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特表2023-503228ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその応用
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-27
(54)【発明の名称】ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその応用
(51)【国際特許分類】
   C07K 16/28 20060101AFI20230120BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20230120BHJP
   A61P 37/04 20060101ALI20230120BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20230120BHJP
   A61P 37/02 20060101ALI20230120BHJP
   A61P 29/00 20060101ALI20230120BHJP
   A61P 31/00 20060101ALI20230120BHJP
   A61K 39/395 20060101ALI20230120BHJP
   A61K 47/68 20170101ALI20230120BHJP
   G01N 33/53 20060101ALI20230120BHJP
   C12N 15/13 20060101ALN20230120BHJP
【FI】
C07K16/28
A61P43/00 111
A61P43/00 107
A61P37/04
A61P35/00
A61P37/02
A61P29/00
A61P31/00
A61K39/395 L
A61K39/395 N
A61K47/68
G01N33/53 D
C12N15/13 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022523656
(86)(22)【出願日】2020-11-11
(85)【翻訳文提出日】2022-06-20
(86)【国際出願番号】 CN2020127993
(87)【国際公開番号】W WO2021093753
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】201911105611.1
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911105605.6
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911106016.X
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.TWEEN
(71)【出願人】
【識別番号】522160066
【氏名又は名称】合肥瀚科邁博生物技術有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】程聯勝
(72)【発明者】
【氏名】劉▲うぇん▼▲てぃん▼
(72)【発明者】
【氏名】張大艶
(72)【発明者】
【氏名】曾小麗
(72)【発明者】
【氏名】王鳳栄
【テーマコード(参考)】
4C076
4C085
4H045
【Fターム(参考)】
4C076AA12
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC26
4C076CC27
4C076CC29
4C076CC31
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF11
4C085AA14
4C085AA25
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB44
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045EA22
4H045EA28
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその使用を提供する。本発明に係る抗体は、重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2及びHCDR3のアミノ酸配列が、順番に、配列番号1のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示されており、軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3のアミノ酸配列が、順番に、配列番号2のN末端からの24~34番目、50~56番目、89~97番目で示されるものである。本発明に係る抗体は、ヒト4-1BB及びサル4-1BBに結合可能であり、且つヒト4-1BBに対して高い親和性を示し、またT細胞応答を効果的に増強させ、T細胞及び抗体により媒介される免疫応答の調節に適用することができる。また、免疫調整剤として、例えば、癌、自己免疫疾患、炎症疾患及び感染疾患等の治療など、幅広い治療の用途に適用できる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3のアミノ酸配列が、配列番号1のN末端から順番に、31~35番目、50~64番目、98~106番目で示されることを特徴とする、抗体。
【請求項2】
軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3のアミノ酸配列が、配列番号2のN末端から順番に、24~34番目、50~56番目、89~97番目で示されることを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
【請求項3】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記の(a1)~(a12)のいずれか一つであることを特徴とする、請求項1に記載の抗体:
(a1)配列番号1のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または、配列番号1のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a2)配列番号18のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号18のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a3)配列番号19のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号19のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a4)配列番号20のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号20のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a5)配列番号21のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号21のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a6)配列番号22のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号22のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a7)配列番号23のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号23のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a8)配列番号24のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号24のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a9)配列番号25のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号25のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a10)配列番号26のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号26のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a11)配列番号27のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号27のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a12)配列番号28のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号28のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項4】
前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項2に記載の抗体:
(b1)配列番号2のN末端からの1~107番目までのアミノ酸配列、または、配列番号2のN末端からの1~107番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b2)配列番号18のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号18のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b3)配列番号19のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号19のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b4)配列番号20のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号20のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b5)配列番号21のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号21のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b6)配列番号22のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号22のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b7)配列番号23のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号23のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b8)配列番号24のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号24のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b9)配列番号25のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号25のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b10)配列番号26のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号26のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b11)配列番号27のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号27のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(b12)配列番号28のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号28のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項5】
IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgDであることを特徴とする、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記IgGは、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプ、またはIgG4サブタイプであることを特徴とする、請求項5に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体の軽鎖タイプは、κ鎖またはλ鎖であることを特徴とする、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗体はIgG4サブタイプであり、前記抗体の軽鎖タイプはKappa鎖であることを特徴とする、請求項6または7に記載の抗体。
【請求項9】
ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体の重鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列、または、配列番号1と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項11】
前記抗体の軽鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸配列、または、配列番号2と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項12】
請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項13】
前記抗体の軽鎖、前記抗体の重鎖、前記抗体の軽鎖可変領域、前記抗体の重鎖可変領域、および前記抗体における1つ若しくは複数のCDR領域のうち、1つまたは複数を含むことを特徴とする、請求項12に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項14】
Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fdフラグメント、FVフラグメント、単離されたCDR、及び単鎖抗体のうち、いずれか一つであることを特徴とする、請求項13に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項15】
前記抗原結合フラグメントは一本鎖抗体であり、前記一本鎖抗体のアミノ酸全配列は下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項14に記載の抗原結合フラグメント:
(c1)配列番号16の1~239番目までのアミノ酸配列、または、配列番号16の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c2)配列番号18の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号18の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c3)配列番号19の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号19の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c4)配列番号20の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号20の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c5)配列番号21の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号21の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c6)配列番号22の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号22の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性をするアミノ酸配列;
(c7)配列番号23の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号23の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c8)配列番号24の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号24の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c9)配列番号25の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号25の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c10)配列番号26の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号26の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c11)配列番号27の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号27の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c12)配列番号28の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号28の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【請求項16】
請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体または請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質。
【請求項17】
請求項14又は15に記載の一本鎖抗体とタグタンパク質とから形成される、タグタンパク質を有する一本鎖抗体であることを特徴とする、請求項16に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項18】
前記タグタンパク質は、Fcであることを特徴とする、請求項17に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項19】
前記Fcは、IgG Fcであることを特徴とする、請求項18に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項20】
前記IgGは、IgG4であることを特徴とする、請求項18に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項21】
前記Fcのアミノ酸配列は、配列番号16の240~472番目で示されるアミノ酸配列、または、配列番号16のN末端からの240~472番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項18~20のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
【請求項22】
前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項21に記載の抗体融合タンパク質:
(d1)配列番号16のアミノ酸配列、または配列番号16と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d2)配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d3)配列番号19のアミノ酸配列、または配列番号19と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d4)配列番号20のアミノ酸配列、または配列番号20と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d5)配列番号21のアミノ酸配列、または配列番号21と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d6)配列番号22のアミノ酸配列、または配列番号22と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d7)配列番号23のアミノ酸配列、または配列番号23と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d8)配列番号24のアミノ酸配列、または配列番号24と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d9)配列番号25のアミノ酸配列、または配列番号25と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d10)配列番号26のアミノ酸配列、または配列番号26と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d11)配列番号27のアミノ酸配列、または配列番号27と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d12)配列番号28のアミノ酸配列、または配列番号28と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項23】
請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体または請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体。
【請求項24】
請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、または請求項23に記載の二重抗体をコードすることを特徴とする、核酸分子。
【請求項25】
前記核酸分子において、請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体の重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号3の5’末端からの91~105番目、148~192番目、292~318番目で示されることを特徴とする、請求項23に記載の核酸分子。
【請求項26】
前記核酸分子において、請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号4の5’末端からの70~102番目、148~168番目、265~291番目で示されることを特徴とする、請求項23に記載の核酸分子。
【請求項27】
前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号3の5’末端からの1~351番目までのヌクレオチド配列、または、配列番号3の5’末端からの1~351番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項25に記載の核酸分子。
【請求項28】
前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号4の5’末端からの1~321番目までのヌクレオチド配列、又は、配列番号4の5’末端からの1~321番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項26に記載の核酸分子。
【請求項29】
前記核酸分子において、前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が、配列番号3のヌクレオチド配列、または、配列番号3と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項27に記載の核酸分子。
【請求項30】
前記核酸分子において、前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列が、配列番号4のヌクレオチド配列、または、配列番号4と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項28に記載の核酸分子。
【請求項31】
前記一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列が、配列番号17の5’末端からの1~717番目までのヌクレオチド配列、または、配列番号17の5’末端からの1~717番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項27または28に記載の核酸分子。
【請求項32】
前記のタグタンパク質を有する一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列が、配列番号17のヌクレオチド配列、または、配列番号17と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項31に記載の核酸分子。
【請求項33】
請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。
【請求項34】
前記組換え細胞は、高等真核宿主細胞、低等真核宿主細胞、原核細胞であることを特徴とする、請求項33に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。
【請求項35】
前記高等真核宿主細胞は哺乳動物細胞であり、前記低等真核宿主細胞は酵母細胞であり、前記原核細胞は細菌細胞、大腸菌であることを特徴とする、請求項34に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。
【請求項36】
前記組換えベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ、またはウイルスベクターであることを特徴とする、請求項33に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。
【請求項37】
請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、または請求項23に記載の二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されることを特徴とする、ADC抗体。
【請求項38】
(A1)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、または請求項37に記載のADC抗体と、
(A2)薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と、
を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項39】
請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物の、以下のいずれか一項における使用:
(B1)4-1BBの検出用製品の調製、または4-1BBの検出;
(B2)4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断するための製品の調製、または4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路の遮断;
(B3)T細胞活性化を刺激するための製品の調製、またはT細胞活性化の刺激;
(B4)T細胞がIFN-γを分泌することを促進するための製品の調製、又はT細胞によるIFN-γの分泌の促進;
(B5)結腸癌細胞の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌細胞の増殖の抑制;
(B6)結腸癌腫瘍の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌腫瘍の増殖の抑制;
(B7)結腸癌の治療および/または予防のための製品の調製、または、結腸癌の治療および/または予防;
(B8)免疫増強剤として、または免疫増強剤の調製;
(B9)免疫調整剤として、または免疫調整剤の調製;
(B10)4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療及び/又は予防及び/又は診断するための製品の調製、又は、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患の治療及び/又は予防及び/又は診断;
(B11)癌を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、癌の治療および/または予防および/または診断;
(B12)自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、自己免疫疾患の治療および/または予防および/または診断;
(B13)炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、炎症性疾患の治療および/または予防および/または診断;
(B14)感染性疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、感染性疾患の治療および/または予防および/または診断。
【請求項40】
前記4-1BBは、ヒト4-1BBまたはサル4-1BBであることを特徴とする、請求項39に記載の使用。
【請求項41】
前記癌は4-1BB発現の調節不全を示す癌であり、前記自己免疫疾患は4-1BB発現の調節不全を示す自己免疫疾患であり、前記炎症性疾患が4-1BB発現の調節不全を示す炎症性疾患であり、前記感染性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す感染性疾患であることを特徴とする、請求項39に記載の使用。
【請求項42】
以下のいずれか一つである方法:
(C1)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞を用い、測定サンプルについて検査を行う工程を含む、4-1BBを検出する方法;
(C2)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する方法;
(C3)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、T細胞活性化を刺激する工程を含む、T細胞活性化を刺激する方法;
(C4)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する工程を含む、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する方法;
(C5)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法;
(C6)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法;
(C7)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、結腸癌を治療および/または予防する工程を含む、結腸癌を治療および/または予防する方法;
(C8)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法;
(C9)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法;
(C10)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C11)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、癌を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、癌を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C12)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C13)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C14)請求項1~11のいずれか一項に記載の抗体、請求項12~15のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項16~22のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項23に記載の二重抗体、請求項24~32のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項33~36のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項37に記載のADC抗体、または請求項38に記載の医薬組成物を用い、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法。
【請求項43】
前記4-1BBは、ヒト4-1BBまたはサル4-1BBであることを特徴とする、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
前記癌は4-1BB発現の調節不全を示す癌であり、前記自己免疫疾患は4-1BB発現の調節不全を示す自己免疫疾患であり、前記炎症性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す炎症性疾患であり、前記感染性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す感染性疾患であることを特徴とする、請求項42に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー9(TNFRSF9)遺伝子によってコードされる4-1BB(CD137)は、KwonおよびWeissmanにより、活性化されたマウスT細胞のクローン、分化、スクリーニングの過程において初めて発見されたものである。Schwarzhらは、ヒト活性化T細胞から、マウス4-1BBと相同性を有するヒト4-1BBを単離し、且つCD137と命名した。I型膜糖タンパク質である4-1BBは、PD-1/PD-L1とは異なり、4-1BBの発現は、活性化依存的であり、また、4-1BBは、T細胞活性化の共刺激シグナルを媒介し、活性化されたNK細胞、活性化されたT細胞、樹状細胞(DC)、マスト細胞、単球、好中球およびTreg細胞などの免疫細胞の表面に広く存在する。
【0003】
255個のアミノ酸を有するヒト4-1BBは、細胞表面において単量体及び二量体の形態で発現し、且つ、容易にリガンドと三量体を形成してシグナル伝達を開始する。
【0004】
