標的ｍＲＮＡを分解することによって、内在性標的遺伝子産物の発現の低下を媒介するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉剤としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー及びモルホリノが挙げられる。
【0312】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡは、約２１～２５ヌクレオチド長の、天然に存在する小分子の非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、１つ以上の標的ｍＲＮＡ分子と少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳の抑制、ｍＲＮＡの切断、及び／または脱アデニル化を通じて、内在性標的遺伝子産物の発現を下方制御する（例えば、低下させる）ことができる。
【0313】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成するとともに、相補的なｍＲＮＡ配列の分解をもたらす約５０～７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、細胞内に導入されるプラスミドまたは非複製型の組み換えウイルスベクターにクローニングして、ｓｈＲＮＡコード配列がゲノムに組み込まれるようにできる。従って、ｓｈＲＮＡは、内在性標的遺伝子の翻訳及び発現の安定的かつ着実な抑制をもたらすことができる。
【0314】
いくつかの実施形態では、核酸ベースの遺伝子調節系は、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡとは、典型的には約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）という複数タンパク質複合体と会合し、その際に、「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。その後、活性化ＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相同性によって、対応するｍＲＮＡにＲＩＳＣを導き、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、その結果、特異的な遺伝子サイレンシングが行われる。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長または２４ヌクレオチド長であり、その３’末端に、２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡを個々の細胞及び／または培養系に導入して、標的ｍＲＮＡ配列の分解をもたらすことができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡについては、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：１９，１９９８、ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、第８，２０２，８４６号及び第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。
【0315】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、１つ以上のモルホリノを含む。本明細書で使用される、「モルホリノ」は、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合しているとともに、ホスホロジアミデート結合を通じて連結されている改変核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは、相補的なｍＲＮＡ配列を分解するために標的とするのではなく、ｍＲＮＡの翻訳を立体的に阻害し、ｍＲＮＡスプライシングを変化させることを通じて機能する。
【0316】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、表４、５、９～１２、及び１７～２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子を含む。本出願の全体を通じて、参照ゲノム座標は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得たヒトゲノムのＧＲＣｈ３８（ｈｇ３８とも呼ばれる）アセンブリのゲノムアノテーションに基づくものであり、このアセンブリは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで利用可能である。ある１つのアセンブリと別のアセンブリとの間でゲノム座標を変換するツール及び方法は、当技術分野で既知であり、そのツール及び方法を用いて、本明細書に提供するゲノム座標を、ヒトゲノムの別のアセンブリにおける対応する座標に変換することができる（同じ機関によってまたは同じアルゴリズムを用いて生成された以前のアセンブリに変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８からＧＲＣｈ３７）、及び異なる機関またはアルゴリズムによって生成されたアセンブリを変換すること（例えば、ＧＲＣｈ３８からＮＣＢＩ３３、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成）を含む）。当技術分野で既知の利用可能な方法及びツールとしては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトで利用可能なＮＣＢＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｍａｐｐｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒのウェブサイトで利用可能なＵＣＳＣ ＬｉｆｔＯｖｅｒ、及びＥｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇのウェブサイトで利用可能なＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒが挙げられるがこれらに限定されない。
【0317】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、該少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0318】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４（ヒトゲノム）または表５（マウスゲノム）に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～３５及び５６～１８７のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～３５及び５６～１８７のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一である標的ヒトＲＮＡ配列に結合する。
【0319】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２３～５５または２３～２００のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２３～３５及び５６～１８７のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ヒトＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２３～５５または２３～２００のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２３～３５及び５６～１８７のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一である標的ヒトＲＮＡ配列に結合する。
【0320】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、当業者に既知のものから選択される少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。例えば、いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号１３～２２から選択される核酸配列を含むＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡである（国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７１２０９９６号、ＷＯ２０１８１３７２９５、ＷＯ２０１７１２０９９８及びＷＯ２０１８１３７２９３参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）（表６）。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号１３～２００から選択される核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～３５及び５６～１８７から選択されるヒト核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～３５から選択されるヒト標的配列に結合するＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である（米国特許第８，３２４，３６９号参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）（表７）。いくつかの実施形態では、該ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号３６～５５から選択されるマウス標的配列に結合するＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である（米国特許第９，９４４，９３１号参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）（表８）。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【0321】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、該少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0322】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９（ヒトゲノム）または表１０（マウスゲノム）に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３１４のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３１４のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0323】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３１４のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３１４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表10】
【0324】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、該少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0325】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１（ヒトゲノム）または表１２（マウスゲノム）に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～３３７または３３１～７９７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～３３７または３３１～７９７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0326】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３２８～３３０または３２９及び３３０（ヒト）から選択される核酸配列を含むＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１６），６，Ａｒｔｉｃｌｅ ＃２４０７３及びＭｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）１６１（５），１０５８－１０７３参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３３６～７８９のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号３３６～７８９のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～３３７から選択される核酸配列によってコードされるＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子である（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２０１５）２９０（３４），２０７８２－２０７９２参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【表11-1】
【表11-2】
【表11-3】
【表11-4】
【表11-5】
【表11-6】
【表11-7】
【表11-8】
【表11-9】
【表11-10】
【表11-11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【0327】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、該少なくとも１つの核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0328】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７（ヒトゲノム）または表１８（マウスゲノム）に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８０８のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８０８のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0329】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８０８のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８０８のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【表17】
【表18】
【0330】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、該少なくとも１つの核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0331】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９（ヒトゲノム）または表２０（マウスゲノム）に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８３６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８３６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0332】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８３６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８３６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【表19】
【表20】
【0333】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、該少なくとも１つの核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0334】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１（ヒトゲノム）または表２２（マウスゲノム）に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８５６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８５６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0335】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８５６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｈＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８５６のうちの１つによってコードされるヒトＲＮＡ配列と１００％同一であるヒト標的ＲＮＡ配列に結合する。
【表21】
【表22】
【0336】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１またはＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、市販業者、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）等から入手される。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、表２３に示されるものである。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、またはＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｈＲＮＡ分子は、表２４に示されるものである。
【表23】
【表24】
【0337】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0338】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0339】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0340】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0341】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0342】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0343】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0344】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0345】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0346】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0347】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0348】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0349】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0350】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0351】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0352】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0353】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0354】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0355】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0356】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0357】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0358】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0359】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0360】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0361】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0362】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0363】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0364】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0365】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0366】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0367】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0368】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0369】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0370】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0371】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0372】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0373】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0374】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0375】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0376】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0377】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0378】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0379】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0380】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0381】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0382】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0383】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0384】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0385】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0386】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0387】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0388】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0389】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0390】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0391】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0392】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0393】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0394】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0395】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0396】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0397】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0398】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0399】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0400】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0401】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0402】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0403】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0404】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0405】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0406】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0407】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0408】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７または３３１～３３７のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0409】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0410】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0411】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0412】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0413】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0414】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００または２３～５５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0415】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＣＢＬＢを標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0416】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0417】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0418】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0419】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0420】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0421】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つの核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含み、ここで、少なくとも１つの核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子であり、少なくとも１つの核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0422】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0423】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0424】
いくつかの実施形態では、該核酸ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0425】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0426】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５のうちの１つによってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0427】
Ｂ．タンパク質ベースの遺伝子調節系
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される少なくとも１つ、２つもしくはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つもしくはそれより多くのタンパク質を含むタンパク質遺伝子調節系を提供する（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つもしくはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つもしくはそれより多くのタンパク質を含むタンパク質遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節系は、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる１つ以上のタンパク質を含む系である。いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。かかる実施形態は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ」と呼ばれる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される少なくとも１つ、２つもしくはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つもしくはそれより多くのタンパク質を含むタンパク質遺伝子調節系を提供する（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つもしくはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つもしくはそれより多くのタンパク質を含むタンパク質遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節系は、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる１つ以上のタンパク質を含む系である。いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。かかる実施形態は、本明細書では「ＴＡＬＥＮ」と呼ばれる。
