特表 2023-502782 星状細胞からニューロンへのＮｅｕｒｏＤ１媒介性変換を介した外傷性脳損傷後の脳の修復

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-25

(54)【発明の名称】星状細胞からニューロンへのＮｅｕｒｏＤ１媒介性変換を介した外傷性脳損傷後の脳の修復

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20230118BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230118BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230118BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230118BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230118BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230118BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20230118BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230118BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

A61P25/00 ZNA

A61K35/76

C12N15/12

C07K14/47

C12N15/864 100Z

C12N7/01

C12N5/10

A61K35/30

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022530253

(86)(22)【出願日】2020-11-25

(85)【翻訳文提出日】2022-06-07

(86)【国際出願番号】 US2020062299

(87)【国際公開番号】W WO2021108609

(87)【国際公開日】2021-06-03

(31)【優先権主張番号】62/939,978

(32)【優先日】2019-11-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】398071440

【氏名又は名称】ザ・ペン・ステイト・リサーチ・ファウンデイション

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｐｅｎｎ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ゴン

(72)【発明者】

【氏名】レイ，ジョウ－ファン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA021

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB45

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療する方法が、本開示の態様に従って提供され、方法は、ＴＢＩを有するヒト対象の脳などの対象の脳のダメージ領域における少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤｌ、本明細書ではＮＤ１とも呼ばれる）を提供することによって、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換することを含む。態様によれば、対象の脳のダメージ領域における非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の存在は、主に、ダメージ領域における出血および／または虚血に起因するものではない。本開示の態様によれば、外傷性脳損傷は、対象の脳のダメージ領域においてアストログリオーシスの期間を引き起こし、外因性ＮｅｕｒｏＤｌは、アストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内に、対象の脳のダメージ領域における反応性星状細胞に提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の脳のダメージ領域における少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）を提供することによって、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換することを含む、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療する方法。

【請求項2】

前記ＴＢＩが、閉鎖性頭部損傷である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記脳の前記ダメージ領域が、前記ＴＢＩに起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記非機能的ニューロンが、死んだニューロンおよび瀕死のニューロンからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記非機能的ニューロンが、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）によって検出される、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記ダメージ領域における非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の存在が、主に前記ダメージ領域における出血に起因するものではない、請求項３～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記ダメージ領域における非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の前記存在が、主に前記ダメージ領域における虚血に起因するものではない、請求項３～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、前記組換え発現ベクターが、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、前記組換え発現ベクターが、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含むウイルス発現ベクターである、請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、前記組換え発現ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターであり、前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

ＮｅｕｒｏＤ１をコードする前記核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結する、請求項８～１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

前記プロモーターが、グリア細胞特異的プロモーターである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記グリア細胞特異的プロモーターが、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＧＦＡＰプロモーターが、ヒトＧＦＡＰ（ｈＧＦＰ）プロモーターである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ＮｅｕｒｏＤ１以外の外因性転写因子が、前記少なくとも１つの反応性星状細胞に提供されない、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項16】

前記対象が、ヒトである、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。

【請求項17】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記外傷性脳損傷後、約２日～約１０日の範囲の第１の治療時間において、前記少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、請求項１～１６のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

前記外傷性脳損傷が、前記ダメージ領域においてアストログリオーシスの期間を引き起こし、前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記アストログリオーシスの期間中または前記アストログリオーシスの期間後４週間以内の第１の治療時間において、前記少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、請求項１～１７のいずれかに記載の方法。

【請求項19】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記第１の治療時間後で、かつ前記アストログリオーシスの期間中または前記アストログリオーシスの期間後４週間以内の第２の治療時間において、前記少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記第２の治療時間後で、かつ前記アストログリオーシスの期間中または前記アストログリオーシスの期間後４週間以内の第３の治療時間において、前記少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ＮｅｕｒｏＤ１が、配列番号２、配列番号４、配列番号２の機能的断片、配列番号４の機能的断片、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれかに記載の方法。

【請求項22】

前記ＮｅｕｒｏＤ１が、配列番号１を含む核酸配列、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列、配列番号３を含む核酸配列、または配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、前記脳の前記ダメージ領域内への注射を含む、請求項１～２２のいずれかに記載の方法。

【請求項24】

前記ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列が、ウイルス粒子内に存在する、請求項８～２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、約１０^７～約１０^１４個のウイルス粒子を前記対象の前記ダメージ脳領域に投与することを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

対象の脳のダメージ領域において反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換するための医薬品の製造における神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）を含む組成物の使用であって、前記脳の前記ダメージ領域が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む、使用。

【請求項27】

前記非機能的ニューロンが、死んだニューロンおよび瀕死のニューロンからなる群から選択される、請求項２６に記載の使用。

【請求項28】

前記外傷性脳損傷が、閉鎖性頭部損傷である、請求項２６または２７に記載の使用。

【請求項29】

前記ＮｅｕｒｏＤ１が、核酸配列によってコードされ、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２６～２８のいずれかに記載の使用。

【請求項30】

ＮｅｕｒｏＤ１をコードする前記核酸が、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２６～２９のいずれかに記載の使用。

【請求項31】

前記ＮｅｕｒｏＤ１が、配列番号２、配列番号４、配列番号２の機能的断片、配列番号４の機能的断片、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６～３０のいずれかに記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮出願第６２／９３９，９７８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
サイズが２９，５３６バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）で、２０２０年１１月２４日に作成されたファイル名３６ＰＳＴ９７６５２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに含まれる配列表は、本明細書とともに電子的に出願され、その全体が参照により組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、世界中の死亡および障害の主要な原因の１つである。ＣＤＣは、米国では毎年約１７０万人がＴＢＩの医療ケアを必要としており、その費用は年間７７０億ドルを超えると報告している。世界では、５，０００万人が、年間４，０００億ドルの費用でＴＢＩによって影響を受けている（Ｍａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．，１６（１２）：９８７－１０４８，２０１７）。

【0004】

ＴＢＩは、脳組織に急性のダメージを引き起こし、神経系に二次的な損傷ももたらし、慢性的な身体的および／または精神的欠損の結果をもたらす。ＴＢＩは、血液脳関門の破壊、ミクログリオーシス、アストログリオーシス、およびニューロンの変性をもたらす。成体の哺乳動物の脳は、損傷後にニューロンを再生する能力を欠いており、ＴＢＩ後のニューロン再生を促進することができる治療が不足している。ＴＢＩ後のダメージを受けた脳の修復を促進する治療についての継続的な必要性が存在する。

【発明の概要】

【0005】

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療する方法は、本開示の態様に従って提供され、方法は、対象の脳のダメージ領域における少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１、本明細書ではＮＤ１とも呼ばれる）を提供することによって、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換することを含む。態様によれば、ＴＢＩは、閉鎖性頭部損傷である。本開示の態様によれば、脳のダメージ領域は、ＴＢＩに起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む。本開示の態様によれば、非機能的ニューロンは、死んだニューロン、瀕死のニューロン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。本開示の態様によれば、脳のダメージ領域に存在する非機能的ニューロンは、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）によって検出される。本開示の態様によれば、対象は、ヒトである。

【0006】

ＴＢＩを治療する方法は、本開示の態様に従って提供され、方法は、対象の脳のダメージ領域における少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することによって、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換することを含み、脳のダメージ領域は、ＴＢＩに起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む。本開示の態様によれば、ダメージ領域における非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の存在は、主にダメージ領域における出血に起因するものではない。本開示の態様によれば、非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の存在は、主にダメージ領域における虚血に起因するものではない。態様によれば、ＴＢＩは、閉鎖性頭部損傷である。本開示の態様によれば、非機能的ニューロンは、死んだニューロンである。本開示の態様によれば、非機能的ニューロンは、瀕死のニューロンである。本開示の態様によれば、脳のダメージ領域に存在する非機能的ニューロンは、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）によって検出される。本開示の態様によれば、対象は、ヒトである。

【0007】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、外傷性脳損傷後、約２日～約１０日の範囲の第１の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む。

【0008】

本開示の態様によれば、外傷性脳損傷は、ダメージ領域においてアストログリオーシスの期間を引き起こし、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、アストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第１の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む。

【0009】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、第１の治療時間後で、かつアストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第２の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む。

【0010】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、第２の治療時間後で、かつアストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第３の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む。

【0011】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、組換え発現ベクターは、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含む。

【0012】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、組換え発現ベクターは、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含むウイルス発現ベクターである。

【0013】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターであり、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含む。

【0014】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結する。

【0015】

本開示の態様によれば、プロモーターは、グリア細胞特異的プロモーターである。

【0016】

本開示の態様によれば、グリア細胞特異的プロモーターは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである。

【0017】

本開示の態様によれば、ＧＦＡＰプロモーターは、ヒトＧＦＡＰ（ｈＧＦＰ）プロモーターである。

【0018】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１以外の外因性転写因子は、少なくとも１つの反応性星状細胞に提供されない。

【0019】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号２の機能的断片、配列番号４の機能的断片、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0020】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、配列番号１を含む核酸配列、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列、配列番号３を含む核酸配列、または配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列によってコードされる。

【0021】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、脳のダメージ領域内への注射を含む。

【0022】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列は、ウイルス粒子内に存在する。

【0023】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、約１０^７～約１０^１４個のウイルス粒子を対象のダメージ脳領域に投与することを含む。

【0024】

ＮｅｕｒｏＤ１を含む組成物の使用は、対象の脳のダメージ領域における反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換するための医薬品の製造において提供され、脳のダメージ領域は、ＴＢＩに起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む。本開示の態様によれば、非機能的ニューロンは、死んだニューロンである。本開示の態様によれば、非機能的ニューロンは、瀕死のニューロンである。本開示の態様によれば、外傷性脳損傷は、閉鎖性頭部損傷である。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、核酸配列によってコードされ、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含む。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸は、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含む。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号２の機能的断片、配列番号４の機能的断片、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0025】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、組換え発現ベクターに含まれる核酸配列によってコードされる。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結する。本開示の態様によれば、プロモーターは、グリア細胞特異的プロモーターである。本開示の態様によれば、グリア細胞特異的プロモーターは、ＧＦＡＰプロモーターである。本開示の態様によれば、ＧＦＡＰプロモーターはｈＧＦＰプロモーターである。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、ウイルス発現ベクターを含んだ核酸配列によってコードされる。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１は、組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターを含んだ核酸配列によってコードされる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1A】外傷性脳損傷の治療の研究のための限局性閉鎖性頭部損傷モデルの確立の態様を示し、モデルには、マウス頭部に図示的に示される運動皮質に限局性閉鎖性頭部損傷を誘導するための電磁石制御デバイスの使用を含む。

【図1B】損傷誘導および病理学的調査のためのタイムラインの概略図である。

【図1C】ニューロンマーカー（ＮｅｕＮ）および星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）に対する免疫染色の結果を示す一連の画像であり、これは、外傷性脳損傷後の指示された時点における、偽外傷性脳損傷マウス（偽ＴＢＩ群）由来のマウスの脳、または外傷性脳損傷マウス（ＴＢＩ群）由来のマウスの脳における生存しているニューロンおよび反応性星状細胞の細胞密度を反映した。

【図1D】損傷コアにおいてＮｅｕＮの密度が顕著に減少したことを示すグラフである。

【図1E】損傷周辺区域においてＮｅｕＮの密度が顕著に減少したことを示すグラフである。

【図1F】全損傷区域において反応性星状細胞の密度が顕著に増加したことを示すグラフである。

【図1G】外傷性脳損傷後の指示された時点における、偽外傷性脳損傷マウス（偽ＴＢＩ群）由来のマウスの脳、または外傷性脳損傷マウス（ＴＢＩ群）由来のマウスの脳におけるミクログリアマーカー（Ｉｂａ１）、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）、および細胞増殖マーカー（Ｋｉ６７）に対する共免疫染色の結果を示す一連の画像であり、ＴＢＩ後のこれらの早い時点での神経炎症プロセスを示している。

【図1H】ミクログリア細胞の増殖速度が、ＴＢＩの約１日後にピークに達し、星状細胞の増殖速度が、ＴＢＩの約４日後にピークに達したことを示すグラフである。

【図2A】ＣＨＩモデルにおけるマウスの運動皮質の損傷コアおよび損傷周辺区域の定義を示す。

【図2B】ＣＨＩ後の早い時点である６時間後および４日後でのダメージを受けた脳組織の免疫染色の結果を示す一連の画像である。免疫染色の結果は、細胞アポトーシスマーカーのＴＵＮＥＬがニューロンマーカーのＮｅｕＮと共局在していることを示し、これは、特にダメージを受けた運動皮質の表層において、多くのニューロンの死および喪失があることを示唆した。

【図2C】ＣＨＩの７日後のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびニューロフィラメントタンパク質（ＮＦ２００）対するダメージを受けた脳組織の免疫染色の結果を示す一連の画像である。免疫染色結果は、ＣＨＩ後の損傷部位でニューロン突起がダメージを受けたことを実証した。

【図3A】ＣＨＩ後の衝撃部位またはその付近でのマウスの運動皮質における閉鎖性頭部損傷およびＮＤ１の投与の図解を示す。

【図3B】本明細書の実施例に詳細に記載されているＣＨＩ誘導、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするウイルスの注射、および免疫蛍光実験の実験スキームを図式的に示す。

【図3C】ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＧＦＰウイルス（対照群、左パネル）の注射またはＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルス（ＮＤ１群、右パネル）の注射の７日後の損傷した皮質を示す一連の代表的な画像である。

【図3D】示されるマーカーのＧＦＰ蛍光および免疫蛍光を示す一連の画像であり、示されるように、ＧＦＡＰプロモーター制御下で、ＧＦＰは、主にＧＦＡＰ＋星状細胞で発現され、一方で、対照群においてはＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＧＦＰウイルスの注射の７日後に、種々の亜型の他の皮質細胞において、非常に低いＧＦＰ発現が見出された。

【図3E】対照群（上部パネル）と比較して、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルスの注射（下部パネル）の７日後のＮＤ１群において、ＧＦＰ＋星状細胞においてＮｅｕｒｏＤ１が高度に発現されたことを示す、図２Ｃからの一連の「ズームイン」画像である。

【図3F】ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルスの注射の後の種々の時間点における星状細胞からニューロンへの変換プロセスを示した、ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、およびＮＤ１に対する共染色の結果を示す一連の画像である。

【図3G】図３Ｄに示される全ＧＦＰ発現皮質細胞中の種々の型のパーセンテージの定量化を示すグラフである。

【図3H】ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルスの注射の後の種々の時点での、ＧＦＰとともにニューロンマーカーのＮｅｕＮを発現する細胞のパーセンテージの定量化を示すグラフである。

【図4A】ＣＨＩの４日後にダメージを受けた脳由来の一連の画像であり、いくらかのＧＦＰ＋細胞が同時にＧＦＡＰおよびＮｅｕＮシグナルの両方を示し、これは、それらが反応性星状細胞からニューロンへの遷移段階にあることを示している。

【図4B】変換されたニューロン中で、未成熟ニューロンマーカー（Ｔｕｊ１）および成熟ニューロンマーカー（ＭＡＰ２）の変動傾向が、変換されたニューロンが徐々に成熟することを暗示したことを示す一連の画像である。

【図4C】ＧＦＰ蛍光、ＮｅｕＮ免疫蛍光、およびＧＦＡＰ免疫蛍光を示し、ＮｅｕｒｏＤ１による「星状細胞からニューロンへの」（ＡｔＮ）変換が、（レトロウイルス）ＣＡＧ：：ＮＤ１－ＧＦＰまたは（レトロウイルス）ＣＡＧ：：ＧＦＰ発現構築物を使用して確認されたことを示す、一連の画像である。

【図4D】ＮｅｕｒｏＤ１による「星状細胞からニューロンへの」（ＡｔＮ）変換が、（レトロウイルス）ＣＡＧ：：ＮＤ１－ＧＦＰまたは（レトロウイルス）ＣＡＧ：：ＧＦＰ発現構築物を使用して確認され、ＮＤ１を担持するレトロウイルスが、ＧＦＰ発現細胞の約半分をＮｅｕＮ＋に変換したが、対照群においては星状細胞からニューロンへの変換が存在しなかったことを示すグラフである。

【図5A】ほとんどの変換されたニューロンがＦｏｘＧ１シグナルを示し、多くの変換されたニューロンがＴｂｒ１シグナルを示したことを示す一連の画像である。

【図5B】ＮＤ１処置後、表面皮質マーカー（Ｃｕｘ１）および深層マーカー（Ｃｔｉｐ２）での免疫染色が、皮質層が依然として十分に組織化されていることを示唆したことを示す画像である。

【図5C】いくらかの変換されたニューロンが、マウスの皮質における表層または深層において、Ｃｕｘ１＋またはＣｔｉｐ２＋であったことを示す一連の画像である。

【図5D】ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルスの注射の２８日後に、ＧＦＰおよびＮｅｕＮとともに、皮質マーカーのＦｏｘＧ１、および／もしくはＴｂｒ１、または層マーカーのＣｕｘ１、および／もしくはＣｔｉｐ２を発現する変換されたニューロンのパーセンテージの定量化の結果を示すグラフである。

【図6A】ＮＤ１処置の２８日後に、いくらかの変換されたニューロンが、ＧＡＢＡ作動性ニューロンであることを示す細胞体内のＧＡＢＡおよびＧＡＤ６７シグナルの両方を有したことを示す一連の画像である。

【図6B】いくらかの変換されたニューロンが、パバブルミン、カルレチニン、ニューロペプチドＹ、ソマトスタチンなどのマウスの皮質におけるＧＡＢＡ作動性ニューロンの種々の亜型のマーカーに対して陽性であり得ることを示す一連の画像である。

【図6C】ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルスの注射の２８日後にニューロン亜型マーカーを発現する細胞のパーセンテージの定量化を示すグラフである。

【図7A】ＧＦＰ蛍光およびＮｅｕＮ免疫蛍光とともに、ａ、ｂ、およびｃで変換されたニューロンの形態を示す一連の画像である。

【図7B】３つの異なる活動電位発火パターンＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを代表する全細胞パッチ記録によって得られた活動電位発火パターンの一連の３つの追跡である。

【図7C】活動電位発火パターンＩ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかを有する変換されたニューロンの定量化の結果を示す円グラフである。

