(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-27
(54)【発明の名称】カンナビジオール－タイプのカンナビノイド化合物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/05 20060101AFI20230120BHJP
C07C 37/00 20060101ALI20230120BHJP
C07C 39/23 20060101ALI20230120BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230120BHJP
【ＦＩ】
A61K31/05
C07C37/00
C07C39/23
A61P25/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022529679
(86)(22)【出願日】2020-11-18
(85)【翻訳文提出日】2022-05-30
(86)【国際出願番号】 GB2020052944
(87)【国際公開番号】W WO2021099783
(87)【国際公開日】2021-05-27
(31)【優先権主張番号】1916977.0
(32)【優先日】2019-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】319016758
【氏名又は名称】ジーダブリュー・リサーチ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー・ガイ
(72)【発明者】
【氏名】ヴォルカー・クナッパーツ
(72)【発明者】
【氏名】ベンジャミン・ウォーリー
(72)【発明者】
【氏名】マリー・ウーリー－ロバーツ
【テーマコード（参考）】
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA04
4C206CA19
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZA06
4H006AA02
4H006AC41
4H006FE12
4H006FE13
(57)【要約】
本発明は、医薬として使用のためのカンナビジオール（ＣＢＤ）タイプのカンナビノイド化合物に関する。ＣＢＤ－タイプのカンナビノイド、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）は、カンナビジバリンの代謝産物である。カンナビノイドは、合成方法で製造され得、６－ＯＨ ＣＢＤＶの製造方法が、本明細書に記載される。加えて、疾患のモデルにおいて６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性を示すデータが、本明細書に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬として使用のための、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）。
【請求項2】
合成化合物の形態である、請求項１に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項3】
純粋化合物又は単離化合物の形態である、請求項１に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項4】
６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量が、１００ｍｇ／ｋｇ／日より多い、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項5】
６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量が、１００ｍｇ／ｋｇ／日より少ない、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項6】
６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）及び１以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬として使用のための組成物。
【請求項7】
てんかんの治療における使用のための、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）。
【請求項8】
治療されるてんかんは、哺乳類においてである、請求項７に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項9】
