特表 2023-503228 ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-27

(54)【発明の名称】ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20230120BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230120BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230120BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230120BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230120BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230120BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230120BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230120BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230120BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230120BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230120BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

A61P43/00 111

A61P43/00 107

A61P37/04

A61P35/00

A61P37/02

A61P29/00

A61P31/00

A61K39/395 L

A61K39/395 N

A61K47/68

G01N33/53 D

C12N15/13 ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022523656

(86)(22)【出願日】2020-11-11

(85)【翻訳文提出日】2022-06-20

(86)【国際出願番号】 CN2020127993

(87)【国際公開番号】W WO2021093753

(87)【国際公開日】2021-05-20

(31)【優先権主張番号】201911105611.1

(32)【優先日】2019-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201911105605.6

(32)【優先日】2019-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201911106016.X

(32)【優先日】2019-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522160066

【氏名又は名称】合肥瀚科邁博生物技術有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】程聯勝

(72)【発明者】

【氏名】劉▲うぇん▼▲てぃん▼

(72)【発明者】

【氏名】張大艶

(72)【発明者】

【氏名】曾小麗

(72)【発明者】

【氏名】王鳳栄

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC29

4C076CC31

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF11

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB44

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA22

4H045EA28

4H045EA29

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその使用を提供する。本発明に係る抗体は、重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、順番に、配列番号１のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示されており、軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、順番に、配列番号２のＮ末端からの２４～３４番目、５０～５６番目、８９～９７番目で示されるものである。本発明に係る抗体は、ヒト４－１ＢＢ及びサル４－１ＢＢに結合可能であり、且つヒト４－１ＢＢに対して高い親和性を示し、またＴ細胞応答を効果的に増強させ、Ｔ細胞及び抗体により媒介される免疫応答の調節に適用することができる。また、免疫調整剤として、例えば、癌、自己免疫疾患、炎症疾患及び感染疾患等の治療など、幅広い治療の用途に適用できる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１のＮ末端から順番に、３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示されることを特徴とする、抗体。

【請求項2】

軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号２のＮ末端から順番に、２４～３４番目、５０～５６番目、８９～９７番目で示されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記の（ａ１）～（ａ１２）のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体：
（ａ１）配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または、配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ２）配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ３）配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ４）配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ５）配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ６）配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ７）配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ８）配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ９）配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ１０）配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ１１）配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ１２）配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【請求項4】

前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項２に記載の抗体：
（ｂ１）配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目までのアミノ酸配列、または、配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ２）配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ３）配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ４）配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ５）配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ６）配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ７）配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ８）配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ９）配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ１０）配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ１１）配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（ｂ１２）配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【請求項5】

ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプであることを特徴とする、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体の軽鎖タイプは、κ鎖またはλ鎖であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

前記抗体はＩｇＧ４サブタイプであり、前記抗体の軽鎖タイプはＫａｐｐａ鎖であることを特徴とする、請求項６または７に記載の抗体。

【請求項9】

ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

前記抗体の重鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項11】

前記抗体の軽鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、または、配列番号２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合フラグメント。

【請求項13】

前記抗体の軽鎖、前記抗体の重鎖、前記抗体の軽鎖可変領域、前記抗体の重鎖可変領域、および前記抗体における１つ若しくは複数のＣＤＲ領域のうち、１つまたは複数を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の抗原結合フラグメント。

【請求項14】

Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、ＦＶフラグメント、単離されたＣＤＲ、及び単鎖抗体のうち、いずれか一つであることを特徴とする、請求項１３に記載の抗原結合フラグメント。

【請求項15】

前記抗原結合フラグメントは一本鎖抗体であり、前記一本鎖抗体のアミノ酸全配列は下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１４に記載の抗原結合フラグメント：
（ｃ１）配列番号１６の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または、配列番号１６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ２）配列番号１８の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ３）配列番号１９の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１９の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ４）配列番号２０の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２０の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ５）配列番号２１の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２１の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ６）配列番号２２の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２２の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性をするアミノ酸配列；
（ｃ７）配列番号２３の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２３の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ８）配列番号２４の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２４の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ９）配列番号２５の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２５の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ１０）配列番号２６の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ１１）配列番号２７の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２７の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ１２）配列番号２８の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体または請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質。

【請求項17】

請求項１４又は１５に記載の一本鎖抗体とタグタンパク質とから形成される、タグタンパク質を有する一本鎖抗体であることを特徴とする、請求項１６に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項18】

前記タグタンパク質は、Ｆｃであることを特徴とする、請求項１７に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項19】

前記Ｆｃは、ＩｇＧ Ｆｃであることを特徴とする、請求項１８に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項20】

前記ＩｇＧは、ＩｇＧ４であることを特徴とする、請求項１８に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項21】

前記Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号１６の２４０～４７２番目で示されるアミノ酸配列、または、配列番号１６のＮ末端からの２４０～４７２番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。

【請求項22】

前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項２１に記載の抗体融合タンパク質：
（ｄ１）配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ２）配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ３）配列番号１９のアミノ酸配列、または配列番号１９と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ４）配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ５）配列番号２１のアミノ酸配列、または配列番号２１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ６）配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ７）配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ８）配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ９）配列番号２５のアミノ酸配列、または配列番号２５と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ１０）配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ１１）配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ１２）配列番号２８のアミノ酸配列、または配列番号２８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【請求項23】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体または請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体。

【請求項24】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、または請求項２３に記載の二重抗体をコードすることを特徴とする、核酸分子。

【請求項25】

前記核酸分子において、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体の重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号３の５’末端からの９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目で示されることを特徴とする、請求項２３に記載の核酸分子。

【請求項26】

前記核酸分子において、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体の軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号４の５’末端からの７０～１０２番目、１４８～１６８番目、２６５～２９１番目で示されることを特徴とする、請求項２３に記載の核酸分子。

【請求項27】

前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３の５’末端からの１～３５１番目までのヌクレオチド配列、または、配列番号３の５’末端からの１～３５１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項２５に記載の核酸分子。

【請求項28】

前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４の５’末端からの１～３２１番目までのヌクレオチド配列、又は、配列番号４の５’末端からの１～３２１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項２６に記載の核酸分子。

【請求項29】

前記核酸分子において、前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３のヌクレオチド配列、または、配列番号３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項２７に記載の核酸分子。

【請求項30】

前記核酸分子において、前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４のヌクレオチド配列、または、配列番号４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項２８に記載の核酸分子。

【請求項31】

前記一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１７の５’末端からの１～７１７番目までのヌクレオチド配列、または、配列番号１７の５’末端からの１～７１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の核酸分子。

【請求項32】

前記のタグタンパク質を有する一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１７のヌクレオチド配列、または、配列番号１７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項３１に記載の核酸分子。

【請求項33】

請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。

【請求項34】

前記組換え細胞は、高等真核宿主細胞、低等真核宿主細胞、原核細胞であることを特徴とする、請求項３３に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。

【請求項35】

前記高等真核宿主細胞は哺乳動物細胞であり、前記低等真核宿主細胞は酵母細胞であり、前記原核細胞は細菌細胞、大腸菌であることを特徴とする、請求項３４に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。

【請求項36】

前記組換えベクターが、プラスミド、コスミド、ファージ、またはウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞。

【請求項37】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、または請求項２３に記載の二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されることを特徴とする、ＡＤＣ抗体。

【請求項38】

（Ａ１）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、または請求項３７に記載のＡＤＣ抗体と、
（Ａ２）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と、
を含むことを特徴とする、医薬組成物。

【請求項39】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物の、以下のいずれか一項における使用：
（Ｂ１）４－１ＢＢの検出用製品の調製、または４－１ＢＢの検出；
（Ｂ２）４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断するための製品の調製、または４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路の遮断；
（Ｂ３）Ｔ細胞活性化を刺激するための製品の調製、またはＴ細胞活性化の刺激；
（Ｂ４）Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進するための製品の調製、又はＴ細胞によるＩＦＮ－γの分泌の促進；
（Ｂ５）結腸癌細胞の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌細胞の増殖の抑制；
（Ｂ６）結腸癌腫瘍の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌腫瘍の増殖の抑制；
（Ｂ７）結腸癌の治療および／または予防のための製品の調製、または、結腸癌の治療および／または予防；
（Ｂ８）免疫増強剤として、または免疫増強剤の調製；
（Ｂ９）免疫調整剤として、または免疫調整剤の調製；
（Ｂ１０）４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療及び／又は予防及び／又は診断するための製品の調製、又は、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断；
（Ｂ１１）癌を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、癌の治療および／または予防および／または診断；
（Ｂ１２）自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、自己免疫疾患の治療および／または予防および／または診断；
（Ｂ１３）炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、炎症性疾患の治療および／または予防および／または診断；
（Ｂ１４）感染性疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、感染性疾患の治療および／または予防および／または診断。

【請求項40】

前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢまたはサル４－１ＢＢであることを特徴とする、請求項３９に記載の使用。

【請求項41】

前記癌は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す癌であり、前記自己免疫疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す自己免疫疾患であり、前記炎症性疾患が４－１ＢＢ発現の調節不全を示す炎症性疾患であり、前記感染性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す感染性疾患であることを特徴とする、請求項３９に記載の使用。

【請求項42】

以下のいずれか一つである方法：
（Ｃ１）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞を用い、測定サンプルについて検査を行う工程を含む、４－１ＢＢを検出する方法；
（Ｃ２）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する方法；
（Ｃ３）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、Ｔ細胞活性化を刺激する工程を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する方法；
（Ｃ４）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する工程を含む、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する方法；
（Ｃ５）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法；
（Ｃ６）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法；
（Ｃ７）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、結腸癌を治療および／または予防する工程を含む、結腸癌を治療および／または予防する方法；
（Ｃ８）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法；
（Ｃ９）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法；
（Ｃ１０）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１１）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、癌を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、癌を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１２）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１３）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１４）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質、請求項２３に記載の二重抗体、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の発現カセット、組換えベクター又は組換え細胞、請求項３７に記載のＡＤＣ抗体、または請求項３８に記載の医薬組成物を用い、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法。

【請求項43】

前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢまたはサル４－１ＢＢであることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記癌は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す癌であり、前記自己免疫疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す自己免疫疾患であり、前記炎症性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す炎症性疾患であり、前記感染性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す感染性疾患であることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）遺伝子によってコードされる４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＫｗｏｎおよびＷｅｉｓｓｍａｎにより、活性化されたマウスＴ細胞のクローン、分化、スクリーニングの過程において初めて発見されたものである。Ｓｃｈｗａｒｚｈらは、ヒト活性化Ｔ細胞から、マウス４－１ＢＢと相同性を有するヒト４－１ＢＢを単離し、且つＣＤ１３７と命名した。Ｉ型膜糖タンパク質である４－１ＢＢは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１とは異なり、４－１ＢＢの発現は、活性化依存的であり、また、４－１ＢＢは、Ｔ細胞活性化の共刺激シグナルを媒介し、活性化されたＮＫ細胞、活性化されたＴ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、単球、好中球およびＴｒｅｇ細胞などの免疫細胞の表面に広く存在する。

【0003】

２５５個のアミノ酸を有するヒト４－１ＢＢは、細胞表面において単量体及び二量体の形態で発現し、且つ、容易にリガンドと三量体を形成してシグナル伝達を開始する。

【0004】

４－１ＢＢは、そのシグナル伝達経路によりＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の分化、増殖およびサイトカインの発生が促進されるという活性化共刺激分子であることが、研究により明らかになっている。４－１ＢＢは、活性化されたＴ細胞に主に発現し、Ｔ細胞の免疫応答の中期および後期において作用する。４－１ＢＢのシグナル伝達経路により、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能が増強し、それにより抗腫瘍効果が発揮される。また、ＮＫ細胞、ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫機能が増強することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答が向上する。４－１ＢＢは、ＴＮＦＲ関連因子であるＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２を動員してヘテロ三量体を形成し、ｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）経路、並びにβ－カテニン及びＡＫＴ経路を介してシグナル伝達を増強し、且つ主要の転写因子ＮＦ－κＢを介して４－１ＢＢシグナルを調節することにより、サイトカインの発生および分泌を促進する。さらに、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬの相互作用により、Ｔ細胞の、ウイルス感染に対する免疫防御効果は増強し得る。さらに、４－１ＢＢの単独療法および併用療法による腫瘍治療モデルでは、Ｔ細胞における持続的な抗腫瘍防御性を示す記憶応答が、すでに確立されている。

【0005】

現在、４－１ＢＢに関するアゴニストは市販されておらず、最も早いものであってもまだ臨床治験の段階にあり、癌を含む各種の疾患の免疫治療方法に対する需要を満たすことができない。したがって、４－１ＢＢをターゲットとする、「アクセラレータ」のような位置づけの薬物を開発し、Ｒｏｃｈｅのリツキサンのような既存のがん薬物を利用して免疫システムの活性化を助ける新たな腫瘍免疫治療手段を開発することは、市場の需要に応え、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の薬物耐性の欠点を克服することができるため、好適な応用が見込まれる。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその応用を提供することを目的とする。

【0007】

本発明に提供されるヒト４－１ＢＢに結合可能な分子は、ヒト化抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント）；または、抗体融合タンパク質（例えば、完全なヒト化抗体、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントと他のタンパク質とが融合して形成される抗体融合タンパク質）；または、ヒト化抗ヒト４－１ＢＢ抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されたＡＤＣ抗体；又は、完全なヒト化抗体、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体であってもよい。

【0008】

第１の態様において、本発明は抗体を特許請求している。

【0009】

本発明は、重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、順番に、配列番号１のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示され、軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、順番に、配列番号２のＮ末端からの２４～３４番目、５０～５６番目、８９～９７番目で示される抗体を特許請求している。

【0010】

さらに、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0011】

（ａ１）配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目）、または配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目）と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ２）配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ３）配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ４）配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ５）配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ６）配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ７）配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ８）配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ９）配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１０）配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１１）配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１２）配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0012】

さらに、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0013】

（ｂ１）配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目）、または配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目）と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ２）配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ３）配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ４）配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ５）配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ６）配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ７）配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ８）配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ９）配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１０）配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１１）配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１２）配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0014】

前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４定常領域であり、配列番号１のＮ末端からの１１８～４４４番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域であり、配列番号２のＮ末端から１０８～２１４番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。

【0015】

さらに、前記重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１であるか、配列番号１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２であるか、配列番号２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0016】

本発明に係る抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤなどの任意のタイプであってもよい。好ましくは、４－１ＢＢ抗体は、ＩｇＧタイプであり、例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプ、より好ましくはＩｇＧ４サブタイプである。

【0017】

本発明に係る抗体の軽鎖タイプは、κ鎖であってもよく、λ鎖であってもよいが、より好ましくはＫａｐｐａ鎖である。

【0018】

本発明の具体的な実施形態において、前記抗体は、具体的に、ヒト化抗ヒト４－１ＢＢ抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４である。前記Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン１およびドメイン２Ａに結合する。

【0019】

本発明にかかる抗体は、以下の特性または特徴の１つ以上を有する。
１）ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する；
２）ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢに結合する；
３）ヒト４－１ＢＢまたはカニクイザル４－１ＢＢに結合する；
４）ヒト４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド）とヒト４－１ＢＢとの結合を、ある程度ブロックする；
５）ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である；
６）ヒト抗体またはヒト化抗体である。

【0020】

本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト４－１ＢＢに対してアゴニストの活性を有し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。また、細胞表面の４－１ＢＢ分子に結合することにより、下流のＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を引き起こすことができ、それにより、サイトカインＩＦＮ－γの発生及び分泌を顕著に促進し、且つヒト４－１ＢＢ遺伝子ノックインによるヒト化マウスの体内の腫瘍の発生及び進行を顕著に抑制することができる。前記抗体又はその抗原結合部分は、免疫細胞の活性を調節することにより免疫システムを調節することができ、免疫増強剤による抗腫瘍若しくは抗ウイルスの免疫応答のための免疫増強剤として、又はT細胞により媒介される自己免疫疾患のための免疫調節剤として使用することができることをある程度示す。

【0021】

本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製でき、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などの不死化真核細胞などの形質転換細胞において発現するにより調製することができる。抗体は、当該技術分野で周知の方法によって、１つのクラスまたはサブタイプから別のクラスまたはサブタイプに転換することができる。さらに、本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。

【0022】

本発明に係る抗体は、以下に詳細に説明されるように、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、Ｂリンパ球のウイルスまたは癌遺伝子形質転換、または組換え抗体技術などの従来のモノクローナル抗体技術を含む、当該技術分野で知られている技術によって発生させることができる。

【0023】

ハイブリドーマの発生は、当技術分野で周知の一般的な方法である。まず、ヒト４－１ＢＢタンパク質を一過性にトランスフェクトして発現させ、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫する。ヒト４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列は、配列番号５（ただし、２４～１８４番目は細胞外ドメインである）で示され、免疫抗原は、単離されたヒト４－１ＢＢまたは精製されたヒト４－１ＢＢであり、ヒト４－１ＢＢフラグメント、例えば、ヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインであってもよい。動物免疫は、例えば、マウス、ラット、ヒツジなどの非ヒト動物を免疫化する、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。ヒト４－１ＢＢ抗原で動物を免疫化した後、免疫化された動物から単離された細胞から、抗体を生成する不死化細胞株を調製する。免疫後、動物を犠牲し、不死化リンパ節および／または脾臓Ｂ細胞を得る。常法により細胞融合を行い、抗４－１ＢＢ抗体を生成する細胞である陽性細胞クローンを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。その後、サブクローニングを繰り返し、さらにスクリーニングすることで、増殖の状態が良好であり、抗体の収率が高く、また培養上清が１００％陽性であるハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマは、同系動物、免疫システムを欠く動物、およびヌードマウスにおいてインビボで増殖させたり、またはインビトロでの細胞培養において増殖させたりすることができる。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび増殖のための方法は、当業者に周知である。ハイブリドーマ細胞が分泌する免疫グロブリンサブタイプを、二相寒天拡散試験によりＩｇＧ１として検出することができる。本発明の抗体はファージディスプレイ法によっても調製できる。ヒト抗体を単離するための上記ファージディスプレイ法は、当技術分野ですでに確立されている。

【0024】

発生・発現された後の前記抗体は、抗体、二量体、一本鎖の軽鎖や重鎖、または他の免疫グロブリン形態を含むが、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などのような当該技術分野での標準的な方法により精製することができる。

【0025】

第２の態様において、本発明は、前述の抗体の抗原結合フラグメントを特許請求している。

【0026】

ここで、抗原結合フラグメントは、（１）前述抗体の軽鎖、（２）前述抗体の重鎖、（３）前述抗体の軽鎖可変領域、（４）前述抗体の重鎖可変領域、（５）前述抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域のうち、１つまたは複数を含み得る。

【0027】

さらに、前記抗原結合性フラグメントは、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（２）ヒンジ領域がジスルフィド結合により連結されている2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（３）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（４）抗体の一方のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦＶフラグメント、（５）単離されたＣＤＲ（例えば、軽鎖由来のＣＤＲおよび／または重鎖由来のＣＤＲ）、及び（６）一本鎖抗体などのうち、いずれか一つであってもよい。ただし、一本鎖抗体はｓｃＦｖ構造であってもよく、また、一本鎖抗体は、異なるタグ、例えば、ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ、ｓｃＦｖ－Ｆｃなどを担持することができる。

【0028】

本発明の具体的な実施形態において、本発明にかかる抗原結合フラグメントは、タグ付き一本鎖抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）である。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）は、VHドメインのVLドメインに連結された単一ポリペプチド鎖を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃタグから構成され得る。ただし、ＶＬドメインとＶＨドメインとは一価分子を形成するように対合する。一本鎖抗体は、当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる。