【図7D】変換されたニューロンが、周波数および振幅が野生型対照由来のものよりも高いｓＥＰＳＣを発火したことを示す追跡である。

【図7E】変換されたニューロンが、周波数および振幅が野生型対照由来のものよりも高いｓＩＰＳＣを発火したことを示す追跡である。

【図7F】変換されたニューロンが、周波数および振幅が野生型対照由来のものよりも高いｓＥＰＳＣを発火したことを示す一連のグラフである。

【図7G】変換されたニューロンが、周波数および振幅が野生型対照由来のものよりも高いｓＩＰＳＣを発火したことを示す一連のグラフである。

【図8A】ｓＥＰＳＣの周波数が早い時点で増加の傾向を示し、次いで、遅い時点で対照レベルまで減少したことを実証するグラフである。

【図8B】ＮｅｕｒｏＤ１投与後の第１の週にｓＥＰＳＣの振幅が有意に増加し、次いで２ヶ月後に対照レベルに下がったことを実証するグラフである。

【図8C】ＮｅｕｒｏＤ１投与後の早い時点（７日目）での変換されたニューロンに対する神経支配を示すための実験的スキームを示す図である。

【図8D】ＮｅｕｒｏＤ１ウイルスの注射および反対側のＣＴＢ－６４７の注射の７日後に、変換されたニューロンの細胞体におけるＧＦＰおよびＮｅｕＮとともにシナプスマーカー（ＶＧＡＴ）の共局在化を示す一連の画像であり、反対側由来のＣＴＢシグナルも、細胞体上で観察された。

【図8E】ＮｅｕｒｏＤ１ウイルスの注射および反対側のＣＴＢ－６４７の注射の７日後に、変換されたニューロンの細胞体におけるＧＦＰおよびＮｅｕＮとともにシナプス小胞マーカー（ＳＶ２）の共局在化を示す一連の画像であり、反対側由来のＣＴＢシグナルも、細胞体上で観察された。

【図9A】グルタミン酸作動性シナプスマーカー（ｖＧｌｕｔ１）、またはＧＡＢＡ作動性シナプスマーカー（ｖＧＡＴ）が、ＮＤ１変換されたニューロンの細胞体上でＧＰＦとともに共局在することを示す一連の画像である。

【図9B】シナプス末端マーカー（シナプトフィシン、ＳＰ１）、またはシナプス小胞マーカー（ＳＶ２）が、ＮＤ１変換されたニューロンの細胞境界の周囲でＧＰＦとともに共局在することを示す一連の画像である。

【図9C】ＮＤ１変換されたニューロンが、マウスの運動皮質における内因性ニューロンと同等のｃＦｏｓ発現を実証したことを示す一連の画像である。

【図9D-9F】視床ニューロンが、順行性追跡のために、ＮｅｕｒｏＤ１群において、（ＡＡＶ）シナプシン：：Ｃｒｅ＋ＣＡＧ：：Ｆｌｅｘ－ｍＣｈｅｒｒｙによって標識化されたことを示す。

【図9D】ＮＤ１－ＧＦＰ発現ウイルスが投与されたマウスにおける順行性追跡のために、ウイルスＡＡＶ－シナプシン：：Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＣＡＧ：：ＦｌｅｘｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する）をマウスの視床にさらに注射し、それによって、ニューロンを標識化して、ＧＦＰを発現するＮＤ１変換されたニューロンへの軸索突起を可視化することを示す画像である。

【図9E】他の変換されたニューロン由来の局所神経支配を示す細胞体上にＧＦＰ含有シナプスボタンを有するＮＤ１変換されたニューロンを示す一連の画像である。

【図9F】遠隔視床ニューロン由来の神経支配を示す細胞体上にｍＣｈｅｒｒｙ含有シナプスボタンを有するＮＤ１変換されたニューロンを示す一連の画像である。

【図9G】ＣＴＢ－４６７が、ＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルスの注射部位の反対側に逆行性追跡のために注射され、ＣＴＢシグナルがいくらかの変換されたニューロンで見出されたことを示す一連の画像である。

【図9H】変換プロセスが進行するにつれて、ＮｅｕｒｏＤ１発現ウイルスが注射された後、変換されたニューロン内の平均ＣＴＢシグナルが経時的に増加したことを示す一連のグラフであり、ＣＴＢは、脳試料がすべての指示された時点で取得される７日前に注射された。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。かかる用語は、例示的に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ Ｅｄ．，２００１、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ Ｅｄ．，２００２、Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ，２００２、Ｄ．Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，２００４、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（Ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００４、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ Ｅｄ．，２００５、Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，８ｔｈ Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００４、およびＬ．Ｂｒｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１２ｔｈ Ｅｄ．，２０１１を含む様々な標準的な参考文献の文脈で定義され使用されていることが見出される。

【0028】

「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の用語は、明確に別途示されない限り、または文脈が明確に別途示さない限り、限定することを意図せず、複数の指示対象を含む。

【0029】

選択肢の群化が提示される場合、その選択肢の群化を構成するメンバーの任意の組み合わせおよびすべての組み合わせが具体的に想定される。例えば、ある項目が、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤからなる群から選択される場合、各選択肢が個々に（例えば、Ａ単独、Ｂ単独など）、ならびにＡ、Ｂ、およびＤ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣなどの組み合わせが想定される。「および／または」という用語は、２つ以上の項目のリストにおいて使用される場合、それ自体の、または他のリスト化された項目のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた、リスト化された項目のうちのいずれか１つを意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、ＡおよびＢのいずれかまたは両方、すなわち、Ａ単独、Ｂ単独、またはＡおよびＢの組み合わせを意味するように意図される。「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という表現は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢの組み合わせ、ＡおよびＣの組み合わせ、ＢおよびＣの組み合わせ、またはＡ、Ｂ、およびＣの組み合わせを意味することを意図している。

【0030】

数値の範囲が本明細書で提供される場合、範囲は、範囲の縁および定義された範囲の縁の間の任意の数字を含むと理解される。例えば、「１～１０」は、１～１０の任意の数字、ならびに数字１および数字１０を含む。

【0031】

「約」という用語が数字に関連して使用される場合、それは、プラスまたはマイナス１０％を意味すると理解される。例えば、「約１００」には、９０～１１０が含まれる。

【0032】

対象における外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療するための組成物および方法は、本開示の態様に従って提供される。

【0033】

ＴＢＩから生じるニューロン損失を逆転させるのに有効な方法が、本開示の態様に従って提供される。意外なことに、グリア細胞、特に星状細胞および／または反応性星状細胞における外因性神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）の発現は、ＴＢＩの治療を必要とする対象においてＴＢＩを治療する。したがって、本開示によって提供されるのは、対象への治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与を含む、対象におけるＴＢＩの治療方法である。

【0034】

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療する方法は、対象の脳のダメージ領域における少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することによって、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換することを含む、本開示の態様に従って提供される。

【0035】

「ＮｅｕｒｏＤ１」という用語は、胎児の脳発達および成人の神経新生に関与するｂＨＬＨ前神経転写因子である神経原性分化１を指し、Ｃｈｏ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，３０：３５－４７，２００４、Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：１０９７－１１０５，２００９、およびＧａｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：１０９０－１０９２，２００９を参照されたい。ＮｅｕｒｏＤ１は、発達の後半、主に神経系において発現し、ニューロンの分化、成熟および生存に関与する。

【0036】

ＮｅｕｒｏＤ１を指すために本明細書で使用される「外因性」という用語は、本開示の方法の操作によって機能的ニューロンに変換されるグリア細胞、特に星状細胞および／または反応性星状細胞内に存在し、グリア細胞内に天然には存在しない、ＮｅｕｒｏＤ１を指す。

【0037】

本明細書で使用される場合、ニューロンに関して「機能的」という用語は、ニューロンが特別に適合されるか、または実施するために存在する作用および／またはタスクを実施する能力を示す、および／または維持するニューロンを指す。

【0038】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、および「ＮｅｕｒｏＤ１治療」という用語または文法的均等物は、ＴＢＩ、ＴＢＩの症状もしくは徴候を緩和、阻害または改善し、またＴＢＩの症状または徴候を予防することを指し、治療的および／または予防的処置を含むが、これらに限定されない。

【0039】

「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療されるＴＢＩの症状もしくは徴候を緩和、改善、または予防するのに有効な本発明の組成物の量を意味することが意図される。本開示の態様によれば、治療有効量は、ＴＢＩの徴候および／または症状を有する対象において有益な効果を有する量である。本開示の態様によれば、ＴＢＩによって影響を受ける対象への治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、反応性星状細胞の機能的ニューロンへの変換による新たな機能的ニューロンの生成、反応性星状細胞の数の低減、新たな非反応性星状細胞の生成、ならびに対象の脳の損傷領域および非損傷領域の両方におけるニューロンネットワークへの新たな機能的ニューロンの統合を提供する。

【0040】

「外傷性脳損傷」という用語は、本明細書では、「ＴＢＩ」と略され、頭部への衝撃による閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）、または貫通性頭部損傷のいずれかとすることができる、脳への突然の損傷を指す。貫通性頭部損傷の非限定的な例は、頭蓋骨を貫通し、脳に入る物体である。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、ＣＨＩである。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、貫通性頭部損傷である。ＴＢＩは、転倒、自動車事故、スポーツ事故、物体が当たる、または爆発からの衝撃波などの間接的な衝撃など、しかしこれらに限定されない様々な原因のうちのいずれかからの頭部への直接の衝撃から生じる可能性がある。爆発の非限定的な例は、戦場の爆発である。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、転倒から生じる。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、自動車事故から生じる。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、スポーツ事故から生じる。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、物体に当たることから生じる。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、爆発からの衝撃波などの間接的な衝撃から生じる。

【0041】

本開示の態様によれば、ＴＢＩの非限定的な例は、追加の機能的ニューロンによって緩和、改善、または予防される対象の頭部への衝撃から生じる脳損傷である。

【0042】

「閉鎖性頭部損傷」という用語は、本明細書では「ＣＨＩ」と略され、対象の頭部に対する非貫通性損傷、または頭蓋骨を骨折しなかった、かつ／もしくは頭蓋骨の完全性を損なわなかった頭部に対する損傷に起因するＴＢＩを指す。

【0043】

本開示の態様によれば、ＴＢＩは、脳への一次的なダメージが衝撃部位に隣接する脳の区域に局在化するような「限局性」である。脳への二次的なダメージは、一次的なダメージから生じる脳の他の領域に存在する可能性がある。

【0044】

「一次的なダメージ」という用語は、衝撃部位に隣接する区域における死んだニューロンおよび／または瀕死のニューロンなどの非機能的ニューロン、ならびに反応性星状細胞の存在を指し、ダメージ領域における死んだニューロンおよび／または瀕死のニューロンなどの非機能的ニューロン、ならびに反応性星状細胞の存在は、主に、ダメージ領域における出血および／または虚血に起因するものではない。本開示の態様によれば、死んだニューロンまたは瀕死のニューロンは、アポトーシスアッセイおよび機能的アッセイによって測定される。アポトーシスアッセイの非限定的な例としては、電子顕微鏡法、ＴＵＮＥＬアッセイ、フローサイトメトリー、ＤＮＡラダーアッセイ、シトクロムｃの検出、アネキシンＶの検出、およびカスパーゼ活性アッセイが挙げられる。機能的アッセイの非限定的な例としては、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）が挙げられる。本開示の態様によれば、ＴＢＩは、２つ以上の衝撃から生じ得、２つ以上の衝撃の各々が、脳への一次的なダメージが２つ以上の衝撃部位の各々に関連付けられるように、衝撃部位と関連付けられる。

【0045】

グリア細胞における治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１は、対象におけるＴＢＩの少なくとも１つの徴候および／または症状を治療し、それによってＴＢＩが治療される。

【0046】

ＴＢＩの徴候および症状は、かかる徴候および症状の検出および評価方法とともに、当該技術分野で周知である。対象におけるＴＢＩの徴候および症状は、意識の喪失、混乱、方向感覚の喪失、頭痛、疲労、発話の問題、睡眠の問題、めまい、バランスの問題、感覚の問題、光への感受性、視力の喪失または視覚の変化、嗅覚の喪失または変化、味覚の喪失または変化、耳鳴り、聴覚の喪失または変化、記憶の問題、集中力の問題、うつ病、不安、興奮、気分の揺れ、発作、協調の喪失または減少、運動の問題、学習困難を含む認知の問題、推論能力の負の変化、判断の負の変化、および注意または集中の負の変化を含む。

【0047】

対象におけるＴＢＩの徴候および／または症状は、ＴＢＩに起因してダメージを受けた脳の領域における、死んだニューロンおよび／または瀕死のニューロンなどの非機能的ニューロンの存在を含む。ＴＢＩに起因してダメージを受けた脳の領域における死んだニューロンおよび／または瀕死のニューロンの数は、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１を対象のグリア細胞に送達することを含む本開示の態様に従って、ＴＢＩの治療を必要とする対象においてＴＢＩを治療する方法によって低減する。

【0048】

対象におけるＴＢＩの徴候および／または症状は、ＴＢＩに起因してダメージを受けた脳の領域における反応性星状細胞の存在を含む。ＴＢＩに起因してダメージを受けた脳の領域における反応性星状細胞の数は、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１を対象のグリア細胞に送達することを含む本開示の態様に従って、ＴＢＩの治療を必要とする対象においてＴＢＩを治療する方法によって低減する。

【0049】

グリア細胞における治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩを有する未治療の対象と比較して、ＴＢＩを有する対象におけるより多くの数の機能的ニューロンをもたらし、それによってＴＢＩが治療される。本開示の態様によれば、グリア細胞における治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩを有する未治療の対象と比較して、ＴＢＩによって影響を受ける対象の脳の区域内により多くの数の機能的ニューロンをもたらし、それによってＴＢＩが治療される。

【0050】

治療を必要とする対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得るが、そのうえ非哺乳動物である可能性もある。したがって、「対象」という用語は、ヒトを指し、また非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、ならびにマウスおよびラットなどげっ歯類などであるがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物、ならびに鳥類、家禽、爬虫類、両生類などであるがこれらに限定されない非哺乳動物も指す。本開示の態様によれば、対象は、ヒトである。

【0051】

本開示の態様によれば、対象は、雄である。本開示の態様によれば、対象は、雌である。本開示の態様によれば、対象は、性別は中性である。本開示の態様によれば、対象は、未熟な新産児（ｎｅｗｂｏｒｎ）である。本開示の態様によれば、未熟な新産児は、妊娠３６週より前に生まれた新産児である。本開示の態様によれば、対象は、正期産新産児である。本開示の態様によれば、正期産新産児は、約２ヶ月齢未満である。本開示の態様によれば、対象は、新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）である。本開示の態様によれば、対象は、約１ヶ月齢未満である新生児である。本開示の態様によれば、対象は、乳児である。本開示の態様によれば、乳児は、２ヶ月～２４ヶ月齢である。本開示の態様によれば、乳児は、２ヶ月～３ヶ月齢、２ヶ月～４ヶ月齢、２ヶ月～５ヶ月齢、３ヶ月～４ヶ月齢、３ヶ月～５ヶ月齢、３ヶ月～６ヶ月齢、４ヶ月～５ヶ月齢、４ヶ月～６ヶ月齢、４ヶ月～７ヶ月齢、５ヶ月～６ヶ月齢、５ヶ月～７ヶ月齢、５ヶ月～８ヶ月齢、６ヶ月～７ヶ月齢、６ヶ月～８ヶ月齢、６ヶ月～９ヶ月齢、７ヶ月～８ヶ月齢、７ヶ月～９ヶ月齢、７ヶ月～１０ヶ月齢、８ヶ月～９ヶ月齢、８ヶ月～１０ヶ月齢、８ヶ月～１１ヶ月齢、９ヶ月～１０ヶ月齢、９ヶ月～１１ヶ月齢、９ヶ月～１２ヶ月齢、１０ヶ月～１１ヶ月齢、１０ヶ月～１２ヶ月齢、１０ヶ月～１３ヶ月齢、１１ヶ月～１２ヶ月齢、１１ヶ月～１３ヶ月齢、１１ヶ月～１４ヶ月齢、１２ヶ月～１３ヶ月齢、１２ヶ月～１４ヶ月齢、１２ヶ月～１５ヶ月齢、１３ヶ月～１４ヶ月齢、１３ヶ月～１５ヶ月齢、１３ヶ月～１６ヶ月齢、１４ヶ月～１５ヶ月齢、１４ヶ月～１６ヶ月齢、１４ヶ月～１７ヶ月齢、１５ヶ月～１６ヶ月齢、１５ヶ月～１７ヶ月齢、１５ヶ月～１８ヶ月齢、１６ヶ月～１７ヶ月齢、１６ヶ月～１８ヶ月齢、１６ヶ月～１９ヶ月齢、１７ヶ月～１８ヶ月齢、１７ヶ月～１９ヶ月齢、１７ヶ月～２０ヶ月齢、１８ヶ月～１９ヶ月齢、１８ヶ月～２０ヶ月齢、１８ヶ月～２１ヶ月齢、１９ヶ月～２０ヶ月齢、１９ヶ月～２１ヶ月齢、１９ヶ月～２２ヶ月齢、２０ヶ月～２１ヶ月齢、２０ヶ月～２２ヶ月齢、２０ヶ月～２３ヶ月齢、２１ヶ月～２２ヶ月齢、２１ヶ月～２３ヶ月齢、２１ヶ月～２４ヶ月齢、２２ヶ月～２３ヶ月齢、２２ヶ月～２４ヶ月齢、および２３ヶ月～２４ヶ月齢である。本開示の態様によれば、対象は、幼児である。本開示の態様によれば、幼児は、１歳～４歳である。本開示の態様によれば、幼児は、１歳～２歳、１歳～３歳、１歳～４歳、２歳～３歳、２歳～４歳、および３歳～４歳である。本開示の態様によれば、対象は、小児である。本開示の態様によれば、小児は、２歳～５歳である。本開示の態様によれば、小児は、２歳～３歳、２歳～４歳、２歳～５歳、３歳～４歳、３歳～５歳、および４歳～５歳である。本開示の態様によれば、対象は、子供である。本開示の態様によれば、子供は、６歳～１２歳である。本開示の態様によれば、子供は、６歳～７歳、６歳～８歳、６歳～９歳、７歳～８歳、７歳～９歳、７歳～１０歳、８歳～９歳、８歳～１０歳、８歳～１１歳、９歳～１０歳、９歳～１１歳、９歳～１２歳、１０歳～１１歳、１０歳～１２歳、および１１歳～１２歳である。本開示の態様によれば、対象は、青年である。本開示の態様によれば、青年は、１３歳～１９歳である。本開示の態様によれば、青年は、１３歳～１４歳、１３歳～１５歳、１３歳～１６歳、１４歳～１５歳、１４歳～１６歳、１４歳～１７歳、１５歳～１６歳、１５歳～１７歳、１５歳～１８歳、１６歳～１７歳、１６歳～１８歳、１６歳～１９歳、１７歳～１８歳、１７歳～１９歳、および１８歳～１９歳である。本開示の態様によれば、対象は、小児科の対象である。本開示の態様によれば、小児科の対象は、１日齢～１８歳である。本開示の態様によれば、小児科の対象は、１日齢～１歳、１日齢～２歳、１日齢～３歳、１歳～２歳、１歳～３歳、１歳～４歳、２歳～３歳、２歳～４歳、２歳～５歳、３歳～４歳、３歳～５歳、３歳～６歳、４歳～５歳、４歳～６歳、４歳～７歳、５歳～６歳、５歳～７歳、５歳～８歳、６歳～７歳、６歳～８歳、６歳～９歳、７歳～８歳、７歳～９歳、７歳～１０歳、８歳～９歳、８歳～１０歳、８歳～１１歳、９歳～１０歳、９歳～１１歳、９歳～１２歳、１０歳～１１歳、１０歳～１２歳、１０歳～１３歳、１１歳～１２歳、１１歳～１３歳、１１歳～１４歳、１２歳～１３歳、１２歳～１４歳、１２歳～１５歳、１３歳～１４歳、１３歳～１５歳、１３歳～１６歳、１４歳～１５歳、１４歳～１６歳、１４歳～１７歳、１５歳～１６歳、１５歳～１７歳、１５歳～１８歳、１６歳～１７歳、１６歳～１８歳、および１７歳～１８歳である。本開示の態様によれば、対象は、老年科の対象である。本開示の態様によれば、老年科の対象は、６５歳～９５歳、またはそれ以上の年齢である。本開示の態様によれば、老年科の対象は、６５歳～７０歳、６５歳～７５歳、６５歳～８０歳、７０歳～７５歳、７０歳～８０歳、７０歳～８５歳、７５歳～８０歳、７５歳～８５歳、７５歳～９０歳、８０歳～８５歳、８０歳～９０歳、８０歳～９５歳、８５歳～９０歳、および８５歳～９５歳である。一態様では、それを必要とする対象は、成人である。本開示の態様によれば、成人の対象は、２０歳～９５歳、またはそれ以上の年齢である。本開示の態様によれば、成人の対象は、２０歳～２５歳、２０歳～３０歳、２０歳～３５歳、２５歳～３０歳、２５歳～３５歳、２５歳～４０歳、３０歳～３５歳、３０歳～４０歳、３０歳～４５歳、３５歳～４０歳、３５歳～４５歳、３５歳～５０歳、４０歳～４５歳、４０歳～５０歳、４０歳～５５歳、４５歳～５０歳、４５歳～５５歳、４５歳～６０歳、５０歳～５５歳、５０歳～６０歳、５０歳～６５歳、５５歳～６０歳、５５歳～６５歳、５５歳～７０歳、６０歳～６５歳、６０歳～７０歳、６０歳～７５歳、６５歳～７０歳、６５歳～７５歳、６５歳～８０歳、７０歳～７５歳、７０歳～８０歳、７０歳～８５歳、７５歳～８０歳、７５歳～８５歳、７５歳～９０歳、８０歳～８５歳、８０歳～９０歳、８０歳～９５歳、８５歳～９０歳、および８５歳～９５歳である。本開示の態様によれば、対象は、１歳～５歳、２歳～１０歳、３歳～１８歳、２１歳～５０歳、２１歳～４０歳、２１歳～３０歳、５０歳～９０歳、６０歳～９０歳、７０歳～９０歳、６０歳～８０歳、または６５歳～７５歳である。本開示の態様によれば、対象は、前期高齢者の対象（６５～７４歳）である。本開示の態様によれば、対象は、中期高齢者の対象（７５～８４歳）である。本開示の態様によれば、対象は、高齢者の対象（＞８５歳）である。

