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特表2023-502925生体内遺伝子治療のためのポリマー封入ウイルスベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-26
(54)【発明の名称】生体内遺伝子治療のためのポリマー封入ウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/867 20060101AFI20230119BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230119BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230119BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230119BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230119BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230119BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230119BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230119BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230119BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20230119BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230119BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230119BHJP
【ＦＩ】
C12N15/867 Z ZNA
A61K35/76
A61K48/00
A61K9/51
A61K47/42
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
C12M1/00 A
A01K67/027
C12N5/10
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022527982
(86)(22)【出願日】2020-11-16
(85)【翻訳文提出日】2022-07-07
(86)【国際出願番号】 IB2020000955
(87)【国際公開番号】W WO2021094831
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】62/936,375
(32)【優先日】2019-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522035443
【氏名又は名称】イグザカ フランス
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】モウレーン，フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】サリー，エメライン
(72)【発明者】
【氏名】バイヤン，ルノー
(72)【発明者】
【氏名】ボッシュ，セシール
(72)【発明者】
【氏名】ビショップ，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】パシュリー，ラシェル
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029BB13
4B029BB20
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AA97X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C076AA65
4C076AA95
4C076EE41
4C084AA13
4C084NA06
4C084NA13
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
(57)【要約】
ポリマー封入ウイルスベクターナノ粒子とその使用方法は、遺伝子治療やその他の適用に使用するための遺伝物質の送達を強化する。ナノ粒子はオリゴペプチド修飾ポリ（β-アミノエステル）ポリマーを含有する外殻を含み、ベクターを封入し、偽似型付けやＶＳＶ－Ｇなどのいかなるウイルス融合タンパク質の含有も必要なくベクターが細胞を形質転換することを可能にする。ポリマー封入ベクターナノ粒子は、白血球などの末梢血細胞に対する自然な指向性を持ち、標的化部位を必要とせず、偽似型ウイルスベクターと比較して安全性プロファイルが改善されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の細胞を生体内で形質導入し、導入遺伝子を発現させる方法であって、前記方法は、（ａ）レンチウイルスベクターナノ粒子を提供することであり、前記ナノ粒子は、
（ｉ）ウイルス融合タンパク質を欠き、かつ導入遺伝子をコードするレンチウイルスベクター；および
（ｉｉ）レンチウイルスベクターを取り囲むシェルを形成する複数のオリゴペプチド修飾ポリ（β-アミノエステル）（ＯＭ－ＰＢＡＥ）分子；
を含み、および
（ｂ）レンチウイルスベクターナノ粒子を対象に非経口的に投与し、それによって対象の細胞がレンチウイルスベクターによって形質導入され、導入遺伝子が細胞内で発現されること、
を含む、
ここで、前記方法は、ウイルス融合タンパク質を含むレンチウイルスベクターを投与することを含む方法と比較して、改善された安全性プロファイルを有する、前記方法。
【請求項2】
前記改善された安全性プロファイルが、免疫細胞の活性化の欠如、体重の変化の欠如、血球数の変化の欠如、サイトカインの誘導の欠如、および肝毒性の欠如のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
安全性プロファイルが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＴＮＦ－ａ、およびＩＦＮ－ｇからなる群から選択される１つ以上のサイトカインの誘導の欠如を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記レンチウイルスベクターナノ粒子が、白血球特異的標的に向けられた標的部位を使用せずに、白血球に対する指向性（トロピズム）を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
レンチウイルスベクターが、脾臓、骨髄、または肝臓に対する指向性を示さない、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
対象のＴ細胞が形質導入される、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
導入遺伝子の導入および発現が、Ｔ細胞の活性化を必要としない、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記導入遺伝子がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に対する特異性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記発現されたＣＡＲが、前記ＣＡＲによって標的化された細胞のＴ細胞による殺傷を指示することができる、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項11】
レンチウイルスベクターナノ粒子が、ナノ粒子を標的細胞に指示する標的化部分をさらに含む、請求項１～請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記標的化部位がＣＤ３に対して特異性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
非経口投与が、１回以上の静脈内注射または１回以上の静脈内点滴によるものである、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＯＭ－ＰＢＡＥがＤＭＳＯを使用しない方法で合成される、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＯＭ－ＰＢＡＥ分子が、分子の両末端にオリゴペプチドを含み、末端修飾オリゴペプチドが、各ＰＢＡＥ分子の両末端で同じか、または異なっている、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
オリゴペプチドが、ＲＲＲ、ＫＫＫ、ＨＨＨ、ＤＤＤ、およびＥＥＥからなる群より選択される配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記レンチウイルスベクターナノ粒子を投与する前の４時間以内に前記レンチウイルスベクターナノ粒子を調製することをさらに含む、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ＯＭ－ＰＢＡＥ分子を含む溶液とレンチウイルスベクターを含む溶液とを混合し、それによってレンチウイルスベクターがＰＢＡＥ分子で被覆され、前記レンチウイルスベクターナノ粒子を形成することを含む方法によってレンチウイルスベクターナノ粒子を調製することを更に含む、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記混合が、マイクロ流体デバイスを用いて行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
レンチウイルスベクターナノ粒子を調製するためのキットであって、前記キットは、（ｉ）第１の容器内の複数のレンチウイルスベクターと、
（ｉｉ）第２の容器に入った複数のＯＭ－ＰＢＡＥ分子と、
（ｉｉｉ）請求項１９に記載の混合を実行するように構成されたマイクロ流体デバイスと、
（ｉｖ）請求項１９に記載の方法を実行するための指示書と、
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリマー封入ウイルスベクターナノ粒子とその使用方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９３６，３７５号の優先権を主張し、その全内容が参照として本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９３６，３７５号の優先権を主張し、その全内容が参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療は、遺伝子異常を矯正したり、細胞機能を変化させて疾患の処置を提供したりするために、外因性遺伝物質を標的細胞に送達する。この目的のために、ウイルス性および非ウイルス性の遺伝子送達方法の両方が使用されてきたが、両方のアプローチは依然として重大な欠点を生じさせる。
多くのウイルスベクターアプリケーションは、遺伝子治療またはワクチン接種プロトコルのいずれかのために、すでにクリニックに移動されている。それにもかかわらず、現在使用されているウイルスベクターには一定の欠点がある。 例えば、ウイルスベクターを用いて特定の細胞を標的とすることは困難である。 いくつかの遺伝子治療プロトコルでは、細胞標的化は、標的細胞を精製し、それらを エクスビボで形質導入し、形質導入細胞をインビ トロ で拡大してから患者に再移植することによって達成される。 ワクチン接種プロトコルにおいては、ベクターの直接注射が行われ、ベクターによってコードされる遺伝子産物に対する免疫応答を惹起するために非特異的な細胞形質導入がしばしば使用される。治療の有効性および安全性を高めるために、細胞標的化が必要となり得る。偽型ウイルスベクターは免疫原性である可能性があり、最初の注射後に免疫応答が発達すると、反復注射を使用することは安全ではない。このようなウイルスベクターはまた、正確に標的化することが困難であり得、望ましくない器官および組織に蓄積し得る。
遺伝物質の標的送達のための改良されたウイルスベクターベースのシステムのニーズがある。
多くのウイルスベクターアプリケーションは、遺伝子治療またはワクチン接種プロトコルのいずれかのために、すでにクリニックに移動されている。それにもかかわらず、現在使用されているウイルスベクターには一定の欠点がある。 例えば、ウイルスベクターを用いて特定の細胞を標的とすることは困難である。 いくつかの遺伝子治療プロトコルでは、細胞標的化は、標的細胞を精製し、それらを エクスビボで形質導入し、形質導入細胞をインビ トロ で拡大してから患者に再移植することによって達成される。 ワクチン接種プロトコルにおいては、ベクターの直接注射が行われ、ベクターによってコードされる遺伝子産物に対する免疫応答を惹起するために非特異的な細胞形質導入がしばしば使用される。治療の有効性および安全性を高めるために、細胞標的化が必要となり得る。偽型ウイルスベクターは免疫原性である可能性があり、最初の注射後に免疫応答が発達すると、反復注射を使用することは安全ではない。このようなウイルスベクターはまた、正確に標的化することが困難であり得、望ましくない器官および組織に蓄積し得る。
遺伝物質の標的送達のための改良されたウイルスベクターベースのシステムのニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
遺伝子治療は、遺伝子異常を矯正したり、細胞機能を変化させて疾患の処置を提供したりするために、外因性遺伝物質を標的細胞に送達する。この目的のために、ウイルス性および非ウイルス性の遺伝子送達方法の両方が使用されてきたが、両方のアプローチは依然として重大な欠点を生じさせる。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本明細書に記載の技術は、ポリマー封入ウイルスベクターナノ粒子およびそれらを使用して、遺伝子治療および他の用途において使用するための遺伝物質の改善された送達を提供する方法を提供する。当該ベクターおよび方法は、１つ以上の導入遺伝子を有する細胞の形質導入が有用である任意の状況において採用することができる。例えば、それらは、癌、感染症、代謝性疾患、神経学的疾患、または炎症状態の処置、または遺伝的欠陥の矯正に使用することができる。
【0005】
本技術のウイルスベクターナノ粒子は、ベクターを封入するポリ（β－アミノエステル）ポリマーを含有する外殻を含む。ポリマー分子は、正に荷電したオリゴペプチドまたは負に荷電したオリゴペプチドで末端修飾される。ベクターナノ粒子のポリマーシェルは、偽型化やＶＳＶ－Ｇなどのウイルス融合タンパク質の包含を必要とせずにナノ粒子を形質導入することを可能にする。ポリマー封入ベクターナノ粒子は、白血球などの末梢血細胞に対して天然の指向性を有し、標的化部分を必要とせずに、他の所望の標的細胞に対して標的化部分を加えることができる。
【0006】
対象の細胞を生体内で形質導入し、導入遺伝子を発現させる方法である。この方法は、ウイルス融合タンパク質を欠損し、かつ導入遺伝子をコードするウイルスベクターを含有するウイルスベクターナノ粒子を提供することを含み、複数のオリゴペプチド修飾ポリ（ベータアミノエステル）（ＯＭ－ＰＢＡＥ）分子がレンチウイルスベクターを取り囲むシェルを形成する。スパイクタンパク質が存在しないと、ＯＭ－ＰＢＡＥは完全で中断のないシェルを形成することができ、それによって標的化の制御が簡素化され、免疫原性が低下し、安全性プロファイルを向上させる。ナノ粒子は、対象に非経口的に投与され、それによって、対象の細胞がウイルスベクターによって形質導入され、導入遺伝子が細胞内で発現される。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたは別のウイルスベクターであり得る。
【0007】
この方法は、ウイルス融合タンパク質を含有し、および／または非毒性および生分解性ポリマーシェルを有さないウイルスベクターを投与する方法と比較して、改善された安全性プロファイルを有する。ベクター中のウイルス融合または「スパイク」または偽型化タンパク質の回避、ならびに生分解性および非毒性のＯＭ－ＰＢＡＥポリマーのシェルにおけるベクターの包み込みは、偽型ベクターに対するベクターの安全性プロファイルを有意に改善する。改善された安全性プロファイルはまた、以下の特徴の１つ以上を含み得る：偽型のベクターの使用に対する免疫細胞の活性化の減少、体重の変化の欠如、血球数の変化の欠如、サイトカインの誘導の欠如、および（ＡＬＴ／ＡＳＴ比の増加または肝毒性のマーカーの他の変化によって示されるような）肝毒性の欠如。サイトカインの誘導の欠如は、サイトカインストームをもたらし得る応答などのベクターに対する免疫応答の発達の欠如を示す。本明細書で使用される「サイトカインの誘導の欠如」は、サイトカインの発現の増加の欠如を指し、例えば、１つ以上のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＴＮＦ－ａ、およびＩＦＮ－ｇなど、サイトカインの血漿レベルによって測定され、ベクターの投与前と比較して増加しないか、５％未満、１０％未満、２０％未満、または５０％未満増加する。改善された安全性プロファイルの別の態様は、ベクターナノ粒子が、導入遺伝子発現またはプロウイルス組込みのいずれかによって評価されるように、脾臓、骨髄、または肝臓に対する指向性を示さないことであり得る。本明細書で使用される「トロピズム（指向性）」は、ウイルスベクターが、それが投与される対象の体内におけるその平均分布よりも高いレベルまで器官または組織に蓄積する傾向を指す。改善された安全性プロファイルのさらに別の態様は、ベクターナノ粒子が、非経口投与のために設計された医薬処方にとって望ましくない溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の非存在下で合成されたＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを含有することであり得る。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1-1】図１Ａ～１Ｆは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ欠損型（「Ｂａｌｄ（はげた）」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射後の全血白血球数を要約したものである。 主な白血球亜集団は、２つの異なる用量で投与されたはげまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子による処置の４日前および１４日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（マウスあたり用量１＝２．８ｘ１０１０ベクター粒子（ｖｐ）またはマウスあたり用量２＝１．４ｘ１０１１ ｖｐ）。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージおよび活性化リンパ球の画分は、ＶＳＶ－Ｇ欠損（「はげの」）（図１Ａ）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子（図１Ｂ）の２用量で、処置の４日前処置（－４）および１４日後処置（１４）で採血したサンプルに対して与えられる。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球（図１Ｄ）とＣＤ８陽性Ｔリンパ球（図１Ｅ）の内容は別々に表現されている。白血球およびＴリンパ球は、注射後１４日目のカウントを、それぞれ図１Ｃおよび１Ｆにおいて異なる処置について比較する。
【図1-2】図１Ａ～１Ｆは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ欠損型（「Ｂａｌｄ（はげた）」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射後の全血白血球数を要約したものである。 主な白血球亜集団は、２つの異なる用量で投与されたはげまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子による処置の４日前および１４日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（マウスあたり用量１＝２．８ｘ１０１０ベクター粒子（ｖｐ）またはマウスあたり用量２＝１．４ｘ１０１１ ｖｐ）。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージおよび活性化リンパ球の画分は、ＶＳＶ－Ｇ欠損（「はげの」）（図１Ａ）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子（図１Ｂ）の２用量で、処置の４日前処置（－４）および１４日後処置（１４）で採血したサンプルに対して与えられる。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球（図１Ｄ）とＣＤ８陽性Ｔリンパ球（図１Ｅ）の内容は別々に表現されている。白血球およびＴリンパ球は、注射後１４日目のカウントを、それぞれ図１Ｃおよび１Ｆにおいて異なる処置について比較する。
【図1-3】図１Ａ～１Ｆは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ欠損型（「Ｂａｌｄ（はげた）」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射後の全血白血球数を要約したものである。 主な白血球亜集団は、２つの異なる用量で投与されたはげまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子による処置の４日前および１４日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（マウスあたり用量１＝２．８ｘ１０１０ベクター粒子（ｖｐ）またはマウスあたり用量２＝１．４ｘ１０１１ ｖｐ）。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージおよび活性化リンパ球の画分は、ＶＳＶ－Ｇ欠損（「はげの」）（図１Ａ）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子（図１Ｂ）の２用量で、処置の４日前処置（－４）および１４日後処置（１４）で採血したサンプルに対して与えられる。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球（図１Ｄ）とＣＤ８陽性Ｔリンパ球（図１Ｅ）の内容は別々に表現されている。白血球およびＴリンパ球は、注射後１４日目のカウントを、それぞれ図１Ｃおよび１Ｆにおいて異なる処置について比較する。