【0428】
１．ジンクフィンガー系
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つもしくはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つもしくはそれより多くのジンクフィンガー融合タンパク質を含むジンクフィンガー遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。本明細書では、ジンクフィンガーベースの系は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを有する融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、該配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、該標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作することができる。従って、切断または組み換えを行いたい標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表２または３で言及されている標的遺伝子内の標的座位）を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、該標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つもしくはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つもしくはそれより多くのジンクフィンガー融合タンパク質を含むジンクフィンガー遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。本明細書では、ジンクフィンガーベースの系は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを有する融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、該配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、該標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作することができる。従って、切断または組み換えを行いたい標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表２または３で言及されている標的遺伝子内の標的座位）を特定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、該標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。
【0429】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、単一のジンクフィンガードメインは、約３０個のアミノ酸長である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチドの結合部位と１つのヌクレオチドが重複し得る４ヌクレオチド配列）に結合する。従って、ジンクフィンガー結合ドメインが配列に結合するように操作される当該配列（例えば、標的配列）の長さが、操作されるジンクフィンガー結合ドメインのジンクフィンガーの数を決定する。例えば、フィンガーモチーフが、重複するサブ部位には結合しないＺＦＰの場合には、６ヌクレオチドの標的配列には、２つのフィンガー結合ドメインが結合し、９ヌクレオチドの標的配列には、３つのフィンガー結合ドメインが結合する等である。標的部位における、個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわち、サブ部位）は、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間のリンカー）の長さ及び性質に応じて、連続している必要はなく、１つまたは数個のヌクレオチドによって隔てられてもよい。いくつかの実施形態では、個々のＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインは、個別のジンクフィンガーリピートを３～６個含み、それぞれ、９～１８塩基対を認識することができる。
【0430】
ジンクフィンガー結合ドメインは、所定の配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有することができる。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。
【0431】
ジンクフィンガードメインによる結合対にする標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。標的ＤＮＡ配列の選択を行うために、ヌクレオチド配列を単に目視確認することも利用できることは、当業者には明らかであろう。従って、本明細書に記載の方法では、標的ＤＮＡ配列を選択するためのいずれの手段も用いることができる。標的部位は概して、少なくとも９ヌクレオチド長であるので、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインと結合する。しかしながら、例えば、４フィンガーの結合ドメインと１２ヌクレオチドの標的部位との結合、５フィンガーの結合ドメインと１５ヌクレオチドの標的部位との結合、または６フィンガーの結合ドメインと１８ヌクレオチドの標的部位との結合も可能である。明らかなように、より大きい結合ドメイン（例えば、７、８、９フィンガー及びそれを超える）と、より長い標的部位との結合も可能である。
【0432】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つのジンクフィンガー融合タンパク質（ＺＦＰ）を含み、これは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0433】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0434】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つのジンクフィンガー融合タンパク質（ＺＦＰ）を含み、これは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0435】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0436】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つのジンクフィンガー融合タンパク質（ＺＦＰ）を含み、これは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0437】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0438】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含み、これは、ＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0439】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0440】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含み、これは、ＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0441】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0442】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含み、これは、ＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0443】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0444】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡを標的とするＺＦＰは、市販業者、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ等から入手される。例えば、いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２またはＺＣ３Ｈ１２ＡのＺＦＰは、表２５に示される。
【表25】
【0445】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0446】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0447】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0448】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0449】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0450】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0451】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0452】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0453】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0454】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0455】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0456】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0457】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0458】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0459】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0460】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0461】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0462】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0463】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0464】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0465】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0466】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0467】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0468】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0469】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0470】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0471】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0472】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0473】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0474】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0475】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0476】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0477】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0478】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0479】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0480】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0481】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0482】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0483】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0484】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0485】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0486】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＺＦＰを含み、ここで、少なくとも１つのＺＦＰは、ＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含み、少なくとも１つのＺＦＰは、ＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0487】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0488】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするジンクフィンガー結合ドメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0489】
該ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。酵素ドメインを得ることができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインの供給源として用いることができる
【0490】
本明細書に記載のＺＦＰの酵素ドメインとして用いるのに適した例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合して、結合部位でまたは結合部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖では、その認識部位から９ヌクレオチドの位置で、他方の鎖では、その認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号及び第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。従って、１つの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する酵素ドメイン、及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【0491】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特有の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。従って、ジンクフィンガー・ＦｏｋＩ融合体を用いて、二本鎖ＤＮＡの標的切断を行うには、ＦｏｋＩ酵素ドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性のある切断ドメインを再構成することができる。代替的に、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。
【0492】
２．ＴＡＬＥＮ系
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つまたはそれより多くのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含むＴＡＬＥＮ遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。ＴＡＬＥＮベースの系は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。上記のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子調節系で用いるのに適した例示的な酵素ドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される少なくとも１つ、２つまたはそれより多くの内在性遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる１つ、２つまたはそれより多くのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含むＴＡＬＥＮ遺伝子調節系を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、かかる遺伝子調節系を含む本明細書に記載の方法によって製造される改変ＴＩＬを提供する。ＴＡＬＥＮベースの系は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含むＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作製される。上記のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮベースの遺伝子調節系で用いるのに適した例示的な酵素ドメインである。
【0493】
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌が植物に感染する際に、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ細菌によって、そのタイプＩＩＩ分泌系を介して分泌されるタンパク質である。該ＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３～３４個のアミノ酸の反復配列を含むが、１２番目と１３番目のアミノ酸は異なる。これらの２つの位置は、リピート中の可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれ、可変性が高く、特異的なヌクレオチドの認識と密接に相関する。従って、適切なＲＶＤを含むリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、ＴＡＬエフェクタードメインが、特定の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＲＶＤの組み合わせの核酸特異性は、以下の通りである。すなわち、ＨＤは、シトシンを標的とし、ＮＩは、アデニンを標的とし、ＮＧは、チミンを標的とし、ＮＮは、グアニンを標的とする（ただし、いくつかの実施形態では、ＮＮは、より低い特異性でアデニンとも結合し得る）。
【0494】
ＴＡＬエフェクターリピートをアセンブルするための方法及び組成物は、当技術分野で既知である。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照されたい。ＴＡＬエフェクターリピートを構築するためのプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから市販されている。
【0495】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0496】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0497】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0498】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0499】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0500】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0501】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、ＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0502】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0503】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0504】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表７または表８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0505】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む少なくとも１つのＴＡＬＥＮ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0506】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0507】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0508】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0509】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0510】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0511】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0512】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0513】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0514】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0515】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0516】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0517】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0518】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0519】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0520】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0521】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0522】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0523】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0524】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0525】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0526】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0527】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0528】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0529】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0530】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0531】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0532】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0533】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0534】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0535】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0536】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0537】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0538】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0539】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0540】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0541】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号３３１～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0542】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0543】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0544】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号２３～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0545】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0546】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0547】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0548】
いくつかの実施形態では、該タンパク質ベースの遺伝子調節系は、少なくとも２つのＴａｌｅｎ融合タンパク質を含み、ここで、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含み、少なくとも１つのＴａｌｅｎ融合タンパク質は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0549】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0550】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするＴＡＬエフェクタードメインは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0551】
Ｃ．組み合わせ核酸／タンパク質ベースの遺伝子調節系
組み合わせ遺伝子調節系は、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列（例えば、内在性標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）をそれが結合する核酸ガイド分子によって標的とし、該標的核酸配列を改変する（例えば、標的核酸配列の切断、変異、またはメチル化）。
組み合わせ遺伝子調節系は、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列（例えば、内在性標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）をそれが結合する核酸ガイド分子によって標的とし、該標的核酸配列を改変する（例えば、標的核酸配列の切断、変異、またはメチル化）。
【0552】
部位特異的改変ポリペプチドは、核酸ガイドと結合する部分及び活性部分という２つの部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、部位特異的な酵素活性（例えば、ＤＮＡのメチル化、ＤＮＡまたはＲＮＡの切断、ヒストンのアセチル化、ヒストンのメチル化等）を呈する活性部分を含み、該酵素活性の部位は、ガイド核酸によって決定される。場合によっては、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列を改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する活性部分を含む。別の場合では、部位特異的改変ポリペプチドは、内在性標的核酸配列と関連するポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボース化活性、脱リボース化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の転写を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドは、標的ＲＮＡ配列の発現または翻訳を調節する（例えば、転写を増減させる）活性部分を含む。
【0553】
該核酸ガイドは、２つの部分、すなわち、内在性標的核酸配列と相補的であり、内在性標的核酸配列と結合することができる第一の部分（本明細書では「核酸結合セグメント」と呼ばれる）、及び部位特異的改変ポリペプチドと相互作用することができる第二の部分（本明細書では「タンパク質結合セグメント」と呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれる。いくつかの実施形態では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは、それぞれ、別々のポリヌクレオチド分子内に含まれており、該核酸ガイドは、２つのポリヌクレオチド分子を含み、これらが互いに会合し、機能的ガイドを形成する。
【0554】
該核酸ガイドは、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズすることによって、タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節系の標的特異性を媒介する。いくつかの実施形態では、該標的核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物内に含まれるＲＮＡ配列等のＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、該標的核酸配列は、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列である。本明細書で標的遺伝子に言及する場合には、複数の標的遺伝子座（すなわち、特定の標的遺伝子配列の一部（例えば、エキソンまたはイントロン））を含むその特定の遺伝子の完全長ＤＮＡ配列が包含される。各標的遺伝子座内にあるのは、本明細書に記載の遺伝子調節系によって改変され得る、より短い領域のＤＮＡ配列（本明細書では「標的ＤＮＡ配列」と呼ばれる）である。さらに、各標的遺伝子座は、「標的改変部位」を含み、該標的改変部位とは、遺伝子調節系によって誘導される改変の正確な位置（例えば、挿入、欠失もしくは変異の位置、ＤＮＡ切断の位置、またはエピジェネティックな改変の位置）を指す。本明細書に記載の遺伝子調節系は、２つ以上の核酸ガイド（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くの核酸ガイド）を含んでもよい。
