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特表2023-502800熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧ

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-26

(54)【発明の名称】熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧ

(51)【国際特許分類】

C12N 15/55 20060101AFI20230119BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20230119BHJP

C12N 9/24 20060101ALI20230119BHJP

C12Q 1/686 20180101ALI20230119BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20230119BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20230119BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20230119BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20230119BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N15/63 Z ZNA

C12N9/24

C12Q1/686 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021506733

(86)(22)【出願日】2020-10-22

(85)【翻訳文提出日】2021-02-08

(86)【国際出願番号】 KR2020014468

(87)【国際公開番号】W WO2022085818

(87)【国際公開日】2022-04-28

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515195738

【氏名又は名称】エンジノミクスカンパニーリミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】509272698

【氏名又は名称】大邱慶北科學技術院

【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＧＵＧＹＥＯＮＧＢＵＫＩＮＳＴＩＴＵＴＥＯＦＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子修平

(72)【発明者】

【氏名】シンヨンゴル

(72)【発明者】

【氏名】ユンジョンヨン

(72)【発明者】

【氏名】ナムギフン

(72)【発明者】

【氏名】イムスルギ

(72)【発明者】

【氏名】ユウギョン

(72)【発明者】

【氏名】バクソンジュン

(72)【発明者】

【氏名】イジュファン

(72)【発明者】

【氏名】ギムサンヨル

(72)【発明者】

【氏名】ガンムソク

(72)【発明者】

【氏名】ソミンゼ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD02

4B050FF01

4B050FF03E

4B050FF14E

4B050LL03

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR15

4B063QR42

4B063QS25

4B063QX02

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA46

(57)【要約】

本願は、野生型対比熱感受性が増加した突然変異ＵＤＧを開示する。本願に係る突然変異ＵＤＧは、高い熱感受性でＰＣＲ反応の阻害効果がなくてＰＣＲ／ｑＰＣＲＰｒｅＭＩＸの開発はもちろん、特に低いｍｅｌｔｉｎｇ及びａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｅｐが必要な実験により適したＵＤＧ適用ＰＣＲ診断キット開発を可能にする。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１の配列で表される大腸菌由来の野生型ＵＤＧ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡＧｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）タンパク質にＥ４Ａ、Ｗ７Ａ、Ｅ１３Ａ、ｑ１６Ａ、Ｙ１９Ａ、Ｄ４３Ｘ、Ｆ４８Ａ、Ｆ５０Ａ、Ｅ５２Ａ、Ｈ６７Ａ、Ｋ５７Ａ、ｑ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ｐ８７Ａ、Ｌ９６Ａ、Ｅ１１２Ａ、Ｌ１２１Ａ、Ｈ１３４Ａ、Ｅ１４２Ａ、Ｆ１４４Ａ、Ｒ１５６Ａ、Ｆ１６１Ａ、Ｌ１６２Ａ、Ｗ１６４Ａ、Ｈ１８０Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｈ２０２Ａ、Ｇ２１４Ｅ、Ｇ２１４Ｗ、Ｇ２１４Ｒ、Ｗ２２０Ａ、及びＬ２２４Ａで構成される群から選択されるアミノ酸置換が導入された、野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質であって、
前記アミノ酸置換を示す各数字はアミノ酸残基の位置を示し、アルファベットはアミノ酸残基を示し、野生型残基は左側に示し、置換された残基は右側に示し、前記Ｘは、任意のアミノ酸残基を示すものである、野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質。

【請求項2】

前記Ｄ４３ＸのＸはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、ＶまたはＷアミノ酸残基のうちのいずれかである、請求項１に記載の野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質。

【請求項3】

前記突然変異ＵＤＧタンパク質は、Ｄ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３ＷまたはＫ５７Ａの中の一つ以上を含むものである、請求項１に記載の野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質。

【請求項4】

前記突然変異ＵＤＧタンパク質は、Ｅ１５７ＡまたはＥ２１５Ａアミノ酸置換をさらに含むものである、請求項２に記載の野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質。

【請求項5】

前記突然変異ＵＤＧタンパク質は、二つ以上の置換の組み合わせを含み、該組み合わせはＤ４３Ａ／Ｋ５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ、または、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａの置換から選択される二つ以上の置換の組み合わせである、請求項１に記載の野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質。

【請求項6】

請求項１乃至請求項５のうちのいずれか一項に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質を含むＲＴ、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応で反応物中の核酸汚染除去用キット。

【請求項7】

請求項１乃至請求項５のうちのいずれか一項に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質、ＰＣＲ重合酵素及びＰＣＲ反応に必要な緩衝液を含む、ＰＣＲプレミックス組成物。

【請求項8】

請求項１乃至請求項５のうちのいずれか一項に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質、ＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）酵素及びＲＴ反応に必要な緩衝液を含む、ＲＴプレミックス組成物。

【請求項9】

請求項１乃至請求項５のうちのいずれか一項に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質、ＲＴ酵素、ＰＣＲ重合酵素及びＲＴ－ＰＣＲ反応に必要な緩衝液を含む、ＲＴ－ＰＣＲプレミックス組成物。

【請求項10】

請求項１乃至請求項５のうちのいずれか一項に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質を、核酸を含む反応物の中で５乃至５５℃で反応させる段階を含む、分析対象サンプルで核酸汚染除去方法。

【請求項11】

前記反応物は、ＲＴ、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられるものである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

請求項１乃至請求項５のうちのいずれか一項に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質をコードする核酸。

【請求項13】

請求項１２に記載の突然変異ＵＤＧタンパク質をコードする核酸を含むベクター。

【請求項14】

請求項１３に記載のベクターを含む原核細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧ及びその用途に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）は、特定核酸を増幅する方法で生物学、生化学及び医学分野で最も広く用いられる方法の一つである（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．ＩｍＭｕｎｏｌ．２００２，９（３），５０８－５１４）。

【0003】

しかし、ＰＣＲは非常に高感度で迅速な分子診断検査法であるが、検出しようとする対象とＰＣＲによって増幅された産物がＤＮＡで、互いに同じであるため、偽陽性の問題が生じる可能性が高い。特に、以前の反応で増幅されたＰＣＲ産物や検体の処理過程中発生したキャリーオーバー汚染（ｃａｒｒｙ－ｏｖｅｒｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）により偽陽性増幅が起きることがある。実際ＰＣＲ診断検査を実施する診断実験室の場合、同じプライマーを使用するＰＣＲ増幅実験を数千から数万回繰り返し行うため、以前の反応で増幅されたＰＣＲ産物がエアロゾルなどの形態で空気中を漂って次回の反応チューブに混入されて偽陽性増幅を起こすとの例は多く報告されてきている。

【0004】

このようなＰＣＲ増幅産物のキャリーオーバー汚染は、一度発生すると、増幅産物の量が極めて大量に増加するので（初期ＤＮＡ対比約１０^１３倍）、通常の洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ）方法では汚染を除去しにくい問題点がある。キャリーオーバー汚染は、感染病や遺伝疾患を診断するに当たり感染しなかったヒトを患者と誤診して重大な問題を起こすことがある。以前に別の患者を診断する際に増幅されたＤＮＡが感染しない新しいヒトのサンプルを検査する際に混入されて正常なヒトを患者と判定してしまい、その結果誤った処方と治療につながることがある。

【0005】

このようなキャリーオーバー汚染を解決するため、現在最も広く用いられる方法は、ＵｒａｃｉｌＤＮＡＧｌｙｃｏｓｙｌａｓｅを利用した方法である。ＵＤＧ処理法ではまず、ＰＣＲ反応液にｄＴＴＰ／ｄＵＴＰの混合物を添加してＰＣＲを行うことによってＴとＵが混合された増幅産物を作る。以後の反応からはＰＣＲ反応を行う際にＵＤＧ酵素をＰＣＲ反応液に添加して３７～５０℃、５～３０分の先行反応を含ませてＰＣＲ診断を行う。このような過程を介してＣａｒｒｙｏｖｅｒｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎが発生する場合、汚染されたＤＮＡはｄＵを含むことになり、これらはＵＤＧによってＵｂａｓｅが除去される。ＵＤＧが処理されてベースがなくなったＤＮＡは、不安定であるためＰＣＲ過程中に熱によって短い断片に切られてしまい、従ってこれらはこれ以上鋳型ＤＮＡとして用いられることができない。

【0006】

ＵＤＧ処理法は、必要な試薬（ＵＤＧ酵素、ｄＵＴＰ）をＰＣＲ反応液に含まれたまま使用することができ、通常のＰＣＲプログラムに１ｓｔｅｐだけ追加すれば良いので、単一反応／単一過程でキャリーオーバー汚染を容易に防止できるという長所がある。

