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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-26
(54)【発明の名称】レーザ捕捉顕微解剖装置、システム、および、方法
(51)【国際特許分類】
G02B 21/00 20060101AFI20230119BHJP
G01N 1/28 20060101ALI20230119BHJP
G01N 21/33 20060101ALI20230119BHJP
G01N 21/3563 20140101ALI20230119BHJP
【ＦＩ】
G02B21/00
G01N1/28 J
G01N21/33
G01N21/3563
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022528321
(86)(22)【出願日】2020-11-17
(85)【翻訳文提出日】2022-07-15
(86)【国際出願番号】 US2020060892
(87)【国際公開番号】W WO2021101893
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】62/937,624
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511237575
【氏名又は名称】フリューダイム・コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110002468
【氏名又は名称】弁理士法人後藤特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サンドキュール ダーフ
(72)【発明者】
【氏名】カルピーノ アラン
【テーマコード（参考）】
2G052
2G059
2H052
【Ｆターム（参考）】
2G052AA33
2G052AD32
2G052AD52
2G052EC17
2G052GA29
2G052JA08
2G059AA05
2G059BB12
2G059EE01
2G059FF01
2G059FF03
2G059GG01
2G059JJ02
2G059JJ11
2G059JJ13
2G059KK04
2H052AC12
2H052AC13
2H052AC27
2H052AC34
2H052AF11
(57)【要約】
顕微鏡装置は、組織試料を保持するように構成されたステージを備える顕微鏡と、組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射するように構成されたＵＶレーザアセンブリと、組織試料の観察領域にＩＲレーザビームを放射するように構成されたＩＲレーザアセンブリと、を備える。ＵＶおよびＩＲレーザアセンブリは、それぞれのＵＶおよびＩＲレーザビームを同じ方向に放射するように配向される。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織試料を保持するように構成されたステージを備える顕微鏡と、前記組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射するように構成されたＵＶレーザアセンブリと、
前記組織試料の前記観察領域にＩＲレーザビームを放射するように構成されたＩＲレーザアセンブリと、を備え、
前記ＵＶレーザアセンブリおよび前記ＩＲレーザアセンブリは、それぞれの前記ＵＶレーザビームおよび前記ＩＲレーザビームを同じ方向に放射するように配向される、顕微鏡装置。
【請求項2】
前記ＵＶレーザアセンブリは、前記ＵＶレーザビームの方向を変更するように構成されたＵＶミラーを備える、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項3】
前記ＩＲレーザアセンブリは、前記ＩＲレーザビームの方向を変更するように構成されたＩＲミラーを備える、請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項4】
前記ＵＶミラーは、前記顕微鏡の光軸に沿って配置される、請求項３に記載の顕微鏡装置。
【請求項5】
前記ＩＲミラーは、前記顕微鏡の前記光軸に沿って配置され、前記ＵＶミラーと直列となる、請求項４に記載の顕微鏡装置。
【請求項6】
前記ＩＲミラーは、前記顕微鏡の前記光軸に沿って、前記ＵＶミラーの真上に配置される、請求項５に記載の顕微鏡装置。
【請求項7】
前記ＵＶミラーは、前記顕微鏡の前記光軸の外側に配置される、請求項３に記載の顕微鏡装置。
【請求項8】
前記顕微鏡は、前記組織試料の前記観察領域に光を向けるように構成された光源を有し、前記光源は、前記光軸に沿って前記ＩＲミラーの上方に配置される、請求項３に記載の顕微鏡装置。
【請求項9】
前記顕微鏡は、前記ステージの上方に位置する対物レンズおよび光源を有し、前記光源は、前記組織試料の前記観察領域に光を向けるように構成され、前記顕微鏡の光軸の外側に配置される、請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項10】
前記光源は、前記ＩＲミラーの垂直下方に配置される、請求項９に記載の顕微鏡装置。
【請求項11】
前記ＵＶレーザビーム及び前記ＩＲレーザビームは、前記組織試料の前記観察領域と略直角の角度で接触するように構成される、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項12】
前記ＵＶレーザビームは、前記組織試料の前記観察領域と斜めの角度で接触するように構成され、前記ＩＲレーザビームは、前記組織試料の前記観察領域と略垂直の角度で接触するように構成される、請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項13】
ＵＶ光およびＩＲ光に曝露された時に組織試料からの標的細胞に接着するように構成されるキャップと、顕微鏡装置と、を備え、
前記顕微鏡装置は、
前記組織試料および前記キャップを保持するように構成されたステージを有する顕微鏡と、
前記組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射するように構成されたＵＶレーザアセンブリと、
前記組織試料の前記観察領域にＩＲレーザビームを放射するように構成されたＩＲレーザアセンブリと、備え、
前記ＵＶレーザアセンブリおよび前記ＩＲレーザアセンブリは、それぞれの前記ＵＶレーザビーム及び前記ＩＲレーザビームを同じ方向に放射するように配向される、レーザ捕捉顕微解剖システム。
【請求項14】
前記ＵＶレーザアセンブリは、前記ＵＶレーザビームの方向を変更するように構成されたＵＶミラーを備える、請求項１３に記載のレーザ捕捉顕微解剖システム。
【請求項15】
前記ＩＲレーザアセンブリは、前記ＩＲレーザビームの方向を変更するように構成されたＩＲミラーを備える、請求項１４に記載のレーザ捕捉顕微解剖システム。
【請求項16】
組織試料から標的細胞を除去する方法であって、顕微鏡のステージの上に組織試料を取り付けること、
前記組織試料から除去される前記標的細胞を選択すること、
ＵＶ光およびＩＲ光の両方に曝露された時に前記組織試料からの前記標的細胞に接着するように構成されるキャップを前記組織試料の上に配置すること、
ＵＶレーザアセンブリから前記組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射すること、
ＩＲレーザアセンブリから前記組織試料の前記観察領域にＩＲレーザビームを放射すること、および、
前記キャップに接着した前記標的細胞を備える前記キャップを、前記組織試料の残部分から除去すること、を有する方法。
【請求項17】
前記ＵＶレーザアセンブリのＵＶミラーを用いて、前記ＵＶレーザビームの方向を変更することをさらに有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＩＲレーザアセンブリのＩＲミラーを用いて、前記ＩＲレーザビームの方向を変更することをさらに有する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の参照）
本出願は、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願６２／９３７，６２４に対する優先権を主張しており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願６２／９３７，６２４に対する優先権を主張しており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、概してレーザ捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）の分野に関する。
【背景技術】
【0003】
レーザ捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）（マイクロダイセクション、レーザ顕微解剖（ＬＭＤ）、またはレーザ補助型顕微解剖（ＬＭＤまたはＬＡＭ）とも称される）は、直接的な顕微鏡観察下で、組織試料の不均質な断片から、目的となる特定の種類の細胞（腫瘍細胞など）または組織の全領域（本明細書では一般に「標的細胞」と称される）の純粋試料を単離するために使用される確立された技術および方法である。そして、獲得された標的細胞は、医薬品産業および学術研究による商業的診断分析、臨床試験、および研究学習などの下流の適用において使用され得る。ＬＣＭは、世界中の多数の科学者によって使用され、ゲノミクス（ＤＮＡ）、トランスクリプトミクス（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、プロテオミクス、メタボロミクス、遺伝子発現および配列決定、分子シグネチャーの決定、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲなどのＰＣＲおよびプロテオミクス）、および次世代配列決定（ＮＧＳ）などの様々な下流の応用において使用することができる。
【0004】
