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特表2023-503046ポンペ病およびリソソーム障害を処置するための肝臓特異的プロモーターを含む治療用アデノ随伴ウイルス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-26
(54)【発明の名称】ポンペ病およびリソソーム障害を処置するための肝臓特異的プロモーターを含む治療用アデノ随伴ウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20230119BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230119BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20230119BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230119BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230119BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230119BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230119BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230119BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230119BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230119BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20230119BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/56
C12N15/62 Z
A61K35/76
A61P21/00
A61P9/00
A61P11/00
A61K48/00
A61K31/7088
A61K38/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022529007
(86)(22)【出願日】2020-11-19
(85)【翻訳文提出日】2022-07-15
(86)【国際出願番号】 US2020061223
(87)【国際公開番号】W WO2021102107
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】62/937,583
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/937,556
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/023,570
(32)【優先日】2020-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520375033
【氏名又は名称】アスクレピオス バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ロバーツ， マイケル
(72)【発明者】
【氏名】イグレシアス， フアン マヌエル
(72)【発明者】
【氏名】トレチャコヴァ， アンナ
(72)【発明者】
【氏名】オカラガン， マイケル ダブリュー．
(72)【発明者】
【氏名】フランソワ， アキッレ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084BA44
4C084CA18
4C084CA33
4C084DC22
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA36
4C084ZA59
4C084ZA94
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA59
4C086ZA94
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA55
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZA59
4C087ZA94
(57)【要約】
肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）に動作可能に連結された、リソソームタンパク質、例えば、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド、ならびに必要に応じてシグナルペプチドおよび／または必要に応じて標的配列、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする異種核酸を含むｒＡＶＶゲノムを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであって、ＧＡＡポリペプチドが肝臓から分泌され、リソソームを標的にするのを可能にする、ｒＡＡＶベクター。特定の実施形態は、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードし、肝臓分泌シグナルペプチド、およびカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体に結合するＩＧＦ２標的化ポリペプチドを有し、ＧＡＡポリペプチドのリソソームへの適当な細胞内局在化を可能にする、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
そのゲノム中に、ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに
ｂ．前記５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、前記異種核酸が、
ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれか１つから選択される肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列
を含む組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
【請求項2】
前記異種核酸配列が、前記ＧＡＡポリペプチドに融合された分泌シグナルを含む融合タンパク質をコードするか、または前記ＧＡＡポリペプチドに融合された標的化ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするか、または前記ＧＡＡポリペプチドに融合された分泌シグナルおよび標的化ペプチドを含む融合タンパク質をコードする、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項3】
前記ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、ａ．５’ＩＴＲ、
ｂ．肝臓特異的プロモーター配列、
ｃ．イントロン配列、
ｄ．分泌シグナルペプチドをコードする核酸、
ｅ．ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、
ｆ．アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、
ｇ．ポリＡ配列、および
ｈ．３’ＩＴＲ
を含む、請求項２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項4】
前記分泌シグナルペプチドをコードする核酸が、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡリーダー配列、ＩＬ－２ ｗｔリーダー配列、改変ＩＬ－２リーダー配列、ＩＬ２（１－３）リーダー配列、ＩｇＧリーダー配列、ＡＡＴリーダー配列、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片のいずれかから選択されるシグナル配列をコードする、請求項１～３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項5】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドが、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）もしくはＩＧＦ２受容体と結合する、請求項１～３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項6】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５を含むか、またはＩＧＦ２受容体と結合する配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変を含む、請求項５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項7】
配列番号５における前記少なくとも１つのアミノ改変が、Ｖ４３Ｍアミノ酸改変（配列番号８または配列番号９）、またはΔ２～７（配列番号６）、またはΔ１～７（配列番号７）である、請求項６に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項8】
前記核酸配列が、野生型ＧＡＡポリペプチド、または改変ＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項9】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、請求項１～８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項10】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためのコドン最適化、（ｉｉ）ＣｐＧアイランドの低減、（ｉｉｉ）ＳＴＯＰ配列の改変、（ｉｖ）代替リーディングフレームの低減、および（ｖ）自然免疫応答の低減のいずれか１つまたは複数のために配列番号１１から改変されている、請求項１～９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項11】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項１～１０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項12】
コードされた前記融合ポリペプチドが、前記ＧＡＡポリペプチドのアミノ末端および前記ＩＧＦ２標的化ペプチドのＣ末端に位置する少なくとも１個のアミノ酸のためのヌクレオチド配列を含むスペーサーをさらに含む、請求項１～１１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項13】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸および前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の間に位置する少なくとも１個のアミノ酸のスペーサーをコードする核酸をさらに含む、請求項１２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項14】
前記ＧＡＡ遺伝子をコードする核酸の３’および前記３’ＩＴＲ配列の５’に位置する少なくとも１つのポリＡ配列をさらに含む、請求項１～１３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項15】
前記異種核酸配列が、前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の３’および前記３’ＩＴＲ配列の５’に位置する、コラーゲン安定性（ＣＳ）配列、または３’ＵＴＲ配列、またはＣＳおよび３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項１～１４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項16】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸および前記ポリＡ配列の間に位置する、コラーゲン安定性（ＣＳ）配列、または３’ＵＴＲ配列、またはＣＳおよび３’ＵＴＲ配列をコードする核酸をさらに含む、請求項１～１５に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項17】
分泌シグナルペプチドをコードする配列の５’および前記プロモーターの３’に位置するイントロン配列をさらに含む、請求項１～１６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項18】
前記イントロン配列が、ＭＶＭ配列、またはＨＢＢ２配列、またはＳＶ４０配列を含む、請求項１７に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項19】
前記ＩＴＲが、挿入、欠失、または置換を含む、請求項１～１８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項20】
前記ＩＴＲにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドが除去されている、請求項１９に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項21】
ａ．前記分泌シグナルペプチドをコードする核酸が、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７～２２と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１８～２１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７５と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号２２と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
からなる群のいずれかから選択され；
ｂ．前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２、または配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群のいずれかから選択される、
請求項１～２０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項22】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のいずれかから選択される、請求項１～２１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項23】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸が、分泌シグナルペプチドをコードする核酸および前記アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸の間に位置する、請求項１～２２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項24】
キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、請求項１～２３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項25】
合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、請求項１～２４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項26】
ＡＡＶＸＬ３２ベクター、ＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、ＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターからなる群から選択される、請求項１～２５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項27】
血清型がＡＡＶ３ｂである、請求項１～２６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項28】
前記ＡＡＶ３ｂ血清型が、２６５Ｄ、５４９Ａ、Ｑ２６３Ｙのいずれかから選択されるカプシドタンパク質における１つまたは複数の変異を含む、請求項２７に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項29】
前記ＡＡＶ３ｂ血清型が、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａ、ＡＡＶ３ｂ５４９ＡもしくはＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙ、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧのいずれかから選択される、請求項２８に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項30】
そのゲノム中に、ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに
ｂ．前記５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、前記異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されており、前記肝臓特異的プロモーターが、
ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれかから選択される、異種核酸配列
を含む組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、
血清型ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ８から選択されるカプシドタンパク質を含む、
組換えＡＡＶベクター。
【請求項31】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記異種核酸配列が、前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸の５’に位置する分泌シグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項３０に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項32】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記異種核酸配列が、分泌シグナルペプチドをコードする前記核酸および前記アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする前記核酸の間に位置する標的化ペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項３１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項33】
前記ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、ａ．５’ＩＴＲ、
ｂ．肝臓特異的プロモーター配列、
ｃ．イントロン配列、
ｄ．分泌シグナルペプチドをコードする核酸、
ｅ．アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、
ｆ．ポリＡ配列、および
ｇ．３’ＩＴＲ
を含む、請求項３０に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項34】
前記ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、ａ．５’ＩＴＲ、
ｂ．肝臓特異的プロモーター配列、
ｃ．イントロン配列、
ｄ．標的化ペプチドをコードする核酸、
ｅ．アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、
ｆ．ポリＡ配列、および
ｇ．３’ＩＴＲ
を含む、請求項３０に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項35】
前記分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡリーダー配列、ＩＬ－２ ｗｔリーダー配列、改変ＩＬ－２リーダー配列、ＩＬ２（１－３）リーダー配列、ＩｇＧリーダー配列、ＡＡＴリーダー配列、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片のいずれかから選択される、請求項３０～３４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項36】
前記標的化ペプチドが、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）もしくはＩＧＦ２受容体と結合するＩＧＦ２標的化ペプチド配列、またはそれらの機能的バリアントのいずれかから選択される、請求項３０～３５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項37】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５を含むか、または前記ＣＩ－ＭＰＲ受容体との結合に影響を与えない、もしくは少なくとも１つの血清ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）との結合を減少させる配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変を含むか、または配列番号５と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項38】
前記核酸配列が、配列番号１０の野生型ＧＡＡポリペプチド、または改変ＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項３０～３７に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項39】
前記核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項３０～３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項40】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、請求項３０～３９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項41】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、請求項３０～４０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項42】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつ自然免疫応答を低減するように、コドン最適化されている、請求項３０～４１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項43】
前記イントロン配列が、ＭＶＭ配列またはＨＢＢ２配列を含む、請求項３０～４２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項44】
前記ＩＴＲが、挿入、欠失もしくは置換を含むか、または前記ＣｐＧアイランドのいずれか１つもしくは複数が、除去されている、請求項３０～４３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項45】
ＡＡＶＸＬ３２、またはＡＡＶＸＬ３２．１、またはＡＡＶ８、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、請求項４４に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項46】
ａ．前記分泌シグナルペプチドをコードする核酸が、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７～２２と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１８～２１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７５と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号２２と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１７９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸；
変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片、例えば、配列番号１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
からなる群のいずれかから選択され；
ｂ．前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２、または配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群のいずれかから選択されるか、あるいは配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を有する前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列である、
請求項３０～４５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項47】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９のいずれかから選択される、請求項３０～４６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項48】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号８もしくは配列番号９、またはそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有する機能的バリアントである、請求項３０～４７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項49】
薬学的に許容される担体中に前の請求項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
【請求項50】
ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む核酸配列であって、前記肝臓特異的プロモーターが以下の肝臓特異的プロモーターのいずれか１つから選択され、前記肝臓特異的プロモーターが、ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、または
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれかから選択される、
核酸配列。
【請求項51】
組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターゲノムのための核酸配列であって、ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）核酸配列、ならびに
ｂ．前記５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、前記異種核酸配列が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されており、前記肝臓特異的プロモーターが、
ｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
の肝臓特異的プロモーターのいずれか１つから選択される、異種核酸配列
を含む、核酸配列。
【請求項52】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、前記分泌シグナルペプチドおよび前記アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、請求項５０または５１に記載の核酸配列。
【請求項53】
前記分泌シグナルをコードする核酸が、配列番号１７、２２～２６、１７７、１７９、１８１、またはそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸のいずれかから選択される、請求項５０～５２に記載の核酸配列。
【請求項54】
前記ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸が、配列番号２（ＩＧＦ２－Δ２～７）、配列番号３（ＩＧＦ２－Δ１～７）もしくは配列番号４（ＩＧＦ２ Ｖ４３Ｍ）、またはそれらと少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸のいずれかから選択される、請求項５０に記載の核酸配列。
【請求項55】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、請求項５０～５４に記載の核酸配列。
【請求項56】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためのコドン最適化、（ｉｉ）ＣｐＧアイランドの低減、（ｉｉｉ）ＳＴＯＰ配列の改変、（ｉｖ）代替リーディングフレームの低減、および（ｖ）自然免疫応答の低減のいずれか１つまたは複数のために配列番号１１から改変されている、請求項５５に記載の核酸配列。
【請求項57】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するように、もしくは自然免疫応答を低減するように、もしくはＣｐＧアイランドを低減し、かつ自然免疫応答を低減するように、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のために、コドン最適化されている、請求項５５に記載の核酸配列。
【請求項58】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする前記核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、請求項５０～５７に記載の核酸配列。
【請求項59】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１１（全長ｈＧＡＡ）、配列番号５５（Ｄｗｉｇｈｔ ｃＤＮＡ）、配列番号５６（ｈＧＡＡ Δ１～６６）、または配列番号８２（ｍｏｄ＿ｈＧＡＡ）、または配列番号１８２、それらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかから選択される、請求項５０～５８に記載の核酸配列。
【請求項60】
前記ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号７４（コドン最適化１）、配列番号７５（コドン最適化２）、配列番号７６（コドン最適化３）、および配列番号８２（ｍｏｄ＿ｈＧＡＡ）、それらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかから選択される、請求項５０～５８に記載の核酸配列。
【請求項61】
前記核酸が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、請求項５０～５８に記載の核酸配列。
【請求項62】
グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型（ＧＳＤ ＩＩ、ポンペ病、酸性マルターゼ欠損症）を有するか、またはアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドにおける欠損を有する対象を処置するための方法であって、先の請求項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項63】
ＧＡＡポリペプチドが、前記対象の肝臓から分泌され、分泌されたＧＡＡの骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せによる取り込みがあり、前記分泌されたＧＡＡの取り込みが、前記組織中のリソソームグリコーゲン貯蔵の低減をもたらす、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記対象に投与する前記ステップが、筋肉内、皮下、脊髄内、大槽内、髄腔内、静脈内の投与のいずれかから選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項65】
前記組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項66】
前記組換えＡＡＶベクターが、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項67】
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、またはＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項68】
前記組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ８ベクターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項69】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を有する対象を処置するための方法であって、先の請求項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを前記対象に投与するステップを含み、前記ＡＡＶベクターが、表５Ｂまたは表６Ｂにおける任意のポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現する、方法。
【請求項70】
前記リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が、表５Ａまたは表６Ａにリストされるもののいずれかから選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項72】
前記組換えＡＡＶベクターが、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項73】
前記組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、またはＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本発明は、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２／９３７，５５６号および２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２／９３７，５８３号、ならびに２０２０年５月１２日に出願された米国仮出願第６３／０２３，５７０号の米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張し、それぞれの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２／９３７，５５６号および２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２／９３７，５８３号、ならびに２０２０年５月１２日に出願された米国仮出願第６３／０２３，５７０号の米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張し、それぞれの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。２０２０年１１月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０４６１９２－０９６６００ＷＯＰＴ ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、８４０，１７９バイトのサイズである。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。２０２０年１１月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０４６１９２－０９６６００ＷＯＰＴ ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、８４０，１７９バイトのサイズである。
【0003】
発明の分野
本発明は、例えば、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドなどのリソソーム酵素の標的化移行のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびベクター、ならびに例えばポンペ病などのリソソーム蓄積症およびリソソーム蓄積障害の処置のための使用の方法に関する。
本発明は、例えば、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドなどのリソソーム酵素の標的化移行のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、ビリオンおよびベクター、ならびに例えばポンペ病などのリソソーム蓄積症およびリソソーム蓄積障害の処置のための使用の方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
４０種を超えるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、直接的または間接的に、リソソームにおける１つまたは複数のリソソーム酵素の非存在によって引き起こされる。ＬＳＤのための酵素補充療法が、積極的に推進されている。療法は、一般に、ＬＳＤタンパク質が、Ｍ６Ｐ依存性の様式で、各種の細胞型のリソソームに取り込まれ、送達されることを必要とする。１つの可能性のあるアプローチは、ＬＳＤタンパク質を精製すること、およびＭ６Ｐによる炭水化物部分が組み込まれるようにそれを改変することを含む。この改変された材料は、細胞表面上のＭ６Ｐ受容体との相互作用に起因して、未改変ＬＳＤタンパク質よりも効率的に細胞によって取り込まれ得る。
４０種を超えるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、直接的または間接的に、リソソームにおける１つまたは複数のリソソーム酵素の非存在によって引き起こされる。ＬＳＤのための酵素補充療法が、積極的に推進されている。療法は、一般に、ＬＳＤタンパク質が、Ｍ６Ｐ依存性の様式で、各種の細胞型のリソソームに取り込まれ、送達されることを必要とする。１つの可能性のあるアプローチは、ＬＳＤタンパク質を精製すること、およびＭ６Ｐによる炭水化物部分が組み込まれるようにそれを改変することを含む。この改変された材料は、細胞表面上のＭ６Ｐ受容体との相互作用に起因して、未改変ＬＳＤタンパク質よりも効率的に細胞によって取り込まれ得る。
【0005】
酵素療法の代替または補助として、ＧＳＤ－ＩＩを処置するための遺伝子治療アプローチの実現可能性が調べられている（Amalfitano, A., et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866、Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446、Fraites, T. J., et al., (2002) Mol. Ther. 5:571-578、Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616）。
【0006】
しかしながら、遺伝子、特に、リソソーム蓄積症の処置のためのリソソームタンパク質および酵素のウイルスまたはＡＡＶ送達は課題がある。通常、哺乳動物のリソソーム酵素は、サイトゾル中で合成され、ＥＲを通過し、そこでそれらは、Ｎ連結された高マンノース型炭水化物でグリコシル化される。ゴルジでは、高マンノース炭水化物は、これらのタンパク質をリソソームに標的化するマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）の付加によって、リソソームタンパク質上で改変される。Ｍ６Ｐ改変タンパク質は、２つのＭ６Ｐ受容体のいずれかとの相互作用を介して、リソソームに送達される。しかしながら、酵素補充療法において使用される組換え的に産生されたタンパク質は、多くの場合、それらをリソソームに標的化するために必要なＭ６Ｐの付加を欠き、したがって、多くの場合、高用量の患者に投与される組換え的に産生された酵素および／または頻繁な注入を必要とする。
【0007】
酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）は、マルトースおよびグリコーゲンの外側の分枝を含む他の直鎖状オリゴ糖においてアルファ１－４連結を加水分解し、それによりリソソーム中の過剰のグリコーゲンを分解する、リソソーム酵素である（Hirschhorn et al. (2001) in The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, Scriver, et al., eds. (2001), McGraw-Hill: New York, p. 3389-3420）。他の哺乳動物のリソソーム酵素と同様に、ＧＡＡは、サイトゾル中で合成され、ＥＲを通過し、そこでそれは、Ｎ連結された高マンノース型炭水化物でグリコシル化される。ゴルジでは、高マンノース炭水化物は、これらのタンパク質をリソソームに標的化するマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）の付加によって、リソソームタンパク質上で改変される。Ｍ６Ｐ改変タンパク質は、２つのＭ６Ｐ受容体のいずれかとの相互作用を介して、リソソームに送達される。改変の最も好ましい形態は、２つのＭ６Ｐが高マンノース炭水化物に付加される場合である。
【0008】
リソソームにおける不十分なＧＡＡ活性は、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ）、グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）、糖原病ＩＩ型、またはＧＡＡ欠損症としても公知の疾患であるポンペ病をもたらす。酵素活性の減少は、ＧＡＡをコードする遺伝子における各種のミスセンス変異およびナンセンス変異に起因して起こる。その結果として、グリコーゲンは、ポンペ病を有する患者において、すべての細胞のリソソームに蓄積する。特に、グリコーゲン蓄積は、心筋および骨格筋、肝臓、ならびに他の組織のリソソームにおいて最も顕著である。蓄積したグリコーゲンは、最終的に、筋肉の機能を損なう。ポンペ病の最も重度の形態では、心肺機能不全に起因して、２歳より前に死亡が起こる。
【0009】
ポンペ病の有効な処置についての必要性が存在する。ポンペのための酵素補充治療学は、組換えＧＡＡタンパク質が投与され、対象における筋肉および肝臓の細胞によって取り込まれ、その後、Ｍ６Ｐ依存性の様式でそれらの細胞中のリソソームに輸送されることを必要とする。しかしながら、酵素療法は、重度の小児型ＧＳＤ ＩＩに対して妥当な効力を実証しているが、ＧＡＡ酵素療法の利益は、頻繁な注入についての必要性、および組換えｈＧＡＡタンパク質に対する阻害剤または中和抗体の対象における発生によって限定されている（Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138）。
【0010】
遺伝子治療は、ウイルスを使用して、遺伝性障害を治癒するだけでなく、後天性の変性疾患の長期の非侵襲的処置も容易にする可能性を有する。１つの遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶそれ自身は、効率的な複製のためにヘルパーウイルスを必要とする非病原性依存性パルボウイルスである。ＡＡＶは、その安全性および単純性のために、遺伝子治療のためのウイルスベクターとして用いられている。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入することができる、広い宿主および細胞型向性を有する。
【0011】
しかしながら、ＧＡＡポリペプチドのＡＡＶ送達は、肝臓における十分な発現および／またはリソソームへの送達の達成に関していくつかの課題を有し、患者は、糖血症の経験を報告している。
特に、ヒト対象では、ＧＡＡポリペプチドをコードするｒＡＡＶベクターの投与は、細胞における非特異的なアップデートに起因して、低血糖を経験するか、または高血糖になっている幾人もの患者をもたらしている（例えば、Byrne et al., A study on the safety and efficacy of Reveglucosidease alfa in patients with late-onset Pompe disease; Orphanet J. of Rare diseases; 2017; 12: 144を参照されたい）。
したがって、例えば、ＧＡＡの改変を含む、リソソームポリペプチド欠損症を処置するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＡＡなどのリソソームポリペプチドを生成する改善された方法についての当技術分野における必要性が存在する。また、ＧＡＡポリペプチドの過剰発現による任意の副作用の低減を助け、低血糖の危険性の低減させるために、肝臓からの分泌の改善、およびＧＡＡのリソソームへの標的化の改善についての必要性が存在する。さらに、ＧＡＡおよび他のリソソームポリペプチドの罹患した組織および臓器への全身送達をもたらす方法についての必要性が存在する。特に、任意の可能性のある副作用を低減しながら、ＧＡＡタンパク質を対象に投与するため、およびＧＡＡタンパク質を患者のリソソームに標的化するためのより効率的な方法についての必要性が残されている。
特に、ヒト対象では、ＧＡＡポリペプチドをコードするｒＡＡＶベクターの投与は、細胞における非特異的なアップデートに起因して、低血糖を経験するか、または高血糖になっている幾人もの患者をもたらしている（例えば、Byrne et al., A study on the safety and efficacy of Reveglucosidease alfa in patients with late-onset Pompe disease; Orphanet J. of Rare diseases; 2017; 12: 144を参照されたい）。
したがって、例えば、ＧＡＡの改変を含む、リソソームポリペプチド欠損症を処置するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＧＡＡなどのリソソームポリペプチドを生成する改善された方法についての当技術分野における必要性が存在する。また、ＧＡＡポリペプチドの過剰発現による任意の副作用の低減を助け、低血糖の危険性の低減させるために、肝臓からの分泌の改善、およびＧＡＡのリソソームへの標的化の改善についての必要性が存在する。さらに、ＧＡＡおよび他のリソソームポリペプチドの罹患した組織および臓器への全身送達をもたらす方法についての必要性が存在する。特に、任意の可能性のある副作用を低減しながら、ＧＡＡタンパク質を対象に投与するため、およびＧＡＡタンパク質を患者のリソソームに標的化するためのより効率的な方法についての必要性が残されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Amalfitano, A., et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866
【非特許文献2】Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446、Fraites, T. J., et al., (2002) Mol. Ther. 5:571-578
【非特許文献3】Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616）
【非特許文献4】Hirschhorn et al. (2001) in The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, Scriver, et al., eds. (2001), McGraw-Hill: New York, p. 3389-3420
【非特許文献5】Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
発明の概要
本明細書に記載される技術は、一般に、例えば、限定されるものではないが、ポンペ病などのリソソーム蓄積症およびリソソーム蓄積障害の処置のための遺伝子治療構築物、方法、および組成物に関する。より詳細には、本技術は、リソソーム酵素、例えば、ＧＡＡポリペプチドを対象に送達するため、より詳細には、リソソームに標的化され、肝臓細胞から分泌される、リソソーム酵素、例えば、ＧＡＡポリペプチドを対象の肝臓に送達するために構成されたアデノ随伴（ＡＡＶ）ビリオンに関する。
本明細書に記載される技術は、一般に、例えば、限定されるものではないが、ポンペ病などのリソソーム蓄積症およびリソソーム蓄積障害の処置のための遺伝子治療構築物、方法、および組成物に関する。より詳細には、本技術は、リソソーム酵素、例えば、ＧＡＡポリペプチドを対象に送達するため、より詳細には、リソソームに標的化され、肝臓細胞から分泌される、リソソーム酵素、例えば、ＧＡＡポリペプチドを対象の肝臓に送達するために構成されたアデノ随伴（ＡＡＶ）ビリオンに関する。
【0014】
特に、例えば、例示的な例としてｒＡＡＶベクターを使用する標的化ウイルスベクターが本明細書に記載され、これは、逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、異種遺伝子、ポリＡテイル、およびリソソーム蓄積症を処置する使用のための潜在的な他の調節エレメント、例えば、本明細書の表５Ａまたは表６Ａにリストされるものを含有するヌクレオチド配列を含み、異種遺伝子は、例えば、ＧＡＡなどのリソソーム酵素であり、ベクター、例えば、ｒＡＡＶは、治療有効用量で患者に投与することができ、これは異種リソソーム酵素遺伝子の発現、および疾患、例えば、ポンペ病の処置のために、適切な組織および／または臓器に送達される。
【0015】
本発明の態様は、下記に記載される例示的な利点を生じさせる構築および使用におけるある特定の利益を教示する。
【0016】
したがって、特定の実施形態では、逆位末端反復（ＩＴＲ）、ならびにＩＴＲの間に位置する、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）タンパク質をコードする異種核酸配列、ポリＡテイル、および潜在的にポンペ病を処置する使用のための他の調節エレメントを含有するヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターが本明細書に記載され、ＧＡＡタンパク質を発現するｒＡＡＶは、患者に治療有効用量で投与することができ、これは、ポンペ病を有する対象の処置のためのＧＡＡタンパク質をコードする異種遺伝子の発現のために、適切な組織および／または臓器に送達される。
【0017】
より具体的には、ＡＡＶビリオンまたはゲノムは、リソソームタンパク質、例えば、ＧＡＡタンパク質が、肝臓において優先的に発現するのを可能にする、本明細書の表４にリストされる任意のプロモーター、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片から選択されるＬＳＰ、あるいは配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片を含む。一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓においてｈＧＡＡタンパク質を優先的に発現しながら、目的の別の組織、例えば、筋肉、またはＣＮＳ、または筋肉およびＣＮＳの組織において、ある程度ｈＧＡＡを発現することもできる。一部の実施形態では、発現されたリソソーム酵素、例えば、ＧＡＡタンパク質は、ＧＡＡタンパク質をリソソームに標的化する、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドなどの標的化配列とのＧＡＡ融合タンパク質として構成され得るか、および／またはシグナルペプチド（ＳＰ）と融合され得、ＧＡＡタンパク質は、肝臓においてｒＡＡＶゲノムによって発現され、そこでこれは、哺乳動物細胞、特に、筋肉細胞のリソソームによって分泌および取り込まれる。
【0018】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、そのゲノム中に、５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含み、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）は、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）、またはそれらの機能的断片もしくはバリアント、あるいは配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的断片もしくはバリアントからリストされる任意のプロモーターから選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、ＩＧＦ２標的化配列またはシグナル配列のいずれにも融合されていない。一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、本明細書に開示されるシグナル配列、および／または本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化配列に融合されている。
【0019】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、そのゲノム中に、５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、（ｉ）分泌シグナルペプチドおよび／またはＩＧＦ２標的化ペプチド、ならびに（ｉｉ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含み、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）は、本明細書の表４にリストされる任意のプロモーター、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片から選択される。
【0020】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、そのゲノム中に、５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、（ｉ）分泌シグナルペプチド（リーダーペプチドとも称される）、および（ｉｉ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、異種核酸は、本明細書の表４にリストされる任意のプロモーター、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは本明細書の表４から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片から選択される肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）に動作可能に連結されている。例示的なリーダー配列としては、限定されるものではないが、本明細書に開示される、生得的ＧＡＡリーダー配列、ＡＡＴ配列、ＩＬ２（１－３）、ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｗｔ）、改変ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｍｕｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ１）シグナル配列もしくはＩｇＧリーダー配列、またはそれらの機能的バリアントが挙げられる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＬＳＰおよびリーダー配列の間に位置するコザック配列を含む。
【0021】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、そのゲノム中に、５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、（ｉ）ＩＧＦ２標的化ペプチド、および（ｉｉ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、異種核酸は、本明細書の表４にリストされる任意のプロモーター、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片から選択される肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）に動作可能に連結されている。
【0022】
さらなる実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、そのゲノム中に、５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列（すなわち、ＧＡＡポリペプチドは異種シグナルペプチド（または、リーダー配列）に融合されても、本明細書に記載されるＩＧＦ２標的化配列に融合されてもいない）を含み、異種核酸は、本明細書の表４にリストされる任意のプロモーター、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片から選択される肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）に動作可能に連結されている。
【0023】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的カプシド、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＸＬ３２およびＸＬ３２．１から選択される肝臓特異的カプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＡＡＶＸＬ３２もしくはＡＡＶＸＬ３２．１、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３の少なくとも１つがＡＡＶ８血清型由来である）を含むハプロイドＡＡＶベクターであり、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも２つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１または国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３６６７６号に開示されるカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号１～３のいずれか１つのヌクレオチド配列または（ｂ）ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号４～６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である核酸ＡＡＶカプシドコード配列によってコードされるカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、本発明のＡＡＶベクターゲノムおよびＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子と一緒に、ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号４～６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが肝臓細胞を形質導入するように、カプシドタンパク質を含み、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが筋肉および肝臓の細胞を形質導入するように、カプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが肝臓細胞を形質導入するように、カプシドタンパク質を含み、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが筋肉および肝臓の細胞を形質導入するように、カプシドタンパク質を含む。
【0024】
方法および組成物における使用のために包含される例示的なＬＳＰは、ＳＰ０４１２（配列番号９１）またはその機能的バリアントである。代替の実施形態では、ＬＳＰは、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）、またはそれらの機能的断片もしくはバリアントのいずれかから選択することができる。
【0025】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡシグナルペプチド、生得的ＧＡＡリーダー配列、ＡＡＴ配列、ＩＬ２（１－３）、ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｗｔ）、改変ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｍｕｔ）もしくはＩｇＧリーダー配列、または分泌シグナル活性を有するそれらの機能的バリアントのいずれかから選択される。
【0026】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドは、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端でＩＧＦ２標的化ペプチドに連結されている。一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド（配列番号１０）のアミノ酸７０のＮ末端に連結されているか（すなわち、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの残基７０～９５２のＮ末端に連結されている）、または配列番号１０のアミノ酸７０～９５２と少なくとも８５％の配列同一性のＧＡＡポリペプチドに連結されている。代替の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド（配列番号１０）のアミノ酸４０のＮ末端に連結されているか（すなわち、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの残基４０～９５２のＮ末端に連結されている）、または配列番号１０のアミノ酸４０～９５２と少なくとも８５％の配列同一性のＧＡＡポリペプチドに連結されている。本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、野生型ＧＡＡ核酸配列（例えば、配列番号１１または配列番号７２）によってコードされるか、または例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現の増加、ＣｐＧアイランドの低減、および／もしくは対象における自然免疫応答の低減のいずれか１つのためにコドン最適化されたＧＡＡ核酸配列であり得る。例示的なコドン最適化ＧＡＡ核酸配列は、限定されるものではないが、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、および配列番号１８２が挙げられる。
【0027】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含み、例えば、限定されるものではないが、肝臓特異的プロモーターは、本明細書の表４におけるいずれかまたはそれらの機能的バリアントから選択される。方法および組成物における使用のために包含される例示的なＬＳＰとしては、ＳＰ０４１２およびその機能的バリアントが挙げられる。代替の実施形態では、ＬＳＰは、本明細書に開示される、ＳＰ０４２２、ＳＰ０１３１Ａ１、ＳＰ０２３９、ＳＰ０２４０もしくはＳＰ０２４６、またはそれらの機能的バリアントのいずれかから選択される核酸配列を含むことができる。例えば、肝臓特異的プロモーターは、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される核酸配列を含むことができる。代替の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ１３１＿Ａ１とも呼ばれるＳＰ０２６５）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、または配列番号９６（ＳＰ０２４６）、または配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、または配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）のいずれかから選択される核酸配列を含むことができる。本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターとしては、参照によりその全体が本明細書に包含される仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａまたは４Ｂに以前に開示されている、肝臓特異的シス調節エレメント（ＣＲＥ）、合成肝臓特異的シス調節モジュール（ＣＲＭ）、または配列番号２７０～３４１（ミニマルＬＳＰ、これはＣＲＭを含み得る）もしくは配列番号３４２～４３０（例示的な合成ＬＳＰ）のいずれかから選択されるプロモーター配列を含む合成肝臓特異的プロモーター、あるいはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントが挙げられる。これらの肝臓特異的プロモーターエレメントとしては、ミニマル肝臓特異的プロモーター（例えば、配列番号８６、２７０～３４１を参照されたい）、または肝臓特異的近位プロモーター（例えば、配列番号９１～９６、１４６～１５０および３４２～４３０を参照されたい）が挙げられ得る。例えば、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片。
【0028】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含み、例えば、限定されるものではないが、肝臓特異的プロモーターは、配列番号８６、９１～９６、１４６～１５０、３７０～４３０、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される。
【0029】
例えば、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは配列番号８６、９１～９６、もしくは１４６～１５０、もしくは３７０～４３０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片は、元の未改変参照配列と、少なくとも約７５％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、およびまた対応する未改変プロモーター配列の少なくとも３５％のプロモーター活性、または少なくとも約４５％のプロモーター活性、または少なくとも約５０％のプロモーター活性、または少なくとも約６０％のプロモーター活性、または少なくとも約７５％のプロモーター活性、または少なくとも約８０％のプロモーター活性、または少なくとも約８５％のプロモーター活性、または少なくとも約９０％のプロモーター活性、または少なくとも約９５％のプロモーター活性を有する。
【0030】
例えば、配列番号９２（ＳＰ０４２２）または配列番号９１（ＳＰ０４１２）の機能的バリアントまたは機能的断片は、それぞれ、配列番号９２もしくは配列番号９１と少なくとも約７５％の配列同一性、または配列番号９２もしくは配列番号９１と少なくとも約８０％の配列同一性、配列番号９２もしくは配列番号９１と少なくとも約９０％の配列同一性、配列番号９２もしくは配列番号９１と少なくとも約９５％の配列同一性、配列番号９２もしくは配列番号９１と少なくとも約９８％の配列同一性、または元の未改変配列を有し、かつ配列番号９２もしくは配列番号９１の対応する未改変プロモーター配列の少なくとも３５％のプロモーター活性、または少なくとも約４５％のプロモーター活性、または少なくとも約５０％のプロモーター活性、または少なくとも約６０％のプロモーター活性、または少なくとも約７５％のプロモーター活性、または少なくとも約８０％のプロモーター活性、または少なくとも約８５％のプロモーター活性、または少なくとも約９０％のプロモーター活性、または少なくとも約９５％のプロモーター活性も有する。
【0031】
機能的断片は、非切断型プロモーターの少なくとも３５％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％を有するプロモーターの一部分である。一部の実施形態では、機能的断片は、未改変プロモーター配列の連続部分を含む。ＴＴＲ（配列番号４３１）は、例示的なＬＳＰとして本明細書の実施例に開示されているが、当業者は、ＴＴＲプロモーター（配列番号４３１）を、本明細書の表４にリストされる肝臓特異的プロモーターのいずれか１つまたは複数、例えば、少なくとも配列番号９２（ＳＰ０４２２）もしくは配列番号９１（ＳＰ０４１２）、または配列番号９２（ＳＰ０４２２）もしくは配列番号９１（ＳＰ０４１２）の機能的バリアントもしくは断片を含む核酸配列、あるいは配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ１３１＿Ａ１）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、配列番号９６（ＳＰ０２４６）、または配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）のいずれかを含む核酸配列、あるいは配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意の配列、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片で置き換えることができる。一部の実施形態では、ＬＳＰは、肝臓においてｈＧＡＡタンパク質を優先的に発現しながら、目的の別の組織、例えば、筋肉、またはＣＮＳ、または筋肉およびＣＮＳの組織において、ある程度ｈＧＡＡを発現することもできる。
【0032】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、本明細書に開示される野生型ＧＡＡポリペプチド（ｗｔＧＡＡ）または改変ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、ＧＡＡポリペプチドの１個または複数のアミノ酸は、改変されている、例えば、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌ改変である。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、またはＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌから選択される改変の１つもしくは複数を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードするコドン最適化されている改変ＧＡＡ核酸配列である、ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。本明細書に開示される方法および組成物のすべての態様では、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現、ＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減するようにのいずれか１つまたは複数のためにコドン最適化されている。本明細書に開示される方法および組成物のすべての態様では、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列は、ＣｐＧアイランドを低減するように、および自然免疫応答を低減するようにコドン最適化されている。一部の実施形態では、野生型ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１８２に開示され、かつ本明細書に記載される改変を含む。
【0033】
本明細書の技術の別の態様は、本明細書に開示される組換えＡＡＶベクター組成物のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【0034】
本明細書の技術の別の態様は、以下の順序で、５’ＩＴＲ、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌから選択される改変の１つまたは複数を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、および３’ＩＴＲを含む核酸配列を含む組成物に関する。一態様では、核酸配列は、必要に応じて、ＬＳＰおよびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の間に位置するリーダー配列（または、シグナル配列）をコードする核酸配列をさらに含み、リーダー配列は、本明細書に開示される、生得的ＧＡＡリーダー配列、ＡＡＴ配列、ＩＬ２（１－３）、ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｗｔ）、改変ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｍｕｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ１）もしくはＩｇＧリーダー配列、またはそれらの機能的バリアントのいずれかから選択される。一部の実施形態では、核酸配列は、必要に応じて、ＬＳＰおよびリーダー配列の間に位置するコザック配列をさらに含む。一部の実施形態では、核酸配列は、必要に応じて、リーダー配列およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、核酸配列は、必要に応じて、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸およびポリＡ配列の３’に位置する３’ＵＴＲをさらに含む。一部の実施形態では、核酸配列は、必要に応じて、ＬＳＰの３’およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の５’に、好ましくは、ＬＳＰおよびコザック配列の間にイントロン配列をさらに含む。ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムのための例示的な構築物を図５Ａ～５Ｇに示す。
【0035】
本明細書の技術の別の態様は、５’ＩＴＲ、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌから選択される改変の１つまたは複数を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲ配列を含む核酸配列を含む組成物であって、ポリＡ配列が、全長または切断型ポリＡシグナル配列であり得る、組成物に関する。本明細書の技術の別の態様は、５’ＩＴＲ、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌから選択される改変の１つまたは複数を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、全長ポリＡ配列、末端反復配列、および３’ＩＴＲ配列を含む核酸配列を含む組成物であって、核酸が、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列を欠く、組成物に関する。
【0036】
本明細書の技術の別の態様は、以下の順序で、（ａ）分泌シグナルペプチドをコードする核酸、（ｂ）ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、および（ｃ）ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含む核酸配列を含む組成物に関する。
【0037】
本明細書の技術の別の態様は、組換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムに対する核酸配列を含む組成物であって、核酸配列が、（ａ）５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）核酸配列、ならびに（ｂ）５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、異種核酸が、上記に記載される肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、組成物に関する。例示的な肝臓特異的プロモーターは、ＳＰ０４１２もしくはＳＰ０４２２、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物における使用のための肝臓特異的プロモーターとしては、肝臓特異的シス調節エレメント（ＣＲＥ）、合成肝臓特異的シス調節モジュール（ＣＲＭ）、または本明細書の表４に開示される合成肝臓特異的プロモーターが挙げられる。
【0038】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、核酸配列は、ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、核酸配列は、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現、ＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減するようにのいずれか１つまたは複数のために、コドン最適化された（ｃｏＧＡＡ）ＧＡＡ遺伝子である異種核酸配列を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、核酸配列は、ＣｐＧアイランドを低減するように、および自然免疫応答を低減するようにコドン最適化された（ｃｏＧＡＡ）ＧＡＡ遺伝子である異種核酸配列を含む。
【0039】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、核酸配列は、配列番号１１（全長ｈＧＡＡ）、配列番号５５（Ｄｗｉｇｈｔ ｃＤＮＡ）、配列番号５６（ｈＧＡＡ Δ１～６６）もしくは配列番号１８２（ｍｏｄＧＡＡ、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ）、または配列番号１７０（ｍｏｄＧＡＡ；Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ）、配列番号１７１（ｍｏｄＧＡＡ；Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌ）のアミノ酸配列を有するＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列、または配列番号１１、５５、５６もしくは１８２のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性であるＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列のいずれかから選択されるＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。
【0040】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、核酸配列は、ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７４（コドン最適化１）、配列番号７５（コドン最適化２）、および配列番号７６（コドン最適化３）、もしくは配列番号１８２（ｍｏｄＧＡＡ、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ）、または配列番号７４、７５、７６もしくは１８２のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される。
【0041】
本明細書の技術の別の態様は、疾患を処置するための方法における本明細書に開示されるｒＡＡＶおよび核酸組成物の使用に関する。特に、本明細書の技術の一態様は、グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型（ＧＳＤ ＩＩ、ポンペ病、酸性マルターゼ欠損症）を有するか、またはアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド中に欠損を有する対象を処置するための方法における、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター組成物および核酸組成物の使用であって、方法が、本明細書に開示される組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを対象に投与するステップを含む、使用に関する。本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、発現されたＧＡＡポリペプチドは、対象の肝臓から分泌され、骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せによって分泌されたＧＡＡの取り込みがあり、分泌されたＧＡＡの取り込みは、組織中のリソソームグリコーゲン貯蔵の低減をもたらす。開示される方法における一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列は、任意の好適な投与方法、例えば、限定されるものではないが、筋肉内、皮下、脊髄内、大槽内、髄腔内、静脈内の投与のいずれかから選択される投与方法によって対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、本明細書に開示される方法において使用することができる。
【0042】
本明細書の技術の別の態様は、本明細書に開示される、ｒＡＡＶ組成物、ｒＡＡＶゲノム組成物、または核酸組成物のいずれか１つまたは複数を含む細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、または非ヒト細胞の哺乳動物細胞、または昆虫細胞である。
【0043】
本明細書の技術の別の態様は、本明細書に開示される、ｒＡＡＶ組成物、ｒＡＡＶゲノム組成物、または核酸組成物のいずれか１つまたは複数を含む宿主動物に関する。一部の実施形態では、宿主動物は、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、またはヒトである。
【0044】
本明細書の技術の別の態様は、本明細書に開示される、ｒＡＡＶ組成物、ｒＡＡＶゲノム組成物、または核酸組成物のいずれか１つまたは複数を含む少なくとも１つの細胞を含む宿主動物に関する。一部の実施形態では、そのような改変細胞を含む宿主動物は、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、またはヒトである。
【0045】
一部の実施形態では、本明細書に開示される、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶゲノムをコードする核酸、および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤が本明細書に開示される。
【0046】
本発明の態様は、下記に記載される例示的な利点を生じさせる構築および使用におけるある特定の利益を教示する。本発明の態様の他の特徴および利点は、例として、本発明の態様の原理を図示する添付の図面と併せて解釈される、以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【0047】
本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴う本特許出願公開の写しは、請求および必要な手数料の支払いによって、庁によって提供されるであろう。添付の図面は、本発明の態様を図示する。そのような図面では、以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【図4-1】図４Ａ～４Ｇは、発現する例示的なリソソームタンパク質としてｈＧＡＡを使用する、標的化ペプチドを有する本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物の図示である。図４Ａは、５’ＩＴＲ、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）、標的化ペプチド（ＴＰ）およびヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、ならびに３’ＩＴＲを含む、ｒＡＡＶゲノムのための核酸構築物を示す。図４Ｂは、図４Ａと同じエレメントを含み、ｈＧＡＡポリペプチドの３’および３’－ＩＴＲの５’に少なくとも１つのポリＡシグナルを追加で含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示す。図４Ｃは、プロモーターの３’にイントロン配列を含むことを除いて、図４Ｂと同じエレメントを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示す。図４Ｄは、ｈＧＡＡポリペプチド核酸配列の３’およびポリＡ配列の前に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列および／または３’ＵＴＲ配列を含むことを除いて、図４Ｃと同じエレメントを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示す。図４Ｅは、ｈＧＡＡポリペプチドをコードする核酸および標的化ペプチド（ＴＰ）、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸の間に位置する少なくとも１個のアミノ酸のスペーサーをコードする核酸も含むことを除いて、図４Ｄと同じエレメントを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示す。図４Ｆは、図４Ｅと同じエレメントを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示し、ここで、プロモーターが肝臓プロモーターであり、イントロン配列が、ＭＶＭまたはＨＢＢ２イントロン配列から選択され、分泌シグナルペプチドが、ＦＮ１シグナルペプチド（例えば、ｈＦＮ１、ｒａｔＦＮ１）、ＡＡＴシグナルペプチドまたはｈＧＡＡシグナルペプチドのいずれかから選択され、標的化ペプチドが、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドであり、少なくともポリＡ配列が、ｈＧＨｐＡまたはｓｙｎＰＡポリＡ配列から選択される。図４Ｇは、ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号２（ＩＧＦ２ Δ２～７）、配列番号３（ＩＧＦ２ Δ１～７）または配列番号４（ＩＧＦ２ Ｖ４３Ｍ）から選択される核酸配列である場合を除いて、図４Ｆと同じエレメントを含む、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示す。
【図4-2】同上。
【0052】