【0029】

この態様において、本発明は、特に抗４－１ＢＢ一本鎖抗体を特許請求している。

【0030】

本発明は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結してなり、前記重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの１５６～１６６番目、１８２～１８８番目、２２１～２２９番目で示される、抗４－１ＢＢ一本鎖抗体を特許請求している。

【0031】

さらに、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0032】

（ａ１）配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ２）配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ３）配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ４）配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ５）配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ６）配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ７）配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ８）配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ９）配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１０）配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１１）配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１２）配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0033】

さらに、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0034】

（ｂ１）配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ２）配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ３）配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ４）配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ５）配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ６）配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ７）配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ８）配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ９）配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１０）配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１１）配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１２）配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0035】

さらに、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は下記のいずれか一つである。

【0036】

（ｃ１）配列番号１６の１～２３９番目、または配列番号１６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ２）配列番号１８の１～２３９番目、または配列番号１８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ３）配列番号１９の１～２３９番目、または配列番号１９の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ４）配列番号２０の１～２３９番目、または配列番号２０の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ５）配列番号２１の１～２３９番目、または配列番号２１の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ６）配列番号２２の１～２３９番目、または配列番号２２の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性をするもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ７）配列番号２３の１～２３９番目、または配列番号２３の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ８）配列番号２４の１～２３９番目、または配列番号２４の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ９）配列番号２５の１～２３９番目、または配列番号２５の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ１０）配列番号２６の１～２３９番目、または配列番号２６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ１１）配列番号２７の１～２３９番目、または配列番号２７の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ１２）配列番号２８の１～２３９番目、または配列番号２８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0037】

第３の態様において、本発明は、前記抗体または前記抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質を特許請求している。

【0038】

ここで、前記の他のタンパク質は、毒素、酵素、細胞膜タンパク質分子、サイトカインまたは受容体タンパク質などであってもよい。

【0039】

さらに、本発明が特許請求している前記抗体融合タンパク質は、前記一本鎖抗体とタグタンパク質とから形成される、タグタンパク質を有する一本鎖抗体であってもよい。

【0040】

本発明の具体的な実施形態において、前記タグタンパク質はＦｃである。

【0041】

さらに、前記Ｆｃは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤに由来してもよい。好ましくは、前記Ｆｃは、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプなどのＩｇＧタイプに由来し、より好ましくはＩｇＧ４サブタイプに由来する。前記Ｆｃは、好ましくはヒト由来である。

【0042】

さらに、前記Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号１６の２４０～４７２番目で示されるか、または配列番号１６のＮ末端からの２４０～４７２番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有する。

【0043】

より詳しくは、前記のタグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであってもよい。

【0044】

（ｄ１）配列番号１６で示されるものか、または配列番号１６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ２）配列番号１８で示されるものか、または配列番号１８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ３）配列番号１９で示されるものか、または配列番号１９と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ４）配列番号２０で示されるものか、または配列番号２０と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ５）配列番号２１で示されるものか、または配列番号２１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ６）配列番号２２で示されるものか、または配列番号２２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ７）配列番号２３で示されるものか、または配列番号２３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ８）配列番号２４で示されるものか、または配列番号２４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ９）配列番号２５で示されるものか、または配列番号２５と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ１０）配列番号２６で示されるものか、または配列番号２６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ１１）配列番号２７で示されるものか、または配列番号２７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ１２）配列番号２８で示されるものか、または配列番号２８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0045】

第４の態様においては、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、または前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体と、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体を特許請求している。

【0046】

第５の態様においては、本発明は、核酸分子を特許請求している。

【0047】

本発明に係る核酸分子は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質、または前記二重抗体をコードする。

【0048】

本発明に係る核酸分子は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、前記核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。

【0049】

さらに、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号３の５’末端からの９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目で示され、前記抗体の軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号４の５’末端からの７０～１０２番目、１４８～１６８番目、２６５～２９１番目で示されるものである。

【0050】

さらに、前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３の５’末端からの１～３５１番目、または配列番号３の５’末端からの１～３５１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するものである（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４の５’末端からの１～３２１番目、又は配列番号４の５’末端からの１～３２１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するものである（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0051】

前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖定常領域の可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３の５’末端からの３５２～１３３２番目である。前記抗体の前記軽鎖定常可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の５’末端からの３２２～６４２番目である。

【0052】

より具体的には、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、または配列番号３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上もしくは７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、または配列番号４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上もしくは７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0053】

本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。ハイブリドーマにより発現される抗体について、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により、前記ハイブリドーマにより発生する抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。

【0054】

本発明に係る核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖の一部、全長軽鎖もしくは重鎖、または抗体誘導体もしくはその抗原結合フラグメントの、アミノ酸配列をコードすることができる。

【0055】

ＶＨをコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に連結することにより、全長重鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト重鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であってもよい。ＩｇＧ４定常領域が好ましい。

【0056】

ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に連結することにより、全長軽鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、Ｋａｐｐａ定常領域またはＬａｍｂｄａ定常領域であってもよい。

【0057】

この態様において、本発明は、特に、前述一本鎖抗体、前述タグタンパク質を有する一本鎖抗体、または前述融合抗体をコードする核酸分子を特許請求している。

【0058】

さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号１７の５’末端からの９１－１０５番目、１４８－１９２番目、２９２－３１８番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号１７の５’末端からの４６６－４９８番目、５４４－５６４番目、６６１－６８７番目で示されるものである。

【0059】

さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７の５’末端からの１－３５１番目、又は配列番号１７の５’末端からの１－３５１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７の５’末端からの３９７－７１７番目、又は配列番号１７の５’末端からの３９７－７１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0060】

より具体的には、前記一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７の５’末端からの１～７１７番目、または配列番号１７の５’末端からの１～７１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0061】

より具体的には、前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、または配列番号１７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0062】

本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。

【0063】

第６の態様において、本発明は、前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、または組換え細胞を特許請求している。

【0064】

ここで、前記ベクターは、抗体若しくはその抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、またはタグタンパク質を有する一本鎖抗体（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）などの結合分子、又は融合抗体の発現のための、発現ベクターに用いられるものである。

【0065】

本発明に係る抗体（または一本鎖抗体又は融合抗体）を発現させるためには、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ＤＮＡ分子の転写および翻訳を開始させる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターまたは同一の発現ベクターに挿入することができる。挿入方法は、例えば、抗体遺伝子フラグメントの相補的制限サイトとベクターとの連結などの公知の任意の適切な方法を用いることができる。本発明に係る抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、任意の抗体タイプおよびサブタイプの全長抗体遺伝子を作製することができる。

【0066】

発明は、本発明に係る核酸分子を含む宿主細胞（すなわち、前記組換え細胞）をさらに提供する。前記宿主細胞は、発現ベクターに利用可能な任意の細胞であってもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を例えば含む哺乳動物の細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの低等真核宿主細胞、細菌細胞、大腸菌などの原核細胞であってもよい。宿主細胞に組換え核酸構築物を導入するためのトランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－グルカン、リポフェクション、ファージ感染などが挙げられる。抗体遺伝子をコードする発現ベクターを公知の方法によって宿主細胞に導入することができ、結合分子を宿主細胞に発現させるように当該宿主細胞を十分な程度に培養することで、抗体を作製することができる。

【0067】

前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクターであってもよい。前記プラスミドは、ｐＣＤＮＡ３．４およびｐＣＤＮＡ３．４－Ｌまたは他のものであってもよい。

【0068】

定向進化および点変異などの公知の方法を用い、本発明に係る抗４－１ＢＢ抗体（または一本鎖抗体または融合抗体）のヌクレオチド配列を突然変異させることは、当業者であれば容易にできる。これらの人工的に修飾された、本発明に係る抗４－１ＢＢ抗体（または一本鎖抗体または融合抗体）のヌクレオチド配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上または７５％以上の同一性を有するヌクレオチドは、前記抗４－１ＢＢ抗体をコードし且つ前記抗４－１ＢＢ抗体の活性を有する限り、すべて、本発明のヌクレオチド配列に由来し且つ本発明の配列と同等のヌクレオチドに相当する。

【0069】

本発明の具体的な実施形態において、配列番号３で示されるＤＮＡフラグメント（抗体の重鎖をコードする遺伝子）をｐｃＤＮＡ３．４ベクターの制限酵素切断サイトＸｂａＩと制限酵素切断サイトＨａｎｄＩＩＩとの間にクローニングして、前記抗体の重鎖を発現する組換え発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４－Ｈと命名する）が得られ、配列番号４で示されるＤＮＡフラグメント（抗体の軽鎖をコードする遺伝子）をｐｃＤＮＡ３．４ベクターの制限酵素切断サイトＸｂａＩと制限酵素切断サイトＨａｎｄＩＩＩとの間にクローニングして、前記抗体の軽鎖を発現する組換え発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４－Ｌと命名する）が得られた。タンパク質の発現をより容易にするために、前記組換え発現ベクターを構築する場合は、配列番号３及び配列番号４で示されるＤＮＡフラグメント（抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子）の上流に、コザック（ｋｏｚａｋ）の共認識配列（５’－ＧＣＣＡＣＣ－３’）、及び、配列番号３及び配列番号４の５’末端と連結される、シグナルペプチドのコード配列（５’－ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣ ＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣ－３’）も導入した。前記組換え細胞は、前記抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ発現する２つの前記組換え発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４－Ｈ及びｐｃＤＮＡ３．４－Ｌ）をＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトして得た組換え細胞である。つまり、前記組換え細胞は、前記抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を発現することができる。

【0070】

第７の態様において、本発明は、ＡＤＣ抗体を特許請求している。

【0071】

本発明が特許請求している前記ＡＤＣ抗体は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質（例えば、タグタンパク質を有する一本鎖抗体）、または前記二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物と、のカップリングにより形成される。

【0072】

第８の態様において、本発明は、医薬組成物を特許請求している。

【0073】

本発明に係る医薬組成物は、（Ａ１）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、または前記ＡＤＣ抗体と、（Ａ２）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と、を含む。

【0074】

第９の態様において、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクター若しくは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物の、以下の（Ｂ１）～（Ｂ１４）のいずれか一項に記載の使用を特許請求している。

【0075】

（Ｂ１）４－１ＢＢの検出用製品の調製、または４－１ＢＢの検出
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液または組織中の４－１ＢＢを検出するために用いられており、
ここで、前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢであってもよく、サル４－１ＢＢであってもよい；
（Ｂ２）４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断するための製品の調製、または４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路の遮断；
（Ｂ３）Ｔ細胞活性化を刺激するための製品の調製、またはＴ細胞活性化の刺激；
（Ｂ４）Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進するための製品の調製、又はＴ細胞によるＩＦＮ－γの分泌の促進；
（Ｂ５）結腸癌細胞の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌細胞の増殖の抑制；
（Ｂ６）結腸癌腫瘍の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌腫瘍の増殖の抑制；
（Ｂ７）結腸癌の治療および／または予防のための製品の調製、または、結腸癌の治療および／または予防；
（Ｂ８）免疫増強剤として、または免疫増強剤の調製；
（Ｂ９）免疫調整剤として、または免疫調整剤の調製；
（Ｂ１０）４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療及び／又は予防及び／又は診断するための製品の調製、又は、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断；
（Ｂ１１）癌を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、癌の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記癌は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す癌であってもよい；
（Ｂ１２）自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、自己免疫疾患の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記自己免疫疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す自己免疫疾患であってもよい；
（Ｂ１３）炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、炎症性疾患の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記炎症性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す炎症性疾患であってもよい；
（Ｂ１４）感染性疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、感染性疾患の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記感染性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す感染性疾患であってもよい。

【0076】

第９の態様において、本発明は、以下の方法（Ｃ１）～方法（Ｃ１４）のいずれか一つを特許請求している。

【0077】

（Ｃ１）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞を用い、測定サンプルについて検出を行う工程を含む、４－１ＢＢを検出する方法、
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の４－１ＢＢを検出するために用いられており、
ここで、前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢであってもよく、サル４－１ＢＢであってもよい；
（Ｃ２）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する方法；
（Ｃ３）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、Ｔ細胞活性化を刺激する工程を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する方法；
（Ｃ４）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する工程を含む、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する方法；
（Ｃ５）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法；
（Ｃ６）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法；
（Ｃ７）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌を治療および／または予防する工程を含む、結腸癌を治療および／または予防する方法；
（Ｃ８）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法；
（Ｃ９）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法；
（Ｃ１０）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１１）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、癌を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、癌を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１２）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１３）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１４）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】ハイブリドーマ抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。

【図2】抗体の構造を示す図である。

【図3】ハイブリドーマによって分泌される抗体がヒト４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図4】ハイブリドーマによって分泌される抗体がサル４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図5】抗原結合フラグメントがヒト４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図6】抗原結合フラグメントがサル４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図7】ＦＡＣＳによる、各抗原結合フラグメントのヒト４－１ＢＢに対する親和性の比較を示す図である。

【図8】Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とＨＫＢ６との親和性の比較を示す図である。

【図9】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４が４－１ＢＢＬと４－１ＢＢとの結合をブロックすることを示す図である。

【図10】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とコントロール抗体とのエピトープ競合を示す図である。

【図11】ＦＡＣＳにより測定された、それぞれの変異点において突然変異させた抗原に対する抗体の親和性を示す図である。

【図12】Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とＨＫＢ６とのエピトープ競合を示す図である。

【図13】ルシフェラーゼ活性測定を示す図である。Ａは「３．５ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定」の結果である。Ｂは「３．９安定性（１）加速安定性」の検出結果である。

【図14】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４による、ＣＤ４^＋Ｔ細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの３本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度（２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ）の条件でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化の効果を示す。

【図15】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４による、ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの３本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度（３μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ）の条件でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化の効果を示す。

【図16】抗体がＭＣ３８腫瘍を阻害するモデルである。各線は、それぞれ１匹のマウスの腫瘍増殖曲線を表す。

【図17】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のチャレンジ試験の図である。

【図18】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の毒性試験の図である。

【図19】Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のＴｍ測定を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0079】

以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特記しない限り、いずれも常法である。以下の実施例に使用された試験材料は、特記しない限り、いずれも従来の生化学試薬販売元から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、いずれも実験を３回繰り返すようにし、それらの結果の平均値を取った。

【0080】

以下の実施例において、陽性対照抗体は、Ｐｆｉｚｅｒ社のＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ（ＰＦ－０５０８２５６６、特許番号：ＵＳ８３３７８５０ Ｂ２）およびＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社のＵｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３、特許番号：ＵＳ７２８８６３８ Ｂ２）であり、この二つの抗体は、いずれも抗ヒト４－１ＢＢ抗体である。陰性対照抗体は、ヒトＩｇＧ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃｈｉｎａの製品）である。

【0081】

以下の実施例において、特に断らない限り、配列表中の各ヌクレオチド配列のいずれにおいても、その１番目の位置（第１位）が当該ＤＮＡの５’末端のヌクレオチドであり、末位が当該ＤＮＡの３’末端のヌクレオチドである。

【0082】

以下の実施例のｐＣＤＮＡ３．４ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ：Ａ１４６９７である。

【0083】

慣用の装置および試薬は、以下の通りである。
１．９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）
２．プレートコーティングバッファー：ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液。
３．洗浄液：０．０５体積％のＴｗｅｅｎ２０のみを含有するｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液
４．ブロッキング溶液：１０ｇ／ＬのＢＳＡのみを含有する洗浄液
５．ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたアビジン
６．発色基質：テトラメチルベンジジン
７．停止液：１Ｍ硫酸

【0084】

ここで、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液の溶媒は水であり、溶質は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記塩化ナトリウムの濃度は１３５ｍＭであり、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記塩化カリウムの濃度は２．７ｍＭであり、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記リン酸二水素カリウムの濃度は１．５ｍＭであり、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記リン酸水素二ナトリウムの濃度は８ｍＭである。

【0085】

実施例１：ハイブリドーマ抗体の作製

【0086】

１．１ マウスの免疫化
４～６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス３匹とＣ５７ｂ１／６マウス３匹を選択し、ヒト４－１ＢＢ細胞外セグメント（配列番号５の２４～１８６番目）を抗原とし、マウスを２週間毎に１回、合計３回免疫した。３回目の免疫後、尾静脈から採血し、抗体の発生を間接ＥＬＩＳＡで測定した。好適な免疫マウスを選択し、眼球摘出後、頸椎脱臼により犠牲にした。マウスの脾細胞を無菌環境下で採取し、常法に従い細胞融合を行い、抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を作製した。

【0087】

１．２ ハイブリドーマのスクリーニング
抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのヒト４－１ＢＢ（配列番号５）で被覆し、４℃で一晩ブロックした。試験細胞培養上清を順番に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。４０００倍で希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）基質で発色させた後、ＯＤ値を４５０ｎｍの波長で測定した。

【0088】

陽性細胞クローンをＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングし、すべてのハイブリドーマ細胞培養上清が１００％陽性として検出されるまで、サブクローンを繰り返した。ハイブリドーマ細胞のクローニングには限界希釈法を用いた。培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートし、約５日後、細胞クローンが顕微鏡で観察された。適切な時期に液体を交換して検出を行い、陽性で且つよく増殖しているモノクローナル細胞株を採取した。その拡大培養を行うことで、抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を得て、これをタイムリーに凍結した。

【0089】

１．３ ハイブリドーマ抗体の同定
スクリーニングして得た、陽性で且つよく増殖している抗ヒト４－１ＢＢ抗体ハイブリドーマ細胞株を、段階的に拡大培養し、遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分間）して上清を採取した。得た上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ社）をＰＢＳで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体Ａ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０である）を使用して、５つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体Ｂ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５である）を使用して、５つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した。その後、３０ＫＤａ濃縮遠心管を使用して濃縮することで、抗体を得た。

【0090】

免疫化によって得られた１５個のハイブリドーマ抗体細胞株を、スクリーニングすることで、最終的に６つの候補ハイブリドーマ親細胞株を得た。サブタイプ同定および予備スクリーニングを経た後の細胞株の詳細および対応する抗体は表１に示す。

【0091】

【0092】

１３Ｆ８Ｈ８及び３７Ｇ１１Ｅ２Ｂ３の２つの候補を除去し、細胞上清を収集し、それぞれ精製、濃縮を行った後、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。電気泳動の測定結果は図１に示す。

【0093】

得られた抗ヒト４－１ＢＢ抗体について配列決定を行った結果、得られた抗ヒト４－１ＢＢ抗体は、１５０Ｋｂの分子量を有し、重鎖と軽鎖を含み、典型的なインタクト抗体であることが示された。抗体の構造は図２に示す。

【0094】

１．４ ハイブリドーマが分泌する抗体による、ヒト４－１ＢＢの認識
４種のハイブリドーマが分泌する抗体がヒト４－１ＢＢを認識する親和性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルプレート（９６ウェルマイクロプレート、Ｎｕｎｃ社）をヒト４－１ＢＢ（配列番号５）で被覆し、濃度１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの条件で、４℃で一晩放置した。プレートを３回洗浄し、３００μｌブロッキング溶液（配合は上記の通りである）をウェル毎に加え、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄液（配合は上記の通りである）で３回洗浄し、抗体を試料希釈液（１％ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＳ－Ｔ）で４０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、７本のＥｐチューブで４倍希釈し、勾配溶液とした。濃度ごとに、２つの複製ウェルを設け、１００μｌ／ウェルの条件で、１時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、８０００倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを各ウェルに加え、０．５時間振とうした。プレートを３回洗浄し、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを各ウェルに加えた。遮光下で発色させ、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。ＯＤ値をＢＩＯ－ＴＥＫＥＬＸ－８００マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。

【0095】

上記の手順によりハイブリドーマから分泌された抗体は、いずれもヒト４－１ＢＢを認識し、且つヒト４－１ＢＢに結合することができた。ＥＬＩＳＡ結果であるＯＤ４５０値を表２に示し、分析グラフを図３に示す。