【0052】

対象におけるＴＢＩの治療方法は、本開示の態様によれば、脳損傷部位の位置またはその付近でのＴＢＩの局所領域における対象への治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与を含む。

【0053】

対象におけるＴＢＩの治療方法は、本開示の態様によれば、ＴＢＩによって引き起こされるグリア瘢痕内またはその付近でのＴＢＩの局所領域における対象への治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与を含む。

【0054】

対象におけるＴＢＩの治療方法は、本開示の態様によれば、グリオーシス、特にアストログリオーシスおよび／またはミクログリオーシスの領域内またはその付近でのＴＢＩの局所領域における対象への治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与を含む。

【0055】

「グリオーシス」という用語は、「アストログリオーシス」および「ミクログリオーシス」を含み、脳のダメージに起因する、星状細胞および反応性星状細胞の増加、すなわち、アストログリオーシス、ならびにミクログリアおよび肥大性ミクログリアの増加、すなわち、ミクログリオーシスを指す。いかなる科学的理論にも制限されるものではないが、グリオーシスは、脳のダメージに応答するグリア細胞の保護反応であり、損傷区域を隔離し、死んだ細胞の破片を除去し、残りの健康な細胞を保護するなどの有益な効果を提供すると考えられている。しかしながら、グリオーシスは、神経再生を妨げ、局所微小環境で負の影響を産生し、さらなる神経変性をもたらす可能性がある。したがって、グリア細胞において外因性ＮｅｕｒｏＤ１を発現することによってグリア細胞がグリオーシスに関与するグリア細胞の機能的ニューロンへの変換は、ＴＢＩの治療において有益な転帰を提供する。本開示の態様によれば、有益な転帰の非限定的な例としては、ＴＢＩに起因して失われたニューロンを置き換えるか、または少なくとも部分的に置き換えるための機能的ニューロンの再生、反応性星状細胞の機能的ニューロンへの変換による反応性星状細胞の数の低減、それによる、グリオーシスの負の影響の調節、ＴＢＩによって引き起こされるダメージを受けた神経ネットワークの修復、およびＴＢＩによって途絶された微小環境の再バランス化が挙げられる。

【0056】

本開示の態様によれば、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、ＴＢＩの影響の改善を必要とする対象においてＴＢＩの影響を改善する。本開示の態様によれば、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、静止した星状細胞と比較して、反応性星状細胞に投与された場合に増強された効果を有する。本開示の態様によれば、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、対象におけるＴＢＩ後、３日～６０日、５日～４５日、８日～３０日とすることができる。本開示の態様によれば、投与は、対象におけるＴＢＩ後、２日～１年または１年以降とすることができる。本開示の態様によれば、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、３日～５日、３日～１０日、３日～１５日、５日～１０日、５日～１５日、５日～２０日、１０日～１５日、１０日～２０日、１０日～２５日、１５日～２０日、１５日～２５日、１５日～３０日、２０日～２５日、２０日～３０日、２０日～３５日、２５日～３０日、２５日～３５日、２５日～４０日、３０日～３５日、３０日～４０日、３０日～４５日、３５日～４０日、３５日～４５日、３５日～５０日、４０日～４５日、４０日～５０日、４０日～５５日、４５日～５０日、４５日～５５日、４５日～６０日、５０日～５５日、５０日～６０日、または５５日～６０日とすることができる。本開示の態様によれば、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、５日～１０日、５日～１５日、５日～２０日、１０日～１５日、１０日～２０日、１０日～２５日、１５日～２０日、１５日～２５日、１５日～３０日、２０日～２５日、２０日～３０日、２０日～３５日、２５日～３０日、２５日～３５日、２５日～４０日、３０日～３５日、３０日～４０日、３０日～４５日、３５日～４０日、３５日～４５日、または４０日～４５とすることができる。本開示の態様によれば、治療有効量のＮｅｕｒｏＤ１の投与は、８日～１０日、８日～１５日、８日～２０日、１０日～１５日、１０日～２０日、１０日～２５日、１５日～２０日、１５日～２５日、１５日～３０日、２０日～２５日、２０日～３０日、または２５日～３０日とすることができる。

【0057】

本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、ＴＢＩ後、約１日～約１０日の範囲の第１の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、少なくとも１つの反応性星状細胞に、１日～２日、１日～３日、１日～４日、２日～３日、２日～４日、２日～５日、３日～４日、３日～５日、３日～６日、４日～５日、４日～６日、４日～７日、５日～６日、５日～７日、５日～８日、６日～７日、６日～８日、６日～９日、７日～８日、７日～９日、７日～１０日、８日～９日、８日～１０日、または９日～１０日提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、１日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、２日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、３日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、４日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、５日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、６日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、７日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、８日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、９日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、ＴＢＩ後、１０日の治療時間において少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。

【0058】

本開示の態様によれば、ＴＢＩは、ダメージ領域においてアストログリオーシスの期間を引き起こし、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することは、アストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第１の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、第１の治療時間後で、かつアストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第２の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。本開示の態様によれば、外因性ＮｅｕｒｏＤ１は、第２の治療時間後で、かつアストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第３の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に提供される。アストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の、外因性ＮｅｕｒｏＤ１の投与を含む、第３の治療後の第４の治療時間における第４の治療、第４の治療後の第５の治療時間における第５の治療、同様に第６、第７、第８、第９、および第１０、またはそれ以上の治療などの、４つ以上の治療が、任意選択的に提供される。

【0059】

対象におけるＴＢＩを治療する療法の組み合わせは、本開示の態様に従って投与される。

【0060】

特定の態様によれば、ＴＢＩの治療を必要とする個々の対象におけるＴＢＩを治療するために対象に投与される追加の薬学的薬剤または治療的処置は、頭蓋骨骨折の修復、血栓の除去、頭蓋骨内の圧力の軽減、１つ以上の抗炎症剤の投与、１つ以上の抗不安剤の投与、および１つ以上の抗凝固剤の投与、１つ以上の抗けいれん剤の投与、１つ以上の抗うつ薬の投与、１つ以上の筋弛緩剤の投与、理学療法、言語療法、および認知療法などの治療を含むが、これらに限定されない。

【0061】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１治療は、医学的検査によって診断および／または評価されるようなＴＢＩを有する対象に投与される。本明細書で使用される場合、「医学的検査」という用語は、神経学的検査および身体的検査を含む、推定ＴＢＩについて対象を診断または評価するのに有効な対象の任意の検査を指す。

【0062】

本開示の態様によれば、医学的検査は、画像化技法および／または電気生理学的技法を含み、ＮｅｕｒｏＤ１治療は、画像化技法および／または電気生理学的技法によって診断および／または評価されるようなＴＢＩを有する対象に投与される。

【0063】

脳波記録法（ＥＥＧ）などの電気生理学的技法を使用して、ＴＢＩに起因するニューロンの細胞死または損傷によって引き起こされる神経発火の機能的変化を評価することができる。

【0064】

磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ｆＭＲＩ、近赤外線分光法、位置放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、および超音波などの画像化技法を使用して、ＴＢＩに起因するニューロンの細胞死または損傷によって引き起こされる構造的および／または機能的変化を評価することができる。

【0065】

本開示の態様によれば、ＴＢＩに起因する非機能的ニューロンの存在は、ｆＭＲＩなどの機能アッセイによって検出される。

【0066】

「ｆＭＲＩ」という用語は、関連する血流の変化を検出することによって脳活動を検出し、測定する画像化手順である機能的磁気共鳴画像法を指す。

【0067】

医学的検査の方法は、対象におけるＴＢＩを診断および／または評価するために、単独で、または任意の組み合わせで使用され得る。

【0068】

さらに、対象におけるＴＢＩのＮｅｕｒｏＤ１治療の有効性を評価するために、医学的検査方法を単独で、または任意の組み合わせで使用し得る。

【0069】

本開示の態様によれば、対象のＮｅｕｒｏＤ１治療は、治療の進行および／または最終転帰を監視するために治療中または治療後に監視される。順調な機能的ニューロン統合および組織微小環境の回復のための治療後のアッセイは、正常な電気生理学、脳組織構造、およびニューロン機能の回復またはほぼ回復によって診断される。ニューロン機能をアッセイするための非侵襲的方法としては、ＥＥＧが挙げられる。ニューロン機能は、近赤外線分光法およびｆＭＲＩを介して非侵襲的にアッセイされ得る。

【0070】

脳組織構造をアッセイするための非侵襲的方法には、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン、または超音波が含まれる。

【0071】

行動アッセイは、ＴＢＩ後の脳機能の回復のための非侵襲的にアッセイするために使用され得る。行動アッセイは、ＴＢＩによって引き起こされる機能の喪失と一致する必要がある。例えば、ＴＢＩが麻痺を引き起こした場合、患者の可動性および四肢の器用さを試験する必要がある。ＴＢＩが発話の喪失または緩慢を引き起こした場合、話し言葉を介した患者のコミュニケーション能力をアッセイする必要がある。ＮｅｕｒｏＤ１治療後の正常な挙動の回復は、効果的なニューロン回路の作製および統合に成功したことを示す。これらの方法を、単独でまたは任意の組み合わせで使用して、ニューロン機能および脳組織の健康についてアッセイし得る。ＮｅｕｒｏＤ１での治療を評価するためのアッセイは、ＮｅｕｒｏＤ１治療の１日後、２日後、３日後、１週間後、２週間後、３週間後、１ヶ月後、またはそれ以降などの任意の時点で実施され得る。かかるアッセイは、必要に応じてベースライン比較を確立するために、ＮｅｕｒｏＤ１治療の前に実施され得る。

【0072】

本開示による特定の態様では、ＮｅｕｒｏＤ１は、対象が未治療であるか、またはグリア瘢痕が既に存在する場合、グリア瘢痕が発生する損傷部位の周辺に投与される。グリア瘢痕の位置は、組織の構造または機能をアッセイすることによって決定され得る。上述のように、ＴＢＩによって引き起こされる構造的および／または機能的変化をアッセイするための非侵襲的方法としては、ＭＲＩ、ｆＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、または超音波が挙げられる。機能アッセイには、ＥＥＧ記録および／またはｆＭＲＩが含まれ得る。

【0073】

本開示による特定の態様では、ＮｅｕｒｏＤ１は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含有する発現ベクターとして投与される。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含有する発現ベクターは、注射によって対象の脳内へ送達される。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含有する発現ベクターは、定位注射によって対象の脳内へ送達される。

【0074】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むウイルスベクターは、対象の中枢または末梢神経組織への注射によって送達される。本開示の態様によれば、中枢または末梢神経組織への注射は、脳内注射、脊髄注射、脳脊髄液への注射、および末梢神経節への注射からなる群から選択される。代替的なウイルス送達方法としては、静脈内注射、鼻腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、および腹腔内注射が挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むウイルスベクターは、対象の脳内への注射によって送達される。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むウイルスベクターは、対象の脳内への定位注射によって送達される。

【0076】

神経学的状態の治療を必要とする対象における神経学的状態を治療するための方法および組成物は、本開示の態様に従って提供され、それらの方法および組成物は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むウイルスベクターを提供することと、ウイルスベクターを対象の脳に送達し、それによって、ウイルスベクターが、脳のグリア細胞に感染して感染したグリア細胞を産生し、そしてそれによって、外因性ＮｅｕｒｏＤ１が、治療有効レベルで感染したグリア細胞において発現されることとを含み、感染した細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１の発現は、ＴＢＩを有する未治療の対象と比較して、ＴＢＩを有する対象におけるより多くの数の機能的ニューロンをもたらし、それによってＴＢＩが治療される。新たな機能的ニューロンの生成に加えて、反応性グリア細胞の数が低減し、放出される神経阻害因子の減少、神経炎症の減少、均一にも分布するより多くの血管をもたらし、それによって、局所環境がニューロン成長または軸索浸透に対してより寛容になり、したがって、ＴＢＩの少なくとも１つの徴候および／または症状が緩和される。

【0077】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本開示の態様による方法において特に有用であり、注射部位で分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する。ＡＡＶは、パルボウイルス科ファミリーのｓｓＤＮＡ動物ウイルスの遍在的で、非細胞障害性で、複製能のないメンバーである。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」は、ＤＮＡベクター構築物とともにパッケージ化されたＡＡＶを指す。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター血清型１、ＡＡＶベクター血清型２、ＡＡＶベクター血清型３、ＡＡＶベクター血清型４、ＡＡＶベクター血清型５、ＡＡＶベクター血清型６、ＡＡＶベクター血清型７、ＡＡＶベクター血清型８、ＡＡＶベクター血清型９、ＡＡＶベクター血清型１０、ＡＡＶベクター血清型１１、およびＡＡＶベクター血清型１２からなる群から選択される。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型５、およびＡＡＶ血清型９からなる群から選択される。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型１である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型２である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型３である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型４である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型５である。一態様において、本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型６である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型７である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型８である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型１０である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型１１である。本開示の態様によれば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型１２である。

【0078】

「ＦＬＥＸ」スイッチアプローチを使用して、本開示の態様に従って、感染細胞においてＮｅｕｒｏＤ１を発現する。「ＦＬＥＸ」および「フリップ切除（ｆｌｉｐ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ）」という用語は、２対の異型で反平行のｌｏｘＰ型組換え部位が、逆向きＮｅｕｒｏＤ１コード配列のいずれかの側に配置され、それは最初にコード配列の反転を受け、続いて２つの部位の切除を受け、各直交組換え部位のうちの１つが反対方向に向けられ、さらなる組換えを行うことができず、安定した反転を達成する方法を示すために互換的に使用され、例えば、Ｓｃｈｎｕｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：５６２－５６５，２００３、およびＡｔａｓｏｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２８：７０２５－７０３０，２００８を参照されたい。グリア細胞特異的プロモーターの制御下にある部位特異的組換え酵素は、反応性星状細胞を含むグリア細胞において強く発現されるため、ＮｅｕｒｏＤ１は、反応性星状細胞を含むグリア細胞においても発現されるだろう。次いで、ＮｅｕｒｏＤ１の前の終止コドンが組換えから除去されるとき、構成的またはニューロン特異的プロモーターは、ＮｅｕｒｏＤ１の高発現を駆動し、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換できるようにする。

【0079】

本開示の特定の態様によれば、１）ＧＦＡＰまたはＳ１００ｂまたはＡｌｄｈ１Ｌ１などの星状細胞特異的プロモーターの転写制御下にある部位特異的組換え酵素をコードするＤＮＡ配列を含むアデノ随伴ウイルス発現ベクター、および２）遍在的（構成的）プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターの転写制御下にあるＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列を含むアデノ随伴ウイルス発現ベクターの投与によって、ＮｅｕｒｏＤ１の投与を必要とする対象へＮｅｕｒｏＤ１が投与され、部位特異的組換え酵素がＮｅｕｒｏＤ１をコードする逆向きＤＮＡ配列を逆向きにすることによってＮｅｕｒｏＤ１の発現が可能になるまで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列は、逆向きであり、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に対して誤った方向である。