【図5-1】図５Ａ～５Ｇは、ｒＡＡＶゲノムのための例示的な核酸構築物を示す。図５Ａは、５’ＩＴＲ、ｈＧＡＡポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター、ポリＡ配列（例えば、ｈＧＨｐＡ、ｓｙｎＰＡ、ＲＢＧまたはＳＶ４０ポリＡ配列のいずれか１つまたは複数）、および３’ＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶゲノムの概略図である。図５Ｂは、５’ＩＴＲ、シグナル分泌ペプチド（例えば、ＦＮ１、ＡＡＴまたは同族ＧＡＡシグナルペプチド、ＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２、ＩｇＧのいずれかから選択される）をコードする核酸に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター、ヒトＧＡＡポリペプチドおよびポリＡ配列をコードする核酸、ならびに３’ＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶゲノムの概略図である。図５Ｃは、５’ＩＴＲ、イントロン配列（例えば、ＭＶＭ、ＳＶ４０またはＨＢＢ２イントロン配列）に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーター、シグナル分泌ペプチド（例えば、ＦＮ１、ＡＡＴまたは同族ＧＡＡシグナルペプチド、ＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２、ＩｇＧのいずれかから選択される）をコードする核酸、ヒトＧＡＡポリペプチドおよびポリＡ配列をコードする核酸、ならびに３’ＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶゲノムの概略図である。図５Ｄは、ＧＡＡをコードする核酸の３’および少なくとも１つのポリＡ配列（例えば、ｈＧＨｐＡおよび／またはｓｙｎＰＡポリＡ配列）の間に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列または３’ＵＴＲを含む、図５Ｃと類似の構築物の概略図である。一部の実施形態では、構築物は、本明細書に開示されるＣＳ配列および３ＵＴＲ配列の両方を含む。一部の実施形態では、ＣＳ配列は、本明細書に開示される３’ＵＴＲ配列によって置き換えることができる。図５Ａ～５Ｄでは、例示的な肝臓特異的プロモーターは、本明細書の表４に開示されるもののいずれかから選択することができ、限定されるものではないが、配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０、または配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。図５Ｅは、ポンペ病を処置するための本明細書に開示される方法および組成物において有用なＡＡＶベクターの一実施形態の概略図であり、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列の間に隣接して、５’から３’への方向に、ＬＳＰプロモーター、コザック配列、シグナル配列（図５Ｅではリーダー配列と称される）、ｈＧＡＡをコードする核酸、およびポリＡ配列を含む核酸を含む。一部の実施形態では、リーダー配列は、生得的ＧＡＡリーダー配列、ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｗｔ）、改変ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｍｕｔ）もしくはＩｇＧリーダー配列、またはそれらの機能的バリアントのいずれかから選択することができ、ｈＧＡＡ配列は、コンセンサスｈＧＡＡ核酸配列、または少なくともＨ２０１Ｌ変異もしくは本明細書に開示される他の改変（例えば、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ）を有するｈＧＡＡ核酸から選択することができる。図５Ｆは、ポンペ病を処置するための本明細書に開示される方法および組成物において有用なＡＡＶベクターの別の実施形態の概略図であり、５’から３’への方向に、肝臓特異的プロモーター、イントロン配列、コザック配列、シグナル配列（リーダー配列とも称される）、ＩＧＦ２標的化ペプチド配列（図５Ｆでは「ＧＩＬＴ」と称される）、ｈＧＡＡをコードする核酸、必要に応じて３’ＵＴＲ配列、およびポリＡ配列を含み、例えば、プロモーターを、本明細書に開示される任意のＬＳＰ、例えば、高発現レベルのＬＳＰ（ＬＳＰ－Ｈ）、中発現レベルのＬＳＰ（ＬＳＰ－Ｍ）、または低発現ＬＳＰ（ＬＳＰ－Ｌ）などの異なる発現のレベルを有するＬＳＰから選択することができ、イントロン配列を、ＨＢＢ２、ＭＶＭ、ＳＶ４０、および他のイントロン配列から選択することができ、リーダー配列を、生得的ＧＡＡリーダー配列、ＡＡＴ配列（図５ＦではＡ１ＡＴと称される）、ＩＬ２（１－３）、ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｗｔ）、改変ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｍｕｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ１、図５Ｆでは、ＦＢＮと称される）もしくはＩｇＧリーダー配列、またはそれらの機能的バリアントのいずれかから選択することができ、ＩＧＦ２標的化ペプチド配列が、本明細書に記載されるＩＧＦ２標的化ペプチド、例えば、ＷＴ ＩＧＦ２（配列番号１）、Δ２～７、Ｖ４３Ｍ（配列番号９）、Δ２～７Ｖ４３Ｍ、またはそれらの機能的バリアントのいずれかから選択され、ｈＧＡＡ核酸配列が、例えばＣ１～１０で、少なくともＨ２０１Ｌ変異、および／または本明細書に開示される他の改変（例えば、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ）も必要に応じて含むことができ本明細書に開示されるようにコドン最適化され、ポリＡ配列が、例えば、ＲＢＧまたはＳＶ４０ポリＡから選択される、異なる実施形態を示す。ＬＳＰ－Ｈ、Ｍ－ＬＳＰおよびＬＳＰ－Ｌと指定されるＬＳＰは、肝臓において主におよび優先的にｈＧＡＡを発現するが、１つまたは複数の他の組織、例えば、筋肉においてｈＧＡＡを発現することができる、肝臓特異的プロモーターを表す。そのようなＬＳＰは、全身性の分泌のための肝臓における発現、および筋肉細胞による取り込み、ならびに筋肉組織におけるいくらかの発現を可能にする。図５Ｇは、ポンペ病を処置するための本明細書に開示される方法および組成物において有用なＡＡＶベクター構築物の異なる実施形態の概略図を示し、構築物１（上パネル）は、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、ｈＧＡＡ核酸配列、切断型ポリＡ配列（ｔ－ｐＡ）、および３’ＩＴＲを含むｒＡＡＶベクター構築物を示し、構築物２（下パネル）は、Ｐ５ ＡＡＶプロモーター断片が除去されている例示的なｒＡＡＶベクター構築物を示し、構築物は、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、ｈＧＡＡ核酸配列、全長ポリＡ配列（ｆｌ－ｐＡ）、アンチセンス方向性のターミネーター配列、および３’ＩＴＲ（センス方向性）を含む。
【図5-2】同上。
【図5-3】同上。
【図5-4】同上。
【0053】
【図6】図６は、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムを作製するためのギブソンクローニング技法の図示を示す。特に、トリプルライゲーションを行って、３つの核酸配列のブロックを一緒にライゲートし、次いで、これを、プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーターならびに５’および３’ＩＴＲを有するベクターにクローニングして、ｒＡＡＶゲノムを作製することができる。ギブソンクローニング方法論を使用して、以下のｒＡＡＶゲノムを作製した：配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））。
【0054】
【図7】図７は、核酸配列ブロック（１、２および３）のギブソンクローニングを使用する、ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ）を含む配列番号５７の例示的なｒＡＡＶゲノムの作製を示す。当業者は、ＴＴＲ肝臓プロモーターを、限定されるものではないが、配列番号８６、９１～９６、１４６～１５０、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択されるプロモーターを含む、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーターのいずれかで容易に置き換えることができる。また、ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ）ベクターにおいて示されるのは、ＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）標的化ペプチドをコードする核酸配列の３’、およびｗｔＧＡＡ（Δ１～６９）酵素をコードする核酸の５’に位置する３アミノ酸（３ａａ）のスペーサー核酸配列（配列番号３１として例示的な３ａａ配列「Ｇ－Ａ－Ｐ」を示す）、ならびにポリＡ配列の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置するスタッファー核酸配列（図８では、「スペーサー」配列と称される）の場所である。
【0055】
【図8】図８は、核酸配列ブロック（８、２および３）のギブソンクローニングを使用する、ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９）を含む配列番号６２のｒＡＡＶゲノムの作製を示す。当業者は、ＴＴＲ肝臓プロモーターを、限定されるものではないが、配列番号８６、９１～９６、１４６～１５０、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択されるプロモーターを含む、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーターのいずれかで容易に置き換えることができる。また、ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９）ベクターにおいて示されるのは、ＩＧＦΔ２～７標的化ペプチドをコードする核酸配列の３’、およびｗｔＧＡＡ（Δ１～６９）酵素をコードする核酸の５’に位置する３アミノ酸（３ａａ）のスペーサー核酸配列（配列番号３１として例示的な３ａａ配列「Ｇ－Ａ－Ｐ」を示す）、ならびにポリＡ配列の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置するスタッファー核酸配列（図１３では、「スペーサー」配列と称される）の場所である。
【0056】
【図9-1】図９Ａ～９Ｆは、野生型ＧＡＡを発現するｒＡＡＶゲノムの例示的な構築物の概略図を示す。図９Ａは、候補１＿ＡＡＴ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号７９）の例示的なｒＡＡＶゲノム構築物の概略図を示す。図９Ｂは、候補２＿ＦＩＢｒａｔ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８０）の例示的なｒＡＡＶゲノム構築物の概略図を示す。図９Ｃは、候補３＿ＦＩＢｈｕｍ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８１）の例示的なｒＡＡＶゲノム構築物の概略図を示す。図９Ｄは、候補４＿ＡＡＴ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８２）の例示的なｒＡＡＶゲノム構築物の概略図を示す。図９Ｅは、候補５＿ＦＩＢｒａｔ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８３）の例示的なｒＡＡＶゲノム構築物の概略図を示す。図９Ｆは、候補６＿ＦＩＢｈｕｍ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８４）の例示的なｒＡＡＶゲノム構築物の概略図を示す。当業者は、図９Ａ～９Ｆに示されるＴＴＲ肝臓プロモーターを、任意のＬＰＳ、例えば、限定されるものではないが、配列番号８６、９１～９６または１４６～１５０のいずれかから選択されるプロモーターを含む、本明細書の表４に開示される任意の肝臓特異的プロモーターと容易に置き換えることができる。また、ＴＴＲプロモーターは、ｈＧＡＡポリペプチドを肝臓において優先的に、また目的の少なくとも１つの他の組織、例えば、筋肉またはＣＮＳにおいて発現することができるＬＳＰと置き換えることができ、一部の実施形態では、ＴＴＲプロモーターは、ｈＧＡＡポリペプチドを肝臓、ならびに筋肉およびＣＮＳの組織において優先的に発現することができるＬＳＰと置き換えることができる。一部の実施形態では、発現されたリソソーム酵素、例えば、ＧＡＡタンパク質は、ＧＡＡタンパク質をリソソームに標的化する、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドなどの標的化配列とのＧＡＡ融合タンパク質として構成され得るか、および／またはシグナルペプチド（ＳＰ）と融合され得、ＧＡＡタンパク質は、肝臓においてｒＡＡＶゲノムによって発現され、そこでこれは、哺乳動物細胞、特に、筋肉細胞のリソソームによって分泌および取り込まれる。 これらは例示の目的のみのための例示的な構築物であるので、ｗｔＧＡＡ配列を本明細書に開示されるコドン最適化配列、または本明細書に開示されるように、ＣｐＧアイランドを低減するように、および／もしくは自然免疫を低減するように改変されたＧＡＡ配列で容易に置換することもできる（図１１Ｂを参照されたい）。
【0057】
【0058】
【図10】図１０は、例示的な肝臓特異的プロモーターＳＰ０２４４およびＳＰ０２３９によって駆動されるマウスにおける平均ｉｎ ｖｉｖｏルシフェラーゼ発現を示す。発現レベルを、平均生物発光強度の全光束として示す（１秒あたりの光子）。エラーバーは、平均の標準誤差である。動物が食塩水のみを注射される場合（ｎ＝１０）、ルシフェラーゼ生物発光は検出されない。動物が、ＬＰ１プロモーターに作動可能に連結されたルシフェラーゼを含む構築物を注射される場合（ｎ＝９）、ルシフェラーゼ生物発光が検出される。例示的な肝臓特異的プロモーターの活性を試験するために、動物に、ＳＰ０２４４プロモーター（ｎ＝８）およびＳＰ０２３９プロモーター（ｎ＝１０）に作動可能に連結されたルシフェラーゼを含む同等の構築物を注射する。プロモーターＳＰ０２４４およびＳＰ０２３９は、対照のＬＰ１よりも高いｉｎ ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ発現を示した。
【0059】
【図11-1】図１１Ａ～１１Ｄは、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列に対する例示的な改変、およびｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶによるＧＡＡタンパク質発現について最適化するための核酸構築物を示す。図１１Ａは、本明細書に開示される肝臓特異的プロモーター、例えば、表４のＬＳＰに動作可能に連結された野生型ＧＡＡ（ｗｔＧＡＡ）ヌクレオチド配列の概略図を示し、代替リーディングフレームを、矢印によって、および３つのＣｐＧアイランドを示す。図１１Ｂは、ＣｐＧアイランドを除去するためのＧＡＡをコードする核酸配列に対するより詳細な改変を示す、図１１Ａに類似する概略図を示す。図１１Ｃは、（ｉ）代替リーディングフレームを低減するように、（ｉｉ）ＣｐＧアイランドの数、および（ｉｉｉ）最適なコザック配列についての改変を含ませるように改変されている配列番号１８２のｗｔＧＡＡ核酸配列に対する改変を示す。図１１Ｄは、代替リーディングフレームを低減するため、ＣｐＧアイランドの数、および最適なコザック配列についての改変のための、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列における改変を示す別の概略図である。
【図11-2】同上。
【図11-3】同上。
【図11-4】同上。
【0060】
【0061】
【図13】図１３Ａ～１３Ｂは、Ｈｕｈ７細胞およびＨＥＰＧ２細胞における肝臓特異的プロモーターＳＰ０４１２およびＳＰ０４２２を含む構築物からのＧＡＡ発現を示す。図１３Ａは、Ｈｕｈ７細胞における肝臓特異的プロモーターＳＰ０４１２（配列番号９１）およびＳＰ０４２２（配列番号９２）を含む構築物からのＧＡＡ発現のウエスタンブロットを示す。図１３Ａは、プロモーター４１２（配列番号９１）および４２２（配列番号９２）を使用するｈＧＡＡの発現が、「ＬＳＰ ＳＳ」と称されるＬＰ１プロモーター（配列番号４３２）を使用する発現と比較して、Ｈｕｈ７細胞において、有意に高いｈＧＡＡの発現をもたらすことを示す。図１３Ｂは、ＨＥＰＧ２細胞における肝臓特異的プロモーターＳＰ０４１２（配列番号９１）およびＳＰ０４２２（配列番号９２）を含む構築物からのＧＡＡ発現のウエスタンブロットを示す。ＧＡＡポリペプチドは、以下のプラスミドを使用して作製されたｒＡＡＶから発現された：ＬＳＰ ＮＥＷ（配列番号１６０）、４１２ ＮＥＷ（配列番号１５９）、ＴＴＲ ＮＥＷ（配列番号１５５）、ＬＳＰ ｓｓ（ＬＰ－１を伴うＡＡＶ）、４１２ ＴＴＲ、４２２スタッファー（配列番号１５８）、４２２ ＴＴＲ、４１２スタッファー（配列番号１５６）。図１３Ｂは、プロモーター４１２（配列番号９１）および４２２（配列番号９２）を使用するｈＧＡＡの発現が、「ＬＳＰ ＳＳ」と称されるＬＰ１プロモーター（配列番号４３２）を使用する発現と比較して、ＨｅｐＧ２細胞において、有意に高いｈＧＡＡの発現をもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0062】
上記に記載した図面は、以下の説明において詳細にさらに定義される、その例示的な実施形態の少なくとも１つにおける本発明の態様を図示する。異なる図面において同じ数字によって参照される本発明の特徴、要素および態様は、１つまたは複数の実施形態による、同じ、同等の、または類似した特徴、要素または態様を表す。
【0063】
詳細な説明
本明細書に記載される開示は、一般に、ＧＡＡポリペプチドなどのリソソームタンパク質を対象に送達するための、遺伝子治療のためのｒＡＡＶゲノムのための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターおよび構築物に関する。特に、本明細書に記載される技術は、一般に、肝臓において発現され、哺乳動物細胞、例えば、ヒトの心筋肉細胞および骨格筋肉細胞のリソソームに効果的に標的化される、リソソームタンパク質、例えば、ＧＡＡポリペプチドを生成するためのｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムに関する。例えば、本技術は、肝臓細胞を形質導入するためのｒＡＡＶベクターに関し、形質導入された肝臓細胞は、ＧＡＡポリペプチドを分泌し、分泌されたＧＡＡポリペプチドは、骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せにおいてリソソームに標的化される。
本明細書に記載される開示は、一般に、ＧＡＡポリペプチドなどのリソソームタンパク質を対象に送達するための、遺伝子治療のためのｒＡＡＶゲノムのための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターおよび構築物に関する。特に、本明細書に記載される技術は、一般に、肝臓において発現され、哺乳動物細胞、例えば、ヒトの心筋肉細胞および骨格筋肉細胞のリソソームに効果的に標的化される、リソソームタンパク質、例えば、ＧＡＡポリペプチドを生成するためのｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムに関する。例えば、本技術は、肝臓細胞を形質導入するためのｒＡＡＶベクターに関し、形質導入された肝臓細胞は、ＧＡＡポリペプチドを分泌し、分泌されたＧＡＡポリペプチドは、骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せにおいてリソソームに標的化される。
【0064】
したがって、本明細書に記載される技術の一態様は、細胞、例えば、肝臓細胞からより効果的に分泌され、次いで、哺乳動物細胞、例えば、ヒトの心筋肉細胞および骨格筋肉細胞のリソソームに標的化される、リソソームタンパク質、例えば、ＧＡＡまたは改変ＧＡＡを生成するために使用することができるｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターを提供する。
【0065】
特に、一部の実施形態では、リソソームタンパク質、例えば、ＧＡＡポリペプチドは、それ自身によって発現される。一部の実施形態では、リソソームタンパク質は、リソソームタンパク質、例えば、ＧＡＡポリペプチドの肝臓からの分泌を促進する少なくともシグナルペプチドを含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドまたは改変ＧＡＡは、ＧＡＡポリペプチドの肝臓からの分泌を促進する少なくともシグナルペプチド、ならびに哺乳動物細胞、例えば、筋肉細胞、例えば、ヒトの心筋肉細胞および骨格筋肉細胞においてリソソームへの効果的な標的化を可能にする標的化配列も含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、本明細書に記載されるＩＧＦ２標的化ペプチドである。
【0066】
本明細書に記載される技術の一態様は、ポンペ病などの疾患を処置する使用のための、さらに、ポンペ病の処置のための、逆位末端反復（ＩＴＲ）、肝臓特異的プロモーター、異種遺伝子、ポリＡテイル、および潜在的に他の調節エレメントを含有するヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターであって、異種遺伝子がＧＡＡであり、ｒＡＡＶ ＧＡＡが、異種遺伝子の発現および疾患の処置のために、適切な組織および／または臓器に送達される治療有効用量で、患者に投与され得る、ｒＡＡＶベクターに関する。
【0067】
本明細書に記載される技術の一態様は、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、以下：５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクターであって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーター、例えば、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、またはそれらの機能的バリアントに動作可能に連結されている、ｒＡＡＶベクターに関する。本明細書に記載される技術の別の態様は、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、以下：５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）をコードする異種核酸配列、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶベクターであって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーター、例えば、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、またはそれらの機能的バリアントに動作可能に連結されている、ｒＡＡＶベクターに関する。
【0068】
本明細書に記載される技術の一態様は、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、以下：５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに５’および３’ＩＴＲの間に位置する、（ｉ）分泌シグナルペプチド（ＳＳ）、（ｉｉ）ＩＧＦ２標的化ペプチド、および（ｉｉｉ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクターであって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーター、例えば、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、またはそれらの機能的バリアントに動作可能に連結されている、ｒＡＡＶベクターに関する。
【0069】
本明細書に記載される技術のすべての実施形態のすべての態様では、肝臓特異的プロモーターは、リソソームタンパク質、例えば、ｈＧＡＡポリペプチドを、肝臓において優先的に発現する。本明細書に記載される技術のすべての実施形態のすべての態様では、肝臓特異的プロモーターは、リソソームタンパク質、例えば、ｈＧＡＡポリペプチドを、肝臓、および目的の少なくとも１つの他の組織、例えば、筋肉またはＣＮＳにおいて優先的に発現し、一部の実施形態では、ＬＳＰは、ｈＧＡＡポリペプチドを肝臓、ならびに筋肉およびＣＮＳの組織において優先的に発現することができるＬＳＰと置き換えることができる。本明細書に記載される技術のすべての実施形態のすべての態様では、ＡＡＶベクターが筋肉を標的にする少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、別のプロモーター、例えば、筋肉プロモーターと置き換えることができる。
【0070】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片のいずれかから選択される。
【0071】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、任意の血清型由来である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、限定されるものではないが、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄビリオン、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａビリオン、ＡＡＶ３ｂ５４９Ａビリオン、ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙビリオン、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧビリオン（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシドを含むビリオン）を含むＡＡＶ３ｂ血清型である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的カプシド、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＸＬ３２およびＸＬ３２．１から選択される肝臓特異的カプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＡＡＶＸＬ３２またはＡＡＶＸＬ３２．１である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ８ベクター、またはＡＡＶ８由来の少なくとも１つのカプシドタンパク質（すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のいずれか１つまたは複数はＡＡＶ８またはそのキメラタンパク質由来である）を含むハプロイドｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１または国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３６６７６号に開示されるカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号１～３のいずれか１つのヌクレオチド配列または（ｂ）ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号４～６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である核酸ＡＡＶカプシドコード配列によってコードされるカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、本発明のＡＡＶベクターゲノムおよびＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子と一緒に、ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号４～６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが肝臓細胞を形質導入するように、カプシドタンパク質を含み、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターが筋肉および肝臓の細胞を形質導入するように、カプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶが、筋肉細胞の形質導入を可能にするカプシドタンパク質を含む、そのような実施形態では、ＬＳＰは、別のプロモーター、例えば、筋肉プロモーター、または肝臓細胞および筋肉細胞においてタンパク質を発現するプロモーターと置き換えることができる。
Ｉ．定義
Ｉ．定義
【0072】
以下の用語を、本明細書での説明および添付の特許請求の範囲において使用する。
【0073】
本発明を記載する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および類似する言及は、本明細書で他に指示されないか、または文脈によって明白に矛盾しない限り、単数および複数の両方に及ぶと解釈されるべきである。さらに、特定された要素についての「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序の指示は、要素間を区別するために使用され、そのような要素の必要な数または限定的な数を示すものでも、意味するものでもなく、他に具体的に記述されない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示すものではない。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で他に指示されないか、または文脈によって他に明白に矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書に提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をより明らかにすることを単に意図しており、他の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須の任意の特許請求の範囲に記載されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【0074】
さらに、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、測定可能な値、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量を指す場合、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。
【0075】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連するリストされる項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せ、ならびに代替的に解釈される場合（「または」）の組合せの欠如を指し、包含する。
【0076】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲の範囲が、特許請求の範囲において列挙された指定された材料またはステップ、および特許請求の範囲に記載される発明の「基本的および新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈されるべきであることを意味する。In re Herz、537 F.2d 549、551~52、190 USPQ 461,463(CCPA 1976)（原文における強調）を参照されたい；ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照されたい。そのため、「から本質的になる」という用語は、本発明の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」と等価であると解釈することは意図しない。文脈が他に指示しない限り、特に、本明細書に記載される本発明のさまざまな特色を、任意の組合せで使用することができることが意図される。
【0077】
また、本発明は、本発明の一部の実施形態では、本明細書に記述される任意の特色または特色の組合せを、排除または省略することができることも企図する。
【0078】
さらに例示するため、例えば、特定のアミノ酸を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択することができることを本明細書が示す場合、この言語は、アミノ酸を、これらのアミノ酸の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから、それぞれのそのような下位組合せが本明細書に明確に記述されているかのように、選択することができることも示す。また、そのような言語は、指定されたアミノ酸の１個または複数が（例えば、否定的な条件付けによって）放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施形態では、それぞれのそのような可能な放棄が本明細書に明確に記述されているかのように、アミノ酸は、ＡでもＧでもＩでもない；Ａではない；ＧでもＶでもない；などである。
【0079】
「パルボウイルス」という用語は、本明細書で使用される場合、自律複製性のパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含むＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科を包含する。自律性パルボウイルスとしては、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、およびコントラウイルス属のメンバーが挙げられる。例示的な自律性パルボウイルスとしては、限定されるものではないが、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在公知であるか、または後で発見される任意の他の自律性パルボウイルスが挙げられる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。
【0080】
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、限定されるものではないが、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在公知であるか、または後で発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい。いくつかの比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが特定されている（例えば、Gao et al., (2004) J. Virology 78:6381-6388；Moris et al., (2004) Virology 33-:375- 383；ならびに２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号に開示される表１、ならびに国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７の表１も参照されたく、それらのそれぞれは、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【0081】
ＡＡＶおよび自律性パルボウイルスのさまざまな血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ逆位末端反復（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたく；それらの開示は、パルボウイルスならびにＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するため、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Srivistava et al., (1983) J Virology 45:555；Chiarini et al., (1998) J. Virology 71:6823；Chiarini et al., (1999) J. Virology 73:1309；Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939；Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208；Shade et al., (1986) J. Viral. 58:921；Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Morris et al., (2004) Virology 33-:375- 383；国際特許公開のＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく；それらの開示は、パルボウイルスならびにＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するため、参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１１月１９日に出願された第６２，９３７，５５６号に開示される表１および表５、または国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７に開示される表１も参照されたく、それらのそれぞれは、それらの全体が本明細書に組み込まれる。自律性パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)に、より詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99:10405-10）、ＡＡＶ４（Padron et al., (2005) J. Viral. 79: 5047-58）、ＡＡＶ５（Walters et al., (2004) J. Viral. 78: 3361-71）、およびＣＰＶ（Xie et al., (1996) J. Mal. Biol. 6:497-520およびTsao et al., (1991) Science 251: 1456-64）の結晶構造の記載も参照されたい。
【0082】
「向性」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスがある特定の細胞または組織に優先的に入り、必要に応じて、それに続いて、細胞においてウイルスゲノムによって運ばれる配列の発現（例えば、転写、および必要に応じて、翻訳）、例えば、組換えウイルスについて、目的の異種核酸の発現が起こることを指す。
【0083】
本明細書で使用される場合、「全身向性」および「全身形質導入」（および等価な用語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、身体全体にわたる組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）に対する向性を示し、および／またはそれらを形質導入することを示す。本発明の実施形態では、中枢神経系（例えば、脳、ニューロン細胞など）の全身形質導入が観察される。他の実施形態では、心筋組織の全身形質導入が達成される。
【0084】
本明細書で使用される場合、「選択的向性」または「特異的向性」は、ある特定の標的細胞および／もしくはある特定の組織へのウイルスベクターの送達、ならびに／またはそれらの特異的な形質導入を意味する。
【0085】
他に示されない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または類似する用語は、好適な対照を参照することによって決定することができる（例えば、それぞれ、対照の形質導入または向性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、またはそれよりも高い）。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓細胞および筋肉細胞を効率的に形質導入するか、またはそれらに対する効率的な向性を有する。好適な対照は、所望の向性および／または形質導入プロファイルを含む、各種の因子に依存するであろう。
【0086】
同様に、ウイルスが標的組織に対して「効率的に形質導入されない」もしくは「効率的な向性を有さない」かどうか、または類似する用語は、好適な対照を参照することによって決定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、腎臓、生殖腺および／または胚細胞に対して効率的に形質導入されない（すなわち、効率的な向性を有さない）。特定の実施形態では、組織（例えば、腎臓）の形質導入（例えば、望ましくない形質導入）は、所望の標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、横隔膜筋、心筋および／または中枢神経系の細胞）の形質導入のレベルの、２０％またはそれよりも低い、１０％またはそれよりも低い、５％またはそれよりも低い、１％またはそれよりも低い、０．１％またはそれよりも低い。
【0087】
本発明の一部の実施形態では、本発明のカプシドを含むＡＡＶ粒子は、３０のある特定の組織／細胞の効率的な形質導入、およびその形質導入が望ましくないある特定の組織／細胞の極めて低レベルの形質導入（例えば、低減した形質導入）の複数の表現型を実証することができる。
【0088】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、他に指示されない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【0089】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
【0090】
「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ウイルス中に天然に存在しない核酸配列を指す。一般に、異種核酸分子または異種ヌクレオチド配列は、目的の（例えば、細胞および／または対象に送達するための）ポリペプチドおよび／または非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【0091】
「キメラ核酸」は、融合ポリペプチドをコードするために、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれよりも多くの核酸配列を含む。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであり得る。
【0092】
「融合ポリペプチド」という用語は、典型的には、ペプチド結合によって、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを含む。
【0093】
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物体またはウイルスの他の構成成分、例えば、ポリヌクレオチドに関連して一般に見出される、細胞もしくはウイルスの構造成分、または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれよりも高く富化される。
【0094】
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然に存在する生物体またはウイルスの他の構成成分、例えば、ポリペプチドに関連して一般に見出される、細胞もしくはウイルスの構造成分、または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれよりも高く富化される。
【0095】
「単離された細胞」は、その天然状態において通常関連する他の構成成分から分離された細胞を指す。例えば、単離された細胞は、培養培地中の細胞、および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であり得る。そのため、単離された細胞は、対象に送達され得るか、および／または対象に導入され得る。一部の実施形態では、単離された細胞は、対象から取り出され、ｅｘ ｖｉｖｏで本明細書に記載されるようにして操作され、次いで、対象へ戻される細胞であり得る。
【0096】
ビリオンの集団は、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製することができる。一実施形態では、集団は、少なくとも１０１ビリオンである。一実施形態では、集団は、少なくとも１０２ビリオン、少なくとも１０３ビリオン、少なくとも１０４ビリオン、少なくとも１０５ビリオン、少なくとも１０６ビリオン、少なくとも１０７ビリオン、少なくとも１０８ビリオン、少なくとも１０９ビリオン、少なくとも１０１０ビリオン、少なくとも１０１１ビリオン、少なくとも１０１２ビリオン、少なくとも１０１３ビリオン、少なくとも１０１４ビリオン、少なくとも１０１５ビリオン、少なくとも１０１６ビリオン、または少なくとも１０１７ビリオンである。ビリオンの集団は、不均一であり得るか、または均一（例えば、実質的に均一または完全に均一）であり得る。
【0097】
「実質的に均一な集団」は、この用語が本明細書で使用される場合、夾雑物のビリオン（同一ではないもの）がほとんどない～まったくない、ほぼ同一であるビリオンの集団を指す。実質的に均一な集団は、少なくとも９０％の同一のビリオン（例えば、所望のビリオン）であり、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％の同一のビリオンであり得る。
【0098】
完全に均一であるビリオンの集団は、同一のビリオンのみを含有する。
【0099】
本明細書で使用される場合、ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団を「単離する」または「精製する」（または文法上の等価物）とは、ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団が、出発材料中の他の構成成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団は、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはそれより高く富化される。
【0100】
他に示されない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または類似する用語は、好適な対照を参照することによって決定することができる（例えば、それぞれ、対照の形質導入または向性の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、またはそれよりも高い）。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ニューロン細胞および心筋細胞を効率的に形質導入するか、またはそれらに対する効率的な向性を有する。好適な対照は、所望の向性および／または形質導入プロファイルを含む、各種の因子に依存するであろう。
【0101】
「治療用ポリペプチド」は、細胞または対象におけるタンパク質の非存在または欠乏から生じる症状を軽減し、低減し、防止し、遅延させ、および／または安定化することができるポリペプチドであるか、ならびに／あるいはそうでなければ、対象に、利益、例えば、疾患の症状を低減もしくは排除するための酵素補充、または移植片生存可能性の改善、または免疫応答の誘導を付与するポリペプチドである。
【0102】
「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ウイルス中に天然に存在しない核酸配列を指す。一般に、異種核酸分子または異種ヌクレオチド配列は、目的の（例えば、細胞および／または対象に送達するための）ポリペプチドおよび／または非翻訳ＲＮＡ、例えば、ＧＡＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【0103】
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達媒体として機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指す。あるいは、一部の文脈では、「ベクター」という用語は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独を指すために使用されることがある。
【0104】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生成するために、逆位末端反復（ＴＲ）のみをシスで必要とする。すべての他のウイルス配列は、重要ではなく、トランスで供給され得る（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbial. Immunol. 158:97）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化にするために、１つまたは複数のＴＲ配列のみを保持するであろう。構造タンパク質および非構造タンパク質のコード配列は、（例えば、プラスミドなどのベクターから、またはパッケージング細胞への配列の安定的な組み込みによって）トランスで提供され得る。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、必要に応じて、２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、それらは、典型的には、ベクターゲノムの５’および３’末端に存在し、異種核酸に隣接しているが、それらと連続している必要はない。ＴＲは、同じまたは互いに異なり得る。
【0105】
「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、ヘアピン構造を形成し、逆位末端反復（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなどを媒介するＩＴＲ）として機能する、任意のウイルス末端反復配列または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであり得る。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもの、または任意の他の好適なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製開始点としての機能を果たすＳＶ４０ヘアピン）などの非ＡＡＶ ＴＲ配列を、ＴＲとして使用することができ、それらは、短縮化、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「ダブルＤ配列」などの部分的にまたは完全に合成のものであり得る。
【0106】
「ＡＡＶ逆位末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」を含む「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、限定されるものではないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２、または現在公知であるか、もしくは後で発見される任意の他のＡＡＶを含む、任意のＡＡＶ由来であり得る。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、ネイティブ末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブＡＡＶ ＴＲまたはＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、短縮化および／またはミスセンス変異によって変更されてもよい）。
【0107】
ＡＡＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、正２０面体対称のＡＡＶカプシドを形成するために、一緒に相互作用するカプシドタンパク質である。ＶＰ１．５は、米国公開第２０１４／００３７５８５号に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質である。
【0108】
本発明のウイルスベクターは、さらに、（例えば、定方向の向性を有する）「標的化」ウイルスベクター、ならびに／または国際特許公開のＷＯ００／２８００４およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載される「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルス由来であるもの）であり得る。
【0109】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開のＷＯ０１／９２５５１（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。そのため、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムは、本発明のウイルスカプシドにパッケージングされ得る。
【0110】
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含有することができる。
【0111】
「キメラ」カプシドタンパク質は、本明細書で使用される場合、野生型と比べて、カプシドタンパク質のアミノ酸配列中の１個または複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）のアミノ酸残基の置換、ならびに野生型と比べて、アミノ酸配列中の１個または複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）のアミノ酸残基の挿入および／または欠失によって改変されているＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のいずれか１つまたは複数）を意味する。一部の実施形態では、あるＡＡＶ血清型由来の完全なまたは部分的なドメイン、機能的領域、エピトープなどは、任意の組合せで、異なるＡＡＶ血清型の対応する野生型のドメイン、機能的領域、エピトープなどと置き換えて、本発明のキメラカプシドタンパク質を生成することができる。キメラカプシドタンパク質の生成は、当技術分野において周知のプロトコールに従って行うことができ、本発明のカプシドに含まれ得る、著しい数のキメラカプシドタンパク質が、文献および本明細書に記載されている。
【0112】
本明細書で使用される場合、「ハプロイドＡＡＶ」という用語は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際出願のＷＯ２０１８／１７０３１０または米国出願のＵＳ２０１８／０３７１４９に記載されるＡＡＶを意味するものとする。一部の実施形態では、ビリオンの集団は、ビリオン粒子が構築され得るハプロイドＡＡＶ集団であり、ＡＡＶカプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３からなる群からの少なくとも１つのウイルスタンパク質は、他のウイルスタンパク質の少なくとも１つと異なり、ＡＡＶゲノムを封入することができるビリオン粒子を形成するために必要である。存在するそれぞれのウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）について、そのタンパク質は同じ種類（例えば、すべてＡＡＶ２ ＶＰ１）である。一例では、ウイルスタンパク質の少なくとも１つはキメラウイルスタンパク質であり、他の２つのウイルスタンパク質の少なくとも１つはキメラではない。一実施形態では、ＶＰ１およびＶＰ２はキメラであり、ＶＰ３のみがキメラではない。例えば、キメラＡＡＶ２／８（ＡＡＶ２のＮ末端およびＡＡＶ８のＣ末端）由来のＶＰ１／ＶＰ２から構成されるウイルス粒子のみが、ＡＡＶ２由来のＶＰ３とのみ対形成したか、またはキメラＶＰ１／ＶＰ２ ２８ｍ－２Ｐ３（ＶＰ３開始コドンの成熟なしのＡＡＶ８由来のＮ末端およびＡＡＶ２由来のＣ末端）のみが、ＡＡＶ２由来のＶＰ３のみと対形成した。別の実施形態では、ＶＰ３のみがキメラであり、ＶＰ１およびＶＰ２はキメラではない。別の実施形態では、ウイルスタンパク質の少なくとも１つは、完全に異なる血清型由来である。例えば、キメラＶＰ１／ＶＰ２ ２８ｍ－２Ｐ３のみが、ＡＡＶ３のみに由来するＶＰ３と対形成した。別の例では、キメラは存在しない。
【0113】
「ハイブリッド」ＡＡＶベクターまたはパルボウイルスという用語は、ウイルスのＴＲまたはＩＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルス由来である、ｒＡＡＶベクターを指す。ハイブリッドベクターは、国際特許公開のＷＯ００／２８００４およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されている。例えば、ハイブリッドＡＡＶベクターは、典型的には、アデノウイルスの複製およびパッケージングのために十分なアデノウイルス５’および３’シスＩＴＲ配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。
【0114】
「ポリプロイドＡＡＶ」という用語は、２つまたはそれよりも多くのＡＡＶ血清型由来のカプシドから構成され、例えば、より高い形質導入のために個々の血清型からの利点を取ることができるが、ある特定の実施形態では、親由来の向性を排除する、ＡＡＶベクターを指す。
【0115】
「ＧＡＡ」または「ＧＡＡポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、成熟（約７６または約６７ｋＤａ）および前駆体（例えば、約１１０ｋＤａ）ＧＡＡだけでなく、生物学的機能を保持する（すなわち、上記に定義されるように、ネイティブＧＡＡタンパク質の少なくとも１つの生物活性を有する、例えば、グリコーゲンを加水分解することができる）改変された（例えば、短縮化された、または挿入、欠失および／もしくは置換によって変異された）ＧＡＡタンパク質またはそれらの断片、およびＧＡＡバリアント（例えば、Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362:269によって記載されるＧＡＡ ＩＩ；ＧＡＡ多形体およびＳＮＰは、Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001) in The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease (Scriver, C. R., Beaudet. A. L., Sly, W. S. & Valle, D. Eds.), pp. 3389-3419, McGraw-Hill, New York, see pages 3403-3405によって記載されており；その全体が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる）を包含する。当技術分野において公知の任意のＧＡＡコード配列が使用されてもよく、例えば、図８および９のコード配列；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５２、ならびにHoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7:1697およびVan Hove et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:65（ヒト）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００８０６４（マウス）、ならびにKunita et al., (1997) Biochemica et Biophysics Acta 1362:269（ウズラ）を参照されたく；それらの開示は、ＧＡＡのコード配列および非コード配列のそれらの教示のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0116】
「カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）」、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、「ＣＩ－ＭＰＲ／ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ－ＩＩ受容体」もしくは「ＩＧＦ２受容体」という用語、またはそれらの略語は、本明細書で互換的に使用され、Ｍ６ＰおよびＩＧＦ－ＩＩの両方と結合する細胞受容体を指す。
【0117】
「標的化配列」とも称される「標的化ペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の細胞内コンパートメント、例えば、哺乳動物リソソームを標的にするペプチドを指すことが意図される。本明細書における使用のために包含される標的化ペプチドは、マンノース－６－リン酸非依存性であるリソソーム標的化ペプチドである。例示的な標的化配列は、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドである。
【0118】
「ＩＧＦ２標的化配列」または「ＩＧＦ２リーダー配列」と併せて使用される「ＩＧＦ２配列」、および「ＩＧＦ２標的化ペプチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞の表面上でＣＩ－ＭＢＲに結合するＩＧＦ２ポリペプチドの配列を指す。特に、ＩＧＦ２配列は、配列番号５のＩＧＦ２取り込み配列の一部を含むか、または配列番号５のアミノ酸に改変を含むペプチドである。ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲまたはＣＡ－Ｍ６Ｐ受容体）の反復１１～１２、反復１１、またはアミノ酸１５０８～１５６６から本質的になる受容体ドメインに結合するペプチド配列を指す。
【0119】
「リーダー配列」という用語は、本明細書で「分泌シグナル配列」もしくは「シグナル配列」もしくは「シグナルペプチド」という用語、またはそれらの変形と互換的に使用され、ネイティブポリペプチドで見られる分泌のレベルと比較して、作動可能に連結されたポリペプチド（例えば、ＧＡＡペプチドまたはＩＧＦ２－ＧＡＡ融合タンパク質）の細胞からの分泌を増強するように機能する（上記に定義される通り）アミノ酸配列を指すことが意図される。上記に定義されるように、「増強された」分泌とは、細胞から分泌される細胞によって合成されたリソソームポリペプチドの相対割合が増加することを意味し、分泌されたタンパク質の絶対量も増加することは必要ではない。本発明の特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドの本質的にすべて（すなわち、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い）が分泌される。しかしながら、分泌のレベルがネイティブＧＡＡポリペプチドと比較して増強される限り、ＧＡＡポリペプチドの本質的にすべてまたはさらには大部分が分泌されることは必要ではない。例示的なリーダー配列としては、限定されるものではないが、本明細書に開示される、生得的ＧＡＡリーダー配列（同族ＧＡＡリーダー配列も指す）、ＡＡＴ配列、ＩＬ２（１－３）、ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｗｔ）、改変ＩＬ２リーダー配列（ＩＬ２ ｍｕｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ１；ＦＢＮとも称される）もしくはＩｇＧリーダー配列、またはそれらの機能的バリアントが挙げられる。
【0120】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に存在するアミノ酸、それらの改変型、および合成アミノ酸を包含する。天然に存在する左旋性（Ｌ－）アミノ酸は、その全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２０１８／０３７１４９６号の表２に開示されている。あるいは、アミノ酸は、改変アミノ酸残基（非限定的な例は、米国公開の米国公開第２０１８／０３７１４９６号の表４に示される）であり得るか、および／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって修飾されたアミノ酸であり得る。さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)によって記載される「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸は、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するために有利に使用することができる。
【0121】
さらに例示するために、例えば、特定のアミノ酸が、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択することができることを本明細書が示す場合、この言語は、アミノ酸を、これらのアミノ酸の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから、それぞれのそのような下位組合せが本明細書に明確に記述されているかのように、選択することができることも示す。また、そのような言語は、指定されたアミノ酸の１個または複数が（例えば、否定的な条件付けによって）放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施形態では、それぞれのそのような可能な放棄が本明細書に明確に記述されているかのように、アミノ酸は、ＡでもＧでもＩでもない；Ａではない；ＧでもＶでもない；などである。
【0122】
「シス調節エレメント」または「ＣＲＥ」という用語は、当業者に周知の用語であり、隣接する遺伝子（すなわち、シスの）の転写を調節またはモジュレートすることができる、エンハンサー、プロモーター、インスレーターまたはサイレンサーなどの核酸配列を意味する。ＣＲＥは、それらが調節する遺伝子の近辺で見出される。ＣＲＥは、典型的には、転写因子（ＴＦ）に結合することによって遺伝子の転写を調節する、すなわち、それらは、ＴＦ結合部位（ＴＦＢＳ）を含む。単一のＴＦは、多くのＣＲＥに結合してもよく、そのため、多くの遺伝子の発現を制御してもよい（多面作用）。ＣＲＥは、通常、常にではないが、それらが調節する遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流に位置する。「エンハンサー」は、それらが作動可能に会合する遺伝子の転写を増強する（すなわち、上方調節する）ＣＲＥであり、それらが調節する遺伝子のイントロンの上流、下流、およびさらにその内で見出すことができる。複数のエンハンサーが、１つの遺伝子の転写を調節するように、協調した方法で作用することができる。この文脈における「サイレンサー」は、リプレッサーと呼ばれるＴＦと結合するＣＲＥに関し、これは、遺伝子の転写を防止または下方調節するように作用する。「サイレンサー」という用語はまた、メッセンジャーＲＮＡの３’非翻訳領域中の領域を指すこともでき、これは、ｍＲＮＡ分子の翻訳を抑制するタンパク質と結合するが、この使用は、ＣＲＥの記載におけるその使用と異なる。一般に、本発明のＣＲＥは、肝臓特異的エンハンサー（多くの場合、肝臓特異的ＣＲＥ、または肝臓特異的ＣＲＥエンハンサーなどと称される）である。本文脈では、ＣＲＥが、転写開始部位（ＴＳＳ）から１５００ヌクレオチドまたはそれよりも短い、より好ましくは、ＴＳＳから１０００ヌクレオチドまたはそれよりも短い、より好ましくは、ＴＳＳから５００ヌクレオチドまたはそれよりも短い、好適には、ＴＳＳから２５０、２００、１５０もしくは１００ヌクレオチドまたはそれよりも短い位置にあることが好ましい。本発明のＣＲＥは、好ましくは、比較的短い長さ、好ましくは、１００ヌクレオチドまたはそれよりも短い長さであり、例えば、それらは、９０、８０、７０、６０ヌクレオチドまたはそれよりも短い長さであってもよい。
【0123】
「シス調節モジュール」または「ＣＲＭ」という用語は、２つまたはそれよりも多くのＣＲＥから構成される機能的モジュールを意味し、本発明では、ＣＲＥは、典型的には、肝臓特異的エンハンサーである。そのため、本出願では、ＣＲＭは、典型的には、複数の肝臓特異的エンハンサーＣＲＥを含む。典型的には、ＣＲＭ内の複数のＣＲＥは、ＣＲＥが作動可能に会合する遺伝子の転写を増強するように、一緒に（例えば、加えてまたは相乗的に）作用する。ＣＲＭ内のＣＲＥを、シャッフルする（すなわち、整理し直す）、反転させる（すなわち、方向性を逆転させる）、およびＣＲＭ内のＣＲＥの間隔を変更するための保存可能な範囲が存在する。したがって、本発明のＣＲＭの機能的バリアントは、参照されるＣＲＭのバリアントを含み、それら内のＣＲＥが、シャッフルおよび／もしくは反転されているか、ならびに／またはＣＲＥ間の間隔が変更されている。
【0124】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という語句は、一般に、転写を起こすために必要である、すなわち、転写を開始する、転写される核酸配列の上流に位置するＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、それらの制御下で、コード配列の転写の適当な活性化または抑制を可能にする。プロモーターは、典型的には、複数のＴＦが認識し、それと結合する、特異的配列を含有する。ＴＦは、プロモーター配列に結合し、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素であるＲＮＡポリメラーゼの動員をもたらす。非常に多くのプロモーターが当技術分野において公知である。
【0125】
「合成プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、天然で生じないプロモーターに関する。本文脈では、これは、典型的には、ミニマル（またはコア）プロモーターまたは肝臓特異的近位プロモーターに作動可能に連結された本発明の合成ＣＲＥおよび／またはＣＲＭを含む。本発明のＣＲＥおよび／またはＣＲＭは、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の肝臓特異的転写を増強する働きをする。合成プロモーターの部分は、天然に存在していてもよいが（例えば、ミニマルプロモーター、またはプロモーター中の１つもしくは複数のＣＲＥ）、完全に実体としての合成プロモーターは、天然に存在しない。
【0126】
本明細書で使用される場合、「ミニマルプロモーター」（「コアプロモーター」としても公知）は、それ自身によって不活性または大部分が不活性であるが、他の転写調節エレメントと組み合わされた場合に転写を媒介することができる、短いＤＮＡセグメントを指す。ミニマムプロモーター配列は、原核生物および真核生物の遺伝子を含む、さまざまな異なる供給源に由来することができる。ミニマルプロモーターの例は、上記で議論され、ドーパミンベータ－ヒドロキシラーゼ遺伝子ミニマムプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子ミニマムプロモーター（ＣＭＶ－ＭＰ）、およびヘルペスチミジンキナーゼミニマルプロモーター（ＭｉｎＴＫ）が挙げられる。ミニマルプロモーターは、典型的には、転写開始部位（ＴＳＳ）および直ぐ上流のエレメント、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための結合部位、ならびに基本転写因子結合部位（多くの場合、ＴＡＴＡボックス）を含む。
【0127】
本明細書で使用される場合、「近位プロモーター」は、一次調節エレメントを含有する傾向がある遺伝子の上流の近位配列をプラスしたミニマルプロモーターに関する。これは、多くの場合、ＴＳＳの上流のおよそ２５０塩基対に広がり、特異的ＴＦＢＳを含む。本場合では、近位プロモーターは、好適には、本発明の１つまたは複数のＣＲＥまたはＣＲＭと組み合わせることができる天然に存在する肝臓特異的近位プロモーターである。しかしながら、近位プロモーターは合成であり得る。
【0128】
本発明の文脈におけるシス調節エレメント（ＣＲＥ）、シス調節モジュール（ＣＲＭ）、プロモーターまたは他の核酸配列の「機能的バリアント」は、参照配列と、例えば、肝臓特異的シス調節エンハンサーエレメント、肝臓特異的シス調節モジュール、または肝臓特異的プロモーターと同じ方法で機能する能力を保持する参照配列のバリアントである。そのような機能的バリアントのための代替用語は、「生物学的等価体」または「等価体」を含む。
【0129】
肝臓特異的エンハンサーとして機能する所与のシス調節エレメントの能力は、参照配列に結合する同じ肝臓特異的転写因子（ＴＦ）と結合する配列の能力によって主に決定されることが認識されるであろう。したがって、ほとんどの場合では、シス調節エレメントの機能的バリアントは、参照シス調節エレメントと同じＴＦに対するＴＦＢＳを含有するであろう。必須ではないが、機能的バリアントの転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）が、参照シス調節エレメントと同じ相対位置（すなわち、順序）であることが好ましい。必須ではないが、機能的バリアントのＴＦＢＳが、参照配列と同じ方向性であることも好ましい（ＴＦＢＳが、一部の場合では、例えば、参照配列中の配列に相対した逆の相補体として、逆の方向性で存在し得ることに留意されたい）。必須ではないが、機能的バリアントのＴＦＢＳが、参照配列と同じ鎖にあることも好ましい。そのため、好ましい実施形態では、機能的バリアントは、同じＴＦについてのＴＦＢＳを、参照配列と同じ順序、同じ方向性および同じ鎖上に含む。ＴＦＢＳ間にある配列（一部の場合では、スペーサー配列などと称される）が、シス調節エレメントの機能にあまり重要ではないことも認識されるであろう。そのような配列は、典型的には、かなり変更することができ、それらの長さを変更することができる。しかしながら、好ましい実施形態では、間隔（すなわち、隣接ＴＦＢＳ間の距離）は、それが参照配列中にあるので、機能的バリアント中で実質的に同じである（例えば、それは、２０を超えて、好ましくは、１０％を超えて、変更されず、より好ましくは、それは同じである）。一部の場合では、シス調節エンハンサーエレメントの機能的バリアントが、逆の方向性で存在することができること、例えば、それが、上記に記載されるシス調節エンハンサーエレメントの逆の相補体、またはそれらのバリアントであり得ることが明らかであろう。
【0130】
機能的バリアントおよび参照配列の間の配列同一性のレベルはまた、指標または保持された機能性であり得る。シス調節エレメントのＴＦＢＳにおける高レベルの配列同一性は、一般に、スペーサー配列における配列同一性よりも重要なものである（配列の任意の保存についてのわずかな要件がある、または要件がない場合）。しかしながら、さらにＴＦＢＳ内では、機能的ＴＦＢＳの配列がコンセンサス配列と厳密に一致する必要がないことを考えると、かなりの程度の配列の変形が適合され得ることが認識されるであろう。
【0131】
所与の機能的バリアントにおいてＴＦＢＳに結合する１つまたは複数のＴＦの能力は、限定されるものではないが、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、結合アッセイ、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびＣｈＩＰシークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）を含む、当技術分野において公知の任意の関連する手段によって決定することができる。好ましい実施形態では、所与の機能的バリアントと結合する１つまたは複数のＴＦの能力は、ＥＭＳＡによって決定される。ＥＭＳＡを行う方法は当技術分野において周知である。好適なアプローチは、上記で引用したSambrook et al.に記載されている。この手順を記載する多くの関連する論文、例えば、Hellman and Fried, Nat Protoc. 2007; 2(8): 1849-1861が利用可能である。
【0132】
「肝臓特異的」または「肝臓特異的発現」という用語は、プロモーターに関する場合、他の組織（例えば、脾臓、筋肉、心臓、肺および脳）と比較して、優先的または主な方法で、肝臓における（または肝臓に由来する細胞における）遺伝子の発現を増強または駆動する、シス調節エレメント、シス調節モジュールまたはプロモーターの能力を指す。遺伝子の発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の形態であり得る。一部の実施形態では、肝臓特異的発現は、他の（すなわち、非肝臓）組織または細胞においてごくわずかな発現が存在する、すなわち、発現が非常に肝臓特異的であるようなものである。一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓において優先的に発現を駆動するが、これは、より低いレベルで、目的の別の組織、例えば、筋肉において、遺伝子の発現を駆動することもできる。
【0133】
肝臓特異的シス調節エンハンサーエレメントとして機能するシス調節エレメントの能力は、当業者によって容易に評価することができる。当業者は、したがって、上記で列挙された特異的シス調節エレメントの任意のバリアントが機能的のままである（すなわち、それが、上記に定義される機能的バリアントである）かどうかを容易に決定することができる。例えば、評価される任意の所与のシス調節エレメントを、ミニマルプロモーターに作動可能に連結することができ（例えば、ＣＭＶ－ＭＰの上流に設置される）、遺伝子（典型的には、レポーター遺伝子）の肝臓特異的発現を駆動するシス調節エレメントの能力が測定される。あるいは、シス調節エンハンサーエレメントのバリアントは、参照シス調節エンハンサーエレメントの代わりに合成肝臓特異的プロモーターに置換することができ、前記改変プロモーターによって駆動される肝臓特異的発現に対する効果を、決定し、未改変形態と比較することができる。同様に、肝臓特異的発現を駆動するシス調節モジュールまたはプロモーターの能力は、当業者によって容易に評価することができる（例えば、下記の実施例に記載される通り）。参照プロモーターのバリアントによって駆動される遺伝子の発現レベルは、参照配列によって駆動される発現レベルと比較することができる。バリアントプロモーターによって駆動される肝臓特異的発現レベルが、参照プロモーターによって駆動される発現レベルの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％である、一部の実施形態では、これは、バリアントが機能的のままであると言うことができる。好適な核酸構築物、および肝臓特異的発現の増強を評価するためのレポーターアッセイは、容易に構築することができ、下記に記述される例は、好適な方法論を与える。
【0134】
遺伝子（例えば、治療用遺伝子またはレポーター遺伝子）の発現が、肝臓に由来する細胞において優先的または主に起こる、肝臓特異性を特定することができる。優先的または主な発現は、例えば、発現のレベルが、細胞の他の種類（すなわち、肝臓に由来しない細胞）におけるよりも肝臓に由来する細胞において有意に高い場合に定義することができる。例えば、肝臓に由来する細胞における発現は、好適には、非肝臓細胞よりも少なくとも５倍高く、好ましくは、非肝臓細胞よりも少なくとも１０倍高く、これは、一部の場合では、５０倍またはそれよりも高くあり得る。便宜上、肝臓特異的発現は、好適には、腎臓に由来する細胞系（例えば、ＨＥＫ－２９３）、子宮頸部組織に由来する細胞系（例えば、ＨｅＬａ）および／または肺に由来する細胞系（例えば、Ａ５４９）における発現レベルと比較する、肝細胞系（例えば、Ｈｕｈ７および／またはＨｅｐＧ２細胞などの肝臓に由来する細胞系）または肝臓初代細胞における発現レベルの比較を介して実証することができる。
【0135】
本発明の合成肝臓特異的プロモーターは、好ましくは、対象の肝臓において発現を促進するため、例えば、導入遺伝子、好ましくは、治療用導入遺伝子の肝臓特異的発現を駆動するために、好適である。一部の実施形態では、本発明の肝臓特異的プロモーターは、配列番号４３２のＬＰ１プロモーターよりも少なくとも１．５倍高い、好ましくは、ＬＰ１プロモーターよりも２倍高い、より好ましくは、ＬＰ１プロモーターよりも３倍高い、さらにより好ましくは、ＬＰ１プロモーター（配列番号４３２）よりも５倍高いレベルで肝臓特異的導入遺伝子の発現を促進するために好適である。そのような発現は、好適には、肝臓に由来する細胞、例えば、Ｈｕｈ７および／もしくはＨｅｐＧ２細胞、または初代肝臓細胞（好適には、初代ヒト肝細胞）において決定される。一部の実施形態では、本発明の合成肝臓特異的プロモーターは、肝臓に由来しない細胞（例えば、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａおよび／またはＡ５４９細胞）において、ＬＰ１プロモーター（配列番号４３２）の３分の２以下のレベルで遺伝子発現を促進するために好適である。
【0136】
本発明の好ましい合成肝臓特異的プロモーターは、肝臓特異的導入遺伝子の発現を促進するために好適であり、ＴＢＧプロモーター（配列番号４３５）の活性の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％または４００％である肝臓細胞における活性を有する。
【0137】
本発明の合成肝臓特異的プロモーターは、好ましくは、肝臓に由来する細胞において配列番号４３３のＣＭＶ－ＩＥプロモーターよりも少なくとも１．５倍高いレベルで、好ましくは、肝臓に由来する細胞（例えば、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａおよび／またはＡ５４９細胞）において、ＣＭＶプロモーターよりも少なくとも２倍高いレベルで肝臓特異的発現を促進するために好適である。本明細書に開示される合成肝臓特異的プロモーターは、肝臓における高、中および低発現を指すＬＳＰ－Ｈ、ＬＳＰ－ＭおよびＬＳＰ－Ｌプロモーターであり得、一部の実施形態では、ＬＳＰ－Ｈ、ＬＳＰ－ＭおよびＬＳＰ－Ｌは、肝臓においてタンパク質を優先的または主に発現することができるが、１つまたは複数の他の組織、例えば、筋肉および／または脳において、タンパク質を発現することもできる。本明細書に開示されるそのようなＬＳＰ－Ｈ、ＬＳＰ－ＭおよびＬＳＰ－Ｌプロモーターは、肝臓において、少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％のタンパク質を優先的に発現することができ、別の組織、例えば、筋肉組織において、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％を発現することもできる。一部の実施形態では、例えば、ポンペ病またはリソソーム病の処置のために、本明細書に開示される方法および組成物において有用なＬＳＰ－Ｈ、ＬＳＰ－ＭおよびＬＳＰ－Ｌプロモーターは、肝臓において、優先的または主な方法で遺伝子発現を駆動または増強するが、筋肉組織において少なくとも一部のタンパク質を発現することもできる。
【0138】
「同一性」および「同一」などの用語は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子間などの２つの核酸分子間の配列類似性を指す。配列アライメントおよび配列同一性の決定は、例えば、Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10)によって元々は記載されている基本的なローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）、例えば、Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)によって記載されている「Ｂｌａｓｔ２配列」アルゴリズムを使用して行うことができる。
【0139】
「合成」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在しない核酸分子を意味する。本発明の合成核酸発現構築物は、人工的に、典型的には、組換え技術によって、生成される。そのような合成核酸は、天然に存在する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、および他のそのような調節配列）を含有していてもよいが、それらは、天然に存在しない状況に存在する。例えば、合成遺伝子（または遺伝子の部分）は、典型的には、天然では連続しない１つもしくは複数の核酸配列を含有するか（キメラ配列）か、ならびに／または置換、挿入および欠失、ならびにそれらの組合せを包含し得る。
【0140】
「スペーサー配列」または「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、２つの機能的核酸配列を分離する核酸配列である。これは、機能的核酸配列（例えば、シス調節エレメント）が所望により機能するのを防止しないという条件で、本質的に任意の配列を有し得る（例えば、これは、それが、サイレンサー配列を含み、所望の転写因子の結合を防止する場合などに起こり得る）。典型的には、これは、隣接する機能的核酸配列を互いから離すためにのみ存在するので、非機能的である。
【0141】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野と一致し、医薬組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害でないことを意味する。
【0142】
「処置する」、「処置すること」または「の処置」という用語（およびそれらの文法的変形）とは、対象の状態の重症度を低減する、少なくとも部分的に改善する、もしくは安定させること、および／または少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和、減少もしくは安定化が達成されること、および／または疾患もしくは障害の進行の遅延が存在することを意味する。
【0143】
「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語（およびそれらの文法的変形）は、本発明の方法の非存在下で起こるであろうことと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の開始の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症状の開始の重症度の低減を指す。予防は、完全、例えば、疾患、障害および／または臨床症状の完全に非存在であり得る。予防はまた、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の出現、ならびに／または開始の重症度が、本発明の非存在下で起こるであろうものよりも実質的に少ないような、部分的であり得る。
【0144】
「処置有効」量は、本明細書で使用される場合、いくらかの改善または利益を対象に提供するために十分な量である。言い換えると、「処置有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状のいくらかの軽減、緩和、減少、または安定化を提供する量である。当業者は、いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果は完全または治癒的である必要がないことを認識するであろう。
【0145】
「予防有効」量は、本明細書で使用される場合、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の開始を予防するため、および／もしくは遅延させるため、ならびに／または本発明の方法の非存在下で起こるであろうものと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の開始の重症度を低減するため、および／もしくは遅延させるために十分な量である。当業者は、いくらかの予防的利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要がないことを認識するであろう。
【0146】
「治療有効量」という語句および類似の語句は、例えば、肝臓において治療用遺伝子を発現する、および血漿に分泌する、所望の特異的な薬理学的効果を提供する、対象における用量または血漿濃度を意味する。そのような投薬量が、当業者によって治療有効量であると見なされたとしても、治療有効量は、本明細書に記載される状態を処置するのに常に有効ではないことがあることが協調される。治療有効量は、投与の経路および剤形、対象の年齢および体重、ならびに／または処置される疾患もしくは状態に基づいて変更され得る。
【0147】
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、処置を必要とする疾患または状態を有する任意の個々の対象を指す。本開示の目的のために、対象は、霊長類、好ましくは、ヒト、または別の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヤギ、もしくはウシなどであり得る。
【0148】
発現される目的の遺伝子を含むＤＮＡベクターを含む、ＡＡＶまたはＡＡＶの態様に関連するか、それらを開示するか、またはそれらを記載する、参照のために本明細書に組み込まれる追加の特許は、米国特許第６，４９１，９０７号；同第７，２２９，８２３号；同第７，７９０，１５４号；同第７，２０１８９８号；同第７，０７１，１７２号；同第７，８９２，８０９号；同第７，８６７，４８４号；同第８，８８９，６４１号；同第９，１６９，４９４号；同第９，１６９，４９２号；同第９，４４１，２０６号；同第９，４０９，９５３号；および同第９，４４７，４３３号；同第９，５９２，２４７号；および同第９，７３７，６１８号である。
ＩＩ．ｒＡＡＶゲノムエレメント
ＩＩ．ｒＡＡＶゲノムエレメント
【0149】
