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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-26
(54)【発明の名称】サッカロポリスポラ組成物及びその食品における使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20230119BHJP
A23L 7/104 20160101ALI20230119BHJP
A23L 27/50 20160101ALN20230119BHJP
C12H 6/02 20190101ALN20230119BHJP
A23L 13/60 20160101ALN20230119BHJP
C12G 3/022 20190101ALN20230119BHJP
A01J 25/00 20060101ALN20230119BHJP
A23L 17/00 20160101ALN20230119BHJP
C12J 1/00 20060101ALN20230119BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A ZNA
A23L7/104
A23L27/50 E
C12H6/02
A23L13/60 A
C12G3/022
A01J25/00
A23L17/00 D
C12J1/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576248
(86)(22)【出願日】2021-02-23
(85)【翻訳文提出日】2022-01-21
(86)【国際出願番号】 CN2021077377
(87)【国際公開番号】W WO2022033010
(87)【国際公開日】2022-02-17
(31)【優先権主張番号】202010812299.6
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010812161.6
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514262886
【氏名又は名称】江南大学
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】521555074
【氏名又は名称】江南大学（紹興）産業技術研究院
【氏名又は名称原語表記】Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｓｈａｏｘｉｎｇ） Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １９ Ｙａｎｇｊｉａｎｇ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ， Ｓｈａｏｘｉｎｇ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】毛健
(72)【発明者】
【氏名】劉双平
(72)【発明者】
【氏名】周志磊
(72)【発明者】
【氏名】姫中偉
(72)【発明者】
【氏名】韓笑
【テーマコード（参考）】
4B023
4B039
4B042
4B065
4B115
4B128
【Ｆターム（参考）】
4B023LC09
4B023LE30
4B023LG05
4B023LK18
4B023LP05
4B023LP08
4B023LP16
4B039LC17
4B039LG02
4B039LG06
4B039LG23
4B039LP08
4B039LP25
4B039LQ01
4B039LQ11
4B039LR01
4B039LR11
4B039LR15
4B039LR22
4B042AC04
4B042AD03
4B042AG12
4B042AH01
4B042AK01
4B042AK11
4B042AK16
4B042AK20
4B042AP27
4B065AA01X
4B065AC20
4B065BA22
4B065CA41
4B065CA42
4B065CA43
4B065CA60
4B115AG02
4B115NB02
4B115NG02
4B115NG17
4B115NP01
4B115NP02
4B128BC05
4B128BL01
4B128BP01
4B128BP10
4B128BP11
(57)【要約】
サッカロポリスポラ組成物及び食品におけるその使用であって、当該組成物は麦麹からスクリーニングした生体アミンの含有量を低減させる効果のあるサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２と、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３とを含む。２種の菌株で製造した混合サッカロポリスポラ製剤を発酵アルコール飲料、発酵食品又は発酵調味料の製造プロセスに用いると、生体アミンの含有量を低減するとともにアミノ酸の含有量を高め、発酵製品の栄養価を高めることができ、さらに、発酵食品の品質を向上させ、発酵食品の安全性を向上させるという目的を達成する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０３である、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２。
【請求項2】
請求項１に記載のサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を含む、微生物製剤。
【請求項3】
１ｇ又は１ｍＬの発酵剤におけるサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の数量が１×１０６ｃｆｕ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の微生物製剤。
【請求項4】
請求項１に記載のサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を使用して製造された麦麹、ふすま麹、酒薬（酒造りやもち米発酵用酵母）又は他の形態の麹。
【請求項5】
麹を作る原料を破砕して、水を加えて攪拌し、滅菌した後、無菌環境で前記サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を加えて、２５～５５℃で７２～９６時間培養して得られることを特徴とする、請求項４に記載の麦麹、ふすま麹、酒薬又は他の形態の麹。
【請求項6】
請求項１に記載のサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２と、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０４であるサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３とを含むことを特徴とする、サッカロポリスポラ組成物。
【請求項7】
前記サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の菌体数の比は１：（０．８～１．２）であることを特徴とする、請求項６に記載のサッカロポリスポラ組成物。
【請求項8】
請求項６又は７に記載のサッカロポリスポラ組成物を含む微生物製剤であって、１ｇ又は１ｍＬの微生物製剤におけるサッカロポリスポラの数量が１×１０６ｃｆｕ以上であることを特徴とする、微生物製剤。
【請求項9】
前記サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３とを含む生細胞、凍結乾燥して得た乾燥菌体、固定化された細胞、又は他の任意の形態で存在する微生物細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の微生物製剤。
【請求項10】
請求項６又は７に記載のサッカロポリスポラ組成物を使用して製造された麦麹、ふすま麹、酒薬又は他の形態の麹。
【請求項11】
麹を作る原料を破砕して、水を加えて攪拌し、滅菌した後、無菌環境で前記サッカロポリスポラ組成物を加えて、２５～５５℃で７２～９６時間培養して得られることを特徴とする、請求項１０に記載の麦麹、ふすま麹、酒薬又は他の形態の麹。
【請求項12】
発酵食品、調味料、飲料、タバコ、飼料の生産のための、請求項６もしくは７に記載のサッカロポリスポラ組成物、又は請求項８もしくは９に記載の微生物製剤、又は請求項１０もしくは１１に記載の麹の使用。
【請求項13】
前記発酵食品は発酵又は半発酵食品を含み、前記飲料は黄酒又は白酒を含み、前記調味料は食酢、醤油、調味料、チーズ又はソーセージを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
発酵食品又は飲料における生体アミンの含有量を低減させるための、請求項６もしくは７に記載のサッカロポリスポラ組成物、又は請求項８もしくは９に記載の微生物製剤、又は請求項１０もしくは１１に記載の麹の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、食品発酵技術の分野に属し、サッカロポリスポラ組成物及び食品におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
黄酒は１種の醸造酒で、一般にはもち米、トウモロコシ、キビを原料とし、糖化剤として麦麹を、発酵剤として酵母を加えて、蒸煮、加麹、糖化発酵、圧搾、濾過、煎酒（火入れ）、貯蔵、調合により得られたものである。黄酒には主成分の水、エタノールの他に、１８種のアミノ酸を含有している。そのうち８種の必須アミノ酸があり、等量のワイン、ビールに比べて当該８種のアミノ酸が数倍も多いため、黄酒を常に飲むのは健康に良いとされる。黄酒には、ポリフェノール、多糖、ポリペプチドなどの抗酸化物質を豊富に含有しているため、抗酸化活性がある。黄酒の醸造はビールやワインと違って、開放発酵プロセスを採用する。発酵反応系ではアミノ酸の含有量が豊富で、微生物の種類が複雑で数量が多く、コロニー構造が複雑である。発酵に関与する細菌は主に酢酸菌、乳酸菌、バシラス、サッカロポリスポラなどである。しかし、微生物の代謝生成物は黄酒に独特な風味をもたらすとともに、生体アミンなどの有害物質が黄酒に含まれる。
【0003】
生体アミンとは、アミノ酸の脱炭酸で形成される含窒素有機塩基性小分子化合物である。生体アミンは動植物と微生物の体内に一般的に存在し、適量の生体アミン成長を促進し、ラジカルを除去し、代謝活性を向上させ、免疫力を高めることができ、人体内で重要な生理機能を発揮する一方、過剰量の生体アミンを摂取すると動脈、血管及び微小血管が拡大するため、下痢、頭痛、腹部痙攣、嘔吐などの不良な生理反応を引き起こしたり、死に至らせる場合もある。生体アミンは様々な食品に幅広く存在しており、ヨーグルト、黄酒、白酒、料理酒、醤油、食酢、ワインなどの発酵食品には特に含有量が高い。
【0004】
発酵食品における生体アミンは主に微生物の代謝から生成されたアミノ酸脱炭酸酵素が遊離アミノ酸に作用して生成される。発酵プロセスでは微生物の代謝から生成されるプロテアーゼとカルボキシペプチダーゼが穀物のタンパク質に作用して、それを分解して低分子ペプチドやアミノ酸を生成して、生体アミンの生成のための豊富な前駆物質を提供し、アミノ酸脱炭酸酵素が作用すると、大量の生体アミンが生成される。
【0005】
現在、国内外の研究では食品発酵と生体アミン低減へのサッカロポリスポラの使用に関する報告が見当たらなかった。そのため、最新のバイオ技術を利用して、優れた特性がある微生物をスクリーニングすることは高品質、高生産量、独特な風味があって良質な発酵食品を生産し、発酵食品の安全性を向上させる分野では大きな意義がある。
【発明の概要】
【0006】
本発明の目的は、従来の醸造食品における生体アミンの含有量が高いという課題を解決するために、優れた特性があるサッカロポリスポラを提供し、酒類（白酒、黄酒）、ソーセージ及び醤油の発酵プロセスにおいて生体増強のために用いることにより、発酵食品における生体アミンの含有量を低減し、食品の食感と風味を改善して、従来の発酵食品における放線菌の使用をより有効に活用することである。
【0007】
