▶ オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-30
(54)【発明の名称】ナノポアを使用する標的ペプチドの特徴付けの方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20230123BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20230123BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230123BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230123BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/34
G01N33/68
C12N15/11
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022531468
(86)(22)【出願日】2020-12-01
(85)【翻訳文提出日】2022-05-27
(86)【国際出願番号】 GB2020053082
(87)【国際公開番号】W WO2021111125
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】1917599.1
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2015479.5
(32)【優先日】2020-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511252899
【氏名又は名称】オックスフォード ナノポール テクノロジーズ ピーエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】ヘロン，アンドリュー ジョン
(72)【発明者】
【氏名】グラハム，ジェームス エドワード
(72)【発明者】
【氏名】ストライチャラスカ，メラニア スラワ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045DA36
4B063QA05
4B063QA11
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX04
(57)【要約】
本明細書で提供されるのは、標的ポリペプチドがナノポアに対して移動するときに標的ポリペプチドを特徴付ける方法である。そのような方法を実行するための関連するキット、システム、および装置も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的ポリペプチドを特徴付ける方法であって、－前記標的ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化して、ポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートを形成することと、
－前記コンジュゲートを、ナノポアに対する前記ポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
－前記コンジュゲートが前記ナノポアに対して移動するときに、前記ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含み、
それにより前記ポリペプチドを特徴付ける、方法。
【請求項2】
前記ナノポアが、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と前記ナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ディスプレーサーユニットを使用して前記ポリペプチドハンドリングタンパク質を前記ナノポアから分離し、それにより前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と前記ナノポアとの間の前記距離を延長することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ディスプレーサーユニットが１つ以上のタンパク質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位から前記ナノポアまでの距離を延長するように修飾されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の前記活性部位と接触している前記コンジュゲートの部分がポリペプチドを含む場合、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記コンジュゲートに結合したままであることが可能である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ポリペプチドを含む前記コンジュゲートの部分と接触するときに、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記コンジュゲートから離脱するのを防ぐように修飾されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ポリヌクレオチド鎖が結合を解くことができる未修飾タンパク質の少なくとも１つのコンフォメーション状態に存在する開口部を完全にまたは部分的に閉じるように修飾されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がヘリカーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記コンジュゲートが複数のポリペプチドセクションおよび／または複数のポリヌクレオチドセクションを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ポリペプチドが２～約５０ペプチド単位の長さを有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ポリペプチドが線形化された形態で保持される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ポリヌクレオチドが約１０～約１０００ヌクレオチドの長さを有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
１つ以上のアダプターおよび／または１つ以上のテザーおよび／または１つ以上のアンカーが、前記コンジュゲート中の前記ポリヌクレオチドに付着している、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアのシス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアのトランス側への前記コンジュゲートの移動を制御するか、またはｉｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記トランス側から前記ナノポアの前記シス側への前記コンジュゲートの前記移動を制御する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアの前記シス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアの前記トランス側への前記ポリヌクレオチドの前記移動を制御し、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチドの前記移動を制御する、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記トランス側から前記ナノポアの前記シス側への前記ポリヌクレオチドの前記移動を制御し、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチドの前記移動を制御する、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記コンジュゲートが、Ｌ－｛Ｐ－Ｎ｝－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
前記方法は、前記リーダー（Ｌ）を前記ナノポアを通してスレッディングし、それにより前記ポリペプチド（Ｐ）を前記ナノポアと接触させることを含み、
ｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記シス側に位置し、前記方法は、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアの前記トランス側への前記ポリヌクレオチド部分（Ｎ）の前記移動を制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチド（Ｐ）の前記移動を制御することを含むか、または
ｉｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記方法は、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記トランス側から前記ナノポアの前記シス側への前記ポリヌクレオチド部分（Ｎ）の前記移動を制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチド（Ｐ）の前記移動を制御する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記コンジュゲートが、Ｌ－Ｐ１－Ｎ－｛Ｐ－Ｎ｝ｎ－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、－ｎは正の整数であり、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｐはポリペプチドであり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
前記方法は、前記リーダー（Ｌ）を前記ナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ１）を前記ナノポアと接触させることを含み、
ｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記シス側に位置し、前記方法は、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアの前記トランス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の前記移動を連続的に制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る各ポリペプチド（Ｐ）の前記移動を連続的に制御することを含むか、または
ｉｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記方法は、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記トランス側から前記ナノポアの前記シス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の前記移動を連続的に制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る各ポリペプチド（Ｐ）の前記移動を連続的に制御することを含む、請求項１８に記載の方法
【請求項20】
ｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアのシス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、前記ナノポアのトランス側から前記ナノポアの前記シス側への前記コンジュゲートの移動を制御するか、またはｉｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアの前記トランス側への前記コンジュゲートの前記移動を制御する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアの前記シス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記トランス側から前記ナノポアの前記シス側への前記ポリヌクレオチドの前記移動を制御し、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチドの前記移動を制御する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアの前記トランス側への前記ポリヌクレオチドの前記移動を制御し、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチドの前記移動を制御する、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記コンジュゲートが、Ｌ－｛Ｐ－Ｎ｝－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、
－ｍは０または１であり、
前記方法は、前記リーダー（Ｌ）を前記ナノポアを通してスレッディングし、それにより前記ポリペプチド（Ｐ）を前記ナノポアと接触させることを含み、
ｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記シス側に位置し、前記方法は、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記トランス側から前記ナノポアの前記シス側への前記ポリヌクレオチド（Ｎ）の前記移動を制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチド（Ｐ）の前記移動を制御することを含むか、または
ｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は前記ナノポアの前記トランス側に位置し、前記方法は、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、前記ナノポアの前記シス側から前記ナノポアの前記トランス側への前記ポリヌクレオチド（Ｎ）の前記移動を制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチド（Ｐ）の前記移動を制御することを含む、請求項１～１４または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記コンジュゲートが、任意選択のリンカーを介して前記ポリペプチドに付着したブロッキング部分を含み、前記方法が、ｉ）前記ブロッキング部分が前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質に対して前記ナノポアの反対側にあるように、前記コンジュゲートを前記ナノポアと接触させることと、
ｉｉ）前記コンジュゲートの前記ポリヌクレオチドを前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ナノポアに対する前記ポリヌクレオチドの前記移動を制御することを可能にし、それにより前記ナノポアを通る前記ポリペプチドの移動を制御することと、
ｉｖ）前記ブロッキング部分が前記ナノポアに接触し、それにより前記ナノポアを通る前記コンジュゲートのさらなる移動を防ぐ場合、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が前記ポリヌクレオチドから一時的に結合を解き、これにより、適用された力の下で、前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御された移動方向と反対方向に前記コンジュゲートが前記ナノポアを通って移動することを可能にすることと、
ｖ）任意選択でステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返して、前記ナノポアを通して前記ポリペプチドを振動させることと、を含む、請求項１～１４または２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記１つ以上の測定が、（ｉ）前記ポリペプチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリペプチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリペプチドの配列、（ｉｖ）前記ポリペプチドの二次構造、および（ｖ）前記ポリペプチドが修飾されているかどうかから選択される、前記ポリペプチドの１つ以上の特徴に特徴的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
狭窄領域を含むナノポアであって、前記ナノポアが、前記狭窄領域と、前記ナノポアと接触しているポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾されている、ナノポア。