本明細書に開示されるように、本技術の一態様は、カプシド、およびそのカプシド内の「ｒＡＡＶベクターゲノム」と称されるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターに関する。ｒＡＡＶベクターゲノム（「ｒＡＡＶゲノム」とも称される）は、限定されるものではないが、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ、例えば、５’－ＩＴＲおよび３’－ＩＴＲ）、ならびにＩＴＲの間に位置する、プロモーター、異種遺伝子およびポリＡテイルを含む追加エレメントを含む、複数のエレメントを含む。
【0150】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、ならびに５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸をコードする異種核酸に動作可能に連結されたプロモーター、例えば、本明細書に開示される肝臓特異的プロモーター配列を含み、異種核酸配列は、必要に応じて、以下のエレメント：イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、およびポリＡ配列の１つまたは複数をさらに含むことができる。
【0151】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、ならびに５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、分泌ペプチドをコードする異種核酸およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸（すなわち、異種核酸は、シグナルペプチド－ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡ融合ポリペプチドをコードする）に動作可能に連結されたプロモーターを含み、ｒＡＡＶゲノムは、必要に応じて、イントロン配列、コラーゲン安定性（ＣＳ）配列、ポリＡテイル、および少なくとも１アミノ酸のスペーサーをコードする核酸の１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、ならびに５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、分泌ペプチド（例えば、ＦＮ１、ＡＡＴまたはＧＡＡシグナルペプチド）をコードする異種核酸およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結された本明細書に開示される肝臓特異的プロモーターを含み、ｒＡＡＶゲノムは、必要に応じて、イントロン配列（例えば、ＭＶＭまたはＨＢＢ２イントロン配列）、コラーゲン安定性（ＣＳ）配列、ポリＡテイル、および少なくとも１アミノ酸のスペーサーをコードする核酸の１つまたは複数をさらに含む。
【0152】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、ならびに５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、分泌ペプチド、標的化ペプチドおよびＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸（すなわち、異種核酸は、シグナルペプチド－標的化配列－ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡ融合ポリペプチドをコードする）に動作可能に連結されたプロモーターを含み、標的化ペプチドは、本明細書に記載されるＩＧＦ２標的化ペプチドであり、ｒＡＡＶゲノムは、必要に応じて、イントロン配列、コラーゲン安定性（ＣＳ）配列、ポリＡテイル、および少なくとも１アミノ酸のスペーサーをコードする核酸の１つまたは複数をさらに含むことができる。
【0153】
ｒＡＡＶゲノム中のエレメントのそれぞれは本明細書で議論される。
Ａ．アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド
Ａ．アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド
【0154】
アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドは、グリコシドヒドロラーゼ（hydrolyases）のファミリー３１のメンバーである。ヒトＧＡＡは、１１０ｋＤａｌの前駆体として合成される（Wisselaar et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31）。酵素の成熟型は、７０および７６ｋＤａｌの単量体の混合物である（Wisselaar et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31）。前駆体酵素は、７つの可能性のあるグリコシル化部位を有し、これらの４つが、成熟酵素において保持される（Wisselaar et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31）。成熟酵素を産生するタンパク質分解切断事象は、後期エンドソームまたはリソソームにおいて起こる（Wisselaar et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3): 2223-31）。
【0155】
ｒＡＡＶベクターゲノムは、例えば、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基４０～９５２もしくは７０～９５２、またはアミノ酸残基４０～７９０もしくは７０～７９０などのより小さな部分を含み得るＧＡＡポリペプチドをコードすることができる。
【0156】
一実施形態では、ＧＡＡポリペプチドは、ＩＧＦ２標的化配列に融合され得る。一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化配列は、ヒトＧＡＡポリペプチドの、アミノ酸４０、またはアミノ酸７０、またはアミノ酸４０もしくは７０の１つもしくは２つの位置内のアミノ酸に融合されている。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドは、細胞外受容体のためのリガンドであり、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体に結合する。
【0157】
Ｃ末端の１６０アミノ酸は、７０および７６ｋＤａｌの成熟ＧＡＡポリペプチド種に存在しない。しかしながら、ＧＡＡ活性の完全な喪失をもたらすある特定のポンペ対立遺伝子、例えば、Ｖａｌ９４９Ａｓｐは、この領域にマッピングされている（Becker et al. (1998) J. Hum. Genet. 62:991）。この変異体の表現型は、タンパク質のＣ末端部分が、７０または７６ｋＤａｌの種の一部ではないが、タンパク質の機能において重要な役割を果たすことを示す。タンパク質のＣ末端部分は、プロセシングの間にタンパク質の残りから切断されるが、主要な種と会合したままであることも報告されている（Moreland et al. (Nov. 1, 2004) J. Biol. Chem., Manuscript 404008200）。したがって、Ｃ末端残基は、タンパク質の触媒活性において直接的な役割を果たすことができ、および／またはタンパク質のＮ末端部分の適当なフォールディングの促進に関与し得る。
【0158】
ネイティブＧＡＡ遺伝子は、シグナル配列および隣接する推定上の膜貫通ドメイン、３つのジスルフィド連結を含有する約４５アミノ酸のシステインリッチドメインであるトレフォイルドメイン（ＰＦＡＭ ＰＦ０００８８）（Thim (1989) FEBS Lett. 250:85）、７０／７６ｋＤａｌの成熟ポリペプチドによって定義されるドメイン、およびＣ末端ドメインを保有する前駆体ポリペプチドをコードする。トレフォイルドメインおよびＣ末端ドメインは両方とも、機能的ＧＡＡの産生のために必要であること、ならびにＣ末端ドメインがタンパク質フォールディングの間にトレフォイルドメインと相互作用し、恐らく、トレフォイルドメインにおける適切なジスルフィド結合形成を促進する可能性があることが報告されている。
【0159】
ＧＡＡポリペプチドは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９６２，３１３号および同第６，５３７，７８５号に記載されている。当業者は、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）、または代わりに標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を融合することができるＧＡＡの特定の位置を認識することができる。したがって、一態様では、本発明は、ＳＰまたはＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号１０のヒトＧＡＡ、または配列番号１７０～１７４の改変ＧＡＡタンパク質、またはそれらの一部分のアミノ酸４０、６８、６９、７０、７１、７２、７７９、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、または７９６に融合されている、ＧＡＡ融合タンパク質に関する。
【0160】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶによって発現されるヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸、またはその断片もしくはバリアント、例えば、配列番号１０の残基４０、６８、６９、７０、７１、７２、７７９、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、もしくは７９６で開始するヒトＧＡＡタンパク質を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶによって発現されるヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸、または配列番号１０と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％同一のタンパク質を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶによって発現されるヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０の残基４０、６８、６９、７０、７１、７２、７７９、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、もしくは７９６で開始するヒトＧＡＡタンパク質、またはそれらと少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％同一のタンパク質であるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶによって発現されるヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１７０（ｍｏｄＧＡＡ；Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ）もしくは配列番号１７１（ｍｏｄＧＡＡ；Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、Ｈ２０１Ｌ）のいずれかの残基４０、６８、６９、７０、７１、７２、７７９、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、もしくは７９６で開始するアミノ酸、またはそれらと少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％同一のタンパク質を含む。
【0161】
一部の実施形態では、当業者は、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）、または代わりに標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を融合することができるＧＡＡの特定の位置を認識することができる。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願のＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１は、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）、または代わりに、標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を付着させることができる切断型ＧＡＡポリペプチドを開示している。シグナルペプチドまたはＩＧＦ２標的化ペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号および２０１９年１１月１５日に出願された国際出願のＷＯ２０２０／１０２６６７に開示されるＧＡＡ切断型タンパク質のアミノ酸で開始する、任意の切断型ＧＡＡポリペプチドまたは切断型改変ＧＡＡポリペプチドに付着させることができる。
【0162】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムによってコードされるＧＡＡ融合ポリペプチドは、例えば、ヒトＧＡＡのアミノ酸残基４０～９５２もしくは残基７０～９５２、またはアミノ酸残基４０～７９０もしくは７０～７９０などのより小さな部分を含むことができる。一実施形態では、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）または標的化ペプチド、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、アミノ酸４０、またはアミノ酸７０、またはアミノ酸４０もしくは７０の１つもしくは２つの位置内のアミノ酸に融合されている。
【0163】
一部の実施形態では、分泌シグナルペプチド（ＳＳ）およびＧＡＡポリペプチド、ならびに必要に応じてＩＧＦ２標的化ペプチドを含む融合タンパク質（すなわち、ＳＳ－ＧＡＡ融合ポリペプチド、またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合タンパク質）は、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）（配列番号１０）のアミノ酸残基４０～９５２または残基７０～９５２を含む。一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端は、ＳＳのＣ末端に付着しており、一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端は、ＩＧＦ２標的化ペプチドのＣ末端に付着しており、ＩＧＦ２標的化ペプチドのＮ末端は、分泌シグナルペプチドのＣ末端に付着している。
（ｉ）改変ＧＡＡ（ｍｏｄＧＡＡ）
（ｉ）改変ＧＡＡ（ｍｏｄＧＡＡ）
【0164】
一部の実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、参照によりそれらの全体が両方とも本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１８６３２６およびMoreland et al., Gene, 2012; 491 (25-30)に開示されているＨ２０１Ｌバリアントを含む。特に、アミノ酸２０１位のヒスチジン（Ｈｉｓ）を、ロイシン（Ｌ）残基に変更して、７６ｋＤのＧＡＡプレタンパク質の７０ｋＤの成熟ＧＡＡタンパク質への迅速なプロセシングを可能にする。
【0165】
特に、一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位またはその近くで増加した疎水性をもたらすアミノ酸の改変を有する、配列番号１０のＧＡＡポリペプチドを含む。一部の例では、ＧＡＡペプチドは、配列番号１０の１９０～２０９位に相当する１個または複数のアミノ酸で改変される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０の１９５～２０９位に相当する１個または複数のアミノ酸で改変される。さらなる実施形態では、改変は、配列番号１０のアミノ酸２００～２０４位に相当する１個または複数のアミノ酸においてである。ある特定の実施形態では、改変は、配列番号１０の２０１位に相当するアミノ酸においてである。さらなる実施形態では、改変は、１個または複数のアミノ酸のより高い疎水性のアミノ酸による置換である。他の実施形態では、改変は、１個または複数の疎水性アミノ酸の挿入である。またさらなる実施形態では、疎水性アミノ酸は、ロイシンおよびチロシン、またはロイシンもしくはチロシンの保存的アミノ酸から選択される。
【0166】
ある特定の実施形態では、ＧＡＡは、少なくとも１個のアミノ酸をより疎水性のアミノ酸で置換することによって、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位またはその近くで、その疎水性を増加させるように改変される。一部の実施形態では、置換は、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位の上流または下流の５アミノ酸以内で行われ得る。ある特定の例では、アミノ酸置換は、配列番号１０の１９５～２０９位に相当するアミノ酸で行われ得る。他の例では、アミノ酸置換は、配列番号１０の２００～２０４位に相当するアミノ酸で行われ得る。さらなる実施形態では、改変ヒトＧＡＡは、配列番号１０のアミノ酸２０１位に相当する位置に疎水性アミノ酸を含有する。一部の実施形態では、ＧＡＡは、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位またはその近くに、１個または複数の疎水性アミノ酸を挿入することによって改変される。追加の改変は、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位またはその近くにおける１個または複数のアミノ酸の欠失を含む。
【0167】
ある特定の実施形態では、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位の２つ以上の位置に、またはＮ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位の５アミノ酸以内に、疎水性アミノ酸（天然または合成）を含有する改変ヒトＧＡＡが提供される。一実施形態では、改変されたアミノ酸の１つは、配列番号１０のアミノ酸２０１に相当する位置においてである。
【0168】
さまざまな実施形態では、疎水性アミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、システインまたはアラニンから選択される。さらなる実施形態では、疎水性アミノ酸は、ロイシンまたはチロシンである。一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡは、疎水性の特性を示す合成または非天然のアミノ酸を含有する。一般に、置換されたアミノ酸は、野生型アミノ酸よりも疎水性であり、したがって、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位またはその近くで、疎水性が増加する。
【0169】
例示的な一実施形態では、改変ＧＡＡは、配列番号１０のアミノ酸２０１に相当する位置にロイシンを有する。別の実施形態では、改変ＧＡＡは、配列番号１０のアミノ酸２０１に相当する位置にチロシンを有する。
【0170】
一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸１９９位でのＨｉｓ（Ｈ）のアルギニン（Ｒ）への（Ｈ１９９Ｒ）改変（ＧＡＡ（Ｈ１９９Ｒ）、または配列番号１０のアミノ酸２２３位でのアルギニン（Ｒ）のヒスチジン（Ｈ）への（Ｒ２２３Ｈ）改変（ＧＡＡ（Ｒ２２３Ｈ）を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸１９９位でのＨｉｓ（Ｈ）のアルギニン（Ｒ）への（Ｈ１９９Ｒ）改変、および配列番号１０のアミノ酸２２３位でのアルギニン（Ｒ）のヒスチジン（Ｈ）への（Ｒ２２３Ｈ）改変（ＧＡＡ（Ｈ１９９Ｒ－Ｒ２２３Ｈ）を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１７０、あるいはＨ１９９ＲもしくはＲ２２３Ｈの少なくとも１つの改変、またはその両方を有する、配列番号１７０の少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、または９００アミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％の相同性のバリアントを含む。一部の実施形態では、ＧＡＡの同族リーダー配列（すなわち、配列番号１７５、または配列番号１７０のアミノ酸１～２７）は、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号１７６のリーダー配列、またはＩＬ２野生型リーダーペプチド（配列番号１７８）、改変ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８０）、または配列番号１７６、１７８もしくは１８０と少なくとも９０％の配列同一性のリーダーペプチドで置き換えられる。
【0171】
一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１７１、またはＨ２１０Ｌの改変を少なくとも含む、配列番号１７１の少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００アミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の相同性のバリアントを含む。一部の実施形態では、ＧＡＡの同族リーダー配列（すなわち、配列番号１７５、または配列番号１７１のアミノ酸１～２７）は、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号１７６のリーダー配列、またはＩＬ２野生型リーダーペプチド（配列番号１７８）、改変ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８０）、または配列番号１７６、１７８もしくは１８０と少なくとも９０％の配列同一性のリーダーペプチドで置き換えられる。
【0172】
一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、もしくはＨ２０１Ｌから選択される少なくとも１つの改変を有するポリペプチド、またはこれらの改変の少なくとも１つを有する、配列番号１０の少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００アミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の相同性のバリアントを含む。一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、もしくはＨ２０１Ｌから選択される少なくとも２つの改変を含むポリペプチド、またはこれらの改変の少なくとも２つを有する、配列番号１０の少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００アミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の相同性のバリアントを含む。一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡタンパク質は、配列番号１０のＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ、およびＨ２０１Ｌの３つの改変を有するポリペプチド（ＧＡＡ－Ｈ１９９Ｒ－Ｈ２０１Ｌ－Ｒ２２３Ｈ）、またはこれらの３つの改変を有する、配列番号１０の少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００アミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の相同性のバリアントを含む。
【0173】
ある特定の実施形態では、配列番号１０の少なくとも５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００アミノ酸と少なくとも８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の相同性を有する改変ヒトＧＡＡであって、Ｎ末端の７０ｋＤａのプロセシング部位においてより疎水性のアミノ酸で置換された少なくとも１個のアミノ酸を有する、改変ヒトＧＡＡが提供される。
【0174】
一部の実施形態では、改変ヒトＧＡＡの少なくとも５０％が、２０、３０または４０時間以内に、リソソームにおいて７０ｋＤａの形態にプロセシングされる。またさらなる実施形態では、改変ヒトＧＡＡの実質的にすべてが、５５、６５または７５時間以内に、リソソームにおいて７０ｋＤａの形態にプロセシングされる。
【0175】
ある特定の実施形態では、本発明の改変ヒトＧＡＡは、７０ｋＤａの成熟形態、またはその対応するバリアントへのそのより迅速なタンパク質分解プロセシングによって特定することができる。他の実施形態では、本明細書に記載される改変ヒトＧＡＡは、ネイティブヒトＧＡＡのタンパク質分解プロセシングの間に生成しない８２ｋＤａの中間ポリペプチドの生成によって特定することができる。さらなる実施形態では、改変ヒトＧＡＡは、未改変ヒトＧＡＡのタンパク質分解プロセシングの間に生成する７６ｋＤａの中間ポリペプチドの非存在によって特定することができる。
【0176】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１７０～１７１の少なくとも５００アミノ酸と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の例では、ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１７０～１７１の少なくとも５００アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する。他の例では、ポリペプチドは、配列番号１０または配列番号１７０～１７１の少なくとも５００アミノ酸と少なくとも９５％の同一性を有する。
【0177】
ある特定の実施形態では、アミノ酸２０１に疎水性残基への改変、例えば、Ｈ２０１Ｌ改変を有するＧＡＡポリペプチドは、未改変ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼタンパク質と比較した場合に、より迅速なリソソームのプロテアーゼプロセシングを示す。一部の実施形態では、ＧＡＡプレポリペプチドの少なくとも５０％が、発現の２０時間以内に７０ｋＤａの成熟ＧＡＡ形態に、タンパク質分解的にプロセシングされる。他の実施形態では、ＧＡＡプレポリペプチドの実質的にすべてが、発現の５５時間以内に７０ｋＤａの成熟ＧＡＡ形態に、タンパク質分解的にプロセシングされる。
【0178】
一部の実施形態では、配列番号１０のアミノ酸１～２７の同族ＧＡＡリーダーペプチド（すなわち、ＭＧＶＲＨＰＰＣＳＨＲＬＬＡＶＣＡＬＶＳＬＡＴＡＡＬＬ、配列番号１７５）は、異なるシグナルペプチド（リーダーペプチド）で置き換えられる。例えば、ＧＡＡの同族リーダーペプチド（配列番号１７５）は、（ｉ）配列番号１７７の核酸配列によってコードされるＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＫＧＶＱＣＥ（配列番号１７６）のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１リーダーペプチド（本明細書では、「２０１リーダーペプチド」または「２０１ｌｐ」と称される）、（ｉｉ）配列番号１７９の核酸配列によってコードされるｗｔＩＬ２ ｌｐ：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１７８）、または（ｉｉｉ）配列番号１８１の核酸配列によってコードされるｍｕｔＩＬ２ ｌｐ：ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１８０）のいずれかで置き換えられ得る。一部の実施形態では、同族ＧＡＡリーダーペプチド（配列番号１７５）は存在したままであり、追加のシグナルペプチド、例えば、シグナルペプチドのＡＡＴ、ＦＮ１、配列番号１７７の核酸配列によってコードされるＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＫＧＶＱＣＥ（配列番号１７６）のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１リーダーペプチド（本明細書では、「２０１リーダーペプチド」または「２０１ｌｐ」と称される）、（ｉｉ）配列番号１７９の核酸配列によってコードされるｗｔＩＬ２ ｌｐ：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１７８）、または（ｉｉｉ）配列番号１８１の核酸配列によってコードされるｍｕｔＩＬ２ ｌｐ：ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１８０）のいずれか１つまたは複数が追加される。
【0179】
一部の実施形態では、ＧＡＡは、Ｎ連結グリコシル化部位、Ｏ連結グリコシル化部位、またはそれらの両方などのグリコシル化部位を付加または除去するように改変される。ある特定の実施形態では、グリコシル化部位の付加または除去は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、内部欠失、ランダム点変異誘発、または部位特異的変異誘発によって達成される。一部の実施形態では、例示的なＧＡＡ改変は、１つもしくは複数のアスパラギン（Ａｓｎ）残基の付加、またはアスパラギン（Ａｓｎ）残基を生じる１つもしくは複数の変異、または１つもしくは複数のアスパラギン（Ａｓｎ）残基の欠失を含む。ある特定の実施形態では、ＧＡＡに存在するすべてまたは一部のＮ連結および／またはＯ連結グリコシル化部位が変異される。一部の実施形態では、ＧＡＡ改変は、ＧＡＡの生物活性、物理的構造および／または基質結合可能性に付随する情報を与えるであろう。
（ｉｉ）ＧＡＡをコードする核酸
（ｉｉ）ＧＡＡをコードする核酸
【0180】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＧＡＡポリペプチド全体（例えば、Ｎ末端／触媒ドメインおよびＣ末端ドメイン）をコードする異種核酸配列を含み、これは、異種シグナル配列または標的化ペプチドに融合されていない。
【0181】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＧＡＡポリペプチド全体（例えば、Ｎ末端／触媒ドメインおよびＣ末端ドメイン）をコードするＧＡＡ核酸配列の３’末端にインフレームで融合された、分泌シグナルペプチドまたはＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする異種核酸配列を含む。例えば、分泌シグナルペプチドまたはＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする異種核酸配列は、７０ｋＤａおよび７６ｋＤａのＧＡＡポリペプチドをコードするＧＡＡ核酸配列の３’末端にインフレームで融合されており、そのような両方のポリペプチドは、ｒＡＡＶベクターが哺乳動物細胞を形質導入する場合に、ｒＡＡＶゲノムから発現される。一部の実施形態では、ＧＡＡ核酸の発現は、ｒＡＡＶゲノム中の２つのプロモーターによって、またはバイシストロニックな構築物の発現を駆動する１つのプロモーターによって駆動され得る。
【0182】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、野生型ＧＡＡ核酸配列、例えば、配列番号１１、または配列番号７２、または配列番号１８２である、ＧＡＡタンパク質をコードする核酸配列を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現、（ｉｉ）ＣｐＧアイランドを低減させるように、（ｉｉｉ）自然免疫応答を低減させるようにのいずれか１つまたは複数のためにコドン最適化されたＧＡＡ核酸配列である、ＧＡＡタンパク質をコードする核酸配列を含む。本明細書に開示される方法およびｒＡＡＶ組成物における使用のために包含される例示的なコドン最適化ＧＡＡ核配列は、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、もしくは配列番号１８２、または配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、もしくは配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列のいずれかから選択することができる。
【0183】
加えて、一部の実施形態では、本明細書に開示される方法およびｒＡＡＶ組成物における使用のために包含されるＧＡＡ核酸配列は、以下の改変：（ｉ）少なくとも１つ、または２つ、または一部の場合では、すべての代替リーディングフレームの除去、（ｉｉ）１つまたは複数のＣｐＧアイランドの除去、（ｉｉｉ）コザック配列の改変、（ｉｖ）翻訳ターミネーター配列の改変、ならびに（ｖ）プロモーターおよびコザック配列の間のスペーサーの除去の少なくとも１つまたは複数でさらに改変される。
【0184】
例えば、一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、配列番号１８２のｈＧＡＡヌクレオチド配列、または配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、配列番号１８２は、ＧＡＡについての野生型核酸配列と比較して、表１Ａに示される以下のエレメントを含む。
【0185】
【表1A】
【0186】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、配列番号１８２のｈＧＡＡヌクレオチド配列、または配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、ｈＧＡＡヌクレオチド配列は、３つの潜在的な炎症誘発性ＣｐＧモチーフおよびいくつかの代替リーディングフレーム（ＡＲＦ）を排除する一連の点変異で改変されており、配列番号１８２は、ＧＡＡについての野生型核酸配列と比較して、表１Ｂに示される以下の点変異を含み、表１Ｂにおける番号付けは、ＧＡＡ開始コドンＡＴＧ中の「Ａ」が最初のヌクレオチドであると仮定する。
【0187】
【表1B】
【0188】
一部の実施形態では、配列番号１８２中の同族リーダーペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号１８２のヌクレオチド１～８１）は、２０１ｌｐ、ｗｔＩＬ２ ｌｐまたはｍｕｔＩＬ２ ｌｐのいずれかをコードする核酸配列によって置き換えることができる。したがって、一部の実施形態では、配列番号１８２の核残基１～８１（ＧＡＡの同族リーダーペプチドをコードする）は、配列番号１７７（２０１ｌｐ）、配列番号１７９（ｗｔＩＬ２ ｌｐ）もしくは配列番号１８１（ｍｕｔＩＬ２ ｌｐ）の核酸配列、または配列番号１７７、１７９もしくは１８１と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列によって置き換えることができる。
【0189】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１７０（同族ＧＡＡシグナル配列、およびＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するＧＡＡポリペプチド）、または配列番号１７１（同族ＧＡＡシグナル配列、およびＨ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するＧＡＡポリペプチド）を含むＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。配列番号１７０のＧＡＡポリペプチドは、配列番号１８２の核酸配列によってコードされる。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする配列番号１８２の核酸を含む。配列番号１７１のＧＡＡポリペプチドは、配列番号１８２の塩基対（ｂｐ）６６７～６６９が、ＣＡＣからＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧのいずれかに変更されているか（ヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）へのアミノ酸変更を生じる）；または配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されている、配列番号１８２の核酸配列によってコードされる。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６７～６６９が、ＣＡＣからＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧのいずれかに変更されているか（ヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）にアミノ酸を変更する）；または配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されている、配列番号１８２の核酸を含み、これは、Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１ＬおよびＲ２２３Ｈ改変を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする。
【0190】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１７２（同族シグナルペプチドが、ＩｇＧシグナル配列、およびＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変で置き換えられているＧＡＡポリペプチド）、または配列番号１７３（同族シグナルペプチドが、ｗｔＩＬ２シグナル配列、およびＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変で置き換えられているＧＡＡポリペプチド）、配列番号１７４（同族シグナルペプチドが、ｍｕｔＩＬ３シグナル配列、およびＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変で置き換えられているＧＡＡポリペプチド）のいずれかから選択されるＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。
【0191】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７７（ＩｇＧシグナル配列）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７２のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するＩｇＧリーダー－ＧＡＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されており、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７７（ＩｇＧシグナルペプチド）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７２のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、およびＲ２２３Ｈ改変を有するＩｇＧリーダー－ＧＡＡ）をコードする。
【0192】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７９（ｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７３のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されており、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７９（ｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７３のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、およびＲ２２３Ｈ改変を有するｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。
【0193】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１８１（ｍｕｔＩＬ２シグナルペプチド）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７４のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するｍｕｔＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されており、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１８１（ｍｕｔ ＩＬ２シグナルペプチド）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７４のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、およびＲ２２３Ｈ改変を有するｍｕｔ ＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。
【0194】
ＧＡＡのＣ末端ドメインは、活性ＧＡＡを発生させるために、７０／７６ｋＤａｌ種と併せてトランスで機能する。触媒ドメインおよびＣ末端ドメインの間の境界は、ファミリー３１のヒドロラーゼのほとんどのメンバーに存在せず、かつＧＡＡ中に４つの連続するプロリン残基を含有する、１８アミノ酸未満の短い領域におけるその存在に基づいて、約アミノ酸残基７９１であると思われる。成熟種に関連するＣ末端ドメインが、アミノ酸残基７９２において開始することが報告されている（Moreland et al. (Nov. 1, 2004) J. Biol. Chem., Manuscript 404008200）。したがって、一部の実施形態では、ＧＡＡ核酸配列は、Ｃ末端ドメインを除いて、ＧＡＡポリペプチド全体をコードする。そのため、そのような実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、別々のポリペプチドとしてＧＡＡのＣ末端ドメインを発現する哺乳動物細胞を形質導入するために使用することができる。
Ｂ．分泌シグナルペプチド
Ｂ．分泌シグナルペプチド
【0195】
ネイティブＧＡＡシグナルペプチドは、ＥＲにおいて切断されず、それによって、ネイティブＧＡＡポリペプチドは、ＥＲにおいて膜に結合している（Tsuji et al. (1987) Biochem. Int. 15(5):945-952）。ＧＡＡの膜会合の破壊は、内因性ＧＡＡシグナルペプチド（および必要に応じて、隣接する配列）を、ＧＡＡのための代用のシグナルペプチドで置き換えることによって達成することができる。
【0196】
したがって、代表的な実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶゲノムは、標的細胞に移入され、内因性ＧＡＡシグナルペプチドの代わりに分泌シグナルペプチドをコードする異種核酸配列に付着した、ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含む。異種核酸は、転写および翻訳の際に、ＧＡＡポリペプチドと作動可能に会合した（例えば、その分泌を指図する）分泌シグナル配列を含有する融合ポリペプチドが産生するように、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントと動作可能に会合している。
【0197】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、内因性ＧＡＡシグナルペプチド（例えば、配列番号１０のアミノ酸１～２７（「生得的ＧＡＡ」または「同族ＧＡＡ」シグナルペプチドとも称される））を含むＧＡＡポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、内因性ＧＡＡシグナルペプチド（例えば、配列番号１０のアミノ酸１～２７（「生得的ＧＡＡ」または「同族ＧＡＡ」シグナルペプチドとも称される））および追加の異種（非ネイティブ）シグナル配列を含むＧＡＡポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ＧＡＡのアミノ酸１～２７の内因性シグナルペプチドを欠くＧＡＡポリペプチドは、分泌シグナルに融合されている。本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、分泌シグナルは、ＧＡＡポリペプチド、または融合ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド－ＧＡＡ融合ポリペプチドの肝臓細胞から血液への分泌を支援する一般的な目的を果たし、血液中で、本明細書に記載されるように、哺乳動物細胞、例えば、ヒトの心筋肉細胞および骨格筋肉細胞のリソソームに移動し、標的にすることができる。一部の実施形態では、異種分泌シグナルは、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するＡＡＴ、ＦＮ１もしくはＧＡＡシグナルペプチドの活性断片のいずれかから選択される。
【0198】
一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、目的のポリペプチドに対して異種（すなわち、外来性または外因性）である。例えば、異種分泌シグナルペプチドは、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドであり、目的のポリペプチドは、フィブロネクチンではない。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、または分泌シグナル活性を有するＡＡＴ、ＦＮ１もしくはＧＡＡシグナルペプチドの活性断片のいずれかから選択される。代替の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＧＡＡに対して異種ではない、すなわち、シグナルペプチドは、ＧＡＡシグナルペプチド（すなわち、ネイティブＧＡＡポリペプチドの残基１～２７）である。
【0199】
一部の実施形態では、配列番号１０のアミノ酸１～２７の同族ＧＡＡシグナルペプチド（すなわち、ＭＧＶＲＨＰＰＣＳＨＲＬＬＡＶＣＡＬＶＳＬＡＴＡＡＬＬ、配列番号１７５）は、異なるまたは異種リーダーペプチドで置き換えられる。例えば、ＧＡＡの同族リーダーペプチド（配列番号１７５）は、（ｉ）配列番号１７７の核酸配列によってコードされるＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＬＫＧＶＱＣＥ（配列番号１７６）のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１リーダーペプチド（本明細書では、「２０１リーダーペプチド」または「２０１ｌｐ」と称される）、（ｉｉ）配列番号１７９の核酸配列によってコードされるｗｔＩＬ２ ｌｐ：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１７８）、もしくは（ｉｉｉ）配列番号１８１の核酸配列によってコードされるｍｕｔＩＬ２ ｌｐ：ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１８０）、または配列番号１７６、１７８もしくは１８０のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するリーダーペプチドから選択される異種シグナルペプチドのいずれかで置き換えられ得る。
【0200】
一般に、分泌シグナルペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）に存在する（すなわち、分泌シグナルペプチドをコードする核酸セグメントは、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムにおいて、ＧＡＡペプチドまたはＧＡＡ融合ペプチドをコードする異種核酸の５’に存在する）。あるいは、分泌シグナルが、それらと動作可能に会合しており、細胞からの（ＧＡＡポリペプチドからのシグナルペプチドの切断による、または切断なしのいずれかで）目的のＧＡＡポリペプチドまたはＧＡＡ融合ポリペプチドの分泌を指図する限り、分泌シグナルは、カルボキシ末端に存在していてもよく、またはＧＡＡポリペプチドもしくはＧＡＡ融合ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチド）内に埋め込まれていてもよい。
【0201】
分泌シグナルは、分泌経路に標的化されるＧＡＡポリペプチドまたはＧＡＡ融合ポリペプチドと動作可能に会合している。言い換えると、分泌シグナルは、ＧＡＡポリペプチドまたはＧＡＡ融合ポリペプチドが、分泌シグナルペプチドの非存在下よりも高いレベルで（すなわち、より多量に）細胞から分泌されるように、ＧＡＡポリペプチドと動作可能に会合している。一般に、典型的には、シグナルペプチドが付着される場合に、分泌シグナルペプチドの付着の非存在下と比較して、（単独のおよび／またはシグナルペプチドと融合した）ＧＡＡポリペプチドまたはＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれより多くが、細胞から分泌される。他の実施形態では、（単独のおよび／または融合ポリペプチドの形態の）検出可能なポリペプチドの本質的にすべてが、細胞から分泌される。
【0202】
「細胞から分泌される」という語句により、ポリペプチドは、限定されるものではないが、間質腔、血液、リンパ、脳脊髄液、腎尿細管、気道（例えば、肺胞、細気管支、気管支、鼻腔など）、胃腸管（例えば、食道、胃、小腸、結腸など）、眼の硝子体液、および蝸牛内リンパなどを含む、細胞外の任意のコンパートメント（例えば、体液または空間）へ分泌され得る。
【0203】
一実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＧＡＡ融合ポリペプチドに融合された分泌シグナルペプチド（ＳＰ）をコードする異種核酸を含み、ＧＡＡ融合ポリペプチドは、ＧＡＡポリペプチドに融合された標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を含む。本明細書で使用される場合、ＧＡＡは、上記に記載される改変ＧＡＡも指す。したがって、本明細書に開示されるシグナルペプチドは、本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶベクターで形質導入されるか、またはｒＡＡＶゲノムを含む細胞からの、ＧＡＡポリペプチドまたはＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドの分泌の効力を増加させる。
【0204】
したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、ならびに５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、分泌ペプチドをコードする異種核酸およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む（すなわち、異種核酸は、シグナルペプチド－ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡ融合ポリペプチドをコードする）。
【0205】
代替の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲ配列、ならびに５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、分泌ペプチドをコードする異種核酸およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）融合ポリペプチドをコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含み、融合タンパク質は、ＩＧＦ２標的化ペプチドおよびＧＡＡポリペプチドを含む（すなわち、異種核酸は、シグナルペプチド－ＩＧＦ２－ＧＡＡポリペプチドを含むＧＡＡ融合ポリペプチドをコードする）。
【0206】
一般に、分泌シグナルペプチドは、小胞体内で切断され、一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、分泌前にＧＡＡポリペプチドから切断される。しかしながら、細胞からのＧＡＡポリペプチドまたはＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドの分泌が増強され、ＧＡＡポリペプチドが機能的である限り、分泌シグナルペプチドが切断されることは必要でない。そのため、一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、部分的にまたは完全に保持される。
【0207】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムまたは単離された核酸は、分泌シグナルペプチドに作動可能に連結されたＧＡＡポリペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含み、キメラポリペプチドは、ｒＡＡＶベクターで形質導入された細胞から発現および産生され、ＧＡＡポリペプチドは、細胞から分泌される。ＧＡＡポリペプチドまたはＧＡＡ融合ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチド）は、分泌シグナルペプチドのすべてまたは一部の切断後に分泌され得る。あるいは、ＧＡＡポリペプチドまたはＧＡＡ融合ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチド）は、分泌シグナルペプチドを保持することができる（すなわち、分泌シグナルは切断されない）。そのため、この文脈では、「ＧＡＡポリペプチドまたはＧＡＡ融合ポリペプチド」は、分泌ペプチドを含むキメラポリペプチドであり得る。
【0208】
本発明の分泌シグナル配列は、それらが目的のポリペプチドを分泌経路へ向かわせる限り、任意の特定の長さに限定されない。代表的な実施形態では、シグナルペプチドは、少なくとも約６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、もしくは３５アミノ酸長、最大で約４０、５０、６０、７５、もしくは１００アミノ酸の長さ、またはそれよりも長い。
【0209】
本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムによって、およびｒＡＡＶベクターにおいてコードされる分泌シグナルペプチドは、天然に存在する分泌シグナル配列またはその改変を含むこと、それらから本質的になること、またはそれらからなることができる。多数の分泌タンパク質および細胞からの分泌を指図する配列が、当技術分野において公知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，８７３，８６８号に開示されている。例示的な分泌タンパク質（およびそれらの分泌シグナル）としては、限定されるものではないが、エリスロポエチン、凝固第ＩＸ因子、シスタチン、ラクトトランスフェリン、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤、アポリポタンパク質（例えば、ＡＰＯ Ａ、Ｃ、Ｅ）、ＭＣＰ－１、α－２－ＨＳ－糖タンパク質、α－１－ミクログロブリン、補体（例えば、Ｃ１Ｑ、Ｃ３）、ビトロネクチン、リンホトキシン－α、アズロシジン、ＶＩＰ、メタロプロテイナーゼ阻害剤２、グリピカン－１、膵臓ホルモン、クラスタリン、肝細胞成長因子、インスリン、α－１－アンチキモトリプシン、成長ホルモン、ＩＶ型コラゲナーゼ、グアニリン、プロパージン、プロエンケファリンＡ、インヒビンβ（例えば、Ａ鎖）、プレアルブミン、アンギオゲニン（angiocenin）、ルトロピン（例えば、β鎖）、インスリン様成長因子結合タンパク質１および２、プロアクチベーターポリペプチド、フィブリノーゲン（例えば、β鎖）、胃トリアシルグリセロールリパーゼ、ミッドカイン、好中球デフェンシン１、２、および３、α－１－アンチトリプシン、マトリックスｇｌａ－タンパク質、α－トリプターゼ、胆汁酸塩活性化リパーゼ、キモトリプシノーゲンＢ、エラスチン、ＩＧラムダ鎖Ｖ領域、血小板因子４バリアント、クロモグラニンＡ、ＷＮＴ－１プロトオンコジーンタンパク質、オンコスタチンＭ、β－ネオエンドルフィン－ダイノルフィン、フォンヴィルブランド因子、血漿セリンプロテアーゼ阻害剤、血清アミロイドＡタンパク質、ナイドジェン、フィブロネクチン、レンニン、オステオネクチン、ヒスタチン３、ホスホリパーゼＡ２、軟骨基質タンパク質、ＧＭ－ＣＳＦ、マトリリシン、神経内分泌タンパク質７Ｂ２、胎盤タンパク質１１、ゲルゾリン、Ｍ－ＣＳＦ、トランスコバラミンＩ、ラクターゼ－フロリジンヒドロラーゼ、エラスターゼ２Ｂ、ペプシノゲンＡ、ＭＩＰ １－β、プロラクチン、トリプシノーゲンＩＩ、ガストリン放出ペプチドＩＩ、心房性ナトリウム利尿因子、分泌アルカリホスファターゼ、膵臓α－アミラーゼ、セクレトグラニンＩ、β－カゼイン、セロトランスフェリン、組織因子経路阻害剤、フォリトロピンβ鎖、凝固第ＸＩＩ因子、成長ホルモン放出因子、前立腺精漿タンパク質、インターロイキン（例えば、２、３、４、５、９、１１）、インヒビン（例えば、アルファ鎖）、アンギオテンシノゲン、サイログロブリン、ＩＧ重鎖または軽鎖、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１、リゾチームＣ、プラスミノーゲン活性化因子、アンチロイコプロテイナーゼ１、スタテリン、フィブリン－１、アイソフォームＢ、ウロモジュリン、チロキシン結合グロブリン、アキソニン－１、子宮内膜α－２グロブリン、インターフェロン（例えば、アルファ、ベータ、ガンマ）、β－２－ミクログロブリン、プロコレシストキニン、プロガストリクシン、前立腺酸性ホスファターゼ、骨シアロタンパク質ＩＩ、コリパーゼ、アルツハイマー病アミロイドＡ４タンパク質、ＰＤＧＦ（例えば、ＡまたはＢ鎖）、凝固第Ｖ因子、トリアシルグリセロールリパーゼ、ハプトグロビン（haptoglobuin）－２、コルチコステロイド結合グロブリン、トリアシルグリセロールリパーゼ、プロレラキシンＨ２、ホリスタチン１および２、血小板糖タンパク質ＩＸ、ＧＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ヘパリンコファクターＩＩ、アンチトロンビン－ＩＩＩ、白血病抑制因子、間質コラゲナーゼ、プレイオトロフィン、小誘導性サイトカインＡ１、メラニン凝集ホルモン、アンジオテンシン変換酵素、膵臓トリプシン阻害剤、凝固第ＶＩＩＩ因子、α－フェトプロテイン、α－ラクトアルブミン、セノゲリン（ｓｅｎｏｇｅｌｉｎ）ＩＩ、カッパカゼイン、グルカゴン、サイロトロピンベータ鎖、トランスコバラミンＩＩ、トロンボスポンジン１、副甲状腺ホルモン、バソプレシンコペプチン、組織因子、モチリン、ＭＰＩＦ－１、キニノーゲン、神経内分泌コンバターゼ２、幹細胞因子プロコラーゲンα１鎖、血漿カリクレイン、ケラチノサイト成長因子、ならびに任意の他の分泌ホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、凝固因子、乳タンパク質、免疫グロブリン鎖などが挙げられる。
【0210】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムによって、およびｒＡＡＶベクターにおいてコードされる他の分泌シグナルペプチドは、限定されるものではないが、プレプロ－カテプシンＬ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＨＲＴＬ、ＮＰ＿０３７２８８；ＮＰ＿０３４１１４、ＡＡＢ８１６１６、ＡＡＡ３９９８４、Ｐ０７１５４、ＣＡＡ６８６９１；それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、およびプレプロ－アルファ２型コラーゲン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ９８９６９、ＣＡＡ２６３２０、ＣＧＨＵ２Ｓ、ＮＰ＿００００８０、ＢＡＡ２５３８３、Ｐ０８１２３；それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ならびにそれらの対立遺伝子の変形、改変および機能的断片（フィブロネクチン分泌シグナル配列に関して上記で議論された通り）から選択することができる。例示的な分泌シグナル配列としては、プレプロカテプシンＬについて（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ＭＴＰＬＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＬＡ［配列番号２７］；受託番号ＣＡＡ６８６９１）、およびプレプロ－アルファ２型コラーゲンについて（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、ＭＬＳＦＶＤＴＲＴＬＬＬＬＡＶＴＬＣＬＡＴＣ［配列番号２８］；受託番号ＣＡＡ９８９６９）、挙げられる。プレプロカテプシンＬおよびプレプロ－アルファ２型コラーゲン由来の全長分泌シグナル配列、またはそれらの機能的断片（フィブロネクチン分泌シグナル配列に関して上記で議論された通り）を含むより長いアミノ酸配列も包含される。
【0211】
一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、肝臓細胞によって産生される分泌ポリペプチドにその一部または全体が由来する。一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、さらに、全体または一部が合成または人工であり得る。合成または人工の分泌シグナルペプチドは、当技術分野において公知であり、例えば、Barash et al., "Human secretory signal peptide description by hidden Markov model and generation of a strong artificial signal peptide for secreted protein expression," Biochem. Biophys. Res. Comm. 294:835-42 (2002)を参照されたく、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、人工分泌シグナル：ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ（配列番号２９）、または１、２、３、４、もしくは５つのアミノ酸置換（必要に応じて、保存的アミノ酸置換、保存的アミノ酸置換は当技術分野において公知である）を有するその変形を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからなる。
【0212】
本明細書に開示される方法および組成物における使用のための例示的なシグナルペプチドは、表２に開示される任意のシグナルペプチド、またはそれらの機能的バリアントから選択することができる。例示的なシグナルペプチドは、フィブロネクチン（ＦＮ１）またはＡＡＴである。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクター組成物は、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、例えば、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、ＧＡＡシグナルペプチド、ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（配列番号２２）、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片から選択される分泌シグナルペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号１７～２２と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
【0213】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、分泌シグナルをコードする核酸は、配列番号１７、８１～２１、２２～２６、または配列番号１７もしくは２２～２６のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される。
【0214】
一部の実施形態では、ＦＮ１またはＡＡＴシグナルペプチドを、肝臓で発現したタンパク質に対するシグナルペプチド、または２０１９年１１月１９日に出願された第６２，９３７，５５６号、もしくは２０１９年１１月１５日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１６５３号に開示されるシグナルペプチドを含む任意のシグナルペプチドで容易に置換することができる。
【0215】
フィブロネクチン分泌シグナルペプチド：
【0216】
一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、フィブロネクチン分泌シグナルペプチドであり、この用語は、天然に存在する配列の改変（下記でより詳細に記載される通り）を含む。
【0217】
一部の実施形態では、分泌シグナルペプチドは、フィブロネクチンシグナルペプチド、例えば、ヒトフィブロネクチンのシグナル配列、またはラットフィブロネクチン由来のシグナル配列である。本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムおよびｒＡＡＶベクターにおける使用のために包含されるフィブロネクチン（ＦＮ１）シグナル配列および改変ＦＮ１シグナルペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７１，１７２号、および２０１９年１１月１９日に出願された仮出願第６２／９３７，５５６号の表３に開示されている。例示的なフィブロネクチン分泌シグナル配列の例としては、限定されるものではないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７１，１７２号の表１にリストされるものが挙げられる。
【0218】
【表2】
【0219】
Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのフィブロネクチン分泌シグナル配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５９０６（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に見出される。また別の例示的な配列として、ヒトフィブロネクチン１、転写物バリアント１の分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（受託番号ＮＭ＿００２０２６、ヌクレオチド２６８～３４５；受託番号ＮＭ＿００２０２６の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の例示的な分泌シグナル配列は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓフィブロネクチンタンパク質の分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされる（受託番号Ｍ７７８２０、ヌクレオチド９８～１９０；受託番号Ｍ７７８２０の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0220】
別の実施形態では、フィブロネクチンシグナル配列（ＦＮ１、ヌクレオチド２０８～３０３、５’－ＡＴＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＧＧＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＡＣＡ ＴＣＧ ＧＴＧ ＣＧＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＧＧ－３’、配列番号２３）は、ラットフィブロネクチンｍＲＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１５９０６）に由来し、以下のペプチドシグナル配列：Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ（配列番号１８）をコードする。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片（例えば、ＦＮ１シグナルペプチドは、配列番号１８～２１のいずれかの配列、または配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）である分泌シグナルペプチドをコードする異種核酸配列を含み、異種核酸配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＴシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するその活性断片（例えば、ＡＡＴシグナルペプチドは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）である分泌シグナルペプチドをコードする異種核酸配列を含み、異種核酸配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする。
【0221】
当業者は、分泌シグナル配列が、ペプチダーゼ切断部位（上矢印によって特定される）のＣ末端側のアミノ酸の１、２、３、４、５、もしくは６個すべて、またはそれよりも多くをコードし得ることを認識するであろう（例えば、表２における配列番号１９および２４を参照されたい）。当業者は、切断部位のカルボキシ末端側における追加のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６個、またはそれよりも多くのアミノ酸）が、分泌シグナル配列に含まれ得ることを認識するであろう。
【0222】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に位置する、分泌シグナルペプチドをコードする異種核酸配列、およびｈＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含むか、またはそれらからなり、シグナル配列をコードする核酸配列は、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片、例えば、配列番号１７～２２、１７５、１７７、１７９もしくは１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸のいずれかから選択され、シグナルペプチドをコードする核酸は、本明細書に開示されるｈＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の５’に位置し、シグナル配列およびｈＧＡＡポリペプチドをコードする核酸は、表４において本明細書に開示される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントに動作可能に連結されている。
【0223】
本発明の実施形態では、機能的断片は、本明細書に具体的に開示される配列と比較して、少なくとも約５０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれよりも高い分泌シグナル活性を有するか、またはさらに、より高い分泌シグナル活性のレベルを有する。
【0224】
ペプチダーゼ切断部位
【0225】
一部の実施形態では、１つまたは複数の外因性ペプチダーゼ切断部位が、分泌シグナルペプチド－ＧＡＡ融合ポリペプチドに、例えば、分泌シグナルペプチドおよびＧＡＡポリペプチドの間に挿入され得る。特定の実施形態では、自己プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼ）が、分泌シグナルペプチドおよびＧＡＡポリペプチドまたはＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドの間に挿入される。他の実施形態では、外因性プロテアーゼの付加によって制御され得るプロテアーゼ認識部位が用いられる（例えば、トリプシンのためのＬｙｓ－Ａｒｇ認識部位、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＫＥＸ２様プロテアーゼのＬｙｓ－Ａｒｇ認識部位、メタロプロテアーゼのための認識部位、セリンプロテアーゼのための認識部位など）。ネイティブプロテアーゼ部位を欠失または不活性化するＧＡＡポリペプチドの改変は、本明細書に包含され、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号、および２０１９年１１月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１６５３号に開示されている。
Ｃ．ＩＧＦ２標的化ペプチド配列
Ｃ．ＩＧＦ２標的化ペプチド配列
【0226】
一実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＧＡＡポリペプチドに融合された標的化ペプチド（ＴＰ）をコードする異種核酸を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、細胞外受容体のためのリガンドであり、標的化ペプチドは、標的細胞の表面上の受容体の細胞外ドメインと結合し、受容体の内部移行の際に、ヒトリソソームにおけるポリペプチドの局在化を可能にする。一実施形態では、標的化ペプチドは、カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体と結合することができるウロキナーゼ型プラスミノーゲン受容体部分を含む。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、ＩＧＦ２標的化ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸配列が組み込まれる。
【0227】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドは、細胞外受容体のためのリガンドの少なくとも一部を含み、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体に結合する。
【0228】
ＩＧＦ２はまた、別名；１１番染色体オープンリーディングフレーム４３、インスリン様成長因子２、ＩＧＦ－ＩＩ、ＦＬＪ４４７３４；ＩＧＦ２、ソマトメジンＡ、およびプレプチンによって公知である。野生型ヒトＩＧＦ２配列のｍＲＮＡは、
ＧＣＴＴＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧ（配列番号１）に相当する。全長ＩＧＦ２タンパク質（ＩＧＦ２標的化配列を含む）は、ＮＭ＿０００６１２．６の核酸配列によってコードされ、全長ＩＧＦ２タンパク質ＮＰ＿０００６０３．１をコードする。
ＧＣＴＴＡＣＣＧＣＣＣＣＡＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＧＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧ（配列番号１）に相当する。全長ＩＧＦ２タンパク質（ＩＧＦ２標的化配列を含む）は、ＮＭ＿０００６１２．６の核酸配列によってコードされ、全長ＩＧＦ２タンパク質ＮＰ＿０００６０３．１をコードする。
【0229】
成熟ヒトＩＧＦ２標的化ペプチドは下記に示される：
Ａ Ｙ Ｒ Ｐ Ｓ Ｅ Ｔ Ｌ Ｃ Ｇ Ｇ Ｅ Ｌ Ｖ Ｄ Ｔ Ｌ Ｑ Ｆ Ｖ Ｃ Ｇ Ｄ Ｒ Ｇ Ｆ Ｙ Ｆ Ｓ Ｒ Ｐ Ａ Ｓ Ｒ Ｖ Ｓ Ｒ Ｒ Ｓ Ｒ Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｅ Ｃ Ｃ Ｆ Ｒ Ｓ Ｃ Ｄ Ｌ Ａ Ｌ Ｌ Ｅ Ｔ Ｙ Ｃ Ａ Ｔ Ｐ Ａ Ｋ Ｓ Ｅ（配列番号５）。
Ａ Ｙ Ｒ Ｐ Ｓ Ｅ Ｔ Ｌ Ｃ Ｇ Ｇ Ｅ Ｌ Ｖ Ｄ Ｔ Ｌ Ｑ Ｆ Ｖ Ｃ Ｇ Ｄ Ｒ Ｇ Ｆ Ｙ Ｆ Ｓ Ｒ Ｐ Ａ Ｓ Ｒ Ｖ Ｓ Ｒ Ｒ Ｓ Ｒ Ｇ Ｉ Ｖ Ｅ Ｅ Ｃ Ｃ Ｆ Ｒ Ｓ Ｃ Ｄ Ｌ Ａ Ｌ Ｌ Ｅ Ｔ Ｙ Ｃ Ａ Ｔ Ｐ Ａ Ｋ Ｓ Ｅ（配列番号５）。
【0230】
ヒトＩＧＦ２のコード配列はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４９２，３８８号（例えば、図２を参照されたい）に開示されている。ＩＧＦ２タンパク質は、アミノ末端の２４アミノ酸シグナルペプチドおよび８９アミノ酸カルボキシ末端領域を有するプレプロタンパク質として合成され、その両方が翻訳後に除去され、O'Dell et al. (1998) Int. J. Biochem Cell Biol. 30(7):767-71に概説される。成熟タンパク質は６７アミノ酸である。成熟ＩＧＦ２のＬｅｉｓｈｍａｎｉａコドン最適化バージョンは、米国特許第８，４９２，３８８号（例えば、第８，４９２，３８８号の図３を参照されたい）に開示されている（Langford et al. (1992) Exp. Parasitol. 74(3):360-1）。成熟ポリペプチドのアミノ酸１～７もしくは２～７の欠失（Δ１～７）、残基２７のチロシンからロイシンへの変更（Ｙ２７Ｌ）、または両方の変異（Δ１～７，Ｙ２７Ｌ、またはΔ２～７，Ｙ２７Ｌ）を含有する追加カセットを、下記に記載されるように、所望の受容体のみに対する特異性を有するＩＧＦ－２カセットを生成するために作製した。したがって、一部の実施形態では、野生型、Ｙ２７Ｌ、Δ１～７、Δ２～７およびＹ２７Ｌ－Δ１～７、Ｙ２７Ｌ－Δ２～７、Ｖ４３Ｍ、Ｙ２７Ｌ－Ｖ４３Ｍ、Ｙ２７Ｌ－Δ１～７－Ｖ４３Ｍ、Ｙ２７Ｌ－Δ２～７－Ｖ４３Ｍ ＩＧＦ２バリアントのいずれかから選択され得るＩＧＦ２標的化配列が、本明細書の使用のために包含される。
【0231】
本明細書の方法および組成物における使用のための例示的なＩＧＦ２標的化ペプチドは、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号、および２０１９年１１月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１６５３号、および２０１９年１１月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１７０１号に開示されており、それらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0232】
一部の実施形態では、本明細書の方法および組成物における使用のためのＩＧＦ２標的化ペプチドは、その全体が本明細書に組み込まれる米国出願第２０１９／０３４３９６８号に開示される、Ｅ６Ｒ、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９５、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、Ｌ５５Ｒ、Ｋ６５Ｒのいずれか１つまたは複数の改変を有することができる。一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｅ６Ｒ、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９５、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、Ｌ５５Ｒ、およびＫ６５Ｒから選択される１つまたは複数の改変に加えて、Ｖ４３Ｍの改変を有する。一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｅ６Ｒ、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９５、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、Ｌ５５Ｒ、およびＫ６５Ｒから選択される１つまたは複数の改変に加えて、Δ１～７またはΔ２～７改変を有する。一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Δ１～７またはΔ２～７改変、Ｖ４３Ｍ改変、ならびにＥ６Ｒ、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９５、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、Ｌ５５Ｒ、およびＫ６５Ｒから選択される１つまたは複数の改変を有する。
【0233】
特定の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、翻訳開始がアミノ酸４３で始まるように、バリンがｍｅｔに改変されているバリン４３での改変（Ｖ４３Ｍ）を含む。標的化ペプチドまたはＩＧＦ２標的化ペプチドとしての本明細書の使用のために包含されるＶ４３Ｍの改変を有するＩＧＦ２標的化ペプチドは、カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体と結合する。代替の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＩＧＦ２のデルタ１～４２であり、Ｖ４３はＭｅｔに変更される（すなわち、ＩＧＦ２－Δ１～４２（配列番号８）またはＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ（配列番号９）。
【0234】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合タンパク質をコードする核酸を含み、成熟ＩＧＦ２標的化ペプチド（配列番号５）、もしくはＩＧＦ２標的化ペプチドバリアント（例えば、配列番号６（ＩＧＦ２－Δ２～７）；配列番号７（ＩＧＦ２－Δ１～７）；配列番号８（ＩＧＦ２－－Δ１～４２）、配列番号９（ＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ））、または配列番号５～９と少なくとも８５％、もしくは９０％、もしくは９５％の配列同一性を有する配列をコードする核酸は、ＧＡＡタンパク質をコードする核酸の５’末端に融合されて、各種の細胞型によって取り込まれ、リソソームに輸送され得る、融合タンパク質（例えば、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチド）が作出される。あるいは、前駆体ＩＧＦ２ポリペプチドをコードする核酸は、ＧＡＡ遺伝子の３’末端に融合され得、前駆体は、哺乳動物細胞において切断されて、成熟ＩＧＦ２ポリペプチドを生じるカルボキシ末端部分を含むが、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、好ましくは、除かれる（または、ＧＡＡ遺伝子の５’末端に移される）。この方法は、タンパク質が単離されたら、さらなる修飾を行う必要がないので、グリコシル化を含む方法に対して、単純性および費用対効果を含む多数の利点を有する。
【0235】
一部の実施形態では、本明細書の使用のために包含されるＩＧＦ２標的化ペプチドは、参照によりそれらの全体が本明細書にそれぞれ組み込まれる米国特許第７，７８５，８５６号および同第９，８７３，８６８号に記載されている。
（ｉ）ＩＧＦ２の欠失変異体：
（ｉ）ＩＧＦ２の欠失変異体：
【0236】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１１月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１７０１号に開示されるように、改変または切断型ＩＧＦ２標的化ペプチド（ＩＧＦ２の欠失変異体とも称される）である。例えば、一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｖ４３Ｍ改変を含み、アミノ酸１～４２からの１個または複数のアミノ酸の任意の欠失も含む。例えば、本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｖ４３Ｍを含み、配列番号５のΔ１～３、Δ１～４、Δ１～５、Δ１～６、Δ１～８、Δ１～９、Δ１～１０、Δ１～１１、Δ１～１２、Δ１～１３、Δ１～１４、Δ１～１５、Δ１～１６、Δ１～１７、Δ１～１８、Δ１～１９、Δ１～２０、Δ１～２１、Δ１～２２、Δ１～２３、Δ１～２４、Δ１～２５、Δ１～２６、Δ１～２７、Δ１～２８、Δ１～２９、Δ１～３０、Δ１～３１、Δ１～３２、Δ１～３３、Δ１～３４、Δ１～３５、Δ１～３６、Δ１～３７、Δ１～３８、Δ１～３９、Δ１～４０、Δ１～４１、またはΔ１～４２のいずれかから選択される１つまたは複数の欠失をさらに含み、配列番号５の残基４３はメチオニンである（Ｖ４３Ｍ）。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｖ４３Ｍを含み、Δ１～７欠失をさらに含む（ＩＧＦ２－Δ１～７，Ｖ４３Ｍ）。
【0237】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、リソソームのＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号５のΔ２～３、Δ２～４、Δ２～５、Δ２～６、Δ２～８、Δ２～９、Δ２～１０、Δ２～１１、Δ２～１２、Δ２～１３、Δ２～１４、Δ２～１５、Δ２～１６、Δ２～１７、Δ２～１８、Δ２～１９、Δ２～２０、Δ２～２１、Δ２～２２、Δ２～２３、Δ２～２４、Δ２～２５、Δ２～２６、Δ２～２７、Δ２～２８、Δ２～２９、Δ２～３０、Δ２～３１、Δ２～３２、Δ２～３３、Δ２～３４、Δ２～３５、Δ２～３６、Δ２～３７、Δ２～３８、Δ２～３９、Δ２～４０、Δ２～４１、またはΔ２～４２のいずれかから選択される１つまたは複数の改変をさらに含み、配列番号５の残基４３はメチオニンである（Ｖ４３Ｍ）。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｖ４３Ｍを含み、Δ２～７欠失をさらに含む（ＩＧＦ２－Δ２～７，Ｖ４３Ｍ）。
【0238】
一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドへの融合のためのＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＩＧＦ２のアミノ酸８～２８および４１～６１を含むことができる。一部の実施形態では、アミノ酸のこれらのストレッチは、直接接合され得るか、またはリンカーによって分離され得る。あるいは、アミノ酸８～２８および４１～６１は、別々のポリペプチド鎖に提供することができる。一部の実施形態では、ＩＧＦ２のアミノ酸８～２８またはその保存的置換バリアントは、ＧＡＡポリペプチドに融合されて、ｒＡＶＶベクターからＩＧＦ２－ＧＡＡ融合タンパク質を発現し得、別々のｒＡＡＶベクターは、ＩＧＦ２アミノ酸４１～６１またはその保存的置換バリアントを発現し得る。
【0239】
ＩＧＦ２標的化ペプチドの適当な提示およびフォールディングを容易にするために、ＩＧＦ２タンパク質のより長い部分を使用することができる。例えば、アミノ酸残基１～６７、１～８７、または前駆体型全体を含むＩＧＦ２標的化ペプチドを使用することができる。
【0240】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、以下のいずれかのＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸配列である：配列番号５の野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）の残基８～６７が続く残基１（すなわち、配列番号６；すなわち、ＩＧＦ２－デルタ２～７）；配列番号５の野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）の残基８～６７（すなわち、配列番号７；ＩＧＦ２－デルタ１～７）、または配列番号５の野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）の残基４３～６７（すなわち、ＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ（配列番号９）またはＩＧＦ－デルタ１～４２（配列番号８））。
【0241】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号２（すなわち、ＩＧＦ２－デルタ２～７）；配列番号３（すなわち、ＩＧＦ２－デルタ１～７）、もしくは配列番号４（すなわち、ＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ）、またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の配列のいずれかを含む任意の核酸配列から選択される核酸配列である。