本発明の第１の目的は、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３とを含むサッカロポリスポラ組成物を提供することである。
前記サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２は、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０３である。
前記サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３は、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託先は中国武漢の武漢大学であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０４である。
前記サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２は、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０３である。
前記サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３は、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託先は中国武漢の武漢大学であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０４である。
【0008】
本発明のサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２及びサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３は、いずれも次の優れた特性がある。
（１）食品発酵反応系に用いても、食品の正常な発酵に影響を与えない。
（２）当該菌株から製造された純粋な麦麹は黄酒の発酵に適し、黄酒のアミノ酸の含有量を高めることができる。
（３）生体アミンの生成量は２．５ｍｇ／Ｌ未満で、生体アミンの検出量は極めて少ない。
（４）チラミン、ヒスタミン、プトレシン、カダベリンのいずれにも分解効果がある。
（５）ソーセージ、黄酒、白酒、チーズ及び醤油の発酵に用いることができ、生体アミンを低減させる特性がある。
（１）食品発酵反応系に用いても、食品の正常な発酵に影響を与えない。
（２）当該菌株から製造された純粋な麦麹は黄酒の発酵に適し、黄酒のアミノ酸の含有量を高めることができる。
（３）生体アミンの生成量は２．５ｍｇ／Ｌ未満で、生体アミンの検出量は極めて少ない。
（４）チラミン、ヒスタミン、プトレシン、カダベリンのいずれにも分解効果がある。
（５）ソーセージ、黄酒、白酒、チーズ及び醤油の発酵に用いることができ、生体アミンを低減させる特性がある。
【0009】
本発明の第２の目的は、前記サッカロポリスポラ組成物を含む微生物製剤を提供することである。
【0010】
一実施形態において、前記１ｇ又は１ｍＬの発酵剤におけるサッカロポリスポラの数量は１×１０６ｃｆｕ以上である。
【0011】
一実施形態において、前記微生物製剤は前記サッカロポリスポラを放線菌液体培地に播種して、２８～３０℃で培養して得られた、サッカロポリスポラ細胞を含む発酵剤である。
【0012】
本発明の第３の目的は、前記サッカロポリスポラ組成物を用いて製造した麹を提供することである。その製造方法は次のとおりである。原料を破砕して水を加えて攪拌し、滅菌した後、無菌環境で種菌を播種し、播種量は５‰～１５％で、菌液濃度は１０５～１０８ｃｆｕ／ｍＬであり、２５～５５℃で７２～９６時間培養し、培養が終了した後、使用に備えて寄託する。
【0013】
一実施形態において、前記サッカロポリスポラ麹の原料を蒸煮した後、無菌条件下で攤涼し（広げて冷まし）、麹を播種して原料と均一に混合する工程及び後に開耙（水を追加）する工程はいずれも無菌環境において行われ、前記サッカロポリスポラ麹は無菌環境において播種及び培養して得る。
【0014】
一実施形態において、前記麹は前記サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２又は前記サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を用いて製造した純粋な麦麹を混合した混合麦麹である。
【0015】
一実施形態において、前記麦麹の製造方法は次のステップを含む。
（１）精麦であって、小麦を少量の粉末が付くように１粒を３～５片程度に破砕することにより、麦粒組織を破砕して、デンプンを露出させる。
（２）湿潤であって、ステップ（１）で処理した材料に材料の質量の３０～４０％の浄水を加え、１５～２５分間攪拌して、充分かつ均一に水分を吸収させる。
（３）蒸煮滅菌であって、ステップ（２）で処理した材料を蒸煮して滅菌する。
（４）播種であって、ステップ（３）の材料が４０℃未満に冷却した後、活性化されたサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を播種し、播種濃度は１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬである。
（５）発酵。
（１）精麦であって、小麦を少量の粉末が付くように１粒を３～５片程度に破砕することにより、麦粒組織を破砕して、デンプンを露出させる。
（２）湿潤であって、ステップ（１）で処理した材料に材料の質量の３０～４０％の浄水を加え、１５～２５分間攪拌して、充分かつ均一に水分を吸収させる。
（３）蒸煮滅菌であって、ステップ（２）で処理した材料を蒸煮して滅菌する。
（４）播種であって、ステップ（３）の材料が４０℃未満に冷却した後、活性化されたサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を播種し、播種濃度は１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬである。
（５）発酵。
【0016】
一実施形態において、前記ステップ（５）の発酵は次のステップを含む。
ａ）胞子発芽期であって、麹の原料をトレイに投入して６時間後に、品温が緩やかに約３４～３５℃に上昇し、自己制御モードをオンにして小風量で間欠的に通風し、１回は５～１０分で、間隔は２時間として、品温を３２℃に下げ、均一に吹き通さなければならない。
ｂ）菌糸成長期であって、間欠的通風が３～５回になると、菌糸が成長し始め、品温が３５℃以上に上がって、麹の原料が固結し始め、この時は連続的に通風し、品温を３５±２℃に維持すべきである。
ｃ）菌糸増殖期であって、播種から１２時間後に、品温が早く上昇し、この時は１回目の固結の状態に応じて麹をひっくり返す必要があり、麹をひっくり返す前に、測温プローブを持ち上げて、麹ひっくり返し装置をオンにした後、敷き詰めて、測温プローブを降ろして、通風・噴霧システムをオンにする。
ｄ）１回目に麹をひっくり返した後、品温が３６～３７℃に保持され、スムーズな通風噴霧を保持して、約２０時間後に、麹の原料が再び固結し、麹の原料が白みを帯びていることを目視にて確認し、温度を３７℃以下に制限して、２回目に麹をひっくり返し、麹を２回ひっくり返した後、品温を３５±２℃に制限する。
ａ）胞子発芽期であって、麹の原料をトレイに投入して６時間後に、品温が緩やかに約３４～３５℃に上昇し、自己制御モードをオンにして小風量で間欠的に通風し、１回は５～１０分で、間隔は２時間として、品温を３２℃に下げ、均一に吹き通さなければならない。
ｂ）菌糸成長期であって、間欠的通風が３～５回になると、菌糸が成長し始め、品温が３５℃以上に上がって、麹の原料が固結し始め、この時は連続的に通風し、品温を３５±２℃に維持すべきである。
ｃ）菌糸増殖期であって、播種から１２時間後に、品温が早く上昇し、この時は１回目の固結の状態に応じて麹をひっくり返す必要があり、麹をひっくり返す前に、測温プローブを持ち上げて、麹ひっくり返し装置をオンにした後、敷き詰めて、測温プローブを降ろして、通風・噴霧システムをオンにする。
ｄ）１回目に麹をひっくり返した後、品温が３６～３７℃に保持され、スムーズな通風噴霧を保持して、約２０時間後に、麹の原料が再び固結し、麹の原料が白みを帯びていることを目視にて確認し、温度を３７℃以下に制限して、２回目に麹をひっくり返し、麹を２回ひっくり返した後、品温を３５±２℃に制限する。
【0017】
本発明の第４の目的は、黄酒の発酵のための前記混合麦麹の使用を提供することである。
【0018】
本発明の第５の目的は、発酵食品、飲料又は調味料の製造のための前記混合麦麹の使用を提供することである。
【0019】
一実施形態において、前記食品は、ソーセージの発酵又は半発酵食品を含み、ただしそれらに限定されない。
【0020】
一実施形態において、前記飲料は、発酵黄酒又は白酒を含み、ただしそれらに限定されない。
【0021】
一実施形態において、前記調味料は、醤油、ソーセージを含み、ただしそれらに限定されない。
【0022】
一実施形態において、前記使用は、前記混合麦麹を醸酒原料と混合して発酵させることである。
【0023】
一実施形態において、前記方法は、純粋な麦麹を１２～１６％の播種量で発酵タンクにおいて米飯、酒母などの原料と均一に混合して発酵させることで、発酵では従来の発酵プロセスを採用する。
【0024】
本発明の第６の目的は、ソーセージ、黄酒、白酒、醤油、チーズにおける生体アミンの低減のための、前記サッカロポリスポラ組成物又は混合麦麹の使用を提供することである。
【0025】
一実施形態において、前記生体アミンは、チラミン、ヒスタミン、プトレシン、カダベリンを含み、ただしそれらに限定されない。
【0026】
一実施形態において、前記醸造黄酒又は白酒は前記サッカロポリスポラから純粋な麹を製造して、酒類の発酵のためにこれを添加して得たものである。
【0027】
本発明の有益な効果は次のとおりである。
（１）本発明の菌株を食品発酵反応系に用いても、食品の正常な発酵に影響を与えない。
（１）本発明の菌株を食品発酵反応系に用いても、食品の正常な発酵に影響を与えない。
【0028】
（２）サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２から製造した純粋な麦麹は黄酒の発酵に用いることができ、アルコールの収率を向上させるだけでなく黄酒におけるアミノ酸の含有量を高めることができる。純粋発酵黄酒のアミノ酸の含有量は最大で６４３４．８１±１２３．３ｍｇ／Ｌに達しており、対照群のサンプルに比べて４０．３７％高くなっている。しかも当該菌株の添加は従来の黄酒の風味には明らかな影響がない。サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加するサンプル群は対照群に比べて生体アミンの含有量が２１．７１％低減しているとともに、黄酒におけるアミノ酸態窒素の含有量及び栄養価を高めており、黄酒におけるアミノ酸と揮発性物質の含有量を高め黄酒の品質を向上させるという目的を達成している。
【0029】
（３）サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２の生体アミン生成量は２．５ｍｇ／Ｌ未満で、生体アミンの検出量は極めて少なく、生体アミンがほとんど生成されない。サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２のチラミンに対する分解率は７７．４１％に達しており、ヒスタミンに対する分解率は１００％に達しており、プトレシンに対する分解率はそれぞれ５８．１％に達しており、カダベリンに対する分解率は４７．７１％に達しており、総生体アミンに対する分解率は７２．９８％に達しており、生体アミンを低減させる能力に優れている。
【0030】