【0007】

しかし現在広く用いられるＵＤＧ酵素は、多くは大腸菌から由来して熱的安定性が高く、しかもＰＣＲ過程が終了した後にも活性が生きている場合がある。このため、増幅産物を直ちにアガロースゲルで分析しなければ増幅産物自体が分解される現象が起きる問題点がある。

【0008】

さらには、複雑なＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲの場合、ＴａｑＭａｎプローブ配列設計の限界があるため、比較的低い温度（約５０℃）でアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応を行わなければならない場合がある。この時、大腸菌由来のＵＤＧ酵素の場合、該当温度で活性を保有しているので、適切に増幅された産物でさえ分解して全体的なＰＣＲの感受度を阻害させる（Ｃｔｖａｌｕｅのｄｅｌａｙ）問題が生じる。これは、ＰＣＲ診断キットの性能を低下させる原因として作用する。

【0009】

比較的低い温度で最適活性を支援する低温性微生物由来のＵＤＧの例で、海洋微生物ＢＭＴＵ３３４６菌株から由来したｍａｒｉｎｅＵＤＧがある（Ｊａｅｇｅｒ，Ｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ、ｓｅｑｕｅｎｃｙ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅａｔ－ｌａｂｉｌｅｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｆｒｏｍａｍａｒｉｎｅｐｓｙｃｈｒｏｐＨｉｌｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｓｔｒａｉｎＢＭＴＵ３３４６．ＥｘｔｒｅｍｏｐＨｉｌｅｓ．２０００，４（２）：１１５－１２２）。しかし、これは本来菌株でない大腸菌から組換え形態で発現させるので、Ｅ．ｃｏｌｉＵＤＧに比べて発現率及び溶解度が低く、単位酵素当たり精製費用が高く、精製過程が相対的に複雑な短所がある。

【0010】

従って、熱感受性が高くてＰＣＲなどといった反応過程中に熱によって不活性化され易く、一度不活性化されたら再活性化されないＵＤＧの開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

熱感受性が高くてＰＣＲ過程中に熱によって不活性化され易く、一度不活性化されたら再活性化が起こりにくい新しい熱感受性突然変異ＵＤＧを提供しようする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

一様態において、本願は配列番号１の配列で表される大腸菌由来の野生型ＵＤＧ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡＧｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）タンパク質にＥ４Ａ、Ｗ７Ａ、Ｅ１３Ａ、ｑ１６Ａ、Ｙ１９Ａ、Ｄ４３Ｘ、Ｆ４８Ａ、Ｆ５０Ａ、Ｅ５２Ａ、Ｈ６７Ａ、Ｋ５７Ａ、ｑ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ｐ８７Ａ、Ｌ９６Ａ、Ｅ１１２Ａ、Ｌ１２１Ａ、Ｈ１３４Ａ、Ｅ１４２Ａ、Ｆ１４４Ａ、Ｒ１５６Ａ、Ｆ１６１Ａ、Ｌ１６２Ａ、Ｗ１６４Ａ、Ｈ１８０Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｈ２０２Ａ、Ｇ２１４Ｅ、Ｇ２１４Ｗ、Ｇ２１４Ｒ、Ｗ２２０Ａ、及びＬ２２４Ａで構成される群から選択されるアミノ酸置換が導入された、野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質を提供し、前記各数字は、アミノ酸残基の位置を示して、アルファベットはアミノ酸残基を示して野生型残基は左側に、置換された残基は右側に示して、前記Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。

【0013】

一実現例において、本願に係る突然変異ＵＤＧは、４３番位置に置換を含み、前記置換は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、ＶまたはＷアミノ酸残基のうちのいずれかである。

【0014】

本願において、４３番位置で置換されたアミノ酸と本願明細書に記載された表２を基に、非常に保存されたアミノ酸、相当保存されたアミノ酸及び保存されたアミノ酸を考慮すると、４３番目の位置には前記置換されたアミノ酸を含むＡ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ｑ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｍ、またはＦで置換可能であり、本願に係る効果をもたらせることを当業者なら分かるであろう。

【0015】

一実現例において、野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質は、Ｄ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３ＷまたはＫ５７Ａの中の一つ以上を含み、別の実現例において、前記野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質は、Ｅ１５７ＡまたはＥ２１５Ａアミノ酸置換をさらに含むことができる。

【0016】

一実現例において、本願に係る突然変異タンパク質は、置換の組み合わせを含み、これはＤ４３Ａ／Ｋ５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ、または、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａから選択される二つの以上の置換の組み合わせを含む。

【0017】

別の様態において、本願は、本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質を含むＲＴ、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応で反応物中の核酸汚染除去用キットを提供する。

【0018】

さらに別の様態において、本願は本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質、ＰＣＲ重合酵素及びＰＣＲ反応に必要な緩衝液を含む、ＰＣＲプレミックス組成物を提供する。

【0019】

また別の様態において、本願は、本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質、ＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）酵素及びＲＴ反応に必要な緩衝液を含む、ＲＴプレミックス組成物を提供する。

【0020】

さらに別の様態において、本願は、本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質、ＲＴ酵素、ＰＣＲ重合酵素及びＲＴ－ＰＣＲ反応に必要な緩衝液を含む、ＲＴ－ＰＣＲプレミックス組成物を提供する。

【0021】

さらに別の様態において、本願は、本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質を核酸を含む反応物の中で約５乃至５５℃で反応させる段階を含む、分析対象サンプルで核酸汚染除去方法を提供する。

【0022】

一実現例において、前記反応物は、ＲＴ、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応に用いられる。

【0023】

別の様態において、本願は、さらに本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞を含む。

【発明の効果】

【0024】

本願に係る突然変異ＵＤＧは、野生型または既存の市販中のＵＤＧと比較して高い熱感受性を持って、続くＰＣＲ反応で効果的に不活性化される。従って、ＰＣＲ反応を阻害しないため、ＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、逆転写）、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ－ＰＣＲまたは定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のプレミックス（ＰｒｅＭＩＸ）の開発はもちろん、特に低い温度のメルティング及び増幅段階が必要な実験により適したＵＤＧ適用ＰＣＲ診断キット開発を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】本願の一実現例により熱感受性アミノ酸残基を選別するため、分子動力学から求めた相互作用エネルギーネットワークグラフである。

【図2】本願の一実現例により製造された突然変異を持つＵＤＧタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌で各目的タンパク質が発現するのをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果である。

【図3】本願の一実現例よって製造された突然変異を持つＵＤＧタンパク質の熱感受度をテストするために用いたイン・ビトロＵＤＧ活性アッセイの原理を模式的に示した図である。

【図4】図３の原理に係る分析物を変性ＰＡＧＥ分析を介して確認した結果で切断された一本鎖だけを特異的に分析可能である。

【図5】本願の一実現例よって製造された突然変異を持つＵＤＧタンパク質の熱感受度を図３及び図４の方法により測定した結果である。

【図6】図５で選別されたＤ４３Ａ、Ｋ５７Ａ、Ｅ１５７Ａ及びＥ２１５Ａ突然変異ＵＤＧの熱感受度を図３及び図４の方法により測定した結果である。Ｄ４３ＡとＫ５７Ａクローンで野生型よりも約３～５倍以上活性を失い（０．２ｎｇ基準）。Ｅ１５７ＡとＥ２１５Ａの場合にも、野生型に比べて熱による活性低下が約３０％程度より大きいことが分かった。

【図7】Ｄ４３Ａ突然変異の熱感受度を、放射性同位元素を利用して測定した結果である。野生型の場合、約５０％の活性が減少するのに約１５分かかったが、Ｄ４３Ａクローンの場合、最初２分熱処理によって７０％以上活性が減少して、５分からは９０％以上活性が減少するのを確認することができる。このような結果から突然変異ＵＤＧの熱感受度が野生型に比べて大幅に高いことを確認することができる。

【図8】野生型とＤ４３Ａ突然変異ＵＤＧのｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅの差を測定するため、Ｊ－８１５ＣＤｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）を利用して円偏光二色性（ＣＤ）分析を実施した結果で、ＷＴのＴｍは約４４℃、Ｄ４３Ａ突然変異のＴｍは約３９℃で測定された。この結果は、Ｄ４３Ａ突然変異が野生型よりも酵素の三次元的構造安定性が低いことを意味して、従って突然変異の高い熱感受性を裏付ける結果である。

【図9】突然変異と野生型ＵＤＧの様々な生化学的特性を様々なバッファー条件で測定した結果で、ｐＨを６．６から９まで異にしてＵＤＧの活性変化を測定した結果、Ｄ４３Ａ突然変異と野生型で共に酵素活性に大きい影響を与えないと確認された。

【図10】突然変異と野生型ＵＤＧ塩濃度に応じた活性影響度を評価するため、ＮａＣｌ濃度を２０から２５０ｍＭまで異にして活性を測定した結果で、野生型と突然変異ＵＤＧ共に低いｓａｌｔ濃度で高い活性を示し、ｓａｌｔ濃度が高いほど活性が阻害されることが示された。特に、２００ｍＭ以上では２０ｍＭでのＵＤＧ活性の２０％程度だけを示すと明らかになったが、このような塩による活性阻害効果は、野生型と突然変異共に類似することが確認された。