【0096】

【0097】

１．５ ハイブリドーマが分泌する抗体による、サル４－１ＢＢの認識
ハイブリドーマが分泌する抗体がサル４－１ＢＢを認識する親和性を、ＥＬＩＳＡ方法により評価した。具体的に、サル４－１ＢＢ（Ｃｙ４－１ＢＢ）（配列番号６）抗原をプレートコーティングバッファー（配合は上記の通りである）で１μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに１００μｌを加えてプレートコーティングし、４℃で一晩放置した。ハイブリドーマから分泌された抗体、及び陽性対照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂを試料希釈液で１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、７本のＥｐチューブを用いて１０倍希釈し勾配溶液とした。濃度ごとに、２つの複製ウェルを設け、１００μｌ／ウェルでプレートに添加し、１時間振とうした。プレートを再度洗浄した後、８０００倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを各ウェルに加え、０．５時間振とうした。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを添加し、発色させた。

【0098】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、ハイブリドーマから分泌された抗体はいずれもＣｙ４－１ＢＢ分子を認識することができた。ＥＬＩＳＡ結果であるＯＤ４５０値を表３に示し、分析グラフを図４に示す。

【0099】

【0100】

実施例２ 抗体のヒト化およびｓｃＦｖ－Ｆｃ抗原結合フラグメントの特性同定

【0101】

本発明により得られた分泌型抗体３７Ｇ１０Ｆ４をスクリーニングして選択した。抗体遺伝子配列を分析した後、抗体Ｆａｂのホモロジーモデリングと最適化した。ヒト化突然変異部位を決定するための表面スキャニング、仮想突然変異及び分子動力学シミュレーション、重要なアミノ酸の同定等の一連の分析により、合理的なヒト化抗体を設計した。ヒト化によって、本実施例に係るさらなる同定に供する１２個の、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ４）形態の抗原結合フラグメント候補（表４）を得た。

【0102】

表４の１２個のｓｃＦｖ－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ４）形態の抗原結合フラグメント候補は、その重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）がいずれも同一であり、Ｆｃ領域も同一であるが、ＶＨ及びＶＬにおけるフレームワーク領域（ＦＲ）にアミノ酸突然変異を有することのみが相違点である。重鎖可変領域中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示され、軽鎖可変領域中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの１５６～１６６番目、１８２～１８８番目、２２１～２２９番目で示される。

【0103】

ここで、ｓｃＦｖＢ６０１０３のアミノ酸配列は、配列番号１６で示され、１～１１７番目が重鎖可変領域であり、１３３～２３９番目が軽鎖可変領域であり、２４０～４７２番目がＦｃである。

【0104】

遺伝子レベルに対応して、ｓｃＦｖＢ６０１０３をコードする遺伝子配列は、配列番号１７で示され、１～３５１番目は、重鎖可変領域をコードする遺伝子（９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目は３つのＨＣＤＲをそれぞれコードする）であり、３９７～７１７番目は、軽鎖可変領域をコードする遺伝子（４６６～４９８番目、５４４～５６４番目、６６１～６８７番目は３つのＬＣＤＲをそれぞれコードする）であり、７１８～１４１６番目はＦｃをコードする遺伝子である。

【0105】

表４の１２個のｓｃＦｖ－Ｆｃ分子候補を発現させて精製した。ＳｃＦｖＢ６０１０３を例として説明する。ｓｃＦｖＢ６０１０３抗体をコードする遺伝子（配列番号１７）を、人工的に合成し、次いで、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入し、一過性トランスフェクションにより発現させた。一過性トランスフェクション操作は、具体的に、Ｅｘｐｉ２９３発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬、ＤＮＡプラスミドを、それぞれＯｐｔｉＭＥＭの中に添加して、溶液Ａおよび溶液Ｂを得た後、溶液Ａおよび溶液Ｂを均一に混合して、溶液Ｃを得た。溶液Ｃを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加し、そしてＥｘｐｉ２９３細胞を５日間培養した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分間）を行い、上清を採取して、得られた上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ社）をＰＢＳで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体Ａ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０である）を使用して、５つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体Ｂ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５である）を使用して、５つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、３０ＫＤａ濃縮遠心管を使用して濃縮することで、ｓｃＦｖＢ６０１０３目的分子を得た。

【0106】

（１）ＥＬＩＳＡ同定
ＥＬＩＳＡにより、ヒト４－１ＢＢ分子及びサル４－１ＢＢ分子に対するｓｃＦｖ分子の親和性を同定した（具体的な方法については、実施例１に記載の当該手順のとおり）。具体的に表４に示すように、１２種のｓｃＦｖ－Ｆｃ分子は、いずれもヒト４－１ＢＢ及びサル４－１ＢＢの両方を認識できたという結果が示された。ただし、ｓｃＦｖＢ６０１０３の認識能力が最も良かった。ＥＬＩＳＡの結果は図５及び図６に示す。

【0107】

【0108】

（２）ＦＡＣＳ測定

【0109】

使用された試薬は次のとおりである：
ＰＢＳへＢＳＡとアジ化ナトリウムを添加して得たＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡの質量％濃度が２％であり、アジ化ナトリウムの質量％濃度が０．０２％である）、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、遮光保存）。

【0110】

ＥＬＩＳＡ測定結果においてヒト４－１ＢＢへの結合活性が高かったｓｃＦｖ分子と、ヒト４－１ＢＢ分子との親和性についての差異を、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用してＦＡＣＳ法により測定した。実験に使用された細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、細胞膜表面において高度にヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）及び４－１ＢＢ発現無しの野生型ＣＨＯ－Ｋ１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0111】

ヒト４－１ＢＢ遺伝子配列（配列番号７）を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入した。Ｇ４１８（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）を最終的に得て、予備とした。

【0112】

試験細胞をＴ７５フラスコ中で８０％の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を収集した（１フラスコあたり１０^６個程度の細胞）。約１ｍｌの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が１×１０^７個／ｍｌである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各試験抗体（表５ご参照）の希釈液２５μｌを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表５に示したとおりである。また、抗体濃度０μｇ／ｍｌの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で３０分間インキュベートした。再び、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を陽性対照とした。

【0113】

上記の手順により、それぞれのｓｃＦｖ分子の、ヒト４－１ＢＢに対する結合活性の高さを比較した。その結果、表５および図７に示されたように、ｓｃＦｖＢ６０１０３のＥＣ５０値が最も低かったこと、すなわち、ヒト４－１ＢＢに対する親和性が最も高かったｓｃＦｖＢ６０１０３は最適な分子となり得ることが示された。

【0114】

【0115】

実施例３ ＩｇＧヒト化抗体
この実施例で同定された例示的な抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、ハイブリドーマ分泌型抗体３７Ｇ１０Ｆ４をヒト化して得たもの、すなわち、表４のｓｃＦｖＢ６０１０３から変換されたものである。この実施例では、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の発現及び精製、その後の、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の検出、Ｔ細胞活性化システムにおける同定について、詳細に説明する。

【0116】

３．１ 抗体の発現および精製
全長遺伝子配列を、配列決定された遺伝子配列に基づいて合成した。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の重鎖をコードする遺伝子は配列番号３で示され、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の軽鎖をコードする遺伝子は配列番号４で示される。

【0117】

配列番号３の１～３５１番目は重鎖可変領域ＶＨのコード遺伝子である。ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のコード配列は、それぞれ配列番号３の９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目に示されている。

【0118】

配列番号４の１～３２１番目は、軽鎖可変領域ＶＬのコード遺伝子である。ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のコード配列は、それぞれ、配列番号４の７０～１０２番目、１４８～１６８番目、２６５～２９１番目で示される。

【0119】

配列番号３の５’末端および配列番号４の５’末端のそれぞれに、ＸｂａＩの認識配列（５’－ＴＣＴＡＧＡ－３’）、ｋｏｚａｋ共認識配列（５’－ＧＣＣＡＣＣ－３’）、およびシグナルペプチドのコード配列（５’－ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣ－３’）を順番に付加し、続いてシグナルペプチドのコード配列と、配列番号３の５’末端および配列番号４の５’末端とを連結した。その後、配列番号３の３’末端および配列番号４の３’末端のそれぞれに、ターミネーター（ＴＧＡ）およびＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を順番に付加し、ＴＧＡと、配列番号３の３’末端および配列番号４の３’末端とを連結した。得られた新規ＤＮＡ配列をそれぞれ、重鎖遺伝子Ａおよび軽鎖遺伝子Ａと表記する。人工的に合成した重鎖遺伝子ＡをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断した後、それを、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをｐＣＤＮＡ３．４－Ｈと命名した。軽鎖遺伝子ＡをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断した後、それを、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをｐＣＤＮＡ３．４－Ｌと命名した。

【0120】

ｐＣＤＮＡ３．４－Ｈ及びｐＣＤＮＡ３．４－Ｌをヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｆ（ＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）に導入して組換え細胞が得た後、組換え細胞を３７℃、５％ＣＯ_２の条件の振盪式インキュベーターに置いて１２０ｒｐｍで培養した。

【0121】

ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにより、培養上清から抗体タンパク質を精製した。詳細な操作としては、まず、ＰＢＳでＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ社）を平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体Ａ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０である）を使用して、５つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体Ｂ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５である）を使用して、５つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、３０ＫＤａ濃縮遠心管を使用して濃縮することで、前記抗体、すなわち抗ヒト４－１ＢＢ抗体を得た。

【0122】

抗ヒト４－１ＢＢ抗体を配列決定した結果、得られた抗ヒト４－１ＢＢ抗体は完全抗体であることが示された。すなわち、当該抗体はＨａｎｋｅ１０Ｆ４であった。この抗体は、アミノ酸配列が配列番号１で示される重鎖と、アミノ酸配列が配列番号２で示される軽鎖とからなっていた。また、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の重鎖タイプはＩｇＧ４であり、軽鎖タイプはκ鎖であった。

【0123】

配列番号１の１～１１７番目は重鎖可変領域ＶＨである。ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号１の３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示される。

【0124】

配列番号２の１～１０７番目の軽鎖可変領域ＶＬにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号２の２４～３４番目、５０～５６番目、８９～９７番目で示される。

【0125】

３．２ ヒト４－１ＢＢまたはサル４－１ＢＢに対する親和性の同定

【0126】

（１）ＥＬＩＳＡ測定
測定方法は、実施例１の手順１．４と同様にして、９６ウェルプレートをそれぞれヒト４－１ＢＢ又はサル４－１ＢＢで直接に被覆した。なお、抗体サンプル（Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ）を一次抗体とし、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウスを二次抗体とした。また、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）を発色剤とし、硫酸で発色を停止させた。ＢＩＯ－ＴＥＫＥＬＸ－８００マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。

【0127】

表６は、ＩｇＧ４形態の抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の、ＥＬＩＳＡによる結果を示しており、ヒト４－１ＢＢおよびサル４－１ＢＢの両方を認識できたことを示している。

【0128】

【0129】

（２）ＦＡＣＳ測定

【0130】

使用された試薬は次のとおりである：
ＰＢＳへＢＳＡとアジ化ナトリウムを添加して得たＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡの質量％濃度が２％であり、アジ化ナトリウムの質量％濃度が０．０２％である）、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、遮光保存）。

【0131】

実験に使用された細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、細胞膜表面に高度においてヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）及び細胞膜表面において高度にサル４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙ４－１ＢＢ）、並びに４－１ＢＢ発現無しの野生型ＣＨＯ－Ｋ１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0132】

ヒト４－１ＢＢ遺伝子配列（配列番号７）及びサル４－１ＢＢ遺伝子配列（配列番号８）を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってそれぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入した後、それぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入した。その後、Ｇ４１８（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）、及び細胞膜表面において高度にサル４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙ４－１ＢＢ）を最終的に得た。

【0133】

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合活性を測定した。Ｔ７５フラスコを使用して試験細胞を８０％の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を収集した（１フラスコあたり１０^６個程度の細胞）。約１ｍｌの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が１×１０^７個／ｍｌである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の希釈液２５μｌを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表７に示したとおりである。また、抗体濃度０μｇ／ｍｌの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で３０分間インキュベートした。再び、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を陽性対照とした。

【0134】

上記の手順に従って、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙ４－１ＢＢを使用してＨａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とサル４－１ＢＢとの結合活性を測定した。

【0135】

上記の手順に基づく実験から、表７のとおり、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体はヒト４－１ＢＢ分子およびサル４－１ＢＢ分子の両方と高い結合活性を有することが証明された。

【0136】

【0137】

（３）ＦＡＣＳによる、抗体親和性の比較

【0138】

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、ＨＫＢ６モノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合活性を測定して比較した。Ｔ７５フラスコを使用して試験細胞を８０％の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を収集した（１フラスコあたり１０^６個程度の細胞）。約１ｍｌの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が１×１０^７個／ｍｌである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の希釈液２５μｌ又はＨＫＢ６抗体の希釈液２５μｌを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表７に示したとおりである。また、抗体濃度０μｇ／ｍｌの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で３０分間インキュベートした。再び、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。

【0139】

ここで、ＨＫＢ６は中国特許出願２０１８１１５４１５４５．８に記載のＨＫＢ６抗体である。

【0140】

上記の手順で測定した結果、表８及び図８に示すように、ヒト４－１ＢＢに対するＨａｎｋｅ１０Ｆ４の親和性は、ＨＫＢ６の親和性よりも大幅に高かった。

【0141】

【0142】

（４）抗体親和性の測定
ｈ４－１ＢＢ－Ｈｉｓ（Ａｃｒｏ社、製品番号：Ｑ０７０１１－１）抗原を使用し、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｏｃｔｅｃ装置によりバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を用いてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、又はＵｒｅｌｕｍａｂの親和性を測定した。

【0143】

結果、表９に示すようにＨａｎｋｅ１０Ｆ４は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ親和性に匹敵する高い抗体親和性を有している。

【0144】

注：ｋａは、単位時間あたりの結合生成物の生成速度を表す。ｋｄは、単位時間あたりに結合生成物の反応物へ分解されたパーセンテージを表す。ＫＤ値は、親和性の強さを表す。

【0145】

３．３ リガンド競合
Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体とヒト４－１ＢＢＬとの間の競合結合活性の比較に、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用した。二次抗体は、ＳＡ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）であり、その他の操作（下記は除く）及び希釈液は、手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定と同じである。ヒト４－１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号９で示される。

【0146】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、Ｂｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４としてビオチンで標識した。標識方法は、当該技術分野で常規のタンパク質標識方法と同じ方法を採用した。Ｂｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を、試料希釈液を用いて希釈し、１．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、ヒト４－１ＢＢＬ－ｈＩｇＧ（またはＨａｎｋｅ１０Ｆ４）の希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表９のとおりである）。溶液Ａ及び溶液Ｂを、等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0147】

逆競争を測定するために同じ操作を実行した。ヒト４－１ＢＢＬをビオチンで標識してＢｉｏ－４－１ＢＢＬとし、且つ試料希釈液を用いて希釈し、２μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４（又はヒト４－１ＢＢＬ－ｈＩｇＧ）希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表８のとおりである）。溶液Ａ及び溶液Ｂを、等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0148】

以上の手順に基づく実験から、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢＬの結合部位とが競合関係にあることが証明された。具体的な結果は表１０及び図９に示す。つまり、このモノクローナル抗体は、薬物の用量に応じて、ヒト４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路をある程度遮断することができる。

【0149】

【0150】

３．４ エピトープ競合

【0151】

３．４．１ Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４と陽性対照抗体との間の抗原結合エピトープ競合
Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体と対照抗体であるＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂとの間のエピトープ競合関係の比較に、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを用いた。二次抗体はＳＡ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）であり、その他の操作（下記は除く）及び希釈液は、手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定と同じである。

【0152】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４をビオチンで標識してＢｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、１．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表１０のとおりである）。溶液Ａと溶液Ｂとを等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0153】

以上の手順に基づく実験を繰り返した。結果から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂおよびＵｒｅｌｕｍａｂの抗原結合部位とは一定の競合関係にあった。また、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂとの競合は、Ｕｒｅｌｕｍａｂとの競合よりも強かった。具体的な結果は表１１及び図１０に示す。

【0154】

【0155】

３．４．２ Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４及び対照抗体の抗原結合エピトープ分析

【0156】

（１）方法1
ヒト４－１ＢＢ抗原の細胞外ドメインを、段階的にマウス４－１ＢＢの対応する細胞外ドメインに置き換え、それぞれの目的遺伝子を合成した。それぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入して、それぞれの４－１ＢＢ抗原のＤＮＡプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの４－１ＢＢ抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た。具体的には表１２のとおりである。ＦＡＣＳを用いて、抗体と、それぞれの４－１ＢＢ抗原との結合活性を分析し、抗体がヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインに結合する具体的なエピトープを更に分析した。

【0157】

一過性トランスフェクションの操作は、具体的には、Ｅｘｐｉ２９３発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。Ｅｘｐｉ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬、ＤＮＡプラスミドを、それぞれＯｐｔｉＭＥＭの中に添加して、溶液Ａおよび溶液Ｂを得た後、溶液Ａおよび溶液Ｂを均一に混合して、溶液Ｃを得た。溶液Ｃを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加し、一晩インキュベートして、細胞表面において４－１ＢＢ抗原を高度に発現させる細胞株を得た。

【0158】

ここで、ヒト４－１ＢＢ抗原の全長アミノ酸配列は配列番号５で示され（対応するコード遺伝子は配列番号７で示される）、細胞外ドメインは２４～１８６番目（対応するコード遺伝子は配列番号７の７０～５５８番目で示される）である。マウス４－１ＢＢ抗原の全長アミノ酸配列は配列番号１０で示され（対応するコード遺伝子は配列番号１１で示される）、細胞外ドメインは２４～１８７番目（対応するコード遺伝子は配列番号１１の７０～５６１番目で示される）である。

【0159】

手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に、抗体サンプル（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、又はＵｒｅｌｕｍａｂ）を一次抗体として順番に添加し、細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供した。

【0160】

特許及び文献報告の分析によると、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂは主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン３及びドメイン４に結合し、Ｕｒｅｌｕｍａｂは主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン１に結合する。上記の操作により、Ｕｒｅｌｕｍａｂの蛍光強度の傾向は細胞Ａ及び細胞Ｆの２つの群について低下し、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂの場合は細胞Ｂ、細胞Ｃ及び細胞Ｄの３つの群について低下することが分かった。これは、研究報告と一致している。一方、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の蛍光強度の傾向は細胞Ａと細胞Ｆの２群について低下し、且つ細胞Ａの群について大幅に低下し、低下程度はＵｒｅｌｕｍａｂの場合の低下程度よりもはるかに低かった。また、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の蛍光強度は細胞Ｂの群について低下せず、増加していた。したがって、ドメイン１と２ＡはＨａｎｋｅ１０Ｆ４とヒト４－１ＢＢとの親和性に対して非常に重要である一方で、ドメイン２Ｂ、３Ａ、３Ｂによる影響は少ないことが示された。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン１およびドメイン２Ａの領域に結合し、対照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ及びＵｒｅｌｕｍａｂの抗原結合エピトープの場合とはいずれも異なっていた（表１２）。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４と陽性対照抗体とは、ある程度の競合関係を有し、この競合関係は抗原抗体の空間エピトープによるものと考えられる。