【0080】

部位特異的組換え酵素およびそれらの認識部位には、例えば、認識部位ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２２７２部位、もしくはＦＬＰ－ＦＲＴ組換え、またはそれらの組み合わせとともに、Ｃｒｅ組換え酵素が含まれる。

【0081】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」という用語は、その核酸ゲノムを細胞に伝達するＡＡＶウイルスのパッケージ化されたキャプシド形態を指す。

【0082】

最適な感染を達成するために、１０^１０～１０^１４個のＡＡＶ粒子／ｍｌの濃度、１～１０００μｌの体積を、０．１～５．０μｌ／分の制御された流速で注射する。本開示の態様によれば、１０^１０個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１１個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１０個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１２個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１０個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１３個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１１個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１２個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１１個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１３個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１１個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１４個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１２個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１３個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、１０^１２個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１４個のＡＡＶ粒子／ｍＬ、または１０^１３個のＡＡＶ粒子／ｍＬ～１０^１４個のＡＡＶ粒子／ｍＬの濃度が注射される。本開示の態様によれば、ＡＡＶ粒子は、１μＬ～１００μＬ、１μＬ～２００μＬ、１μＬ～３００μＬ、１００μＬ～２００μＬ、１００μＬ～３００μＬ、１００μＬ～４００μＬ、２００μＬ～３００μＬ、２００μＬ～４００μＬ、２００μＬ～５００μＬ、３００μＬ～４００μＬ、３００μＬ～５００μＬ、３００μＬ～６００μＬ、４００μＬ～５００μＬ、４００μＬ～６００μＬ、４００ｕＬ～７００μＬ、５００μＬ～６００μＬ、５００μＬ～７００μＬ、５００μＬ～８００μＬ、６００μＬ～７００μＬ、６００μＬ～８００μＬ、６００μＬ～９００μＬ、７００μＬ～８００μＬ、７００μＬ～９００μＬ、７００μＬ～１０００μＬ、８００μＬ～９００μＬ、８００μＬ～１０００μＬ、または９００μＬ～１０００μＬの体積で注射される。本開示の態様によれば、流速は、０．１μＬ／分～０．２μＬ／分、０．１μＬ／分～０．３μＬ／分、０．１μＬ／分～０．４μＬ／分、０．２μＬ／分～０．３μＬ／分、０．２μＬ／分～０．４μＬ／分、０．２μＬ／分～０．５μＬ／分、０．３μＬ／分～０．４μＬ／分、０．３μＬ／分～０．５μＬ／分、０．３μＬ／分～０．６μＬ／分、０．４μＬ／分～０．５μＬ／分、０．４μＬ／分～０．６μＬ／分、０．４μＬ／分～０．７μＬ／分、０．５μＬ／分～０．６μＬ／分、０．５μＬ／分～０．７μＬ／分、０．５μＬ／分～０．８μＬ／分、０．６μＬ／分～０．７μＬ／分、０．６μＬ／分～０．８μＬ／分、０．６μＬ／分～０．９μＬ／分、０．７μＬ／分～０．８μＬ／分、０．７μＬ／分～０．９μＬ／分、０．７μＬ／分～１．０μＬ／分、０．８μＬ／分～０．９μＬ／分、０．８μＬ／分～１．０μＬ／分、０．８μＬ／分～１．１μＬ／分、０．９μＬ／分～１．０μＬ／分、０．９μＬ／分～１．１μＬ／分、０．９μＬ／分～１．２μＬ／分、１．０μＬ／分～１．１μＬ／分、１．０μＬ／分～１．２μＬ／分、１．０μＬ／分～１．３μＬ／分、１．１μＬ／分～１．２μＬ／分、１．１μＬ／分～１．３μＬ／分、１．１μＬ／分～１．４μＬ／分、１．２μＬ／分～１．３μＬ／分、１．２μＬ／分～１．４μＬ／分、１．２μＬ／分～１．５μＬ／分、１．３μＬ／分～１．４μＬ／分、１．３μＬ／分～１．５μＬ／分、１．３μＬ／分～１．６μＬ／分、１．４μＬ／分～１．５μＬ／分、１．４μＬ／分～１．６μＬ／分、１．４μＬ／分～１．７μＬ／分、１．５μＬ／分～１．６μＬ／分、１．５μＬ／分～１．７μＬ／分、１．５μＬ／分～１．８μＬ／分、１．６μＬ／分～１．７μＬ／分、１．６μＬ／分～１．８μＬ／分、１．６μＬ／分～１．９μＬ／分、１．７μＬ／分～１．８μＬ／分、１．７μＬ／分～１．９μＬ／分、１．７μＬ／分～２．０μＬ／分、１．８μＬ／分～１．９μＬ／分、１．８μＬ／分～２．０μＬ／分、１．８μＬ／分～２．１μＬ／分、１．９μＬ／分～２．０μＬ／分、１．９μＬ／分～２．１μＬ／分、１．９μＬ／分～２．２μＬ／分、２．０μＬ／分～２．１μＬ／分、２．０μＬ／分～２．２μＬ／分、２．０μＬ／分～２．３μＬ／分、２．１μＬ／分～２．２μＬ／分、２．１μＬ／分～２．３μＬ／分、２．１μＬ／分～２．４μＬ／分、２．２μＬ／分～２．３μＬ／分、２．２μＬ／分～２．４μＬ／分、２．２μＬ／分～２．５μＬ／分、２．３μＬ／分～２．４μＬ／分、２．３μＬ／分～２．５μＬ／分、２．３μＬ／分～２．６μＬ／分、２．４μＬ／分～２．５μＬ／分、２．４μＬ／分～２．６μＬ／分、２．４μＬ／分～２．７μＬ／分、２．５μＬ／分～２．６μＬ／分、２．５μＬ／分～２．７μＬ／分、２．５μＬ／分～２．８μＬ／分、２．６μＬ／分～２．７μＬ／分、２．６μＬ／分～２．８μＬ／分、２．６μＬ／分～２．９μＬ／分、２．７μＬ／分～２．８μＬ／分、２．７μＬ／分～２．９μＬ／分、２．７μＬ／分～３．０μＬ／分、２．８μＬ／分～２．９μＬ／分、２．８μＬ／分～３．０μＬ／分、２．８μＬ／分～３．１μＬ／分、２．９μＬ／分～３．０μＬ／分、２．９μＬ／分～３．１μＬ／分、２．９μＬ／分～３．２μＬ／分、３．０μＬ／分～３．１μＬ／分、３．０μＬ／分～３．２μＬ／分、３．０μＬ／分～３．３μＬ／分、３．１μＬ／分～３．２μＬ／分、３．１μＬ／分～３．３μＬ／分、３．１μＬ／分～３．４μＬ／分、３．２μＬ／分～３．３μＬ／分、３．２μＬ／分～３．４μＬ／分、３．２μＬ／分～３．５μＬ／分、３．３μＬ／分～３．４μＬ／分、３．３μＬ／分～３．５μＬ／分、３．３μＬ／分～３．６μＬ／分、３．４μＬ／分～３．５μＬ／分、３．４μＬ／分～３．６μＬ／分、３．４μＬ／分～３．７μＬ／分、３．５μＬ／分～３．６μＬ／分、３．５μＬ／分～３．７μＬ／分、３．５μＬ／分～３．８μＬ／分、３．６μＬ／分～３．７μＬ／分、３．６μＬ／分～３．８μＬ／分、３．６μＬ／分～３．９μＬ／分、３．７μＬ／分～３．８μＬ／分、３．７μＬ／分～３．９μＬ／分、３．７μＬ／分～４．０μＬ／分、３．８μＬ／分～３．９μＬ／分、３．８μＬ／分～４．０μＬ／分、３．８μＬ／分～４．１μＬ／分、３．９μＬ／分～４．０μＬ／分、３．９μＬ／分～４．１μＬ／分、３．９μＬ／分～４．２μＬ／分、４．０μＬ／分～４．１μＬ／分、４．０μＬ／分～４．２μＬ／分、４．０μＬ／分～４．３μＬ／分、４．１μＬ／分～４．２μＬ／分、４．１μＬ／分～４．３μＬ／分、４．１μＬ／分～４．４μＬ／分、４．２μＬ／分～４．３μＬ／分、４．２μＬ／分～４．４μＬ／分、４．２μＬ／分～４．５μＬ／分、４．３μＬ／分～４．４μＬ／分、４．３μＬ／分～４．５μＬ／分、４．３μＬ／分～４．６μＬ／分、４．４μＬ／分～４．５μＬ／分、４．４μＬ／分～４．６μＬ／分、４．４μＬ／分～４．７μＬ／分、４．５μＬ／分～４．６μＬ／分、４．５μＬ／分～４．７μＬ／分、４．５μＬ／分～４．８μＬ／分、４．６μＬ／分～４．７μＬ／分、４．６μＬ／分～４．８μＬ／分、４．６μＬ／分～４．９μＬ／分、４．７μＬ／分～４．８μＬ／分、４．７μＬ／分～４．９μＬ／分、４．７μＬ／分～５．０μＬ／分、４．８μＬ／分～４．９μＬ／分、４．８μＬ／分～５．０μＬ／分、または４．９μＬ／分～５．０μＬ／分である。

【0083】

本開示の態様によれば、遍在的（構成的）プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターの転写制御下にあるＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むＡＡＶベクターは、部位特異的組換え酵素がＮｅｕｒｏＤ１をコードする逆向きＤＮＡ配列を逆向きにすることによってＮｅｕｒｏＤ１の発現が可能になるまで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列は、逆向きであり、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に対して誤った方向であり、さらに部位特異的組換え酵素による組換え酵素活性のための部位を含み、部位特異的組換え酵素をコードするＡＡＶとともに、対象の脳内への定位注射によって送達される。

【0084】

本開示の態様によれば、遍在的（構成的）プロモーターまたはニューロン特異的プロモーターの転写制御下にあるＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含むＡＡＶベクターは、部位特異的組換え酵素がＮｅｕｒｏＤ１をコードする逆向きＤＮＡ配列を逆向きにすることによってＮｅｕｒｏＤ１の発現が可能になるまで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列は、逆向きであり、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に対して誤った方向であり、さらに部位特異的組換え酵素による組換え酵素活性のための部位を含み、本開示の態様に従って、中枢神経系（ＣＮＳ）の正常な血流の途絶の領域または部位において、部位特異的組換え酵素をコードするアデノ随伴ウイルスとともに、対象の脳内への定位注射によって送達される。任意選択的に、定位注射の部位は、ＣＮＳにおける正常な血流の途絶によって引き起こされるグリア瘢痕内またはその近くである。

【0085】

本開示の態様によれば、組成物は、部位特異的組換え酵素をコードする核酸に作動可能に連結したグリア細胞特異的プロモーターを含む第１の組換え発現ベクターと、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列、レポーター遺伝子をコードする核酸配列、エンハンサー、および調節要素に作動可能に連結したプロモーターを含む第２の組換え発現ベクターとを含む。

【0086】

本開示の態様によれば、組成物は、部位特異的組換え酵素をコードする核酸に作動可能に連結したグリア細胞特異的プロモーターを含む第１の組換えＡＡＶ発現ベクターと、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列、レポーター遺伝子をコードする核酸配列、エンハンサー、および調節要素に作動可能に連結したプロモーターを含む第２の組換えＡＡＶ発現ベクターとを含む。

【0087】

本開示の態様によれば、部位特異的組換え酵素は、Ｃｒｅ組換え酵素であり、組換え酵素活性のための部位は、認識部位ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２２７２部位である。

【0088】

「ＮｅｕｒｏＤ１」という用語は、配列番号２として、ここで同定されるヒトＮｅｕｒｏＤ１タンパク質、および配列番号４として、ここで同定されるマウスＮｅｕｒｏＤ１タンパク質を包含する。配列番号２および配列番号４のＮｅｕｒｏＤ１タンパク質に加えて、「ＮｅｕｒｏＤ１」という用語は、本開示の方法および組成物に含まれ得る、配列番号２および配列番号４のバリアントなどのＮｅｕｒｏＤ１タンパク質のバリアントを包含する。本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、天然に生じる遺伝的バリエーションおよび組換え調製されたバリエーションを指し、その各々は、例えば、配列番号２または配列番号４などの参照ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質と比較して、そのアミノ酸配列の１つ以上の変化を含有し、バリアントは、参照タンパク質の機能的特性を保持する。かかる変化には、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換、付加または欠失によって修飾されているものが含まれる。「バリアント」という用語は、例えば、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、トリ、家禽、ならびにマウスおよびラットを含むがこれらに限定されないげっ歯類由来のＮｅｕｒｏＤ１オーソログなどの、しかしこれらに限定されない、哺乳動物およびトリＮｅｕｒｏＤ１を含むヒトＮｅｕｒｏＤ１オーソログを包含する。非限定的な例では、アミノ酸配列番号４として本明細書に例示されるマウスＮｅｕｒｏＤ１は、ヒトＮｅｕｒｏＤ１のオーソログである。

【0089】

好ましいバリアントは、配列番号２または配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、バリアントは、参照タンパク質の機能的特性を保持する。

【0090】

変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準的な分子生物学的技法を使用して導入することができる。当業者は、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の機能的特性を変化させることなく、１つ以上のアミノ酸変異を導入することができることを認識するであろう。例えば、配列番号２または４のＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の機能的特性を変化させることなく、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を行うことができる。

【0091】

ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質バリアントを産生するために保存的アミノ酸置換をＮｅｕｒｏＤ１タンパク質において行うことができ、バリアントは、参照タンパク質の機能的特性を保持する。保存的アミノ酸置換は、同様の特徴を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の当該技術分野で認められた置換である。例えば、各アミノ酸は、以下の、正電荷、負電荷、脂肪族、芳香族、極性、疎水性、および親水性の特徴のうちの１つ以上を有すると説明され得る。保存的置換は、同じ特徴を有する別のアミノ酸に対する特定の構造的または機能的特徴を有する１つのアミノ酸の置換である。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、塩基性アミノ酸には、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが含まれ、脂肪族アミノ酸には、イソロイシン、ロイシン、およびバリンが含まれ、芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、グリシン、チロシン、およびトリプトファンが含まれ、極性アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、およびチロシンが含まれ、疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、およびトリプトファンが含まれ、保存的置換には、各群内のアミノ酸間の置換が含まれる。アミノ酸はまた、相対サイズの観点から記載されてもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸塩、グリシン、アスパラギン、プロリン、スレオニン、セリン、バリンは、すべて典型的には小さいとみなされる。

【0092】

ＮｅｕｒｏＤ１バリアントは、合成アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体、および／または非標準アミノ酸を含むことができ、例示的に、α－アミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシ－フェニルアラニン、ジエンコル酸、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、３－ホスホセリン、ホモセリン、５－ヒドロキシトリプトファン、１－メチルヒスチジン、３－メチルヒスチジン、およびオルニチンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0093】

２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するために、配列が最適な比較の目的のためにアライメントされる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適アライメントのために第１のアミノ酸の配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性のパーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性の％＝同一の重複した位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。

【0094】

２つの配列間の同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，ＰＮＡＳ．９０：５８７３ ５８７７のように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，ＰＮＡＳ ８７：２２６４ ２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本開示の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２にセットされたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索が実施される。

【0095】

本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、スコア＝５０、ワード長＝３にセットされたＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が実施される。比較の目的のためのギャップ付きのアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ３４０２に記載のギャップ付きＢＬＡＳＴを利用する。代替的に、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施する。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）既定値パラメータが使用される（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。

【0096】

配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１ １７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用される。

【0097】

２つの配列間の同一性のパーセントは、ギャップを許容してまたはギャップを許容することなく、上述の技法と同様の技法を使用して決定される。同一性のパーセントを計算では、典型的には、正確な一致のみが計数される。

【0098】

「ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質」という用語は、本開示の方法および組成物において作動可能な、配列番号２および４の断片などのＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の断片、ならびにそれらのバリアントを包含する。

【0099】

ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質および核酸は、ＮｅｕｒｏＤ１を発現する生物の脳または細胞株の細胞などの天然供給源から単離され得る。代替的に、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質または核酸は、発現構築物を使用した発現などによって、インビトロまたはインビボで組み換えて生成され得る。ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質および核酸はまた、周知の方法によって合成され得る。

【0100】

本開示の方法および組成物に含まれるＮｅｕｒｏＤ１は、好ましくは、組換え核酸技術を使用して産生される。組換えＮｅｕｒｏＤ１の産生は、インビトロまたはインビボで、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などの核酸配列を包含する組換え発現ベクターを宿主細胞内に導入することを含む。

【0101】

ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を、宿主細胞に導入して、配列番号２、配列番号４、またはそのバリアントをコードする本開示の実施形態によるＮｅｕｒｏＤ１を産生する。

【0102】

本開示の態様によれば、配列番号１として本明細書で同定される核酸配列は、配列番号２をコードし、発現ベクターに含まれ、発現してＮｅｕｒｏＤ１を産生する。本開示の態様によれば、配列番号３として本明細書で同定される核酸配列は、配列番号４をコードし、発現ベクターに含まれ、発現してＮｅｕｒｏＤ１を産生する。

【0103】

遺伝子コードの縮重性質に起因して、配列番号１および３と実質的に同一の核酸配列は、ＮｅｕｒｏＤ１およびＮｅｕｒｏＤ１のバリアントをコードし、かかる代替の核酸は、発現ベクターに含まれてもよく、発現してＮｅｕｒｏＤ１およびＮｅｕｒｏＤ１のバリアントを産生し得ることが理解される。当業者は、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質の断片を産生するために、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードする核酸の断片を使用することができることを理解するであろう。

【0104】

「発現ベクター」という用語は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を、インビトロまたはインビボで宿主細胞に導入するための組換えビヒクルを指し、核酸は発現されて、ＮｅｕｒｏＤ１を産生する。

【0105】

本開示の態様によれば、配列番号１もしくは３、または配列番号２もしくは配列番号４またはそれらのバリアントをコードする実質的に同一の核酸配列を含む発現ベクターを発現して、インビトロまたはインビボで発現ベクターを含有する細胞においてＮｅｕｒｏＤ１を産生する。「組換え」という用語は、２つ以上の核酸が連結されており、かつ天然では連結して見出されない核酸構築物を示すために使用される。発現ベクターには、プラスミド、ウイルス、ＢＡＣおよびＹＡＣが含まれるが、これらに限定されない。特定のウイルス発現ベクターとしては、例示的に、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスに由来するものが挙げられる。