【0242】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）配列は、配列番号６５（ＩＧＦ２Δ２～７Ｖ４３Ｍ）、または配列番号６５と少なくとも８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列、あるいは配列番号６６（ＩＧＦΔ１～７Ｖ４３Ｍ）、または配列番号６６と少なくとも８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列のいずれかのＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）配列をコードする核酸配列である。
【表3】
【0243】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドの適当な提示およびフォールディングを容易にするために、ＩＧＦ２タンパク質のより長い部分を使用することができる。例えば、アミノ酸残基１～６７、１～８７、または前駆体型全体を含むＩＧＦ２標的化ペプチドを使用することができる。
【0244】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、分泌シグナルペプチド（ＳＰ）およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含むシグナルペプチド－ＧＡＡ（ＳＰ－ＧＡＡ）融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。
【0245】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体と結合するＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする異種核酸配列を含み、例えば、異種核酸配列は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＩＧＦ２標的化ペプチドをコードするか、またはＩＧＦ２受容体に結合する配列番号５に少なくとも１つのアミノ改変を含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変が、Ｖ４３Ｍアミノ酸改変（配列番号８または配列番号９）、もしくはΔ２～７（配列番号６）、もしくはΔ１～７（配列番号７）であるか、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドである、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする異種核酸配列を含む。
【0246】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸は、配列番号２（ＩＧＦ２－Δ２～７）、配列番号３（ＩＧＦ２－Δ１～７）、もしくは配列番号４（ＩＧＦ２ Ｖ４３Ｍ）、または配列番号２、３、もしくは４のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される。
【0247】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号５の野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）の残基８～６７が続く残基１（すなわち、ＩＧＦ２－デルタ２～７またはＩＧＦ２Δ２～７；これは配列番号６に相当する）；配列番号５の野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）の残基８～６７（すなわち、ＩＧＦ２－デルタ１～７またはＩＧＦ２Δ１～７、これは配列番号７に相当する）、または配列番号５の野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）の残基４３～６７（すなわち、ＩＧＦ２デルタ１～４２またはＩＧＦ２Δ１～４２、これは配列番号８に相当する）のいずれかをコードする核酸配列である。本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、アミノ酸残基４３の改変を有する核酸配列であり、例えば、残基４３は、開始コドン、例えば、ＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍに改変される（配列番号９に相当する）。
【0248】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号２（すなわち、ＩＧＦ２－デルタ２～７）；配列番号３（すなわち、ＩＧＦ２－デルタ１～７）、または配列番号４（すなわち、ＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ）のいずれかを含む核酸配列である。
【0249】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドおよびＩＧＦ２標的化ペプチドを含む融合タンパク質は、野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）（配列番号５）の残基８～６７が続く残基１を含む（すなわち、成熟ヒトＩＧＦ２（配列番号５）の残基２～７は存在しない）ＩＧＦ２標的化ペプチドに付着されるヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド（配列番号１０）のアミノ酸残基４０～９５２または残基７０～９５２を含み、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒトＧＡＡ（配列番号１０）のアミノ酸残基７０に連結される。
【0250】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドおよびＩＧＦ２標的化ペプチドを含む融合タンパク質は、野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）（配列番号５）の残基８～６７を含む（すなわち、成熟ヒトＩＧＦ２の残基１～７（すなわち、Ｙ Ｒ Ｐ Ｓ Ｅ Ｔ；配列番号６３）は存在しない）ＩＧＦ２標的化ペプチドに付着されるヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド（配列番号１０）のアミノ酸残基４０～９５２または残基７０～９５２を含み、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒトＧＡＡ（配列番号１０）のアミノ酸残基７０に連結される。
【0251】
本明細書に記載される組成物および方法の一部の実施形態では、ＧＡＡポリペプチドおよびＩＧＦ２標的化ペプチドを含む融合タンパク質は、野生型成熟ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）（配列番号５）の残基４３～６７を含む（成熟ヒトＩＧＦ２（配列番号５）の残基１～４２は存在しない）改変ＩＧＦ２標的化ペプチドに付着されるヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）（配列番号１０）のアミノ酸残基４０～９５２または残基７０～９５２を含み、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヒトＧＡＡ（配列番号１０）のアミノ酸残基７０に連結される。
【0252】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＩＧＦ２ペプチドをコードする異種核酸配列を含み、ＩＧＦ２ペプチド配列は、配列番号８もしくは配列番号９、または配列番号８もしくは９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドである。
（ｉｉ）改変ＩＧＦ２標的化ペプチドおよびＩＧＦ２相同体
（ｉｉ）改変ＩＧＦ２標的化ペプチドおよびＩＧＦ２相同体
【0253】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２をコードする核酸は、ＩＧＦＢＰに対するそれらの親和性を減少させるように、および／またはＩＧＦ－Ｉ受容体への結合に対する親和性を減少させ、それによって、融合したＧＡＡ－ポリペプチドのリソソームへの標的化を増加させ、生物学的利用率を増加させるために、改変することができる。
【0254】
ＩＧＦ２標的化ペプチドは、好ましくは、Ｍ６Ｐ受容体を特異的に標的にし、結合する。ＣＩ－ＭＰＲ／Ｍ６Ｐ受容体と高い親和性で結合するが、もはや他の２つの受容体と認識可能な親和性で結合しないタンパク質をもたらす、ＩＧＦ２ポリペプチドに変異を有するＩＧＦ２標的化ペプチドが特に有用である。
【0255】
ＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）標的化ペプチドは、好ましくは、Ｍ６Ｐ受容体を特異的に標的にする。ＣＩ－ＭＰＲ／Ｍ６Ｐ受容体と高い親和性で結合するが、もはや他の２つの受容体と認識可能な親和性で結合しないタンパク質をもたらす、ＩＧＦ２ポリペプチドに変異を有するＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）標的化ペプチドが特に有用である。
【0256】
ＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）標的化ペプチドは、ＩＧＦ２構築物の隔離を回避するために、血清ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）（Baxter (2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278(6):967-76）およびＩＧＦ－Ｉ受容体との結合を最小化するように、改変することもできる。いくつかの研究が、ＩＧＦ結合タンパク質との結合のために必要なＩＧＦ－１およびＩＧＦ２の残基を突き止めた。これらの残基において変異を有する構築物は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２受容体との高親和性結合の保持について、およびＩＧＦ結合タンパク質に対する低減した親和性についてスクリーニングすることができる。例えば、ＩＧＦ２のＰｈｅ ２６をＳｅｒで置き換えることは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２受容体との結合に対する効果なしで、ＩＧＦ２のＩＧＦＢＰ－１およびＩＧＦＢＰ－６に対する親和性を低減することが報告されている（Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(13):9246-54）。Ｐｈｅ １９についてのＳｅｒおよびＧｌｕ ９についてのＬｙｓなどの他の置換も、有利であり得る。ＩＧＦ２で高度に保存されているＩＧＦ－Ｉの領域における類似の変異は、別々に、または組み合わせて、ＩＧＦ－ＢＰ結合の大きな減少をもたらす（Magee et al. (1999) Biochemistry 38(48): 15863-70）。
【0257】
ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＩＧＦ２構築物の隔離を回避するために、血清ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）およびＩＧＦ－Ｉ受容体との結合を最小化するように、改変することもできる。
【0258】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、フューリン抵抗性、すなわち、Ａｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇ切断部位を認識するフューリンプロテアーゼによる分解に対して抵抗性であるよう改変される。そのようなＩＧＦ２標的化ペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国出願第２０１２／０２１３７６２号に開示されている。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムにおける使用のためのフューリン抵抗性ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号５（ｗｔ ＩＧＦ２標的化ペプチド）のアミノ酸３０～４０（例えば、３１～４０、３２～４０、３３～４０、３４～４０、３０～３９、３１～３９、３２～３９、３４～３７、３２～３９、３３～３９、３４～３９、３５～３９、３６～３９、３７～４０、３４～４０）に対応する領域内に、任意の他のアミノ酸での置換または欠失であり得る変異を含有する。例えば、３４位における置換は、第１の切断部位のフューリン認識に影響を与え得る。それぞれの認識部位内の１個または複数の追加のアミノ酸の挿入は、一方または両方のフューリン切断部位を消失させ得る。縮重位置における残基の１個または複数の欠失も、両方のフューリン切断部位を消失させ得る。
【0259】
一部の実施形態では、フューリン抵抗性ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号５のＡｒｇ３７（Ｒ３７）またはＡｒｇ４０（Ｒ４０）に対応する位置にアミノ酸置換を含有する。一部の実施形態では、フューリン抵抗性ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列番号５のＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０位にＬｙｓ（Ｋ）またはＡｌａ（Ａ）の置換を含有する。３７位および４０位の両方におけるＬｙｓおよび／もしくはＡｌａ変異の組合せ、またはＬｙｓ（Ｋ）もしくはＡｌａ（Ａ）以外のアミノ酸の置換を含む他の置換が可能である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＶＶゲノムにおける使用のために包含されるＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＩＧＦΔ２～７－Ｋ３７、またはＩＧＦΔ２～７－Ｋ４０、またはＩＧＦΔ１～７－Ｋ３７、またはＩＧＦΔ１～７－Ｋ４０であり、ＩＧＦ２標的化ペプチドが、それぞれ、ａａ２～７または１～７の欠失、および３７位のＡｒｇ（Ｒ）残基のリシンへの改変（すなわち、Ｒ３７Ｋ改変）またはＲ４０Ｋを有することを示す。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＶＶゲノムにおける使用のために包含されるＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＩＧＦΔ２～７－Ｋ３７－Ｋ４０またはＩＧＦΔ１～７－Ｒ３７Ｋ－Ｒ４０Ｋであり、ＩＧＦ２標的化ペプチドが、残基２～７または残基１～７の欠失、ならびに３７位および４０位のＲ残基のリシン（lysinines）への改変（Ｒ３７ＫおよびＲ４０Ｋ）を有することを示す。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＶＶゲノムにおける使用のために包含されるＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＩＧＦΔ２～７－Ｒ３７Ａ、またはＩＧＦΔ２～７－Ｒ４０Ａ、またはＩＧＦΔ１～７－Ｒ３７Ａ、またはＩＧＦΔ１～７－Ｒ４０Ａ、ＩＧＦΔ２～７－Ｒ３７Ａ－Ｒ４０Ａ、またはＩＧＦΔ１～７－Ｒ３７Ａ－Ｒ４０Ａのいずれかから選択される。本明細書に開示されるｒＡＶＶゲノムにおける使用のために包含されるＩＧＦ２標的化ペプチドのための例示的な構築物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国出願第２０１２／０２１３７６２号に開示されている。
【0260】
一部の実施形態では、本発明のために好適なフューリン抵抗性ＩＧＦ２標的化ペプチドは、追加の変異を含有していてもよい。例えば、配列番号５の残基の最大で３０％またはそれよりも多くが、変更されていてもよい（例えば、最大で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、またはそれよりも多くの残基が変更されていてもよい）。そのため、本発明のために好適なフューリン抵抗性ＩＧＦ２変異タンパク質は、配列番号５と少なくとも７０％、例えば、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一のアミノ酸配列を有していてもよい。
【0261】
また、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドの使用は、ＩＧＦ２標的化ペプチドが、リソソームを標的にする部分としてＭ６Ｐを置き換えるので、当技術分野において、グリコシル化非依存性リソソーム標的（ＧＩＬＴ）とも称される。ＧＩＬＴ技術の詳細は、米国出願公開第２００３／００８２１７６号、同第２００４／０００６００８号、同第２００４／０００５３０９号、同第２００３／００７２７６１号、同第２００５／０２８１８０５号、同第２００５／０２４４４００号、および国際公開のＷＯ０３／０３２９１３、ＷＯ０３／０３２７２７、ＷＯ０２／０８７５１０、ＷＯ０３／１０２５８３、ＷＯ２００５／０７８０７７に記載されており、それらのすべての開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0262】
本明細書に開示される方法および組成物における使用のためのＩＧＦ２標的化ペプチドのアミノ酸配列に対する他の改変は、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号、および２０１９年１１月１５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１６５３号に開示されており、それらは両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0263】
ＩＧＦ２は、比較的高い親和性でＩＧＦ２／Ｍ６ＰおよびＩＧＦ－Ｉ受容体に結合し、より低い親和性でインスリン受容体に結合する。ＩＧＦ２の残基４８～５０（Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ）のインスリン由来の対応する残基（Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ）での置換、または残基５４～５５（Ａｌａ Ｌｅｕ）のＩＧＦ－Ｉ由来の対応する残基（Ａｒｇ Ａｒｇ）での置換は、ＩＧＦ２／Ｍ６Ｐ受容体への結合を減少させるが、ＩＧＦ－Ｉおよびインスリン受容体への結合の保持をもたらす（Sakano et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(31):20626-35）。
【0264】
ＩＧＦ２は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体の反復１１と結合する。実際に、反復１１のみがカチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合されたミニ受容体は、（全長受容体の親和性のおよそ１０分の１の親和性で）ＩＧＦ２と結合し、ＩＧＦ２の内部移行およびリソソームへの送達を媒介することができる（Grimme et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33697-33703）。Ｍ６Ｐ受容体のドメイン１１の構造は公知である（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅの登録名１ＧＰ０および１ＧＰ３；Brown et al. (2002) EMBO J. 21(5):1054-1062）。推定上のＩＧＦ２結合部位は、ＩＧＦ２の疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットであり；ＩＧＦ２の候補アミノ酸は、ロイシン８、フェニルアラニン４８、アラニン５４、およびロイシン５５を含む。反復１１は、ＩＧＦ２結合のために十分であるが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体のより大きな部分（例えば、反復１０～１３または１～１５）を含む構築物は、一般に、より大きな親和性および増加したｐＨ依存性でＩＧＦ２と結合する（例えば、Linnell et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(26):23986-23991を参照されたい）。
【0265】
ＩＧＦ２残基Ｔｙｒ ２７のＬｅｕでの置換、またはＳｅｒ ２６のＰｈｅでの置換は、それぞれ、９４分の１、５６分の１、および４分の１に、ＩＧＦ－Ｉ受容体に対するＩＧＦ２の親和性を減少させる（Torres et al. (1995) J. Mol. Biol. 248(2):385-401）。ヒトＩＧＦ２の残基１～７の欠失は、ヒトＩＧＦ－Ｉ受容体に対する親和性の３０分の１への減少をもたらし、同時に、ラットＩＧＦ２受容体に対する親和性の１２倍の増加をもたらした（Hashimoto et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(30):18013-8）。ＩＧＦ２のＣ末端（残基６２～６７）の短縮化はまた、ＩＧＦ－Ｉ受容体に対するＩＧＦ２の親和性を５分の１にするように見える（Roth et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2):907-14）。
【0266】
ＩＧＦ２残基フェニルアラニン２６のセリンでの置換は、ＩＧＦＢＰ１～５との結合を５～７５分の１に低減する（Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(13):9246-54）。ＩＧＦ２残基４８～５０のトレオニン－セリン－イソロイシンでの置き換えは、ＩＧＦＢＰの大部分との結合を１００分の１より少なく低減し（Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(13):9246-54）；しかしながら、これらの残基は、カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体との結合にも重要である。ＩＧＦ－Ｉ受容体との結合を破壊するＹ２７Ｌ置換は、ＩＧＦＢＰ３および酸不安定サブユニットとの三重複合体の形成を妨げ（Hashimoto et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(44):27936-42）；この三重複合体は、循環中のＩＧＦ２の大部分を占める（Yu et al. (1999) J. Clin. Lab Anal. 13(4):166-72）。ＩＧＦ２の最初の６残基の欠失も、ＩＧＦＢＰ結合を妨げる（Luthi et al. (1992) Eur. J. Biochem. 205(2):483-90）。
【0267】
ＩＧＦ－ＩのＩＧＦＢＰとの相互作用についての研究は、追加的に、フェニルアラニン１６に対するセリンの置換が、二次構造には影響を与えないが、ＩＧＦＢＰ結合を４０～３００分の１の間に減少させることを明らかにした（Magee et al. (1999) Biochemistry 38(48):15863-70）。グルタミン酸９のリシンへの変更も、ＩＧＦＢＰ結合の有意な減少をもたらした。さらに、二重変異体リシン９／セリン１６は、ＩＧＦＢＰに対する最低の親和性を示した。ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ２のこの領域の間の配列の保存は、類似する変異がＩＧＦ２において作られる場合に、類似する効果が観察されるであろうことを示唆する（グルタミン酸１２リシン／フェニルアラニン１９セリン）。
【0268】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）配列は、少なくともアミノ酸４８～５５、少なくともアミノ酸８～２８および４１～６１、もしくは少なくともアミノ酸８～８７、またはカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体と結合するそれらの配列バリアント（例えば、Ｒ６８Ａ）もしくはそれらの短縮型（例えば、６２位からＣ末端が短縮されたもの）を含む。
【0269】
本発明の別の実施形態では、標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）をコードするｒＡＡＶゲノムは、７０／７６ｋＤａｌの成熟ポリペプチドおよびＣ末端ドメインとの接合部、例えば、７９１位において、ネイティブＧＡＡコード配列に挿入される。これは、単一のキメラポリペプチドを作出する。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）の直ぐ下流に挿入され得る。
【0270】
一実施形態では、本明細書に定義される、標的化ペプチド、例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に直接融合されている。別の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、スペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されている。具体的な一実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、１０～２５アミノ酸のスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、グリシン残基を含むスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。
【0271】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、少なくとも１、２または３個のアミノ酸のスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。一部の実施形態では、スペーサーは、アミノ酸ＧＡＰもしくはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号３１）、またはそれらと少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＧ、もしくはＧＡ、もしくは、ＡＰ、もしくはＧＰ、またはそれらのバリアントである。一部の実施形態では、スペーサーは、核酸ＧＧＣ ＧＣＧ ＣＣＧ（配列番号３０）によってコードされる。
【0272】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヘリックス構造を含むスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号３５）と少なくとも５０％同一のスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３１（配列番号３０の核酸によってコードされる）である。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、もしくは配列番号３５、またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の配列のいずれかから選択される。
（ｉｉｉ）カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）に結合する代替標的化ペプチド
（ｉｉｉ）カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）に結合する代替標的化ペプチド
【0273】
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、リソソーム標的化ペプチドもしくはタンパク質、またはマンノース－６－リン酸非依存的な方法で、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）に結合する本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチド以外の他の部分である。ＣＩ－ＭＰＲは、標的化ペプチドとして使用することができる少なくとも３つの異なるリガンドのための結合部位も含有する。本明細書に開示されるように、ＩＧＦ２リガンドは、主に、反復１１との相互作用を通して、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、約１４ｎＭの解離定数でＣＩ－ＭＰＲに結合する。ＣＩ－ＭＰＲは、高分子量Ｏ－グリコシル化ＩＧＦ２形態と結合することができる。したがって、一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、Ｏ－グリコシル化を含むように、転写後に改変され得る。
【0274】
代替の実施形態では、ＣＩ－ＭＰＲに結合する標的化ペプチドは、レチノイン酸である。レチノイン酸は、２．５ｎＭの解離定数で受容体に結合する。レチノイン酸によるカチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体の親和性光標識は、ＩＧＦ２またはＭ６Ｐの受容体との結合を妨げず、レチノイン酸が受容体上の異なる部位と結合することを示す。レチノイン酸の受容体との結合は、細胞質小胞中の受容体のより高い蓄積により、受容体の細胞内分布を変更し、Ｍ６Ｐ修飾β－グルクロニダーゼの取り込みも増強する。レチノイン酸は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体に結合する能力を妨げることなく、それを治療剤に連結するために使用することができる光活性化可能部分を有する。
【0275】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン受容体（ｕＰＡＲ）も、９μＭの解離定数でＣＩ－ＭＰＲと結合する。ｕＰＡＲは、ほとんどの細胞型の表面上のＧＰＩで固定された受容体であり、そこで接着分子として、プラスミノーゲンおよびＴＧＦ－βのタンパク質分解活性化において機能する。ｕＰＡＲのＣＩ－Ｍ６Ｐ受容体との結合は、それをリソソームに標的化し、それによって、その活性をモジュレートする。そのため、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体と結合する能力がある、ｕＰＡＲの細胞外ドメインまたはそれらの一部分の治療剤への融合は、その薬剤に対してリソソームへの標的化を可能にする。
Ｄ．ＧＡＡポリペプチドのスペーサーおよび融合接合部
Ｄ．ＧＡＡポリペプチドのスペーサーおよび融合接合部
【0276】
ＧＡＡが、分泌シグナルペプチドとの融合タンパク質（例えば、ＳＳ－ＧＡＡ融合ポリペプチド）、または標的化ペプチドとの融合タンパク質（すなわち、ＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡポリペプチド二重融合ポリペプチド）として発現される場合、シグナルペプチドまたはＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＧＡＡポリペプチドに直接融合され得るか、またはリンカーによってＧＡＡポリペプチドから分離され得る。アミノ酸リンカー（本明細書では、「スペーサー」とも称される）は、天然タンパク質のその位置に出現するもの以外の１個または複数のアミノ酸を組み込む。スペーサーは、一般に、フレキシブルであるように、または２つのタンパク質部分の間にａ－ヘリックスのなどの構造を挿入するように、設計することができる。
【0277】
したがって、本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合タンパク質は、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端およびＩＧＦ２標的化ペプチドのＣ末端に位置する、少なくとも１アミノ酸長のヌクレオチド配列を含むスペーサーをさらに含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の間に位置する少なくとも１アミノ酸のスペーサーをコードする核酸を含む異種核酸配列を含む。
【0278】
一実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に直接融合されている。別の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、スペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されている。具体的な一実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、１０～２５アミノ酸のスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、グリシン残基を含むスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヘリックス構造を含むスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号３５）と少なくとも５０％同一のスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。
【0279】
一部の実施形態では、スペーサーまたはリンカーは、比較的短くあり得る、例えば、少なくとも１、２、３、４、もしくは５アミノ酸、または例えば、配列Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号３１）もしくはＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（配列番号３２）であり得るか、あるいはより長くあり得る、例えば、５～１０アミノ酸長、または１０～２５アミノ酸長であり得る。例えば、配列（ＧＧＧＧＳ（配列番号３３））の３～４コピーのフレキシブルな反復リンカー、および配列（ＥＡＡＡＫ（配列番号３４））の２～５コピーのａ－ヘリックス反復リンカーが、記載されている（Arai et al. (2004) Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 57:829-838）。
【0280】
別のリンカーのＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号３５）の使用も、ＩＧＦ２融合タンパク質の文脈において、報告されており（DiFalco et al. (1997) Biochem. J. 326:407-413）、使用のために包含される。ヒト血清タンパク質のａ－ヘリックス部分が組み込まれているリンカーは、リンカー領域の免疫原性を最小化するために使用することができる。
【0281】
一部の実施形態では、スペーサーは、アミノ酸ＧＡＰまたはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ（配列番号３１）を含むアミノ酸スペーサーをコードする核酸ＧＧＣ ＧＣＧ ＣＣＧ（配列番号３０）によってコードされる。
【0282】
シグナルペプチド（ＳＳ－ＧＡＡ融合タンパク質を作製するため）または標的化ペプチド（例えば、ＳＰ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドを作製するため）のいずれかと融合させるためのＧＡＡポリペプチド中の融合接合部の部位は、融合タンパク質中のそれぞれのポリペプチドの適当なフォールディングおよび活性を促進するため、ならびにＧＡＡポリペプチドからのシグナルペプチドの早熟分離を防止するために、注意して選択されるべきである。
【0283】
一部の実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、ヘリックス構造を含むスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。別の具体的な実施形態では、ＩＧＦ２標的化ペプチドは、配列ＧＧＧＴＶＧＤＤＤＤＫ（配列番号３５）と少なくとも５０％同一のスペーサーによって、ＧＡＡポリペプチドに融合されている。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３１（配列番号３０の核酸によってコードされる）である。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、スペーサーは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、もしくは配列番号３５のいずれかから選択される。
【0284】
ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合タンパク質を作出するための４つの例示的な戦略を作成することができ、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１１月１９日に出願された仮出願第６２，９３７，５５６号および２０１９年１１月１５日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１６５３号に開示されている。
【0285】
一部の実施形態では、標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）は、実施例において本明細書に記載されるように、タンパク質の発現、ＧＡＡタンパク質の触媒活性、およびＩＧＦ２標的化ペプチドによる適当な標的化を可能にする位置であるＧＡＡのアミノ酸４０またはアミノ酸７０に、直接またはスペーサーによって融合され得る。あるいは、標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）は、成熟ポリペプチドからＧＡＡのＣ末端ドメインを分離する切断部位またはその近くで融合され得る。これは、内部標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を有するＧＡＡタンパク質の合成を可能にし、これは、必要に応じて、切断部位の配置に応じて、標的化ドメインから成熟ポリペプチドまたはＣ末端ドメインを自由にするために切断され得る。あるいは、成熟ポリペプチドは、発現構築物のオープンリーディングフレームにＣ末端配列を組み込むことなく、約７９１位での融合タンパク質として合成され得る。
【0286】
ＩＧＦ２標的化ペプチドのフォールディングを容易にするために、融合接合部に隣接するＧＡＡアミノ酸残基を改変することができる。例えば、ＧＡＡシステイン残基は、標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）の適当なフォールディングを妨げ得ることが可能であるので、末端ＧＡＡシステイン９５２を、欠失またはセリンと置換して、Ｃ末端標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を適合させることができる。標的化ペプチド（例えば、ＩＧＦ２標的化ペプチド）を、最後のＣｙｓ９５２の直前で融合させることもできる。最後のＣｙｓ９５２のセリンへの変異と併せて、最後から２番目のｃｙｓ９３８をプロリンに変更することができる。
Ｅ．ＣＳ配列
Ｅ．ＣＳ配列
【0287】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列をさらに含む異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムは、ＧＡＡ遺伝子の３’およびポリＡシグナルの５’に設置されるコラーゲン安定性配列（ＣＳまたはＣＳＳ）を必要に応じて含み得る異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＳ配列は、本明細書に開示される３’ＵＴＲ配列によって置き換えることができる。
【0288】
例示的なコラーゲン安定性配列は、ＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＣＣＡＡ（配列番号６５）、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性の配列を含む。例示的なコラーゲン安定性配列は、Ｐ Ｓ Ｐ Ｌ Ｆ Ｐ（配列番号６６）のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。ＣＳ配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるHolick and Liebhaber, Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 2410-2414, 1997（例えば、図３、５２０５頁を参照されたい）に開示されている。
Ｆ．プロモーター
Ｆ．プロモーター
【0289】
一部の実施形態では、適切なレベルのＧＡＡ発現を達成するために、ｒＡＡＶ遺伝子型は、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）を含む。ＬＳＰは、肝臓において動作可能に連結された遺伝子の発現を可能にし、一部の実施形態では、誘導性ＬＳＰであり得る。実施形態では、ＬＳＰは、上流の５’に位置し、ＧＡＡタンパク質をコードする異種核酸配列に動作可能に連結されている。例示的な肝臓特異的プロモーターは、本明細書に開示され、例えば、配列番号８６、９１～９６もしくは１４６～１５０を含むＬＳＰ、またはそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、あるいは本明細書の表４にリストされる任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントが挙げられる。本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターとしては、肝臓特異的シス調節エレメント（ＣＲＥ）、合成肝臓特異的シス調節モジュール（ＣＲＭ）、または本明細書の表４に開示される配列番号２７０～３４１（ＣＲＭを有するミニマルＬＳＰ）もしくは配列番号３４２～４３０（合成肝臓特異的近位プロモーター）のいずれかから選択される合成肝臓特異的プロモーターが挙げられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、１つまたは複数の構成的プロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、または転写の促進において一般に活性である哺乳動物遺伝子由来のプロモーターを含むことができる。
（ｉ）合成肝臓特異的プロモーター
（ｉ）合成肝臓特異的プロモーター
【0290】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターであり、限定されるものではないが、本明細書に開示される表４にリストされるもの、もしくはそれらの機能的バリアント、ならびに／または２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａおよび４Ｂから選択されるいずれか、もしくはそれらの機能的バリアントを含むプロモーターから選択され得る。
【0291】
トランスチレチンプロモーター（ＴＴＲ）（配列番号４３１）およびＳＰ０４１２（配列番号９１）およびＳＰ０４２２（配列番号９２）は、本明細書および実施例において例示的な肝臓特異的プロモーターとして使用され（実施例１、１２および１３を参照されたい）、当業者は、ＴＴＲを、本明細書の表４に開示される任意の肝臓特異的プロモーター、もしくはその機能的バリアント、ならびに／または２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａおよび４Ｂから選択されるいずれか、もしくはそれらの機能的バリアントで容易に置き換えることができる。肝臓特異的プロモーターは、肝臓特異的シス調節エレメント（ＣＲＥ）、合成肝臓特異的シス調節モジュール（ＣＲＭ）、もしくは本明細書、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａおよび４Ｂに開示される合成肝臓特異的プロモーター、またはそれらの機能的バリアントを含むことができる。
【0292】
表４は、例示的な肝臓特異的プロモーターを示す。本明細書に開示される比較的小さなサイズの肝臓特異的プロモーターは、それがベクターの最小量のペイロードを取り入れるので、有利である。これは、ＬＳＰが、ＡＡＶ系ベクターなどの限定された能力を有するベクターにおいて使用される場合に、特に重要である。
【0293】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【0294】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用な合成肝臓特異的プロモーターは、本明細書で定義されるように、二特異性プロモーターまたは三特異性プロモーターである。実例として、肝臓二特異性プロモーターは、肝臓、および１つの他の組織、例えば、筋肉において活性である。加えて、肝臓二特異性プロモーターの別の実例は、肝臓、および１つの他の組織、例えば、脳において活性である。肝臓三特異性プロモーターの実例として、肝臓、および２つの他の組織、例えば、筋肉および脳において活性である。加えて、肝臓三特異性プロモーターの別の実例は、肝臓、および２つの他の組織、例えば、腎臓および筋肉などにおいて活性である。
【0295】
一部の実施形態では、配列番号８６、９１～９６、１４６～１５０、２７０～４３０のいずれかと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である合成肝臓特異的プロモーターは、肝臓において優先的に活性である供給源調節核酸配列を含み、第２の細胞または組織の種類、例えば、筋肉またはＣＮＳにおいて、より低い程度で活性でもある（例えば、総発現の＜５０％、または約４９～４０％、または約３９～３０％、または約２９～２０％、または約１９～１０％、または＜１０％）。
【0296】
一部の実施形態では、プロモーターは、シス調節エレメント（ＣＲＥ）のＣＲＥ００５１（配列番号９７）およびＣＲＥ００４２（配列番号１０４）、またはそれらの機能的バリアントの組合せを含む合成肝臓特異的プロモーターである。それらの機能的バリアントは、それらと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。一部の好ましい実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）、および次いでプロモーターエレメントの順序で含む（順序は、当技術分野において慣習であるように、上流から下流への方向で与えられる）。
【0297】
プロモーターエレメントは、任意の好適な近位プロモーターまたはミニマルプロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターエレメントはミニマルプロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターが肝臓特異的であることが好ましい。
【0298】
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００５９（配列番号１１０）またはその機能的バリアントである。ＣＲＥ００５９は、下記でさらに議論されるように、近位プロモーターである。
【0299】
そのため、一実施形態では、プロモーターは、以下の調節エレメント：ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）およびＣＲＥ００５９（配列番号１１０）、またはそれらの機能的バリアントを含む。
【0300】
ＣＲＥ００５１（配列番号９７）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００５１から変更されているが、肝臓特異的ＣＲＥとしての活性を実質的に保持する配列を有する調節エレメントである。必須の転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するその能力を保持しながら、ＣＲＥの配列を変更することが可能であることが当業者に認識されるであろう。機能的バリアントは、それらがＣＲＥを実質的に非機能的にしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して、置換、欠失および／または挿入を含むことができる。
【0301】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５１の機能的バリアントは、プロモーター中でＣＲＥ００５１の代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥと見なすことができる。例えば、ＣＲＥ００５１の代わりに置換されたＣＲＥ００５１の機能的バリアントを含む肝臓プロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する。例えば、例としてプロモーターＳＰ０４１２（配列番号９１）を考慮すれば、ＳＰ０４１２中のＣＲＥ００５１は、ＣＲＥ００５１の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換されたＣＲＥを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。
【0302】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５１の機能的バリアントは、ＣＲＥ００５１と同じ肝臓特異的ＴＦのための転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む。それらが存在する順序でリストされる、ＣＲＥ００５１中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＨＮＦ１（配列番号９８）、ＨＮＦ４（配列番号９９）、ＨＮＦ３（配列番号１００）、ＨＮＦ１’（配列番号１０１）およびＨＮＦ３’（配列番号１０２）であり、表５を参照されたい。したがって、ＣＲＥ００５１の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳのすべてを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ００５１中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＨＮＦ１（配列番号９８）、ＨＮＦ４（配列番号９９）、ＨＮＦ３（配列番号１００）、ＨＮＦ１’（配列番号１０１）およびＨＮＦ３’（配列番号１０２）の順序で存在する。シス調節エレメントが、プロモーターおよび遺伝子と会合する場合、この順序は、好ましくは、上流から下流への方向（すなわち、転写開始部位（ＴＳＳ）の遠位からＴＳＳの近位への方向）と考えられる。スペーサー配列が、隣接するＴＦＢＳの間に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、好適には、重複していてもよく、すなわち、重複している配列は両方とも、発現を調節するために必要な程度にそれらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0303】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５１（配列番号９７）の機能的バリアントは、以下のＴＦＢＳ配列：ＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡ（ＨＮＦ１）（配列番号９８）、ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧ（ＨＮＦ４）（配列番号９９）、ＴＧＴＴＴＧＣ（ＨＮＦ３）（配列番号１００）、ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＣＡ（ＨＮＦ１’）（配列番号１０１）、次いでＡＣＡＡＡＣＡ（ＨＮＦ３）（配列番号１０２）、それらと相補的な配列、またはそれらのそれぞれのＴＦに結合する能力を維持するこれらのＴＦＢＳ配列の機能的バリアントを含む。これらは、ＣＲＥ００５１と同じ順序、すなわち、それらが上記で示された順序で存在していてもよい。ＴＦＢＳに関連する配列可変性が存在すること、および所与のＴＦＢＳについて、典型的にはコンセンサス配列が存在すること、それらから、いくらかの逸脱度が、典型的には存在することは当技術分野において周知である。ＴＦＢＳにおいて生じる変形についてのさらなる情報は、位置特異的重み行列（ＰＷＭ）を使用して図示することができ、これは、所与のヌクレオチドが、典型的には、コンセンサス配列中の所与の場所で見出される頻度を表す。ＴＦコンセンサス配列および関連するＰＷＭの詳細は、例えば、ＪａｓｐａｒまたはＴｒａｎｓｆａｃデータベース（http://jaspar.genereg.net/およびhttp://gene-regulation.com/pub/databases.html）に見出すことができる。この情報は、当業者が、ＣＲＥの機能性を保持し、一部の場合では、さらに増加させる方法で、ＣＲＥの任意の所与のＴＦＢＳにおいて配列を改変することを可能にする。
【0304】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５１の機能的バリアントは、配列：
【0305】
ＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡ－Ｎａ－ＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧ－Ｎｂ－ＴＧＴＴＴＧＣ－Ｎｃ－ＴＧＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＣＡ－Ｎｄ－ＡＣＡＡＡＣＡ（配列番号１０３）、またはそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％同一である配列を含み、Ｎａ、Ｎｂ、Ｎｃ、およびＮｄは、必要に応じたスペーサー配列を表す。存在する場合、Ｎａは、必要に応じて、１０～２６ヌクレオチド、好ましくは、１４～２２ヌクレオチド、より好ましくは、１８ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｂは、必要に応じて、８～２２ヌクレオチド、好ましくは、１２～２０ヌクレオチド、より好ましくは、１６ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｃは、必要に応じて、１～１０ヌクレオチド、好ましくは、１～５ヌクレオチド、より好ましくは、２ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｄは、好適には、１～１３ヌクレオチドの長さ、好ましくは、２～９ヌクレオチド長、より好ましくは、５ヌクレオチド長を有する。
【0306】
一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号９８～１０２、またはそれらの機能的バリアントからなる。
【0307】
ＣＲＥまたはその機能的バリアントが、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に提供され得、かついずれかの方向性で提供され得ることに留意されたい。そのため、配列番号９７～１０２、またはそれらの機能的バリアントの相補配列および逆相補配列は、本発明の範囲内である。配列番号９７もしくは１０３、またはそれらの機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も、本発明の範囲内である。
【0308】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５１（配列番号９７）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または１００もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0309】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または１００もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0310】
ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００４２から変更されているが、肝臓特異的ＣＲＥとしてのそれらの活性を実質的に保持する配列を有する調節エレメントである。必須の転写因子（ＴＦ）に結合し、発現を増強するその能力を保持しながら、ＣＲＥの配列を変更することが可能であることが当業者に認識されるであろう。機能的バリアントは、それらがＣＲＥを実質的に非機能的にしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して、置換、欠失および／または挿入を含むことができる。
【0311】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）の機能的バリアントは、プロモーター中でＣＲＥ００４２の代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥと見なすことができる。例えば、ＣＲＥ００４２の代わりに置換されたＣＲＥ００４２の機能的バリアントを含むプロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）を含む参照プロモーターと比較して）。例えば、例としてプロモーターＳＰ０４１２を考慮すれば、ＳＰ４１２（配列番号９１）中のＣＲＥ００４２（配列番号１０４）は、ＣＲＥ００４２の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換されたＣＲＥを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。
【0312】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００４２と同じ肝臓特異的ＴＦのためのＴＦＢＳを含むことが好ましい。それらが存在する順序でリストされる、ＣＲＥ００４２中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＨＮＦ－３（配列番号１０６）、Ｃ／ＥＢＰ（配列番号１０７）、ＨＮＦ－４（配列番号１０８）およびＣ／ＥＢＰ’（配列番号１０９）である。したがって、ＣＲＥ００４２の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳのすべてを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ００４２中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＨＮＦ－３、Ｃ／ＥＢＰ、ＨＮＦ－４、および次いでＣ／ＥＢＰの順序で存在する。シス調節エレメントが、プロモーターおよび遺伝子と会合する場合、この順序は、好ましくは、上流から下流への方向（すなわち、転写開始部位（ＴＳＳ）の遠位からＴＳＳの近位への方向）と考えられる。スペーサー配列が、隣接するＴＦＢＳの間に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、好適には、重複していてもよく、すなわち、重複している配列は両方とも、それらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0313】
一部の実施形態では、ＣＲＥ０４２（配列番号１０４）の機能的バリアントは、以下のＴＦＢＳ配列：ＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧ（ＨＮＦ－３）（配列番号１０６）、ＣＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧ（Ｃ／ＥＢＰ）（配列番号１０７）、ＴＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴ（ＨＮＦ－４）（配列番号１０８）、およびＴＴＡＣＴＣＡＡＣＡ（Ｃ／ＥＢＰ）（配列番号１０９）、ならびにそれらと相補的な配列、またはそれらのそれぞれのＴＦに結合する能力を維持するこれらのＴＦＢＳ配列の機能的バリアントを含む。これらは、ＣＲＥ００４２と同じ順序、すなわち、それらが上記で示された順序で存在していてもよい。上記で議論されるように、ＴＦＢＳに関連する配列可変性が存在すること、および所与のＴＦＢＳについて、典型的にはコンセンサス配列が存在すること、それらから、いくらかの逸脱度が、典型的には存在することは当技術分野において周知である。
【0314】
本発明の一部の実施形態では、ＣＲＥ００４２の機能的バリアントは、配列：
【0315】
ＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧ－Ｎａ－ＣＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧ－Ｎｂ－ＴＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡＴ－Ｎｃ－ＴＴＡＣＴＣＡＡＣＡ（配列番号１０５）、またはそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％同一である配列を含み、Ｎａ、Ｎｂ、およびＮｃは、必要に応じたスペーサー配列を表す。存在する場合、Ｎａは、必要に応じて、１～１０ヌクレオチド、好ましくは、１～５ヌクレオチド、より好ましくは、２ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｂは、必要に応じて、１～１０ヌクレオチド、好ましくは、２～６ヌクレオチド、より好ましくは、４ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｃは、必要に応じて、８～２３ヌクレオチド、好ましくは、１０～２０ヌクレオチド、より好ましくは、１５ヌクレオチドの長さを有する。
【0316】
本発明の一部の実施形態では、シス調節エンハンサーエレメントは、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）またはその機能的バリアントからなる。
【0317】
ＣＲＥまたはその機能的バリアントが、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に提供され得、かついずれかの方向性で提供され得ることに留意されたい。そのため、配列番号１０４もしくは１０５、またはそれらの機能的バリアントの相補配列および逆相補配列は、本発明の範囲内である。配列番号１０４もしくは１０５、またはそれらの機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も、本発明の範囲内である。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または８０もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＣＲＥ００４２（配列番号１０４）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または８０もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0318】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５９（配列番号１１０）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または１００もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0319】
上記で議論されるように、ＣＲＥ００５９（配列番号１１０）の機能的バリアントは、肝臓特異的プロモーターエレメントとして作用するＣＲＥ０００５９の能力を実質的に保持する。例えば、ＣＲＥ００５９の機能的バリアントが肝臓特異的プロモーターＳＰ０４１２に置換される場合、改変プロモーターは、ＳＰ０４１２（配列番号９１）の活性の少なくとも８０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する。好適には、ＣＲＥ００５９の機能的バリアントは、配列番号１１０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【0320】
ＣＲＥ００５９は、近位プロモーターであり、ＴＳＳの上流に、肝臓特異的ＴＦ、すなわち、ＨＮＦ１のためのＴＦＢＳを含む。したがって、ＣＲＥ００５９の機能的バリアントは、好ましくは、ＴＳＳの上流にＨＮＦ１のためのＴＦＢＳを含む。
【0321】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５９の機能的バリアントは、配列番号１１０と少なくとも７０％同一（好ましくは、配列番号１１０と少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％同一）である配列を含み、これは、ＨＮＦ１（配列番号１１１）のためのＴＦＢＳを含有し、ＨＮＦ１のための前記ＴＦＢＳの下流に、配列番号１１２と少なくとも８０％、９０％、９５％、または完全に同一であるＴＳＳ配列（ｐ１＠ＳＥＲＰＩＮＡ１またはｐ１＠ＡＦＰと称される）を含有する。
【0322】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５９の機能的バリアントは、配列番号１１０と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み、これは、２４～３６位またはその近くに、ＨＮＦ１のための配列番号１１１を含むＴＦＢＳをさらに含み、７３～９３位またはその近くに、配列番号１１２と少なくとも８０％、９０％、９５％、または完全に同一であるＴＳＳ配列を含み、位置は、配列番号１１０を参照して番号付けされる。本文脈において、そこまたはその近く（ａｔ ｏｒ ｎｅａｒ）は、好適には、配列番号１１０を参照して列挙された位置の１０、５、４、３、２、または１ヌクレオチド以内を意味する。好適なＴＦＢＳ配列は、配列番号１１１および配列番号１１２であるが、代替のＴＦＢＳ配列を使用することができる。
【0323】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５９（配列番号１１０）もしくはそれらの機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるプロモーターエレメントは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１１０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または９５もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0324】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物において有用な肝臓特異的プロモーターは、配列番号９１、もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。配列番号９１による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０４１２と称される。ＳＰ０４１２プロモーターは、一部の実施形態では、特に好ましい。このプロモーターは、強力であることが見出されており、また非常に短く、これは、状況次第で有利である。
ａ．ＳＰ０２６５（ＳＰ１３１Ａ１としても公知）およびそのバリアント
ａ．ＳＰ０２６５（ＳＰ１３１Ａ１としても公知）およびそのバリアント
【0325】
一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＲＥのＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）、ＣＲＥ００６５（配列番号１１７）、およびＣＲＥ００６６（配列番号１２２）、またはそれらの機能的バリアントの組合せを含む合成肝臓特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。一部の好ましい実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、ＣＲＥ００６６、および次いでプロモーターエレメントの順序で含む（上流から下流への方向）。
【0326】
プロモーターエレメントは、任意の好適な近位プロモーターまたはミニマルプロモーターであり得る。一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントはミニマルプロモーターである。プロモーターが近位プロモーターである場合、一般に、近位プロモーターが肝臓特異的であることが好ましい。
【0327】
一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００５２（Ｇ６ＰＣとも称される）（配列番号１２６）である。ＣＲＥ００５２は、ミニマルプロモーター（コアプロモーターとも称される）である。
【0328】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下の調節エレメント（またはその機能的バリアント）：ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、ＣＲＥ００６６、次いでＣＲＥ００５２（配列番号１２６）を含む。
ＣＲＥ００５１（配列番号９７）の配列およびそのバリアントは、上記に示される。
ＣＲＥ００５１（配列番号９７）の配列およびそのバリアントは、上記に示される。
【0329】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または８０もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0330】
ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００５８から変更されているが、肝臓特異的ＣＲＥとしてのそれらの活性を実質的に保持する配列を有する調節エレメントである。必須のＴＦに結合し、発現を増強するその能力を保持しながら、ＣＲＥの配列を変更することが可能であることが当業者に認識されるであろう。機能的バリアントは、それらがＣＲＥを非機能的にしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して、置換、欠失および／または挿入を含むことができる。
【0331】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）の機能的バリアントは、プロモーター中でＣＲＥ００５８の代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥと見なすことができる。例えば、ＣＲＥ００５８の代わりに置換されたＣＲＥ００５８の機能的バリアントを含むプロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）を含む参照プロモーターと比較して）。例えば、例としてプロモーターＳＰ０２６５（配列番号９４）を考慮すれば、ＳＰ０２６５中のＣＲＥ００５８は、ＣＲＥ００５８の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換されたＣＲＥを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。
【0332】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００５８と同じ肝臓特異的転写因子（ＴＦ）のための転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含むことが好ましい。それらが存在する順序でリストされる、ＣＲＥ００５８中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＨＮＦ４（配列番号１１５）およびｃ／ＥＢＰ（配列番号１１６）である。したがって、ＣＲＥ００５８の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳのすべてを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ００５８中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＨＮＦ４、次いでｃ／ＥＢＰの順序で存在する。ＣＲＥが、プロモーターおよび遺伝子と会合する場合、この順序は、好ましくは、上流からへ下流の方向（すなわち、転写開始部位（ＴＳＳ）の遠位からＴＳＳの近位への方向）と考えられる。スペーサー配列が、隣接するＴＦＢＳの間に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、好適には、重複していてもよく、すなわち、重複している配列は両方とも、それらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0333】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）の機能的バリアントは、以下のＴＦＢＳ配列：ＣＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＣＣ（ＨＮＦ４）（配列番号１１５）およびＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧ（ｃ／ＥＢＰ）（配列番号１１６）、それらと相補的な配列、またはそれらのそれぞれのＴＦに結合する能力を維持するこれらのＴＦＢＳ配列の機能的バリアントを含む。これらは、ＣＲＥ００５８と同じ順序、すなわち、それらが上記で示された順序で存在していてもよい。上記で議論されるように、ＴＦＢＳに関連する配列可変性が存在すること、および所与のＴＦＢＳについて、典型的にはコンセンサス配列が存在すること、それらから、いくらかの逸脱度が、典型的には存在することは当技術分野において周知である。
【0334】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５８の機能的バリアントは、配列：ＧＣＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧ（配列番号１１４）、またはそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％同一である配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１１３もしくは１１４、またはそれらの機能的バリアントからなる。
一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１１３もしくは１１４、またはそれらの機能的バリアントからなる。
【0335】
ＣＲＥまたはその機能的バリアントが、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に提供され得、かついずれかの方向性で提供され得ることに留意されたい。そのため、配列番号１１３もしくは１１４、またはそれらの機能的バリアントの相補配列および逆相補配列は、本発明の範囲内である。配列番号１１３もしくは１１４、またはそれらの機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も、本発明の範囲内である。
【0336】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００５８もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、１２０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、８０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、６０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または４０もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0337】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６５（配列番号１１７）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または８０もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0338】
ＣＲＥ００６５（配列番号１１７）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００６５から変更され得るが、肝臓特異的ＣＲＥとしてのそれらの活性を実質的に保持する配列を有する調節エレメントである。必須のＴＦに結合し、発現を増強するその能力を保持しながら、ＣＲＥの配列を変更することが可能であることが当業者に認識されるであろう。機能的バリアントは、それらがＣＲＥを非機能的にしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して、置換、欠失および／または挿入を含むことができる。
【0339】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６５の機能的バリアントは、プロモーター中でＣＲＥ００６５の代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥと見なすことができる。例えば、ＣＲＥ００６５の代わりに置換されたＣＲＥ００６５の機能的バリアントを含むプロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（ＣＲＥ００６５を含む参照プロモーターと比較して）。例えば、例としてプロモーターＳＰ０２６５（配列番号９４）を考慮すれば、ＳＰ０２６５中のＣＲＥ００６５は、ＣＲＥ００６５の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換されたＣＲＥを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。
【0340】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６５の機能的バリアントは、ＣＲＥ００６５と同じ肝臓特異的ＴＦのためのＴＦＢＳを含むことが好ましい。それらが存在する順序でリストされる、ＣＲＥ００６５中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＲＸＲアルファ（配列番号１１９）、ＨＮＦ３（配列番号１２０）およびＨＮＦ３（配列番号１２１）である。したがって、ＣＲＥ００６５の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳのすべてを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ００６５中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＲＸＲアルファ、ＨＮＦ３、次いでＨＮＦ３の順序で存在する。シス調節エレメントが、プロモーターおよび遺伝子と会合する場合、この順序は、好ましくは、上流から下流への方向（すなわち、転写開始部位（ＴＳＳ）の遠位からＴＳＳの近位への方向）と考えられる。スペーサー配列が、隣接するＴＦＢＳの間に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、好適には、重複していてもよく、すなわち、重複している配列は両方とも、それらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0341】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６５の機能的バリアントは、以下のＴＦＢＳ配列：ＡＣＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴ（ＲＸＲアルファ）（配列番号１１９）、ＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣ（ＨＮＦ３）（配列番号１２０）、およびＣＴＡＴＴＴＧＣＣＣ（ＨＮＦ３）（配列番号１２１）、それらと相補的な配列、またはそれらのそれぞれのＴＦに結合する能力を維持するこれらのＴＦＢＳ配列の機能的バリアントを含む。これらは、ＣＲＥ００６５と同じ順序、すなわち、それらが上記で示された順序で存在していてもよい。上記で議論されるように、ＴＦＢＳに関連する配列可変性が存在すること、および所与のＴＦＢＳについて、典型的にはコンセンサス配列が存在すること、それらから、いくらかの逸脱度が、典型的には存在することは当技術分野において周知である。
【0342】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６５の機能的バリアントは、配列：
【0343】
ＡＣＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴ－Ｎａ－ＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣ－Ｎｂ－ＴＡＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号１１８）、またはそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％同一である配列を含み、ＮａおよびＮｂは、必要に応じたスペーサー配列を表す。存在する場合、Ｎａは、必要に応じて、１４～３０ヌクレオチド、好ましくは、１８～２６ヌクレオチド、より好ましくは、２２ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｂは、必要に応じて、１～１０ヌクレオチド、好ましくは、２～６ヌクレオチド、より好ましくは、４ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１１７もしくは１１８、またはそれらの機能的バリアントからなる。
【0344】
ＣＲＥまたはその機能的バリアントが、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に提供され得、かついずれかの方向性で提供され得ることに留意されたい。そのため、配列番号１１７もしくは１１８、またはそれらの機能的バリアントの相補配列および逆相補配列は、本発明の範囲内である。配列番号１１７もしくは１１８、またはそれらの機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も、本発明の範囲内である。
【0345】
一部の好ましい実施形態では、ＣＲＥ００６５もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、９０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または７２もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0346】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６６（配列番号１２２）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または８０もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0347】
ＣＲＥ００６６（配列番号１２２）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００６６から変更されているが、肝臓特異的ＣＲＥとしてのそれらの活性を実質的に保持する配列を有する調節エレメントである。必須のＴＦに結合し、発現を増強するその能力を保持しながら、ＣＲＥの配列を変更することが可能であることが当業者に認識されるであろう。機能的バリアントは、それらがＣＲＥを非機能的にしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して、置換、欠失および／または挿入を含むことができる。
【0348】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６６の機能的バリアントは、プロモーター中でＣＲＥ００６６の代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥと見なすことができる。例えば、ＣＲＥ００６６の代わりに置換されたＣＲＥ００６６の機能的バリアントを含むプロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（ＣＲＥ００６６（配列番号１２２）を含む参照プロモーターと比較して）。例えば、例としてプロモーターＳＰ０２６５（配列番号９４）を考慮すれば、ＳＰ０２６５中のＣＲＥ００６６は、ＣＲＥ００６６の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換されたＣＲＥを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。
【0349】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６６の機能的バリアントは、ＣＲＥ００６６と同じ肝臓特異的転写因子（ＴＦ）のための転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を含む。それらが存在する順序でリストされる、ＣＲＥ００６６中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＨＮＦ４Ｇ（配列番号１２４）およびＦＯＳ：：ＪＵＮ（配列番号１２５）である。したがって、ＣＲＥ００６６の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳのすべてを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ００６６中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＨＮＦ４Ｇ、次いでＦＯＳ：：ＪＵＮの順序で存在する。シス調節エレメントが、プロモーターおよび遺伝子と会合する場合、この順序は、好ましくは、上流から下流への方向（すなわち、転写開始部位（ＴＳＳ）の遠位からＴＳＳの近位への方向）と考えられる。スペーサー配列が、隣接するＴＦＢＳの間に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、好適には、重複していてもよく、すなわち、重複している配列は両方とも、それらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0350】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６６（配列番号１２２）の機能的バリアントは、以下のＴＦＢＳ配列：ＧＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＡ（ＨＮＦ４Ｇ）（配列番号１２４）およびＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧ（ＦＯＳ：：ＪＵＮ）（配列番号１２５）、それらと相補的な配列、またはそれらのそれぞれのＴＦに結合する能力を維持するこれらのＴＦＢＳ配列の機能的バリアントを含む。これらは、ＣＲＥ００６６と同じ順序、すなわち、それらが上記で示された順序で存在していてもよい。上記で議論されるように、ＴＦＢＳに関連する配列可変性が存在すること、および所与のＴＦＢＳについて、典型的にはコンセンサス配列が存在すること、それらから、いくらかの逸脱度が、典型的には存在することは当技術分野において周知である。
【0351】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００６６（配列番号１２２）の機能的バリアントは、配列：ＧＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＡ－Ｎａ－ＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１２３）、またはそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％同一である配列を含み、Ｎａは、必要に応じたスペーサー配列を表す。存在する場合、Ｎａは、必要に応じて、１０～２８ヌクレオチド、好ましくは、１４～２４ヌクレオチド、より好ましくは、１９ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、ＣＲＥは、ＣＲＥ００６６、またはその機能的バリアントからなる。
一部の実施形態では、ＣＲＥは、ＣＲＥ００６６、またはその機能的バリアントからなる。
【0352】
ＣＲＥまたはその機能的バリアントが、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に提供され得、かついずれかの方向性で提供され得ることに留意されたい。そのため、配列番号１２２もしくは１２３、またはそれらの機能的バリアントの相補配列および逆相補配列は、本発明の範囲内である。配列番号１２２もしくは１２３、またはそれらの機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も、本発明の範囲内である。
【0353】
一部の好ましい実施形態では、ＣＲＥ００６６もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または８７もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0354】