【0161】

【0162】

注：細胞Ａにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン１，２Ａ，２Ｂ（ａａ２４－８６）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における２４～８６番目のアミノ酸を、配列番号１０で示されるマウス４－１ＢＢ抗原の全長における２４～８６番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｂにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン２Ｂ，３Ａ，３Ｂ（ａａ６４－１１８）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における６４～１１８番目のアミノ酸を、配列番号１０の６４～１１８番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｃにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン３Ａ，３Ｂ，４Ａ（ａａ８７－１３３）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における８７～１３３番目のアミノ酸を、配列番号１０の８７～１３３番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｄにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン３Ｂ，４Ａ，４Ｂ（ａａ９７－１５９）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における９７～１５９番目のアミノ酸を、配列番号１０の９７～１５９番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｅにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン４Ａ，４Ｂ，ＮＦ（ａａ１１９－１８６）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における１１９～１８６番目のアミノ酸を、配列番号１０の１１９～１８６番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｆにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン１，４Ｂ，ＮＦ（ａａ２４－４６，ａａ１３９－１８６）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における２４～４６および１３９～１８６番目のアミノ酸を、配列番号１０の２４～４６および１３９～１８６番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。

【0163】

（２）方法２
文献の分析によると、ヒト４－１ＢＢ抗原における１０１番目、１３２番目のアミノ酸はＵｔｏｍｉｌｕｌａｂにおける重要な結合部位であり、４２番目はＵｒｅｌｕｍａｂにおける重要な結合部位である。上記部位のアミノ酸を一つずつ突然変異させ、それぞれの目的遺伝子を合成した。これにより、それぞれの４－１ＢＢ抗原を有するＤＮＡプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの４－１ＢＢ抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た（（１）方法１の欄に記載の関連手順に従って得た）。具体的には表１３に示す。

【0164】

【0165】

手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を添加して細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供し、抗体と、それぞれの４－１ＢＢ抗原との結合活性を分析した。結果を図１１に示す。ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとＵｒｅｌｕｍａｂは、いずれも、重要なアミノ酸が変異した後の抗原に結合しなかった。一方、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、上記の全ての抗原と結合する能力には顕著な相違がなく、顕著な低下現象もなかった。即ち、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４における、抗原に結合する重要なアミノ酸は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂ抗体の場合とは一致していなく、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４が、特異的かつユニークな抗原結合部位を有することが、示されている。

【0166】

３．４．３ 抗原に結合するＨａｎｋｅ１０Ｆ４およびＨＫＢ６のエピトープ競合
Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体とＨＫＢ６との間の、抗原に結合するエピトープ競合関係を、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを用いて比較した。二次抗体はＳＡ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）であり、他の手順（下記は除く）及び希釈液は、手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定と同じである。

【0167】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４をビオチンで標識してＢｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、１．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、ＨＫＢ６、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表１４のとおりである）。溶液Ａと溶液Ｂとを等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0168】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とＨＫＢ６とは、競合関係がなく、すなわち、この２つの抗体の抗原結合エピトープが異なっていた。具体的な結果を表１４および図１２に示す。

【0169】

【0170】

３．５ ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定
ＨＥＫ－２９３／ＮＦκＢ－Ｌｕｃｉ／４１－ＢＢ細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、ヒト４－１ＢＢ膜タンパク質及びＮＦκＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子を安定に発現させるＨＥＫ２９３細胞株である。具体的には以下のように操作した。ヒト４－１ＢＢ配列（配列番号７）を目的遺伝子としてｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入してプラスミドＡを得た。同時にＮＦκＢエレメント配列（配列番号１２）とルシフェラーゼ遺伝子（配列番号１３）を目的遺伝子とし、該分野の一般的手法により、ｐＧＬ４．１０ベクター（Ｙｏｕｂｉｏ ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃｈｉｎａ）におけるそれぞれの部位に挿入し、プラスミドＢを得た。次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＡプラスミド及びＢプラスミドの両方をともにＨＥＫ２９３細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に導入した。これに、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）とＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を添加し、加圧スクリーニングを行い、最終的にはＨＥＫ－２９３／ＮＦκＢ－Ｌｕｃｉ／４１－ＢＢを得た。

【0171】

加圧培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋１ｕｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ＋２５０ｕｇ／ｍｌＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ）を調製し、ＨＥＫ－２９３／ＮＦκＢ－Ｌｕｃｉ／４１－ＢＢ細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件の静的インキュベーター中で継続的に培養した。対数増殖期の細胞を採取し、トリプシンで消化した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ）中へ再懸濁させ、５０μｌの細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１７）に、３×１０^４個／ウェルで、プレートコーティングした。抗体と、架橋抗体Ｆａｂ’であるヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－００６－００８）とを、１：２の濃度比で混合した後、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルで添加した。インキュベーター中で１８～２４時間静置した後、１００μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｔｅｍ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、室温で１０分間インキュベートし、化学発光値を測定した。

【0172】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂは、両方とも、レポーター遺伝子を活性化してシグナルを発現させることができる。具体的な結果は図１３Ａに示す。結果のように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとの両方は、いずれも、Ｔ細胞活性化のシグナル伝達経路を活性化させ、Ｔ細胞の免疫機能を開始させることができた。また、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の活性化効果はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂよりも顕著に高かった。

【0173】

３．６ インビトロでの薬効

【0174】

３．６．１ ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化効果の測定
抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番３１７３２５）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌになるまで希釈して抗ＣＤ３抗体溶液を得た。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体をＰＢＳで希釈して高、中、低の３つの濃度としたことで、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の濃度が４μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌである溶液をそれぞれ得られた。抗ＣＤ３抗体溶液を、３つの濃度のＨａｎｋｅ１０Ｆ４抗体溶液と１：１の体積比でそれぞれ均一に混合した後、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。なお、3つの複製ウェルを設けた。９６ウェルプレートを３７℃で静置して１時間インキュベートした。翌日の使用の前にＰＢＳで３回洗浄した。また、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂを陽性対照抗体とし、ＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番４０３６０１）を陰性対照抗体とした。

【0175】

ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の分離：
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、その説明書に従って操作してＰＢＭＣ細胞を単離した。また、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞磁気ビーズ（ＢＤ社、品番５５７７６７）を用いて、説明書に従ってヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離・精製し、予備とした。

【0176】

３７℃下のインキュベートを経たコーティング済の９６ウェル細胞培養プレートに、密度１×１０^５個／ウェルの条件でＣＤ４^＋Ｔ細胞を添加した。この９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ_２の条件のインキュベーターに置いて３日間インキュベートし、細胞上清を収集し、サイトカインＩＮＦ－γの分泌量をＥＬＩＳＡにより測定した。

【0177】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂに類似し、両方とも、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、且つサイトカインＩＮＦ－γを分泌させた。具体的な結果は図１４に示す。

【0178】

３．６．２ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化効果の測定
抗ＣＤ３抗体をＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に６０μｌ／ウェルで添加し、９６ウェルプレートを３７℃で静置して１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、次いでＣＨＯ－Ｋ１安定発現細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２ＡまたはＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２ＢまたはＣＨＯ－Ｋ１）を１００μｌ／ウェル、１×１０^４個／ウェルで９６ウェルプレートに加えた。次いで９６ウェルプレートを細胞インキュベーターに一晩置いた。

【0179】

実験に使用された細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、細胞膜表面においてヒトＦｃγＲ∥Ａ（ＣＤ３２Ａ）を高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ａ）、及び細胞膜表面においてヒトＦｃγＲ∥Ｂ（ＣＤ３２Ｂ）を高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ｂ）、並びに、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

【0180】

ヒトＦｃγＲ∥Ａのコーディング遺伝子配列（配列番号１４）およびヒトＦｃγＲ∥Ｂのコーディング遺伝子配列（配列番号１５）を人工的に合成し、次いで、これらを当該分野で慣用的な方法に従ってそれぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれぞれ導入した。Ｇ４１８（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入した。）を添加して加圧スクリーニングし、細胞膜においてヒトＦｃγＲ∥Ａを高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ａ）、及び細胞膜表面においてヒトＦｃγＲ∥Ｂを高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ｂ）を最終的に得た。

【0181】

ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の分離：
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、その説明書に従って操作してＰＢＭＣ細胞を単離した。また、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞磁気ビーズ（ＢＤ社、品番５５７７６６）を用いて、説明書に従ってヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を分離・精製し、予備とした。

【0182】

９６ウェルプレートを一晩インキュベートした後、細胞上清を吸引して除去した。そして、１００μｌのヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１×１０^５個／ウェルで、各ウェルにそれぞれ添加した。次いで、抗体を、目的濃度になるように培地で希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加した。なお、最終濃度はそれぞれ３μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌであり、各濃度について、それぞれ3つの複製ウェルを設けた。９６ウェルプレートを細胞インキュベーターで３日間インキュベートし、細胞培養上清の中のサイトカインＩＮＦ－γの分泌量をＥＬＩＳＡ法により測定した。

【0183】

上記の手順に基づく実験により証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂに類似し、両方とも、Ｔ細胞の活性化を刺激し、且つＴ細胞の活性化はＦｃγＲ∥Ａ、ＦｃγＲ∥Ｂに依存していた。具体的な結果は図１５に示す。

【0184】

３．７ インビボでの薬効
実験では、Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスを選択して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスモデルは、具体的には遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムにヒト由来のｈ４－１ＢＢ遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄから入手した。

【0185】

ＭＣ３８細胞系を被験マウスの背中（剃り）の一側に皮下接種した（各マウスに対して、２×１０^６の細胞をそれぞれ接種した。なお、細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１の体積比で均一に混合した後に２００μｌ接種した）。腫瘍担持マウスの平均腫瘍体積が１００ｍｍ^３に達したとき、実験設計に従って、マウスを８匹ずつの５つのグループにランダムに割り当てた。各グループについて投与した日を０日目と定義した。グループの割り当ておよび投与スケジュールは表１５に示す。

【0186】

【0187】

腫瘍が接種された後の動物の生存状況および活動状況を毎週、２回検査した。検査には、腫瘍の増殖状況、運動能力、飲食、体重および他の異常な行為が含まれる。

【0188】

上記の手順に基づく実験により証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体は、ＭＣ３８腫瘍の増殖を抑制することができ、ドーズ依存性が顕著であった。また、同じドーズでは、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の腫瘍抑制能力は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ抗体の抗腫瘍効果よりも顕著に強かった。具体的な結果は図１６に示す。

【0189】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４投与グループでは、腫瘍が消失した後、1ヶ月観察し続けた結果、腫瘍の再発は認められなかった。腫瘍が消失したマウスに、再びＭＣ３８細胞を４×１０^６個接種し、１５日経過しても、図１７に示すように腫瘍は形成されなかった。つまり、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は腫瘍の増殖を抑制するだけでなく、マウスの記憶Ｔ細胞の機能を動員することで腫瘍の再発を抑えることができ、且つ同型の腫瘍に対して免疫機能を有することが示されている。

【0190】

３．８ 安全性の評価

【0191】

３．８．１ マウスを用いる毒性試験
実験では、Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスを選択して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスモデルは、具体的には遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムにヒト由来のｈ４－１ＢＢ遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄから入手した。

【0192】

被験マウスを４つのグループにランダムに割り当て、それぞれ生理食塩水、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ及びＵｒｅｌｕｍａｂを投与した。具体的には、週に２回、毎回の投与濃度が３０ｍｇ／ｋｇの条件で、３週間投与した。投与終了後、尾を切って血液を採取し、マウスの末梢血の中のＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の含有量を測定した。図１８に示すように、Ｕｒｅｌｕｍａｂは生理食塩水の場合のグループと比較してＡＳＴ含有量が顕著に上昇しており、この抗体では肝毒性のリスクを有することを示している。一方、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂの場合のＡＳＴ及びＡＬＴの含有量は、いずれも、生理食塩水の場合のグループとは有意差がなかった。これは、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４およびＵｔｏｍｉｌｕｍａｂのいずれも、低い毒性を有することを示している。

【0193】

３．８．２ ＳＤラットへＨａｎｋｅ１０Ｆ４を静脈注射で投与する場合の機能観察総合評価（ＦＯＢ）試験
高（３０ｍｇ／ｋｇ）、中（１０ｍｇ／ｋｇ）、低（３ｍｇ／ｋｇ）の３つの投与ドーズを設定して、４０匹のＳＤラット（メス半分、オス半分）へＨａｎｋｅ１０Ｆ４を単回の静脈注射で投与し、それぞれの時点における機能観察総合評価（ＦＯＢ）試験に基づいて、ＳＤラットの中枢神経系に対する、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の影響を評価した。

【0194】

実験の期間中、プラセボ対照グループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４低ドーズグループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４中ドーズグループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４高ドーズグループのいずれについても、ラットの通常状態の観察では有意な異常が認められなかった。投与前、及び投与後の０．５時間、６時間、２４時間、４８時間、１６８時間では、各グループの動物の姿勢、立毛などの指標において、薬物に関連する異常や変化が見られなかった。動物の自傷又はケージ内の他の動物への攻撃が見られず、動物の死亡も見られなかった。各グループの動物は、ケージから出る難しさ、フリーハンド拘束観察、流涙、流涎、分泌物、眼球の突出、瞳孔、閉瞼、皮膚の色、立毛、呼吸などの指標に異常や変化が見られなかった。各グループの動物は、接近反応、接触反応、パニック反応、腹部の緊張、体の張り、耳介反射、掉尾反射の観察、平面立ち直り反射観察、空中立ち直り反射、瞳孔反射の観察、瞼の反射、屈筋反応、伸筋反応などの指標に異常や変化が見られなかった。総合すると、本実験の条件で、ＳＤラットへ単回の静脈注射で３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇのＨａｎｋｅ１０Ｆ４を投与したところ、動物の中枢神経系の機能への明らかな影響はなかった。

【0195】

３．８．３ カニクイザルを用いる毒性試験
４匹のカニクイザルを、性別に基づいて分け、体重に基づいてドーズクライミンググループ、固定ドーズグループの合計２つのグループにランダムに割り当てた。なお、１グループにつき２匹、且つメス半分、オス半分であった。それらに静脈注射のルートで投薬した。詳細は表１６を示す。

【0196】

【0197】

測定の時点については、適応期間において１回測定し、Ｄ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９に投与して２４時間経過したときにそれぞれ１回測定し、投与期間の終了（Ｄ３５）後に１回測定した。実験の結果、投与期間において、各グループのサルは、通常状態の観察、体重、及び摂食量／食物消費量、体温、呼吸、心電図、血圧、血液凝固指標等のいずれにおいても異常が認められなかったことが示された。投与前と比べて、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を用いた各ドーズグレープにおける全ての動物は、血液の生化学指標の各指標（アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ）がいずれも正常の範囲内で変動し、顕著な変化傾向は認められなかった。詳細は表１７を示す。ドーズクライミンググループでは、１００ｍｇ／ｋｇ以上のドーズの場合、オス動物の白血球及び好中球、単球が上昇し、サイトカインＩＬ－６が僅かに上昇したが、再び投与された後、元のレベルに戻った。詳細は表１８を示す。したがって、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、カニクイザル体内での最大耐量（ＭＴＤ）≧２００ｍｇ／ｋｇと分かった。

【0198】

【0199】

【0200】

３．９ 安定性

【0201】

（１）加速安定性
調製したＦ０１（ｐＨ５．２）とＦ０２（ｐＨ５．５）の２種類の緩衝液を用い、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を２０ｍｇ／ｍｌとし、４℃の条件で３ヶ月間（３Ｍ）放置して、抗体濃度、凝集分解等の各物理化学的特性を測定した。具体的には、光路長可変型分光光度計によりＨａｎｋｅ１０Ｆ４タンパク質の濃度を測定し、高速液体クロマトグラフィーによりＨａｎｋｅ１０Ｆ４の分子サイズ、ヘテロ純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）及び電荷ヘテロ純度（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）を測定し、キャピラリー電気泳動分析システムによりＨａｎｋｅ１０Ｆ４非還元キャピラリーゲル電気泳動タンパク質純度（ＮＲ－ＣＥ）を測定した。結果は表１９に示す。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、それぞれのｐＨの緩衝液中に４℃で３ヶ月間放置した後、初期時のサンプル（Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４／Ｔ０）と比較して、明らかな変化がなく、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の安定性が良好であった。

【0202】

同時に、４℃で１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、３ヶ月（３Ｍ）放置したＨａｎｋｅ１０Ｆ４のサンプルと、実験開始の時点のサンプル（Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４／Ｔ０）を取り、先に述べたレポーター遺伝子法により、最高濃度が４ｕｇ／ｍｌ、２倍の勾配で希釈してなる９つの濃度ポイントという条件で、抗体の生物学的活性を測定した。実験結果は図１３Ｂに示す。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を４℃で３ヶ月放置した後でも、抗体の生物学的活性は良好であった。

【0203】

【0204】

（２）Ｔｍ値の測定
示差走査蛍光（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）により、両波長（３５０ｎｍと３３０ｎｍ）における、抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の蛍光強度を測定し、蛍光強度比を算出した。また、タンパク質のアンフォールディング期間中の蛍光強度及び蛍光ピーク値の変化を測定し、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のタンパク質が半分アンフォールディングされた時点の温度、すなわち、Ｔｍ値を得た。結果として、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のＴｍ１値は６４．４℃であり、Ｔｍ２値は７１．５℃（Ｔｍ１とＴｍ２は、タンパク質のアンフォールディング期間中に蛍光ピークが変化したときの２つの温度である）であった。つまり、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の安定性は良好であった（図１９）。

【産業上の利用可能性】

【0205】

本発明が提供する抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、ヒト４－１ＢＢに結合することができ、且つヒト４－１ＢＢに対して高い親和性を示し、また、Ｔ細胞応答を効果的に増強させることができる。前記抗体は、ある程度、ヒト４－１ＢＢＬと競合してヒト４－１ＢＢに結合する。他方、Ｔ細胞共刺激測定法では、前記抗体はＩＮＦ－γの発生を誘導し、マウスモデルにおいて腫瘍の増殖を顕著に阻害し、且つ腫瘍の再発はない。本発明に係る抗体は、T細胞および抗体により媒介される免疫応答の調節に有用であり、また、腫瘍免疫療法に有用である。本発明で提供される一本鎖抗体の融合抗体は、ヒト４－１ＢＢ及びサル４－１ＢＢに結合することができる。

【0206】

本発明に係る抗体とヒト４－１ＢＢとの結合は、免疫応答の増強をもたらす。本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫増強剤として、または、Ｔ細胞により媒介される自己免疫疾患の免疫調節剤として有用である。前記抗体およびその抗原結合フラグメントは、癌、自己免疫、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の４－１ＢＢを検出するための診断ツールとしても有用である。

【0207】

本発明により提供される抗体は、抗腫瘍の効果が良く、安全性が高く、安定性が高い。

【0208】

本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫調整剤として、例えば、癌、自己免疫疾患、炎症疾患及び感染疾患等の治療など、幅広い治療用途に適用されうる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2023503228000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-07-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
抗体の重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１のＮ末端から順番に、３１～３５番目、５０～６４番目、および９８～１０６番目で示されているか、または、
抗体の軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号２のＮ末端から順番に、２４～３４番目、５０～５６番目、および８９～９７番目で示されることを特徴とする、抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、下記の（ａ１）～（ａ１２）のいずれか一つであるか、または前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、下記の（ｂ１）～（ｂ１２）のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ１）配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または、配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ２）配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ３）配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ４）配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ５）配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ６）配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ７）配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ８）配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ９）配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ１０）配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ１１）配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ａ１２）配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目までのアミノ酸配列、または配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目までのアミノ酸配列、または、配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ２）配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ３）配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ４）配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ５）配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ６）配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ７）配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ８）配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ９）配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ１０）配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ１１）配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ１２）配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【請求項3】