【図2-1】図２Ａ～２Ｅは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ－欠損型（「Ｂａｌｄ（はげた）」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）のレンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射後の循環サイトカインレベルを示したものである。ＴＮＦ－ａ（図２Ａ）、ＩＦＮ－ｇ（図２Ｂ）、ＩＬ－２（図２Ｅ）、ＩＬ４（図２Ｄ）およびＩＬ－５（図２Ｃ）の血漿レベルを、２つの異なる用量で投与されたはげたまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子による処置の４日前および１４日後にビーズベースのフローサイトメトリー法により定量した（用量１=２．８ｘ１０１０ｖｐ／マウスまたは用量２=１．４ ｘ １０１１ｖｐ ／マウス）。
【図2-2】図２Ａ～２Ｅは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ－欠損型（「Ｂａｌｄ（はげた）」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）のレンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射後の循環サイトカインレベルを示したものである。ＴＮＦ－ａ（図２Ａ）、ＩＦＮ－ｇ（図２Ｂ）、ＩＬ－２（図２Ｅ）、ＩＬ４（図２Ｄ）およびＩＬ－５（図２Ｃ）の血漿レベルを、２つの異なる用量で投与されたはげたまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子による処置の４日前および１４日後にビーズベースのフローサイトメトリー法により定量した（用量１=２．８ｘ１０１０ｖｐ／マウスまたは用量２=１．４ ｘ １０１１ｖｐ ／マウス）。
【図2-3】図２Ａ～２Ｅは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ－欠損型（「Ｂａｌｄ（はげた）」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）のレンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射後の循環サイトカインレベルを示したものである。ＴＮＦ－ａ（図２Ａ）、ＩＦＮ－ｇ（図２Ｂ）、ＩＬ－２（図２Ｅ）、ＩＬ４（図２Ｄ）およびＩＬ－５（図２Ｃ）の血漿レベルを、２つの異なる用量で投与されたはげたまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子による処置の４日前および１４日後にビーズベースのフローサイトメトリー法により定量した（用量１=２．８ｘ１０１０ｖｐ／マウスまたは用量２=１．４ ｘ １０１１ｖｐ ／マウス）。
【図3】図３は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおける ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型」）のレンチウイルスベクター粒子の生体内組織生体分布の結果を示す。全身生物発光イメージングは、２つの異なる用量で投与されたはげたまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射の３，７または１４日後に実施された（用量１＝２．８ｘ１０１０ｖｐ／マウス、または用量２＝１．４ｘ１０１１ ｖｐ／マウス）。
【図4-1】図４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおける ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ－欠損型（「はげた」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子の生体内組織生体分布の結果 を示す。 組込みプロウイルス配列を検出するためのｑＰＣＲは、２つの異なる用量で投与されたはげたまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射の１４日後に採取された臓器に対して実施された（用量１＝２．８ｘ１０１０ｖｐ／マウス、または用量２＝１．４ｘ１０１１ ｖｐ／マウス）。
【図4-2】図４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおける ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＶＳＶ－Ｇ－欠損型（「はげた」）およびＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型の」）レンチウイルスベクター粒子の生体内組織生体分布の結果 を示す。 組込みプロウイルス配列を検出するためのｑＰＣＲは、２つの異なる用量で投与されたはげたまたはＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子の単回静脈内注射の１４日後に採取された臓器に対して実施された（用量１＝２．８ｘ１０１０ｖｐ／マウス、または用量２＝１．４ｘ１０１１ ｖｐ／マウス）。
【図5-1】図５Ａ～５Ｄは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型タイプ」）またはＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射を繰り返した後の全血白血球数を要約する。主な白血球亜集団は、２回、３回、４回または５回の静脈内用量（１日あたり１回）を介して投与した、封入したはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の８日前および７日後に、多色フローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝マウス当たり１．３から最大２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）まで）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内投与（総注射用量=マウス１匹あたり２．５７ ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球および活性化リンパ球の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥ（２ＩＶ、３ＩＶ、４ＩＶおよび５ＩＶ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋５ＩＶ）中で封入したＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の２、３、４または５用量で、処置の８日前（ー８）および７日後（７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図５Ａ）。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球とＣＤ８陽性Ｔリンパ球のコンテンツは別々に表現されている（図５Ｃ）。白血球およびＴリンパ球は、注射後７日目のカウントを、それぞれ図５Ｂおよび５Ｄにおいて異なる処置について比較する。
【図5-2】図５Ａ～５Ｄは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型タイプ」）またはＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射を繰り返した後の全血白血球数を要約する。主な白血球亜集団は、２回、３回、４回または５回の静脈内用量（１日あたり１回）を介して投与した、封入したはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の８日前および７日後に、多色フローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝マウス当たり１．３から最大２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）まで）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内投与（総注射用量=マウス１匹あたり２．５７ ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球および活性化リンパ球の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥ（２ＩＶ、３ＩＶ、４ＩＶおよび５ＩＶ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋５ＩＶ）中で封入したＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の２、３、４または５用量で、処置の８日前（ー８）および７日後（７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図５Ａ）。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球とＣＤ８陽性Ｔリンパ球のコンテンツは別々に表現されている（図５Ｃ）。白血球およびＴリンパ球は、注射後７日目のカウントを、それぞれ図５Ｂおよび５Ｄにおいて異なる処置について比較する。
【図5-3】図５Ａ～５Ｄは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ＋（「偽型タイプ」）またはＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射を繰り返した後の全血白血球数を要約する。主な白血球亜集団は、２回、３回、４回または５回の静脈内用量（１日あたり１回）を介して投与した、封入したはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の８日前および７日後に、多色フローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝マウス当たり１．３から最大２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）まで）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内投与（総注射用量=マウス１匹あたり２．５７ ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球および活性化リンパ球の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥ（２ＩＶ、３ＩＶ、４ＩＶおよび５ＩＶ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋５ＩＶ）中で封入したＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の２、３、４または５用量で、処置の８日前（ー８）および７日後（７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図５Ａ）。ＣＤ４陽性Ｔリンパ球とＣＤ８陽性Ｔリンパ球のコンテンツは別々に表現されている（図５Ｃ）。白血球およびＴリンパ球は、注射後７日目のカウントを、それぞれ図５Ｂおよび５Ｄにおいて異なる処置について比較する。
【図6-1】図６Ａおよび６Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された偽型タイプ、またはＶＳＶ－Ｇ－欠損のレンチウイルスベクター粒子の静脈内注射を繰り返した後の循環サイトカインレベルを示す。ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－２、ＩＬ４およびＩＬ－５の血漿レベルを、偽型タイプ（”ＶＳＶ－Ｇ＋”）またはＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）のレンチウイルスベクター粒子による２、３、４または５回の静脈内注射による処置の８日前および３日後（図６Ａ）および７日後（図６Ｂ）のビーズベースのフローサイトメトリー法によって定量した。
【図6-2】図６Ａおよび６Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された偽型タイプ、またはＶＳＶ－Ｇ－欠損のレンチウイルスベクター粒子の静脈内注射を繰り返した後の循環サイトカインレベルを示す。ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－２、ＩＬ４およびＩＬ－５の血漿レベルを、偽型タイプ（”ＶＳＶ－Ｇ＋”）またはＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）のレンチウイルスベクター粒子による２、３、４または５回の静脈内注射による処置の８日前および３日後（図６Ａ）および７日後（図６Ｂ）のビーズベースのフローサイトメトリー法によって定量した。
【図7】図７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおいて ＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された偽型タイプまたはＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクター粒子を繰り返し静脈内注射した後の生体内組織生体分布の結果 を示す。統合されたプロウイルス配列を検出するためのｑＰＣＲは、偽型タイプ（「ＶＳＶ－Ｇ＋」）による５回の静脈内注射、またはＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（“はげた”）レンチウイルスベクター粒子の２、３、４、または５回の静脈内注射による処置の３日後に回収された臓器で実行された。
【図8】図８Ａおよび８Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された偽型タイプまたはＶＳＶ－Ｇ－欠損（「はげた」）レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射を繰り返した後の白血球におけるＧＦＰ発現プロファイルを要約する。ＧＦＰ発現は、偽型タイプ（”ＶＳＶ－Ｇ＋”）による５回の静脈内注射、またはＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”はげた”）レンチウイルスベクター粒子の２、３、４または５回の静脈内注射による処置後３日目（図８Ａ）または７日目（図８Ｂ）に回収された、血液、骨髄および脾臓細胞におけるフローサイトメトリーによって測定した。
【図10-1】図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”はげた”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の全血白血球数を要約する。主な白血球亜集団は、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）投与した、注射または灌流のいずれかを介して投与した封入したはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注射用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球および好酸球の画分は、ＯＭ－ＰＢＡに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）、 はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５回の灌流による処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血したサンプルに対して与えられる（図１０Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて白血球数を評価し、図１０Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の点滴を介して投与した。
【図10-2】図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”はげた”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の全血白血球数を要約する。主な白血球亜集団は、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）投与した、注射または灌流のいずれかを介して投与した封入したはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注射用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球および好酸球の画分は、ＯＭ－ＰＢＡに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）、 はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５回の灌流による処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血したサンプルに対して与えられる（図１０Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて白血球数を評価し、図１０Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の点滴を介して投与した。
【図10-3】図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”はげた”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の全血白血球数を要約する。主な白血球亜集団は、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）投与した、注射または灌流のいずれかを介して投与した封入したはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注射用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血中ＣＤ３陽性リンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球／マクロファージ、好中球および好酸球の画分は、ＯＭ－ＰＢＡに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）、 はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５回の灌流による処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血したサンプルに対して与えられる（図１０Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて白血球数を評価し、図１０Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の点滴を介して投与した。