一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターエレメントＣＲＥ００５２（Ｇ６ＰＣとも称される）（配列番号１２６）、またはその機能的バリアントもしくは機能的断片を含む。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0355】
ＣＲＥ００５２（配列番号１２６）の機能的バリアントは、肝臓特異的プロモーターエレメントとして作用するＣＲＥ００５２の能力を実質的に保持する。例えば、ＣＲＥ００５２の機能的バリアントが肝臓特異的プロモーターＳＰ０２６５に置換される場合、改変プロモーターは、ＳＰ０２６５の活性の少なくとも８０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する。
【0356】
一実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号９４またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号９４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。配列番号９４による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０２６５（ＳＰ１３１Ａ１またはＬＶＲ １３１＿Ａ１としても公知）と称される。配列番号９４を含むか、またはそれからなるプロモーターは、一部の実施形態では、特に好ましい。
【0357】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号９４であり、以下の構成成分：ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）、ＣＲＥ００６５（配列番号１１７）、ＣＲＥ００６６（配列番号１２２）、ＣＲＥ００５２（配列番号１２６）、またはそれらと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有し得る、配列番号９７、１１３、１１７、１２２、もしくは１２６の機能的バリアントを含む。
ｂ．ＳＰ０２３９およびそのバリアント
ｂ．ＳＰ０２３９およびそのバリアント
【0358】
一部の実施形態では、プロモーターは、以下のＣＲＥ：ＣＲＥ００１８（配列番号１５１）、ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）、ＣＲＥ００６５（配列番号１１７）、およびＣＲＥ００６６（配列番号１２２）、またはそれらの機能的バリアントを含む合成肝臓特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。一部の好ましい実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００１８、ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、ＣＲＥ００６６、および次いでプロモーターエレメントの順序で含む（上流から下流への方向）。
【0359】
プロモーターエレメントは、任意の好適な近位プロモーターまたはミニマルプロモーターであり得る。一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００５２（Ｇ６ＰＣとも称される）である。ＣＲＥ００５２は、ミニマルプロモーター（コアプロモーターとも称される）である。
【0360】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）：ＣＲＥ００１８、ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、ＣＲＥ００６６、および次いでＣＲＥ００５２を含む。
【0361】
ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、およびＣＲＥ００６６、ならびにプロモーターエレメントＣＲＥ００５２の配列、ならびにそれらの機能的バリアントは、上記に示される。
【0362】
ＣＲＥ００１８は、配列番号１５１の配列、またはその機能的バリアントもしくは機能的断片を有する。その機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0363】
ＣＲＥ００１８（配列番号１５１）の機能的バリアントは、ＣＲＥ００１８から変更されているが、肝臓特異的ＣＲＥとしてのそれらの活性を実質的に保持する配列を有する調節エレメントである。必須のＴＦに結合し、発現を増強するその能力を保持しながら、ＣＲＥの配列を変更することが可能であることが当業者に認識されるであろう。機能的バリアントは、それらがＣＲＥを実質的に非機能的にしないという条件で、参照ＣＲＥと比較して、置換、欠失および／または挿入を含むことができる。
【0364】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００１８の機能的バリアントは、プロモーター中でＣＲＥ００１８の代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するＣＲＥと見なすことができる。例えば、ＣＲＥ００１８の代わりに置換されたＣＲＥ００１８の機能的バリアントを含むプロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（ＣＲＥ００１８を含む参照プロモーターと比較して）。例えば、例としてプロモーターＳＰ０２３９を考慮すれば、ＳＰ０２３９中のＣＲＥ００１８は、ＣＲＥ００１８の機能的バリアントで置き換えることができ、プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換されたＣＲＥを含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。
【0365】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００１８の機能的バリアントは、ＣＲＥ００１８と同じ肝臓特異的ＴＦのためのＴＦＢＳを含む。それらが存在する順序でリストされる、ＣＲＥ００１８中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＩＲＦ（配列番号１２９）、ＮＦ１（配列番号１３０）、ＨＮＦ３（配列番号１３１）、ＨＢＬＦ（配列番号１３２）、ＲＸＲａ（配列番号１３３）、ＥＦ－Ｃ（配列番号１３４）、ＮＦ１（配列番号１３５）、およびｃ／ＥＢＰ（配列番号１３６）である。したがって、ＣＲＥ００１８の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳのすべてを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ００１８中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＩＲＦ、ＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＢＬＦ、ＲＸＲａ、ＥＦ－Ｃ、ＮＦ１、および次いでｃ／ＥＢＰの順序で存在する。ＣＲＥが、プロモーターおよび遺伝子と会合する場合、この順序は、好ましくは、上流から下流への方向（すなわち、転写開始部位（ＴＳＳ）の遠位からＴＳＳの近位への方向）と考えられる。スペーサー配列が、隣接するＴＦＢＳの間に提供されてもよい。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、好適には、重複していてもよく、すなわち、重複している配列は両方とも、それらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0366】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００１８の機能的バリアントは、以下のＴＦＢＳ配列：ＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣ（ＩＲＦ）（配列番号１２９）、ＴＣＧＣＣＡＡ（ＮＦ１）（配列番号１３０）、ＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡ（ＨＮＦ３）（配列番号１３１）、ＴＧＴＡＡＡＣＡＡＴＡ（ＨＢＬＦ）（配列番号１３２）、ＣＴＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣ（ＲＸＲａ）（配列番号１３３）、ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣ（ＥＦ－Ｃ）（配列番号１３４）、ＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧ（ＮＦ１）（配列番号１３５）、ＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧ（ｃ／ＥＢＰ）（配列番号１３６）、それらと相補的な配列、または配列番号１２９～１３６のそれらのそれぞれのＴＦに結合する能力を維持するこれらのＴＦＢＳ配列の機能的バリアントを含む。これらは、ＣＲＥ００１８と同じ順序、すなわち、それらが上記で示された順序で存在していてもよい。上記で議論されるように、ＴＦＢＳに関連する配列可変性が存在すること、および所与のＴＦＢＳについて、典型的にはコンセンサス配列が存在すること、それらから、いくらかの逸脱度が、典型的には存在することは当技術分野において周知である。
【0367】
本発明の一部の実施形態では、ＣＲＥ００１８の機能的バリアントは、配列：ＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＧＣＣＡＡ－Ｎａ－ＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＡＴＡ－Ｎｂ－ＣＴＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣ－Ｎｃ－ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣ－Ｎｄ－ＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＴＴＧ（配列番号１２８）、またはそれと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％同一である配列を含み、Ｎａ、Ｎｂ、Ｎｃ、およびＮｄは、必要に応じたスペーサー配列を表す。存在する場合、Ｎａは、必要に応じて、１０～２０ヌクレオチド、好ましくは、１３～１７ヌクレオチド、より好ましくは、１５ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｂは、必要に応じて、１～１０ヌクレオチド、好ましくは、１～５ヌクレオチド、より好ましくは、１ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｃは、必要に応じて、１～１０ヌクレオチド、好ましくは、１～５ヌクレオチド、より好ましくは、１ヌクレオチドの長さを有する。存在する場合、Ｎｄは、好適には、１～１０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、２～８ヌクレオチド長、より好ましくは、３ヌクレオチド長を有する。
【0368】
本発明の一部の実施形態では、ＣＲＥは、配列番号１２７もしくは１２８、またはそれらの機能的バリアントからなる。
【0369】
ＣＲＥまたはその機能的バリアントが、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖に提供され得、かついずれかの方向性で提供され得ることに留意されたい。そのため、配列番号１２８もしくは１２９、またはそれらの機能的バリアントの相補配列および逆相補配列は、本発明の範囲内である。配列番号１２８もしくは１２９、またはそれらの機能的バリアントによる配列を含む一本鎖核酸も、本発明の範囲内である。
【0370】
一部の実施形態では、ＣＲＥ００１８（配列番号１５１）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなるＣＲＥは、２００もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１５０もしくはそれよりも短いヌクレオチド、１２５もしくはそれよりも短いヌクレオチド、または１０３もしくはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有する。
【0371】
一実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号９３もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。配列番号９３による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０２３９と称される。ＳＰ０２３９の機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有することができる。
【0372】
したがって、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＳＰ０２３９（配列番号９３）であり、以下の構成成分：ＣＲＥ００１８（配列番号１５１）、ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００５８（配列番号１１３）、ＣＲＥ００６５（配列番号１１７）、およびＣＲＥ００６６（配列番号１２２）、およびＣＲＥ００５２（配列番号１２６）、またはそれらと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有し得る機能的バリアントを含む。
ｃ．ＳＰ０２４０およびそのバリアント
ｃ．ＳＰ０２４０およびそのバリアント
【0373】
一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターエレメントに作動可能に連結されたＣＲＥ００１８を含む合成肝臓特異的プロモーターである。一部の好ましい実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＣＲＥ００１８、または直ぐ上流のプロモーターエレメントを含む。
【0374】
プロモーターエレメントは、任意の好適な近位プロモーターまたはミニマルプロモーターであり得る。一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ０００６（配列番号１３７）である。ＣＲＥ０００６は、肝臓特異的近位プロモーターである。
【0375】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）：ＣＲＥ００１８、および次いでＣＲＥ０００６を含む。
【0376】
ＣＲＥ００１８の配列およびそのバリアントは、上記に示される。
【0377】
ＣＲＥ０００６は、近位プロモーターであり、ＴＳＳの上流に、肝臓特異的ＴＦのためのＴＦＢＳを含む。リストされる順序でＣＲＥ０００６中に存在する肝臓特異的ＴＦＢＳは、ＨＮＦ４（配列番号１３８）、ＲＸＲａ（配列番号１３９）、ＨＮＦ４（配列番号１４０）、ｃ／ＥＢＰ（配列番号１４１）、およびＨＮＦ３（配列番号１４２）、ならびに必要に応じてｐ１＠ＶＴＮ（配列番号１４３）である。したがって、ＣＲＥ０００６の機能的バリアントは、好ましくは、これらのＴＦＢＳを含む。好ましくは、それらは、それらがＣＲＥ０００６中に存在するのと同じ順序、すなわち、ＨＮＦ４、ｃ／ＥＢＰ、ＨＮＦ３、およびＨＮＦ３の順序で存在する。一部の実施形態では、ＴＦＢＳは、それらが、機能的のままであるという条件で、重複しており、すなわち、重複している配列は両方とも、それらのそれぞれのＴＦと結合することが可能である。
【0378】
ｐ１＠ＶＴＮ（配列番号１４３）は、遺伝子発現のＣａｐ分析（ＣＡＧＥ）によって決定されるＣＲＥ０００６中の転写開始部位（ＴＳＳ）を表す。
【0379】
一部の実施形態では、ＣＲＥ０００６の機能的バリアントは、配列番号１３７と少なくとも７０％同一（好ましくは、配列番号２５と少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％同一）である配列を含み、これは、ＨＮＦ４、ＲＸＲａ、ＨＮＦ４、ｃ／ＥＢＰ、およびＨＮＦ３のためのＴＦＢＳを含有し、好ましくは、前記ＴＦＢＳの下流に、ＨＮＦ４、ＲＸＲａ、ＨＮＦ４、ｃ／ＥＢＰ、およびＨＮＦ３のためのＴＦＢＳと少なくとも８０％、９０％、９５％、または完全に同一であるＴＳＳ配列を含有する。
【0380】
一部の実施形態では、ＣＲＥ０００６の機能的バリアントは、配列番号１３７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有し、以下のＴＦＢＳ：２５～３７位またはその近くにＨＮＦ４（配列番号１３８）；７３～８３位またはその近くにＲＸＲａ（配列番号１３９）；７４～８６位またはその近くにＨＮＦ４（配列番号１４０）；１２３～１３６位またはその近くにｃ／ＥＢＰ（配列番号１４１）；および１２９～１３７位またはその近くにＨＮＦ３（配列番号１４２）をさらに含み、かつ１６６～１９６位またはその近くに配列番号１４３と少なくとも８０％、９０％、９５％、または完全に同一であるＴＳＳ配列を含む配列を含み、位置は、配列番号１３７を参照して番号付けされる。本文脈において、そこまたはその近く（ａｔ ｏｒ ｎｅａｒ）は、好適には、配列番号１３７を参照して列挙された位置の１０、５、４、３、２、または１ヌクレオチド以内を意味する。好適なＴＦＢＳ配列は、配列番号１３８～１４２であるが、代替のＴＦＢＳ配列を使用することができる。
【0381】
一実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号９５もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。配列番号９５による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０２４０と称される。ＳＰ０２４０の機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有することができる。
ｄ．ＳＰ０２４６およびそのバリアント
ｄ．ＳＰ０２４６およびそのバリアント
【0382】
一部の実施形態では、プロモーターは、以下のＣＲＥ：ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、およびＣＲＥ００６５、またはそれらの機能的バリアントを含む合成肝臓特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。一部の好ましい実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、およびＣＲＥ００６５、ならびに次いで、プロモーターエレメントの順序で含む（上流から下流への方向）。
【0383】
プロモーターエレメントは、任意の好適な近位プロモーターまたはミニマルプロモーターであり得る。一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００５２（Ｇ６ＰＣとも称される）である。ＣＲＥ００５２は、ミニマルプロモーター（コアプロモーターとも称される）である。
【0384】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、以下のエレメント（またはその機能的バリアント）：ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、および次いでＣＲＥ００５２を含む。ＣＲＥ００５１、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、およびプロモーターエレメントＣＲＥ００５２の配列、ならびにそれらの機能的バリアントは、上記に示される。
【0385】
一実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、配列番号９６もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。配列番号９６による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０２４６と称される。ＳＰ０２４６の機能的バリアントは、配列番号９６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有することができる。
ｅ．ＳＰ０１３１およびそのバリアント
ｅ．ＳＰ０１３１およびそのバリアント
【0386】
一部の実施形態では、プロモーターは、以下のＣＲＥ：ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、およびＣＲＥ００６６、またはそれらの機能的バリアントを含む合成肝臓特異的プロモーターである。典型的には、ＣＲＥは、プロモーターエレメントに作動可能に連結されている。一部の好ましい実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、前記ＣＲＥまたはその機能的バリアントを、ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、ＣＲＥ００６６、および次いでプロモーターエレメントの順序で含む（上流から下流への方向）。
【0387】
プロモーターエレメントは、任意の好適な近位プロモーターまたはミニマルプロモーターであり得る。一部の好ましい実施形態では、プロモーターエレメントは、ＣＲＥ００５２（Ｇ６ＰＣとも称される）である。ＣＲＥ００５２は、ミニマルプロモーター（コアプロモーターとも称される）である。
【0388】
ＣＲＥ００５８、ＣＲＥ００６５、およびＣＲＥ００６６、ならびにプロモーターエレメントＣＲＥ００５２の配列、ならびにそれらの機能的バリアントは、上記に示される。
【0389】
配列番号１４１またはその機能的バリアント。配列番号１４１による配列を有するプロモーターは、ＳＰ０１３１と称される。ＳＰ０１３１の機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有することができる。
ｆ．複合プロモーター：
ｆ．複合プロモーター：
【0390】
一部の実施形態では、上記に示される肝臓特異的プロモーターは、１つまたは複数の追加の調節配列に作動可能に連結されている。追加の調節配列は、例えば、追加の調節配列が作動可能に連結されていない肝臓特異的プロモーターと比較して、発現を増強することができる。一般に、追加の調節配列は、肝臓特異的プロモーターの特異性を実質的に低減しないことが好ましい。
【0391】
例えば、肝臓特異的プロモーターは、ＵＴＲ（例えば、５’および／または３’ＵＴＲ）、イントロンなどをコードする配列に作動可能に連結され得る。
【0392】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＵＴＲ、例えば、５’ＵＴＲをコードする配列に作動可能に連結されている。５’ＵＴＲは、遺伝子発現を調節し得るさまざまなエレメントを含有することができる。天然遺伝子中の５’ＵＴＲは、転写開始部位で始まり、コード領域の開始コドンの１ヌクレオチド前で終わる。本明細書で指す５’ＵＴＲが、天然に存在する５’ＵＴＲ全体であり得るか、または天然に存在する５’ＵＴＲの一部分であり得ることに留意すべきである。５’ＵＴＲはまた、部分的または全体的に合成であり得る。真核生物では、５’ＵＴＲは、およそ１５０ｎｔの中位長さを有するが、一部の場合では、それらは、相当長くあり得る。５’ＵＴＲ中で見出され得る調節配列としては、限定されるものではないが、
ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与え得るタンパク質のための結合部位；
リボスイッチ；
翻訳開始を促進または阻害する配列；ならびに
遺伝子発現およびｍＲＮＡ排出の調節のための連結されている５’ＵＴＲ内のイントロン
が挙げられる。
ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与え得るタンパク質のための結合部位；
リボスイッチ；
翻訳開始を促進または阻害する配列；ならびに
遺伝子発現およびｍＲＮＡ排出の調節のための連結されている５’ＵＴＲ内のイントロン
が挙げられる。
【0393】
一部の実施形態では、上記に示される肝臓特異的プロモーターは、ＣＭＶの主な即時型遺伝子（ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子）に由来する５’ＵＴＲをコードする配列に作動可能に連結されている。例えば、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲは、好適には、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子エクソン１、およびＣＭＶ－ＩＥ遺伝子エクソン１、またはそれらの部分を含む。一部の場合では、プロモーターエレメントは、５’ＵＴＲへの連結を考慮して、改変されていてもよく、例えば、プロモーターエレメント中の転写開始部位（ＴＳＳ）の下流の配列を除去する（例えば、５’ＵＴＲで置き換える）ことができる。
【0394】
ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲは、参照により本明細書に組み込まれるSimari, et al., Molecular Medicine 4: 700-706, 1998 "Requirements for Enhanced Transgene Expression by Untranslated Sequences from the Human Cytomegalovirus Immediate-Early Gene"に記載されている。Simari, et al.において議論されたＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲ配列のバリアントは、参照により組み込まれるＷＯ２００２／０３１１３７にも示されており、そこで開示されている調節配列を使用することもできる。プロモーターと組み合わせて使用することができる他のＵＴＲは、当技術分野において、例えば、参照により組み込まれるLeppek, K., Das, R. & Barna, M. "Functional 5' UTR mRNA structures in eukaryotic translation regulation and how to find them". Nat Rev Mol Cell Biol 19, 158-174 (2018)において公知である。
【0395】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、配列番号１４５またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。配列番号１４５は、ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲをコードする。
【0396】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、産生したｍＲＮＡにおいてコザック配列を定義する配列を含む。例えば、一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、その３’末端またはその近くに配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含む。他のコザック配列または他のタンパク質翻訳開始部位は、当技術分野において公知であるように（例えば、Marilyn Kozak, "Point Mutations Define a Sequence Flanking the AUG Initiator Codon That Modulates Translation by Eukaryotic Ribosomes" Cell, Vol. 44, 283-292, January 31, 1986；Marilyn Kozak "At Least Six Nucleotides Preceding the AUG Initiator Codon Enhance Translation in Mammalian Cells" J. Mol. Rid. (1987) 196, 947-950；Marilyn Kozak "An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs" Nucleic Acids Research. Vol. 15 (20) 1987、それらのすべてが、参照により本明細書に組み込まれる）、使用することができる。タンパク質翻訳開始部位（例えば、コザック配列）は、好ましくは、開始コドンに直ぐ隣接して設置される。
【0397】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲをコードする配列は、配列番号４３８またはその機能的バリアントを含む。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。この５’ＵＴＲは、ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲの３’末端にコザック配列を定義する配列番号１５３の６ヌクレオチドを含む。
【0398】
一部の実施形態では、上記で議論されるＳＰ０４１２プロモーターまたはそのバリアントは、５’ＵＴＲをコードする配列に連結されて、複合プロモーター／５’ＵＴＲ調節構築物を提供する。本明細書では、そのような複合プロモーター／５’ＵＴＲ構築物は、単に「複合プロモーター」、または一部の場合では、簡潔さのために、単に「プロモーター」と称することがある。
【0399】
一部の実施形態では、複合プロモーターは、配列番号９２もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号９２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0400】
この複合プロモーターは、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲ（配列番号１４５）をコードする配列、および上記で議論されたＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）のコザック配列に作動可能に連結されたＳＰ０４１２を含む。この（複合）プロモーターは、ＳＰ０４２２（配列番号９２）と称される。ＳＰ０４２２は、一部の実施形態では、好ましい肝臓特異的プロモーターである。上記で議論されるように、５’ＵＴＲは、好適には、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、コザック配列を定義する配列を含む。上記の配列では、５’ＵＴＲは、その３’末端に配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含むが、この配列モチーフは除くことができるか、または代替配列を使用することができる。
【0401】
一部の実施形態では、上記で議論されるＳＰ０２６５プロモーターまたはそのバリアントは、５’ＵＴＲをコードする配列に連結されて、複合プロモーター（ＳＰ０２３６－５ＵＴＲ）を提供する。
【0402】
一部の実施形態では、複合プロモーターは、配列番号１４６もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１４６と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0403】
この複合プロモーターは、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲ（配列番号１４５）、およびＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）のコザック配列に作動可能に連結されたＳＰ０２６５（配列番号９４）を含む。この（複合）プロモーターは、ＳＰ０４２０と称される。このプロモーターでは、ＣＲＥ００５２プロモーターエレメント中のＴＳＳの下流の短い配列が、ＣＭＶ－ＩＥ由来の５’ＵＴＲからの配列で置き換えられている。そのため、このプロモーターは、実際には、ＣＲＥ００５２に対する改変を有し、それによって、一部の配列が除去されている、ＳＰ０２６５のマイナーなバリアントを含む。一部の実施形態では、ＳＰ０４２０が好ましい。上記で議論されるように、５’ＵＴＲは、好適には、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、コザック配列を定義する配列を含む。上記の配列では、５’ＵＴＲは、その３’末端に配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含むが、この配列モチーフは除くことができるか、または代替配列を使用することができる。
【0404】
一部の実施形態では、上記で議論されるＳＰ０２３９プロモーターまたはそのバリアントは、５’ＵＴＲをコードする配列に連結されて、複合プロモーター（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）を提供する。
【0405】
一部の実施形態では、複合プロモーターは、配列番号１４７もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１４７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0406】
この複合プロモーター／５’ＵＴＲ構築物は、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲ、およびＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）のコザック配列に作動可能に連結されたＳＰ０２３９を含む。この（複合）プロモーターは、ＳＰ０４２１と称される。再び、このプロモーターでは、ＣＲＥ００５２プロモーターエレメント中のＴＳＳの下流の短い配列が、ＣＭＶ－ＩＥ由来の５’ＵＴＲからの配列で置き換えられている。そのため、このプロモーターは、実際には、ＣＲＥ００５２に対する改変を有し、それによって、一部の配列が除去されている、ＳＰ０２３９のマイナーなバリアントを含む。一部の実施形態では、ＳＰ０４２１が好ましい。上記で議論されるように、５’ＵＴＲは、好適には、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、コザック配列を定義する配列を含む。上記の配列では、５’ＵＴＲは、その３’末端に配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含むが、この配列モチーフは除くことができるか、または代替配列を使用することができる。
【0407】
一部の実施形態では、上記で議論されるＳＰ０２４０プロモーターまたはそのバリアントは、５’ＵＴＲをコードする配列に連結されて、複合プロモーターを提供する。
【0408】
一部の実施形態では、複合プロモーターは、配列番号１４８もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0409】
この複合プロモーター／５’ＵＴＲ構築物は、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲ、およびＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）のコザック配列に作動可能に連結されたＳＰ０２４０を含む。この（複合）プロモーターは、ＳＰ０２４０－ＵＴＲと称される。再び、このプロモーターでは、ＣＲＥ０００６プロモーターエレメント中のＴＳＳの下流の短い配列が、ＣＭＶ－ＩＥ由来の５’ＵＴＲからの配列で置き換えられている。そのため、このプロモーターは、実際には、ＣＲＥ０００６に対する改変を有し、それによって、一部の配列が除去されている、ＳＰ０２４０のマイナーなバリアントを含む。一部の実施形態では、ＳＰ０２４０－ＵＴＲが好ましい。上記で議論されるように、５’ＵＴＲは、好適には、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、コザック配列を定義する配列を含む。上記の配列では、５’ＵＴＲは、その３’末端に配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含むが、この配列モチーフは除くことができるか、または代替配列を使用することができる。
【0410】
一部の実施形態では、上記で議論されるＳＰ０２４６プロモーターまたはそのバリアントは、５’ＵＴＲをコードする配列に連結されて、複合プロモーターを提供する。
【0411】
一部の実施形態では、複合プロモーターは、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0412】
この複合プロモーター／５’ＵＴＲ構築物は、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲ、およびＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）のコザック配列に作動可能に連結されたＳＰ０２４６を含む。この（複合）プロモーターは、ＳＰ０２４６－ＵＴＲと称される。再び、このプロモーターでは、ＣＲＥ００５２プロモーターエレメント中のＴＳＳの下流の短い配列が、ＣＭＶ－ＩＥ由来の５’ＵＴＲからの配列で置き換えられている。そのため、このプロモーターは、実際には、ＣＲＥ００５２に対する改変を有し、それによって、一部の配列が除去されている、ＳＰ０２４６のマイナーなバリアントを含む。一部の実施形態では、ＳＰ０２４６－ＵＴＲが好ましい。上記で議論されるように、５’ＵＴＲは、好適には、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、コザック配列を定義する配列を含む。上記の配列では、５’ＵＴＲは、その３’末端に配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含むが、この配列モチーフは除くことができるか、または代替配列を使用することができる。
【0413】
一部の実施形態では、上記で議論されるＳＰ０１３１＿Ａ１プロモーターまたはそのバリアントは、５’ＵＴＲをコードする配列に連結されて、複合プロモーターを提供する。
【0414】
一部の実施形態では、複合プロモーターは、配列番号１５０（ＳＰ０１３１ Ａ１－ＵＴＲ）もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、機能的バリアントは、それと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を有していてもよい。
【0415】
この複合プロモーター／５’ＵＴＲ構築物は、ＣＭＶ－ＩＥ遺伝子由来の５’ＵＴＲ、およびＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）のコザック配列に作動可能に連結されたＳＰ０１３１を含む。この（複合）プロモーターは、ＳＰ０１３１－ＵＴＲと称される。再び、このプロモーターでは、ＣＲＥ００５２プロモーターエレメント中のＴＳＳの下流の短い配列が、ＣＭＶ－ＩＥ由来の５’ＵＴＲからの配列で置き換えられている。そのため、このプロモーターは、実際には、ＣＲＥ００５２に対する改変を有し、それによって、一部の配列が除去されている、ＳＰ０１３１のマイナーなバリアントを含む。一部の実施形態では、ＳＰ０１３１－ＵＴＲが好ましい。上記で議論されるように、５’ＵＴＲは、好適には、タンパク質翻訳開始部位として機能する核酸モチーフ、例えば、コザック配列を定義する配列を含む。上記の配列では、５’ＵＴＲは、その３’末端に配列モチーフＧＣＣＡＣＣ（配列番号１５３）を含むが、この配列モチーフは除くことができるか、または代替配列を使用することができる。
【0416】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＳＰ０４１２（配列番号９１）であり、以下の構成成分：ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００６７（配列番号１５２）、ＣＲＥ００５９（配列番号１１０）、およびコザック配列（配列番号１５３）、またはそれらと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有し得る機能的バリアントを含む。
【0417】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ＳＰ０４２２（配列番号９）であり、以下の構成成分：ＣＲＥ００５１（配列番号９７）、ＣＲＥ００６７（配列番号１５２）、ＣＲＥ００５９（配列番号１１０）、ＣＭＶ－ＩＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１５３）、およびコザック配列（配列番号１５３）、またはそれらと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である配列を有し得る機能的バリアントを含む。
（ｉｉｉ）合成肝臓特異的プロモーターの機能的バリアント
（ｉｉｉ）合成肝臓特異的プロモーターの機能的バリアント
【0418】
一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントは、プロモーター中で参照プロモーターエレメントの代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するプロモーターエレメントと見なすことができる。例えば、肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントは、本明細書の表４における所与のプロモーターの機能的バリアント、あるいは配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）からリストされる任意のプロモーター、またはそれらの機能的断片もしくはバリアント、あるいは配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰ、またはそれらの機能的断片もしくはバリアントを含み、機能的バリアントまたは機能的断片は、好ましくは、未変更のプロモーターの活性の少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９５％、さらにより好ましくは、活性の１００％を保持する（未改変プロモーターエレメントを含む未変更のプロモーター配列と比較して）。肝臓特異的プロモーターの活性を評価するための好適なアッセイは、本明細書に、例えば、実施例１２および１３に開示される。
【0419】
一部の実施形態では、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、または配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）からリストされる任意のプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰの機能的バリアントまたは機能的断片は、元の未改変配列と少なくとも約７５％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性を有し、かつ対応する未改変プロモーター配列の少なくとも３５％のプロモーター活性、または少なくとも約４５％のプロモーター活性、または少なくとも約５０％のプロモーター活性、または少なくとも約６０％のプロモーター活性、または少なくとも約７５％のプロモーター活性、または少なくとも約８０％のプロモーター活性、または少なくとも約８５％のプロモーター活性、または少なくとも約９０％のプロモーター活性、または少なくとも約９５％のプロモーター活性も有する。
【0420】
例えば、配列番号２５８（ＳＰ０４１２）または配列番号９２（ＳＰ０４２２）の機能的バリアントまたは機能的断片は、それぞれ、配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）と少なくとも約７５％の配列同一性、または配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）と少なくとも約８０％の配列同一性、配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）と少なくとも約９０％の配列同一性、配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）と少なくとも約９５％の配列同一性、配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）と少なくとも約９８％の配列同一性、または元の未改変配列を有し、かつ配列番号９１（ＳＰ０４１２）もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）の対応する未改変プロモーター配列の少なくとも３５％のプロモーター活性、または少なくとも約４５％のプロモーター活性、または少なくとも約５０％のプロモーター活性、または少なくとも約６０％のプロモーター活性、または少なくとも約７５％のプロモーター活性、または少なくとも約８０％のプロモーター活性、または少なくとも約８５％のプロモーター活性、または少なくとも約９０％のプロモーター活性、または少なくとも約９５％のプロモーター活性も有する。
【0421】
一部の実施形態では、本明細書に開示される肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントは、未改変プロモーター配列と著しい配列同一性のレベルを保持する。好適には、機能的バリアントは、未改変プロモーター配列と少なくとも６０％同一、より好ましくは、未改変肝臓特異的プロモーター配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一である配列を含む。
【0422】
一部の実施形態では、本明細書に開示される肝臓特異的プロモーターの機能的断片は、未改変プロモーター配列と著しい配列同一性のレベルを保持する。好適な機能的断片は、未改変プロモーター配列と少なくとも６０％同一、より好ましくは、未改変肝臓特異的プロモーター配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一である配列を含む。
【0423】
一部の実施形態では、プロモーターエレメントの機能的バリアントは、プロモーター中で参照プロモーターエレメントの代わりに置換された場合に、その活性を実質的に保持するプロモーターエレメントと見なすことができる。例えば、所与のプロモーターエレメントの機能的バリアントを含む肝臓特異的プロモーターは、好ましくは、その活性の少なくとも８０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９０％、より好ましくは、その活性の少なくとも９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（未改変プロモーターエレメントを含む参照プロモーターと比較して）。肝臓特異的プロモーターの活性を評価するための好適なアッセイは、本明細書に、例えば、実施例１２および１３に開示される。
【0424】
本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰの配列を、活性の実質的な喪失を引き起こすことなく、変更することができることに留意すべきである。そのため、下記で議論される肝臓特異的プロモーターの機能的バリアントは、肝臓特異的プロモーターの活性に著しく害を及ぼす改変を回避するという条件で、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰの配列を改変することによって調製することができる。本開示に提供される情報を考慮して、機能的バリアントを提供するための、本明細書の表４に開示される肝臓特異的プロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰの改変は、複雑でない。また、本開示は、任意の所与の肝臓特異的プロモーターバリアントの機能性を簡単に評価するための方法論を提供する。それぞれの肝臓特異的プロモーターについての機能的バリアントは下記で議論される。
【0425】
本発明の一部の実施形態では、合成肝臓特異的プロモーターは、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）からリストされる任意のプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰ、あるいはそれらのいずれかの機能的バリアントからなる群からの配列を含む。好適には、前記肝臓特異的プロモーターのいずれかの機能的バリアントは、参照合成肝臓特異的プロモーターと少なくとも７０％同一、より好ましくは、参照合成肝臓特異的プロモーターと少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％同一である配列を含む。
【0426】
一部の実施形態では、その機能的バリアントは、好適には、表４にリストされる配列のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一である配列を含み得る。加えて、または代わりに、表４にリストされる配列のいずれか１つの機能的バリアントは、好適には、参照配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む。表４にリストされる配列のいずれか１つの機能的バリアントは、そこで提供される配列の１つまたは複数が、上記に定義されるその機能的バリアントで置き換えられているか、および／またはそこで提供される配列の順序が変更されている、バリアントを含む。
【0427】
一部の実施形態では、表４にリストされる肝臓特異的プロモーター配列のいずれか１つの機能的バリアントは、少なくとも１つまたは複数のヌクレオチドが置換され、それがその活性を実質的に保持する場合に、肝臓特異的プロモーターと見なすことができる。例えば、表４にリストされる肝臓特異的プロモーター配列のいずれか１つの機能的バリアントを含む肝臓特異的プロモーターは、好ましくは、その活性の８０％、より好ましくは、その活性の９０％、より好ましくは、その活性の９５％、さらにより好ましくは、その活性の１００％を保持する（参照プロモーター配列と比較して）。例えば、ＬＳＰが例としてＳＰ０４１２（配列番号９１）を含む核酸配列を含む場合、ＳＰ０４１２（例えば、配列番号９１）中のヌクレオチドの一部分を、その機能的バリアントで置き換えることができ、肝臓特異的ＳＰ０４１２プロモーターは、その活性を実質的に保持する。活性の保持は、同等の条件下で、参照プロモーターの制御下で好適なレポーターの発現を、置換された核酸を含むそうでなければ同一のプロモーターと比較することによって、評価することができる。肝臓特異的プロモーターの活性を評価するための好適なアッセイは、本明細書に、例えば、実施例１２および１３に開示される。
【0428】
本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書の表４に開示される合成肝臓特異的プロモーター、または配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）からリストされる任意のプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰは、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、もしくは２００、もしくは１５０、またはそれよりも短いヌクレオチドの長さを有するそれらの機能的バリアントである。
【0429】
本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書の表４に開示される合成肝臓特異的プロモーター、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）からリストされる任意のプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰは、ミニマルプロモーターに作動可能に連結された合成肝臓特異的シス調節エレメント（ＣＲＥ）またはシス調節モジュール（ＣＲＭ）を含む。本発明における使用のための好適なミニマルプロモーターの例としては、限定されるものではないが、ＣＭＶ－ミニマルプロモーター、ＭｉｎＴｋミニマルプロモーター、およびＬＶＲ＿ＣＲＥ００５２＿Ｇ６ＰＣミニマルプロモーター（配列番号１２６）が挙げられる。特定の実施形態では、ミニマルプロモーターは、配列番号１４５の配列、配列番号１４５と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一である配列を含むＣＭＶ－ＩＥプロモーターである。本明細書に開示される方法および組成物における使用のためのＣＭＶ－ＩＥを含む例示的なプロモーターは、限定されるものではないが、配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、または配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）から選択することができる。
【0430】
本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書の表４に開示される合成肝臓特異的プロモーター、例えば、配列番号８６（ＣＲＭ ０４１２）、配列番号９１（ＳＰ０４１２）、もしくは配列番号９２（ＳＰ０４２２）、配列番号９３（ＳＰ０２３９）、配列番号９４（ＳＰ０２６５、ＳＰ１３１＿Ａ１も指す）、配列番号９５（ＳＰ０２４０）、もしくは配列番号９６（ＳＰ０２４６）、もしくは配列番号１４６（ＳＰ０２６５－ＵＴＲ）、配列番号１４７（ＳＰ０２３９－ＵＴＲ）、配列番号１４８（ＳＰ０２４０－ＵＴＲ）、配列番号１４９（ＳＰ０２４６－ＵＴＲ）、もしくは配列番号１５０（ＳＰ０１３１－Ａ１－ＵＴＲ）からリストされる任意のプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰは、ＬＰ－１プロモーター（配列番号４３２）と比べて、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれよりも高く、対象の肝臓または肝臓細胞において、遺伝子の発現を増加させることが可能である。
【0431】
本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書の表４に開示される合成肝臓特異的プロモーター、または配列番号８６、９１～９６、１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰ、合成肝臓特異的プロモーターは、肝臓特異的な導入遺伝子の発現を促進することが可能であり、ＴＴＲプロモーター（配列番号４３１）の活性の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、または４００％である肝臓細胞における活性を有する。
【0432】
本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書の表４に開示される合成肝臓特異的プロモーター、または配列番号８６、９１～９６、１４６～１５０から選択される任意のＬＳＰプロモーター、または配列番号２７０～３４１もしくは３４２～４３０から選択される任意のＬＳＰ、合成肝臓特異的プロモーターは、肝臓特異的な導入遺伝子の発現を促進することが可能であり、ＴＢＧプロモーター（配列番号４３５）の活性の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、または４００％である肝臓細胞における活性を有する。
Ｇ．イントロン配列
Ｇ．イントロン配列
【0433】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子型は、プロモーター配列の３’および分泌シグナルペプチドの５’に位置するイントロン配列を含む。イントロン配列は、ｍＲＮＡ安定性、核からのｍＲＮＡ輸送、ならびに／または発現されたＧＡＡ融合ポリペプチド（例えば、ＳＳ－ＧＡＡ融合ポリペプチドもしくはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡポリペプチド）の発現および／もしくは調節の１つまたは複数を増加させる働きをする。代替の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子型は、イントロン配列を含まない。
【0434】
一部の実施形態では、イントロン配列は、ＭＶＭイントロン配列、例えば、限定されるものではないが、配列番号１３のイントロン配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列である。
【0435】
一部の実施形態では、イントロン配列は、ＨＢＢ２イントロン配列、例えば、限定されるものではないが、配列番号１４のイントロン配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列である。
【0436】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、分泌シグナルペプチドをコードする配列の５’およびプロモーターの３’に位置するイントロン配列をさらに含む異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＭＶＭ配列、またはＨＢＢ２配列を含み、ＭＶＭ配列は、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含み、ＨＢＢ２配列は、配列番号１４の核酸配列、または配列番号１４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含む。
【0437】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子型は、ヒトベータグロビンｂ２（またはＨＢＢ２）イントロン、ＦＩＸイントロン、ニワトリベータグロビンイントロン、およびＳＶ４０イントロンからなる群において選択されるイントロン配列を含む。一部の実施形態では、イントロンは、必要に応じて、改変ＨＢＢ２イントロン（例えば、ＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１の配列番号１７を参照されたい）、改変ＦＩＸイントロン（例えば、ＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１の配列番号１９を参照されたい）、もしくは改変ニワトリベータグロビンイントロン（例えば、ＷＯ２０１８０４６７７４Ａ１の配列番号２１を参照されたい）、または参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１６２３０２に開示される改変ＨＢＢ２もしくはＦＩＸイントロンなどの改変イントロンである。
Ｈ．ポリＡ
Ｈ．ポリＡ
【0438】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、一実施形態では、ＧＡＡ融合ポリペプチド（例えば、ＳＳ－ＧＡＡ融合ポリペプチドまたはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡポリペプチド）をコードする異種核酸遺伝子の３’および下流に位置する少なくとも１つのポリＡテイルを含む。一部の実施形態では、ポリＡシグナルは、本明細書に定義される安定性配列またはＣＳ配列の３’である。限定されるものではないが、ｈＧＨポリＡ、ｓｙｎｐＡポリＡなどを含む任意のポリＡ配列を使用することができる。一部の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡ配列である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、２つのポリＡテイル、例えば、ｈＧＨポリＡ配列および別のポリＡ配列を含み、スペーサー核酸配列は、２つのポリＡ配列の間に位置する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、ＧＡＡ融合ポリペプチド（例えば、ＳＳ－ＧＡＡ融合ポリペプチドまたはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡポリペプチド）をコードする核酸の３’、または代わりに、ＣＳ配列の３’に、以下のエレメントを含む；第１のポリＡ配列、（１００～４００ｂｐの間または約２５０ｂｐの）スペーサー核酸配列、第２のポリＡ配列、スペーサー核酸配列、および３’ＩＴＲ。一部の実施形態では、第１および第２のポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ配列であり、一部の実施形態では、第１および第２のポリＡ配列は、合成ポリＡ配列である。一部の実施形態では、第１のポリＡ配列がｈＧＨポリＡ配列であり、第２のポリＡ配列が合成配列であるか、またはその逆である、すなわち、代替の実施形態では、第１のポリＡ配列が合成ポリＡ配列であり、第２のポリＡ配列がｈＧＨポリＡ配列である。例示的なポリＡ配列は、例えば、配列番号１５（ｈＧＨポリＡ配列）、または配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有するポリＡ核酸配列である。一部の実施形態では、使用のために包含されるｈＧＨポリ配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるAnderson et al. J. Biol. Chem 264(14); 8222-8229, 1989（例えば、８２２３頁、第２欄、第１段落を参照されたい）に記載されている。
【0439】
一部の実施形態では、ポリＡテイルは、一実施形態ではＧＡＡである異種遺伝子に対する転写物を含むｒＡＡＶベクターゲノムから転写されるＲＮＡ転写物を安定化するように操作され得、代替の実施形態では、ポリＡテイルは、不安定なエレメントを含むよう操作され得る。
【0440】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、ＧＡＡ遺伝子をコードする核酸の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置する少なくとも１つのポリＡ配列を含む。一部の実施形態では、ポリＡは、全長ポリＡ（ｆｌ－ポリＡ）配列である。一部の実施形態では、ポリＡは、切断型ポリＡ配列であり、例えば、図５Ｇを参照されたい。
【0441】
実施形態では、ポリＡテイルは、ポリＡテイルの長さを変更することによって、不安定なエレメントになるよう操作され得る。実施形態では、ポリＡテイルは、長く、または短くされ得る。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ＧＡＡ ３’ＵＴＲ（配列番号８５）または３’ＵＴＲ（配列番号７７）を含む。
【0442】
別の実施形態では、不安定なエレメントは、異種遺伝子をコードする、ｍｉＲＮＡが結合するＲＮＡ転写物をサイレンシングする（翻訳を抑制し、分解を促進する）能力を有するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。実施形態では、ポリＡテイル内のシード領域の付加または欠失は、ＧＡＡタンパク質または改変ＧＡＡポリペプチドなどのタンパク質の発現を増加または減少させることができる。
【0443】
別の実施形態では、シード領域は、異種遺伝子およびポリＡテイルの間に位置する３’非翻訳領域に操作することもできる。さらなる実施形態では、不安定化剤は、ｓｉＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡのコード領域が、ｒＡＡＶベクターゲノムに含まれ得、一般に、ポリＡテイルの３’の下流に位置する。
【0444】
本明細書に開示される方法および組成物のすべての態様では、ｒＡＡＶゲノムは、スタッファーＤＮＡ核配列も含んでいてもよい。例示的なスタッファーＤＮＡ配列は、配列番号７１、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列である。図７～８および図９Ａ～９Ｅに示されるように、スタッファー配列は、例えば、ポリＡテイルの３に位置し、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。一部の実施形態では、スタッファーＤＮＡ配列は、逆の方向性の合成ポリアデニル化シグナルを含む。
【0445】
一部の実施形態では、スタッファー核酸配列（「スペーサー」核酸断片とも称される、図７～８を参照されたい）は、ポリＡ配列および３’ＩＴＲの間に位置することができる（すなわち、スタッファー核酸配列は、ポリＡ配列の３’および３’ＩＴＲの５’に位置する）（例えば、図７～８を参照されたい）。そのようなスタッファー核酸配列は、約３０ｂｐ、５０ｐｂ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、または３００ｂｐ超であり得る。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、スタッファー核酸断片は、２０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、１００～２００ｂｐ、２００～３００ｂｐ、３００～５００ｂｐの間であるか、または２０～５００ｂｐの間の任意の整数である。例示的なスタッファー（またはスペーサー）核酸配列は、配列番号１６、配列番号７１、もしくは配列番号７８、または配列番号１６、もしくは配列番号７１、もしくは配列番号７８と少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一の核酸配列を含む。
Ｉ．ＡＡＶ ＩＴＲ
Ｉ．ＡＡＶ ＩＴＲ
【0446】
本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムはＡＡＶ ＩＴＲを含み、これは、望ましい特徴を有し、ＩＴＲが組み込まれたベクターの活性およびそれに対する細胞応答をモジュレートするように設計され得る。別の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４７４３３号に記述されるように、望ましい特徴を有し、１つまたは２つの合成ＩＴＲを含むベクターの活性およびそれに対する細胞応答を操作するように設計され得る、合成ＡＡＶ ＩＴＲである。
【0447】
別の実施形態では、ＩＴＲは、天然に存在するＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ２と比べて、改変された転写活性を示す。ＩＴＲ２配列は、本質的に、プロモーター活性を有することが公知である。それは、本質的に、ポリ（Ａ）配列に類似している終止活性も有する。本発明の最小の機能的ＩＴＲは、ＩＴＲ２と比べて減少したレベルであるが、実施例に示されるように、転写活性を示す。そのため、一部の実施形態では、ＩＴＲは、転写について機能的である。他の実施形態では、ＩＴＲは、転写について欠陥がある。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、転写インスレーターとして作用することができ、例えば、ベクターが宿主染色体へ組み込まれる時に、ベクターに存在するトランスジェニックカセットの転写を防止する。
【0448】
本発明の一態様は、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターゲノムに関し、ＩＴＲ中の１つまたは複数の転写因子結合部位のヌクレオチド配列は、ＩＴＲ２などの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲの配列と比べて、欠失および／または置換されている。一部の実施形態では、それは、１つまたは複数の転写因子結合部位が欠失および／または置換されている最小の機能的ＩＴＲである。一部の実施形態では、少なくとも１つの転写因子結合部位、例えば、少なくとも５つもしくはそれよりも多く、または１０もしくはそれよりも多くの転写因子結合部位、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の転写因子結合部位が、欠失および／または置換されている。
【0449】
別の実施形態である、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つの合成ＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、典型的には、ＩＴＲ中の転写開始部位またはその近くで生じる１つまたは複数のＣｐＧアイランド（シトシン塩基の直後にグアニン塩基が続き（ＣｐＧ）、そこでは、そのような配置中のシトシンはメチル化される傾向がある）は、欠失および／または置換されている。実施形態では、ＣｐＧアイランドの欠失または数の低減は、ｒＡＡＶベクターの免疫原性を低減することができる。これは、ＣｐＧアイランドで生じる、ｒＡＡＶベクターＤＮＡ配列とのＴＬＲ－９の結合の低減または完全な阻害に起因する。ＣｐＧモチーフのメチル化が転写サイレンシングをもたらすことも周知である。ＩＴＲ中のＣｐＧモチーフの除去は、ＴＬＲ－９認識の減少および／またはメチル化の減少、ならびにしたがって、導入遺伝子サイレンシングの減少をもたらすと予想される。一部の実施形態では、それは、１つまたは複数のＣｐＧアイランドが欠失および／または置換されている最小の機能的ＩＴＲである。実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲ２は、１６のＣｐＧアイランドを含有することが公知であり、その１つもしくは複数、または１６すべてが欠失され得る。
【0450】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、例えば、少なくとも４つもしくはそれよりも多く、または８つもしくはそれよりも多くのＣｐＧモチーフ、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のＣｐＧモチーフが、欠失および／または置換されている。
【0451】
別の実施形態では、合成ＩＴＲは、表７にリストされるヌクレオチド配列の１つを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。他の実施形態では、合成ＩＴＲは、表７にリストされるヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、ＩＴＲは、図１において改変ＩＴＲ配列を開示するSamulski et al., 1983, Cell, 33; 135-143（「Samulski et al, 1983」を指し、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図１に開示されている配列である。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、Samulski et al, 1993に開示される図１におけるＩＴＲ配列の１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、ＩＴＲは、Samulski et al, 1983に開示される図１の中央パネルに開示されるｐＳＭ６０９右のＩＴＲ配列（９ｂｐを欠く）と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号４４１～４４４のいずれかのＩＴＲ配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列、例えば、右ＩＴＲ（または、３’ＩＴＲ）は、配列番号４４２、または配列番号４４２と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列、例えば、左ＩＴＲ（または、５’ＩＴＲ）は、配列番号４４１、または配列番号４４１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列である。
【0452】
【表7-1】
【表7-2】
（ｉ）ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２
【0453】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、５’ＡＡＶ２－ＩＴＲ（配列番号１６１）、スタッファーＤＮＡ（配列番号１６２）、ＳＰ０４１２ ＬＳＰ（配列番号９１）、Ｇｌｕｃのためのコザック配列（配列番号１５３）、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１８２）、３’ＵＴＲ（配列番号７７）、ポリＡ配列（配列番号１６４）、３’ＡＡＶ－ＩＴＲ配列（配列番号１６５）を含む構築物を含む。例示的な構築物は、配列番号１５４（ＬＶＲ４１２＿ＡｓｋＢｉｏＥＵ）として示される。配列番号１６１および１６５のＩＴＲ配列を、異なるＡＡＶ血清型についての任意のＩＴＲ配列、または配列番号４４１～４４４のいずれかから選択されるＩＴＲと容易に変更することができるだけでなく、配列番号７７および配列番号１６４の代わりに、それぞれ、異なるＵＴＲ配列またはポリＡ配列を使用することができる。
【0454】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、５’ＡＡＶ２－ＩＴＲ（配列番号１６１）、スタッファーＤＮＡ（配列番号１６２）、ＳＰ０４１２ ＬＳＰ（配列番号９１）、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１８２）、３’ＵＴＲ（配列番号７７）、ポリＡ配列（配列番号１６６）、３’ＡＡＶ－ＩＴＲ配列（配列番号１６５）を含む構築物を含む。例示的な構築物は、配列番号１５５（ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ＿Ｂａｃｋｂｏｎｅ＿Ａｓｋ）として示される。配列番号１６１および１６５のＩＴＲ配列を、異なるＡＡＶ血清型についての任意のＩＴＲ配列、または配列番号４４１～４４４のいずれかから選択されるＩＴＲと容易に変更することができるだけでなく、配列番号７７および配列番号１６４の代わりに、それぞれ、異なるＵＴＲ配列またはポリＡ配列を使用することができる。
【0455】
ＡＡＶ２－ＬＶＰ４２２：
【0456】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、５’ＡＡＶ２－ＩＴＲ（配列番号１６１）、スタッファーＤＮＡ、ＳＰ０４２２ ＬＳＰ（配列番号９２）、Ｇｌｕｃのためのコザック配列（配列番号１５３）、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号５５）、コラーゲン安定性配列（配列番号６５）、ポリＡ配列（配列番号１６４）、３’ＡＡＶ－ＩＴＲ配列（配列番号１６５）を含む構築物を含む。例示的な構築物は、配列番号１５６（ＬＶＲ４１２スタッファー）として示される。配列番号１６１および１６５のＩＴＲ配列を、異なるＡＡＶ血清型についての任意のＩＴＲ配列、または配列番号４４１～４４４のいずれかから選択されるＩＴＲと容易に変更することができるだけでなく、配列番号６５および配列番号１６４の代わりに、それぞれ、異なるコラーゲン安定性配列またはポリＡ配列を使用することができる。
【0457】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、そのゲノム中に、５’から３’への方向に、５’ＡＡＶ２－ＩＴＲ（配列番号１６１）、スタッファーＤＮＡ、ＳＰ０４２２ ＬＳＰ（配列番号９２）、Ｇｌｕｃのためのコザック配列（配列番号１５３）、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１８２）、３’ＵＴＲ配列（配列番号７７）、必要に応じてＡＡＴＡＡ停止シグナルを含むポリＡ配列（配列番号１６４）、３’ＡＡＶ－ＩＴＲ配列（配列番号１６５）を含む構築物を含む。例示的な構築物は、配列番号１５７（ＬＶＲ４２２ＡｓｋＢｉｏ ＥＵ構築物）として示される。配列番号１６１および１６５のＩＴＲ配列を、異なるＡＡＶ血清型についての任意のＩＴＲ配列、または配列番号４４１～４４４のいずれかから選択されるＩＴＲと容易に変更することができるだけでなく、配列番号７７および配列番号１６４の代わりに、それぞれ、異なるＵＴＲ配列またはポリＡ配列を使用することができる。
【0458】
配列番号１６０、１５９、１５５、１５８、１５６のｒＡＡＶゲノム中のＩＴＲ配列を、異なるＡＡＶ血清型についての任意のＩＴＲ配列、または配列番号４４１～４４４のＩＴＲと容易に変更することができるだけでなく、本明細書に開示されるように、異なるＵＴＲ配列またはポリＡ配列を使用することができる。
【0459】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１７０（同族ＧＡＡシグナル配列、およびＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するＧＡＡポリペプチド）、または配列番号１７１（同族ＧＡＡシグナル配列、ならびにＨ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、およびＲ２２３Ｈ改変を有するＧＡＡポリペプチド）を含むＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。配列番号１７０のＧＡＡポリペプチドは、配列番号１８２の核酸配列によってコードされる。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする配列番号１８２の核酸を含む。配列番号１７１のＧＡＡポリペプチドは、配列番号１８２の塩基対（ｂｐ）６６７～６６９が、ＣＡＣからＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧのいずれかに変更されているか（ヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）へのアミノ酸変更を生じる）；または配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更される（ヒスチジン（Ｈ）からロイシン（Ｌ）へのアミノ酸変更をもたらす）、配列番号１８２の核酸配列によってコードされる。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６７～６６９が、ＣＡＣからＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧのいずれかに変更されているか；または配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されている、配列番号１８２の核酸を含み、これは、Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１ＬおよびＲ２２３Ｈ改変を含む改変ＧＡＡポリペプチドをコードする。
【0460】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１７２（同族シグナルペプチドが、ＩｇＧシグナル配列およびＨ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変で置き換えられているＧＡＡポリペプチド）もしくは配列番号１７２と少なくとも８５％の配列同一性の配列、または配列番号１７３（同族シグナルペプチドが、ｗｔＩＬ２シグナル配列、ならびにＨ１９９ＲおよびＲ２２３Ｈ改変で置き換えられているＧＡＡポリペプチド）もしくは配列番号１７３と少なくとも８５％の配列同一性の配列、または配列番号１７４（同族シグナルペプチドが、ｍｕｔＩＬ３シグナル配列、ならびにＨ１９９ＲおよびＲ２２３Ｈ改変で置き換えられているＧＡＡポリペプチド）もしくは配列番号１７４と少なくとも８５％の配列同一性の配列のいずれかから選択されるＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列を含む。
【0461】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７７（ＩｇＧシグナル配列）の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７２のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９ＲおよびＲ２２３Ｈ改変を有するＩｇＧリーダー－ＧＡＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されており、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７７（ＩｇＧシグナルペプチド）またはそれと少なくとも８５％の配列同一性の配列の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７２のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、およびＲ２２３Ｈ改変を有するＩｇＧリーダー－ＧＡＡ）をコードする。
【0462】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７９（ｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド）またはそれと少なくとも８５％の配列同一性の配列の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７３のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されており、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１７９（ｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド）またはそれと少なくとも８５％の配列同一性の配列の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７３のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１Ｌ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するｗｔ ＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。
【0463】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１８１（ｍｕｔＩＬ２シグナルペプチド）またはそれと少なくとも８５％の配列同一性の配列の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７４のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｒ２２３Ｈ改変を有するｍｕｔＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号１８２のｂｐ６６８が、ＡからＵに変更されており、配列番号１８２のｂｐ１～８１が、配列番号１８１（ｍｕｔ ＩＬ２シグナルペプチド）またはそれと少なくとも８５％の配列同一性の配列の核酸で置き換えられている、配列番号１８２を含む異種核酸配列を含み、これは、配列番号１７４のＧＡＡポリペプチド（Ｈ１９９Ｒ、Ｈ２０１ＬおよびＲ２２３Ｈ改変を有するｍｕｔ ＩＬ２シグナルペプチド－ＧＡＡ）をコードする。
ＩＩＩ．ベクターおよびビリオン
ＩＩＩ．ベクターおよびビリオン
【0464】
一実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター（ｒＡＡＶビリオンとも称される）は、カプシドタンパク質、およびカプシドタンパク質中にｒＡＡＶゲノムを含む。ポンペ病を処置するために使用されるｒＡＡＶビリオンのｒＡＡＶカプシドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１１月１９日に出願された第６２，９３７，５５６号に開示される表１にリストされたもののいずれか、またはそれらの任意の組合せである。
【0465】
一実施形態では、ポンペ病を処置するために使用されるｒＡＡＶビリオンのｒＡＡＶカプシドは、それらのそれぞれが、それらの全体が本明細書に組み込まれる国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７に開示される表１にリストされるもののいずれかである。一実施形態では、ポンペ病を処置するために使用されるｒＡＡＶビリオンのｒＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ８ベクターである。
【0466】
一実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクター（ｒＡＡＶビリオンとも称される）は、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるもののいずれかからのカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的カプシド、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＸＬ３２およびＸＬ３２．１から選択される肝臓特異的カプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＡＡＶＸＬ３２またはＡＡＶＸＬ３２．１である。
【0467】
本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターにおいてＡＡＶカプシドとして使用され得る例示的なキメラまたはバリアントのカプシドタンパク質は、その参照において本明細書に具体的に組み込まれる２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号からの表２から選択することができ、あるいは野生型カプシドタンパク質、および／または現在公知であるか、もしくは後で特定され、本明細書にそれぞれ組み込まれる、他のキメラもしくはバリアントのカプシドタンパク質との任意の組合せで使用することができる。一部の実施形態では、使用のために包含されるｒＡＡＶベクターは、キメラベクター、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる第９，０１２，２２４号およびＵＳ７，８９２，８０９に開示されるキメラベクターである。
【0468】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、米国出願のＵＳ２０１８／０３７１４９６および第ＰＣＴ／ＵＳ１８／２２７２５号に開示されるハプロイドｒＡＡＶベクター、または、例えば、２０１８年７月３１日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４４６３２号および米国出願第１６／１５１，１１０号に開示されるポリプロイドｒＡＡＶベクターであり、それらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる第９，０１２，２２４号およびＷＯ２０１７／１０６２３６に開示されるｒＡＡＶ３ベクターである。
【0469】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／２４１３２４に開示されるＡＡＶＸＬ３２またはＡＡＶＸＬ３２．１ ＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１または国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３６６７６号に開示されるカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８ベクター、またはＡＡＶ８カプシドタンパク質を含む合理的ハプロイドである。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来、例えば、それらのそれぞれが、それらの全体が本明細書に組み込まれる国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７に開示される表１に開示される任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである。
【0470】
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号１～３のいずれか１つのヌクレオチド配列または（ｂ）ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号４～６のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である核酸ＡＡＶカプシドコード配列によってコードされるカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、本発明のＡＡＶベクターゲノムおよびＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子と一緒に、ＷＯ２０１９２４１３２４Ａ１に開示される配列番号４～６のいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0471】