【請求項27】
－狭窄領域を含むナノポアと、－ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、
を含むシステムであって、
ｉ）前記ナノポアは、前記ポリヌクレオチドハンドリング酵素が前記ナノポアと接触しているときに、前記狭窄領域と前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を増加させるように修飾されており、かつ／または
ｉｉ）前記システムは、前記ナノポアと前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間に配置され、それにより前記ナノポアと前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の前記活性部位との間の前記距離を延長する、１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む、システム。
【請求項28】
前記ナノポア、コンジュゲートおよび／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質、ならびに任意選択で、存在する場合は前記１つ以上のディスプレーサーユニットが、請求項２～１４のいずれか一項に定義される通りである、請求項２７に記載のシステム。
【請求項29】
－狭窄領域を含むナノポアと、－標的ポリヌクレオチドにコンジュゲート化するための反応性官能基を含むポリヌクレオチドと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、を含む、キット。
【請求項30】
（ｉ）前記ナノポアは、前記ポリヌクレオチドハンドリング酵素が前記ナノポアと接触しているときに、前記狭窄領域と前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾され、かつ／または（ｉｉ）前記キットは、前記ナノポアと前記ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長するための１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
前記ナノポア、ポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質、ならびに任意選択で、存在する場合は前記１つ以上のディスプレーサーユニットが、請求項２～１４のいずれか一項に定義される通りである、請求項２９または３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、標的ポリペプチドとポリヌクレオチドとのコンジュゲートを形成し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用してナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することにより、標的ポリペプチドを特徴付ける方法に関する。本開示はまた、そのような方法を実行するためのキット、システム、および装置に関する。
【背景技術】
【0002】
生物学的分子の特徴付けは、生物医学および生物工学の適用でますます重要になっている。例えば、核酸の配列決定により、ゲノムおよびそれらがコードするタンパク質の研究が可能になり、例えば、核酸変異と疾患徴候などの観察可能な現象との間の関連付けが可能になる。核酸配列決定は、生物間の関係を研究するために進化生物学で使用することができる。メタゲノミクスは、サンプルに存在する生物、例えばマイクロバイオーム中の微生物を同定することを含み、核酸配列決定によりそのような生物の同定が可能になる。ポリヌクレオチドを特徴付ける（例えば配列決定する）技術は広く開発されてきたが、ポリペプチドを特徴付ける技術は、非常に重要な生物工学的重要性があるにもかかわらず、あまり進歩していない。例えば、タンパク質配列の知識により、構造活性相関を確立することができ、特定の受容体のリガンドを開発するための合理的な医薬品開発戦略に影響を及ぼしてきている。翻訳後修飾の同定も、多くのタンパク質の機能特性を理解するための鍵となる。例えば、真核生物では、典型的には、タンパク質種の３０～５０％がリン酸化されている。一部のタンパク質は、タンパク質を活性化もしくは不活性化するか、その分解を促進するか、またはタンパク質パートナーとの相互作用を調節するのに役立つ複数のリン酸化部位を有する場合がある。したがって、タンパク質および他のポリペプチドを特徴付ける方法が差し迫って必要とされている。
【0003】
ポリペプチドを特徴付ける既知の方法には、質量分析およびエドマン分解が含まれる。
【0004】
タンパク質質量分析は、イオン化された形でタンパク質全体またはその断片を特徴付けることを含む。タンパク質質量分析の既知の方法には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれる。質量分析にはいくつかの利点があるが、得られる結果は混入物質の存在によって影響を受ける可能性があり、壊れやすい分子を断片化せずにプロセシングすることは困難な場合がある。さらに、質量分析は単一分子技術ではなく、調査されたサンプルに関するバルク情報のみを提供する。質量分析は、ポリペプチドサンプルの集団内の違いを特徴付けるには不適切であり、隣接する残基を区別しようとする場合には扱いにくい。
【0005】
エドマン分解は、ポリペプチドの残基ごとの配列決定を可能にする質量分析の代替手段である。エドマン分解は、Ｎ末端アミノ酸を連続的に切断し、クロマトグラフィーまたは電気泳動を使用して個々に切断された残基を特徴付けることにより、ポリペプチドを配列決定する。しかしながら、エドマンシーケンシングは遅く、高価な試薬を使用する必要があり、質量分析のように単一分子技術ではない。
【0006】
このように、特に単一分子レベルで、ポリペプチドを特徴付けるための新しい技術の差し迫った必要性がなおある。ポリヌクレオチドなどの生体分子を特徴付けるための単一分子技術は、それらの高い忠実度および増幅バイアスの回避のために特に魅力的であることが証明されている。
【0007】
ポリペプチドなどの生体分子の単一分子特徴付けの魅力的な方法の１つは、ナノポアセンシングである。ナノポアセンシングは、分析物分子とイオン伝導チャネルとの間の個々の結合または相互作用事象の観察に依存する分析物の検出および特徴付けへのアプローチである。ナノポアセンサーは、ナノメートル寸法の単一ポアを絶縁膜内に置き、分析物分子の存在下でポアを通る電圧駆動イオン電流を測定することによって作製することができる。ナノポアの内部または近くに分析物が存在する場合、ポアを通るイオン流が変化し、チャネルにわたって測定されるイオン電流または電流の変化がもたらされるであろう。分析物の同一性は、その特有の電流シグネチャ、とりわけ電流ブロックの期間および程度、ならびにポアとの相互作用時間中の電流レベルの変動を通して明らかになる。ナノポアセンシングは、迅速かつ安価なポリペプチドの特徴付けを可能にする潜在能力を有する。
【0008】
ポリペプチドのナノポアセンシングおよび特徴付けが当技術分野で提案されている。例えば、ＷＯ２０１３／１２３３７９は、ＮＴＰ駆動型タンパク質プロセシングアンフォルダーゼ（ｕｎｆｏｌｄａｓｅ）酵素を使用し、タンパク質をプロセシングしてナノポアを通って転座させることを開示している。しかしながら、ポリペプチドを特徴付ける代替のおよび／または改善された方法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【0009】
本開示は、標的ポリペプチドを特徴付ける方法に関する。この方法は、標的ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化して、ポリペプチド－ポリヌクレオチドコンジュゲートを形成することを含む。この方法は、コンジュゲートをポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることを含む。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができる。コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定が行われる。このようにして、コンジュゲートに含まれる標的ポリペプチドが特徴付けられる。
【0010】
したがって、本明細書で提供されるのは、標的ポリペプチドを特徴付ける方法であって、
－標的ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化して、ポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートを形成することと、
－コンジュゲートを、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
－コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含み
それによりポリペプチドを特徴付ける、方法である。
－標的ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化して、ポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートを形成することと、
－コンジュゲートを、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
－コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含み
それによりポリペプチドを特徴付ける、方法である。
【0011】
いくつかの実施形態では、ナノポアは狭窄領域を有する。いくつかの実施形態において、ナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ディスプレーサーユニットを使用してナノポアから分離され、それによりポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位とナノポアとの間の距離を延長する。いくつかの実施形態では、ディスプレーサーユニットは、１つ以上のタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位からナノポアまでの距離を延長するように修飾される。
【0012】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位と接触しているコンジュゲートの部分がポリペプチドを含む場合、コンジュゲートに結合したままであることが可能である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリペプチドを含むコンジュゲートの部分と接触するときに、それがコンジュゲートから離脱するのを防ぐように修飾される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチド鎖が結合を解くことができる未修飾タンパク質の少なくとも１つのコンフォメーション状態に存在する開口部を完全にまたは部分的に閉じるように修飾される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はヘリカーゼである。
【0013】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、複数のポリペプチドセクションおよび／または複数のポリヌクレオチドセクションを含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、２～約５０ペプチド単位の長さを有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、線形化された形態で保持される。
【0015】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１０～約１０００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアダプターおよび／または１つ以上のテザーおよび／または１つ以上のアンカーが、コンジュゲート中のポリヌクレオチドに付着している。
【0016】
開示される方法のいくつかの実施形態において、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御するか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御する。
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御するか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御する。
【0017】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。
【0018】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、Ｌ－｛Ｐ－Ｎ｝－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチド部分（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含むか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチド部分（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチド部分（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含むか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチド部分（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、Ｌ－Ｐ１－Ｎ－｛Ｐ－Ｎ｝ｎ－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、
－ｎは正の整数であり、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｐはポリペプチドであり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ１）をナノポアと接触させることを含み、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を連続的に制御することを可能にし、それによりナノポアを通る各ポリペプチド（Ｐ）の移動を連続的に制御することを含むか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を連続的に制御することを可能にし、それによりナノポアを通る各ポリペプチド（Ｐ）の移動を連続的に制御することを含む。
－ｎは正の整数であり、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｐはポリペプチドであり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ１）をナノポアと接触させることを含み、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を連続的に制御することを可能にし、それによりナノポアを通る各ポリペプチド（Ｐ）の移動を連続的に制御することを含むか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を連続的に制御することを可能にし、それによりナノポアを通る各ポリペプチド（Ｐ）の移動を連続的に制御することを含む。
【0020】
開示される方法のいくつかの実施形態において、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御するか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御する。
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御するか、または
ｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御する。
【0021】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。
【0022】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、Ｌ－｛Ｐ－Ｎ｝－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含むか、または
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み、
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含むか、または
ｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、任意選択のリンカーを介してポリペプチドに付着したブロッキング部分を含み、方法は、
ｉ）ブロッキング部分がポリヌクレオチドハンドリングタンパク質に対してナノポアの反対側にあるように、コンジュゲートをナノポアと接触させることと、
ｉｉ）コンジュゲートのポリヌクレオチドをポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
ｉｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御することと、
ｉｖ）ブロッキング部分がナノポアに接触し、それによりナノポアを通るコンジュゲートのさらなる移動を防ぐ場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドから一時的に結合を解き、これにより、適用された力の下で、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御された移動方向と反対方向にコンジュゲートがナノポアを通って移動することを可能にすることと、
ｖ）任意選択でステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返して、ナノポアを通してポリペプチドを振動させることと、を含む。
ｉ）ブロッキング部分がポリヌクレオチドハンドリングタンパク質に対してナノポアの反対側にあるように、コンジュゲートをナノポアと接触させることと、
ｉｉ）コンジュゲートのポリヌクレオチドをポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
ｉｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御することと、
ｉｖ）ブロッキング部分がナノポアに接触し、それによりナノポアを通るコンジュゲートのさらなる移動を防ぐ場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドから一時的に結合を解き、これにより、適用された力の下で、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御された移動方向と反対方向にコンジュゲートがナノポアを通って移動することを可能にすることと、
ｖ）任意選択でステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返して、ナノポアを通してポリペプチドを振動させることと、を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、１つ以上の測定は、（ｉ）ポリペプチドの長さ、（ｉｉ）ポリペプチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリペプチドの配列、（ｉｖ）ポリペプチドの二次構造および（ｖ）ポリペプチドが修飾されているかどうかから選択されるポリペプチドの１つ以上の特徴に特徴的である。
【0025】
狭窄領域を含むナノポアも本明細書で提供され、このナノポアは、狭窄領域と、ナノポアと接触しているポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾されている。
【0026】
また、提供されるのは、
－狭窄領域を含むナノポアと、
－ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、
を含むシステムであって、
ｉ）このナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素がナノポアと接触しているときに、狭窄領域とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を増加させるように修飾され、かつ／または
ｉｉ）このシステムは、ナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間に配置され、それによりナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長する、１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む。
－狭窄領域を含むナノポアと、
－ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、
を含むシステムであって、
ｉ）このナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素がナノポアと接触しているときに、狭窄領域とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を増加させるように修飾され、かつ／または
ｉｉ）このシステムは、ナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間に配置され、それによりナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長する、１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、ナノポア、コンジュゲートおよび／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質、ならびに任意選択で、存在する場合、１つ以上のディスプレーサーユニットは、本明細書で定義される通りである。
【0028】
また、提供されるのは、
－狭窄領域を含むナノポアと、
－標的ポリヌクレオチドにコンジュゲート化するための反応性官能基を含むポリヌクレオチドと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、を含む、キットである。
－狭窄領域を含むナノポアと、
－標的ポリヌクレオチドにコンジュゲート化するための反応性官能基を含むポリヌクレオチドと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、を含む、キットである。
【0029】
いくつかの実施形態において、（ｉ）このナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素がナノポアと接触している場合、狭窄領域とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾され、かつ／または（ｉｉ）このキットは、ナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長するための１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む。いくつかの実施形態において、ナノポア、ポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質、ならびに任意選択で、存在する場合、１つ以上のディスプレーサーユニットは、本明細書で定義される通りである。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】ナノポアのシス側のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ポリペプチドにコンジュゲート化されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ２）を含むコンジュゲートのナノポアのシス側からナノポアのトランス側への移動を制御し、したがって、ポリペプチドがナノポアに対して移動するときにポリペプチドを特徴付けることを可能にする、開示される方法の実施形態の非限定的な例を示す概略図。示されているように、任意選択のリーダー（ＤＮＡ１）がコンジュゲートに付着して、ナノポアを通るポリペプチドのスレッディングを促進する。ＲＥＤ（本明細書で考察される）は、ナノポア中の狭窄とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の概念的な距離として示されている。（Ａ）基質は、膜のトランス側に例えば正の電圧を印加することにより、例えば膜のシス側からナノポアに捕捉され得る。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドセクションに沿って点線の矢印で示される方向に移動し、基質をポアに供給し、状態（Ｂ）に進む。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドに沿って移動するにつれて（例えば、１ヌクレオチド燃料駆動ステップで）、コンジュゲートがナノポア内に供給され、ペプチドセクションがナノポアを通過する。
【図2】図１に示す一般的なセットアップの実施形態を示す概略図。この非限定的な例では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、まず、コンジュゲートのポリヌクレオチド部分（ＤＮＡ）のスペーサー（Ｘ）で失速する。アダプターは、コンジュゲートのポリヌクレオチド部分に付着しており、それにテザーが付着して、特徴付けのためにナノポア領域の膜にコンジュゲートを局在化させる。ステップ（Ａ）および（Ｂ）は、図１で説明した通りである。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドをプロセシングするとき、このタンパク質がアダプターを置換し得る。
【図3】図１に示す一般的なセットアップのさらなる実施形態を示す概略図。この非限定的な例において、コンジュゲートは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の制御下でナノポアを通って連続的に移動される複数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドセクションを含む。示されているように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、まず、コンジュゲートの第１のポリヌクレオチド部分（ＤＮＡ１）上に装填され、コンジュゲートのその部分を、ナノポアを通して移動させる。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートから解離することなく、コンジュゲートの第１のポリペプチドセクションをナノポアを通して通過させる。次に、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートの第２のポリヌクレオチド部分（ＤＮＡ２）と接触し、ナノポアを通るその移動を制御する。さらなるポリペプチドおよびポリヌクレオチド部分（未提示）は、ナノポアに対して同様に連続的に移動し得る。
【図4-1】図３に記載された実施形態で使用するための基質の非限定的な例を示す概略図。Ａ：コンジュゲートの第１のポリヌクレオチド部分（ＤＮＡ１）は、ナノポアでの捕捉を促進するリーダー（点線）を備えたシーケンシングＹアダプターと、ナノポアの領域にコンジュゲートを局在化させるための膜へのテザリングを可能にするテザーと、スペーサー（Ｘ）によって失速したポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とを含む。示されているように、コンジュゲートのポリヌクレオチド部分は二本鎖ＤＮＡを含む。Ｂ：（Ａ）に示される基質の実施形態の変形。テザー（または追加のテザー）を、コンジュゲートの第２のポリヌクレオチド部分（ＤＮＡ２）に配置できる。「トップ」と「ボトム」の表記は、純粋に理解を容易にするためのものである。Ｃ：４（Ａ）に示される基質を使用する本発明の方法を示す概略図。
【図5】開示される方法で使用するための基質のさらなる非限定的な例を示す概略図。コンジュゲートは、複数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドセクション（ｎ＞０）を含み得、これらは、本明細書に記載されるように、ナノポアによる特徴付けのためにポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって連続的にプロセシングされ得る。
【図6】ナノポアのシス側のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ポリペプチドにコンジュゲート化されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ２）を含むコンジュゲートのナノポアのトランス側からナノポアのシス側への移動を制御し、したがって、ポリペプチドがナノポアに対して移動するときにポリペプチドを特徴付けることを可能にする、開示される方法の実施形態の非限定的な例を示す概略図。示されているように、任意選択のリーダーがコンジュゲートに付着して、ナノポアを通るポリペプチドの最初のスレッディングを促進する。（Ａ）基質は、膜のトランス側に例えば正の電圧を印加することにより、例えば膜のシス側からナノポアに捕捉され得る。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドセクションに沿って点線の矢印で示される方向に移動して、基質をポアから外に移動させ、状態（Ｂ）に進む。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドに沿って移動するにつれて（例えば、１ヌクレオチド燃料駆動ステップで）、このタンパク質はコンジュゲートをナノポアから追い出す。したがって、コンジュゲートのポリペプチドセクションは、ナノポア（状態Ｃ）を通過し、したがって特徴付けられる。
【図7】ナノポアと接触したときにナノポアを通るコンジュゲートの移動を防ぐブロッキング部分（黒い四角）の使用の非限定的な例を示す概略図。示されるような非限定的な例において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートのポリヌクレオチド部分の伸長によってコンジュゲートの移動を制御することができるポリメラーゼである。鎖の伸長は、ブロッキング部分がナノポアに到達するまで続く可能性がある。新たに合成された鎖の解離により、コンジュゲートはナノポアを通ってシスからトランスに戻ることができ、ポリヌクレオチドは、コンジュゲートのナノポアを通るトランスからシスへの移動を再循環させることができる。このようにして、コンジュゲートを、ナノポアを通して「フロス」することができる。他のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、類似の方法で使用することができる。
【図8】ナノポア（例えば、ナノポア内の狭窄）と、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用されるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を増加させるための戦略の非限定的な例を示す概略図。Ａ：未修飾のＲＥＤを示す未修飾のポアの概略図。Ｂ：ＲＥＤを拡張するためにナノポアを修飾し得る。Ｃ：ディスプレーサーユニットを使用して、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質をナノポアから置換し、こうしてＲＥＤを拡張することができる。Ｄ：複数のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用して、ナノポアに対するコンジュゲートのナノポアからの移動を制御する活性ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を置換することができる。これらの実施形態は、本明細書でより詳細に記載されている。
【図9】わかりやすくするために、対応する構築物の模式図を使用した実施例１の代表的な電流対時間のトレース。状態Ａ～Ｄは、図４Ｆで説明されている状態に対応する。Ａ－ナノポアによるリーダー鎖の捕捉、Ｂ－ナノポアリーダーヘッド（ＲＥＤ）を横切るＹアダプターの転座、Ｃ－ＲＥＤを横切るポリペプチドの転座、Ｄ－ポリヌクレオチドテール（ＤＮＡ２）の転座。第１のトレースは、Ｙアダプターのみの部分的な転座事象（状態ＡおよびＢのみ）を表す一方、第２のトレースは、ナノポアを横切るコンジュゲート化ポリヌクレオチド－ポリペプチド全体の転座を示す。実施例１に記載されるように得られたデータ（配列番号２０の配列のペプチドを含むポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートに関するこのデータ）。
【図10】データ収集のハイスループットを示す電流対時間のトレース。３秒間の期間に、５つの捕捉事象があり、４つは完全なポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートに対応する（事象３はＹアダプターのみの部分的な転座である）。実施例１に記載のデータ（配列番号２０の配列のペプチドを含むポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートに関するこのデータ）。