【図11-1】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”はげた”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の定住動物及び活性化骨髄の全血球数を要約する。骨髄性亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与され、３、４または５回分の静脈注射用量を介して１日１回投与された、封入はげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後にマルチプレックスフローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）／マウス、および点滴のためのマウス当たり、＝２．４ｘ１０１１～４ｘ１０１１ｖｐ）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１１Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて骨髄数を評価し、図１１Ｂにおいて全血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図11-2】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”はげた”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の定住動物及び活性化骨髄の全血球数を要約する。骨髄性亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与され、３、４または５回分の静脈注射用量を介して１日１回投与された、封入はげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後にマルチプレックスフローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）／マウス、および点滴のためのマウス当たり、＝２．４ｘ１０１１～４ｘ１０１１ｖｐ）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１１Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて骨髄数を評価し、図１１Ｂにおいて全血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図12-1】図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ３＋細胞中におけるＣＤ４＋，ＣＤ８＋およびＴＣＲγ／δ＋のカウントを要約する。骨髄性亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与され、３、４または５回分の静脈注射用量を介して１日１回投与された、封入はげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後にマルチプレックスフローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）／マウス、および点滴のためのマウス当たり、＝２．４ｘ１０１１～４ｘ１０１１ｖｐ）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ＣＤ３＋ ＣＤ４＋，ＣＤ８＋およびＴＣＲγ／δ＋細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量 １、２および３）で、または３、４または５回の点滴（点滴用量 １、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血したサンプルに対して与えられる（図１２Ａ）。ＣＤ３＋細胞中のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＴＣＲγ／δ＋のカウントを、脾臓および骨髄における殺処分後（７日目）のマウスにおいて評価し、図１２Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図12-2】図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ３＋細胞中におけるＣＤ４＋，ＣＤ８＋およびＴＣＲγ／δ＋のカウントを要約する。骨髄性亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与され、３、４または５回分の静脈注射用量を介して１日１回投与された、封入はげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後にマルチプレックスフローサイトメトリーによって決定された（総注射用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）／マウス、および点滴のためのマウス当たり、＝２．４ｘ１０１１～４ｘ１０１１ｖｐ）。ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ＣＤ３＋ ＣＤ４＋，ＣＤ８＋およびＴＣＲγ／δ＋細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量 １、２および３）で、または３、４または５回の点滴（点滴用量 １、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血したサンプルに対して与えられる（図１２Ａ）。ＣＤ３＋細胞中のＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＴＣＲγ／δ＋のカウントを、脾臓および骨髄における殺処分後（７日目）のマウスにおいて評価し、図１２Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図13-1】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ４＋細胞におけるＴ－Ｒｅｇｓ、原始的な、中央記憶およびエフェクター記憶数を要約する。ＣＤ４＋亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）を介して投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１３Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいてＣＤ４＋亜集団数を評価し、図１３Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図13-2】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ４＋細胞におけるＴ－Ｒｅｇｓ、原始的な、中央記憶およびエフェクター記憶数を要約する。ＣＤ４＋亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）を介して投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１３Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいてＣＤ４＋亜集団数を評価し、図１３Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図14-1】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ８＋細胞内の原始的な、中央記憶およびエフェクター記憶数を要約する。ＣＤ８＋亜集団は、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）投与した、注射または灌流のいずれかを介して投与した、封入はげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１４Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいてＣＤ８＋亜集団数を評価し、図１４Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図14-2】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ８＋細胞内の原始的な、中央記憶およびエフェクター記憶数を要約する。ＣＤ８＋亜集団は、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）投与した、注射または灌流のいずれかを介して投与した、封入はげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１４Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいてＣＤ８＋亜集団数を評価し、図１４Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図15-1】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ４＋細胞の中におけるＣＤ２５－ＣＤ６９－，ＣＤ２５＋ＣＤ６９－，ＣＤ２５－ＣＤ６９＋およびＣＤ２５＋ＣＤ６９＋細胞数を要約する。ＣＤ４＋亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）を介して投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１５Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて活性化ＣＤ４＋亜集団数を評価し、図１５Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図15-2】図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ４＋細胞の中におけるＣＤ２５－ＣＤ６９－，ＣＤ２５＋ＣＤ６９－，ＣＤ２５－ＣＤ６９＋およびＣＤ２５＋ＣＤ６９＋細胞数を要約する。ＣＤ４＋亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）を介して投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回の点滴（点滴用量１、２および３）で、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５つの灌流で、処置９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１５Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて活性化ＣＤ４＋亜集団数を評価し、図１５Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図16-1】図１６Ａおよび１６Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ８＋細胞中のＣＤ２５－ ＣＤ６９－、ＣＤ２５＋ ＣＤ６９－、ＣＤ２５－ ＣＤ６９＋およびＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋細胞数を要約する。ＣＤ４＋亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）を介して投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５回分の灌流を用いて、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回分の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回分の点滴（点滴用量１、２および３）で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１６Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて活性化ＣＤ８＋亜集団数を評価し、図１６Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図16-2】図１６Ａおよび１６Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＣＤ８＋細胞中のＣＤ２５－ ＣＤ６９－、ＣＤ２５＋ ＣＤ６９－、ＣＤ２５－ ＣＤ６９＋およびＣＤ２５＋ ＣＤ６９＋細胞数を要約する。ＣＤ４＋亜集団は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）を介して投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって決定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および注入用は、マウス１匹当たり＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。血液常在性および炎症性骨髄系細胞の画分は、はげたレンチベクター（Ｂａｌｄ）および偽型のレンチウイルスベクター粒子（ＶＳＶ－Ｇ＋）の５回分の灌流を用いて、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損粒子の３、４または５回分の注射（ＩＶ用量１、２および３）または３、４または５回分の点滴（点滴用量１、２および３）で、処置の９日前（－９）および３および７日後（＋３および＋７）に採血されたサンプルに対して与えられる（図１６Ａ）。脾臓および骨髄において、殺処分後（７日目）のマウスにおいて活性化ＣＤ８＋亜集団数を評価し、図１６Ｂにおいて全血白血球数と比較した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図17-1】図１７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の循環サイトカインレベルを要約する。ＴＮＦ－ａ，ＩＦＮ－ｇ，ＩＬ－２，ＩＬ４およびＩＬ－５の血漿レベルは、注射または灌流のいずれかを介して投与された３，４または５回分の静脈注射の用量を（１日１回）投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって定量化された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用は、マウス１匹当たり総注入用量＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図17-2】図１７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の循環サイトカインレベルを要約する。ＴＮＦ－ａ，ＩＦＮ－ｇ，ＩＬ－２，ＩＬ４およびＩＬ－５の血漿レベルは、注射または灌流のいずれかを介して投与された３，４または５回分の静脈注射の用量を（１日１回）投与された、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に多色フローサイトメトリーによって定量化された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用は、マウス１匹当たり総注入用量＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図18】図１８は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）を示す。酵素活性は、注射または灌流のいずれかを介して投与された、３，４または５回分の静脈注射の用量を（１日１回）投与した、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置の９日前、３日および７日後に回収された商用血漿の比色キットを用いて測定された（注射用総注入用量＝マウス１匹あたり１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用は、マウス１匹当たり総注入用量＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図19-1】図１９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の生体内組織生体分布の結果を示す。組込みプロウイルス配列を検知するためのｑＰＣＲは、注射または灌流のいずれかを介して投与された３，４または５回の静脈内用量（１日１回）を投与した封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子を用いた処置後、７日目に回収された器官上で実施された（注射用のマウス１匹当たり総用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ ｘ １０１１ベクター粒子（ｖｐ）および点滴用マウス１匹当たり総用量＝２．４ｘ１０１１～４ｘ１０１１ＶＰ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図19-2】図１９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の生体内組織生体分布の結果を示す。組込みプロウイルス配列を検知するためのｑＰＣＲは、注射または灌流のいずれかを介して投与された３，４または５回の静脈内用量（１日１回）を投与した封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子を用いた処置後、７日目に回収された器官上で実施された（注射用のマウス１匹当たり総用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ ｘ １０１１ベクター粒子（ｖｐ）および点滴用マウス１匹当たり総用量＝２．４ｘ１０１１～４ｘ１０１１ＶＰ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図20】図２０は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後の白血球におけるＧＦＰ発現プロファイルを要約したものである。ＧＦＰ発現は、注射または灌流のいずれかを介して投与した、３，４または５回分の静脈注射の用量を（１日１回）投与した、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置後７日目に回収された血液、骨髄および脾臓における多色フローサイトメトリーによって測定された（注射用マウス１匹当たり総注入用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用マウス１匹当たり総注入用量＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【図21】図２１は、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ欠損（”Ｂａｌｄ”）レンチウイルスベクター粒子の静脈内点滴または注射を繰り返した後のＴリンパ球亜集団におけるＧＦＰ発現プロファイルを要約したものである。ＧＦＰ発現は、注射または灌流のいずれかを介して３，４または５静脈注射の用量を（１日１回）投与した、封入されたはげたレンチウイルスベクター粒子による処置後７日目に回収された血液、骨髄および脾臓における多色フローサイトメトリーによって測定された（注射用マウス１匹当たり総注入用量＝１．３ｘ１０１１～２．５７ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）、および点滴用マウス１匹当たり総注入用量＝２．４ｘ １０１１～４ｘ １０ １１ｖｐ）ＶＳＶ－Ｇ＋レンチウイルスベクター粒子を５回の静脈内点滴投与（総注入用量=マウス１匹あたり４ｘ１０１１ベクター粒子（ｖｐ）を通じて投与した。ビヒクルコントロールを研究に含め、４５０ μＬ処方物バッファーの５回の注入を介して投与した。
【発明を実施するための形態】
【0009】
詳細な説明
本明細書に記載の技術は、合成パッケージ化されたウイルスベクターナノ粒子組成物、および遺伝子治療およびワクチン適用において使用するための遺伝物質の増強された送達を提供するためにそれらを使用するための方法を提供する。当該ベクター組成物および方法は、１つ以上の導入遺伝子を有する細胞の形質導入が有用である任意の状況において採用することができる。 例えば、それらは、癌、感染症、代謝性疾患、神経学的疾患、または炎症状態の処置、または遺伝的欠陥の矯正に使用することができる。
本明細書に記載の技術は、合成パッケージ化されたウイルスベクターナノ粒子組成物、および遺伝子治療およびワクチン適用において使用するための遺伝物質の増強された送達を提供するためにそれらを使用するための方法を提供する。当該ベクター組成物および方法は、１つ以上の導入遺伝子を有する細胞の形質導入が有用である任意の状況において採用することができる。 例えば、それらは、癌、感染症、代謝性疾患、神経学的疾患、または炎症状態の処置、または遺伝的欠陥の矯正に使用することができる。
【0010】
本技術のウイルスベクターナノ粒子組成物には、ベクターを封入するポリマーまたはポリマーの混合物を含有する外殻が含まれる。特定の実施態様では、ナノ粒子のポリマーのシェル（殻）は、一般式を有するオリゴペプチド誘導体化ポリ（β－アミノエステル）の１種または複数種を含有する。
ここで、Ｐｅｐはペプチド、例えばオリゴペプチドであり、ＲはＯＨ、ＣＨ３ 、またはコレステロール基であり、ここでｍは１～２０の範囲、ｎは１～１００の範囲、およびｏは１～１０の範囲である。好ましい実施態様において、ペプチドは、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびシステイン（Ｃ）からなる群から選択される少なくとも２つまたは少なくとも３つのアミノ酸を含む。本技術で使用することができるオリゴペプチド誘導体化ＰＢＡＥのさらなる説明については、ＷＯ２０１４／１３６１００およびＷＯ２０１６／１１６８８７も参照されたい。 システインは、ポリマーに対するペプチドの共有結合点を提供するために含むことができ、ｐＨ７ではわずかな負電荷を帯びるが、正に荷電したアミノ酸と一緒に使用すればも電荷を大きく変化させない。例示的なペプチドは、ＣＲＲＲ（配列番号１）、ＣＨＨＨ（配列番号２）、ＣＫＫＫ（配列番号３）、ＣＥＥＥ（配列番号４）、およびＣＤＤＤ（配列番号５）である。他の実施態様において、任意の天然に存在するアミノ酸を、Ｐｅｐ部分に含めることができる。ペプチドの配列は、ポリマーコーティングベクターの細胞取り込みおよび標的化を促進するように選択される。ウイルスエンベロープタンパク質を利用する、および欠損する実施態様において、オリゴペプチド配列および正味電荷は、意図された標的細胞においてポリマーと共に封入されたウイルスベクターの細胞取り込みおよび／またはエンドソーム取り込みおよび／またはエンドソーム脱出を促進するように選択される。 ポリマーの両末端の各々におけるペプチドは、典型的には、所与のポリマー分子上で同じであるが、異なっていてもよい。 ベクターを被覆するために使用される混合物中のポリマー分子は、同一でも異なっていてもよい；異なる場合、それらはポリマー骨格または末端ペプチドにおいて異なっていてもよい。 好ましい実施態様において、ポリマーの両末端のペプチドは、アミノ酸配列 ＣＲＲＲ（配列番号１）、またはＣＨＨＨ（配列番号２）、またはＣＫＫＫ（配列番号３）、またはＣＥＥＥ（配列番号４）、またはＣＤＤＤ（配列番号５）を有する。ポリマーまたはポリマーの混合物は、正味の正または負の電荷を有することができ、または非電荷であり得る。Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥなどの単一タイプのアミノ酸のみの２残基以上を含有するオリゴペプチドを使用することができる。ポリマーは、ポリマー主鎖に結合した側鎖上にグラフトされた糖または糖アルコールを含み得る。各ベクターナノ粒子を封入する１つ以上のポリマー分子は、任意選択で、Ｒにおけるようなポリマー分子上の任意の所望の位置でポリマーに連結された標的化部分を含み得る。ポリマー分子は、架橋または非架橋であり得る。ポリマー分子は、ウイルスベクターに非共有結合で、または共有結合によって、ベクターの脂質二重層に分配する脂質分子（例えば、コレステロール、リン脂質、または脂肪酸）に、または脂質二重層に埋め込まれたタンパク質に結合させることができる。いくつかの実施態様においては、ポリマーは、単にベクターを被覆するが、非特異的に結合している、すなわち、特定の共有的または非共有的相互作用によってベクターに結合しているのではなく、正味電荷、疎水性、またはファンデルワールス相互作用などの非特異的相互作用によってのみ結合される。特定の実施態様においては、レトロウイルスベクターに対するポリマーまたはポリマーの混合物の比は、重量比で約１：１００～約５：１であり、またはベクター粒子あたりのポリマー分子の数は、約１０６～ 約１０１２である。
【化1】
【0011】
ウイルスベクターナノ粒子は、ウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、所望の特性（例えば、免疫原性、異なるサイズの構築物を収容する能力、統合および複製特性、発現レベル、発現持続時間、組織指向性または標的化特性、分裂および／または静止細胞に感染する能力など）に基づいて選択し得る。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター等のレトロウイルスベクターであり得る。好ましい実施態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。しかしながら、本発明は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスに由来するものを含む他のタイプのウイルスおよび／またはウイルスベクターを用いて実施することもできる。
【0012】