ＬＣＭの一形態は、レーザビームまたは放射線源を用いて、ガラススライド上に取り付けられた組織試料のスライスに対して保持された平坦なプラスチックフィルムを加熱する。プラスチックフィルムには、レーザエネルギーを吸収する染料が均一に含浸されている。標的細胞の上に位置するプラスチックフィルムの領域は、放射線によって選択的に加熱され、この領域が溶融されて、直下の組織セグメントにそれ自体を埋め込まれる。フィルムが組織試料から離昇されると、フィルムの下面に接着された組織の部分が、組織試料の残部分から切り離される（例えば、Espina V., et al.(2006) Nature Prot. 1(2):586-603を参照、この開示全体は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
様々な実施形態は、組織試料を保持するように構成されたステージを備える顕微鏡と、組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射するように構成されたＵＶレーザアセンブリと、組織試料の観察領域にＩＲレーザビームを放射するように構成されたＩＲレーザアセンブリと、を備える顕微鏡装置を提供する。ＵＶ及びレーザアセンブリは、それぞれのＵＶ及びＩＲレーザビームを、同じ方向に放射するように配向される。
【0006】
種々の他の実施形態は、ＵＶ光およびＩＲ光に曝露された時に、組織試料からの標的細胞に接着するように構成されるキャップと、顕微鏡装置とを備える、レーザ捕捉顕微解剖システムを提供する。顕微鏡装置は、組織試料およびキャップを保持するように構成されたステージを備える顕微鏡と、組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射するように構成されたＵＶレーザアセンブリと、組織試料の観察領域にＩＲレーザビームを放射するように構成されたＩＲレーザアセンブリとを備える。ＵＶ及びＩＲレーザアセンブリは、それぞれのＵＶ及びＩＲレーザビームを同じ方向に放射するように配向される。
【0007】
様々な他の実施形態は、組織試料から標的細胞を除去する方法を提供する。この方法は、顕微鏡のステージ上に組織試料を取り付けることと、組織試料から除去される標的細胞を選択することと、ＵＶ光およびＩＲ光の両方に暴露されると、組織試料からの標的細胞に接着するように構成されるキャップを組織試料上に設置することと、を有する。この方法は、ＵＶレーザアセンブリから組織試料の観察領域にＵＶレーザビームを放射することと、ＩＲレーザアセンブリから組織試料の観察領域にＩＲレーザビームを放射することと、キャップに付着された標的細胞を備えるキャップを組織試料の残部から除去することと、を有する。
【0008】
これらのおよび他の特徴（保持の特徴および／または観察の特徴を含むが、それらに限定されない）は、その構成および動作の様式とともに、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。また、以下に示される図面全体では、同様の要素は同様の番号を有する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
概して図面を参照すると、本明細書に開示される種々の実施形態は、超精密レーザ顕微解剖および超高感度分析を可能にする、紫外線（ＵＶ）および赤外線（ＩＲ）レーザビームの両方を利用する、レーザ捕捉顕微解剖（「ＬＣＭ」）のための種々の装置、システム、および方法に関する。ＵＶおよびＩＲレーザビームの両方を提供することによって、使用者には、様々な異なるＬＣＭ用途のために純粋な細胞集団を単離するためのより多くの選択肢が与えられる。
【0022】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、「a」および「an」および「the」などの単数形の冠詞、ならびに要素を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）同様の指示対象は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡潔な方法としての役割を果たすことを単に意図しており、各別個の値は、あたかもそれが本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に実施形態をより明瞭にすることを意図しており、別段の記載がない限り、特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、任意の請求されていない要素を必須として示すものとして解釈されるべきではない。
【0023】
本明細書に例示的に記載される実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）が存在していない状況でも適切に実施され得る。したがって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」などの用語は、広範にかつ限定なく読まれるものとする。加えて、本明細書で使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、図示および説明される特徴またはその部分の任意の均等物を排除する意図はないが、種々の修正が、特許請求される技術の範囲内で可能であることが認識される。さらに、「から本質的になる（consisting essentially of）」という語句は、具体的に列挙された要素および請求される技術の基本的および新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の要素を含むと理解されるであろう。「からなる（consisting of）」という語句は、特定されていない任意の要素を除外する。「含む（comprising）」という表現は、「含むがこれに限定されない」ことを意味する。したがって、他の言及されていない物質、添加剤、担体、またはステップが存在し得る。特に明記しない限り、「a」または「an」は、１つ以上を意味する。
【0024】
特に示されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される特性、パラメータ、条件などの量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは近似値である。任意の数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。「約」の語句は、数値表示の前に使用する場合、例えば、温度、時間、量、および範囲を含む濃度は、（＋）または（－）の１０％、５％または１％変化し得る近似値を示す。
【0025】
当業者によって理解されるように、あらゆる目的のために、特に記載された説明を提供することに関して、本明細書に開示される全ての範囲はまた、あらゆる可能な部分的範囲およびその部分的範囲の組み合わせも包含する。列挙された任意の範囲は、同じ範囲を少なくとも等しく半分に、１／３に、１／４に、５／１に、１０／１などに分割することを十分に説明し、可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１、および上３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者によって理解されるように、「～まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての言語は、列挙された数を含み、上記で論じたように、後に部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、各々固有のメンバーを含む。
【0026】
ＬＣＭ技術の目的は、典型的な組織病理学生検スライド上に含まれる異種個体郡または組織試料から特定の標的細胞を取得するための単純な方法を提供することである。典型的な組織生検試料は、病理学の分野で周知の技術を用いて顕微鏡スライド上に配置される組織の５～１０ミクロンスライスからなる。多くの場合、病理学者は、さらなる分析のために、組織試料（例えば、「標的細胞」）のわずかな部分のみを除去することを所望する。
【0027】
組織試料は、様々な異なるタイプまたは異種混の細胞であってもよく、様々な異なる生物からの様々な異なる組織タイプであってもよい。例えば、組織試料は、ヒト細胞を含んでもよく、研究されている身体器官の断面であってもよい。組織試料の残部分から除去される対象となる組織試料の所望のまたは選択された領域、部分、切片、細胞、または組織は、「標的細胞」と呼ばれる。
【0028】
ＬＣＭを実施するために、フィルム（マイクロパターン化熱可塑性フィルムなど）を組織試料の上面と接触させて配置し、同時に組織試料の下面をスライドの上に取り付ける。組織試料から所定の標的細胞を単離するために、次いで、フィルム（組織試料と接触しているもの）に電磁放射線（すなわち、レーザエネルギー）を照射する。このフィルムは、消耗品であるキャップ（本明細書においてさらに説明される）の一部である。
【0029】
レーザ照射が組織試料の所望の領域上（すなわち、標的細胞を覆うように）に配向されると、照射により組織試料接着特性が変化する。組織試料の上面に沿ったレーザ照射は、フィルムを活性化することによって、組織試料の上面に沿った接着捕捉剤を活性化する。特に、フィルムが集光レーザビームに曝露されると、レーザエネルギーのビーム内にあるフィルム（及びキャップ）の曝露領域は、レーザによって加熱され、局所的に溶融する。フィルムの溶融領域は組織試料表面と一体となり、それによって、組織試料の曝露部分（すなわち、所望の標的細胞）をフィルムに接着させる。
【0030】
一方、組織試料の下面は、スライド上に直接置かれる代わりに、微粒子またはナノ粒子コーティング（一実施形態による）上に置かれる。微粒子またはナノ粒子コーティングは、レーザエネルギー単独で、または組織試料の化学的処理と組み合わせて、その接着特性が変化され得る。レーザエネルギーは、組織試料の下の接着力を破壊または溶解しながら、同時に、組織試料の上部表面上の接着力を活性化する（上述のように）。特に、接着捕捉剤は、より高い効率、捕捉精度（より低い非特異的な捕捉を伴う）、収率、および分解能を達成するように、組織試料の下では溶解される。
【0031】
レーザ照射後、次いで、フィルムを組織試料から持ち上げ、除去する。選択された標的細胞（局所的に溶融したフィルム領域の直下のもの）がフィルムに接着されるので、組織試料の選択された標的細胞は、残りの組織試料からフィルムと共に除去される。特に、標的細胞は、組織試料の残部分から切り離され、除去され、これにより標的細胞が組織試料の残部分から単離される（または、標的細胞は、組織試料の残部分から切り離すことができる）。標的細胞が捕捉され、収集デバイス内に配置され、これにより組織試料または細胞の顕微鏡的領域から組織学的に純粋な強化された細胞集団を収集する。