【図11】突然変異と野生型ＵＤＧの２価金属イオンの濃度に応じた酵素の活性変化を測定した。これのために、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２を０．０１から１ｍＭまで様々な濃度で用いた。実験結果、野生型と突然変異ＵＤＧ共に２価金属イオンの濃度が増加するほど活性が略阻害されることが示されたが、突然変異と野生型ＵＤＧとの間のｄｉｖａｌｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎ濃度に応じた活性阻害度の差は殆どないことが示された。

【図12】突然変異と野生型ＵＤＧのＺｎＣｌ_２とＣｏＣｌ_２の濃度に応じた酵素の活性変化を測定した結果である。ＺｎＣｌ_２とＣｏＣｌ_２の場合には、各々０．０５ｍＭと０．２ｍＭで９５％以上酵素の活性が抑制されることが示された。

【図13】野生型と突然変異ＵＤＧの最適反応温度を確認するために、５～９５℃まで５℃間隔で酵素の活性を測定した。実験結果野生型と突然変異共に４５℃で最適活性を示すことが確認された。しかし、熱感受性が高いと確認されたＤ４３Ａ突然変異の場合、３５℃での活性が５５℃活性の約３倍程度で測定されて（野生型の場合、略同じ）、全般的な最適活性温度が野生型に比べて低い側に偏っていることを示す。このような結果は、Ｄ４３Ａ突然変異の熱感受性が野生型に比べて高いから現れたものと判断される。

【図14】ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲで突然変異と野生型ＵＤＧによるＰＣＲ効率阻害効果を分析した結果である。野生型ＵＤＧを用いた場合、反応に添加したＵＤＧ量に比例してＣｔ（Ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値が増加し、これはＵＤＧ反応過程以後の前変性段階で野生型ＵＤＧが完全に不活性化されずに、以後のＰＣＲ増幅段階で増幅された産物を分解していることを意味する。しかし、本願の突然変異ＵＤＧは、野生型に比べて高い熱感受性を示し、特にＤ４３ＡとＫ５７Ａ突然変異の場合、ＰＣＲ過程中に存在する９５℃反応条件で速く不活性化されて、添加したＵＤＧの量に応じたＣｔ値の変化が殆どないことを確認することができた。

【図15】本願の一実現例により製造された、Ｄ４３位置がＣ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｗアミノ酸で置換された突然変異ＵＤＧを発現、精製した結果である。前記突然変異に対するＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ結果は図１５及び図１６に記載されている。

【図16】図１５で製造された突然変異ＵＤＧの熱感受度をＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙで分析した結果である。Ｄ４３位置を各々Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｗに変更させた際に野生型対比各々５３、５２、３２、６５倍熱感受度が増加することが示され、Ｄ４３Ａの場合、既存実験結果と類似して熱感受度が約８倍増加し、残りのＣ、Ｇ、Ｋ、Ｉ、Ｐ突然変異も程度の差はあるものの野生型対比約３～１５倍程度熱感受度が増加することが示された。

【図17】図１６の結果を野生型と比較して熱感受度増加倍数で示したものである。

【図18】Ｄ４３Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｅ２１５Ａ、Ｌ１６２Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｋ５７Ａ及びＫ１７１Ａ番目残基から選択される二つ以上の突然変異を含むＵＤＧの熱感受度を測定した結果である。Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ突然変異で共に野生型より２倍以上増加した熱感受性を示すのを確認することができた。しかしＤ４３Ａを含まない組み合わせ突然変異の場合、熱感受性増大効果が１．５倍以内であることが示された。このような結果は、Ｄ４３位置の突然変異がＥ．ｃｏｌｉＵＤＧの熱的安定性決定に重要であることを示す。

【図19】本願の一実現例により製造されたＥ４、Ｗ７、Ｙ１９、Ｆ４８、Ｅ５２、Ｈ６７、ｑ７１、Ｈ７３、Ｆ７７、Ｒ８０、Ｐ８７、Ｌ９６、Ｅ１１２、Ｌ１２１、Ｆ１４４、Ｆ１６１、Ｇ２１４位置をアラニン、グルタミン酸、アルギニンまたはトリプトファンで変化させた合計１９種の突然変異ＵＤＧの熱感受度の測定結果である。Ｗ７Ａ、Ｅ５２Ａ、Ｇ２１４Ｗ突然変異酵素の場合、野生型対比各々６．９倍、１４．２倍、９．３倍熱感受度が増加するのを確認することができる。この他にＹ１９Ａ、Ｆ４８Ａ、ｑ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ｅ１１２Ａ、Ｆ１４４Ａ、Ｆ１６１Ａ、Ｇ２１４Ｒ突然変異の場合にも熱感受性が約２倍以上増加することが示された。

【図20】本願に係るＤ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３ＷＵＤＧと野生型ＵＤＧの熱感受度及び不活性化後再活性化の可否を測定した結果である。野生型ＵＤＧの場合、５５℃熱処理後にも２２％の活性を保有すると確認されたが、本願に係るＵＤＧは４５℃で９０％以上不活性化されるのを確認することができる。さらに野生型ＵＤＧの場合、６５℃と７５℃で完全に不活性化されたが、８５℃と９５℃熱処理後には一部活性が残っていること（再活性化）を確認することができたが、本願に係るＵＤＧは、このような現象が現れなかった。これは、本願のＵＤＧが高い熱感受性によって最も効果的に不活性化されて再活性化されずＲＴはもちろんＰＣＲ反応に使用時ＰＣＲを阻害しなくてその効率を最も効果的に高めることができることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本願は、大腸菌ＵＤＧ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｓ）の特定残基に突然変異を導入して熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質の開発に基づいたものである。

【0027】

ＰＣＲのような増幅反応では、実際の鋳型でない、すでに一度増幅された産物が検体に汚染されて増幅される場合が頻繁に発生して、これによって偽陽性（ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅ）がもたらされる。これを防止するために、通常、増幅されたＤＮＡはｄＵＴＰを含むようにして、新しい増幅反応で増幅されたＤＮＡの汚染物は、反応初期にＵＤＧによって除去されて、その後ＵＤＧは不活性化されるか、熱感受度が低い場合、不活性化されずに残ってＰＣＲの増幅効率を減少させる問題がある。

【0028】

本願においては、大腸菌由来ＵＤＧの特定残基に置換突然変異を導入した結果、野生型と比較して熱感受度が向上して相対的に低い温度で行われた後に続くＰＣＲ反応でも不活性化されるので、ＰＣＲの増幅効率を減少させる従来の問題を解決した。

【0029】

そこで、一様態において、本願は、配列番号１の配列で表される大腸菌由来の野生型ＵＤＧタンパク質にＥ４Ａ、Ｗ７Ａ、Ｅ１３Ａ、ｑ１６Ａ、Ｙ１９Ａ、Ｄ４３Ｘ、Ｆ４８Ａ、Ｆ５０Ａ、Ｅ５２Ａ、Ｈ６７Ａ、Ｋ５７Ａ、ｑ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ｐ８７Ａ、Ｌ９６Ａ、Ｅ１１２Ａ、Ｌ１２１Ａ、Ｈ１３４Ａ、Ｅ１４２Ａ、Ｆ１４４Ａ、Ｒ１５６Ａ、Ｆ１６１Ａ、Ｌ１６２Ａ、Ｗ１６４Ａ、Ｈ１８０Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｈ２０２Ａ、Ｇ２１４Ｅ、Ｇ２１４Ｗ、Ｇ２１４Ｒ、Ｗ２２０Ａ、及びＬ２２４Ａで構成される群から選択される一つ以上のアミノ酸置換が導入された、野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質に関する。

【0030】

本願において、アミノ酸残基は、当業界に公知されたアルファベットの単文字で示し、野生型残基は、残基位置を示す数字の左側に、置換された残基は、右側に示して、前記Ｘは、任意のアミノ酸残基を示す。アルファベットの単文字は次のアミノ酸を示す：
Ａ、アラニンＡｌａｎｉｎｅ；Ｒ、アルギニンＡｒｇｉｎｉｎｅ；Ｎ、アスパラギンＡｓｐａｒａｇｉｎｅ；Ｄ、アスパラギン酸Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ；Ｃ、システインＣｙｓｔｅｉｎｅ；Ｅ、グルタミン酸Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ；Ｑ、グルタミンＧｌｕｔａｍｉｎｅ；Ｇ、グリシンＧｌｙｃｉｎｅ；Ｈ、ヒスチジンＨｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｉ、イソロイシンＩｓｏｌｅｕｃｉｎｅ；Ｌ、ロイシンＬｅｕｃｉｎｅ；Ｋ、リシンＬｙｓｉｎｅ；Ｍ、メチオニンＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ；Ｆ、フェニルアラニンＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｐ、プロリンＰｒｏｌｉｎｅ；Ｓ、セリンＳｅｒｉｎｅ；Ｔ、スレオニンＴｈｒｅｏｎｉｎｅ；Ｗ、トリプトファンＴｒｙｐｔｏｐｈａｎ；Ｙ、チロシンＴｙｒｏｓｉｎｅ；Ｖ、バリンＶａｌｉｎｅ；Ｘ、任意のアミノ酸。

