特表 2023-503058 ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-26

(54)【発明の名称】ヘモフィルス・パラスイスに対する新規ワクチン

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20230119BHJP

   A61K 39/102 20060101ALI20230119BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230119BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230119BHJP

【ＦＩ】

C07K14/195 ZNA

A61K39/102

A61P37/04

A61P31/04 171

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022529031

(86)(22)【出願日】2020-11-19

(85)【翻訳文提出日】2022-07-12

(86)【国際出願番号】 EP2020082634

(87)【国際公開番号】W WO2021099444

(87)【国際公開日】2021-05-27

(31)【優先権主張番号】19210262.2

(32)【優先日】2019-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ヤコブス，アントニウス・アルノルドゥス・クリスティアーン

(72)【発明者】

【氏名】ファン・カステレン－ウェスターネン，テオドーラ・ヨハンナ

(72)【発明者】

【氏名】ビルスマ，ヨハンナ・ヤコバ・エリザベス

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085BA18

4C085BB11

4C085CC21

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA30

4H045CA11

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ブタにワクチンを投与することによる、ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護するための予防的方法で使用するための、配列番号１によるタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片に関し、ワクチンは、タンパク質またはその免疫原性断片を抗原として含む。本発明はまた、ワクチン、そのようなワクチンを製造する方法、およびＨ．パラスイスからブタを保護する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブタにワクチンを投与することによる、ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護するための予防的方法で使用するための、
配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片であり、
該ワクチンが、前記タンパク質またはその免疫原性断片を抗原として含む、タンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片。

【請求項2】

前記タンパク質が、配列番号１のタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのタンパク質またはその免疫原性断片。

【請求項3】

前記タンパク質が配列番号１のタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のためのタンパク質またはその免疫原性断片。

【請求項4】

前記タンパク質が配列番号１に記載のタンパク質であることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の使用のためのタンパク質またはその免疫原性断片。

【請求項5】

前記方法が、ヘモフィルス・パラスイスの感染による死亡のリスクの増加からブタを保護するためであることを特徴とする、前述の請求項のいずれかに記載の使用のためのタンパク質またはその免疫原性断片。

【請求項6】

前記方法が、ヘモフィルス・パラスイスの感染による１つ以上の臨床徴候からブタを保護することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の使用のためのタンパク質またはその免疫原性断片。

【請求項7】

配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片、および、薬学的に許容される担体を含む、ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護するためのワクチン。

【請求項8】

ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護するためのワクチンを製造するための抗原としての、配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片の使用。

【請求項9】

配列番号１のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片を抗原として含むワクチンをブタに投与することによる、ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを防御するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、病原性細菌ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）による感染に対するブタの治療に関する。特に、本発明は、この細菌による感染に対してブタを予防的に処置するための新規なワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

ヘモフィルス・パラスイスは、ブタに影響を及ぼす最も重要な細菌のひとつである。この病原体による疾患は、多発性漿膜炎を特徴とし、グレーサー病として知られている。ヘモフィルス・パラスイスはすべての主要な豚飼育国に存在し、現代の豚生産システムにおいて依然として重大な病原体である。ヘモフィルス・パラスイスは疾患を引き起こすだけでなく、健康な豚の上気道から頻繁に分離される。ヘモフィルス・パラスイスの既知の異なる血清型が存在し、これらの各々は免疫拡散の技術を使用して同定され得る（Ｋｉｅｌｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：８６２－８６５；１９９２、および、Ｒａｐｐ－Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら、ＡＪＶＲ、５３：６５９－６６４；１９９２）。死亡率の低下をもたらすワクチン接種の成功は、様々な種類のワクチンによって達成されている。

【0003】

不活化Ｈ．パラスイス(すなわち、バクテリン）ワクチンは、今日広く使用されている。市販のＨ．パラスイスワクチンは、すべて不活化ワクチンである。現在市販されているワクチンのほとんどは、株を不活化した後、病原性Ｈ．パラスイス株を増殖させて製造される。細菌培養物を高速遠心分離によってペレット化し、無菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、続いて、適切なアジュバント（例えば、鉱油、水酸化アルミニウム、カルボポール、サポニン、ビタミンＥアセテート、スクアレン、スクアレンなど）を用いて処方する。一価ワクチンに加えて、種々の血清型を含む二価、三価、または四価のＨ．パラスイスワクチンがある。これらは一般的に低レベルの交差防御をもたらし、同種血清型に対してより有効である。これらの不活化ワクチン、例えば、ポルシリス・グレーサー（ＭＳＤ、オランダ、Ｂｏｘｍｅｅｒ）は、世界中のグレーサー疾患のアウトブレイクの制御に重要な役割を果たしている。