4-1BBは、そのシグナル伝達経路によりT細胞、特にCD8+T細胞の分化、増殖およびサイトカインの発生が促進されるという活性化共刺激分子であることが、研究により明らかになっている。4-1BBは、活性化されたT細胞に主に発現し、T細胞の免疫応答の中期および後期において作用する。4-1BBのシグナル伝達経路により、腫瘍特異的CD8+T細胞の機能が増強し、それにより抗腫瘍効果が発揮される。また、NK細胞、DCおよびCD4+T細胞の免疫機能が増強することにより、CD8+T細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答が向上する。4-1BBは、TNFR関連因子であるTRAF1およびTRAF2を動員してヘテロ三量体を形成し、c-JunN末端キナーゼ(JNK)経路、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)経路、並びにβ-カテニン及びAKT経路を介してシグナル伝達を増強し、且つ主要の転写因子NF-κBを介して4-1BBシグナルを調節することにより、サイトカインの発生および分泌を促進する。さらに、4-1BB/4-1BBLの相互作用により、T細胞の、ウイルス感染に対する免疫防御効果は増強し得る。さらに、4-1BBの単独療法および併用療法による腫瘍治療モデルでは、T細胞における持続的な抗腫瘍防御性を示す記憶応答が、すでに確立されている。
【0005】
現在、4-1BBに関するアゴニストは市販されておらず、最も早いものであってもまだ臨床治験の段階にあり、癌を含む各種の疾患の免疫治療方法に対する需要を満たすことができない。したがって、4-1BBをターゲットとする、「アクセラレータ」のような位置づけの薬物を開発し、Rocheのリツキサンのような既存のがん薬物を利用して免疫システムの活性化を助ける新たな腫瘍免疫治療手段を開発することは、市場の需要に応え、PD-1/PD-L1の薬物耐性の欠点を克服することができるため、好適な応用が見込まれる。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその応用を提供することを目的とする。
【0007】
本発明に提供されるヒト4-1BBに結合可能な分子は、ヒト化抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fabフラグメント、ScFvフラグメント);または、抗体融合タンパク質(例えば、完全なヒト化抗体、ScFvフラグメント、Fabフラグメントと他のタンパク質とが融合して形成される抗体融合タンパク質);または、ヒト化抗ヒト4-1BB抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されたADC抗体;又は、完全なヒト化抗体、ScFvフラグメント、Fabフラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体であってもよい。
【0008】
第1の態様において、本発明は抗体を特許請求している。
【0009】
本発明は、重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3のアミノ酸配列が、順番に、配列番号1のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示され、軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3のアミノ酸配列が、順番に、配列番号2のN末端からの24~34番目、50~56番目、89~97番目で示される抗体を特許請求している。
【0010】
さらに、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0011】
(a1)配列番号1のN末端からの1~117番目(即ち、配列番号16のN末端からの1~117番目)、または配列番号1のN末端からの1~117番目(即ち、配列番号16のN末端からの1~117番目)と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a2)配列番号18のN末端からの1~117番目、または配列番号18のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a3)配列番号19のN末端からの1~117番目、または配列番号19のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a4)配列番号20のN末端からの1~117番目、または配列番号20のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a5)配列番号21のN末端からの1~117番目、または配列番号21のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a6)配列番号22のN末端からの1~117番目、または配列番号22のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a7)配列番号23のN末端からの1~117番目、または配列番号23のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a8)配列番号24のN末端からの1~117番目、または配列番号24のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a9)配列番号25のN末端からの1~117番目、または配列番号25のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a10)配列番号26のN末端からの1~117番目、または配列番号26のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a11)配列番号27のN末端からの1~117番目、または配列番号27のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a12)配列番号28のN末端からの1~117番目、または配列番号28のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0012】
さらに、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0013】
(b1)配列番号2のN末端からの1~107番目(即ち、配列番号16のN末端からの133~239番目)、または配列番号2のN末端からの1~107番目(即ち、配列番号16のN末端からの133~239番目)と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b2)配列番号18のN末端からの133~239番目、または配列番号18のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b3)配列番号19のN末端からの133~239番目、または配列番号19のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b4)配列番号20のN末端からの133~239番目、または配列番号20のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b5)配列番号21のN末端からの133~239番目、または配列番号21のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b6)配列番号22のN末端からの133~239番目、または配列番号22のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b7)配列番号23のN末端からの133~239番目、または配列番号23のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b8)配列番号24のN末端からの133~239番目、または配列番号24のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b9)配列番号25のN末端からの133~239番目、または配列番号25のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b10)配列番号26のN末端からの133~239番目、または配列番号26のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b11)配列番号27のN末端からの133~239番目、または配列番号27のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b12)配列番号28のN末端からの133~239番目、または配列番号28のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0014】
前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトIgG4定常領域であり、配列番号1のN末端からの118~444番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒトKappa軽鎖定常領域であり、配列番号2のN末端から108~214番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。
【0015】
さらに、前記重鎖のアミノ酸配列は、配列番号1であるか、配列番号1と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号2であるか、配列番号2と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0016】
本発明に係る抗体は、例えばIgG、IgM、IgE、IgAまたはIgDなどの任意のタイプであってもよい。好ましくは、4-1BB抗体は、IgGタイプであり、例えば、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプまたはIgG4サブタイプ、より好ましくはIgG4サブタイプである。
【0017】
本発明に係る抗体の軽鎖タイプは、κ鎖であってもよく、λ鎖であってもよいが、より好ましくはKappa鎖である。
【0018】
本発明の具体的な実施形態において、前記抗体は、具体的に、ヒト化抗ヒト4-1BB抗体Hanke10F4である。前記Hanke10F4は、主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン1およびドメイン2Aに結合する。
【0019】
本発明にかかる抗体は、以下の特性または特徴の1つ以上を有する。
1)ヒト4-1BBに特異的に結合する;
2)ヒト4-1BB及びカニクイザル4-1BBに結合する;
3)ヒト4-1BBまたはカニクイザル4-1BBに結合する;
4)ヒト4-1BBL(4-1BBリガンド)とヒト4-1BBとの結合を、ある程度ブロックする;
5)IgG、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である;
6)ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【0020】
本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト4-1BBに対してアゴニストの活性を有し、CD4T細胞及びCD8T細胞の増殖を刺激することができる。また、細胞表面の4-1BB分子に結合することにより、下流のNF-κBシグナル伝達経路の活性化を引き起こすことができ、それにより、サイトカインIFN-γの発生及び分泌を顕著に促進し、且つヒト4-1BB遺伝子ノックインによるヒト化マウスの体内の腫瘍の発生及び進行を顕著に抑制することができる。前記抗体又はその抗原結合部分は、免疫細胞の活性を調節することにより免疫システムを調節することができ、免疫増強剤による抗腫瘍若しくは抗ウイルスの免疫応答のための免疫増強剤として、又はT細胞により媒介される自己免疫疾患のための免疫調節剤として使用することができることをある程度示す。
【0021】
本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製でき、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などの不死化真核細胞などの形質転換細胞において発現するにより調製することができる。抗体は、当該技術分野で周知の方法によって、1つのクラスまたはサブタイプから別のクラスまたはサブタイプに転換することができる。さらに、本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【0022】
本発明に係る抗体は、以下に詳細に説明されるように、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、Bリンパ球のウイルスまたは癌遺伝子形質転換、または組換え抗体技術などの従来のモノクローナル抗体技術を含む、当該技術分野で知られている技術によって発生させることができる。
【0023】
ハイブリドーマの発生は、当技術分野で周知の一般的な方法である。まず、ヒト4-1BBタンパク質を一過性にトランスフェクトして発現させ、Balb/cマウスを免疫する。ヒト4-1BB抗原のアミノ酸配列は、配列番号5(ただし、24~184番目は細胞外ドメインである)で示され、免疫抗原は、単離されたヒト4-1BBまたは精製されたヒト4-1BBであり、ヒト4-1BBフラグメント、例えば、ヒト4-1BBの細胞外ドメインであってもよい。動物免疫は、例えば、マウス、ラット、ヒツジなどの非ヒト動物を免疫化する、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。ヒト4-1BB抗原で動物を免疫化した後、免疫化された動物から単離された細胞から、抗体を生成する不死化細胞株を調製する。免疫後、動物を犠牲し、不死化リンパ節および/または脾臓B細胞を得る。常法により細胞融合を行い、抗4-1BB抗体を生成する細胞である陽性細胞クローンを、ELISAによってスクリーニングする。その後、サブクローニングを繰り返し、さらにスクリーニングすることで、増殖の状態が良好であり、抗体の収率が高く、また培養上清が100%陽性であるハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマは、同系動物、免疫システムを欠く動物、およびヌードマウスにおいてインビボで増殖させたり、またはインビトロでの細胞培養において増殖させたりすることができる。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび増殖のための方法は、当業者に周知である。ハイブリドーマ細胞が分泌する免疫グロブリンサブタイプを、二相寒天拡散試験によりIgG1として検出することができる。本発明の抗体はファージディスプレイ法によっても調製できる。ヒト抗体を単離するための上記ファージディスプレイ法は、当技術分野ですでに確立されている。
【0024】
発生・発現された後の前記抗体は、抗体、二量体、一本鎖の軽鎖や重鎖、または他の免疫グロブリン形態を含むが、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などのような当該技術分野での標準的な方法により精製することができる。
【0025】
第2の態様において、本発明は、前述の抗体の抗原結合フラグメントを特許請求している。
【0026】
ここで、抗原結合フラグメントは、(1)前述抗体の軽鎖、(2)前述抗体の重鎖、(3)前述抗体の軽鎖可変領域、(4)前述抗体の重鎖可変領域、(5)前述抗体の1つまたは複数のCDR領域のうち、1つまたは複数を含み得る。
【0027】
さらに、前記抗原結合性フラグメントは、(1)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFabフラグメント、(2)ヒンジ領域がジスルフィド結合により連結されている2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab’)2フラグメント、(3)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント、(4)抗体の一方のアームのVLおよびVHドメインからなるFVフラグメント、(5)単離されたCDR(例えば、軽鎖由来のCDRおよび/または重鎖由来のCDR)、及び(6)一本鎖抗体などのうち、いずれか一つであってもよい。ただし、一本鎖抗体はscFv構造であってもよく、また、一本鎖抗体は、異なるタグ、例えば、scFv-His、scFv-Fcなどを担持することができる。
【0028】
本発明の具体的な実施形態において、本発明にかかる抗原結合フラグメントは、タグ付き一本鎖抗体(scFv-Fc)である。一本鎖抗体(scFv-Fc)は、VHドメインのVLドメインに連結された単一ポリペプチド鎖を含むヒトIgG4 Fcタグから構成され得る。ただし、VLドメインとVHドメインとは一価分子を形成するように対合する。一本鎖抗体は、当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる。
【0029】
この態様において、本発明は、特に抗4-1BB一本鎖抗体を特許請求している。
【0030】
本発明は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結してなり、前記重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2及びHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2及びLHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの156~166番目、182~188番目、221~229番目で示される、抗4-1BB一本鎖抗体を特許請求している。
【0031】
さらに、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0032】
(a1)配列番号16のN末端からの1~117番目、または配列番号16のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a2)配列番号18のN末端からの1~117番目、または配列番号18のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a3)配列番号19のN末端からの1~117番目、または配列番号19のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a4)配列番号20のN末端からの1~117番目、または配列番号20のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a5)配列番号21のN末端からの1~117番目、または配列番号21のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a6)配列番号22のN末端からの1~117番目、または配列番号22のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a7)配列番号23のN末端からの1~117番目、または配列番号23のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a8)配列番号24のN末端からの1~117番目、または配列番号24のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a9)配列番号25のN末端からの1~117番目、または配列番号25のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a10)配列番号26のN末端からの1~117番目、または配列番号26のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a11)配列番号27のN末端からの1~117番目、または配列番号27のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a12)配列番号28のN末端からの1~117番目、または配列番号28のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0033】
さらに、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0034】
(b1)配列番号16のN末端からの133~239番目、または配列番号16のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b2)配列番号18のN末端からの133~239番目、または配列番号18のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b3)配列番号19のN末端からの133~239番目、または配列番号19のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b4)配列番号20のN末端からの133~239番目、または配列番号20のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b5)配列番号21のN末端からの133~239番目、または配列番号21のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b6)配列番号22のN末端からの133~239番目、または配列番号22のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b7)配列番号23のN末端からの133~239番目、または配列番号23のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b8)配列番号24のN末端からの133~239番目、または配列番号24のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b9)配列番号25のN末端からの133~239番目、または配列番号25のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b10)配列番号26のN末端からの133~239番目、または配列番号26のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b11)配列番号27のN末端からの133~239番目、または配列番号27のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b12)配列番号28のN末端からの133~239番目、または配列番号28のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0035】
さらに、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は下記のいずれか一つである。
【0036】
(c1)配列番号16の1~239番目、または配列番号16の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c2)配列番号18の1~239番目、または配列番号18の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c3)配列番号19の1~239番目、または配列番号19の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c4)配列番号20の1~239番目、または配列番号20の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c5)配列番号21の1~239番目、または配列番号21の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c6)配列番号22の1~239番目、または配列番号22の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性をするもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c7)配列番号23の1~239番目、または配列番号23の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c8)配列番号24の1~239番目、または配列番号24の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c9)配列番号25の1~239番目、または配列番号25の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c10)配列番号26の1~239番目、または配列番号26の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c11)配列番号27の1~239番目、または配列番号27の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c12)配列番号28の1~239番目、または配列番号28の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0037】
第3の態様において、本発明は、前記抗体または前記抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質を特許請求している。
【0038】
ここで、前記の他のタンパク質は、毒素、酵素、細胞膜タンパク質分子、サイトカインまたは受容体タンパク質などであってもよい。
【0039】
さらに、本発明が特許請求している前記抗体融合タンパク質は、前記一本鎖抗体とタグタンパク質とから形成される、タグタンパク質を有する一本鎖抗体であってもよい。
【0040】
本発明の具体的な実施形態において、前記タグタンパク質はFcである。
【0041】
さらに、前記Fcは、例えば、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgDに由来してもよい。好ましくは、前記Fcは、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプ、またはIgG4サブタイプなどのIgGタイプに由来し、より好ましくはIgG4サブタイプに由来する。前記Fcは、好ましくはヒト由来である。
【0042】
さらに、前記Fcのアミノ酸配列は、配列番号16の240~472番目で示されるか、または配列番号16のN末端からの240~472番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有する。
【0043】
より詳しくは、前記のタグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであってもよい。
【0044】
(d1)配列番号16で示されるものか、または配列番号16と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d2)配列番号18で示されるものか、または配列番号18と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d3)配列番号19で示されるものか、または配列番号19と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d4)配列番号20で示されるものか、または配列番号20と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d5)配列番号21で示されるものか、または配列番号21と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d6)配列番号22で示されるものか、または配列番号22と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d7)配列番号23で示されるものか、または配列番号23と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d8)配列番号24で示されるものか、または配列番号24と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d9)配列番号25で示されるものか、または配列番号25と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d10)配列番号26で示されるものか、または配列番号26と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d11)配列番号27で示されるものか、または配列番号27と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d12)配列番号28で示されるものか、または配列番号28と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0045】
第4の態様においては、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、または前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体と、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体を特許請求している。
【0046】
第5の態様においては、本発明は、核酸分子を特許請求している。
【0047】
本発明に係る核酸分子は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質、または前記二重抗体をコードする。
【0048】
本発明に係る核酸分子は、DNAであっても、RNAであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、前記核酸分子は、cDNA分子である。
【0049】
さらに、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号3の5’末端からの91~105番目、148~192番目、292~318番目で示され、前記抗体の軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号4の5’末端からの70~102番目、148~168番目、265~291番目で示されるものである。
【0050】
さらに、前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号3の5’末端からの1~351番目、または配列番号3の5’末端からの1~351番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するものである(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号4の5’末端からの1~321番目、又は配列番号4の5’末端からの1~321番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するものである(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0051】
前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖定常領域の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号3の5’末端からの352~1332番目である。前記抗体の前記軽鎖定常可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号4の5’末端からの322~642番目である。
【0052】
より具体的には、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号3、または配列番号3と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上もしくは75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号4、または配列番号4と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上もしくは75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0053】
本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。ハイブリドーマにより発現される抗体について、PCR増幅またはcDNAクローニング技術により、前記ハイブリドーマにより発生する抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAを得ることができる。
【0054】
本発明に係る核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖の一部、全長軽鎖もしくは重鎖、または抗体誘導体もしくはその抗原結合フラグメントの、アミノ酸配列をコードすることができる。
【0055】
VHをコードする単離されたDNAは、VHをコードするDNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)をコードする別のDNA分子に連結することにより、全長重鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト重鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgD定常領域であってもよい。IgG4定常領域が好ましい。
【0056】
VL領域をコードする単離されたDNAは、VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に連結することにより、全長軽鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、Kappa定常領域またはLambda定常領域であってもよい。
【0057】
この態様において、本発明は、特に、前述一本鎖抗体、前述タグタンパク質を有する一本鎖抗体、または前述融合抗体をコードする核酸分子を特許請求している。
【0058】
さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2及びHCDR3をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号17の5’末端からの91-105番目、148-192番目、292-318番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2及びLHCDR3をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号17の5’末端からの466-498番目、544-564番目、661-687番目で示されるものである。
【0059】
さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17の5’末端からの1-351番目、又は配列番号17の5’末端からの1-351番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17の5’末端からの397-717番目、又は配列番号17の5’末端からの397-717番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0060】
より具体的には、前記一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17の5’末端からの1~717番目、または配列番号17の5’末端からの1~717番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0061】
より具体的には、前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17、または配列番号17と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0062】
本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。