【0032】
この操作の成功は、選択された対象領域の上方（すなわち、フィルムと組織試料との間）と選択された対象領域の下方（すなわち、組織試料とスライドとの間）の力のバランスに依存する。様々な組成物および方法は、接着強度を増加させ、組織試料表面と接触するフィルムの解像度を改善することができると同時に、スライド上でしっかりと乾燥させることができ、組織試料の底部との接触面の接着力を選択的に低減することができる。
【0033】
本明細書にさらに記載されるように、本明細書に開示される種々の実施形態は、フィルム（組織試料と接触する）が、紫外線（ＵＶ）および赤外線（ＩＲ）スペクトルの両方の電磁放射線で照射されることを可能にする。
【0034】
ＬＣＭシステム
図１は、顕微鏡装置３０および種々の消耗品２２（例えば、上流または下流の試料処理用）を含むレーザ捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）システム２０の一実施形態を示す。様々な消耗品２２は、キャップ２４（本明細書で更に説明されるフィルムを含む）、スライド２６（例えば、組織試料が最初に置かれるスライド）、及び試薬（例えば、抽出試薬、染色試薬、および下流試薬（捕捉された材料を分析するため））を含んでもよい。顕微鏡装置３０は、顕微鏡３２と、ＵＶレーザ構造またはアセンブリ４０およびＩＲレーザ構造またはアセンブリ６０を備えるデュアルレーザシステムとを備える。
図１は、顕微鏡装置３０および種々の消耗品２２（例えば、上流または下流の試料処理用）を含むレーザ捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）システム２０の一実施形態を示す。様々な消耗品２２は、キャップ２４（本明細書で更に説明されるフィルムを含む）、スライド２６（例えば、組織試料が最初に置かれるスライド）、及び試薬（例えば、抽出試薬、染色試薬、および下流試薬（捕捉された材料を分析するため））を含んでもよい。顕微鏡装置３０は、顕微鏡３２と、ＵＶレーザ構造またはアセンブリ４０およびＩＲレーザ構造またはアセンブリ６０を備えるデュアルレーザシステムとを備える。
【0035】
ＵＶレーザアセンブリ４０とＩＲレーザアセンブリ６０の両方を含むことによって、ＬＣＭシステム２０は、従来のＬＣＭシステムを上回る性能改善を提供する。特に、ＬＣＭシステム２０の分解能が改善され、標的細胞のより小さいサイズの領域が、顕微鏡３２のタワー内の顕微解剖を通して正確に捕捉されることが可能になる。ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０の両方を含むことによって、ＬＣＭシステム２０の追加的な応用のための有用性および使用性が（従来のＬＣＭシステムと比較して）拡張され、ＬＣＭシステム２０は、単一のレーザ波長のみを使用する従来のＬＣＭシステム内で言及または提供されないさらなる機能性を提供する。さらに、より高品質の画像を生成することができ、同時に、標的細胞を捕捉するために容易に使用できる。
【0036】
ＬＣＭシステム２０は、組織の微小環境を単一細胞レベルで調べることを可能にし、組織の高忠実可視化（例えば、マウスまたはスタイラスによる選択のためのコンピュータスクリーン上のデジタルフルカラー画像）を提供し、そうでなければ異種細胞集団において不明瞭となり得るユニークな分子シグネチャーを明らかにすることを可能にし、より高い捕捉、抽出収率、および保存のためにナノテクノロジー増強（本明細書にさらに記載される）を実現する「ヤモリ把捉（GeckoGrip）」キャップを利用する。
【0037】
従来のＬＣＭシステムと比較して、ＬＣＭシステム２０は、柔軟性を最大にしながら、対象となる標的細胞を標的化する精度を増加させながらＬＣＭの速度を増加させる。ＬＣＭシステム２０は、微小解剖された組織試料を維持し、ＬＣＭシステム２０の一部と接触することを可能にし、同時に、組織の大部分は、参照のために画像化およびカタログ化される。捕捉された細胞の空間配向は、捕捉表面上で維持され、それによって、細胞の分子完全性が保存され、組織試料中の生体分子のＵＶレーザビームに起因する損傷からの遮蔽が可能となる。
【0038】
ＬＣＭシステムの消耗品
ＬＣＭシステム２０は、ＬＣＭを実行するためにフィルムを有する捕捉消耗品またはキャップ２４を備える。キャップ２４は、（フィルムを介して）ＵＶ光およびＩＲ光の両方に曝露された時に、組織試料から標的細胞に接着するように構成される。フィルムは、米国特許第１０，３２４，００８号に開示されるものなどのようなパターン化された（例えば、マイクロパターン化された）熱可塑性転写フィルムであってもよい。なお、当該米国特許の開示全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。フィルムは、マイクロピラー、マイクロ突起、ヒドロゲルマイクロスフェア、および／またはマイクロニードルなどの「ヤモリ足（gecko feet）」または突起を含んでもよく、これらは、組織試料の上部に配置される熱可塑性フィルムに付着されるか、熱可塑性フィルムと連続するか、または熱可塑性フィルムと一体的に形成される。これらの突起は、同時捕捉および放出を可能にし、組織および細胞顕微解剖のためにマイクロパターン表面を使用する。突起はまた、標的細胞の上面とフィルムとの間の接着力を増加させることによって、異種組織試料からの標的細胞の純粋集団の捕捉（例えば、リフト）効率を改善する。
ＬＣＭシステム２０は、ＬＣＭを実行するためにフィルムを有する捕捉消耗品またはキャップ２４を備える。キャップ２４は、（フィルムを介して）ＵＶ光およびＩＲ光の両方に曝露された時に、組織試料から標的細胞に接着するように構成される。フィルムは、米国特許第１０，３２４，００８号に開示されるものなどのようなパターン化された（例えば、マイクロパターン化された）熱可塑性転写フィルムであってもよい。なお、当該米国特許の開示全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。フィルムは、マイクロピラー、マイクロ突起、ヒドロゲルマイクロスフェア、および／またはマイクロニードルなどの「ヤモリ足（gecko feet）」または突起を含んでもよく、これらは、組織試料の上部に配置される熱可塑性フィルムに付着されるか、熱可塑性フィルムと連続するか、または熱可塑性フィルムと一体的に形成される。これらの突起は、同時捕捉および放出を可能にし、組織および細胞顕微解剖のためにマイクロパターン表面を使用する。突起はまた、標的細胞の上面とフィルムとの間の接着力を増加させることによって、異種組織試料からの標的細胞の純粋集団の捕捉（例えば、リフト）効率を改善する。
【0039】
一実施形態によれば、突起は、熱ポリマー抽出キャップ２４上に取り付けられた熱ポリマー表面に適用されるフォトリソグラフィーモールドを使用してフィルム上に形成されてもよい。顕微鏡３２は、キャップ２４を定位置に保持するための加重方法を含んでもよく、これは、標的細胞との接触を向上させる。任意選択で、キャップ２４は、手動で組織試料上に設置されてもよく、顕微鏡３２は、精度よく安定してキャップ２４を手動で設置するために、手動キャップアーム等のキャップ設置システムを備え得る。これは、ＬＣＭポリマースポットの機能性（細胞への接着およびスポット直径など）を改善し、より小さいサイズの捕捉を可能にする。
【0040】
フィルム（および任意選択で突起）は、下方の凹凸のある組織試料表面に接着するように、レーザビームからなどの選択的な放射エネルギーによって活性化され得る表面を有する。例えば、フィルム（および任意選択で突起）は、一般的なレーザダイオード、例えばＡｌＧａＡｓレーザダイオードの発光領域に重なるスペクトルの紫外（ＵＶ）又は赤外（ＩＲ）領域において選択的に吸収するように選ばれた有機染料（ＵＶ及び／又はＩＲ吸収染料など）を含むか又は含浸させて製造することができる。レーザ吸収染料の勾配を突起（マイクロピラーなど）に含浸させることによって、突起の先端を膨張させ、先端における組織試料表面の凹凸に選択的に適合させることができる。
【0041】
追加的に、ＬＣＭシステム２０は、組織試料が取り付けられるスライド２６を備える。スライド２６はまた、レーザ照射によって組織接着特性を変化可能な微粒子またはナノ粒子によりスライド２６をコーティングすることによって加工することもできる。例えば、スライド２６を酸化インジウムスズでコーティングして、レーザ照射下での標的細胞の底面とスライド２６との間の接着力を低減することができる。スライド２６は、ガラスまたは膜（例えば、ガラス膜または金属膜）を含むがこれらに限定されず様々な異なる材料から構成されてもよい。
【0042】
顕微鏡
顕微鏡３２は、組織試料（または標的細胞）が、容易に拡大され、観察され、または可視化され、例えば、２倍、１０倍、および４０倍の倍率で（画像として）捕捉されることを可能にする。顕微鏡３２は、デジタル顕微鏡法を提供してもよく、画像位置合わせのためのマーク、画面上の特徴選択、自動または手動顕微解剖、直感的、ユーザフレンドリーなオペレータソフトウェア、および統合された遠隔病理学オプション等の種々の特徴を含んでもよい。顕微鏡３２は、捕捉表面との間の界面における屈折率整合によって、組織試料の高忠実の色可視化を提供してもよい。図１１Ａ～１１Ｅは顕微鏡３２の一実施形態を示し、図１２Ａ～１２Ｄは顕微鏡３２の別の実施形態を示す。
顕微鏡３２は、組織試料（または標的細胞）が、容易に拡大され、観察され、または可視化され、例えば、２倍、１０倍、および４０倍の倍率で（画像として）捕捉されることを可能にする。顕微鏡３２は、デジタル顕微鏡法を提供してもよく、画像位置合わせのためのマーク、画面上の特徴選択、自動または手動顕微解剖、直感的、ユーザフレンドリーなオペレータソフトウェア、および統合された遠隔病理学オプション等の種々の特徴を含んでもよい。顕微鏡３２は、捕捉表面との間の界面における屈折率整合によって、組織試料の高忠実の色可視化を提供してもよい。図１１Ａ～１１Ｅは顕微鏡３２の一実施形態を示し、図１２Ａ～１２Ｄは顕微鏡３２の別の実施形態を示す。
【0043】
一実施形態によれば、顕微鏡の台座は、図２に示すように、２倍、１０倍、および４０倍の対物レンズと、長作動距離集光器（および双眼鏡を備えない）とを有するオリンパスｉｘ７３倒立顕微鏡であってもよい。
【0044】