【0031】

本願で用いられた用語“ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｓ，ＵＤＧ）”は、ＤＮＡ合成中にｄＵＴＰが組み込まれて入る場合、塩基ウラシルと糖であるデオキシリボースとの間のグリコシド（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ）結合を切断する酵素を称し、ＵＤＧは、自由ｄＵＴＰ、自由デオキシウリジン、またはＲＮＡには作用しない。

【0032】

一実現例において、本願に係る突然変異ＵＤＧペプチドは、配列番号１の配列を基準に４３番目位置にアミノ酸置換を含む。これのため、Ｅ．ｃｏｌｉＵＤＧと構造的類似性が高い様々な酵素を多重配列整列及び常用ウェブサーバーを利用した安定性分析を介してＤ４３位置に突然変異を誘発した際に最も熱安定性を減少させると計算された８種のアミノ酸残基を選別した。本願では、野生型アスパラギン酸残基（Ｄ）をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、ＶまたはＷのいずれか一つで置き換えた場合、野生型対比熱感受性が向上した突然変異ＵＤＧタンパク質を収得し、前記様々な残基は、いくつかの化学的性質でグルーピングされ得る２０個のアミノ酸残基を代表することができ、そこで、４３番目残基で野生型であるＤを除いた任意のアミノ酸で置換された突然変異ＵＤＧを含む。

【0033】

別の実現例において、本願に係る突然変異ＵＤＧペプチドは、５７番目位置にアミノ酸置換を含む。一実現例において、野生型５７番目位置にはリシン（Ｋ）残基はアラニンまたはこれと大きさ的化学的側面で類似のグリシン（Ｇ）で置換されたものである。

【0034】

本願で構築された突然変異ＵＤＧのアミノ酸配列に該当する配列番号は以下の表のとおりである。

【0035】

【表1】

【0036】

別の実現例において、本願に係る突然変異ＵＤＧは、二つ以上の突然変異の組み合わせを含む。

【0037】

一実現例において、二つ以上の突然変異の組み合わせを含む場合、４３番位置での突然変異を含み、これに追加してＫ５７Ａ、Ｅ１５７ＡまたはＥ２１５Ａの組み合わせを含む。

【0038】

一実現例においては、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ、または、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａであるが、これに制限されない。

【0039】

本願に係る突然変異ＵＤＧペプチドは、上のような配列で限定されず、これの生物学的均等物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）を含む。生物学的均等物とは、本願に開示されたアミノ酸配列に追加的な変形を加えたが、本願に係るポリペプチドと実質的に同じ活性を持つもので、このような変形は、例えばアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／または置換を含む。

【0040】

一実現例においては、本願に係る突然変異ＵＤＧペプチドに保存的アミノ酸置換が起きたものを含む。保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）とは、特定ポリペプチドが持つ活性を実質的に影響を及ぼしたり減少させない置換を意味する。

【0041】

保存的アミノ酸置換は、当業界に知らされており、例えばＢｌｏｓｕｍ（ＢＬＯｃｋｓＳＵｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎＭａｔｒｉｘ）に基づいた表２に記載されたとおりであり、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ（Ｅｄｓ）；及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）．“ＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎＭａｔｒｉｃｅｓｆｒｏｍＰｒｏｔｅｉｎＢｌｏｃｋｓ”．ＰＮＡＳ８９（２２）：１０９１５－１０９１９．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８９.２２.１０９１５；ＷＯ２００９０１２１７５Ａ１等に記載されたのを参照することができる。

【0042】

【表2】

【0043】

さらに、上述したような生物学的均等活性を持つ変移を考慮するならば、本願に開示されたアミノ酸配列または後述するようにこれをコードするポリヌクレオチドは、本願に開示されたのと実質的同一性を持つのも含まれる。実質的同一性とは、本願に開示された配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７０）４８：４４３；ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２４：３０７-３１；ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：２３７－４４；ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）５：１５１－３；Ｃｏｒｐｅｔｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１－９０；Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．（１９９２）８：１５５－６５及びＰｅａｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２４：３０７－３１に開示されている。ＮＣＢＩＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－１０）は、ＮＢＣＩなどで接近可能で、ｂｌａｓｔ、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴは、www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／で接続可能で、このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／blast_helphtmlで確認することができる。

【0044】

本願に係る突然変異ＵＤＧは、ＲＴ、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲ反応前に用いられて、特に核酸のキャリーオーバー汚染を除去する。

【0045】

本願で用いられた用語ＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、逆転写）は、ｍＲＮＡから相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する反応である。これのために、逆転写酵素（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）が用いられて、反応条件は一般に約４２～６０℃で約３０分間行われる。逆転写酵素は、市販で購入することができる。逆転写反応で合成されたｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応の鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いられるので、ＲＴ反応で汚染を除去することが重要で、さらに続くＰＣＲ反応を妨げないことがまた重要である。特に一つの試験管で行われるワンステップＲＴ－ＰＣＲで有利に作用することができる。ＲＴ－ＰＣＲにおいて本願に係るＵＤＧとＲＴ－ＰＣＲ反応物を１５～５５℃で約１０分間反応した後、約４２～６０℃で約３０分間ＲＴ反応を行って、以後連結して９２～９５℃で～０．５分（変性ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、５０～６５℃で～１分（アニーリングａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７０～７４℃で～１分／ｋｂを１サイクルにして２５～４０サイクル行うことができる。従来のＵＤＧの場合は、ＵＤＧとＲＴの反応温度が重なるので、ＲＴ－ＰＣＲに使用できなかったが、本願に係るＵＤＧは、ＲＴ反応の温度で（例えば４２℃）で相当部分不活性化されてＲＴ－ＰＣＲに使用可能になり得る。

【0046】

本願で用いられた用語ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）とは、特定核酸を増幅する方法で、生物学、生化学及び医学分野で最も広く用いられる方法の一つである（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，９（３），５０８－５１４）。ＰＣＲは、変性、プライマー結合及び伸長で構成される三つの段階を一つのサイクルにして多数のサイクルで繰り返されて、各段階はこれに適した温度で行われる。ＰＣＲに最も広く用いられる酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑＤＮＡ重合酵素であり、高い温度で熱安定により効率的かつ安定したＰＣＲを可能にする。特定核酸の存在の有無を確認する定性分析ＰＣＲ、特定核酸の量を測定する定量ＰＣＲ及びＰＣＲ過程をリアルタイムで追跡して定性及び定量分析を可能にするリアルタイムＰＣＲをともに含む概念である。

【0047】

そこで、他の側面で本願は、本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質を含むＲＴ、ＲＴ－ＰＣＲまたはＰＣＲ反応で反応物の核酸汚染除去用キットまたは組成物に関する。

【0048】

さらに他の側面で本願は、本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質を含むＲＴ、ＲＴ－ＰＣＲまたはＰＣＲ反応用キットまたは組成物に関する。

【0049】

本願に係る組成物は、プレミックスの形態で提供され得る。プレミックスとは、ＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、逆転写）、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ－ＰＣＲまたは定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）等に本願に係るＵＤＧまたはこれを含む組成物が用いられる場合、前記各反応に必要な各構成要素が製造段階ですでに混合されて濃縮された形態で使用者に供給される試薬で、このようなプレミックスを利用する場合、使用者は、例えばＰＣＲの場合、プレミックスは本願に係るＵＤＧに追加してＰＣＲ反応に必要な耐熱性重合酵素、ｄＮＴＰ及び緩衝溶液（バッファー）を含み、使用者は鋳型ＤＮＡ、プライマー及び精製水だけ追加で添加して使用することができる。ＰＣＲプラミクスは、本願に係るＵＤＧ、Ｔａｑ重合酵素、ｄＮＴＰ、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋のような二価陽イオン、塩、緩衝液、保存剤及び／または添加剤を含むことができる。前記成分中、塩の例としては、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＡｍＭｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ、緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｓｏｄｉｕｍ－／Ｐｏｔａｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ、保存剤の例としては、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、添加剤の例としては、ＤＭＳＯが挙げられ、特にそれらに制限されない。具体的使用目的や用途に応じて本願に係る組成物はさらに他の活性を有する酵素と共に混合でき、例えば、ＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＵＴＰａｓｅ、Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＤＮＡｓｅ／ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒと共に使用されてもよく、この場合、該当酵素の活性を示すために必要な組成物が追加で使用できたり、変更されることができる。