【0063】
第6の態様において、本発明は、前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、または組換え細胞を特許請求している。
【0064】
ここで、前記ベクターは、抗体若しくはその抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、またはタグタンパク質を有する一本鎖抗体(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)などの結合分子、又は融合抗体の発現のための、発現ベクターに用いられるものである。
【0065】
本発明に係る抗体(または一本鎖抗体又は融合抗体)を発現させるためには、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、当該DNA分子の転写および翻訳を開始させる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターまたは同一の発現ベクターに挿入することができる。挿入方法は、例えば、抗体遺伝子フラグメントの相補的制限サイトとベクターとの連結などの公知の任意の適切な方法を用いることができる。本発明に係る抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、任意の抗体タイプおよびサブタイプの全長抗体遺伝子を作製することができる。
【0066】
発明は、本発明に係る核酸分子を含む宿主細胞(すなわち、前記組換え細胞)をさらに提供する。前記宿主細胞は、発現ベクターに利用可能な任意の細胞であってもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を例えば含む哺乳動物の細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの低等真核宿主細胞、細菌細胞、大腸菌などの原核細胞であってもよい。宿主細胞に組換え核酸構築物を導入するためのトランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-グルカン、リポフェクション、ファージ感染などが挙げられる。抗体遺伝子をコードする発現ベクターを公知の方法によって宿主細胞に導入することができ、結合分子を宿主細胞に発現させるように当該宿主細胞を十分な程度に培養することで、抗体を作製することができる。
【0067】
前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクターであってもよい。前記プラスミドは、pCDNA3.4およびpCDNA3.4-Lまたは他のものであってもよい。
【0068】
定向進化および点変異などの公知の方法を用い、本発明に係る抗4-1BB抗体(または一本鎖抗体または融合抗体)のヌクレオチド配列を突然変異させることは、当業者であれば容易にできる。これらの人工的に修飾された、本発明に係る抗4-1BB抗体(または一本鎖抗体または融合抗体)のヌクレオチド配列と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上または75%以上の同一性を有するヌクレオチドは、前記抗4-1BB抗体をコードし且つ前記抗4-1BB抗体の活性を有する限り、すべて、本発明のヌクレオチド配列に由来し且つ本発明の配列と同等のヌクレオチドに相当する。
【0069】
本発明の具体的な実施形態において、配列番号3で示されるDNAフラグメント(抗体の重鎖をコードする遺伝子)をpcDNA3.4ベクターの制限酵素切断サイトXbaIと制限酵素切断サイトHandIIIとの間にクローニングして、前記抗体の重鎖を発現する組換え発現ベクター(pcDNA3.4-Hと命名する)が得られ、配列番号4で示されるDNAフラグメント(抗体の軽鎖をコードする遺伝子)をpcDNA3.4ベクターの制限酵素切断サイトXbaIと制限酵素切断サイトHandIIIとの間にクローニングして、前記抗体の軽鎖を発現する組換え発現ベクター(pcDNA3.4-Lと命名する)が得られた。タンパク質の発現をより容易にするために、前記組換え発現ベクターを構築する場合は、配列番号3及び配列番号4で示されるDNAフラグメント(抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子)の上流に、コザック(kozak)の共認識配列(5’-GCCACC-3’)、及び、配列番号3及び配列番号4の5’末端と連結される、シグナルペプチドのコード配列(5’-ATGGAGTTTGGGCTGAGTTGGGTCTTTCTGGTCGCAATTC TGCTGAAGGGAGTGCAGTGC-3’)も導入した。前記組換え細胞は、前記抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ発現する2つの前記組換え発現ベクター(pcDNA3.4-H及びpcDNA3.4-L)をHEK293細胞にコトランスフェクトして得た組換え細胞である。つまり、前記組換え細胞は、前記抗体Hanke10F4を発現することができる。
【0070】
第7の態様において、本発明は、ADC抗体を特許請求している。
【0071】
本発明が特許請求している前記ADC抗体は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質(例えば、タグタンパク質を有する一本鎖抗体)、または前記二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物と、のカップリングにより形成される。
【0072】
第8の態様において、本発明は、医薬組成物を特許請求している。
【0073】
本発明に係る医薬組成物は、(A1)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、または前記ADC抗体と、(A2)薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と、を含む。
【0074】
第9の態様において、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクター若しくは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物の、以下の(B1)~(B14)のいずれか一項に記載の使用を特許請求している。
【0075】
(B1)4-1BBの検出用製品の調製、または4-1BBの検出
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液または組織中の4-1BBを検出するために用いられており、
ここで、前記4-1BBは、ヒト4-1BBであってもよく、サル4-1BBであってもよい;
(B2)4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断するための製品の調製、または4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路の遮断;
(B3)T細胞活性化を刺激するための製品の調製、またはT細胞活性化の刺激;
(B4)T細胞がIFN-γを分泌することを促進するための製品の調製、又はT細胞によるIFN-γの分泌の促進;
(B5)結腸癌細胞の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌細胞の増殖の抑制;
(B6)結腸癌腫瘍の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌腫瘍の増殖の抑制;
(B7)結腸癌の治療および/または予防のための製品の調製、または、結腸癌の治療および/または予防;
(B8)免疫増強剤として、または免疫増強剤の調製;
(B9)免疫調整剤として、または免疫調整剤の調製;
(B10)4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療及び/又は予防及び/又は診断するための製品の調製、又は、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患の治療及び/又は予防及び/又は診断;
(B11)癌を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、癌の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記癌は4-1BB発現の調節不全を示す癌であってもよい;
(B12)自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、自己免疫疾患の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記自己免疫疾患は4-1BB発現の調節不全を示す自己免疫疾患であってもよい;
(B13)炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、炎症性疾患の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記炎症性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す炎症性疾患であってもよい;
(B14)感染性疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、感染性疾患の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記感染性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す感染性疾患であってもよい。
【0076】
第9の態様において、本発明は、以下の方法(C1)~方法(C14)のいずれか一つを特許請求している。
【0077】
(C1)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞を用い、測定サンプルについて検出を行う工程を含む、4-1BBを検出する方法、
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の4-1BBを検出するために用いられており、
ここで、前記4-1BBは、ヒト4-1BBであってもよく、サル4-1BBであってもよい;
(C2)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する方法;
(C3)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、T細胞活性化を刺激する工程を含む、T細胞活性化を刺激する方法;
(C4)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する工程を含む、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する方法;
(C5)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法;
(C6)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法;
(C7)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌を治療および/または予防する工程を含む、結腸癌を治療および/または予防する方法;
(C8)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法;
(C9)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法;
(C10)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C11)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、癌を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、癌を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C12)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C13)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C14)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法。
【図面の簡単な説明】
【0078】
図1】ハイブリドーマ抗体のSDS-PAGEを示す図である。
図2】抗体の構造を示す図である。
図3】ハイブリドーマによって分泌される抗体がヒト4-1BBを認識することを示す図である。
図4】ハイブリドーマによって分泌される抗体がサル4-1BBを認識することを示す図である。
図5】抗原結合フラグメントがヒト4-1BBを認識することを示す図である。
図6】抗原結合フラグメントがサル4-1BBを認識することを示す図である。
図7】FACSによる、各抗原結合フラグメントのヒト4-1BBに対する親和性の比較を示す図である。
図8】Hanke10F4とHKB6との親和性の比較を示す図である。
図9】抗体Hanke10F4が4-1BBLと4-1BBとの結合をブロックすることを示す図である。
図10】抗体Hanke10F4とコントロール抗体とのエピトープ競合を示す図である。
図11】FACSにより測定された、それぞれの変異点において突然変異させた抗原に対する抗体の親和性を示す図である。
図12】Hanke10F4とHKB6とのエピトープ競合を示す図である。
図13】ルシフェラーゼ活性測定を示す図である。Aは「3.5ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定」の結果である。Bは「3.9安定性(1)加速安定性」の検出結果である。
図14】抗体Hanke10F4による、CD4T細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの3本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度(2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml)の条件でのCD4T細胞の活性化の効果を示す。
図15】抗体Hanke10F4による、CD8T細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの3本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度(3μg/ml、0.5μg/ml、0.08μg/ml)の条件でのCD4T細胞の活性化の効果を示す。
図16】抗体がMC38腫瘍を阻害するモデルである。各線は、それぞれ1匹のマウスの腫瘍増殖曲線を表す。
図17】抗体Hanke10F4のチャレンジ試験の図である。
図18】抗体Hanke10F4の毒性試験の図である。
図19】Hanke10F4のTm測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0079】
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特記しない限り、いずれも常法である。以下の実施例に使用された試験材料は、特記しない限り、いずれも従来の生化学試薬販売元から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、いずれも実験を3回繰り返すようにし、それらの結果の平均値を取った。
【0080】
以下の実施例において、陽性対照抗体は、Pfizer社のUtomilumab(PF-05082566、特許番号:US8337850 B2)およびBristol Myers Squibb社のUrelumab(BMS-663513、特許番号:US7288638 B2)であり、この二つの抗体は、いずれも抗ヒト4-1BB抗体である。陰性対照抗体は、ヒトIgG(Nanjing GenScript,Chinaの製品)である。
【0081】
以下の実施例において、特に断らない限り、配列表中の各ヌクレオチド配列のいずれにおいても、その1番目の位置(第1位)が当該DNAの5’末端のヌクレオチドであり、末位が当該DNAの3’末端のヌクレオチドである。
【0082】
以下の実施例のpCDNA3.4ベクターは、Invitrogen、Cat:A14697である。
【0083】
慣用の装置および試薬は、以下の通りである。
1.96ウェルマイクロプレート(Nunc社)
2.プレートコーティングバッファー:pH7.0のリン酸塩緩衝液。
3.洗浄液:0.05体積%のTween20のみを含有するpH7.0のリン酸塩緩衝液
4.ブロッキング溶液:10g/LのBSAのみを含有する洗浄液
5.ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたアビジン
6.発色基質:テトラメチルベンジジン
7.停止液:1M硫酸
【0084】
ここで、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液の溶媒は水であり、溶質は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記塩化ナトリウムの濃度は135mMであり、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記塩化カリウムの濃度は2.7mMであり、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記リン酸二水素カリウムの濃度は1.5mMであり、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記リン酸水素二ナトリウムの濃度は8mMである。
【0085】
実施例1:ハイブリドーマ抗体の作製
【0086】
1.1 マウスの免疫化
4~6週齢のBalb/cマウス3匹とC57b1/6マウス3匹を選択し、ヒト4-1BB細胞外セグメント(配列番号5の24~186番目)を抗原とし、マウスを2週間毎に1回、合計3回免疫した。3回目の免疫後、尾静脈から採血し、抗体の発生を間接ELISAで測定した。好適な免疫マウスを選択し、眼球摘出後、頸椎脱臼により犠牲にした。マウスの脾細胞を無菌環境下で採取し、常法に従い細胞融合を行い、抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を作製した。
【0087】
1.2 ハイブリドーマのスクリーニング
抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞をELISAによってスクリーニングした。ELISAプレートを10μg/mlのヒト4-1BB(配列番号5)で被覆し、4℃で一晩ブロックした。試験細胞培養上清を順番に添加し、37℃で1時間インキュベートし、プレートをPBSTで3回洗浄した。4000倍で希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス(ThermoFisher社)を添加し、37℃で45分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した後、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine、TMB)(ThermoFisher社)基質で発色させた後、OD値を450nmの波長で測定した。
【0088】
陽性細胞クローンをELISA法によりスクリーニングし、すべてのハイブリドーマ細胞培養上清が100%陽性として検出されるまで、サブクローンを繰り返した。ハイブリドーマ細胞のクローニングには限界希釈法を用いた。培養プレートを37℃、5%COインキュベーター中でインキュベートし、約5日後、細胞クローンが顕微鏡で観察された。適切な時期に液体を交換して検出を行い、陽性で且つよく増殖しているモノクローナル細胞株を採取した。その拡大培養を行うことで、抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を得て、これをタイムリーに凍結した。
【0089】
1.3 ハイブリドーマ抗体の同定
スクリーニングして得た、陽性で且つよく増殖している抗ヒト4-1BB抗体ハイブリドーマ細胞株を、段階的に拡大培養し、遠心分離(10000rpmで10分間)して上清を採取した。得た上清をProtein Gアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Protein Gカラム(GE社)をPBSで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体A(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH5.0である)を使用して、5つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体B(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、pH3.5である)を使用して、5つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した。その後、30KDa濃縮遠心管を使用して濃縮することで、抗体を得た。
【0090】
免疫化によって得られた15個のハイブリドーマ抗体細胞株を、スクリーニングすることで、最終的に6つの候補ハイブリドーマ親細胞株を得た。サブタイプ同定および予備スクリーニングを経た後の細胞株の詳細および対応する抗体は表1に示す。
【0091】
【0092】
13F8H8及び37G11E2B3の2つの候補を除去し、細胞上清を収集し、それぞれ精製、濃縮を行った後、サンプルをSDS-PAGE電気泳動に供した。電気泳動の測定結果は図1に示す。
【0093】
得られた抗ヒト4-1BB抗体について配列決定を行った結果、得られた抗ヒト4-1BB抗体は、150Kbの分子量を有し、重鎖と軽鎖を含み、典型的なインタクト抗体であることが示された。抗体の構造は図2に示す。
【0094】
1.4 ハイブリドーマが分泌する抗体による、ヒト4-1BBの認識
4種のハイブリドーマが分泌する抗体がヒト4-1BBを認識する親和性を、ELISAにより評価した。96ウェルプレート(96ウェルマイクロプレート、Nunc社)をヒト4-1BB(配列番号5)で被覆し、濃度1μg/ml、100μl/ウェルの条件で、4℃で一晩放置した。プレートを3回洗浄し、300μlブロッキング溶液(配合は上記の通りである)をウェル毎に加え、37℃で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄液(配合は上記の通りである)で3回洗浄し、抗体を試料希釈液(1%ウシ血清アルブミンを加えたPBS-T)で4000ng/mlに希釈し、7本のEpチューブで4倍希釈し、勾配溶液とした。濃度ごとに、2つの複製ウェルを設け、100μl/ウェルの条件で、1時間インキュベートした。プレートを洗浄液で3回洗浄し、8000倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス(ThermoFisher社)100μlを各ウェルに加え、0.5時間振とうした。プレートを3回洗浄し、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine,TMB)(ThermoFisher社)100μlを各ウェルに加えた。遮光下で発色させ、1M硫酸を加えて反応を停止させた。OD値をBIO-TEKELX-800マイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定した。
【0095】
上記の手順によりハイブリドーマから分泌された抗体は、いずれもヒト4-1BBを認識し、且つヒト4-1BBに結合することができた。ELISA結果であるOD450値を表2に示し、分析グラフを図3に示す。
【0096】
【0097】
1.5 ハイブリドーマが分泌する抗体による、サル4-1BBの認識
ハイブリドーマが分泌する抗体がサル4-1BBを認識する親和性を、ELISA方法により評価した。具体的に、サル4-1BB(Cy4-1BB)(配列番号6)抗原をプレートコーティングバッファー(配合は上記の通りである)で1μg/mlに希釈し、各ウェルに100μlを加えてプレートコーティングし、4℃で一晩放置した。ハイブリドーマから分泌された抗体、及び陽性対照抗体Utomilumabを試料希釈液で1000ng/mlに希釈し、7本のEpチューブを用いて10倍希釈し勾配溶液とした。濃度ごとに、2つの複製ウェルを設け、100μl/ウェルでプレートに添加し、1時間振とうした。プレートを再度洗浄した後、8000倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス(ThermoFisher社)100μlを各ウェルに加え、0.5時間振とうした。洗浄後、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine,TMB)(ThermoFisher社)100μlを添加し、発色させた。
【0098】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、ハイブリドーマから分泌された抗体はいずれもCy4-1BB分子を認識することができた。ELISA結果であるOD450値を表3に示し、分析グラフを図4に示す。
【0099】
【0100】
実施例2 抗体のヒト化およびscFv-Fc抗原結合フラグメントの特性同定
【0101】
本発明により得られた分泌型抗体37G10F4をスクリーニングして選択した。抗体遺伝子配列を分析した後、抗体Fabのホモロジーモデリングと最適化した。ヒト化突然変異部位を決定するための表面スキャニング、仮想突然変異及び分子動力学シミュレーション、重要なアミノ酸の同定等の一連の分析により、合理的なヒト化抗体を設計した。ヒト化によって、本実施例に係るさらなる同定に供する12個の、scFv-Fc(ヒトIgG4)形態の抗原結合フラグメント候補(表4)を得た。
【0102】
表4の12個のscFv-Fc(ヒトIgG4)形態の抗原結合フラグメント候補は、その重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)における相補性決定領域(CDR)がいずれも同一であり、Fc領域も同一であるが、VH及びVLにおけるフレームワーク領域(FR)にアミノ酸突然変異を有することのみが相違点である。重鎖可変領域中のHCDR1、HCDR2及びHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示され、軽鎖可変領域中のLCDR1、LCDR2及びLHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの156~166番目、182~188番目、221~229番目で示される。
【0103】
ここで、scFvB60103のアミノ酸配列は、配列番号16で示され、1~117番目が重鎖可変領域であり、133~239番目が軽鎖可変領域であり、240~472番目がFcである。
【0104】
遺伝子レベルに対応して、scFvB60103をコードする遺伝子配列は、配列番号17で示され、1~351番目は、重鎖可変領域をコードする遺伝子(91~105番目、148~192番目、292~318番目は3つのHCDRをそれぞれコードする)であり、397~717番目は、軽鎖可変領域をコードする遺伝子(466~498番目、544~564番目、661~687番目は3つのLCDRをそれぞれコードする)であり、718~1416番目はFcをコードする遺伝子である。
【0105】
表4の12個のscFv-Fc分子候補を発現させて精製した。ScFvB60103を例として説明する。scFvB60103抗体をコードする遺伝子(配列番号17)を、人工的に合成し、次いで、pCDNA3.4ベクターに挿入し、一過性トランスフェクションにより発現させた。一過性トランスフェクション操作は、具体的に、Expi293発現系(ThermoFisher)の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。ExpiFectamineトランスフェクション試薬、DNAプラスミドを、それぞれOptiMEMの中に添加して、溶液Aおよび溶液Bを得た後、溶液Aおよび溶液Bを均一に混合して、溶液Cを得た。溶液Cを、Expi293細胞(ThermoFisher)に添加し、そしてExpi293細胞を5日間培養した。その後、遠心分離(10000rpmで10分間)を行い、上清を採取して、得られた上清を、Protein Gアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Protein Gカラム(GE社)をPBSで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体A(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH5.0である)を使用して、5つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体B(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、pH3.5である)を使用して、5つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、30KDa濃縮遠心管を使用して濃縮することで、scFvB60103目的分子を得た。
【0106】
(1)ELISA同定
ELISAにより、ヒト4-1BB分子及びサル4-1BB分子に対するscFv分子の親和性を同定した(具体的な方法については、実施例1に記載の当該手順のとおり)。具体的に表4に示すように、12種のscFv-Fc分子は、いずれもヒト4-1BB及びサル4-1BBの両方を認識できたという結果が示された。ただし、scFvB60103の認識能力が最も良かった。ELISAの結果は図5及び図6に示す。
【0107】
【0108】
(2)FACS測定
【0109】
使用された試薬は次のとおりである:
PBSへBSAとアジ化ナトリウムを添加して得たFACSバッファー(BSAの質量%濃度が2%であり、アジ化ナトリウムの質量%濃度が0.02%である)、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体(Sigma社、遮光保存)。
【0110】
ELISA測定結果においてヒト4-1BBへの結合活性が高かったscFv分子と、ヒト4-1BB分子との親和性についての差異を、CHO-K1-hu4-1BBを使用してFACS法により測定した。実験に使用された細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、細胞膜表面において高度にヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)及び4-1BB発現無しの野生型CHO-K1(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)である。
【0111】
ヒト4-1BB遺伝子配列(配列番号7)を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってpCDNA3.4ベクターに挿入した後、Lipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いて野生型CHO-K1細胞に導入した。G418(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.から購入した)を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)を最終的に得て、予備とした。
【0112】
試験細胞をT75フラスコ中で80%の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集した(1フラスコあたり10個程度の細胞)。約1mlの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が1×10個/mlである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各試験抗体(表5ご参照)の希釈液25μlを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表5に示したとおりである。また、抗体濃度0μg/mlの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。30分間インキュベートした後、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で30分間インキュベートした。再び、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Utomilumab(Pfizer Pharmaceuticals Co.,Ltd.)を陽性対照とした。
【0113】
上記の手順により、それぞれのscFv分子の、ヒト4-1BBに対する結合活性の高さを比較した。その結果、表5および図7に示されたように、scFvB60103のEC50値が最も低かったこと、すなわち、ヒト4-1BBに対する親和性が最も高かったscFvB60103は最適な分子となり得ることが示された。
【0114】
【0115】
実施例3 IgGヒト化抗体
この実施例で同定された例示的な抗体Hanke10F4は、ハイブリドーマ分泌型抗体37G10F4をヒト化して得たもの、すなわち、表4のscFvB60103から変換されたものである。この実施例では、Hanke10F4の発現及び精製、その後の、ELISA、FACS、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の検出、T細胞活性化システムにおける同定について、詳細に説明する。
【0116】
3.1 抗体の発現および精製
全長遺伝子配列を、配列決定された遺伝子配列に基づいて合成した。Hanke10F4抗体の重鎖をコードする遺伝子は配列番号3で示され、Hanke10F4抗体の軽鎖をコードする遺伝子は配列番号4で示される。
【0117】
配列番号3の1~351番目は重鎖可変領域VHのコード遺伝子である。ここで、CDR1、CDR2およびCDR3のコード配列は、それぞれ配列番号3の91~105番目、148~192番目、292~318番目に示されている。
【0118】
配列番号4の1~321番目は、軽鎖可変領域VLのコード遺伝子である。ここで、CDR1、CDR2、およびCDR3のコード配列は、それぞれ、配列番号4の70~102番目、148~168番目、265~291番目で示される。
【0119】
配列番号3の5’末端および配列番号4の5’末端のそれぞれに、XbaIの認識配列(5’-TCTAGA-3’)、kozak共認識配列(5’-GCCACC-3’)、およびシグナルペプチドのコード配列(5’-ATGGAGTTTGGGCTGAGTTGGGTCTTTCTGGTCGCAATTCTGCTGAAGGGAGTGCAGTGC-3’)を順番に付加し、続いてシグナルペプチドのコード配列と、配列番号3の5’末端および配列番号4の5’末端とを連結した。その後、配列番号3の3’末端および配列番号4の3’末端のそれぞれに、ターミネーター(TGA)およびHindIIIの認識配列(5’-AAGCTT-3’)を順番に付加し、TGAと、配列番号3の3’末端および配列番号4の3’末端とを連結した。得られた新規DNA配列をそれぞれ、重鎖遺伝子Aおよび軽鎖遺伝子Aと表記する。人工的に合成した重鎖遺伝子AをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断した後、それを、pCDNA3.4ベクターをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをpCDNA3.4-Hと命名した。軽鎖遺伝子AをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断した後、それを、pCDNA3.4ベクターをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをpCDNA3.4-Lと命名した。