顕微鏡３２は、光が顕微鏡３２を通って組織試料まで伝搬する経路を画定する光軸３９を画定する。光軸３９は、組織試料の視野（または観察領域または範囲）の中心と一致し、その中心を通って延びる。光軸３９は、顕微鏡３２の各レンズの曲率中心を通る（そして、レーザアセンブリ４０、６０の任意のミラーを通る）。本明細書で言及されるように、「光の経路」は、可視光およびレーザビーム４２、６２の両方が組織試料およびステージ３４に向かって放出される方向を指す。
【0045】
顕微鏡３２は、組織試料を照明するために観察領域を向かって可視光を放射する照明または光源３８（図７～図８に示されている）を備えてもよい。光源３８は、ステージ３４の上方に配置されてもよい。様々な実施形態によれば、光源３８は白色発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。図８に示される一実施形態によれば、光源３８は、光のリング（例えば、ＬＥＤのリング）であってもよく、顕微鏡３２は、光を拡散するために光源３８の真下に配置される拡散器１３１（環状の接地ガラス拡散器など）を含んでもよい。
【0046】
（図７に示すように）顕微鏡３２は、少なくとも１つの集光レンズ３６及び少なくとも１つの対物レンズ３７を含む様々な異なるレンズを含む。一実施形態によれば、顕微鏡３２は２つの集光レンズ３６を含む。対物レンズ３７は、低倍率反射対物レンズ（例えば、Thorlabs LMM-15X-UVVまたは約３０ミリメートル（ｍｍ）の比較的長い作動距離を有する１０倍の対物レンズなど）であってもよい。（図９に示すように）顕微鏡３２は、ステージ３４の上方に位置する反射対物レンズおよびステージ３４の下方に位置する観察対物レンズなどの、複数の異なるタイプの対物レンズ３７を含むことができる。対物レンズ３７は、２倍～１００倍を含む様々な異なる倍率を有してもよい。
【0047】
図２～図３に示すように、顕微鏡３２は、組織試料を保持するように構成された電動器具プラットフォームまたはステージ３４を備える。組織試料（およびスライド２６）は、レーザによる分析および解剖のためにステージの上部に装填または配置することができる。ステージ３４は、組織試料を所望の位置に位置決めするために、顕微鏡３２の残部分に対して（手動でまたはコンピュータによって）移動させることができる。例えば、ステージ３４を垂直に移動させて、顕微鏡３２のレンズから所定の垂直距離に組織試料を位置決めすることができる。ステージ３４はまた、解剖のために、組織試料の特定の部分（すなわち、標的細胞）を視野（光軸３９と整列される）内におよびレーザの下に位置付けるために、水平面に沿って移動させられてもよい。顕微鏡３２は、任意選択で、ステージ３４の移動を制御するためのステージコントローラを含んでもよい。図３に示す一実施形態によれば、ステージ３４はThorlabs MLS203-1リニアステージ（０．２５マイクロメートル（μｍ）の再現性で２５０ｍｍ／秒までの速度）である。
【0048】
図４に示すように、顕微鏡３２は、組織試料のカラー画像をデジタル的に取り込むように構成されたカメラ３５を備えることができ、このカメラ３５は前方視赤外線（ＦＬＩＲ）カメラであってもよい。図４に示す一実施形態によれば、カメラ３５はオリンパス ＤＰ７４であり、対角線長が２１ｍｍの広い視野での６０フレーム／秒（ｆｐｓ）のフルＨＤ画像解像度と組み合わされている。オリンパス ＤＰ７４の相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）のグローバルシャッタは、画素全体を一度に露出し、歪みを除去する。オリンパス ＤＰ７４は、ＬＣＭシステム２０のソフトウェアと統合され得る内蔵位置ナビゲータを有する。一実施形態によれば、カメラ３５は、光軸３９の外側に配置されてもよく、そして、カメラミラーは、カメラ３５が顕微鏡３２下の組織試料の画像またはビデオを捕捉および記録することが可能となるように、位置付けられ、角度付けられてもよい。
【0049】
レーザアセンブリ
レーザアセンブリデュアルレーザシステムのＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は両方とも固体状態であり、広範囲の応用のために異なる波長および異なるエネルギーでレーザビームを放出する。ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は、単細胞または細胞の小群を捕捉し、複雑な多細胞形状を顕微解剖し、大きな組織領域を抽出し、凍結切片、パラフィン包埋切片、および生細胞を含む（したがって、任意選択で、ライブセル応用のための位相差およびＤＩＣオプションを含んでもよい）、種々の組織試料とともに使用することができる。一実施形態によれば、ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は両方とも、顕微鏡３２の光軸３９の外側に配置され、固定レーザ焦点を有する。
レーザアセンブリデュアルレーザシステムのＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は両方とも固体状態であり、広範囲の応用のために異なる波長および異なるエネルギーでレーザビームを放出する。ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は、単細胞または細胞の小群を捕捉し、複雑な多細胞形状を顕微解剖し、大きな組織領域を抽出し、凍結切片、パラフィン包埋切片、および生細胞を含む（したがって、任意選択で、ライブセル応用のための位相差およびＤＩＣオプションを含んでもよい）、種々の組織試料とともに使用することができる。一実施形態によれば、ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は両方とも、顕微鏡３２の光軸３９の外側に配置され、固定レーザ焦点を有する。
【0050】
図７に示すように、ＵＶレーザアセンブリ４０は、組織試料の観察領域にＵＶレーザビーム４２を送達し、放出し、または出力するように構成されるＵＶレーザ４１（ＵＶレーザヘッド内にあってもよい）（例えば、ＵＶレーザエミッタ）を備える。ＵＶレーザビーム４２は、優れた速度および精度を提供し、高密度組織構造（特に、多数の細胞が採取される場合）を顕微解剖するのに、およびその小さいスポットサイズ（ＩＲレーザビーム６２に対して）を前提として単細胞または細胞下構造を迅速に捕捉するのによく適している。顕微鏡３２に対するＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０の位置決め（本明細書でさらに説明されるような、レーザビーム４２、６２を顕微鏡３２のタワーまたは光軸３９内の位置決めのように）により、より短いＵＶ波長による分解能の増加が可能になり、したがって、単一の細胞および少数の細胞のために捕捉サイズをより小さくできる。様々な実施形態によれば、ＵＶレーザビーム４２は、３５５ナノメートル（ｎｍ）の波長を有することができる。一実施形態によれば、ＵＶレーザビーム４２の直径は、約８～１２ｍｍとすることができる。
【0051】
組織切断に加えて、ＵＶレーザアセンブリ４０はまた、ＩＲレーザアセンブリ６０の動作と同様に、ＵＶ ＬＣＭを実行するために使用されてもよい。比較すれば、ＵＶレーザを組み込む従来のＬＣＭシステムでは、ＵＶレーザは、直接キャップベースの組織を捕捉するのではなく、組織切断のためにのみ使用される。図５に示される一実施形態によれば、ＵＶレーザアセンブリ４０は、３５５ｎｍ（１９ｋＨｚのパルス周波数および１０ｍＷの電力出力を有する）のTeemPhotonics SNV-20F-10xである。
【0052】
ＵＶレーザアセンブリ４０は、ＵＶレーザ４１から放射されるＵＶレーザビーム４２の方向を変更するように構成された単一のＵＶミラー４４を含む。ＵＶミラー４４は、ＵＶレーザ４１からのＵＶレーザビーム４２の経路をステージ３４に沿って組織試料の観察領域に方向転換するように構成される。したがって、ＵＶレーザビーム４２は、最初にＵＶレーザ４１から第１の方向に放射され、ＵＶレーザ４１とＵＶミラー４４との間で第１の方向に進行し、跳ね返ってＵＶミラー４４によって偏向され（ＵＶレーザビーム４２の経路を方向転換する）、その後、ＵＶミラー４４と、組織試料及びステージ３４との間で第２の方向に進行し、そして、第２の方向に移動しながら組織試料の観察領域に接触する。第１及び第２の方向は、互いに実質的に垂直であってもよく（すなわち、図７～９に示すように、それぞれ水平方向および垂直方向である）、又は互いに斜めの角度であってもよい（図１０に示すように）。
【0053】
ＵＶミラー４４により、ＵＶレーザ４１は、顕微鏡３２内の組織試料の光軸３９の外側に配置できる。ＵＶレーザビーム４２の第１の方向は、ステージ３４の上面と実質的に平行であってもよい（しかし、他の実施形態によれば、ＵＶレーザビーム４２は、最初にステージ３４に対して他の角度で放射されてもよく、それに応じてＵＶミラー４４の角度が調整される）。
【0054】
顕微鏡装置３０の構成に応じて、ＵＶミラー４４は、（ＵＶレーザビーム４２を偏向させながら）特定の波長の光を透過させることができる。例えば、図７に示すように、ＵＶミラー４４は、光軸３９に沿って光源３８（または図１０に示されるスコープ集光ヘッド１３６）と組織試料（又はステージ３４）との間に配置することができる。ＵＶミラー４４はまた、光路及び光軸３９に沿ってＩＲミラー６４の下方に配置される。したがって、ＵＶミラー４４は可視光およびＩＲ光の両方に対して透明であり、可視光およびＩＲ光の両方はＵＶミラー４４を直接通過することができる。一実施形態によれば、ＵＶミラー４４は、CVI Laser Optics Y3-1025-45ミラーとすることができる。ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２は、少なくとも１つの実施形態では、同じ方向に配向される（例えば、図７に示される）。少なくとも１つの実施形態では、ＵＶおよびＩＲレーザアセンブリは、それぞれのＵＶおよびＩＲレーザビームを試料に対して同じ方向に（例えば、同じ角度で）放射するように配向される。
【0055】
図７に示すように、ＩＲレーザアセンブリ６０は、組織試料の観察領域にＩＲレーザビーム６２を送達し、放出し、又は出力するように構成されたＩＲレーザ６１（ＩＲレーザヘッド内にあってもよい）（例えば、ＩＲレーザエミッタ）を含む。ＩＲレーザビーム６２は、標的細胞の生体分子の完全性を保存する穏やかな捕捉技術を提供し、（ＵＶレーザビーム４２に対して）その大きなスポットサイズに起因して比較的大きな細胞集団に対して理想的である。ＩＲレーザビーム６２は超高感度であり、対象となる単一の細胞および小領域を高精度で捕捉するのに特に有利である。図６に示される一実施形態によれば、ＩＲレーザアセンブリ６０は、約８０８ｎｍの波長を有するＩＲレーザビーム６２を送達するThorlabs FPL808S（連続波で２５０ｍＷ）である。一実施形態によれば、ＩＲレーザビーム６２の直径は、約８～１２ｍｍであってもよい。