哺乳類はヒトである、請求項８に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項10】
哺乳類は犬である、請求項８に記載の使用のための６－ＯＨ ＣＢＤＶ。
【請求項11】
６ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬として使用のための、カンナビジオール（ＣＢＤ）タイプのカンナビノイド化合物に関する。
【0002】
ＣＢＤ－タイプのカンナビノイド、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）は、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）の代謝産物である。
【0003】
カンナビノイドは、合成方法によって製造され得る。
【0004】
疾患のモデルにおいて、６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性を示すデータが本明細書中に記載される。加えて、６－ＯＨ ＣＢＤＶの製造方法が記載される。
【背景技術】
【0005】
カンナビノイドは、構造的又は薬理学的に大麻植物（cannabis plant）の構成成分又はカンナビノイドレセプターＣＢ１又はＣＢ２の内因性アゴニスト（内在性カンナビノイド）に関する、天然化合物及び合成化合物である。天然では、これらの化合物が生産される唯一の方法が、大麻植物によるものである。大麻は、麻（Cannabis sativa）、インド麻（Cannabis indica）及び（時として麻の一部として考えられる）カンナビスルデラリス（Cannabis ruderalis）の種を含むアサ科（Cannabaceae）における花をつける植物の属である。
【0006】
大麻植物は、高度に複雑な化合物の混合物を含む。少なくとも５６８の固有の分子が特定されている。これらの化合物の中には、カンナビノイド、テルペノイド、糖、脂肪酸、フラボノイド、他の炭化水素、窒素化合物及びアミノ酸が含まれる。
【0007】
カンナビノイドは、制限するものではないが、アドレナリンレセプター、カンナビノイドレセプター（ＣＢ１及びＣＢ２）、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ３、又はＧＰＲ５を含む様々なレセプターを通じて生理学の効果を発揮する。大麻植物に存在する主要なカンナビノイドは、カンナビノイド酸Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸（Δ９－ＴＨＣＡ）及びカンナビノール酸（ＣＢＤＡ）と少量のそれぞれの中性（脱カルボキシル化）カンナビノイドである。加えて、大麻は、低い濃度の他の少数のカンナビノイドを含有し得る。「これらの薬効のある植物、及び大麻からのより重量な抽出物の、化学組成、薬理学のプロファイリング、完全な生理学の有効性は、完全には解明されていない」Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｍ．ら、ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ，２，６０９１－６１０３（２０１７）。
【0008】
ＣＢＤを含有する大麻植物の粗抽出物は、病気及び疾患に苦しむ患者によって使用されてきた。しかしながらそのような粗製品は、製剤処方での使用に適切でない。病気又は疾患の治療において使用するため、より安定したＣＢＤ製剤を調製しようとする人々は、ＣＢＤを合成的に調整するか、植物由来のカンナビノイドから、ＣＢＤ以外のすべての化合物、特にＴＨＣなどの精神活性化合物を除去しようと試みる、一致した努力を行ってきた。例えば、米国特許２０１４／０２９８５１１参照。
【0009】
本発明は、ＣＢＤＶの代謝産物は、治療効果を有するという驚くべき発見を含む。この化合物、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）は、合成的に生産され得、純粋な形態で使用されてもよい。
【0010】
カンナビノイドは、大麻植物から天然に由来し得る又は化学合成を通じて合成的に生産され得る多くの化合物群である。
【0011】
大麻から生産される１００以上の様々なカンナビノイドが特定されてきた。これらのカンナビノイドは、以下の異なる群に分離され得る：植物性カンナビノイド；内在性カンナビノイド、及び（新しいカンナビノイド又は植物性カンナビノイド又は内在性カンナビノイドの合成生産版であってもよい）合成カンナビノイド。
【0012】