（４）当該サッカロポリスポラはまた、発酵食品における生体アミンを低減させる効果があり、それをソーセージの発酵に用いて、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加して発酵させたソーセージにおいて生体アミンの平均含有量は１２９．６０ｍｇ／ｋｇと生体アミンを低減させる効果が明らかで、対照群に比べて３６．１９％低減している。サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加する白酒は対照群に比べて生体アミンの含有量が２４．３２％低減している。サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加する醤油は対照群に比べて生体アミンの含有量が３４．２８％低減している。サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加するチーズは対照群に比べて生体アミンの含有量が１６．３７％低減している。
【0031】
（５）サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２は品質を向上させ有害物質を低減する効果があり、それをタバコの発酵に用いる場合に、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加する発酵葉タバコにおける有害成分のタール量、ＨＣＮ、フェノール、ＮＨ３及び亜硝酸塩の含有量は対照群に比べてそれぞれ２３．５１％、１６．２５％、１９．７５％、２７．０９％、３７．６２％低減している。
【0032】
（６）サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２は栄養転化率を高める効果があり、それを飼料の発酵に用いる場合に、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加する発酵飼料における有機酸の含有量は対照群に比べて２６．７７％高くなり、アミノ酸の含有量は２１．９８％高くなり、粗タンパク質の含有量は１８．５３％高くなっている。
【0033】
本発明は、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３とを含む複合菌剤をさらに提供し、当該複合菌剤には次の用途がある。
（１）サッカロポリスポラ複合菌剤を添加した発酵黄酒のアミノ酸の含有量が最も高く、菌株を添加しても従来の黄酒の風味にはさほどの影響はない。生体アミンの含有量を低減させる効果は対照群に比べて４２．１７％低減しており、黄酒におけるアミノ酸態窒素の含有量及び栄養価を高めており、黄酒におけるアミノ酸と揮発性物質の含有量を高め黄酒の品質を向上させるという目的を達成している。
（１）サッカロポリスポラ複合菌剤を添加した発酵黄酒のアミノ酸の含有量が最も高く、菌株を添加しても従来の黄酒の風味にはさほどの影響はない。生体アミンの含有量を低減させる効果は対照群に比べて４２．１７％低減しており、黄酒におけるアミノ酸態窒素の含有量及び栄養価を高めており、黄酒におけるアミノ酸と揮発性物質の含有量を高め黄酒の品質を向上させるという目的を達成している。
【0034】
（２）サッカロポリスポラ複合菌剤には生体アミンを低減させる効果があり、複合菌剤を添加するケツギョの塩漬け物は生体アミンの含有量が対照群に比べて２０．８７％低減し、料理酒の生産に用いる場合は料理酒における生体アミンの含有量が対照群に比べて２３．１６％低減し、食酢の生産に用いる場合は生体アミンの含有量が対照群に比べて２５．０８％低減し、チーズの生産に用いる場合はチーズにおける生体アミンの含有量が対照群に比べて１３．３３％低減している。
【0035】
（３）サッカロポリスポラ複合菌剤には品質を向上させ有害物質を低減させる効果があり、それをタバコの発酵に用いる場合に、複合菌剤を添加した発酵葉タバコにおける有害成分のタール量、ＨＣＮ、フェノール、ＮＨ３及び亜硝酸塩の含有量は対照群に比べてそれぞれ３０．１２％、１７．１４％、２２．０１％、１６．７３％、２７．１５％低減している。
【0036】
（４）サッカロポリスポラ複合菌剤には栄養転化率を高める効果があり、それを飼料の発酵に用いる場合に、複合菌剤を添加する発酵飼料における有機酸の含有量は対照群に比べて２９．１８％高くなり、アミノ酸の含有量は１０．２２％高くなり、粗タンパク質の含有量は１４．４８％高くなっている。
【0037】
生物材料の寄託について
サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３は、分類名がサッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３で、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託先は中国武漢の武漢大学であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０４である。
サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３は、分類名がサッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３で、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託先は中国武漢の武漢大学であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０４である。
【0038】
サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２は、分類名がサッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２で、２０２０年４月３０日から中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託先は中国武漢の武漢大学であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０２０１０３である。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【発明を実施するための形態】
【0040】
黄酒の理化学的指標の測定は次のとおりである。アルコール度数、アミノ酸態窒素及び総酸の測定は規格ＧＢ／Ｔ １３６６２－２０１８に基づいて行った。生体アミンの含有量及び風味物質は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びガスクロマトグラフィー－質量分析装置（ＧＣ－ＭＳ）を用いて測定した。還元糖の含有量の測定はＤＮＳ法を用いた。
【0041】
ソーセージの理化学的指標の測定は次のとおりである。粗タンパク質の含有量は規格ＧＢ５００９．３－２０１０のセミミクロケルダール法に基づいて測定した。水分の含有量は規格ＧＢ／Ｔ ９６９５．１５－２００８に記載の方法に従って測定した。ｐＨの測定では、１０ｇのサンプルに９０ｍＬの蒸留水を加えて均質化した後に２分間静置し、ｐＨ計を用いて上澄み液のｐＨを測定した。
【0042】
生体アミンの含有量の測定方法は次のとおりである。１ｍＬの被検液を１５ｍＬ遠心管に正確に量り取り、１ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えて均一に混合し、２ｍＬのダンシルクロリド（５ｍｇ／ｍＬのアセトン）を加えて、均一に混合して６５℃の恒温水浴鍋に入れて暗所で３０分間誘導し、室温で静置した後、０．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合して５ｍＬのジエチルエーテルを加えて、２０秒間ボルテックスし、静置して分層した後、上層の有機相を１５ｍＬ遠心管に移し、下層の水相は１回抽出して、２回の抽出液を合わせて、５０℃の水浴下で窒素ブローして乾燥させた。１ｍＬのアセトニトリルを加えて振盪して均一に混合して、残留物を溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【0043】
実施例１：サッカロポリスポラのスクリーニングと同定
（１）サンプルの採取と前処理
麦麹サンプルは浙江省紹興市の黄酒工場から採取され、採取した麦麹を密封された無菌プラスチック袋に入れて４℃で保存していた。５０ｍＬ遠心管に５ｇの麦麹を秤量し、３０ｍＬの蒸留水を加えて３０℃のインキュベーターシェーカーに入れて３０分間培養した。
（１）サンプルの採取と前処理
麦麹サンプルは浙江省紹興市の黄酒工場から採取され、採取した麦麹を密封された無菌プラスチック袋に入れて４℃で保存していた。５０ｍＬ遠心管に５ｇの麦麹を秤量し、３０ｍＬの蒸留水を加えて３０℃のインキュベーターシェーカーに入れて３０分間培養した。
【0044】
（２）菌株の平板スクリーニング
放線菌スクリーニング培地であって、硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌ、寒天１５．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃）である。
放線菌スクリーニング培地であって、硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌ、寒天１５．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃）である。
【0045】
無菌操作環境において、無菌ピペットで１ｍＬのサンプルを吸引して１５ｍＬ無菌遠心管に入れ、無菌水を加えて１０ｍＬとし、充分かつ均一に混合して、１０－１のサンプル均一液を得た。無菌ピペットで１０－１のサンプル均一液を１ｍＬ吸引して１５ｍＬ無菌遠心管に入れ、無菌水を加えて１０ｍＬとし、充分かつ均一に混合して、１０－２のサンプル均一液を得た。前記手順により、１０－１～１０－６の１０倍段階希釈シリーズ麦麹、研米水、発酵マッシュ希釈均一液を調製した。
【0046】
麦麹、発酵マッシュ、研米水の各種希釈度の菌液をそれぞれ１００μＬ吸引して放線菌スクリーニング培地に塗布して、２８℃で１～７日培養した。コロニー密度が適切な平板から乳白色で薄くて隆起又は凸面があり、少ししわのある単一のコロニーをピックアップして、それぞれ画線して放線菌スクリーニング培地に播種し、繰り返し画線して純粋なコロニーを選定して、選定菌株を保存した。
【0047】
（３）菌株同定
選定菌株のゲノムを抽出し、選定菌株に対して１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅による配列決定を行う。
選定菌株のゲノムを抽出し、選定菌株に対して１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅による配列決定を行う。
【0048】
ＰＣＲ増幅プライマーは、２７Ｆ（５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’）、１４９２Ｒ（５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’）であった。
【0049】
ＰＣＲ増幅反応系（５０μＬ）は、２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ２５μＬであり、上流と下流プライマーは各１μＬとし、テンプレートは１μＬとし、無菌水２２μＬを加えて５０μＬとした。
【0050】
ＰＣＲ増幅プロセスは次のとおりである。９４℃での３分間予備変性、９５℃での３０秒間変性、５８℃での３０秒間アニール、７２℃での２分間延伸を、合計で３５のサイクルとし、最後に７２℃で８分間延伸した。
【0051】
ＰＣＲ生成物は１％アガロースゲル電気泳動を用いて測定し、遺伝子配列決定業者に配列決定を依頼し、返された配列決定結果に基づいて、ＮＣＢＩ公式サイトにおいてＢＬＡＳＴ配列アラインメントを行った。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を用いてＢＬＡＳＴアラインメントを行い、さらに系統発生解析を行った結果は図１、図２に示すとおりである。菌株Ｊ２のヌクレオチド配列（配列番号１）はサッカロポリスポラ属サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＭＮ５１５０５７．１及びＮＲ＿１１８８７０．１）との相同性又は類似性が９８．３０％以上に達しているため、菌株をサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２と命名した。菌株Ｊ３のヌクレオチド配列（配列番号２）はサッカロポリスポラ属サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ、ＧｅｎＢａｎｋの類似配列番号：ＭＧ２５５１７９．１）との相同性又は類似性が９８．８４％以上となるため、当該菌株をサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３と命名した。