前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤであり、
好ましくは、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプであり、及び／又は
前記抗体の軽鎖タイプは、κ鎖またはλ鎖であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記抗体の重鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であるか、又は
前記抗体の軽鎖におけるアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、または、配列番号２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗原結合フラグメントは一本鎖抗体であり、前記一本鎖抗体のアミノ酸全配列は下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ｃ１）配列番号１６の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または、配列番号１６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ２）配列番号１８の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ３）配列番号１９の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号１９の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ４）配列番号２０の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２０の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ５）配列番号２１の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２１の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ６）配列番号２２の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２２の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性をするアミノ酸配列；
（ｃ７）配列番号２３の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２３の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ８）配列番号２４の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２４の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ９）配列番号２５の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２５の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ１０）配列番号２６の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ１１）配列番号２７の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２７の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｃ１２）配列番号２８の１～２３９番目までのアミノ酸配列、または配列番号２８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【請求項6】

下記の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか一つである抗体誘導体：
（ｉ）請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質；
（ｉｉ）請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体；
（ｉｉｉ）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質又は前記二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されるＡＤＣ抗体。

【請求項7】

前記抗体融合タンパク質における前記他のタンパク質は、タグタンパク質であることを特徴とする、請求項６に記載の抗体誘導体。

【請求項8】

前記タグタンパク質は、Ｆｃであることを特徴とする、請求項７に記載の抗体誘導体。

【請求項9】

前記Ｆｃは、ＩｇＧ Ｆｃであることを特徴とする、請求項８に記載の抗体誘導体。

【請求項10】

前記ＩｇＧは、ＩｇＧ４であることを特徴とする、請求項８に記載の抗体誘導体。

【請求項11】

前記Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号１６の２４０～４７２番目で示されるアミノ酸配列、または、配列番号１６のＮ末端からの２４０～４７２番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項８に記載の抗体誘導体。

【請求項12】

前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体誘導体：
（ｄ１）配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ２）配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ３）配列番号１９のアミノ酸配列、または配列番号１９と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ４）配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ５）配列番号２１のアミノ酸配列、または配列番号２１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ６）配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ７）配列番号２３のアミノ酸配列、または配列番号２３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ８）配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ９）配列番号２５のアミノ酸配列、または配列番号２５と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ１０）配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ１１）配列番号２７のアミノ酸配列、または配列番号２７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｄ１２）配列番号２８のアミノ酸配列、または配列番号２８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【請求項13】

以下のいずれか一つである方法：
（Ｃ１）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、試験されるサンプルを検出する工程を含む、４－１ＢＢを検出する方法；
（Ｃ２）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する方法；
（Ｃ３）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、Ｔ細胞活性化を刺激する工程を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する方法；
（Ｃ４）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する工程を含む、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する方法；
（Ｃ５）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法；
（Ｃ６）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法；
（Ｃ７）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、結腸癌を治療および／または予防する工程を含む、結腸癌を治療および／または予防する方法；
（Ｃ８）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を活性成分として用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法；
（Ｃ９）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を活性成分として用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法；
（Ｃ１０）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１１）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、癌を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、癌を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１２）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１３）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１４）請求項１に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項６に記載の抗体誘導体を用い、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法。

【請求項14】

前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢまたはサル４－１ＢＢであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記癌は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す癌であり、前記自己免疫疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す自己免疫疾患であり、前記炎症性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す炎症性疾患であり、前記感染性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す感染性疾患であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）遺伝子によってコードされる４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＫｗｏｎおよびＷｅｉｓｓｍａｎにより、活性化されたマウスＴ細胞のクローン、分化、スクリーニングの過程において初めて発見されたものである。Ｓｃｈｗａｒｚｈらは、ヒト活性化Ｔ細胞から、マウス４－１ＢＢと相同性を有するヒト４－１ＢＢを単離し、且つＣＤ１３７と命名した。Ｉ型膜糖タンパク質である４－１ＢＢは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１とは異なり、４－１ＢＢの発現は、活性化依存的であり、また、４－１ＢＢは、Ｔ細胞活性化の共刺激シグナルを媒介し、活性化されたＮＫ細胞、活性化されたＴ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、単球、好中球およびＴｒｅｇ細胞などの免疫細胞の表面に広く存在する。

【0003】

２５５個のアミノ酸を有するヒト４－１ＢＢは、細胞表面において単量体及び二量体の形態で発現し、且つ、容易にリガンドと三量体を形成してシグナル伝達を開始する。

【0004】

４－１ＢＢは、そのシグナル伝達経路によりＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の分化、増殖およびサイトカインの発生が促進されるという活性化共刺激分子であることが、研究により明らかになっている。４－１ＢＢは、活性化されたＴ細胞に主に発現し、Ｔ細胞の免疫応答の中期および後期において作用する。４－１ＢＢのシグナル伝達経路により、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能が増強し、それにより抗腫瘍効果が発揮される。また、ＮＫ細胞、ＤＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫機能が増強することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答が向上する。４－１ＢＢは、ＴＮＦＲ関連因子であるＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２を動員してヘテロ三量体を形成し、ｃ－ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）経路、並びにβ－カテニン及びＡＫＴ経路を介してシグナル伝達を増強し、且つ主要の転写因子ＮＦ－κＢを介して４－１ＢＢシグナルを調節することにより、サイトカインの発生および分泌を促進する。さらに、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬの相互作用により、Ｔ細胞の、ウイルス感染に対する免疫防御効果は増強し得る。さらに、４－１ＢＢの単独療法および併用療法による腫瘍治療モデルでは、Ｔ細胞における持続的な抗腫瘍防御性を示す記憶応答が、すでに確立されている。

【0005】

現在、４－１ＢＢに関するアゴニストは市販されておらず、最も早いものであってもまだ臨床治験の段階にあり、癌を含む各種の疾患の免疫治療方法に対する需要を満たすことができない。したがって、４－１ＢＢをターゲットとする、「アクセラレータ」のような位置づけの薬物を開発し、Ｒｏｃｈｅのリツキサンのような既存のがん薬物を利用して免疫システムの活性化を助ける新たな腫瘍免疫治療手段を開発することは、市場の需要に応え、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の薬物耐性の欠点を克服することができるため、好適な応用が見込まれる。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ヒト４－１ＢＢに結合可能な分子及びその応用を提供することを目的とする。

【0007】

本発明に提供されるヒト４－１ＢＢに結合可能な分子は、ヒト化抗ヒト４－１ＢＢ抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、ＳｃＦｖフラグメント）；または、抗体融合タンパク質（例えば、完全なヒト化抗体、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントと他のタンパク質とが融合して形成される抗体融合タンパク質）；または、ヒト化抗ヒト４－１ＢＢ抗体と、生物活性を有する小分子薬物とのカップリングにより形成されたＡＤＣ抗体；又は、完全なヒト化抗体、ＳｃＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントと、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体であってもよい。

【0008】

第１の態様において、本発明は抗体を特許請求している。

【0009】

本発明は、重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、順番に、配列番号１のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示され、軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、順番に、配列番号２のＮ末端からの２４～３４番目、５０～５６番目、８９～９７番目で示される抗体を特許請求している。

【0010】

さらに、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0011】

（ａ１）配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目）、または配列番号１のＮ末端からの１～１１７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目）と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ２）配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ３）配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ４）配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ５）配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ６）配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ７）配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ８）配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ９）配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１０）配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１１）配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１２）配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0012】

さらに、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0013】

（ｂ１）配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目）、または配列番号２のＮ末端からの１～１０７番目（即ち、配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目）と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ２）配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ３）配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ４）配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ５）配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ６）配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ７）配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ８）配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ９）配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１０）配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１１）配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１２）配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0014】

前記抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４定常領域であり、配列番号１のＮ末端からの１１８～４４４番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。前記抗体の軽鎖定常領域は、ヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域であり、配列番号２のＮ末端から１０８～２１４番目で示される特定のアミノ酸配列を有する。

【0015】

さらに、前記重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１であるか、配列番号１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。前記軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２であるか、配列番号２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0016】

本発明に係る抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤなどの任意のタイプであってもよい。好ましくは、４－１ＢＢ抗体は、ＩｇＧタイプであり、例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプ、より好ましくはＩｇＧ４サブタイプである。

【0017】

本発明に係る抗体の軽鎖タイプは、κ鎖であってもよく、λ鎖であってもよいが、より好ましくはＫａｐｐａ鎖である。

【0018】

本発明の具体的な実施形態において、前記抗体は、具体的に、ヒト化抗ヒト４－１ＢＢ抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４である。前記Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン１およびドメイン２Ａに結合する。

【0019】

本発明にかかる抗体は、以下の特性または特徴の１つ以上を有する。
１）ヒト４－１ＢＢに特異的に結合する；
２）ヒト４－１ＢＢ及びカニクイザル４－１ＢＢに結合する；
３）ヒト４－１ＢＢまたはカニクイザル４－１ＢＢに結合する；
４）ヒト４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド）とヒト４－１ＢＢとの結合を、ある程度ブロックする；
５）ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である；
６）ヒト抗体またはヒト化抗体である。

【0020】

本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト４－１ＢＢに対してアゴニストの活性を有し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。また、細胞表面の４－１ＢＢ分子に結合することにより、下流のＮＦ－κＢシグナル伝達経路の活性化を引き起こすことができ、それにより、サイトカインＩＦＮ－γの発生及び分泌を顕著に促進し、且つヒト４－１ＢＢ遺伝子ノックインによるヒト化マウスの体内の腫瘍の発生及び進行を顕著に抑制することができる。前記抗体又はその抗原結合部分は、免疫細胞の活性を調節することにより免疫システムを調節することができ、免疫増強剤による抗腫瘍若しくは抗ウイルスの免疫応答のための免疫増強剤として、又はT細胞により媒介される自己免疫疾患のための免疫調節剤として使用することができることをある程度示す。

【0021】

本発明の抗体は、当該技術分野で周知の方法によって調製でき、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などの不死化真核細胞などの形質転換細胞において発現するにより調製することができる。抗体は、当該技術分野で周知の方法によって、１つのクラスまたはサブタイプから別のクラスまたはサブタイプに転換することができる。さらに、本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。

【0022】

本発明に係る抗体は、以下に詳細に説明されるように、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、Ｂリンパ球のウイルスまたは癌遺伝子形質転換、または組換え抗体技術などの従来のモノクローナル抗体技術を含む、当該技術分野で知られている技術によって発生させることができる。

【0023】

ハイブリドーマの発生は、当技術分野で周知の一般的な方法である。まず、ヒト４－１ＢＢタンパク質を一過性にトランスフェクトして発現させ、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫する。ヒト４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列は、配列番号５（ただし、２４～１８４番目は細胞外ドメインである）で示され、免疫抗原は、単離されたヒト４－１ＢＢまたは精製されたヒト４－１ＢＢであり、ヒト４－１ＢＢフラグメント、例えば、ヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインであってもよい。動物免疫は、例えば、マウス、ラット、ヒツジなどの非ヒト動物を免疫化する、当該技術分野で公知の任意の方法によって実施することができる。ヒト４－１ＢＢ抗原で動物を免疫化した後、免疫化された動物から単離された細胞から、抗体を生成する不死化細胞株を調製する。免疫後、動物を犠牲し、不死化リンパ節および／または脾臓Ｂ細胞を得る。常法により細胞融合を行い、抗４－１ＢＢ抗体を生成する細胞である陽性細胞クローンを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。その後、サブクローニングを繰り返し、さらにスクリーニングすることで、増殖の状態が良好であり、抗体の収率が高く、また培養上清が１００％陽性であるハイブリドーマを選択する。ハイブリドーマは、同系動物、免疫システムを欠く動物、およびヌードマウスにおいてインビボで増殖させたり、またはインビトロでの細胞培養において増殖させたりすることができる。ハイブリドーマの選択、クローニングおよび増殖のための方法は、当業者に周知である。ハイブリドーマ細胞が分泌する免疫グロブリンサブタイプを、二相寒天拡散試験によりＩｇＧ１として検出することができる。本発明の抗体はファージディスプレイ法によっても調製できる。ヒト抗体を単離するための上記ファージディスプレイ法は、当技術分野ですでに確立されている。

【0024】

発生・発現された後の前記抗体は、抗体、二量体、一本鎖の軽鎖や重鎖、または他の免疫グロブリン形態を含むが、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などのような当該技術分野での標準的な方法により精製することができる。

【0025】

第２の態様において、本発明は、前述の抗体の抗原結合フラグメントを特許請求している。

【0026】

ここで、抗原結合フラグメントは、（１）前述抗体の軽鎖、（２）前述抗体の重鎖、（３）前述抗体の軽鎖可変領域、（４）前述抗体の重鎖可変領域、（５）前述抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域のうち、１つまたは複数を含み得る。

【0027】

さらに、前記抗原結合性フラグメントは、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（２）ヒンジ領域がジスルフィド結合により連結されている2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（３）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（４）抗体の一方のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦＶフラグメント、（５）単離されたＣＤＲ（例えば、軽鎖由来のＣＤＲおよび／または重鎖由来のＣＤＲ）、及び（６）一本鎖抗体などのうち、いずれか一つであってもよい。ただし、一本鎖抗体はｓｃＦｖ構造であってもよく、また、一本鎖抗体は、異なるタグ、例えば、ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ、ｓｃＦｖ－Ｆｃなどを担持することができる。

【0028】

本発明の具体的な実施形態において、本発明にかかる抗原結合フラグメントは、タグ付き一本鎖抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）である。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）は、VHドメインのVLドメインに連結された単一ポリペプチド鎖を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃタグから構成され得る。ただし、ＶＬドメインとＶＨドメインとは一価分子を形成するように対合する。一本鎖抗体は、当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる。

【0029】

この態様において、本発明は、特に抗４－１ＢＢ一本鎖抗体を特許請求している。

【0030】

本発明は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結してなり、前記重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの１５６～１６６番目、１８２～１８８番目、２２１～２２９番目で示される、抗４－１ＢＢ一本鎖抗体を特許請求している。

【0031】

さらに、前記一本鎖抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0032】

（ａ１）配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ２）配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ３）配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号１９のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ４）配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２０のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ５）配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２１のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ６）配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２２のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ７）配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２３のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ８）配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２４のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ９）配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２５のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１０）配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２６のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１１）配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２７のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ａ１２）配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目、または配列番号２８のＮ末端からの１～１１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0033】

さらに、前記一本鎖抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つである。

【0034】

（ｂ１）配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ２）配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ３）配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号１９のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ４）配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２０のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ５）配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２１のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ６）配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２２のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ７）配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２３のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ８）配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２４のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ９）配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２５のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１０）配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２６のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１１）配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２７のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｂ１２）配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目、または配列番号２８のＮ末端からの１３３～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0035】

さらに、前記一本鎖抗体のアミノ酸配列は下記のいずれか一つである。

【0036】

（ｃ１）配列番号１６の１～２３９番目、または配列番号１６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ２）配列番号１８の１～２３９番目、または配列番号１８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ３）配列番号１９の１～２３９番目、または配列番号１９の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ４）配列番号２０の１～２３９番目、または配列番号２０の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ５）配列番号２１の１～２３９番目、または配列番号２１の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ６）配列番号２２の１～２３９番目、または配列番号２２の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性をするもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ７）配列番号２３の１～２３９番目、または配列番号２３の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ８）配列番号２４の１～２３９番目、または配列番号２４の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ９）配列番号２５の１～２３９番目、または配列番号２５の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ１０）配列番号２６の１～２３９番目、または配列番号２６の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ１１）配列番号２７の１～２３９番目、または配列番号２７の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｃ１２）配列番号２８の１～２３９番目、または配列番号２８の１～２３９番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0037】

第３の態様において、本発明は、前記抗体または前記抗原結合フラグメントと、他のタンパク質とから形成される抗体融合タンパク質を特許請求している。

【0038】

ここで、前記の他のタンパク質は、毒素、酵素、細胞膜タンパク質分子、サイトカインまたは受容体タンパク質などであってもよい。

【0039】

さらに、本発明が特許請求している前記抗体融合タンパク質は、前記一本鎖抗体とタグタンパク質とから形成される、タグタンパク質を有する一本鎖抗体であってもよい。

【0040】

本発明の具体的な実施形態において、前記タグタンパク質はＦｃである。

【0041】

さらに、前記Ｆｃは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤに由来してもよい。好ましくは、前記Ｆｃは、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、またはＩｇＧ４サブタイプなどのＩｇＧタイプに由来し、より好ましくはＩｇＧ４サブタイプに由来する。前記Ｆｃは、好ましくはヒト由来である。

【0042】

さらに、前記Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号１６の２４０～４７２番目で示されるか、または配列番号１６のＮ末端からの２４０～４７２番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有する。

【0043】

より詳しくは、前記のタグタンパク質を有する一本鎖抗体のアミノ酸配列は、下記のいずれか一つであってもよい。

【0044】

（ｄ１）配列番号１６で示されるものか、または配列番号１６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ２）配列番号１８で示されるものか、または配列番号１８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ３）配列番号１９で示されるものか、または配列番号１９と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ４）配列番号２０で示されるものか、または配列番号２０と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ５）配列番号２１で示されるものか、または配列番号２１と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ６）配列番号２２で示されるものか、または配列番号２２と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ７）配列番号２３で示されるものか、または配列番号２３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ８）配列番号２４で示されるものか、または配列番号２４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ９）配列番号２５で示されるものか、または配列番号２５と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ１０）配列番号２６で示されるものか、または配列番号２６と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ１１）配列番号２７で示されるものか、または配列番号２７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）；
（ｄ１２）配列番号２８で示されるものか、または配列番号２８と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0045】

第４の態様においては、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、または前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体と、他のターゲット抗体とから形成される二重抗体を特許請求している。

【0046】

第５の態様においては、本発明は、核酸分子を特許請求している。

【0047】

本発明に係る核酸分子は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質、または前記二重抗体をコードする。

【0048】

本発明に係る核酸分子は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、前記核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。

【0049】

さらに、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号３の５’末端からの９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目で示され、前記抗体の軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列が、順番に、配列番号４の５’末端からの７０～１０２番目、１４８～１６８番目、２６５～２９１番目で示されるものである。

【0050】

さらに、前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３の５’末端からの１～３５１番目、または配列番号３の５’末端からの１～３５１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するものである（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。前記抗体の前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４の５’末端からの１～３２１番目、又は配列番号４の５’末端からの１～３２１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上又は７５％以上の同一性を有するものである（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）。

【0051】

前記核酸分子において、前記抗体の前記重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３の５’末端からの３５２～１３３２番目である。前記抗体の前記軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の５’末端からの３２２～６４２番目である。

【0052】

より具体的には、前記核酸分子において、前記抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、または配列番号３と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上もしくは７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。前記抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４、または配列番号４と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上もしくは７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0053】

本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。ハイブリドーマにより発現される抗体について、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により、前記ハイブリドーマにより発生する抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。

【0054】

本発明に係る核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖の一部、全長軽鎖もしくは重鎖、または抗体誘導体もしくはその抗原結合フラグメントの、アミノ酸配列をコードすることができる。

【0055】

ＶＨをコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に連結することにより、全長重鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト重鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域であってもよい。ＩｇＧ４定常領域が好ましい。

【0056】

ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に連結することにより、全長軽鎖遺伝子に転換されることができる。ヒト軽鎖定常領域の遺伝子配列は当該技術分野では公知であるが、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、Ｋａｐｐａ定常領域またはＬａｍｂｄａ定常領域であってもよい。

【0057】

この態様において、本発明は、特に、前述一本鎖抗体、前述タグタンパク質を有する一本鎖抗体、または前述融合抗体をコードする核酸分子を特許請求している。

【0058】

さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号１７の５’末端からの９１－１０５番目、１４８－１９２番目、２９２－３１８番目で示され、前記軽鎖可変領域におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＨＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は、順番に、配列番号１７の５’末端からの４６６－４９８番目、５４４－５６４番目、６６１－６８７番目で示されるものである。