植物性カンナビノイドは、天然に由来し、大麻植物中で発見され得るカンナビノイドである。植物性カンナビノイドは、高純度の抽出物を生産するために、植物から単離され得る。植物性カンナビノイドは、植物材料からカンナビノイドの抽出に使用される方法に依存して、中性（脱カルボキシル化形態）又はカルボン酸形態として得られてもよい。例えば、カルボン酸形態の加熱は、多くのカルボン酸形態を、脱カルボキシル化して中性形態にすることを引き起こすことが知られている。植物性カンナビノイドは、植物から生産され得るのみであるが、植物性カンナビノイド版として、化学合成によって合成的に生産されてもよい。
【0013】
内在性カンナビノイドは、カンナビノイドレセプターに結合した内因性の脂質ベースの、逆行性の神経伝達物質であり、（脳を含む）哺乳類の中枢神経系、及び末梢神経系を通じて発現されるカンナビノイドレセプタータンパク質である。内在性カンナビノイド系は、妊孕性、妊娠、生前及び生後発達の間、食欲、痛覚、気分、及び記憶を含む様々な生理学及び認知性の過程を調節すること、並びに大麻の薬理学の効果を媒介することに関係する。
【0014】
合成カンナビノイドは、カンナビノイド－様の構造を有する化合物であり、植物というよりはむしろ化学手法を用いて製造される。
【0015】
特定のカンナビノイドが以下に詳細に記載される。
【0016】
カンナビジオール（ＣＢＤ）は、麻植物（Cannabis sativa）などの、大麻種の主要なカンナビノイド構成成分である。ＴＨＣなどの他のカンナビノイドとは異なり、カンナビジオールは、ＣＢ１又はＣＢ２に結合しない、又はそのレセプターへの結合は、薬理学の効果を含む観点において無視できる。したがって、カンナビジオールは、ＣＢ１又はＣＢ２レセプターによって媒介される中枢神経系、又は末梢神経系への効果を引き起こさない。ＣＢＤは、向精神（大麻類似性の）作用がほとんど又は全くなく、その分子構造及び特性は、他のカンナビノイドとは大きく異なる。
【0017】
ＣＢＤ及びＣＢＤＶの投与は、治療に応答し得る様々な病気及び疾患のための代替治療を提供する試みにおいて研究主題となっている。
【0018】
ＣＢＤ及びＣＢＤＶの代謝を決定するための動物での多くの研究がある。ＣＢＤ及びＣＢＤＶの薬物動態は、主に実質の初回通過効果により、複雑である。次にこれは、ヒト及び他の種において、経口ＣＢＤのバイオアベイラビリティーが低くなることを引き起こす。
【0019】
最も豊富なＣＢＤの代謝産物は、ＣＢＤのヒドロキシル化７－カルボキシ誘導体であって：２”－ＯＨ－７－ＣＯＯＯＨ，３”，４”，５”－トリノル ＣＢＤ； ＣＢＤ－グルクロニド； ４”－ＯＨ－７－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； ２”－ＯＨ－７－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； １０－ＯＨ－７－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； ３”－ＯＨ－７－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； ７－ＯＨ－３”－ＣＯＯＨ，４”，５”－ジノル ＣＢＤ； ７－ＣＯＯＨ－８，９－ジヒドロ－８，９－ｄｉＯＨ ＣＢＤ； １”－ＯＨ－７－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； ６－ＯＨ－４２－ＣＯＯＨ，５”－ノル ＣＢＤ； ６－ＯＨ－３”－ＣＯＯＨ，４”，５”－ジノル ＣＢＤ； ７－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； ７－ＯＨ－４”－ＣＯＯＨ，５”－ノル ＣＢＤ； ４”－ＣＯＯＨ，５”－ノル ＣＢＤ； ７－ＯＨ ＣＢＤ； ８，９－ジヒドロ－７，８，９－トリＯＨ ＣＢＤ； カンナビノール； ３”－ＣＯＯＨ，４”，５”－ジノル ＣＢＤ； ２”－ＣＯＯＨ，３”，４”，５”－トリノル ＣＢＤ； ２”，６－ジＯＨ，３”，４”，５”－トリノル ＣＢＤ６，７－ジＯＨ ＣＢＤ； ７－ＯＨ－１”－ＣＯＯＨ，２”，３”，４”，５”－テトラノル ＣＢＤ； ６－ＯＨ ＣＢＤ； ７－ＯＨ－５”－ＣＯＯＨ ＣＢＤ； １”－ＣＯＯＨ，２”，３”，４”，５”－テトラノル ＣＢＤ； ６－ＯＨ－１”－ＣＯＯＨ，２”，３”，４”，５”－テトラノル ＣＢＤ 及び ６－ＯＨ－５”－ＣＯＯＨ ＣＢＤ を含む（Ｕｊｖａｒｙ 及び Ｈａｎｕｓ， ２０１６）。
【0020】
現在、ＣＢＤＶ分子に対して代謝が起こることは知られていないが、ＣＢＤＶに対してもＣＢＤと同様の代謝産物が存在すると考えられるが、その代謝産物は、ＣＢＤ分子に存在するペンチル側鎖ではなく、プロピル側鎖を有するであろう。
【0021】
米国特許６，６３０，５０７号は、多数のカンナビジオールの類似体を記載している。化合物６－ＯＨ ＣＢＤが、この文書に詳述されているが、この化合物が治療薬として有効であるという根拠となるデータは示されていない。