【0052】
（４）サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌株の生体アミンの代謝能についての解析：
種菌の活性化：寄託したサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、３０℃で４８時間振盪培養して、一次種菌液を得た。活性化した菌株を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、４８時間振盪培養し、回転数は１５０回転／分で、温度は３０℃であった。
種菌の活性化：寄託したサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、３０℃で４８時間振盪培養して、一次種菌液を得た。活性化した菌株を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、４８時間振盪培養し、回転数は１５０回転／分で、温度は３０℃であった。
【0053】
サンプルの前処理：種菌をそれぞれ生体アミン生成測定培地及び生体アミン分解測定培地に播種して、２８℃で５日振盪培養し、１２０００回転／分で５分間遠心分離して上澄み液を収集した。
【0054】
放線菌液体培地：硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃）であった。
【0055】
生体アミン生成測定培地：放線菌液体培地に０．４ｇ／ＬのＬ－チロシン、１ｇ／ＬのＬ－ヒスチジン、１ｇ／ＬのＬ－リシン、１ｇ／ＬのＬ－オルニチン、０．０５ｇ／Ｌの５’－リン酸ピリドキサールが添加されたもの。
【0056】
生体アミン分解測定培地：放線菌液体培地に５０ｍｇ／Ｌの生体アミン（ヒスタミン、チラミン、カダベリン、プトレシン、スペルミン、スペルミジン、トリプタミン、β－フェニルエチルアミンを含む）を添加して、ｐＨを６．０～６．２に調整したもの。
【0057】
サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の生体アミン低減効果を分析したところ、生体アミン生成測定培地及び生体アミン分解測定培地において培養したサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の生体アミンの生成量は２．５ｍｇ／Ｌ未満で、生体アミンの検出量は極めて少ないことから、生体アミンの含有がほぼ検出されていないということが示され、したがって生体アミンは生成しないと考えている。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２のチラミンに対する分解率は７７．４１％で、ヒスタミンに対する分解率は１００％に達しており、プトレシンに対する分解率は５８．１％に達しており、カダベリンに対する分解率は４７．７１％に達しており、総生体アミンに対する分解率は７２．９８％に達していることから、菌株はいずれも生体アミンを低減させる能力に優れているということが示された。
【0058】
（５）サッカロポリスポラＪ３の生体アミンの代謝能についての解析
サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の生体アミン低減効果を解析したところ、生体アミンの前駆体が存在する培地において培養したサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の各種生体アミンの生成量はいずれも２．５ｍｇ／Ｌ未満で、生体アミンの検出量は極めて少ないことから、生体アミンの含有がほぼ検出されていないということが示され、したがって生体アミンは生成しないと考えている。サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３のチラミンに対する分解率はそれぞれ８１．５５％で、ヒスタミンに対する分解率はそれぞれ１００％に達しており、プトレシンに対する分解率はそれぞれ５１．８％に達しており、カダベリンに対する分解率はそれぞれ４０．０１％に達しており、総生体アミンに対する分解率は６９．０９％に達していることから、当該菌株は生体アミンを低減させる能力に優れているということが示された。
サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の生体アミン低減効果を解析したところ、生体アミンの前駆体が存在する培地において培養したサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の各種生体アミンの生成量はいずれも２．５ｍｇ／Ｌ未満で、生体アミンの検出量は極めて少ないことから、生体アミンの含有がほぼ検出されていないということが示され、したがって生体アミンは生成しないと考えている。サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３のチラミンに対する分解率はそれぞれ８１．５５％で、ヒスタミンに対する分解率はそれぞれ１００％に達しており、プトレシンに対する分解率はそれぞれ５１．８％に達しており、カダベリンに対する分解率はそれぞれ４０．０１％に達しており、総生体アミンに対する分解率は６９．０９％に達していることから、当該菌株は生体アミンを低減させる能力に優れているということが示された。
【0059】
実施例２：サッカロポリスポラの活性化と培養
放線菌液体培地：硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃測定）であった。
放線菌液体培地：硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃測定）であった。
【0060】
ＰＤＡ培地：ジャガイモデンプン６．０ｇ／Ｌ、グルコース２０．０ｇ／Ｌ、寒天２０．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨが５．４～５．８であるものを１２１℃で１５分間高圧滅菌したものであり、固体培地はこれに基づいて添加して得られた。
【0061】
ＭＲＳ培地：牛肉エキス１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ポリソルベート８０ ０．１０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２ｇ／Ｌ、クエン酸水素二アンモニウム２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５８ｇ／Ｌ、硫酸マンガン０．２８ｇ／Ｌからなるもの。
【0062】
実施例１でスクリーニングしたサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、３０℃で４８時間振盪培養して、一次種菌液を得た。活性化した菌株を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、４８時間振盪培養し、回転数は１５０回転／分で、温度は２５～４５℃として、菌体濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌液を得、培養して成熟した後、これを純粋な麦麹の製造に使用した。
【0063】
寄託したアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）及びニホンコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）をＰＤＡ平板に播種して、２８℃で３～５日培養した。その後、無菌水で胞子液を洗浄して、再びＰＤＡナスフラスコに移し、温度が２８℃で３～５日培養して、菌体濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌液を得、胞子が成熟した後、純粋な麦麹の製造に使用した。
【0064】
寄託したラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）をＭＲＳ培地に播種し、播種量は１０％で、３７℃恒温で２４時間嫌気培養して、一次種菌培養液を得た。活性化された種菌液を再びＭＲＳ液体培地に播種し、播種量は１０％で、３７℃恒温で２４時間嫌気培養して、菌体濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌液を得、種菌を培養して成熟した後、純粋な麦麹の製造に使用した。
【0065】
サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹は上記と同じ方法で製造し、ただし違いは、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２をサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３に置き換えることである。
【0066】
実施例３：サッカロポリスポラからの純粋な麦麹の製造
（１）精麦であって、小麦を少量の粉末が付くように１粒を３～５片程度に破砕したことにより、麦粒組織を破砕して、デンプンを露出させた。
（２）湿潤であって、ステップ（１）で処理した材料に約３５～４０％の浄水を加え、２０～２５分間攪拌して、充分かつ均一に水分を吸収させた。
（３）蒸煮滅菌であって、ステップ（２）で処理した材料を１２１℃で３０分間滅菌した。
（４）播種であって、ステップ（３）の材料が３６℃に冷却後、実施例２の方法で活性化した種菌を播種し、播種菌液の濃度は１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬで、播種量は５‰～１５％であった。
（１）精麦であって、小麦を少量の粉末が付くように１粒を３～５片程度に破砕したことにより、麦粒組織を破砕して、デンプンを露出させた。
（２）湿潤であって、ステップ（１）で処理した材料に約３５～４０％の浄水を加え、２０～２５分間攪拌して、充分かつ均一に水分を吸収させた。
（３）蒸煮滅菌であって、ステップ（２）で処理した材料を１２１℃で３０分間滅菌した。
（４）播種であって、ステップ（３）の材料が３６℃に冷却後、実施例２の方法で活性化した種菌を播種し、播種菌液の濃度は１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬで、播種量は５‰～１５％であった。
【0067】
（５）麹の原料をトレイに投入した後、適切な品温と室温を保持して、静置して約６時間培養した。
【0068】
ａ）胞子発芽期：麹の原料をトレイに投入してから６時間後に、品温が緩やかに約３４～３５℃に上昇し、自己制御モードをオンにして小風量で間欠的に通風し、１回は５～１０分で、間隔は２時間として、品温を３２℃に下げ、均一に吹き通さなければならない。
【0069】
ｂ）菌糸成長期：間欠的通風を３～５回実施してから、菌糸が成長し始め、品温が３５℃以上に上がって、麹の原料が固結し始め、この時は連続的に通風し、品温を約３５℃に維持した。
【0070】
ｃ）菌糸増殖期：播種から１２時間後に、品温が早く上昇し、この時は１回目の固結の状態に応じて麹をひっくり返す必要があり、麹をひっくり返す前に、測温プローブを持ち上げて、麹ひっくり返し装置をオンにした後、敷き詰めて、測温プローブを降ろした。通風・噴霧システムをオンにした。
【0071】
ｄ）１回目に麹をひっくり返した後、品温が３６～３７℃に保持され、スムーズな通風噴霧を保持して、約２０時間後に、麹の原料が再び固結し、麹の原料が白みを帯びていることを目視にて確認し、温度を３７℃以下に制限するには難があり、２回目に麹をひっくり返し、麹を２回ひっくり返した後、品温を約３５℃に制御した。