【0059】

さらに、前記核酸分子において、前記重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７の５’末端からの１－３５１番目、又は配列番号１７の５’末端からの１－３５１番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。前記軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７の５’末端からの３９７－７１７番目、又は配列番号１７の５’末端からの３９７－７１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、又は７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0060】

より具体的には、前記一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７の５’末端からの１～７１７番目、または配列番号１７の５’末端からの１～７１７番目と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0061】

より具体的には、前記タグタンパク質を有する一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７、または配列番号１７と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、または７５％以上の同一性を有するもの（一致しない部分は、好ましくは、骨格領域（ＦＲ）にある）である。

【0062】

本発明に係る核酸分子は、適切な分子生物学的技術により得ることができる。

【0063】

第６の態様において、本発明は、前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、または組換え細胞を特許請求している。

【0064】

ここで、前記ベクターは、抗体若しくはその抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、またはタグタンパク質を有する一本鎖抗体（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）などの結合分子、又は融合抗体の発現のための、発現ベクターに用いられるものである。

【0065】

本発明に係る抗体（または一本鎖抗体又は融合抗体）を発現させるためには、軽鎖および重鎖の一部または全長をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ＤＮＡ分子の転写および翻訳を開始させる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターまたは同一の発現ベクターに挿入することができる。挿入方法は、例えば、抗体遺伝子フラグメントの相補的制限サイトとベクターとの連結などの公知の任意の適切な方法を用いることができる。本発明に係る抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、任意の抗体タイプおよびサブタイプの全長抗体遺伝子を作製することができる。

【0066】

発明は、本発明に係る核酸分子を含む宿主細胞（すなわち、前記組換え細胞）をさらに提供する。前記宿主細胞は、発現ベクターに利用可能な任意の細胞であってもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を例えば含む哺乳動物の細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの低等真核宿主細胞、細菌細胞、大腸菌などの原核細胞であってもよい。宿主細胞に組換え核酸構築物を導入するためのトランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－グルカン、リポフェクション、ファージ感染などが挙げられる。抗体遺伝子をコードする発現ベクターを公知の方法によって宿主細胞に導入することができ、結合分子を宿主細胞に発現させるように当該宿主細胞を十分な程度に培養することで、抗体を作製することができる。

【0067】

前記ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクターであってもよい。前記プラスミドは、ｐＣＤＮＡ３．４およびｐＣＤＮＡ３．４－Ｌまたは他のものであってもよい。

【0068】

定向進化および点変異などの公知の方法を用い、本発明に係る抗４－１ＢＢ抗体（または一本鎖抗体または融合抗体）のヌクレオチド配列を突然変異させることは、当業者であれば容易にできる。これらの人工的に修飾された、本発明に係る抗４－１ＢＢ抗体（または一本鎖抗体または融合抗体）のヌクレオチド配列と９９％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上または７５％以上の同一性を有するヌクレオチドは、前記抗４－１ＢＢ抗体をコードし且つ前記抗４－１ＢＢ抗体の活性を有する限り、すべて、本発明のヌクレオチド配列に由来し且つ本発明の配列と同等のヌクレオチドに相当する。

【0069】

本発明の具体的な実施形態において、配列番号３で示されるＤＮＡフラグメント（抗体の重鎖をコードする遺伝子）をｐｃＤＮＡ３．４ベクターの制限酵素切断サイトＸｂａＩと制限酵素切断サイトＨａｎｄＩＩＩとの間にクローニングして、前記抗体の重鎖を発現する組換え発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４－Ｈと命名する）が得られ、配列番号４で示されるＤＮＡフラグメント（抗体の軽鎖をコードする遺伝子）をｐｃＤＮＡ３．４ベクターの制限酵素切断サイトＸｂａＩと制限酵素切断サイトＨａｎｄＩＩＩとの間にクローニングして、前記抗体の軽鎖を発現する組換え発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４－Ｌと命名する）が得られた。タンパク質の発現をより容易にするために、前記組換え発現ベクターを構築する場合は、配列番号３及び配列番号４で示されるＤＮＡフラグメント（抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子）の上流に、コザック（ｋｏｚａｋ）の共認識配列（５’－ＧＣＣＡＣＣ－３’）、及び、配列番号３及び配列番号４の５’末端と連結される、シグナルペプチドのコード配列（５’－ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣ ＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣ－３’）（配列番号：２９）も導入した。前記組換え細胞は、前記抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ発現する２つの前記組換え発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４－Ｈ及びｐｃＤＮＡ３．４－Ｌ）をＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトして得た組換え細胞である。つまり、前記組換え細胞は、前記抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を発現することができる。

【0070】

第７の態様において、本発明は、ＡＤＣ抗体を特許請求している。

【0071】

本発明が特許請求している前記ＡＤＣ抗体は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント、前記抗体融合タンパク質（例えば、タグタンパク質を有する一本鎖抗体）、または前記二重抗体と、生物活性を有する小分子薬物と、のカップリングにより形成される。

【0072】

第８の態様において、本発明は、医薬組成物を特許請求している。

【0073】

本発明に係る医薬組成物は、（Ａ１）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、または前記ＡＤＣ抗体と、（Ａ２）薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と、を含む。

【0074】

第９の態様において、本発明は、前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクター若しくは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物の、以下の（Ｂ１）～（Ｂ１４）のいずれか一項に記載の使用を特許請求している。

【0075】

（Ｂ１）４－１ＢＢの検出用製品の調製、または４－１ＢＢの検出
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液または組織中の４－１ＢＢを検出するために用いられており、
ここで、前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢであってもよく、サル４－１ＢＢであってもよい；
（Ｂ２）４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断するための製品の調製、または４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路の遮断；
（Ｂ３）Ｔ細胞活性化を刺激するための製品の調製、またはＴ細胞活性化の刺激；
（Ｂ４）Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進するための製品の調製、又はＴ細胞によるＩＦＮ－γの分泌の促進；
（Ｂ５）結腸癌細胞の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌細胞の増殖の抑制；
（Ｂ６）結腸癌腫瘍の増殖を抑制するための製品の調製、または結腸癌腫瘍の増殖の抑制；
（Ｂ７）結腸癌の治療および／または予防のための製品の調製、または、結腸癌の治療および／または予防；
（Ｂ８）免疫増強剤として、または免疫増強剤の調製；
（Ｂ９）免疫調整剤として、または免疫調整剤の調製；
（Ｂ１０）４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療及び／又は予防及び／又は診断するための製品の調製、又は、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患の治療及び／又は予防及び／又は診断；
（Ｂ１１）癌を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、癌の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記癌は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す癌であってもよい；
（Ｂ１２）自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、自己免疫疾患の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記自己免疫疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す自己免疫疾患であってもよい；
（Ｂ１３）炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、炎症性疾患の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記炎症性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す炎症性疾患であってもよい；
（Ｂ１４）感染性疾患を治療および／または予防および／または診断するための製品の調製、または、感染性疾患の治療および／または予防および／または診断、
さらに、前記感染性疾患は４－１ＢＢ発現の調節不全を示す感染性疾患であってもよい。

【0076】

第１０の態様において、本発明は、以下の方法（Ｃ１）～方法（Ｃ１４）のいずれか一つを特許請求している。

【0077】

（Ｃ１）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞を用い、測定サンプルについて検出を行う工程を含む、４－１ＢＢを検出する方法、
実際の使用において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、診断ツールとして、癌、自己免疫疾患、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の４－１ＢＢを検出するために用いられており、
ここで、前記４－１ＢＢは、ヒト４－１ＢＢであってもよく、サル４－１ＢＢであってもよい；
（Ｃ２）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する工程を含む、４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路を遮断する方法；
（Ｃ３）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、Ｔ細胞活性化を刺激する工程を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する方法；
（Ｃ４）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する工程を含む、Ｔ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進する方法；
（Ｃ５）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌細胞の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌細胞の増殖を抑制する方法；
（Ｃ６）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する工程を含む、結腸癌腫瘍の増殖を抑制する方法；
（Ｃ７）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、結腸癌を治療および／または予防する工程を含む、結腸癌を治療および／または予防する方法；
（Ｃ８）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫増強剤を調製する工程を含む、免疫増強剤を調製する方法；
（Ｃ９）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、免疫調整剤を調製する工程を含む、免疫調整剤を調製する方法；
（Ｃ１０）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、４－１ＢＢ発現の調節不全の特徴を示す疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１１）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、癌を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、癌を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１２）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、自己免疫疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１３）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、炎症性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法；
（Ｃ１４）前記抗体、前記抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体）、前記抗体融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体とＦｃとの融合）、前記二重抗体、前記核酸分子、前記発現カセット、組換えベクターまたは組換え細胞、前記ＡＤＣ抗体、または前記医薬組成物を用い、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する工程を含む、感染性疾患を治療および／または予防および／または診断する方法。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】ハイブリドーマ抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す図である。

【図2】抗体の構造を示す図である。

【図3】ハイブリドーマによって分泌される抗体がヒト４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図4】ハイブリドーマによって分泌される抗体がサル４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図5】抗原結合フラグメントがヒト４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図6】抗原結合フラグメントがサル４－１ＢＢを認識することを示す図である。

【図7】ＦＡＣＳによる、各抗原結合フラグメントのヒト４－１ＢＢに対する親和性の比較を示す図である。

【図8】Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とＨＫＢ６との親和性の比較を示す図である。

【図9】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４が４－１ＢＢＬと４－１ＢＢとの結合をブロックすることを示す図である。

【図10】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とコントロール抗体とのエピトープ競合を示す図である。

【図11】ＦＡＣＳにより測定された、それぞれの変異点において突然変異させた抗原に対する抗体の親和性を示す図である。

【図12】Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とＨＫＢ６とのエピトープ競合を示す図である。

【図13】ルシフェラーゼ活性測定を示す図である。Ａは「３．５ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定」の結果である。Ｂは「３．９安定性（１）加速安定性」の検出結果である。

【図14】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４による、ＣＤ４^＋Ｔ細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの３本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度（２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ）の条件でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化の効果を示す。

【図15】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４による、ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化効果の測定を示す図である。図中、各グループの３本の棒グラフは、左から右へ順に、それぞれ高、中、低抗体濃度（３μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ）の条件でのＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化の効果を示す。

【図16】抗体がＭＣ３８腫瘍を阻害するモデルである。各線は、それぞれ１匹のマウスの腫瘍増殖曲線を表す。

【図17】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のチャレンジ試験の図である。

【図18】抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の毒性試験の図である。

【図19】Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のＴｍ測定を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0079】

以下の実施例は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特記しない限り、いずれも常法である。以下の実施例に使用された試験材料は、特記しない限り、いずれも従来の生化学試薬販売元から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、いずれも実験を３回繰り返すようにし、それらの結果の平均値を取った。

【0080】

以下の実施例において、陽性対照抗体は、Ｐｆｉｚｅｒ社のＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ（ＰＦ－０５０８２５６６、特許番号：ＵＳ８３３７８５０ Ｂ２）およびＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社のＵｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３、特許番号：ＵＳ７２８８６３８ Ｂ２）であり、この二つの抗体は、いずれも抗ヒト４－１ＢＢ抗体である。陰性対照抗体は、ヒトＩｇＧ（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｃｈｉｎａの製品）である。

【0081】

以下の実施例において、特に断らない限り、配列表中の各ヌクレオチド配列のいずれにおいても、その１番目の位置（第１位）が当該ＤＮＡの５’末端のヌクレオチドであり、末位が当該ＤＮＡの３’末端のヌクレオチドである。

【0082】

以下の実施例のｐＣＤＮＡ３．４ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ：Ａ１４６９７である。

【0083】

慣用の装置および試薬は、以下の通りである。
１．９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社）
２．プレートコーティングバッファー：ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液。
３．洗浄液：０．０５体積％のＴｗｅｅｎ２０のみを含有するｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液
４．ブロッキング溶液：１０ｇ／ＬのＢＳＡのみを含有する洗浄液
５．ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたアビジン
６．発色基質：テトラメチルベンジジン
７．停止液：１Ｍ硫酸

【0084】

ここで、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液の溶媒は水であり、溶質は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記塩化ナトリウムの濃度は１３５ｍＭであり、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記塩化カリウムの濃度は２．７ｍＭであり、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記リン酸二水素カリウムの濃度は１．５ｍＭであり、前記ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝液における前記リン酸水素二ナトリウムの濃度は８ｍＭである。

【0085】

実施例１：ハイブリドーマ抗体の作製

【0086】

１．１ マウスの免疫化
４～６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス３匹とＣ５７ｂ１／６マウス３匹を選択し、ヒト４－１ＢＢ細胞外セグメント（配列番号５の２４～１８６番目）を抗原とし、マウスを２週間毎に１回、合計３回免疫した。３回目の免疫後、尾静脈から採血し、抗体の発生を間接ＥＬＩＳＡで測定した。好適な免疫マウスを選択し、眼球摘出後、頸椎脱臼により犠牲にした。マウスの脾細胞を無菌環境下で採取し、常法に従い細胞融合を行い、抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を作製した。

【0087】

１．２ ハイブリドーマのスクリーニング
抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌのヒト４－１ＢＢ（配列番号５）で被覆し、４℃で一晩ブロックした。試験細胞培養上清を順番に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。４０００倍で希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）基質で発色させた後、ＯＤ値を４５０ｎｍの波長で測定した。

【0088】

陽性細胞クローンをＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングし、すべてのハイブリドーマ細胞培養上清が１００％陽性として検出されるまで、サブクローンを繰り返した。ハイブリドーマ細胞のクローニングには限界希釈法を用いた。培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートし、約５日後、細胞クローンが顕微鏡で観察された。適切な時期に液体を交換して検出を行い、陽性で且つよく増殖しているモノクローナル細胞株を採取した。その拡大培養を行うことで、抗ヒト４－１ＢＢモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株を得て、これをタイムリーに凍結した。

【0089】

１．３ ハイブリドーマ抗体の同定
スクリーニングして得た、陽性で且つよく増殖している抗ヒト４－１ＢＢ抗体ハイブリドーマ細胞株を、段階的に拡大培養し、遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分間）して上清を採取した。得た上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ社）をＰＢＳで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体Ａ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０である）を使用して、５つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体Ｂ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５である）を使用して、５つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した。その後、３０ＫＤａ濃縮遠心管を使用して濃縮することで、抗体を得た。

【0090】

免疫化によって得られた１５個のハイブリドーマ抗体細胞株を、スクリーニングすることで、最終的に６つの候補ハイブリドーマ親細胞株を得た。サブタイプ同定および予備スクリーニングを経た後の細胞株の詳細および対応する抗体は表１に示す。

【0091】

【0092】

１３Ｆ８Ｈ８及び３７Ｇ１１Ｅ２Ｂ３の２つの候補を除去し、細胞上清を収集し、それぞれ精製、濃縮を行った後、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。電気泳動の測定結果は図１に示す。

【0093】

得られた抗ヒト４－１ＢＢ抗体について配列決定を行った結果、得られた抗ヒト４－１ＢＢ抗体は、１５０Ｋｂの分子量を有し、重鎖と軽鎖を含み、典型的なインタクト抗体であることが示された。抗体の構造は図２に示す。

【0094】

１．４ ハイブリドーマが分泌する抗体による、ヒト４－１ＢＢの認識
４種のハイブリドーマが分泌する抗体がヒト４－１ＢＢを認識する親和性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルプレート（９６ウェルマイクロプレート、Ｎｕｎｃ社）をヒト４－１ＢＢ（配列番号５）で被覆し、濃度１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルの条件で、４℃で一晩放置した。プレートを３回洗浄し、３００μｌブロッキング溶液（配合は上記の通りである）をウェル毎に加え、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄液（配合は上記の通りである）で３回洗浄し、抗体を試料希釈液（１％ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＳ－Ｔ）で４０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、７本のＥｐチューブで４倍希釈し、勾配溶液とした。濃度ごとに、２つの複製ウェルを設け、１００μｌ／ウェルの条件で、１時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、８０００倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを各ウェルに加え、０．５時間振とうした。プレートを３回洗浄し、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを各ウェルに加えた。遮光下で発色させ、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。ＯＤ値をＢＩＯ－ＴＥＫＥＬＸ－８００マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。

【0095】

上記の手順によりハイブリドーマから分泌された抗体は、いずれもヒト４－１ＢＢを認識し、且つヒト４－１ＢＢに結合することができた。ＥＬＩＳＡ結果であるＯＤ４５０値を表２に示し、分析グラフを図３に示す。

【0096】

【0097】

１．５ ハイブリドーマが分泌する抗体による、サル４－１ＢＢの認識
ハイブリドーマが分泌する抗体がサル４－１ＢＢを認識する親和性を、ＥＬＩＳＡ方法により評価した。具体的に、サル４－１ＢＢ（Ｃｙ４－１ＢＢ）（配列番号６）抗原をプレートコーティングバッファー（配合は上記の通りである）で１μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに１００μｌを加えてプレートコーティングし、４℃で一晩放置した。ハイブリドーマから分泌された抗体、及び陽性対照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂを試料希釈液で１０００ｎｇ／ｍｌに希釈し、７本のＥｐチューブを用いて１０倍希釈し勾配溶液とした。濃度ごとに、２つの複製ウェルを設け、１００μｌ／ウェルでプレートに添加し、１時間振とうした。プレートを再度洗浄した後、８０００倍希釈された、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを各ウェルに加え、０．５時間振とうした。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）１００μｌを添加し、発色させた。

【0098】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、ハイブリドーマから分泌された抗体はいずれもＣｙ４－１ＢＢ分子を認識することができた。ＥＬＩＳＡ結果であるＯＤ４５０値を表３に示し、分析グラフを図４に示す。

【0099】

【0100】

実施例２ 抗体のヒト化およびｓｃＦｖ－Ｆｃ抗原結合フラグメントの特性同定

【0101】

本発明により得られた分泌型抗体３７Ｇ１０Ｆ４をスクリーニングして選択した。抗体遺伝子配列を分析した後、抗体Ｆａｂのホモロジーモデリングと最適化した。ヒト化突然変異部位を決定するための表面スキャニング、仮想突然変異及び分子動力学シミュレーション、重要なアミノ酸の同定等の一連の分析により、合理的なヒト化抗体を設計した。ヒト化によって、本実施例に係るさらなる同定に供する１２個の、ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ４）形態の抗原結合フラグメント候補（表４）を得た。

【0102】

表４の１２個のｓｃＦｖ－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ４）形態の抗原結合フラグメント候補は、その重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）における相補性決定領域（ＣＤＲ）がいずれも同一であり、Ｆｃ領域も同一であるが、ＶＨ及びＶＬにおけるフレームワーク領域（ＦＲ）にアミノ酸突然変異を有することのみが相違点である。重鎖可変領域中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示され、軽鎖可変領域中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、順番に、配列番号１６のＮ末端からの１５６～１６６番目、１８２～１８８番目、２２１～２２９番目で示される。

【0103】

ここで、ｓｃＦｖＢ６０１０３のアミノ酸配列は、配列番号１６で示され、１～１１７番目が重鎖可変領域であり、１３３～２３９番目が軽鎖可変領域であり、２４０～４７２番目がＦｃである。

【0104】

遺伝子レベルに対応して、ｓｃＦｖＢ６０１０３をコードする遺伝子配列は、配列番号１７で示され、１～３５１番目は、重鎖可変領域をコードする遺伝子（９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目は３つのＨＣＤＲをそれぞれコードする）であり、３９７～７１７番目は、軽鎖可変領域をコードする遺伝子（４６６～４９８番目、５４４～５６４番目、６６１～６８７番目は３つのＬＣＤＲをそれぞれコードする）であり、７１８～１４１６番目はＦｃをコードする遺伝子である。