【0022】
テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）は、大麻の主要な精神活性の構成成分である。ＴＨＣは、ＣＢ１及びＣＢ２レセプターで部分的なアゴニストである。合成ＴＨＣ又はドロナビノールは、ＡＩＤＳ患者における食欲喪失及びがんの化学療法により引き起こされる吐き気及び嘔吐の治療のために承認されている。
【0023】
麻（Cannabis sativa）において特定された１００種以上の天然カンナビノイドのうち、７種類がＣＢＤ－型化合物として分類されており、これらのカンナビノイドは、ＣＢＤと同じ絶対配置を有している。これらは：ＣＢＤ、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）、カンナビジオール－Ｃ１（ＣＢＤ－Ｃ１）、カンナビジオール－Ｃ４（ＣＢＤ－Ｃ４）、カンナビジオール－Ｃ６（ＣＢＤ－Ｃ６）及びカンナビジオールモノメチルエーテル（ＣＢＤＭ）である。
【0024】
カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）は、ＣＢＤが大麻植物中に存在する主要な形態である。脱カルボキシル化の後、それはＣＢＤに変換される。
【0025】
カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）は、二つのメチレン架橋によって側鎖が短くされたＣＢＤのホモログである。ＣＢＤＶは、非精神活性のカンナビノイドであり、てんかんのマウスモデルにおいて抗けいれん性の活性を有することが示されている。
【0026】
カンナビジオール－Ｃ１（ＣＢＤ－Ｃ１）もまた、カンナビジオールコールとして知られ、４つのメチレン架橋によって側鎖が短くされたＣＢＤのホモログである。ＣＢＤ－Ｃ１は、ＣＢＤを生産する植物中において自然に発生するが、治療効果を有することは示されていない。
【0027】
カンナビジオール－Ｃ４（ＣＢＤ－Ｃ４）は、ノル－カンナビジオールとしても知られており、一つのメチレン架橋によって側鎖が短くされたＣＢＤのホモログである。ＣＢＤ－Ｃ４は、ＣＢＤを生産する植物中で自然に発生し、本発明の前に治療効果を有することが示されてはいない。
【0028】
カンナビジオール－Ｃ６（ＣＢＤ－Ｃ６）は、一つのメチレン架橋によって側鎖が増加されたＣＢＤのホモログである。ＣＢＤ－Ｃ６は、ＣＢＤを生産する植物中で自然に発生し、本発明の前に、治療効果を有することが示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0029】
【特許文献1】米国特許２０１４／０２９８５１１号
【特許文献2】米国特許６，６３０，５０７号
【非特許文献】
【0030】
【非特許文献1】ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ，２，６０９１－６１０３（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0031】
本発明は、化合物６－ヒドロキシカンナビジバリンが治療上の利点を提供し得ることを示唆するデータを初めて示す。
【課題を解決するための手段】
【0032】
本発明の第一の態様によると、医薬として使用のための６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）が提供される。
【0033】
好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶは合成化合物として存在する。別法として、６－ＯＨ ＣＢＤＶは、純粋化合物及び単離化合物として存在する。
【0034】
好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／日より多い。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、２５０ｍｇ／ｋｇ／日より多い。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、５００ｍｇ／ｋｇ／日より多い。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、７５０ｍｇ／ｋｇ／日より多い。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、１０００ｍｇ／ｋｇ／日より多い。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、１５００ｍｇ／ｋｇ／日より多い。
【0035】