【0072】
（６）麹の出来上がり：７２～９６時間培養し、培養が終了した後、麦麹を４～７℃の冷凍庫に入れて、使用に備えて貯蔵した。
上記の方法により、菌体数量が１０１５ｃｆｕ／ｇ程度でサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２から純粋な麦麹、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３から純粋な麦麹をそれぞれ製造した。
上記の方法により、菌体数量が１０１５ｃｆｕ／ｇ程度でサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２から純粋な麦麹、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３から純粋な麦麹をそれぞれ製造した。
【0073】
実施例４：サッカロポリスポラからの混合麦麹の製造
実施例３で製造したサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２からの純粋な麦麹とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹を任意の割合で混合して、混合麦麹を製造した。
実施例３で製造したサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２からの純粋な麦麹とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹を任意の割合で混合して、混合麦麹を製造した。
【0074】
選択可能で、醸造アルコール飲料の発酵用の混合麦麹はサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２からの純粋な麦麹とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹を１：（０．８～１．５）の質量比で混合したものである。
【0075】
実施例５：黄酒の発酵のためのサッカロポリスポラからの純粋な麦麹の使用
（１）本実施例では、従来の黄酒の発酵のための原料配合比は（発酵体積が１Ｌの場合）、蒸し米５００ｇ、浄水４１７Ｌ、酒母３８ｇであった。
（２）従来の黄酒醸造プロセス：
ａ）酵母の活性化と培養:グリセリン保存管に入れた酵母菌を、無菌実験台においてＹＰＤ培地に移して、３０℃で１５０回転／分の条件下で２４時間培養し、その後、調製した酒母に移して、酵母を移した後は３０℃で１５０回転／分の条件下で、使用に備えて１８～２４時間培養した。
（１）本実施例では、従来の黄酒の発酵のための原料配合比は（発酵体積が１Ｌの場合）、蒸し米５００ｇ、浄水４１７Ｌ、酒母３８ｇであった。
（２）従来の黄酒醸造プロセス：
ａ）酵母の活性化と培養:グリセリン保存管に入れた酵母菌を、無菌実験台においてＹＰＤ培地に移して、３０℃で１５０回転／分の条件下で２４時間培養し、その後、調製した酒母に移して、酵母を移した後は３０℃で１５０回転／分の条件下で、使用に備えて１８～２４時間培養した。
【0076】
ｂ）酒母の製作:６００ｇの蒸し米に１６００ｍＬの浄水、６０ｇの生麦麹を加えて、８００Ｕ／ｇ米飯として糖化酵素で糖化し、糖化温度を５５～６５℃に制限し、時間は３～４時間で、糖化が終了して糖度が１２°Ｂｘ以上となったら、１１５℃下で１５分間滅菌し、滅菌した後は２４～３１℃に冷却し、成熟した酵母種菌培養液を５％入れ、培養温度は３０℃以下で、培養時間は２４時間で培養し、成熟後に酒母を得た。
【0077】
ｃ）ステップ（１）に記載の従来の黄酒の発酵の原料配合比に従って原料を投入して発酵させる。実験群は純粋な麦麹４５．３ｇで、対照群は生麦麹３９．３ｇ、熟麦麹６．０ｇであった。
【0078】
最初の４日は前期発酵段階で、温度を２８～３０℃に制限して、４日発酵させ、最初の４日は毎日少なくとも１回開耙し、初めての開耙の時間は８～１０時間であった。後期発酵段階では、温度が１３～１５℃で、毎日攪拌して１回開耙し、発酵は１０～１５日持続した。
【0079】
対照群（ＴＦ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、本実施例のｃ）の純粋な麦麹を工場から採取した生麦麹３９．３ｇ／Ｌと熟麦麹６．０ｇ／Ｌに置き換えたものである。
【0080】
実施例６：黄酒の発酵のためのサッカロポリスポラからの混合麦麹の使用
混合麦麹発酵群は、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２からの純粋な麦麹とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹の複合麦麹を出芽酵母（サッカロミセスセレビシエ）と併用して従来の醸造方法で発酵させた。
混合麦麹発酵群は、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２からの純粋な麦麹とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹の複合麦麹を出芽酵母（サッカロミセスセレビシエ）と併用して従来の醸造方法で発酵させた。
【0081】
複合菌剤群（Ｍｉｘ）は、菌体数１：１の割合でサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２からの純粋な麦麹とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹を添加し、添加量は合計で４５．３ｇであった。
【0082】
黄酒発酵プロセスにおける理化学的指標の変化
黄酒の発酵におけるサッカロポリスポラの役割の一層の検証のために、従来の麦麹と純粋な麦麹による発酵プロセスにおける理化学的指標（アルコール度数、還元糖、滴定酸、アミノ酸態窒素）の変化を比較した。純粋発酵の方は６群に分け、それぞれがアスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ、黄酒の発酵でよく使用する菌）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、清酒の醸造でよく使用する菌）、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３、Ｍｉｘ、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であった。当該５種の純粋な麦麹をそれぞれ出芽酵母と併用して従来の醸造方法で発酵させる。発酵が終了すると、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）群以外の各群はアルコール度数、酸度、アミノ酸態窒素の含有量がいずれも黄酒の国家規格に達している（図３）。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）群の滴定酸の含有量は早く１７．５０ｇ／Ｌに増加しており、サンプルには明らかな酸敗が生じていた。サッカロポリスポラは黄酒発酵プロセスにおいて重要な理化学的指標にさほどの影響はなく、発酵が正常に進んでいることが示された。
黄酒の発酵におけるサッカロポリスポラの役割の一層の検証のために、従来の麦麹と純粋な麦麹による発酵プロセスにおける理化学的指標（アルコール度数、還元糖、滴定酸、アミノ酸態窒素）の変化を比較した。純粋発酵の方は６群に分け、それぞれがアスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ、黄酒の発酵でよく使用する菌）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ、清酒の醸造でよく使用する菌）、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３、Ｍｉｘ、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であった。当該５種の純粋な麦麹をそれぞれ出芽酵母と併用して従来の醸造方法で発酵させる。発酵が終了すると、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）群以外の各群はアルコール度数、酸度、アミノ酸態窒素の含有量がいずれも黄酒の国家規格に達している（図３）。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）群の滴定酸の含有量は早く１７．５０ｇ／Ｌに増加しており、サンプルには明らかな酸敗が生じていた。サッカロポリスポラは黄酒発酵プロセスにおいて重要な理化学的指標にさほどの影響はなく、発酵が正常に進んでいることが示された。
【0083】
黄酒発酵サンプルにおけるアミノ酸の含有量
ＨＰＬＣ法で発酵黄酒のアミノ酸の含有量を解析したところ、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加した実験群のアミノ酸の含有量は６４３４．８１±１２３．３ｍｇ／Ｌに達しており、対照群に比べて４０．３７％高くなっている。Ｍｉｘ、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）及びニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）実験群のアミノ酸の含有量には大差がないが、いずれも対照群（ＴＦ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を有意に上回っている。サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３を添加した実験群の総アミノ酸の含有量は対照群と大差がなく、一部のアミノ酸の含有量が対照群を有意に上回っている。
注：表中ｇａｇａはγ－アミノ酪酸。
ＨＰＬＣ法で発酵黄酒のアミノ酸の含有量を解析したところ、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加した実験群のアミノ酸の含有量は６４３４．８１±１２３．３ｍｇ／Ｌに達しており、対照群に比べて４０．３７％高くなっている。Ｍｉｘ、アスペルギルス・フラバス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）及びニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）実験群のアミノ酸の含有量には大差がないが、いずれも対照群（ＴＦ Ｃｏｎｔｒｏｌ）を有意に上回っている。サッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３を添加した実験群の総アミノ酸の含有量は対照群と大差がなく、一部のアミノ酸の含有量が対照群を有意に上回っている。
【表1】
【0084】
サッカロポリスポラの生体アミン低減効果を解析した。得られた製品は高速液体クロマトグラフィーにより黄酒の生体アミンの含有量を測定したところ、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を添加したサンプル群は対照群に比べて２１．７１％低減し、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を添加したサンプル群は対照群に比べて３５．０９％低減している。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を添加した複合菌剤（Ｍｉｘ）群は対照群に比べて４２．１７％低減している。
【0085】
純粋発酵と従来の発酵の風味の解析