【0120】
pCDNA3.4-H及びpCDNA3.4-Lをヒト胎児腎細胞株HEK293F(ATCC、American Cell Bank)に導入して組換え細胞が得た後、組換え細胞を37℃、5%COの条件の振盪式インキュベーターに置いて120rpmで培養した。
【0121】
ProteinAアフィニティークロマトグラフィーカラムにより、培養上清から抗体タンパク質を精製した。詳細な操作としては、まず、PBSでProteinAカラム(GE社)を平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体A(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH5.0である)を使用して、5つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体B(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、pH3.5である)を使用して、5つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、30KDa濃縮遠心管を使用して濃縮することで、前記抗体、すなわち抗ヒト4-1BB抗体を得た。
【0122】
抗ヒト4-1BB抗体を配列決定した結果、得られた抗ヒト4-1BB抗体は完全抗体であることが示された。すなわち、当該抗体はHanke10F4であった。この抗体は、アミノ酸配列が配列番号1で示される重鎖と、アミノ酸配列が配列番号2で示される軽鎖とからなっていた。また、Hanke10F4抗体の重鎖タイプはIgG4であり、軽鎖タイプはκ鎖であった。
【0123】
配列番号1の1~117番目は重鎖可変領域VHである。ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3の配列は、それぞれ、配列番号1の31~35番目、50~64番目、98~106番目で示される。
【0124】
配列番号2の1~107番目の軽鎖可変領域VLにおけるCDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、それぞれ、配列番号2の24~34番目、50~56番目、89~97番目で示される。
【0125】
3.2 ヒト4-1BBまたはサル4-1BBに対する親和性の同定
【0126】
(1)ELISA測定
測定方法は、実施例1の手順1.4と同様にして、96ウェルプレートをそれぞれヒト4-1BB又はサル4-1BBで直接に被覆した。なお、抗体サンプル(Hanke10F4及びUtomilumab)を一次抗体とし、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウスを二次抗体とした。また、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine、TMB)を発色剤とし、硫酸で発色を停止させた。BIO-TEKELX-800マイクロプレートリーダーを使用して、450nmでOD値を測定した。
【0127】
表6は、IgG4形態の抗体Hanke10F4の、ELISAによる結果を示しており、ヒト4-1BBおよびサル4-1BBの両方を認識できたことを示している。
【0128】
【0129】
(2)FACS測定
【0130】
使用された試薬は次のとおりである:
PBSへBSAとアジ化ナトリウムを添加して得たFACSバッファー(BSAの質量%濃度が2%であり、アジ化ナトリウムの質量%濃度が0.02%である)、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体(Sigma社、遮光保存)。
【0131】
実験に使用された細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、細胞膜表面に高度においてヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)及び細胞膜表面において高度にサル4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-cy4-1BB)、並びに4-1BB発現無しの野生型CHO-K1(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)である。
【0132】
ヒト4-1BB遺伝子配列(配列番号7)及びサル4-1BB遺伝子配列(配列番号8)を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってそれぞれpCDNA3.4ベクターに挿入した後、それぞれLipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いて野生型CHO-K1細胞に導入した。その後、G418(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.から購入した)を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)、及び細胞膜表面において高度にサル4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-cy4-1BB)を最終的に得た。
【0133】
CHO-K1-hu4-1BBを使用して、Hanke10F4モノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合活性を測定した。T75フラスコを使用して試験細胞を80%の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集した(1フラスコあたり10個程度の細胞)。約1mlの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が1×10個/mlである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各Hanke10F4抗体の希釈液25μlを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表7に示したとおりである。また、抗体濃度0μg/mlの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。30分間インキュベートした後、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で30分間インキュベートした。再び、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Utomilumab(Pfizer Pharmaceuticals Co.,Ltd.)を陽性対照とした。
【0134】
上記の手順に従って、CHO-K1-cy4-1BBを使用してHanke10F4モノクローナル抗体とサル4-1BBとの結合活性を測定した。
【0135】
上記の手順に基づく実験から、表7のとおり、Hanke10F4モノクローナル抗体はヒト4-1BB分子およびサル4-1BB分子の両方と高い結合活性を有することが証明された。
【0136】
【0137】
(3)FACSによる、抗体親和性の比較
【0138】
CHO-K1-hu4-1BBを使用して、Hanke10F4、HKB6モノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合活性を測定して比較した。T75フラスコを使用して試験細胞を80%の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集した(1フラスコあたり10個程度の細胞)。約1mlの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が1×10個/mlである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、Hanke10F4抗体の希釈液25μl又はHKB6抗体の希釈液25μlを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表7に示したとおりである。また、抗体濃度0μg/mlの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。30分間インキュベートした後、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で30分間インキュベートした。再び、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。
【0139】
ここで、HKB6は中国特許出願201811541545.8に記載のHKB6抗体である。
【0140】
上記の手順で測定した結果、表8及び図8に示すように、ヒト4-1BBに対するHanke10F4の親和性は、HKB6の親和性よりも大幅に高かった。
【0141】
【0142】
(4)抗体親和性の測定
h4-1BB-His(Acro社、製品番号:Q07011-1)抗原を使用し、Fortebio octec装置によりバイオレイヤー干渉法(BLI)技術を用いてUtomilumab、Hanke10F4、又はUrelumabの親和性を測定した。
【0143】
結果、表9に示すようにHanke10F4は、Utomilumab親和性に匹敵する高い抗体親和性を有している。
【0144】
注:kaは、単位時間あたりの結合生成物の生成速度を表す。kdは、単位時間あたりに結合生成物の反応物へ分解されたパーセンテージを表す。KD値は、親和性の強さを表す。
【0145】
3.3 リガンド競合
Hanke10F4抗体とヒト4-1BBLとの間の競合結合活性の比較に、CHO-K1-hu4-1BBを使用した。二次抗体は、SA-FITC(Biolegend社)であり、その他の操作(下記は除く)及び希釈液は、手順3.2に記載のFACS測定と同じである。ヒト4-1BBLアミノ酸配列は、配列番号9で示される。
【0146】
Hanke10F4は、Bio-Hanke10F4としてビオチンで標識した。標識方法は、当該技術分野で常規のタンパク質標識方法と同じ方法を採用した。Bio-Hanke10F4を、試料希釈液を用いて希釈し、1.5μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、ヒト4-1BBL-hIgG(またはHanke10F4)の希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表9のとおりである)。溶液A及び溶液Bを、等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0147】
逆競争を測定するために同じ操作を実行した。ヒト4-1BBLをビオチンで標識してBio-4-1BBLとし、且つ試料希釈液を用いて希釈し、2μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、Hanke10F4(又はヒト4-1BBL-hIgG)希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表8のとおりである)。溶液A及び溶液Bを、等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0148】
以上の手順に基づく実験から、Hanke10F4モノクローナル抗体とヒト4-1BBLの結合部位とが競合関係にあることが証明された。具体的な結果は表10及び図9に示す。つまり、このモノクローナル抗体は、薬物の用量に応じて、ヒト4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路をある程度遮断することができる。
【0149】
【0150】
3.4 エピトープ競合
【0151】
3.4.1 Hanke10F4と陽性対照抗体との間の抗原結合エピトープ競合
Hanke10F4抗体と対照抗体であるUtomilumab、Urelumabとの間のエピトープ競合関係の比較に、CHO-K1-hu4-1BBを用いた。二次抗体はSA-FITC(Biolegend社)であり、その他の操作(下記は除く)及び希釈液は、手順3.2に記載のFACS測定と同じである。
【0152】
Hanke10F4をビオチンで標識してBio-Hanke10F4とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、1.5μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、Utomilumab、Urelumab、Hanke10F4抗体希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表10のとおりである)。溶液Aと溶液Bとを等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0153】
以上の手順に基づく実験を繰り返した。結果から証明されたように、Hanke10F4モノクローナル抗体とUtomilumabおよびUrelumabの抗原結合部位とは一定の競合関係にあった。また、Utomilumabとの競合は、Urelumabとの競合よりも強かった。具体的な結果は表11及び図10に示す。
【0154】
【0155】
3.4.2 Hanke10F4及び対照抗体の抗原結合エピトープ分析
【0156】
(1)方法1
ヒト4-1BB抗原の細胞外ドメインを、段階的にマウス4-1BBの対応する細胞外ドメインに置き換え、それぞれの目的遺伝子を合成した。それぞれpCDNA3.4ベクターに挿入して、それぞれの4-1BB抗原のDNAプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの4-1BB抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た。具体的には表12のとおりである。FACSを用いて、抗体と、それぞれの4-1BB抗原との結合活性を分析し、抗体がヒト4-1BBの細胞外ドメインに結合する具体的なエピトープを更に分析した。
【0157】
一過性トランスフェクションの操作は、具体的には、Expi293発現系(ThermoFisher)の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。Expi Fectamineトランスフェクション試薬、DNAプラスミドを、それぞれOptiMEMの中に添加して、溶液Aおよび溶液Bを得た後、溶液Aおよび溶液Bを均一に混合して、溶液Cを得た。溶液Cを、Expi293細胞(ThermoFisher)に添加し、一晩インキュベートして、細胞表面において4-1BB抗原を高度に発現させる細胞株を得た。
【0158】
ここで、ヒト4-1BB抗原の全長アミノ酸配列は配列番号5で示され(対応するコード遺伝子は配列番号7で示される)、細胞外ドメインは24~186番目(対応するコード遺伝子は配列番号7の70~558番目で示される)である。マウス4-1BB抗原の全長アミノ酸配列は配列番号10で示され(対応するコード遺伝子は配列番号11で示される)、細胞外ドメインは24~187番目(対応するコード遺伝子は配列番号11の70~561番目で示される)である。
【0159】
手順3.2に記載のFACS測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に、抗体サンプル(Utomilumab、Hanke10F4、又はUrelumab)を一次抗体として順番に添加し、細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトFITCを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、FACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供した。
【0160】
特許及び文献報告の分析によると、Utomilumabは主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン3及びドメイン4に結合し、Urelumabは主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン1に結合する。上記の操作により、Urelumabの蛍光強度の傾向は細胞A及び細胞Fの2つの群について低下し、Utomilumabの場合は細胞B、細胞C及び細胞Dの3つの群について低下することが分かった。これは、研究報告と一致している。一方、Hanke10F4の蛍光強度の傾向は細胞Aと細胞Fの2群について低下し、且つ細胞Aの群について大幅に低下し、低下程度はUrelumabの場合の低下程度よりもはるかに低かった。また、Hanke10F4の蛍光強度は細胞Bの群について低下せず、増加していた。したがって、ドメイン1と2AはHanke10F4とヒト4-1BBとの親和性に対して非常に重要である一方で、ドメイン2B、3A、3Bによる影響は少ないことが示された。Hanke10F4は主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン1およびドメイン2Aの領域に結合し、対照抗体Utomilumab及びUrelumabの抗原結合エピトープの場合とはいずれも異なっていた(表12)。Hanke10F4と陽性対照抗体とは、ある程度の競合関係を有し、この競合関係は抗原抗体の空間エピトープによるものと考えられる。
【0161】
【0162】
注:細胞Aにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン1,2A,2B(aa24-86)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における24~86番目のアミノ酸を、配列番号10で示されるマウス4-1BB抗原の全長における24~86番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Bにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン2B,3A,3B(aa64-118)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における64~118番目のアミノ酸を、配列番号10の64~118番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Cにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン3A,3B,4A(aa87-133)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における87~133番目のアミノ酸を、配列番号10の87~133番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Dにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン3B,4A,4B(aa97-159)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における97~159番目のアミノ酸を、配列番号10の97~159番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Eにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン4A,4B,NF(aa119-186)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における119~186番目のアミノ酸を、配列番号10の119~186番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Fにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン1,4B,NF(aa24-46,aa139-186)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における24~46および139~186番目のアミノ酸を、配列番号10の24~46および139~186番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。
【0163】
(2)方法2
文献の分析によると、ヒト4-1BB抗原における101番目、132番目のアミノ酸はUtomilulabにおける重要な結合部位であり、42番目はUrelumabにおける重要な結合部位である。上記部位のアミノ酸を一つずつ突然変異させ、それぞれの目的遺伝子を合成した。これにより、それぞれの4-1BB抗原を有するDNAプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの4-1BB抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た((1)方法1の欄に記載の関連手順に従って得た)。具体的には表13に示す。
【0164】
【0165】
手順3.2に記載のFACS測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に抗体Hanke10F4を添加して細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトFITCを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、FACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供し、抗体と、それぞれの4-1BB抗原との結合活性を分析した。結果を図11に示す。UtomilumabとUrelumabは、いずれも、重要なアミノ酸が変異した後の抗原に結合しなかった。一方、Hanke10F4は、上記の全ての抗原と結合する能力には顕著な相違がなく、顕著な低下現象もなかった。即ち、Hanke10F4における、抗原に結合する重要なアミノ酸は、Utomilumab、Urelumab抗体の場合とは一致していなく、Hanke10F4が、特異的かつユニークな抗原結合部位を有することが、示されている。
【0166】
3.4.3 抗原に結合するHanke10F4およびHKB6のエピトープ競合
Hanke10F4抗体とHKB6との間の、抗原に結合するエピトープ競合関係を、CHO-K1-hu4-1BBを用いて比較した。二次抗体はSA-FITC(Biolegend社)であり、他の手順(下記は除く)及び希釈液は、手順3.2に記載のFACS測定と同じである。
【0167】
Hanke10F4をビオチンで標識してBio-Hanke10F4とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、1.5μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、HKB6、Hanke10F4抗体希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表14のとおりである)。溶液Aと溶液Bとを等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0168】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、Hanke10F4モノクローナル抗体とHKB6とは、競合関係がなく、すなわち、この2つの抗体の抗原結合エピトープが異なっていた。具体的な結果を表14および図12に示す。
【0169】
【0170】
3.5 ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定
HEK-293/NFκB-Luci/41-BB細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、ヒト4-1BB膜タンパク質及びNFκB-Luciferaseレポーター遺伝子を安定に発現させるHEK293細胞株である。具体的には以下のように操作した。ヒト4-1BB配列(配列番号7)を目的遺伝子としてpCDNA3.4ベクターに挿入してプラスミドAを得た。同時にNFκBエレメント配列(配列番号12)とルシフェラーゼ遺伝子(配列番号13)を目的遺伝子とし、該分野の一般的手法により、pGL4.10ベクター(Youbio company, China)におけるそれぞれの部位に挿入し、プラスミドBを得た。次いでLipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いてAプラスミド及びBプラスミドの両方をともにHEK293細胞(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)に導入した。これに、Puromycin(Gibco)とHygromycinB(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.)を添加し、加圧スクリーニングを行い、最終的にはHEK-293/NFκB-Luci/41-BBを得た。
【0171】
加圧培地(DMEM+10%FBS+1%P/S+1ug/ml Puromycin+250ug/mlHygromycinB)を調製し、HEK-293/NFκB-Luci/41-BB細胞を、37℃、5%COの条件の静的インキュベーター中で継続的に培養した。対数増殖期の細胞を採取し、トリプシンで消化した後、1000rpmで5分間遠心分離し、完全培地(DMEM+10%FBS+1%P/S)中へ再懸濁させ、50μlの細胞を96ウェルプレート(Corning、3917)に、3×10個/ウェルで、プレートコーティングした。抗体と、架橋抗体Fab’であるヤギ抗ヒトIgGFc(Jackson、109-006-008)とを、1:2の濃度比で混合した後、96ウェルプレートに50μl/ウェルで添加した。インキュベーター中で18~24時間静置した後、100μlのONE-Glo Luciferase assay sytem試薬(Promega)を添加し、室温で10分間インキュベートし、化学発光値を測定した。
【0172】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、Hanke10F4モノクローナル抗体及びUtomilumabは、両方とも、レポーター遺伝子を活性化してシグナルを発現させることができる。具体的な結果は図13Aに示す。結果のように、Hanke10F4とUtomilumabとの両方は、いずれも、T細胞活性化のシグナル伝達経路を活性化させ、T細胞の免疫機能を開始させることができた。また、Hanke10F4の活性化効果はUtomilumabよりも顕著に高かった。
【0173】
3.6 インビトロでの薬効
【0174】
3.6.1 CD4T細胞の活性化効果の測定
抗CD3抗体(Biolegend、品番317325)をPBSで1μg/mlになるまで希釈して抗CD3抗体溶液を得た。Hanke10F4抗体をPBSで希釈して高、中、低の3つの濃度としたことで、Hanke10F4抗体の濃度が4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/mlである溶液をそれぞれ得られた。抗CD3抗体溶液を、3つの濃度のHanke10F4抗体溶液と1:1の体積比でそれぞれ均一に混合した後、50μl/ウェルで96ウェルプレートに添加した。なお、3つの複製ウェルを設けた。96ウェルプレートを37℃で静置して1時間インキュベートした。翌日の使用の前にPBSで3回洗浄した。また、Utomilumabを陽性対照抗体とし、IgG(Biolegend、品番403601)を陰性対照抗体とした。
【0175】
ヒトCD4T細胞の分離:
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液(Sigma社)を用いて、その説明書に従って操作してPBMC細胞を単離した。また、ヒトCD4T細胞磁気ビーズ(BD社、品番557767)を用いて、説明書に従ってヒトCD4T細胞を分離・精製し、予備とした。
【0176】
37℃下のインキュベートを経たコーティング済の96ウェル細胞培養プレートに、密度1×10個/ウェルの条件でCD4T細胞を添加した。この96ウェルプレートを37℃、5%COの条件のインキュベーターに置いて3日間インキュベートし、細胞上清を収集し、サイトカインINF-γの分泌量をELISAにより測定した。
【0177】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、Hanke10F4抗体はUtomilumabに類似し、両方とも、CD4T細胞の活性化を刺激し、且つサイトカインINF-γを分泌させた。具体的な結果は図14に示す。
【0178】
3.6.2 CD8T細胞の活性化効果の測定
抗CD3抗体をPBSで0.5μg/mlに希釈し、96ウェルプレート(Corning)に60μl/ウェルで添加し、96ウェルプレートを37℃で静置して1時間インキュベートした。PBSで洗浄し、次いでCHO-K1安定発現細胞株(CHO-K1-CD32AまたはCHO-K1-CD32BまたはCHO-K1)を100μl/ウェル、1×10個/ウェルで96ウェルプレートに加えた。次いで96ウェルプレートを細胞インキュベーターに一晩置いた。
【0179】
実験に使用された細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、細胞膜表面においてヒトFcγR∥A(CD32A)を高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32A)、及び細胞膜表面においてヒトFcγR∥B(CD32B)を高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32B)、並びに、CHO-K1細胞である。
【0180】
ヒトFcγR∥Aのコーディング遺伝子配列(配列番号14)およびヒトFcγR∥Bのコーディング遺伝子配列(配列番号15)を人工的に合成し、次いで、これらを当該分野で慣用的な方法に従ってそれぞれpCDNA3.4ベクターに挿入した後、Lipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いて野生型CHO-K1細胞にそれぞれ導入した。G418(Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.より購入した。)を添加して加圧スクリーニングし、細胞膜においてヒトFcγR∥Aを高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32A)、及び細胞膜表面においてヒトFcγR∥Bを高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32B)を最終的に得た。
【0181】
ヒトCD8T細胞の分離:
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液(Sigma社)を用いて、その説明書に従って操作してPBMC細胞を単離した。また、ヒトCD8T細胞磁気ビーズ(BD社、品番557766)を用いて、説明書に従ってヒトCD8T細胞を分離・精製し、予備とした。
【0182】
96ウェルプレートを一晩インキュベートした後、細胞上清を吸引して除去した。そして、100μlのヒトCD8T細胞を、1×10個/ウェルで、各ウェルにそれぞれ添加した。次いで、抗体を、目的濃度になるように培地で希釈し、96ウェルプレートに100μl/ウェルで添加した。なお、最終濃度はそれぞれ3μg/ml、0.5μg/ml、0.08μg/mlであり、各濃度について、それぞれ3つの複製ウェルを設けた。96ウェルプレートを細胞インキュベーターで3日間インキュベートし、細胞培養上清の中のサイトカインINF-γの分泌量をELISA法により測定した。
【0183】
上記の手順に基づく実験により証明されたように、Hanke10F4抗体はUtomilumab、Urelumabに類似し、両方とも、T細胞の活性化を刺激し、且つT細胞の活性化はFcγR∥A、FcγR∥Bに依存していた。具体的な結果は図15に示す。
【0184】
3.7 インビボでの薬効
実験では、B-hCD137(4-1BB)マウスを選択して、Hanke10F4のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。B-hCD137(4-1BB)マウスモデルは、具体的には遺伝的背景C57BL/6マウスのゲノムにヒト由来のh4-1BB遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltdから入手した。
【0185】
MC38細胞系を被験マウスの背中(剃り)の一側に皮下接種した(各マウスに対して、2×10の細胞をそれぞれ接種した。なお、細胞は、Matrigelと1:1の体積比で均一に混合した後に200μl接種した)。腫瘍担持マウスの平均腫瘍体積が100mmに達したとき、実験設計に従って、マウスを8匹ずつの5つのグループにランダムに割り当てた。各グループについて投与した日を0日目と定義した。グループの割り当ておよび投与スケジュールは表15に示す。
【0186】
【0187】
腫瘍が接種された後の動物の生存状況および活動状況を毎週、2回検査した。検査には、腫瘍の増殖状況、運動能力、飲食、体重および他の異常な行為が含まれる。
【0188】
上記の手順に基づく実験により証明されたように、Hanke10F4抗体は、MC38腫瘍の増殖を抑制することができ、ドーズ依存性が顕著であった。また、同じドーズでは、Hanke10F4抗体の腫瘍抑制能力は、Utomilumab抗体の抗腫瘍効果よりも顕著に強かった。具体的な結果は図16に示す。
【0189】
Hanke10F4投与グループでは、腫瘍が消失した後、1ヶ月観察し続けた結果、腫瘍の再発は認められなかった。腫瘍が消失したマウスに、再びMC38細胞を4×10個接種し、15日経過しても、図17に示すように腫瘍は形成されなかった。つまり、Hanke10F4は腫瘍の増殖を抑制するだけでなく、マウスの記憶T細胞の機能を動員することで腫瘍の再発を抑えることができ、且つ同型の腫瘍に対して免疫機能を有することが示されている。
【0190】
3.8 安全性の評価
【0191】
3.8.1 マウスを用いる毒性試験
実験では、B-hCD137(4-1BB)マウスを選択して、Hanke10F4のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。B-hCD137(4-1BB)マウスモデルは、具体的には遺伝的背景C57BL/6マウスのゲノムにヒト由来のh4-1BB遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltdから入手した。
【0192】
被験マウスを4つのグループにランダムに割り当て、それぞれ生理食塩水、Hanke10F4、Utomilumab及びUrelumabを投与した。具体的には、週に2回、毎回の投与濃度が30mg/kgの条件で、3週間投与した。投与終了後、尾を切って血液を採取し、マウスの末梢血の中のAST(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ)及びALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)の含有量を測定した。図18に示すように、Urelumabは生理食塩水の場合のグループと比較してAST含有量が顕著に上昇しており、この抗体では肝毒性のリスクを有することを示している。一方、Hanke10F4及びUtomilumabの場合のAST及びALTの含有量は、いずれも、生理食塩水の場合のグループとは有意差がなかった。これは、Hanke10F4およびUtomilumabのいずれも、低い毒性を有することを示している。