別法として、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、１００ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、５０ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、２０ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、１０ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、５ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、１ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。より好ましくは、６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。
【0036】
本発明の第二の態様によると、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）及び１種以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬としての使用のための組成物が提供される。
【0037】
本発明の第三の態様によると、てんかんの治療における使用のための６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）が提供される。このましくは、てんかんは哺乳類において治療される。より好ましくは、哺乳類はヒトである。別法として、哺乳類は犬である。
【0038】
本発明の第四の態様によると、６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【発明を実施するための形態】
【0040】
カンナビノイド及びそれらの略称
本明細書に記載されるカンナビノイドが、それらの標準的な略称と共に以下にリスト化される。
本明細書に記載されるカンナビノイドが、それらの標準的な略称と共に以下にリスト化される。
【表1】
【実施例】
【0041】
実施例１：アルファ６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）の合成製造方法
前記の化合物６－ＯＨ ＣＢＤＶは、カンナビジオールの代謝産物である。
前記の化合物６－ＯＨ ＣＢＤＶは、カンナビジオールの代謝産物である。
【0042】
以下に示される合成経路は、カンナビノイドアルファ６－ＯＨ ＣＢＤＶを生成するために使用され得る方法論を詳述する。
【0043】
式中Ｒ＝Ｃ３Ｈ７である。
【0044】
無水ピリジン（２０ｍＬ）中のＣＢＤＶ（５．００ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）に、無水酢酸（５．６３ｇ、５．２０ｍＬ、５５．２ｍｍｏｌ）を添加し、４時間溶液を撹拌した。ジクロロメタン（３００ｍＬ）を加え、溶液を水（２００ｍＬ）、１Ｍ塩酸（２００ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濃縮して、更なる精製なしで使用される黄色のオイルとして、ＣＢＤＶジアセテート（６．８４ｇ、定量）を得た。
【0045】
氷酢酸（９ｍＬ）及び無水酢酸（４．９６ｇ、４．５９ｍＬ、４８．６ｍｍｏｌ）中のＣＢＤＶジアセテート（４．００ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）に、ニクロム酸ナトリウム（３．８６ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で４日間撹拌した。得られた溶液を水（１５０ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。混合された有機抽出物は、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄され（１５０ｍＬ）、乾燥（ＭｇＳＯ４）され、濃縮され、黄色のオイルを得、Biotage Isolera自動クロマトグラフィー装置を使用して、通常の段階条件（シリカカラム、勾配５→３３％ガソリン中の酢酸エチル）の下、２５４ｎｍで検出して、精製し、６－ｏｘｏ－ＣＢＤＶジアセテート（１．４０ｇ３３％）を無色のオイルとして得た。
【0046】
Ｒｆ＝０．３６（酢酸エチル－ガソリン、１：４ｖ／ｖ）
【0047】