ナノ粒子は、カプセル化されたベクターナノ粒子の表面で、例えば、標的化部分とポリマーコーティングとの共有結合または非共有結合の会合などによって露出される１つ以上の標的化部分を含むことができる。標的化部分の１つの分子種、または標的化部分の１つ以上の異なる分子種を、各ウイルスベクターナノ粒子上に存在させることができる。標的化部分は、例えば、抗体、抗体断片（Ｆａｂを含む）、ｓｃＦｖｓ、抗体様タンパク質スカフォールド、オリゴペプチド、アプタマー、Ｌ－ＲＮＡアプタマー、または細胞表面受容体に対するリガンドであり得る。実施態様では、標的化部分は、ナノ粒子をＴ細胞に向けて標的化するための抗ＣＤ３抗体またはアプタマーである。 ひとつの実施態様において、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体をコードする。ナノ粒子は、ビヒクルが投与される対象において生体内で細胞を形質導入することによって、またはインビ トロで細胞を形質導入することによって遺伝子送達ビヒクルとして作用することができる。特定の実施態様において、ナノ粒子は、通常、標的化部分の作用を介して、および／またはポリマーまたはポリマー混合物の作用を介して、特定のタイプの細胞または細胞のクラスを形質導入することができる。 いくつかの実施態様において、ポリマー被覆されたベクター粒子のポリマーは、標的細胞表面への付着によってだけでなく、エンドサイトーシス、ミクロピノサイトーシス、貪食、または他の機構などによるエンドソーム取り込み、およびエンドソーム脱出（エンドソーム小胞内のｐＨの低下後の膜融合を介して）を通じて、細胞形質導入を促進することができる。好ましい実施態様において、ポリマーに関連するオリゴペプチドのアミノ酸配列は、エンドソーム経路を介した細胞形質導入を特異的に促進することができる。
【0013】
本技術のいくつかの実施態様においては、ウイルスベクターは偽型化されるが、他の実施態様ではベクターは特定のウイルスまたは偽型化するエンベロープタンパク質を欠いている。 偽型のベクターにおいて、ＨＩＶ ｇｐ１２０－ｇｐ４１複合体や水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）糖タンパク質などのエンベロープタンパク質がウイルスエンベロープの外表面にスパイク様構造を形成し、ベクター粒子の宿主細胞への付着および宿主細胞へのウイルスの侵入を促進する。ＶＳＶ－Ｇなどの偽型化タンパク質はまた、精製中にベクターを保護または結合するために使用され得る（例えば、超遠心分離中の保護、アフィニティーカラムまたはその他のアフィニティーマトリックスへの結合、またはゲル精製）。しかしながら、ウイルスベクターのポリマーパッケージングの状況において、そのような構造は、ベクター粒子エンベロープとポリマーとの間の緊密な会合を妨害し得る。ウイルスエンベロープタンパク質はまた、ｐＨ依存性の電荷を運び、これはポリマー、特に荷電ポリマーの会合を制限または妨害し得る。さらに、偽型タイプ付けタンパク質を保有するパッケージ化されたウイルスベクターは、インビトロおよび生体内 でコーティングの不安定化および 破壊を被ることができ、したがって細胞を非特異的に形質導入することができるウイルスベクターを放出し、潜在的に安全性プロファイルの低下に導く。エンベロープタンパク質を欠くベクターは、ポリマーを用いてウイルスベクターのパッケージングを増強することができる。エンベロープタンパク質を欠く被覆されたベクターは、エンベロープタンパク質を有するベクターと比較して改善された安全性プロファイルを示すが、これは、コーティングの不安定化または破壊後、インビトロで細胞を形質導入することができないからである。ウイルスベクターがウイルスエンベロープタンパク質を欠いている本技術のナノ粒子は、ナノ粒子がベクター当たりのポリマー分子の閾値数を超える哺乳動物細胞のみを形質導入することができるため、遺伝子治療または免疫療法に使用するための組み込みの安全機構を有する。ベクター当たりのポリマー分子のその閾値数を下回ると、ポリマーの量がベクターを完全に被覆するには不十分であり、ナノ粒子が構造的に不安定になったり、ナノ粒子からのポリマー分子の解離を受ける可能性がある。一旦エンベロープタンパク質を欠くこのようなベクターが有効なポリマーコーティングを失うと、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞を形質導入することができなくなる。このようなナノ粒子は、閾値特徴を欠くベクターまたはポリマーを封入したベクターと比較して、生体内での使用に対する改善された安全性プロファイルを有する。
【0014】
いくつかの実施態様において、ウイルスエンベロープまたは融合タンパク質ではなく、偽型タイプ付けに使用されないベクター産生細胞からのタンパク質など、膜外面にスパイク様構造を形成しないタンパク質などのいくつかの膜タンパク質がウイルスベクター粒子の脂質膜に存在し得る。本技術の特定の実施態様において、ウイルスエンベロープタンパク質は、エンベロープ脂質二重層の外表面から突出する有意な質量を有するもの、例えば、それらの質量の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％が外側エンベロープ表面から突出しているものなど、ウイルスベクター粒子から除外される。
【0015】
ナノ粒子組成物は、場合により、追加の成分、例えば脂質分子、界面活性剤、核酸、タンパク質分子、または小分子薬物を含有することができる。本技術はまた、ナノ粒子を１つまたは複数の賦形剤、担体、緩衝液、塩、または液体と一緒に含む医薬処方物または組成物をもくろみ、送達ビヒクルを、静脈内、筋肉内、 皮下、腫瘍周囲または腫瘍内注射などの経口、鼻腔内、または非経口投与を介する投与、または生体外遺伝子導入プロトコルにおける細胞への体外投与に適するようにする。このような組成物および処方物は、保存中にそれらを安定化させるために凍結乾燥することもできる。
【0016】
本技術のウイルスベクターナノ粒子は、遺伝子送達ビヒクルとして仕えることができる。ナノ粒子は、ポリマーまたはポリマーの混合物を含有する層でその外表面にコーティングされたウイルスベクターを含む。いくつかの実施態様において、ウイルスベクターは、偽型化され、融合促進エンベロープタンパク質を有し、導入遺伝子を含む。他の実施態様において、ウイルスベクターは、任意の天然または組換えエンベロープタンパク質を欠いており、導入遺伝子を含む。 特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、類似のレトロウイルスベクターのエンベロープに典型的に含まれ得るウイルスエンベロープタンパク質を特異的に欠損する。 特定の実施形態において、ウイルスベクターは、天然に存在するまたは修飾されたウイルスベクターエンベロープタンパク質、例えば野生型または修飾されたＶＳＶ－Ｇ、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＭＭＴＶ ｇｐ５２、ＭＭＴＶ ｇｐ３６、ＭＬＶ ｇｐ７１、シンシチン、野生型または修飾されたシンドビスウイルスエンベロープタンパク質、麻疹ウイルスヘマグルチニン（Ｈ）および融合体（Ｆ）糖タンパク質、ならびにＨＥＭＯを特異的に欠損する。他の実施形態において、ベクターは、このようなエンベロープタンパク質の１つ以上を含有する。
【0017】
本技術の別の態様は、上述のナノ粒子／遺伝子送達ビヒクル（ウイルスベクターナノ粒子）を作製する方法である。この方法は、（ａ）エンベロープタンパク質を保有または欠損し、かつ導入遺伝子を含有するウイルスベクターを提供する工程と、（ｂ）ポリマーまたはポリマーの混合物を提供する工程と、（ｃ）ウイルスベクターとポリマーまたはポリマーの混合物とを接触させ、それによって、ウイルスベクターとポリマー／ポリマーの混合物とが結合してナノ粒子を形成し、ポリマーまたはポリマーの混合物でコーティングされたウイルスベクターを含有する工程、とを含む。
【0018】
この技術のさらなる態様は、 上述のウイルスベクターナノ粒子（遺伝子送達ビヒクル）を用いて疾患を処置する生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の方法である。この方法は、ナノ粒子を含有する組成物をそれを必要とする対象に非経口的に投与することを必要とし、それによって、対象内の細胞がウイルスベクターによって形質導入され、導入遺伝子が形質導入された細胞において発現される。一つの実施態様において、処置される疾患は癌である。 生体内 投与の場合 、ＶＳＶ－Ｇなどのウイルスエンベロープタンパク質が存在しない態様は、宿主内で非標的細胞を形質導入する能力を欠いているため、およびエンベロープタンパク質によってそうでなければ提供される細胞取り込みおよび／またはエンドソーム取り込みおよび／またはエンドソーム脱出を回復させるためのポリマー封入の使用によって提供されるより特異的な標的化のために、強化された安全性プロファイルを提供するので好ましい。
【実施例】
【0019】
実施例１：生体分布研究に使用されるレンチウイルスベクターのバッチの生産。
以前に操作された融合原性および高い免疫原性のＶＳＶ－Ｇタンパク質を欠落する形質導入欠損レンチウイルスベクター（国際公開第２０１９／１４５７９６ Ａ２号参照、それは参照により本明細書に組み込まれる）を、マウスにおける生体分布研究に使用するために調製した。これらのベクターは、反復全身投与を可能にする。
導入遺伝子の組織生体分布を観察するために健康なマウスモデルに注入されたレンチウイルスベクターの異なるバッチを、以下の材料および方法を用いて作製した。
以前に操作された融合原性および高い免疫原性のＶＳＶ－Ｇタンパク質を欠落する形質導入欠損レンチウイルスベクター（国際公開第２０１９／１４５７９６ Ａ２号参照、それは参照により本明細書に組み込まれる）を、マウスにおける生体分布研究に使用するために調製した。これらのベクターは、反復全身投与を可能にする。
導入遺伝子の組織生体分布を観察するために健康なマウスモデルに注入されたレンチウイルスベクターの異なるバッチを、以下の材料および方法を用いて作製した。
【0020】
原料
転写ベクタープラスミドは、ｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼまたはｐＡｒａ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰであった。カナマイシン耐性プラスミドは、プロウイルス（ＨＩＶ－１、ＮＬ４－３株由来の非病原性、非複製性の組換えプロウイルスＤＮＡ）をコードし、その中に発現カセットがクローニングされた。インサートには、導入遺伝子、導入遺伝子発現のためのプロモーター、および導入遺伝子発現を高め、レンチウイルスベクターが、非有糸分裂の細胞を含むすべての細胞種を形質導入できるようにするために追加された配列が含有された。コード配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはホタルルシフェラーゼ（生物発光レポータータンパク質）をコードする遺伝子、または自己切断２Ａペプチド配列によって分離されたルシフェラーゼおよびＧＦＰ導入遺伝子の両方の同時発現を駆動するバイシストロニックカセットに対応していた。プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーター（ｈＵＢＣ）またはＣＭＶプロモーターであった。これらはいかなるエンハンサー配列も欠いており、高いレベルで普遍的に遺伝子発現を促進した。非コード配列および発現シグナルは、５´ＬＴＲ（Ｕ３－Ｒ－Ｕ５）では全体的なシス活性エレメントを有し、３´ＬＴＲではこのエレメントが削除され、それゆえプロモーター域（ΔＵ３－Ｒ－Ｕ５）を欠いている長い末端反復配列（ＬＴＲ）に相当した。転写および組込み実験のために、カプシド形成配列（ＳＤおよび５´Ｇａｇ）、ベクターの核トランスロケーションのためのセントラルポリプリントラクト／Ｃｅｎｔｒａｌ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ、およびＢＧＨポリアデニル化部位を加えた。
転写ベクタープラスミドは、ｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼまたはｐＡｒａ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰであった。カナマイシン耐性プラスミドは、プロウイルス（ＨＩＶ－１、ＮＬ４－３株由来の非病原性、非複製性の組換えプロウイルスＤＮＡ）をコードし、その中に発現カセットがクローニングされた。インサートには、導入遺伝子、導入遺伝子発現のためのプロモーター、および導入遺伝子発現を高め、レンチウイルスベクターが、非有糸分裂の細胞を含むすべての細胞種を形質導入できるようにするために追加された配列が含有された。コード配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはホタルルシフェラーゼ（生物発光レポータータンパク質）をコードする遺伝子、または自己切断２Ａペプチド配列によって分離されたルシフェラーゼおよびＧＦＰ導入遺伝子の両方の同時発現を駆動するバイシストロニックカセットに対応していた。プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーター（ｈＵＢＣ）またはＣＭＶプロモーターであった。これらはいかなるエンハンサー配列も欠いており、高いレベルで普遍的に遺伝子発現を促進した。非コード配列および発現シグナルは、５´ＬＴＲ（Ｕ３－Ｒ－Ｕ５）では全体的なシス活性エレメントを有し、３´ＬＴＲではこのエレメントが削除され、それゆえプロモーター域（ΔＵ３－Ｒ－Ｕ５）を欠いている長い末端反復配列（ＬＴＲ）に相当した。転写および組込み実験のために、カプシド形成配列（ＳＤおよび５´Ｇａｇ）、ベクターの核トランスロケーションのためのセントラルポリプリントラクト／Ｃｅｎｔｒａｌ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ、およびＢＧＨポリアデニル化部位を加えた。
【0021】
パッケージングプラスミドは、ｐＡＲＡ－Ｐａｃｋであった。カナマイシン耐性プラスミドは、レンチウイルスプロウイルスのカプシド形成のためのトランスに使用される、構造レンチウイルスのタンパク質（ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＴＡＴおよびＲＥＶ）をコードした。コード配列は、構造タンパク質（マトリックスＭＡ、カプシドＣＡおよびヌクレオカプシドＮＣ）、酵素タンパク質（プロテアーゼＰＲ、インテグラーゼＩＮおよび逆転写酵素ＲＴ）、ならびに制御タンパク質（ＴＡＴおよびＲｅｖ）をコードする、ポリシストロン性遺伝子であるｇａｇ－ｐｏｌ－ｔａｔ－ｒｅｖに相当していた。非コード配列および発現シグナルは、転写開始のためのＣＭＶからの最小プロモーター、転写終結のためのインシュリン遺伝子からのポリアデニル化シグナル、パッケージングＲＮＡの核外移行に関与するＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）に相当していた。
【0022】
エンベローププラスミドは、用いられるとき、ｐＥＮＶ１であった。このカナマイシン耐性プラスミドは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）インディアナ株由来の糖タンパク質Ｇをコードし、いくつかのレンチウイルスベクターの偽型化に用いられる。ＶＳＶ－Ｇ遺伝子をヒト細胞での発現用にコドン最適化し、この遺伝子をｐＶＡＸ１プラスミド（Invitrogen, Inc.社製）にクローニングした。コード配列はコドン最適化されたＶＳＶ－Ｇ遺伝子に対応し、非コード配列および発現シグナルは、転写開始のためのＣＭＶからの最小プロモーター、およびＢＧＨポリアデニル化部位に対応してＲＮＡを安定化させた。
【0023】
ＶＳＶ－Ｇ－（”はげた（Ｂａｌｄ）”）レンチウイルスベクター粒子の産生
２つの３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（Corning社製）中、１０００ｍＬのＬＶｍａｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Gibco Invitrogen社製）において、ＬＶ２９３細胞を５×１０５細胞／ｍＬで播種した。２つのエルレンマイヤーフラスコを、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。播種の翌日、一過性トランスフェクションを行った。ＰＥＩＰｒｏトランスフェクタント試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）をトランスファーベクタープラスミド（ｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＰＡＲＡ－ＨＵＢＣ－ルシフェラーゼまたはＰＡＲＡ－ＨＵＢＣ－ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ）およびパッケージングプラスミド（ｐＡＲＡ－Ｐａｃｋ）と混合した。室温でのインキュベーション後、ＰＥＩＰｒｏ／プラスミド混合物を細胞株に滴下し、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。３日目に、レンチベクターの産生を、５ｍＭの最終濃度の酪酸ナトリウムによって刺激した。バルク混合物を、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下で２４時間インキュベートした。５μｍおよび０．５μｍの深層ろ過（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による清澄化の後、清澄化されたバルク混合物を、デオキシリボヌクレアーゼ処置のために、室温で１時間インキュベートした。
２つの３０００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（Corning社製）中、１０００ｍＬのＬＶｍａｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Gibco Invitrogen社製）において、ＬＶ２９３細胞を５×１０５細胞／ｍＬで播種した。２つのエルレンマイヤーフラスコを、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。播種の翌日、一過性トランスフェクションを行った。ＰＥＩＰｒｏトランスフェクタント試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）をトランスファーベクタープラスミド（ｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＰＡＲＡ－ＨＵＢＣ－ルシフェラーゼまたはＰＡＲＡ－ＨＵＢＣ－ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ）およびパッケージングプラスミド（ｐＡＲＡ－Ｐａｃｋ）と混合した。室温でのインキュベーション後、ＰＥＩＰｒｏ／プラスミド混合物を細胞株に滴下し、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下でインキュベートした。３日目に、レンチベクターの産生を、５ｍＭの最終濃度の酪酸ナトリウムによって刺激した。バルク混合物を、３７℃、６５ｒｐｍで、加湿した８％のＣＯ２の下で２４時間インキュベートした。５μｍおよび０．５μｍの深層ろ過（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による清澄化の後、清澄化されたバルク混合物を、デオキシリボヌクレアーゼ処置のために、室温で１時間インキュベートした。
【0024】
Ｑ ｍｕｓｔａｎｇメンブレン（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でのクロマトグラフィーによってレンチベクター精製を実施し、ＮａＣｌグラジエントによって溶出させた。１００ｋＤａのＨＹＤＲＯＳＯＲＴメンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でタンジェンシャルフローろ過を実施し、それによって体積を減少させ、ｐＨ７の特定の緩衝液中で処方して、少なくとも２年の安定性を確保することが可能となった。０．２２μｍでの滅菌ろ過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の後、バルク製剤を１ｍｌ未満の量で２ｍＬのガラスバイアル中に充填し、続いて標識化し、＜－７０℃で凍結および保管した。
【0025】
はげた（ｂａｌｄ）ＬＶ数を、物理的な力価定量化によって評価した。ＨＩＶ－１ ｐ２４コアタンパク質に関連するレンチウイルス（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）のみの検出および定量化によってアッセイを実施した。試料の前処理によって、破壊されたレンチベクターと遊離ｐ２４との区別が可能となる。物理的力価、粒子分布および粒子寸法を、調節可能抵抗パルスセンサ（ＴＲＰＳ）技術（ｑＮａｎｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、オックスフォード、英国）によって測定した。ＮＰ１５０ナノポア、１１０ｎｍのキャリブレーションビーズおよび４４～４７ｍｍの膜ストレッチを使用した。ＩＺＯＮ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｕｉｔｅソフトウエアを使用して、結果を決定した。
【0026】
ＶＳＶ－Ｇ＋（”偽型の”）レンチウイルスベクター粒子の産生
ＰＥＩＰｒｏトランスフェクタント試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、１１５－０１０）をトランスファーベクタープラスミド（ｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼまたはｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ）、パッケージングプラスミド（ｐＡＲＡ－Ｐａｃｋ）およびエンベローププラスミド（ｐＥＮＶ１）と 混合した以外は上記と同様の方法を用いた。
ＰＥＩＰｒｏトランスフェクタント試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、１１５－０１０）をトランスファーベクタープラスミド（ｐＡＲＡ－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼまたはｐＡＲＡ－ｈＵＢＣ－ルシフェラーゼ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰ）、パッケージングプラスミド（ｐＡＲＡ－Ｐａｃｋ）およびエンベローププラスミド（ｐＥＮＶ１）と 混合した以外は上記と同様の方法を用いた。
【0027】