【0555】
いくつかの実施形態では、該タンパク質／核酸複合型の遺伝子調節系は、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ａｇｏ、またはＴｔＡｇｏ）に由来する部位特異的改変ポリペプチドを含む。かかる実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ Ａｇｏ ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、該核酸ガイドは、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７（２０１４），２５８－２６１参照）。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、部位特異的改変ポリペプチドＴｔＡｇｏをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれる。
【0556】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系である。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、クラス２系である。クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型系、Ｖ型系及びＶＩ型系という３つの型に分類される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９タンパク質を用いるクラス２のＩＩ型系である。かかる実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ９（またはそのバリアント）であり、該核酸ガイド分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても知られている）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても知られている）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても知られている）及びＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても知られている））を用いるクラス２のＶ型系である。かかる実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１２（またはそのバリアント）であり、該核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られている）、Ｃａｓ１３ｂ及びＣａｓ１３ｃ）を用いるクラス２のＶＩ型系である（Ｐｙｚｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（２），３４７－３５６参照）。かかる実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドは、ＲＮＡリボエンドヌクレアーゼであるＣａｓ１３であり、該核酸ガイド分子は、ｇＲＮＡである。
【0557】
Ｃａｓポリペプチドとは、ｇＲＮＡ分子と相互作用することができるとともに、ｇＲＮＡ分子に呼応して、標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列に誘導または局在化され得るポリペプチドを指す。Ｃａｓポリペプチドには、天然に存在するＣａｓタンパク質、及び天然に存在するＣａｓ配列とは１つ以上のアミノ酸残基が異なる操作、変更または別段に改変されたＣａｓタンパク質が含まれる。
【0558】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＤＮＡ結合セグメント及びタンパク質結合セグメントという２つのセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子に含まれ、該ＤＮＡ結合セグメントは、別の異なるＲＮＡ分子に含まれる。かかる実施形態は、本明細書では、「二重分子ｇＲＮＡ」もしくは「二分子ｇＲＮＡ」または「デュアルｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、該ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、包括的な用語であり、二分子ガイドＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの両方を指す。
【0559】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡデュプレックス（ｄｓＲＮＡデュプレックス）を形成する２つの相補的ヌクレオチド領域を含み、該二本鎖が、Ｃａｓタンパク質への結合を促す。ｇＲＮＡの核酸結合セグメント（または「核酸結合配列」）は、特異的な標的核酸配列と相補的であり、該配列に結合することができるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的改変ポリペプチドとの相互作用によって、Ｃａｓが内在性核酸配列に結合し、標的核酸配列内または標的核酸配列周辺で、１つ以上の改変が行われる。標的改変部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的核酸配列との塩基対形成の相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの位置（標的ＲＮＡ配列内では、プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）という）の両方によって決定される。Ｃａｓが標的核酸配列に結合するには、ＰＡＭ／ＰＦＳ配列が必要である。様々なＰＡＭ／ＰＦＳ配列が当技術分野で既知であり、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）とともに使用するのに適する（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１及びＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５参照）。いくつかの実施形態では、該ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から５０塩基対以内に位置する。いくつかの実施形態では、該ＰＡＭ配列は、標的ＤＮＡ配列内の標的改変部位から１０塩基対以内に位置する。本方法によって標的化することができるＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列と標的改変部位との相対的な距離、及び配列特異的かつｇＲＮＡ媒介性のＣａｓ結合を媒介するための特有の２０塩基対の配列の存在によってのみ制限される。いくつかの実施形態では、該ＰＦＳ配列は、標的ＲＮＡ配列の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、該標的改変部位は、標的座位の５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、該標的改変部位は、標的座位の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、該標的改変部位は、標的座位のイントロンまたはエキソン内に位置する。
【0560】
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする核酸は、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターに含まれる。
【0561】
１．Ｃａｓタンパク質
いくつかの実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。本明細書に記載の方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ分子を使用することができ、これらとしては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、該部位特異的改変ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質である。本明細書に記載の方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ分子を使用することができ、これらとしては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子が挙げられる。
【0562】
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３及びＣｓｆ４からなる群から選択される。
【0563】
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質等のエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａタンパク質（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５０（２０１７），２８０－２８４）、Ｃａｓ１３ｂタンパク質（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、Ｃａｓ１３ｃタンパク質（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、またはＣａｓ１３ｄタンパク質（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７５（２０１８），２１２－２２３）である。
【0564】
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、野生型または天然に存在するＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するためのＨＮＨヌクレアーゼドメイン、及び非標的鎖を切断するためのＲｕｖＣ様ドメインを用いるマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡの特異性に基づいてＷＴＣａｓ９がＤＮＡに結合すると、二本鎖ＤＮＡの切断が生じ、これらは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）によって修復され得る。例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されており、さらなるＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載されている。かかるＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリーまたはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。
【0565】
いくつかの実施形態では、該天然に存在するＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９及びＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３，１－６に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0566】
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、以下の活性のうちの１つ以上を含む：
ａ．ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
ｂ．二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を創出する能力（実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）、
ｃ．エンドヌクレアーゼ活性、
ｄ．エキソヌクレアーゼ活性、及び／または
ｅ．ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力。
ａ．ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
ｂ．二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を創出する能力（実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）、
ｃ．エンドヌクレアーゼ活性、
ｄ．エキソヌクレアーゼ活性、及び／または
ｅ．ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力。
【0567】
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、様々な修復機序による、標的配列の修復の可能性または修復率をさらに向上させるために、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼまたはホスファターゼを動員する異種タンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、ＷＴＣａｓポリペプチドを核酸修復鋳型と共発現させる。
【0568】
いくつかの実施形態では、（例えば、異なるＰＡＭ配列選択性、酵素活性の向上または低下、細胞傷害性レベルの上昇または低下、ＮＨＥＪ、相同配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断等のバランスの変更のために）異なるＣａｓタンパク質の様々な酵素特性を活用するためには、異なるＣａｓタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓ９タンパク質）が、提供する各種方法で用いるものとして有益であり得る。
【0569】
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡというＰＡＭ配列モチーフを認識する（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６）。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧＮＧ及び／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０及びＤｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００参照）。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＧ及び／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ ２００８；１９０（４）：１３９０－１４００参照）。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＮＧＡＴＴまたはＮＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）というＰＡＭ配列モチーフを認識する（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｈ，ＰＮＡＳ ２０１３，１－６参照）。上記の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれでもよい。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉに由来するＣａｓ１３タンパク質であり、３’の単一のＡ、ＵまたはＣというＰＦＳ配列モチーフを認識する。
【0570】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１３ １０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
【0571】
２．Ｃａｓ変異体
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、該Ｃａｓポリペプチドの１つ以上の特性を変更するように操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、変更された酵素特性、例えば、（天然に存在するＣａｓ分子もしくは他の参照Ｃａｓ分子と比較して）変更されたヌクレアーゼ活性、または変更されたヘリカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓポリペプチドは、そのサイズを変更する変化、例えば、該Ｃａｓポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、そのサイズを縮小するアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす変化を含む。例えば、操作されたＣａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように変更することができる。
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、該Ｃａｓポリペプチドの１つ以上の特性を変更するように操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、変更された酵素特性、例えば、（天然に存在するＣａｓ分子もしくは他の参照Ｃａｓ分子と比較して）変更されたヌクレアーゼ活性、または変更されたヘリカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓポリペプチドは、そのサイズを変更する変化、例えば、該Ｃａｓポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、そのサイズを縮小するアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作されたＣａｓポリペプチドは、ＰＡＭ認識に影響を及ぼす変化を含む。例えば、操作されたＣａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように変更することができる。
【0572】
所望の特性を有するＣａｓポリペプチドは、所望の特性を有する変異体または変更されたＣａｓポリペプチドを提供するように、天然に存在するＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドを変化させることを含めたいくつかの方法で作製することができる。例えば、１つ以上の変異を親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然に存在するＣａｓポリペプチドまたは操作されたＣａｓポリペプチド）の配列に導入することができる。かかる変異及び相違は、置換（例えば、保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）、挿入または欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドに対して１個以上の変異（例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個または５０個の変異）を含む。
【0573】
実施形態では、変異体のＣａｓポリペプチドは、天然に存在するＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓは、不活性型Ｃａｓ（ｄＣａｓ）変異体である。かかる実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、いずれの内在性酵素活性も含まず、標的核酸切断を媒介することができない。かかる実施形態では、該ｄＣａｓは、非切断ベースの形式で標的核酸を改変することができる異種タンパク質と融合し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ｄＣａｓタンパク質は、転写活性化因子または転写抑制因子のドメイン（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）、ＥＲＦ抑制ドメイン（ＥＲＤ）、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）等）に融合される。いくつかのかかる場合では、該ｄＣａｓ融合タンパク質は、ｓｇＲＮＡによって、標的核酸における所定の位置（すなわち、配列）に導かれて、座位特異的な調節、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターへの結合のブロック（それにより、転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）、及び／または局在的なクロマチンの状態の改変（例えば、標的ＤＮＡを改変するか、もしくは標的ＤＮＡと関連するポリペプチドを改変する融合配列を用いる場合）を行う。場合によっては、該変化は、一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。場合によっては、該変化は、遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡと関連するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンに、エピジェネティックな改変を加える場合）。
【0574】
いくつかの実施形態では、該ｄＣａｓは、ｄＣａｓ１３変異体である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３（２０１８），６６５－６７６）。これらのｄＣａｓ１３変異体は、次いでＲＮＡを改変する酵素に融合することができ、該酵素としては、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２）が挙げられる。アデノシンデアミナーゼは、アデニンをイノシンに変換し、該イノシンを翻訳機構がグアニンのように扱うことにより、ＲＮＡ配列において、機能的なＡ→Ｇという変更が行われる。いくつかの実施形態では、該ｄＣａｓは、ｄＣａｓ９変異体である。
【0575】
いくつかの実施形態では、該変異体Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体である。Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体は、触媒活性を有するドメインを１つだけ含む（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）。該Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体は、ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡ結合性を保持するが、切断できるのは、ＤＮＡの一方の鎖のみであることから、一本鎖切断（例えば「ニック」）が生じる。いくつかの実施形態では、同じ細胞内で、２つの相補的Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（例えば、ＲｕｖＣドメインが不活性化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体、及びＨＮＨドメインが不活性化された１つのＣａｓ９ニッカーゼ変異体）が、２つのそれぞれの標的配列（ＤＮＡセンス鎖上の１つの標的配列、及びＤＮＡアンチセンス鎖上の１つの標的配列）に対応する２つのｇＲＮＡとともに発現する。このデュアルニッカーゼ系により、ずれた位置で二本鎖切断が行われ、二本鎖切断を起こすのに十分なほど近くで２つのオフターゲットニックが生じる可能性が低くなるため、標的特異性を向上させることができる。いくつかの実施形態では、相同配向型修復による外因性核酸配列の導入を促すために、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体を核酸修復鋳型と共発現させる。
【0576】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣａｓポリペプチドを操作して、該ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を変更することができる。いくつかの実施形態では、変異体Ｃａｓポリペプチドは、ＰＡＭ／ＰＦＳ特異性が、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なる。例えば、オフターゲット部位を減少させるか、特異性を向上させるか、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を排除するために、天然に存在するＣａｓタンパク質を改変して、該変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を変更することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質を改変して、ＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを長くすることができる。いくつかの実施形態では、該ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１５個のアミノ酸長である。指向性進化法を用いて、異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識し、及び／またはオフターゲット活性が低減されたＣａｓポリペプチドを生成することができる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化法で使用することができる例示的な方法及びシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１１，４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。
【0577】
例示的なＣａｓ変異体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １７３（２０１８），６６５－６７６に記載されており、これらは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0578】
３．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、核酸を標的とするセグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、その標的核酸内の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）によって標的核酸と相互作用し、ｇＲＮＡが結合する標的核酸内の位置を、該核酸を標的とするセグメントのヌクレオチド配列が決定する。該ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントを（例えば遺伝子操作によって）改変し、標的核酸配列内の任意の所望の配列にハイブリダイズさせることができる。
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、核酸を標的とするセグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、その標的核酸内の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。従って、ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）によって標的核酸と相互作用し、ｇＲＮＡが結合する標的核酸内の位置を、該核酸を標的とするセグメントのヌクレオチド配列が決定する。該ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントを（例えば遺伝子操作によって）改変し、標的核酸配列内の任意の所望の配列にハイブリダイズさせることができる。
【0579】
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的改変ポリペプチド（例えば、Ｃａｓタンパク質）と相互作用して、複合体を形成する。該ガイドＲＮＡは、結合したポリペプチドを、上記の核酸を標的とするセグメントによって、標的核酸内の特定のヌクレオチド配列に導く。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるとともに、二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成する２つのヌクレオチド領域を含む。
【0580】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む。かかる実施形態では、該２つのＲＮＡ分子はそれぞれ、互いに相補的であるヌクレオチド領域であって、該２つのＲＮＡ分子の該相補的なヌクレオチドがハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡデュプレックスのタンパク質結合セグメントを形成するヌクレオチド領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含む。
【0581】
標的座位に対するｇＲＮＡの特異性は、該核酸結合セグメントの配列によって媒介され、該核酸結合セグメントは、該標的座位内の標的核酸配列と相補的である約２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該対応する標的核酸配列は、およそ２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的座位内の標的核酸配列と１００％相補的である。いくつかの実施形態では、該標的核酸配列は、ＲＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、該標的核酸配列は、ＤＮＡ標的配列である。いくつかの実施形態では、該標的核酸配列は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａを含めた内在性遺伝子に由来するＤＮＡ標的配列である（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【0582】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、ＳＯＣＳ１を標的とする核酸結合セグメントを含むｇＲＮＡ分子（すなわち、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ）を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0583】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表３または表４に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＳＯＣＳ１標的ＤＮＡ配列は、表２６及び２７に示される。
【0584】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。該ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表２６及び２７に示される。
【表26-1】
【表26-2】
【表26-3】
【表26-4】
【表27】
【0585】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、ＰＴＰＮ２を標的とする核酸結合セグメントを含むｇＲＮＡ分子（すなわち、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ）を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0586】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＰＴＰＮ２標的ＤＮＡ配列は、表２８及び２９に示される。
【0587】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。該ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表２８及び２９に示される。
【表28-1】
【表28-2】
【表28-3】
【表29】
【0588】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とする核酸結合セグメントを含むｇＲＮＡ分子（すなわち、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ）を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0589】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＺＣ３Ｈ１２Ａ標的ＤＮＡ配列は、表３０及び３１に示される。