【0004】

安定して弱毒化したＨ．パラスイス株は、理論的には安全かつ有効なワクチンとして役立つ可能性がある。しかし、弱毒化Ｈ．パラスイスワクチンの開発はＨ．パラスイスの主要な毒素因子に関する知識が不足しているため制限されており、潜在的なワクチンとして役立つ可能性のあるＨ．パラスイス突然変異体を作り出すことは困難である。現在までのところ、遺伝子操作された弱毒化生または不活化Ｈ．パラスイスワクチン候補は存在しない。

【0005】

いくつかのサブユニットワクチンが研究されているが、既存のデータから、少数のサブユニットワクチンが高レベルの抗Ｈ．パラスイスワクチン中和抗体とＨ．パラスイス攻撃に対するブタの防御を誘導することが示唆されている。しかし、グレーサー病を予防および管理する市販のサブユニットワクチンは現在のところ入手できない。最近、（Ｈｕｉｓｈｅｎｇ Ｌｉｕら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８０、２０１６年１１月１日、ｐｐ５３－５８）、組換えトランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）などの新たに同定された防御抗原を含むサブユニットワクチン、ＴｂｐＢ、ＯＭＰ２およびＯＭＰ５で強化された外膜タンパク質（ＯＭＰ）製剤、トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）、三量体オートトランスポーター（ＶｔａＡ）、６つの分泌タンパク質（ＰｆｌＡ、Ｇｃｐ、ＨｓｄＳ、ＲｎｆＣ、およびＨＡＰＳ＿００１７）、３つのグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ＯａｐＡ、およびＨＰＳ－６７５融合タンパク質、様々な代替ＯＭＰ（ＳｍｐＡ、ＹｇｉＷ、およびＦＯＧ）、６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、細胞致死性膨張性毒素サブユニットＡ、ＢおよびＣ、ノイラミニダーゼまたはリポタンパクが、Ｈ．パラスイス攻撃に対して部分的な防御効果を示すことが証明されている。

【0006】

現在までに、ＤＮＡワクチンは、Ｈ．パラスイスに対してもある程度の部分的防御効果があることが示されている。このワクチンは、Ｈ．パラスイス ＧＡＰＤＨをコードするＤＮＡを含む。

【0007】

しかしながら、ワクチンが市販されているにもかかわらず、主に多くの既存ワクチンの効果が不完全であるため、抗菌薬が依然としてＨ．パラスイス感染の治療に広く使用されている。Ｈ．パラスイス感染の初期に抗菌薬を投与されたブタは、通常、全身感染から生き延びることができる。しかし、成長期のブタに使用される抗菌薬の量を減らす圧力は多い。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】ＷＯ２０１５／１８１３５６

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：８６２－８６５；１９９２、

【非特許文献2】ＡＪＶＲ、５３：６５９－６６４；１９９２

【非特許文献3】Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８０、２０１６年１１月１日、５３－５８

【非特許文献4】Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：１０７３－７９、２００７

【非特許文献5】Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐｌ．３

【非特許文献6】Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７、１４３５－１４４１、１９８５

【0010】

発明の対象
Ｈ．パラスイスの感染に対してブタを予防的に処置するための代替ワクチンを提供することが目的であり、このワクチンは、好ましくは少なくとも従来のバクテリンワクチンと同程度に良好な防御を提供する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

発明の概要
本発明の目的を満たすために、配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはそのタンパク質の免疫原性断片が、ブタにワクチンを投与することによってヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護するための予防方法において使用できることが見いだされ、このワクチンは、このタンパク質またはその免疫原性断片を抗原として含む。

【0012】

Ｈ．パラスイスの感染に対するブタの治療にこのタンパク質またはその免疫原性断片を使用できるという事実は、様々なＨ．パラスイス血清型（病原性血清型４、５、１２、１３、１５を含む）に保存されている推定セリンプロテアーゼである天然タンパク質が、Ｈ．パラスイスの感染において重要な役割を果たしているという驚くべき知見に基づいていた。このことは、自然界に存在するタンパク質の（一部）ワクチン接種により、病原性Ｈ．パラスイスに対する非常に良好な防御効果が得られ、従来の十分に確立された細菌ワクチンに到達できる防御効果よりもさらに優れていることから確証することができる。このことは、このセリンプロテアーゼが細菌の病原性において鍵となる役割を果たしており、このタンパク質の機能を中和することが、それに起因する臨床疾患を含めて感染を減少させるのに役立つことを示している。この点において、本発明者らの利点は、このセリンプロテアーゼがＨ．パラスイスの病原性において重要な役割を果たすという認識にある。このことがいったん認識されれば、このタンパク質に対する抗体を誘導することがＨ．パラスイスの感染に対する治療として有効であることに続いた。このような抗体を誘導する最も直接的な方法は、野生型タンパク質に類似するタンパク質またはポリペプチドを投与することである。