【0056】
ＩＲレーザアセンブリ６０は、ＩＲレーザ６１から放出されるＩＲレーザビーム６２の方向を変更するように構成された１つのＩＲミラー６４を含む。ＩＲミラー６４は、ＩＲレーザ６１から組織試料へのＩＲレーザビーム６２の経路を、ステージ３４に沿った組織試料の観察領域に方向転換するように構成される。したがって、ＩＲレーザビーム６２は、最初にＩＲレーザ６１から第１の方向に放射され、ＩＲレーザ６１とＩＲミラー６４との間で第１の方向に進行し、跳ね返ってＩＲミラー６４によって偏向され（ＩＲレーザビーム６２の経路を方向転換する）、その後、ＩＲミラー６４と、組織試料及びステージ３４との間で第２の方向に進行し、そして、第２の方向に移動しながら組織試料の観察領域に接触する。第１及び第２の方向は、互いに実質的に垂直であってもよい（すなわち、図７～１０に示すように、それぞれ水平方向および垂直方向である）。
【0057】
ＩＲミラー６４により、ＩＲレーザ６１は、顕微鏡３２内の組織試料の光軸３９の外側に配置できる。ＩＲレーザビーム６２の第１の方向は、ステージ３４の上面と実質的に平行であってもよい（しかし、他の実施形態によれば、ＩＲレーザビーム６２は、最初にステージ３４に対して他の角度で放射されてもよく、それに応じてＩＲミラー６４の角度が調整される）。
【0058】
顕微鏡装置３０の配置に応じて、ＩＲミラー６４は、（ＩＲレーザビーム６２を偏向させながら）特定の波長の光を透過させることができる。例えば、図７に示すように、ＩＲミラー６４は、光軸３９に沿って光源３８（または図１０に示されるスコープ集光ヘッド１３６）と組織試料（又はステージ３４）との間に配置することができる。ＩＲミラー６４は、光路及び光軸３９に沿ってＵＶミラー４４の上方に配置されている。したがって、ＩＲミラー６４は可視光に対して透明であり、可視光はＩＲミラー６４を直接通過することができる。一実施形態によれば、ＩＲミラー６４はThorlabs BB1-E03 ＩＲレーザラインミラーである。特に、Thorlabs BB1 E03 ＩＲレーザラインミラーは可視光に対して透明ではないので、図８に示すような特定の構成に適している。ＩＲレーザビーム６２は、任意選択で、ＩＲレーザ６１からＩＲファイバまたはケーブルを介してＩＲミラー６４に伝送されてもよい。
【0059】
一実施形態によれば、ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０はそれぞれ、１つのミラー（すなわち、ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４をそれぞれ）のみを備える。図９に示すように、ＵＶミラー４４及びＩＲミラー６４は、ミラーマウント５１に取り付けられていてもよい。ミラーマウント５１の各々は、それぞれのＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２を操舵または方向付けるように調整可能であってもよい。例えば、ミラーマウント５１を、したがってＩＲミラー６４を移動させることによって、ＩＲレーザビーム６２が、ＵＶレーザビーム４２と焦点においてコアラインメントされるように移動されてもよい。一実施形態によれば、ミラーマウント５１はThorlabs KCB1ミラーマウントであり、レーザビーム４２、６２をそれらの元の方向に対して約９０°に方向転換するために、ミラー４４、６４が約４５°に位置決めされるように構成される。
【0060】
ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は、任意選択で、それぞれ、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２を同時に放出するように構成されてもよい。ＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２は、それぞれコリメートビームとしてＵＶレーザ４１及びＩＲレーザ６１から水平方向に出射される。ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は、任意選択で、コリメートビームを拡大し、次いでビームを再集光させるための複数の集光レンズを含んでもよく、またはビームエキスパンダを含んでもよい。本明細書でさらに説明するように、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２はそれぞれ、少なくとも１つのレンズ（集光レンズ３６など）を通して集光され、それぞれのミラー４４、６４から偏向出射され、ステージ３４に沿った観察領域に対して垂直に下向きに配向される。
【0061】
図１に示すように、ＵＶレーザアセンブリ４０はＵＶレーザコントローラ４９を備え、ＩＲレーザアセンブリ６０はＩＲレーザコントローラ６９を備える。ＵＶレーザコントローラ４９およびＩＲレーザコントローラ６９は、それぞれ、ＵＶレーザ４１およびＩＲレーザ６１に対して制御（本明細書でさらに説明されるように、コンピュータシステムを介して）および電力供給するように構成され、ＵＶレーザ４１およびＩＲレーザ６１のそれぞれの状態を示す種々のライトインジケータを含んでもよい。ＵＶレーザ４１及びＩＲレーザ６１のバックエンドは、それぞれＵＶレーザコントローラ４９及びＩＲレーザコントローラ６９に接続されている。電源ユニット５９（１２ＶＤＣ電源など）は、ＵＶレーザコントローラ４９およびＩＲレーザコントローラ６９の各々に接続されて、ＵＶレーザコントローラ４９およびＩＲレーザコントローラ６９を介してＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０に電力を供給してもよい。ＵＳＢ制御リレーは、コンピュータシステムからＵＶレーザコントローラ４９およびＩＲレーザコントローラ６９に制御信号を送信してもよい。顕微鏡装置３０は、システムを冷却するためのケースファンをさらに含んでもよい。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＵＶおよびＩＲレーザコントローラ４９、６９の各々は、中央処理装置（ＣＰＵ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１０３を含む。ＣＰＵは、バスラインを介してＲＯＭ及びＲＡＭに接続されている。ＣＰＵは、ＲＯＭまたはメモリに記憶された少なくとも１つの制御プログラムをＲＡＭに格納する。ＣＰＵは、制御プログラムに従って動作することにより、レーザ又は電源の動作を制御する。
【0063】
ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２について、適切なレーザパルス幅は、０～約１秒、好ましくは０～約１００ミリ秒、より好ましくは約５０ミリ秒であり得る。少なくとも１つの実施形態では、ＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２からのパルスは、それらが決して重なり合わないように位相調整される。ＵＶおよびＩＲエネルギーが決して同時に放出されないように、ＩＲレーザビームがオンのときにＵＶレーザビームはオフであってもよく、逆もまた同様である。微量遠心管キャップ上に位置するフィルムにおけるＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２のスポットサイズは、０．１～１００ミクロン、好ましくは１～６０ミクロン、より好ましくは５～３０ミクロンで可変である。これらの範囲は、光学サブシステムを設計するときに比較的好ましい。臨床オペレータの観点からは、最も広いスポットサイズレンジが最も汎用性が高い。５ミクロンのオーダーのスポットサイズレンジの下端点は、単細胞を搬送するのに有用である。
【0064】
ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２は、広い出力レンジを有し得る。例えば、ＵＶまたはＩＲレーザビームの少なくとも１つに１００ミリワットレーザーを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＵＶまたはＩＲレーザビームの少なくとも１つに５０ｍＷレーザを使用することができる。ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２は、ファイバ光結合によって光学サブシステムの残部分に接続することができる。より小さいスポットサイズは、エミッタとして回折限界レーザダイオードの使用および／またはシングルモード光ファイバの使用により得ることができる。シングルモードファイバは、回折限界ビームを可能にする。
【0065】
ＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２のビーム径を変更することで、取得する試料の部分の大きさを調整することができる。初期条件がタイトに集光されている場合には、ビームサイズは、デフォーカスで増加させることができる。初期条件がデフォーカスされている場合には、ビームサイズは、集光によって減少させることができる。焦点の変化は固定量とすることができる。焦点の変化は、可動レンズマウント上の窪みによって、および／または光学ガラスステップによって得ることができる。いずれにしても、光路長を増加／減少させることは、ビームの焦点を変更するために必要とされる効果であり、それによってスポットサイズを変更する。例えば、ビームが１ステップトレッドに当たるように段付きガラスプリズムをビームに挿入すると、光路長が変化し、スポットサイズが変化する。
【0066】
任意選択で、顕微鏡システムは、任意選択のＵＶレーザ切断および落射蛍光を提供するよう拡張可能プラットフォームを含んでもよい。
【0067】
ＬＣＭシステムセットアップ
ＬＣＭシステム２０は、所望の用途およびセットアップ構成に応じて、様々な異なる構成および配置でセットアップされてもよい。図７～図９に示すような様々な実施形態によれば、ＵＶレーザ４１及びＩＲレーザ６１の両方は、顕微鏡３２の光軸３９の外側に（任意選択で、顕微鏡３２の同じ側にあってもよい）配置される。ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４の両方は、顕微鏡３２の光軸３９に沿って、組織資料の観察領域の真上に配置される。ＩＲミラー６４は、光路及び光軸３９に沿ってＵＶミラー４４の真上に配置される。ＵＶミラー４４及びＩＲミラー６４は、互いに直列に配置されており、コンデンサ（集光レンズ３６のような）及び対物レンズ３７を備えている。ＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２の両方は、単一の対物レンズ３７を通過して集光される。