【0106】

発現ベクターは、目的のポリペプチドをコードするセグメントの転写を提供する１つ以上の調節要素に作動可能に連結した目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む核酸を含有する。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、第２の核酸と機能的関係にある核酸を指す。「作動可能に連結した」という用語は、転写される核酸および調節要素などの２つ以上の核酸分子の機能的連結を包含する。本明細書で使用される場合、「調節要素」という用語は、作動可能に連結した核酸の発現のいくつかの態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例示的な調節要素としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または２Ａドメインなどであるがこれらに限定されないエンハンサー、イントロン、複製起点、ポリアデニル化シグナル（ＰＡ）、プロモーター、転写終結配列、および上流調節ドメインが挙げられ、これらは、作動可能に連結した核酸配列の複製、転写、転写後プロセシングに寄与する。当業者であれば、日常的な実験のみで、発現ベクターにおいて、これらおよび他の調節要素を選択および使用することができる。

【0107】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列などの転写される核酸配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、概して、転写される核酸配列の上流に位置付けられ、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。特定の実施形態では、プロモーターは、概して、所望の分子を産生するために転写される核酸配列の上流に配置され、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

【0108】

当業者によって認識されるように、遺伝子の５’非コード領域を単離し、作動可能に連結した核酸の発現を駆動するために、その全体をプロモーターとして使用することができる。代替的に、５’非コード領域の一部分を単離し、作動可能に連結した核酸の発現を駆動するために使用することができる。概して、作動可能に連結した核酸の発現を駆動するために、遺伝子の５’非コード領域の約５００～６０００ｂｐを使用する。任意選択的に、作動可能に連結した核酸の発現を駆動するのに必要な最小量の５’非コード領域を含有する遺伝子の５’非コード領域の一部分を使用する。遺伝子の５’非コード領域の指定された部分の、作動可能に連結した核酸の発現を駆動する能力を決定するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。

【0109】

本開示の方法によるＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、インビトロまたはインビボで、発現ベクターが移入される多くの、ほとんどの、またはすべての細胞型における発現を駆動する「遍在的」または「構成的」プロモーターである。ＮｅｕｒｏＤ１の発現に使用することができる遍在的プロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルスプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ベータアクチンプロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース調節タンパク質７８プロモーター、グルコース調節タンパク質９４プロモーター、熱ショックタンパク質７０プロモーター、ベータキネシンプロモーター、ＲＯＳＡプロモーター、ユビキチンＢプロモーター、真核生物開始因子４Ａ１プロモーター、および伸長因子Ｉプロモーターであり、これらはすべて当該技術分野で周知であり、日常的な方法論を使用して一次供給源から単離することができるか、または商業的供給源から得ることができる。プロモーターは、単一の遺伝子に完全に由来することができるか、または２つ以上の遺伝子に由来する部分を有するキメラとすることができる。

【0110】

調節配列の組み合わせは、発現ベクターに含まれ得、ＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用され得る。ＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するための発現ベクターに含まれる非限定的な例は、サイトメガロウイルスＣＭＶ初期エンハンサー要素、ニワトリベータアクチンプロモーター、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを組み合わせたＣＡＧプロモーターである。

【0111】

本明細書に記載の方法によるＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、グリア細胞、特に星状細胞および／またはＮＧ２細胞において優先的に発現を駆動するものである。かかるプロモーターは、「星状細胞特異的」および／または「ＮＧ２細胞特異的」プロモーターと称される。

【0112】

星状細胞特異的プロモーターの非限定的な例は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＬ１（Ａｌｄｈ１Ｌ１）プロモーターである。ヒトＧＦＡＰプロモーターは、配列番号６として本明細書に示されている。マウスＡｌｄｈ１Ｌ１プロモーターは、配列番号７として本明細書に示されている。

【0113】

ＮＧ２細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、ニューロングリア抗原２（ＮＧ２）としても既知であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４遺伝子のプロモーターである。ヒトＮＧ２プロモーターは、配列番号８として本明細書に示されている。

【0114】

本明細書に記載の方法によるＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、反応性グリア細胞において優先的に発現を駆動するものである。反応性グリア細胞の非限定的な例としては、反応性星状細胞および反応性ＮＧ２細胞が挙げられる。本開示の態様によれば、反応性グリア細胞は、反応性星状細胞である。本開示の態様によれば、反応性グリア細胞は、反応性ＮＧ２細胞である。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、「反応性星状細胞特異的」プロモーターと称される。本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、「反応性ＮＧ２細胞特異的」プロモーターと称される。「反応性星状細胞特異的」プロモーターの非限定的な例は、リポカリン２（ｌｃｎ２）遺伝子のプロモーターである。マウスｌｃｎ２プロモーターは、配列番号５として本明細書に示されている。

【0115】

遍在的および細胞型特異的プロモーターの相同体およびバリアントを、ＮｅｕｒｏＤ１の発現に使用し得る。

【0116】

本開示によるＮｅｕｒｏＤ１を発現するための発現ベクターに、プロモーター相同体およびプロモーターバリアントを含むことができる。「プロモーター相同体」および「プロモーターバリアント」という用語は、本明細書に開示されるものと比較して、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする作動可能に連結した核酸上でＮｅｕｒｏＤ１の細胞型特異的発現、またはＮｅｕｒｏＤ１の遍在的発現など、所望の型の発現を付与するために実質的に同様の機能的特性を有するプロモーターを指す。例えば、プロモーター相同体またはバリアントは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００ｂ、Ａｌｄｈ１Ｌ１、ＮＧ２、ｌｃｎ２およびＣＡＧプロモーターと比較して、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする作動可能に連結した核酸に対して細胞型特異的発現を付与するための実質的に同様の機能的特性を有する。

【0117】

当業者は、所与のプロモーターの機能的特性を変更することなく、１つ以上の核酸変異を導入することができることを認識するであろう。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準の分子生物学の技法を使用して導入されて、プロモーターバリアントを産生することができる。本明細書で使用される場合、「プロモーターバリアント」という用語は、単離された天然に生じるか、またはＧＦＡＰ、Ｓ１００ｂ、Ａｌｄｈ１Ｌ１、ＮＧ２、ｌｃｎ２、およびｐＣＡＧプロモーターなどであるがこれらに限定されない、参照プロモーターの組換え調製されたバリエーションのいずれかを指す。

【0118】

他の種由来のプロモーターが機能的であることが当該技術分野で既知であり、例えば、マウスＡｌｄｈ１Ｌ１プロモーターは、ヒト細胞において機能的である。他の種由来の相同体および相同プロモーターは、当該技術分野で既知のバイオインフォマティクスツールを使用して同定することができ、例えば、Ｘｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ６：Ｒ７２、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ３３：Ｄ１０３－１０７、およびＨａｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００３ ３１：３５５４－３５５９を参照されたい。

【0119】

構造的に、ＮｅｕｒｏＤ１の細胞型特異的プロモーターおよび／または遍在的プロモーターの相同体およびバリアントは、参照の発達的に調節された、および／または遍在的プロモーターと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の核酸配列同一性を有し、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、および任意選択的に、転写因子のための１つ以上の結合部位を含む。

【0120】

配列番号１または配列番号３と実質的に同一である核酸配列は、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１または配列番号３にハイブリダイゼーション可能な相補的な核酸配列を有するとして特徴付けられる。

【0121】

ＮｅｕｒｏＤ１をコードする１つ以上の核酸に加えて、追加のタンパク質をコードする１つ以上の核酸配列が、発現ベクターに含まれ得る。例えば、かかる追加のタンパク質には、ベータガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、および抗生物質耐性レポーターを含むが、これらに限定されない、レポーターなどの非ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質が含まれる。

【0122】

本開示の態様によれば、組換え発現ベクターは、少なくとも配列番号２のＮｅｕｒｏＤ１、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質、または配列番号１と実質的に同一の核酸配列によってコードされるタンパク質をコードする。

【0123】

本開示の態様によれば、組換え発現ベクターは、少なくとも配列番号４のＮｅｕｒｏＤ１、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質、または配列番号２と実質的に同一の核酸配列によってコードされるタンパク質をコードする。

【0124】

任意選択的に、レポーター遺伝子は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする組換え発現ベクターに含まれる。レポーター遺伝子は、組換え発現ベクターからのＮｅｕｒｏＤ１の発現のための代理マーカーとして機能するペプチドまたはタンパク質を産生するために含まれ得る。本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」という用語は、発現した場合、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導性マーカー、および／またはリガンド結合アッセイによって容易に検出可能な遺伝子を指す。例示的なレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ＭｍＧＦＰ（Ｚｅｒｎｉｃｋａ－Ｇｏｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２４：１１３３－１１３７，１９９７、ｄｓＲｅｄ、ルシフェラーゼ、およびベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）が挙げられるが、これらに限定されない。ｍＣｈｅｒｒｙは、本開示の態様によるレポーターとして使用されるｄｓＲｅｄに由来する単量体赤色蛍光タンパク質である。

【0125】

本開示の態様によれば、配列番号９は、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸に作動可能に連結したＣＡＧプロモーター、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする核酸配列、エンハンサー、ウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）およびａを含む核酸の例である。ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸およびＥＧＦＰをコードする核酸を分離するＩＲＥＳ。

【0126】

本開示の態様によれば、配列番号９は、ＮｅｕｒｏＤ１およびレポーター遺伝子ＥＧＦＰの発現のための発現ベクター内に挿入される。

【0127】

任意選択的に、本開示の態様によれば、ＩＲＥＳおよびＥＧＦＰをコードする核酸は、配列番号９から除去され、ＣＡＧプロモーターおよびＮｅｕｒｏＤ１をコードする作動可能に連結した核酸を含む残りの核酸配列は、ＮｅｕｒｏＤ１の発現のための発現ベクター内に挿入される。ＷＰＲＥまたは別のエンハンサーは、任意選択的に含まれる。

【0128】

例えば、宿主細胞内の遺伝子材料によってコードされる所望のタンパク質の一過性または安定な発現のためなどの、遺伝子材料をレシピエント宿主細胞に導入するプロセスは、「トランスフェクション」または「形質導入」と称される。トランスフェクション技法は、当該技術分野で周知であり、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」技術としても既知である粒子加速形質転換、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール媒介性トランスフェクション、および熱ショック媒介性トランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。形質導入は、レシピエント宿主細胞内への遺伝物質のウイルス媒介性導入を指す。

【0129】

ウイルス媒介性形質導入は、アデノウイルス、ＡＡＶおよびレンチウイルスに由来するものなどのウイルスベクターを使用して達成され得る。

【0130】

任意選択的に、宿主細胞をエクスビボでトランスフェクションまたは形質導入し、次いで宿主生物内に再導入する。例えば、細胞または組織を対象から取り出し、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする発現ベクターでトランスフェクションまたは形質導入し、次いで対象に戻してもよい。

【0131】

宿主グリア細胞において外因性ＮｅｕｒｏＤ１を発現してグリア細胞を機能的ニューロンに変換するための、ＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片をコードする核酸を含む、組換え発現ベクターのインビトロまたはインビボでの宿主グリア細胞内への導入は、様々なトランスフェクションまたは形質導入方法論のうちのいずれかによって達成される。

【0132】

本開示の態様によれば、グリア細胞を機能的ニューロンに変換するための宿主グリア細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１の発現は、インビトロまたはインビボで宿主グリア細胞にＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片をコードするｍＲＮＡを導入することによって達成される。

【0133】

本開示の態様によれば、グリア細胞を機能的ニューロンに変換するための宿主グリア細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１の発現は、インビトロまたはインビボで宿主グリア細胞にＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片をコードするＤＮＡを導入することによって達成される。

【0134】

本開示の態様によれば、グリア細胞を機能的ニューロンに変換するための宿主グリア細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１の発現は、インビトロまたはインビボで宿主グリア細胞にＮｅｕｒｏＤ１タンパク質を導入することによって達成される。

【0135】

これらおよび他の技術の詳細は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ Ｅｄ．，２００１、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ Ｅｄ．，２００２、およびＥｎｇｅｌｋｅ，Ｄ．Ｒ．，ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｎｕｔｓ ａｎｄ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ，Ｅａｇｌｅｖｉｌｌｅ，ＰＡ，２００３に記載されるように、当該技術分野で既知である。

【0136】

組換え発現ベクターを使用したＮｅｕｒｏＤ１の発現は、当該技術分野で認識される昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、または任意の他の単一または多細胞生物などの真核または原核宿主細胞発現系に発現ベクターを導入することによって達成される。宿主細胞は、任意選択的に、初代細胞または不死化誘導体細胞である。不死化細胞は、少なくとも５回の複製継代の間、インビトロで維持することができるものである。

【0137】

組換え発現ベクターを含有する宿主細胞は、ＮｅｕｒｏＤ１が産生される条件下で維持される。宿主細胞は、Ｃｅｌｉｓ，Ｊｕｌｉｏ，ｅｄ．，１９９４，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．に記載されているような既知の細胞培養技法を使用して培養および維持され得る。特定の栄養素、酸素、張力、二酸化炭素、および低減した血清レベルに関する培地製剤を含む、これらの細胞の様々な培養条件を、当業者によって選択および最適化することができる。

【0138】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを、対象のグリア細胞に導入する。グリア細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１の発現は、グリア細胞を機能的ニューロンに「変換する」。

【0139】

「変換する」および「変換された」という用語は、本明細書では、グリア細胞、特に、星状細胞または反応性星状細胞の表現型の場合の機能的ニューロンの表現型への変化をもたらす、グリア細胞におけるＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、またはその機能的断片の発現の効果を説明するために使用される。同様に、「ＮｅｕｒｏＤ１変換されたニューロン」、および「変換されたニューロン」という語句は、本明細書では、結果として生じる機能的ニューロンの表現型を有する外因性ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質またはその機能的断片を含む細胞を指定するために使用される。

【0140】

「表現型」という用語は、本明細書で言及される細胞の周知の検出可能な特徴を指す。機能的ニューロンの表現型は、ニューロンの形態、１つ以上のニューロンマーカーの発現、ニューロンの電気生理学的特徴、シナプス形成、および神経伝達物質の放出のうちの１つ以上であり得るが、これらに限定されない。例えば、ニューロン表現型は、樹状突起、軸索および樹状突起棘の存在などのニューロンの特徴的な形態学的態様；シナプス点におけるシナプスタンパク質の存在、樹状突起におけるＭＡＰ２の存在、神経核タンパク質（ＮｅｕＮ）、ＧＡＢＡ、ＧＡＤ６７などのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、フォークヘッドボックスＧ１（ＦｏｘＧ１）、、Ｔブレイン１（Ｔｂｒ１）、Ｃｕｘ１、Ｃｔｉｐ２、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルレチニン（ＣＲ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、およびソマトスタチン（ＳＳＴ）のうちの１つ以上の存在などの特徴的なニューロンタンパク質の発現および分布；ならびに自発的および誘発されるシナプス事象などの特徴的な電気生理学的徴候を包含するが、これらに限定されない。

【0141】

さらなる例では、星状細胞表現型および反応性星状細胞表現型などのグリア表現型は、概して「星の形状」の形態などの星状細胞および反応性星状細胞の特徴的な形態学的態様、ならびにグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の存在などの特徴的な星状細胞および反応性星状細胞のタンパク質発現を包含するが、これらに限定されない。

【0142】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸、そのバリアント、またはその機能的断片を含む組換え発現ベクターを、対象の星状細胞内に導入する。星状細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、またはその機能的断片の発現は、星状細胞を機能的ニューロンに「変換する」。

【0143】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸、そのバリアント、またはその機能的断片、それのを含む組換え発現ベクターを、対象の反応性星状細胞内に導入する。反応性星状細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、またはその機能的断片の発現は、反応性星状細胞を機能的ニューロンに「変換する」。

【0144】

本開示の態様によれば、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸、そのバリアント、またはその機能的断片を含む組換え発現ベクターを、対象のＮＧ２細胞内に導入する。ＮＧ２細胞における外因性ＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、またはその機能的断片の発現は、ＮＧ２細胞を機能的ニューロンに「変換する」。

【0145】

ＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、もしくはその機能的断片をコードする核酸、ＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、もしくはその機能的断片をコードするＤＮＡ、ＮｅｕｒｏＤ１、そのバリアント、もしくはその機能的断片をコードするｍＲＮＡ、および／またはＮｅｕｒｏＤ１タンパク質、そのバリアント、その全長、もしくはその機能的断片を含む発現ベクターは、任意選択的に、インビトロまたはインビボで宿主細胞内に導入するための担体と会合する。

【0146】

特定の態様では、担体は、リポソーム、ミセル、単層、もしくは多層小胞を含む脂質粒子、ポリマー粒子（ヒドロゲル粒子、ポリグリコール酸粒子、もしくはポリ乳酸粒子など）、無機粒子（例えば、米国特許第５，６４８，０９７号に記載されるようなリン酸カルシウム粒子など）、および無機／有機粒子状担体（例えば、米国特許第６，６３０，４８６号に記載されるものなど）などの粒子状担体である。

【0147】

粒子状担体は、脂質粒子、ポリマー粒子、無機粒子、有機粒子、および無機／有機ハイブリッド粒子の中から選択することができる。粒子の種類の混合物はまた、粒子状の薬学的に許容可能な担体として含むことができる。

【0148】

粒子状担体は、典型的には、粒子が約１ｎｍ～１０マイクロメートルの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。特定の態様では、粒子状担体は、粒子が約１ｎｍ～１００ｎｍの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。

【0149】

リポソームのさらなる説明およびそれらの調製および使用に関連する方法は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２６４），Ｖ．Ｐ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ａｎｄ Ｖ．Ｗｅｉｓｓｉｇ（Ｅｄｓ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ ｅｄ．，２００３に見出され得る。ナノ粒子のさらなる態様は、Ｓ．Ｍ．Ｍｏｇｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００５，１９，３１１－３０に記載されている。

【0150】

外因性ＮｅｕｒｏＤ１またはその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターの導入後の外因性ＮｅｕｒｏＤ１の発現の検出は、ＮｅｕｒｏＤ１を検出するためのイムノアッセイ、ＮｅｕｒｏＤ１核酸を検出するための核酸アッセイ、および外因性ＮｅｕｒｏＤ１と共発現するレポーター遺伝子の検出を含むが、これらに限定されない、様々な標準的方法論のうちのいずれかを使用して達成される。