主成分解析法を用いて純粋発酵と従来の発酵のサンプルにおける風味成分の変化と類似性を解析した。全てのサンプルのバイプロット（ｂｉｐｌｏｔ）解析から、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３で発酵させた黄酒における１番と２番の主成分の分散への累積寄与率はいずれも８３．６％であることが分かり、これにより発酵サンプルに風味の差があることの理由がほぼ解明している。図４から分かるように、従来の発酵群はサッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３群に近づいているが、アスペルギルス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ）群及びラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）群と明らかに離れている。これはサッカロポリスポラが殆どの風味物質の合成に関与しており、黄酒の発酵において大きな役割を果たすことを示している。
主成分解析法を用いて純粋発酵と従来の発酵のサンプルにおける風味成分の変化と類似性を解析した。全てのサンプルのバイプロット（ｂｉｐｌｏｔ）解析から、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３で発酵させた黄酒における１番と２番の主成分の分散への累積寄与率はいずれも８３．６％であることが分かり、これにより発酵サンプルに風味の差があることの理由がほぼ解明している。図４から分かるように、従来の発酵群はサッカロポリスポラ・ジアングシエンシス（Ｓ．ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ）Ｊ３群に近づいているが、アスペルギルス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ）群及びラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）群と明らかに離れている。これはサッカロポリスポラが殆どの風味物質の合成に関与しており、黄酒の発酵において大きな役割を果たすことを示している。
【0086】
実施例７：黄酒の発酵のためのサッカロポリスポラ菌剤の使用
実施例５の従来の黄酒の原料投入処方で黄酒の発酵を行い、実験群としてそれぞれＭｉｘ群、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群を設け、ただし、麦麹の播種割合はいずれも１０％で、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群にはサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹を播種し、Ｍｉｘ群にはサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３とサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の混合菌液を用いて実施例３の方法で製造した複合種菌麦麹を播種したことで違っている。黄酒醸造プロセスと指標測定手順については実施例４を参照した。
実施例５の従来の黄酒の原料投入処方で黄酒の発酵を行い、実験群としてそれぞれＭｉｘ群、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群を設け、ただし、麦麹の播種割合はいずれも１０％で、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群にはサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３からの純粋な麦麹を播種し、Ｍｉｘ群にはサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３とサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の混合菌液を用いて実施例３の方法で製造した複合種菌麦麹を播種したことで違っている。黄酒醸造プロセスと指標測定手順については実施例４を参照した。
【0087】
（１）黄酒の主要理化学的指標への影響：
表２から分かるように、発酵が終了した後は各群のアルコール度数が約１４％Ｖ／Ｖに達しており、全てのサンプルの還元糖、総酸及びアミノ酸態窒素の含有量はいずれも４．５２～５．０３ｇ／Ｌで、いずれも黄酒の理化学的規格に適合している。有意性を検討したところ、Ｍｉｘ群とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群のアルコール度数、総酸含有量及びアミノ酸態窒素の含有量は対照群と有意差がない（Ｐ＞０．０５）ことから、サッカロポリスポラ属サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を播種しても黄酒発酵プロセスにおいて主要理化学的指標に大きな影響がなく、黄酒発酵プロセスにはマイナスの影響がないことが分かった。
表２から分かるように、発酵が終了した後は各群のアルコール度数が約１４％Ｖ／Ｖに達しており、全てのサンプルの還元糖、総酸及びアミノ酸態窒素の含有量はいずれも４．５２～５．０３ｇ／Ｌで、いずれも黄酒の理化学的規格に適合している。有意性を検討したところ、Ｍｉｘ群とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群のアルコール度数、総酸含有量及びアミノ酸態窒素の含有量は対照群と有意差がない（Ｐ＞０．０５）ことから、サッカロポリスポラ属サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を播種しても黄酒発酵プロセスにおいて主要理化学的指標に大きな影響がなく、黄酒発酵プロセスにはマイナスの影響がないことが分かった。
【表2】
【0088】
（２）サッカロポリスポラの黄酒における生体アミンの含有量への影響
発酵が終了した後、複合菌剤を播種したＭｉｘ群とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群のサンプルの生体アミンの含有量はそれぞれ１５．５７±０．４４ｍｇ／Ｌ、１６．８８±１．４１ｍｇ／Ｌで、いずれも対照群の２６．７５±２．３９ｍｇ／Ｌよりは低かった。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の方の総アミン含有量の平均値は対照群に比べて４１．７９％低減し、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群は対照群に比べて３６．９０％低減している。複合菌剤Ｍｉｘとサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３はいずれも生体アミンの含有量を低減させる効果があることが示された。
発酵が終了した後、複合菌剤を播種したＭｉｘ群とサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群のサンプルの生体アミンの含有量はそれぞれ１５．５７±０．４４ｍｇ／Ｌ、１６．８８±１．４１ｍｇ／Ｌで、いずれも対照群の２６．７５±２．３９ｍｇ／Ｌよりは低かった。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の方の総アミン含有量の平均値は対照群に比べて４１．７９％低減し、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３群は対照群に比べて３６．９０％低減している。複合菌剤Ｍｉｘとサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３はいずれも生体アミンの含有量を低減させる効果があることが示された。
【0089】
以上から明らかなように、黄酒発酵反応系に複合菌剤Ｍｉｘ、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を播種しても黄酒の品質に影響はなく、しかも総アミンに対する分解率がそれぞれ対照群の４１．７９％と３６．９０％に達していることから、複合菌剤Ｍｉｘの直接的な添加の方も、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の方も、黄酒の生産に用いると黄酒における生体アミンの含有量を調整するために利用する可能性があり、複合菌剤Ｍｉｘの方は黄酒における生体アミンの分解効果がより優れていることが示されている。
【0090】
実施例８：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の発酵ソーセージへの使用による生体アミンの含有量低減
（１）種菌の活性化と培養
放線菌液体培地：硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃測定）であった。
（１）種菌の活性化と培養
放線菌液体培地：硝酸カリウム１．０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄０．０１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、可溶性デンプン２０．０ｇ／Ｌからなり、ｐＨの値は７．２～７．４（２５℃測定）であった。
【0091】
寄託したサッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、３０℃で５９時間振盪培養して、一次種菌液を得た。活性化した菌株を放線菌液体培地に播種し、播種量は１０％で、４８時間振盪培養し、回転数は１５０回転／分で、温度は３０℃であった。培養して菌体濃度が１０５～１０７ｃｆｕ／ｍＬ程度になったら発酵ソーセージに使用した。
【0092】
（２）発酵ソーセージの製造
質量基準で、６５～８０％の赤身と２０～３５％の脂身を取り合わせた。洗浄して骨、腱、筋膜、リンパ、血管、病変及び損傷部位を除去した。赤身と脂身を分けて、４～５ｃｍの肉塊に切った。赤身と約５～８％の砕氷をみじん切り器に入れて、１～３分間切り刻む。豚肉の質量基準で、０．０１～０．１５％の亜硝酸ナトリウム、２～３％の食塩、０．２～０．３％の複合リン酸塩、０．０５～０．０６％のアスコルビン酸ナトリウムを加えた。香辛料、コショウ、ニンニク、唐辛子、ナツメグは原料肉の０．２％～０．３％とした。２群はそれぞれ８～１２％の活性化サッカロポリスポラを播種し、１群は播種せずに対照とし、１～２分間切り刻み、さらに脂身と約５～８％の砕氷を加えて、４～６分間切り刻む。塩漬けした後にケーシングに詰め込む。ソーセージ発酵プロセスのパラメータは表３に示すとおりである。
質量基準で、６５～８０％の赤身と２０～３５％の脂身を取り合わせた。洗浄して骨、腱、筋膜、リンパ、血管、病変及び損傷部位を除去した。赤身と脂身を分けて、４～５ｃｍの肉塊に切った。赤身と約５～８％の砕氷をみじん切り器に入れて、１～３分間切り刻む。豚肉の質量基準で、０．０１～０．１５％の亜硝酸ナトリウム、２～３％の食塩、０．２～０．３％の複合リン酸塩、０．０５～０．０６％のアスコルビン酸ナトリウムを加えた。香辛料、コショウ、ニンニク、唐辛子、ナツメグは原料肉の０．２％～０．３％とした。２群はそれぞれ８～１２％の活性化サッカロポリスポラを播種し、１群は播種せずに対照とし、１～２分間切り刻み、さらに脂身と約５～８％の砕氷を加えて、４～６分間切り刻む。塩漬けした後にケーシングに詰め込む。ソーセージ発酵プロセスのパラメータは表３に示すとおりである。
【表3】
【0093】
（３）サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の生体アミン低減効果の解析
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。
【0094】
サンプル前処理の手順は次のとおりである。５０ｍＬ遠心管に５．０ｇの挽いたサンプルを秤量し、２０ｍＬの５％トリクロロ酢酸を加えて３０分間超音波処理して、５０ｍＬ栓付き遠心管に移し、６０００回転／分で１０分間遠心分離して、上澄み液を５０ｍＬメスフラスコに移し、残渣を２０ｍＬの前記溶液で再び１回抽出して、上澄み液を合わせて所定の目盛りまで希釈した。
【0095】