ジエチルエーテル（５０ｍＬ）中のリチウムアルミニウムヒドリド（０．５８ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）に０℃で、ジエチルエーテル（２３ｍＬ）中の６－ｏｘｏ－ＣＢＤＶジアセテートを加え、混合物を４時間室温で撹拌した。得られた混合物をアイスバスにて冷却し、氷水（１００ｍＬ）で慎重にクエンチさせた。１Ｍの塩酸（６０ｍＬ）を加え、混合物をジエチルエーテル（１００ｍＬ＋５０ｍＬ）で抽出した。混合された有機層は、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）して、濃縮し、淡黄色のオイルを得、Biotage Isolera自動クロマトグラフィー装置を使用して、通常の段階条件（シリカカラム、勾配７→５３％ガソリン中の酢酸エチル）の下、２５４ｎｍで検出して、精製し、６－ｏｘｏ－ＣＢＤＶ（０．７０ｇ６４％）を白色のガラス状固体として得た。
【0048】
Ｒｆ＝０．２９（酢酸エチル－ガソリン、３：７ｖ／ｖ）
【0049】
【化1】
【0050】
得られた材料はアルファ６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）であることを確認した。化合物は黄色のガラス状半固体材料であり、化学式Ｃ１９Ｈ２６Ｏ３、分子量３０２．４ｇ／ｍｏｌである。
【0051】
化合物の純度を、ＨＰＬＣによって試験し、９６．７％の純物質を製造したことが示された。
【0052】
６－ＯＨ ＣＢＤＶを－２０℃で保管し、試験で必要になるまで光から遮断した。
【0053】
実施例２：マウスにおける最大上刺激電気ショック療法発作の（ＭＥＳ）試験を使用した６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）の抗けいれん活性の評価
６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性は、発作、最大上刺激電気ショック療法発作（ＭＥＳ）試験のマウスモデルにおいて試験した。
６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性は、発作、最大上刺激電気ショック療法発作（ＭＥＳ）試験のマウスモデルにおいて試験した。
【0054】
最大上刺激電気ショック療法発作（ＭＥＳ）試験は、分子の抗けいれん特性、及び標準の抗－てんかん性薬を評価するために臨床前に広く利用される（Ｌｏｓｃｈｅｒら、１９９１年）。
【0055】
ＭＥＳ試験は、マウスに対照動物の１００％に確実に、剛直性後肢伸筋発作を引き起こすのに十分な強度の所定の高レベルの電気刺激を与える極めて厳しいモデルである。この様に、ＭＥＳ試験は、抗けいれん作用を厳密に評価する（Ｓｗｉｎｙａｒｄ、１９８５年）。
【0056】
方法
ナイーブマウスを、アドリブで利用可能な食物及び水で、ケージ中で処置部屋に慣れさせた。
ナイーブマウスを、アドリブで利用可能な食物及び水で、ケージ中で処置部屋に慣れさせた。
【0057】
治療群に応じて、動物にｉ．ｐ．投与した。
【0058】
媒体（１０ｍｌ／ｋｇｉ．ｐ．６０分前処理時間）は、１：１：１８の媒体であり、５％エタノール、５％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＥＬ、９０％生理食塩水であった。
【0059】
試験化合物、アルファ６－ＯＨ ＣＢＤＶを実施例１にて記載した方法によって調製した。
【0060】
試験化合物、６－ＯＨ ＣＢＤＶを、１０ｍｌ／ｋｇｉ．ｐ．６０分前処理時間で、３、１０、３０及び１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
【0061】
陽性対照バルプロ酸を、２５０ｍｇ／ｋｇで使用した（１０ｍｌ／ｋｇｉ．ｐ．３０分前処理時間）。
【0062】
マウスを個々に、対象動物の１００％が確実に剛直性後肢伸筋発作を引き起こすのに十分強度のな所定の高レベル（３０ｍＡ：５０Ｈｚ）の角膜電気ショック（０．２秒間）の後に、剛直性後肢伸筋発作の引き起こしについて評価した。
【0063】
発作の誘因は、各動物について、あり（＋）又はなし（０）として全か無かの効果として測定した。
【0064】
各動物の治療を知らない観察者がデータを収集し、各治療群の＋又は０の数字で表現した。
【0065】
次に、関連する媒体処理群の阻害率（媒体処理群に対する保護率）を作成した。
【0066】
個々の処理群と媒体処理群の間の有意差を、フィッシャー直接確立法両側試験（ｐ＜０．０５の場合、有意差ありと考えられる）を使用して評価した。
【0067】
結果
以下の表１にこの実験で得られたデータを示す。
以下の表１にこの実験で得られたデータを示す。
【0068】
陽性対照バルプロ酸（２５０ｍｇ／ｋｇ）処理群において、試験前３０分にｉ．ｐ．投与され、すべての動物に発作が起きないとして評価された。この結果は、媒体対照と比較して、統計的に有意差（ｐ＜０．０１）がある。