一実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、野生型カプシドタンパク質および／あるいは現在公知であるか、もしくは後で特定される他のキメラまたはバリアントのカプシドタンパク質との任意の組合せで本発明のＡＡＶカプシドに組み込まれ得るキメラまたはバリアントのカプシドタンパク質を記載している、ＵＳＰＴＯによって発行された特許および公開出願の包袋にリストされた以下の生物学的配列ファイルのいずれかに関連するカプシドタンパク質を含む（指示目的のために、１１４８６２５４は米国特許出願第１１／４８６，２５４号に対応し、他の生物学的配列ファイルも同様の方法で読み取られるべきである）：１１４８６２５４、１１９３２０１７、１２１７２１２１、１２３０２２０６、１２３０８９５９、１２６７９１４４、１３０３６３４３、１３１２１５３２、１３１７２９１５、１３５８３９２０、１３６６８１２０、１３６７３３５１、１３６７９６８４、１４００６９５４、１４１４９９５３、１４１９２１０１、１４１９４５３８、１４２２５８２１、１４４６８１０８、１４５１６５４４、１４６０３４６９、１４６８０８３６、１４６９５６４４、１４８７８７０３、１４９５６９３４、１５１９１３５７、１５２８４１６４、１５３６８５７０、１５３７１１８８、１５４９３７４４、１５５０３１２０、１５６６０９０６、および１５６７５６７７。
【0472】
実施形態では、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、それらが、例えば、参照により組み込まれる国際特許公開のＷＯ００／２８００４に記載される、別のウイルス、必要に応じて、別のパルボウイルスまたはＡＡＶに由来するカプシドサブユニットのすべてまたは一部分を含み得るという点で、キメラであり得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、本明細書に組み込まれる米国特許第８，７８４，７９９号に記載される一本鎖または単量体二重鎖である。
【0473】
さらなる実施形態として、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、それらが、参照により組み込まれる米国出願のＵＳ２０１８／０３７１４９６に記載される単一ＡＡＶカプシド中にＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３ ＡＡＶ血清型の異なる組合せを含み得るという点で、ポリプロイド（ハプロイドとも称される）であり得る。
【0474】
実施形態では、本明細書に開示されるポンペ病の処置において有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂカプシドである。使用のために包含されるＡＡＶ３ｂカプシドは、第２０１７／１０６２３６号、および第９，０１２，２２４号、および第７，８９２，８０９号、ならびに２０１９年１１月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６１６５３号、ならびに国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７に記載されており、それらのそれぞれは、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0475】
一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂカプシドは配列番号４４を含む。実施形態では、ポンペ病の処置において使用されるＡＡＶカプシドは、配列番号４４に記述されるＡＡＶカプシドの全部または一部に由来する改変ＡＡＶカプシドであり得る。一部の実施形態では、配列番号４４に記述されるＡＡＶ３ｂカプシド由来のアミノ酸は、異なるＡＡＶ血清型の別のカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
【0476】
別の実施形態では、ポンペ病の処置において使用されるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシドである。この特定の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシドのアミノ酸Ｇ２６５のＤ２６５との置き換えを介した、ＡＡＶ３ｂカプシドの２フォールド軸ループのアミノ酸配列における改変を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシドは配列番号４６を含む。しかしながら、本発明の改変ウイルスカプシドは、配列番号４６に記述されるＡＡＶカプシドに限定されない。一部の実施形態では、配列番号４６に記述されるＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ由来のアミノ酸は、異なる血清型のＡＡＶからのカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
【0477】
別の実施形態では、本明細書に開示されるポンペ病の処置において有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシドである。この特定の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシドのアミノ酸Ｇ２６５のＤ２６５との置き換え、およびＡＡＶ３ｂカプシドのアミノ酸Ｔ５４９のＡ５４９との置き換えを介した、ＡＡＶ３ｂカプシドの２フォールド軸ループのアミノ酸配列における改変を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシドは配列番号５０を含む。しかしながら、本発明の改変ウイルスカプシドは、配列番号５０に記述されるＡＡＶカプシドに限定されない。一部の実施形態では、配列番号５０に記述されるＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａ由来のアミノ酸は、異なる血清型のＡＡＶからのカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧ（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）に由来するアミノ酸は、異なる血清型のＡＡＶからのカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
【0478】
別の実施形態では、本明細書に開示されるポンペ病の処置において有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシドである。この特定の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシドのアミノ酸Ｔ５４９のＡ５４９との置き換えを介した、ＡＡＶ３ｂカプシドの２フォールド軸ループのアミノ酸配列における改変を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシドは配列番号５２を含む。しかしながら、本発明の改変ウイルスカプシドは、配列番号５２に記述されるＡＡＶカプシドに限定されない。一部の実施形態では、配列番号５２に記述されるＡＡＶ３ｂ５４９Ａ由来のアミノ酸は、異なる血清型のＡＡＶからのカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
【0479】
別の実施形態では、本明細書に開示されるポンペ病の処置において有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシドである。この特定の実施形態では、ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシドのアミノ酸Ｑ２６３のＹ２６３との置き換えを介した、ＡＡＶ３ｂカプシドの２フォールド軸ループのアミノ酸配列における改変を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシドは配列番号５４を含む。しかしながら、本発明の改変ウイルスカプシドは、配列番号５４に記述されるＡＡＶカプシドに限定されない。一部の実施形態では、配列番号５４に記述されるＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙ由来のアミノ酸は、異なる血清型のＡＡＶからのカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
【0480】
別の実施形態では、本明細書に開示されるポンペ病の処置において有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧ血清型であるか、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシドを含む。この特定の実施形態では、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシドは、ＳＡＳＴＧ変異を含むようなアミノ酸配列における改変を含み、特に、ＡＡＶ３ｂカプシドは、ＡＡＶ２ Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５サブバリアントに似るように、ＡＡＶ３ｂカプシド中の類似する位置においてこれらの改変を導入することによって、改変された（参照によりそれらの全体が本明細書に両方とも組み込まれる、Messina EL, et al., Adeno-associated viral vectors based on serotype 3b use components of the fibroblast growth factor receptor signaling complex for efficient transduction. Hum. Gene Ther. 2012 Oct: 23(10):1031-4、Piacentino III, Valentino, et al. "X-linked inhibitor of apoptosis protein-mediated attenuation of apoptosis, using a novel cardiac-enhanced adeno-associated viral vector." Human gene therapy 23.6 (2012): 635-646に開示される通り）。したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示されるポンペ病の処置において有用なｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧ血清型であるか、またはＡＡＶ３ｂ Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５カプシドを含むＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシドを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧ由来のアミノ酸は、異なる血清型のＡＡＶからのカプシド由来のアミノ酸であり得るか、またはそれと置換されており、置換されたアミノ酸および／または挿入されたアミノ酸は、任意のＡＡＶ血清型由来であり得、天然に存在するか、または部分的もしくは完全に合成のアミノ酸のいずれかを含み得る。
【0481】
細胞へのそれらの導入を容易にするために、本発明において有用なｒＡＡＶベクターゲノムは、（１）発現される異種配列（一実施形態では、ＧＡＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）、ならびに（２）異種遺伝子の組み込みおよび発現を容易にするウイルス配列エレメントを含む組換え核酸構築物である。ウイルス配列エレメントは、ＤＮＡの複製およびＡＡＶカプシドへのパッケージングのための、シスで必要なＡＡＶベクターゲノムの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含んでいてもよい。実施形態では、異種遺伝子は、ポンペ病を患っている患者におけるＧＡＡ欠損を直すために有用であるＧＡＡをコードする。実施形態では、そのようなｒＡＡＶベクターゲノムはまた、マーカーまたはレポーター遺伝子を含有していてもよい。実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、その全部または一部が置き換えられたか、または欠失した、ＡＡＶ３ｂ野生型（ＷＴ）シス遺伝子の１つまたは複数を有し得るが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持し得る。
【0482】
一実施形態では、ポンペ病の処置において有用な本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂカプシドによって被包された本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムを含む。一部の実施形態では、ポンペ病の処置において有用な本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧ（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５）カプシドから選択される任意のＡＡＶ３ｂカプシドによって被包された本明細書に開示されるｒＡＡＶゲノムを含む。
【0483】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＥＵ（配列番号１５４）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５５）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５６）、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４２２＿ＥＵ（配列番号１５７）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４２２＿Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５８）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＷＴ－ｈＧＡＡ ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５９）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＳＰ＿ＷＴ－ｈＧＡＡ－ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１６０）、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかの核酸配列を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、配列番号１５４～１６０のいずれかの核酸配列を含むｒＡＡＶベクターは、本明細書に開示される改変ＧＡＡ核酸配列によって置き換えられたｗｔＧＡＡ配列を有することができる。
【0484】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかの核酸配列を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＴ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号７９）；ＦＩＢｒａｔ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８０）；ＦＩＢｈｕｍ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８１）；ＡＡＴ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８２）；ＦＩＢｒａｔ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８３）；ＦＩＢｈｕｍ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２（配列番号８４）、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかの核酸配列を含む。
【0485】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＥＵ（配列番号１５４）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５５）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５６）、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４２２＿ＥＵ（配列番号１５７）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４２２＿Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５８）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＷＴ－ｈＧＡＡ ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５９）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＳＰ＿ＷＴ－ｈＧＡＡ－ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１６０）、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかの核酸配列を含む。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、配列番号１５４～１６０のいずれかの核酸配列を含むｒＡＡＶベクターは、本明細書に開示される改変ＧＡＡ核酸配列によって置き換えられたｗｔＧＡＡ配列を有することができる。
ＩＶ．最適化されたｒＡＡＶベクターゲノム
ＩＶ．最適化されたｒＡＡＶベクターゲノム
【0486】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、最適化されたｒＡＡＶベクターゲノムは、本明細書に開示されるエレメントのいずれかから、プロモーターをコードする核酸配列、ＩＴＲ、ポリＡテイル、異種遺伝子の発現を増加または減少させることができるエレメント、および一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＡＡタンパク質の発現のためにコドン最適化された核酸配列（すなわち、ｃｏＧＡＡまたはコドン最適化ＧＡＡ）、および必要に応じて、免疫原性を低減する１つまたは複数のエレメントを含む任意の組合せで、作出される。そのような最適化されたｒＡＡＶベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターゲノムが形質導入および発現される組織および細胞に対する向性を有する任意のＡＡＶカプシドとともに使用することができる。
【0487】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、本明細書に開示される肝臓特異的プロモーターの上流に通常位置するＡＡＶ Ｐ５プロモーターを欠く。通常は、Ｐ５プロモーターは、ＡＡＶ複製の間に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐタンパク質の発現を制御する。一部の実施形態では、このＰ５プロモーター断片は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター中に存在し、これは、予測される転写因子結合部位、例えば、環状ＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質３（ＣＲＥＢ３）を含有し、小胞体（ＥＲ）／ゴルジストレス（Sampieri 2019）、活性化転写因子２（ＡＴＦ２）によって活性化され得、ストレス応答にも関与し（Watson 2017）、核内受容体サブファミリー１グループＩメンバー２（ＮＲ１Ｉ２）（プレグナンＸ受容体［ＰＸＲ］としても公知）は、肝臓において富化されることが公知であり、プレグナンステロイド、リファンピン、およびデキサメタゾン（ＮＲ１Ｉ２＿ＨＧＮＣ）を含む他の分子によって活性化される（Xing 2020）。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ Ｐ５プロモーターの断片は、ＧＡＡカセットの意図される性能に影響を与えることなく、除去される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ポリＡシグナルおよび３’ＩＴＲの間に位置するＲＮＡポリメラーゼＩＩ終止配列も含む。例示的な末端配列は、２つの終止コドンを導入し、１つの制限部位（例えば、ＸｈｏＩ）をＴＡＧに置き換える配列番号４３９であり、ｈＧＡＡの最後のコードアミノ酸の直ぐ下流に位置し、３’ＵＴＲの直ぐ上流に位置する。
ＡＡＶ３ｂカプシド改変
ＡＡＶ３ｂカプシド改変
【0488】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターにおける使用のためのＡＡＶ３ｂカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、またはそれらの両方が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるNienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42およびPiacentino III, Valentino, et al. "X-linked inhibitor of apoptosis protein-mediated attenuation of apoptosis, using a novel cardiac-enhanced adeno-associated viral vector." Human gene therapy 23.6 (2012): 635-646に開示されるＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）のいずれかと、例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９７％、約８０％～約９７％、約８５％～約９７％、約９０％～約９７％、または約９５％～約９７％の範囲のアミノ酸同一性を有する。この実施形態のまた他の態様では、ＡＡＶ３ｂに由来するＡＡＶは、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42およびPiacentino III, Valentino, et al. "X-linked inhibitor of apoptosis protein-mediated attenuation of apoptosis, using a novel cardiac-enhanced adeno-associated viral vector." Human gene therapy 23.6 (2012): 635-646に開示されるＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）についてのアミノ酸配列のいずれかと、例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９７％、約８０％～約９７％、約８５％～約９７％、約９０％～約９７％、または約９５％～約９７％の範囲のアミノ酸同一性を有するが、カプシドは、依然として機能的に活性なＡＡＶタンパク質である。
【0489】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ３ｂ）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMessina EL, et al., Adeno-associated viral vectors based on serotype 3b use components of the fibroblast growth factor receptor signaling complex for efficient transduction. Hum. Gene Ther. 2012 Oct: 23(10):1031-42に記載されるＳＡＳＴＧ変異を含む。
【0490】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターにおける使用のためのＡＡＶ３ｂカプシドは、例えば、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、もしくはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）（Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42に開示される通り）についてのアミノ酸配列のいずれかと比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０個の連続するアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換；またはＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）（Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42に開示される通り）についてのアミノ酸配列のいずれかと比べて、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０個の連続するアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する。また別の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターにおける使用のためのＡＡＶ３ｂカプシドは、例えば、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、もしくはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）（Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42に開示される通り）についてのアミノ酸配列のいずれかと比べて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０個の連続するアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換；またはＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、もしくはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）（Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42に開示される通り）についてのアミノ酸配列のいずれかと比べて、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０個の連続するアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有するが、依然として機能的に活性なＡＡＶである。
【0491】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターにおける使用のためのＡＡＶ３ｂカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）（Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42に開示される通り）についてのアミノ酸配列のいずれかと、例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９７％、約８０％～約９７％、約８５％～約９７％、約９０％～約９７％、または約９５％～約９７％の範囲のアミノ酸同一性を有する。またさらなる実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターにおける使用のためのＡＡＶ３ｂカプシドは、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）（Nienaber et al., Hum. Gen Ther, 2012, 23(10); 1031-42に開示される通り）についてのアミノ酸配列のいずれかと、例えば、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、約９５％～約９９％、約７５％～約９７％、約８０％～約９７％、約８５％～約９７％、約９０％～約９７％、または約９５％～約９７％の範囲のアミノ酸同一性を有するが、依然として機能的に活性なＡＡＶである。
Ｖ．処置の方法
Ａ．ポンペ病
Ｖ．処置の方法
Ａ．ポンペ病
【0492】
本明細書に開示されるＧＡＡタンパク質を発現する組換えＡＡＶは、ポンペ病および他のグリコーゲン貯蔵障害（ＧＳＤ）を処置するための方法において使用することができる。ポンペ病は、エネルギーのために使用される糖の貯蔵形態であるグリコーゲンを分解するために必要な酵素の酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によって引き起こされるまれな遺伝性障害である。ポンペ病は、グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型、ＧＳＤ ＩＩ、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵障害、糖原病ＩＩ型、酸性マルターゼ欠損症、アルファ－１，４－グルコシダーゼ欠損症、びまん性糖原性心臓肥大、および全身性糖原病の心臓型としても公知である。グリコーゲンの集積は、身体全体にわたる進行性の筋力低下（ミオパチー）を引き起こし、さまざまな身体組織、特に、心臓、骨格筋、肝臓、呼吸器、および神経系に影響を与える。
【0493】
ポンペ病の主な臨床症状は、疾患開始の年齢および残ったＧＡＡ活性に応じて広く変わり得る。残ったＧＡＡ活性は、グリコーゲン蓄積の量および組織分布の両方だけでなく、疾患の重症度とも相関する。小児期に開始するポンペ病（正常なＧＡＡ活性の１％未満）は、最も重度の形態であり、筋緊張低下、全身性の筋力低下、および肥大型心筋症、ならびに心臓および他の筋肉組織における大量のグリコーゲン蓄積によって特徴付けられる。通常、心肺機能不全に起因して、生後１年以内に死亡が起こる。若年期に開始する（正常なＧＡＡ活性の１～１０％）および成人で開始する（正常なＧＡＡ活性の１０～４０％）ポンペ病は、開始の年齢、臨床所見、および疾患進行におけるより大きな変動を伴って、臨床的により不均一である。若年期および成人で開始するポンペ病は、一般に、重度の心臓関与の欠如、より遅い開始の年齢、およびより遅い疾患進行によって特徴付けられるが、最終的な呼吸器または手足の筋肉の関与は、著しい病的状態および死亡率をもたらす。平均余命は変動し得るが、一般に、呼吸不全に起因して死亡が起こる。
【0494】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、ポンペ病を処置するために好適なＧＡＡ酵素としては、野生型ヒトＧＡＡ、または直鎖状のオリゴ糖のα１－４結合を切断する能力を保持するその断片もしくは配列バリアントが挙げられる。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、野生型ＧＡＡ核酸配列、例えば、配列番号１１または配列番号７２によってコードされる。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、例えば、（１）ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現、（２）ＣｐＧアイランドを低減させるように、または（３）自然免疫応答を低減させるようにのいずれか１つまたは複数のためにコドン最適化されたＧＡＡ核酸配列によってコードされる。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＧＡＡタンパク質は、コドン最適化ＧＡＡ核配列、例えば、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６、もしくは配列番号１８２、または配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、もしくは配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列のいずれかから選択される任意の核酸配列によってコードされる。
【0495】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、対象の肝臓を形質導入し、ｈＧＡＡポリペプチドが、融合したＩＧＦ２配列の支援により、細胞に取り込まれ、リソソームへ輸送される、患者の組織を灌流する血液にｈＧＡＡポリペプチドを分泌し、そこで、酵素が、酵素欠損に起因するリソソームに蓄積した材料を排除するために作用する。リソソーム酵素補充療法が有効であるためには、治療用酵素は、蓄積の欠乏が現れている組織における適切な細胞中のリソソームに送達されなければならない。
Ｂ．ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞におけるＧＡＡレベルのモジュレート
Ｂ．ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞におけるＧＡＡレベルのモジュレート
【0496】
本明細書に記載される核酸、ベクター、およびビリオンは、細胞においてＧＡＡのレベルをモジュレートするために使用することができる。方法は、２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入されたＧＡＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む組成物を細胞に投与するステップを含む。細胞は、本発明の核酸が投与され得る任意の動物由来であり得る。ＧＡＡ欠損症を有する対象由来の哺乳動物細胞（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギなど）は、本発明における使用のための典型的な標的細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝臓細胞、または心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ）、例えば、心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）である。
【0497】
実施形態では、ｒＡＡＶベクターで形質導入された細胞のｅｘ ｖｉｖｏ送達が、本明細書に開示される。さらなる実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子送達は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターで形質導入された細胞を、宿主に戻して移植するために使用され得る。さらなる実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏ幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）療法は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターで形質導入された細胞を、宿主に戻して移植するために使用され得る。別の実施形態では、好適なｅｘ ｖｉｖｏのプロトコールは、いくつかのステップを含み得る。
【0498】
一部の実施形態では、標的組織（例えば、筋肉、肝臓組織）のセグメントは、対象から回収され得、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを使用して、ＧＡＡをコードする核酸を宿主の細胞に形質導入し得る。次いで、これらの遺伝子改変された細胞は、宿主に戻して移植され得る。静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、または標的組織へのその位置での注射を含むいくつかのアプローチが、宿主への細胞の再導入のために使用され得る。本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターで形質導入または感染された改変ｅｘ ｖｉｖｏ細胞のマイクロカプセル化は、本発明内で使用され得る別の技法である。自己および同種の細胞移植が、本発明に従って使用され得る。
【0499】
また別の実施形態では、対象におけるＧＡＡの欠損を処置する方法であって、薬学的に許容される担体中で、治療有効量で本明細書に開示されるＧＡＡを発現する細胞を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、対象はヒトである。
Ｃ．対象におけるＧＡＡ活性の増加
Ｃ．対象におけるＧＡＡ活性の増加
【0500】
本明細書に記載される核酸、ベクター、およびビリオンは、対象、例えば、ヒト対象、またはポンペ病を有する対象もしくはポンペ病を有する危険性がある対象において、機能的ＧＡＡポリペプチドのレベルをモジュレートするために使用することができる。方法は、２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に挿入されたＧＡＡをコードする異種核酸を含む本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶベクターを含む組成物を対象に投与するステップを含み、ｈＧＡＡは、本明細書に記載されるシグナルペプチド、および必要に応じて、本明細書に開示されるＩＧＦ２標的化ペプチドに連結されている。対象は、任意の動物であり得、例えば、哺乳動物（例えば、人間、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギなど）は、好適な対象である。本発明の方法および組成物は、特に、ＧＡＡ欠損ヒト対象に適用可能である。
【0501】
さらにまた、本明細書に記載される核酸、ベクター、およびビリオンは、任意の好適な方法によって、任意の好適な製剤で、人間を含む動物に投与され得る。例えば、本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、例えば、所望の投与の経路および標的にされる組織に応じて、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えばエアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、経膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または、卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、大脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および気道表面を含む粘膜表面の両方に、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに組織もしくは臓器への直接注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、または脳に）、または他の非経口経路による投与を通して、動物に直接導入することができる
【0502】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターの制御下またはそれに動作可能に連結されたＧＡＡをコードする核酸配列を含むので、本明細書に開示される方法および組成物は、静脈内または筋肉内注射を介して投与することができ、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムは、肝臓に移動し、ＧＡＡタンパク質を発現する。
【0503】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、筋肉への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によってであり得る。投与の例示的な機序としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えばエアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、経膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または、卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、大脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および気道表面を含む粘膜表面の両方に、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに組織または臓器への直接注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、または脳に）が挙げられる。任意の所与の場合における最も好適な経路は、処置および／または予防される状態の性質および重症度に、ならびに使用される特定のベクターの性質に依存するであろう。
【0504】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、本発明による骨格筋への投与は、限定されるものではないが、手足（例えば、上腕、前腕、大腿、および／または下腿）、背部、頸部、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、ならびに／または指の骨格筋への投与を含む。注射され得る好適な骨格筋は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号に開示されている。
【0505】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、対象の骨格筋、肝臓、横隔膜、肋骨、および／または心筋肉細胞に投与される。例えば、従来の注射器および針を、ｒＡＡＶビリオン懸濁液を動物に注射するために使用することができる。注射によるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムの非経口投与は、例えば、ボーラス注射または連続注入によって行うことができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプル、または保存剤が添加された複数回用量の容器に提示され得る。組成物は、油性または水性の媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態をとってもよく、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤などの薬学的製剤のための薬剤を含有していてもよい。あるいは、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、使用前の好適な媒体、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水による構成のための粉末形態であり得る（例えば、凍結乾燥され得る）。
【0506】
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回など、またはそれよりも多くの投与）を、さまざまな間隔、例えば、時間単位、日単位、週単位、月単位、年単位などの期間にわたって、遺伝子発現の所望のレベルを達成するために用いてもよい。投薬は、単一投薬量、または累積的（連続投薬）であり得、当業者によって容易に決定することができる。例えば、疾患または障害の処置は、有効用量の本明細書に開示される医薬組成物ウイルスベクターの１回投与を含み得る。あるいは、疾患または障害の処置は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、数日ごとに１回、または週に１回などのある範囲の期間にわたって行われる、有効用量のウイルスベクターの複数回投与を含み得る。
【0507】
投与のタイミングは、個体の症状の重症度などの因子に応じて、個体ごとに変わり得る。例えば、有効用量の本明細書に開示されるウイルスベクターは、無期限で、または個体がもはや治療を必要としなくなるまで、６か月ごとに１回、個体に投与することができる。当業者は、個体の状態を、処置の経過の間中、モニタリングすることができること、および投与される本明細書に開示されるウイルスベクターの有効量をそれに従って調整することができることを認識するであろう。
【0508】
注射物質は、液状の溶液もしくは懸濁液、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液のために好適な固体の形態、またはエマルジョンとしてのいずれかの従来の形態で調製され得る。あるいは、全身よりもむしろ局所的な方法、例えば、デポーまたは持続放出製剤で、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを投与してもよい。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に植込み可能なマトリックスに付着させて、送達することができる（例えば、米国特許公開第ＵＳ－２００４－００１３６４５－Ａｌ号に記載される通り）。本明細書に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、任意の好適な手段によって、必要に応じて、対象が吸入するウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドから構成される吸入可能粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与することができる。吸入可能粒子は、液体または固体であり得る。当業者に公知であるように、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、圧力で駆動するエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器などの任意の好適な手段によって生成され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において公知の技法によって、任意の固体粒子医薬エアロゾル発生器で同様に生成され得る。
【0509】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを溶解させるために十分な量の溶媒、エマルジョン、または他の希釈剤中で製剤化することができる。この実施形態の他の態様では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、本明細書において、例えば、約９０％（ｖ／ｖ）未満、約８０％（ｖ／ｖ）未満、約７０％（ｖ／ｖ）未満、約６５％（ｖ／ｖ）未満、約６０％（ｖ／ｖ）未満、約５５％（ｖ／ｖ）未満、約５０％（ｖ／ｖ）未満、約４５％（ｖ／ｖ）未満、約４０％（ｖ／ｖ）未満、約３５％（ｖ／ｖ）未満、約３０％（ｖ／ｖ）未満、約２５％（ｖ／ｖ）未満、約２０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、または約１％（ｖ／ｖ）未満の量の溶媒、エマルジョン、または希釈剤中で製剤化され得る。他の態様では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～９０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～７０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～６０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～４０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）～１５％（ｖ／ｖ）、または約８％（ｖ／ｖ）～１２％（ｖ／ｖ）の範囲の量の溶媒、エマルジョン、または他の希釈剤を含み得る。
【0510】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、任意の血清型の、例えば、限定されるものではないが、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧカプシド（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）から選択される任意のＡＡＶ３ｂカプシドによって被包された、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、治療有効量の治療用化合物を含むことができる。実施形態では、本明細書で使用される場合、限定されないが、「有効量」という用語は、「治療有効量」、「有効用量」、または「治療有効用量」と同義である。実施形態では、ポンペ病を処置するための本明細書に開示される治療用化合物の有効性は、限定されないが、ポンペ病に関連する１つまたは複数の臨床症状および／または生理学的指標に基づいて、個体における改善を観察することによって決定することができる。実施形態では、ポンペ病に関連する症状の改善は、同時的治療の必要性の低減によって示され得る。
【0511】
本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムの送達を容易にするために、それを担体または賦形剤と混合することができる。使用され得る担体および賦形剤としては、生理食塩水（特に、滅菌されたパイロジェンフリーの生理食塩水）、塩類緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。ＵＳＰグレードの担体および賦形剤は、ヒト対象へのビリオンの送達のために特に有用である。
【0512】
以前に記載された製剤に加えて、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、デポー調製物として製剤化することもできる。そのような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）によって、またはＩＭ注射によって投与され得る。そのため、例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂で、あるいは難溶性誘導体として、製剤化され得る。
【0513】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、方法は、対象におけるＧＡＡの欠損に起因するポンペ病を処置することを対象とし、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、ポンペ病を患っている患者に投与され、投与後、ＧＡＡが肝臓における細胞から分泌され、骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せにおいて、分泌されたＧＡＡの細胞による取り込みがあり、分泌されたＧＡＡの取り込みは、組織におけるリソソームグリコーゲン貯蔵の低減をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、カプシドに被包されており、例えば、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）から選択される任意のＡＡＶ３ｂカプシドによって被包されている。
【0514】
特定の実施形態では、１用量あたり少なくとも約１０２～約１０８個の細胞または少なくとも約１０３～約１０６個の細胞が、薬学的に許容される担体中で投与される。さらなる実施形態では、対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはカプシドの投薬量は、投与の機序、処置および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、送達される核酸などに依存し、日常的な方法で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入単位、必要に応じて、約１０８～１０１３形質導入単位の力価である。
【0515】
別の態様では、ＧＡＡをコードする核酸を細胞に投与する方法であって、核酸が細胞に導入され、ＧＡＡを産生するよう発現される条件下で、細胞を本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムと接触させるステップを含む、方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞である。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、ＧＡＡをコードする核酸を細胞に投与する方法は、細胞培養培地に分泌されたＧＡＡを収集するステップをさらに含む。
Ｄ．哺乳動物における運動ニューロン機能の増加
Ｄ．哺乳動物における運動ニューロン機能の増加
【0516】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、ポンペ病および／または不十分なＧＡＡレベルを有する哺乳動物において横隔神経活性を増加させるための組成物および方法において有用である。例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムは、例えば、カプシドに被包された、例えば、ＡＡＶ３ｂカプシド（配列番号４４）；ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄカプシド（配列番号４６）、ＡＡＶ３ｂ ＳＴ（Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ）カプシド（配列番号４８）、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａカプシド（配列番号５０）；ＡＡＶ３ｂ５４９Ａカプシド（配列番号５２）；ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙカプシド（配列番号５４）から選択される任意のＡＡＶ３ｂカプシドによって被包されたｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムを、中枢神経系（例えば、ニューロン）に投与することができる。別の実施形態では、ＧＡＡをコードする本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶゲノムの横隔膜（または他の筋肉）から横隔神経または他の運動ニューロンへの逆行輸送は、ポンペ病の生化学的および生理学的な是正をもたらすことができる。これらの同じ原理を、他の神経変性疾患に適用することができる。
【0517】
実施形態では、表１に記載される任意の血清型、例えば、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ３、またはＡＡＶ３ｂ（限定されるものではないが、ＡＡＶ３ｂ血清型のＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａ、ＡＡＶ３ｂ５４９Ａ、ＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙ、ＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧ（すなわち、Ｑ２６３Ａ／Ｔ２６５変異を含むＡＡＶ３ｂカプシド）血清型を含む）のｒＡＡＶ ＧＡＡ構築物は、（ｉ）脚、躯幹、および／または腕を含む、患者の下肢における衰弱の感覚、（ｉｉ）息切れ、つらいエクササイズ、肺感染症、脊椎における大きな湾曲、睡眠中の呼吸困難、肝肥大、舌肥大、および／または関節のこわばり、（ｉｉｉ）ポンペ病を患っている患者における、症状のいずれか１つまたは複数を、同じ処置を受けていない患者と比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減することができる。この実施形態の他の態様では、任意の血清型のＡＡＶ ＧＡＡは、（ｉ）脚、躯幹、および／または腕を含む、患者の下肢における衰弱の感覚、（ｉｉ）息切れ、つらいエクササイズ、肺感染症、脊椎における大きな湾曲、睡眠中の呼吸困難、肝肥大、舌肥大、および／または関節のこわばり、（ｉｉｉ）ポンペ病を患っている患者における、症状のいずれか１つまたは複数を、同じ処置を受けていない患者と比較して、例えば、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％低減することができる。
【0518】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、ポンペ病に関連する少なくとも１つの症状、またはポンペ病に関連する少なくとも１つの有害な副作用を、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減し、ポンペ病に関連する少なくとも１つの症状、または少なくとも１つの有害な副作用の重症度を、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。別の実施形態では、ポンペ病に関連する少なくとも１つの症状、またはポンペ病に関連する少なくとも１つの有害な副作用を、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、または約５０％～約７０％低減する。
Ｅ．免疫抑制
Ｅ．免疫抑制
【0519】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムを投与される対象は、免疫抑制剤も投与される。ＡＡＶを投与される患者の免疫応答の免疫抑制をもたらすためのさまざまな方法が、公知である。当技術分野において公知の方法は、プロテアソーム阻害剤などの免疫抑制剤を患者に投与するステップを含む。例えば、それらの両方が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１６９，４９２号および米国特許出願第１５／７９６，１３７号に開示される当技術分野において公知の１つのそのようなプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。別の実施形態では、免疫抑制剤は、ポリクローナル、モノクローナル、ｓｃｆｖ、または、例えば、抗体産生細胞の排除もしくは抑制を通して、免疫応答を抑制することができる他の抗体由来分子を含む抗体であり得る。さらなる実施形態では、免疫抑制エレメントは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。そのような実施形態では、ｓｈＲＮＡのコード領域を、ｒＡＡＶカセットに含め、一般に、ポリＡテイルの下流の３’に位置させる。ｓｈＲＮＡは、サイトカイン、成長因子（トランスフォーミング成長因子β１およびβ２、ＴＮＦ、ならびに公に公知の他のものを含む）などの免疫刺激剤の発現を低減または排除するために標的にされ得る。
ＶＩ．他のリソソーム酵素によるＧＡＡの置き換え
ＶＩ．他のリソソーム酵素によるＧＡＡの置き換え
【0520】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物のいずれかでは、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列を、リソソーム酵素の核酸配列と置換することができる。本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムによる発現に好適なリソソーム酵素は、哺乳動物のリソソーム中で蓄積した物質を低減することができるか、または１つもしくは複数のリソソーム蓄積症の症状をレスキューもしくは回復させることができる任意の酵素を含む。好適なリソソーム酵素は、野生型または改変リソソーム酵素の両方を含み、組換え方法もしくは合成方法を使用して生成することができ、または天然源から精製することができる。例示的なリソソーム酵素を表５Ａまたは表６Ａにリストする。
【0521】
【表5A-1】
【表5A-2】
【0522】
本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、１つの特に好ましいリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼであり、これは、現在、Ｇｅｎｚｙｍｅによって組換え的に産生および製造され、ゴーシェ病のための酵素補充療法において使用されている。現在、組換え酵素は、マクロファージ系列の細胞に特異的なタンパク質を標的化する露出したマンノース残基を用いて調製される。１型ゴーシェ患者における主な病理は、グルコセレブロシドを蓄積するマクロファージに起因するが、他の細胞型にグルコセレブロシダーゼを送達することに治療上の利点が存在し得る。本発明を使用してグルコセレブロシダーゼをリソソームに標的化することで、薬剤を複数の細胞型に標的化し、他の調製物と比較して治療上の利点を有し得る。本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に開示される方法において処置されるリソソーム病は、ポンペではない。本明細書に開示される組成物および方法の一部の実施形態では、標的化ベクターまたはｒＡＡＶベクターにおいて核酸によってコードされるリソソーム酵素は、ＧＡＡではない。
【0523】
本発明の方法および組成物は、任意の治療剤を産生するため、およびそれを細胞内コンパートメントに送達するために有用であるが、本発明は、代謝性疾患を処置するための遺伝子産物を送達するために特に有用である。
【0524】
一部の実施形態では、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置するためのリソソーム酵素は、表５Ａに示される。一部の実施形態では、リソソーム酵素は、ゴルジまたはＥＲの欠乏に関連し、これは、表６Ａに示される。好ましい実施形態では、本明細書に記載されるリソソーム酵素をコードするウイルスベクターは、同じリソソーム酵素遺伝子の欠乏を患っている患者に送達される。代替の実施形態では、リソソーム酵素遺伝子の機能的配列または種バリアントが使用される。さらなる実施形態では、リソソーム酵素遺伝子の欠乏をレスキューすることができる異なる酵素をコードする遺伝子は、本発明の方法に従う。
【0525】
【表6A】
【0526】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、標的化ベクターまたはｒＡＡＶは、表５Ｂまたは表６Ｂにおける配列のいずれかのタンパク質を発現する。
【0527】
【表5B-1】
【表5B-2】
【表5B-3】
【表5B-4】
【0528】
【表6B】
【0529】
一部の実施形態では、本明細書に記載される技術は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムを、リソソーム病またはリソソーム障害を有する対象に、例えば、ポンペ病を有する対象に投与するための方法および組成物に関する。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶベクターの均一な集団を含む組成物を投与するステップを含み、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３もしくはＡＡＶ８ベクター、または本明細書に開示されるＡＡＶ３もしくはＡＡＶ８由来の少なくとも１つのカプシドタンパク質を含むハプロイドｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、対象は、本明細書に開示される異なるｒＡＡＶベクターのカクテル、例えば、肝臓細胞を標的化または形質導入するｒＡＡＶベクター、および筋肉細胞を標的化または形質導入するｒＡＡＶベクターを含む組成物を投与される。例示的な実施形態では、対象は、本明細書に開示される２つまたはそれよりも多くの異なるｒＡＡＶベクターのカクテルを含む組成物、例えば、本明細書に開示されるＡＡＶ３ベクターおよびＡＡＶ８ベクターを含む組成物を投与され、それぞれのＡＡＶベクターは、本明細書に開示されるＬＳＰに動作可能に連結されたＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0530】
一部の実施形態では、対象は、例えば、同じ時、またはその後に、本明細書に開示される２つまたはそれよりも多くの異なるｒＡＡＶベクターを同時投与される。例示的な目的だけのために、対象は、肝臓細胞を標的化または形質導入するｒＡＡＶベクターを含む組成物を投与され得、対象は、筋肉細胞を標的化または形質導入するｒＡＡＶベクターを含む組成物も同時投与される。例示的な実施形態では、対象は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを含む組成物、例えば、本明細書に開示されるＬＳＰに動作可能に連結されたＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む本明細書に開示されるＡＡＶ３ベクターまたはそのバリアントを含む組成物を同時投与され、対象は、本明細書に開示される異なるｒＡＡＶベクターを含む組成物、例えば、本明細書に開示されるＬＳＰに動作可能に連結されたＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含むＡＡＶ８ベクターもしくはハプロイドＡＡＶベクターを含む組成物も同時投与され、または代わりにＬＳＰは、異なるプロモーター、例えば、筋肉特異的プロモーターで置き換えられる。
【0531】
対象に投与される本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの投薬量は、投与の機序、処置および／または予防されるポンペ病または他の状態の重症度、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸などに依存し、日常的な方法で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位、必要に応じて、約１０８～１０１３形質導入単位の力価である。
【0532】
さらなる実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの対象への投与は、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、またはそれよりも長い循環半減期を有するＧＡＡタンパク質の産生をもたらす。
【0533】
実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの対象への投与の期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれよりも長い。さらなる実施形態では、投与が停止される間の期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、またはそれよりも長い。
【0534】
別の実施形態では、ポンペ病の処置のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムの投与は、例えば、少なくとも０．５ポンド、少なくとも１ポンド、少なくとも１．５ポンド、少なくとも２ポンド、少なくとも２．５ポンド、少なくとも３ポンド、少なくとも３．５ポンド、少なくとも４ポンド、少なくとも４．５ポンド、少なくとも５ポンド、少なくとも５．５ポンド、少なくとも６ポンド、少なくとも６．５ポンド、少なくとも７ポンド、少なくとも７．５ポンド、少なくとも８ポンド、少なくとも８．５ポンド、少なくとも９ポンド、少なくとも９．５ポンド、少なくとも１０ポンド、少なくとも１０．５ポンド、少なくとも１１ポンド、少なくとも１１．５ポンド、少なくとも１２ポンド、少なくとも１２．５ポンド、少なくとも１３ポンド、少なくとも１３．５ポンド、少なくとも１４ポンド、少なくとも１４．５ポンド、少なくとも１５ポンド、少なくとも２０ポンド、少なくとも２５ポンド、少なくとも３０ポンド、少なくとも５０ポンドの体重の増加をもたらす。
【0535】
別の実施形態では、ポンペ病の処置のための本明細書に開示される任意の血清型のＡＡＶ ＧＡＡは、例えば、０．５ポンド～５０ポンド、０．５ポンド～３０ポンド、０．５ポンド～２５ポンド、０．５ポンド～２０ポンド、０．５ポンド～１５ポンド、０．５ポンド～１０ポンド、０．５ポンド～７．５ポンド、０．５ポンド～５ポンド、１ポンド～１５ポンド、１ポンド～１０ポンド、１ポンド～７．５ポンド、１ポンド～５ポンド、２ポンド～１０ポンド、２ポンド～７．５ポンドの体重の増加をもたらす。
Ａ．医薬組成物
[001]
本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、薬学的に許容される賦形剤、すなわち、１つまたは複数の薬学的に許容される担体物質および／または添加物、例えば、緩衝液、担体、賦形剤、安定化剤などと、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、キットの形態で提供されてもよい。本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物、およびその使用は、当技術分野において公知である。
[002]
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物を提供する。本開示による医薬組成物中の活性成分（例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター）、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象のアイデンティティー、サイズ、および／または状態に応じて、ならびに組成物が投与される経路にさらに応じて、変わり得る。例えば、組成物は、０．１パーセント～９９パーセント（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含んでいてもよい。例として、組成物は、０．１パーセント～１００パーセントの間、例えば、５～５０パーセントの間、１～３０パーセントの間、５～８０パーセントの間、少なくとも８０パーセント（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでいてもよい。
[003]
医薬組成物は、（１）安定性を増加させる；（２）細胞のトランスフェクションもしくは形質導入を増加させる；（３）ペイロードの持続放出もしくは遅延放出を可能にする；（４）生体内分布を変更する（例えば、特異的な組織または細胞型にウイルス粒子を標的化する）；（５）コードされるタンパク質の翻訳を増加させる；（６）コードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する、ならびに／または（７）本発明のペイロードの調節可能な発現を可能にするために、１つまたは複数の賦形剤または希釈剤を使用して、製剤化することができる。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、または１００パーセント純粋であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒト用の使用のため、および獣医学的使用のために承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬グレードのものであり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たし得る。本明細書で使用される場合、賦形剤としては、限定されるものではないが、特定の所望の剤形に適するような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、または乳化剤、保存剤などが挙げられる。医薬組成物を製剤化するためのさまざまな賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（その全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照されたい）。例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じる、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の構成成分と有害な方法で相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と適合し得ない場合を除いて、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で企図され得る。
[004]
本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数の他の治療剤、予防剤、研究剤、または診断剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が、同じ時に投与されなければならないか、および／または一緒の送達のために製剤化されなければならないことを意味することを意図するものではないが、これらの送達の方法は、本発明の範囲内である。組成物は、１つもしくは複数の他の所望の治療薬もしくは医療手順と同時的に、その前に、またはその後に投与することができる。一部の実施形態では、１つの処置（例えば、遺伝子治療ベクター）の送達は、第２の送達（例えば、１つまたは複数の治療薬）が開始する時に、依然として起こっており、その結果、投与に関して重複が存在する。これは、本明細書では、「同時」または「同時的送達」と称される場合がある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達を開始する前に終わる。いずれかの場合の一部の実施形態では、処置は、併用投与のために、より有効である。例えば、第２の処置は、より有効である、例えば、同等の効果が、少ない第２の処置で見られる、もしくは第２の処置が、第２の処置が第１の処置の非存在で投与される場合に見られるよりも、高い程度で症状を低減する、または類似の状況が第１の処置で見られる。一部の実施形態では、送達は、症状または障害に関する他のパラメーターの低減が、他のものの非存在下で送達された１つの処置で観察されるであろうものよりも大きいようなものである。２つの処置の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的、または相加的よりも高くあり得る。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２が送達される場合に、依然として検出可能であるようなものであり得る。本明細書に記載される組成物、および少なくとも１つの追加治療は、同時に、同じもしくは別々の組成物で、または逐次的に、投与することができる。逐次的投与のために、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを、最初に投与することができ、１つもしくは複数の治療薬を２番目に投与することができ、または投与の順序を逆転することができる。遺伝子治療ベクター、および１つまたは複数の治療薬は、活動性の障害の期間の間、または寛解もしくは活動性が低い疾患の期間の間に投与することができる。遺伝子治療ベクターは、別の処置の前、処置と同時的に、処置後、または障害の寛解の間に投与することができる。
[005]
組合せで投与される場合、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２または第３の治療薬）、またはすべては、個々に、例えば、単剤療法として、それぞれ使用される量または投薬量よりも高い、それよりも低い、または同じ、量または用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２または第３の薬剤）、またはすべての投与される量または投薬量は、個々にそれぞれ使用される量または投薬量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）。他の実施形態では、所望の効果（例えば、心臓血管疾患または心臓疾患の処置）をもたらす、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２または第３の薬剤）、またはすべての量または投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々にそれぞれ必要な量または投薬量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％低い）。
[006]
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターの投与の方法は、本明細書に開示されるｒＡＶＶベクターを、単独で、または追加薬剤、例えば、本明細書に開示される免疫モジュレーターと組み合わせて、送達することができる。
Ｂ．免疫モジュレーター：
Ａ．医薬組成物
[001]
本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、薬学的に許容される賦形剤、すなわち、１つまたは複数の薬学的に許容される担体物質および／または添加物、例えば、緩衝液、担体、賦形剤、安定化剤などと、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、キットの形態で提供されてもよい。本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物、およびその使用は、当技術分野において公知である。
[002]
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物を提供する。本開示による医薬組成物中の活性成分（例えば、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター）、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象のアイデンティティー、サイズ、および／または状態に応じて、ならびに組成物が投与される経路にさらに応じて、変わり得る。例えば、組成物は、０．１パーセント～９９パーセント（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含んでいてもよい。例として、組成物は、０．１パーセント～１００パーセントの間、例えば、５～５０パーセントの間、１～３０パーセントの間、５～８０パーセントの間、少なくとも８０パーセント（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでいてもよい。
[003]
医薬組成物は、（１）安定性を増加させる；（２）細胞のトランスフェクションもしくは形質導入を増加させる；（３）ペイロードの持続放出もしくは遅延放出を可能にする；（４）生体内分布を変更する（例えば、特異的な組織または細胞型にウイルス粒子を標的化する）；（５）コードされるタンパク質の翻訳を増加させる；（６）コードされるタンパク質の放出プロファイルを変更する、ならびに／または（７）本発明のペイロードの調節可能な発現を可能にするために、１つまたは複数の賦形剤または希釈剤を使用して、製剤化することができる。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、または１００パーセント純粋であり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒト用の使用のため、および獣医学的使用のために承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。一部の実施形態では、賦形剤は、医薬グレードのものであり得る。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たし得る。本明細書で使用される場合、賦形剤としては、限定されるものではないが、特定の所望の剤形に適するような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤、または乳化剤、保存剤などが挙げられる。医薬組成物を製剤化するためのさまざまな賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野において公知である（その全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照されたい）。例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じる、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の構成成分と有害な方法で相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と適合し得ない場合を除いて、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の範囲内で企図され得る。
[004]
本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数の他の治療剤、予防剤、研究剤、または診断剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が、同じ時に投与されなければならないか、および／または一緒の送達のために製剤化されなければならないことを意味することを意図するものではないが、これらの送達の方法は、本発明の範囲内である。組成物は、１つもしくは複数の他の所望の治療薬もしくは医療手順と同時的に、その前に、またはその後に投与することができる。一部の実施形態では、１つの処置（例えば、遺伝子治療ベクター）の送達は、第２の送達（例えば、１つまたは複数の治療薬）が開始する時に、依然として起こっており、その結果、投与に関して重複が存在する。これは、本明細書では、「同時」または「同時的送達」と称される場合がある。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達を開始する前に終わる。いずれかの場合の一部の実施形態では、処置は、併用投与のために、より有効である。例えば、第２の処置は、より有効である、例えば、同等の効果が、少ない第２の処置で見られる、もしくは第２の処置が、第２の処置が第１の処置の非存在で投与される場合に見られるよりも、高い程度で症状を低減する、または類似の状況が第１の処置で見られる。一部の実施形態では、送達は、症状または障害に関する他のパラメーターの低減が、他のものの非存在下で送達された１つの処置で観察されるであろうものよりも大きいようなものである。２つの処置の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的、または相加的よりも高くあり得る。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２が送達される場合に、依然として検出可能であるようなものであり得る。本明細書に記載される組成物、および少なくとも１つの追加治療は、同時に、同じもしくは別々の組成物で、または逐次的に、投与することができる。逐次的投与のために、本明細書に記載される遺伝子治療ベクターを、最初に投与することができ、１つもしくは複数の治療薬を２番目に投与することができ、または投与の順序を逆転することができる。遺伝子治療ベクター、および１つまたは複数の治療薬は、活動性の障害の期間の間、または寛解もしくは活動性が低い疾患の期間の間に投与することができる。遺伝子治療ベクターは、別の処置の前、処置と同時的に、処置後、または障害の寛解の間に投与することができる。
[005]
組合せで投与される場合、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２または第３の治療薬）、またはすべては、個々に、例えば、単剤療法として、それぞれ使用される量または投薬量よりも高い、それよりも低い、または同じ、量または用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２または第３の薬剤）、またはすべての投与される量または投薬量は、個々にそれぞれ使用される量または投薬量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％）。他の実施形態では、所望の効果（例えば、心臓血管疾患または心臓疾患の処置）をもたらす、本明細書に開示される投与の方法における使用のための本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、および１つもしくは複数の治療薬（例えば、第２または第３の薬剤）、またはすべての量または投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々にそれぞれ必要な量または投薬量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％低い）。
[006]
一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターの投与の方法は、本明細書に開示されるｒＡＶＶベクターを、単独で、または追加薬剤、例えば、本明細書に開示される免疫モジュレーターと組み合わせて、送達することができる。
Ｂ．免疫モジュレーター：
【0536】
一部の実施形態では、リソソーム病、例えば、ポンペを処置するための、本明細書に記載されるＡＡＶベクターおよびＡＡＶゲノムを使用する方法および組成物は、免疫モジュレーターを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ｒＡＡＶベクターの投与の時に、ｒＡＡＶベクターの投与の前に、またはｒＡＡＶベクターの投与の後に投与することができる。
【0537】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＩｄｅＳ、ＩｄｅＺ、ＩｄｅＳ／Ｚ、Ｅｎｄｏ Ｓ、またはそれらの機能的バリアントなどの免疫グロブリンを分解する酵素である。そのような免疫グロブリンを分解する酵素およびそれらの使用の参照の非限定的な例は、ＵＳ７，６６６，５８２、ＵＳ８，１３３，４８３、ＵＳ２０１８００３７９６２、ＵＳ２０１８００２３０７０、ＵＳ２０１７０２０９５５０、ＵＳ８，８８９，１２８、ＷＯ２０１０／０５７６２６、ＵＳ９，７０７，２７９、ＵＳ８，３２３，９０８、ＵＳ２０１９０３４５５３３、ＵＳ２０１９０２６２４３４、およびＷＯ２０２０／０１６３１８に記載されており、それらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【0538】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターはプロテアソーム阻害剤である。ある特定の態様では、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである。実施形態の一部の態様では、免疫モジュレーターは、ボルテゾミブ、および抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブを含む。実施形態の他の態様では、免疫モジュレーターは、ボルテゾミブ、リツキシマブ、メトトレキサート、および静脈内ガンマグロブリンを含む。プロテアソーム阻害剤、ならびにリツキシマブ、メトトレキサートおよび静脈内ガンマグロブリンとのそれらの組合せを開示するそのような参照の非限定的な例は、ＵＳ１０，０２８，９９３、ＵＳ９，５９２，２４７、およびＵＳ８，８０９，２８２に記載されており、それらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【0539】
代替の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＮＦ－ｋＢ経路の阻害剤である。実施形態のある特定の態様では、免疫モジュレーターは、ラパマイシン、または機能的バリアントである。ＵＳ１０，０７１，１１４、ＵＳ２０１６００６７２２８、ＵＳ２０１６００７４５３１、ＵＳ２０１６００７４５３２、ＵＳ２０１９００７６４５８、ＵＳ１０，０４６，０６４に記載されるラパマイシンおよびその使用を開示する参照の非限定的な例は、それらの全体が組み込まれる。実施形態の他の態様では、免疫モジュレーターは、免疫抑制薬を含む合成ナノキャリアである。免疫抑制薬、合成ナノキャリアにカップリングされた免疫抑制薬、ラパマイシンを含む合成ナノキャリア、および／または寛容原性合成ナノキャリア、それらの用量、投与、ならびに使用の参照の非限定的な例は、ＵＳ２０１５０３２０７２８、ＵＳ２０１８０１９３４８２、ＵＳ２０１９０１４２９７４、ＵＳ２０１５０３２８３３３、ＵＳ２０１６０２４３２５３、ＵＳ１０，０３９，８２２、ＵＳ２０１９００７６５２２、ＵＳ２０１６００２２６５０、ＵＳ１０，４４１，６５１、ＵＳ１０，４２０，８３５、ＵＳ２０１５０３２０８７０、ＵＳ２０１４０３５６３６、ＵＳ１０，４３４，０８８、ＵＳ１０，３３５，３９５、ＵＳ２０２０００６９６５９、ＵＳ１０，３５７，４８３、ＵＳ２０１４０３３５１８６、ＵＳ１０，６６８，０５３、ＵＳ１０，３５７，４８２、ＵＳ２０１６０１２８９８６、ＵＳ２０１６０１２８９８７、ＵＳ２０２０００３８４６２、ＵＳ２０２０００３８４６３に記載されており、それらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【0540】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ＵＳ２０２０００３８４６３、米国特許第９，００６，２５４号に開示されるように、ラパマイシンを含む合成ナノキャリア（ＩｍｍＴＯＲ（商標）ナノ粒子）（Kishimoto, et al., 2016, Nat Nanotechnol, 11(10): 890-899；Maldonado, et al., 2015, PNAS, 112(2): E156-165）であり、それらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、操作された細胞、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７１９２７８６に開示されるＳＱＺ技術を使用して改変された免疫細胞である。