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーの産生、精製、定量 － 古典的な方法
ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を、Ｄｏｓｔａらによって記載されているような２段階製法に、わずかな変更を加えて調製した。第１の工程はＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成であり、第２の工程にはＤＭＳＯ中のペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）の合成が含まれる。
ポリ（β－アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を、Ｄｏｓｔａらによって記載されているような２段階製法に、わずかな変更を加えて調製した。第１の工程はＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成であり、第２の工程にはＤＭＳＯ中のペプチド修飾ＰＢＡＥ（ＯＭ－ＰＢＡＥ）の合成が含まれる。
【0028】
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ポリ（β－アミノエステル）－ジアクリレートポリマーを、付加型の重合を介して、第１級アミンモノマーおよびジアクリレート官能性モノマーを使用して合成した。５－アミノ－１－ペンタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９５．７％の純度、３．９ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）、１－ヘキシルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９の純度、３．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）および１，４－ブタンジオールジアクリレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、８９．１％の純度、１８ｇ、８１ｍｍｏｌ）を、第１級アミン基に対するアクリレートのモル比２．２：１で、丸底フラスコ中で混合した。混合物を９０℃で２０時間撹拌した。次に、反応混合物を室温まで冷却することによって、粗生成物、すなわち薄黄色の粘性の油状物が得られ、さらに使用するまで－２０℃で保管した。
ポリ（β－アミノエステル）－ジアクリレートポリマーを、付加型の重合を介して、第１級アミンモノマーおよびジアクリレート官能性モノマーを使用して合成した。５－アミノ－１－ペンタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９５．７％の純度、３．９ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）、１－ヘキシルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９の純度、３．８ｇ、３８ｍｍｏｌ）および１，４－ブタンジオールジアクリレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、８９．１％の純度、１８ｇ、８１ｍｍｏｌ）を、第１級アミン基に対するアクリレートのモル比２．２：１で、丸底フラスコ中で混合した。混合物を９０℃で２０時間撹拌した。次に、反応混合物を室温まで冷却することによって、粗生成物、すなわち薄黄色の粘性の油状物が得られ、さらに使用するまで－２０℃で保管した。
【0029】
１Ｈ－ＮＭＲ分光法を使用して構造を確認し、ＧＰＣを使用して分子量特性を決定して、合成されたＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの特徴付けを行った。５ｍｍのＢｒｕｋｅｒ製ＰＡＢＢＯ ＢＢプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＮＭＲ分光計中にＮＭＲスペクトルを集め、ＤＭＳＯ－ｄ６を重水素化溶媒として使用した。分子量測定を、ＧＰＣ ＳＨＯＤＥＸ ＫＦ－６０３カラム（６．０×約１５０ｍｍ）、および移動相としてのＴＨＦおよびＲＩ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムで実施した。ポリスチレン標準により得られた従来の較正曲線を用いて、分子量を測定した。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）を、それぞれ４９００ｇ／ｍｏｌおよび２９００ｇ／ｍｏｌと決定した。
【0030】
ＤＭＳＯ中におけるＯＭ－ＰＢＡＥの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、ＤＭＳＯにおける、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレート中のチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチドの塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，浙江省、中国）から購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマー溶液およびペプチド溶液を混合し、温度制御された恒温水槽において、２５℃で２０時間撹拌した。ペプチド修飾ＰＢＡＥを２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させ、続いて生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後、真空乾燥し、得られた生成物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に再懸濁させ、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを、ＤＭＳＯにおける、２．８：１の比率のチオール／ジアクリレート中のチオール－アクリレートマイケル付加反応を介する、ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのペプチド末端修飾によって得た。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げる。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチドの塩酸塩（ＣＲ３―９５％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，浙江省、中国）から購入）（１６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。続いて、ポリマー溶液およびペプチド溶液を混合し、温度制御された恒温水槽において、２５℃で２０時間撹拌した。ペプチド修飾ＰＢＡＥを２０ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させ、続いて生成物を７．５ｍＬのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄し、その後、真空乾燥し、得られた生成物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に再懸濁させ、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0031】
さらなる実施例において、トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー、すなわちＰＢＡＥ－ＣＨ３において、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）中に溶解したＰＢＡＥ－ジアクリレート（１９９ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）中に溶解したＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨ（ＣＨ３）の塩酸塩（１５４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。
【0032】
１Ｈ－ＮＭＲ解析で、予想される構造を確認した。さらに、アクリレートの変換率を、残留アクリレートのピーク（５．７５～６．５ｐｐｍ）に対する、出発物質のスペクトルと同じ値に較正されたポリマー主鎖上のＣＨ３プロトン（０．８ｐｐｍ）の比率から決定した。したがって、アクリレートピークの積分値が６（アクリレート基上のプロトンの数である）になるように分割すると、残留アクリレート量が得られた。粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートからペプチド修飾ＰＢＡＥへのマイケル付加反応の効率は、ＰＢＡＥ－ＣＲ３：８４％、ＰＢＡＥ－ＣＨ３：９３％であると決定された。ただし、両方の場合について、反応の全体的な収率は１００％を超えており、これは大過剰の残留ＤＭＳＯが存在していることを示している。さらに、それぞれのペプチド修飾ＰＢＡＥ中の残留ペプチド含有量を、ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１３０Ａ、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、温度３５℃）を備え、０．１％ＴＦＡ入りのアセトニトリル／水をグラジエントとして使用したＵＰＬＣ ＡＣＱＵＩＴＹシステム（Ｗａｔｅｒｓ）による分離後、ＵＶ検出（波長２２０ｎｍ）によって定量化した。
【0033】
ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーの産生、精製、定量 － ＤＭＳＯのない方法
ＤＭＳＯ非含有条件下での機能的ＯＭ－ＰＢＡＥのグラムスケール合成は、ヒト細胞に毒性のない遺伝子送達のための新しい物質を提供するために以前に確立されていた。この独自の方法で得られたポリマーは、不純物が少なく、生体系と互換性のある条件で安定に貯蔵することができる。
ＤＭＳＯ非含有条件下での機能的ＯＭ－ＰＢＡＥのグラムスケール合成は、ヒト細胞に毒性のない遺伝子送達のための新しい物質を提供するために以前に確立されていた。この独自の方法で得られたポリマーは、不純物が少なく、生体系と互換性のある条件で安定に貯蔵することができる。
【0034】
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成を前述のように行った後、反応混合物をヘプタン沈殿によって精製した。粗生成物を酢酸エチルに溶解し、過剰のヘプタン（１／１０、ｖ／ｖ）に滴下し、この手順を２回繰り返した。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートは８６％の収率で得られ、ＧＰＣによって、５２００ｇ／ｍｏｌおよび３３００ｇ／ｍｏｌのそれぞれＭｗおよびＭｎを有すると特徴付けされた。加えて、古典的方法によって得られた粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのＧＰＣ曲線によって、粗生成物のＧＰＣト痕跡上の低分子量領域の小さいピークが、精製後に消え、ピーク分子量が高い値にわずかに移動した（粗ポリマーおよび精製ポリマーに対して、それぞれ４９００および５０００）ことが示された。
ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーの合成を前述のように行った後、反応混合物をヘプタン沈殿によって精製した。粗生成物を酢酸エチルに溶解し、過剰のヘプタン（１／１０、ｖ／ｖ）に滴下し、この手順を２回繰り返した。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートは８６％の収率で得られ、ＧＰＣによって、５２００ｇ／ｍｏｌおよび３３００ｇ／ｍｏｌのそれぞれＭｗおよびＭｎを有すると特徴付けされた。加えて、古典的方法によって得られた粗ＰＢＡＥ－ジアクリレートおよび精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマーのＧＰＣ曲線によって、粗生成物のＧＰＣト痕跡上の低分子量領域の小さいピークが、精製後に消え、ピーク分子量が高い値にわずかに移動した（粗ポリマーおよび精製ポリマーに対して、それぞれ４９００および５０００）ことが示された。
【0035】
ＤＭＳＯフリー中におけるＯＭ－ＰＢＡＥの合成、精製およびキャラクタリゼーション
ＯＭ－ＰＢＡＥの１ｇスケールでの合成を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）において、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート前駆体ポリマーおよび２倍濃縮ペプチド溶液を使用して実施した。反応媒体中のジスルフィド形成を防ぐために、反応中、不活性窒素（Ｎ２）雰囲気を適用した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げた。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチドの塩酸塩（ＣＲ３―９７％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、クエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（２０ｍｌ）中に溶解し、ペプチドを完全に溶解させた後、１０ｍｌのアセトニトリルを添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）／アセトニトリル（２／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１００ｍｌのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５０ｍＬのエタノール中に再溶解させ、２００ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７５ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄した。残留有機溶媒を真空下で除去し、さらに凍結乾燥によって３７％（ｗｔ％）の収率で最終生成物を得て、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
ＯＭ－ＰＢＡＥの１ｇスケールでの合成を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（３／２、ｖ／ｖ）において、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレート前駆体ポリマーおよび２倍濃縮ペプチド溶液を使用して実施した。反応媒体中のジスルフィド形成を防ぐために、反応中、不活性窒素（Ｎ２）雰囲気を適用した。一例として、トリ－アルギニン修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＲ３）の合成を挙げた。精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－ＣＯＯＨペプチドの塩酸塩（ＣＲ３―９７％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１６８４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、クエン酸塩緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（２０ｍｌ）中に溶解し、ペプチドを完全に溶解させた後、１０ｍｌのアセトニトリルを添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）／アセトニトリル（２／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１００ｍｌのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５０ｍＬのエタノール中に再溶解させ、２００ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７５ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄した。残留有機溶媒を真空下で除去し、さらに凍結乾燥によって３７％（ｗｔ％）の収率で最終生成物を得て、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0036】
トリ－ヒスチジン末端修飾ＰＢＡＥポリマー（ＰＢＡＥ－ＣＨ３）に対しては、精製ＰＢＡＥ－ジアクリレートポリマー（１９９９ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ２－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－ＣＯＯＨペプチドの塩酸塩（ＣＨ３―９８％の純度―Ｏｎｔｏｒｅｓから購入）（１．５３８ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を、ｐＨ５．０の２５ｍＭクエン酸塩緩衝液２０ｍｌ中に溶解した。ＣＨ３ペプチドが完全に溶解した後、１０ｍＬのアセトニトリルを添加した。続いて、アセトニトリル中のポリマー溶液を、アセトニトリル／クエン酸塩（２５ｍＭ、ｐＨ５．０）（２／１、ｖ／ｖ）中のペプチド溶液に添加し、２５℃に温度制御された恒温水槽において、不活性Ｎ２雰囲気下にて２０時間撹拌した。続いて、すべての溶媒を、減圧下、４０℃で蒸発させた。得られたペレットを、１００ｍｌのエタノールを用いて２回抽出した。エタノール抽出物を乾燥させた。乾燥した残部を５０ｍＬのエタノール中に再溶解させ、２００ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）中で沈殿させた。続いて、生成物を７５ｍｌのジエチルエーテル／アセトン（７／３、ｖ／ｖ）を用いて２回洗浄した。残留有機溶媒を真空下で除去し、さらに４５．３％（ｗｔ％）の収率で最終生成物を得て、さらなる使用のために－２０℃で保管した。
【0037】
オリゴペプチド修飾ＰＢＡＥを用いた、ＶＳＶ－Ｇ（”Ｂａｌｄ”）のレンチウイルスベクターのコーティング
静脈内注射の場合、レンチウイルスベクター（４．５～５．１ｘ１０１０レンチウイルス粒子）のコーティングを、以下のようにレンチウイルスベクター粒子あたり１０９個のポリマー分子の比率で行った。 はげた（Ｂａｌｄ）レンチウイルスベクターを、５０ ｍＭスクロース（シグマアルドリッチ社製）を含むダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で希釈し、反復あたり７５ μＬの最終容量を調製した。ＲおよびＨ ＯＭ－ＰＢＡＥポリマー（ＤＭＳＯの有無にかかわらず）を６０／４０（ｖ／ｖ）で予め混合し、ｐＨ ５．４（反復あたり７５ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液で希釈し、均質化のために２秒ボルテックス処理した。希釈したベクターに希釈したポリマーを１：１の比率（ｖ／ｖ）で添加し、混合物を１０秒間静かにボルテックスし、室温において１０分間インキュベートした。最後に、等量のｐＨ ５．４（１５０ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液を注入前に被覆粒子に添加した。
静脈内注射の場合、レンチウイルスベクター（４．５～５．１ｘ１０１０レンチウイルス粒子）のコーティングを、以下のようにレンチウイルスベクター粒子あたり１０９個のポリマー分子の比率で行った。 はげた（Ｂａｌｄ）レンチウイルスベクターを、５０ ｍＭスクロース（シグマアルドリッチ社製）を含むダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で希釈し、反復あたり７５ μＬの最終容量を調製した。ＲおよびＨ ＯＭ－ＰＢＡＥポリマー（ＤＭＳＯの有無にかかわらず）を６０／４０（ｖ／ｖ）で予め混合し、ｐＨ ５．４（反復あたり７５ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液で希釈し、均質化のために２秒ボルテックス処理した。希釈したベクターに希釈したポリマーを１：１の比率（ｖ／ｖ）で添加し、混合物を１０秒間静かにボルテックスし、室温において１０分間インキュベートした。最後に、等量のｐＨ ５．４（１５０ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液を注入前に被覆粒子に添加した。
【0038】
灌流の場合、同じプロトコルを使用したが、体積は以下のようにより大きな体積に調整された。はげたレンチウイルスベクター（８ｘ１０１０レンチウイルスウイルス粒子）を、５０ ｍＭスクロースを含む（ＤＰＢＳ）で希釈し、反復あたり２２５ μＬの最終容量を調製した。予め混合したＲおよびＨ ＯＭ－ＰＢＡＥポリマー（ＤＭＳＯの有無にかかわらず）を６０／４０（ｖ／ｖ）で、ｐＨ ５．４（反復あたり７５ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液で希釈し、均一化のために２秒ボルテックスした。最後に、ｐＨ ５．４（１５０ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液を注入前に被覆粒子に添加した。
【0039】
マイクロフルイディクスベースのプロセスを用いたオリゴペプチド修飾ＰＢＡＥによるＶＳＶ－Ｇ－（”はげた”）レンチウイルスベクターのコーティング
ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”はげた（Ｂａｌｄ）”）レンチウイルスベクター粒子の均質性、単分散性を厳密に制御し、製造中のバッチ間の一貫性を可能にするために、マイクロフルイディクスベースの封入プロセスが実施された。
禿げた（Ｂａｌｄ）レンチウイルスベクターを、５０ ｍＭスクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で適当な濃度まで希釈した。ＲおよびＨ ＯＭ－ＰＢＡＥポリマー（ＤＭＳＯの有無にかかわらず）を６０／４０（ｖ／ｖ）で予め混合し、ｐＨ ５．４（反復あたり７５ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液で希釈し、均質化のために２秒ボルテックス処理した。各溶液を、マイクロフルイディクスチャンバのＹ字型イノックス入口に接続されたタイゴンチューブ（内径＝０．０２インチおよび外径＝０．０６インチ）で注入した。ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーによるＶＳＶ－Ｇ欠損ＬＶ（”ｂａｌｄ”）の封入は、制御された圧力条件（フルイジェント）（チャンバ入口と出口の圧力差が２５ｍｂａｒ）下で、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）サーペンタインチャンバー（形状長さ=１８ｃｍｘ幅=４００μｍｘ高さ=１００μｍ）で両成分を混合することによって、室温で３０分間の滅菌環境内で実施した。