【図11】ペプチド配列ＧＧＳＧＲＲＳＧＳＧ（配列番号２１）に対応する、図４Ｂおよび実施例１に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの転座の電流トレース。Ａ：図４および図９で説明されている状態に関して整列されたトレースの１１の例。Ｂ：同じ１１のトレースのオーバーレイ。Ｃ：主要なトレース特徴の最適な整列を促進する動的時間伸縮アルゴリズムを使用した、時間軸の正規化を示す、１１のトレース例の積み上げプロット。
【図12】ペプチド配列ＧＧＳＧＹＹＳＧＳＧ（配列番号２２）に対応する図４Ｂおよび実施例１に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの転座の電流トレース。Ａ：図４および図９で説明されている状態に関して整列しているトレースの１２の例。Ｂ：同じ１２のトレースのオーバーレイ。Ｃ：１２のトレース例の積み上げプロット。
【図13】ペプチド配列ＧＧＳＧＤＤＳＧＳＧ（配列番号２０）に対応する、図４Ｂおよび実施例１に記載のポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの転座の電流トレース。Ａ：図４および図９で説明されている状態に関して整列しているトレースの１１の例。Ｂ：同じ１１のトレースのオーバーレイ。Ｃ：１１のトレース例の積み上げプロット。
【図14】配列番号２２のペプチドを使用して得られた構築物の概略構造。配列番号１１、１２および１３のポリヌクレオチド鎖を含むＹアダプター；ならびに配列番号１４および１６のポリヌクレオチド鎖を含むポリヌクレオチドテール（実施例１に記載）。
【図15】実施例１と比較した実施例２の代表的な電流対時間のトレース。状態Ａ～Ｄは、図４Ｆで説明されている状態に対応する。Ａ－ナノポアによるリーダー鎖の捕捉、Ｂ－ナノポアリーダーヘッド（ＲＥＤ）を横切るＹアダプターの転座、Ｃ－ＲＥＤを横切るポリペプチドの転座、Ｄ－ポリヌクレオチドテール（ＤＮＡ２）の転座。上部パネルのトレースは、実施例１のプロトコルに従って収集された（合成中に事前に修飾されたペプチドを使用）。下部パネルのトレースは、実施例２のプロトコルに従ってコンジュゲート化されたポリヌクレオチド－ポリペプチドの転座を示す（配列番号２３の未修飾ペプチド；すなわち、実施例１の対応するトレースと同じ配列を使用）。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、特定の実施形態に関して、かつある特定の図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲内のいずれの参照符号も、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。言うまでもなく、必ずしもすべての態様または利点が本発明のいずれかの特定の実施形態に従って達成され得るとは限らないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者であれば、本明細書で教示または示唆され得る他の態様または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示される１つの利点または一群の利点を達成または最適化する様式で本発明が具体化または実行され得ることを認識するであろう。
【0032】
本発明は、編成および動作方法の両方に関して、その特徴および利点とともに、添付の図面と併せて読まれたときに以下の発明を実施するための形態を参照することにより最もよく理解され得る。本発明の態様および利点は、以下に記載の実施形態を参照して明らかになり、解明されるであろう。本明細書を通して「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な場所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべて同じ実施形態を指すとは限らないが、そうである場合もある。同様に、本発明の例示的な実施形態の説明では、本開示を簡素化し、かつ様々な発明態様のうちの１つ以上の理解を支援するために、本発明の様々な特徴が、単一の実施形態、図、またはそれらの説明にまとめられることもあることを理解されたい。しかしながら、本開示の方法は、特許請求される発明が各々の特許請求項に明示的に列挙されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するものと解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、発明態様は、単一の前述の開示される実施形態のすべての特徴に満たない。
【0033】
文脈が別途指示しない限り、本開示の「実施形態」が具体的に一緒に組み合わせられ得ることを理解されたい。すべての開示される実施形態の特定の組み合わせは（文脈により別途暗示されない限り）、特許請求される発明のさらに開示された実施形態である。
【0034】
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「モータータンパク質」への言及は２つ以上のかかるタンパク質を含み、「ヘリカーゼ」への言及は２つ以上のヘリカーゼを含み、「モノマー」への言及は２つ以上のモノマーを指し、「ポア」への言及は２つ以上のポアを含む。
【0035】
上記または下記の本明細書で引用されるすべての出版物、特許、および特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0036】
定義
単数名詞を指すときに不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、他のことが明記されない限り、これは、その名詞の複数形を含む。「含む」という用語が本説明および特許請求の範囲で使用される場合、これは、他の要素またはステップを除外しない。さらに、本説明および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも起こった順序または経時的順序を説明するために使用されるとは限らない。そのように使用されるそれらの用語が適切な状況下で交換可能であり、かつ本明細書に記載される本発明の実施形態が本明細書に記載または例証される順序以外の順序で動作可能であることを理解されたい。以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためのみに提供される。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者が理解する意味と同じ意味を有する。熟練者は、定義および技術用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）を参照する。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解される範囲よりも狭いと解釈されるべきではない。
単数名詞を指すときに不定冠詞または定冠詞、例えば、「ａ」または「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、他のことが明記されない限り、これは、その名詞の複数形を含む。「含む」という用語が本説明および特許請求の範囲で使用される場合、これは、他の要素またはステップを除外しない。さらに、本説明および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも起こった順序または経時的順序を説明するために使用されるとは限らない。そのように使用されるそれらの用語が適切な状況下で交換可能であり、かつ本明細書に記載される本発明の実施形態が本明細書に記載または例証される順序以外の順序で動作可能であることを理解されたい。以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためのみに提供される。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者が理解する意味と同じ意味を有する。熟練者は、定義および技術用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）を参照する。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解される範囲よりも狭いと解釈されるべきではない。
【0037】
量および時間的持続時間などの測定可能な値を指す際に本明細書で使用される「約」は、指定された値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、なおより好ましくは±０．１％の変動を包含するよう意図されており、かかる変動は開示される方法を行うのに適切である。
【0038】
本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、または「核酸分子」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、その分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本明細書で使用される「核酸」という用語は、各ヌクレオチドの３’末端および５’末端がホスホジエステル結合によって連結されている、一本鎖または二本鎖の共有結合したヌクレオチド配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基で構成されていてもリボヌクレオチド塩基で構成され得る。核酸は、インビトロで合成的に製造され得るか、または天然源から単離され得る。核酸には、修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えば、メチル化されているＤＮＡもしくはＲＮＡ、または翻訳後修飾、例えば、７－メチルグアノシンでの５’－キャッピング、切断およびポリアデニル化などの３’－プロセシング、ならびにスプライシングに供されているＲＮＡがさらに含まれ得る。核酸には、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成核酸（ＸＮＡ）も含まれ得る。本明細書で「ポリヌクレオチド」とも称される核酸のサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの塩基対（ｂｐ）の数で、または一本鎖ポリヌクレオチドの場合にはヌクレオチド（ｎｔ）の数で表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、キロベース（ｋｂ）に相当する。約４０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と呼ばれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによるＤＮＡの操作に使用するためのプライマーを含み得る。
【0039】
本開示との関連での「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、各アミノ酸に特異的な側鎖（例えば、Ｒ基）とともに、アミン（ＮＨ２）およびカルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基を含む有機化合物を含むよう意図されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するＬ α－アミノ酸または残基を指す。天然に存在するアミノ酸について一般に使用される１文字および３文字略語：Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、およびＹ＝Ｔｙｒが本明細書で使用される（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ ｅｄ．，ｐｐ．７１－９２，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。「アミノ酸」という一般用語は、Ｄ－アミノ酸、レトロ－インベルソアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体などの化学的に修飾されたアミノ酸、ノルロイシンなどのタンパク質に通常組み込まれない天然に存在するアミノ酸、およびβ－アミノ酸などのアミノ酸の特徴を示す当該技術分野で既知の特性を有する化学的に合成された化合物をさらに含む。例えば、天然ＰｈｅまたはＰｒｏと同じペプチド化合物の立体構造上の制限を可能にするフェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣物は、アミノ酸の定義内に含まれる。かかる類似体および模倣物は、本明細書でそれぞれのアミノ酸の「機能的等価物」と称される。アミノ酸の他の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５ ｐ．３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．１９８３により挙げられる。
【0040】
「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基のポリマー、ならびにその変異形および合成類似体を指すために、本明細書で互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体などの天然に存在しない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、グリコシル化、タンパク質分解的切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化などを含み得るが、これらに限定されない、成熟または翻訳後修飾プロセスも受け得る。ペプチドは、組換え技法を使用して、例えば、組換えまたは合成ポリヌクレオチドの発現により作製され得る。組換えにより産生されたペプチドは、典型的には、培養培地を実質的に含まず、例えば、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。
【0041】
「タンパク質」という用語は、二次または三次構造を有する折り畳まれたポリペプチドを説明するために使用される。タンパク質は、単一のポリペプチドから構成され得るか、または集合して多量体を形成する複数のポリペプチドを含み得る。多量体は、ホモオリゴマーであってもヘテロオリゴマーであってもよい。タンパク質は、天然に存在するタンパク質または野生型タンパク質であってもよく、または修飾されたタンパク質もしくは天然に存在しないタンパク質であってもよい。タンパク質は、例えば、１つ以上のアミノ酸の付加、置換、または欠失が野生型タンパク質とは異なり得る。
【0042】
タンパク質の「変異形」は、問題となっている未修飾または野生型タンパク質と比較してアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を有し、かつそれらが由来する未修飾タンパク質と類似の生物学的および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含する。本明細書で使用される「アミノ酸同一性」という用語は、配列が比較ウィンドウにわたってアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列を比較し、同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列に生じる位置の数を決定して一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。
【0043】
本発明のすべての態様および実施形態について、「変異形」は、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％完全な配列同一性を有する。配列同一性は、完全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの断片または部分に対するものである場合もある。したがって、配列は、完全長参照配列と全体的に５０％のみの配列同一性を有し得るが、特定の領域、ドメイン、またはサブユニットの配列は、参照配列と８０％、９０％、または９９％もの配列同一性を共有し得る。
【0044】