【0590】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。該ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表３０及び３１に示される。
【表30-1】
【表30-2】
【表30-3】
【表30-4】
【表30-5】
【表30-6】
【表30-7】
【表30-8】
【表30-9】
【表30-10】
【表30-11】
【表31】
【0591】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、ＣＢＬＢを標的とする核酸結合セグメントを含むｇＲＮＡ分子（すなわち、ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ）を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0592】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＣＢＬＢ標的ＤＮＡ配列は、表３２及び３３に示される。
【0593】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。該ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表３２及び３３に示される。
【表32】
【表33】
【0594】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、ＲＣ３Ｈ１を標的とする核酸結合セグメントを含むｇＲＮＡ分子（すなわち、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ）を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0595】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＲＣ３Ｈ１標的ＤＮＡ配列は、表３４及び３５に示される。
【0596】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。該ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表３４及び３５に示される。
【表34】
【表35】
【0597】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、ＮＦＫＢＩＡを標的とする核酸結合セグメントを含むｇＲＮＡ分子（すなわち、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ）を少なくとも１つ含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0598】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。例示的なＮＦＫＢＩＡ標的ＤＮＡ配列は、表３６及び３７に示される。
【0599】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子の核酸結合セグメントは、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。該ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡの核酸結合セグメントをコードする例示的なＤＮＡ配列は、表３６及び３７に示される。
【表36】
【表37】
【0600】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0601】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0602】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0603】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0604】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0605】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0606】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0607】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0608】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0609】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0610】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0611】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0612】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0613】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0614】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0615】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0616】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0617】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0618】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0619】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0620】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0621】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0622】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0623】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0624】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0625】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0626】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0627】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0628】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0629】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0630】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0631】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0632】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0633】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0634】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0635】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0636】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0637】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0638】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0639】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0640】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＰＴＰＮ２遺伝子（配列番号３）またはＰｔｐｎ２遺伝子（配列番号４）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0641】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、表９または表１０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0642】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0643】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＰＴＰＮ２を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２０１～３２７または２０１～３１４のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0644】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＺＣ３Ｈ１２Ａ遺伝子（配列番号５）またはＺｃ３ｈ１２ａ遺伝子（配列番号６）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0645】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１１または表１２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0646】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0647】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＺＣ３Ｈ１２Ａを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号３３１～７９７、３３８～７９７または３３８～７８９のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0648】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＳＯＣＳ１遺伝子（配列番号１）またはＳｏｃｓ１遺伝子（配列番号２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0649】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表４または表５に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0650】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0651】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＳＯＣＳ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号２３～２００、５６～２００または５６～１８７のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0652】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＣＢＬＢ遺伝子（配列番号７）またはＣｂｌｂ遺伝子（配列番号８）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0653】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、表１７または表１８に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0654】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0655】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＣＢＬＢを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号７９８～８２３または７９８～８０８のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0656】
いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、少なくとも２つのｇＲＮＡ分子を含み、ここで、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子であり、少なくとも１つのｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＲＣ３Ｈ１遺伝子（配列番号９）またはＲｃ３ｈ１遺伝子（配列番号１０）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、ＮＦＫＢＩＡ遺伝子（配列番号１１）またはＮｆｋｂｉａ遺伝子（配列番号１２）内のＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0657】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、表１９または表２０に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、表２１または表２２に示される一連のゲノム座標によって定義されるＤＮＡ配列によってコードされるＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0658】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合し、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0659】
いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＲＣ３Ｈ１を標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８２４～８４４または８２４～８４４または８２４～８３６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされ、該少なくとも１つのＮＦＫＢＩＡを標的とするｇＲＮＡ分子は、配列番号８４５～８７５または８４５～８５６のうちの１つと１００％同一であるＤＮＡ配列によってコードされる。
【0660】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、特定の標的座位または標的遺伝子に特有である標的配列を特定するための、当技術分野で既知のアルゴリズム（例えばＣａｓ－ＯＦＦ ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、オフターゲット結合を最小限にするように設計される。
【0661】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する１つ以上の改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドを含むことができる。かかる実施形態では、これらの改変ｇＲＮＡは、非改変ｇＲＮＡと比較して、自然免疫の低下を誘発し得る。「自然免疫反応」という用語には、概ねウイルスまたは細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞反応が含まれ、該反応には、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導が伴う。
【0662】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｇＲＮＡは、５’末端または５’末端近傍（例えば、その５’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）が改変される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核ｍＲＮＡのキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというキャップアナログ、または３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇというアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））を含めることによって改変される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写ｇＲＮＡが、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）で処理して５’三リン酸基を除去することによって改変される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端またはその３’末端近傍（例えば、その３’末端から１～１０ヌクレオチド、１～５ヌクレオチドまたは１～２ヌクレオチド以内）に改変を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つ以上（例えば、２５～２００個）のアデニン（Ａ）残基を付加することによって改変される。
【0663】
いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、ｇＲＮＡに存在することができるが、他の遺伝子調節系、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡベースの系にも存在し得る。いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：
ａ．ホスホジエステル骨格結合において結合していないリン酸酸素のうちの１つもしくは両方及び／または結合しているリン酸酸素のうちの１つ以上の変更、例えば、置換、
ｂ．リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更、例えば置換、
ｃ．リン酸部分の「脱リン」リンカーへの大規模置換、
ｄ．天然に存在する核酸塩基の改変または置換、
ｅ．リボース－リン酸骨格の置換または改変、
ｆ．オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の、または部分のコンジュゲーションの除去、改変もしくは置換、ならびに
ｇ．糖の改変。
ａ．ホスホジエステル骨格結合において結合していないリン酸酸素のうちの１つもしくは両方及び／または結合しているリン酸酸素のうちの１つ以上の変更、例えば、置換、
ｂ．リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更、例えば置換、
ｃ．リン酸部分の「脱リン」リンカーへの大規模置換、
ｄ．天然に存在する核酸塩基の改変または置換、
ｅ．リボース－リン酸骨格の置換または改変、
ｆ．オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の、または部分のコンジュゲーションの除去、改変もしくは置換、ならびに
ｇ．糖の改変。
【0664】
いくつかの実施形態では、上に列挙した改変を組み合わせて、改変を２個、３個、４個、またはそれより多く有し得る改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、いくつかの実施形態では、改変ヌクレオシドまたは改変ヌクレオチドは、改変糖及び改変核酸塩基を有することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのすべての塩基が改変される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の各々が、ホスホロチオエート基で置き換えられる。
【0665】
いくつかの実施形態では、例えば、ゲノム全体における総オフターゲット活性を最小限にするために、ソフトウェアツールを用いて、ユーザーの標的配列内におけるｇＲＮＡの選択を最適化することができる。オフターゲット活性は、切断以外の場合もある。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を用いる場合の考え得る各ｇＲＮＡの選択を行う際には、ソフトウェアツールによって、ゲノム全体において、ある特定の数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個）以下のミスマッチ塩基対を含むすべての潜在的オフターゲット配列（ＮＡＧまたはＮＧＧのいずれかのＰＡＭに先行する）を特定することができる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験によって導出した重み付けスキームを用いて予測することができる。その後、考え得る各ｇＲＮＡをオフターゲット切断の総予測数によってランク付けし、上位のｇＲＮＡは、オンターゲット切断の可能性が最も高く、オフターゲット切断の可能性が最も低いものを表す。該ツールには、他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクターの構築用試薬の自動設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用プライマーの設計、次世代シーケンシングによってオフターゲット切断のハイスループットの検出及び定量を行うためのプライマーの設計の機能も含まれていることがある。
【0666】
ＩＩＩ．改変ＴＩＬの作製方法
いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＴＩＬを産生するための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、遺伝子調節系を免疫エフェクター細胞の集団に導入することを含み、該遺伝子調節系は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＴＩＬを産生するための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、遺伝子調節系を免疫エフェクター細胞の集団に導入することを含み、該遺伝子調節系は、ＡＮＫＲＤ１１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ３、ＢＣＯＲ、ＣＡＬＭ２、ＣＢＬＢ、ＣＨＩＣ２、ＣＴＬＡ４、ＤＨＯＤＨ、Ｅ２Ｆ８、ＥＧＲ２、ＦＬＩ１、ＦＯＸＰ３、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡＳ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ２、ＩＫＺＦ３、ＬＡＧ３、ＭＡＰ４Ｋ、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＰ１、ＰＢＲＭ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＥＬＩ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＲＢＭ３９、ＲＣ３Ｈ１、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＴＤ５、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＭＡＤ２、ＳＯＣＳ１、ＴＡＮＫ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＩＰ１、ＴＲＡＦ６、ＵＭＰＳ、ＷＤＲ６及びＺＣ３Ｈ１２Ａから選択される１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子の発現及び／または機能を低下させることができる（国際公開第ＷＯ２０１９／１７８４２２号、ＷＯ２０１９／１７８４２０及びＷＯ２０１９／１７８４２１参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該１つ、２つまたはそれより多くの内在性標的遺伝子は、ＳＯＣＳ１、ＰＴＰＮ２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＣＢＬＢ、ＲＣ３Ｈ１及びＮＦＫＢＩＡから選択される。
【0667】
本明細書に記載の遺伝子調節系、例えば、核酸ベース、タンパク質ベース、または核酸／タンパク質ベースの系の構成成分は、様々な送達方法及び製剤を用いて、様々な形態で標的細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、該系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、組み換えベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）によって送達される。いくつかの実施形態では、該系が、２つ以上の構成成分を含む場合には、ベクターは、該系の構成成分をそれぞれコードする複数のポリヌクレオチドを含んでよい。いくつかの実施形態では、該系が、２つ以上の構成成分を含む場合には、複数のベクターを用いてもよく、各ベクターは、該系の特定の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のためのシグナルペプチド）をコードする配列が、該系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合されたものも含んでよい。例えば、ベクターは、該系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドに融合された核局在化配列（例えば、ＳＶ４０に由来する核局在化配列）を含んでよい。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系の細胞への導入は、インビトロで行われる。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系の細胞への導入は、インビボで行われる。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系の細胞への導入は、エキソビボで行われる。
【0668】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、ウイルスベクターである。適切なウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４及びＷＯ９５／００６５５参照）、アデノ随伴ウイルス（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、ＳｒｉｖａｓｔａｖａによるＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２－３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４－１６５及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３－１０６１７参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９参照）をベースとするウイルスベクター、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0669】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターは、プラスミドである。数多くの適切なプラスミド発現ベクターが当業者に既知であり、多くは市販されている。例えば、真核宿主細胞用では、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）というベクターが提供されている。しかしながら、宿主細胞と適合するものであれば、いずれの他のプラスミドベクターも使用され得る。使用される細胞の種類及び遺伝子調節系に応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含め、多くの適切な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４参照）。
【0670】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、調節エレメント、例えば、プロモーター等の転写調節エレメントに作動可能に連結される。該転写調節エレメントは、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）または原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）のいずれかで機能するものであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方でポリヌクレオチドの発現を可能にする複数の調節エレメントに作動可能に連結される。使用される細胞型及び遺伝子調節系に応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含め、多くの適切な転写調節エレメント及び翻訳調節エレメントのうちのいずれかを発現ベクターで用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４参照）。
【0671】
適切な真核生物プロモーター（真核細胞で機能するプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスに由来する長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。該発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写ターミネーターも含んでよい。該発現ベクターは、発現を増幅させるための適切な配列も含んでよい。該発現ベクターは、部位特異的改変ポリペプチドに融合されることによりキメラポリペプチドが生じるタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【0672】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。
【0673】
ポリヌクレオチド及び組み換えベクターを宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で既知であり、任意の既知の方法を用いて、遺伝子調節系の構成成分を細胞に導入することができる。適切な方法としては、例えば、ウイルス感染、バクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９－４０９Ｘ（１２）００２８３－９参照）、マイクロフルイディクス送達方法（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３号参照）等が挙げられる。いくつかの実施形態では、電気穿孔による送達は、細胞と、遺伝子調節系の構成成分とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で混合すること、ならびに電気的刺激を所定の期間及び振幅で１回以上加えることを含む。いくつかの実施形態では、混合物をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットに送る装置（例えば、ポンプ）に連結された容器内で、細胞を遺伝子調節系の構成成分と混合し、電気的刺激を１回以上、所定の期間及び振幅で加えた後、該細胞を第２の反応容器に送る。
【0674】
いくつかの実施形態では、遺伝子調節系の構成成分を細胞内に導入するために電気穿孔が使用される。ｐｒｅ－ＲＥＰ及びＲＥＰプロトコルが使用されるいくつかの実施形態では、電気穿孔は、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階の後、ＲＥＰ段階の前に、遺伝子調節系の構成成分を細胞内に導入するために使用される。