【0151】

「核酸」という用語は、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む任意の形態で２つ以上のヌクレオチドを有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。「ヌクレオチド配列」という用語は、核酸の一本鎖形態におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を指す。

【0152】

「ＮｅｕｒｏＤ１核酸」という用語は、単離されたＮｅｕｒｏＤ１核酸分子を指し、配列番号１もしくは配列番号３に記載のＤＮＡ配列、もしくはその相補体、もしくはその断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する配列を有する単離されたＮｅｕｒｏＤ１核酸、または高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号３に記載の核酸、もしくはその相補体、もしくはその断片とハイブリダイゼーションする配列を有する、ＲＮＡもしくはＤＮＡなどの単離された核酸の分子を包含する。ＮｅｕｒｏＤ１核酸分子に関して「単離された」という用語は、分子が、その位置にあるＮｅｕｒｏＤ１プロモーターの制御下で由来した生物のゲノム内にないことを示す。

【0153】

配列番号３の核酸は、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１に記載の核酸にハイブリダイゼーションする配列を有する単離されたＤＮＡ分子の例である。

【0154】

ＮｅｕｒｏＤ１核酸の断片は、ＮｅｕｒｏＤ１核酸を含む本開示の態様において作動可能なＮｅｕｒｏＤ１核酸の任意の断片である。

【0155】

ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡなどの標的ＮｅｕｒｏＤ１のＲＮＡまたはＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションすることができる核酸プローブまたはプライマーは、ＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡなどのＲＮＡまたはＤＮＡの検出および／または定量化に使用することができる。核酸プローブは、少なくとも１０、１５、３０、５０、または１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとすることができ、ストリンジェントな条件下で、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡなどのＮｅｕｒｏＤ１のＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその相補配列に特異的にハイブリダイゼーションするのに十分とすることができる。核酸プライマーは、少なくとも、１０、１５、または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドとすることができ、ストリンジェントな条件下で、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡなどのＲＮＡもしくはＤＮＡまたはその相補配列に特異的にハイブリダイゼーションするのに十分とすることができる。

【0156】

「相補体」および「相補的」という用語は、ヌクレオチド間のワトソン－クリック塩基対合を指し、具体的には、２つの水素結合によるアデニン残基に連結されたチミンまたはウラシル残基、ならびに３つの水素結合によって連結されたシトシンおよびグアニン残基と互いに水素結合されたヌクレオチドを指す。概して、核酸は、特定の第２のヌクレオチド配列に対して、ある「パーセントの相補性」を有すると記載されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第２のヌクレオチド配列に対して８０％、９０％、または１００％の相補性を有し得、これは、配列の１０個のヌクレオチドのうち８個、１０個のヌクレオチドのうち９個、または１０個のヌクレオチドのうち１０個が、特定の第２のヌクレオチド配列に対して相補的であることを示す。例えば、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－５’は、ヌクレオチド配列５’－ＡＧＣＴ－３’に１００％相補的である。さらに、ヌクレオチド配列３’－ＴＣＧＡ－は、ヌクレオチド配列５’－ＴＴＡＧＣＴＧＧ－３’の領域に１００％相補的である。

【0157】

「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイゼーションする」という用語は、相補的核酸の対合および結合を指す。ハイブリダイゼーションは、当該技術分野で周知であるように、核酸の相補性の程度、核酸の融解温度、Ｔｍ、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェントさなどの要因に応じて、２つの核酸間で様々な程度に生じる。「ハイブリダイゼーション条件のストリンジェントさ」という用語は、ホルムアミドおよびデンハルト溶液などの特定の一般的な添加剤に関する、ハイブリダイゼーション媒体の温度、イオン強度、および組成の条件を指す。

【0158】

特定の核酸に関する特定のハイブリダイゼーション条件の決定は、日常的であり、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；３ｒｄ Ｅｄ．，２００１、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；５ｔｈ Ｅｄ．，２００２に記載されているように、当該技術分野で周知である。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションのみを可能にする条件である。典型的には、約８５～１００％の相補性を有する核酸は、高度に相補的であるとみなされ、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする。中間ストリンジェントな条件は、中間の相補性である、約５０～８４％の相補性を有する核酸、および高い相補性を有する核酸がハイブリダイゼーションする条件によって例示される。対照的に、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、低い相補性を有する核酸がハイブリダイゼーションする条件である。

【0159】

「特異的ハイブリダイゼーション」および「特異的にハイブリダイゼーションする」という用語は、試料中の標的核酸以外の核酸への実質的なハイブリダイゼーションを伴わない、特定の核酸の標的核酸へのハイブリダイゼーションを指す。

【0160】

ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェントさは、当業者に周知のように、プローブおよび標的のＴｍならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のイオン強度を含むいくつかの要因に依存する。所望のハイブリダイゼーションのストリンジェントさを達成するためのハイブリダイゼーションおよび条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ．），Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，２００２に記載されている。

【0161】

高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、３７℃で一晩、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、３０％ホルムアミド、および１００マイクログラム／ｍＬの変性サーモン精子を含有する溶液中での約１００ヌクレオチド長にわたる核酸のハイブリダイゼーション、それに続く６０℃で１５分間、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの溶液中の洗浄である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである。デンハルト溶液は、０．０２％のウシ血清アルブミン／０．０２％のフィコール／０．０２％のポリビニルピロリドンである。高ストリンジェントな条件下で、配列番号１および配列番号３は、実質的に同一の標的の相補体にハイブリダイゼーションし、無関係な配列にはハイブリダイゼーションしない。

【0162】

本発明の組成物および方法の実施形態は、以下の実施例において例示される。これらの実施例は、例示的な目的のために提供され、本発明の組成物および方法の範囲に対する制限とはみなされない。

【実施例】

【0163】

材料および方法
閉鎖性頭部損傷のマウスモデル
野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＦＶＢ／Ｎ－Ｔｇ（ＧＦＡＰ：：ＧＦＰ）１４Ｍｅｓ／ＪトランスジェニックマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスを１２時間の明／暗サイクルで飼育し、十分な食べ物および水を供給した。本実施例では、４～６ヶ月齢の両方の性別の成体マウス（２５～３５ｇ）を使用した。

【0164】

マウスを、腹腔内（ＩＰ）注射によってケタミン／キシラジン（１２０ｍｇ／ｋｇのケタミン、８ｍｇ／ｋｇのキシラジン）で麻酔した。完全に麻酔した後、各マウスを定位装置に移し、頭部を形状適合フォーム上に固定した。フォームは、過剰な衝撃を吸収するとともに、動物の頭部を安定させるために、柔らかいプラスチック材料によって作られた。正中線に沿って切開を行い、前頂の前方に１．０ｍｍ、正中線の外側に１．５ｍｍの座標で、マウスの運動皮質の上にある頭蓋骨の衝撃部位を完全に露出させた。衝撃誘導前に外耳道を損傷しないように、耳バーを取り外した。電磁気制御デバイスであるＩｍｐａｃｔｏｒ Ｏｎｅは、ＴＢＩ誘導のためにＬｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）から購入した。頭蓋骨骨折および死亡を防ぐため、５．０ｍ／秒より大きい衝撃力を避けた。

【0165】

直径２ｍｍのインパクタチップを、５ｍ／秒の速度、２００ｍｓの滞留時間、１．０ｍｍの衝撃深度で使用し、限局性閉鎖性頭部損傷を引き起こした。インパクタチップの底面は、頭蓋骨へ衝撃力を均等に送達し、頭蓋骨骨折のリスクを低減するために、頭蓋骨の衝撃部位に接するように調整された。明らかな頭蓋骨骨折を有する動物を、実験から除外し、直ちに安楽死させた。

【0166】

衝撃送達および切開縫合後、動物を定位装置から取り出し、加熱パッド上に配置し、深く規則的な呼吸が回復するまで、外傷後の酸素を直ちに毎分３～５リットルのＯ_２の速度で投与した。動物を加熱パッド上に保持し、処置から回復するまで観察し、次いで、手術後少なくとも７日間毎日監視した。衝撃の後の最初の３日間、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を１日２回投与して痛みを緩和した。

【0167】

ウイルスの注射
閉鎖性頭部損傷の７日後、ＮｅｕｒｏＤ１をコードするウイルスまたは対照ウイルスのいずれかの注射投与のために、マウスを無作為に選択した。マウスを、腹腔内注射によってケタミン／キシラジン（１２０ｍｇ／ｋｇのケタミン、８ｍｇ／ｋｇのキシラジン）で麻酔し、定位装置に配置した。鼻ブリッジホルダーおよび２本の耳バーを備えた切歯バーを使用して頭部を固定した。正中線切開を行った後、衝撃部位の中心に約１ｍｍの小さな穴を頭蓋骨に開けた（座標：前頂の前方１．０ｍｍ、左外側１．５ｍｍ）。選択されたウイルス、１．５μＬの（ＡＡＶ９）ｈＧＦＡＰ：：ＧＦＰもしくは（ＡＡＶ９）ｈＧＦＡＰ：：ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ、またはＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰもしくはＧＦＰ対照を担持する３μＬのレトロウイルスを、３３ゲージ針を備えた５μＬのハミルトンブランドのガラス注射器を用いて、電動化されたマイクロポンプ注射装置を使用して０．１５μＬ／分の速度で１０分間、損傷した脳領域に注射した。注射後、針を所定の位置にさらに３分間保持した後、ゆっくりと引き抜いた。手術後、マウスは自由な動きが観察されるまで加熱パッド上で回復した。マウスを単独で飼育し、毎日、少なくとも１週間、または屠殺まで注意深く監視した。

【0168】

ウイルスまたは染料による神経投射追跡
順行性追跡のために、ｈＳｙｎ：：ＣｒｅプラスＣＡＧ：：ＦＬＥＸ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を視床内に注射した（座標：前頂の後方２．０ｍｍ、左外側１．１ｍｍ、頭蓋骨表面の前面２．８ｍｍ）。逆行性追跡のために、６４７蛍光プローブと融合したコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ－６４７）を、損傷部位の反対側の皮質内に注射した（座標：前頂の前方１．０ｍｍ、右外側１．５ｍｍ、頭蓋骨表面の前面１．６ｍｍ）。７日後に動物を屠殺し、分析のために脳試料を収集した。

【0169】

ＡＡＶベクターの構築
プラスミドｐＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）－ｍＣｈｅｒｒｙは、Ａｄｄｇｅｎｅ（プラスミド＃２７０５５、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２７０５５）から得た。ｐＡＡＶ－ｈＧＦＡＰ：：ＧＦＰおよびｐＡＡＶ－ｈＧＦＡＰ：：ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰベクターを構築するために、ＧＦＰまたはＮｅｕｒｏＤ１をコードするｃＤＮＡを、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４，１８８－２０２，２０１４に詳述されるようにレトロウイルス構築物を使用してＰＣＲによって産生した。ＧＦＰ遺伝子またはＰ２Ａ－ＧＦＰ遺伝子と融合したＮｅｕｒｏＤ１を、ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）－ｍＣｈｅｒｒｙがＫｐｎＩ部位とＢｓｒＧＩ部位との間で切り出されたｐＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）－ｍＣｈｅｒｒｙベクター中にサブクローニングした。ｐＡＡＶ－シナプシン：：Ｃｒｅのプラスミドについては、ｈＧＦＡＰ－Ｃｒｅ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４０５９１）からＰＣＲによってＣｒｅ遺伝子を得、ＡＡＶ ｐｈＳｙｎ（Ｓ）－ＦｌｐＯ－ｂＧＨｐＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５１６６９）のＫｐｎＩ部位とＢｍｔＩ部位との間に挿入してＦｌｐＯが置き換えられ、ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ：Ｃｒｅベクターを生成した。ｐＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０２０ Ｊａｎ ８；２８（１）：２１７－２３４に詳述されるように構築された。プラスミド構築物を検証のために配列決定した。

【0170】

ＡＡＶウイルスの産生
組換えＡＡＶ９を、２９３ＡＡＶ細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）中で産生した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、線形、ＭＷ２５，０００）を、ｐＡＡＶ発現ベクター、ｐＡＡＶ９－ＲＣ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）およびｐＨｅｌｐｅｒ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）の三重プラスミドのトランスフェクションに使用した。トランスフェクションの７２時間後、細胞を培地中でこすり取り、遠心分離し、ドライアイスまたはエタノールおよび３７℃の水浴中に交互に置くことによって、４回凍結解凍した。ＡＡＶ粗溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ５５Ｔｉロータを用いて、不連続なイオジキサノール勾配で１時間、５４，０００ｒｐｍで遠心分離することによって精製した。ウイルス含有層を抽出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓによってウイルスを濃縮した。ウイルス力価は、ｈＧＦＡＰ：：ＧＦＰについては、ミリリットル当たり２．２×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ／ｍＬ）、ｈＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰについては、２．３×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、ｈＳｙｎ：：Ｃｒｅについては、４．６×１０^１１ＧＣ／ｍＬ、およびＣＡＧ：：ＦＬＥＸ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙについては、１．６×１０^１２ＧＣ／ｍＬであり、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）によって決定された。

【0171】

レトロウイルスの産生
ｐＣＡＧ－ＮｅｕｒｏＤ１－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびｐＣＡＧ－ＧＦＰを、以前に記載されるように構築した（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１４：１８８－２０２（２０１４））。レトロウイルス粒子をパッケージングするために、ｇｐｇヘルパーフリーＨＥＫ細胞に、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）ベクターとともに標的プラスミドでトランスフェクションし、ＮｅｕｒｏＤ１またはＧＦＰを発現するレトロウイルスを産生した。レトロウイルス粒子の力価は、約１０^７個の粒子／ｍＬであり、ＨＥＫ細胞の形質導入後に決定された。

【0172】

免疫組織化学
Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４，１８８－２０２，２０１４）に詳述されるようにマウスの脳を収集した。簡潔に述べると、麻酔のために動物に２．５％のアヴェルチンを注射した。人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）による経心腔的灌流を実施して、全身の血液を洗い流した。次いで、脳を解剖し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で４℃で一晩、後固定した。固定後、脳組織を、Ｌｅｉｃａ－１０００ビブラトームを使用して４０μｍの切片に切片化した。脳スライスを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００中で１０分間透過処理した。次いで、脳切片を、ＰＢＳ中５％の正常ロバ血清中および０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００中で、２時間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング緩衝液に添加し、脳切片とともに４℃で一晩インキュベーションした。一次抗体をＰＢＳで３回すすぎ、続いて二次抗体を室温（ＲＴ）で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、脳切片を、退色防止搭載溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するスライドガラス上にマウントした。画像を共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００またはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ８００）で取得した。抗体特異性を確実にするために、二次抗体のみを、並列対照として免疫染色に使用し、明確なシグナルは検出されなかった。

【0173】

ホイールランニングおよびｃ－Ｆｏｓ検出
閉鎖性頭部損傷（ＣＨＩ）後のＮｅｕｒｏＤ１ウイルスの注射の２８日後、動物をランニングホイールに置いた。活発に走った３０分後に、マウスをホームケージに戻した。１時間後、ｃ－Ｆｏｓ免疫染色のために、屠殺し、灌流した。

【0174】

電気生理学
脳スライス記録は、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １４，１８８－２０２，２０１４、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，４１５９，２０１４）に詳述されるように実施された。ウイルスの注射の７、１４、２８、および５６日後に、マウスを２．５％のアヴェルチンで麻酔し、次いで、以下（ｍＭで）：９３ ＮＭＤＧ、９３ ＨＣｌ、２．５ ＫＣｌ、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ_４、３０ ＮａＨＣＯ_３、２０ ＨＥＰＥＳ、１５ グルコース、１２ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、５ アスコルビン酸ナトリウム、２ チオウレア、３ ピルビン酸ナトリウム、７ ＭｇＳＯ_４、および０．５ ＣａＣｌ_２を含有する、ｐＨ７．３～７．４、３００ｍＯｓｍのＮＭＤＧベースの切断溶液で灌流し、そして９５％のＯ_２／５％のＣＯ_２でバブリングした。厚さ３００μｍの冠状切片を、室温でビブラトーム（ＶＴ１２００Ｓ、Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で、ＡＡＶ注射された皮質区域の周囲で切断した。スライスを収集し、酸素化ＮＭＤＧ切断溶液中で、３３．０±１．０℃で１０～１５分間インキュベーションした。次いで、連続した９５％のＯ２／５％のＣＯ２のバブリングを伴い、以下（ｍＭで）：９２ ＮａＣｌ、２．５ ＫＣｌ、１．２５ ＮａＨ２ＰＯ_４、３０ ＮａＨＣＯ_３、２０ ＨＥＰＥＳ、１５ グルコース、１２ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、５ アスコルビン酸ナトリウム、２ チオウレア、３ ピルビン酸ナトリウム、２ ＭｇＳＯ_４、および２ ＣａＣｌ_２を含有する保持溶液にスライスを移した。保持溶液中、室温で少なくとも０．５時間回復した後、単一のスライスを記録チャンバーに移し、９５％のＯ_２／５％のＣＯ_２によって３３．０±１．０℃で飽和させた標準的なａＣＳＦ（人工脳脊髄液）で連続的に灌流した。標準ａＣＳＦは、以下（ｍＭで）：１２４ ＮａＣｌ、２．５ ＫＣｌ、１．２５ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２６ ＮａＨＣＯ_３、１０ グルコース、１．３ ＭｇＳＯ_４、および２．５ ＣａＣｌ_２を含有した。ＮｅｕｒｏＤ１－ＧＦＰ感染したニューロンにおける活動電位発火を検出するために、全細胞記録を、以下（ｍＭで）：１３５ グルコン酸カリウム、１０ ＫＣｌ、５ ホスホクレアチンナトリウム、１０ ＨＥＰＥＳ、２ ＥＧＴＡ、４ ＭｇＡＴＰおよび０．３ Ｎａ_２ＧＴＰを含有し、ＫＯＨで調整したｐＨ７．３、２８０～２９０ｍＯｓｍのピペット溶液で実施した。電流クランプモデルの下で活動電位を誘発するために脱分極電流を注射した。自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）および自発的抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）を記録するために、ピペット溶液は以下（ｍＭで）：１２０ メタンスルホン酸セシウム、１０ ＫＣｌ、１０ ホスホクレアチンナトリウム、１０ ＨＥＰＥＳ、５ ＱＸ－３１４、１ ＥＧＴＡ、４ ＭｇＡＴＰおよび０．３ Ｎａ_２ＧＴＰを含有し、ＫＯＨで調整したｐＨ７．３、２８０～２９０ｍＯｓｍであった。記録されたニューロンを標識化するために、０．５％のビオシチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｂ４２６１）をピペット溶液に添加した。細胞膜電位は、ｓＥＰＳＣ記録については－７０ｍＶ（ＧＡＢＡＡ受容体の逆転電位）、ｓＩＰＳＣ記録については０ｍＶ（イオンチャネル型グルタミン酸受容体の逆転電位）でそれぞれ保持した。データをＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ７００Ａ増幅器で収集し、ｐＣｌａｍｐ９．０およびＣｌａｍｐｆｉｔ１０．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で分析した。