【0069】
６－ＯＨ ＣＢＤＶ処理群において、試験前６０分にｉ．ｐ．投与され、３及び１０ｍｇ／ｋｇ６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量では、媒体対照と比較して発作において２０％しか変化がなく、有意差なしであった。
【0070】
しかしながら、３０及び１００ｍｇ／ｋｇ６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量では、全てのマウスが発作に耐えることを可能にし、媒体に対して統計的な有意効果を発現した（ｐ＜０．００１）。
【0071】
【表2】
【0072】
結論
これらのデータは、化合物６－ＯＨ ＣＢＤＶに対する治療の有効性を初めて示すものである。
これらのデータは、化合物６－ＯＨ ＣＢＤＶに対する治療の有効性を初めて示すものである。
【0073】
これらのデータは、このカンナビノイドが治療の有効性を発揮する可能性があることを示す証拠はこれまで知られていなかったため、重要である。
【0074】
実施例３：マウスにおける最大上刺激電気ショック療法発作の閾値（ＭＥＳＴ）試験を使用した６－ヒドロキシカンナビジバリン（６－ＯＨ ＣＢＤＶ）の抗けいれん活性の評価
６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性を、一般化された発作、最大上刺激電気ショック療法発作の閾値（ＭＥＳＴ）試験のマウスモデルにおいて試験した。
６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性を、一般化された発作、最大上刺激電気ショック療法発作の閾値（ＭＥＳＴ）試験のマウスモデルにおいて試験した。
【0075】
最大上刺激電気ショック療法発作の閾値（ＭＥＳＴ）試験は、試験化合物の促進又は抗－けいれん特性を評価するために臨床前に広く利用される（Ｌｏｓｃｈｅｒら、１９９１年）。
【0076】
ＭＥＳＴ試験において、後肢剛直性伸筋けいれんを誘発するのに必要な発作閾値電流を変化させる薬物の能力は、ショック滴定法の「アップアンドダウン」法によって測定される（Ｋｉｍｂａｌｌら、１９５７年）。発作閾値の増加は、抗けいれん効果を示唆している。一般化された剛直性間代性発作に対して効果が臨床的に示されている、ナトリウムチャンネルブロッカーを含む（例えばラモトリギン）抗てんかん薬は、マウスにおいてこの試験で全て、抗－けいれん特性を示す。
【0077】
逆に、発作閾値の減少は、ピクロトキシンなどの痙攣剤として知られるものに観察されるように、促進－けいれん効果を示唆するものである。
【0078】
電流（ｍＡ）として表現される、剛直性後肢伸筋けいれんの存在の誘導に必要とされる、刺激強度を変更させる試験化合物の性能は、ＭＥＳＴにおいて評価される。治療群の５０％の動物（ＣＣ５０）に剛直性後肢伸展を生じさせる電流から観察される剛直性後肢伸筋けいれんのあり（＋）又はなし（０）の結果から、治療群に対する発作閾値を決定し、その後、その効果を媒体対照群のＣＣ５０と比較した。
【0079】
方法
試験詳細：
ナイーブマウスを、アドリブで利用可能な食物及び水で、最大７日間ケージ中で処置部屋に慣れさせる。
試験詳細：
ナイーブマウスを、アドリブで利用可能な食物及び水で、最大７日間ケージ中で処置部屋に慣れさせる。
【0080】
すべての動物を試験の開始時に重さを量り、群間の体重の平均分布に基づいて治療群に無作為に割り当てた。媒体、３、１０若しくは３０ｍｇ／ｋｇでの６－ＯＨ ＣＢＤＶ、２．５ｍｇ／ｋｇでのジアゼパム、又は２５０ｍｇ／ｋｇでのバルプロ酸ナトリウムのいずれかで、全ての動物が、１０ｍＬ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ）注射を通じて投与された。
【0081】
動物を、媒体の１５分投与後、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇそれぞれで、６－ＯＨ ＣＢＤＶの１５及び３０分投与後、並びにジアゼパム及びバルプロ酸ナトリウムの３０分投与後に、一度の電気ショックによって剛直性後肢伸筋けいれんの発現についてそれぞれ評価した。
【0082】
治療群の第一の動物は、推測又は推定ＣＣ５０電流でショックを与えた。後続の動物には、前の動物のけいれんの結果に応じて電流を下げる又は上げた。
【0083】
各治療群から得られたデータを治療群のＣＣ５０±ＳＥＭ値の計算に使用した。
【0084】
試験化合物：
媒体：（５％エタノール、５％Ｓｏｌｕｔｏｌ、９０％生理食塩水）を下記の様に調製した：３６ｍＬの生理食塩水中の２ｍＬのエタノール、２ｍＬのＳｏｌｕｔｏｌを６０℃まで加熱した（１：１：１８）。