【0013】

タンパク質自体に関して、様々な血清型にわたって、その全長にわたるタンパク質の天然の変異は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有するタンパク質に関して約６９％である。従って、この同一性レベルを満たすタンパク質の使用は、対応するタンパク質を天然に産生する異なる血清型の種々の野生型Ｈ．パラスイス株に対する防御に到達するために使用され得る。

【0014】

本発明の要旨を見出すために、天然タンパク質に対する抗体を誘導するための抗原として（完全である）配列番号１のタンパク質を使用したが、抗体を特定の（天然に存在する）タンパク質に対して産生させる必要がある場合、典型的にはタンパク質全体を使用する必要はないことが一般に知られている。対応するタンパク質の免疫応答性断片を使用することが可能であり、それ自体が可能であるか、または、対応するタンパク質に対する免疫応答を誘導する、例えばＫＬＨなどの担体に結合しているものを使用することが可能である。これは、本発明のセリンプロテアーゼについて特に当てはまる。まず、配列番号１によるタンパク質は既に、自己輸送体βバレルを含む天然に存在するタンパク質の一部にすぎない。これに次いで、Ｈ．パラスイスの病原性における機能は未だ不明であるが、このタンパク質は、ヒトＭａｃ－１タンパク質と相同であることがわかった。これは、いわゆるコバルトアラインメント：ＲＰＳ－ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＰＨＩ－ＢＬＡＳＴを使用して、保存されたドメインデータベース、タンパク質モチーフデータベース、および配列類似性に由来するペアワイズ制約のコレクションを見出す多重配列アラインメントツールを介して確立され得、ここで、ペアワイズ制約は次いで、漸進的多重アラインメントに組み込まれる（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＪＳおよびＡｇａｒｗａｌａ Ｒ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：１０７３－７９、２００７； ＰＭＩＤ： １７３３２０１９を参照のこと）。このことは、「ヘモフィルス」細菌の「Ｍａｃ－１ファミリー」タンパク質をＮＣＢＩデータベースで検索した結果、Ｈ．パラスイスにＭａｃ－１ドメイン相同体を有するタンパク質の存在が確認されたことから確認された。Ｍａｃ－１タンパク質はＷＯ２０１５／１８１３５６（ＩＤＴ Ｂｉｏｌｏｇｉｋａ ＧｍｂＨ）に記載されているように、ブタ病原性細菌ストレプトコッカス スイスのＩｇＭプロテアーゼに相同であることが知られている。ＷＯ２０１５／１８１３５６に教示されるように、全長タンパク質または高度に保存されたＭａｃ－１ドメインのみを含む断片に対するワクチンは、全長の天然に存在するタンパク質に対する抗体を誘導することができ、それによって対応する細菌に対する防御を提供する。Ｈ．パラスイスは全くＳ．スイスとは無関係であるが、両細菌が免疫グロブリンペプチダーゼ活性を有することが知られているＭａｃ－１ドメイン相同体を有するタンパク質を産生するという事実（ＷＯ２０１５／１８１３５６に確認されている欧州分子生物学研究所のＰＦＡＭデータベースを参照）と、疾患が臨床的に類似している（両疾患とも多発性漿膜炎を引き起こし、典型的には子ブタにのみ病原性を示し、離乳や輸送などのストレスによって誘発される）事実を合わせると、Ｈ．パラスイスでも、ストレプトコッカス スイスと同様に、対応する天然タンパク質が免疫回避に関与していることが示される。さらに、両病原性細菌において、Ｍａｃ－１ドメインは血清型間で高度に保存されているが、残りについては、Ｈ．パラスイスおよびストレプトコッカス スイスタンパク質はまったく関連がないという事実（Ｍａｃ－１ドメインを含むタンパク質全体の同一性レベルは１３％と低い）と、Ｈ．パラスイス血清型３、４、５、９、１２、１３および１５にわたって、Ｍａｃ－１ドメインの同一性はさらに１００％であるという事実（一方、タンパク質の残りについては、これは６９％まではるかに低い）と相まって、Ｍａｃ－１ドメインが主要な免疫原性エピトープを含んでいるという証拠でさえ、このこと自体がこのいわゆるＭａｃ－１ドメインを含む自然発生セリンプロテアーゼを中和する抗体を誘導することができる。好ましくは、この断片がＨ．パラスイスの天然に存在するＭａｃ－１ドメイン（すなわち、配列番号２に従う配列）を含む。しかしながら、一般的に知られているように、配列同一性において１０～２０％の小さな変異、さらには３０％までもが、有効な抗原としてなお有用であり得、そして中和抗体を誘導し得る。これらの変異は、配列全体におけるアミノ酸（類）の差異、または前記配列におけるアミノ酸（類）の欠失、置換、挿入、逆位または付加によって反映され得る。生物学的および免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈらによって、「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換または進化において頻繁に起こる置換は、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ、Ｍ．Ｄ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７８、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐｌ．３を参照のこと）。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／ＶａｌおよびＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度のタンパク質比較のための方法を開発し（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７、１４３５－１４４１、１９８５）、相同タンパク質間の機能的類似性を決定した。本発明の例示的な実施形態のこのようなアミノ酸置換、ならびに欠失および／または挿入を有する変異は、本発明の範囲内である。したがって、本発明において使用するための断片は、配列番号２に従うポリペプチドと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％またはそれ以上同一であるポリペプチドを含むべきである。