表４から分かるように、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を添加して発酵させたソーセージは発酵により成熟するとｐＨはそれぞれ６．１６±０．１６で、対照群は６．５１±０．１７であり、水分の含有量と粗タンパク質の含有量には有意差がない。サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加して発酵させたソーセージは成熟すると生体アミンの平均含有量が１２９．６０ｍｇ／ｋｇで、対照群に比べて３６．１９％低減している。
【表4】
【0096】
実施例９：サッカロポリスポラＪ２の白酒への使用による生体アミンの含有量低減
白酒の醸造で使用したサッカロポリスポラからの純粋な麦麹は実施例３の麦麹の作製方法を参照して作製した。実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
白酒の醸造で使用したサッカロポリスポラからの純粋な麦麹は実施例３の麦麹の作製方法を参照して作製した。実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
【0097】
白酒の醸造は二次発酵法を採用し、一次発酵の時はモロコシを蒸し通した後、空冷で２５℃に冷却し、４％のニホンコウジカビ種菌液を添加して、２８℃下で２４時間培養した。１０％のもみ殻、１５％の蒸留酒麹、８％のふすま、５～９％の純粋な麦麹を添加して、１％の割合で出芽酵母種菌液を播種し、その後、密封して、３０日発酵させた後に蒸留した。二次発酵の時は１０％の中温の蒸留酒麹を添加して、１％の割合で出芽酵母種菌液を播種し、酵母種菌液の濃度は１０１０～１０１２ｃｆｕ／ｍＬで、引き続き１２～１５日発酵させて蒸留した。
【0098】
サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２の生体アミン低減効果を以下のように解析した。蒸留後の白酒をアルコール度数６０％（Ｖ／Ｖ）にブレンドし、調合後のサンプルにおける生体アミンの含有量を測定し、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓ．ｈｉｒｓｕｔａ）Ｊ２を添加するサンプル群は対照群に比べて２４．３２％低減している。
【0099】
実施例１０：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の醤油への使用による生体アミンの含有量低減
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。高塩希釈状態発酵により醤油を醸造した。
（１）まず豆粕と小麦を１：１の割合で均一に混合し、その後、蒸し通した。
（２）５‰～１０％の割合で菌液濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２種菌液を加え、その後、材料の質量の約１．５～２倍の塩水を加えて、醤油マッシュ（醤醪、麹を大量の塩水と混ぜて濃厚な半流動の状態にする混合物）の最終的な塩含有量は約１８％で、水分の含有量は６５％であり、その後、均一に混合した。
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。高塩希釈状態発酵により醤油を醸造した。
（１）まず豆粕と小麦を１：１の割合で均一に混合し、その後、蒸し通した。
（２）５‰～１０％の割合で菌液濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２種菌液を加え、その後、材料の質量の約１．５～２倍の塩水を加えて、醤油マッシュ（醤醪、麹を大量の塩水と混ぜて濃厚な半流動の状態にする混合物）の最終的な塩含有量は約１８％で、水分の含有量は６５％であり、その後、均一に混合した。
【0100】
（３）しょうぺい、（「しょう」の漢字は「醤」、「ぺい」の漢字は酒偏に、旁は「立」と「口」を縦に重ねたもの、麹を少量の塩水と混ぜて流れない状態にする混合物）を以下のように発酵させた。初期発酵温度を１４～１６℃に制限し、発酵が進行するにつれて温度が徐々に約３５℃に上昇していった。発酵を約５ヶ月持続した。
【0101】
（４）醤油マッシュの発酵が終了した後、プレートアンドフレーム式フィルタープレス装置において圧搾して、しょうぺいを除去した。圧搾が終了した後はダイアトマイト濾過と膜濾過を行って、沈殿を除去した。濾過して清澄になった醤油を低温殺菌して、充填した。
【0102】
サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の生体アミン低減効果を解析した。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を添加した醤油製品における生体アミンの含有量は対照群に比べて３４．２８％低減している。
【0103】
実施例１１：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の料理酒への使用による生体アミンの含有量低減
実施例５の醸造方法により純粋発酵黄酒を得、発酵黄酒に質量基準で１０％の食塩を加えて、滅菌機において８５℃で３０分間滅菌して熱充填した。
実施例５の醸造方法により純粋発酵黄酒を得、発酵黄酒に質量基準で１０％の食塩を加えて、滅菌機において８５℃で３０分間滅菌して熱充填した。
【0104】
菌株の料理酒における生体アミンの含有量の低減効果を解析した。高速液体クロマトグラフィーにより料理酒における生体アミンの含有量を測定し、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を添加したサンプル群は、対照群に比べて生体アミンの含有量が低減している。
【0105】
実施例１２：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の食酢への使用による生体アミンの含有量低減
実施例５の醸造方法により純粋発酵黄酒を得、これを酢酸の発酵原料として、実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
実施例５の醸造方法により純粋発酵黄酒を得、これを酢酸の発酵原料として、実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
【0106】
酢酸の発酵では固体発酵プロセスを採用した。大型の糠、ふすま、黄酒を１：４：１０の質量比で均一に攪拌して、５％の酢の固体発酵基質（「さくぺい」、「さく」の漢字は、「酢」、「しょう」の漢字は「しょうぺい」の「ぺい」に同じ）を播種し、播種後の最初の２日は毎日材料の表面から前記固体発酵基質をひっくり返し、温度を３５～４２℃に保持した。６～８日目に材料の底部に至った。８～１２日目では、毎日底部から前記固体発酵基質をひっくり返し、温度が自ず低減した。酢の固体発酵基質から生酢を分離して、８５℃で３０分間滅菌して１２ヶ月熟成させた。充填した前に高温滅菌を行ってから、熱充填した。
【0107】
調製した食酢の品質を測定したところ、固体発酵醸造食酢における酢酸の含有量はいずれも５５ｇ／Ｌであった。食酢における生体アミンの含有量を解析したところ、高速液体クロマトグラフィーにより料理酒における生体アミンの含有量を測定し、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を添加したサンプル群は、対照群に比べて生体アミンの含有量が低減している。
【0108】
実施例１３：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２のチーズ発酵への使用による生体アミンの含有量低減
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。
【0109】
新鮮な牛乳を均質化して低温殺菌処理を行い、室温に冷却後、０．１ｇ／Ｌの発酵剤を添加して、均一に攪拌し、３２～３５℃で３０分間酸性化して０．０５ｇ／Ｌのキモシンを添加し、均一に混合してカードができたら切断し、ホエーを排除してチーズカードを得た。チーズカードの表面に１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を散布し、３０～３７℃で３～５日培養し、成長して成熟後、３．０ｇ／Ｌの食塩を加え、その後、圧搾成形によりチーズ完成品を得た。
【0110】
発酵チーズ完成品について測定したところ、サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を添加したチーズ完成品の生体アミンの含有量は対照群に比べて１６．３７％低減している。
【0111】
実施例１４：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２のタバコ発酵への使用による品質向上と有害物質低減
実施例１の方法で種菌を活性化させた。活性化した菌液を４℃、１００００ｇで１５分間遠心分離し、収集した菌体から無菌水で１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液を調製し、菌液を葉タバコの表面に均一に散布して、充分かつ均一に混合し、等量の無菌水で処理したものを対照とし、３０～３７℃で湿度７０～８０％の恒温恒湿チャンバーに入れて１５日発酵培養して、毎日通風し、培養が終了した後、葉タバコを水分１５％未満まで乾燥した。
実施例１の方法で種菌を活性化させた。活性化した菌液を４℃、１００００ｇで１５分間遠心分離し、収集した菌体から無菌水で１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液を調製し、菌液を葉タバコの表面に均一に散布して、充分かつ均一に混合し、等量の無菌水で処理したものを対照とし、３０～３７℃で湿度７０～８０％の恒温恒湿チャンバーに入れて１５日発酵培養して、毎日通風し、培養が終了した後、葉タバコを水分１５％未満まで乾燥した。
【0112】
発酵葉タバコの品質を測定したところ、得られた発酵葉タバコの香気成分が明らかに増加し、不要なガスが減り、刺激性が低減している。発酵葉タバコにおける有害成分のタール量、ＨＣＮ、フェノール、ＮＨ３及び亜硝酸塩の含有量は対照群に比べてそれぞれ２３．５１％、１６．２５％、１９．７５％、２７．０９％、３７．６２％低減している。
【0113】
実施例１５：サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２の飼料発酵への使用による栄養転化率の向上
実施例１の方法で種菌を活性化させた。米糠、藁、豆粕を（１～５）：（１～５）：２の割合で均一に混合し、粉砕して発酵物を調製した。原料と水の比が１：０．５～０．９の割合で水を加えて、１０‰～１０％の割合で菌液濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を播種し、均一に攪拌して、自然発酵させ、発酵温度は３０～４０℃で、発酵時間は４～９日であり、発酵が終了後に水分の含有量が１５％未満になるまで乾燥して、生物発酵飼料を得た。
実施例１の方法で種菌を活性化させた。米糠、藁、豆粕を（１～５）：（１～５）：２の割合で均一に混合し、粉砕して発酵物を調製した。原料と水の比が１：０．５～０．９の割合で水を加えて、１０‰～１０％の割合で菌液濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２を播種し、均一に攪拌して、自然発酵させ、発酵温度は３０～４０℃で、発酵時間は４～９日であり、発酵が終了後に水分の含有量が１５％未満になるまで乾燥して、生物発酵飼料を得た。
【0114】
発酵飼料の品質を解析した。得られた発酵飼料には特別な香気があり、しかも栄養が豊富で、アミノ酸の構成にバランスがとれており、有機酸の含有量は対照群に比べて２６．７７％高くなり、アミノ酸の含有量は２１．９８％高くなり、粗タンパク質の含有量は１８．５３％高くなっている。
【0115】
実施例１６：サッカロポリスポラによる魚の発酵食品における生体アミンの含有量の低減
実施例１の方法で種菌を活性化させた。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．７～１．５で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