【0105】

表４の１２個のｓｃＦｖ－Ｆｃ分子候補を発現させて精製した。ＳｃＦｖＢ６０１０３を例として説明する。ｓｃＦｖＢ６０１０３抗体をコードする遺伝子（配列番号１７）を、人工的に合成し、次いで、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入し、一過性トランスフェクションにより発現させた。一過性トランスフェクション操作は、具体的に、Ｅｘｐｉ２９３発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬、ＤＮＡプラスミドを、それぞれＯｐｔｉＭＥＭの中に添加して、溶液Ａおよび溶液Ｂを得た後、溶液Ａおよび溶液Ｂを均一に混合して、溶液Ｃを得た。溶液Ｃを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加し、そしてＥｘｐｉ２９３細胞を５日間培養した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍで１０分間）を行い、上清を採取して、得られた上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティクロマトグラフィーカラムにより精製した。詳細な操作としては、まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ社）をＰＢＳで平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体Ａ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０である）を使用して、５つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体Ｂ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５である）を使用して、５つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、３０ＫＤａ濃縮遠心管を使用して濃縮することで、ｓｃＦｖＢ６０１０３目的分子を得た。

【0106】

（１）ＥＬＩＳＡ同定
ＥＬＩＳＡにより、ヒト４－１ＢＢ分子及びサル４－１ＢＢ分子に対するｓｃＦｖ分子の親和性を同定した（具体的な方法については、実施例１に記載の当該手順のとおり）。具体的に表４に示すように、１２種のｓｃＦｖ－Ｆｃ分子は、いずれもヒト４－１ＢＢ及びサル４－１ＢＢの両方を認識できたという結果が示された。ただし、ｓｃＦｖＢ６０１０３の認識能力が最も良かった。ＥＬＩＳＡの結果は図５及び図６に示す。

【0107】

【0108】

（２）ＦＡＣＳ測定

【0109】

使用された試薬は次のとおりである：
ＰＢＳへＢＳＡとアジ化ナトリウムを添加して得たＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡの質量％濃度が２％であり、アジ化ナトリウムの質量％濃度が０．０２％である）、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、遮光保存）。

【0110】

ＥＬＩＳＡ測定結果においてヒト４－１ＢＢへの結合活性が高かったｓｃＦｖ分子と、ヒト４－１ＢＢ分子との親和性についての差異を、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用してＦＡＣＳ法により測定した。実験に使用された細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、細胞膜表面において高度にヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）及び４－１ＢＢ発現無しの野生型ＣＨＯ－Ｋ１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0111】

ヒト４－１ＢＢ遺伝子配列（配列番号７）を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入した。Ｇ４１８（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）を最終的に得て、予備とした。

【0112】

試験細胞をＴ７５フラスコ中で８０％の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を収集した（１フラスコあたり１０^６個程度の細胞）。約１ｍｌの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が１×１０^７個／ｍｌである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各試験抗体（表５ご参照）の希釈液２５μｌを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表５に示したとおりである。また、抗体濃度０μｇ／ｍｌの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で３０分間インキュベートした。再び、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を陽性対照とした。

【0113】

上記の手順により、それぞれのｓｃＦｖ分子の、ヒト４－１ＢＢに対する結合活性の高さを比較した。その結果、表５および図７に示されたように、ｓｃＦｖＢ６０１０３のＥＣ５０値が最も低かったこと、すなわち、ヒト４－１ＢＢに対する親和性が最も高かったｓｃＦｖＢ６０１０３は最適な分子となり得ることが示された。

【0114】

【0115】

実施例３ ＩｇＧヒト化抗体
この実施例で同定された例示的な抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、ハイブリドーマ分泌型抗体３７Ｇ１０Ｆ４をヒト化して得たもの、すなわち、表４のｓｃＦｖＢ６０１０３から変換されたものである。この実施例では、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の発現及び精製、その後の、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の検出、Ｔ細胞活性化システムにおける同定について、詳細に説明する。

【0116】

３．１ 抗体の発現および精製
全長遺伝子配列を、配列決定された遺伝子配列に基づいて合成した。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の重鎖をコードする遺伝子は配列番号３で示され、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の軽鎖をコードする遺伝子は配列番号４で示される。

【0117】

配列番号３の１～３５１番目は重鎖可変領域ＶＨのコード遺伝子である。ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のコード配列は、それぞれ配列番号３の９１～１０５番目、１４８～１９２番目、２９２～３１８番目に示されている。

【0118】

配列番号４の１～３２１番目は、軽鎖可変領域ＶＬのコード遺伝子である。ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のコード配列は、それぞれ、配列番号４の７０～１０２番目、１４８～１６８番目、２６５～２９１番目で示される。

【0119】

配列番号３の５’末端および配列番号４の５’末端のそれぞれに、ＸｂａＩの認識配列（５’－ＴＣＴＡＧＡ－３’）、ｋｏｚａｋ共認識配列（５’－ＧＣＣＡＣＣ－３’）、およびシグナルペプチドのコード配列（５’－ＡＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣ－３’）（配列番号：２９）を順番に付加し、続いてシグナルペプチドのコード配列と、配列番号３の５’末端および配列番号４の５’末端とを連結した。その後、配列番号３の３’末端および配列番号４の３’末端のそれぞれに、ターミネーター（ＴＧＡ）およびＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を順番に付加し、ＴＧＡと、配列番号３の３’末端および配列番号４の３’末端とを連結した。得られた新規ＤＮＡ配列をそれぞれ、重鎖遺伝子Ａおよび軽鎖遺伝子Ａと表記する。人工的に合成した重鎖遺伝子ＡをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断した後、それを、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをｐＣＤＮＡ３．４－Ｈと命名した。軽鎖遺伝子ＡをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断した後、それを、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断して得たベクター骨格に連結し、組換えベクターを得た。その配列決定において正しいと検証された組換えベクターをｐＣＤＮＡ３．４－Ｌと命名した。

【0120】

ｐＣＤＮＡ３．４－Ｈ及びｐＣＤＮＡ３．４－Ｌをヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｆ（ＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）に導入して組換え細胞が得た後、組換え細胞を３７℃、５％ＣＯ_２の条件の振盪式インキュベーターに置いて１２０ｒｐｍで培養した。

【0121】

ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにより、培養上清から抗体タンパク質を精製した。詳細な操作としては、まず、ＰＢＳでＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ社）を平衡化し、次に、培養上清はカラムを通過させた。液体Ａ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０である）を使用して、５つのカラムの容積分の予溶出を行った後、液体Ｂ（配合：溶媒は水であり、溶質及び濃度は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３．５である）を使用して、５つのカラムの容積分の溶出を行い、溶出ピーク分を収集した後、３０ＫＤａ濃縮遠心管を使用して濃縮することで、前記抗体、すなわち抗ヒト４－１ＢＢ抗体を得た。

【0122】

抗ヒト４－１ＢＢ抗体を配列決定した結果、得られた抗ヒト４－１ＢＢ抗体は完全抗体であることが示された。すなわち、当該抗体はＨａｎｋｅ１０Ｆ４であった。この抗体は、アミノ酸配列が配列番号１で示される重鎖と、アミノ酸配列が配列番号２で示される軽鎖とからなっていた。また、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の重鎖タイプはＩｇＧ４であり、軽鎖タイプはκ鎖であった。

【0123】

配列番号１の１～１１７番目は重鎖可変領域ＶＨである。ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号１の３１～３５番目、５０～６４番目、９８～１０６番目で示される。

【0124】

配列番号２の１～１０７番目の軽鎖可変領域ＶＬにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ、配列番号２の２４～３４番目、５０～５６番目、８９～９７番目で示される。

【0125】

３．２ ヒト４－１ＢＢまたはサル４－１ＢＢに対する親和性の同定

【0126】

（１）ＥＬＩＳＡ測定
測定方法は、実施例１の手順１．４と同様にして、９６ウェルプレートをそれぞれヒト４－１ＢＢ又はサル４－１ＢＢで直接に被覆した。なお、抗体サンプル（Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ）を一次抗体とし、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウスを二次抗体とした。また、テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＴＭＢ）を発色剤とし、硫酸で発色を停止させた。ＢＩＯ－ＴＥＫＥＬＸ－８００マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。

【0127】

表６は、ＩｇＧ４形態の抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の、ＥＬＩＳＡによる結果を示しており、ヒト４－１ＢＢおよびサル４－１ＢＢの両方を認識できたことを示している。

【0128】

【0129】

（２）ＦＡＣＳ測定

【0130】

使用された試薬は次のとおりである：
ＰＢＳへＢＳＡとアジ化ナトリウムを添加して得たＦＡＣＳバッファー（ＢＳＡの質量％濃度が２％であり、アジ化ナトリウムの質量％濃度が０．０２％である）、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、遮光保存）。

【0131】

実験に使用された細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、細胞膜表面に高度においてヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）及び細胞膜表面において高度にサル４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙ４－１ＢＢ）、並びに４－１ＢＢ発現無しの野生型ＣＨＯ－Ｋ１（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0132】

ヒト４－１ＢＢ遺伝子配列（配列番号７）及びサル４－１ＢＢ遺伝子配列（配列番号８）を人工的に合成し、次いで、当該分野での慣用的方法に従ってそれぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入した後、それぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入した。その後、Ｇ４１８（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加して加圧スクリーニングを行い、細胞膜表面において高度にヒト４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢ）、及び細胞膜表面において高度にサル４－１ＢＢを発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙ４－１ＢＢ）を最終的に得た。

【0133】

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合活性を測定した。Ｔ７５フラスコを使用して試験細胞を８０％の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を収集した（１フラスコあたり１０^６個程度の細胞）。約１ｍｌの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が１×１０^７個／ｍｌである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、各Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の希釈液２５μｌを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表７に示したとおりである。また、抗体濃度０μｇ／ｍｌの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で３０分間インキュベートした。再び、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を陽性対照とした。

【0134】

上記の手順に従って、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙ４－１ＢＢを使用してＨａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とサル４－１ＢＢとの結合活性を測定した。

【0135】

上記の手順に基づく実験から、表７のとおり、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体はヒト４－１ＢＢ分子およびサル４－１ＢＢ分子の両方と高い結合活性を有することが証明された。

【0136】

【0137】

（３）ＦＡＣＳによる、抗体親和性の比較

【0138】

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、ＨＫＢ６モノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢとの結合活性を測定して比較した。Ｔ７５フラスコを使用して試験細胞を８０％の満杯度になるまで培養し、トリプシンで消化し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を収集した（１フラスコあたり１０^６個程度の細胞）。約１ｍｌの緩衝液で再懸濁して洗浄し、遠心分離し、且つ再懸濁し、細胞濃度が１×１０^７個／ｍｌである細胞懸濁液を得た。希釈勾配ごとに、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の希釈液２５μｌ又はＨＫＢ６抗体の希釈液２５μｌを準備し、それぞれの濃度の抗体を加えた各遠心分離管に、25μlの細胞懸濁液を加えて混合した。最終の抗体濃度は表７に示したとおりである。また、抗体濃度０μｇ／ｍｌの抗体希釈液を添加した遠心分離管を、ブランク対照とした。３０分間インキュベートした後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ二次抗体を添加し、ブローイングして再懸濁させ、遮光下で３０分間インキュベートした。再び、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で氷の上に置き、測定装置に供した。

【0139】

ここで、ＨＫＢ６は中国特許出願２０１８１１５４１５４５．８に記載のＨＫＢ６抗体である。

【0140】

上記の手順で測定した結果、表８及び図８に示すように、ヒト４－１ＢＢに対するＨａｎｋｅ１０Ｆ４の親和性は、ＨＫＢ６の親和性よりも大幅に高かった。

【0141】

【0142】

（４）抗体親和性の測定
ｈ４－１ＢＢ－Ｈｉｓ（Ａｃｒｏ社、製品番号：Ｑ０７０１１－１）抗原を使用し、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｏｃｔｅｃ装置によりバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を用いてＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、又はＵｒｅｌｕｍａｂの親和性を測定した。

【0143】

結果、表９に示すようにＨａｎｋｅ１０Ｆ４は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ親和性に匹敵する高い抗体親和性を有している。

【0144】

注：ｋａは、単位時間あたりの結合生成物の生成速度を表す。ｋｄは、単位時間あたりに結合生成物の反応物へ分解されたパーセンテージを表す。ＫＤ値は、親和性の強さを表す。

【0145】

３．３ リガンド競合
Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体とヒト４－１ＢＢＬとの間の競合結合活性の比較に、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを使用した。二次抗体は、ＳＡ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）であり、その他の操作（下記は除く）及び希釈液は、手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定と同じである。ヒト４－１ＢＢＬアミノ酸配列は、配列番号９で示される。

【0146】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、Ｂｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４としてビオチンで標識した。標識方法は、当該技術分野で常規のタンパク質標識方法と同じ方法を採用した。Ｂｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を、試料希釈液を用いて希釈し、１．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、ヒト４－１ＢＢＬ－ｈＩｇＧ（またはＨａｎｋｅ１０Ｆ４）の希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表９のとおりである）。溶液Ａ及び溶液Ｂを、等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0147】

逆競争を測定するために同じ操作を実行した。ヒト４－１ＢＢＬをビオチンで標識してＢｉｏ－４－１ＢＢＬとし、且つ試料希釈液を用いて希釈し、２μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４（又はヒト４－１ＢＢＬ－ｈＩｇＧ）希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表８のとおりである）。溶液Ａ及び溶液Ｂを、等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0148】

以上の手順に基づく実験から、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とヒト４－１ＢＢＬの結合部位とが競合関係にあることが証明された。具体的な結果は表１０及び図９に示す。つまり、このモノクローナル抗体は、薬物の用量に応じて、ヒト４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬシグナル伝達経路をある程度遮断することができる。

【0149】

【0150】

３．４ エピトープ競合

【0151】

３．４．１ Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４と陽性対照抗体との間の抗原結合エピトープ競合
Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体と対照抗体であるＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂとの間のエピトープ競合関係の比較に、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを用いた。二次抗体はＳＡ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）であり、その他の操作（下記は除く）及び希釈液は、手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定と同じである。

【0152】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４をビオチンで標識してＢｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、１．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表１０のとおりである）。溶液Ａと溶液Ｂとを等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0153】

以上の手順に基づく実験を繰り返した。結果から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂおよびＵｒｅｌｕｍａｂの抗原結合部位とは一定の競合関係にあった。また、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂとの競合は、Ｕｒｅｌｕｍａｂとの競合よりも強かった。具体的な結果は表１１及び図１０に示す。

【0154】

【0155】

３．４．２ Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４及び対照抗体の抗原結合エピトープ分析

【0156】

（１）方法1
ヒト４－１ＢＢ抗原の細胞外ドメインを、段階的にマウス４－１ＢＢの対応する細胞外ドメインに置き換え、それぞれの目的遺伝子を合成した。それぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入して、それぞれの４－１ＢＢ抗原のＤＮＡプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの４－１ＢＢ抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た。具体的には表１２のとおりである。ＦＡＣＳを用いて、抗体と、それぞれの４－１ＢＢ抗原との結合活性を分析し、抗体がヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインに結合する具体的なエピトープを更に分析した。

【0157】

一過性トランスフェクションの操作は、具体的には、Ｅｘｐｉ２９３発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の製品を使用し、製品の取扱説明書の手順に従って操作した。Ｅｘｐｉ Ｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬、ＤＮＡプラスミドを、それぞれＯｐｔｉＭＥＭの中に添加して、溶液Ａおよび溶液Ｂを得た後、溶液Ａおよび溶液Ｂを均一に混合して、溶液Ｃを得た。溶液Ｃを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加し、一晩インキュベートして、細胞表面において４－１ＢＢ抗原を高度に発現させる細胞株を得た。

【0158】

ここで、ヒト４－１ＢＢ抗原の全長アミノ酸配列は配列番号５で示され（対応するコード遺伝子は配列番号７で示される）、細胞外ドメインは２４～１８６番目（対応するコード遺伝子は配列番号７の７０～５５８番目で示される）である。マウス４－１ＢＢ抗原の全長アミノ酸配列は配列番号１０で示され（対応するコード遺伝子は配列番号１１で示される）、細胞外ドメインは２４～１８７番目（対応するコード遺伝子は配列番号１１の７０～５６１番目で示される）である。

【0159】

手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に、抗体サンプル（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、又はＵｒｅｌｕｍａｂ）を一次抗体として順番に添加し、細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供した。

【0160】

特許及び文献報告の分析によると、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂは主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン３及びドメイン４に結合し、Ｕｒｅｌｕｍａｂは主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン１に結合する。上記の操作により、Ｕｒｅｌｕｍａｂの蛍光強度の傾向は細胞Ａ及び細胞Ｆの２つの群について低下し、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂの場合は細胞Ｂ、細胞Ｃ及び細胞Ｄの３つの群について低下することが分かった。これは、研究報告と一致している。一方、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の蛍光強度の傾向は細胞Ａと細胞Ｆの２群について低下し、且つ細胞Ａの群について大幅に低下し、低下程度はＵｒｅｌｕｍａｂの場合の低下程度よりもはるかに低かった。また、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の蛍光強度は細胞Ｂの群について低下せず、増加していた。したがって、ドメイン１と２ＡはＨａｎｋｅ１０Ｆ４とヒト４－１ＢＢとの親和性に対して非常に重要である一方で、ドメイン２Ｂ、３Ａ、３Ｂによる影響は少ないことが示された。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は主にヒト４－１ＢＢの細胞外ドメインのドメイン１およびドメイン２Ａの領域に結合し、対照抗体Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ及びＵｒｅｌｕｍａｂの抗原結合エピトープの場合とはいずれも異なっていた（表１２）。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４と陽性対照抗体とは、ある程度の競合関係を有し、この競合関係は抗原抗体の空間エピトープによるものと考えられる。

【0161】

【0162】

注：細胞Ａにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン１，２Ａ，２Ｂ（ａａ２４－８６）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における２４～８６番目のアミノ酸を、配列番号１０で示されるマウス４－１ＢＢ抗原の全長における２４～８６番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｂにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン２Ｂ，３Ａ，３Ｂ（ａａ６４－１１８）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における６４～１１８番目のアミノ酸を、配列番号１０の６４～１１８番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｃにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン３Ａ，３Ｂ，４Ａ（ａａ８７－１３３）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における８７～１３３番目のアミノ酸を、配列番号１０の８７～１３３番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｄにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン３Ｂ，４Ａ，４Ｂ（ａａ９７－１５９）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における９７～１５９番目のアミノ酸を、配列番号１０の９７～１５９番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｅにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン４Ａ，４Ｂ，ＮＦ（ａａ１１９－１８６）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における１１９～１８６番目のアミノ酸を、配列番号１０の１１９～１８６番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。細胞Ｆにおける抗原の具体的構造「ヒト４－１ＢＢ＋マウス４－１ＢＢドメイン１，４Ｂ，ＮＦ（ａａ２４－４６，ａａ１３９－１８６）」は、配列番号５で示されるヒト４－１ＢＢ抗原の全長における２４～４６および１３９～１８６番目のアミノ酸を、配列番号１０の２４～４６および１３９～１８６番目のアミノ酸に置き換えたものを指す。

【0163】

（２）方法２
文献の分析によると、ヒト４－１ＢＢ抗原における１０１番目、１３２番目のアミノ酸はＵｔｏｍｉｌｕｌａｂにおける重要な結合部位であり、４２番目はＵｒｅｌｕｍａｂにおける重要な結合部位である。上記部位のアミノ酸を一つずつ突然変異させ、それぞれの目的遺伝子を合成した。これにより、それぞれの４－１ＢＢ抗原を有するＤＮＡプラスミドを得た。一過性トランスフェクションにより、それぞれの４－１ＢＢ抗原を細胞表面において発現させる細胞株を得た（（１）方法１の欄に記載の関連手順に従って得た）。具体的には表１３に示す。