【0050】

さらに別の側面で本願は、本願に係るＵＤＧタンパク質を利用したＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、逆転写）、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ－ＰＣＲまたは定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の反応で核酸汚染除去方法またはＰＣＲ方法に関する。

【0051】

本願に係るＵＤＧは野生型よりも最適反応温度及び不活性化温度が約５乃至１０℃程度低く、適切な量の酵素を用いる場合、通常４２～５０℃で行うＲＴ反応と結合したＯｎｅ－ｓｔｅｐＲＴ－ＰＣＲ／ＲＴ－ｑＰＣＲに効果的に利用され得る。また、低いメルティング及び増幅が一つの段階で行われるＰＣＲ反応に有利に使用され得る。

【0052】

本願に係る方法において、本願に係るＵＤＧを利用した核酸汚染除去反応は、１５℃乃至５５℃、または３５乃至４５℃、特に４０℃で行われることができる。

【0053】

本願に係る突然変異ＵＤＧは、ＲＴ反応で不活性化されることができる。ＲＴ反応は、通常に４２℃進行され、場合によって６０℃まででも行われる。特に、一実現例においてＤ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３Ｗは、４５℃で活性が１００％減少したので（図２０）、４２℃で進行されるＲＴ反応以前に不活性化が始まるので、ＲＴ反応を阻害しなくてＲＴ－ＰＣＲに適用時特に有利になる。

【0054】

本願に係る突然変異ＵＤＧは、ＰＣＲに用いられる温度で不活性化される。ＰＣＲは、変性／プライマー結合（アニーリング）／伸長の各段階に特定温度が必要であるが、特に多数個セットのプライマーを利用するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲの場合、ＴａｑＭａｎプローブ配列設計の限界のため、比較的低い温度（約５０℃以下）でアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応を行わなければならない場合がある。この時、大腸菌由来ＵＤＧ酵素の場合、該当温度で活性を示し、熱処理（最初変性温度）以後にも活性を示すため、ＰＣＲの増幅効率を顕著に低くする。本願に係るＵＤＧは、本願図１４に記載されたように、特に約５０℃以下のアニーリング反応が行われるＰＣＲに有用に使用することができる。

【0055】

一実現例において本願に係るＵＤＧを用いるＰＣＲ方法は、約５０℃以下、例えば約４５℃乃至約５０℃で行われるアニーリング反応を含むＰＣＲ反応に使用することができる。また、アニーリングとＤＮＡ合成が一つの段階で進行されるツーステップＰＣＲにも有用である。

【0056】

一実現例においてＰＣＲでＰＣＲ反応開示前に用いられて、反応物の核酸汚染を除去する。例えば、約１５～５５℃で約１０分間本願に係るＵＤＧで処理して反応物の汚染を除去して、続いて約９２～９５℃で約０．５分（変性）処理でＵＤＧを完全に不活性化させて、鋳型を変性して、約５０～６５℃で約１分（アニーリング）、約７０～７４℃で約１分／ｋｂを１サイクルとして２５～４０サイクルを行う。

【0057】

別の実現例においてワンステップＲＴ－ＰＣＲに用いられて、約１５～５５℃で約１０分間ＵＤＧで処理して反応物の核酸汚染を除去して、続いて約４２～６０℃で約３０分間ＲＴ反応を行うことができ、このようなＲＴ温度で本願に係るＵＤＧは、相当部分不活性化されてワンステップＲＴ－ＰＣＲに効果的に使用可能である。以後連結して約９２～９５℃で約０．５分（変性）、約５０～６５℃で約１分（アニーリング）、約７０～７４℃で約１分／ｋｂを１サイクルとて２５～４０サイクル行う。

【0058】

さらに別の実現例においては、ＲＴまたはＲＴ－ＰＣＲ反応でＵＤＧ反応段階が省略される。例えば、常温で前記反応のためのプレミックスを準備する間、常温でＵＤＧ反応が起きることがあり、本願に係るＵＤＧは後に続いた反応で効果的に不活性される。

【0059】

他の側面で本願は、さらに上述した本願に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び前記組換えベクターが導入された細胞に関するものである。ポリヌクレオチド配列は、タンパク質配列が決定される場合、公示された、２０個のアミノ酸をコードするコドン配列から容易に決定されることができる。一つのアミノ酸をコードする複数個のコドンが存在する場合、生物の種に応じて選好して用いられるコドンの種類も知られており、本願では大腸菌で選好されるコドンを用いてポリヌクレオチド配列を導き出すことができる。

【0060】

本願に係るポリヌクレオチドは、様々な目的、例えば生産のために適切なベクターに導入されて用いられることができる。例えば、適した宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように適した調節配列、例えば転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列に作動可能に連結されて用いられることができる。このような本願に係るポリヌクレオチドが導入されることができるベクターまたはプラスミドは、宿主で複製できるのであれば特に制限されず、具体的な目的に合わせて公知された任意のベクターが用いられ、天然、または組換えプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λＴ１０、λＴ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣＨＡＲＯＮ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系統、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系ベクター、例えばｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＥＴ－２１ａ、ｐＥＴ－３２ａベクターなどを用いることができる。

【0061】

本願に係るポリヌクレオチドを含むベクターは、適当な宿主内に導入されて用いられ、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能したりすることができ、ゲノムそれ自体に統合されることができる。

【0062】

本願に係るポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを含む細胞は、特に原核細胞を含む。例えば、特にこれに制限されないが、大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞を含む。

【0063】

本願に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、宿主細胞内に導入されて発現のために様々な形態で導入されることができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されることができる。前記発現カセットは通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結言号、リボソーム結合部位及び翻訳終結言号を含む。前記発現カセットは、自ら複製が可能な発現ベクター形態であり得る。さらに、前記ポリヌクレオチドはそれ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。

【0064】

さらに別の側面で本願はさらに前記組換え細胞を培養して培養物を収得する段階；及び前記培養された細胞または培養物から前記ポリペプチドを回収する段階を含む本願に係る突然変異ＵＤＧタンパク質の産生方法に関する。

【0065】

本発明において、前記組換え細胞を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知されたバッチ培養方法、連続培養方法、流加培養方法などにより行われることが好ましく、培養条件は特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（ｐＨ５乃至９、好ましくはｐＨ６乃至８、最も好ましくはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができ、培養温度は２０乃至４５℃、好ましくは２５乃至４０℃を維持することができ、約１０乃至１６０時間培養することが好ましい。前記培養によって産生された前記ポリペプチドは、培地中に分泌されたり細胞内に残留したりすることができる。

【0066】

本発明において、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例：大豆油、ひまわり油、ピーナツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例：グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例：酢酸）等を個別的に使用するかまたは混合して使用でき；窒素供給源としては窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、とうもろこし浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）等を個別的に使用するかまたは混合して使用でき；リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別的に使用するかまたは混合して使用でき；その他金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンといった必須成長－促進物質を含むことができる。

【0067】

本発明の前記培養段階で産生されたポリペプチドを回収する方法は、培養方法、例えばバッチ、連続または流加培養方法などにより当分野公知された適した方法を利用して培養液から目的するポリペプチドを収集することができる。

【0068】

本発明は特に言及しない限り、分子生物学、ＤＮＡ組換え技術の技術水準内である通常の技術を用いて実施されることができる。また、通常の技術に関するより詳しい説明は、下記の本及び文献を参照することができる。分子生物学及び生化学に関する通常の方法に関しては、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ２００１）；ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈＥｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．ｅｄｓ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．，１９８５）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔｅｄ．，１９８４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；ＣｕｌｔｕｒｅＯｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ（ＦｒｅｓｈｎｅｙａｎｄＡｌａｎ，Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．，１９８７）；ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒａｎｄＣａｌｏｓ，ｅｄｓ．）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．）；及びＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）等を参照することができる。

【0069】

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより理解しやすくするために提供されるだけで、本発明が下記の実施例に限定されるのではない。

【実施例】

【0070】

実施例１．ＵＤＧ構造分析を介した熱感受性アミノ酸残基選別
ＸＲＤ実験で明らかになったＥ．ｃｏｌｉ由来ＵＤＧタンパク質の三次元構造を（ＰＤＢｃｏｄｅ：２ＥＵＧ）スーパーコンピューティングを利用して分子動力学シミュレーションを行った（分子動力学シミュレーションはすでに与えられたｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄを距離に対して微分してタンパク質を構成するすべての原子間のカを求めて、ニュートンの法則を利用して分子の運動を記述するシミュレーションである。（Ｆ＝ｍａ＝－ｄＵ／ｄｘ））。ＡＭＢＥＲｆｏｒｃｅ－ｆｉｅｌｄを利用して与えられた温度でタンパク質の構造の集合を分子動力学シミュレーションで求めて、これからタンパク質を構成するアミノ酸残基の間のすべての相互作用エネルギー、即ちエネルギーネットワークを計算した。