実施例１の方法で種菌を活性化させた。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．７～１．５で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
【0116】
中性プロテアーゼを用いた発酵によりケツギョの塩漬け物を調製した。プロセスは具体的に次のとおりであった。
（１）サンプル前処理：ケツギョの内臓を取り除き、秤量して３ｋｇであった。
（２）発酵液の調製：ケツギョと等質量の飲料水を使用し、これを１００％として、６％の塩、１％のネギ、０．６％のショウガ、０．１％のトウシキミ、０．０５％のウイキョウ、０．０５％のクミン、０．０１％の唐辛子、０．０１％のサンショウ、３０００００Ｕの中性プロテアーゼを加えて、均一に混合して、発酵液を得た。
（３）播種：発酵液を３部に分け、一部は１０％の播種量で発酵液に菌液濃度が１０７ｃｆｕ／ｍＬの複合菌液Ｍｉｘを播種し、もう一部は１０％の播種量で発酵液に菌液濃度が１０７ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を播種し、さらにもう１部は播種しないとした。
（４）発酵：ケツギョをステップ（３）の播種後の発酵液に浸し、上から石をかけて押し固め、２０℃で６日発酵させて、ケツギョの塩漬け物を得た。
（１）サンプル前処理：ケツギョの内臓を取り除き、秤量して３ｋｇであった。
（２）発酵液の調製：ケツギョと等質量の飲料水を使用し、これを１００％として、６％の塩、１％のネギ、０．６％のショウガ、０．１％のトウシキミ、０．０５％のウイキョウ、０．０５％のクミン、０．０１％の唐辛子、０．０１％のサンショウ、３０００００Ｕの中性プロテアーゼを加えて、均一に混合して、発酵液を得た。
（３）播種：発酵液を３部に分け、一部は１０％の播種量で発酵液に菌液濃度が１０７ｃｆｕ／ｍＬの複合菌液Ｍｉｘを播種し、もう一部は１０％の播種量で発酵液に菌液濃度が１０７ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を播種し、さらにもう１部は播種しないとした。
（４）発酵：ケツギョをステップ（３）の播種後の発酵液に浸し、上から石をかけて押し固め、２０℃で６日発酵させて、ケツギョの塩漬け物を得た。
【0117】
生体アミンの測定方法は次のとおりである。５０ｍＬ遠心管に５．０ｇの挽いた魚肉サンプルを秤量し、２０ｍＬの５％トリクロロ酢酸を加えて３０分間超音波処理して、５０ｍＬ栓付き遠心管に移し、６０００回転／分で１０分間遠心分離して、上澄み液を５０ｍＬメスフラスコに移し、残渣を２０ｍＬの前記溶液で再び１回抽出して、上澄み液を合わせて目盛りまで希釈した。その後、１ｍＬの上澄み液を１５ｍＬ遠心管に正確に量り取り、１ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えて均一に混合し、２ｍＬのダンシルクロリド（５ｍｇ／ｍＬのアセトン）を加えて、均一に混合して６５℃の恒温水浴鍋に入れて暗所で３０分間誘導し、室温で静置した後、０．５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合して５ｍＬのジエチルエーテルを加えて、２０秒間ボルテックスし、静置して分層した後、上層の有機相を１５ｍＬ遠心管に移し、下層の水相は１回抽出して、２回の抽出液を合わせて、５０℃の水浴下で窒素ブローして乾燥させた。
【0118】
１ｍＬのアセトニトリルを加えて振盪して均一に混合して、残留物を溶解し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【0119】
発酵が終了後、複合菌剤Ｍｉｘで強化したケツギョの塩漬け物の生体アミンは対照群に比べて２０．８７％低減している。
【0120】
実施例１７：サッカロポリスポラの料理酒への使用による生体アミンの含有量低減
実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
【0121】
実施例５の醸造方法により純粋発酵黄酒を得、発酵黄酒に質量基準で１０％の食塩を加えて、滅菌機において８５℃で３０分間滅菌して熱充填した。
【0122】
菌株の料理酒における生体アミン低減効果を解析した。高速液体クロマトグラフィーにより料理酒における生体アミンの含有量を測定し、複合菌剤Ｍｉｘ、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を添加したサンプル群は、対照群に比べてそれぞれ２３．１６％、１８．９１％低減している。
【0123】
実施例１８：サッカロポリスポラの食酢への使用による生体アミンの含有量低減
実施例５の醸造方法で純粋発酵黄酒を得、これを酢酸の発酵原料として、実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
実施例５の醸造方法で純粋発酵黄酒を得、これを酢酸の発酵原料として、実施例１の方法で生体アミンの含有量を測定した。
【0124】
酢酸の発酵では固体発酵プロセスを採用した。大型の糠、ふすま、黄酒を１：４：１０の質量比で均一に攪拌して、５％の酢の固体発酵基質を播種し、播種後の最初の２日は毎日材料の表面から前記固体発酵基質をひっくり返し、温度を３５～４２℃に保持した。６～８日目に材料の底部に至った。８～１２日目では、毎日底部から前記固体発酵基質をひっくり返し、温度が自ずと低減した。酢の固体発酵基質から生酢を分離して、８５℃で３０分間滅菌して１２ヶ月熟成させた。充填した前に高温滅菌を行ってから、熱充填した。
【0125】
複合菌剤Ｍｉｘ及びサッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３の生体アミン低減効果を解析した。固体発酵醸造食酢における酢酸の含有量はいずれも５５ｇ／Ｌであった。サンプルにおける生体アミンの含有量を測定し、複合菌剤Ｍｉｘ、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を添加したサンプル群は、対照群に比べてそれぞれ２５．０８％、２７．６１％低減している。
【0126】
実施例１９：サッカロポリスポラのチーズ発酵への使用による生体アミンの含有量低減
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．８～１．４で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
実施例１の方法で種菌を活性化し生体アミンの含有量を測定した。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．８～１．４で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
【0127】
新鮮な牛乳を均質化して低温殺菌処理を行い、室温に冷却後、発酵剤として０．１ｍＬ／Ｌの菌体数比１：１のラクトバチルス・ブルガリクスとラクトバチルス・プランタルムの混合菌液を添加し（菌液の菌体濃度は１×１０８～１０９ｃｆｕ／ｍＬ）、均一に攪拌し、３２～３５℃で３０分間酸性化して０．０５ｇ／Ｌのキモシンを添加し、均一に混合してカードができたら切断し、ホエーを排除してチーズカードを得た。チーズカードの表面に１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬのサッカロポリスポラ菌剤を散布し、３０～３７℃で３～５日培養し、成長して成熟後に３．０ｇ／Ｌの食塩を加え、その後、圧搾成形によりチーズ完成品を得た。
【0128】
発酵チーズ完成品を測定したところ、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３、複合菌剤Ｍｉｘを添加したチーズ完成品の生体アミンの含有量は対照群に比べて１３．３３％、２１．６６％低減している。
【0129】
実施例２０：サッカロポリスポラのタバコ発酵への使用による品質向上と有害物質低減
実施例１の方法で種菌を活性化させた。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．７～１．５で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
実施例１の方法で種菌を活性化させた。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．７～１．５で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
【0130】
活性化した菌液を４℃、１００００ｇで１５分間遠心分離し、収集した菌体から無菌水で１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調製し、菌液を葉タバコの表面に均一に散布して、充分かつ均一に混合し、等量の無菌水で処理したものを対照とし、３０～３７℃で湿度７０～８０％の恒温恒湿チャンバーに入れて１５日発酵培養して、毎日通風し、培養が終了した後、葉タバコを水分１５％未満まで乾燥した。
【0131】
発酵葉タバコの品質を測定したところ、発酵葉タバコの香気成分が明らかに増加し、不要なガスが減り、刺激性が低減している。サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を添加した発酵葉タバコにおける有害成分のタール量、ＨＣＮ、フェノール、ＮＨ３及び亜硝酸塩の含有量は対照群に比べてそれぞれ３２．６５％、１７．５５％、１７．６９％、２５．３６％、２９．１７％低減している。複合菌剤Ｍｉｘを添加した発酵葉タバコにおける有害成分のタール量、ＨＣＮ、フェノール、ＮＨ３及び亜硝酸塩の含有量は対照群に比べてそれぞれ３０．１２％、１７．１４％、２２．０１％、１６．７３％、２７．１５％低減している。
【0132】
実施例２１：サッカロポリスポラの飼料発酵への使用による栄養転化率の向上
実施例１の方法で種菌を活性化させた。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．５～１．２で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
実施例１の方法で種菌を活性化させた。サッカロポリスポラ・ヒルスタＪ２菌液、サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３菌液をそれぞれ調製し、両者を１：０．５～１．２で混合して、複合菌液Ｍｉｘを得た。
【0133】
米糠、藁、豆粕を（１～５）：（１～５）：２の割合で均一に混合し、粉砕して発酵物を調製した。原料と水の比が１：０．５～０．９の割合で水を加えて、１０‰～１０％の割合で菌液濃度が１０５～１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌液を播種し、均一に攪拌して、自然発酵させ、発酵温度は３０～４０℃で、発酵時間は４～９日であり、発酵が終了後に水分の含有量が１５％未満になるまで乾燥して、生物発酵飼料を得た。
【0134】
発酵飼料の品質を解析した。得られた発酵飼料には特別な香気があり、しかも栄養が豊富で、アミノ酸の構成にバランスがとれている。サッカロポリスポラ・ジアングシエンシスＪ３を添加した発酵飼料における有機酸の含有量は対照群に比べて３７．２６％高くなり、アミノ酸の含有量は１８．５７％高くなり、粗タンパク質の含有量は２３．４１％高くなっている。複合菌剤Ｍｉｘを添加した発酵飼料における有機酸の含有量は対照群に比べて２９．１８％高くなり、アミノ酸の含有量は１０．２２％高くなり、粗タンパク質の含有量は１４．４８％高くなっている。
【0135】
上記の好適な実施例で本発明を開示しているが、本発明はそれに限定されない。当業者は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において様々な変更や修正を行うことができ、本発明の権利範囲は、特許請求の範囲に記載した内容に準拠する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】