【0164】

【0165】

手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定の手順に従い、一過性トランスフェクションにより得られた細胞株に抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を添加して細胞とともにインキュベートした。その後、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣを二次抗体として添加し、インキュベートした。再び、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加して再懸濁させ、遮光下で測定装置に供し、抗体と、それぞれの４－１ＢＢ抗原との結合活性を分析した。結果を図１１に示す。ＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとＵｒｅｌｕｍａｂは、いずれも、重要なアミノ酸が変異した後の抗原に結合しなかった。一方、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、上記の全ての抗原と結合する能力には顕著な相違がなく、顕著な低下現象もなかった。即ち、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４における、抗原に結合する重要なアミノ酸は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂ抗体の場合とは一致していなく、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４が、特異的かつユニークな抗原結合部位を有することが、示されている。

【0166】

３．４．３ 抗原に結合するＨａｎｋｅ１０Ｆ４およびＨＫＢ６のエピトープ競合
Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体とＨＫＢ６との間の、抗原に結合するエピトープ競合関係を、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢを用いて比較した。二次抗体はＳＡ－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）であり、他の手順（下記は除く）及び希釈液は、手順３．２に記載のＦＡＣＳ測定と同じである。

【0167】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４をビオチンで標識してＢｉｏ－Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とした。これを、試料希釈液を用いて希釈し、１．５μｇ／ｍｌの濃度の溶液Ａとした。同時に、ＨＫＢ６、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体希釈液Ｂを調製した。また、溶液Ａの濃度を一定にし、溶液Ｂの濃度を溶液Ａの濃度の所定倍数とした（具体的な倍数は、表１４のとおりである）。溶液Ａと溶液Ｂとを等比率で均一に混合し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕ４－１ＢＢと共にインキュベートした。

【0168】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体とＨＫＢ６とは、競合関係がなく、すなわち、この２つの抗体の抗原結合エピトープが異なっていた。具体的な結果を表１４および図１２に示す。

【0169】

【0170】

３．５ ルシフェラーゼのレポーター遺伝子の活性測定
ＨＥＫ－２９３／ＮＦκＢ－Ｌｕｃｉ／４１－ＢＢ細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、ヒト４－１ＢＢ膜タンパク質及びＮＦκＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子を安定に発現させるＨＥＫ２９３細胞株である。具体的には以下のように操作した。ヒト４－１ＢＢ配列（配列番号７）を目的遺伝子としてｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入してプラスミドＡを得た。同時にＮＦκＢエレメント配列（配列番号１２）とルシフェラーゼ遺伝子（配列番号１３）を目的遺伝子とし、該分野の一般的手法により、ｐＧＬ４．１０ベクター（Ｙｏｕｂｉｏ ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃｈｉｎａ）におけるそれぞれの部位に挿入し、プラスミドＢを得た。次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＡプラスミド及びＢプラスミドの両方をともにＨＥＫ２９３細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に導入した。これに、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）とＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を添加し、加圧スクリーニングを行い、最終的にはＨＥＫ－２９３／ＮＦκＢ－Ｌｕｃｉ／４１－ＢＢを得た。

【0171】

加圧培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ＋１ｕｇ／ｍｌ Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ＋２５０ｕｇ／ｍｌＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ）を調製し、ＨＥＫ－２９３／ＮＦκＢ－Ｌｕｃｉ／４１－ＢＢ細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件の静的インキュベーター中で継続的に培養した。対数増殖期の細胞を採取し、トリプシンで消化した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ）中へ再懸濁させ、５０μｌの細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１７）に、３×１０^４個／ウェルで、プレートコーティングした。抗体と、架橋抗体Ｆａｂ’であるヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－００６－００８）とを、１：２の濃度比で混合した後、９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルで添加した。インキュベーター中で１８～２４時間静置した後、１００μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｔｅｍ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、室温で１０分間インキュベートし、化学発光値を測定した。

【0172】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４モノクローナル抗体及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂは、両方とも、レポーター遺伝子を活性化してシグナルを発現させることができる。具体的な結果は図１３Ａに示す。結果のように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４とＵｔｏｍｉｌｕｍａｂとの両方は、いずれも、Ｔ細胞活性化のシグナル伝達経路を活性化させ、Ｔ細胞の免疫機能を開始させることができた。また、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の活性化効果はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂよりも顕著に高かった。

【0173】

３．６ インビトロでの薬効

【0174】

３．６．１ ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化効果の測定
抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番３１７３２５）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌになるまで希釈して抗ＣＤ３抗体溶液を得た。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体をＰＢＳで希釈して高、中、低の３つの濃度としたことで、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の濃度が４μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０４μｇ／ｍｌである溶液をそれぞれ得られた。抗ＣＤ３抗体溶液を、３つの濃度のＨａｎｋｅ１０Ｆ４抗体溶液と１：１の体積比でそれぞれ均一に混合した後、５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加した。なお、3つの複製ウェルを設けた。９６ウェルプレートを３７℃で静置して１時間インキュベートした。翌日の使用の前にＰＢＳで３回洗浄した。また、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂを陽性対照抗体とし、ＩｇＧ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、品番４０３６０１）を陰性対照抗体とした。

【0175】

ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞の分離：
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、その説明書に従って操作してＰＢＭＣ細胞を単離した。また、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞磁気ビーズ（ＢＤ社、品番５５７７６７）を用いて、説明書に従ってヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離・精製し、予備とした。

【0176】

３７℃下のインキュベートを経たコーティング済の９６ウェル細胞培養プレートに、密度１×１０^５個／ウェルの条件でＣＤ４^＋Ｔ細胞を添加した。この９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ_２の条件のインキュベーターに置いて３日間インキュベートし、細胞上清を収集し、サイトカインＩＮＦ－γの分泌量をＥＬＩＳＡにより測定した。

【0177】

上記の手順に基づく実験から証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂに類似し、両方とも、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化を刺激し、且つサイトカインＩＮＦ－γを分泌させた。具体的な結果は図１４に示す。

【0178】

３．６．２ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化効果の測定
抗ＣＤ３抗体をＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に６０μｌ／ウェルで添加し、９６ウェルプレートを３７℃で静置して１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄し、次いでＣＨＯ－Ｋ１安定発現細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２ＡまたはＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２ＢまたはＣＨＯ－Ｋ１）を１００μｌ／ウェル、１×１０^４個／ウェルで９６ウェルプレートに加えた。次いで９６ウェルプレートを細胞インキュベーターに一晩置いた。

【0179】

実験に使用された細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｈｅｆｅｉ ＨａｎｋｅＭａｂ Ｃｏｍｐａｎｙにより構築された、細胞膜表面においてヒトＦｃγＲ∥Ａ（ＣＤ３２Ａ）を高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ａ）、及び細胞膜表面においてヒトＦｃγＲ∥Ｂ（ＣＤ３２Ｂ）を高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ｂ）、並びに、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

【0180】

ヒトＦｃγＲ∥Ａのコーディング遺伝子配列（配列番号１４）およびヒトＦｃγＲ∥Ｂのコーディング遺伝子配列（配列番号１５）を人工的に合成し、次いで、これらを当該分野で慣用的な方法に従ってそれぞれｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入した後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて野生型ＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれぞれ導入した。Ｇ４１８（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入した。）を添加して加圧スクリーニングし、細胞膜においてヒトＦｃγＲ∥Ａを高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ａ）、及び細胞膜表面においてヒトＦｃγＲ∥Ｂを高度に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ３２Ｂ）を最終的に得た。

【0181】

ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の分離：
健康な被験者から全血を採取し、リンパ球分離液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、その説明書に従って操作してＰＢＭＣ細胞を単離した。また、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞磁気ビーズ（ＢＤ社、品番５５７７６６）を用いて、説明書に従ってヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を分離・精製し、予備とした。

【0182】

９６ウェルプレートを一晩インキュベートした後、細胞上清を吸引して除去した。そして、１００μｌのヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１×１０^５個／ウェルで、各ウェルにそれぞれ添加した。次いで、抗体を、目的濃度になるように培地で希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加した。なお、最終濃度はそれぞれ３μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌであり、各濃度について、それぞれ3つの複製ウェルを設けた。９６ウェルプレートを細胞インキュベーターで３日間インキュベートし、細胞培養上清の中のサイトカインＩＮＦ－γの分泌量をＥＬＩＳＡ法により測定した。

【0183】

上記の手順に基づく実験により証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体はＵｔｏｍｉｌｕｍａｂ、Ｕｒｅｌｕｍａｂに類似し、両方とも、Ｔ細胞の活性化を刺激し、且つＴ細胞の活性化はＦｃγＲ∥Ａ、ＦｃγＲ∥Ｂに依存していた。具体的な結果は図１５に示す。

【0184】

３．７ インビボでの薬効
実験では、Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスを選択して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスモデルは、具体的には遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムにヒト由来のｈ４－１ＢＢ遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄから入手した。

【0185】

ＭＣ３８細胞系を被験マウスの背中（剃り）の一側に皮下接種した（各マウスに対して、２×１０^６の細胞をそれぞれ接種した。なお、細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌと１：１の体積比で均一に混合した後に２００μｌ接種した）。腫瘍担持マウスの平均腫瘍体積が１００ｍｍ^３に達したとき、実験設計に従って、マウスを８匹ずつの５つのグループにランダムに割り当てた。各グループについて投与した日を０日目と定義した。グループの割り当ておよび投与スケジュールは表１５に示す。

【0186】

【0187】

腫瘍が接種された後の動物の生存状況および活動状況を毎週、２回検査した。検査には、腫瘍の増殖状況、運動能力、飲食、体重および他の異常な行為が含まれる。

【0188】

上記の手順に基づく実験により証明されたように、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体は、ＭＣ３８腫瘍の増殖を抑制することができ、ドーズ依存性が顕著であった。また、同じドーズでは、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の腫瘍抑制能力は、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ抗体の抗腫瘍効果よりも顕著に強かった。具体的な結果は図１６に示す。

【0189】

Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４投与グループでは、腫瘍が消失した後、1ヶ月観察し続けた結果、腫瘍の再発は認められなかった。腫瘍が消失したマウスに、再びＭＣ３８細胞を４×１０^６個接種し、１５日経過しても、図１７に示すように腫瘍は形成されなかった。つまり、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は腫瘍の増殖を抑制するだけでなく、マウスの記憶Ｔ細胞の機能を動員することで腫瘍の再発を抑えることができ、且つ同型の腫瘍に対して免疫機能を有することが示されている。

【0190】

３．８ 安全性の評価

【0191】

３．８．１ マウスを用いる毒性試験
実験では、Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスを選択して、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のインビボでの抗腫瘍薬効を測定した。Ｂ－ｈＣＤ１３７（４－１ＢＢ）マウスモデルは、具体的には遺伝的背景Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムにヒト由来のｈ４－１ＢＢ遺伝子を嵌合してなる遺伝子改変マウスであり、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄから入手した。

【0192】

被験マウスを４つのグループにランダムに割り当て、それぞれ生理食塩水、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４、Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ及びＵｒｅｌｕｍａｂを投与した。具体的には、週に２回、毎回の投与濃度が３０ｍｇ／ｋｇの条件で、３週間投与した。投与終了後、尾を切って血液を採取し、マウスの末梢血の中のＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の含有量を測定した。図１８に示すように、Ｕｒｅｌｕｍａｂは生理食塩水の場合のグループと比較してＡＳＴ含有量が顕著に上昇しており、この抗体では肝毒性のリスクを有することを示している。一方、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４及びＵｔｏｍｉｌｕｍａｂの場合のＡＳＴ及びＡＬＴの含有量は、いずれも、生理食塩水の場合のグループとは有意差がなかった。これは、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４およびＵｔｏｍｉｌｕｍａｂのいずれも、低い毒性を有することを示している。

【0193】

３．８．２ ＳＤラットへＨａｎｋｅ１０Ｆ４を静脈注射で投与する場合の機能観察総合評価（ＦＯＢ）試験
高（３０ｍｇ／ｋｇ）、中（１０ｍｇ／ｋｇ）、低（３ｍｇ／ｋｇ）の３つの投与ドーズを設定して、４０匹のＳＤラット（メス半分、オス半分）へＨａｎｋｅ１０Ｆ４を単回の静脈注射で投与し、それぞれの時点における機能観察総合評価（ＦＯＢ）試験に基づいて、ＳＤラットの中枢神経系に対する、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の影響を評価した。

【0194】

実験の期間中、プラセボ対照グループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４低ドーズグループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４中ドーズグループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４高ドーズグループのいずれについても、ラットの通常状態の観察では有意な異常が認められなかった。投与前、及び投与後の０．５時間、６時間、２４時間、４８時間、１６８時間では、各グループの動物の姿勢、立毛などの指標において、薬物に関連する異常や変化が見られなかった。動物の自傷又はケージ内の他の動物への攻撃が見られず、動物の死亡も見られなかった。各グループの動物は、ケージから出る難しさ、フリーハンド拘束観察、流涙、流涎、分泌物、眼球の突出、瞳孔、閉瞼、皮膚の色、立毛、呼吸などの指標に異常や変化が見られなかった。各グループの動物は、接近反応、接触反応、パニック反応、腹部の緊張、体の張り、耳介反射、掉尾反射の観察、平面立ち直り反射観察、空中立ち直り反射、瞳孔反射の観察、瞼の反射、屈筋反応、伸筋反応などの指標に異常や変化が見られなかった。総合すると、本実験の条件で、ＳＤラットへ単回の静脈注射で３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇのＨａｎｋｅ１０Ｆ４を投与したところ、動物の中枢神経系の機能への明らかな影響はなかった。

【0195】

３．８．３ カニクイザルを用いる毒性試験
４匹のカニクイザルを、性別に基づいて分け、体重に基づいてドーズクライミンググループ、固定ドーズグループの合計２つのグループにランダムに割り当てた。なお、１グループにつき２匹、且つメス半分、オス半分であった。それらに静脈注射のルートで投薬した。詳細は表１６を示す。

【0196】

注：動物番号の項目において１番目の数字は、グループを表し（１、２は、それぞれ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４ドーズクライミンググループ、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４高ドーズグループを表す）、２番目の文字は、性別を表す（Ｆはメスである、Ｍはオスである）。

【0197】

測定の時点については、適応期間において１回測定し、Ｄ８、Ｄ１５、Ｄ２２、Ｄ２９に投与して２４時間経過したときにそれぞれ１回測定し、投与期間の終了（Ｄ３５）後に１回測定した。実験の結果、投与期間において、各グループのサルは、通常状態の観察、体重、及び摂食量／食物消費量、体温、呼吸、心電図、血圧、血液凝固指標等のいずれにおいても異常が認められなかったことが示された。投与前と比べて、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を用いた各ドーズグレープにおける全ての動物は、血液の生化学指標の各指標（アラニンアミノトランスフェラーゼＡＬＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ）がいずれも正常の範囲内で変動し、顕著な変化傾向は認められなかった。詳細は表１７を示す。ドーズクライミンググループでは、１００ｍｇ／ｋｇ以上のドーズの場合、オス動物の白血球及び好中球、単球が上昇し、サイトカインＩＬ－６が僅かに上昇したが、再び投与された後、元のレベルに戻った。詳細は表１８を示す。したがって、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、カニクイザル体内での最大耐量（ＭＴＤ）≧２００ｍｇ／ｋｇと分かった。

【0198】

【0199】

【0200】

３．９ 安定性

【0201】

（１）加速安定性
調製したＦ０１（ｐＨ５．２）とＦ０２（ｐＨ５．５）の２種類の緩衝液を用い、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を２０ｍｇ／ｍｌとし、４℃の条件で３ヶ月間（３Ｍ）放置して、抗体濃度、凝集分解等の各物理化学的特性を測定した。具体的には、光路長可変型分光光度計によりＨａｎｋｅ１０Ｆ４タンパク質の濃度を測定し、高速液体クロマトグラフィーによりＨａｎｋｅ１０Ｆ４の分子サイズ、ヘテロ純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）及び電荷ヘテロ純度（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）を測定し、キャピラリー電気泳動分析システムによりＨａｎｋｅ１０Ｆ４非還元キャピラリーゲル電気泳動タンパク質純度（ＮＲ－ＣＥ）を測定した。結果は表１９に示す。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、それぞれのｐＨの緩衝液中に４℃で３ヶ月間放置した後、初期時のサンプル（Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４／Ｔ０）と比較して、明らかな変化がなく、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の安定性が良好であった。

【0202】

同時に、４℃で１ヶ月（１Ｍ）、２ヶ月（２Ｍ）、３ヶ月（３Ｍ）放置したＨａｎｋｅ１０Ｆ４のサンプルと、実験開始の時点のサンプル（Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４／Ｔ０）を取り、先に述べたレポーター遺伝子法により、最高濃度が４ｕｇ／ｍｌ、２倍の勾配で希釈してなる９つの濃度ポイントという条件で、抗体の生物学的活性を測定した。実験結果は図１３Ｂに示す。Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４を４℃で３ヶ月放置した後でも、抗体の生物学的活性は良好であった。

【0203】

注：Ｔ０は初期時を表し、３Ｍは３ヶ月の末を表す。

【0204】

（２）Ｔｍ値の測定
示差走査蛍光（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）により、両波長（３５０ｎｍと３３０ｎｍ）における、抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４の蛍光強度を測定し、蛍光強度比を算出した。また、タンパク質のアンフォールディング期間中の蛍光強度及び蛍光ピーク値の変化を測定し、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のタンパク質が半分アンフォールディングされた時点の温度、すなわち、Ｔｍ値を得た。結果として、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４のＴｍ１値は６４．４℃であり、Ｔｍ２値は７１．５℃（Ｔｍ１とＴｍ２は、タンパク質のアンフォールディング期間中に蛍光ピークが変化したときの２つの温度である）であった。つまり、Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４抗体の安定性は良好であった（図１９）。

【産業上の利用可能性】

【0205】

本発明が提供する抗体Ｈａｎｋｅ１０Ｆ４は、ヒト４－１ＢＢに結合することができ、且つヒト４－１ＢＢに対して高い親和性を示し、また、Ｔ細胞応答を効果的に増強させることができる。前記抗体は、ある程度、ヒト４－１ＢＢＬと競合してヒト４－１ＢＢに結合する。他方、Ｔ細胞共刺激測定法では、前記抗体はＩＮＦ－γの発生を誘導し、マウスモデルにおいて腫瘍の増殖を顕著に阻害し、且つ腫瘍の再発はない。本発明に係る抗体は、T細胞および抗体により媒介される免疫応答の調節に有用であり、また、腫瘍免疫療法に有用である。本発明で提供される一本鎖抗体の融合抗体は、ヒト４－１ＢＢ及びサル４－１ＢＢに結合することができる。

【0206】

本発明に係る抗体とヒト４－１ＢＢとの結合は、免疫応答の増強をもたらす。本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫増強剤として、または、Ｔ細胞により媒介される自己免疫疾患の免疫調節剤として有用である。前記抗体およびその抗原結合フラグメントは、癌、自己免疫、または他の疾患を有する患者の血液若しくは組織中の４－１ＢＢを検出するための診断ツールとしても有用である。

【0207】

本発明により提供される抗体は、抗腫瘍の効果が良く、安全性が高く、安定性が高い。

【0208】

本発明により提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫調整剤として、例えば、癌、自己免疫疾患、炎症疾患及び感染疾患等の治療など、幅広い治療用途に適用されうる。

【国際調査報告】