ＬＣＭシステム２０は、所望の用途およびセットアップ構成に応じて、様々な異なる構成および配置でセットアップされてもよい。図７～図９に示すような様々な実施形態によれば、ＵＶレーザ４１及びＩＲレーザ６１の両方は、顕微鏡３２の光軸３９の外側に（任意選択で、顕微鏡３２の同じ側にあってもよい）配置される。ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４の両方は、顕微鏡３２の光軸３９に沿って、組織資料の観察領域の真上に配置される。ＩＲミラー６４は、光路及び光軸３９に沿ってＵＶミラー４４の真上に配置される。ＵＶミラー４４及びＩＲミラー６４は、互いに直列に配置されており、コンデンサ（集光レンズ３６のような）及び対物レンズ３７を備えている。ＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２の両方は、単一の対物レンズ３７を通過して集光される。
【0068】
この構成では、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２がそれぞれのミラー４４、６４によって方向転換された後、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２は、顕微鏡３２の光軸３９に沿ってステージ３４まで互いに平行に延伸する。ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２の両方は、ほぼ垂直の角度で（かつ光軸３９と平行に）組織試料の観察領域およびステージ３４に接触する。ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２を、ステージ３４に沿って（したがってキャップ２４を通って延伸するように）観察領域に垂直の角度で接触するように配置することによって、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２をタイトに集光させることができる。ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４の両方を光軸３９内に位置決めするために（すなわち、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２が、ミラー４４、６４によるそれぞれの方向転換の前後で互いに平行となるように）、ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４は、互いにほぼ同じ角度にある。
【0069】
図７に示す実施形態によれば、光源３８は、集光レンズ３６の上方に配置され、集光レンズは、光路及び光軸３９に沿ってＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４の上方に配置される。対物レンズ３７は、ＵＶミラー４４とキャップ２４（キャップ２４は、ステージ３４の上部に配置されたスライド２６に沿ってその上部に配置されている）との間に配置される。これにより、ＵＶレーザ４１およびＩＲレーザ６１は、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２をそれぞれＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４に向けて出射する。ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４は、それぞれのレーザビーム４２、６２を光軸３９に沿って下方に方向転換し、対物レンズ３７を通過し、キャップ２４を通過し、ステージ３４上のスライド２６上の組織試料の観察領域に至る。光源３８からの可視光は、集光レンズ３６、ＩＲミラー６４、ＵＶミラー４４、対物レンズ３７、キャップ２４を透過して組織試料の観察領域に到達する。図７の構成は、振動に対して比較的耐性があり、対物レンズ３７の底部とステージ３４上の組織試料の頂部との間に充分な作業空間（約１インチなど）を提供する。さらに、図７の設定は、約１．５～２ｍｍの組織試料の観察領域の照明半径を提供する。
【0070】
図８に示される実施形態によれば、ＬＣＭシステム２０は、顕微鏡３２の光源３８が、光軸３９の外側で対物レンズ３７の外側の周りの位置にて延在して照明リングを形成するライトのリングであることを除いて、図７のものと同様の構成を含む。光源３８は対物レンズ３７の外側に沿って配置されているので、光源３８はミラー４４、６４の垂直下方に配置されている。ライトのリングは、任意選択で、拡散器を含んでもよく、および／またはライトのそれぞれは、観察領域の中心を照らすように半径方向内向きに角度付けられてもよい。光のリングは、ステージ３４の上表面の約１．２５インチ上にあり得る。この構成は、ミラー４４、６４の上方に光源を必要としないので、全体的な設定を単純化し、光学部品及び取り付けのコストを低減する。あるいは、光源３８は、光軸３９の外側の他の領域に沿って配置され、ステージ３４に沿って組織試料の観察領域に向けられてもよく、および／または光源３８は、顕微鏡３２上の落射照明ポートの一部であってもよい。
【0071】
図８のセットアップは、光源３８からの照明光線が角度をつけて（真っ直ぐではなく）組織試料および検査対物レンズに入るので、明視野ではなく暗視野の照明を可能にし、それによって、観察される組織試料のコントラストを増大させる。しかしながら、ＬＣＭシステム２０の他の実施形態は、明視野照明を提供してもよい。
【0072】
図９に示す実施形態によれば、ＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２の両方は、それらのそれぞれのミラー４４、６４によって方向転換された後、並進管５２（Thorlabs SMIチューブをその中に通すThorlabs SM1NR1並進チューブなど）を通り、ズームハウジング５３（例えば、そこにねじ込まれたＲＭＳアダプタを有するThorlabs SM1ZMの高精度ズームハウジング）を通り、対物レンズ３７（特に反射対物レンズ）を通り、そして、ステージ３４へ方向転換される。別の対物レンズ３７（特に観察または検査対物レンズ）は、ステージ３４の下方に配置される。一実施形態によれば、対物レンズ３７の下端は、ステージ３４の上面から約３０．５ｍｍの距離Ｄだけ離れていてもよい。参照のために、図９の矢印Ａは、ＬＣＭシステム２０の正面の方向を指している。
【0073】
図９にさらに示すように、ＵＶレーザアセンブリ４０は、ＵＶレーザビーム４２を操作するための様々な異なる構成要素を含んでもよい。例えば、ＵＶレーザアセンブリ４０は、様々なアイリス１４１（例えば、Thorlabs SM05D5 Irisおよび／またはThorlabs SM1D12 Iris）と、アダプタ（例えば、Thorlabs SM05～SMIアダプタ）内で平凹レンズ１４３（例えば、焦点距離－１２ｍｍレンズを備えるThorlabs LC4291-UV、または焦点距離－２０ｍｍレンズを備えるThorlabs LC4924-UV）を有するズームレンズチューブ１４２（例えば、Thorlabs SM1NR05ズームレンズ）と、ジンバルマウント１４４（例えば、Thorlabs GMBIOOジンバルマウント）と、チューブ１４５（例えば、４インチThorlabs SMIチューブ）と、平凸レンズ１４７（例えば、１インチのThorlabs LA4924-UV、ＵＶコーティングされた平凸レンズで約１７５ｍｍの焦点距離を有する）を有するレンズチューブ１４６（例えば、Thorlabs SM1L30C開放側レンズチューブ）と、を含んでもよい。ＵＶレーザ４１からＵＶレーザビーム４２が出射されると、ＵＶレーザビーム４２は、第１アイリス１４１、ズームレンズチューブ１４２内の平凹レンズ１４３、第２アイリス１４１、ジンバルマウント１４４、チューブ１４５、レンズチューブ１４６内の平凸レンズ１４７を通ってＵＶミラー４４に至り、このポイントで、ＵＶレーザビーム４２の方向は、ステージ３４に向かって下方に方向転換される。種々のレンズは、３５５ｎｍの光を透過することができるＵＶ溶融シリカ又はＮ－ＢＫ７で作成されてもよい。
【0074】
また、図９に示すように、ＩＲレーザアセンブリ６０は、ＩＲレーザビーム６２を操作するための様々な異なる構成要素を含んでもよい。例えば、ＩＲレーザアセンブリ６０は、トリプレットコリメータ１６２（例えば、Thorlabs TC25APC-850トリプレットコリメータ）、レンズチューブ１６３（例えば、Thorlabs SMI L05レンズチューブ）、およびビームエキスパンダ１６４（例えば、Thorlabs GBE02-B ２倍ビームエキスパンダ）を備える５軸運動学的コリメータマウント１６１（例えば、Thorlabs K5X1運動学的マウントなど）を含んでもよい。ＩＲレーザビーム６２がＩＲレーザ６１から放射されると、ＩＲレーザビーム６２は、コリメータマウント１６１内のトリプレットコリメータ１６２を通り、レンズチューブ１６３を通り、ビームエキスパンダ１６４を通り、ＩＲミラー６４まで進み、このポイントで、ＩＲレーザビーム６２の方向は、ステージ３４に向かって下向きに方向転換される。
【0075】
別の実施形態によれば、ＩＲレーザアセンブリ６０は、ＩＲミラー６４などのＩＲミラーを含まなくてもよい。代わりに、ＩＲレーザビーム６２は、光軸３９に平行かつそれに沿って直接ＩＲレーザ６１から（例えば、ＩＲファイバから）放出されてもよい。したがって、トリプレットコリメータ１６２（コリメータマウント１６１を有する）は、エキスパンダ（例えば、単なる例として、約１１ｍｍの幅を有するＩＲレーザビーム６２のための２倍エキスパンダ）上に直接ねじ込みされ、トリプレットコリメータ１６２が対物レンズ３７（すなわち、反射対物レンズ）を通って光軸３９に沿って直接下を向くように垂直に取り付けられてもよい。
【0076】