この方法は、参照生物物理学的方法（ナノ粒子追跡分析、動的光散乱、ビデオドロップ）によって示されるように、単分散で均質なナノ粒子の迅速かつ堅牢な調製を可能にした。動物への全身投与の前に、ナノ粒子の機能性を、形質導入細胞アッセイにおいてインビトロ で検証した。
ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”はげた（Ｂａｌｄ）”）レンチウイルスベクター粒子の均質性、単分散性を厳密に制御し、製造中のバッチ間の一貫性を可能にするために、マイクロフルイディクスベースの封入プロセスが実施された。
禿げた（Ｂａｌｄ）レンチウイルスベクターを、５０ ｍＭスクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で適当な濃度まで希釈した。ＲおよびＨ ＯＭ－ＰＢＡＥポリマー（ＤＭＳＯの有無にかかわらず）を６０／４０（ｖ／ｖ）で予め混合し、ｐＨ ５．４（反復あたり７５ μＬ）の２５ ｍＭクエン酸カルシウム緩衝液で希釈し、均質化のために２秒ボルテックス処理した。各溶液を、マイクロフルイディクスチャンバのＹ字型イノックス入口に接続されたタイゴンチューブ（内径＝０．０２インチおよび外径＝０．０６インチ）で注入した。ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーによるＶＳＶ－Ｇ欠損ＬＶ（”ｂａｌｄ”）の封入は、制御された圧力条件（フルイジェント）（チャンバ入口と出口の圧力差が２５ｍｂａｒ）下で、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）サーペンタインチャンバー（形状長さ=１８ｃｍｘ幅=４００μｍｘ高さ=１００μｍ）で両成分を混合することによって、室温で３０分間の滅菌環境内で実施した。
この方法は、参照生物物理学的方法（ナノ粒子追跡分析、動的光散乱、ビデオドロップ）によって示されるように、単分散で均質なナノ粒子の迅速かつ堅牢な調製を可能にした。動物への全身投与の前に、ナノ粒子の機能性を、形質導入細胞アッセイにおいてインビトロ で検証した。
【0040】
実施例２：ＶＳＶ－Ｇ－（”Ｂａｌｄ”）およびＶＳＶ－Ｇ＋（”偽型”）レンチウイルスベクター粒子の生体内組織生体分布。
動物実験
動物実験は、フランスの動物保護法および各欧州連合のガイドラインの規制に従って、施設および国内動物管理委員会の正式な承認を得た後、実施された。
４～６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ジャンヴィエ研究所、ル・ジュネーブ・サン・アイル、フランス）を動物施設に２週間適応させてから、２％イソフルランで麻酔し、 ＤＰＢＳ－５０ｍＭスクロースに処方されたｈＵＢＣプロモーターの制御下で、ルシフェラーゼをコードするＶＳＶ－Ｇ－（”ｂａｌｄ”）またはＶＳＶ－Ｇ＋（”偽型”）レンチウイルスベクター粒子を単回静脈（尾静脈）注射で投与した。 ２５０μＬ中の１．４ｘ１０１１ レンチウイルスウイルス粒子（最大投与用量つまり”ＭＡＤ”に相当）または２．８ｘ１０１０レンチウイルス粒子２５０μＬ （ＭＡＤ／５）の２回の用量を、１条件あたり３匹のマウスで試験した。動物の行動、体重、水分および食物消費を、１４日間にわたって週３回記録した。
動物実験
動物実験は、フランスの動物保護法および各欧州連合のガイドラインの規制に従って、施設および国内動物管理委員会の正式な承認を得た後、実施された。
４～６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ジャンヴィエ研究所、ル・ジュネーブ・サン・アイル、フランス）を動物施設に２週間適応させてから、２％イソフルランで麻酔し、 ＤＰＢＳ－５０ｍＭスクロースに処方されたｈＵＢＣプロモーターの制御下で、ルシフェラーゼをコードするＶＳＶ－Ｇ－（”ｂａｌｄ”）またはＶＳＶ－Ｇ＋（”偽型”）レンチウイルスベクター粒子を単回静脈（尾静脈）注射で投与した。 ２５０μＬ中の１．４ｘ１０１１ レンチウイルスウイルス粒子（最大投与用量つまり”ＭＡＤ”に相当）または２．８ｘ１０１０レンチウイルス粒子２５０μＬ （ＭＡＤ／５）の２回の用量を、１条件あたり３匹のマウスで試験した。動物の行動、体重、水分および食物消費を、１４日間にわたって週３回記録した。
【0041】
血球数
血球数は、処置（顎下サンプリング）の４日前または、２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の静脈内注射の１４日後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスから回収した新鮮でヘパリン化された全血サンプルで決定した。血球をマウスＦｃブロック試薬（ＢＤバイオサイエンス社）とを用いてインキュベートした。循環細胞の表現型をフローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；インビトロジェン・インク） にミルテニー・バイオテックから購入した特異的抗体パネル：一般的パネル（ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３ｅ－ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＰＥ－Ｖｉｏ６１５、ＣＤ１１ｂ－ＰＥ、ＣＤ４９ｂ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ－Ｖｉｏ７００、ＣＤ６９－ＰＥ、ＣＤ８ａ－ＰＥ－Ｖｉｏ６１５およびＣＤ２５－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）または骨髄系細胞（ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ－ＰＥ－Ｖｉｏ６１５、Ｌｙ－６Ｇ－ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、Ｆ４／８０－ＰＥおよびＣＤ１１ｃ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）を用いて、解析された。４℃で１０分間インキュベートした後、赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（インビトロジェン社製）で室温にて溶解した。細胞を５００ｇで２分間遠心分離し、ＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences社製）で固定した。蛍光陽性細胞をＢＬ３（ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００染料）、ＹＬ１（ＰＥ染料）、ＹＬ２（ＰＥ－Ｖｉｏ－６１５染料）およびＹＬ４（ＰＥ－Ｖｉｏ７７０染料）チャネル上フローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc.社製）により計数した。細胞表現型は、ＣＤ４５+、生存細胞および単一細胞の間で以下のように定義された：一般パネル上のＴリンパ球（CD3ehigh－BB220neg），Ｂリンパ球（BB220high）およびＮＫ細胞（CD49high-CD11bhigh）；活性化Ｔ細胞パネル上のCD4+ Ｔリンパ球（CD4high）およびＣＤ８＋Ｔリンパ球（CD4high）； 骨髄系細胞パネル上に配置した好中球（Ly6high）、単球（Ly6low-CD11clow-CD11bhigh）およびマクロファージ（CD11clow -CD11bhigh -F4/80high）。
血球数は、処置（顎下サンプリング）の４日前または、２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の静脈内注射の１４日後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスから回収した新鮮でヘパリン化された全血サンプルで決定した。血球をマウスＦｃブロック試薬（ＢＤバイオサイエンス社）とを用いてインキュベートした。循環細胞の表現型をフローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；インビトロジェン・インク） にミルテニー・バイオテックから購入した特異的抗体パネル：一般的パネル（ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３ｅ－ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＰＥ－Ｖｉｏ６１５、ＣＤ１１ｂ－ＰＥ、ＣＤ４９ｂ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ－Ｖｉｏ７００、ＣＤ６９－ＰＥ、ＣＤ８ａ－ＰＥ－Ｖｉｏ６１５およびＣＤ２５－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）または骨髄系細胞（ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ－ＰＥ－Ｖｉｏ６１５、Ｌｙ－６Ｇ－ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、Ｆ４／８０－ＰＥおよびＣＤ１１ｃ－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）を用いて、解析された。４℃で１０分間インキュベートした後、赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（インビトロジェン社製）で室温にて溶解した。細胞を５００ｇで２分間遠心分離し、ＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences社製）で固定した。蛍光陽性細胞をＢＬ３（ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００染料）、ＹＬ１（ＰＥ染料）、ＹＬ２（ＰＥ－Ｖｉｏ－６１５染料）およびＹＬ４（ＰＥ－Ｖｉｏ７７０染料）チャネル上フローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc.社製）により計数した。細胞表現型は、ＣＤ４５+、生存細胞および単一細胞の間で以下のように定義された：一般パネル上のＴリンパ球（CD3ehigh－BB220neg），Ｂリンパ球（BB220high）およびＮＫ細胞（CD49high-CD11bhigh）；活性化Ｔ細胞パネル上のCD4+ Ｔリンパ球（CD4high）およびＣＤ８＋Ｔリンパ球（CD4high）； 骨髄系細胞パネル上に配置した好中球（Ly6high）、単球（Ly6low-CD11clow-CD11bhigh）およびマクロファージ（CD11clow -CD11bhigh -F4/80high）。
【0042】
サイトカインプロファイリング
処置前、または室温にて１５００ ｘｇで１０分間遠心分離した、レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射後１４日目に回収したマウスの新鮮な末梢血から血漿を回収した。 上澄みを新鮮なチューブに移し、２，０００ｘｇで再び１５分間遠心分離した。血漿は、メーカーの指示に従ってマウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）（Becton Dickinson Biosciences社製）で分析するまで－８０℃で保存した。サンプルをフローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；Invitron, Inc.社製）によって、分泌されたインターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－ａ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇ）のＹＬ－１チャネルおよび血漿中レベルを分析し、ＡｔｔｕｎｅＮＸＴソフトウェア（Invitrogen社製）を用いて定量化した。
処置前、または室温にて１５００ ｘｇで１０分間遠心分離した、レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射後１４日目に回収したマウスの新鮮な末梢血から血漿を回収した。 上澄みを新鮮なチューブに移し、２，０００ｘｇで再び１５分間遠心分離した。血漿は、メーカーの指示に従ってマウスＴｈ１／Ｔｈ２サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）（Becton Dickinson Biosciences社製）で分析するまで－８０℃で保存した。サンプルをフローサイトメトリー（ＡｔｔｕｎｅＮＸＴ；Invitron, Inc.社製）によって、分泌されたインターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－ａ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇ）のＹＬ－１チャネルおよび血漿中レベルを分析し、ＡｔｔｕｎｅＮＸＴソフトウェア（Invitrogen社製）を用いて定量化した。
【0043】
２週間の観察期間中、毒性の明らかな徴候は観察されなかった。処置されたマウスのいずれも、偽型レンチウイルスベクターまたはそのＶＳＶ－Ｇ欠損操作変異体の単回ボーラス注射後に体重減少、苦痛または行動変化を経験しなかった。
【0044】
図１Ａ－１Ｆに示すように、未処置動物で決定した血液組成と比較して、処置後１４日目に血中白血球組成に変化は認められなかった。はげ（Ｂａｌｄ）または偽型レントウイルスベクターは、白血球減少症、単球症またはリンパ球増加症、リンパ枯渇、Ｔ細胞活性化を誘発せず、免疫系に急性の影響を及ぼさないことを示唆していた。免疫系の活性化のこの欠如は、図２Ａ－２Ｆに描かれたサイトカインレベルの血漿レベルによってさらに確認された。両方のタイプのレンチウイルスベクターの最高用量は、Ｔリンパ球の活性化に関与する炎症誘発性メディエーターまたはサイトカインの有意なアップレギュレーションを誘発しなかった。
これらの結果は、操作されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターが、偽型粒子と比較して同様の安全性プロファイルを示し、１回のボーラス静脈内注射後に良好に忍容されているのを示したことを示している。
これらの結果は、操作されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターが、偽型粒子と比較して同様の安全性プロファイルを示し、１回のボーラス静脈内注射後に良好に忍容されているのを示したことを示している。
【0045】
生体内生物発光イメージング
レンチウイルスベクター粒子の組織分布をフォローアップするために、静脈内注射後の３日目、７日目および１４日目にＩＶＩＳの画像化を行った。この目的のために、２％イソフルラン（Forane，Baxter Healthcare社製）で麻酔をかけたＢａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍＬ）中のＤ－ルシフェリン（Perkin Elmer社製）を１５０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内注射した。
画像化データは、キセノーゲンＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（Xenogen社）によるＤ－ルシフェリン注射の１０分後に得られた。取得時間は１０秒から３分の範囲で、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアバージョン４．３.１（Xenogen社製）を使用してデータの取得と定量化を行った。
レンチウイルスベクター粒子の組織分布をフォローアップするために、静脈内注射後の３日目、７日目および１４日目にＩＶＩＳの画像化を行った。この目的のために、２％イソフルラン（Forane，Baxter Healthcare社製）で麻酔をかけたＢａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳ（１５ｍｇ／ｍＬ）中のＤ－ルシフェリン（Perkin Elmer社製）を１５０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内注射した。
画像化データは、キセノーゲンＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（Xenogen社）によるＤ－ルシフェリン注射の１０分後に得られた。取得時間は１０秒から３分の範囲で、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアバージョン４．３.１（Xenogen社製）を使用してデータの取得と定量化を行った。
【0046】
図３に要約した結果は、最高用量の偽型のレンチウイルス粒子の単回静脈内注射後、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現の局在化を反映する生物発光シグナルが肝臓、脾臓および骨髄(脊椎および下肢)において処置後3日目から時間依存的に蓄積することを示す。対照的に、等価用量のＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターを注射したマウスの全身において導入遺伝子発現は観察されなかった。これらの予想外の観察は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の除去が、生体内で細胞を形質導入することができなくなる操作されたレンチウイルスベクターの生体分布プロファイルを大きく変更することを示唆する。
【0047】
定量ＰＣＲによる組織分布の評価
レンチウイルスベクター粒子の注射後１４日目に、ヘパリン処理した全血を、２％イソフルランで麻酔したＢａｌｂ／ｃマウスからの心臓穿刺によってサンプリングした。次いで、マウスを頸椎脱臼によって殺処分し、以下の器官を回収した：脾臓、骨髄（ＤＰＢＳで脛骨からフラッシュした）、肝臓、リンパ節肺、筋肉、腎臓、小腸、生殖腺および脳。ゲノムＤＮＡは、それぞれＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ８ ＢｌｏｏｄおよびＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅキット（Macherey-Nagel社製）を使用して、メーカーの指示に従って、新鮮な血液および凍結組織から単離した。
レンチウイルスベクター粒子の注射後１４日目に、ヘパリン処理した全血を、２％イソフルランで麻酔したＢａｌｂ／ｃマウスからの心臓穿刺によってサンプリングした。次いで、マウスを頸椎脱臼によって殺処分し、以下の器官を回収した：脾臓、骨髄（ＤＰＢＳで脛骨からフラッシュした）、肝臓、リンパ節肺、筋肉、腎臓、小腸、生殖腺および脳。ゲノムＤＮＡは、それぞれＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ８ ＢｌｏｏｄおよびＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅキット（Macherey-Nagel社製）を使用して、メーカーの指示に従って、新鮮な血液および凍結組織から単離した。
【0048】
レンチウイルスベクターの生体分布は、示された組織から単離されたゲノムＤＮＡにおけるｐＡＲＡ骨格の組み込みを追跡することによって分析した。ＤＮＡ１ｎｇあたりのベクターコピー数（ＶＣＮ）分析は、PerfeCTa(R) MultiPlex ToughMix(R)試薬（Quantabio，Beverly，マサチューセッツ州，米国）およびCFX96リアルタイムＰＣＲインスツルメントＩＩ（Biorad社製）を用いた定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行った。データはＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ ３．１ソフトウエアで分析した。組み込みレンチウイルスベクター検出は、ロングターミナルリピート配列（ＬＴＲ）特異的プローブ（5’-6FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BHQ1-3’）（配列番号６）およびプライマー（fwd:5’-TGGAGGAGGAGATATGAGGG-3’（配列番号７）およびrev:5’-CTGCTGCACTATACCAGACA-3’）（配列番号８）（シグマアルドリッチ社製）を用いて行った。内部基準として、マウスＧＡＰＤＨ特異的プローブ（5’-Cy5-CGCCTGGTCACCAGGGCTGC-BHQ2-3’）（配列番号９）およびプライマー（fwd:5’-AACGGATTTGGCCGTATTGG-3’（配列番号１０）およびrev:5’-CATTCTCGGCCTTGACTGTG -3’）（配列番号１１）を用いた。ＬＴＲおよびマウスＧＡＰＤＨの配列を含むプラスミド標準を定量に使用した。
【0049】
図４に示すように、組込みプロウイルス配列が生体内の生物発光イメージング結果と 完全に相関する偽型レンチウイルスベクターの生体分布のｑＰＣＲ分析は、最高用量のウイルス粒子を投与されたマウス上で回収した脾臓、肝臓、骨髄において検出された。ＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターは、解析されたいずれの臓器においても検出されず、根本的に異なる生体分布プロファイルおよび宿主ゲノム内に組み込むことができないことが確認された。
【0050】
実施例３：ＯＭ－ＰＢＡＥおよびＶＳＶ－Ｇ＋（”偽型”）レンチウイルスベクター粒子に封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”Ｂａｌｄ”）の静脈内注射を繰り返した後の安全性および生体分布の生体内評価。
ＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターの予期せぬ生体分布が遺伝子導入機械装置の機能喪失によるものではないことを除外するために、それらの形質導入特性を回復するためにこれらの操作が行なわれたが、以前に記載したＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたベクターを用いて、追跡研究が行われた。加えて、このプロトコルは、これらのナノ粒子の反復静脈内投与の安全性を評価することを目的とした。
ＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターの予期せぬ生体分布が遺伝子導入機械装置の機能喪失によるものではないことを除外するために、それらの形質導入特性を回復するためにこれらの操作が行なわれたが、以前に記載したＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたベクターを用いて、追跡研究が行われた。加えて、このプロトコルは、これらのナノ粒子の反復静脈内投与の安全性を評価することを目的とした。
【0051】
動物実験
動物実験は、フランスの動物保護法および各欧州連合のガイドラインの規制に従って、施設および国内動物管理委員会の正式な承認を得た後、実施されました。
４～６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ジャンヴィエ研究所、ル・ジュネーブ・サン・アイル、フランス）を動物施設に２週間適応させてから、２％イソフルランで麻酔をかけ、 実施例１記載したようにＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”はげた”）またはＤＰＢＳ－５０ｍＭスクロースに処方されたｈＵＢＣプロモーターの制御下でルシフェラーゼ－Ｔ２－ＧＦＰをコードするＶＳＶ－Ｇ＋ （”似型”）レンチウイルスベクター粒子をの用量で静脈注射（尾静脈）した。３匹の動物群は、２２０μＬで５．１ｘ１０１１レンチウイルス粒子の静脈内注射を２、３、４または５回１日１回の頻度で繰り返し受けた（マウス１ 匹あたり１．３～２．５７ｘ１０１１ レンチウイルス粒子の総用量、すなわち最大投与用量つまり”ＭＡＤ”の２／５、３／５、４／５の合計用量に相当）。動物の行動、体重、水分および食物消費を、７日間にわたって週３回記録した。
動物実験は、フランスの動物保護法および各欧州連合のガイドラインの規制に従って、施設および国内動物管理委員会の正式な承認を得た後、実施されました。
４～６週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（ジャンヴィエ研究所、ル・ジュネーブ・サン・アイル、フランス）を動物施設に２週間適応させてから、２％イソフルランで麻酔をかけ、 実施例１記載したようにＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”はげた”）またはＤＰＢＳ－５０ｍＭスクロースに処方されたｈＵＢＣプロモーターの制御下でルシフェラーゼ－Ｔ２－ＧＦＰをコードするＶＳＶ－Ｇ＋ （”似型”）レンチウイルスベクター粒子をの用量で静脈注射（尾静脈）した。３匹の動物群は、２２０μＬで５．１ｘ１０１１レンチウイルス粒子の静脈内注射を２、３、４または５回１日１回の頻度で繰り返し受けた（マウス１ 匹あたり１．３～２．５７ｘ１０１１ レンチウイルス粒子の総用量、すなわち最大投与用量つまり”ＭＡＤ”の２／５、３／５、４／５の合計用量に相当）。動物の行動、体重、水分および食物消費を、７日間にわたって週３回記録した。
【0052】
血球数
血球数は、処置（顎下サンプリング）前８日目に、または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射の６時間、３日および７日目にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した新鮮でヘパリン化された全血サンプルについて、実施例２に既に記載されているように決定した。
血球数は、処置（顎下サンプリング）前８日目に、または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射の６時間、３日および７日目にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した新鮮でヘパリン化された全血サンプルについて、実施例２に既に記載されているように決定した。
【0053】
サイカインプロファイリング
循環レベルは、レンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射の前または６時間後、３もしくは７日後に回収したマウスの新鮮な末梢血から採取した血漿を用いて実施例２に既に記載されるように定量した。
１週間の観察期間中、毒性の明らかな徴候は観察されなかった。処置されたマウスのいずれも、偽型レンチウイルスベクターまたはそのＶＳＶ－Ｇ欠損操作変異体の反復注射後に体重減少、苦痛または行動変化を経験しなかった。 このプロトコルでは、静脈注射の投与に必要な反復麻酔が最も困難な手順であることが判明し、覚醒期にマウスを注意深く監視する必要があった。
循環レベルは、レンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射の前または６時間後、３もしくは７日後に回収したマウスの新鮮な末梢血から採取した血漿を用いて実施例２に既に記載されるように定量した。
１週間の観察期間中、毒性の明らかな徴候は観察されなかった。処置されたマウスのいずれも、偽型レンチウイルスベクターまたはそのＶＳＶ－Ｇ欠損操作変異体の反復注射後に体重減少、苦痛または行動変化を経験しなかった。 このプロトコルでは、静脈注射の投与に必要な反復麻酔が最も困難な手順であることが判明し、覚醒期にマウスを注意深く監視する必要があった。
【0054】
図５Ａ～５Ｄに示すように、未処置動物で決定された血液組成と比較して、単球／マクロファージおよび好中球数の増加およびＴリンパ球の減少が、処置後３または７日目ですべての群にわたって観察された。これらの効果は用量依存的ではなく、注射後６時間ですでに実施されており、生成物に関連していないことが示唆された。実際、イソフルラン麻酔の繰り返しは、Ｔリンパ球集団の減少を含む血球数の改変を誘発することが示されている（Stolling et al., 2016）。それにもかかわらず、ＯＭ－ＰＢＡＥまたは偽型レンチウイルスベクターに封入されたＶＳＶ－Ｇ欠損操作変異体は、白血球減少またはＴ細胞活性化を誘発せず、免疫系に急性の影響を及ぼさないことを示唆している。免疫系の活性化のこの欠如は、図６Ａ－６Ｂに描かれたサイトカインレベルの血漿レベルによってさらに確認された。両方のタイプのレンチウイルスベクターの最高用量は、Ｔリンパ球の活性化に関与する炎症誘発性メディエーターまたはサイトカインのいかなるアップレギュレーションをも誘発しなかった。
これらの結果は、操作されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターが、偽型粒子と比較して同様の安全性プロファイルを示し、反復静脈内注射後によく耐えることを示している。
これらの結果は、操作されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターが、偽型粒子と比較して同様の安全性プロファイルを示し、反復静脈内注射後によく耐えることを示している。
【0055】
生体内生物発光イメージング
ＩＶＩＳイメージングによるＯＭ－ＰＢＡＥＳに封入された偽型レンチウイルスベクターおよびＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターの組織分布は、画像取得が産物の最後の静脈内注射の３または７日後に行ったことを除いて、実施例２に記載されるように一般的に行った。
先に記載したように、偽型レンチウイルス粒子は、肝臓、脾臓および骨髄（脊椎および下肢）において３日の後処置から時間依存的に局在するルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現時に放出される生物発光シグナルを産生した。対照的に、ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された等価用量のＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターを注射したマウスでは、任意の特定の器官に局在する導入遺伝子発現は観察されなかった。ナノ粒子の異なる適用用量は、全身に分布する拡散シグナルを誘発した。
ＩＶＩＳイメージングによるＯＭ－ＰＢＡＥＳに封入された偽型レンチウイルスベクターおよびＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターの組織分布は、画像取得が産物の最後の静脈内注射の３または７日後に行ったことを除いて、実施例２に記載されるように一般的に行った。
先に記載したように、偽型レンチウイルス粒子は、肝臓、脾臓および骨髄（脊椎および下肢）において３日の後処置から時間依存的に局在するルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現時に放出される生物発光シグナルを産生した。対照的に、ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された等価用量のＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターを注射したマウスでは、任意の特定の器官に局在する導入遺伝子発現は観察されなかった。ナノ粒子の異なる適用用量は、全身に分布する拡散シグナルを誘発した。
【0056】
定量ＰＣＲによる組織分布の評価
ＯＭ－ＰＢＡＥＳに封入された偽型のまたはＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクター粒子によって送達されるプロウイルス配列のゲノム組み込みの解析は、産物の最後の静脈内注射の６時間後、３日または７日後に採取された血液および組織から抽出されたゲノムＤＮＡに対してｑＰＣＲを行ったことを除いて、実施例２に記載されるように概して実施した。
組込みプロウイルス配列が生体内の生物発光イメージング結果と完全に相関する偽型レンチウイルスベクターの生体分布のｑＰＣＲ分析は、図７に示すように、最後の静脈内注射後３日目に、マウス上で回収した脾臓、肝臓、骨髄において検出された。ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターは、分析されたいずれの臓器においても検出されなかったが、最高投与用量の血球において検出された。リンパ節における組込みは、最低用量で処置された１匹のマウスにおいて検出された。ＯＭ－ＰＢＡＥベースのナノ粒子が肝臓の取り込みをバイパスして増加させる能力に沿った組込みは肝臓では検出されなかった（Brugada-Vila et al. 2020）。 ＯＭ－ＰＢＡＥがナノ粒子の血液持続性を改善することが示されている場合、 それらの増殖の事前活性化なしに血液静止細胞の生体内の形質導入は予想されない。
ＯＭ－ＰＢＡＥＳに封入された偽型のまたはＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクター粒子によって送達されるプロウイルス配列のゲノム組み込みの解析は、産物の最後の静脈内注射の６時間後、３日または７日後に採取された血液および組織から抽出されたゲノムＤＮＡに対してｑＰＣＲを行ったことを除いて、実施例２に記載されるように概して実施した。
組込みプロウイルス配列が生体内の生物発光イメージング結果と完全に相関する偽型レンチウイルスベクターの生体分布のｑＰＣＲ分析は、図７に示すように、最後の静脈内注射後３日目に、マウス上で回収した脾臓、肝臓、骨髄において検出された。ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターは、分析されたいずれの臓器においても検出されなかったが、最高投与用量の血球において検出された。リンパ節における組込みは、最低用量で処置された１匹のマウスにおいて検出された。ＯＭ－ＰＢＡＥベースのナノ粒子が肝臓の取り込みをバイパスして増加させる能力に沿った組込みは肝臓では検出されなかった（Brugada-Vila et al. 2020）。 ＯＭ－ＰＢＡＥがナノ粒子の血液持続性を改善することが示されている場合、 それらの増殖の事前活性化なしに血液静止細胞の生体内の形質導入は予想されない。
【0057】
フローサイトメトリーによる細胞ＧＦＰ発現の評価
新鮮でヘパリン処理された全血サンプルを、処置の７日前（顎下サンプリング）または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射から６時間、３日および７日後にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した。また、脾臓および骨髄を殺処分時に回収した。単一細胞懸濁液は、１００μｍの細胞ストレーナーを介して組織をメッシュ分けし、続いてＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen社）を備えたリンパ組織を解離するためのプロトコルに従って赤血球溶解ステップによって得られた。
新鮮でヘパリン処理された全血サンプルを、処置の７日前（顎下サンプリング）または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射から６時間、３日および７日後にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した。また、脾臓および骨髄を殺処分時に回収した。単一細胞懸濁液は、１００μｍの細胞ストレーナーを介して組織をメッシュ分けし、続いてＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen社）を備えたリンパ組織を解離するためのプロトコルに従って赤血球溶解ステップによって得られた。
【0058】
ＧＦＰを発現する血液循環細胞の割合を、白血球数について先に記載した抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによって決定し、ＢＬ１チャネルでＧＦＰ蛍光を記録した。さらに、血液、骨髄および脾臓においてＧＦＰ導入遺伝子を発現する形質導入細胞の表現型を、メーカーの指示書（BD Biosciences）に従って以下の細胞型に特異的な異なる抗体との共染色によって決定した：Ｔリンパ球についてはＣＤ３（ＣＤ３ｅ－ＢＢ７００）、ＣＤ４（ＣＤ４－ＰＥ）、ＣＤ８（ＣＤ８ａ－ＰＥ－Ｃｙ５．５）、Ｂリンパ球についてはＣＤ１９（ＣＤ１９－ＰＥ－ＣＦ５９４）。細胞をＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences社製）で固定し、蛍光陽性細胞をフローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc製）によって、ＢＬ１（ＧＦＰ）、ＹＬ１（ＰＥ色素）、ＹＬ２（ＰＥ－ＣＦ５９４）またはＹＬ３（ＰＥ－Ｃｙ５．５）チャネル上でカウントした。
【0059】
図８に示すように、血球を形質導入できなかった偽型のレンチウイルス粒子で処置したマウスの骨髄および脾臓においてＧＦＰ陽性白血球が見出され、それによって従前の生物発光およびｑＰＣＲの結果が確認された。対照的にＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターは、処置後３日目から血球において用量依存的にＧＦＰ発現を誘発した。形質導入された白血球亜集団のさらなる分析は、図９に描かれているように、すべての主要な細胞型をナノ粒子で効率的に形質導入できることを明らかにした。
これらの結果は、ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターが、偽型対応物とは根本的に異なり、血球に対して予期しない指向性を有することを示唆している。これらは、すべての白血球亜集団を生体内 で形質導入し、標的化剤を必要とせずに、またはレンチウイルス媒介遺伝子導入で通常必要とされる増殖の事前活性化を必要とせずに導入遺伝子を送達することができる。
これらの結果は、ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ欠損レンチウイルスベクターが、偽型対応物とは根本的に異なり、血球に対して予期しない指向性を有することを示唆している。これらは、すべての白血球亜集団を生体内 で形質導入し、標的化剤を必要とせずに、またはレンチウイルス媒介遺伝子導入で通常必要とされる増殖の事前活性化を必要とせずに導入遺伝子を送達することができる。
【0060】
実施例４：反復静脈内注射または点滴後のＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”はげた（Ｂａｌｄ）”）レンチウイルスベクター粒子の安全性および生体分布の生体内評価。
非経口投与のための医薬品要件に準拠したＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターの処方物を試験するために、ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを用いて動物実験を実施した。
臨床現場では、市販の遺伝子（ZOLGENSMA(R)）およびＣＡＲ－Ｔ細胞（TECARTUS(R)，KYMRIAH(R), YESCARTA(R)）療法が現在、点滴を介して患者に投与されている。したがって、この研究では、静脈内投与にわたって高用量のレンチウイルスベクターを送達するための反復点滴の安全性および可能性を比較した。
非経口投与のための医薬品要件に準拠したＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターの処方物を試験するために、ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーを用いて動物実験を実施した。
臨床現場では、市販の遺伝子（ZOLGENSMA(R)）およびＣＡＲ－Ｔ細胞（TECARTUS(R)，KYMRIAH(R), YESCARTA(R)）療法が現在、点滴を介して患者に投与されている。したがって、この研究では、静脈内投与にわたって高用量のレンチウイルスベクターを送達するための反復点滴の安全性および可能性を比較した。
【0061】
動物実験
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、実施例３で既に説明したのと同じ手順および処置を受けた。ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰをコードする実施例１に記載されるようにＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－ （”はげた”）レンチウイルスベクター粒子の用量が、２％イソフルランによる全身麻酔下で１分以内に静脈内注射（尾静脈）された。３匹の動物群は、２５０μＬで４．５ｘ１０１１のレンチウイルス粒子の静脈内注射を３、４または５回１日１回の頻度で繰り返し受けた（マウス１ 匹あたり１．３～２．２２ｘ１０１１ レンチウイルス粒子、すなわちＭＡＤの０．３、０．４または０．５倍の総用量に相当）。ＤＰＢＳ－５０ｍＭスクロースに処方されたＣＭＶプロモーターの制御下で、ＧＦＰをコードするＯＭ－ＰＢＡＥまたはＶＳＶ－Ｇ＋ （”偽型”）レンチウイルスベクター粒子に封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”Ｂａｌｄ”）の用量を、２２．５μＬ／分の制御された流れで２０ 分間点滴（尾静脈）された。３匹の動物群は、４５０μＬ中のマウス１匹あたり８．１ｘ１０１１ 個のレンチウイルス粒子３、４または５回の繰り返し点滴を受けた（マウス１匹当たり２．４～４ｘ１０１１個のレンチウイルス粒子の総用量、すなわち０．６、０．８倍または１倍のＭＡＤに相当）。対照群は、ビヒクル（ＤＰＢＳ／クエン酸カルシウム処方物緩衝液）、ＶＳＶ－Ｇ－（”Ｂａｌｄ”）（マウス１匹あたり４ｘ１０１１個のレンチウイルス粒子の総用量に対応する４５０μＬ中の８ｘ１０１０個のレンチウイルスウイルス粒子、すなわちＭＡＤ）またはＶＳＶ－Ｇ＋ （”偽型”）レンチウイルスベクター（マウス１匹当たりの総用量１．５ｘ１０１１個の レンチウイルス粒子、すなわち０．４倍のＭＡＤに対応する３．１ｘ１０１０個の４５０μＬ中のレンチウイルスウイルス粒子）の５回反復点滴（１日１回）で処置された動物に含められた。 動物の行動、体重、水分および食物消費を、７日間にわたって週３回記録した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、実施例３で既に説明したのと同じ手順および処置を受けた。ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰをコードする実施例１に記載されるようにＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－ （”はげた”）レンチウイルスベクター粒子の用量が、２％イソフルランによる全身麻酔下で１分以内に静脈内注射（尾静脈）された。３匹の動物群は、２５０μＬで４．５ｘ１０１１のレンチウイルス粒子の静脈内注射を３、４または５回１日１回の頻度で繰り返し受けた（マウス１ 匹あたり１．３～２．２２ｘ１０１１ レンチウイルス粒子、すなわちＭＡＤの０．３、０．４または０．５倍の総用量に相当）。ＤＰＢＳ－５０ｍＭスクロースに処方されたＣＭＶプロモーターの制御下で、ＧＦＰをコードするＯＭ－ＰＢＡＥまたはＶＳＶ－Ｇ＋ （”偽型”）レンチウイルスベクター粒子に封入されたＶＳＶ－Ｇ－（”Ｂａｌｄ”）の用量を、２２．５μＬ／分の制御された流れで２０ 分間点滴（尾静脈）された。３匹の動物群は、４５０μＬ中のマウス１匹あたり８．１ｘ１０１１ 個のレンチウイルス粒子３、４または５回の繰り返し点滴を受けた（マウス１匹当たり２．４～４ｘ１０１１個のレンチウイルス粒子の総用量、すなわち０．６、０．８倍または１倍のＭＡＤに相当）。対照群は、ビヒクル（ＤＰＢＳ／クエン酸カルシウム処方物緩衝液）、ＶＳＶ－Ｇ－（”Ｂａｌｄ”）（マウス１匹あたり４ｘ１０１１個のレンチウイルス粒子の総用量に対応する４５０μＬ中の８ｘ１０１０個のレンチウイルスウイルス粒子、すなわちＭＡＤ）またはＶＳＶ－Ｇ＋ （”偽型”）レンチウイルスベクター（マウス１匹当たりの総用量１．５ｘ１０１１個の レンチウイルス粒子、すなわち０．４倍のＭＡＤに対応する３．１ｘ１０１０個の４５０μＬ中のレンチウイルスウイルス粒子）の５回反復点滴（１日１回）で処置された動物に含められた。 動物の行動、体重、水分および食物消費を、７日間にわたって週３回記録した。
【0062】
血液、脾臓および骨髄細胞数
血球数は、処置前９日目、または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射または点滴の後、３日目（顎下サンプリング）および７日目にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した新鮮でヘパリン化された全血サンプルについて、実施例２に既に記載されているように決定された。脾臓および骨髄を殺処分時に採取した。単一細胞懸濁液は、１００μｍの細胞ストレーナーを介して組織をメッシュ分けし、続いてＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen社）を備えたリンパ組織を解離するためのプロトコルに従って赤血球溶解ステップによって得られた。