「野生型」という用語は、天然に存在する源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、ある集団で最も頻繁に観察され、したがって、その遺伝子の任意に設計された「正常」または「野生型」形態である。対照的に、「修飾された」、「変異体」、または「変異形」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して、配列の修飾（例えば、置換、切断、もしくは挿入）、翻訳後修飾、および／または機能的特性（例えば、改変された特徴）を呈する遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する変異体を単離することができることに留意されたく、これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して改変された特徴を有するという事実によって特定される。天然に存在するアミノ酸を導入または置換するための方法が当該技術分野で周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド中の関連する位置でメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＣＧＴ）に置き換えることにより、アルギニン（Ｒ）で置換され得る。天然に存在しないアミノ酸を導入または置換するための方法も当該技術分野で周知である。例えば、天然に存在しないアミノ酸は、変異体モノマーを発現させるために使用されるＩＶＴＴ系中に合成アミノアシル－ｔＲＮＡを含めることによって導入され得る。あるいは、それらは、特定のアミノ酸の合成（すなわち、天然に存在しない）類似体の存在下で、それらの特定のアミノ酸に対して栄養要求性であるＥ．ｃｏｌｉ中で変異体モノマーを発現させることによって導入され得る。それらは、変異体モノマーが部分的ペプチド合成を使用して産生される場合、ネイキッドライゲーション（ｎａｋｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって生成される場合もある。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、または荷電性を有し得る。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野で周知であり、以下の表１に定義される２０個の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これはまた表２におけるアミノ酸側鎖の疎水性スケールを参照して決定し得る。
【表1】
【表2】
【0045】
変異体または修飾タンパク質、モノマー、またはペプチドは、任意の方法および任意の部位で化学的に修飾することもできる。変異体または修飾モノマーまたはペプチドは、好ましくは、１つ以上のシステインへの分子の付着（システイン結合）、１つ以上のリジンへの分子の付着、１つ以上の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾によって化学的に修飾される。かかる修飾を実行するための好適な方法が当該技術分野で周知である。修飾タンパク質、モノマー、またはペプチドの変異体は、任意の分子の付着によって化学的に修飾され得る。例えば、修飾タンパク質、モノマー、またはペプチドの変異体は、色素またはフルオロフォアの付着によって化学的に修飾され得る。
【0046】
開示される方法
本開示は、ポリヌクレオチドとコンジュゲートを形成し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用してナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することにより、ポリペプチドを特徴付ける方法に関する。
本開示は、ポリヌクレオチドとコンジュゲートを形成し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用してナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することにより、ポリペプチドを特徴付ける方法に関する。
【0047】
ポリペプチドハンドリング酵素を使用してナノポアに対するポリペプチドの移動を制御しようとする方法とは対照的に、本開示の方法は、ポリヌクレオチドハンドリング酵素を使用してナノポアに対してポリペプチドの移動を制御することを可能にする。
【0048】
本明細書に開示される方法は、ポリヌクレオチドだけを含むのではないコンジュゲートの移動を制御するポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の能力を利用する。特に、ポリペプチドを含むコンジュゲートは、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用して制御された方式で移動され得る。開示される方法での使用に適したポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、本明細書でより詳細に記載されている。
【0049】
したがって、本明細書で提供されるのは、標的ポリペプチドを特徴付ける方法であって、
－標的ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化して、ポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートを形成することと、
－コンジュゲートを、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
－コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含み、
それによりポリペプチドを特徴付ける、方法である。
－標的ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化して、ポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートを形成することと、
－コンジュゲートを、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
－コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含み、
それによりポリペプチドを特徴付ける、方法である。
【0050】
任意の適切なポリペプチドは、本明細書に開示される方法を使用して特徴付けることができる。いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドは、タンパク質または天然に存在するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、合成ポリペプチドである。開示される方法に従って特徴付けることができるポリペプチドは、本明細書でより詳細に記載されている。
【0051】
本明細書に開示される方法で使用するためのコンジュゲートを形成する際に、任意の適切なポリヌクレオチドを使用することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、特徴付けられるべき標的ポリペプチドの部分と少なくとも同じ長さを有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、特徴付けられるべき標的ポリペプチドの部分よりも長い長さを有する。これは、以下でより詳しく考察される。開示される方法での使用に適したポリヌクレオチドは、本明細書でより詳細に開示されている。
【0052】
開示される方法において、標的ポリペプチドは、任意の適切な手段を使用してポリヌクレオチドにコンジュゲート化され得る。いくつかの例示的な手段が本明細書でより詳細に記載されている。
【0053】
開示される方法で形成されたコンジュゲートは、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させられる。例示的なポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、本明細書でより詳細に記載されている。
【0054】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御する。したがって、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御する。開示される方法では、任意の適切なナノポアを使用することができる。開示される方法での使用に適したナノポアは、本明細書でより詳細に記載されている。
【0055】
開示される方法は、コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことを含む。１つ以上の測定は、任意の適切な測定であり得る。典型的には、１つ以上の測定は電気的測定、例えば電流測定、および／または１つ以上の光学的測定である。適切な測定を記録するための装置、およびそのような測定が提供できる情報は、本明細書でより詳細に記載されている。
【0056】
標的ポリペプチドの特徴付け
本明細書に開示されるように、ポリヌクレオチドは、ナノポアに対するポリペプチドの移動を制御するために使用され得る。ポリヌクレオチドの移動は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御される。ポリヌクレオチドはコンジュゲート中のポリペプチドにコンジュゲート化されているため、ポリヌクレオチドの移動はポリペプチドの移動を駆動する。
本明細書に開示されるように、ポリヌクレオチドは、ナノポアに対するポリペプチドの移動を制御するために使用され得る。ポリヌクレオチドの移動は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御される。ポリヌクレオチドはコンジュゲート中のポリペプチドにコンジュゲート化されているため、ポリヌクレオチドの移動はポリペプチドの移動を駆動する。
【0057】
ポリヌクレオチドの移動、したがってポリペプチドの移動を制御するためのポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の使用は、当技術分野で知られているポリペプチドを特徴付けるための方法と比較した利点と関連し得る。例として、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリペプチドハンドリング酵素と比較してより高い代謝回転率でポリヌクレオチドのハンドリングをプロセシングすることができる。これは、以前に知られている方法と比較して、開示される方法に従って特徴付けられたポリペプチドについて、特徴付けデータがより迅速に得られ得ることを意味する。
【0058】
これらおよび他の利点は、本開示を通して明らかになるであろう。
【0059】
本開示の方法を開発する際に、本発明者らは、より短いバレルまたはチャネルを有するナノポアと比較して、より長いバレルまたはチャネルを有するナノポアが使用される場合、特徴付けられ得るポリペプチドの長さが典型的には改善されることを見出している。理論に拘束されることなく、本発明者らは、これは、開示される方法のようにポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と組み合わせて使用される場合、より長いバレルまたはチャネルを有するポアが、より短いバレルまたはチャネルを有するポアよりも、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位とナノポア中の狭窄との間のより長い距離をもたらすためである可能性があると考える。この距離は、ＲＥＤ（リーダー－酵素距離）と呼ばれ得る。当業者は、（以下で考察されるように）ナノポアの形態が限定的ではないことを理解するであろう。ナノポアは、タンパク質ナノポアまたは固体ナノポアであり得る。ナノポアがナノポアのチャネル内に狭窄を有しない場合、本明細書で使用される狭窄は、例えば、一実施形態では、ナノポアの開口部で同定され得る。
【0060】
理論に拘束されることなく、ナノポアによって特徴付けられ得るコンジュゲート内のポリペプチドの部分の長さは、ＲＥＤに対応するか、またはＲＥＤによって決定され得ると推測される。言い換えれば、ナノポアは読み取りヘッドを含み得、１つ以上の測定は、ポリペプチドの「読み取り部分」に特徴的であり、読み取り部分の長さは、読み取りヘッドとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離に対応するか、またはそれにより決定される。
【0061】
これを考慮して、開示される方法のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、特徴付けられるべき標的ポリペプチドの部分と少なくとも同じ長さを有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、特徴付けられるべき標的ポリペプチドの部分よりも長い長さを有する。これにより、特徴付けられ得るポリペプチド部分の長さが、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が移動を制御するためのポリヌクレオチドの量によって制限されないことが保証される。
【0062】
この方法は、開示される方法の１つの非限定的な例を示す図１を参照することによって理解され得る。コンジュゲートは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含み得、ポリペプチドがナノポアをスレッディングするように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させられる。例示される実施形態では、さらなるポリヌクレオチドを使用して、ナノポアを通るポリペプチドのスレッディングを促進する。そのような使用は開示される方法の範囲内であるが、これは必須ではない。
【0063】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリペプチドにコンジュゲート化されたポリヌクレオチドをプロセシングする。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドをプロセシングするとき、コンジュゲートはナノポアを通過し、したがってポリペプチドはナノポアを通過する。ポリペプチドがナノポアを通過するとき、ポリペプチドは特徴付けられる。
【0064】
図１に示す例では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の「視点」から、コンジュゲートをポアの「中」に移動させる。例えば、示されているように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側に位置し、コンジュゲートをポア内に、すなわちシス側からトランス側に移動させる。反対の設定も使用され得る。
【0065】
言い換えれば、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御する。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。
【0066】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御する。したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。
【0067】
本明細書で説明されるように、コンジュゲートはリーダーを含み得る。本明細書で説明されるように、任意の適切なリーダーを使用することができる。場合により、リーダーはポリヌクレオチドであり得る。リーダーは、コンジュゲート中のポリヌクレオチドと同じであっても、異なっていてもよい。上で説明したように、リーダーは、ナノポアを通るコンジュゲートのスレッディングを促進し得る。
【0068】
言い換えれば、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、Ｌ－｛Ｐ－Ｎ｝－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み得る。
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み得る。
【0069】
いくつかのそのような実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチド部分（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。他の実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチド部分（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。
【0070】
本明細書でより詳細に説明されるように、コンジュゲートは、１つ以上のアダプターおよび／またはアンカーを含み得る。このような設定の非限定的な例を図２に示す。
【0071】
本明細書でより詳細に説明されるように、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、複数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む。そのような実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を連続的に制御し、したがって、ナノポアに対してポリペプチドを連続的に移動させる。このようにして、コンジュゲート内の各ポリペプチドは、開示される方法において連続的に特徴付けられ得る。
【0072】
例えば、コンジュゲートは、Ｌ－Ｐ１－Ｎ－｛Ｐ－Ｎ｝ｎ－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み得、