図１０は、別の実施形態を示しており、この実施形態においては、ＩＲミラー６４のみが顕微鏡３２の光軸３９に沿って（そして、スコープ集光ヘッド１３６からステージ３４上の組織試料の観察領域への可視光の柱状部内に入る）、スコープ集光ヘッド１３６の真下かつ組織試料の観察領域の真上に配置される。ＵＶミラー４４は、光軸３９の外側（スコープ集光ヘッド１３６からの可視光の柱状部の外側）に配置され、集光ヘッド１３６の真下でなく、かつ、組織試料の観察領域の真上でないように配置される。したがって、ＩＲレーザビーム６２は、ＩＲミラー６４によって方向転換された後、光軸３９に沿ってステージ３４まで延伸し、ほぼ直角に（かつ光軸３９と平行に）組織試料の観察領域およびステージ３４に接触する。しかしながら、ＵＶレーザビーム４２は、ＵＶミラー４４によって方向転換された後、光軸３９に沿って延伸せず、代わりに、光軸３９及びＩＲレーザビーム６２に対して非平行な角度で延伸し、斜角で組織試料の観察領域及びステージ３４に接触する。ＵＶレーザアセンブリ４０を、ＵＶレーザビーム４２がステージ３４に沿った観察領域に斜角で接触するように配置することによって、ユーザは、ＵＶレーザビーム４２の効果をより容易にリアルタイムで見ることができる。ＵＶミラー４４を光軸３９の外側に配置する（そして、ＵＶレーザビーム４２は、それぞれの方向転換の後にＩＲレーザビーム６２に対して角度をなす）ために、ＵＶミラー４４はＩＲミラー６４とは異なる角度にある。
【0077】
図１０の実施形態では、ＵＶレーザ４１及びＩＲレーザダイオード６１の両方は、顕微鏡３２の光軸３９の外側に配置される。ＵＶレーザ４１及びＩＲレーザ６１は、顕微鏡３２の異なる面に沿って配置されてもよい。ＵＶレーザ４１およびＩＲレーザ６１は顕微鏡３２の両側に示されているが、ＵＶレーザ４１およびＩＲレーザ６１は、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２が互いに接触するのを防ぐために、光軸３９の周りで互いに約９０°をなすように位置付けられてもよい（少なくとも部分的に顕微鏡３２の後ろに配置されてもよい）。
【0078】
図１０に示すように、この構成では、ＵＶレーザアセンブリ４０は、ＵＶレーザビーム４２を操作するための様々な異なる構成要素も含んでもよい。例えば、ＵＶレーザアセンブリ４０は、ＵＶレーザビーム４２がＵＶミラー４４に到達する前に方向転換されるアクロマティックダブレット２４３（例えば、Thorlabs ACA254-200、１インチのＵＶアクロマティックダブレットであり、焦点距離は約２００ｍｍである）を有する調節可能なテレスコープレンズチューブ２４２（例えば、Thorlabs SMIチューブがその中にねじ込まれているThorlabs SM1NR1調節可能な調整レンズチューブ）を含んでもよい。この構成では、ＵＶミラー４４は、Thorlabs NB1-K07 ＵＶレーザダインミラーであってもよい。ＵＶレーザビーム４２がＵＶレーザ４１から放出されると、ＵＶレーザビーム４２は、テレスコープレンズチューブ２４２内のアクロマティックダブレット２４３を通過し、ＵＶミラー４４に移動し、それから跳ね返り、そのポイントで、ＵＶレーザビーム４２の方向は、観察領域に向かってステージ３４に向かって下向きに方向転換または偏向される。
【0079】
また、図１０に示すように、ＩＲレーザアセンブリ６０は、ＩＲレーザビーム６２を操作するための様々な異なる構成要素を含んでもよい。例えば、ＩＲレーザアセンブリ６０は、トリプレットコリメータ１６２を有するコリメータマウント１６１と、ＩＲレーザビーム６２がＩＲミラー６４に到達する前に方向転換されるアクロマティックダブレット２６３（例えば、Thorlabs ACA254-200、１インチのＩＲアクロマティックダブレットであり、焦点距離は約２００ｍｍである）を有するテレスコープレンズチューブ２４２とを含んでもよい。この構成では、ＩＲミラー６４は、Thorlabs DMSP750Bダイクロイックミラーなどの、ＩＲ光を反射し、可視光に対して透明であるダイクロイックミラーとすることができる。ＩＲレーザビーム６２がＩＲレーザ６１から（及びファイバを通って）放射されると、ＩＲレーザビーム６２は、コリメータマウント１６１内のトリプレットコリメータ１６２（一実施形態によれば、約５．４ｍｍの出射ビームサイズを有する）を通過し、テレスコープレンズチューブ２４２内のアクロマティックダブレット２６３を通過し、次いでＩＲミラー６４に移動し、ＩＲミラーから跳ね返り、このポイントで、ＩＲレーザビーム６２の方向は、観察領域に対してステージ３４に向かって下向きに方向転換又は偏向される。
【0080】
図１０に示す実施形態では、顕微鏡３２は、光軸３９に沿ってかつステージ３４に向かう光の経路に沿ってＩＲミラー６４（ＩＲミラー６４は、集光レンズ３６とステージ３４との間に配置される）の上方に位置するスコープ集光ヘッド１３６を含む。対物レンズ３７は、ステージ３４の下方に配置されている。一実施形態によれば、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２はそれぞれのミラー４４、６４によって方向転換される前に、それぞれ、ステージ３４の約３インチ上の距離Ｄ２にあってもよい。
【0081】
一実施形態によれば、図１０のセットアップにおけるＵＶレーザビーム４２の直径は、約１ｍｍのように比較的小さくてもよい。アクロマティックダブレット２４３の焦点距離は比較的大きい（すなわち、約２００ｍｍ）ので、焦点は比較的大きく、焦点の周りのウエスト直径は約９０μｍであり、テレスコープレンズチューブ２４２の並進に鈍感である。
【0082】
アクロマティックダブレット２４３および２６３は、レーザビーム４２、６２が、それぞれのミラー４４、６４に接触する前に集光されることを可能にする。あるいは、アクロマティックダブレット２４３および２６３の代わりに、非球面物体（例えば、Thorlabs AL50100H-B、２インチ非球面レンズ）を使用してもよい。
【0083】
一実施形態によれば、顕微鏡装置３０は、ＵＶレーザアセンブリ４０を含まなくてもよく、その唯一のレーザ源としてＩＲレーザアセンブリ６０のみを含んでもよい。ＩＲレーザアセンブリ６０は、本明細書に記載される様々な構成、構成要素、及び特徴のいずれかを有し得る。
【0084】
【0085】
ＬＣＭシステム動作
ＬＣＭシステム２０においてＬＣＭを実行および操作するために（特に、組織試料から標的細胞を除去するために）、スライドが準備され（そして、任意選択で組織試料が染色される）、そして、組織試料が顕微鏡３２のステージ３４上に取り付けまたは配置され、そして、対象の標的細胞を特定するために顕微鏡３２を通して（任意選択で、関連するコンピュータモニタを通して）視覚的に検査される。レーザ切開によって組織試料の残部分から切開および除去される組織試料の標的細胞は、組織試料のどの部分が顕微切開されるべきかを指定するために、位置特定され、選択され、輪郭が描かれ、トレースされる（例えば、フリーハンド描画ツールを有するコンピュータモニタ上で）。顕微鏡３２のステージ３４は、標的細胞をＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２の経路に配置するために、顕微鏡３２の残部分（及び顕微鏡装置３０の残部分）に対して水平面に沿って（組織試料と共に）移動される。操作者は、キャップホルダまたはアーム上にキャップ２４（フィルムを含む）を手動で配置してもよく、キャップ２４は、組織試料（およびスライド２６）上に押圧または配置される。ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は、任意選択で、試験焼成されてもよい。
ＬＣＭシステム２０においてＬＣＭを実行および操作するために（特に、組織試料から標的細胞を除去するために）、スライドが準備され（そして、任意選択で組織試料が染色される）、そして、組織試料が顕微鏡３２のステージ３４上に取り付けまたは配置され、そして、対象の標的細胞を特定するために顕微鏡３２を通して（任意選択で、関連するコンピュータモニタを通して）視覚的に検査される。レーザ切開によって組織試料の残部分から切開および除去される組織試料の標的細胞は、組織試料のどの部分が顕微切開されるべきかを指定するために、位置特定され、選択され、輪郭が描かれ、トレースされる（例えば、フリーハンド描画ツールを有するコンピュータモニタ上で）。顕微鏡３２のステージ３４は、標的細胞をＵＶレーザビーム４２及びＩＲレーザビーム６２の経路に配置するために、顕微鏡３２の残部分（及び顕微鏡装置３０の残部分）に対して水平面に沿って（組織試料と共に）移動される。操作者は、キャップホルダまたはアーム上にキャップ２４（フィルムを含む）を手動で配置してもよく、キャップ２４は、組織試料（およびスライド２６）上に押圧または配置される。ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０は、任意選択で、試験焼成されてもよい。
【0086】
ソフトウェアを介して、オペレータは、ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０を操作し、それぞれから、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２を組織試料の観察領域に放射する（一実施形態によれば透視照明ピラーを介する）。本明細書でさらに説明するように、ＵＶミラー４４およびＩＲミラー６４はそれぞれＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２の方向を変化させて、ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２がそれぞれＵＶレーザ４１およびＩＲレーザ６１から組織試料の観察領域に進行する。ＵＶレーザビーム４２およびＩＲレーザビーム６２は、キャップ表面を溶融または軟化させ、これは、組織試料の曝露部分（すなわち、標的細胞）をキャップ２４に接着させ、それによって、キャップ２４上への組織試料の選択された部分（すなわち、標的細胞）の捕捉を可能にする。次いで、キャップ２４（標的細胞をキャップ２４に付着または接着されている）は、手動で組織試料から除去され、これは、組織試料の残部分から標的細胞を離昇または除去する。次いで、キャップ上の顕微解剖された材料は、捕捉された材料の肯定的同定およびその後の下流での分析のために、検査される。
【0087】
その後、キャップ２４（標的細胞が付着している）をエッペンドルフチューブ（例えば、０．５ミリリットル（ｍＬ）エッペンドルフチューブ）に取り付けることができ、次いで、これを下流での応用のための試薬キット（例えば、遺伝子発現またはＤＮＡ配列決定などの下流分子分析のためのＤＮＡまたはＲＮＡの抽出）を用いて利用され得る。