【0015】

全体として、ワクチンにおいて本発明のタンパク質を使用すると、天然に存在するＨ．パラスイスセリンプロテアーゼに対する抗体を誘導することができることが見出された。これは、ワクチン接種後のＨ．パラスイス感染を治療できるという意味である。これに続いて、ヒトＭａｃ－１タンパク質およびＭａｃ－１ドメインを含むＩｇＭプロテアーゼを産生するストレプトコッカス スイスとの相同性に基づいて、（少なくとも）現在のセリンプロテアーゼのＭａｃ－１ドメイン（例えば、ＫＬＨのような免疫原性担体に任意に連結される）を含むポリペプチドは、ワクチン中の抗原として使用される場合、天然に存在するタンパク質に対する抗体を誘導するのに十分であることが理解される。

【0016】

本発明はまた、ヘモフィルス・パラスイスの感染に対してブタを防御するためのワクチンにおいて具体化され、このワクチンは、配列番号１のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片、および薬学的に許容可能な担体を含む。

【0017】

本発明はまた、ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護するためのワクチンを製造するための抗原としての、配列番号１のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片の使用に関する。

【0018】

これに続いて、本発明は、ブタにワクチンを投与することによって、ヘモフィルス・パラスイスの感染からブタを保護する方法に関し、このワクチンは、抗原として、配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも６９％の配列同一性を有するタンパク質またはこのタンパク質の免疫原性断片を含む。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
抗原は、抗原が最終的に人工的に産生されるにもかかわらず、微生物に由来する抗原性材料である。抗原は、対応する天然に存在する化合物（典型的にはタンパク質）に対して作用する抗体の形成を開始し、媒介する。細菌、ウイルス、原生動物、その他の微生物は、抗原の重要な供給源である。これらは、例えば、細胞の外表面（被膜抗原）、細胞内部（体細胞またはＯ抗原）、べん毛（べん毛またはＨ抗原）、または例えば酵素および毒素を含む排泄産物に由来するタンパク質または多糖であってもよい。

【0020】

ワクチンは動物への適用に適した構成であり、免疫学的に有効な量の1以上の抗原を含み、すなわち、標的動物の免疫系を十分に刺激して、抗原に対して、およびそれとともに対応する天然に存在するタンパク質に対して、抗体などの免疫応答を誘導することができ、通常、薬学的に許容される担体（すなわち、生体適合性媒体、すなわち、投与後に対象動物に重大な有害反応を誘発せず、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示することができる媒体）、例えば、水および/または他の生体適合性溶媒を含む液体、または凍結乾燥ワクチン（糖および/またはタンパク質に基づく）を得るために一般的に使用されるような固体担体と組み合わせを含み、任意に免疫刺激剤（アジュバント）を含み、これにより、動物への投与時に、（ワクチン接種後の）感染から動物を保護することができる免疫応答を誘導する。