【0193】
3.8.2 SDラットへHanke10F4を静脈注射で投与する場合の機能観察総合評価(FOB)試験
高(30mg/kg)、中(10mg/kg)、低(3mg/kg)の3つの投与ドーズを設定して、40匹のSDラット(メス半分、オス半分)へHanke10F4を単回の静脈注射で投与し、それぞれの時点における機能観察総合評価(FOB)試験に基づいて、SDラットの中枢神経系に対する、Hanke10F4の影響を評価した。
【0194】
実験の期間中、プラセボ対照グループ、Hanke10F4低ドーズグループ、Hanke10F4中ドーズグループ、Hanke10F4高ドーズグループのいずれについても、ラットの通常状態の観察では有意な異常が認められなかった。投与前、及び投与後の0.5時間、6時間、24時間、48時間、168時間では、各グループの動物の姿勢、立毛などの指標において、薬物に関連する異常や変化が見られなかった。動物の自傷又はケージ内の他の動物への攻撃が見られず、動物の死亡も見られなかった。各グループの動物は、ケージから出る難しさ、フリーハンド拘束観察、流涙、流涎、分泌物、眼球の突出、瞳孔、閉瞼、皮膚の色、立毛、呼吸などの指標に異常や変化が見られなかった。各グループの動物は、接近反応、接触反応、パニック反応、腹部の緊張、体の張り、耳介反射、掉尾反射の観察、平面立ち直り反射観察、空中立ち直り反射、瞳孔反射の観察、瞼の反射、屈筋反応、伸筋反応などの指標に異常や変化が見られなかった。総合すると、本実験の条件で、SDラットへ単回の静脈注射で3mg/kg、10mg/kg及び30mg/kgのHanke10F4を投与したところ、動物の中枢神経系の機能への明らかな影響はなかった。
【0195】
3.8.3 カニクイザルを用いる毒性試験
4匹のカニクイザルを、性別に基づいて分け、体重に基づいてドーズクライミンググループ、固定ドーズグループの合計2つのグループにランダムに割り当てた。なお、1グループにつき2匹、且つメス半分、オス半分であった。それらに静脈注射のルートで投薬した。詳細は表16を示す。
【0196】
【0197】
測定の時点については、適応期間において1回測定し、D8、D15、D22、D29に投与して24時間経過したときにそれぞれ1回測定し、投与期間の終了(D35)後に1回測定した。実験の結果、投与期間において、各グループのサルは、通常状態の観察、体重、及び摂食量/食物消費量、体温、呼吸、心電図、血圧、血液凝固指標等のいずれにおいても異常が認められなかったことが示された。投与前と比べて、Hanke10F4を用いた各ドーズグレープにおける全ての動物は、血液の生化学指標の各指標(アラニンアミノトランスフェラーゼALT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST)がいずれも正常の範囲内で変動し、顕著な変化傾向は認められなかった。詳細は表17を示す。ドーズクライミンググループでは、100mg/kg以上のドーズの場合、オス動物の白血球及び好中球、単球が上昇し、サイトカインIL-6が僅かに上昇したが、再び投与された後、元のレベルに戻った。詳細は表18を示す。したがって、Hanke10F4は、カニクイザル体内での最大耐量(MTD)≧200mg/kgと分かった。
【0198】
【0199】
【0200】
3.9 安定性
【0201】
(1)加速安定性
調製したF01(pH5.2)とF02(pH5.5)の2種類の緩衝液を用い、Hanke10F4を20mg/mlとし、4℃の条件で3ヶ月間(3M)放置して、抗体濃度、凝集分解等の各物理化学的特性を測定した。具体的には、光路長可変型分光光度計によりHanke10F4タンパク質の濃度を測定し、高速液体クロマトグラフィーによりHanke10F4の分子サイズ、ヘテロ純度(SEC-HPLC)及び電荷ヘテロ純度(CEX-HPLC)を測定し、キャピラリー電気泳動分析システムによりHanke10F4非還元キャピラリーゲル電気泳動タンパク質純度(NR-CE)を測定した。結果は表19に示す。Hanke10F4は、それぞれのpHの緩衝液中に4℃で3ヶ月間放置した後、初期時のサンプル(Hanke10F4/T0)と比較して、明らかな変化がなく、Hanke10F4の安定性が良好であった。
【0202】
同時に、4℃で1ヶ月(1M)、2ヶ月(2M)、3ヶ月(3M)放置したHanke10F4のサンプルと、実験開始の時点のサンプル(Hanke10F4/T0)を取り、先に述べたレポーター遺伝子法により、最高濃度が4ug/ml、2倍の勾配で希釈してなる9つの濃度ポイントという条件で、抗体の生物学的活性を測定した。実験結果は図13Bに示す。Hanke10F4を4℃で3ヶ月放置した後でも、抗体の生物学的活性は良好であった。
【0203】
【0204】
(2)Tm値の測定
示差走査蛍光(differential scanning fluorimetry、DSF)により、両波長(350nmと330nm)における、抗体Hanke10F4の蛍光強度を測定し、蛍光強度比を算出した。また、タンパク質のアンフォールディング期間中の蛍光強度及び蛍光ピーク値の変化を測定し、Hanke10F4のタンパク質が半分アンフォールディングされた時点の温度、すなわち、Tm値を得た。結果として、Hanke10F4のTm1値は64.4℃であり、Tm2値は71.5℃(Tm1とTm2は、タンパク質のアンフォールディング期間中に蛍光ピークが変化したときの2つの温度である)であった。つまり、Hanke10F4抗体の安定性は良好であった(図19)。
【産業上の利用可能性】
【0205】
本発明が提供する抗体Hanke10F4は、ヒト4-1BBに結合することができ、且つヒト4-1BBに対して高い親和性を示し、また、T細胞応答を効果的に増強させることができる。前記抗体は、ある程度、ヒト4-1BBLと競合してヒト4-1BBに結合する。他方、T細胞共刺激測定法では、前記抗体はINF-γの発生を誘導し、マウスモデルにおいて腫瘍の増殖を顕著に阻害し、且つ腫瘍の再発はない。本発明に係る抗体は、T細胞および抗体により媒介される免疫応答の調節に有用であり、また、腫瘍免疫療法に有用である。本発明で提供される一本鎖抗体の融合抗体は、ヒト4-1BB及びサル4-1BBに結合することができる。
【0206】
本発明に係る抗体とヒト4-1BBとの結合は、免疫応答の増強をもたらす。本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫増強剤として、または、T細胞により媒介される自己免疫疾患の免疫調節剤として有用である。前記抗体およびその抗原結合フラグメントは、癌、自己免疫、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の4-1BBを検出するための診断ツールとしても有用である。
【0207】
本発明により提供される抗体は、抗腫瘍の効果が良く、安全性が高く、安定性が高い。
【0208】
本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫調整剤として、例えば、癌、自己免疫疾患、炎症疾患及び感染疾患等の治療など、幅広い治療用途に適用されうる。
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
図14
図15
図16
図17
図18
図19
【配列表】
2023503228000001.app
【手続補正書】
【提出日】2022-07-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域および/もしくは軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
抗体の重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3のアミノ酸配列が、配列番号1のN末端から順番に、31~35番目、50~64番目、および98~106番目で示されているか、または、
抗体の軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3のアミノ酸配列が、配列番号2のN末端から順番に、24~34番目、50~56番目、および89~97番目で示されることを特徴とする、抗又はその抗原結合フラグメント
【請求項2】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、下記の(a1)~(a12)のいずれか一つであるか、または前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、下記の(b1)~(b12)のいずれか一つであることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント
(a1)配列番号1のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または、配列番号1のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a2)配列番号18のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号18のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a3)配列番号19のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号19のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a4)配列番号20のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号20のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a5)配列番号21のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号21のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a6)配列番号22のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号22のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a7)配列番号23のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号23のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a8)配列番号24のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号24のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a9)配列番号25のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号25のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a10)配列番号26のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号26のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a11)配列番号27のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号27のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(a12)配列番号28のN末端からの1~117番目までのアミノ酸配列、または配列番号28のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列
(b1)配列番号2のN末端からの1~107番目までのアミノ酸配列、または、配列番号2のN末端からの1~107番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b2)配列番号18のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号18のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b3)配列番号19のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号19のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b4)配列番号20のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号20のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b5)配列番号21のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号21のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b6)配列番号22のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号22のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b7)配列番号23のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号23のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b8)配列番号24のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号24のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b9)配列番号25のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号25のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b10)配列番号26のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号26のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b11)配列番号27のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号27のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(b12)配列番号28のN末端からの133~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号28のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項3】
前記抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、またはIgDであり、
好ましくは、前記IgGは、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプ、またはIgG4サブタイプであり、及び/又は
前記抗体の軽鎖タイプは、κ鎖またはλ鎖であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント
【請求項4】
前記抗体の重鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列、または、配列番号1と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列であるか、又は
前記抗体の軽鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号2のアミノ酸配列、または、配列番号2と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント
【請求項5】
前記抗原結合フラグメントは一本鎖抗体であり、前記一本鎖抗体のアミノ酸全配列は下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント:
(c1)配列番号16の1~239番目までのアミノ酸配列、または、配列番号16の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c2)配列番号18の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号18の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c3)配列番号19の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号19の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c4)配列番号20の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号20の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c5)配列番号21の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号21の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c6)配列番号22の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号22の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性をするアミノ酸配列;
(c7)配列番号23の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号23の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c8)配列番号24の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号24の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c9)配列番号25の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号25の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c10)配列番号26の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号26の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c11)配列番号27の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号27の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(c12)配列番号28の1~239番目までのアミノ酸配列、または配列番号28の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【請求項6】
下記の(i)~(iii)のいずれか一つである抗体誘導体:
(i)請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質
(ii)請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体;
(iii)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質又は前記二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されるADC抗体。
【請求項7】
前記抗体融合タンパク質における前記他のタンパク質は、タグタンパク質であることを特徴とする、請求項に記載の抗体誘導体
【請求項8】
前記タグタンパク質は、Fcであることを特徴とする、請求項に記載の抗体誘導体
【請求項9】
前記Fcは、IgG Fcであることを特徴とする、請求項に記載の抗体誘導体
【請求項10】
前記IgGは、IgG4であることを特徴とする、請求項に記載の抗体誘導体
【請求項11】
前記Fcのアミノ酸配列は、配列番号16の240~472番目で示されるアミノ酸配列、または、配列番号16のN末端からの240~472番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項に記載の抗体誘導体
【請求項12】
前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項11に記載の抗体誘導体
(d1)配列番号16のアミノ酸配列、または配列番号16と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d2)配列番号18のアミノ酸配列、または配列番号18と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d3)配列番号19のアミノ酸配列、または配列番号19と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d4)配列番号20のアミノ酸配列、または配列番号20と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d5)配列番号21のアミノ酸配列、または配列番号21と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d6)配列番号22のアミノ酸配列、または配列番号22と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d7)配列番号23のアミノ酸配列、または配列番号23と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d8)配列番号24のアミノ酸配列、または配列番号24と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d9)配列番号25のアミノ酸配列、または配列番号25と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d10)配列番号26のアミノ酸配列、または配列番号26と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d11)配列番号27のアミノ酸配列、または配列番号27と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(d12)配列番号28のアミノ酸配列、または配列番号28と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項13】
以下のいずれか一つである方法:
(C1)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、試験されるサンプルを検出する工程を含む、4-1BBを検出する方法;
(C2)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する方法;
(C3)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、T細胞活性化を刺激する工程を含む、T細胞活性化を刺激する方法;
(C4)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する工程を含む、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する方法;
(C5)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法;
(C6)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法;
(C7)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、結腸癌を治療および/または予防する工程を含む、結腸癌を治療および/または予防する方法;
(C8)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を活性成分として用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法;
(C9)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を活性成分として用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法;
(C10)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C11)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、癌を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、癌を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C12)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C13)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C14)請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項6に記載の抗体誘導体を用い、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法。
【請求項14】
前記4-1BBは、ヒト4-1BBまたはサル4-1BBであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
前記癌は4-1BB発現の調節不全を示す癌であり、前記自己免疫疾患は4-1BB発現の調節不全を示す自己免疫疾患であり、前記炎症性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す炎症性疾患であり、前記感染性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す感染性疾患であることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー9(TNFRSF9)遺伝子によってコードされる4-1BB(CD137)は、KwonおよびWeissmanにより、活性化されたマウスT細胞のクローン、分化、スクリーニングの過程において初めて発見されたものである。Schwarzhらは、ヒト活性化T細胞から、マウス4-1BBと相同性を有するヒト4-1BBを単離し、且つCD137と命名した。I型膜糖タンパク質である4-1BBは、PD-1/PD-L1とは異なり、4-1BBの発現は、活性化依存的であり、また、4-1BBは、T細胞活性化の共刺激シグナルを媒介し、活性化されたNK細胞、活性化されたT細胞、樹状細胞(DC)、マスト細胞、単球、好中球およびTreg細胞などの免疫細胞の表面に広く存在する。
【0003】
255個のアミノ酸を有するヒト4-1BBは、細胞表面において単量体及び二量体の形態で発現し、且つ、容易にリガンドと三量体を形成してシグナル伝達を開始する。
【0004】
4-1BBは、そのシグナル伝達経路によりT細胞、特にCD8+T細胞の分化、増殖およびサイトカインの発生が促進されるという活性化共刺激分子であることが、研究により明らかになっている。4-1BBは、活性化されたT細胞に主に発現し、T細胞の免疫応答の中期および後期において作用する。4-1BBのシグナル伝達経路により、腫瘍特異的CD8+T細胞の機能が増強し、それにより抗腫瘍効果が発揮される。また、NK細胞、DCおよびCD4+T細胞の免疫機能が増強することにより、CD8+T細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答が向上する。4-1BBは、TNFR関連因子であるTRAF1およびTRAF2を動員してヘテロ三量体を形成し、c-JunN末端キナーゼ(JNK)経路、細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)経路、並びにβ-カテニン及びAKT経路を介してシグナル伝達を増強し、且つ主要の転写因子NF-κBを介して4-1BBシグナルを調節することにより、サイトカインの発生および分泌を促進する。さらに、4-1BB/4-1BBLの相互作用により、T細胞の、ウイルス感染に対する免疫防御効果は増強し得る。さらに、4-1BBの単独療法および併用療法による腫瘍治療モデルでは、T細胞における持続的な抗腫瘍防御性を示す記憶応答が、すでに確立されている。
【0005】
現在、4-1BBに関するアゴニストは市販されておらず、最も早いものであってもまだ臨床治験の段階にあり、癌を含む各種の疾患の免疫治療方法に対する需要を満たすことができない。したがって、4-1BBをターゲットとする、「アクセラレータ」のような位置づけの薬物を開発し、Rocheのリツキサンのような既存のがん薬物を利用して免疫システムの活性化を助ける新たな腫瘍免疫治療手段を開発することは、市場の需要に応え、PD-1/PD-L1の薬物耐性の欠点を克服することができるため、好適な応用が見込まれる。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、ヒト4-1BBに結合可能な分子及びその応用を提供することを目的とする。
【0007】
本発明に提供されるヒト4-1BBに結合可能な分子は、ヒト化抗ヒト4-1BB抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば、Fabフラグメント、ScFvフラグメント);または、抗体融合タンパク質(例えば、完全なヒト化抗体、ScFvフラグメント、Fabフラグメントと他のタンパク質とが融合して形成される抗体融合タンパク質);または、ヒト化抗ヒト4-1BB抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されたADC抗体;又は、完全なヒト化抗体、ScFvフラグメント、Fabフラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体であってもよい。
【0008】
第1の態様において、本発明は抗体を特許請求している。
【0009】
本発明は、重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3のアミノ酸配列が、順番に、配列番号1のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示され、軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3のアミノ酸配列が、順番に、配列番号2のN末端からの24~34番目、50~56番目、89~97番目で示される抗体を特許請求している。
【0010】
さらに、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0011】
(a1)配列番号1のN末端からの1~117番目(即ち、配列番号16のN末端からの1~117番目)、または配列番号1のN末端からの1~117番目(即ち、配列番号16のN末端からの1~117番目)と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a2)配列番号18のN末端からの1~117番目、または配列番号18のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a3)配列番号19のN末端からの1~117番目、または配列番号19のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a4)配列番号20のN末端からの1~117番目、または配列番号20のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a5)配列番号21のN末端からの1~117番目、または配列番号21のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a6)配列番号22のN末端からの1~117番目、または配列番号22のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a7)配列番号23のN末端からの1~117番目、または配列番号23のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a8)配列番号24のN末端からの1~117番目、または配列番号24のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a9)配列番号25のN末端からの1~117番目、または配列番号25のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a10)配列番号26のN末端からの1~117番目、または配列番号26のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a11)配列番号27のN末端からの1~117番目、または配列番号27のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a12)配列番号28のN末端からの1~117番目、または配列番号28のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0012】
さらに、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0013】
(b1)配列番号2のN末端からの1~107番目(即ち、配列番号16のN末端からの133~239番目)、または配列番号2のN末端からの1~107番目(即ち、配列番号16のN末端からの133~239番目)と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b2)配列番号18のN末端からの133~239番目、または配列番号18のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b3)配列番号19のN末端からの133~239番目、または配列番号19のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b4)配列番号20のN末端からの133~239番目、または配列番号20のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b5)配列番号21のN末端からの133~239番目、または配列番号21のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b6)配列番号22のN末端からの133~239番目、または配列番号22のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b7)配列番号23のN末端からの133~239番目、または配列番号23のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b8)配列番号24のN末端からの133~239番目、または配列番号24のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b9)配列番号25のN末端からの133~239番目、または配列番号25のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b10)配列番号26のN末端からの133~239番目、または配列番号26のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b11)配列番号27のN末端からの133~239番目、または配列番号27のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b12)配列番号28のN末端からの133~239番目、または配列番号28のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0014】