【0071】

図１は、シミュレーションから抽出されたアミノ酸残基の間のエネルギーネットワークを示して、これに対してＬａｐｌａｃｉａｎｎｅｔｗｏｒｋｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ分析を行ってエネルギーネットワークのハブを求めて、下記のように構造安定性に重要なアミノ酸リストを選別した：Ｅ１３、ｑ１６、Ｄ４３、Ｆ５０、Ｋ５７、Ｉ６０、Ｅ９７、Ｎ１０７、Ｈ１３４、Ｅ１４２、Ｒ１５６、Ｅ１５７、Ｌ１６２、Ｗ１６４、Ｋ１７１、ｑ１７８、Ｒ１７９、Ｈ１８０、Ｌ１８３、Ｈ２０２、Ｅ２１５、Ｗ２２０、Ｌ２２４．Ｌａｐｌａｃｉａｎｎｅｔｗｏｒｋｃｌｕｓｔｅｒｅｉｎｇは与えられたネットワークでｉ、ｊが接続できていれば、ｗｅｉｇｈｔを付与してそうでなければ０の値を持つ隣接行列（Ａｉｊ、ＡｄｊａｃｅｎｃｙＭａｔｒｉｘ）と、行列の対角成分ｉ、ｉがノードｉと連結されたｗｅｉｇｈｔの合計であり、残りの非対角成分は、全０であるＤｅｇｒｅｅＭａｔｒｉｘ（Ｄｉｊ）を求める。なおラプラシアン行列Ｌｉｊ＝Ｄｉｊ－Ａｉｊで定義する。なおラプラシアン行列の性質を利用してクラスタリングをしてハブを求める（Ｌｉｊを対角化してｎｏｎｚｅｒｏｌｏｗｅｓｔｅｉｇｅｎｖａｌｕｅに該当する固有ベクトルの値が同じ成分がグループを示して、ａｆｅｗｌａｒｇｅｓｔｅｉｇｅｎｖａｌｕｅに該当する固有ベクトルで値が大きい成分がｈｕｂと定義する。）。

【0072】

実施例２．熱感受性誘発候補突然変異ＵＤＧクローニング及びタンパク質発現
実施例１で選別された残基が各々アラニンで置換されたＵＤＧ遺伝子を下記のように製造した。
これのために野生型Ｅ．ｃｏｌｉＵＤＧ遺伝子（配列番号２）にＥＺｃｈａｎｇｅＳｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）及び表３のプライマーを使用者の指示のとおり用いて選別された残基に人為的に点突然変異を導入した。正しい突然変異が導入されたのか配列分析で確認した（ゼノテックまたはバイオニックス）。

【0073】

【表3】

【0074】

続いて前記の通りに製造された２４種の突然変異ＵＤＧタンパク質を下記のように発現した。前記２４種の熱感受性ＵＤＧ候補遺伝子を含む発現ベクターを各々ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ菌株にカルシウムクロリド熱ショック形質転換をした。引き続き前記形質転換された単一大腸菌コロニーを３７℃でＯＤ６００＝０．５～１になるように培養した後、１ｍＭＩＰＴＧを添加して４時間培養してタンパク質を発現させた。引き続き遠心分離を介して細胞ペレットを確保してソニケーションを介して細胞を破砕した後、再度遠心分離して可溶性分画と不溶性分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法で分析した。

【0075】

その結果図２に示された通り、野生型を含んで合計２５種の試料で目的タンパク質が発現するのを確認した。

【0076】

実施例３．候補突然変異ＵＤＧの熱感受度測定
続いて実施例２で発現したＵＤＧタンパク質２４種の中で熱感受度が増加した突然変異があるか確認するために、ＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙを行った。該当実験は５’端の部分に、ＦＡＭ蛍光物質が標識されており、中ほどにｄＵを一つ含んでいる完全に相補的な二本鎖ＤＮＡを基質として用いる実験方法である（図３及び図４参照）。

【0077】

これのために合計２０ｕｌの反応液に１０ＸＵＳＥＲｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（ＥＺＵＳＥＥｎｚｙｍｅ，Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）、ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）１００ｎｇ、二本鎖蛍光ｄＵ基質２０ｐｍｏｌを混合して準備した。ここに９５℃で５～１５分間熱処理または熱処理をしなかった野生型及び突然変異ＵＤＧを入れて３７℃で１５分間反応させると、ＵＤＧによってｄＵのｕｒａｃｉｌ塩基が切れてａｂａｓｉｃｓｉｔｅが形成される。次に、過量のＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＶＩＩＩによって非塩基部位が切断されて添加したＵＤＧの活性に比例して二本鎖ＤＮＡの一方の鎖が切断される（図３）。該当反応液を変性ＰＡＧＥ分析を介して確認すると切断された一本鎖だけを特異的に分析可能である（図４）。

【0078】

前記のようなＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ方法で不溶性タンパク質を産生する突然変異クローンを除いた２３種の候補突然変異ＵＤＧと野生型ＵＤＧに対する熱感受度テストを行った。分析には発現した可溶性分画を精製過程なしに定量だけして用いた。

【0079】

熱感受性増加率は次のような数式で計算した；
［熱処理以後５０％基質を切断するために必要な酵素の量］／［熱処理以前の５０％基質を切断するために必要な酵素の量］。

【0080】

結果は図５に記載されている。これに示されたとおり、Ｄ４３ＡとＫ５７Ａ突然変異が各々野生型対比５０％以上の熱感受性が増加して、Ｈ１３４Ａ、Ｅ１４２Ａ、Ｗ１６４Ａ、Ｈ１８０Ａ、Ｌ１８３Ａ、Ｈ２０２Ａ、Ｌ２２４Ａも野生型対比１０％以上熱感受性が増加したのを確認することができた。各突然変異ＵＤＧの特異的活性度はＷ１６４Ａクローンを除くと野生型対比５０％以内で測定されてＰＣＲ実験適用に適したことが確認された（Ｄａｔａｎｏｔｓｈｏｗｎ）。

【0081】

実施例４．突然変異ＵＤＧ精製及び熱感受度測定
（１）精製
ＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙ方法を介した熱感受性評価実験を基に今後追加開発及び評価のために５０％以上の熱感受性増加が確認されたＤ４３ＡとＫ５７Ａ、そして野生型と類似の熱感受性を持つものと評価されたＥ１５７ＡとＥ２１５Ａ及び野生型ＵＤＧ合計５種のタンパク質に対する精製作業を行った。約５０ｍｇの発現したＵＤＧが含まれた可溶性抽出物を１ｍｌのＮｉ－ＮＴＡｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合して４℃低温条件で３時間ｏｖｅｒｈｅａｄｒｏｔａｔｉｏｎしてＵＤＧとＮｉ－ＮＴＡｒｅｓｉｎの結合を誘導した。以後ｇｒａｖｉｔｙｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）で混合液を移した後、２０ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅのＷ１ｂｕｆｆｅｒ（ＣＢ２０００＋５ｍＭＩＤＺ）、２０ｃｏｌｕｍｎｂｕｆｆｅｒのＷ２（Ｄ．Ｗ）、１０ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅのＷ３（２ＭＮａＣｌ＋４０％エチレングリコール）、１０ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅのＷ４ｂｕｆｆｅｒ（ＣＢ３００＋２０ｍＭＩＤＺ）で順次洗浄した。最終的に６０ｍＭＩＤＺが含まれたＷ４ｂｕｆｆｅｒと２５０ｍＭＩＤＺが含まれたＥｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを使用してタンパク質を溶出した。

【0082】

これにより、野生型ＵＤＧと突然変異ＵＤＧ４種が含まれた合計５種のＵＤＧ酵素を精製した。野生型ＵＤＧの場合、最高１．３７ｍｇ／ｍｌ（１３７，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ）、Ｄ４３Ａの場合、最高１．５１ｍｇ／ｍｌ（１５１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ）、Ｋ５７Ａの場合、最高２．３２ｍｇ／ｍｌ（２３２，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ）、Ｅ１５７Ａの場合、最高１．６７ｍｇ／ｍｌ（１６７，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ）、Ｅ２１５Ａの場合、最高１．６３ｍｇ／ｍｌ（１６３，０００ｕｎｉｔ／ｍｌ）の濃度を確保した。確保されたＵＤＧの平均純度はＳＤＳ－ＰＡＧＥ実験結果、約９０～９５％範囲であることを確認することができた。