－ｎは正の整数であり、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｐはポリペプチドであり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ１）をナノポアと接触させることを含み得る。
－ｎは正の整数であり、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｐはポリペプチドであり、
－同じであっても異なっていてもよい各Ｎはポリヌクレオチドを含み、かつ
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ１）をナノポアと接触させることを含み得る。
【0073】
典型的には、そのような実施形態では、ｎは１～約１０００、例えば２～約１００、例えば約３～約１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
【0074】
いくつかのそのような実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を連続的に制御することを可能にし、それにより各ポリペプチド（Ｐ）がナノポアを連続的に通過する移動を制御することを含む。他のそのような実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側への各ポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を連続的に制御することを可能にし、それにより各ポリペプチド（Ｐ）がナノポアを連続的に通過する移動を制御することを含む。
【0075】
当業者は、コンジュゲートが１つより多いポリペプチドを含む場合、（本明細書でより詳細に記載されるように）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ポリペプチドと接触するときに解離せずにコンジュゲートに結合したままであり得ることが有利であり得ることを理解するであろう。例えば、図３に示すように、これにより、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために、ポリヌクレオチドの連続した部分上を移動するため、コンジュゲート中のポリペプチド部分に接触するにつれて、それらを通過することが可能になる。
【0076】
図３に示される実施形態によるより複雑な設定の非限定的な例が図４に示され、この図では、ポリペプチドの特徴付けを促進するために様々なアダプターおよびテザーが使用される。図５に概略的に示されるように、当業者は複数のそのようなセクションを組み込むことができることを理解するであろうが、ただ１つのポリペプチドセクションが図４に示されている。
【0077】
開示される方法の別の非限定的な実施形態が図６に概略的に示されている。コンジュゲートは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含み得、ポリペプチドがナノポアをスレッディングするように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させられる。図示の実施形態では、リーダー（任意選択でさらなるポリヌクレオチドである）を使用して、ナノポアを通るポリペプチドのスレッディングを促進する。そのような使用は開示される方法の範囲内であるが、これは必須ではない。
【0078】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリペプチドにコンジュゲート化されたポリヌクレオチドをプロセシングする。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドをプロセシングするとき、コンジュゲートはナノポアを通過し、したがってポリペプチドはナノポアを通過する。ポリペプチドがナノポアを通過するとき、ポリペプチドは特徴付けられる。
【0079】
図６に示す例では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の「視点」から、コンジュゲートをポアの「外」に移動させる。例えば、示されているように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、コンジュゲートをポア内に、すなわちトランス側からシス側に移動させる。反対の設定も使用され得る。
【0080】
言い換えれば、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御する。したがって、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。
【0081】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御する。したがって、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチドの移動を制御し、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御する。
【0082】
上記と同様の表記法を使用して、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、Ｌ－｛Ｐ－Ｎ｝－Ｐｍの形態の１つ以上の構造を含み、
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み得る。
－Ｌはリーダーであり、Ｌは任意選択でＮ部分であり、
－Ｐはポリペプチドであり、
－Ｎはポリヌクレオチドを含み、
－ｍは０または１であり、
方法は、リーダー（Ｌ）をナノポアを通してスレッディングし、それによりポリペプチド（Ｐ）をナノポアと接触させることを含み得る。
【0083】
いくつかのそのような実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのシス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。他のそのような実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質はナノポアのトランス側に位置し、方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのポリヌクレオチド（Ｎ）の移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチド（Ｐ）の移動を制御することを含む。
【0084】
いくつかの実施形態、特に上で考察されるようにポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアの「外」へのコンジュゲートの移動を制御する実施形態では、コンジュゲートは、任意選択のリンカーを介してポリペプチドに付着したブロッキング部分を含み得る。ブロッキング部分は、典型的には、ナノポアを通過するには大きすぎるため、ナノポアに対するコンジュゲートの移動がブロッキング部分をナノポアと接触させると、ナノポアを通るコンジュゲートのさらなる移動が妨げられる。そのようなとき、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートから一時的に結合を解くことができる可能性がある。コンジュゲートが適用された力（例えば、電位または化学ポテンシャル）の下でナノポアに対して移動する、開示される方法の実施形態では、コンジュゲートは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御される移動とは反対の方向にポアを通って「戻る」ことができる。コンジュゲートがポアを通って戻る移動により、コンジュゲートのポリペプチド部分を再び特徴付けることができる。
【0085】
このプロセスは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質をコンジュゲートに連続的に結合および再結合させることにより、複数回繰り返すことができる。このようにして、コンジュゲートはポアを通して振動する可能性がある（すなわち、ナノポアを通して「フロス」される可能性がある）。この「フロッシング」により、コンジュゲートのポリペプチド部分をナノポアによって繰り返し特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、これにより、特徴付け情報の精度を高めることができる。
【0086】
そのような実施形態では、任意の適切なブロッキング部分を使用することができる。例えば、コンジュゲートはビオチンで修飾することができ、ブロッキング部分は例えばストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンであり得る。ブロッキング部分は、デンドリマーなどの大きな化学基であり得る。ブロッキング部分は、ナノ粒子またはビーズであり得る。他の適切なブロッキング部分は、当業者には明らかであろう。
【0087】
このような方法の非限定的な例を図７に示す。
【0088】
したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、
ｉ）ブロッキング部分がポリヌクレオチドハンドリングタンパク質に対してナノポアの反対側にあるように、コンジュゲートをナノポアと接触させることと、
ｉｉ）コンジュゲートのポリヌクレオチドをポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
ｉｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御することと、
ｉｖ）ブロッキング部分がナノポアに接触し、それによりナノポアを通るコンジュゲートのさらなる移動を防ぐ場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドから一時的に結合を解き、これにより、適用された力の下で、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御された移動方向と反対方向にコンジュゲートがナノポアを通って移動することを可能にすることと、
ｖ）任意選択でステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返して、ナノポアを通してポリペプチドを振動させることと、を含む。
ｉ）ブロッキング部分がポリヌクレオチドハンドリングタンパク質に対してナノポアの反対側にあるように、コンジュゲートをナノポアと接触させることと、
ｉｉ）コンジュゲートのポリヌクレオチドをポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、
ｉｉｉ）ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することを可能にし、それによりナノポアを通るポリペプチドの移動を制御することと、
ｉｖ）ブロッキング部分がナノポアに接触し、それによりナノポアを通るコンジュゲートのさらなる移動を防ぐ場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチドから一時的に結合を解き、これにより、適用された力の下で、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって制御された移動方向と反対方向にコンジュゲートがナノポアを通って移動することを可能にすることと、
ｖ）任意選択でステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返して、ナノポアを通してポリペプチドを振動させることと、を含む。
【0089】
ディスプレーサーユニット
上記のように、理論に拘束されることなく、本発明者らは、より短いバレルまたはチャネルを有するナノポアと比較して、より長いバレルまたはチャネルを有するナノポアが使用される場合、特徴付けられ得るポリペプチドの長さが典型的には改善されることを見出した。上で説明したように、これは、図８Ａ（Ａ）に概略的に示されているように、「ＲＥＤ」距離と相関しているか、それにより決定されると考えられる。
上記のように、理論に拘束されることなく、本発明者らは、より短いバレルまたはチャネルを有するナノポアと比較して、より長いバレルまたはチャネルを有するナノポアが使用される場合、特徴付けられ得るポリペプチドの長さが典型的には改善されることを見出した。上で説明したように、これは、図８Ａ（Ａ）に概略的に示されているように、「ＲＥＤ」距離と相関しているか、それにより決定されると考えられる。
【0090】
したがって、いくつかの実施形態において、ナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。ナノポアは、典型的には、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用されるときに決定されるように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。いくつかの実施形態において、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用される場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアと接触する、例えば、ナノポアのシスまたはトランス開口と接触する、「着座位置」にある。これは、本明細書でより詳細に説明されており、図８Ａ（Ｂ）に概略的に示されている。
【0091】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位とナノポアとの間の距離は、ディスプレーサーユニットを使用することによって延長され得る。ディスプレーサーユニットの使用法を図８Ａ（Ｃ）に模式的に示す。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、ディスプレーサーユニットを提供することを含む。いくつかの実施形態において、ディスプレーサーユニットは、ポリペプチドハンドリングタンパク質をナノポアから分離し、それによりポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアとの間の距離を延長するためのものである。
【0092】
そのような実施形態では、任意の適切なディスプレーサーユニットを使用することができる。例えば、ディスプレーサーユニットをタンパク質として提供することができる。
【0093】
任意の適切なタンパク質をディスプレーサーユニットとして使用することができる。例示的なタンパク質には、例えば多量体などのリング状のコンフォメーションを採用し、したがってナノポアの入口に容易に配置することができるタンパク質が含まれる。本明細書に記載のナノポア、ヘリカーゼ（例えば、Ｔ７ヘリカーゼ）およびその変異体などを含む、多くの適切なリング状タンパク質が当技術分野で知られている。ディスプレーサーが、それ自体の活性を有する必要はない。いくつかの実施形態において、ディスプレーサーユニットは、コンジュゲート中のポリヌクレオチドまたはペプチドのいずれかのいかなる有意な識別も提供しない。
【0094】
いくつかの実施形態において、ディスプレーサーユニットは、１つ以上のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質またはその不活性変異体を含み得る。これは、図８Ｂに概略的に示されている。示されるように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質（Ｅ１）は、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用される。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質Ｅ２…Ｅｎは、最初はコンジュゲートのポリペプチド部分と接触しているため、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御しない。しかしながら、それらはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質Ｅ１をナノポアから置換し、ＲＥＤを増加させる。
【0095】
そのような実施形態では、ディスプレーサーユニットとして使用されるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートの移動を制御するために使用されるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ディスプレーサーユニットとして使用されるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートの移動を制御するために使用される同じポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の不活性変異体から形成される。
【0096】