媒体：（５％エタノール、５％Ｓｏｌｕｔｏｌ、９０％生理食塩水）を下記の様に調製した：３６ｍＬの生理食塩水中の２ｍＬのエタノール、２ｍＬのＳｏｌｕｔｏｌを６０℃まで加熱した（１：１：１８）。
【0085】
陽性対照：ジアゼパムを２．５ｍｇ／ｋｇで、バルプロ酸ナトリウムを２５０ｍｇ／ｋｇで使用した。
【0086】
試験化合物、アルファ６－ＯＨ ＣＢＤＶを実施例１に記載した方法によって調製した。６－ＯＨ ＣＢＤＶは、１：１：１８のエタノール：Ｓｏｌｕｔｏｌ：０．９％生理食塩水中の３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）処方で投与された。
【0087】
サンプル収集
各動物は、１９８６年動物（科学処置）法Ｓｃｈｅｄｕｌｅ１に基づくＨｕｍａｎｅ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓに準拠して、けいれん発現の直後に、頭蓋をたたいて脳を破壊し、その後首を切って永久に循環が停止したことを確認することによって、人道的に殺処分された。終末の血液及び脳収集は、首切り後に行った。
各動物は、１９８６年動物（科学処置）法Ｓｃｈｅｄｕｌｅ１に基づくＨｕｍａｎｅ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓに準拠して、けいれん発現の直後に、頭蓋をたたいて脳を破壊し、その後首を切って永久に循環が停止したことを確認することによって、人道的に殺処分された。終末の血液及び脳収集は、首切り後に行った。
【0088】
血液をリチウム－ヘパリンチューブ内に収集し、１５００×ｇで、１０分間４℃で遠心分離した。得られた血漿を、除去し（＞１００μＬ）、安定化のために、１００μＬのアスコルビン酸（１００ｍｇ／ｍＬ）を含有する０．５ｍＬのエッペンドルフチューブに２分割した。脳を取り除き、生理食塩水で洗浄し、半割にした。それぞれ半分を、別々の２ｍｌスクリューキャップクライオバイアルに入れ、重量を測定し、ドライアイス上で凍結させた。
【0089】
統計的分析
それぞれの治療群に対するデータを、採用したそれぞれの電流レベルで＋及び０の数として記録し、この情報をＣＣ５０値（動物の５０％が発作挙動を発現するのに必要な電流）±標準偏差の計算にその後使用した。
それぞれの治療群に対するデータを、採用したそれぞれの電流レベルで＋及び０の数として記録し、この情報をＣＣ５０値（動物の５０％が発作挙動を発現するのに必要な電流）±標準偏差の計算にその後使用した。
【0090】
６－ＯＨ ＣＢＤＶの有効性についても、媒体対照群からＣＣ５０のパーセンテージ変化として計算した。薬－治療動物と対照間の有意差は、Litchfield and Wilcoxon（１９４９年）によって評価した。
【0091】
結果
以下の表２は、本実施例において得られたデータを示し、図１はこれらの結果を示す。
以下の表２は、本実施例において得られたデータを示し、図１はこれらの結果を示す。
【0092】
媒体群において、ＣＣ５０値は２５．７ｍＡであると計算された。
【0093】
陽性対照ジアゼパム（２．５ｍｇ／ｋｇ）治療群において、試験前３０分のｉ．ｐ．投与で、ＣＣ５０値は５７．５ｍＡであった。バルプロ酸ナトリウム（２５０ｍｇ／ｋｇ）治療群において、試験前３０分のｉ．ｐ．投与で、ＣＣ５０値は２８１．５ｍＡであった。これらの結果は、媒体対照と比較して統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）。
【0094】
６－ＯＨ ＣＢＤＶ治療群において、試験前１５及び３０分のｉ．ｐ．投与、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇの６－ＯＨ ＣＢＤＶの用量で、３種すべて化合物の用量で、媒体と比較して統計的に有意であるＣＣ５０値が得られた。
【0095】
そのようなデータは、この化合物が治療的に有効であることを示唆するものである。
【表3】
【0096】
結論
６－ＯＨ ＣＢＤＶは、ＭＥＳＴにおいて容量依存増加を発現し、この化合物が抗けいれん特性を有する証拠を与える。有意な効果は、媒体と比較した場合に、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで観察された。
６－ＯＨ ＣＢＤＶは、ＭＥＳＴにおいて容量依存増加を発現し、この化合物が抗けいれん特性を有する証拠を与える。有意な効果は、媒体と比較した場合に、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇで観察された。
【0097】
これらのデータは、このカンナビノイドが治療に効果がある可能性がある証拠はこれまで知られていなかったため、重要である。
【図1】
【国際調査報告】