【0541】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、ポリＩＣＬＣ、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクター系、ＰＬＧＡ微小粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ならびにＡｑｕｉｌａのＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。別のさらなる実施形態では、免疫モジュレーターまたはアジュバントは、ポリＩＣＬＣである。
【0542】
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、クロロキン（ＴＬＲシグナル伝達阻害剤）および２－アミノプリン（ＰＫＲ阻害剤）などの細胞における自然免疫応答を阻害する小分子であり、本明細書に開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを含む組成物と組み合わせて投与することもできる。市販のＴＬＲシグナル伝達阻害剤のいくつかの非限定的な例としては、ＢＸ７９５、クロロキン、ＣＬＩ－０９５、ＯｘＰＡＰＣ、ポリミキシンＢ、およびラパマイシン（すべてＩＮＶＩＶＯＧＥＮ（商標）から購入可能）が挙げられる。加えて、２－アミノプリン、ＢＸ７９５、クロロキン、およびＨ－８９などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）の阻害剤（自然免疫シグナル伝達に関与する）も、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｖｏタンパク質発現のために、本明細書に開示される少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物および方法において使用することができる。
【0543】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＮＬＲＸ１などの自然免疫の負の調節因子をコードすることもできる。したがって、一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、必要に応じて、ＮＬＲＸ１、ＮＳ１、ＮＳ３／４Ａ、もしくはＡ４６Ｒの１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せをコードすることもできる。加えて、一部の実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物は、組織または対象によって生じる自然免疫応答を回避するために、自然免疫系の阻害剤をコードする合成改変ＲＮＡを含むこともできる。
【0544】
一部の実施形態では、本明細書に開示される投与方法における使用のための免疫モジュレーターは、免疫抑制剤である。本明細書で使用される場合、「免疫抑制薬または免疫抑制剤」という用語は、正常な免疫機能を阻害または妨げる医薬品を含むことを意図する。本明細書に開示される方法に好適な免疫抑制剤の例としては、Ｔ細胞／Ｂ細胞共刺激経路を阻害する薬剤、例えば、米国特許公開第２００２／０１８２２１１号に開示されるＣＴＬＡ４およびＢ７経路を介してＴ細胞およびＢ細胞のカップリングを妨げる薬剤が挙げられる。一実施形態では、免疫抑制剤はシクロスポリンＡである。他の例としては、ミコフェノール酸モフェチル（myophenylate mofetil）、ラパマイシン（rapamicin）、および抗胸腺細胞グロブリンが挙げられる。一実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書に開示される少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物中で投与されるか、または別々の組成物中であるが、本明細書に開示される投与の方法に従って、少なくとも１つのｒＡＡＶベクターを含む組成物の投与と同時に、もしくはその前に、もしくはその後に投与することができる。免疫抑制薬は、投与の経路に適合する製剤で投与され、所望の治療効果を達成するのに十分な投薬量で対象に投与される。一部の実施形態では、免疫抑制薬は、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターに対する耐性を誘導するのに十分な時間、一時的に投与される。
【0545】
本明細書に開示される方法および組成物の任意の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムを投与される対象は、免疫抑制剤も投与される。ＡＡＶを投与される患者の免疫応答の免疫抑制をもたらすためのさまざまな方法が、公知である。当技術分野において公知の方法は、プロテアソーム阻害剤などの免疫抑制剤を患者に投与するステップを含む。例えば、それらの両方が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，１６９，４９２号および米国特許出願第１５／７９６，１３７号に開示される当技術分野において公知の１つのそのようなプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。一部の実施形態では、免疫抑制剤は、ポリクローナル、モノクローナル、ｓｃｆｖ、または、例えば、抗体産生細胞の排除もしくは抑制を通して、免疫応答を抑制することができる他の抗体由来分子を含む抗体であり得る。さらなる実施形態では、免疫抑制エレメントは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。そのような実施形態では、ｓｈＲＮＡのコード領域を、ｒＡＡＶカセットに含め、一般に、ポリＡテイルの下流の３’に位置させる。ｓｈＲＮＡは、サイトカイン、成長因子（トランスフォーミング成長因子β１およびβ２、ＴＮＦ、ならびに公に公知の他のものを含む）などの免疫刺激剤の発現を低減または排除するために標的にされ得る。
【0546】
そのような免疫モジュレート剤の使用は、何か月および／または何年にもわたって、複数の投薬（例えば、複数回投与）を使用する能力を容易にする。これは、下記で議論される複数の薬剤、例えば、複数の遺伝子をコードするｒＡＡＶベクター、または対象への複数回投与を使用することを可能にする。
【0547】
本明細書に開示される技術の組成物および方法のすべての態様を、以下の番号付けられた項のいずれか１つまたは複数において定義することができる。
１．そのゲノム中に、（ａ）５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに（ｂ）５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列を含む組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
２．ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸の５’に位置するシグナルペプチドをさらに含むか、またはＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端にＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
３．ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含むか、またはＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端にＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
４．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）肝臓特異的プロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）分泌シグナルペプチドをコードする核酸、（ｅ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｆ）ポリＡ配列、および（ｇ）３’ＩＴＲを含む、項１～３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。一部の実施形態では、イントロン配列（ｃ）は存在しない。
５．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）肝臓特異的プロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、（ｅ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｆ）ポリＡ配列、および（ｇ）３’ＩＴＲを含む、項１～３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。一部の実施形態では、イントロン配列（ｃ）は存在しない。
６．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）肝臓特異的プロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）分泌シグナルペプチドをコードする核酸、（ｅ）ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、（ｆ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｇ）ポリＡ配列、および（ｈ）３’ＩＴＲを含む、項１～６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。一部の実施形態では、イントロン配列は存在しない。
７．分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片から選択される、項１～６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。例えば、分泌シグナルペプチドをコードする核酸は、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片、例えば、配列番号１７～２２、１７５、１７７、１７９もしくは１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸から選択することができる。
８．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体と結合する、項１～７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
９．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５を含むか、あるいはＣＩ－ＭＰＲ受容体との結合に影響を与えないか、または１つもしくは複数のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ、例えば、ＩＧＦＢＰ１～６）とのその結合を低減させる、配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変を含む、項１～５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１０．配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変が、Ｖ４３Ｍアミノ酸改変（配列番号８または配列番号９）、またはΔ２～７（配列番号６）、またはΔ１～７（配列番号７）である、項１～９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１１．肝臓特異的プロモーターが、本明細書の表４、または２０１９年１１月１９日に出願された仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは４Ｂにリストされた配列のいずれかのプロモーター、あるいはそれらの機能的バリアントまたはそれらの機能的断片である、項１～１０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１２．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片を含む、項１～１０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１３．肝臓特異的プロモーターが、（ｉ）ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される、項１～１２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１４．核酸配列が、野生型ＧＡＡポリペプチドまたは改変ＧＡＡポリペプチドをコードする、項１～１３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１５．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、項１～１４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１６．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、項１～１５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１７．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、項１～１６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１８．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつ自然免疫応答を低減するように、コドン最適化されている、項１～１７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１９．核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、項１～１８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２０．コードされたポリペプチドが、ＧＡＡポリペプチドのアミノ末端およびＩＧＦ２標的化ペプチドのＣ末端に位置する少なくとも１個のアミノ酸に対するヌクレオチド配列を含むスペーサーをさらに含む、項１～１９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２１．ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の間に位置する少なくとも１個のアミノ酸のスペーサーをコードする核酸をさらに含む、項１～２０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２２．ＧＡＡ遺伝子をコードする核酸の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置する少なくとも１つのポリＡ配列をさらに含む、項１～２１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２３．異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列をさらに含む、項１～２２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２４．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸およびポリＡ配列の間に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列をコードする核酸さらに含む、項１～２３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２５．分泌シグナルペプチドをコードする配列の５’およびプロモーターの３’に位置するイントロン配列をさらに含む、項１～２４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２６．イントロン配列が、ＭＶＭ配列、ＳＶ４０配列、またはＨＢＢ２配列を含み、ＭＶＭ配列が、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含み、ＨＢＢ２配列が、配列番号１４の核酸配列、または配列番号１４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含む、項１～２５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２７．ＩＴＲが、挿入、欠失、または置換を含む、項１～２６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２８．ＩＴＲにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドが除去されている、項１～２７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２９．ａ．異種核酸配列が、
１．フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片（例えば、ＦＮ１シグナルペプチドは、配列番号１８～２１のいずれかの配列、または配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、
２．ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、または配列番号１７のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
３．ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、または配列番号２２のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
４．ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、または配列番号１７７のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
５．ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、または配列番号１７９のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
６．変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または配列番号１８１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択される分泌シグナルペプチドをコードし、
ｂ．異種核酸配列が、配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２、または配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群のいずれかから選択されるＧＡＡポリペプチドをコードし、および必要に応じて、核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を有するＧＡＡポリペプチドをコードする、
項１～２８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３０．異種核酸が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドもコードする、項２９に記載の組換えＡＡＶベクター。
３１．コードされた分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するその活性断片であり（例えば、ＡＡＴシグナルペプチドは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、異種核酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする、項１～３０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３２．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号８もしくは配列番号９、または配列番号８もしくは９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドである、項１～３１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３３．キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、ポリプロイドＡＡＶベクター、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型、例えば、国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７に開示される表１にリストされる任意の血清型由来のＡＡＶベクターのいずれかから選択される、項１～３２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３４．２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表１、もしくは国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７にリストされたもの、またはおよびそれらの任意の組合せからなる群中のいずれかのＡＡＶ血清型から選択されるカプシドタンパク質を含む、項１～３３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３５．ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、ＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、ＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターからなる群からの血清型から選択される、項１～３４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３６．ＡＡＶ３ｂ血清型が、２６５Ｄ、５４９Ａ、Ｑ２６３Ｙのいずれかから選択されるカプシドタンパク質における１つまたは複数の変異を含む、項１～３５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３７．ＡＡＶ３ｂ血清型が、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａ、ＡＡＶ３ｂ５４９ＡもしくはＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙ、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧのいずれかから選択される、項１～３６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３８．そのゲノム中に、
ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに
ｂ．５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列
を含む組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、
ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ３ｂ血清型のカプシドタンパク質を含む、組換えＡＡＶベクター。
３９．ＧＡＡポリペプチドが、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端に位置する分泌シグナルペプチドをさらに含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４０．ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端に位置するか、または分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項３８～３９に記載の組換えＡＡＶベクター。
４１．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４２．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４３．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４４．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４５．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、３’ＩＴＲ配列、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４６．分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片、例えば、配列番号１７～２２、１７５、１７７、１７９もしくは１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸から選択することができる分泌シグナルペプチドをコードする核酸から選択される、項３４～４７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
４７．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体と結合する、項３８～４６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
４８．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５を含むか、あるいはIGF2受容体との結合に影響を与えないか、またはＩＧＦ結合タンパク質ＩＧＦＢＰ１～６のうちの１つもしくは複数とのその結合を低減させる、配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変を含む、項３８～４７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
４９．配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変が、Ｖ４３Ｍアミノ酸改変（配列番号８または配列番号９）、またはΔ２～７（配列番号６）、またはΔ１～７（配列番号７）である、項４８に記載の組換えＡＡＶベクター。
５０．肝臓特異的プロモーターが、表４、または２０１９年１１月１９日に出願された仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは４Ｂにリストされた配列のいずれか、あるいはそれらの機能的バリアントまたは機能的断片から選択される、項３８～４９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５１．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される、項３８～５０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５２．肝臓特異的プロモーターが、（ｉ）ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される、項３８～５０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５３．核酸配列が、野生型ＧＡＡポリペプチドまたは改変ＧＡＡポリペプチドをコードする、項３８～５２に記載の組換えＡＡＶベクター。
５４．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、項３８～５３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５５．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、項３８～５４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５６．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、項３８～５５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５７．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつＣｐＧアイランドを低減するように、コドン最適化されている、項３８～５６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５８．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、項３８～５７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５９．イントロン配列が、ＭＶＭ、ＨＢＢ２、またはＳＶ４０イントロン配列から選択され、ＭＶＭ配列が、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含み、ＨＢＢ２配列が、配列番号１４の核酸配列、または配列番号１４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含む、項３８～５８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６０．ＩＴＲが、挿入、欠失、または置換を含む、項３８～５９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６１．ＩＴＲにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドが除去されている、項６０に記載の組換えＡＡＶベクター。
６２．３’ＩＴＲが、配列番号４４２、または配列番号４４２と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなり、５’ＩＴＲが、配列番号４４１、または配列番号４４１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる、項３８～６１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６３．３’ＩＴＲが、配列番号１６５、または配列番号１６５と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなり、５’ＩＴＲが、配列番号１６１、または配列番号１６１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる、項３８～６１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６４．分泌シグナルペプチドが、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片であり（例えば、ＦＮ１シグナルペプチドは、配列番号１８～２１のいずれかの配列、または配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、異種核酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする、項３８～６３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６５．コードされた分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するその活性断片であり（例えば、ＡＡＴシグナルペプチドは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、異種核酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする、項３８～６４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６６．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号８もしくは配列番号９、または配列番号８もしくは９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドである、項３８～６５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６７．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６８．肝臓特異的プロモーターが、ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６９．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７０．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７１．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７２．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７３．薬学的に許容される担体中に前の項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
７４．異種核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーターであって、異種核酸配列がＧＡＡポリペプチドをコードする、肝臓特異的プロモーター
を含む核酸配列であって、肝臓特異的プロモーターが、表４、または２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは表４Ｂに開示される配列、あるいはそれらの機能的バリアントまたは機能的断片のいずれか１つから選択される、核酸配列。
７５．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む、項７４に記載の核酸配列。
７６．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む、項７４に記載の核酸配列。
７７．ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）核酸配列、ならびに
ｂ．５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列
を含む組換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムのための核酸配列であって、肝臓特異的プロモーターが、表４、または２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは表４Ｂに開示される配列、あるいはそれらの機能的バリアントまたは機能的断片のいずれか１つから選択される、核酸配列。
７８．核酸配列が、分泌シグナルおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする、項７５に記載の核酸配列。
７９．核酸配列が、分泌シグナル、ＩＧＦ２標的化ペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする、項７５に記載の核酸配列。
８０．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む異種核酸配列であって、肝臓特異的プロモーターが、
ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれかから選択される、
核酸配列。
８１．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルをコードする核酸、およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、項８０に記載の核酸配列。
８２．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸配列、およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、項７５に記載の核酸配列。
８３．組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターゲノムのための核酸配列であって、（ａ）５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）核酸配列、ならびに（ｂ）５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、または分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されており、肝臓特異的プロモーターが、
ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、または
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれか１つから選択される、異種核酸配列
を含む、核酸配列。
８４．ＧＡＡポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列が、分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項７４～８３のいずれかに記載の核酸配列。
８５．分泌シグナルをコードする核酸が、配列番号１７、２２～２６、１７５、１７７、１７９、もしくは１８１、または配列番号１７、もしくは２２～２６、もしくは１７５、１７７、１７９、もしくは１８１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～８４のいずれかに記載の核酸配列。
８６．ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸が、配列番号２（ＩＧＦ２－Δ２～７）、配列番号３（ＩＧＦ２－Δ１～７）もしくは配列番号４（ＩＧＦ２ Ｖ４３Ｍ）、または配列番号２、３または４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～８５のいずれかに記載の核酸配列。
８７．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、項７４～８６のいずれかに記載の核酸配列。
８８．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、項７４～８７のいずれかに記載の核酸配列。
８９．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、項７４～８８のいずれかに記載の核酸配列。
９０．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつＣｐＧアイランドを低減するように、コドン最適化されている、項７４～８９のいずれかに記載の核酸配列。
９１．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、項７４～９０のいずれかに記載の核酸配列。
９２．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１１（全長ｈＧＡＡ）、配列番号５５（Ｄｗｉｇｈｔ ｃＤＮＡ）、配列番号５６（ｈＧＡＡ Δ１～６６）、または配列番号１１、５５もしくは５６のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～９１のいずれかに記載の核酸配列。
９３．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号７４（コドン最適化１）、配列番号７５（コドン最適化２）、および配列番号７６（コドン最適化３）、または配列番号７４、７５もしくは７６のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～９２に記載の核酸配列。
９４．核酸が、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））、配列番号７９（ＡＡＴ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８０（ＦＩＢｒａｔ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８１（ＦＩＢｈｕｍ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８２（ＡＡＴ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８３（ＦＩＢｒａｔ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８４（ＦＩＢｈｕｍ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）、または配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかから選択される、項７４～９３に記載の核酸配列。
９５．グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型（ＧＳＤ ＩＩ、ポンペ病、酸性マルターゼ欠損症）を有するか、またはアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドにおける欠損を有する対象を処置するための方法であって、先の項１～９５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを前記対象に投与するステップを含む、方法。
９６．ＧＡＡポリペプチドが、対象の肝臓から分泌され、分泌されたＧＡＡの骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せによる取り込みがあり、前記分泌されたＧＡＡの取り込みが、前記組織中のリソソームグリコーゲン貯蔵の低減をもたらす、項９５に記載の方法。
９７．対象に投与するステップが、筋肉内、皮下、脊髄内、大槽内、髄腔内、静脈内の投与のいずれかから選択される、項９５～９６のいずれかに記載の方法。
９８．組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、項９５～９７のいずれかに記載の方法。
９９．組換えＡＡＶベクターが、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、項９５～９７のいずれかに記載の方法。
１００．組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、またはＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、項９５～９７のいずれかに記載の方法。
１０１．組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ８ベクターである、項１００に記載の方法。
１０２．リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を有する対象を処置するための方法であって、先の項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを前記対象に投与するステップを含み、ＡＡＶベクターが、表５Ｂまたは表６Ｂにおける任意のポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現する、方法。
１０３．リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が、表５Ａまたは表６Ａにリストされるもののいずれかから選択される、項１０２に記載の方法。
１０４．組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、項１０２に記載の方法。
１０５．組換えＡＡＶベクターが、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、項１０２に記載の方法。
１０６．組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、またはＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、項１０２に記載の方法。
１０７．項７４～９４のいずれかに記載の核酸配列を含む細胞。
１０８．ヒト細胞である、項１０７に記載の細胞。
１０９．非ヒト細胞の哺乳動物細胞である、項１０７～１０８のいずれかに記載の細胞。
１１０．昆虫細胞である、項１０７～１０９のいずれかに記載の細胞。
１１１．項１～７２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターを含む細胞。
１１２．項１～７２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターを含む宿主動物。
１１３．哺乳動物である、項１１２に記載の宿主動物。
１１４．非ヒト哺乳動物である、項１１２または１１３に記載の宿主動物。
１１５．ヒトである、項１１３に記載の宿主動物。
１１６．項９５～１０１のいずれかに記載の方法における使用のための項７３に記載の医薬組成物。
１１７．項１０７～１１１のいずれかに記載の細胞を含む宿主動物。
１１８．項１～７２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターを含む宿主動物。
１１９．哺乳動物である、項１１８に記載の宿主動物。
１２０．非ヒト哺乳動物である、項１１８～１１９に記載の宿主動物。
１２１．ヒトである、項１１９に記載の宿主動物。
１．そのゲノム中に、（ａ）５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに（ｂ）５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列を含む組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクター。
２．ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸の５’に位置するシグナルペプチドをさらに含むか、またはＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端にＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
３．ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含むか、またはＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端にＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
４．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）肝臓特異的プロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）分泌シグナルペプチドをコードする核酸、（ｅ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｆ）ポリＡ配列、および（ｇ）３’ＩＴＲを含む、項１～３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。一部の実施形態では、イントロン配列（ｃ）は存在しない。
５．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）肝臓特異的プロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、（ｅ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｆ）ポリＡ配列、および（ｇ）３’ＩＴＲを含む、項１～３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。一部の実施形態では、イントロン配列（ｃ）は存在しない。
６．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、（ａ）５’ＩＴＲ、（ｂ）肝臓特異的プロモーター配列、（ｃ）イントロン配列、（ｄ）分泌シグナルペプチドをコードする核酸、（ｅ）ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、（ｆ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｇ）ポリＡ配列、および（ｈ）３’ＩＴＲを含む、項１～６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。一部の実施形態では、イントロン配列は存在しない。
７．分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、ＧＡＡシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片から選択される、項１～６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。例えば、分泌シグナルペプチドをコードする核酸は、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片、例えば、配列番号１７～２２、１７５、１７７、１７９もしくは１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸から選択することができる。
８．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体と結合する、項１～７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
９．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５を含むか、あるいはＣＩ－ＭＰＲ受容体との結合に影響を与えないか、または１つもしくは複数のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ、例えば、ＩＧＦＢＰ１～６）とのその結合を低減させる、配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変を含む、項１～５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１０．配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変が、Ｖ４３Ｍアミノ酸改変（配列番号８または配列番号９）、またはΔ２～７（配列番号６）、またはΔ１～７（配列番号７）である、項１～９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１１．肝臓特異的プロモーターが、本明細書の表４、または２０１９年１１月１９日に出願された仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは４Ｂにリストされた配列のいずれかのプロモーター、あるいはそれらの機能的バリアントまたはそれらの機能的断片である、項１～１０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１２．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片を含む、項１～１０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１３．肝臓特異的プロモーターが、（ｉ）ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される、項１～１２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１４．核酸配列が、野生型ＧＡＡポリペプチドまたは改変ＧＡＡポリペプチドをコードする、項１～１３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１５．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、項１～１４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１６．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、項１～１５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１７．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、項１～１６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１８．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつ自然免疫応答を低減するように、コドン最適化されている、項１～１７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
１９．核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、項１～１８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２０．コードされたポリペプチドが、ＧＡＡポリペプチドのアミノ末端およびＩＧＦ２標的化ペプチドのＣ末端に位置する少なくとも１個のアミノ酸に対するヌクレオチド配列を含むスペーサーをさらに含む、項１～１９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２１．ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の間に位置する少なくとも１個のアミノ酸のスペーサーをコードする核酸をさらに含む、項１～２０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２２．ＧＡＡ遺伝子をコードする核酸の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置する少なくとも１つのポリＡ配列をさらに含む、項１～２１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２３．異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列をさらに含む、項１～２２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２４．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸およびポリＡ配列の間に位置するコラーゲン安定性（ＣＳ）配列をコードする核酸さらに含む、項１～２３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２５．分泌シグナルペプチドをコードする配列の５’およびプロモーターの３’に位置するイントロン配列をさらに含む、項１～２４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２６．イントロン配列が、ＭＶＭ配列、ＳＶ４０配列、またはＨＢＢ２配列を含み、ＭＶＭ配列が、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含み、ＨＢＢ２配列が、配列番号１４の核酸配列、または配列番号１４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含む、項１～２５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２７．ＩＴＲが、挿入、欠失、または置換を含む、項１～２６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２８．ＩＴＲにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドが除去されている、項１～２７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
２９．ａ．異種核酸配列が、
１．フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片（例えば、ＦＮ１シグナルペプチドは、配列番号１８～２１のいずれかの配列、または配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、
２．ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、または配列番号１７のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
３．ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、または配列番号２２のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
４．ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、または配列番号１７７のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
５．ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、または配列番号１７９のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
６．変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または配列番号１８１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
から選択される分泌シグナルペプチドをコードし、
ｂ．異種核酸配列が、配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２、または配列番号１１、配列番号７２もしくは配列番号１８２と少なくとも６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる群のいずれかから選択されるＧＡＡポリペプチドをコードし、および必要に応じて、核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を有するＧＡＡポリペプチドをコードする、
項１～２８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３０．異種核酸が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドもコードする、項２９に記載の組換えＡＡＶベクター。
３１．コードされた分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するその活性断片であり（例えば、ＡＡＴシグナルペプチドは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、異種核酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする、項１～３０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３２．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号８もしくは配列番号９、または配列番号８もしくは９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドである、項１～３１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３３．キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、ポリプロイドＡＡＶベクター、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型、例えば、国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７に開示される表１にリストされる任意の血清型由来のＡＡＶベクターのいずれかから選択される、項１～３２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３４．２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表１、もしくは国際出願のＷＯ２０２０／１０２６４５およびＷＯ２０２０／１０２６６７にリストされたもの、またはおよびそれらの任意の組合せからなる群中のいずれかのＡＡＶ血清型から選択されるカプシドタンパク質を含む、項１～３３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３５．ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、ＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、ＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターからなる群からの血清型から選択される、項１～３４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３６．ＡＡＶ３ｂ血清型が、２６５Ｄ、５４９Ａ、Ｑ２６３Ｙのいずれかから選択されるカプシドタンパク質における１つまたは複数の変異を含む、項１～３５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３７．ＡＡＶ３ｂ血清型が、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ、ＡＡＶ３ｂ２６５Ｄ５４９Ａ、ＡＡＶ３ｂ５４９ＡもしくはＡＡＶ３ｂＱ２６３Ｙ、またはＡＡＶ３ｂＳＡＳＴＧのいずれかから選択される、項１～３６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
３８．そのゲノム中に、
ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、ならびに
ｂ．５’および３’ＩＴＲの間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列
を含む組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターであって、
ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ３ｂ血清型のカプシドタンパク質を含む、組換えＡＡＶベクター。
３９．ＧＡＡポリペプチドが、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端に位置する分泌シグナルペプチドをさらに含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４０．ＧＡＡポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＧＡＡポリペプチドのＮ末端に位置するか、または分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項３８～３９に記載の組換えＡＡＶベクター。
４１．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４２．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４３．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４４．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４５．ＡＡＶゲノムが、５’から３’への方向に、５’ＩＴＲ、肝臓特異的プロモーター配列、イントロン配列、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸、３’ＩＴＲ配列、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲを含む、項３８に記載の組換えＡＡＶベクター。
４６．分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド（例えば、配列番号１７）、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）（例えば、配列番号１８～２１）、同族ＧＡＡシグナルペプチド（配列番号１７５）、ｈＩＧＦ２シグナルペプチド（例えば、配列番号２２）、ＩｇＧ１リーダーペプチド（配列番号１７７）、ｗｔＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１７９）、変異型ＩＬ２リーダーペプチド（配列番号１８１）、または分泌シグナル活性を有するそれらの活性断片、例えば、配列番号１７～２２、１７５、１７７、１７９もしくは１８１と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸から選択することができる分泌シグナルペプチドをコードする核酸から選択される、項３４～４７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
４７．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、ヒトカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）またはＩＧＦ２受容体と結合する、項３８～４６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
４８．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号５を含むか、あるいはIGF2受容体との結合に影響を与えないか、またはＩＧＦ結合タンパク質ＩＧＦＢＰ１～６のうちの１つもしくは複数とのその結合を低減させる、配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変を含む、項３８～４７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
４９．配列番号５における少なくとも１つのアミノ改変が、Ｖ４３Ｍアミノ酸改変（配列番号８または配列番号９）、またはΔ２～７（配列番号６）、またはΔ１～７（配列番号７）である、項４８に記載の組換えＡＡＶベクター。
５０．肝臓特異的プロモーターが、表４、または２０１９年１１月１９日に出願された仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは４Ｂにリストされた配列のいずれか、あるいはそれらの機能的バリアントまたは機能的断片から選択される、項３８～４９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５１．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される、項３８～５０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５２．肝臓特異的プロモーターが、（ｉ）ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｉｉ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｉｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；（ｖ）ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片のいずれかから選択される、項３８～５０のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５３．核酸配列が、野生型ＧＡＡポリペプチドまたは改変ＧＡＡポリペプチドをコードする、項３８～５２に記載の組換えＡＡＶベクター。
５４．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、項３８～５３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５５．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、項３８～５４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５６．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、項３８～５５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５７．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつＣｐＧアイランドを低減するように、コドン最適化されている、項３８～５６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５８．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ、Ｈ１９９Ｒ、またはＲ２３３Ｈから選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つすべてのアミノ酸改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、項３８～５７のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
５９．イントロン配列が、ＭＶＭ、ＨＢＢ２、またはＳＶ４０イントロン配列から選択され、ＭＶＭ配列が、配列番号１３の核酸配列、または配列番号１３と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含み、ＨＢＢ２配列が、配列番号１４の核酸配列、または配列番号１４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列を含む、項３８～５８のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６０．ＩＴＲが、挿入、欠失、または置換を含む、項３８～５９のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６１．ＩＴＲにおける１つまたは複数のＣｐＧアイランドが除去されている、項６０に記載の組換えＡＡＶベクター。
６２．３’ＩＴＲが、配列番号４４２、または配列番号４４２と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなり、５’ＩＴＲが、配列番号４４１、または配列番号４４１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる、項３８～６１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６３．３’ＩＴＲが、配列番号１６５、または配列番号１６５と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなり、５’ＩＴＲが、配列番号１６１、または配列番号１６１と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、もしくは９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる、項３８～６１のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６４．分泌シグナルペプチドが、フィブロネクチンシグナルペプチド（ＦＮ１）、または分泌シグナル活性を有するその活性断片であり（例えば、ＦＮ１シグナルペプチドは、配列番号１８～２１のいずれかの配列、または配列番号１８～２１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、異種核酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする、項３８～６３のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６５．コードされた分泌シグナルペプチドが、ＡＡＴシグナルペプチド、または分泌シグナル活性を有するその活性断片であり（例えば、ＡＡＴシグナルペプチドは、配列番号１７の配列、または配列番号１７と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）、異種核酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のいずれかから選択されるＩＧＦ２標的化ペプチド、または配列番号５～９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドをコードする、項３８～６４のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６６．ＩＧＦ２標的化ペプチドが、配列番号８もしくは配列番号９、または配列番号８もしくは９と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＩＧＦ２ペプチドである、項３８～６５のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６７．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６８．肝臓特異的プロモーターが、ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
６９．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７０．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７１．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７２．肝臓特異的プロモーターが、ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片である、項３８～６６のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクター。
７３．薬学的に許容される担体中に前の項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
７４．異種核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーターであって、異種核酸配列がＧＡＡポリペプチドをコードする、肝臓特異的プロモーター
を含む核酸配列であって、肝臓特異的プロモーターが、表４、または２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは表４Ｂに開示される配列、あるいはそれらの機能的バリアントまたは機能的断片のいずれか１つから選択される、核酸配列。
７５．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む、項７４に記載の核酸配列。
７６．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルペプチドをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸、およびＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む、項７４に記載の核酸配列。
７７．ａ．５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）核酸配列、ならびに
ｂ．５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されている、異種核酸配列
を含む組換えアデノウイルス随伴（ｒＡＡＶ）ベクターゲノムのための核酸配列であって、肝臓特異的プロモーターが、表４、または２０１９年１１月１９日に出願された米国仮出願第６２，９３７，５５６号の表４Ａもしくは表４Ｂに開示される配列、あるいはそれらの機能的バリアントまたは機能的断片のいずれか１つから選択される、核酸配列。
７８．核酸配列が、分泌シグナルおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする、項７５に記載の核酸配列。
７９．核酸配列が、分泌シグナル、ＩＧＦ２標的化ペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする、項７５に記載の核酸配列。
８０．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸を含む核酸配列に動作可能に連結された肝臓特異的プロモーターを含む異種核酸配列であって、肝臓特異的プロモーターが、
ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれかから選択される、
核酸配列。
８１．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルをコードする核酸、およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、項８０に記載の核酸配列。
８２．異種核酸配列が、以下の順序で、分泌シグナルをコードする核酸、ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸配列、およびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドをコードする核酸を含む、項７５に記載の核酸配列。
８３．組換えアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）ベクターゲノムのための核酸配列であって、（ａ）５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）核酸配列、ならびに（ｂ）５’および３’ＩＴＲ配列の間に位置する、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、または分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列であって、異種核酸が、肝臓特異的プロモーターに動作可能に連結されており、肝臓特異的プロモーターが、
ｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）もしくはＳＰ０４１２（配列番号９１）、または配列番号８６もしくは配列番号９１に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片、または
ｉｉ．ＳＰ０４２２（配列番号９２）、または配列番号９２に対して少なくとも６０％の活性を有するその機能的バリアントもしくは機能的断片、
ｉｉｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）もしくはＳＰ０２３９（配列番号９３）もしくはＳＰ０２３８－ＵＴＲ（配列番号１４７）、または配列番号８７、配列番号９３もしくは配列番号１４７に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｉｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２６５（ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号８８）もしくはＳＰ０２６５（ＬＶＲ＿ＳＰ０１３１＿Ａ１）（配列番号９４）もしくはＳＰ０２６５－ＵＴＲ（配列番号１４６）、または配列番号８８、配列番号９４もしくは配列番号１４６に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；
ｖ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４０（配列番号８９）もしくはＳＰ０２４０（配列番号９５）もしくはＳＰ０２４０－ＵＴＲ（配列番号１４８）、または配列番号８９、配列番号９５もしくは配列番号１４８に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片；あるいは
ｖｉ．ＣＲＭ＿ＳＰ０２４６（配列番号９０）もしくはＳＰ０２４６（配列番号９６）もしくはＳＰ０２４６－ＵＴＲ（配列番号１４９）、または配列番号９０、配列番号９６もしくは配列番号１４９に対して少なくとも６０％の活性を有するそれらの機能的バリアントもしくは機能的断片
のいずれか１つから選択される、異種核酸配列
を含む、核酸配列。
８４．ＧＡＡポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする異種核酸配列が、分泌シグナルペプチドおよびアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドの間に位置するＩＧＦ２標的化ペプチドをさらに含む、項７４～８３のいずれかに記載の核酸配列。
８５．分泌シグナルをコードする核酸が、配列番号１７、２２～２６、１７５、１７７、１７９、もしくは１８１、または配列番号１７、もしくは２２～２６、もしくは１７５、１７７、１７９、もしくは１８１のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～８４のいずれかに記載の核酸配列。
８６．ＩＧＦ２標的化ペプチドをコードする核酸が、配列番号２（ＩＧＦ２－Δ２～７）、配列番号３（ＩＧＦ２－Δ１～７）もしくは配列番号４（ＩＧＦ２ Ｖ４３Ｍ）、または配列番号２、３または４と少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～８５のいずれかに記載の核酸配列。
８７．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ヒトＧＡＡ遺伝子、またはヒトコドン最適化ＧＡＡ遺伝子（ｃｏＧＡＡ）、または改変ＧＡＡ核酸配列である、項７４～８６のいずれかに記載の核酸配列。
８８．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のためにコドン最適化されている、項７４～８７のいずれかに記載の核酸配列。
８９．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、ＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されている、項７４～８８のいずれかに記載の核酸配列。
９０．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、自然免疫応答を低減するように、またはＣｐＧアイランドを低減するように、または自然免疫応答を低減し、かつＣｐＧアイランドを低減するように、コドン最適化されている、項７４～８９のいずれかに記載の核酸配列。
９１．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号１０のＨ２０１Ｌ改変を含むＧＡＡポリペプチドをコードする、項７４～９０のいずれかに記載の核酸配列。
９２．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号１１（全長ｈＧＡＡ）、配列番号５５（Ｄｗｉｇｈｔ ｃＤＮＡ）、配列番号５６（ｈＧＡＡ Δ１～６６）、または配列番号１１、５５もしくは５６のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～９１のいずれかに記載の核酸配列。
９３．ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸が、配列番号７４（コドン最適化１）、配列番号７５（コドン最適化２）、および配列番号７６（コドン最適化３）、または配列番号７４、７５もしくは７６のいずれかと少なくとも約７５％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％、もしくは９５％、もしくは９８％、もしくは９９％の配列同一性の核酸配列のいずれかから選択される、項７４～９２に記載の核酸配列。
９４．核酸が、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））、配列番号７９（ＡＡＴ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８０（ＦＩＢｒａｔ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８１（ＦＩＢｈｕｍ＿ｈＩＧＦ２－Ｖ４３Ｍ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８２（ＡＡＴ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８３（ＦＩＢｒａｔ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）；配列番号８４（ＦＩＢｈｕｍ＿ＧＩＬＴ＿ｗｔＧＡＡ＿ｄｅｌ１－６９＿Ｓｔｕｆｆｅｒ．Ｖ０２）、または配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、７９、８０、８１、８２、８３、もしくは８４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の同一性を有する核酸配列のいずれかから選択される、項７４～９３に記載の核酸配列。
９５．グリコーゲン貯蔵障害ＩＩ型（ＧＳＤ ＩＩ、ポンペ病、酸性マルターゼ欠損症）を有するか、またはアルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチドにおける欠損を有する対象を処置するための方法であって、先の項１～９５のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを前記対象に投与するステップを含む、方法。
９６．ＧＡＡポリペプチドが、対象の肝臓から分泌され、分泌されたＧＡＡの骨格筋組織、心筋組織、横隔膜筋組織、またはそれらの組合せによる取り込みがあり、前記分泌されたＧＡＡの取り込みが、前記組織中のリソソームグリコーゲン貯蔵の低減をもたらす、項９５に記載の方法。
９７．対象に投与するステップが、筋肉内、皮下、脊髄内、大槽内、髄腔内、静脈内の投与のいずれかから選択される、項９５～９６のいずれかに記載の方法。
９８．組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、項９５～９７のいずれかに記載の方法。
９９．組換えＡＡＶベクターが、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、項９５～９７のいずれかに記載の方法。
１００．組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、またはＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、項９５～９７のいずれかに記載の方法。
１０１．組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ８ベクターである、項１００に記載の方法。
１０２．リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を有する対象を処置するための方法であって、先の項のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶゲノムまたは核酸配列のいずれかを前記対象に投与するステップを含み、ＡＡＶベクターが、表５Ｂまたは表６Ｂにおける任意のポリペプチドから選択されるポリペプチドを発現する、方法。