１つ以上のディスプレーサーユニット、例えば、本明細書に記載の１つ以上のディスプレーサーユニットは、ナノポアに付着（例えば、共有結合または非共有結合）することができる。あるいは、１つ以上のディスプレーサーユニットを、例えば、ポリヌクレオチドを使用してナノポアに対するそれらの位置を制御することによって、ナノポアに会合させることができる。
【0097】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位からナノポアまでの距離を延長するように修飾される。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用されるときに決定されるように、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位とナノポアとの間の距離を延長するように修飾される。これは、本明細書により詳細に記載される。
【0098】
ポリペプチド
上で説明したように、開示される方法は、コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、コンジュゲート内の標的ポリペプチドを特徴付けることを含む。
上で説明したように、開示される方法は、コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、コンジュゲート内の標的ポリペプチドを特徴付けることを含む。
【0099】
任意の適切なポリペプチドは、開示される方法で特徴付けられ得る。
【0100】
いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドは、未修飾タンパク質もしくはその部分、または天然に存在するポリペプチドもしくはその部分である。
【0101】
いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドは、細胞から分泌される。あるいは、標的ポリペプチドは、開示される方法による特徴付けのために細胞から抽出されなければならないように、細胞内で産生され得る。ポリペプチドは、プラスミド、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １１４），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１６）に記載されている方法に従ってタンパク質のクローニングに使用されるプラスミドの細胞発現の産物を含み得る。
【0102】
ポリペプチドは、任意の生物または微生物から得られ得るか、またはそれらから抽出され得る。ポリペプチドは、ヒトまたは動物から、例えば、尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、もしくは羊水から、または全血、血漿、もしくは血清から得られ得る。ポリペプチドは、植物、例えば、穀草類、マメ科植物、果物、または野菜から得られ得る。
【0103】
標的ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドおよび１つ以上の不純物の不純な混合物として提供され得る。不純物は、開示される方法における特徴付けのための「標的ポリペプチド」とは異なる標的ポリペプチドの一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型を含み得る。例えば、標的ポリペプチドは完全長タンパク質であり得、不純物はタンパク質の画分を含み得る。不純物はまた、標的タンパク質以外のタンパク質も含み得、これらは例えば、細胞培養物から同時精製され得るか、またはサンプルから得られ得る。
【0104】
ポリペプチドは、任意のアミノ酸、アミノ酸類似体、および修飾アミノ酸（すなわち、アミノ酸誘導体）の任意の組み合わせを含み得る。ポリペプチド中のアミノ酸（および誘導体、類似体など）は、それらの物理的サイズと電荷によって区別することができる。
【0105】
アミノ酸／誘導体／類似体は、天然に存在するものであっても人工的なものであってもよい。
【0106】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。２０のアミノ酸が普遍的な遺伝暗号によってコードされている。これらは、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸／グルタメート（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）である。他の天然に存在するアミノ酸には、セレノシステインとピロリシンが含まれる。
【0107】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは修飾されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、開示される方法を使用する検出のために修飾される。いくつかの実施形態において、開示される方法は、標的ポリペプチドにおける修飾を特徴付けるためのものである。
【0108】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド中のアミノ酸／誘導体／類似体の１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中のアミノ酸／誘導体／類似体の１つ以上が、翻訳後修飾されている。したがって、本明細書に開示される方法は、ポリペプチドにおける翻訳後修飾の存在、非存在、位置の数を検出するために使用することができる。開示される方法は、ポリペプチドが翻訳後修飾されている程度を特徴付けるために使用することができる。
【0109】
任意の１つ以上の翻訳後修飾がポリペプチドに存在し得る。典型的な翻訳後修飾には、疎水性基による修飾、補因子による修飾、化学基の付加、糖化（糖の非酵素的結合）、ビオチン化およびペグ化が含まれる。翻訳後修飾は、生物工学または生物医学の目的で、実験室で行われる化学修飾であるなど、非自然的である場合もある。これにより、天然の対応物とは対照的に、実験室で製造されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のレベルを監視することが可能となり得る。
【0110】
疎水性基による翻訳後修飾の例には、ミリストイル化、ミリスチン酸、Ｃ１４飽和酸の付着；パルミトイル化、パルミチン酸、Ｃ１６飽和酸の付着；イソプレニル化またはプレニル化、イソプレノイド基の付着；ファルネシル化、ファルネソール基の付着；ゲラニルゲラニル化、ゲラニルゲラニオール基の付着；およびグリピエーション、およびアミド結合を介したグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成が含まれる。
【0111】
補因子による翻訳後修飾の例には、リポイル化、リポエート（Ｃ８）官能基の付着；フラビン化、フラビン部分（例えばフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ））の付着；例えばシステインとのチオエーテル結合を介したヘムＣの付着；ホスホパンテテイニル化、４’－ホスホパンテテイニル基の付着；およびレチニリデンシッフ塩基の形成が含まれる。
【0112】
化学基の付加による翻訳後修飾の例には、アシル化、例えば、Ｏ－アシル化（エステル）、Ｎ－アシル化（アミド）またはＳ－アシル化（チオエステル）；アセチル化、例えばＮ末端またはリジンへのアセチル基の付着；ホルミル化；アルキル化、メチルまたはエチルなどのアルキル基の付加；メチル化、例えばリジンまたはアルギニンへのメチル基の付加；アミド化；酪酸化；ガンマカルボキシル化；グリコシル化、例えばアルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシンまたはトリプトファンへのグリコシル基の酵素的付着；ポリシアリル化、ポリシアル酸の付着；マロニル化；ヒドロキシル化；ヨウ素化；臭素化；シトルリン化；ヌクレオチド付加、上で考察されるもののうちのいずれかなどの任意のヌクレオチドの付着、ＡＤＰリボシル化；酸化；リン酸化、例えばセリン、スレオニンもしくはチロシン（Ｏ－結合）またはヒスチジン（Ｎ－結合）へのリン酸基の付着；アデニリル化、例えばチロシン（Ｏ－結合型）またはヒスチジンもしくはリジン（Ｎ－結合型）へのアデニリル部分の付着；プロピオン化；ピログルタミン酸の形成；Ｓ－グルタチオン化；スモイル化（Ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）；Ｓ－ニトロシル化；スクシニル化、例えばリジンへのスクシニル基の結合；セレノイル化、セレンの取り込み；およびユビキチン化、ユビキチンサブユニット（Ｎ－結合型）の追加が含まれる。
【0113】
ポリペプチドが分子標識で標識されることは、本明細書で提供される方法の範囲内である。分子標識は、本明細書で提供される方法におけるポリペプチドの検出を促進するポリペプチドへの修飾であり得る。例えば、標識は、コンジュゲートが特徴付けられるときに得られるシグナルを改変させるポリペプチドへの修飾であり得る。例えば、標識はナノポアを通るイオンの流れに干渉し得る。このようにして、標識は方法の感度を向上させ得る。
【0114】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上の架橋されたセクション、例えば、Ｃ－Ｃブリッジを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、開示される方法を使用して特徴付けられる前に架橋されない。
【0115】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、硫化物含有アミノ酸を含み、したがって、ジスルフィド結合を形成する可能性を有する。典型的には、そのような実施形態において、ポリペプチドは、開示される方法を使用して特徴付けられる前に、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）などの試薬を使用して還元される。
【0116】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、全長タンパク質または天然に存在するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、タンパク質または天然に存在するポリペプチドは、ポリヌクレオチドにコンジュゲート化される前に断片化される。いくつかの実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、化学的または酵素的に断片化されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、より長い標的ポリペプチドを形成するためにコンジュゲートされ得る。
【0117】
ポリペプチドは、任意の適切な長さのポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約２～約３００ペプチド単位の長さを有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約２～約１００ペプチド単位、例えば、約２～約５０ペプチド単位、例えば、約２～約４０ペプチド単位、例えば、約２～約３０ペプチド単位、例えば、約２～約２５ペプチド単位、例えば約２～約２０ペプチド単位；または、約３～約５０ペプチド単位、例えば、約３～約４０ペプチド単位、例えば、約３～約３０ペプチド単位、例えば、約３～約２５ペプチド単位、例えば、約３～約２０ペプチド単位；または、約５～約５０ペプチド単位、例えば、約５～約４０ペプチド単位、例えば、約５～約３０ペプチド単位、例えば、約５～約２５ペプチド単位、例えば、約５～約２０ペプチド単位；例えば、約７～約１６のペプチド単位、例えば、約９～約１２ペプチド単位；または、約１６～約２５ペプチド単位、例えば、約１８～約２２ペプチド単位の長さを有する。
【0118】
任意の数のポリペプチドを、開示される方法で特徴付けることができる。例えば、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上のポリヌクレオチドの特徴付けに関し得る。２つ以上のポリペプチドが使用される場合、それらは、異なるポリペプチドまたは同じポリペプチドの２つ以上の例であり得る。
【0119】
したがって、開示される方法で行われる測定は、典型的には、（ｉ）ポリペプチドの長さ、（ｉｉ）ポリペプチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリペプチドの配列、（ｉｖ）ポリペプチドの二次構造、および（ｖ）ポリペプチドが修飾されているかどうかより選択されるポリペプチドの１つ以上の特性に特徴的であることが明らかである。典型的な実施形態では、測定は、ポリペプチドの配列、またはポリペプチドが、例えば、１つ以上の翻訳後修飾によって修飾されているかどうかに特徴的である。いくつかの実施形態では、測定は、ポリペプチドの配列の特徴である。
【0120】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、弛緩した形態である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、線形化された形態で保持される。線形化された形態でポリペプチドを保持することは、ナノポア内のポリペプチドの「バンチング」が防止されるため、残基ごとにポリペプチドの特徴付けを促進し得る。
【0121】
ポリペプチドは、任意の適切な手段を使用して線形化された形態で保持され得る。
【0122】
例えば、ポリペプチドが帯電している場合、電圧を印加することにより、ポリペプチドを線形化された形態で保持することができる。
【0123】
ポリペプチドが帯電していないか、わずかにしか帯電していない場合は、ｐＨを調整することで電荷を変更または制御できる。例えば、ポリペプチドの相対的な負電荷を増加させるために高ｐＨを使用することにより、ポリペプチドを線形化された形態で保持することができる。ポリペプチドの負電荷を増加させると、例えば正の電圧下で線形化された形態で保持することができる。あるいは、ポリペプチドの相対的な正電荷を増加させるために低ｐＨを使用することにより、ポリペプチドを線形化された形態で保持することができる。ポリペプチドの正電荷を増加させると、例えば負の電圧下で線形化された形態で保持することができる。開示される方法において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御するために使用される。ポリヌクレオチドは典型的には負に帯電しているため、ポリヌクレオチドと同様に、ｐＨを上げることによってポリペプチドの線形化を高め、それによりポリペプチドをより負に帯電させることが一般に最も適切である。このようにして、コンジュゲートは全体的に負の電荷を保持するため、印加電圧の下で容易に移動できる。
【0124】
ポリペプチドは、適切な変性条件を使用することにより、線形化された形態で保持され得る。適切な変性条件には、例えば、グアニジンＨＣｌおよび／または尿素などの適切な濃度の変性剤の存在が含まれる。開示される方法で使用するそのような変性剤の濃度は、方法で特徴付けられる標的ポリペプチドに依存し、当業者によって容易に選択することができる。
【0125】
ポリペプチドは、適切な界面活性剤を使用することにより、線形化された形態で保持され得る。開示される方法で使用するのに適した洗剤には、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）が含まれる。
【0126】
ポリペプチドは、開示される方法を高温で実施することにより、線形化された形態で保持され得る。温度を上げると、鎖内結合が克服され、ポリペプチドが線形化された形をとることができる。
【0127】
ポリペプチドは、強い電気浸透力の下で開示される方法を実行することにより、線形化された形態で保持され得る。そのような力は、非対称の塩条件を使用することによって、および／またはナノポアのチャネルに適切な電荷を提供することによって提供され得る。タンパク質ナノポアのチャネルの電荷は、例えば変異誘発によって改変させることができる。ナノポアの電荷を変更することは、当業者の能力の範囲内である。ナノポアの電荷を変えると、電位がナノポアを横切って印加されたときに、ナノポアを通る陽イオンと陰イオンの不均衡な流れから強い電気浸透力が生成される。
【0128】
ポリペプチドは、ナノピラーのアレイなどの構造、ナノスリットを通過またはナノギャップを横切ることにより、線形化された形態で保持され得る。いくつかの実施形態において、そのような構造の物理的制約は、ポリペプチドに線形化された形態を採用させることができる。
【0129】
コンジュゲートの形成
本明細書でより詳細に説明されるように、コンジュゲートは、標的ポリペプチドにコンジュゲート化されたポリヌクレオチドを含む。
本明細書でより詳細に説明されるように、コンジュゲートは、標的ポリペプチドにコンジュゲート化されたポリヌクレオチドを含む。
【0130】
標的ポリペプチドは、任意の適切な位置でポリヌクレオチドにコンジュゲート化され得る。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端でポリヌクレオチドにコンジュゲート化され得る。ポリペプチドは、ポリペプチド中の残基（例えば、アミノ酸残基）の側鎖基を介してポリヌクレオチドにコンジュゲート化され得る。