【0675】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子調節系の１つ以上の構成成分、または遺伝子調節系の１つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、トランスポゾン、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、弱毒化細菌、またはウイルス様粒子等の非ウイルス送達媒体で細胞に導入される。いくつかの実施形態では、該媒体は、弱毒化細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ある特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ及び改変Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを含めた、天然の細菌または人工的に操作されて、侵襲性であるが、発病を防ぐように弱毒化されている細菌）、特定の細胞を標的とするための栄養特異的及び組織特異的なトロピズムを有する細菌、ならびに標的細胞特異性を変化させるために、表面タンパク質が改変された細菌である。いくつかの実施形態では、該媒体は、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、パッケージング能が大きく、免疫原性が少なく、哺乳類のプラスミド保持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた操作されたファージ）である。いくつかの実施形態では、該媒体は、哺乳類のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空の」粒子を精製した後、エキソビボでウイルスを所望のカーゴとともにアセンブルすることによって）改変ウイルス粒子を生成することができる。該媒体を操作して標的リガンドを組み込み、標的組織特異性を改変することもできる。いくつかの実施形態では、該媒体は、生体リポソームである。例えば、該生体リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、対象に由来する赤血球を溶血させ、球体構造にしたものである赤血球ゴースト、組織標的化は、様々な組織特異的または細胞特異的リガンドを取り付けることによって達成され得る）、分泌エクソソーム、または対象から得られる、エンドサイトーシス由来の膜結合型ナノベシクル（３０～１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から産生され得るため、標的リガンドを必要とすることなく細胞に取り込むことができる）である。
【0676】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変ＴＩＬの方法は、免疫エフェクター細胞の集団をサンプルから得ることを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、組織サンプル、流体サンプル、細胞サンプル、タンパク質サンプル、またはＤＮＡサンプルもしくはＲＮＡサンプルを含む。いくつかの実施形態では、組織サンプルは、いずれの組織型から得てもよく、該組織型としては、皮膚、毛髪（毛根を含む）、骨髄、骨、筋肉、唾液腺、食道、胃、小腸（例えば、十二指腸、空腸もしくは回腸の組織）、大腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、膣、胎盤、精巣、甲状腺、副腎、心臓組織、胸腺、脾臓、リンパ節、脊髄、脳、眼、耳、舌、軟骨、白色脂肪組織、または褐色脂肪組織が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、組織サンプルは、がん性腫瘍、前がん性腫瘍または非がん性腫瘍に由来してもよい。いくつかの実施形態では、流体サンプルは、口腔スワブ、血液、血漿、口腔粘膜、膣粘膜、末梢血、臍帯血、唾液、精液（ｓｅｍｅｎ）、尿、腹水、胸膜液、髄液、肺洗浄液、涙、汗、精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、精漿、前立腺液、射精前液（クーパー液）、排泄物、脳脊髄液、リンパ、１つ以上の細胞集団を含む細胞培地、１つ以上の細胞集団を含む緩衝液等を含む。
【0677】
いくつかの実施形態では、該サンプルは、免疫エフェクター細胞等の特定の細胞型を該サンプルの残部から濃縮または単離するために処理される。ある特定の実施形態では、該サンプルは、末梢血サンプルであり、これはその後、白血球分離に供され、赤血球及び血小板を分離され、白血球が単離される。いくつかの実施形態では、該サンプルは、ｌｅｕｋｏｐａｋであり、免疫エフェクター細胞がそこから単離または濃縮され得る。いくつかの実施形態では、該サンプルは、腫瘍サンプルであり、これがさらに処理され、該腫瘍に存在するリンパ球が単離される（すなわち、腫瘍浸潤リンパ球が単離される）。
【0678】
いくつかの実施形態では、単離された免疫エフェクター細胞を培養中で増殖させ、増殖した免疫エフェクター細胞の集団を産生する。該増殖プロセス中、該培養系に、１つ以上の活性化因子または成長因子が添加され得る。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のサイトカイン（ＩＬ－２及び／またはＩＬ－７等）を培養系に加えて、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を増強または促進することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体を該培養系に加え、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を増強または促進してもよい。いくつかの実施形態では、該免疫エフェクター細胞は、該増殖プロセス中、フィーダー細胞と共培養してよい。いくつかの実施形態では、本発明に提供する方法は、１回以上の増殖相を含む。例えば、いくつかの実施形態では、該免疫エフェクター細胞は、サンプルから単離した後に増殖させ、増殖を休止させてから、再び増殖させることができる。いくつかの実施形態では、該免疫エフェクター細胞は、ある一連の増殖条件で増殖させた後、第二の異なる一連の増殖条件で、第２回の増殖を行うことができる。免疫細胞の従来のエキソビボ増殖法は、例えば、米国特許出願公開第２０１８０２８２６９４号及び第２０１７０１５２４７８号、ならびに米国特許第８，３８３，０９９号及び第８，０３４，３３４号に記載されているように、当技術分野で既知である。
【0679】
培養及び増殖プロセスのいずれかの時点で、本明細書に記載の遺伝子調節系を免疫エフェクター細胞に導入し、改変ＴＩＬの集団を産生することができる。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、免疫エフェクター細胞の集団に、サンプルからの濃縮の直後に導入される。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、１つ以上の増殖プロセスの前、最中または後に、該免疫エフェクター細胞の集団に導入される。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、該免疫エフェクター細胞の集団に、サンプルからの濃縮または対照からの採取直後、任意の増殖回の前に導入される。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、該免疫エフェクター細胞の集団に、第１回の増殖後かつ第２回の増殖の前に導入される。いくつかの実施形態では、該遺伝子調節系は、該免疫エフェクター細胞の集団に、第１回及び第２回の増殖の後に導入される。
【0680】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって産生される改変ＴＩＬは、直ちに使用され得る。代替的に、該細胞は、液体窒素の温度で凍結され、長期間保存される場合もあり、解凍され、再利用することができる。かかる場合には、該細胞は、通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、または当技術分野で一般に使用されるなんらかの他のかかる溶液中で凍結され、かかる凍結温度で細胞が保存され、凍結した培養細胞を解凍するための当技術分野で一般に知られる方法で該細胞が解凍される。
【0681】
いくつかの実施形態では、該改変ＴＩＬは、様々な培養条件下でインビトロにて培養され得る。該細胞は、培養中で増殖、すなわち、それらの増殖を促進する条件下で成長し得る。培地は、液体でも半固体でもよく、例えば、寒天、メチルセルロース等を含んでもよい。該細胞集団は、適切な栄養培地、例えば、通常はウシ胎児血清（約５～１０％）、Ｌ－グルタミン、チオール、特に２－メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンが添加されたイスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０に懸濁され得る。該培養は、制御性Ｔ細胞が反応する成長因子を含み得る。本明細書で定義される成長因子とは、膜貫通受容体に対する特異的作用を通じて、培養細胞または無傷の組織内の細胞のいずれかの生存、成長及び／または分化を促すことができる分子である。成長因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子が含まれる。
【0682】
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用した改変ＴＩＬの産生
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の産生方法は、標的ＤＮＡ配列と、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体とを接触させることを含む。上で論じたように、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドが複合体を形成し、該ｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメインが、該複合体を標的ＤＮＡ配列に導き、該Ｃａｓタンパク質（または酵素的に不活性なＣａｓタンパク質に融合された異種タンパク質）が、標的ＤＮＡ配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、該ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（または該ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ核酸であり、細胞に形質導入によって導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系のＣａｓ及びｇＲＮＡ成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルス形質導入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系のＣａｓ９及びｇＲＮＡ成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第一のウイルスベクターに含まれ、該ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、第二のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、該第二のウイルスベクターよりも前に、該第一のウイルスベクターが細胞に導入される。この実施形態のいくつかの態様では、該第一のウイルスベクターよりも前に、該第二のウイルスベクターが細胞に導入される。かかる実施形態では、該ベクターが組み込まれることにより、該Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ成分の発現が持続する。しかしながら、一部の細胞型では、Ｃａｓ９の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。従って、いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ核酸配列は、トランスフェクションによって、該細胞の集団に導入され得る。かかる実施形態では、Ｃａｓ９の発現は、時間とともに減少し、オフターゲット変異またはオフターゲット切断部位の数が減少し得る。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の産生方法は、標的ＤＮＡ配列と、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体とを接触させることを含む。上で論じたように、ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドが複合体を形成し、該ｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメインが、該複合体を標的ＤＮＡ配列に導き、該Ｃａｓタンパク質（または酵素的に不活性なＣａｓタンパク質に融合された異種タンパク質）が、標的ＤＮＡ配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、該ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（または該ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ核酸であり、細胞に形質導入によって導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系のＣａｓ及びｇＲＮＡ成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡ成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルス形質導入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系のＣａｓ９及びｇＲＮＡ成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第一のウイルスベクターに含まれ、該ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、第二のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、該第二のウイルスベクターよりも前に、該第一のウイルスベクターが細胞に導入される。この実施形態のいくつかの態様では、該第一のウイルスベクターよりも前に、該第二のウイルスベクターが細胞に導入される。かかる実施形態では、該ベクターが組み込まれることにより、該Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ成分の発現が持続する。しかしながら、一部の細胞型では、Ｃａｓ９の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。従って、いくつかの実施形態では、該Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ核酸配列は、トランスフェクションによって、該細胞の集団に導入され得る。かかる実施形態では、Ｃａｓ９の発現は、時間とともに減少し、オフターゲット変異またはオフターゲット切断部位の数が減少し得る。
【0683】
いくつかの実施形態では、この複合体は、該ｇＲＮＡ分子とＣａｓタンパク質を混合し、複合体を形成するのに十分な時間培養することにより、無細胞系で形成される。該ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含み、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ－リボ核タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ）と呼ばれるこの予備形成複合体をその後、細胞に導入し、標的ＤＮＡ配列を改変することができる。該複合体化は、該Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡを別々に導入した場合には標的細胞でも生じ得る。
【0684】
Ｂ．ｓｈＲＮＡ系を使用した改変ＴＩＬの産生
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞を、該細胞に、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を含む１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって産生する方法を開示する。該免疫エフェクター細胞は、小さい遺伝子カセットを介して、特定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、該ｓｈＲＮＡを産生するように改変され得る。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方が、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入するために使用され得る。導入されたＤＮＡは、該細胞自体のＤＮＡの一部となる場合もあれば、核内で存続する場合もあり、ｓｈＲＮＡを産生するように該細胞内機構に指示する。ｓｈＲＮＡは、該細胞内でダイサーまたはＡＧＯ２が媒介するスライサー活性によって、ＲＮＡｉが媒介する遺伝子ノックダウンを誘導するようにプロセッシングされ得る。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞を、該細胞に、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を含む１つ以上のｓｈＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって産生する方法を開示する。該免疫エフェクター細胞は、小さい遺伝子カセットを介して、特定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、該ｓｈＲＮＡを産生するように改変され得る。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方が、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入するために使用され得る。導入されたＤＮＡは、該細胞自体のＤＮＡの一部となる場合もあれば、核内で存続する場合もあり、ｓｈＲＮＡを産生するように該細胞内機構に指示する。ｓｈＲＮＡは、該細胞内でダイサーまたはＡＧＯ２が媒介するスライサー活性によって、ＲＮＡｉが媒介する遺伝子ノックダウンを誘導するようにプロセッシングされ得る。
【0685】
Ｃ．ｓｉＲＮＡ系を使用した改変ＴＩＬの産生
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞を、該細胞に、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を含む１つ以上のｓｉＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって産生する方法を開示する。該免疫エフェクター細胞は、小さい遺伝子カセットを介して、特定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、該ｓｉＲＮＡを産生するように改変され得る。レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びレンチウイルスが、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入するために使用され得る。導入されたＤＮＡは、該細胞自体のＤＮＡの一部となる場合もあれば、核内で存続する場合もあり、ｓｉＲＮＡを産生するように該細胞内機構に指示する。該ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を妨げ得る。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞を、該細胞に、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を含む１つ以上のｓｉＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドを導入することによって産生する方法を開示する。該免疫エフェクター細胞は、小さい遺伝子カセットを介して、特定のＤＮＡ配列を細胞核に導入することによって、該ｓｉＲＮＡを産生するように改変され得る。レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びレンチウイルスが、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを免疫エフェクター細胞に導入するために使用され得る。導入されたＤＮＡは、該細胞自体のＤＮＡの一部となる場合もあれば、核内で存続する場合もあり、ｓｉＲＮＡを産生するように該細胞内機構に指示する。該ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を妨げ得る。
【0686】
ＩＶ．養子細胞移入
養子細胞移入（ＡＣＴ）は、極めて有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞をがん患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロでの識別、これら細胞の多数へのインビトロ増殖及び担がん宿主へのそれらの注入を含む治療アプローチである。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬ）の間質に由来し得る。ＡＣＴ用のＴＩＬは、本明細書に記載の通りに調製され得る。ＴＩＬは、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作される場合、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）で強化される場合、または自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされる場合には、血液から得られるまたは血液に由来し得る。該リンパ球が、注入を受ける担がん宿主に由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと呼ばれる。参照により全体として本明細書に組み込まれる米国公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患した患者の治療用のがんの退縮を促進するための養子細胞療法を行うための方法に関し、これは、これらの方法に関して参照により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の通りに投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回投与で施され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈注射によって行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ及び／または細胞傷害性リンパ球は、複数回投与で施され得る。
養子細胞移入（ＡＣＴ）は、極めて有効な形態の免疫療法であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞をがん患者に移入することを含む。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロでの識別、これら細胞の多数へのインビトロ増殖及び担がん宿主へのそれらの注入を含む治療アプローチである。養子移入に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬ）の間質に由来し得る。ＡＣＴ用のＴＩＬは、本明細書に記載の通りに調製され得る。ＴＩＬは、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作される場合、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）で強化される場合、または自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローニングされる場合には、血液から得られるまたは血液に由来し得る。該リンパ球が、注入を受ける担がん宿主に由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと呼ばれる。参照により全体として本明細書に組み込まれる米国公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患した患者の治療用のがんの退縮を促進するための養子細胞療法を行うための方法に関し、これは、これらの方法に関して参照により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の通りに投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回投与で施され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈注射によって行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ及び／または細胞傷害性リンパ球は、複数回投与で施され得る。
【0687】
抗腫瘍活性を有する免疫細胞をがん患者に移入する前に、該患者に対してリンパ球枯渇化段階が使用され得る。該リンパ球枯渇化により、制御性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素が部分的または完全に除去される。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇化が使用される。他の実施形態では、リンパ球枯渇化は使用されない。
【0688】
Ｖ．抗体及び抗体複合体
Ａ．抗体複合体
固定化抗体とは異なり、可溶性抗体複合体は、Ｔ細胞に対してより軽度の活性化シグナルを提供し得る。参照により全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２００７／００３６７８３号は、Ｔ細胞の活性化及び増殖を開始することができるＣＤ２８に対する第二の抗体と複合した１つの抗ＣＤ３抗体から構成される可溶性二重特異性四量体抗体複合体（ＴＡＣ）の使用を記載している。
Ａ．抗体複合体
固定化抗体とは異なり、可溶性抗体複合体は、Ｔ細胞に対してより軽度の活性化シグナルを提供し得る。参照により全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２００７／００３６７８３号は、Ｔ細胞の活性化及び増殖を開始することができるＣＤ２８に対する第二の抗体と複合した１つの抗ＣＤ３抗体から構成される可溶性二重特異性四量体抗体複合体（ＴＡＣ）の使用を記載している。
【0689】
本開示は、ＴＩＬの活性化方法を提供し、該方法は、ＴＩＬを含むサンプルを、少なくとも１つの可溶性単一特異性複合体を含む組成物とともに培養することを含み、各可溶性単一特異性複合体は、連結されかつ該ＴＩＬの同じ抗原に特異的に結合する２つの結合タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、対ＴＩＬは、ＩＬ－２の存在下で培養される。ある特定の実施形態では、該２つの結合タンパク質は、同じ結合タンパク質であり、該抗原の同じエピトープに結合する。
【0690】
ある特定の実施形態では、該結合タンパク質は、抗体またはその断片である。使用され得る抗体断片としては、組み換え供給源に由来する及び／またはトランスジェニック動物で産生されるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ及びｄｓＦｖ断片が挙げられる。該抗体または断片は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター及びヒトを含めた任意の種に由来し得る。キメラ抗体誘導体、すなわち、非ヒト動物の可変領域及びヒトの定常領域を組み合わせた抗体分子もまた、本発明の範囲内に企図される。キメラ抗体分子としては、例えば、マウス、ラット、または他の種の抗体由来の抗原結合ドメインと、ヒト定常領域を含むヒト化抗体を挙げることができる。キメラ抗体を作製するために従来の方法が使用され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許公開第ＥＰ１７１４９６号、欧州特許公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号参照）。ヒト化抗体の調製は、ＥＰ－Ｂ １０ ２３９４００に記載されている。ヒト化抗体は、商業的にも産生され得る（Ｓｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２ Ｈｏｌｌｙ Ｒｏａｄ，Ｔｗｉｃｋｅｎｈａｍ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象において免疫原性が少ないことが予想される。ヒト化抗体は、例えば、ＷＯ００／６１６３５に記載の通りにさらに安定化され得る。これらの公開のすべては、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0691】
ＴＩＬ抗原に結合する抗体またはその断片は、商業的に入手可能であるか、または当業者によって調製され得る。１つの実施形態では、同じ抗原に結合する該２つの抗体またはそれらの断片は、直接連結される。該抗体の直接の連結は、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用して、１つの抗体を他の抗体に化学的に結合させることによって調製され得る。
【0692】
別の実施形態では、該２つの抗体は、該可溶性単一特異性複合体において、間接的に連結される。「間接的に連結される」とは、該２つの抗体が、互いに直接共有結合的に連結されないが、免疫学的複合体等の連結部分を介して結合されることを意味する。好ましい実施形態では、該２つの抗体は、四量体抗体複合体を調製することによって間接的に連結される。四量体抗体複合体は、同じ抗原に結合しかつ同じ動物種のものであるモノクローナル抗体と、該第一の動物種の抗体のＦｃ断片に対するものである第二の動物種のモノクローナル抗体をほぼ等モル量混合することによって調製され得る。該第一及び第二の抗体を、該第一の動物種の抗体のＦｃ断片に対するものである第二の動物種のモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２断片のほぼ等モル量と反応させてもよい。四量体抗体複合体及びその調製方法の説明に関しては、参照により全体として本明細書に組み込まれるＬａｎｓｄｏｒｐに対する米国特許第４，８６８，１０９号を参照されたい。
【0693】
１つの実施形態では、該組成物は、少なくとも２つの異なる単一特異性複合体を含み、各々がＴＩＬの異なる抗原に結合する。１つの実施形態では、該組成物は、少なくとも２つの異なる可溶性単一特異性複合体を含み、該少なくとも２つの異なる可溶性単一特異性複合体の各々は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＩＣＥＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される異なる抗原に結合する。
【0694】
特定の実施形態では、１つの単一特異性複合体がＣＤ３に結合し、第二の単一特異性複合体がＣＤ２８に結合する。別の実施形態では、該組成物は、少なくとも３つの異なる可溶性単一特異性複合体を含み、各々がＴＩＬの３つの異なる抗原のうちの１つに結合する。かかる実施形態では、２つの単一特異性複合体が同じ抗原に結合することはない。特定の実施形態では、該組成物は、３つの異なる可溶性単一特異性複合体を含み、１つがＣＤ３に特異的であり、第二はＣＤ２８に特異的であり、第三がＣＤ２に特異的である。特定の実施形態では、該可溶性単一特異性複合体の存在下でのＴＩＬの活性化は、各々がＴＩＬの異なる抗原に結合する２つの異なる結合タンパク質または抗体を含む二重特異性複合体を使用したＴＩＬの活性化より大きい。
【0695】
Ｂ．抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体
当業者には理解されるように、本発明で用いられるいくつかの適切な抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体が存在する。抗ヒトＣＤ３抗体としては、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌの抗体が挙げられるがこれらに限定されない様々な哺乳類由来のポリクローナル及びモノクローナル抗体が挙げられる。特定の実施形態では、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）。同様に当業者には理解されるように、本発明で用いられるいくつかの適切な抗ヒトＣＤ２８抗体が存在し、これらとしては、抗ヒトＣＤ２８ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が含まれる。