前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトIgG4定常領域であり、配列番号1のN末端からの118~444番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒトKappa軽鎖定常領域であり、配列番号2のN末端から108~214番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。
【0015】
さらに、前記重鎖のアミノ酸配列は、配列番号1であるか、配列番号1と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号2であるか、配列番号2と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0016】
本発明に係る抗体は、例えばIgG、IgM、IgE、IgAまたはIgDなどの任意のタイプであってもよい。好ましくは、4-1BB抗体は、IgGタイプであり、例えば、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプまたはIgG4サブタイプ、より好ましくはIgG4サブタイプである。
【0017】
本発明に係る抗体の軽鎖タイプは、κ鎖であってもよく、λ鎖であってもよいが、より好ましくはKappa鎖である。
【0018】
本発明の具体的な実施形態において、前記抗体は、具体的に、ヒト化抗ヒト4-1BB抗体Hanke10F4である。前記Hanke10F4は、主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン1およびドメイン2Aに結合する。
【0019】
本発明にかかる抗体は、以下の特性または特徴の1つ以上を有する。
1)ヒト4-1BBに特異的に結合する;
2)ヒト4-1BB及びカニクイザル4-1BBに結合する;
3)ヒト4-1BBまたはカニクイザル4-1BBに結合する;
4)ヒト4-1BBL(4-1BBリガンド)とヒト4-1BBとの結合を、ある程度ブロックする;
5)IgG、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である;
6)ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【0020】
本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト4-1BBに対してアゴニストの活性を有し、CD4T細胞及びCD8T細胞の増殖を刺激することができる。また、細胞表面の4-1BB分子に結合することにより、下流のNF-κBシグナル伝達経路の活性化を引き起こすことができ、それにより、サイトカインIFN-γの発生及び分泌を顕著に促進し、且つヒト4-1BB遺伝子ノックインによるヒト化マウスの体内の腫瘍の発生及び進行を顕著に抑制することができる。前記抗体又はその抗原結合部分は、免疫細胞の活性を調節することにより免疫システムを調節することができ、免疫増強剤による抗腫瘍若しくは抗ウイルスの免疫応答のための免疫増強剤として、又はT細胞により媒介される自己免疫疾患のための免疫調節剤として使用することができることをある程度示す。
【0021】
本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製でき、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などの不死化真核細胞などの形質転換細胞において発現するにより調製することができる。抗体は、当該技術分野で周知の方法によって、1つのクラスまたはサブタイプから別のクラスまたはサブタイプに転換することができる。さらに、本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【0022】
本発明に係る抗体は、以下に詳細に説明されるように、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、Bリンパ球のウイルスまたは癌遺伝子形質転換、または組換え抗体技術などの従来のモノクローナル抗体技術を含む、当該技術分野で知られている技術によって発生させることができる。
【0023】
ハイブリドーマの発生は、当技術分野で周知の一般的な方法である。まず、ヒト4-1BBタンパク質を一過性にトランスフェクトして発現させ、Balb/cマウスを免疫する。ヒト4-1BB抗原のアミノ酸配列は、配列番号5(ただし、24~184番目は細胞外ドメインである)で示され、免疫抗原は、単離されたヒト4-1BBまたは精製されたヒト4-1BBであり、ヒト4-1BBフラグメント、例えば、ヒト4-1BBの細胞外ドメインであってもよい。動物免疫は、例えば、マウス、ラット、ヒツジなどの非ヒト動物を免疫化する、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。ヒト4-1BB抗原で動物を免疫化した後、免疫化された動物から単離された細胞から、抗体を生成する不死化細胞株を調製する。免疫後、動物を犠牲し、不死化リンパ節および/または脾臓B細胞を得る。常法により細胞融合を行い、抗4-1BB抗体を生成する細胞である陽性細胞クローンを、ELISAによってスクリーニングする。その後、サブクローニングを繰り返し、さらにスクリーニングすることで、増殖の状態が良好であり、抗体の収率が高く、また培養上清が100%陽性であるハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマは、同系動物、免疫システムを欠く動物、およびヌードマウスにおいてインビボで増殖させたり、またはインビトロでの細胞培養において増殖させたりすることができる。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび増殖のための方法は、当業者に周知である。ハイブリドーマ細胞が分泌する免疫グロブリンサブタイプを、二相寒天拡散試験によりIgG1として検出することができる。本発明の抗体はファージディスプレイ法によっても調製できる。ヒト抗体を単離するための上記ファージディスプレイ法は、当技術分野ですでに確立されている。
【0024】
発生・発現された後の前記抗体は、抗体、二量体、一本鎖の軽鎖や重鎖、または他の免疫グロブリン形態を含むが、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などのような当該技術分野での標準的な方法により精製することができる。
【0025】
第2の態様において、本発明は、前述の抗体の抗原結合フラグメントを特許請求している。
【0026】
ここで、抗原結合フラグメントは、(1)前述抗体の軽鎖、(2)前述抗体の重鎖、(3)前述抗体の軽鎖可変領域、(4)前述抗体の重鎖可変領域、(5)前述抗体の1つまたは複数のCDR領域のうち、1つまたは複数を含み得る。
【0027】
さらに、前記抗原結合性フラグメントは、(1)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFabフラグメント、(2)ヒンジ領域がジスルフィド結合により連結されている2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab’)2フラグメント、(3)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント、(4)抗体の一方のアームのVLおよびVHドメインからなるFVフラグメント、(5)単離されたCDR(例えば、軽鎖由来のCDRおよび/または重鎖由来のCDR)、及び(6)一本鎖抗体などのうち、いずれか一つであってもよい。ただし、一本鎖抗体はscFv構造であってもよく、また、一本鎖抗体は、異なるタグ、例えば、scFv-His、scFv-Fcなどを担持することができる。
【0028】
本発明の具体的な実施形態において、本発明にかかる抗原結合フラグメントは、タグ付き一本鎖抗体(scFv-Fc)である。一本鎖抗体(scFv-Fc)は、VHドメインのVLドメインに連結された単一ポリペプチド鎖を含むヒトIgG4 Fcタグから構成され得る。ただし、VLドメインとVHドメインとは一価分子を形成するように対合する。一本鎖抗体は、当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる。
【0029】
この態様において、本発明は、特に抗4-1BB一本鎖抗体を特許請求している。
【0030】
本発明は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結してなり、前記重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2及びHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2及びLHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの156~166番目、182~188番目、221~229番目で示される、抗4-1BB一本鎖抗体を特許請求している。
【0031】
さらに、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0032】
(a1)配列番号16のN末端からの1~117番目、または配列番号16のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a2)配列番号18のN末端からの1~117番目、または配列番号18のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a3)配列番号19のN末端からの1~117番目、または配列番号19のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a4)配列番号20のN末端からの1~117番目、または配列番号20のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a5)配列番号21のN末端からの1~117番目、または配列番号21のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a6)配列番号22のN末端からの1~117番目、または配列番号22のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a7)配列番号23のN末端からの1~117番目、または配列番号23のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a8)配列番号24のN末端からの1~117番目、または配列番号24のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a9)配列番号25のN末端からの1~117番目、または配列番号25のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a10)配列番号26のN末端からの1~117番目、または配列番号26のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a11)配列番号27のN末端からの1~117番目、または配列番号27のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(a12)配列番号28のN末端からの1~117番目、または配列番号28のN末端からの1~117番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0033】
さらに、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。
【0034】
(b1)配列番号16のN末端からの133~239番目、または配列番号16のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b2)配列番号18のN末端からの133~239番目、または配列番号18のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b3)配列番号19のN末端からの133~239番目、または配列番号19のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b4)配列番号20のN末端からの133~239番目、または配列番号20のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b5)配列番号21のN末端からの133~239番目、または配列番号21のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b6)配列番号22のN末端からの133~239番目、または配列番号22のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b7)配列番号23のN末端からの133~239番目、または配列番号23のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b8)配列番号24のN末端からの133~239番目、または配列番号24のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b9)配列番号25のN末端からの133~239番目、または配列番号25のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b10)配列番号26のN末端からの133~239番目、または配列番号26のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b11)配列番号27のN末端からの133~239番目、または配列番号27のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(b12)配列番号28のN末端からの133~239番目、または配列番号28のN末端からの133~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0035】
さらに、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は下記のいずれか一つである。
【0036】
(c1)配列番号16の1~239番目、または配列番号16の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c2)配列番号18の1~239番目、または配列番号18の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c3)配列番号19の1~239番目、または配列番号19の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c4)配列番号20の1~239番目、または配列番号20の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c5)配列番号21の1~239番目、または配列番号21の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c6)配列番号22の1~239番目、または配列番号22の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性をするもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c7)配列番号23の1~239番目、または配列番号23の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c8)配列番号24の1~239番目、または配列番号24の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c9)配列番号25の1~239番目、または配列番号25の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c10)配列番号26の1~239番目、または配列番号26の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c11)配列番号27の1~239番目、または配列番号27の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(c12)配列番号28の1~239番目、または配列番号28の1~239番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0037】
第3の態様において、本発明は、前記抗体または前記抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質を特許請求している。
【0038】
ここで、前記の他のタンパク質は、毒素、酵素、細胞膜タンパク質分子、サイトカインまたは受容体タンパク質などであってもよい。
【0039】
さらに、本発明が特許請求している前記抗体融合タンパク質は、前記一本鎖抗体とタグタンパク質とから形成される、タグタンパク質を有する一本鎖抗体であってもよい。
【0040】
本発明の具体的な実施形態において、前記タグタンパク質はFcである。
【0041】
さらに、前記Fcは、例えば、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgDに由来してもよい。好ましくは、前記Fcは、IgG1サブタイプ、IgG2サブタイプ、IgG3サブタイプ、またはIgG4サブタイプなどのIgGタイプに由来し、より好ましくはIgG4サブタイプに由来する。前記Fcは、好ましくはヒト由来である。
【0042】
さらに、前記Fcのアミノ酸配列は、配列番号16の240~472番目で示されるか、または配列番号16のN末端からの240~472番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有する。
【0043】
より詳しくは、前記のタグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであってもよい。
【0044】
(d1)配列番号16で示されるものか、または配列番号16と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d2)配列番号18で示されるものか、または配列番号18と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d3)配列番号19で示されるものか、または配列番号19と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d4)配列番号20で示されるものか、または配列番号20と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d5)配列番号21で示されるものか、または配列番号21と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d6)配列番号22で示されるものか、または配列番号22と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d7)配列番号23で示されるものか、または配列番号23と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d8)配列番号24で示されるものか、または配列番号24と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d9)配列番号25で示されるものか、または配列番号25と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d10)配列番号26で示されるものか、または配列番号26と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d11)配列番号27で示されるものか、または配列番号27と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある);
(d12)配列番号28で示されるものか、または配列番号28と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0045】
第4の態様においては、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、または前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体と、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体を特許請求している。
【0046】
第5の態様においては、本発明は、核酸分子を特許請求している。
【0047】
本発明に係る核酸分子は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質、または前記二重抗体をコードする。
【0048】
本発明に係る核酸分子は、DNAであっても、RNAであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、前記核酸分子は、cDNA分子である。
【0049】
さらに、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2およびHCDR3をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号3の5’末端からの91~105番目、148~192番目、292~318番目で示され、前記抗体の軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2およびLHCDR3をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号4の5’末端からの70~102番目、148~168番目、265~291番目で示されるものである。
【0050】
さらに、前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号3の5’末端からの1~351番目、または配列番号3の5’末端からの1~351番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するものである(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号4の5’末端からの1~321番目、又は配列番号4の5’末端からの1~321番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上又は75%以上の同一性を有するものである(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)。
【0051】
前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号3の5’末端からの352~1332番目である。前記抗体の前記軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号4の5’末端からの322~642番目である。
【0052】
より具体的には、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号3、または配列番号3と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上もしくは75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号4、または配列番号4と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上もしくは75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0053】
本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。ハイブリドーマにより発現される抗体について、PCR増幅またはcDNAクローニング技術により、前記ハイブリドーマにより発生する抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAを得ることができる。
【0054】
本発明に係る核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖の一部、全長軽鎖もしくは重鎖、または抗体誘導体もしくはその抗原結合フラグメントの、アミノ酸配列をコードすることができる。
【0055】
VHをコードする単離されたDNAは、VHをコードするDNAを、重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)をコードする別のDNA分子に連結することにより、全長重鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト重鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、またはIgD定常領域であってもよい。IgG4定常領域が好ましい。
【0056】
VL領域をコードする単離されたDNAは、VLをコードするDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に連結することにより、全長軽鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、Kappa定常領域またはLambda定常領域であってもよい。
【0057】
この態様において、本発明は、特に、前述一本鎖抗体、前述タグタンパク質を有する一本鎖抗体、または前述融合抗体をコードする核酸分子を特許請求している。
【0058】
さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域におけるHCDR1、HCDR2及びHCDR3をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号17の5’末端からの91-105番目、148-192番目、292-318番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるLCDR1、LCDR2及びLHCDR3をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号17の5’末端からの466-498番目、544-564番目、661-687番目で示されるものである。
【0059】
さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17の5’末端からの1-351番目、又は配列番号17の5’末端からの1-351番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17の5’末端からの397-717番目、又は配列番号17の5’末端からの397-717番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、又は75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0060】
より具体的には、前記一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17の5’末端からの1~717番目、または配列番号17の5’末端からの1~717番目と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0061】
より具体的には、前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号17、または配列番号17と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、または75%以上の同一性を有するもの(一致しない部分は、好ましくは、骨格領域(FR)にある)である。
【0062】
本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。
【0063】
第6の態様において、本発明は、前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、または組換え細胞を特許請求している。
【0064】
ここで、前記ベクターは、抗体若しくはその抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、またはタグタンパク質を有する一本鎖抗体(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)などの結合分子、又は融合抗体の発現のための、発現ベクターに用いられるものである。
【0065】
本発明に係る抗体(または一本鎖抗体又は融合抗体)を発現させるためには、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、当該DNA分子の転写および翻訳を開始させる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターまたは同一の発現ベクターに挿入することができる。挿入方法は、例えば、抗体遺伝子フラグメントの相補的制限サイトとベクターとの連結などの公知の任意の適切な方法を用いることができる。本発明に係る抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、任意の抗体タイプおよびサブタイプの全長抗体遺伝子を作製することができる。
【0066】
発明は、本発明に係る核酸分子を含む宿主細胞(すなわち、前記組換え細胞)をさらに提供する。前記宿主細胞は、発現ベクターに利用可能な任意の細胞であってもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を例えば含む哺乳動物の細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの低等真核宿主細胞、細菌細胞、大腸菌などの原核細胞であってもよい。宿主細胞に組換え核酸構築物を導入するためのトランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-グルカン、リポフェクション、ファージ感染などが挙げられる。抗体遺伝子をコードする発現ベクターを公知の方法によって宿主細胞に導入することができ、結合分子を宿主細胞に発現させるように当該宿主細胞を十分な程度に培養することで、抗体を作製することができる。
【0067】
前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクターであってもよい。前記プラスミドは、pCDNA3.4およびpCDNA3.4-Lまたは他のものであってもよい。
【0068】
定向進化および点変異などの公知の方法を用い、本発明に係る抗4-1BB抗体(または一本鎖抗体または融合抗体)のヌクレオチド配列を突然変異させることは、当業者であれば容易にできる。これらの人工的に修飾された、本発明に係る抗4-1BB抗体(または一本鎖抗体または融合抗体)のヌクレオチド配列と99%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上または75%以上の同一性を有するヌクレオチドは、前記抗4-1BB抗体をコードし且つ前記抗4-1BB抗体の活性を有する限り、すべて、本発明のヌクレオチド配列に由来し且つ本発明の配列と同等のヌクレオチドに相当する。
【0069】
本発明の具体的な実施形態において、配列番号3で示されるDNAフラグメント(抗体の重鎖をコードする遺伝子)をpcDNA3.4ベクターの制限酵素切断サイトXbaIと制限酵素切断サイトHandIIIとの間にクローニングして、前記抗体の重鎖を発現する組換え発現ベクター(pcDNA3.4-Hと命名する)が得られ、配列番号4で示されるDNAフラグメント(抗体の軽鎖をコードする遺伝子)をpcDNA3.4ベクターの制限酵素切断サイトXbaIと制限酵素切断サイトHandIIIとの間にクローニングして、前記抗体の軽鎖を発現する組換え発現ベクター(pcDNA3.4-Lと命名する)が得られた。タンパク質の発現をより容易にするために、前記組換え発現ベクターを構築する場合は、配列番号3及び配列番号4で示されるDNAフラグメント(抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子)の上流に、コザック(kozak)の共認識配列(5’-GCCACC-3’)、及び、配列番号3及び配列番号4の5’末端と連結される、シグナルペプチドのコード配列(5’-ATGGAGTTTGGGCTGAGTTGGGTCTTTCTGGTCGCAATTC TGCTGAAGGGAGTGCAGTGC-3’)(配列番号:29)も導入した。前記組換え細胞は、前記抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ発現する2つの前記組換え発現ベクター(pcDNA3.4-H及びpcDNA3.4-L)をHEK293細胞にコトランスフェクトして得た組換え細胞である。つまり、前記組換え細胞は、前記抗体Hanke10F4を発現することができる。
【0070】
第7の態様において、本発明は、ADC抗体を特許請求している。
【0071】
本発明が特許請求している前記ADC抗体は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質(例えば、タグタンパク質を有する一本鎖抗体)、または前記二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物と、のカップリングにより形成される。
【0072】
第8の態様において、本発明は、医薬組成物を特許請求している。
【0073】
本発明に係る医薬組成物は、(A1)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、または前記ADC抗体と、(A2)薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と、を含む。
【0074】
第9の態様において、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクター若しくは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物の、以下の(B1)~(B14)のいずれか一項に記載の使用を特許請求している。
【0075】
(B1)4-1BBの検出用製品の調製、または4-1BBの検出
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液または組織中の4-1BBを検出するために用いられており、
ここで、前記4-1BBは、ヒト4-1BBであってもよく、サル4-1BBであってもよい;
(B2)4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断するための製品の調製、または4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路の遮断;
(B3)T細胞活性化を刺激するための製品の調製、またはT細胞活性化の刺激;
(B4)T細胞がIFN-γを分泌することを促進するための製品の調製、又はT細胞によるIFN-γの分泌の促進;