１０３．リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が、表５Ａまたは表６Ａにリストされるもののいずれかから選択される、項１０２に記載の方法。
１０４．組換えＡＡＶベクターが、キメラＡＡＶベクター、ハプロイドＡＡＶベクター、ハイブリッドＡＡＶベクター、またはポリプロイドＡＡＶベクターである、項１０２に記載の方法。
１０５．組換えＡＡＶベクターが、合理的ハプロイドベクター、モザイクＡＡＶベクター、化学修飾ＡＡＶベクター、または任意のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである、項１０２に記載の方法。
１０６．組換えＡＡＶベクターが、ＡＡＶＸＬ３２ベクター、またはＡＡＶＸＬ３２．１ベクター、またはＡＡＶ８ベクター、または少なくとも１つのＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶ８ベクターである、項１０２に記載の方法。
１０７．項７４～９４のいずれかに記載の核酸配列を含む細胞。
１０８．ヒト細胞である、項１０７に記載の細胞。
１０９．非ヒト細胞の哺乳動物細胞である、項１０７～１０８のいずれかに記載の細胞。
１１０．昆虫細胞である、項１０７～１０９のいずれかに記載の細胞。
１１１．項１～７２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターを含む細胞。
１１２．項１～７２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターを含む宿主動物。
１１３．哺乳動物である、項１１２に記載の宿主動物。
１１４．非ヒト哺乳動物である、項１１２または１１３に記載の宿主動物。
１１５．ヒトである、項１１３に記載の宿主動物。
１１６．項９５～１０１のいずれかに記載の方法における使用のための項７３に記載の医薬組成物。
１１７．項１０７～１１１のいずれかに記載の細胞を含む宿主動物。
１１８．項１～７２のいずれかに記載の組換えＡＡＶベクターを含む宿主動物。
１１９．哺乳動物である、項１１８に記載の宿主動物。
１２０．非ヒト哺乳動物である、項１１８～１１９に記載の宿主動物。
１２１．ヒトである、項１１９に記載の宿主動物。
【実施例】
【0548】
以下の非限定的な実施例は、ここで企図される代表的な実施形態のより完全な理解を容易にするために、例示的な目的のためだけに提供される。これらの実施例は、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターが用いられ得るすべての可能な状況の単なるサブセットであることが意図される。したがって、これらの実施例は、ＡＡＶビリオンおよびｒＡＡＶベクターならびに／またはそれらの方法および使用に関連するものを含む本明細書に記載される実施形態のいずれかを限定するものと解釈されるべきではない。最終的に、ＡＡＶビリオンおよびベクターは、遺伝子送達が望まれる事実上任意の状況において用いられ得る。
（実施例１）
ｒＡＡＶゲノムの構築
（実施例１）
ｒＡＡＶゲノムの構築
【0549】
多数のｒＡＡＶゲノムを、ギブソンクローニング方法論を使用して構築した。以下のｒＡＡＶゲノムを作製した：ＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＥＵ（配列番号１５４）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５５）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５６）、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４２２＿ＥＵ（配列番号１５７）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４２２＿Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５８）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＷＴ－ｈＧＡＡ ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５９）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＳＰ＿ＷＴ－ｈＧＡＡ－ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１６０）、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））。一部のｒＡＡＶベクターはｗｔＧＡＡポリペプチドをコードする核酸配列を含むが、ｗｔＧＡＡを本明細書に開示される改変ＧＡＡ核酸配列をコードする核酸配列で容易に置き換えることができる。
【0550】
ギブソンクローニングは、核酸配列のブロック（例えば、３つのブロック）を一緒にクローニングすることを含む。一般的なプロトコールは、以下の通りである：以下の試薬（ｉ）Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、緩衝液）、（ｉｉ）１５～２５ｂｐの相同末端を有するＤＮＡインサート（ブロック１～３）（図６を参照されたい）、（ｉｉｉ）最も外側のＤＮＡインサートに１５～２５ｂｐの相同末端を有する線状化ＤＮＡ骨格（図６を参照されたい）を単一管反応に組み合わせる。反応物を、５０℃で１５～６０分間インキュベートする。反応混合物を、コンピテント細胞に形質転換し、カナマイシン寒天プレート上に蒔く。完全にアセンブリーされたプラスミドＤＮＡのミニプレップを、制限酵素消化および／またはコロニーＰＣＲ分析を介してスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定分析によって検証する。検証されたクローンを、マキシプレップ生成のために拡大増殖させ、アデノウイルスヘルパー、ＸＸ６８０ Ｋａｎ、および適切なＲｅｐ／Ｃａｐヘルパーと一緒にｒＡＡＶ産生細胞系に一過性トランスフェクトして、ｒＡＡＶを生成する。図６は、例示的なｒＡＡＶゲノムを作製するためのクローニング核ブロックを示す。
【0551】
図７～９は、ｗｔＧＡＡ（Δ１～６９）が例示的なＧＡＡ酵素であることを示すが、この核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでの増強された発現のため、および／もしくは免疫応答を低減するように、および／もしくはＣｐＧアイランドを低減するようにコドン最適化されているか、ならびに／またはＨ２０１Ｌ改変を有するＧＡＡをコードする核酸配列で当業者によって容易に置き換えることができる。したがって、図９Ａ～９Ｅは、野生型ＧＡＡ（ｗｔＧＡＡ）を有する例示的な構築物を示すが、ｗｔＧＡＡをコードする核酸を本明細書に開示される改変ＧＡＡ核酸配列をコードする核酸配列、例えば、配列番号１８２で容易に置き換えることができる。図７～８に例示されたクローニングブロックに示されるものは、ＩＧＦ２（Ｖ４３Ｍ）またはＩＧＦΔ２～７標的化ペプチドをコードする核酸配列の３’、およびＧＡＡ酵素をコードする核酸の５’に位置する３アミノ酸（３ａａ）のスペーサー核酸配列、ならびにポリＡ配列の３’および３’ＩＴＲ配列の５’に位置するスタッファー核酸配列のスタッファー配列（図７～８において「スペーサー」配列と称される）のｒＡＡＶゲノムの作製である。
（実施例２）
ｒＡＡＶベクターの作製
（実施例２）
ｒＡＡＶベクターの作製
【0552】
ｒＡＡＶゲノムを、ｒＡＡＶ産生細胞系を使用して、カプシドにパッケージングして、ｒＡＡＶベクターを作製した。ｒＡＡＶベクター構築の原理の証明のためにのみ、使用したカプシドはＡＡＶ３ｂカプシドであった。
【0553】
ｒＡＡＶ産生細胞系におけるｒＡＡＶの作製：三重トランスフェクション技法を使用して、懸濁ｒＡＡＶ産生細胞株においてｒＡＡＶを作製し、これは臨床グレードのベクターを作製するためにスケールアップすることができる。あるいは、異なるプラスミド、例えば、１）ｐＸＸ６８０－ａｄヘルパー、ならびに２）ｐＸＲ３ ＲｅｐおよびＣａｐ、ならびに３）導入遺伝子プラスミド（ＩＴＲ－導入遺伝子－ＩＴＲ）を使用することができる。
【0554】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，４４１，２０６号に記載される方法に従って、ｒＡＡＶ産生細胞系を使用して、実施例１で作製したｒＡＡＶゲノムを使用して、ｒＡＶＶベクターを作製する。特に、ｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶビリオンは、（ａ）ｒＡＡＶ産生細胞系にＡＡＶ発現系を提供するステップ；（ｂ）ＡＡＶ粒子が産生される条件下で細胞を培養するステップ；および（ｃ）必要に応じて、ＡＡＶ粒子を単離するステップを含む方法を使用して、産生される。プラスミドの三重トランスフェクションの比およびトランスフェクションカクテル体積は、ｒＡＡＶベクター産生のための最適のプラスミド比を決定するためにＸＸ６８０、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐヘルパー、およびＴＲプラスミドのプラスミド比を変えることによって最適化することができる。
【0555】
一部の例では、細胞は、ＡＡＶ粒子が産生される条件下、懸濁液中で培養される。別の実施形態では、細胞は、動物構成成分を含まない条件下で培養される。動物構成成分を含まない培地は、ｒＡＡＶ産生細胞系と適合する任意の動物構成成分を含まない培地（例えば、無血清培地）であり得る。例としては、限定されないが、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ－２９３（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｅｘ－Ｃｅｌｌ ２９３（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＣ－ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＰｒｏ２９３－Ｓ（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。ＡＡＶ粒子の複製およびパッケージングのために十分な条件は、例えば、本明細書に記載されるｒＡＡＶゲノムの複製、およびＡＡＶカプシドへのカプシド形成のために十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）、ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。
【0556】
プラスミド骨格由来の細菌ＤＮＡ配列は、ＴＬＲ９とのその相互作用により自然免疫系の活性化をもたらす組換えＡＡＶベクターの製造の間に、ＡＡＶカプシドにパッケージングされ得る（Akira, 2006；Chadeuf, 2005；Wright, 2014）。さまざまな技術を使用して、組換えＡＡＶ調製物中のプラスミド骨格配列、例えば、スケーラビリティを制限するミニサークルを排除することができる（Schnodt, 2016）。プラスミド骨格において細菌ＤＮＡ配列を回避するための別の方法は、閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡを使用することであり、これは、限定されるものではないが、組換えＡＡＶベクターの特異的製造のためのイヌの骨型ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を含むある範囲のＤＮＡ複製技術を含む。ｄｂＤＮＡ（商標）などの閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡを使用することは、細菌骨格を排除し、ワクチンおよびレンチウイルスを生成するために使用されており（Walters et al, 2014；Scott et al, 2015；Karda et al, 2019）、ＤＮＡワクチン開発者によりＴＬＲ９応答を引き起こすことができないことが示された。
【0557】
したがって、代替の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物における使用のためのｒＡＡＶベクターの作製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国出願第２０１８／００３７９４３号およびKarbowniczek et al., Bioinsights, 2017に開示されるように、限定されるものではないが、イヌの骨型技術（ｄｂＤＮＡ（商標））を含む閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡを使用して行うことができる。簡潔には、閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡ技術を使用するＡＡＶ産生のためのプラスミドは、ＩＴＲ、プロモーター、および５６ｂｐのパリンドロームプロテロメラーゼ認識配列に隣接している目的の遺伝子、例えば、本明細書に開示されるＧＡＡを含むことができる。プラスミドは変性され、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよび適切なプライマーの存在下、Ｐｈｉ２９はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を開始し、元の構築物の二本鎖鎖状体（cancatameric）反復を作出する。プロテロメラーゼが添加されると、パリンドロームプロテロメラーゼ認識配列の結合が起こり、開裂－接合反応が起こって、単量体の二本鎖（ｄｓ）の線状の共有結合的に閉鎖されたＤＮＡ構築物をもたらす。一般的な制限酵素の添加は、望ましくないＤＮＡプラスミド骨格配列およびエキソヌクレアーゼ活性による消化を除去し、サイズ分画して、ＩＴＲ、プロモーター、および目的の遺伝子をコードするｄｂＤＮＡ配列を単離することができるｄｂＤＮＡをもたらす。ｄｂＤＮＡ（商標）技術などの閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡを使用するｒＡＡＶベクターの作製のための例示的なプラスミドは、以下の５’から３’への方向で、５’－プロテロメラーゼＲＳ、５’ＩＴＲ、ＬＳＰプロモーター、ｈＧＡＡ、３’ＵＴＲ、ｈＧＨポリ（Ａ）、３’ＩＴＲ、３’－プロテロメラーゼＲＳ（センス鎖）を含み、センス鎖は、鎖（ｄｓ）の線状の共有結合的に閉鎖されたＤＮＡ構築物に対する相補的アンチセンス鎖に連結されている。本明細書に開示される方法および組成物における使用のためのＡＡＶベクターの製造のための出発材料としての閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡ、例えば、イヌの骨型ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））の使用は、産物に対してＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）応答を引き起こすことができないＡＡＶベクターを含有するプラスミドを増殖させるために使用される細菌骨格を排除する。製造のための閉鎖末端の線状二重鎖ＤＮＡ技術の使用は、ポンペ病を有する患者における１．６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で観察される肝臓酵素の上昇についての危険性をさらに低減する。
（実施例３）
ｒＡＡＶベクターの評価
（実施例３）
ｒＡＡＶベクターの評価
【0558】
全血クリアランス。図１は、３×１０１２ｖｇ／ｋｇの異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３ＳＴ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）を３ｋｇの血清反応陰性の雄マカクに静脈内注射した実験に由来する結果を示す。マカクを、異なるＡＡＶ血清型の投与の６０日後に安楽死させた。ベクターゲノムを全血において検索し、結果は、ＡＡＶ３ｂは、１週間以内に除去され、犠牲時に検出不可であったが、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、マカクが犠牲にされた時に全血中でまだ検出可能であったことを示した。
【0559】
肝臓特異的ベクター効力：図２は、３×１０１２ｖｇ／ｋｇの異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３ＳＴ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）を３ｋｇの血清反応陰性の雄マカクに静脈内注射した実験に由来する結果を示す。マカクを、異なるＡＡＶ血清型の投与の６０日後に安楽死させた。ベクターゲノムを、マカクのそれぞれからの３つの肝葉のそれぞれにおいて定量化した。定量限界は、０．００２ｖｇ／ｄｇであった。図２に提示された結果に基づいて、ＡＡＶ３ｂは、強力な肝臓ベクターであることが見出された。ＡＡＶ３ｂは、ＡＡＶ８よりも肝臓特異的であり、ＡＡＶ９よりも迅速に血液から除去される。ＡＡＶ３ＳＴ変異体は、任意の有意な有益な効果を提供しなかった。
（実施例４）
上清へのＧＡＡの分泌の測定およびＧＡＡ取り込みアッセイ
（実施例４）
上清へのＧＡＡの分泌の測定およびＧＡＡ取り込みアッセイ
【0560】
上清におけるＧＡＡの測定。
【0561】
したがって、実施例１において作製されたｒＡＡＶゲノムを、ＧＡＡポリペプチドの上清への分泌について試験する。上清におけるＧＡＡの測定を、Kikuchi et al.（Kikuchi, Tateki, et al. "Clinical and metabolic correction of Pompe disease by enzyme therapy in acid maltase-deficient quail." The Journal of clinical investigation 101.4 (1998): 827-833.）に記載されるようにして、４－メチル－ウンベリフェリル－アルファ－Ｄ－グルコシド（４－ＭＵ）基質を使用して評価することができる（４－ＭＵアッセイ）。
【0562】
簡潔には、ｒＡＡＶ産生細胞系を、ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＥＵ（配列番号１５４）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５５）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５６）、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４２２＿ＥＵ（配列番号１５７）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４２２＿Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５８）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＷＴ－ｈＧＡＡ ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５９）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＳＰ＿ＷＴ－ｈＧＡＡ－ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１６０）、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））でトランスフェクトすることができる。ＧＡＡ活性を、２４時間にわたって、初期活性（ｔ＝０）の％に基づいて測定する。試料を、０、３、６、および２４時間に、蛍光発生基質である４－ＭＵ－α－グルコースの加水分解に基づいて、ＧＡＡ酵素活性についてアッセイした。ＧＡＡ活性を、初期活性の％、すなわち、残存活性として表した。
【0563】
あるいは、回収後、培養上清を、ＨＩＣクロマトグラフィーによって部分的に精製した。すべての試料を、電気泳動前にＰＮＧａｓｅで処理した。細胞によるＧＡＡポリペプチドの発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび免疫ブロットを使用して評価することができる。
【0564】
ＧＡＡ取り込みアッセイおよび組織におけるＧＡＡの取り込みの測定。
【0565】
次に、実施例１および２において作製されたｒＡＡＶゲノムを、細胞への取り込み活性の保持について試験する。例えば、ｒＡＡＶ産生細胞系を、ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＥＵ（配列番号１５４）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５５）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５６）、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４２２＿ＥＵ（配列番号１５７）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４２２＿Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５８）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＷＴ－ｈＧＡＡ ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５９）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＳＰ＿ＷＴ－ｈＧＡＡ－ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１６０）、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））でトランスフェクトすることができる。
【0566】
哺乳動物細胞へのｒｈＧＡＡの取り込みを評価し得る４－ＭＵアッセイ（上記に記載の通り）は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許出願のＵＳ２００９／０１１７０９１Ａ１に記載されている。実施例１および２において作製されたｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶゲノムを、１２３ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．０を１０ｍＭの４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－グルコシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ－９７６６）とともに含有する２０μｌの反応混合物中でインキュベートする。反応物を、３７℃で１時間インキュベートし、２６７ｍＭの炭酸ナトリウム、４２７ｍＭのグリシンを含有する２００μｌの緩衝液、ｐＨ１０．７で停止した。蛍光を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて３５５ｎｍの励起および４６０ｎｍのフィルターで測定し、４－メチルウンベリフェロン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ１３８１）に由来する標準曲線と比較した。１ ＧＡＡ ４ ＭＵ単位は、１ナノモルの４－メチルウンベリフェロン加水分解／時間として定義される。線維芽細胞における例示的なｒＡＡＶゲノム、例えば、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＥＵ（配列番号１５４）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２ＷＴ－ｈＧＡＡ＿ＡｓｋＢｉｏ＿ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５５）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４１２Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５６）、ＡＡＶ＿ＬＶＲ４２２＿ＥＵ（配列番号１５７）、ＡＡＶ－ＬＶＲ４２２＿Ｓｔｕｆｆｅｒ（配列番号１５８）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＶＲ４１２＿ＷＴ－ｈＧＡＡ ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１５９）、ｓｓＡＡＶ＿ＬＳＰ＿ＷＴ－ｈＧＡＡ－ＣＨＡＴＨＡＭ（配列番号１６０）、配列番号５７（ＡＡＴ－Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５８（ｒａｔＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号５９（ｈＦＮ１－ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９ａａ））；配列番号６０（ＡＡＴ－ＩＧＦ２Δ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６１（ＦＮ１ｒａｔ－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））；配列番号６２（ｈＦＮ１－ＩＧＦΔ２～７－ｗｔＧＡＡ（デルタ１～６９））の特異的活性を評価する。ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドの酵素活性を評価し、ＧＡＡ（ｗｔＧＡＡ）ポリペプチドそれ自身（すなわち、異種シグナルペプチドまたはＩＧＦ２標的化ペプチドなし）と比較する。
【0567】
細胞に基づく取り込みアッセイを、ＩＧＦ２タグ化ＧＡＡまたは非タグ化ＧＡＡの標的細胞に入る能力を実証するために行うこともできる。ラットＬ６筋芽細胞を、取り込みの２４時間前に、２４ウェルプレートにおいて、１ウェルあたり１×１０５個の細胞の密度で蒔く。実験の開始時に、培地を細胞から除去し、実施例１および２において作製されたｒＡＡＶベクターを含有する０．５ｍｌの取り込み培地で置き換える。取り込みの特異性を実証するために、一部のウェルは、競合剤のＭ６Ｐ（５ｍＭの最終濃度）および／またはＩＧＦ２（１８μｇ／ｍｌの最終濃度）を追加で含有していた。１８時間後、培地を細胞から吸引し、細胞をＰＢＳで４回洗浄する。次いで、細胞を２００μｌのＣｅｌＬｙｔｉｃ ＭＴＭ溶解緩衝液で溶解する。溶解物を、４ ＭＵ基質を使用して、上記に記載されるようにして、ＧＡＡ活性についてアッセイする。タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイキットを使用して決定する。
【0568】
典型的な取り込み実験は、ＣＨＯ細胞において行われるが、他の細胞系および筋芽細胞細胞系を使用することができる。ＧＡＡポリペプチドのラットＬ６筋芽細胞への取り込みは、大過剰モル濃度のＭ６Ｐの添加によって実質的には影響を受けないと予想される一方、取り込みは、過剰のＩＧＦ２によって有意に消滅すると予想される。対照的に、ｗｔＧＡＡの取り込みは、過剰のＭ６Ｐの添加によって有意に消滅するが、ＩＧＦ２による競合によっては実質的に影響を受けないと予想される。加えて、ＩＧＦ２Ｖ４３Ｍ－ｗｔＧＡＡおよびＩＧＦデルタ２～７ｗｔＧＡＡの取り込みは、過剰のＩＧＦ２によって有意に影響を受けないと予想される。
（実施例５）
ラットＬ６筋芽細胞におけるＧＡＡの半減期
（実施例５）
ラットＬ６筋芽細胞におけるＧＡＡの半減期
【0569】
取り込み実験を、ラットＬ６筋芽細胞において、実施例１および２において生成されたｒＡＡＶベクターを用いて、上記に記載されるようにして（実施例３および４を参照されたい）、行った。１８時間後、ｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞から培地を吸引し、細胞をＰＢＳで４回洗浄した。この時点で、二連のウェルを溶解し（時間０）、溶解物を－８０℃で凍結させた。その後それぞれの日に、二連のウェルを溶解し、分析のために保管した。１４日後、溶解物のすべてを、ＧＡＡ活性についてアッセイして、半減期を評価し、および細胞の内部の時点で、ＩＧＦ２タグ化ＧＡＡ酵素が非タグ化ＧＡＡと類似する動力学で持続しているかを評価した。
（実施例６）
取り込み後のＧＡＡのプロセシング
（実施例６）
取り込み後のＧＡＡのプロセシング
【0570】
哺乳動物ＧＡＡは、典型的には、Moreland et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:6780-6791およびそこに含有される参照文献によって記載されるように、リソソームにおいて逐次的なタンパク質分解プロセシングを受ける。プロセシングされたタンパク質は、７０ｋＤａ、２０ｋＤａ、１０ｋＤａのペプチド、およびいくつかのより小さいペプチドのパターンを生じさせる。ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドが、非タグ化ＧＡＡと類似してプロセシングされるかどうかを決定するために、上記の取り込み実験からの溶解物のアリコートを、７０ｋＤａのＩＧＦ２ペプチドおよびＩＧＦ２タグを有するより大きな中間体を認識するモノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。この実験において特定されたポリペプチドの類似のプロファイルは、細胞に入ると、ＩＧＦ２標的化ペプチドが失われ、ＩＧＦ２－ＧＡＡポリペプチドが、非タグ化ＧＡＡと類似してプロセシングされることを示し、これは、ＩＧＦ２標的化ペプチドが、細胞の内部にある時に、ＧＡＡの挙動に対してほとんどまたは全く影響を与えないことを実証する。
（実姉例７）
薬物動態
（実姉例７）
薬物動態
【0571】
ｒＡＡＶベクターによって産生されたＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドの薬物動態を、野生型１２９マウスにおいて測定することができる。１２９マウスに、実施例１および２において作製されたｒＡＡＶベクターを注射する。血清試料を、注射前、ならびに注射の１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後、４時間後および８時間後に採取する。次いで、動物を犠牲にする。血清試料を、定量的ウエスタンブロットによってアッセイする。ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドまたはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドを発現するｒＡＡＶベクター由来のＧＡＡについての半減期を、ＩＧＦ２融合ＧＡＡポリペプチドが、過度に迅速に循環から除去されるかを決定するために評価する。
（実施例８）
ＧＡＡの組織半減期
（実施例８）
ＧＡＡの組織半減期
【0572】
この実験の目的は、ｒＡＡＶベクターから発現したＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドまたはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドが、その標的組織に到達したら、ＧＡＡ活性が失われる速度を決定することであった。ポンペマウスモデルにおいて、ＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）は、さまざまな筋肉組織において約６～７日の組織半減期を有すると思われる（Application Number 125141/0 to the Center for Drug Evaluation and Research and Center for Biologics Evaluation and Research, Pharmacology Reviews）。
【0573】
ポンペマウス（Raben (1998) JBC, 273:19086-19092に記載されるポンペマウスモデル６ｎｅｏ／６ｎｅｏ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に、実施例１および２において作製されたｒＡＡＶベクターを頸静脈に注射する。次いで、マウスを、注射の１日後、５日後、１０日後、および１５日後に犠牲にする。組織試料を、標準的な手順に従って、均質化し、ＧＡＡ活性を測定した。ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドならびに非タグ化ＧＡＡからのＧＡＡ活性の組織半減期を、異なる組織（例えば、四頭筋組織；心臓組織；横隔膜組織；および肝臓組織）における減衰曲線から計算し、それぞれの組織における半減期を計算する。これを、ポンペマウスの細胞の内部の時点で、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターから発現したＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドが、非タグ化ＧＡＡと類似する動力学で持続するように見えるかを決定するために、ラットＬ６筋芽細胞における半減期と比較することができる。さらにまた、ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドの減衰動力学の知識は、適切な投薬間隔の設計を助けることができる。
（実施例９）
ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドのＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のリソソームへの取り込み
（実施例９）
ＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドのＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞のリソソームへの取り込み
【0574】
ポリリシンでコーティングされたスライド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で成長したＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を、実施例１および２において生成されたｒＡＡＶベクターで形質導入する。次いで、細胞を洗浄した後、細胞を１時間成長培地中でインキュベートし、次いで、Ｄ－ＰＢＳで４回洗浄した後、室温で１５分間メタノールで固定する。以下のインキュベーションは、すべて室温であり、Ｄ－ＰＢＳ中での３回の洗浄によってそれぞれ分けられた。スライドを、０．１％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１５分間透過処理し、次いで、ブロッキング緩衝液（Ｄ－ＰＢＳ中に１０％の熱失活ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でブロッキングする。スライドを、一次マウスモノクローナル抗ＧＡＡ抗体３Ａ６－１Ｆ２（ブロッキング緩衝液中１：５，０００）とともに、次いで、二次ウサギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ５９４コンジュゲート抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０３２、ブロッキング緩衝液中１：２００）とともにインキュベートする。ＦＩＴＣコンジュゲートラット抗マウスＬＡＭＰ－１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５３７９３、ブロッキング緩衝液中１：５０）をインキュベートする。スライドを、ＤＡＰＩを含有するマウンティング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントし、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、およびＤＡＰＩフィルター（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡で調査する。画像を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）によって制御された測光Ｃａｓｃａｄｅカメラでキャプチャーし、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ）を使用して統合することができる。抗ＧＡＡ抗体によって検出されたシグナルの、リソソームマーカーのＬＡＭＰ１に対する抗体によって検出されたシグナルとの共局在化を評価して、ＩＧＦ２タグ化ＧＡＡがリソソームに送達されることを実証することができる。
（実施例１０）
ポンペマウスモデルにおけるｒＡＡＶベクターの処置およびポンペ病理学の逆転の評価
（実施例１０）
ポンペマウスモデルにおけるｒＡＡＶベクターの処置およびポンペ病理学の逆転の評価
【0575】
実施例１において作製されたｒＡＡＶベクターを、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPeng et al.,. "Reveglucosidase alfa (BMN 701), an IGF2-Tagged rhAcid α-Glucosidase, Improves Respiratory Functional Parameters in a Murine Model of Pompe Disease." Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 360.2 (2017): 313-323)に記載された方法に従って、ポンペマウスモデルにおいて評価することができる。
【0576】
任意のポンペマウスモデルを使用して、ポンペ病の処置におけるｒＡＡＶベクターの効果を評価することができる。１つのポンペマウスモデルは、破壊ＧＡＡマウスモデルを記載しているRaben et al., JBC, 1998; 273(30); 19086-19092に記載されており、疾患の小児型および成人型の両方の重要な特色を再現する。他の例では、ポンペマウスモデル（Sidman et al., 2008）を使用することができるだけでなく、破壊された酸性αグルコシダーゼ遺伝子を有するマウスの系統（Ｂ６；１２９－ＧＡＡｔｍ１Ｒａｂｎ／Ｊ；Ｐｏｍｐｅ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を使用することができる。ポンペマウスは、ヒト成人ポンペ病と同じ細胞特徴および臨床的特徴を発生する（Raben et al., 1998）。動物は、１２時間の明／暗周期で維持され、新鮮な水および標準的なげっ歯類用飼料を自由に提供される。
【0577】
４．５～５か月齢のポンペマウスに、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを投与し、投与後に４週間またはそれより長い間、グリコーゲンクリアランスについて評価することができる。肉眼評価の後、心臓（左室）、四頭筋、横隔膜、腰筋、およびヒラメ筋を収集し、秤量し、液体窒素中で瞬間凍結させ、－６０～－９０℃で保管した後、グリコーゲンに由来するグルコースの定量分析を行った。筋肉を、セラミックスフェアを使用して、氷上で、緩衝液（０．２ＭのＮａＯＡｃ／０．５％のＮＰ４０）中で均質化した。アミログルコシダーゼを、３７℃で澄明化された溶解物に添加して、ペルオキシダーゼ－グルコースオキシダーゼ酵素反応系（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、その後の比色定量検出（４３０ｎｍ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）のためにグリコーゲンをグルコースに消化した。対の試料を、アミログルコシダーゼなしでも測定して、回収時にグリコーゲン型でなかった内因性組織グルコースについて補正する。グルコース値を、６点標準曲線から外挿した。測定されたグルコース濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、試料のグリコーゲン濃度に比例し、均質化ステップ（組織１グラムあたり５μｌの緩衝液を添加）のために調整することによって、ｍｇグリコーゲン／ｇ組織に変換される。
【0578】
個々のマウス筋肉グリコーゲンレベルに対する本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターの効果を、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ｃｌａｓｓｉｃ ＰＤモデリング（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｂｕｉｌｄバージョン６．４；Ｃｅｒｔａｒａ，Ｌ．Ｐ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を使用して評価することができる。結果を、心臓、横隔膜、四頭筋、腰筋、およびヒラメ筋におけるｈＧＡＡについて、得ることができる。薬物動態学的分析のために、ＷＴマウスに、実施例１において作製されたｒＡＡＶベクターを投与し、血液試料を、投薬前、投薬の０．０８３時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、および４時間後に、末端心穿刺として収集することができる。血漿ｈＧＡＡ濃度を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＯＱを用いるブリッジング電気化学発光方法を使用して定量化することができる。簡潔には、０．５μｇ／ｍｌのルテニウム標識抗ｒｈＧＡＡ（アフィニティ精製されたヤギポリクローナル）および０．５μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ＩＧＦ２（ＭＡＢ７９２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、緩衝液［Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ］で１：１０に希釈されたＫ２ＥＤＴＡ血漿試料と合わせ、１時間インキュベートした後、ブロッキングされたストレプトアビジンアッセイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に移すことができる。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し、１×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加し、電気化学発光シグナルを、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において読み取った。ｈＧＡＡ濃度を標準曲線から外挿することができる。
【0579】
あるいは、心臓および横隔膜の組織ホモジネートを回収し、ｒｈＧＡＡ活性を蛍光発生基質（４－ＭＵＧ）を使用して測定することができる。
【0580】
本明細書の実施例１および２において作製されたｒＡＡＶベクターを使用して産生したＧＡＡポリペプチドの治療効果を、ｉｎ ｖｉｖｏで、ｗｔ ＧＡＡと比較することができる。研究を行って、実施例１に開示されるｒＡＡＶベクターの能力を、ポンペマウスにおいて骨格筋組織からグリコーゲンを除去するための非タグ化ｗｔ ＧＡＡを発現するものと比較することができる（例えば、ポンペマウスモデル６ｎｅｏ／６ｎｅｏ動物を使用した（Raben (1998) JBC 273:19086-19092））。ポンペマウスの群（５頭／群）は、ｗｔ ＧＡＡもしくは実施例１において作製されたｒＡＡＶベクターの２用量の１つ、または媒体のＩＶ注射を受けた。５頭の未処置動物を、対照として使用し、生理食塩水溶液の毎週の注射を４回受けることができる。動物は、２、３および４回目の注射の１時間前に、経口ジフェンヒドラミン（diphenhydromine）５ｍｇ／ｋｇを受ける。マウスを注射の１週間後に犠牲にし、組織（横隔膜、心臓、肺、肝臓、ヒラメ筋、四頭筋、腓腹筋、ＴＡ、ＥＤＬ、舌）を、組織学的分析および生化学的分析のために回収する。組織ホモジネート中のグリコーゲン含有量を、Ａ．ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキットを使用して測定し、ＧＡＡ酵素レベルを、標準的な手順を使用して、異なる組織ホモジネートにおいて評価することができる。
【0581】
組織ホモジネート中のグリコーゲン含有量を、Zhu et al. (2005) Biochem J., 389:619-628によって本質的に記載されるようにして、Ａ．ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定することができる。
【0582】
本明細書に記載され、実施例１および２の方法によって生成されたｒＡＡＶベクターｓｓ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ ｒＡＡＶは、ＩＧＦ２－ＧＡＡ ｒＡＡＶ（すなわち、分泌シグナル配列なし）と比較して、ポンペマウスモデルにおいて、より高い分泌とそれに続く筋肉への取り込み、およびより大きい治療効果を有すると予想され、これは、ｗｔＧＡＡ ｒＡＡＶベクター（すなわち、異種分泌シグナルおよびＩＧＦ２標的化ペプチドのいずれもなし）および／またはＭＹＯＺＹＭＥ（登録商標）より大きいと予想される。例えば、Ｈ２０１Ｌ変異を有するＧＡＡを含む、本明細書に開示される改変ＧＡＡを含むｒＡＡＶベクターは、未改変ＧＡＡ、例えば、ｗｔＧＡＡを含むｒＡＡＶよりもポンペマウスモデルにおいて治療的により有効であるとさらに予想される。確立されたポンペモデルを考えると、これらの結果は、臨床に翻訳され、ポンペ病の処置のための治療効果と相関すると予想される。
（実施例１１）
ｉｎ ｖｉｖｏでのグリコーゲンのクリアランス
（実施例１１）
ｉｎ ｖｉｖｏでのグリコーゲンのクリアランス
【0583】
この実験の目的は、実施例１および２において生成されたＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドを発現するｒＡＡＶベクターの単回注射の後にポンペマウスの心臓組織からグリコーゲンが除去される速度を決定することである。
【0584】
ポンペマウス（Raben (1998) JBC, 273:19086-19092に記載されるポンペマウスモデル６ｎｅｏ／６ｎｅｏ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に、実施例１および２において生成されたものを発現するｒＡＡＶベクターを頸静脈に注射する。マウスを、注射の１日後、５日後、１０日後、および１５日後に犠牲にした。心臓組織試料を、標準的な手順に従って均質化し、グリコーゲン含有量について分析する。これらの組織ホモジネート中のグリコーゲン含有量を、Zhu et al. (2005) Biochem J., 389:619-628によって本質的に記載されるようにして、Ａ．ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して測定する。マウス由来の心臓組織の評価は、グリコーゲン含有量の小さな変化のみが最小のクリアランスを示すであろう、本明細書に記載されるＩＧＦ２標的化ペプチドおよび／またはＳＳにＧＡＡが融合されていないｒＡＡＶを投与されたマウスと比較して、実施例１および２において生成されたＩＧＦ２－ＧＡＡ融合ポリペプチドおよび／またはＳＳ－ＩＧＦ２－ＧＡＡ二重融合ポリペプチドを発現するｒＡＡＶベクターを投与されたマウスにおいて、グリコーゲンのほぼ完全なクリアランスがあるかを決定することができる。
（実施例１２）
例示的な肝臓特異的プロモーター
（実施例１２）
例示的な肝臓特異的プロモーター
【0585】
本明細書の表４から選択されるか、または本明細書の表４に開示されるものから選択される例示的な肝臓特異的プロモーターを、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングし、続いてＳＶ４０後期ポリＡシグナルを、ｐＵＣ１９と本質的に同一の性質を有する骨格を有するベクターにクローニングした。特に、プロモーターＳＰ０４１２およびＳＰ０４２２を評価する実験は、ｒＡＡＶの作製のために構築物にクローニングした。プラスミドのＤＮＡ調製物を、Ｈｕｈ７（肝細胞癌細胞系）、ＨｅＬａ（子宮頸がんに由来する不死化細胞系）またはＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓細胞）のいずれかにトランスフェクトして、転写活性を評価した。Ｈｕｈ－７細胞はＪＣＲＢ細胞バンク（ＪＣＲＢ０４０３）から供給され、ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３はＥＣＡＣＣ細胞バンクから供給された。すべての細胞系は、細胞バンクの推奨に従って、成長および維持した。
【0586】
トランスフェクションを、４８ウェルプレートにおいて、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ２３１１）を使用して、１：１．１のＤＮＡ：ＦｕＧｅｎｅ ＨＤの比で、三連で行った。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの２４時間後に測定した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１００μｌのＰａｓｓｉｖｅ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ１９４Ａ）に溶解し、－８０℃で終夜保管した。ルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １０００アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ 番号Ｅ４５５０）を使用して、製造者のガイドラインに従って、１０μｌの溶解物中で、９６ウェル平底白色マイクロプレートのＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 番号２３６１０５）を使用して定量化し、発光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）機器において定量化した。
【0587】
上記のルシフェラーゼ方法は、当技術分野において通常のものであり、類似の技法が、文献、例えば、Alam and Cook, "Reporter Genes: Application to the Study of Mammalian Gene Transcription", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 188,245-254 (1990)に広範囲にわたって記載されている。
【0588】
データ
【0589】
使用される例示的な肝臓特異的プロモーターの配列を、本明細書の表４に示す。これらの合成肝臓特異的プロモーターの肝臓細胞中で発現を駆動する能力を、遍在性のＣＭＶ＿ＩＥおよびＣＢＡプロモーターに対して、また公知の肝臓特異的プロモーターＬＰ１に対して、基準に従って評価した。本発明による合成プロモーターはすべて、Ｈｕｈ７細胞において、ＬＰ１プロモーターよりも高い活性を示した（データは示さない）。これらのプロモーターを、非肝臓由来のＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞においてカウンタースクリーニングした場合、それらは、遍在的に活性なプロモーターのＣＭＶ＿ＩＥおよびＣＢＡと比較して、ごくわずかな活性を示した（データは示さない）。
【0590】
肝臓特異的プロモーター（すなわち、表４に提示されたすべてのプロモーター）の活性も、本質的に上記に記載される材料および方法を使用して、Ｈｕｈ７細胞において試験した。しかしながら、この場合では、肝臓特異的プロモーターの活性は、ＴＢＧがＬＰ１よりも高く、より一貫したｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を有することが見出されていたので、プロモーターＴＢＧ（配列番号４３５）の活性と比較した。ＴＢＧが、極めて強力な肝臓特異的プロモーターであり、したがって、ＴＢＧよりも低い発現を示すプロモーターは、依然として、極めて有用であり得ることに留意すべきである。特に、ＴＢＧよりも短いが、依然として高レベルの活性（例えば、配列番号４３５のＴＢＧの活性の１５％、より好ましくは、２５％、５０％もしくは７５％、またはそれよりも高い）を実証する、表４に開示される肝臓特異的プロモーターまたはそれらの機能的バリアントは、特に興味深い。
【0591】
肝臓細胞に対する肝臓特異的プロモーターの特異性も、実施例２に記載される材料および方法を使用して、非肝臓ＨＥＫ２９３細胞を使用して試験した。肝臓特異的プロモーターの活性を、ＣＭＶ－ＩＥ（配列番号４３３）の活性と比較して表す（ＴＢＧおよびＬＰ１は肝臓特異的であり、したがって、ＨＥＫ２９３細胞において特に活性ではない）。ＨＥＫ２９３細胞において試験された肝臓特異的プロモーターの特異性を示すグラフにおける「相対活性」は、ＣＭＶ－ＩＥの活性に対する比として表される名付けられたプロモーターの活性であり、１は、ＣＭＶ－ＩＥプロモーター（配列番号４３３）と同じ活性であり、１より高いのは、ＣＭＶ－ＩＥと比較してより高い活性であり、１より低いのは、配列番号４３３のＣＭＶ－ＩＥプロモーターと比較してより低い活性である。
（実施例１３）
ｉｎ ｖｉｖｏでの例示的な肝臓特異的プロモーターからの発現
（実施例１３）
ｉｎ ｖｉｖｏでの例示的な肝臓特異的プロモーターからの発現
【0592】
ある特定の肝臓特異的プロモーターを、ｉｎ ｖｉｖｏでの評価のために、例示的な肝臓特異的プロモーターとして選択した。特に、ミニマルプロモーターのＣＲＭ＿ＳＰ０２３９（配列番号８７）およびＣＲＭ＿ＳＰ０４１２（配列番号８６）、ならびに合成肝臓特異的プロモーターのＳＰ０２３９（配列番号９３）、ＳＰ０４１２（配列番号９１）およびＳＰ０４２２（配列番号９２）を、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した（図１０および図１３Ａ～１３Ｂを参照されたい）。
【0593】
ＡＡＶ産生：
本発明によるプロモーターのサブセットの活性をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。この研究に含まれる合成プロモーターは、ＳＰ０２３９、ＳＰ０２４４、ＳＰ０４１２、および陽性対照のＬＰ１であった。使用されるレポーター遺伝子は、ｆＬＵＣ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰ、すなわち、Ｔ２Ａシグナル（二方向自己切断ペプチド）を介してｍＥＧＦＰ（変異型緑色蛍光タンパク質）に融合されたｆＬＵＣ（ホタルルシフェラーゼ）であった。ｐＡＡＶ＿ＳＹＮＰ＿Ｌｕｃ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰデスティネーションベクターは、ＺｓＧｒｅｅｎ１レポーターがＬｕｃ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰデュアルレポーターによって置き換えられたｐＡＡＶ ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）に由来する。すべてのＤＮＡプラスミドは、製造者の説明書に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ番号１２１８１、ドイツ）を使用して調製した。
本発明によるプロモーターのサブセットの活性をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。この研究に含まれる合成プロモーターは、ＳＰ０２３９、ＳＰ０２４４、ＳＰ０４１２、および陽性対照のＬＰ１であった。使用されるレポーター遺伝子は、ｆＬＵＣ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＰ、すなわち、Ｔ２Ａシグナル（二方向自己切断ペプチド）を介してｍＥＧＦＰ（変異型緑色蛍光タンパク質）に融合されたｆＬＵＣ（ホタルルシフェラーゼ）であった。ｐＡＡＶ＿ＳＹＮＰ＿Ｌｕｃ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰデスティネーションベクターは、ＺｓＧｒｅｅｎ１レポーターがＬｕｃ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰデュアルレポーターによって置き換えられたｐＡＡＶ ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）に由来する。すべてのＤＮＡプラスミドは、製造者の説明書に従って、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ番号１２１８１、ドイツ）を使用して調製した。
【0594】
ｒＡＡＶ産生細胞系を、培養ディッシュにおいて培養し、組織培養物を、ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ番号Ｆ７５２４、英国）が補充されたＧｌｕｔａＭＡＸ補充（Ｇｉｂｃｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）番号６１９６５－０５９、英国）中、１４５ｍｍ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｌｔｄ 番号６３９１６０、英国）で処理し、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。細胞培養のための他の試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－英国から購入し、プラスチック製品はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【0595】
この研究で使用されたすべてのＡＡＶベクターを、ＡＡＶ９カプシドにシュードタイプ化した。ｒＡＡＶ産生細胞系を、レポーター遺伝子がウイルス増殖を可能にするヘルパー機能をコードするプラスミド（ｐＤＧ９）と並行して異なるプロモーターによって制御されたプラスミドで共トランスフェクトした。ｒＡＡＶ産生細胞系を、（１ｕｇ／ｕｌ）のストック濃度のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ番号７６４６０４、英国）を使用し、１：３のモル比（ＤＮＡ：ＰＥＩ）を使用して、トランスフェクトした。
【0596】
ＡＡＶの精製およびタイトレーション：
７２時間のトランスフェクション後、細胞を溶解し、粗溶解物を、濾過し、次いでＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ａ３６７３９）を含有するＨＰＬＣカラムによって、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（高速液体クロマトグラフィー－ＨＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、番号１１００１３１３））を使用して、精製した。
７２時間のトランスフェクション後、細胞を溶解し、粗溶解物を、濾過し、次いでＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ａ３６７３９）を含有するＨＰＬＣカラムによって、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（高速液体クロマトグラフィー－ＨＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、番号１１００１３１３））を使用して、精製した。
【0597】
ベクターゲノムの数を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３システムリアルタイムＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）において、Ｌｕｎａ（登録商標）汎用ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ番号Ｍ３００３、英国）の製造者の説明書に従って、フォワードプライマー（ＡＣＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＴＴＧＡＴＣ－配列番号４４５）、リバースプライマー（ＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＴＴＣＴＴＧ－配列番号４４６）およびプローブ（ＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧ－配列番号４４７）による、ＬＵＣカセットを標的とするｑＰＣＲタイトレーションによって決定し、データをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏの設計および分析ソフトウェアＶ１．４．１によって分析した。
【0598】
動物手順：
【0599】
非近交系の６週齢のＣＤ１雄マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ－英国から購入した。それらを、隔離所で１週間保ち、次いで、それらの閉鎖された換気ケージに移し、最小の疾患設備において維持した。それらを、５頭のマウス／ケージでケージに入れ、自由に食事および水を与えて、それらの体重に対して正規化した。新たに収容されたマウスは、任意の実験を行う前に、順応のためにさらに１週間与えられた。この研究は、法定の内務省の勧告；規制、倫理およびライセンス手順；ならびに動物（科学的手順）法１９８６の下で、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎの組織ガイドラインに従って、実施した。
【0600】
動物注射：
【0601】
ＡＡＶを、温かいチャンバー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）において、医療用空気（２１％の酸素）（Ａｂｂｏｔｔｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国）中に供給された２％～４％のイソフルランで麻酔された８週齢の若年成人雄ＣＤ１マウスに投与した。マウスに、インスリンシリンジ：２７ Ｇ １／２インチ、１．０ｍｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）を使用して、側尾静脈に、静脈内注射した。それぞれのマウスは、２００μｌの生理的食塩水溶液の最終体積で、マウス１頭あたり８Ｅ＋１０のＡＡＶウイルスゲノムのＡＡＶベクター用量で注射される。次いで、マウスを通常の温度に戻した後、それらのケージに戻した。
【0602】
生物発光イメージング
【0603】
マウスを、毎週の全身生物発光イメージングに付した。適切な場合には、マウスは、医療用空気（２１％の酸素）中に供給された２％～４％のイソフルランで麻酔され、インスリンシリンジ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国）を使用して、１５ｍｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｓｙｄ Ｌａｂｓ 番号ＭＢ０００１０２、米国）の３００μｌの腹腔内注射を受けた。Ｄ－ルシフェリンストックを生理的食塩水（Ｇｉｂｃｏ 番号１４１９０－０９４、英国）中で調製した。マウスを、１秒～１０秒の間、冷却された電荷結合素子カメラ（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ ｍａｃｈｉｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、英国）を使用して、５分後に画像化した。目的の領域（ＲＯＩ）を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅ ４．５．５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定し、１ステラジアンあたり１平方センチメートルあたり１秒あたりの光子（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）として表した。
【0604】
データ
【0605】
この研究の結果を図１０に示す。結果を、それぞれの群のすべての試験された動物について、ルシフェラーゼ生物発光強度の平均、全光束（１秒あたりの光子）として表す。エラーバーは、平均の標準誤差である。群「食塩水」（ｎ＝１０）では、動物は、食塩水のみを注射され、ルシフェラーゼ生物発光は検出されない。この群は、陰性対照であり、プロモーターに作動可能に連結されたルシフェラーゼが注射されない場合に、ルシフェラーゼ生物発光が検出されないことを示す。群「ＬＰ１」（ｎ＝９）では、動物は、ＬＰ１プロモーター（配列番号４３２）に作動可能に連結されたルシフェラーゼを注射され、ルシフェラーゼ生物発光が検出される。この群は、陽性対照であり、ルシフェラーゼが、ＬＰ１プロモーターの制御下で発現され、検出することができることを示す。
【0606】
本発明による肝臓特異的プロモーターの活性を試験するために、動物に、作動可能に連結された２つのプロモーター下のルシフェラーゼを含む構築物を注射した。群「ＳＰ０２４４」（ｎ＝８）では、ルシフェラーゼはＳＰ０２４４プロモーターに作動可能に連結されている。群「ＳＰ０２３９」（ｎ＝１０）では、ルシフェラーゼはＳＰ０２３９プロモーター（配列番号９３）に作動可能に連結されている。
【0607】
図１０から見ることができるように、発現は、汎用の肝臓特異的プロモーター「ＬＰ１」（配列番号４３２）よりも高い生物発光強度によって示されるように、プロモーター「ＳＰ０２４４」（配列番号３６６）および「ＳＰ０２３９」（配列番号９３）から最も高かった。したがって、プロモーターＳＰ０２４４およびＳＰ０２３９はｉｎ ｖｉｖｏで高い活性を示し、それらの活性はＬＰ１の活性よりも高い。
【0608】
図１３Ａおよび１３Ｂでは、ＧＡＡの発現が、Ｈｕｈ７細胞およびＨＥＰＨ２細胞において、細胞内に、異なるＬＳＰ；ＬＳＰ ＮＥＷ（配列番号１６０）；４１２ ＮＥＷ（配列番号１５９）；ＴＴＲ ＮＥＷ（配列番号１５５）；４１２－ＴＴＲ、４２２スタッファー（配列番号１５８）；４２２ ＴＴＲ；４１２スタッファー（配列番号１５６）を含む異なるｒＡＡＶベクターから検出され、ｈＧＡＡが、ＳＰ０４１２およびＳＰ０４２２プロモーターを使用して、著しいレベルでｒＡＡＶから発現され得ることを実証した。さらにまた、図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、上記のＡＡＶベクターのいずれかによるＧＡＡ発現は、汎用の肝臓特異的プロモーターを含むＡＡＶベクターからのＧＡＡの発現よりも有意に高い。重要なことには、図１３Ａおよび１３Ｂは、プロモーター４１２（配列番号９１）および４２２（配列番号９２）を含むｒＡＡＶベクターからのｈＧＡＡの発現が、図１３Ａおよび１３Ｂにおいて「ＬＳＰ ＳＳ」と称されるＬＰ１プロモーター（配列番号４３２）を含むｒＡＡＶからのｈＧＡＡ発現のレベルと比較して、Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２細胞において、高いｈＧＡＡの発現をもたらすことを示す。
【0609】
この実験は、実施例１２において得られたｉｎ ｖｉｔｒｏの結果が、ｉｎ ｖｉｖｏでの著しいＧＡＡタンパク質発現により達成することができることを実証、確認する。異なる強度を有する肝臓特異的プロモーターの範囲を、本明細書に開示される方法および組成物において使用することができ、これは、疾患、例えば、ポンペ病の処置のための治療的背景において、所望のレベルの肝臓特異的発現を提供するために非常に有用であり得る。
（実施例１４）
ポンペ患者の臨床研究
（実施例１４）
ポンペ患者の臨床研究
【0610】
３人の対象の２つのコホートにそれぞれ、ＬＯＰＤを有する成人対象を採用した臨床研究ＡＣＴ－ＣＳ１０１においてｒＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡを投薬した。コホート１の対象は、１．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇを受け、コホート２の対象は、１．６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇを受けた。すべての対象は、酵素補充療法（ＥＲＴ）（アルグルコシダーゼアルファ［ＬＵＭＩＺＹＭＥ（登録商標）］）から離脱し；コホート１の対象は、ｒＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ投与後６か月間ＥＲＴに留まったが、コホート２の対象は、ｒＡＡＶ－ＬＳＰ－ｈＧＡＡ投与の時にＥＲＴから離脱した。ＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡについての構築物を図３Ｂに示し、これは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む感染性の非複製組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８ベクター（vecto）であるか、カプシド８および別のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２由来のカプシドタンパク質を含むハプロイドＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２／８－ＬＳＰｈＧＡＡ）であり、ヒト酸性アルファ－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）を発現する。
【0611】
予備データは、２０２０年６月１日の時点で、優先報告ルールを満たした重篤な有害事象がないことを示す。報告された有害事象は、ほとんどが予想／予期されたものであり、軽度から中程度の重症度で、一時的および可逆的であった。
【0612】
コホート１は、１．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇを受け、これは、３人の対象すべてによって十分に許容され、そのすべてが、現在投薬後１２か月に達し、生検データが間もなく利用可能である。アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）またはアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の上昇は、コホート１（１．６Ｅ１２ｖｇ／ｋｇ）に登録されたいずれの対象においても観察されなかった。すべての対象は、６０ｍｇ／日で開始する４週間のプレドニゾン、続いて漸減レジメン（５ｍｇ／週で１１週間）による免疫予防を受けた。コホート１における対象は、カプシドまたは酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）に対する陽性の酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）反応性を示さなかった。すべての対象は、それらのそれぞれのベースライン値を上回る血清ＧＡＡ濃度を示したが、しかしながら、血清ＧＡＡ濃度は、経時的に減少している。ＥＲＴによるレスキューを受ける必要がある対象はいなかった。
【0613】
コホート２は、１．６Ｅ１３ｖｇ／ｋｇを受けた（２０１９年の８月中旬、９月中旬および１０月初旬に投薬）。ＡＳＴおよびＡＬＴの無症候性の上昇が、４６日目（００４）、４１日目（００５）および５５日目（００６）に開始して、コホート２におけるすべての対象において観察された。すべての対象は、６０ｍｇ／日で開始するプレドニゾンによる免疫予防を受けたが、しかしながら、すべての対象は、ＡＳＴおよびＡＬＴの上昇に応答して、プレドニゾンの増大する用量を受けた。２人の対象（００４および００５）はＩＶメチルプレドニゾロンを受けた。コホート２における２人の対象は、ＣＴＣＡＥグレード３の検査の上昇を有していた。対象００４は、１回のＡＬＴのグレード３の上昇（３４８Ｕ／Ｌ；ＵＬＮ＝６３；５×ＵＬＮ＝３１５）、および１回のＡＳＴのグレード３の上昇（２２２Ｕ／Ｌ；ＵＬＮ＝４１；５×ＵＬＮ＝２０５）を経験した。グレード３の上昇は両方とも、同じ日に起こり、治験責任医師によって、ＡＣＴＵＳ－１０１に関連して確実に／ほぼ確実に考慮された。対象５は、１回のガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）のグレード３の上昇（３１１Ｕ／Ｌ；ＵＬＮ＝５０；５×ＵＬＮ＝２５０）を経験し、これを、治験責任医師は、より確実にはプレドニゾンであるが、場合によりＡＣＴＵＳ－１０１に関連して考慮した。すべてのグレード３の上昇は、一時的および無症候性であった。対象００４は、グレード３の検査の上昇後１０日以内に肝生検を受け、その結果は、軽度で、非特異性炎症を示した。この対象はまた、２４週目に脂肪腫を報告し、これは、高い長期のステロイド投与の結果であると考えられ、その後、次第に小さくなった。すべての対象は、陽性であるが、ＡＡＶ８カプシドに対する異なるレベルのＥＬＩＳＰＯＴ Ｔ細胞応答を示し、これは、注目される肝臓酵素の変化の時間内で、常に一致するわけではない。
【0614】
分析的比較可能性研究を実施して、ＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡの同一性、強度、品質、純度もしくは効力に対する提案された製造変更の効果またはその欠如を決定した。
【0615】
ＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡの分析的比較可能性は、方法の標準作業手順（ＳＯＰ）の下でＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｏｓｔｏｎ，ＬＬＣ（ＡＳＢ、Ｍｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で行われた適格なｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを使用して評価することができ、これは、参照標準に対するＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡ試験試料の効力の決定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイである。簡潔には、９６ウェルのＨｕＨ－７細胞培養プレートフォーマット（ヒト肝細胞系、Ｓｅｋｉｓｕｉ ＸｅｎｏＴｅｃｈ、カタログ番号ＪＣＲＢ０４０３）における６日のアッセイを行い、９点希釈スキームを使用してＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡで形質導入し、９６±２時間インキュベートし、その後、ＧＡＡを、４－ＭＵバイオアッセイによって細胞上清中で測定する。相対効力を、ＰＬＡソフトウェア３．０（Ｓｔｅｇｍａｎｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、平行線アッセイモデルで計算する。
【0616】
用量範囲研究：
【0617】
ＧＡＡノックアウト（ＫＯ）マウスにおける用量範囲研究を、ＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡの薬力学的効果を裏付けるために、使用した。雄および雌のＧＡＡ ＫＯポンペマウス（Ｂ６；１２９－Ｇａａｔｍ１Ｒａｂｎ／Ｊ、ストック番号００４１５４、６ｎｅｏ）に、８～１２週齢（改変１は、機関からのフィードバックの９～１２週間前に提案された）で、尾静脈（静脈内）注射（ボーラス）によって注射する。最小限の６頭の雄（Ｍ）および６頭の雌（Ｆ）を、Han et al（2017および2019）に基づいて、２Ｅ１１、２Ｅ１２および２Ｅ１３ｖｇ／ｋｇで投薬される試験生成物（ＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡ）の１つを受けるように無作為に割り当てられ、対照群は、製剤の緩衝液のみ（媒体）を受ける。動物は、８週間追跡され、次いで、組織および血液の収集のために犠牲にされる。実験群および対照群は、操作者に盲検のままである。
【0618】
生存中モニタリングは、死亡についての毎日のチェックからなる。瀕死の動物は研究から除かれる（肉眼的剖検実験および組織病理のための組織試料採取が行われた）。血清ＧＡＡを、投薬８週間後の終了まで、すべての群で２週間ごとに測定する。
【0619】
剖検での測定および組織収集は、肝臓、心臓、四頭筋、前脛骨筋、横隔膜、脳、ヒラメ筋、腎臓、脾臓、肺、ならびに（１）最終体重、（２）肝臓および心臓についての臓器重量、（３）血清（ＧＡＡ活性）および抗ＧＡＡ抗体（ＡＤＡ）のその後の測定のための－２０℃での保管、（４）いくつかの断片にバラバラにされる、肝臓、心臓、ヒラメ筋、四頭筋、前脛骨筋、舌、横隔膜、脳を含む他の臨床測定を含む。追加の測定は、定量化アッセイによって測定される、（４）血清および組織におけるＧＡＡ活性、ならびに組織中のグリコーゲン含有量を含む（組織は、液体窒素中で瞬間凍結され、－８０℃で保管される）。それぞれの指定された組織の約５０ｍｇの標的を、それぞれのアッセイ、ならびに（５）上記に示される組織におけるヘマトキシリン（Haemotoxylin）およびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ならびに剖検で観察される任意の肉眼的病変についての１０％の中性緩衝ホルマリンで固定された組織病理学的検査分析のために収集する。組織の小区分を、必要によりグリコーゲン染色（過ヨウ素酸－シッフ染色－ＰＡＳ）、抗ＧＡＡ抗体応答（ＡＤＡ）を測定することによる導入遺伝子産物に対する免疫応答の評価、ディプロイドゲノム決定１つあたりのベクターゲノムコピー数に対する総ＤＮＡ－ｖｇ／ｕｇのＤＮＡ（液体窒素中で瞬間凍結され、次いで－８０℃で保管）のために、グルタルアルデヒド中で固定する。
【0620】
有意差が、以下の測定：１．すべての収集された組織における認定獣医病理学者による組織病理学（安全性）；２． ０．８０～１．２５（８０～１２５％）の間のＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡの改変ＡＡＶベクターの相対活性による心臓、横隔膜および四頭筋におけるＧＡＡ活性およびグリコーゲン含有量（効力）；３． ０．８０～１．２５（８０～１２５％）の間のＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡの改変ＡＡＶベクターの相対生体内分布による収集された組織中のＤＮＡ１ｕｇあたりのベクターゲノムＤＮＡ（生体内分布）；４．抗ＧＡＡ ＡＤＡの変化なしにより観察されなければ、ＧＡＡ ＫＯマウスにおける用量範囲研究は、ＡＡＶ８－ＬＳＰｈＧＡＡ、および本明細書の開示により改変された改変ＡＡＶベクター（例えば、異なるＬＳＰ、ｈＧＡＡ配列の最適化）の間のｉｎ ｖｉｖｏ比較可能性を裏付ける。
【0621】
本発明を、いくつかの具体的な実施形態と併せて記載および図示したが、当業者には、本明細書に図示され、記載され、特許請求の範囲に記載される本発明の原理から逸脱することなく、変形および改変を行ってもよいことが認識されるであろう。本発明は、それらの精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で具体化され得る。記載される実施形態は、あらゆる点で、実例であって、限定的ではないと考えられる。
【0622】
最後に、本明細書に示され、記載される本発明の例示的な実施形態に関して、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ウイルスビリオンを含むゲノム構築物は、ＡＡＶベクターの送達のために開示され、構成されることが認識されるであろう。本発明の原理は、示され、記載されたものを越えるいくつかの構成で実施され得るので、本発明は、例示的な実施形態によって決して限定されるものではないが、一般に、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ウイルスビリオン装置を含むゲノム構築物を対象とし、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そうするための多数の形態をとることができることが理解されるべきである。
【0623】
本発明のある特定の実施形態が、本発明を行うための本発明者らに公知の最良の形態を含んで、本明細書に記載される。当然ながら、これらの記載される実施形態における変形は、先述の説明を読む際に当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形を必要により用いることを予想し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたもの以外で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙された主題のすべての改変および等価物を含む。また、それらのすべての可能な変形における上記に記載される実施形態の任意の組合せは、本明細書で他に指示されるか、または文脈によって明白に他に矛盾しない限り、本発明に包含される。
【0624】
本発明の代替の実施形態、要素、またはステップのグループ化は、限定として解釈されるべきではない。それぞれの群のメンバーは、個々に、または本明細書に開示される他の群のメンバーとの任意の組み合わせで、言及され、かつ特許請求の範囲に記載され得る。群の１つまたは複数のメンバーが、便宜上および／または特許性の理由のために、群に含まれてもよく、または群から削除されてもよいことが予期される。任意のそのような包含または削除が起こる場合、本明細書は、改変された群を含有し、そのため、添付される特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ群の記載を充足すると見なされる。
【0625】
他に指示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、特徴、項目、量、パラメーター、性質、用語などを表すすべての数は、すべての例において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、そのように条件付けされた特徴、項目、量、パラメーター、性質、または用語が、述べられた特徴、項目、量、パラメーター、性質、または用語の値の上下プラスまたはマイナス１０パーセントの範囲を包含することを意味する。したがって、逆のことが示されない限り、本明細書および添付される特許請求の範囲に記述される数的パラメーターは、変動し得る近似値である。少なくとも、また特許請求の範囲の範囲への均等論の適用を限定する試みとしてではないが、それぞれの数的指標は、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記述する数的な範囲および値は近似値であるにも関わらず、具体例において記述された数的な範囲および値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、数的な範囲または値は、本質的に、それらのそれぞれの試験測定値においてに見出される標準偏差に必然的に起因するある特定の誤差を含有する。本明細書における数的な値の範囲の列挙は、その範囲内にあるそれぞれ別々の数値を個々に言及する簡便な方法としての機能を果たすことが単に意図される。本明細書で他に指示されない限り、数的な範囲のそれぞれの個々の値は、本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書中に組み込まれる。同様に、本明細書で使用される場合、逆のことが示されない限り、「実質的に」という用語は、そのように条件付けされた特徴、項目、量、パラメーター、性質、または用語の近似値を示すことが意図される程度の用語であり、当業者によって理解および解釈され得る範囲を包含する。
【0626】
「であってもよい（ｍａｙ）」または「ことができる（ｃａｎ）」という用語の使用は、実施形態または実施形態の態様に関して、「でなくてもよい（ｍａｙ ｎｏｔ）」または「ことができない（ｃａｎｎｏｔ）」という代替の意味も有する。そのため、本明細書が、実施形態または実施形態の態様が、本発明の主題の一部として含まれていてもよく、または含まれることができることを開示する場合、否定的限定または排他的条件も明確に意味し、実施形態または実施形態の態様が、本発明の主題の一部として含まれていなくてもよいか、または含まれることができないことを意味する。同様の方法で、「必要に応じて」という用語の使用は、実施形態または実施形態の態様に関して、そのような実施形態または実施形態の態様が、本発明の主題の一部として含まれていてもよく、または本発明の主題の一部として含まれていなくてもよいことを意味する。そのような否定的限定または排他的条件が適用されるかどうかは、否定的限定または排他的条件が、特許請求の範囲に記載される主題において列挙されるかどうかに基づくであろう。
【0627】
特許請求の範囲において使用される場合、出願されたもの、または補正によって追加されたものにかかわらず、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンドの移行句は（「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などのそれらの等価なオープンエンドの移行句と一緒に）、単独で、または列挙されていない主題と組み合わせて、明示的に列挙される要素、限定、ステップ、および／または特色をすべて包含し；名付けられた要素、限定、および／または特色は必須であるが、他の名付けられていない要素、限定、および／または特色が追加されてもよく、かつ特許請求の範囲の範囲内の構築物を依然として形成してもよい。本明細書に開示される具体的な実施形態は、「含む」の代わりに、または補正として、「からなる」または「から本質的になる」というクローズドエンドの移行句を使用して、特許請求の範囲においてさらに限定されることがある。特許請求の範囲において使用される場合、出願されたもの、または補正によって追加されたものにかかわらず、「からなる」というクローズドエンドの移行句は、特許請求の範囲に明示的に列挙されない任意の要素、限定、ステップ、または特色を排除する。「から本質的になる」というクローズドエンドの移行句は、明示的に列挙される要素、限定、ステップ、および／または特色、ならびに特許請求の範囲に記載される主題の基本的および新規の特徴に実質的に影響を与えない任意の他の要素、限定、ステップ、および／または特色に、特許請求の範囲の範囲を限定する。したがって、「含む」というオープンエンドの移行句の意味は、具体的に列挙された要素、限定、ステップ、および／または特色だけでなく、任意の必要に応じた追加の指定されていないものもすべて包含するものとして定義される。「からなる」というクローズドエンドの移行句の意味は、特許請求の範囲に具体的に列挙された要素、限定、ステップ、および／または特色のみを含むとして定義される一方、「から本質的になる」というクローズドエンドの移行句の意味は、特許請求の範囲に具体的に列挙された要素、限定、ステップ、および／または特色、ならびに特許請求の範囲に記載される主題の基本的および新規の特徴に実質的に影響を与えない要素、限定、ステップ、および／または特色のみを含むとして定義される。したがって、「含む」というオープンエンドの移行句は（それらの等価なオープンエンドの移行句と一緒に）、「からなる」または「から本質的になる」というクローズドエンドの移行句によって指定された特許請求の範囲に記載される主題を、限定的な場合として、その意味内に含む。そのため、「含む」という語句を用いて本明細書に記載されるか、またはそのように特許請求の範囲に記載される実施形態は、「から本質的になる」および「からなる」という語句について、本明細書において、明示的または本質的に明確に記載され、可能にされ、支持される。
【0628】
本発明の態様を、少なくとも１つの例示的な実施形態に関して記載したが、本発明がそれらに限定されないことは、当業者によって明白に理解されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、添付される特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきであり、ここで、本発明者らが、特許請求の範囲に記載される主題が本発明であると考えることが明白にされる。
参照
参照
【0629】
限定されるものではないが、特許および特許出願ならびに国際特許出願を含む、本明細書および実施例において開示される参照は、参照によりそれらの全体が本明細書にすべて組み込まれる。
【0630】
本明細書において参照および特定された特許、特許公開ならびに他の刊行物はすべて、例えば、本発明に関連して使用される可能性があるそのような刊行物に記載された組成物および方法論を記載および開示する目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に個々におよび明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにもっぱら提供される。これに関して、本発明者らが、先行発明または任意の他の理由によりそのような開示に先行する権利がないという自白として解釈されるべきではない。これらの文書の日付についての陳述またはこれらの文書の内容についての表明はすべて、本出願人らに利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さについての任意の承認を構成するものではない。
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【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】