【0083】

（２）ＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧ活性分析を利用した熱感受度測定
候補突然変異ＵＤＧの熱感受性をより正確に測定するために、精製された突然変異ＵＤＧを使用してＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙを行った。図３及び図４と同じ方法で実験を進めて添加されたＵＤＧの量は０．２、１、２、５ｎｇ順に増加させて用いた。結果は、図６に記載されている。これに示された通り、熱処理以前には野生型と突然変異ＵＤＧに関係なく全０．２ｎｇと１ｎｇとの間で用いられた基質を９８％以上切断するのを確認した。しかし、９５℃で１５分間熱処理過程を先に進めた場合には、Ｄ４３ＡとＫ５７Ａクローンで野生型よりも約３～５倍以上活性をさらに多く低下させるのを確認することができた（０．２ｎｇ基準）。Ｅ１５７ＡとＥ２１５Ａの場合にも、野生型に比べて熱による活性低下が約３０％程度より大きいことが観察された（０．２ｎｇ基準）。

【0084】

（３）放射性同位元素を利用した熱感受度測定
突然変異ＵＤＧの熱感受性増加度をより直接的に確認するために、放射性同位元素を活用した活性測定実験を行った。これのために最初に、放射性同位元素で標識された基質を準備した。基質準備のために用いられたＤＮＡの配列は次のとおりである。基質１：５’-GGA ACA ATT CUG CGG CTT TAG-３’（配列番号１６０）、基質２：５’－CTA AAG CCG CAG AAT TGT TCC-３’（配列番号１６１）。まず基質１オリゴヌクレオチド２０ｐｍｏｌを８．２５ｐｍｏｌの［γ－^３２Ｐ］ＡＴＰとｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を利用して標識した。ＥＤＴＡを入れて反応を中断させた後、基質２オリゴヌクレオチドを２０ｐｍｏｌだけさらに添加した。該当反応液を最終１ＸＡｎｎｅａｌｉｎｇｂｕｆｆｅｒ［１２５ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］条件で混合してＰＣＲ装置を利用して二つの一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡで混成化させた。最終的に１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びゲル精製を介して純粋に分離した。

【0085】

このように準備した基質を利用して野生型と突然変異ＵＤＧの熱処理以前と以後の活性を評価した。まず２００ｆｍｏｌ／ｕｌで準備された精製された野生型及びＤ４３Ａ突然変異酵素を９５℃で０、２、５、１０、２０分間熱処理した。以後、それら各々１ｕｌずつ用いて合計２０ｕｌの反応液で（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡ）１５ｆｍｏｌの基質と反応させた。反応は、２５℃で１０分間進行され、その後同じ体積の２Ｘｓｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して反応を中断した。反応物を沸騰水で２０分間処理した後３ＭＨＣｌを２ｕｌ添加して塩濃度を中和した。最後に反応物８ｕｌを１５％変性ゲルに１ＸＴＢＥを入れて３５Ｗで３０分間電気永動して分離した。最終電気永動産物を８５℃で２．５時間３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ）紙の上に真空で乾燥した後ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ及びＸ－ｒａｙフィルムを利用して分析した。

【0086】

結果は、図７に記載されている。これに示された通り野生型の場合、約５０％の活性が減少するのに１５分近く掛かったが、Ｄ４３Ａクローンの場合、最初２分熱処理によって７０％以上活性が減少して５分からは９０％以上活性が減少するのを確認することができた。このような結果から突然変異ＵＤＧの熱感受度が野生型に比べて大幅に高いことを確認することができた。

【0087】

実施例５．突然変異ＵＤＧの野生型と比較したＴｍ分析
実施例４で精製されたタンパク質を利用して野生型とＤ４３Ａ突然変異ＵＤＧの融解温度を分析した。これのためにＪ－８１５ＣＤｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ、Ｊａｐａｎ）を製造者の方法のとおり利用して円偏光二色性（ＣＤ）分析を実施した。２５℃から９５℃まで温度を増加させながら２℃単位で２２２ｎｍの楕円率を測定した。結果は、図８に記載されている。これに示された通りＷＴのＴｍは約４４℃、Ｄ４３Ａ突然変異のＴｍは約３９℃と測定されて突然変異ＵＤＧのＴｍが約５℃程度低いことが確認された。この結果は、Ｄ４３Ａ突然変異が野生型よりも酵素の三次元的構造安定性が低いことを意味し、従って突然変異の高い熱感受性を裏付ける結果である。

【0088】

実施例６．突然変異ＵＤＧの野生型と比較したｐＨ、塩、２価カチオンによる活性差分析
実施例４で精製されたタンパク質を利用して野生型とＤ４３Ａ突然変異ＵＤＧの様々な生化学的特性を様々なバッファー条件で測定した。まずｐＨを６．６から９まで異にしてＵＤＧの活性変化を測定した結果、Ｄ４３Ａ突然変異と野生型で共に酵素活性に大きい影響を与えないことが確認された（図９参照）。

【0089】

塩濃度に応じた活性影響度を評価するために、ＮａＣｌ濃度を２０から２５０ｍＭまで異にして活性を測定した。野生型と突然変異ＵＤＧ共に低い塩濃度で高い活性を示し塩濃度が高くなるほど活性が阻害されるのを確認することができた。特に、２００ｍＭ以上では、２０ｍＭでのＵＤＧ活性の２０％程度だけを示すことが明らかになり、このような塩による活性阻害効果は、野生型と突然変異共に類似することが確認された（図１０参照）。

【0090】

最後に、２価金属イオンの濃度に応じた酵素の活性変化を測定した。２価金属イオンは、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２を０．０１で１ｍＭまで様々な濃度で用いた。実験結果、野生型と突然変異ＵＤＧ共に２価金属イオンの濃度が増加するほど活性が略阻害されるのを確認することができた（図１１及び図１２参照）。特に、ＺｎＣｌ_２とＣｏＣｌ_２の場合には、各々０．０５ｍＭと０．２ｍＭで９５％以上酵素の活性が抑制されるのを確認することができた（図１２）。しかし、突然変異と野生型ＵＤＧとの間の２価金属イオン濃度に応じた活性阻害度の差は殆どないことが確認された。

【0091】

実施例７．突然変異ＵＤＧの最適反応温度分析
実施例４で精製されたタンパク質を利用して野生型とＤ４３Ａ突然変異ＵＤＧの最適反応温度を分析した。これのために５～９５℃まで５℃間隔で酵素の活性を測定した。結果は、図１３に記載されている。実験結果、野生型と突然変異共に４５℃で最適活性を示すと確認された。しかし、熱感受性が高いと確認されたＤ４３Ａ突然変異の場合、３５℃での活性が５５℃活性の約３倍程度で測定されて（野生型の場合、略同じ）全般的な最適活性温度が野生型に比べて低い方に偏向していることが分かった（図１３）。このような結果は、Ｄ４３Ａ突然変異の熱感受性が野生型に比べて高いため、現れたものと判断される。

【0092】

実施例８．突然変異ＵＤＧのＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲでＵＤＧによる阻害効果減少実験
最も広く用いられる大腸菌由来ＵＤＧの場合、ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲに適用した時ＰＣＲ過程中に完全に不活性化されることなくＰＣＲ増幅産物を一部分解することによってＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲの効率を減少させる副作用があると観察されている。

【0093】

本願で開発された熱感受性ＵＤＧ突然変異の場合、ＰＣＲ過程中に速く不活性化されて、このような副作用がないことと予測した。これを実験的に検証するために、下記のような実験を行った。ヒトｃＤＮＡ１０ｎｇを鋳型にしてＧＡＰＤＨ遺伝子を標的ＤＮＡに増幅するために、Ｆｏｒｗａｒｄ（５’-ACGGATTTGGTCGTATTGGGC-３’）（配列番号１５７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’-TTGACGGTGCCATGGAATTTG-３’）（配列番号１５８）プライマーと蛍光ＴａｑＭａｎプローブ（５’FAM-CCTGGTCACCAGGGCTGCTTTTAA-TAMRA ３’）（配列番号１５９）を用いた（ゼノテック、韓国）。遺伝子増幅のために標準ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ８．３、１．５ＭｇＣｌ２、５０ｍＭＫＣｌ、０．２ｍＭｄＮＴＰ）に野生型Ｔａｑポリメラーゼ１ｕｎｉｔ（５０ｎｇ／ｕｎｉｔ）と野生型または突然変異ＵＤＧを０、１、２、５、１０ｎｇを混合して用いた。ＰＣＲ反応は、リアルタイムＰＣＲ装備（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、５０℃で４分ＵＤＧ反応段階、９５℃で１５分間前変性段階を経た後、９５℃で１０秒、５０℃で４０秒、６０℃で２０秒を１サイクルにして合計５０サイクルを行った。相対的蛍光値はサイクル毎の５０℃、４０秒反応後で測定して示した。

【0094】

結果は、図１４に記載されている。これに示されたように、野生型ＵＤＧを用いた場合、反応に添加したＵＤＧ量に比例してＣｔ（Ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値が増加するのを確認することができた。これは、ＵＤＧ反応過程以後の前変性段階で野生型ＵＤＧが完全に不活性化されることなく以後のＰＣＲ増幅段階で増幅された産物を分解していることを意味する。しかし、Ｄ４３ＡとＫ５７Ａ突然変異の場合、ＰＣＲ過程中に存在する９５℃反応条件で速く不活性化されて添加したＵＤＧの量に応じたＣｔ値の変化が殆どないことを確認することができた。程度の差はあるものの、Ｅ１５７ＡとＥ２１５Ａ突然変異の場合にも野生型よりも低いＣｔ値増加を示すことを確認することができ、これは該当突然変異が野生型ＵＤＧに比べて高い熱感受性を示すことを意味する。