血球数は、処置前９日目、または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射または点滴の後、３日目（顎下サンプリング）および７日目にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した新鮮でヘパリン化された全血サンプルについて、実施例２に既に記載されているように決定された。脾臓および骨髄を殺処分時に採取した。単一細胞懸濁液は、１００μｍの細胞ストレーナーを介して組織をメッシュ分けし、続いてＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen社）を備えたリンパ組織を解離するためのプロトコルに従って赤血球溶解ステップによって得られた。
【0063】
骨髄系細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔリンパ球組成物に対する処置の効果に関するより多くの洞察を得るために、異なる抗体パネルが設計された。バイオレジェンドから購入した特異的抗体パネルを用いて、細胞表現型をフローサイトメトリーにより解析した（AttuneNXT; Invitrogen, Inc.社製）：一般パネル（ＣＤ４５－ＡＦ７００，ＣＤ１７０（Siglec-F）－ＰＥ，Ｌｙ－６Ｇ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５，ＣＤ３３５－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ５９４， ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＰＥ－Ｃｙ７， ＣＤ３ｅ－ＡＰＣ，Ｆ４／８０－ＢＶ４２１， ＣＤ１１ｂ－ＢＶ５１０， ＣＤ１１ｂ－ＢＶ５１０， ＣＤ１１ｂ－ＢＶ５１０， Ｌｙ６Ｃ－ＢＶ６０５および ＣＤ１１ｃ－ＢＶ７１１） およびＴ細胞パネル（ＣＤ４５－ＡＦ７００， ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５， ＣＤ２５－ＰＥ， ＣＤ６９－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ５９４， ＣＤ６２Ｌ－ＰＥ－Ｃｙ７， ＣＤ３ｅ－ＡＰＣ， ＣＤ１２７－ＢＶ４２１， ＣＤ４－ＢＶ５１０， ＴＣＲｇｄ－ＢＶ６０５， ＣＤ４４－ＢＶ７１１）。
【0064】
血液、脾臓および骨髄細胞を、マウスＦｃブロック試薬（BD Biosciences社）と共に５分間インキュベートした。抗体と一緒に４℃で２０分間インキュベートした後、赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen Inc.社製）で室温にて溶解した。細胞を５００ｇで２分間遠心分離し、ＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences社製）で固定した。
【0065】
蛍光陽性細胞をフローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc.社製）によりカウントした ＢＬ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５色素）、ＹＬ１（ＰＥ色素）、ＹＬ２（ＰＥ-－Ｄａｚｚｌｅ色素）、ＹＬ４（ＰＥ－Ｃｙ７色素）、ＲＬ１（ＡＰＣ色素）、ＲＬ２（ＡＦ７００色素）、ＲＬ３（ＡＰＣ－Ｃｙ７色素）、ＶＬ１（ＢＶ４２１色素）、ＶＬ２（ＢＶ５１０色素）、ＶＬ３（ＢＶ６０５色素）およびＶＬ４（ＢＶ７１１色素）チャネル。
【0066】
細胞表現型は、ＣＤ４５+、生存細胞および単一細胞の間で以下のように定義された：Ｔリンパ球（ＣＤ３ｅｐｏｓ－ＢＢ２２０ｎｅｇ）、Ｂリンパ球（ＣＤ３ｅｎｅｇ－ＢＢ２２０ｈｉｇｈ ）およびＮＫ細胞（ＣＤ３ｅｎｅｇ－ＢＢ２２０ｎｅｇ－ＣＤ１１ｃｎｅｇ－ＣＤ１１ｂｌｏｗ－ＣＤ３３５ｐｏｓ）、好中球（ＳＣＣｈｉｇｈ－ＣＤ１７０ｐｏｓ－Ｌｙ６ｈｉｇｈ）、好酸球（ＣＤ１７０ｈｉｇｈ）－Ｌｙ６ｈｉｇｈ）、単球／マクロファージ（ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ－ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ－Ｆ４／８０ｌｏｗ／ｈｉｇｈ）、常在単球／マクロファージ（ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ－ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ－Ｌｙ６Ｃｎｅｇ）および炎症性単球／マクロファージ（ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ－ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ－Ｌｙ６Ｃｐｏｓ）を一般パネルに配置；Ｔリンパ球（ＣＤ３ｅｐｏｓ）、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球（ＣＤ４ｐｏｓ）、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球（ＣＤ８ｐｏｓ）、ガンマ／デルタＴリンパ球（ＣＤ３ｐｏｓ－ＴＣＲｇｄｐｏｓ ）、ＴｒｅｇＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４ｐｏｓ－ＣＤ２５ｈｉｇｈ－ＣＤ１２７ｌｏｗ）、原始的なＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４ｐｏｓ－ＣＤ４４ｌｏｗ－ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）、中枢記憶ＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４ｐｏｓ－ＣＤ４４ｈｉｇｈ－ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）、エフェクターメモリＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４ｐｏｓ－ＣＤ４４ｈｉｇｈ－ＣＤ６２Ｌｎｅｇ）、原始的なＣＤ８＋リンパ球（ＣＤ８ｈｉｇｈＣＤ４４ｌｏｗＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）、セントラルメモリーＣＤ８＋リンパ球（ＣＤ８ｐｏｓ－ＣＤ４４ｈｉｇｈ－ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ）、活性化ＣＤ４リンパ球（ＣＤ４ｈｉｇｈＣＤ２５ｎｅｇ／高ＣＤ６９ｎｅｇ／ｈｉｇｈ）および活性化されたＣＤ８リンパ球（ＣＤ８ｈｉｇｈＣＤ２５ｎｅｇ／ｈｉｇｈＣＤ６９ｎｅｇ／ｈｉｇｈ）をＴリンパ球パネル上に配置した。
【0067】
サイトカインプロファイリング
循環レベルは、処置の前９日、またはレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射または点滴後３日目もしくは７日目に採取したマウスの新鮮な末梢血から採取した血漿を用いて実施例２、３に既に記載されるように定量した。
循環レベルは、処置の前９日、またはレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射または点滴後３日目もしくは７日目に採取したマウスの新鮮な末梢血から採取した血漿を用いて実施例２、３に既に記載されるように定量した。
【0068】
血漿ＡＳＴ／ＡＬＴ活性測定
処置前または室温にて１５００ ｘｇで１０分間遠心分離した、レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射後７日目に採取したマウスの新鮮な末梢血から血漿を採取した。 上澄みを新鮮なチューブに移し、２，０００ｘｇで再び１５分間遠心分離した。血漿は、メーカーの指示に従って、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性比色アッセイ（Merck-Millipore社製）による希釈されていないサンプル上のＡＳＴおよびＡＬＴ酵素活性の測定まで、－８０℃で保存した。
処置前または室温にて１５００ ｘｇで１０分間遠心分離した、レンチウイルスベクター粒子の静脈内注射後７日目に採取したマウスの新鮮な末梢血から血漿を採取した。 上澄みを新鮮なチューブに移し、２，０００ｘｇで再び１５分間遠心分離した。血漿は、メーカーの指示に従って、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性比色アッセイ（Merck-Millipore社製）による希釈されていないサンプル上のＡＳＴおよびＡＬＴ酵素活性の測定まで、－８０℃で保存した。
【0069】
１週間の観察期間中、毒性の明らかな徴候は観察されなかった。処置されたマウスのいずれも、はげた偽型レンチウイルスベクターまたはＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損操作変異体の反復注射または点滴後に体重減少、苦痛または行動変化を経験しなかった。実施例３で既に観察されているように、投薬に必要な反復麻酔は最も困難な手順であることが判明し、覚醒期にマウスを注意深く監視する必要があった。
【0070】
図１０Ａおよび１０Ｂに示すように、異なる処置は、７日間の観察期間中に血液、脾臓または骨髄中の一般的な白血球組成物の有意な変化を引き起こさなかった。すべての処置動物は、血液単球／マクロファージおよびマクロファージの時間依存的な減少を示したが、偽型レンチウイルスベクターを注射したマウスの骨髄では好中球の増加が観察された。骨髄系集団に焦点を当てたところ、おそらく麻酔の繰り返しの結果として、すべての動物が常在細胞および炎症細胞の数の顕著な減少を経験したことが明らかになった。興味深いことに、図１１Ａに描かれているように、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損操作変異体を注射した動物では、７日目の回復後に血球数の差は見られなかったが、骨髄においては炎症性骨髄系細胞の用量依存的な減少が観察された。しかしながら、偽型レンチウイルスベクター（図１１Ｂ）は、脾臓および骨髄における炎症性骨髄系細胞の増加により、より顕著な効果を引き起こした。封入されたレンチウイルスベクターの静脈内注射または点滴を繰り返しても、７日間血液、脾臓および骨髄中で一定に保たれたＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはγ／δＴリンパ球には影響を及ぼさなかった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。偽型ベクターは、ＣＤ８陽性の増加およびＣＤ４陽性リンパ球の減少を誘発した。ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性亜集団内では、すべての処置が原始的な細胞の時間依存的減少を誘発した（図１３Ａおよび１４Ａ）。７日目の回復後、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損操作変異体で処置したマウスからの血液、脾臓および骨髄においてＣＤ４およびＣＤ８陽性組成に差は見られなかった（図１３Ｂおよび１４Ｂ）。偽型レンチウイルスベクターは、血液、脾臓および骨髄中のＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性エフェクター／記憶細胞の増加に関連する原始的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の両方の減少を誘発した。最後に、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球におけるＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現は、ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損操作変異体で処置された群においてアップレギュレートされなかった（図１５Ａおよび１５Ｂ）。しかし、ＣＤ８＋ＣＤ２５－ＣＤ６９＋細胞の増加は、ＣＤ６９が早期活性化マーカーとして記載されている、一時的な活性化状態を反映して７日目に視認された。偽型のレンチウイルスベクターは、脾臓および骨髄中の血液ＣＤ２５－ＣＤ６９＋中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９－細胞を増加させ（図１５Ｂ）、脾臓および骨髄におけるＣＤ８＋ＣＤ２５－ＣＤ６９＋細胞のより高い出現、および骨髄中でのみＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋の減少を伴った（図１６Ｂ）。血液、脾臓および骨髄白血球の表現型のこの詳細な分析は、偽型レンチウイルスベクターの反復点滴が、処置後７日以内に免疫原性の高いVSV-Gタンパク質に対する先天性免疫応答および適応免疫応答の初期事象を引き起こすことを示唆している。これらの分子および細胞事象のいずれも、ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルス粒子の静脈注射および点滴を繰り返し受けた動物では観察されなかった。荷電テトラペプチドを含有するＯＭ－ＰＢＡＥポリマーが表面に存在しているにもかかわらず、これらのナノ粒子は好ましい安全性プロファイルを有するようであり、反復処置サイクルと適合性がある。
【0071】
免疫系の活性化のこの欠如は、図１７に描かれた血漿のサイトカインレベルによってさらに確認された。１週間の観察期間中、サイトカインアップレギュレーションの明らかな徴候は、すべての処置マウスにおいて観察されなかった。偽型レンチウイルスベクターに対する先天性免疫応答および適応免疫応答の初期徴候にもかかわらず、試験されたサイトカインのレベルは、ビヒクルを注射した対照動物において測定されたバックグラウンドレベルよりも高くなかった。ＤＭＳＯ非含有のＯＭ－ＰＢＡＥＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損操作変異体の最高用量は、Ｔリンパ球の活性化に関与する炎症誘発性メディエーターまたはサイトカインのいかなるアップレギュレーションを誘発しなかった。ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－４およびＩＬ－５の一時的に上昇した分泌物は３日後に観察されたが、血漿レベルはバックグラウンドレベルに戻った。
【0072】
これらの結果は、ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入された、操作されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターが、良好な安全性プロファイルを示し、反復静脈内注射または点滴後によく耐えることを示した。
【0073】
最後に、この器官が薬物解毒および代謝の主要な部位であるため、肝機能に対する異なる処置の影響が調査された。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は、肝障害または肝不全時に血流中に放出される代謝反応に関与する肝酵素である。ＡＳＴおよびＡＬＴ酵素活性は、商用の試薬で血漿中で測定し得る。図２０は、１週間の観察期間中、すべての処置マウスにおいて肝毒性の明らかな徴候が観察されなかったことを示す。ＡＳＴおよびＡＬＴ活性は、処置前に得られた値と異ならず、すべて通常の健常マウスについて記載された正常範囲内に収まった（ＡＬＴ：２５－６０ ｍＵ／ｍＬ； ＡＳＴ：５０－１００ ｍＵ／ｍＬ）。これらの結果は、偽型のはげたレンチウイルスベクターおよびＯＭ－ＰＢＡＥに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損操作変異体の反復投与が急性肝障害を引き起こさないことを確認する。
【0074】
定量ＰＣＲによる組織分布の評価
ＯＭ－ＰＢＡＥＳに封入された偽型のまたはＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクター粒子によって送達されるプロウイルス配列のゲノム組み込みの解析は、産物の最後の静脈内注射の６時間後、７日後に採取された血液および組織から抽出されたゲノムＤＮＡに対してｑＰＣＲを行ったことを除いて、実施例２および３に記載されるように概して実施した。
ＯＭ－ＰＢＡＥＳに封入された偽型のまたはＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクター粒子によって送達されるプロウイルス配列のゲノム組み込みの解析は、産物の最後の静脈内注射の６時間後、７日後に採取された血液および組織から抽出されたゲノムＤＮＡに対してｑＰＣＲを行ったことを除いて、実施例２および３に記載されるように概して実施した。
【0075】
先に記載したように、偽型レンチウイルスベクターの生体分布のｑＰＣＲ分析は、図１９に描かれているように、最後の静脈内点滴の７日後にマウス上で回収した脾臓、肝臓、骨髄におけるプロウイルス配列の組込みを明らかにした。ＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターは、回収された器官のいずれにも組み込まなかった。ＤＭＳＯ非含有のＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターは、ＤＭＳＯに処方されたポリマーで得られた結果と比較して、予期しない微妙な変化を伴う異なる生体分布プロファイルを示した。ここで組込みプロファイルは、注射された用量によって変化した。血液細胞への組込みは、骨髄細胞を形質導入するのに十分であった１回の点滴（０．６ＭＡＤ）に際して３回の静脈内注射（０．５ＭＡＤ）で起こった。レンチウイルスベクターの用量依存的な組み込みがリンパ節で観察された。さらに驚くべきことに、１回の点滴（０．６ＭＡＤ）時に２回の静脈内注射（０．４ＭＡＤ）で肺に組込みが検出されました。肺が高度に血管新生された器官であることを考えると、シグナルはこれらの組織に存在する形質導入された血球から来るだけかもしれない。したがって、血球の形質導入を実施例３（２Ｘ１０１１個のレンチウイルス粒子）と同等の用量で繰り返すことができれば、ＯＭ－ＰＢＡＥの処方物および投与経路は、体内のナノ粒子の運命に大きな影響を与えると思われる。
【0076】
フローサイトメトリーによる細胞ＧＦＰ発現の評価
新鮮でヘパリン処理された全血サンプルを、処置の９日前（顎下サンプリング）または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射または点滴から３日および７日後にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した。また、脾臓および骨髄を殺処分時に回収した。単一細胞懸濁液は、１００μｍの細胞ストレーナーを介して組織をメッシュ分けし、続いてＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen社）を備えたリンパ組織を解離するためのプロトコルに従って赤血球溶解ステップによって得られた。
ＧＦＰを発現する血液循環細胞の割合を、白血球数について先に記載した抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによって決定し、ＢＬ１チャネルでＧＦＰ蛍光を記録した。
新鮮でヘパリン処理された全血サンプルを、処置の９日前（顎下サンプリング）または２％イソフルランで麻酔した動物への心臓穿刺によるレンチウイルスベクター粒子の最後の静脈内注射または点滴から３日および７日後にＢａｌｂ／ｃマウスから回収した。また、脾臓および骨髄を殺処分時に回収した。単一細胞懸濁液は、１００μｍの細胞ストレーナーを介して組織をメッシュ分けし、続いてＲＢＣ溶解緩衝液（Invitrogen社）を備えたリンパ組織を解離するためのプロトコルに従って赤血球溶解ステップによって得られた。
ＧＦＰを発現する血液循環細胞の割合を、白血球数について先に記載した抗体パネルを用いたフローサイトメトリーによって決定し、ＢＬ１チャネルでＧＦＰ蛍光を記録した。
【0077】
図２０に示すように、ＧＦＰ陽性の好酸球および単球／マクロファージは、貪食によるバックグラウンド取り込みを反映して、すべての処置にわたって血液および骨髄中に見出された。しかしながら、ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターは、はげた偽型のレンチウイルスベクターがこれらの細胞型に対して活性でなかったときに静脈内注射を介して投与された場合、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびＮＫ細胞においてＧＦＰレポーターの用量依存的発現を誘発した。低ＧＦＰ陽性細胞は、はげたおよび偽型レンチウイルスベクターで処置したマウスから回収した脾臓において検出された。ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターによるすべての処置後に、脾臓およびＮＫ細胞、骨髄中のＢリンパ球およびＴリンパ球におけるＧＦＰ陽性Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および好酸球の増加率が生じた。
【0078】
Ｔリンパ球集団の詳細な分析は、ＤＭＳＯ非含有ＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターが、両方の投与経路で血液中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブ集団の用量依存的形質導入を誘発したことを確認する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の形質導入は脾臓でも起こったが、２回および３回の静脈内注射が最も効率的な処置であった。両方の器官について、ＧＦＰ発現レベルは、はげたおよび偽型レンチウイルスベクターを注射したマウスで検出されたものよりも優れていた。骨髄レベルで有意差は視認されなかった。
【0079】
これらの結果に基づいて、ＤＭＳフリーのＯＭ－ＰＢＡＥポリマーに封入されたＶＳＶ－Ｇ－欠損レンチウイルスベクターは、反復的に全身的に安全に注入することができ、生体内 で導入遺伝子を血液中に存在する白血球だけでなく、標的化剤を必要とせずに、またはレンチウイルス媒介遺伝子導入で通常必要とされる増殖の事前活性化を必要とせずに、一次（骨髄）および二次（脾臓）リンパ器官にも効率的に送達することができる。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】