当業者には理解されるように、本発明で用いられるいくつかの適切な抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体が存在する。抗ヒトＣＤ３抗体としては、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌの抗体が挙げられるがこれらに限定されない様々な哺乳類由来のポリクローナル及びモノクローナル抗体が挙げられる。特定の実施形態では、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎ．Ｊ．またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）。同様に当業者には理解されるように、本発明で用いられるいくつかの適切な抗ヒトＣＤ２８抗体が存在し、これらとしては、抗ヒトＣＤ２８ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が含まれる。
【0696】
ＣＤ３に対する抗体は、多くのＴ細胞増殖プロトコルにおいて中心的な要素である。表面に固定化されると、抗ＣＤ３は、Ｔ細胞の表面のＴ細胞受容体複合体の架橋により、活性化及び増殖を誘導するシグナルを提供する。シグナル及び共刺激シグナルを同時に送達するように抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を固定化することにより、増殖が増加し得る（Ｂａｒｏｊａ ｅｔ ａｌ（１９８９），Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２０：２０５－２１７）。Ｗ００９４２９４３６Ａ１では、固相表面、例えば、培養皿及びビーズを使用して、該抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体が固定化される。通常は、ビーズへの固定化は、直径４．５μｍのサイズを有するＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－４５０で行われる。これらの公開のすべては、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0697】
ＶＩ．サイトカイン
本明細書に記載の増殖方法は、一般に、当技術分野で周知のように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培地を使用する。
本明細書に記載の増殖方法は、一般に、当技術分野で周知のように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培地を使用する。
【0698】
本明細書で使用される、「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも呼ばれる）という用語は、インターロイキン－２として知られるサイトカイン及びＴ細胞成長因子を指し、ＩＬ－２のすべての型、すなわち、ヒト及び哺乳類型、保存的アミノ酸置換を有する型、糖型、バイオ後続品、及びそれらのバリアント等を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、これらの開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２という用語は、ヒト、組み換え型のＩＬ－２、例えば、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）、及びＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）によって市販されている組み換え型ＩＬ－２ならびに他の供給業者から市販の同等物を包含する。アルデスロイキン（ｄｅｓ－アラニル－１，セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、非グリコシル化ヒト組み換え型のＩＬ－２であり、分子量は約１５ｋＤａである。ＩＬ－２という用語はまた、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡより入手可能なペグ化ＩＬ－２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含めたペグ化型のＩＬ－２も包含する。本発明での使用に適したＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０６５０８６Ａ１号に記載されている。これらの開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適した別の型のコンジュゲートＩＬ－２は、米国特許第４，７６６，１０６号、第５，２０６，３４４号、第５，０８９，２６１号及び第４，９０２，５０２号に記載されている。これら特許の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明での使用に適したＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されている。その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。ヒトＩＬ２遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３５５８によって識別される。ヒトＩＬ２遺伝子に関する例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＧ＿０１６７７９．１である。ヒトＩＬ－２ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号８７９として提供される。
【0699】
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種であるインターロイキンである。それは、１５．５～１６ｋＤａのタンパク質であり、免疫に関与する白血球（白血球、多くの場合リンパ球）の活性を調節する。ＩＬ－２は、微生物感染に対する体の自然な反応の一部である。ＩＬ－２は、リンパ球で発現されるＩＬ－２受容体に結合することにより、その作用を媒介する。ＩＬ－２の主な供給源は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【0700】
ＩＬ－２は、免疫系の重要な機能、すなわち、寛容及び免疫において、主にそれが直接Ｔ細胞に与える影響を介して不可欠の役割を果たす。Ｔ細胞が成熟する胸腺では、ＩＬ－２がある特定の未熟Ｔ細胞の制御性Ｔ細胞への分化を促進し、これが体内の正常な健康細胞を攻撃する状態になっている他のＴ細胞を抑制することにより、自己免疫疾患を防ぐ。ＩＬ－２は、活性化誘発性細胞死（ＡＩＣＤ）を増進する。ＩＬ－２はまた、初期Ｔ細胞が同様に抗原によって刺激された場合に、Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞への分化及びメモリーＴ細胞への分化を促進し、ひいては体の感染との闘いを促進する。他の極性化サイトカインとともに、ＩＬ－２は、天然のＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１及びＴｈ２リンパ球への分化を刺激する一方、Ｔｈ１７及び濾胞性Ｔｈリンパ球への分化を妨げる。その発現及び分泌は、厳重に制御され、免疫反応の組み込み及び減弱における正及び負の両方の一時的なフィードバックループの一部として機能する。抗原選択Ｔ細胞クローンの数の増殖及びその機能に依存するＴ細胞の免疫記憶の発達におけるその役割を通じて、ＩＬ－２は、細胞性免疫の持続に関与する。
【0701】
ＶＩＩ．医薬組成物、用量、及び投与計画
実施形態では、本開示の方法を使用して増殖させたＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。実施形態では、該医薬組成物は、滅菌緩衝液中でのＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して増殖させたＴＩＬは、当技術分野で既知の任意の適切な経路で投与され得る。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞は、好ましくは約３０～６０分間持続する単回の動脈内注入または静脈内注入として投与される。他の適切な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ管内投与が挙げられる。
実施形態では、本開示の方法を使用して増殖させたＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。実施形態では、該医薬組成物は、滅菌緩衝液中でのＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して増殖させたＴＩＬは、当技術分野で既知の任意の適切な経路で投与され得る。いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞は、好ましくは約３０～６０分間持続する単回の動脈内注入または静脈内注入として投与される。他の適切な投与経路としては、腹腔内、髄腔内、及びリンパ管内投与が挙げられる。
【0702】
任意の適切な用量のＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、約１×１０９～約２×１０１１のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、特に、該がんが黒色腫の場合には、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０のＴＩＬ、平均約７．８×１０１０のＴＩＬが投与される。実施形態では、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０１０～約１２×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０１０～約１０×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約２．３×１０１０～約１３．７×１０１０である。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、特に、該がんが黒色腫の場合には、約７．８×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約１．２×１０１０～約４．３×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約３×１０１０～約１２×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約４×１０１０～約１０×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約５×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約６×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、該治療有効用量は、約７×１０１０～約８×１０１０のＴＩＬである。
【0703】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３である。実施形態では、本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０１１～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０１２～１×１０１３の範囲である。
【0704】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬの濃度は、該医薬組成物の例えば、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ未満である。
【0705】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬの濃度は、該医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖを超える。
【0706】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬの濃度は、該医薬組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはｖ／ｖの範囲である。
【0707】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬの濃度は、該医薬組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはｖ／ｖの範囲である。
【0708】
本発明の医薬組成物に提供されるＴＩＬは、広い用量範囲にわたって有効である。厳密な用量は、投与経路、該化合物が投与される形態、治療を受ける対象の性別及び年齢、治療を受ける対象の体重、ならびに担当医の好み及び経験に依存する。適切な場合は、臨床的に実証された該ＴＩＬの用量が使用され得る。本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量、例えば、ＴＩＬの用量は、治療されるヒトまたは哺乳類、当該障害または状態の重症度、投与速度、当該活性医薬品成分の体内動態及び処方医師の裁量に依存する。
【0709】
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回投与で施され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈注射によって行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、複数回投与で施され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回より多く行われ得る。投与は、１か月に１回、２週間に１回、週１回、または１日おきに行われ得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続され得る。
【0710】
いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効用量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１１、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１１、８×１０１２、９×１０１１、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、及び９×１０１３細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効用量は、１×１０６～５×１０６、５×１０６～１×１０７、１×１０７～５×１０７、５×１０７～１×１０８、１×１０８～５×１０８、５×１０８～１×１０９、１×１０９～５×１０９、５×１０９～１×１０１０、１×１０１０～５×１０１０、５×１０１０～１×１０１１、５×１０″～１×１０１２、１×１０１２～５×１０１２、及び５×１０″～１×１０１３細胞の範囲である。
【0711】
該ＴＩＬの有効量は、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与方法のいずれか、すなわち、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射により、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植、または吸入等により、単回投与で施される場合も複数回投与で施される場合もある。ある特定の実施形態では、ＴＩＬは、静脈内投与される。
【0712】
ＶＩＩＩ．細胞数、細胞の生存、フローサイトメトリー
いくつかの実施形態では、細胞数及び／または生存が測定される。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６、ならびに本明細書に開示または記載の任意の他のマーカー等であるがこれらに限定されないマーカーの発現は、例えば、これらに限定されないが、ＢＤ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている抗体で、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって測定され得る。細胞は、ディスポーザブルｃ－ｃｈｉｐ血球計算盤（ＶＷＲ，Ｂａｔａｖｉａ，Ｉｌｌ．）を使用して手動で計数することができ、生存は、トリパンブルー染色が挙げられるがこれに限定されない当技術分野で既知の任意の方法を使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、細胞数及び／または生存が測定される。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６、ならびに本明細書に開示または記載の任意の他のマーカー等であるがこれらに限定されないマーカーの発現は、例えば、これらに限定されないが、ＢＤ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている抗体で、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリーによって測定され得る。細胞は、ディスポーザブルｃ－ｃｈｉｐ血球計算盤（ＶＷＲ，Ｂａｔａｖｉａ，Ｉｌｌ．）を使用して手動で計数することができ、生存は、トリパンブルー染色が挙げられるがこれに限定されない当技術分野で既知の任意の方法を使用して評価され得る。
【0713】
実施形態では、ＴＩＬの増殖方法は、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、または約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地の使用を含み得る。実施形態では、ＴＩＬ数の増殖は、１種類のみの細胞培地を使用する。任意の適切な細胞培地、例えば、ＡＩＭ－Ｖ細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭの硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭの硫酸ゲンタマイシン）の細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆ．）が使用され得る。
【0714】
実施形態では、ＴＩＬを、気体透過性容器内で増殖させる。気体透過性容器は、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載のものを含めた当技術分野で既知の方法、組成物、及び装置を用いて、ＰＢＭＣを使用したＴＩＬの増殖に使用されている。実施形態では、ＴＩＬを、気体透過性バッグ内で増殖させる。実施形態では、ＴＩＬをＸｕｒｉ細胞増殖システムＷ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の気体透過性バッグ内で増殖させる細胞増殖システムを使用してＴＩＬを増殖させる。実施形態では、ＴＩＬをＸｕｒｉ細胞増殖システムＷ５としても知られるＷＡＶＥバイオリアクターシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の気体透過性バッグ内で増殖させる細胞増殖システムを使用してＴＩＬを増殖させる。実施形態では、該細胞増殖システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される容積の気体透過性細胞バッグを含む。実施形態では、ＴＩＬを、Ｇ－Ｒｅｘフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから市販されている）内で増殖させることができる。かかる実施形態により、細胞集団を約５×１０５細胞／ｃｍ２から１０×１０６～３０×１０６細胞／ｃｍ２まで増殖させることが可能になる。実施形態では、この増殖は、新鮮な細胞培地を当該細胞に加えること（該細胞に供給することとも呼ばれる）なく行われる。実施形態では、これは、培地がＧ－Ｒｅｘフラスコ内で約１０ｃｍの高さにある限り、供給することを伴わない。実施形態では、これは、供給することを伴わないが、１つ以上のサイトカインの添加を伴う。実施形態では、該サイトカインと該培地を混合する必要もなくボーラスとして該サイトカインを添加することができる。かかる容器、装置、及び方法は、当技術分野で既知であり、ＴＩＬを増殖させるために使用されており、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１４／２１００３６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１１５６１７Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１３／１８８４２７Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１３６２２８Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０Ｂ２号、国際公開第ＷＯ２０１１／０７２０８８Ａ２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０２０８２１６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０２４４１３３Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１２／１２９２０１Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１０２０７５Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０Ｂ２号、国際公開第ＷＯ２０１３／１７３８３５Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１７５９６６Ａ１号に記載されているものを含む。かかるプロセスはまた、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，３５：２８３－２９２にも記載されている。これら刊行物のすべては、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0715】
実施例１：腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増殖方法
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、原発ヒト黒色腫転移の単細胞懸濁液から直接増殖させた。ＴＩＬは、異なる３ドナー、すなわち、ドナー１（Ｄ３２３９）、ドナー２（Ｄ３３９９）、及びドナー３（Ｄ６７５５）から得た。培養の０日目に、単細胞懸濁液から２００，０００～８００，０００生細胞を採取し、２４ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルにて、体積６ｍＬのＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０とＡＩＭ Ｖの１：１混合物、５％ヒトＡＢ血清添加）に播種し、これに６，０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、カタログ番号１０２０－１０００）を添加した。条件ごとに播種した生存細胞は、フローサイトメトリーで測定して３．４Ｋ～５２ＫのＣＤ３＋Ｔ細胞を含んでいた。以下に記載の通りに、４つの異なる方法を使用して細胞を活性化及び増殖させた（図２）：
・ＴＩＬの増殖方法１（「ＲＥＰ様」）－ｐｒｅ－ＲＥＰなしの一段階急速増殖プロトコル。健康な５ドナー由来のフィーダー細胞（ＰＢＭＣ）を照射し（６，０００ｒａｄ）、１：１：１：１：１比でプールした。１０Ｍの照射されたＰＢＭＣを各ウェルに加え、同様に３６０ｎｇのＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３２６）を加えて最終濃度６０ｎｇ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法２（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」）－Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェルで添加した。表面に抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体がコンジュゲートされたＤｙｎａｂｅａｄｓをＴＩＬに添加した。
・ＴＩＬの増殖方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）－Ｓｔｅｍｃｅｌｌからの四量体抗体複合体（ＴＡＣ）。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２／抗ＣＤ２８四量体抗体複合体（ＴＡＣ）（カタログ番号１０９７０）３７．５μｌをＴＩＬに添加し、最終濃度６．２５μｌ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからのナノマトリックス。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのヒトＣＤ３及びＣＤ２８に対するヒト化組み換えアゴニストに共有結合したコロイドポリマーナノマトリックス（ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ、カタログ番号１３０－０１９－０１１）３２４μｌをＴＩＬに添加し、最終濃度５４μｌ／ｍｌにした。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、原発ヒト黒色腫転移の単細胞懸濁液から直接増殖させた。ＴＩＬは、異なる３ドナー、すなわち、ドナー１（Ｄ３２３９）、ドナー２（Ｄ３３９９）、及びドナー３（Ｄ６７５５）から得た。培養の０日目に、単細胞懸濁液から２００，０００～８００，０００生細胞を採取し、２４ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルにて、体積６ｍＬのＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０とＡＩＭ Ｖの１：１混合物、５％ヒトＡＢ血清添加）に播種し、これに６，０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、カタログ番号１０２０－１０００）を添加した。条件ごとに播種した生存細胞は、フローサイトメトリーで測定して３．４Ｋ～５２ＫのＣＤ３＋Ｔ細胞を含んでいた。以下に記載の通りに、４つの異なる方法を使用して細胞を活性化及び増殖させた（図２）：
・ＴＩＬの増殖方法１（「ＲＥＰ様」）－ｐｒｅ－ＲＥＰなしの一段階急速増殖プロトコル。健康な５ドナー由来のフィーダー細胞（ＰＢＭＣ）を照射し（６，０００ｒａｄ）、１：１：１：１：１比でプールした。１０Ｍの照射されたＰＢＭＣを各ウェルに加え、同様に３６０ｎｇのＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３２６）を加えて最終濃度６０ｎｇ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法２（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」）－Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェルで添加した。表面に抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体がコンジュゲートされたＤｙｎａｂｅａｄｓをＴＩＬに添加した。
・ＴＩＬの増殖方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）－Ｓｔｅｍｃｅｌｌからの四量体抗体複合体（ＴＡＣ）。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２／抗ＣＤ２８四量体抗体複合体（ＴＡＣ）（カタログ番号１０９７０）３７．５μｌをＴＩＬに添加し、最終濃度６．２５μｌ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからのナノマトリックス。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのヒトＣＤ３及びＣＤ２８に対するヒト化組み換えアゴニストに共有結合したコロイドポリマーナノマトリックス（ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ、カタログ番号１３０－０１９－０１１）３２４μｌをＴＩＬに添加し、最終濃度５４μｌ／ｍｌにした。
【0716】
上記の４つのすべてのＴＩＬの増殖方法では、通常のプロトコルに続いて、以下に示す各方法について離散間隔で変化させた（図２）：
・２日目：消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・４日目：培地の５０％を置換／交換した。方法１では、各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して４ｍＬの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、４ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３５，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。方法２では、細胞を採取し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去するために磁石に入れ、その後３００×ｇで５分間遠心分離した。方法３及び４では、培養物を採取し、ＴＩＬを３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞上清を吸引し、細胞培養物の各々を６ｍＬのＴＩＬ培地＋６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２に再懸濁し、その後２４ウェルのＧ－ｒｅｘプレートのウェルに播種した。
・７日目：消費を仮定して、ＩＬ－２を培地に加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。培養物が５Ｍの細胞を超えた（Ｇｒｅｘ膜１ｃｍ２あたり２．５Ｍ細胞超を反映する）時点で、それらを６ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ ｗｏｌｆ）のウェルに移し、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴＩＬ培地で１００ｍＬにした。
・９日目：４日目と同様に培地の５０％を置換／交換した。
・１２日目：消費を仮定して、ＩＬ－２を培地に加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。培養物が５Ｍの細胞を超えた（Ｇｒｅｘ膜１ｃｍ２あたり２．５Ｍ細胞超を反映する）時点で、それらを６ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ ｗｏｌｆ）のウェルに移し、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴＩＬ培地で１００ｍＬにした。
・１４日目：１０Ｍの細胞を培養物から取り出し、Ｇｒｅｘ－１０容器に４０ｍｌのＴＩＬ培地＋６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２とともに再播種した。図３Ａに示す通り、１４日目では、平均で、ＩＬ－２単独で成長させた細胞培養物（「対照」と標識）は、約２７倍増殖し、方法１（ＲＥＰ様）によって成長させた細胞は、５０６３倍増殖し、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）によって増殖させた細胞は、３７５５倍増殖し、方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）によって成長させた細胞は、７９４２倍増殖した。
・１６日目：４日目と同様に培地の５０％を置換／交換した。
・１７日目：消費を仮定して、ＩＬ－２を培地に加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・２１日目：細胞培養物を採取した。図３Ｂに示す通り、２１日目までに、平均で、方法１（ＲＥＰ様）によって成長させた細胞は、６０１６６倍増殖し、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）によって増殖させた細胞は、３７５９６倍増殖し、方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）によって成長させた細胞は、８０３７３倍増殖した。