【0095】

実施例９．４３番目残基でアラニン以外の様々なアミノ酸への突然変異製造及び熱感受性分析
より熱感受性が増加した突然変異を探すために、選別された残基を様々なアミノ酸に変化させては実験を行った。これのために、Ｅ．ｃｏｌｉＵＤＧと構造的類似性が高い様々な酵素を分子動力学シミュレーションを利用した自由エネルギー計算、多重配列整列及び常用ウェブサーバーを利用した安定性分析を介してＤ４３位置に突然変異を誘発した時、最も熱安定性を減少させると計算された８種のアミノ酸残基を選別した。これらは各々Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｗであり、実施例２、３と同様に部位特異的突然変異導入後タンパク質発現及び精製を介して突然変異ＵＤＧ８種を確保した。これに用いられたプライマーセットは表３に開示されている。

【0096】

これらの突然変異ＵＤＧを発現した結果は図１５に記載されている。

【0097】

これらを利用してＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙを行った結果を図１６、１７に示した。実験結果、Ｄ４３位置を各々Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｗに変更させた時、野生型対比各々５３、５２、３２、６５倍熱感受度が増加することが分かった。Ｄ４３Ａの場合、既存実験結果と似ているように熱感受度が約８倍増加するのを確認することができた。残りのＣ、Ｇ、Ｋ、Ｉ、Ｐ突然変異も程度の差はあるものの、野生型対比約３～１５倍程度熱感受度が増加する結果を得ることができた。このような結果から予測されたＤ４３位置にＡでない他のアミノ酸を導入しても、野生型対比熱感受性が増加するのを確認でき、特にＨ、Ｒ、Ｖ、Ｗ突然変異の場合、Ａより４～８倍増加した熱感受性を示した。

【0098】

実施例１０．組み合わせ突然変異製造及び熱感受性分析
次に前で確認された突然変異を互いに組み合わせた時、熱感受性がさらに増大するか確認するために、組み合わせ突然変異を製作した。一次に選別されたアミノ酸残基を組み合わせてｓｉｎｇｌｅ、ｄｏｕｂｌｅ、ｔｒｉｐｌｅ、ｑｕａｄｒｕｐｌｅ突然変異を製作して、新しい候補突然変異を追加して合計１７種の突然変異ＵＤＧに対して、ＩｎｖｉｔｒｏＵＤＧａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙを行った。結果は、図１８に記載されており、実験結果、Ｄ４３Ａと組合わせたＤ４３Ａ／Ｋ５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ、Ｄ４３Ａ／Ｋ５７Ａ／Ｅ１５７Ａ／Ｅ２１５Ａ突然変異で共に野生型より２倍以上増加した熱感受性を示すのを確認することができた。しかし、Ｄ４３Ａを含まない組み合わせ突然変異の場合、熱感受性増大効果が１．５倍以内であることを確認した。このような結果をまとめてみると、Ｄ４３位置の突然変異がＥ．ｃｏｌｉＵＤＧの熱的安定性維持に重要な役割をすることを確認することができた。

【0099】

実施例１１．様々な突然変異ＵＤＧ製造及び熱感受度分析
より様々な熱感受性ＵＤＧを選別するために、Ｅ４、Ｗ７、Ｙ１９、Ｆ４８、Ｅ５２、Ｈ６７、ｑ７１、Ｈ７３、Ｆ７７、Ｒ８０、Ｐ８７、Ｌ９６、Ｅ１１２、Ｌ１２１、Ｆ１４４、Ｆ１６１、Ｇ２１４位置をアラニン、グルタミン酸、アルギニンまたはトリプトファンに変化させた突然変異ＵＤＧを製作した。選択された残基は、以前の実験と似ているように構造を基に自由エネルギー計算によって予測された。

【0100】

結果は、図１９に記載されている。これに示された通り精製された合計１９種の突然変異ＵＤＧの熱感受性を既に確認されたＤ４３Ａ突然変異と比較／測定した結果、Ｗ７Ａ、Ｅ５２Ａ、Ｇ２１４Ｗ突然変異酵素の場合、野生型対比各々６．９倍、１４．２倍、９．３倍熱感受度が増加するのを確認することができた。この他にＹ１９Ａ、Ｆ４８Ａ、ｑ７１Ａ、Ｈ７３Ａ、Ｅ１１２Ａ、Ｆ１４４Ａ、Ｆ１６１Ａ、Ｇ２１４Ｒ突然変異の場合にも熱感受性が約２倍以上増加するのを観察することができた。

【0101】

実施例１２．本願の突然変異ＵＤＧと野生型ＵＤＧの不活性化温度及び再活性化の有無分析
本願に係る突然変異ＵＤＧ中でＤ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３Ｗを対象に比較実験を行った。

【0102】

野生型ＵＤＧ及び本願のＵＤＧは、事前実験を行って同等な量の基質を切断する濃度を決めた後、３５℃から９５℃まで１０℃間隔で温度を異にして５分間熱処理した後、３５℃、１５分反応を介してＵＤＧの活性を測定した。

【0103】

結果は図２０に記載されている。これに示された通り、５５℃以上では野生型ＵＤＧを除いたすべてのＵＤＧが不活性化されるのを確認した。野生型ＵＤＧの場合、５５℃熱処理以後２２％の活性を保有すると確認されたが、本願のＤ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３Ｗの場合、該当温度で完全に不活性化されるのを確認できて、熱感受性が高いことを確認することができた。

【0104】

これに加えて、Ｄ４３Ａは４５℃から、Ｄ４３ＲとＤ４３Ｖは３５℃から不活性化が開始するのを確認できて、熱感受性が相当高いことを確認することができた。これは、また４２℃で進行されるＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、逆転写）反応以前に不活性化が始まるので、ＲＴ反応を阻害しないことを示す。

【0105】

追加して、野生型ＵＤＧの場合、６５℃と７５℃で完全に不活性化されたが、８５℃と９５℃熱処理以後には一部活性が残っていること（再活性化）を確認することができたが、本願に係るＵＤＧはこのような現象が現れなかった。

【0106】

これは本願のＤ４３Ａ、Ｄ４３Ｃ、Ｄ４３Ｈ、Ｄ４３Ｒ、Ｄ４３Ｖ、Ｄ４３Ｗが高い熱感受性により効果的に不活性化されて再活性化されることなくＰＣＲ反応に使用時ＰＣＲを阻害しなくてその効率を最も効果的に高める可能性があることを示す。

【0107】

以上、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれらに限定されるのではなく、次の請求範囲で定義している本願の基本概念を利用した当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。

【0108】

本発明で用いられるすべての技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するのと同様の意味で用いられる。本明細書に参考文献として記載されるすべての刊行物の内容は本発明に導入される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2023502800000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021-02-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0025】

【図1】本願の一実現例により熱感受性アミノ酸残基を選別するため、分子動力学から求めた相互作用エネルギーネットワークグラフである。

【図2A-F】本願の一実現例により製造された突然変異を持つＵＤＧタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された大腸菌で各目的タンパク質が発現するのをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果である。

【図4】図３の原理に係る分析物をＤｅｎａｔｕｒｉｎｇＰＡＧＥ分析を介して確認した結果で切断された一本鎖だけを特異的に分析可能である。

【図5】本願の一実現例よって製造された突然変異を持つＵＤＧタンパク質の熱感受度を図３及び図４の方法により測定した結果である。

【図8】野生型とＤ４３Ａ突然変異ＵＤＧのｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅの差を測定するため、Ｊ－８１５ＣＤｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）を利用してｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ（ＣＤ）分析を実施した結果で、ＷＴのＴｍは約４４℃、Ｄ４３Ａ突然変異のＴｍは約３９℃で測定された。この結果は、Ｄ４３Ａ突然変異が野生型よりも酵素の三次元的構造安定性が低いことを意味して、従って突然変異の高い熱感受性を裏付ける結果である。

【図10】突然変異と野生型ＵＤＧＳａｌｔ濃度に応じた活性影響度を評価するため、ＮａＣｌ濃度を２０から２５０ｍＭまで異にして活性を測定した結果で、野生型と突然変異ＵＤＧ共に低いｓａｌｔ濃度で高い活性を示し、ｓａｌｔ濃度が高いほど活性が阻害されることが示された。特に、２００ｍＭ以上では２０ｍＭでのＵＤＧ活性の２０％程度だけを示すと明らかになったが、このような塩による活性阻害効果は、野生型と突然変異共に類似することが確認された。