【0021】

予防的方法とは、感染が実際に起こる前に作用することによって感染または対応する疾患を防御するように設計された方法であり、典型的には対象動物が感染すると予想される前に対象動物をワクチンで処置することによって行われる。

【0022】

Ｈ．パラスイス感染に対するブタの防御は、Ｈ．パラスイスによる病原性感染の予防、改善または治癒を助けること、またはその感染から生じる障害の予防、改善または治癒を助けること、例えば、Ｈ．パラスイスによる感染から生じる１つ以上の臨床徴候を予防または軽減することを意味する。

【0023】

免疫原性断片は、宿主において免疫応答を誘導するその能力を依然として保持している、すなわちＢ細胞またはＴ細胞エピトープを含むタンパク質の断片である。免疫原性断片（決定基）、特にタンパク質の免疫原性断片を容易に同定するために、種々の技術が一般に利用可能である。Ｇｅｙｓｅｎらによって記載された方法（特許出願ＷＯ８４／０３５６４、特許出願ＷＯ ８６／０６４８７、米国特許ＮＲ．４，８３３，０９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３９９８－４００２（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．、１０２，２５９－２７４（１９８７）、いわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法は、タンパク質の免疫原性エピトープを検出するための、実施が容易であり迅速かつ十分に確立された方法である。この方法は世界中で使用されており、当業者には周知である。この（経験的）方法は、Ｂ細胞エピトープの検出に特に適している。また、任意のタンパク質をコードする遺伝子の配列が与えられると、コンピュータアルゴリズムは、現在知られているエピトープとのそれらの連続的および／または構造的一致に基づいて、特定のタンパク質断片を免疫学的に重要なエピトープとして指定することができる。これらの領域の決定は、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４８－３８２８（１９８１））による親水性基準、ならびにＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７：４５－１４８（１９８７）および米国特許第４，５５４，１０１号）による二次構造態様の組み合わせに基づく。Ｔ細胞エピトープは、同様に、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５，１０５９－１０６２（１９８７）および米国特許出願ＮＴＩＳ ＵＳ０７／００５，８８５）の補助により、コンピューターによって配列から予測され得る。要約された概要は、以下に見出される：共通原理に関するＳｈａｎ Ｌｕ：Ｔｉｂｔｅｃｈ ９：２３８－２４２（１９９１）、マラリアエピトープに関するＧｏｏｄら；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１０５９－１０６２（１９８７）、Ｌｕのレビュー；Ｖａｃｃｉｎｅ １０：３－７（１９９２）、ＨＩＶ－エピトープに関するＢｅｒｚｏｆｓｋｙ；Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ５：２４１２－２４１８（１９９１）。免疫原性であるためには、ＭＨＣ Ｉ受容体結合のために、ペプチドが最小の長さ；８～１１ａａであり、およびＭＨＣ ＩＩ受容体結合のために１１～１５ａａである必要があることは一般的な知識である（例えば、Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉｎ＆Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、１９９３、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．１１、ｐ４０３－４５０：Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）。

【0024】

２つのポリペプチド（または核酸）間の配列同一性は、デフォルトパラメーターを有するｂｌａｓｔｐアルゴリズムを用いてＢＬＡＳＴプログラムで確立されたように、ポリペプチド（または核酸）の重複領域における同一のアミノ酸（またはヌクレオチド）の割合を意味する（Ｔａｔｉａｎａ Ａ、Ｔａｔｕｓｏｖａ、Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １７４：２４７－２５０；１９９９を参照のこと）。

【0025】

本発明のさらなる実施形態
さらなる実施形態において、そのタンパク質は、配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１に記載のタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性でさえあり、１００％までの配列同一性を有する。

【0026】

別の実施形態において、そのタンパク質または免疫原性断片は、ヘモフィルス・パラスイスの感染による死亡リスクの増加からブタを保護するための方法において使用される。

【0027】

さらに別の実施形態において、そのタンパク質または免疫原性断片は、ヘモフィルス・パラスイスの感染による１つ以上の臨床徴候に対してブタを保護するための方法において使用される。

【0028】

以下の具体例を用いて、本発明をさらに説明する。

【実施例】

【0029】

実施例１
目的
このアラインメント実験の目的は、様々な血清型の様々なＨ．パラスイス株にわたるセリンプロテアーゼの配列同一性レベルを見出し、セリンプロテアーゼにおけるＭａｃ－１ドメインを同定することであった。