・２日目：消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・４日目：培地の５０％を置換／交換した。方法１では、各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して４ｍＬの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、４ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３５，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。方法２では、細胞を採取し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去するために磁石に入れ、その後３００×ｇで５分間遠心分離した。方法３及び４では、培養物を採取し、ＴＩＬを３００×ｇで５分間遠心分離した。細胞上清を吸引し、細胞培養物の各々を６ｍＬのＴＩＬ培地＋６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２に再懸濁し、その後２４ウェルのＧ－ｒｅｘプレートのウェルに播種した。
・７日目：消費を仮定して、ＩＬ－２を培地に加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。培養物が５Ｍの細胞を超えた（Ｇｒｅｘ膜１ｃｍ２あたり２．５Ｍ細胞超を反映する）時点で、それらを６ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ ｗｏｌｆ）のウェルに移し、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴＩＬ培地で１００ｍＬにした。
・９日目：４日目と同様に培地の５０％を置換／交換した。
・１２日目：消費を仮定して、ＩＬ－２を培地に加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。培養物が５Ｍの細胞を超えた（Ｇｒｅｘ膜１ｃｍ２あたり２．５Ｍ細胞超を反映する）時点で、それらを６ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ ｗｏｌｆ）のウェルに移し、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加したＴＩＬ培地で１００ｍＬにした。
・１４日目：１０Ｍの細胞を培養物から取り出し、Ｇｒｅｘ－１０容器に４０ｍｌのＴＩＬ培地＋６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２とともに再播種した。図３Ａに示す通り、１４日目では、平均で、ＩＬ－２単独で成長させた細胞培養物（「対照」と標識）は、約２７倍増殖し、方法１（ＲＥＰ様）によって成長させた細胞は、５０６３倍増殖し、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）によって増殖させた細胞は、３７５５倍増殖し、方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）によって成長させた細胞は、７９４２倍増殖した。
・１６日目：４日目と同様に培地の５０％を置換／交換した。
・１７日目：消費を仮定して、ＩＬ－２を培地に加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・２１日目：細胞培養物を採取した。図３Ｂに示す通り、２１日目までに、平均で、方法１（ＲＥＰ様）によって成長させた細胞は、６０１６６倍増殖し、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）によって増殖させた細胞は、３７５９６倍増殖し、方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）によって成長させた細胞は、８０３７３倍増殖した。
【0717】
実施例２：ＴＩＬの表現型の特徴
ＴＩＬの増殖プロセスでの時間の関数としてのＴＩＬの細胞組成をフローサイトメトリーによって評価した（図４）。細胞を実施例１の通りに培養し、細胞のアリコートをＣＤ４５及びＣＤ３ｅを発現する細胞を検出する抗体で０、９及び１４日目に染色した。時間とともに進行するＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮がすべてのドナーに関して認められ（図５Ａ）、実施例１に記載の方法１、３及び４を使用した場合の特異的なＴ細胞の増殖が実証された。
ＴＩＬの増殖プロセスでの時間の関数としてのＴＩＬの細胞組成をフローサイトメトリーによって評価した（図４）。細胞を実施例１の通りに培養し、細胞のアリコートをＣＤ４５及びＣＤ３ｅを発現する細胞を検出する抗体で０、９及び１４日目に染色した。時間とともに進行するＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の濃縮がすべてのドナーに関して認められ（図５Ａ）、実施例１に記載の方法１、３及び４を使用した場合の特異的なＴ細胞の増殖が実証された。
【0718】
さらに、産生されたＴ細胞の表現型を評価した。特に、セントラルメモリーＴ細胞表現型（Ｔｃｍ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）として定義される細胞の割合をフローサイトメトリーで特定した。実施例１の通りに培養した細胞を取り出し、１４日目に、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡを検出する蛍光標識抗体で細胞のアリコートを染色した。フィーダー細胞を使用した方法１（ＲＥＰ様）と比較して、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）は、Ｔｃｍの割合が高かった（図５Ｂ）。
【0719】
ＴＩＬをＦＡＣＳにより、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＣＲ７の共発現、すなわち、セントラルメモリーＴ細胞表現型のマーカーについて分析した（図６）。ドナー３の場合、実施例１に記載の３つのフィーダー細胞を含まないＴＩＬ増殖方法（方法２（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」、１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェル使用）、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）、及び方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」））のいずれかを使用して増殖させたＴＩＬは、セントラルメモリーＴ細胞表現型を有する細胞の濃縮が大きく、約６％～１４％であったのと比較して、方法１（「ＲＥＰ」）を使用して増殖させたＴＩＬでは、セントラルメモリーＴ細胞表現型は、約１％を構成したのみであった。ドナー２の場合、実施例１に記載の３つのフィーダー細胞を含まないＴＩＬ増殖方法（方法２（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」、１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェル使用）、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）、及び方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」））のいずれかを使用して増殖させたＴＩＬは、セントラルメモリーＴ細胞表現型を有する細胞の濃縮が大きく、約５％～２９％であったのと比較して、方法１（「ＲＥＰ様」）を使用して増殖させたＴＩＬでは、セントラルメモリーＴ細胞表現型は、約３％を構成したのみであった。ドナー１の場合、実施例１に記載の３つのフィーダー細胞を含まないＴＩＬ増殖方法（方法２（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」、１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェル使用）、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）、及び方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」））のいずれかを使用して増殖させたＴＩＬは、セントラルメモリーＴ細胞表現型を有する細胞の濃縮が大きく、約７％～１９％であったのと比較して、方法１（「ＲＥＰ様」、フィーダー細胞ベース）を使用して増殖させたＴＩＬでは、セントラルメモリーＴ細胞表現型は、約４％を構成したのみであった。３ドナーすべてに由来するＴＩＬを使用した４つの方法すべてによって増殖させたＴＩＬに関するセントラルメモリーＴ細胞表現型％のデータをまとめたところ、方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）は、３ドナーのうちの２ドナーに関してセントラルメモリーＴ細胞表現型が有意に濃縮されたＴＩＬを産生したことが分かった（図６）。
【0720】
ＴＩＬの１４日目の増殖倍率（図７）（０日目での細胞数に対して）を、ＩＬ－２単独の添加（「対照」）ならびに実施例１に記載の４つの方法すべて（方法１（「ＲＥＰ様」）、方法２（「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ」、１．５または０．５×１０６ビーズ／ウェル使用）、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）、及び方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」））によって増殖させたＴＩＬに関して評価した。ドナー３及び１の場合、方法４により、方法１（フィーダー細胞ベース）と比較して、約４～５倍の発現がもたらされたが、ドナー２の場合、方法１により、方法４と比較して、約２０倍の増殖がもたらされた。ドナー１の場合は、方法３により、方法１（フィーダー細胞ベース）と比較して、約４．５倍の増殖がもたらされた（図７）。３ドナーすべてのデータを合わせたところ、平均で、方法３及び方法４によって増殖させたＴＩＬは、方法１（ＲＥＰ様）によって増殖させたＴＩＬと少なくとも同じ程度かそれ以上の増殖倍率を示した（図８）。一部の細胞を１４日目を過ぎても培養し、さらなる増殖が可能かどうか評価した。細胞は１４日目～２１日目に増殖し続け、場合によっては、１５０，０００を超える全増殖倍率を示した（図９）。
【0721】
腫瘍は、不均一であり、様々なパーセンテージのＴ細胞を含み、強力なＴ細胞の増殖方法により、高密度及び低密度のＴ細胞で細胞を増殖させることができるはずである。フィーダー細胞を含まずに低播種密度のＴ細胞が増殖できるかどうかは不明であった。従って、０日目でのＴ細胞の播種密度が１４日目までのＴＩＬの増殖倍率に与える影響を評価した。方法１（「ＲＥＰ様」）及び方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）により増殖させたＴＩＬに関しては、増殖倍率は比較的直線的に増加したが、方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）によって増殖させたＴＩＬでは、播種密度が約２，０００Ｔ細胞／ｃｍ２～約９，０００Ｔ細胞／ｃｍ２でピークとなった（図１０）。従って、方法４は、低密度でＴ細胞を増殖させる際には方法１とほぼ同等であり、方法３は、低密度では方法１より良好であった。これにより、培地１ｍＬあたり８５Ｔ細胞（体積６ｍＬ中）ほどの低密度でＴ細胞を増殖させるためには、本質的にフィーダー細胞は必要ではないことが実証される。
【0722】
ドナー３は、以前にｐｒｅ－ＲＥＰ／ＲＥＰ法を使用したＴＩＬの増殖用にサンプルを提供したことがあった。そのドナー３のサンプルは、ｐｒｅ－ＲＥＰ段階からＲＥＰ段階に進めるのに適切なＴＩＬ数を提供するのに失敗した。ドナー３からのサンプルは、ｐｒｅ－ＲＥＰを使用して達成されたものよりはるかに高い増殖倍率のＴＩＬを提供した。これにより、本明細書に記載の方法は、ｐｒｅ－ＲＥＰ中に適切な増殖が生じる状況を取り返すことができることが示される。
【0723】
実施例３：フィーダーを含まないプロセスの細胞の機能（ＴＩＬによるサイトカイン産生）
フィーダー細胞を含まない方法（ＴＩＬの増殖方法３及び４）を使用して生成したＴＩＬによるサイトカインＩＬ－２、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαの産生を評価した。ＴＩＬを、実施例１に記載の通りに解離組織細胞から増殖させた。このプロセスの１４日目に、２００，０００の増殖したＴＩＬ（独立した３ドナー由来）を採取し、６．６μｌの四量体抗ＣＤ３試薬（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カスタム試薬）をさらに添加した体積２００μｌのＴＩＬ培地にて１８時間刺激した。その後、細胞上清を採取し、２連のサンプルを使用して、その上清中のサイトカイン濃度をＱｕｉｃｋｐｌｅｘ Ｓ１２０（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で測定した。図１１に示す通り、これらの異なる３ドナーの場合、解離した腫瘍細胞から直接生成したＴＩＬは、再刺激後にＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、及びＩＬ－６を産生することが可能であった。さらに、フィーダー細胞を含まない方法（方法３：「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」及び方法４：「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）を使用して生成したＴＩＬは、方法１（「ＲＥＰ様」、フィーダー細胞使用）を使用して生成したＴＩＬより、最大約６倍多くのＩＦＮγ、約４倍多くのＩＬ－２、約１０倍多くのＴＮＦα、及び約２５倍多くのＩＬ－６を生成することが可能であった（図１１）。
フィーダー細胞を含まない方法（ＴＩＬの増殖方法３及び４）を使用して生成したＴＩＬによるサイトカインＩＬ－２、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαの産生を評価した。ＴＩＬを、実施例１に記載の通りに解離組織細胞から増殖させた。このプロセスの１４日目に、２００，０００の増殖したＴＩＬ（独立した３ドナー由来）を採取し、６．６μｌの四量体抗ＣＤ３試薬（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カスタム試薬）をさらに添加した体積２００μｌのＴＩＬ培地にて１８時間刺激した。その後、細胞上清を採取し、２連のサンプルを使用して、その上清中のサイトカイン濃度をＱｕｉｃｋｐｌｅｘ Ｓ１２０（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で測定した。図１１に示す通り、これらの異なる３ドナーの場合、解離した腫瘍細胞から直接生成したＴＩＬは、再刺激後にＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、及びＩＬ－６を産生することが可能であった。さらに、フィーダー細胞を含まない方法（方法３：「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」及び方法４：「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）を使用して生成したＴＩＬは、方法１（「ＲＥＰ様」、フィーダー細胞使用）を使用して生成したＴＩＬより、最大約６倍多くのＩＦＮγ、約４倍多くのＩＬ－２、約１０倍多くのＴＮＦα、及び約２５倍多くのＩＬ－６を生成することが可能であった（図１１）。
【0724】
実施例４：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したＴＩＬの遺伝子操作方法
実施例１に記載のプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作し、標的遺伝子の機能的遺伝子ノックアウトを創出した。この遺伝子操作は、実施例１に記載の各方法の１３日目に行い、０～２１日目にわたって他の日にも行った。簡潔には、１３日目に、１．２×１０６の増殖させたＴＩＬを、３００×ｇで５分間遠心分離し、４０μｌのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＥＰＢ１）で再懸濁した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のマスターミックスを、Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、カタログ番号９２１２）５２ｐｍｏｌ及びＣＤ４５抗原をコードするＰＴＰＲＣ遺伝子（ＩＤＴ、ＧＡＧＴＴＴＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡ 配列番号９０９）を標的とするｓｇＲＮＡ２４０ｐｍｏｌを含めて作製した。１００μＭのＰＴＰＲＣのｓｇＲＮＡ溶液を、１０ｎｍｏｌの凍結乾燥されたｓｇＲＮＡを１００μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５７０）で再懸濁することによって作製した。試薬は、以下の通りに添加した：
実施例１に記載のプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作し、標的遺伝子の機能的遺伝子ノックアウトを創出した。この遺伝子操作は、実施例１に記載の各方法の１３日目に行い、０～２１日目にわたって他の日にも行った。簡潔には、１３日目に、１．２×１０６の増殖させたＴＩＬを、３００×ｇで５分間遠心分離し、４０μｌのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＥＰＢ１）で再懸濁した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）のマスターミックスを、Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、カタログ番号９２１２）５２ｐｍｏｌ及びＣＤ４５抗原をコードするＰＴＰＲＣ遺伝子（ＩＤＴ、ＧＡＧＴＴＴＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＡ 配列番号９０９）を標的とするｓｇＲＮＡ２４０ｐｍｏｌを含めて作製した。１００μＭのＰＴＰＲＣのｓｇＲＮＡ溶液を、１０ｎｍｏｌの凍結乾燥されたｓｇＲＮＡを１００μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５７０）で再懸濁することによって作製した。試薬は、以下の通りに添加した：
【表38】
【0725】
ＲＮＰマスターミックスの全１０μｌを４０μｌの細胞懸濁液に添加した。細胞懸濁液５０μｌを次にＯＣ１００Ｘ２プロセッシングアセンブリ（ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＳＯＣ－１Ｘ２）に移した。細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ ＥｘＰＥＲＴエレクトロポレーターにて、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＃９」プログラムを使用して電気穿孔した。その後、ＴＩＬ培地５０μｌをウェルに加え、細胞を、ＴＩＬ培地１００μｌを含む９６ウェルのプレートに移し、これを次いで３７℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を計数し、５００Ｋの生細胞を次いで、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した６ｍＬのＴＩＬ培地を含む２４ウェルのＧｒｅｘプレートに播種した。
【0726】
１日後（培養から１４日目）、ＩＬ－２を、消費を仮定して６，０００Ｕ／ｍｌまで添加した。培養から１７日目、各ウェルから３ｍＬの細胞上清を除去し、廃棄した（ウェルの底の細胞を乱さないように注意した）。これを新鮮ＴＩＬ培地３ｍＬで置換し、ＩＬ－２を、消費を仮定して最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌまで添加した。１８日目に、ＩＬ－２を、消費を仮定して６，０００Ｕ／ｍｌまで添加した。２１日目に細胞を採取し、計数した。細胞のペレットを凍結し、アンプリコンの配列決定によって編集を特定した。
【0727】
細胞の生存及びＣＤ４５の編集パーセントを、編集されたＴＩＬ対遺伝子改変されなかったＴＩＬに関して評価した（図１２）。アッセイは、電気穿孔から８日後に、方法１（「ＲＥＰ様」、フィーダー細胞使用）、方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）、及び方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）を使用して増殖させたＴＩＬについて行った。
【0728】
実施例５：ｐｒｅ－ＲＥＰで失敗したＴＩＬを可溶性活性化因子または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）で増殖させる方法
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を原発ヒト黒色腫転移の単細胞懸濁液から直接増殖させた。ＴＩＬを、異なる３ドナー、すなわち、ドナー３２３９、ドナー６７５２、及びドナー６７５５から得た。ドナー６７５２及びドナー６７５５は、以前にｐｒｅ－ＲＥＰの失敗として同定され、ｐｒｅ－ＲＥＰの２３日目に４×１０７細胞まで増殖することができなかった。培養の０日目に、単細胞懸濁液から４００，０００～８００，０００の生細胞を採取し、２４ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルにて、体積６ｍｌのＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０とＡＩＭ Ｖの１：１混合物、５％ヒトＡＢ血清添加）に播種し、これに６，０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）を添加した。条件ごとに播種した生存細胞は、フローサイトメトリーで測定して２２Ｋ～５２ＫのＣＤ３＋Ｔ細胞を含んでいた。以下に記載の通りに、５つの異なる方法を使用して細胞を活性化及び増殖させた：
・ＴＩＬの増殖方法１（「ＲＥＰ様」）－ｐｒｅ－ＲＥＰなしの一段階急速増殖プロトコル。健康な５ドナー由来のフィーダー細胞（ＰＢＭＣ）を照射し（６，０００ｒａｄ）、１：１：１：１：１比でプールした。１×１０７の照射されたＰＢＭＣを各ウェルに加え、同様に３６０ｎｇのＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３２６）を加えて最終濃度６０ｎｇ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）－Ｓｔｅｍｃｅｌｌからの四量体抗体複合体（ＴＡＣ）。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２／抗ＣＤ２８四量体抗体複合体（ＴＡＣ）（カタログ番号１０９７０）３７．５μｌをＴＩＬに添加し、最終濃度６．２５μｌ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからのナノマトリックス。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのヒトＣＤ３及びＣＤ２８に対するヒト化組み換えアゴニストに共有結合したコロイドポリマーナノマトリックス（ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ、カタログ番号１７０－０７６－１５６）８５μｌをＴＩＬに添加し、最終希釈を７０：１にした。
・ＴＩＬの増殖方法５（「ａＡＰＣ－ＯＫＴ３］）－ＯＫＴ３を発現するように操作されたＫ５６２細胞を照射した（１５，０００ｒａｄ）。１×１０６の照射されたａＡＰＣ－ＯＫＴ３細胞を各ウェルに加え、最終的な細胞対面積比を５×１０５細胞／ｃｍ２にした。
・ＴＩＬの増殖方法６（「ａＡＰＣ－ＯＫＴ３－ＣＤ８６」）－ＯＫＴ３及びＣＤ８６を発現するように操作されたＫ５６２細胞を照射した（１５，０００ｒａｄ）。１×１０６の照射されたａＡＰＣ－ＯＫＴ３細胞を各ウェルに加え、最終的な細胞対面積比を５×１０５細胞／ｃｍ２にした。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を原発ヒト黒色腫転移の単細胞懸濁液から直接増殖させた。ＴＩＬを、異なる３ドナー、すなわち、ドナー３２３９、ドナー６７５２、及びドナー６７５５から得た。ドナー６７５２及びドナー６７５５は、以前にｐｒｅ－ＲＥＰの失敗として同定され、ｐｒｅ－ＲＥＰの２３日目に４×１０７細胞まで増殖することができなかった。培養の０日目に、単細胞懸濁液から４００，０００～８００，０００の生細胞を採取し、２４ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルにて、体積６ｍｌのＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０とＡＩＭ Ｖの１：１混合物、５％ヒトＡＢ血清添加）に播種し、これに６，０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）を添加した。条件ごとに播種した生存細胞は、フローサイトメトリーで測定して２２Ｋ～５２ＫのＣＤ３＋Ｔ細胞を含んでいた。以下に記載の通りに、５つの異なる方法を使用して細胞を活性化及び増殖させた：
・ＴＩＬの増殖方法１（「ＲＥＰ様」）－ｐｒｅ－ＲＥＰなしの一段階急速増殖プロトコル。健康な５ドナー由来のフィーダー細胞（ＰＢＭＣ）を照射し（６，０００ｒａｄ）、１：１：１：１：１比でプールした。１×１０７の照射されたＰＢＭＣを各ウェルに加え、同様に３６０ｎｇのＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３２６）を加えて最終濃度６０ｎｇ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法３（「Ｓｔｅｍｃｅｌｌ」）－Ｓｔｅｍｃｅｌｌからの四量体抗体複合体（ＴＡＣ）。Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２／抗ＣＤ２８四量体抗体複合体（ＴＡＣ）（カタログ番号１０９７０）３７．５μｌをＴＩＬに添加し、最終濃度６．２５μｌ／ｍｌにした。
・ＴＩＬの増殖方法４（「Ｔｒａｎｓａｃｔ」）－Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃからのナノマトリックス。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃからのヒトＣＤ３及びＣＤ２８に対するヒト化組み換えアゴニストに共有結合したコロイドポリマーナノマトリックス（ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ、カタログ番号１７０－０７６－１５６）８５μｌをＴＩＬに添加し、最終希釈を７０：１にした。
・ＴＩＬの増殖方法５（「ａＡＰＣ－ＯＫＴ３］）－ＯＫＴ３を発現するように操作されたＫ５６２細胞を照射した（１５，０００ｒａｄ）。１×１０６の照射されたａＡＰＣ－ＯＫＴ３細胞を各ウェルに加え、最終的な細胞対面積比を５×１０５細胞／ｃｍ２にした。
・ＴＩＬの増殖方法６（「ａＡＰＣ－ＯＫＴ３－ＣＤ８６」）－ＯＫＴ３及びＣＤ８６を発現するように操作されたＫ５６２細胞を照射した（１５，０００ｒａｄ）。１×１０６の照射されたａＡＰＣ－ＯＫＴ３細胞を各ウェルに加え、最終的な細胞対面積比を５×１０５細胞／ｃｍ２にした。
【0729】
上記の５つのすべてのＴＩＬの増殖方法では、通常のプロトコルに続いて、以下に示す各方法について、離散間隔で変化させた：
・２日目：対応するウェルに対して消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・４日目及び６日目：培地の５０％を置換／交換した。各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して３ｍｌの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、３ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３６，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
７日目：すべての条件に関して、細胞を計数した。全体積（６ｍｌ）を、１００ｍｌのＴＩＬ培地と６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含む６ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。
・１０日目及び１１日目：１０日目及び１１日目に、実施例４に記載の通り、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、それぞれ、全ａＡＰＣサンプル及び可溶性活性化因子サンプルを操作した。電気穿孔後、２×１０５の細胞を、６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含む６ｍｌのＴＩＬ培地中、２４ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。
・１３日目：対応するウェルに対して消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・１５日目：培地の５０％を置換／交換した。各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して５０ｍｌの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、５０ｍｌの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３６，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・１８日目：ドナー３３３９のサンプルを採取した。ドナー６７５５のサンプルを採取し、ＩＬ－２中でａＡＰＣ－ＯＫＴ３またはａＡＰＣ－ＯＫＴ３－ＣＤ８６で活性化した嗅細胞（Ｏ）、ＳＯＣＳ１（Ｓ）、及びＳＯＣＳ１＋ＰＴＰＮ２（Ｓ＋Ｐ２）サンプルに、１５日目で記載した通りに５０％培地交換を行った。ドナー６７５２のサンプルに、１５日目で記載した通りに５０％培地交換を行った。
・２１日目：残余のドナー６７５５のサンプル及びドナー６７５２のサンプルに、１５日目で記載した通りに５０％培地交換を行った。
・２３日目：残余のドナー６７５５のサンプル及びドナー６７５２のサンプルを採取した。
・２日目：対応するウェルに対して消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・４日目及び６日目：培地の５０％を置換／交換した。各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して３ｍｌの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、３ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３６，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
７日目：すべての条件に関して、細胞を計数した。全体積（６ｍｌ）を、１００ｍｌのＴＩＬ培地と６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含む６ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。
・１０日目及び１１日目：１０日目及び１１日目に、実施例４に記載の通り、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、それぞれ、全ａＡＰＣサンプル及び可溶性活性化因子サンプルを操作した。電気穿孔後、２×１０５の細胞を、６０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含む６ｍｌのＴＩＬ培地中、２４ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。
・１３日目：対応するウェルに対して消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・１５日目：培地の５０％を置換／交換した。各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して５０ｍｌの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、５０ｍｌの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３６，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