【0175】

共焦点画像化および分析
損傷区域の定義。
正中線の外側７５０μｍ～２２５０μｍの損傷部位の周囲の皮質区域を、分析のための全損傷区域として定義した。衝撃中心から幅６００μｍ未満、深さ４５０μｍ未満の表層を損傷コアと定義した。衝撃中心から幅６００～１０００μｍ、深さ４５０～９００μｍの中間層を損傷周辺区域と定義した。

【0176】

細胞密度分析。
マウスの脳の切片を、免疫染色後に４０倍オイルレンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ－１０００のＺスタックおよびタイル機能によって画像化した。Ｚスタックの範囲は、搭載されたスライスの中心面の周囲に１．５μｍのステップサイズを有する５層とした。各切片で、Ｚスタック画像の３つの正方形（解像度：５１２×５１２、０．６２１μｍ／ピクセル）を、定量化のために損傷コアの内側または損傷周辺区域の内側で選択した。

【0177】

細胞変換および亜型比分析。
損傷範囲および感染範囲の内側の３つの切片を選択した。１つの切片は、損傷および感染の中心に近かった。他の２つの切片は、比較的に感染区域の前半分または後半分の中間の位置にあった。各脳切片の単層共焦点画像を、定量のために４０倍オイルレンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ－１０００によって撮像した。

【0178】

データ分析および統計
統計分析および棒グラフには、Ｐｒｉｓｍ６Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用した。２つのデータセットの比較については、スチューデントのｔ検定を実施した。３つのデータセットの比較については、一元配置または二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施し、続いて事後試験を実施した。統計的有意性は、ｐ＜０．０５として設定された。データは平均±ＳＥＭとして表された。

【0179】

結果
限局性閉鎖性頭部損傷モデルの確立および損傷部位におけるニューロンおよびグリア細胞の病理。
本実施例では、図１Ａ左に図示的に示されている電磁気制御デバイス、Ｌｅｉｃａインパクター１を使用して、ＴＢＩの一種である正確に制御されたＣＨＩをマウスの運動皮質上の露出させた頭蓋骨に誘導した。図１Ａ右を参照されたい。

【0180】

ＣＨＩ後、種々の時点で病理学的転帰を調査した。図１Ｂを参照されたい。病理の調査は、星状細胞およびニューロンに焦点を当てた。予備実験は、発明者らのモデルにおけるＣＨＩ後の一次的および二次的な脳損傷が主に衝撃部位の下に限局的に位置していることを証明した。

【0181】

図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、ＣＨＩ後の損傷部位におけるニューロンの死および変性を実証している。

【0182】

図２Ａに示されるように、衝撃中心に近い３つの脳領域は、破線によって定義された最小の半円区域内に主に位置する損傷コアとしてみなされた。損傷コアの隣の５つの領域は、破線で定義されたより大きな半円形区域の内側に主に位置する損傷周辺区域とした。破線で定義された破線の長方形のボックス内のすべての領域を、分析のための関心領域（ＲＯＩ）とした。

【0183】

偽ＴＢＩ群と比較して、損傷の７日後、ならびに１４日後および２８日後において、ＮｅｕＮシグナルは明らかに減少し、ＧＦＡＰシグナルは大幅に増加した。図１Ｃを参照されたい。損傷部位、反対側、および偽ＴＢＩ対照におけるＮｅｕＮ＋またはＧＦＡＰ＋細胞の密度を定量化した。結果は、損傷側および反対側の両方が、偽ＴＢＩ群由来の脳よりもより少ないＮｅｕＮ＋細胞（図１Ｄおよび図１Ｅを参照されたい）、ならびにより多くのＧＦＡＰ＋細胞（図１Ｆを参照されたい）を有していたことを示した。損傷コアは、最も重篤なＮｅｕＮ損失を受け（図１Ｄを参照されたい）、これは、ＣＨＩ後のニューロンの死および星状細胞の再活性化があったことを示した。

【0184】

ＣＨＩ後の損傷コアの周囲のニューロンの死を確認するために、損傷の６時間後および４日後などの、ＣＨＩ後の早い時点の脳試料を収集し、アッセイして、細胞アポトーシスのバイオマーカー－末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンド標識化、ＴＵＮＥＬを検出した。結果は、損傷コアに近い表層における多くのニューロンが強いＴＵＮＥＬおよび混沌としたＮｅｕＮシグナルを有しており、それらが瀕死の細胞であることを表していることを示している。さらに、損傷区域の下の深層においてでさえも、いくらかのニューロンは、他の隣接ニューロンと比較して、蓄積されたＴＵＮＥＬシグナルおよび弱いＮｅｕＮシグナルを示した。図２Ｂを参照されたい。それらの形態に基づいて、これらの細胞は深部皮質層の錐体ニューロンである可能性がある。したがって、ＣＨＩは、機械的な力による一次的な損傷またはそれに続く二次的な損傷を伴い、細胞にダメージを与え、アポトーシスを誘導した。衝撃部位から遠く離れた同じ半球または反対側の領域のような、他の脳区域においては、ＴＵＮＥＬシグナルは検出されなかった。

【0185】

ニューロン突起に対するＣＨＩの影響をさらに調査するために、ＣＨＩの１週間後の動物由来の脳試料を免疫染色して、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）および高（２００ｋＤ）分子量ニューロフィラメントタンパク質（ＮＦ２００）を検出した。両方のマーカーは、ニューロン突起の形態を表し、皮質の健康状態を反映している。損傷側と反対側とを比較すると、損傷側には強ＭＢＰ信号を伴う多くの拡大された軸索末端が見出され（図２Ｃ、上部画像を参照されたい）、「退縮球」を形成する損傷した軸索を表している場合がある。ＮＦ２００染色はまた、ＣＨＩが衝撃部位の周囲の細胞骨格の破壊を引き起こしたことを示した。図２Ｃ、中央画像を参照されたい。これは、他のＴＢＩモデルの結果と一致している。

【0186】

ニューロンの変性に伴い、損傷コアの周囲の星状細胞は、非損傷側または偽群と比較して、非常に反応性が高くなった。図１Ｃおよび図１Ｆを参照されたい。さらに、ＣＨＩ後の種々の時点で細胞増殖マーカーのＫｉ６７を染色することにより、星状細胞の増殖速度が、損傷の４日後でピークに達し、損傷の７日後で静止することが見出された。図１Ｇおよび図１Ｈを参照されたい。Ｉｂａ１染色によって印付けされたミクログリア集団（図１Ｇを参照されたい）は、早期の損傷の１日後にピークに達する増殖曲線を有するようである。図１Ｈを参照されたい。

【0187】

マウス新皮質における閉鎖性頭部損傷後のＮｅｕｒｏＤ１によるインサイチュでの星状細胞からニューロンへの変換。
マウスの皮質の星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供するために、ＡＡＶベクター、組換え血清型ＡＡＶ９を構築して、発現の指標としての増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有するヒトＧＦＡＰプロモーターの直接制御下で、マウスの皮質の星状細胞内でＮｅｕｒｏＤ１を発現させた。構築物はｈＧＦＡＰ：：ＮｅｕｒｏＤ１－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（（ＡＡＶ）ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰとも呼ばれる）と指定された。図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ、および３Ｈは、マウスの新皮質における閉鎖性頭部損傷後のＮｅｕｒｏＤ１（ＮＤ１）によるインサイチュでの星状細胞からニューロンへの変換を示す。

【0188】

図３Ａおよび図３Ｂに図示的に示されるように、ＮｅｕｒｏＤ１を発現するＡＡＶ発現ベクター（ＡＡＶ）ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰまたは対照発現ベクター（ＡＡＶ）ＧＦＡＰ：：ＧＦＰ）を、ＣＨＩの７日後に、損傷部位内に注射した。これらのベクターの投与後、細胞を検査して、どれが各ウイルスによって感染し、どれがＧＦＡＰプロモーターの制御下でコードされた遺伝子を発現するかを決定した。図３Ｃは、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＧＦＰウイルス（対照群、左パネル）の注射またはＡＡＶ－ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰウイルス（ＮＤ１群、右パネル）の注射の７日後の損傷した皮質を示す一連の代表的な画像である。

【0189】

ウイルスの注射の７日後の対照群の脳試料における種々の細胞亜型マーカーに対する免疫染色とＧＦＰ蛍光との比較により、標識化された星状細胞（ＧＦＡＰ）、乏突起膠細胞（ｏｌｉｇ２）、ミクログリア細胞（Ｉｂａ１）、ニューロン（ＮｅｕＮ）、および幹細胞（ＤＣＸ）のパーセンテージが決定された。図３Ｄを参照されたい。結果により、ＧＦＰ発現細胞のうちのほとんどが星状細胞であり、いくらかが乏突起膠細胞であり、わずかがニューロンであり、ごくわずかがミクログリア細胞であり、ほとんどが幹細胞ではなかったことが示された。図３Ｇを参照されたい。これにより、ＮＤ１群において変換されたニューロンは、星状細胞に由来することが確認された。この時点で、ＮＤ１群におけるほとんどのＧＦＰ＋細胞は、依然として、ＧＦＡＰを有するグリア細胞であった。図３Ｅ－２を参照されたい。しかしながら、ＮｅｕｒｏＤ１染色は、これらの細胞が内部に高発現のＮｅｕｒｏＤ１を有していることを示し（図３Ｅを参照されたい）、対照とは根本的に異なる。

【0190】

「ＮＤ１群」（すなわち、（ＡＡＶ）ＧＦＡＰ：：ＮＤ１－ＧＦＰを注射したもの）の動物由来の脳試料を、ウイルスの注射の４／７／１４／２８日後などの複数の時点で分析し、星状細胞からニューロンへの変換プロセスを示した。注射の４日後（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｄｐｉ）などの非常に早い時点で、ほぼすべてのＧＦＰ＋細胞は、免疫染色による視認可能なＮｅｕｒｏＤ１（ＮＤ１）発現を伴わないＧＦＡＰ＋およびＮｅｕＮ－であった。図３Ｆ－４日目、すなわち４ｄｐｉ）を参照されたい。しかしながら、この時点で、いくらかの星状細胞は形質転換し始めていた。約５％のＧＦＰ＋細胞は、ＮｅｕＮシグナルを有した。それらのうちのいくらかは、依然、同時にＧＦＡＰシグナルを有してさえおり、それは遷移段階と呼ばれる。図４Ａを参照されたい。図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｄは、星状細胞からニューロンへの変換、変換されたニューロンの成熟、およびＮｅｕｒｏＤ１を担持するレトロウイルスによって誘導される変換の遷移段階を示す。後期に細胞内により多くのＮＤ１が蓄積されると（図３Ｆ－７日目、すなわち７ｄｐｉを参照されたい）、ますます多くのＧＦＰ＋細胞が、星状細胞マーカー（ＧＦＡＰ）を失い、ニューロンマーカー（ＮｅｕＮ）を得た。図３Ｆおよび図３Ｈを参照されたい。ＮＤ１群の動物由来の脳切片を、未成熟ニューロンマーカーのＴｕｊ１、および成熟ニューロンマーカーのＭＡＰ２について共免疫染色した。図４Ｂを参照されたい。ほとんどの変換されたニューロンは、早い時点で、より高いＴｕｊ１およびより低いＭＡＰ２を示すが、より遅い時点でより低いＴｕｊ１およびより高いＭＡＰ２を示す。これは、変換されたニューロンが成熟プロセスを受けることになることを反映している可能性があり、それは神経幹細胞の発達段階と同様である可能性がある。

【0191】

さらに、星状細胞からニューロンへの変換は、レトロウイルスベクターを使用して確認され、これは分裂細胞に特異的に感染し、漏出問題を除外することができる。プラスミドは、以前にＧｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１４：１８８－２０２（２０１４）を記載されているように、ＣＡＧプロモーターの制御下でＮＤ１を発現するように構築された。レトロウイルスの注射の７日後、ＮＤ１およびＧＦＰを発現するレトロウイルスを「ＮＤ１レトロウイルス」群に投与したマウスの脳において、ＧＦＰのみを発現する対照と比較して、ニューロン形態を有する多くのＮｅｕＮ＋細胞およびＧＦＰ＋細胞が見出された。図４Ｃおよび図４Ｄを参照されたい。

【0192】

変換されたニューロンは、皮質の特徴を有する種々の亜型に発達する可能性がある。
グリア細胞がニューロンに変換されることを示したので、変換されたニューロンが内因性ニューロンと同じ分子プロファイルを獲得するかどうかを調査した。本研究のために、細胞を免疫染色して、前脳マーカーのフォークヘッドボックスＧ１（ＦｏｘＧ１）および前脳ニューロンマーカーのＴブレイン１（Ｔｂｒ１）を検出した。マウスの脳において、ＦｏｘＧ１は、終脳に由来する領域すべてに広く広がる転写因子である。Ｔｂｒ１は、マウス、特にグルタミン酸作動性ニューロンにおけるニューロンの分化および遊走に関与している。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄは、変換されたニューロンが、局所微小環境と一致する皮質の特徴を獲得し得ることを示す。

【0193】

結果は、変換されたニューロンのほぼすべてが、ＦｏｘＧ１＋（８８．０％±６．０％、Ｎ＝３のマウス）であり、変換されたニューロンの大部分が、Ｔｂｒ１＋（５９．９％±１０．０％、Ｎ＝３のマウス）であることを示した。図５Ａおよび図５Ｄを参照されたい。さらに、細胞を免疫染色して、皮質表層マーカーのＣｕｘ１および深層マーカーのＣｔｉｐ２を検出した。図５Ｂおよび図５Ｃを参照されたい。ＮＤ１処置後、これらの２つのマーカーは、未損傷の皮質におけるものと同じ分布を依然として有した。図５Ｂおよび図５Ｃを参照されたい。合計で、ＧＦＰ＋およびＮｅｕＮ＋細胞のうちの２４．６％±６．８％が、Ｃｕｘ１シグナルの共局在化を示した。Ｃｔｉｐ２の場合、共局在化のパーセンテージは、１１．０％±１．５％であった。図５Ｄを参照されたい。

【0194】

変換されたニューロンをアッセイして、それらが興奮性または抑制性のニューロンであるかどうかを決定した。図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、変換されたニューロンが異なる亜型に分化し得ることを示す。

【0195】

ＧＡＢＡおよびＧＡＤ６７を検出するための共免疫染色によって、ＧＦＰ＋およびＮｅｕＮ＋細胞のうちの２３．６％±３．５％が、ＧＡＢＡおよびＧＡＤ６７の両方について免疫陽性であることが決定された。図６Ａおよび図６Ｃを参照されたい。さらなる研究を実施し、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルレチニン（ＣＲ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）などの主要なＧＡＢＡ作動性ニューロンマーカーを検出するための免疫染色によって、変換されたＧＡＢＡ作動性ニューロンの亜型を決定した。図６Ｂを参照されたい。以前の研究は、正常なマウスの皮質が主にＰＶ、ＣＲ、ＮＰＹ、およびＳＳＴを有し、ＣｈＡＴまたはＴＨを有さなかったことを示した。本実施例では、定量化は、ＰＶ＋の変換されたニューロンのパーセンテージが、１９．２％±２．３％、ＣＲ＋が９．１％±０．７％、ＮＰＹ＋が７．８％±１．１％、ＳＳＴ＋が５．３％±３．３％に達したことを示した。図６Ｃを参照されたい。皮質において、ＣｈＡＴまたはＴＨと共局在した変換されたニューロンは、見出されなかった。要約すると、これらの結果により、変換されたニューロンが、局所微小環境と一致する種々の亜型に分化したことが示された。

【0196】

変換されたニューロンは機能的に成熟している。
脳の神経ネットワークにおける基本的な機能単位として、各単一ニューロンは、電気信号を受信、統合、および送信することによってその役割を果たす。したがって、変換されたニューロンの電気生理学的特性を、ウイルスの注射の４週間後に調査した。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ、７Ｆ、および７Ｇは、ＮＤ１変換されたニューロンが機能的に成熟していることを示す。

【0197】

変換されたニューロンの活動電位（ＡＰ）を発火する能力を、全細胞記録によって評価し、変換されたニューロンの形態を、注射されたビオチンの免疫染色によって評価した。種々の形態とともに、ＡＰの発火の３つの主なパターンが見出された。図７Ａおよび図７Ｂを参照されたい。第１のパターンは、記録されたＧＦＰ＋ニューロンのうちの約６０パーセントを表した。図７Ｃを参照されたい。第１の発火パターンを有するニューロンの代表的な形態と組み合わせると（図７Ａを参照されたい）、これらが皮質におけるＰＶ＋介在ニューロンである可能性があるようであった。パターン２は変換されたニューロンのうちの約２０パーセントを表しており、それは他の介在ニューロンである場合がある。パターン３を有する変換されたニューロンは明らかに錐体ニューロンであった。それらは、表層に達する長い先端樹状突起、およびＡｐｓの規則的な発火パターンを有した。図７Ａおよび図７Ｂを参照されたい。