(B5)結腸癌細胞の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌細胞の増殖の抑制;
(B6)結腸癌腫瘍の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌腫瘍の増殖の抑制;
(B7)結腸癌の治療および/または予防のための製品の調製、または、結腸癌の治療および/または予防;
(B8)免疫増強剤として、または免疫増強剤の調製;
(B9)免疫調整剤として、または免疫調整剤の調製;
(B10)4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療及び/又は予防及び/又は診断するための製品の調製、又は、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患の治療及び/又は予防及び/又は診断;
(B11)癌を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、癌の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記癌は4-1BB発現の調節不全を示す癌であってもよい;
(B12)自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、自己免疫疾患の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記自己免疫疾患は4-1BB発現の調節不全を示す自己免疫疾患であってもよい;
(B13)炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、炎症性疾患の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記炎症性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す炎症性疾患であってもよい;
(B14)感染性疾患を治療および/または予防および/または診断するための製品の調製、または、感染性疾患の治療および/または予防および/または診断、
さらに、前記感染性疾患は4-1BB発現の調節不全を示す感染性疾患であってもよい。
【0076】
10の態様において、本発明は、以下の方法(C1)~方法(C14)のいずれか一つを特許請求している。
【0077】
(C1)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞を用い、測定サンプルについて検出を行う工程を含む、4-1BBを検出する方法、
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の4-1BBを検出するために用いられており、
ここで、前記4-1BBは、ヒト4-1BBであってもよく、サル4-1BBであってもよい;
(C2)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路を遮断する方法;
(C3)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、T細胞活性化を刺激する工程を含む、T細胞活性化を刺激する方法;
(C4)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する工程を含む、T細胞がIFN-γを分泌することを促進する方法;
(C5)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法;
(C6)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法;
(C7)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌を治療および/または予防する工程を含む、結腸癌を治療および/または予防する方法;
(C8)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法;
(C9)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法;
(C10)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、4-1BB発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C11)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、癌を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、癌を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C12)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C13)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法;
(C14)前記抗体、前記抗原結合フラグメント(例えば、一本鎖抗体)、前記抗体融合タンパク質(例えば、一本鎖抗体とFcとの融合)、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ADC抗体、または前記医薬組成物を用い、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および/または予防および/または診断する方法。
【図面の簡単な説明】
【0078】
図1】ハイブリドーマ抗体のSDS-PAGEを示す図である。
図2】抗体の構造を示す図である。
図3】ハイブリドーマによって分泌される抗体がヒト4-1BBを認識することを示す図である。
図4】ハイブリドーマによって分泌される抗体がサル4-1BBを認識することを示す図である。
図5】抗原結合フラグメントがヒト4-1BBを認識することを示す図である。
図6】抗原結合フラグメントがサル4-1BBを認識することを示す図である。
図7】FACSによる、各抗原結合フラグメントのヒト4-1BBに対する親和性の比較を示す図である。
図8】Hanke10F4とHKB6との親和性の比較を示す図である。
図9】抗体Hanke10F4が4-1BBLと4-1BBとの結合をブロックすることを示す図である。
図10】抗体Hanke10F4とコントロール抗体とのエピトープ競合を示す図である。
図11】FACSにより測定された、それぞれの変異点において突然変異させた抗原に対する抗体の親和性を示す図である。
図12】Hanke10F4とHKB6とのエピトープ競合を示す図である。
図13】ルシフェラーゼ活性測定を示す図である。Aは「3.5ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定」の結果である。Bは「3.9安定性(1)加速安定性」の検出結果である。
図14】抗体Hanke10F4による、CD4T細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの3本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度(2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml)の条件でのCD4T細胞の活性化の効果を示す。
図15】抗体Hanke10F4による、CD8T細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの3本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度(3μg/ml、0.5μg/ml、0.08μg/ml)の条件でのCD4T細胞の活性化の効果を示す。
図16】抗体がMC38腫瘍を阻害するモデルである。各線は、それぞれ1匹のマウスの腫瘍増殖曲線を表す。
図17】抗体Hanke10F4のチャレンジ試験の図である。
図18】抗体Hanke10F4の毒性試験の図である。
図19】Hanke10F4のTm測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0079】
以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特記しない限り、いずれも常法である。以下の実施例に使用された試験材料は、特記しない限り、いずれも従来の生化学試薬販売元から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、いずれも実験を3回繰り返すようにし、それらの結果の平均値を取った。
【0080】
以下の実施例において、陽性対照抗体は、Pfizer社のUtomilumab(PF-05082566、特許番号:US8337850 B2)およびBristol Myers Squibb社のUrelumab(BMS-663513、特許番号:US7288638 B2)であり、この二つの抗体は、いずれも抗ヒト4-1BB抗体である。陰性対照抗体は、ヒトIgG(Nanjing GenScript,Chinaの製品)である。
【0081】
以下の実施例において、特に断らない限り、配列表中の各ヌクレオチド配列のいずれにおいても、その1番目の位置(第1位)が当該DNAの5’末端のヌクレオチドであり、末位が当該DNAの3’末端のヌクレオチドである。
【0082】
以下の実施例のpCDNA3.4ベクターは、Invitrogen、Cat:A14697である。
【0083】
慣用の装置および試薬は、以下の通りである。
1.96ウェルマイクロプレート(Nunc社)
2.プレートコーティングバッファー:pH7.0のリン酸塩緩衝液。
3.洗浄液:0.05体積%のTween20のみを含有するpH7.0のリン酸塩緩衝液
4.ブロッキング溶液:10g/LのBSAのみを含有する洗浄液
5.ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたアビジン
6.発色基質:テトラメチルベンジジン
7.停止液:1M硫酸
【0084】
ここで、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液の溶媒は水であり、溶質は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記塩化ナトリウムの濃度は135mMであり、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記塩化カリウムの濃度は2.7mMであり、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記リン酸二水素カリウムの濃度は1.5mMであり、前記pH7.0のリン酸塩緩衝液における前記リン酸水素二ナトリウムの濃度は8mMである。
【0085】
実施例1:ハイブリドーマ抗体の作製
【0086】
1.1 マウスの免疫化
4~6週齢のBalb/cマウス3匹とC57b1/6マウス3匹を選択し、ヒト4-1BB細胞外セグメント(配列番号5の24~186番目)を抗原とし、マウスを2週間毎に1回、合計3回免疫した。3回目の免疫後、尾静脈から採血し、抗体の発生を間接ELISAで測定した。好適な免疫マウスを選択し、眼球摘出後、頸椎脱臼により犠牲にした。マウスの脾細胞を無菌環境下で採取し、常法に従い細胞融合を行い、抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を作製した。
【0087】
1.2 ハイブリドーマのスクリーニング
抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞をELISAによってスクリーニングした。ELISAプレートを10μg/mlのヒト4-1BB(配列番号5)で被覆し、4℃で一晩ブロックした。試験細胞培養上清を順番に添加し、37℃で1時間インキュベートし、プレートをPBSTで3回洗浄した。4000倍で希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス(ThermoFisher社)を添加し、37℃で45分間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄した後、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine、TMB)(ThermoFisher社)基質で発色させた後、OD値を450nmの波長で測定した。
【0088】
陽性細胞クローンをELISA法によりスクリーニングし、すべてのハイブリドーマ細胞培養上清が100%陽性として検出されるまで、サブクローンを繰り返した。ハイブリドーマ細胞のクローニングには限界希釈法を用いた。培養プレートを37℃、5%COインキュベーター中でインキュベートし、約5日後、細胞クローンが顕微鏡で観察された。適切な時期に液体を交換して検出を行い、陽性で且つよく増殖しているモノクローナル細胞株を採取した。その拡大培養を行うことで、抗ヒト4-1BBモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を得て、これをタイムリーに凍結した。
【0089】
1.3 ハイブリドーマ抗体の同定
スクリーニングして得た、陽性で且つよく増殖している抗ヒト4-1BB抗体ハイブリドーマ細胞株を、段階的に拡大培養し、遠心分離(10000rpmで10分間)して上清を採取した。得た上清をProtein Gアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Protein Gカラム(GE社)をPBSで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体A(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH5.0である)を使用して、5つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体B(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、pH3.5である)を使用して、5つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した。その後、30KDa濃縮遠心管を使用して濃縮することで、抗体を得た。
【0090】
免疫化によって得られた15個のハイブリドーマ抗体細胞株を、スクリーニングすることで、最終的に6つの候補ハイブリドーマ親細胞株を得た。サブタイプ同定および予備スクリーニングを経た後の細胞株の詳細および対応する抗体は表1に示す。
【0091】
【0092】
13F8H8及び37G11E2B3の2つの候補を除去し、細胞上清を収集し、それぞれ精製、濃縮を行った後、サンプルをSDS-PAGE電気泳動に供した。電気泳動の測定結果は図1に示す。
【0093】
得られた抗ヒト4-1BB抗体について配列決定を行った結果、得られた抗ヒト4-1BB抗体は、150Kbの分子量を有し、重鎖と軽鎖を含み、典型的なインタクト抗体であることが示された。抗体の構造は図2に示す。
【0094】
1.4 ハイブリドーマが分泌する抗体による、ヒト4-1BBの認識
4種のハイブリドーマが分泌する抗体がヒト4-1BBを認識する親和性を、ELISAにより評価した。96ウェルプレート(96ウェルマイクロプレート、Nunc社)をヒト4-1BB(配列番号5)で被覆し、濃度1μg/ml、100μl/ウェルの条件で、4℃で一晩放置した。プレートを3回洗浄し、300μlブロッキング溶液(配合は上記の通りである)をウェル毎に加え、37℃で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄液(配合は上記の通りである)で3回洗浄し、抗体を試料希釈液(1%ウシ血清アルブミンを加えたPBS-T)で4000ng/mlに希釈し、7本のEpチューブで4倍希釈し、勾配溶液とした。濃度ごとに、2つの複製ウェルを設け、100μl/ウェルの条件で、1時間インキュベートした。プレートを洗浄液で3回洗浄し、8000倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス(ThermoFisher社)100μlを各ウェルに加え、0.5時間振とうした。プレートを3回洗浄し、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine,TMB)(ThermoFisher社)100μlを各ウェルに加えた。遮光下で発色させ、1M硫酸を加えて反応を停止させた。OD値をBIO-TEKELX-800マイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定した。
【0095】
上記の手順によりハイブリドーマから分泌された抗体は、いずれもヒト4-1BBを認識し、且つヒト4-1BBに結合することができた。ELISA結果であるOD450値を表2に示し、分析グラフを図3に示す。
【0096】
【0097】
1.5 ハイブリドーマが分泌する抗体による、サル4-1BBの認識
ハイブリドーマが分泌する抗体がサル4-1BBを認識する親和性を、ELISA方法により評価した。具体的に、サル4-1BB(Cy4-1BB)(配列番号6)抗原をプレートコーティングバッファー(配合は上記の通りである)で1μg/mlに希釈し、各ウェルに100μlを加えてプレートコーティングし、4℃で一晩放置した。ハイブリドーマから分泌された抗体、及び陽性対照抗体Utomilumabを試料希釈液で1000ng/mlに希釈し、7本のEpチューブを用いて10倍希釈し勾配溶液とした。濃度ごとに、2つの複製ウェルを設け、100μl/ウェルでプレートに添加し、1時間振とうした。プレートを再度洗浄した後、8000倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス(ThermoFisher社)100μlを各ウェルに加え、0.5時間振とうした。洗浄後、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine,TMB)(ThermoFisher社)100μlを添加し、発色させた。
【0098】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、ハイブリドーマから分泌された抗体はいずれもCy4-1BB分子を認識することができた。ELISA結果であるOD450値を表3に示し、分析グラフを図4に示す。
【0099】
【0100】
実施例2 抗体のヒト化およびscFv-Fc抗原結合フラグメントの特性同定
【0101】
本発明により得られた分泌型抗体37G10F4をスクリーニングして選択した。抗体遺伝子配列を分析した後、抗体Fabのホモロジーモデリングと最適化した。ヒト化突然変異部位を決定するための表面スキャニング、仮想突然変異及び分子動力学シミュレーション、重要なアミノ酸の同定等の一連の分析により、合理的なヒト化抗体を設計した。ヒト化によって、本実施例に係るさらなる同定に供する12個の、scFv-Fc(ヒトIgG4)形態の抗原結合フラグメント候補(表4)を得た。
【0102】
表4の12個のscFv-Fc(ヒトIgG4)形態の抗原結合フラグメント候補は、その重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)における相補性決定領域(CDR)がいずれも同一であり、Fc領域も同一であるが、VH及びVLにおけるフレームワーク領域(FR)にアミノ酸突然変異を有することのみが相違点である。重鎖可変領域中のHCDR1、HCDR2及びHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの31~35番目、50~64番目、98~106番目で示され、軽鎖可変領域中のLCDR1、LCDR2及びLHCDR3のアミノ酸配列は、順番に、配列番号16のN末端からの156~166番目、182~188番目、221~229番目で示される。
【0103】
ここで、scFvB60103のアミノ酸配列は、配列番号16で示され、1~117番目が重鎖可変領域であり、133~239番目が軽鎖可変領域であり、240~472番目がFcである。
【0104】
遺伝子レベルに対応して、scFvB60103をコードする遺伝子配列は、配列番号17で示され、1~351番目は、重鎖可変領域をコードする遺伝子(91~105番目、148~192番目、292~318番目は3つのHCDRをそれぞれコードする)であり、397~717番目は、軽鎖可変領域をコードする遺伝子(466~498番目、544~564番目、661~687番目は3つのLCDRをそれぞれコードする)であり、718~1416番目はFcをコードする遺伝子である。
【0105】
表4の12個のscFv-Fc分子候補を発現させて精製した。ScFvB60103を例として説明する。scFvB60103抗体をコードする遺伝子(配列番号17)を、人工的に合成し、次いで、pCDNA3.4ベクターに挿入し、一過性トランスフェクションにより発現させた。一過性トランスフェクション操作は、具体的に、Expi293発現系(ThermoFisher)の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。ExpiFectamineトランスフェクション試薬、DNAプラスミドを、それぞれOptiMEMの中に添加して、溶液Aおよび溶液Bを得た後、溶液Aおよび溶液Bを均一に混合して、溶液Cを得た。溶液Cを、Expi293細胞(ThermoFisher)に添加し、そしてExpi293細胞を5日間培養した。その後、遠心分離(10000rpmで10分間)を行い、上清を採取して、得られた上清を、Protein Gアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Protein Gカラム(GE社)をPBSで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体A(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH5.0である)を使用して、5つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体B(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、pH3.5である)を使用して、5つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、30KDa濃縮遠心管を使用して濃縮することで、scFvB60103目的分子を得た。
【0106】
(1)ELISA同定
ELISAにより、ヒト4-1BB分子及びサル4-1BB分子に対するscFv分子の親和性を同定した(具体的な方法については、実施例1に記載の当該手順のとおり)。具体的に表4に示すように、12種のscFv-Fc分子は、いずれもヒト4-1BB及びサル4-1BBの両方を認識できたという結果が示された。ただし、scFvB60103の認識能力が最も良かった。ELISAの結果は図5及び図6に示す。
【0107】
【0108】
(2)FACS測定
【0109】
使用された試薬は次のとおりである:
PBSへBSAとアジ化ナトリウムを添加して得たFACSバッファー(BSAの質量%濃度が2%であり、アジ化ナトリウムの質量%濃度が0.02%である)、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体(Sigma社、遮光保存)。
【0110】
ELISA測定結果においてヒト4-1BBへの結合活性が高かったscFv分子と、ヒト4-1BB分子との親和性についての差異を、CHO-K1-hu4-1BBを使用してFACS法により測定した。実験に使用された細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、細胞膜表面において高度にヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)及び4-1BB発現無しの野生型CHO-K1(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)である。
【0111】
ヒト4-1BB遺伝子配列(配列番号7)を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってpCDNA3.4ベクターに挿入した後、Lipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いて野生型CHO-K1細胞に導入した。G418(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.から購入した)を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)を最終的に得て、予備とした。
【0112】
試験細胞をT75フラスコ中で80%の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集した(1フラスコあたり10個程度の細胞)。約1mlの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が1×10個/mlである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各試験抗体(表5ご参照)の希釈液25μlを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表5に示したとおりである。また、抗体濃度0μg/mlの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。30分間インキュベートした後、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で30分間インキュベートした。再び、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Utomilumab(Pfizer Pharmaceuticals Co.,Ltd.)を陽性対照とした。
【0113】
上記の手順により、それぞれのscFv分子の、ヒト4-1BBに対する結合活性の高さを比較した。その結果、表5および図7に示されたように、scFvB60103のEC50値が最も低かったこと、すなわち、ヒト4-1BBに対する親和性が最も高かったscFvB60103は最適な分子となり得ることが示された。
【0114】
【0115】
実施例3 IgGヒト化抗体
この実施例で同定された例示的な抗体Hanke10F4は、ハイブリドーマ分泌型抗体37G10F4をヒト化して得たもの、すなわち、表4のscFvB60103から変換されたものである。この実施例では、Hanke10F4の発現及び精製、その後の、ELISA、FACS、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の検出、T細胞活性化システムにおける同定について、詳細に説明する。
【0116】
3.1 抗体の発現および精製
全長遺伝子配列を、配列決定された遺伝子配列に基づいて合成した。Hanke10F4抗体の重鎖をコードする遺伝子は配列番号3で示され、Hanke10F4抗体の軽鎖をコードする遺伝子は配列番号4で示される。
【0117】
配列番号3の1~351番目は重鎖可変領域VHのコード遺伝子である。ここで、CDR1、CDR2およびCDR3のコード配列は、それぞれ配列番号3の91~105番目、148~192番目、292~318番目に示されている。
【0118】
配列番号4の1~321番目は、軽鎖可変領域VLのコード遺伝子である。ここで、CDR1、CDR2、およびCDR3のコード配列は、それぞれ、配列番号4の70~102番目、148~168番目、265~291番目で示される。
【0119】
配列番号3の5’末端および配列番号4の5’末端のそれぞれに、XbaIの認識配列(5’-TCTAGA-3’)、kozak共認識配列(5’-GCCACC-3’)、およびシグナルペプチドのコード配列(5’-ATGGAGTTTGGGCTGAGTTGGGTCTTTCTGGTCGCAATTCTGCTGAAGGGAGTGCAGTGC-3’)(配列番号:29)を順番に付加し、続いてシグナルペプチドのコード配列と、配列番号3の5’末端および配列番号4の5’末端とを連結した。その後、配列番号3の3’末端および配列番号4の3’末端のそれぞれに、ターミネーター(TGA)およびHindIIIの認識配列(5’-AAGCTT-3’)を順番に付加し、TGAと、配列番号3の3’末端および配列番号4の3’末端とを連結した。得られた新規DNA配列をそれぞれ、重鎖遺伝子Aおよび軽鎖遺伝子Aと表記する。人工的に合成した重鎖遺伝子AをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断した後、それを、pCDNA3.4ベクターをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをpCDNA3.4-Hと命名した。軽鎖遺伝子AをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断した後、それを、pCDNA3.4ベクターをXbaIおよびHindIIIで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをpCDNA3.4-Lと命名した。
【0120】
pCDNA3.4-H及びpCDNA3.4-Lをヒト胎児腎細胞株HEK293F(ATCC、American Cell Bank)に導入して組換え細胞が得た後、組換え細胞を37℃、5%COの条件の振盪式インキュベーターに置いて120rpmで培養した。
【0121】
ProteinAアフィニティークロマトグラフィーカラムにより、培養上清から抗体タンパク質を精製した。詳細な操作としては、まず、PBSでProteinAカラム(GE社)を平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体A(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mMリン酸ナトリウム、500mMNaCl、pH5.0である)を使用して、5つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体B(配合:溶媒は水であり、溶質及び濃度は、20mM酢酸ナトリウム、150mMNaCl、pH3.5である)を使用して、5つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、30KDa濃縮遠心管を使用して濃縮することで、前記抗体、すなわち抗ヒト4-1BB抗体を得た。
【0122】
抗ヒト4-1BB抗体を配列決定した結果、得られた抗ヒト4-1BB抗体は完全抗体であることが示された。すなわち、当該抗体はHanke10F4であった。この抗体は、アミノ酸配列が配列番号1で示される重鎖と、アミノ酸配列が配列番号2で示される軽鎖とからなっていた。また、Hanke10F4抗体の重鎖タイプはIgG4であり、軽鎖タイプはκ鎖であった。
【0123】
配列番号1の1~117番目は重鎖可変領域VHである。ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3の配列は、それぞれ、配列番号1の31~35番目、50~64番目、98~106番目で示される。
【0124】
配列番号2の1~107番目の軽鎖可変領域VLにおけるCDR1、CDR2、およびCDR3の配列は、それぞれ、配列番号2の24~34番目、50~56番目、89~97番目で示される。
【0125】
3.2 ヒト4-1BBまたはサル4-1BBに対する親和性の同定
【0126】
(1)ELISA測定
測定方法は、実施例1の手順1.4と同様にして、96ウェルプレートをそれぞれヒト4-1BB又はサル4-1BBで直接に被覆した。なお、抗体サンプル(Hanke10F4及びUtomilumab)を一次抗体とし、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウスを二次抗体とした。また、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine、TMB)を発色剤とし、硫酸で発色を停止させた。BIO-TEKELX-800マイクロプレートリーダーを使用して、450nmでOD値を測定した。
【0127】
表6は、IgG4形態の抗体Hanke10F4の、ELISAによる結果を示しており、ヒト4-1BBおよびサル4-1BBの両方を認識できたことを示している。
【0128】
【0129】
(2)FACS測定
【0130】
使用された試薬は次のとおりである:
PBSへBSAとアジ化ナトリウムを添加して得たFACSバッファー(BSAの質量%濃度が2%であり、アジ化ナトリウムの質量%濃度が0.02%である)、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体(Sigma社、遮光保存)。
【0131】
実験に使用された細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、細胞膜表面に高度においてヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)及び細胞膜表面において高度にサル4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-cy4-1BB)、並びに4-1BB発現無しの野生型CHO-K1(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)である。
【0132】
ヒト4-1BB遺伝子配列(配列番号7)及びサル4-1BB遺伝子配列(配列番号8)を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってそれぞれpCDNA3.4ベクターに挿入した後、それぞれLipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いて野生型CHO-K1細胞に導入した。その後、G418(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.から購入した)を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-hu4-1BB)、及び細胞膜表面において高度にサル4-1BBを発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-cy4-1BB)を最終的に得た。
【0133】
CHO-K1-hu4-1BBを使用して、Hanke10F4モノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合活性を測定した。T75フラスコを使用して試験細胞を80%の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集した(1フラスコあたり10個程度の細胞)。約1mlの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が1×10個/mlである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各Hanke10F4抗体の希釈液25μlを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表7に示したとおりである。また、抗体濃度0μg/mlの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。30分間インキュベートした後、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で30分間インキュベートした。再び、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Utomilumab(Pfizer Pharmaceuticals Co.,Ltd.)を陽性対照とした。