・１８日目：ドナー３３３９のサンプルを採取した。ドナー６７５５のサンプルを採取し、ＩＬ－２中でａＡＰＣ－ＯＫＴ３またはａＡＰＣ－ＯＫＴ３－ＣＤ８６で活性化した嗅細胞（Ｏ）、ＳＯＣＳ１（Ｓ）、及びＳＯＣＳ１＋ＰＴＰＮ２（Ｓ＋Ｐ２）サンプルに、１５日目で記載した通りに５０％培地交換を行った。ドナー６７５２のサンプルに、１５日目で記載した通りに５０％培地交換を行った。
・２１日目：残余のドナー６７５５のサンプル及びドナー６７５２のサンプルに、１５日目で記載した通りに５０％培地交換を行った。
・２３日目：残余のドナー６７５５のサンプル及びドナー６７５２のサンプルを採取した。
【0730】
実施例６：ｐｒｅ－ＲＥＰで失敗したＴＩＬを可溶性活性化因子またはａＡＰＣでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作する方法
実施例５に記載のプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作し、標的遺伝子の機能的遺伝子ノックアウトを創出した。この遺伝子操作は、実施例５に記載の各方法の１０日目に行い、０～２１日目にわたって他の日にも行った。簡潔には、１０日目に、１．２×１０６の増殖させたＴＩＬを、３００×ｇで５分間遠心分離し、２０μｌのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＥＰＢ１）で再懸濁した。いくつかのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のマスターミックスを、Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、カタログ番号９２１２）５２ｐｍｏｌ及び各ｓｇＲＮＡ１２０ｐｍｏｌを含めて作製した。マスターミックス１は、ＯＲ１Ａ２遺伝子（Ｏ）（ＩＤＴ、ＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧ 配列番号９１０）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。マスターミックス２は、ＳＯＣＳ１遺伝子（Ｓ）（ＩＤＴ、ＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧ 配列番号６１）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。マスターミックス３は、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＰＴＰＮ２遺伝子（Ｓ＋Ｐ２）（ＩＤＴ、ＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧ 配列番号２０６）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。１００μＭのＯＲ１Ａ２のｓｇＲＮＡ溶液を、１０ｎｍｏｌの凍結乾燥されたｓｇＲＮＡを１００μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５７０）で再懸濁することによって作製した。試薬は、以下の通りに添加した：
実施例５に記載のプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作し、標的遺伝子の機能的遺伝子ノックアウトを創出した。この遺伝子操作は、実施例５に記載の各方法の１０日目に行い、０～２１日目にわたって他の日にも行った。簡潔には、１０日目に、１．２×１０６の増殖させたＴＩＬを、３００×ｇで５分間遠心分離し、２０μｌのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＥＰＢ１）で再懸濁した。いくつかのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のマスターミックスを、Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、カタログ番号９２１２）５２ｐｍｏｌ及び各ｓｇＲＮＡ１２０ｐｍｏｌを含めて作製した。マスターミックス１は、ＯＲ１Ａ２遺伝子（Ｏ）（ＩＤＴ、ＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧ 配列番号９１０）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。マスターミックス２は、ＳＯＣＳ１遺伝子（Ｓ）（ＩＤＴ、ＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧ 配列番号６１）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。マスターミックス３は、ＳＯＣＳ１遺伝子及びＰＴＰＮ２遺伝子（Ｓ＋Ｐ２）（ＩＤＴ、ＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧ 配列番号２０６）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。１００μＭのＯＲ１Ａ２のｓｇＲＮＡ溶液を、１０ｎｍｏｌの凍結乾燥されたｓｇＲＮＡを１００μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５７０）で再懸濁することによって作製した。試薬は、以下の通りに添加した：
【表39】
【0731】
ＲＮＰマスターミックスの全５μｌを２０μｌの細胞懸濁液に添加した。細胞懸濁液２５μｌを次にＯＣ２５Ｘ３プロセッシングアセンブリ（ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ－２５ｘ３）に移した。細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ ＥｘＰＥＲＴエレクトロポレーターにて、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＃９」プログラムを使用して電気穿孔した。その後、ＴＩＬ２５μｌを９６ウェルのプレートに移し、各チャンバーを、２５μｌのＴＩＬ培地で２回洗浄し、９６ウェルのリカバリープレートに移し、これをその後３７℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を計数し、２×１０５の生細胞を次いで、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した６ｍＬのＴＩＬ培地を含む２４ウェルのＧｒｅｘプレートに播種した。１３日目から始まるさらなる細胞操作を、実施例５に記載の通りに行った。１８日目及び２３日目に、細胞を採取し、計数した。細胞のペレットを凍結し、アンプリコンの配列決定によって編集を特定した（図１６）。
【0732】
実施例７：可溶性活性化因子またはａＡＰＣでのｐｒｅ－ＲＥＰで失敗したＴＩＬの表現型の特徴
１８日目及び２３日目で産生されたＴ細胞の表現型を評価した。特に、セントラルメモリーＴ細胞表現型（Ｔｃｍ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）として定義される細胞の割合をフローサイトメトリーで特定した。実施例５の通りに培養した細胞を取り出し、１８日目及び２３日目に、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡを検出する蛍光標識抗体で細胞のアリコートを染色した。ｐｒｅ－ＲＮＰ（電気穿孔前の細胞）と比較して、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）は、１８日目または２３日目で同様のパーセンテージのＴｃｍ細胞を生成した（図１５）。ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、すべての方法に関して１８日目及び２３日目で、ｐｒｅ－ＲＮＰ細胞と比較して全体的な濃縮を示した（データは示さず）。
１８日目及び２３日目で産生されたＴ細胞の表現型を評価した。特に、セントラルメモリーＴ細胞表現型（Ｔｃｍ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）として定義される細胞の割合をフローサイトメトリーで特定した。実施例５の通りに培養した細胞を取り出し、１８日目及び２３日目に、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡを検出する蛍光標識抗体で細胞のアリコートを染色した。ｐｒｅ－ＲＮＰ（電気穿孔前の細胞）と比較して、方法３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）及び方法４（Ｔｒａｎｓａｃｔ）は、１８日目または２３日目で同様のパーセンテージのＴｃｍ細胞を生成した（図１５）。ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、すべての方法に関して１８日目及び２３日目で、ｐｒｅ－ＲＮＰ細胞と比較して全体的な濃縮を示した（データは示さず）。
【0733】
電気穿孔の前の１０日目及び１１日目のＴＩＬの増殖倍率（図１３）（０日目での細胞数に対して）を、実施例５に記載の５つの方法に関して、ＩＬ－２の添加によって増殖させたＴＩＬを評価した。２つのｐｒｅ－ＲＥＰで失敗したものを含めたすべてのドナーが、方法１、３、４、５、及び６で２６００倍を超える増殖を示した。ＳＯＣＳ１編集ＴＩＬは、嗅細胞及びＳＯＣＳ１＋ＰＴＰＮ２編集ＴＩＬより、１８日目または２３日目ですべての方法にわたって大きな平均増殖倍率を示した（図１４）。方法６では、方法５と比較して、１８日目または２３日目でのＳＯＣＳ１編集ＴＩＬの平均増殖倍率が大きかった。
【0734】
実施例８：可溶性活性化因子を用いた腫瘍断片からのＴＩＬの増殖方法
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、原発患者由来の凍結黒色腫腫瘍断片から直接増殖させた。腫瘍断片は、２ドナー、すなわち、ドナーＤ４４６２及びドナーＤ７２８３から得た。０日目に、腫瘍断片を解凍し、ＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０とＡＩＭ Ｖの１：１混合物、５％ヒトＡＢ血清添加）を含む１０ｃｍ２の皿に入れた。断片を計量し、次いで２つのアリコートに均等に分割し（断片の数で）、各アリコートを２４ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルに入れた。ＴＩＬ培地６ｍＬを、１：７０希釈のＧＭＰ Ｔｒａｎｓａｃｔ試薬（ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ、カタログ番号１７０－０７６－１５６）を６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）中に含む各ウェルに加えた。細胞を３７℃で培養した。
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、原発患者由来の凍結黒色腫腫瘍断片から直接増殖させた。腫瘍断片は、２ドナー、すなわち、ドナーＤ４４６２及びドナーＤ７２８３から得た。０日目に、腫瘍断片を解凍し、ＴＩＬ培地（ＲＰＭＩ１６４０とＡＩＭ Ｖの１：１混合物、５％ヒトＡＢ血清添加）を含む１０ｃｍ２の皿に入れた。断片を計量し、次いで２つのアリコートに均等に分割し（断片の数で）、各アリコートを２４ウェルのＧｒｅｘプレート（Ｗｉｌｓｏｎ ｗｏｌｆ、カタログ番号８０１９２Ｍ）のウェルに入れた。ＴＩＬ培地６ｍＬを、１：７０希釈のＧＭＰ Ｔｒａｎｓａｃｔ試薬（ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ、カタログ番号１７０－０７６－１５６）を６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０２）中に含む各ウェルに加えた。細胞を３７℃で培養した。
【0735】
増殖の２日目に、消費を仮定して、３６，０００Ｕの組み換えヒトＩＬ－２を各ウェルに加え、最終濃度６，０００Ｕ／ｍＬにした。
【0736】
増殖の６日目に、Ｄ７２８３に対して培地の５０％を置換／交換した。各ウェルからウェルの底の細胞を乱さないように注意して３ｍＬの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、３ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３６，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。Ｄ４４６２の場合は、サンプルを実施例９に記載の通りにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して操作した。電気穿孔後、４×１０５の細胞を、６０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む６ｍＬのＴＩＬ培地中、２４ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。
【0737】
増殖の９日目に、培地の５０％を置換／交換した。各ウェルから、ウェルの底の細胞を乱さないように注意して３ｍＬの細胞上清を除去及び廃棄した。その後、３ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地及び消費を仮定して、３６，０００ＵのＩＬ－２を次いで添加し、最終濃度６，０００Ｕ／ｍｌにした。
【0738】
増殖の１０日目に、Ｄ４４６２の場合は、３ｍＬの培地を２４ウェルのＧｒｅｘの各ウェルから吸引した。残余の３ｍＬを、６，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む１００ｍＬのＴＩＬ培地を含む６ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に加えた。Ｄ７２８３の場合は、サンプルを実施例９に記載の通りにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して操作した。電気穿孔後、４×１０５の細胞を、６，０００Ｕ／ｍＬを含む６ｍＬのＴＩＬ培地中、２４ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に移した。
【0739】
増殖の１４日目に、Ｄ４４６２のウェルを採取した。Ｄ７２８３の３ｍＬの培地を２４ウェルのＧｒｅｘの各ウェルから吸引した。残余の３ｍＬを、６，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２とともに１００ｍＬのＴＩＬ培地を含む６ウェルのＧｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）に加えた。
【0740】
増殖の１７日目に、Ｄ７２８３の５０ｍＬのＴＩＬ培地を除去し、５０ｍＬの新鮮ＴＩＬ培地で置換した。６，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を消費に対して加えた。
【0741】
増殖の２０日目に、Ｄ７２８３のウェルを採取した。
【0742】
実施例９：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して可溶性活性化因子で断片増殖させたＴＩＬを遺伝子操作する方法
実施例８に記載のプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作し、標的遺伝子の機能的遺伝子ノックアウトを創出した。この遺伝子操作は、６日目または１０日目に行った。簡潔には、６日目または１０日目に、１．２×１０６の増殖させたＴＩＬを、３００×ｇで５分間遠心分離し、２０μｌのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＥＰＢ１）で再懸濁した。２つのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のマスターミックスを、Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、カタログ番号９２１２）５２ｐｍｏｌ及び各ｓｇＲＮＡ１２０ｐｍｏｌを含めて作製した。マスターミックス１は、ＯＲ１Ａ２遺伝子（Ｏ）（ＩＤＴ、ＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧ 配列番号９１０）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。マスターミックス２は、ＳＯＣＳ１遺伝子（Ｓ）（ＩＤＴ、ＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧ 配列番号６１）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。１００μＭのＯＲ１Ａ２のｓｇＲＮＡ溶液を、１０ｎｍｏｌの凍結乾燥されたｓｇＲＮＡを１００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５７０）で再懸濁することによって作製した。試薬は、以下の通りに添加した：
実施例８に記載のプロトコルを使用して増殖させたＴＩＬを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して遺伝子操作し、標的遺伝子の機能的遺伝子ノックアウトを創出した。この遺伝子操作は、６日目または１０日目に行った。簡潔には、６日目または１０日目に、１．２×１０６の増殖させたＴＩＬを、３００×ｇで５分間遠心分離し、２０μｌのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＥＰＢ１）で再懸濁した。２つのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のマスターミックスを、Ｃａｓ９タンパク質（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、カタログ番号９２１２）５２ｐｍｏｌ及び各ｓｇＲＮＡ１２０ｐｍｏｌを含めて作製した。マスターミックス１は、ＯＲ１Ａ２遺伝子（Ｏ）（ＩＤＴ、ＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＡＧＧＡＧ 配列番号９１０）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。マスターミックス２は、ＳＯＣＳ１遺伝子（Ｓ）（ＩＤＴ、ＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧ 配列番号６１）に対するｓｇＲＮＡを含んでいた。１００μＭのＯＲ１Ａ２のｓｇＲＮＡ溶液を、１０ｎｍｏｌの凍結乾燥されたｓｇＲＮＡを１００μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５７０）で再懸濁することによって作製した。試薬は、以下の通りに添加した：
【表40】
【0743】
ＲＮＰマスターミックスの全５μｌを２０μＬの細胞懸濁液に添加した。細胞懸濁液２５μｌを次にＯＣ２５Ｘ３プロセッシングアセンブリ（ＭａｘＣｙｔｅ、カタログ番号ＯＣ－２５ｘ３）に移した。細胞を、ＭａｘＣｙｔｅ ＥｘＰＥＲＴエレクトロポレーターにて、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ＃９」プログラムを使用して電気穿孔した。その後、ＴＩＬ２５μＬを９６ウェルのプレートに移し、各チャンバーを、２５μＬのＴＩＬ培地で２回洗浄し、９６ウェルのリカバリープレートに移し、これをその後３７℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を計数し、４×１０５の生細胞を次いで、６，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した６ｍＬのＴＩＬ培地を含む２４ウェルのＧｒｅｘプレートに播種した。さらなる細胞操作を、実施例８に記載の通りに行った。１４日目及び２０日目に、細胞を採取し、計数した。細胞のペレットを凍結し、ＮＧＳの配列決定によって編集を特定した（図１９）。
【0744】
実施例１０：可溶性活性化因子またはａＡＰＣで腫瘍断片増殖させたＴＩＬの表現型の特徴
１４日目及び２０日目に産生されたＴ細胞の表現型を評価した。特に、セントラルメモリーＴ細胞表現型（Ｔｃｍ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）またはエフェクターメモリーＴ細胞表現型（Ｔｅｆｆ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ－）として定義される細胞の割合をフローサイトメトリーで特定した。実施例８の通りに培養した細胞を取り出し、１４日目または２０日目に、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡを検出する蛍光標識抗体で細胞のアリコートを染色した。調べたすべての条件は、主にＴｅｆｆメモリー表現型を示した。ＳＯＣＳ１編集は、Ｔｃｍ表現型を多少増加させた（図１８）。
１４日目及び２０日目に産生されたＴ細胞の表現型を評価した。特に、セントラルメモリーＴ細胞表現型（Ｔｃｍ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）またはエフェクターメモリーＴ細胞表現型（Ｔｅｆｆ、マーカー表現型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ－）として定義される細胞の割合をフローサイトメトリーで特定した。実施例８の通りに培養した細胞を取り出し、１４日目または２０日目に、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡを検出する蛍光標識抗体で細胞のアリコートを染色した。調べたすべての条件は、主にＴｅｆｆメモリー表現型を示した。ＳＯＣＳ１編集は、Ｔｃｍ表現型を多少増加させた（図１８）。
【0745】
この可溶性活性化因子による腫瘍断片増殖法によって１４日目または２０日目に生成したＴＩＬ細胞の理論数を、ＩＬ－２の添加によって増殖させたＴＩＬについて評価した。理論細胞数は、１グラムの腫瘍断片サンプルを仮定して計算した。調べたすべての条件で、２０日後に１×１０１０ＴＩＬを超える平均増殖を示した（図１７）。
【0746】
実施例１１：凍結した腫瘍消化物のＴＩＬの増殖及び凍結した腫瘍断片のＴＩＬの増殖
凍結した腫瘍消化物のＴＩＬの増殖を、凍結した腫瘍断片のＴＩＬの増殖と、ＩＬ－２の存在下、ＴｒａｎｓＡＣＴ活性化因子を使用して比較した。活性化後、嗅細胞（Ｏ）及びＳＯＣＳ１（Ｓ）に対する編集を行い、電気穿孔なし（ＥＰなし）の対照と比較した。
凍結した腫瘍消化物のＴＩＬの増殖を、凍結した腫瘍断片のＴＩＬの増殖と、ＩＬ－２の存在下、ＴｒａｎｓＡＣＴ活性化因子を使用して比較した。活性化後、嗅細胞（Ｏ）及びＳＯＣＳ１（Ｓ）に対する編集を行い、電気穿孔なし（ＥＰなし）の対照と比較した。
【0747】
この評価に使用した材料は、以下の通りである：
【表41】
【0748】
黒色腫消化物は、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏから入手し、黒色腫腫瘍断片は、ｉＳｐｅｃｉｍｅｎから入手した。ドナー情報及び参照は、以下の通りである：
【表42】
【0749】
両方のＴＩＬの増殖では、通常のプロトコルに続いて、以下に示す通りに離散間隔で行った。
【0750】
増殖の０日目に、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのプロトコル（Ｔｈａｗｉｎｇ Ｖｉａｂｌｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－１．ｐｄｆ）に従い、１ドナーあたり３個のバイアルを使用して細胞を解凍した。各ＴＩＬのドナーチューブを１ｍＬの完全培地に再懸濁し、合わせて合計３ｍＬにした。細胞をＮｅｘｅｌｃｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して、製造業者の推奨通りに計数した。ＦＡＣＳ染色用に各ドナーから２００μＬを取り出した。ＷＩ－００２ ＡＣＴ ＦＡＣＳ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ．ｄｏｃｘの作業指示に従って染色した。最後の再懸濁段階で、１００μＬのＡｃｃｕｃｈｅｃｋビーズ溶液を加え（原液濃度２００，０００ビーズ／ｍＬ）、合計２０，０００ビーズを得た。Ｔ細胞の総数を、獲得したビーズに基づいて計算した。その後、最終濃度１：７０に、２倍の希釈標準溶液（１：３５）からＴｒａｎｓＡｃｔ試薬を調製した。２×１０６の細胞及び３ｍＬの２倍ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬を２４ウェルのＧｒｅｘのウェルに加え、残りのＴＩＬ培地を細胞に加えて合計体積を６ｍＬにした。ＩＬ－２を最終濃度６，０００Ｕ／ｍＬで加えた。細胞を３７℃でインキュベートした。
【0751】
さらに増殖の０日目に、腫瘍断片のバイアルを３７℃の水浴で解凍した。それらの断片を次いで１０ｍＬのＴＩＬ培地を含む１０ｃｍ２の皿に入れた。その１０ｃｍ２の皿を、測定パッドに置き、断片を写真に撮った。これらの断片を２つの同一のアリコートに分割し、各アリコートを、１ｍＬのＴＩＬ培地を含む１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れた。これらの断片を２００ｇで５分間遠沈させた。その培地を吸引し、溜まった断片を計量した。３ｍＬの２倍ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬及び３ｍＬのＴＩＬ培地を２４ウェルのＧｒｅｘのウェルに加えた。断片を２４ウェルのＧｒｅｘのウェルに加えた。Ｄ４４６２では、８個の断片をＩＬ－２と合わせた。Ｄ７２８３では、６個の断片をＩＬ－２と合わせた。ＩＬ－２は６，０００Ｕ／ｍＬで加えた。細胞を３７℃でインキュベートした。
【0752】
増殖の２日目に、ＩＬ－２をすべてのドナーに加えた。ＩＬ－２は、消費に対して６，０００Ｕ／ｍＬまで加えた。
【0753】
増殖の４日目に、すべてのドナーの培地を交換した。３ｍＬの培地を各ウェルから廃棄し、３ｍＬのＴＩＬ培地を各ウェルに加えた。その後、ＩＬ－２を最終濃度６，０００Ｕ／ｍＬまで加えた。
【0754】
増殖の６日目に、Ｄ３２３９、Ｄ６１３８、Ｄ６７５５、及びＤ４４６２をＦＡＣＳ染色し、電気穿孔した。嗅細胞ｓｇＲＮＡの濃度を、１０ｎｍｏｌのバイアルを１００ｕＬのｄｕｐｌｅｘ緩衝液で再懸濁することによって１００μＭに調整した。ＳＯＣＳ１のガイドは、すでに必要な濃度であった。合計１５試験用のＲＮＰ溶液を、以下の体積で調製した。
【表43】
【0755】
ＭａｘＣｙｔｅ機器を準備し、「ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ＃９」ＯＣ２５Ｘ３に設定した。３ｍＬの培地を各ウェルから吸引し、その体積を記録し、細胞を計数した。予め電気穿孔した細胞１００ｕＬを、９６ウェルのｖ底プレートに移し、ＷＩ－００２ ＡＣＴ ＦＡＣＳ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ．ｄｏｃｘのプロトコルに従って染色した。１．２×１０６の細胞を、条件ごとに１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに加えた。チューブを３００ｇで５分間遠沈させ、上清を除去した。２０ｕＬのＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔緩衝液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに加えた。５ｕＬの嗅細胞またはＳＯＣＳ１ ＲＮＰ溶液を対応するエッペンドルフチューブに加えた。最大２５μＬをＯＣ２５Ｘ３アセンブリに移し、細胞を電気穿孔した。２５μＬの細胞をＯＣ２５Ｘ３のウェルから、９６ウェルのリカバリープレートに移した。このＯＣ２５Ｘ３のウェルを２５μＬのＴＩＬ培地で２回すすぎ、リカバリープレートのウェルで最終体積７５μＬにした。これらの細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を以下によって計数した：リカバリープレートから５μＬを、計数ウェルの４５ｕＬのＴＩＬ培地に加え（１０倍希釈）、５０μＬのＡＯＰＩを加えて混合し、計数チャンバーに移し、細胞を計数する。４×１０５の細胞をその後２４ウェルのＧｒｅｘのウェルに移した。そのウェルを３７℃でインキュベートした。
【0756】
増殖の９日目に、すべてのドナーの培地を交換した。各ウェルから３ｍＬの培地を廃棄した。３ｍＬのＴＩＬ培地を各ウェルに加え、ＩＬ－２を最終濃度６，０００Ｕ／ｍＬまで加えた。
【0757】
増殖の１０日目に、Ｄ７２８３をＦＡＣＳ染色し、電気穿孔した。サンプルを６日目のサンプルに関して述べた通りに調製した。５サンプルに対して十分な量を調製した。
【0758】
さらに増殖の１０日目に、Ｄ３２３９、Ｄ６１３８、Ｄ６７５５、及びＤ４４６２のサンプルを６ウェルのＧｒｅｘに移した。１００ｍＬのＴＩＬ培地を、６，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む６ウェルのＧｒｅｘに加えた。各ドナーのウェルから３ｍＬの培地を廃棄した。細胞を計数し、体積を記録した。３ｍＬのドナー細胞を、サイトカインとともに１００ｍＬのＴＩＬ培地を含む６ウェルのＧｒｅｘの対応するウェルに加えた。
【0759】
増殖の１４日目に、テイクダウン（ｔａｋｅｄｏｗｎ）アッセイをＤ３２３９、Ｄ６１８３、Ｄ６７５５、及びＤ４４６２に対して行った。８０ｍＬを６ウェルのＧｒｅｘの各ウェルから吸引し、混合し、それらの体積を記録した。１つのバイアルをＮＧＳプロセッシング用に残した。すなわち、１００万細胞を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、そのチューブを３００ｇで５分間遠沈させた。上清を吸引し、細胞を－８０℃で保存した。ＦＡＣＳ分析を行った。すなわち、条件ごとに１００万細胞を、分化及び多機能パネル用に、それぞれ、ｖ底またはｕ底９６ウェルのプレートに移した。作業指示に従って細胞を処理した。残余の細胞を凍結した。すなわち、５０００万細胞のペレットを調製し、その細胞を３００ｇで５分間遠沈させ、その上清を吸引し、ｃｒｙｏｓｔｏｒｅを加え、細胞を再懸濁して５０００万細胞／ｍＬにし、１ｍＬをクライオバイアルに加え、ＬＮ２に移す前に－８０℃でクージーに終夜入れた。
【0760】
増殖の１４日目に、Ｄ７２８３を６ウェルのＧｒｅｘに移した。１００ｍＬのＴＩＬ培地を、６，０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を含む６ウェルのＧｒｅｘに加えた。各ドナーのウェルから３ｍＬの培地を廃棄した。細胞を計数し、体積を記録した。３ｍＬのドナー細胞を、サイトカインとともに１００ｍＬのＴＩＬ培地を含む６ウェルのＧｒｅｘの対応するウェルに加えた。
【0761】
増殖の１７日目に、Ｄ７２８３のサンプルからの細胞を計数し、培地の５０％交換を行った。５０ｍＬの培地を取り出し、細胞を計数した。５０ｍＬのＴＩＬ培地を加えて合計１００ｍＬにした。消費を仮定して、６，０００Ｕ／ｍＬまでＩＬ－２を加えた。
【0762】
増殖の２０日目に、テイクダウンアッセイをＤ７２８３に関して行い、増殖を継続した。６ウェルのＧｒｅｘの各ウェルから７０ｍＬを吸引し、混合して、それらの体積を記録した。５００万細胞を取り出し、以下のテイクダウンアッセイを裏付けた。１つのバイアルをＮＧＳプロセッシング用に残した。すなわち、１００万細胞を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、３００ｇで５分間遠沈させ、上清を吸引し、－８０℃で保存した。編集効率を図２０に示す。ＦＡＣＳ分析を行った。すなわち、条件ごとに１００万細胞を、分化用に、ｖ底９６ウェルのプレートに移し、作業指示に従って細胞を処理した。残余の細胞を凍結した。すなわち、５０００万細胞のペレットを調製し、その細胞を３００ｇで５分間遠沈させ、その上清を吸引し、ｃｒｙｏｓｔｏｒｅを加え、細胞を再懸濁して５０００万細胞／ｍＬにし、１ｍＬをクライオバイアルに加え、ＬＮ２に移す前に－８０℃でクージーに終夜入れた。７０ｍＬのＴＩＬ培地をウェルに加え、合計１００ｍＬにした。消費を仮定して、６，０００Ｕ／ｍＬまでＩＬ－２を加えた。
【0763】
増殖の２３日目に、テイクダウンアッセイをＤ７２８３に対して行い、サンプルを凍結した。６ウェルのＧｒｅｘの各ウェルから７０ｍＬを吸引し、混合して、それらの体積を記録した。１００万細胞を取り出し、以下のテイクダウンアッセイを裏付けた。ＦＡＣＳ分析を行った。すなわち、条件ごとに１００万細胞を、多機能パネル用に、ｕ底９６ウェルのプレートに移し、作業指示「ＷＩ－００８ ＡＣＴ ＦＡＣＳ Ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐａｎｅｌ ＣＤ２５ ＡＰＣ．ｄｏｃｘ」に従って細胞を処理した。残余の細胞を凍結した。すなわち、５０００万細胞のペレットを調製し、その細胞を３００ｇで５分間遠沈させ、その上清を吸引し、ｃｒｙｏｓｔｏｒｅを加え、細胞を再懸濁して５０００万細胞／ｍＬにした。１ｍＬをクライオバイアルに加え、ＬＮ２に移す前に－８０℃でクージーに終夜入れた。ＴＩＬは、生存能力が高いと判断され（図２１）、ＴＩＬの外挿の収量は、このプロセスの１４日目までに断片及び消化物の両サンプルで１×１０９細胞を上回った（図２２）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】