【0088】
コンピュータシステム
顕微鏡装置３０はさらに、コンピュータ、ソフトウェア、およびディスプレイ（例えば、タッチセンサ式画面インターフェース（例えば、無線タブレット））を含むコンピュータシステム等の種々のユーザ入力および制御デバイスを備えてもよい。顕微鏡装置３０の全ての構成要素は、コンピュータシステムのソフトウェアと完全に統合されてもよい。顕微鏡３２、ＵＶレーザアセンブリ４０、及びＩＲレーザアセンブリ６０は、コンピュータシステムに接続し、コンピュータシステムによって制御されてもよい。
顕微鏡装置３０はさらに、コンピュータ、ソフトウェア、およびディスプレイ（例えば、タッチセンサ式画面インターフェース（例えば、無線タブレット））を含むコンピュータシステム等の種々のユーザ入力および制御デバイスを備えてもよい。顕微鏡装置３０の全ての構成要素は、コンピュータシステムのソフトウェアと完全に統合されてもよい。顕微鏡３２、ＵＶレーザアセンブリ４０、及びＩＲレーザアセンブリ６０は、コンピュータシステムに接続し、コンピュータシステムによって制御されてもよい。
【0089】
コンピュータシステムは、ユーザがＬＣＭシステムを制御することを可能にしてもよい。例えば、コンピュータシステムを通して、ユーザは、カメラ３５を用いて（例えば、ＦＬＩＲカメラ用のSpinnakerソフトウェア開発キット（ＳＤＫ）を使用して）顕微鏡３２から写真または画像を撮ることができる。
【0090】
ユーザはまた、コンピュータシステムを使用して、静止画像を通して、またはリアルタイムで、組織試料上の標的細胞を単純に選択（例えば、フリーハンドで、または長方形もしくは円形などの単純な形状を介する）してもよい。コンピュータシステムは、ユーザが、標的細胞上にレーザ直径に対応する単一のＩＲスポットを配置することを可能にし、捕捉された面積およびレーザの直径を測定するための測定ツールを組み込んでいる。コンピュータシステムはまた、ユーザが、顕微鏡装置３０が選択された標的細胞に対してどの切断オプションを実行するかを選択することを可能にする。特に、コンピュータシステムを通して、ユーザは、ＩＲ ＬＣＭ、ＵＶ切断、および／またはＵＶ ＬＣＭを行うように顕微鏡装置３０に命令することができる。
【0091】
コンピュータシステムは、ＵＶレーザビーム４２のサイズを手動で評価することを可能にし、ＩＲレーザビーム６２及びＵＶレーザビーム４２の両方を手動又は自動で位置決めすることを可能にする。
【0092】
ユーザが手動でスライド２６をセットアップし、キャップ２４を位置決めし、スライド２６に配向するようにレーザビーム４２、６２を較正すると、ユーザは、ソフトウェアを使用して、どのタイプのスライド２６（例えば、ガラス、ガラス膜、または金属膜）が顕微鏡装置３０上に装填されているかを選択することができる。
【0093】
ユーザはまた、コンピュータシステムを使用し、ＵＳＢリレーコントローラを介して、ＵＶレーザアセンブリ４０およびＩＲレーザアセンブリ６０の両方を制御することができる。ＵＶおよびＩＲレーザアセンブリ４０、６０は、コントローラの特定のスイッチを使用してもよい。例えば、ＩＲレーザアセンブリ６０は、コントローラのスイッチ１～７を使用してもよく、ＵＶレーザアセンブリ４０は、スイッチ８のみをオン／オフスイッチとして使用してもよい。コンピュータシステムはまた、単出力動作によりＩＲレーザビーム６２の出力レベル及び持続時間を制御することができる。コンピュータシステムは、ステージ３４を移動させ、ＩＲレーザビーム６２を発射して、標的細胞のキャップ２４への接着を容易にし、ＵＶレーザビーム４２を発射して、組織試料の選択された輪郭に沿って切断することができる。特に、キャップへの標的細胞の接着は、微小パターン化表面でキャップをパターン化することによって達成され得る。微小パターン化表面は、標的細胞の組織トポグラフィを容易に把持するヤモリの足状に働くファンデルワールス力を利用する。
【0094】
ＬＣＭシステム仕様
ＬＣＭシステム２０の精度は、捕捉のために輪郭が描かれた面積に対する、実際に捕捉された物質（すなわち、標的細胞）の量の比であり、レーザスポットサイズの分解能に相関し得る。正確な結果を提供するために、ＬＣＭシステム２０は、レーザが実際に発射された場所に対して、最初に選択された場所にある標的細胞の１μｍの精度で標的細胞を捕捉する。一実施形態によれば、ＩＲレーザビーム６２のレーザスポットサイズの直径は約５μｍであり、ＵＶレーザビーム４２のレーザスポットサイズの直径は約１μｍ以下である。さらに、顕微鏡３２のステージ３４は、正しい標的細胞が確実に捕捉されるように、約１μｍを超える精度を有する。ＬＣＭシステム２０の精度は、ＩｍａｇｅＪまたは定規測定などのツールを用いた画像分析を介して測定され、その精度は、ＩｍａｇｅＪ分析によって決定されるように、捕捉境界内の標的細胞の約９５％を超える捕捉である。
ＬＣＭシステム２０の精度は、捕捉のために輪郭が描かれた面積に対する、実際に捕捉された物質（すなわち、標的細胞）の量の比であり、レーザスポットサイズの分解能に相関し得る。正確な結果を提供するために、ＬＣＭシステム２０は、レーザが実際に発射された場所に対して、最初に選択された場所にある標的細胞の１μｍの精度で標的細胞を捕捉する。一実施形態によれば、ＩＲレーザビーム６２のレーザスポットサイズの直径は約５μｍであり、ＵＶレーザビーム４２のレーザスポットサイズの直径は約１μｍ以下である。さらに、顕微鏡３２のステージ３４は、正しい標的細胞が確実に捕捉されるように、約１μｍを超える精度を有する。ＬＣＭシステム２０の精度は、ＩｍａｇｅＪまたは定規測定などのツールを用いた画像分析を介して測定され、その精度は、ＩｍａｇｅＪ分析によって決定されるように、捕捉境界内の標的細胞の約９５％を超える捕捉である。
【0095】
ＬＣＭシステム２０の信頼性は、所与の顕微解剖設定および抽出領域を使用して所与の組織試料タイプから所与の量の標的細胞がどのように一貫して抽出されるかである。信頼性はまた、レーザがユーザによって選択された正しい位置で発射する能力を指す。信頼性測定に対する患者間の試料のばらつきの影響を低減するために、およびこの組織を使用した測定を標準化するために、固定単層培養細胞または固定培養細胞のブロックなどの標準的な組織試料タイプを使用して、ＬＣＭシステム２０の信頼性が測定され得る。所与の抽出領域を用いて所与の設定でこの標準組織試料タイプを抽出する場合、捕捉された物質の量は約５％を超えて変化しない。
【0096】
ＬＣＭシステム２０の感度は、所与の量の顕微解剖された組織からのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の定量可能な量である。所定数の抽出された細胞から得られたＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質含量の総量を定量化し、Bradfordアッセイを使用して総タンパク質含量分析を実施することによって、感度を測定することができる。少なくとも１０００個の細胞の複数の組織タイプから抽出された総タンパク質は、所定のカットオフ値より大きいであろう。
【0097】
ＬＣＭシステム２０の領域あたりの組織総収率は、Thermo FischerによるＩＲ ＬＣＭと比較して、スポットあたりの組織捕捉で約３０％超良好な収率であり、その収率はLeica、Zeiss、およびThermo FischerによるUV切断とほぼ等しい。
【0098】
例示的な仕様
表１は、様々な実施形態における、ＬＣＭシステム２０内で使用され得る様々な値の例示的な仕様を提供する。
表１は、様々な実施形態における、ＬＣＭシステム２０内で使用され得る様々な値の例示的な仕様を提供する。
【表1】
【0099】
表２もまた、様々な実施形態における、ＬＣＭシステム２０内で使用され得る様々な値の例示的な仕様を提供する。
【表2】
【0100】
表３は、様々な実施形態による、ＬＣＭシステム２０内で使用され得る例示的な部品（ならびにそれらのそれぞれのモデルおよびブランド）を提供する。示されるように、例示的なパーツは、ＬＣＭシステム２０内で様々な機能を実行するために含まれてもよい。
【表3】
【0101】
本明細書で使用される場合、用語「およそ」、「約」、「実質的に」および類似の用語は、本開示の主題が関係する当業者による共通のかつ受け入れられた使用と調和する広い意味を有することが意図され、同定された値からの分散の少なくとも最小レベルを含むと解釈されるべきである。本開示を検討する当業者は、これらの用語が、これらの特徴の範囲を、提供される正確な数値範囲に限定することなく、記載される特定の特徴の説明を可能にすることを意図することを理解されたい。したがって、これらの用語は、説明される主題の実質的でないまたは重要でない修正または変更が本開示の範囲内にあると見なされることを示すものとして解釈されるべきである。
【0102】
本明細書で使用される用語「結合された」、「接続された」、「取り付けられた」などは、２つの部材を互いに直接接合することを意味する。そのような接合は、静止（例えば、恒久的）または可動（例えば、取り外し可能または解放可能）であってもよい。
【0103】
本明細書における要素の位置（例えば、「上」、「下」、「上」、「下」など）への言及は、図における様々な要素の向きを説明するために使用されるにすぎない。種々の要素の配向は、他の例示的実施形態に従って異なり得、そのような変形例は、本開示によって包含されることが意図されることに留意されたい。
【0104】
様々な例示的な実施形態の構成および配置は例示にすぎないことに留意することが重要である。本開示では少数の実施形態のみが詳細に説明されているが、本開示を検討する当業者は、本明細書で説明される主題の新規の教示および利点から実質的に逸脱することなく、多くの修正（例えば、様々な要素のサイズ、寸法、構造、形状および比率、パラメータの値、取り付け配置、材料の使用、色、向きなどの変動。）が可能であることを容易に理解するであろう。例えば、要素の位置は、逆転または別様に変更されてもよく、別個の要素または位置の性質または数は、変更または変更されてもよい。任意のプロセスまたは方法ステップの順序またはシーケンスは、代替実施形態に従って、変更または再配列されてもよい。他の置換、修正、変更、および省略もまた、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の例示的実施形態の設計、動作条件、および配置において行われてもよい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【国際調査報告】