【0134】
上記の手順に従って、CHO-K1-cy4-1BBを使用してHanke10F4モノクローナル抗体とサル4-1BBとの結合活性を測定した。
【0135】
上記の手順に基づく実験から、表7のとおり、Hanke10F4モノクローナル抗体はヒト4-1BB分子およびサル4-1BB分子の両方と高い結合活性を有することが証明された。
【0136】
【0137】
(3)FACSによる、抗体親和性の比較
【0138】
CHO-K1-hu4-1BBを使用して、Hanke10F4、HKB6モノクローナル抗体とヒト4-1BBとの結合活性を測定して比較した。T75フラスコを使用して試験細胞を80%の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、1000rpmで5分間遠心分離し、細胞を収集した(1フラスコあたり10個程度の細胞)。約1mlの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が1×10個/mlである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、Hanke10F4抗体の希釈液25μl又はHKB6抗体の希釈液25μlを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表7に示したとおりである。また、抗体濃度0μg/mlの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。30分間インキュベートした後、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、ヤギ抗ヒトFITC二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で30分間インキュベートした。再び、1mlのFACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。
【0139】
ここで、HKB6は中国特許出願201811541545.8に記載のHKB6抗体である。
【0140】
上記の手順で測定した結果、表8及び図8に示すように、ヒト4-1BBに対するHanke10F4の親和性は、HKB6の親和性よりも大幅に高かった。
【0141】
【0142】
(4)抗体親和性の測定
h4-1BB-His(Acro社、製品番号:Q07011-1)抗原を使用し、Fortebio octec装置によりバイオレイヤー干渉法(BLI)技術を用いてUtomilumab、Hanke10F4、又はUrelumabの親和性を測定した。
【0143】
結果、表9に示すようにHanke10F4は、Utomilumab親和性に匹敵する高い抗体親和性を有している。
【0144】
注:kaは、単位時間あたりの結合生成物の生成速度を表す。kdは、単位時間あたりに結合生成物の反応物へ分解されたパーセンテージを表す。KD値は、親和性の強さを表す。
【0145】
3.3 リガンド競合
Hanke10F4抗体とヒト4-1BBLとの間の競合結合活性の比較に、CHO-K1-hu4-1BBを使用した。二次抗体は、SA-FITC(Biolegend社)であり、その他の操作(下記は除く)及び希釈液は、手順3.2に記載のFACS測定と同じである。ヒト4-1BBLアミノ酸配列は、配列番号9で示される。
【0146】
Hanke10F4は、Bio-Hanke10F4としてビオチンで標識した。標識方法は、当該技術分野で常規のタンパク質標識方法と同じ方法を採用した。Bio-Hanke10F4を、試料希釈液を用いて希釈し、1.5μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、ヒト4-1BBL-hIgG(またはHanke10F4)の希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表9のとおりである)。溶液A及び溶液Bを、等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0147】
逆競争を測定するために同じ操作を実行した。ヒト4-1BBLをビオチンで標識してBio-4-1BBLとし、且つ試料希釈液を用いて希釈し、2μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、Hanke10F4(又はヒト4-1BBL-hIgG)希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表8のとおりである)。溶液A及び溶液Bを、等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0148】
以上の手順に基づく実験から、Hanke10F4モノクローナル抗体とヒト4-1BBLの結合部位とが競合関係にあることが証明された。具体的な結果は表10及び図9に示す。つまり、このモノクローナル抗体は、薬物の用量に応じて、ヒト4-1BB/4-1BBLシグナル伝達経路をある程度遮断することができる。
【0149】
【0150】
3.4 エピトープ競合
【0151】
3.4.1 Hanke10F4と陽性対照抗体との間の抗原結合エピトープ競合
Hanke10F4抗体と対照抗体であるUtomilumab、Urelumabとの間のエピトープ競合関係の比較に、CHO-K1-hu4-1BBを用いた。二次抗体はSA-FITC(Biolegend社)であり、その他の操作(下記は除く)及び希釈液は、手順3.2に記載のFACS測定と同じである。
【0152】
Hanke10F4をビオチンで標識してBio-Hanke10F4とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、1.5μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、Utomilumab、Urelumab、Hanke10F4抗体希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表10のとおりである)。溶液Aと溶液Bとを等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0153】
以上の手順に基づく実験を繰り返した。結果から証明されたように、Hanke10F4モノクローナル抗体とUtomilumabおよびUrelumabの抗原結合部位とは一定の競合関係にあった。また、Utomilumabとの競合は、Urelumabとの競合よりも強かった。具体的な結果は表11及び図10に示す。
【0154】
【0155】
3.4.2 Hanke10F4及び対照抗体の抗原結合エピトープ分析
【0156】
(1)方法1
ヒト4-1BB抗原の細胞外ドメインを、段階的にマウス4-1BBの対応する細胞外ドメインに置き換え、それぞれの目的遺伝子を合成した。それぞれpCDNA3.4ベクターに挿入して、それぞれの4-1BB抗原のDNAプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの4-1BB抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た。具体的には表12のとおりである。FACSを用いて、抗体と、それぞれの4-1BB抗原との結合活性を分析し、抗体がヒト4-1BBの細胞外ドメインに結合する具体的なエピトープを更に分析した。
【0157】
一過性トランスフェクションの操作は、具体的には、Expi293発現系(ThermoFisher)の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。Expi Fectamineトランスフェクション試薬、DNAプラスミドを、それぞれOptiMEMの中に添加して、溶液Aおよび溶液Bを得た後、溶液Aおよび溶液Bを均一に混合して、溶液Cを得た。溶液Cを、Expi293細胞(ThermoFisher)に添加し、一晩インキュベートして、細胞表面において4-1BB抗原を高度に発現させる細胞株を得た。
【0158】
ここで、ヒト4-1BB抗原の全長アミノ酸配列は配列番号5で示され(対応するコード遺伝子は配列番号7で示される)、細胞外ドメインは24~186番目(対応するコード遺伝子は配列番号7の70~558番目で示される)である。マウス4-1BB抗原の全長アミノ酸配列は配列番号10で示され(対応するコード遺伝子は配列番号11で示される)、細胞外ドメインは24~187番目(対応するコード遺伝子は配列番号11の70~561番目で示される)である。
【0159】
手順3.2に記載のFACS測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に、抗体サンプル(Utomilumab、Hanke10F4、又はUrelumab)を一次抗体として順番に添加し、細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトFITCを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、FACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供した。
【0160】
特許及び文献報告の分析によると、Utomilumabは主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン3及びドメイン4に結合し、Urelumabは主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン1に結合する。上記の操作により、Urelumabの蛍光強度の傾向は細胞A及び細胞Fの2つの群について低下し、Utomilumabの場合は細胞B、細胞C及び細胞Dの3つの群について低下することが分かった。これは、研究報告と一致している。一方、Hanke10F4の蛍光強度の傾向は細胞Aと細胞Fの2群について低下し、且つ細胞Aの群について大幅に低下し、低下程度はUrelumabの場合の低下程度よりもはるかに低かった。また、Hanke10F4の蛍光強度は細胞Bの群について低下せず、増加していた。したがって、ドメイン1と2AはHanke10F4とヒト4-1BBとの親和性に対して非常に重要である一方で、ドメイン2B、3A、3Bによる影響は少ないことが示された。Hanke10F4は主にヒト4-1BBの細胞外ドメインのドメイン1およびドメイン2Aの領域に結合し、対照抗体Utomilumab及びUrelumabの抗原結合エピトープの場合とはいずれも異なっていた(表12)。Hanke10F4と陽性対照抗体とは、ある程度の競合関係を有し、この競合関係は抗原抗体の空間エピトープによるものと考えられる。
【0161】
【0162】
注:細胞Aにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン1,2A,2B(aa24-86)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における24~86番目のアミノ酸を、配列番号10で示されるマウス4-1BB抗原の全長における24~86番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Bにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン2B,3A,3B(aa64-118)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における64~118番目のアミノ酸を、配列番号10の64~118番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Cにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン3A,3B,4A(aa87-133)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における87~133番目のアミノ酸を、配列番号10の87~133番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Dにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン3B,4A,4B(aa97-159)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における97~159番目のアミノ酸を、配列番号10の97~159番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Eにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン4A,4B,NF(aa119-186)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における119~186番目のアミノ酸を、配列番号10の119~186番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Fにおける抗原の具体的構造「ヒト4-1BB+マウス4-1BBドメイン1,4B,NF(aa24-46,aa139-186)」は、配列番号5で示されるヒト4-1BB抗原の全長における24~46および139~186番目のアミノ酸を、配列番号10の24~46および139~186番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。
【0163】
(2)方法2
文献の分析によると、ヒト4-1BB抗原における101番目、132番目のアミノ酸はUtomilulabにおける重要な結合部位であり、42番目はUrelumabにおける重要な結合部位である。上記部位のアミノ酸を一つずつ突然変異させ、それぞれの目的遺伝子を合成した。これにより、それぞれの4-1BB抗原を有するDNAプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの4-1BB抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た((1)方法1の欄に記載の関連手順に従って得た)。具体的には表13に示す。
【0164】
【0165】
手順3.2に記載のFACS測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に抗体Hanke10F4を添加して細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトFITCを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、FACS緩衝液で2回洗浄した後、500μlのFACS緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供し、抗体と、それぞれの4-1BB抗原との結合活性を分析した。結果を図11に示す。UtomilumabとUrelumabは、いずれも、重要なアミノ酸が変異した後の抗原に結合しなかった。一方、Hanke10F4は、上記の全ての抗原と結合する能力には顕著な相違がなく、顕著な低下現象もなかった。即ち、Hanke10F4における、抗原に結合する重要なアミノ酸は、Utomilumab、Urelumab抗体の場合とは一致していなく、Hanke10F4が、特異的かつユニークな抗原結合部位を有することが、示されている。
【0166】
3.4.3 抗原に結合するHanke10F4およびHKB6のエピトープ競合
Hanke10F4抗体とHKB6との間の、抗原に結合するエピトープ競合関係を、CHO-K1-hu4-1BBを用いて比較した。二次抗体はSA-FITC(Biolegend社)であり、他の手順(下記は除く)及び希釈液は、手順3.2に記載のFACS測定と同じである。
【0167】
Hanke10F4をビオチンで標識してBio-Hanke10F4とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、1.5μg/mlの濃度の溶液Aとした。同時に、HKB6、Hanke10F4抗体希釈液Bを調製した。また、溶液Aの濃度を一定にし、溶液Bの濃度を溶液Aの濃度の所定倍数とした(具体的な倍数は、表14のとおりである)。溶液Aと溶液Bとを等比率で均一に混合し、CHO-K1-hu4-1BBと共にインキュベートした。
【0168】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、Hanke10F4モノクローナル抗体とHKB6とは、競合関係がなく、すなわち、この2つの抗体の抗原結合エピトープが異なっていた。具体的な結果を表14および図12に示す。
【0169】
【0170】
3.5 ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定
HEK-293/NFκB-Luci/41-BB細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、ヒト4-1BB膜タンパク質及びNFκB-Luciferaseレポーター遺伝子を安定に発現させるHEK293細胞株である。具体的には以下のように操作した。ヒト4-1BB配列(配列番号7)を目的遺伝子としてpCDNA3.4ベクターに挿入してプラスミドAを得た。同時にNFκBエレメント配列(配列番号12)とルシフェラーゼ遺伝子(配列番号13)を目的遺伝子とし、該分野の一般的手法により、pGL4.10ベクター(Youbio company, China)におけるそれぞれの部位に挿入し、プラスミドBを得た。次いでLipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いてAプラスミド及びBプラスミドの両方をともにHEK293細胞(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)に導入した。これに、Puromycin(Gibco)とHygromycinB(Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.)を添加し、加圧スクリーニングを行い、最終的にはHEK-293/NFκB-Luci/41-BBを得た。
【0171】
加圧培地(DMEM+10%FBS+1%P/S+1ug/ml Puromycin+250ug/mlHygromycinB)を調製し、HEK-293/NFκB-Luci/41-BB細胞を、37℃、5%COの条件の静的インキュベーター中で継続的に培養した。対数増殖期の細胞を採取し、トリプシンで消化した後、1000rpmで5分間遠心分離し、完全培地(DMEM+10%FBS+1%P/S)中へ再懸濁させ、50μlの細胞を96ウェルプレート(Corning、3917)に、3×10個/ウェルで、プレートコーティングした。抗体と、架橋抗体Fab’であるヤギ抗ヒトIgGFc(Jackson、109-006-008)とを、1:2の濃度比で混合した後、96ウェルプレートに50μl/ウェルで添加した。インキュベーター中で18~24時間静置した後、100μlのONE-Glo Luciferase assay sytem試薬(Promega)を添加し、室温で10分間インキュベートし、化学発光値を測定した。
【0172】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、Hanke10F4モノクローナル抗体及びUtomilumabは、両方とも、レポーター遺伝子を活性化してシグナルを発現させることができる。具体的な結果は図13Aに示す。結果のように、Hanke10F4とUtomilumabとの両方は、いずれも、T細胞活性化のシグナル伝達経路を活性化させ、T細胞の免疫機能を開始させることができた。また、Hanke10F4の活性化効果はUtomilumabよりも顕著に高かった。
【0173】
3.6 インビトロでの薬効
【0174】
3.6.1 CD4T細胞の活性化効果の測定
抗CD3抗体(Biolegend、品番317325)をPBSで1μg/mlになるまで希釈して抗CD3抗体溶液を得た。Hanke10F4抗体をPBSで希釈して高、中、低の3つの濃度としたことで、Hanke10F4抗体の濃度が4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/mlである溶液をそれぞれ得られた。抗CD3抗体溶液を、3つの濃度のHanke10F4抗体溶液と1:1の体積比でそれぞれ均一に混合した後、50μl/ウェルで96ウェルプレートに添加した。なお、3つの複製ウェルを設けた。96ウェルプレートを37℃で静置して1時間インキュベートした。翌日の使用の前にPBSで3回洗浄した。また、Utomilumabを陽性対照抗体とし、IgG(Biolegend、品番403601)を陰性対照抗体とした。
【0175】
ヒトCD4T細胞の分離:
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液(Sigma社)を用いて、その説明書に従って操作してPBMC細胞を単離した。また、ヒトCD4T細胞磁気ビーズ(BD社、品番557767)を用いて、説明書に従ってヒトCD4T細胞を分離・精製し、予備とした。
【0176】
37℃下のインキュベートを経たコーティング済の96ウェル細胞培養プレートに、密度1×10個/ウェルの条件でCD4T細胞を添加した。この96ウェルプレートを37℃、5%COの条件のインキュベーターに置いて3日間インキュベートし、細胞上清を収集し、サイトカインINF-γの分泌量をELISAにより測定した。
【0177】
上記の手順に基づく実験から証明されたように、Hanke10F4抗体はUtomilumabに類似し、両方とも、CD4T細胞の活性化を刺激し、且つサイトカインINF-γを分泌させた。具体的な結果は図14に示す。
【0178】
3.6.2 CD8T細胞の活性化効果の測定
抗CD3抗体をPBSで0.5μg/mlに希釈し、96ウェルプレート(Corning)に60μl/ウェルで添加し、96ウェルプレートを37℃で静置して1時間インキュベートした。PBSで洗浄し、次いでCHO-K1安定発現細胞株(CHO-K1-CD32AまたはCHO-K1-CD32BまたはCHO-K1)を100μl/ウェル、1×10個/ウェルで96ウェルプレートに加えた。次いで96ウェルプレートを細胞インキュベーターに一晩置いた。
【0179】
実験に使用された細胞は、China Hefei HankeMab Companyにより構築された、細胞膜表面においてヒトFcγR∥A(CD32A)を高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32A)、及び細胞膜表面においてヒトFcγR∥B(CD32B)を高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32B)、並びに、CHO-K1細胞である。
【0180】
ヒトFcγR∥Aのコーディング遺伝子配列(配列番号14)およびヒトFcγR∥Bのコーディング遺伝子配列(配列番号15)を人工的に合成し、次いで、これらを当該分野で慣用的な方法に従ってそれぞれpCDNA3.4ベクターに挿入した後、Lipofectamine3000トランスフェクション試薬(Invitrogen社)を用いて野生型CHO-K1細胞にそれぞれ導入した。G418(Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.より購入した。)を添加して加圧スクリーニングし、細胞膜においてヒトFcγR∥Aを高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32A)、及び細胞膜表面においてヒトFcγR∥Bを高度に発現させるCHO-K1細胞(CHO-K1-CD32B)を最終的に得た。
【0181】
ヒトCD8T細胞の分離:
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液(Sigma社)を用いて、その説明書に従って操作してPBMC細胞を単離した。また、ヒトCD8T細胞磁気ビーズ(BD社、品番557766)を用いて、説明書に従ってヒトCD8T細胞を分離・精製し、予備とした。
【0182】
96ウェルプレートを一晩インキュベートした後、細胞上清を吸引して除去した。そして、100μlのヒトCD8T細胞を、1×10個/ウェルで、各ウェルにそれぞれ添加した。次いで、抗体を、目的濃度になるように培地で希釈し、96ウェルプレートに100μl/ウェルで添加した。なお、最終濃度はそれぞれ3μg/ml、0.5μg/ml、0.08μg/mlであり、各濃度について、それぞれ3つの複製ウェルを設けた。96ウェルプレートを細胞インキュベーターで3日間インキュベートし、細胞培養上清の中のサイトカインINF-γの分泌量をELISA法により測定した。
【0183】
上記の手順に基づく実験により証明されたように、Hanke10F4抗体はUtomilumab、Urelumabに類似し、両方とも、T細胞の活性化を刺激し、且つT細胞の活性化はFcγR∥A、FcγR∥Bに依存していた。具体的な結果は図15に示す。
【0184】
3.7 インビボでの薬効
実験では、B-hCD137(4-1BB)マウスを選択して、Hanke10F4のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。B-hCD137(4-1BB)マウスモデルは、具体的には遺伝的背景C57BL/6マウスのゲノムにヒト由来のh4-1BB遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltdから入手した。
【0185】
MC38細胞系を被験マウスの背中(剃り)の一側に皮下接種した(各マウスに対して、2×10の細胞をそれぞれ接種した。なお、細胞は、Matrigelと1:1の体積比で均一に混合した後に200μl接種した)。腫瘍担持マウスの平均腫瘍体積が100mmに達したとき、実験設計に従って、マウスを8匹ずつの5つのグループにランダムに割り当てた。各グループについて投与した日を0日目と定義した。グループの割り当ておよび投与スケジュールは表15に示す。
【0186】
【0187】
腫瘍が接種された後の動物の生存状況および活動状況を毎週、2回検査した。検査には、腫瘍の増殖状況、運動能力、飲食、体重および他の異常な行為が含まれる。
【0188】
上記の手順に基づく実験により証明されたように、Hanke10F4抗体は、MC38腫瘍の増殖を抑制することができ、ドーズ依存性が顕著であった。また、同じドーズでは、Hanke10F4抗体の腫瘍抑制能力は、Utomilumab抗体の抗腫瘍効果よりも顕著に強かった。具体的な結果は図16に示す。
【0189】
Hanke10F4投与グループでは、腫瘍が消失した後、1ヶ月観察し続けた結果、腫瘍の再発は認められなかった。腫瘍が消失したマウスに、再びMC38細胞を4×10個接種し、15日経過しても、図17に示すように腫瘍は形成されなかった。つまり、Hanke10F4は腫瘍の増殖を抑制するだけでなく、マウスの記憶T細胞の機能を動員することで腫瘍の再発を抑えることができ、且つ同型の腫瘍に対して免疫機能を有することが示されている。
【0190】
3.8 安全性の評価
【0191】
3.8.1 マウスを用いる毒性試験
実験では、B-hCD137(4-1BB)マウスを選択して、Hanke10F4のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。B-hCD137(4-1BB)マウスモデルは、具体的には遺伝的背景C57BL/6マウスのゲノムにヒト由来のh4-1BB遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltdから入手した。
【0192】
被験マウスを4つのグループにランダムに割り当て、それぞれ生理食塩水、Hanke10F4、Utomilumab及びUrelumabを投与した。具体的には、週に2回、毎回の投与濃度が30mg/kgの条件で、3週間投与した。投与終了後、尾を切って血液を採取し、マウスの末梢血の中のAST(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ)及びALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)の含有量を測定した。図18に示すように、Urelumabは生理食塩水の場合のグループと比較してAST含有量が顕著に上昇しており、この抗体では肝毒性のリスクを有することを示している。一方、Hanke10F4及びUtomilumabの場合のAST及びALTの含有量は、いずれも、生理食塩水の場合のグループとは有意差がなかった。これは、Hanke10F4およびUtomilumabのいずれも、低い毒性を有することを示している。
【0193】
3.8.2 SDラットへHanke10F4を静脈注射で投与する場合の機能観察総合評価(FOB)試験
高(30mg/kg)、中(10mg/kg)、低(3mg/kg)の3つの投与ドーズを設定して、40匹のSDラット(メス半分、オス半分)へHanke10F4を単回の静脈注射で投与し、それぞれの時点における機能観察総合評価(FOB)試験に基づいて、SDラットの中枢神経系に対する、Hanke10F4の影響を評価した。
【0194】
実験の期間中、プラセボ対照グループ、Hanke10F4低ドーズグループ、Hanke10F4中ドーズグループ、Hanke10F4高ドーズグループのいずれについても、ラットの通常状態の観察では有意な異常が認められなかった。投与前、及び投与後の0.5時間、6時間、24時間、48時間、168時間では、各グループの動物の姿勢、立毛などの指標において、薬物に関連する異常や変化が見られなかった。動物の自傷又はケージ内の他の動物への攻撃が見られず、動物の死亡も見られなかった。各グループの動物は、ケージから出る難しさ、フリーハンド拘束観察、流涙、流涎、分泌物、眼球の突出、瞳孔、閉瞼、皮膚の色、立毛、呼吸などの指標に異常や変化が見られなかった。各グループの動物は、接近反応、接触反応、パニック反応、腹部の緊張、体の張り、耳介反射、掉尾反射の観察、平面立ち直り反射観察、空中立ち直り反射、瞳孔反射の観察、瞼の反射、屈筋反応、伸筋反応などの指標に異常や変化が見られなかった。総合すると、本実験の条件で、SDラットへ単回の静脈注射で3mg/kg、10mg/kg及び30mg/kgのHanke10F4を投与したところ、動物の中枢神経系の機能への明らかな影響はなかった。
【0195】
3.8.3 カニクイザルを用いる毒性試験
4匹のカニクイザルを、性別に基づいて分け、体重に基づいてドーズクライミンググループ、固定ドーズグループの合計2つのグループにランダムに割り当てた。なお、1グループにつき2匹、且つメス半分、オス半分であった。それらに静脈注射のルートで投薬した。詳細は表16を示す。
【0196】
注:動物番号の項目において1番目の数字は、グループを表し(1、2は、それぞれ、Hanke10F4ドーズクライミンググループ、Hanke10F4高ドーズグループを表す)、2番目の文字は、性別を表す(Fはメスである、Mはオスである)。
【0197】
測定の時点については、適応期間において1回測定し、D8、D15、D22、D29に投与して24時間経過したときにそれぞれ1回測定し、投与期間の終了(D35)後に1回測定した。実験の結果、投与期間において、各グループのサルは、通常状態の観察、体重、及び摂食量/食物消費量、体温、呼吸、心電図、血圧、血液凝固指標等のいずれにおいても異常が認められなかったことが示された。投与前と比べて、Hanke10F4を用いた各ドーズグレープにおける全ての動物は、血液の生化学指標の各指標(アラニンアミノトランスフェラーゼALT、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST)がいずれも正常の範囲内で変動し、顕著な変化傾向は認められなかった。詳細は表17を示す。ドーズクライミンググループでは、100mg/kg以上のドーズの場合、オス動物の白血球及び好中球、単球が上昇し、サイトカインIL-6が僅かに上昇したが、再び投与された後、元のレベルに戻った。詳細は表18を示す。したがって、Hanke10F4は、カニクイザル体内での最大耐量(MTD)≧200mg/kgと分かった。
【0198】
【0199】
【0200】
3.9 安定性
【0201】
(1)加速安定性
調製したF01(pH5.2)とF02(pH5.5)の2種類の緩衝液を用い、Hanke10F4を20mg/mlとし、4℃の条件で3ヶ月間(3M)放置して、抗体濃度、凝集分解等の各物理化学的特性を測定した。具体的には、光路長可変型分光光度計によりHanke10F4タンパク質の濃度を測定し、高速液体クロマトグラフィーによりHanke10F4の分子サイズ、ヘテロ純度(SEC-HPLC)及び電荷ヘテロ純度(CEX-HPLC)を測定し、キャピラリー電気泳動分析システムによりHanke10F4非還元キャピラリーゲル電気泳動タンパク質純度(NR-CE)を測定した。結果は表19に示す。Hanke10F4は、それぞれのpHの緩衝液中に4℃で3ヶ月間放置した後、初期時のサンプル(Hanke10F4/T0)と比較して、明らかな変化がなく、Hanke10F4の安定性が良好であった。
【0202】
同時に、4℃で1ヶ月(1M)、2ヶ月(2M)、3ヶ月(3M)放置したHanke10F4のサンプルと、実験開始の時点のサンプル(Hanke10F4/T0)を取り、先に述べたレポーター遺伝子法により、最高濃度が4ug/ml、2倍の勾配で希釈してなる9つの濃度ポイントという条件で、抗体の生物学的活性を測定した。実験結果は図13Bに示す。Hanke10F4を4℃で3ヶ月放置した後でも、抗体の生物学的活性は良好であった。
【0203】
注:T0は初期時を表し、3Mは3ヶ月の末を表す。
【0204】
(2)Tm値の測定
示差走査蛍光(differential scanning fluorimetry、DSF)により、両波長(350nmと330nm)における、抗体Hanke10F4の蛍光強度を測定し、蛍光強度比を算出した。また、タンパク質のアンフォールディング期間中の蛍光強度及び蛍光ピーク値の変化を測定し、Hanke10F4のタンパク質が半分アンフォールディングされた時点の温度、すなわち、Tm値を得た。結果として、Hanke10F4のTm1値は64.4℃であり、Tm2値は71.5℃(Tm1とTm2は、タンパク質のアンフォールディング期間中に蛍光ピークが変化したときの2つの温度である)であった。つまり、Hanke10F4抗体の安定性は良好であった(図19)。
【産業上の利用可能性】
【0205】
本発明が提供する抗体Hanke10F4は、ヒト4-1BBに結合することができ、且つヒト4-1BBに対して高い親和性を示し、また、T細胞応答を効果的に増強させることができる。前記抗体は、ある程度、ヒト4-1BBLと競合してヒト4-1BBに結合する。他方、T細胞共刺激測定法では、前記抗体はINF-γの発生を誘導し、マウスモデルにおいて腫瘍の増殖を顕著に阻害し、且つ腫瘍の再発はない。本発明に係る抗体は、T細胞および抗体により媒介される免疫応答の調節に有用であり、また、腫瘍免疫療法に有用である。本発明で提供される一本鎖抗体の融合抗体は、ヒト4-1BB及びサル4-1BBに結合することができる。
【0206】
本発明に係る抗体とヒト4-1BBとの結合は、免疫応答の増強をもたらす。本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫増強剤として、または、T細胞により媒介される自己免疫疾患の免疫調節剤として有用である。前記抗体およびその抗原結合フラグメントは、癌、自己免疫、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の4-1BBを検出するための診断ツールとしても有用である。
【0207】
本発明により提供される抗体は、抗腫瘍の効果が良く、安全性が高く、安定性が高い。
【0208】
本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫調整剤として、例えば、癌、自己免疫疾患、炎症疾患及び感染疾患等の治療など、幅広い治療用途に適用されうる。
【国際調査報告】