【0198】

次いで、自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）および自発的抑制性シナプス後電流（ｓＩＰＳＣ）を含む、変換されたニューロンの追加の電気生理学的特徴を調査した。変換されたニューロンにおけるｓＥＰＳＣ／ｓＩＰＳＣは、細胞が局所神経ネットワークから興奮性／抑制性の刺激を受けることができ、フィードバックを与えることができることを反映していると考えられている。ＮＤ１処置の４週間後、ｓＥＰＳＣおよびｓＩＰＳＣが、パッチされたほとんどのＧＦＰ＋ニューロンにおいて記録された。それぞれ、図７Ｄおよび図７Ｅを参照されたい。ｓＥＰＳＣ／ｓＩＰＳＣの振幅および周波数を、ＮＤ１群と対照ＧＦＰウイルス群との間で比較した。ＮＤ１群と対照ＧＦＰウイルス群との間のｓＥＰＳＣ振幅に有意差があり（ｐ＜０．００１）、それぞれ１３．３±１．１ｐＡおよび７．４±０．６ｐＡであった。図７Ｆを参照されたい。ｓＥＰＳＣの周波数は、ＮＤ１群では６．０±１．０Ｈｚ、対照群では２．６±０．４Ｈｚであり、ＮＤ１群と対照群との間に有意差（ｐ＝０．０１）があった。図７Ｆを参照されたい。ｓＩＰＳＣに関しては、振幅（ＮＤ１：１９．４±１．８ｐＡ、対照：２０．４±２．４ｐＡ）でも、または周波数（ＮＤ１：１．２±０．３Ｈｚ、対照：１．０±０．２Ｈｚ）でも、２群間で有意差はなかった。図７Ｇを参照されたい。ｓＥＰＳＣが、変換されたニューロンと対照との間で明らかな差を示したため、ウイルスの注射の１週間後、２週間後、４週間後、および８週間後（ｗｅｅｋｓ ｐｏｓｔ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｗｐｉ）を含む、より多くの時点での変換されたニューロンの電気生理学的特性を評価し、対照と比較した。変換されたニューロンにおけるｓＥＰＳＣの周波数は、早い時点（１、２、および４ｗｐｉ）でより高く、次いで８ｗｐｉで低下した。図８Ａを参照されたい。ｓＥＰＳＣの振幅は、１ｗｐｉで低く、次いで２ｗｐｉおよび４ｗｐｉで高くなり、次いで８ｗｐｉで低下した。図８Ｂを参照されたい。より遅い時点である８ｗｐｉにおけるｓＥＰＳＣの周波数および振幅の両方は、対照と同等であった。図８Ａおよび図８Ｂを参照されたい。ｓＥＰＳＣの周波数は、他のニューロンが変換されたニューロンに与える興奮性神経支配の強度を反映した。ｓＥＰＳＣの振幅は、変換されたニューロンのシナプス後膜上のグルタミン酸受容体の密度によって決定される可能性がある。これらの結果は、変換されたニューロンが、神経幹細胞で生じるものと同様の構造的および機能的成熟プロセスを受けることを示す。

【0199】

変換されたニューロンは、局所神経ネットワークに統合することができる。
変換されたニューロンの機能分析に基づいて、それらは、内因性ニューロンおよび他の変換されたニューロンを含む、局所神経ネットワーク内の他のニューロンと通信することができた。したがって、細胞を免疫染色して、シナプスマーカー、興奮性シナプスを示すｖＧｌｕｔ１、抑制性シナプスを示すｖＧＡＴ、ならびにシナプス伝達を示すシナプトフィシン（ＳＰ１）およびシナプス小胞タンパク質（ＳＶ２）を検出した。図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ、図９Ｆ、および図９Ｈは、ＮＤ１変換されたニューロンが局所および遠隔神経ネットワークに組み込まれることを示す。

【0200】

４ｗｐｉでは、かなり多くの変換されたニューロンが、細胞体上にｖＧｌｕｔ１またはｖＧＡＴ点を有することが見出され、これは、他のニューロンから興奮性または抑制性の入力を受けることができることを示唆した。図９Ａを参照されたい。さらに、変換されたニューロンは、細胞体内にＳＰ１およびＳＶ２の発現を有し、特に膜に並行して局在し、他のニューロンとのシナプス伝達の能力を示した。図９Ｂを参照されたい。

【0201】

次に、動物がホイール上を走った１時間後に、マウスの運動皮質においてｃＦｏｓに対する免疫染色を実施し、変換されたニューロンが運動機能に関与しているかどうかを確認した。画像データは、変換されたニューロンのうちのいくらかが高いｃＦｏｓ発現を有し、周囲の内因性ニューロンと同等であることを示した。図９Ｃを参照されたい。

【0202】

ニューロンは、他の周囲のニューロンだけでなく、遠隔の上流の脳領域のニューロンからも神経突起を受けることが周知である。変換されたニューロンがこれらの遠隔の神経接続を構築したかどうかをさらに調査するために、順行性追跡および逆行性追跡を実施した。

【0203】

順行性追跡については、ウイルス、ＡＡＶ－シナプシン：：Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＣＡＧ：：ＦｌｅｘｍＣｈｅｒｒｙ、標識化ニューロンをマウス視床内に注射して、それらの軸索突起を可視化した。図９Ｄを参照されたい。１週間後、変換されたニューロンの周囲の神経突起およびシナプスボタンが可視化された。多くの変換されたニューロンが、順行性追跡マーカーだけでなく、ＧＦＰについてもシグナルを示すそれらの体細胞上の拡大されたシナプスボタンを得たことが見出され（図９Ｅおよび図９Ｆを参照されたい）、これは、これらのニューロンが、遠隔の視床ニューロンからの神経支配および他の変換されたニューロンからの局所神経支配の両方を受け取ることができることを示す。

【0204】

逆行性追跡については、フルオロフォアコンジュゲートを有するコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ－６４７）を、損傷した運動皮質の反対側内に注射した。図８Ｃを参照されたい。７日後、マウスの脳を収集して検査し、いくらかの変換されたニューロンが、損傷側の体細胞内にＣＴＢ－６４７を有していることを明らかにした。図９Ｇを参照されたい。これは、変換されたニューロンが、内因性ニューロンと同様に、下流の脳領域に遠位の神経突起を送ったことを示した。これらの実験を、ＮＤ１ウイルスの注射の１４日後、２８日後、および４２日後を含む種々の時点で繰り返した。画像データを解析することにより、変換されたニューロン内のＣＴＢ－６４７の平均シグナル強度を計算した。図９Ｈを参照されたい。絶対ＣＴＢ－６４７シグナル強度について、ＧＦＰ＋ニューロンにおいては有意差があった（１４日目：１８５±１７、２８日目：２４９±４５、４２日目：３５３±５０、ｐ＝０．０１）が、種々の時点間のＧＦＰ＋グリア細胞においては有意差がなかった（１４日目：１８０±６１、２８日目：１３１±１５、４２日目：１５０±７１、ｐ＝０．８１）。ＧＦＰ＋グリア細胞中のＣＴＢ－６４７シグナルをバックグランドとして、ＧＦＰ＋ニューロン中の相対的なＣＴＢ－６４７シグナル強度を計算し、これは１４日目で１．０±０．１、２８日目で１．９±０．３、４２日目で２．３±０．３であり、ｐ＝０．００４の有意差があった。結果は、変換されたニューロンからその下流の脳領域への神経支配の強度が時間とともに増加していることを反映した。

【0205】

図８Ｄは、ＮｅｕｒｏＤ１ウイルスの注射および反対側のＣＴＢ－６４７の注射の７日後に、変換されたニューロンの細胞体におけるＧＦＰおよびＮｅｕＮとともにシナプスマーカー（ＶＧＡＴ）の共局在化を示す一連の画像であり、反対側由来のＣＴＢシグナルも、細胞体上で観察された。

【0206】

図８Ｅは、ＮｅｕｒｏＤ１ウイルスの注射および反対側のＣＴＢ－６４７の注射の７日後に、変換されたニューロンの細胞体におけるＧＦＰおよびＮｅｕＮとともにシナプス小胞マーカー（ＳＶ２）の共局在化を示す一連の画像であり、反対側由来のＣＴＢシグナルも、細胞体上で観察された。

【0207】

実施形態
実施形態１．対象の脳のダメージ領域における少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）を提供することによって、反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換することを含む、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療する方法。

【0208】

実施形態２．ＴＢＩが、閉鎖性頭部損傷である、実施形態１に記載の方法。

【0209】

実施形態３．脳のダメージ領域が、ＴＢＩに起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む、実施形態１または２に記載の方法。

【0210】

実施形態４．非機能的ニューロンが、死んだニューロンおよび瀕死のニューロンからなる群から選択される、実施形態３に記載の方法。

【0211】

実施形態５．非機能的ニューロンが、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）によって検出される、実施形態３または４に記載の方法。

【0212】

実施形態６．ダメージ領域における非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の存在が、主にダメージ領域における出血に起因するものではない、実施形態３～５のいずれかに記載の方法。

【0213】

実施形態７．ダメージ領域における非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞の存在が、主にダメージ領域における虚血に起因するものではない、実施形態３～６のいずれかに記載の方法。

【0214】

実施形態８．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、組換え発現ベクターが、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。

【0215】

実施形態９．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、組換え発現ベクターが、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含むウイルス発現ベクターである、実施形態１～７のいずれかに記載の方法。

【0216】

実施形態１０．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、対象に組換え発現ベクターを投与することを含み、組換え発現ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターであり、組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列を含む、実施形態１～８のいずれかに記載の方法。

【0217】

実施形態１１．ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結する、実施形態８～１０のいずれかに記載の方法。

【0218】

実施形態１２．プロモーターが、グリア細胞特異的プロモーターである、実施形態１１に記載の方法。

【0219】

実施形態１３．グリア細胞特異的プロモーターが、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである、実施形態１２に記載の方法。

【0220】

実施形態１４．ＧＦＡＰプロモーターが、ヒトＧＦＡＰ（ｈＧＦＰ）プロモーターである、実施形態１３に記載の方法。

【0221】

実施形態１５．ＮｅｕｒｏＤ１以外の外因性転写因子が、少なくとも１つの反応性星状細胞に提供されない、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法。

【0222】

実施形態１６．対象が、ヒトである、実施形態１～１５のいずれかに記載の方法。

【0223】

実施形態１７．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、外傷性脳損傷後、約２日～約１０日の範囲の第１の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、実施形態１～１６のいずれかに記載の方法。

【0224】

実施形態１８．外傷性脳損傷が、ダメージ領域においてアストログリオーシスの期間を引き起こし、外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、アストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第１の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、実施形態１～１７のいずれかに記載の方法。

【0225】

実施形態１９．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、第１の治療時間後で、かつアストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第２の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、実施形態１８に記載の方法。

【0226】

実施形態２０．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、第２の治療時間後で、かつアストログリオーシスの期間中またはアストログリオーシスの期間後４週間以内の第３の治療時間において、少なくとも１つの反応性星状細胞に外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することを含む、実施形態１９に記載の方法。

【0227】

実施形態２１．ＮｅｕｒｏＤ１が、配列番号２、配列番号４、配列番号２の機能的断片、配列番号４の機能的断片、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載の方法。

【0228】

実施形態２２．ＮｅｕｒｏＤ１が、配列番号１を含む核酸配列、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列、配列番号３を含む核酸配列、または配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列によってコードされる、実施形態２１に記載の方法。

【0229】

実施形態２３．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、脳のダメージ領域内への注射を含む、実施形態１～２２のいずれかに記載の方法。

【0230】

実施形態２４．ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸配列が、ウイルス粒子内に存在する、実施形態８～２３のいずれかに記載の方法。

【0231】

実施形態２５．外因性ＮｅｕｒｏＤ１を提供することが、約１０^７～約１０^１４個のウイルス粒子を対象のダメージ脳領域に投与することを含む、実施形態２４に記載の方法。

【0232】

実施形態２６．対象の脳のダメージ領域において反応性星状細胞を機能的ニューロンに変換するための医薬品の製造における神経原性分化１（ＮｅｕｒｏＤ１）を含む組成物の使用であって、脳のダメージ領域が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）に起因する非機能的ニューロンおよび反応性星状細胞を含む、使用。

【0233】

実施形態２７．非機能的ニューロンが、死んだニューロンおよび瀕死のニューロンからなる群から選択される、実施形態２６に記載の使用。

【0234】

実施形態２８．外傷性脳損傷が、閉鎖性頭部損傷である、実施形態２６または２７に記載の使用。

【0235】

実施形態２９．ＮｅｕｒｏＤ１が、核酸配列によってコードされ、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態２６～２８のいずれかに記載の使用。

【0236】

実施形態３０．ＮｅｕｒｏＤ１をコードする核酸が、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態２６～２９のいずれかに記載の使用。

【0237】

実施形態３１．ＮｅｕｒｏＤ１が、配列番号２、配列番号４、配列番号２の機能的断片、配列番号４の機能的断片、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６～３０のいずれかに記載の使用。

【0238】

配列
配列番号１－終止コドンを含む、ヒトＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードするヒトＮｅｕｒｏＤ１核酸配列－１０７１ヌクレオチド
ＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＡＧＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＡＡＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＧＧＡＣＴＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＴＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＡＣＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＣＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＴＡＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＴＡＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＴＴＡＡＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧ

【0239】

配列番号２－配列番号１によってコードされるヒトＮｅｕｒｏＤ１アミノ酸配列－３５６アミノ酸
ＭＴＫＳＹＳＥＳＧＬＭＧＥＰＱＰＱＧＰＰＳＷＴＤＥＣＬＳＳＱＤＥＥＨＥＡＤＫＫＥＤＤＬＥＡＭＮＡＥＥＤＳＬＲＮＧＧＥＥＥＤＥＤＥＤＬＥＥＥＥＥＥＥＥＥＤＤＤＱＫＰＫＲＲＧＰＫＫＫＫＭＴＫＡＲＬＥＲＦＫＬＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲＭＨＧＬＮＡＡＬＤＮＬＲＫＶＶＰＣＹＳＫＴＱＫＬＳＫＩＥＴＬＲＬＡＫＮＹＩＷＡＬＳＥＩＬＲＳＧＫＳＰＤＬＶＳＦＶＱＴＬＣＫＧＬＳＱＰＴＴＮＬＶＡＧＣＬＱＬＮＰＲＴＦＬＰＥＱＮＱＤＭＰＰＨＬＰＴＡＳＡＳＦＰＶＨＰＹＳＹＱＳＰＧＬＰＳＰＰＹＧＴＭＤＳＳＨＶＦＨＶＫＰＰＰＨＡＹＳＡＡＬＥＰＦＦＥＳＰＬＴＤＣＴＳＰＳＦＤＧＰＬＳＰＰＬＳＩＮＧＮＦＳＦＫＪＥＰＳＡＥＦＥＫＮＴＡＦＴＭＨＹＰＡＡＴＬＡＧＡＱＳＨＧＳＩＦＳＧＴＡＡＰＲＣＥＩＰＩＤＮＩＭＳＦＤＳＨＳＨＨＥＲＶＭＳＡＱＬＮＡＩＦＨＤ

【0240】

配列番号３－終止コドンを含む、マウスＮｅｕｒｏＤ１タンパク質をコードするマウスＮｅｕｒｏＤ１核酸配列－１０７４ヌクレオチド
ＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＧＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＧＣＴＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＴＡＣＡＧＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＧＴＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＣＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＡＴＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＡＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧ

【0241】

配列番号４－配列番号３によってコードされるマウスＮｅｕｒｏＤ１アミノ酸配列－３５７アミノ酸
ＭＴＫＳＹＳＥＳＧＬＭＧＥＰＱＰＱＧＰＰＳＷＴＤＥＣＬＳＳＱＤＥＥＨＥＡＤＫＫＥＤＥＬＥＡＭＮＡＥＥＤＳＬＲＮＧＧＥＥＥＥＥＤＥＤＬＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＤＱＫＰＫＲＲＧＰＫＫＫＫＭＴＫＡＲＬＥＲＦＫＬＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲＭＨＧＬＮＡＡＬＤＮＬＲＫＶＶＰＣＹＳＫＴＱＫＬＳＫＩＥＴＬＲＬＡＫＮＹＩＷＡＬＳＥＩＬＲＳＧＫＳＰＤＬＶＳＦＶＱＴＬＣＫＧＬＳＱＰＴＴＮＬＶＡＧＣＬＱＬＮＰＲＴＦＬＰＥＱＮＰＤＭＰＰＨＬＰＴＡＳＡＳＦＰＶＨＰＹＳＹＱＳＰＧＬＰＳＰＰＹＧＴＭＤＳＳＨＶＦＨＶＫＰＰＰＨＡＹＳＡＡＬＥＰＦＦＥＳＰＬＴＤＣＴＳＰＳＦＤＧＰＬＳＰＰＬＳＩＮＧＮＦＳＦＫＨＥＰＳＡＥＦＥＫＮＹＡＦＴＭＨＹＰＡＡＴＬＡＧＰＱＳＨＧＳＩＦＳＳＧＡＡＡＰＲＣＥＩＰＩＤＮＩＭＳＦＤＳＨＳＨＨＥＲＶＭＳＡＱＬＮＡＩＦＨＤ

【0242】

配列番号５－ＬＣＮ２プロモーター
ＧＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＣＣＴＴＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＴＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＣＣＴＴＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＣＴＴＴＴＧＧＡＣＧＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＡＣＴＡＴＡＣＴＣＡＣＴＡＴＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＣＡＡＣＣＴＴＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＴＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＴＡＣＴＴＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＡＧＧＣＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＴＡＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡ

【0243】

配列番号６－ヒトＧＦＡＰプロモーター
ＧＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＴＧＴＴＣＧＧＧＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＴＴＧＡＧＴＡＧＧＧＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＴＴＧＧＧＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＡＧＴＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＡＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴＧＡＣＣＣＴＴＡＧＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧＡＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴ

【0244】

配列番号７－マウスＡｌｄｈ１Ｌ１プロモーター
ＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＡＡＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＡＴＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＡＧＧＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧＴＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣＴＣＣＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＡＧＣＡＴＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴＡＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＣＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＣＣＣＧＧＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＣＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＣＣＧＣＡＡＡＴＧＧＡＣＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＡＴＴＣＴＡＧＧＧＡＣＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＧＧＴＣＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＧＧＣＣＴＣＣＴＡＴＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＧＣＡＧＣＴＡＧＣＡＧＧＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＧＴＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＣＧＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ

【0245】

配列番号８－ヒトＮＧ２プロモーター
ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＡＣＣＣＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＴＴＡＧＧＧＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＣＴＴＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＣＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＴＡＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＡＣＴＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＡＧＧＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣＡＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＧＣＡＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＣＣＣＴＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＧＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＡＡＧＴＣＴＴＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＣＡＣＧＧＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＡＡＧＴＧＣＧＣＧＧＡＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＧＧ

【0246】

配列番号９－ＣＡＧ：：ＮｅｕｒｏＤ１－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ
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【0247】

本明細書で言及される任意の特許または刊行物は、あたかも各個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0248】

本明細書に記載の組成物および方法は、現在、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていない。その中での変更およびその他の使用が、当業者に生じるであろう。かかる変更および他の使用は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【配列表】

2023502782000001.app

【国際調査報告】