【0030】

結果
以下の表において、他のＨ．パラスイス株における対応するセリンプロテアーゼについて配列番号１に関して配列同一性が何であるかを示す。同一性のレベルは、一般的な血清型の様々な株間で少なくとも６９％であると思われる。既知の高病原性および最も蔓延している血清型４、５、１２および１３のグループ内の株については、同一性のレベルはさらに９０％以上である。

【0031】

【表1】

【0032】

上記に次いで、Ｈ．パラスイスのＭａｃ－１ドメインを同定し、配列番号２として本明細書に開示した。配列番号１によるタンパク質は、７８０アミノ酸の長さを有するヘモフィルス・パラスイス血清型５株ＳＨ０１６５（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ ＡＣＬ３２９６１．１（Ｌｉｎｋ））の推定細胞外セリンプロテアーゼに由来する。オートトランスポータードメイン（ＡＡ５２１～７８０）を除去し、ＨＭＭＲ同定（ｗｗｗ．ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ；Ｒｏｂｅｒｔ Ｆｉｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１ Ｊｕｌ １；３９、Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ、Ｗ２９－Ｗ３７を参照のこと）を行う場合、Ｍａｃ－１ファミリードメインはＡＡ１３０で開始し、ＡＡ２２１で終了することが示される。

【0033】

Ｈ．パラスイスのＭａｃ－１ドメインをストレプトコッカス スイスのＭａｃ－１ドメインと比較すると、１７％の同一性しかなく（Ｂｌａｓｔｐを使用して）、これは、ドメインのごく一部のみが抗体結合および／またはプロテアーゼ活性に必須であることを示す。これに次いで、このことはＭａｃ－１ドメインが種々のＨ．パラスイス血清型において１００％の同一性を有しているが（ここで示したように；他の株または血清型においては同一性のレベルが低いにもかかわらず）、天然に存在するタンパク質の変動は少なくとも７０％の同一性レベルまたはそれ以上の範囲内の変動において、天然タンパク質に対する有効な抗体を誘導する可能性が高いという表示である。

【0034】

実施例２
目的
本研究の目的は、Ｈ．パラスイス血清型５の攻撃に対するサブユニットワクチンの有効性を従来のバクテリンワクチンと比較して検証することであった。サブユニットワクチンは、配列番号１によるポリペプチドを含み、ここで、対応するＤＮＡは、Ｈ．パラスイス血清型５、株ＳＨ０１６５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＣＬ３２９６１．１）からクローン化され、大腸菌発現ベクターシステム（ｐＥＴ２２ｂ、ｐｅｌＢシグナル配列およびＨＩＳタグ付き）で発現された。バクテリンワクチンには、血清型５のヘモフィルス・パラスイス細菌の不活化細胞が含まれていた。

【0035】

試験デザイン
本研究では、４週齢の健康な子ブタ３０頭を用いた。子ブタを各１０頭ずつ３群（異なる同腹児に均等に分布）に割り付けた。グループ１には、４週齢および６週齢で、７５μｇ／ｍｌのサブユニットを含むワクチン２ｍｌを、水アジュバント中の油に懸濁した状態で、筋肉内に２回ワクチン接種した。グループ２は、水中油型アジュバントに懸濁された不活化細胞を含むバクテリンワクチンを筋肉内に２回ワクチン接種され、グループ３は、攻撃コントロールとしてワクチン接種されないままであった。８週齢時に、ブタにＨ．パラスイス血清型５の毒性培養物を気管内投与した。

【0036】

攻撃後１０日間、ブタのうつ病、運動障害および／または神経学的徴候などのＨ．パラスイス感染の臨床徴候を毎日観察し、標準的なスコアリングシステムを用いてスコア化した。各ワクチン接種および攻撃の直前に、抗体測定のために血清血液を採取した。攻撃誘発の前後の定期的な時期に、攻撃誘発株の再分離のためにヘパリン血液を採取した。剖検は、剖検予定日前に殺処分された全動物ならびに全生存動物について実施した。

【0037】

結果
攻撃前、異常は認められず、併発死亡も認められなかった。平均生存日数、平均臨床スコア、試験終了前に安楽死させる必要があった動物数および血液再分離結果を以下の表２に示す。

【0038】

【表2】

【0039】

結論
この結果は、組換えサブユニットワクチンが、Ｈ．パラスイス攻撃に対して非常に良好な防御を誘導したことを示している。誘導された防御は、バクテリンワクチンによって誘導された防御よりも優れていた。

【配列表】

2023503058000001.app

【国際調査報告】