【0131】
いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドは、ポリヌクレオチドへのコンジュゲート化を促進するために使用され得る天然に存在する反応性官能基を有する。例えば、システイン残基を使用して、ポリヌクレオチドまたはその上の修飾基へのジスルフィド結合を形成することができる。
【0132】
いくつかの実施形態において、標的ポリペプチドは、ポリヌクレオチドへのそのコンジュゲート化を促進するために修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリヌクレオチドに付着させるための反応性官能基を含む部分を付着することによって修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリヌクレオチド上の対応する反応性官能基と反応するための１つ以上の反応性官能基を含む１つ以上の残基（例えばアミノ酸残基）によってＮ末端またはＣ末端で伸長され得る。例えば、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、１つ以上のシステイン残基によってＮ末端および／またはＣ末端で伸長され得る。このような残基は、例えばマレイミド化学による（例えばシステインのアジド－［Ｐｏｌ］－マレイミドなどのアジド－マレイミド化合物との反応、ここで［Ｐｏｌ］は典型的にはＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、またはＰＥＧ４などの短鎖ポリマーである；続いて、適切に官能化されたポリヌクレオチド、例えば、アジドとの反応のためのＢＣＮ基を所持するポリヌクレオチドへのカップリングによる）、コンジュゲートのポリヌクレオチド部分への付着に使用され得る。そのような化学的性質は実施例２に記載されている。誤解を避けるために、ポリペプチドがＮ末端および／またはＣ末端に適切な天然に存在する残基（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端に天然に存在するシステイン残基）を含む場合、そのような残基を、ポリヌクレオチドへの付着のため、使用することができる。
【0133】
いくつかの実施形態において、標的ポリペプチド中の残基は、標的ポリペプチドのポリヌクレオチドへの付着を促進するように修飾される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中の残基（例えば、アミノ酸残基）は、ポリヌクレオチドへの付着のために化学的に修飾されている。いくつかの実施形態において、ポリペプチド中の残基（例えば、アミノ酸残基）は、ポリヌクレオチドへの付着のために酵素的に修飾される。
【0134】
コンジュゲート中のポリヌクレオチドとポリペプチドとの間のコンジュゲート化化学は、特に限定されない。反応性官能基の任意の適切な組み合わせを使用することができる。多くの適切な反応性基およびそれらの化学的標的が当技術分野で知られている。いくつかの例示的な反応性基およびそれらの対応する標的には、アミンと反応し得るアリールアジド、アミンおよびカルボキシル基と反応し得るカルボジイミド、炭水化物と反応し得るヒドラジド、アミンと反応し得るヒドロキシメチルホスフィン、アミンと反応し得るイミドエステル、ヒドロキシル基と反応し得るイソシアナート、ヒドラジンと反応し得るカルボニル、スルフヒドリル基と反応し得るマレイミド、アミンと反応し得るＮＨＳ－エステル、アミンと反応し得るＰＦＰ－エステル、チミンと反応し得るソラレン、スルフヒドリル基と反応し得るピリジルジスルフィド、スルフヒドリルアミンおよびヒドロキシル基と反応し得るビニルスルホン、ビニルスルホンアミドなどが含まれる。
【0135】
ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化させるための他の適切な化学には、クリックケミストリーが含まれる。多くの適切なクリックケミストリー試薬が当技術分野で知られている。クリックケミストリーの好適な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン環化付加（アジドアルキンヒュスゲン環化付加）、
（ｂ）歪み促進アジド－アルキン環化付加；アルケンとアジドの［３＋２］環化付加；アルケンとテトラジンの逆需要ディールスアルダー反応；およびアルケンとテトラゾールのフォトクリック反応を含む、
（ｃ）アジドが、例えばシクロオクタン環中、例えば二環［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）中の歪みを受けているアルキンと反応する、１，３双極性環化付加反応の銅不含バリアント、
（ｄ）一方のリンカー上の酸素求核試薬の、他方のエポキシドまたはアジリジン反応性部分との反応、ならびに
（ｅ）アルキン部分をアリールホスフィンで置換して、アジドとの特異的反応をもたらして、アミド結合を付与することができる、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結。
（ａ）銅（Ｉ）触媒によるアジド－アルキン環化付加（アジドアルキンヒュスゲン環化付加）、
（ｂ）歪み促進アジド－アルキン環化付加；アルケンとアジドの［３＋２］環化付加；アルケンとテトラジンの逆需要ディールスアルダー反応；およびアルケンとテトラゾールのフォトクリック反応を含む、
（ｃ）アジドが、例えばシクロオクタン環中、例えば二環［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）中の歪みを受けているアルキンと反応する、１，３双極性環化付加反応の銅不含バリアント、
（ｄ）一方のリンカー上の酸素求核試薬の、他方のエポキシドまたはアジリジン反応性部分との反応、ならびに
（ｅ）アルキン部分をアリールホスフィンで置換して、アジドとの特異的反応をもたらして、アミド結合を付与することができる、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結。
【0136】
コンジュゲートを形成するために任意の反応性基を使用することができる。いくつかの適切な反応性基には、［１，４－ビス［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン；１，１ １－ビス－マレイミドトリエチレングリコール；３，３’－ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）；エチレングリコール－ビス（コハク酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）；４，４’－ジイソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸二ナトリウム塩；ビス［２－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド；３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル；４－マレイミド酪酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル；ヨード酢酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル；Ｓ－アセチルチオグリコール酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル；アジド－ＰＥＧ－マレイミド；およびアルキン－ＰＥＧ－マレイミドが含まれる。反応基は、ＷＯ２０１０／０８６６０２、特にその出願の表３に開示されているもののうちのいずれであってもよい。
【0137】
いくつかの実施形態では、コンジュゲート化ステップの前に、反応性官能基はポリヌクレオチドに含まれ、標的官能基はポリペプチドに含まれる。他の実施形態では、コンジュゲート化ステップの前に、反応性官能基はポリペプチドに含まれ、標的官能基はポリヌクレオチドに含まれる。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、ポリペプチドに直接付着している。いくつかの実施形態では、反応性官能基は、スペーサーを介してポリペプチドに付着している。任意の適切なスペーサーを使用することができる。適切なスペーサーには、例えば、エチルジアミンなどのアルキルジアミンなどが含まれる。
【0138】
上記の考察から明らかなように、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、複数のポリペプチドセクションおよび／または複数のポリヌクレオチドセクションを含む。例えば、コンジュゲートは、Ｐがポリペプチドであり、Ｎがポリヌクレオチドである、形態…－Ｐ－Ｎ－Ｐ－Ｎ－Ｐ－Ｎ…の構造を含み得る。そのような実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対してコンジュゲートのＮ部分を連続的に制御し、したがって、ナノポアに対するＰセクションの移動を連続的に制御し、したがって、Ｐセクションの連続的な特徴付けを可能にする。そのような実施形態において、複数のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、同じまたは異なる化学によってともにコンジュゲート化され得る。
【0139】
本明細書で説明されるように、コンジュゲートはリーダーを含み得る。本明細書で説明されるように、任意の適切なリーダーを使用することができる。いくつかの実施形態では、リーダーはポリヌクレオチドである。リーダーがポリヌクレオチドである実施形態において、リーダーは、コンジュゲート中で使用されるポリヌクレオチドと同じ種類のポリヌクレオチドであり得るか、またはリーダーは、異なるタイプのポリヌクレオチドであり得る。例えば、コンジュゲート中のポリヌクレオチドはＤＮＡであり得、リーダーはＲＮＡであり得るか、またはその逆であり得る。
【0140】
いくつかの実施形態では、リーダーは、帯電したポリマー、例えば、負に帯電したポリマーである。いくつかの実施形態では、リーダーは、ＰＥＧまたは多糖などのポリマーを含む。そのような実施形態では、リーダーは、１０～１５０のモノマー単位（例えば、エチレングリコールまたは糖単位）の長さ、例えば、２０～１２０、例えば、３０～１００、例えば、４０～８０、例えば、５０～７０のモノマー単位（例えば、エチレングリコールまたは糖類単位）の長さであり得る。
【0141】
ポリヌクレオチド
本明細書でより詳細に説明されるように、本明細書で提供される方法は、ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用してナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することを含む。
本明細書でより詳細に説明されるように、本明細書で提供される方法は、ポリペプチドをポリヌクレオチドにコンジュゲート化し、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用してナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することを含む。
【0142】
開示される方法において、任意の適切なポリヌクレオチドを使用することができる。
【0143】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは細胞から分泌される。あるいは、ポリヌクレオチドは、開示される方法で使用するために細胞から抽出されなければならないように、細胞内で産生され得る。
【0144】
ポリヌクレオチドは、１つ以上のポリヌクレオチドおよび１つ以上の不純物の不純な混合物として提供され得る。不純物は、コンジュゲートの形成に使用するためのポリヌクレオチドとは異なる、一部切除型のポリヌクレオチドを含み得る。例えば、コンジュゲートの形成に使用するためのポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであり得、不純物は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドなどの画分を含み得る。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのコード領域であり得、望ましくないポリヌクレオチドは、ＤＮＡの非コード領域を含み得る。
【0145】
ポリヌクレオチドの例には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡにおける塩基は、それらの物理的サイズによって識別される場合がある。
【0146】
ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、天然に存在しても人工であってもよい。ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、酸化されてもメチル化されてもよい。ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、損傷している場合がある。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジンダイマーを含み得る。かかるダイマーは、典型的には、紫外線による損傷に関連しており、皮膚メラノーマの主な原因である。
【0147】
ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、例えば、標識またはタグで修飾され得、その好適な例は当業者に知られている。ポリヌクレオチドは、１つ以上のスペーサーを含み得る。アダプター、例えば配列決定アダプターは、ポリヌクレオチド中に含まれ得る。アダプター、タグおよびスペーサーは、本明細書でより詳細に記載されている。
【0148】
修飾された塩基の例は、本明細書に開示され、当技術分野で知られている手段によって、例えば、鎖コピー中の修飾ヌクレオチド三リン酸のポリメラーゼ取り込み（例えば、ＰＣＲ）によって、またはポリメラーゼ充填法によって、ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の塩基は、当技術分野で知られている試薬を使用する化学的手段によって修飾され得る。
【0149】
ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、および少なくとも１つのリン酸基を含む。核酸塩基および糖がヌクレオシドを形成する。核酸塩基は、典型的には、複素環である。核酸塩基には、プリンおよびピリミジン、より具体的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、およびシトシン（Ｃ）が含まれるが、これらに限定されない。糖は、典型的には、五炭糖である。ヌクレオチド糖には、リボースおよびデオキシリボースが含まれるが、これらに限定されない。糖は、好ましくは、デオキシリボースである。ポリヌクレオチドは、好ましくは、以下のヌクレオシド：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）を含む。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸、または三リン酸を含む。ヌクレオチドは、３個より多くのリン酸、例えば、４個または５個のリン酸を含み得る。リン酸は、ヌクレオチドの５’側または３’側に付着し得る。ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で互いに付着し得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸と同様に、それらの糖およびリン酸基によって付着する。ヌクレオチドは、ピリミジンダイマーと同様に、それらの核酸塩基を介して接続され得る。
【0150】
ポリヌクレオチドは二本鎖でも一本鎖でもよい。
【0151】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは、一本鎖ＤＮＡをＲＮＡにライゲーションするか、またはその逆を行うことで調製され得る。ポリヌクレオチドは、最も典型的には一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）または一本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）である。
【0152】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。二本鎖ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドは、ｃＤＮＡ補体を逆転写することにより一本鎖ＲＮＡから調製され得る。
【0153】
ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド長もしくはヌクレオチド対長以上、５０００ヌクレオチド長もしくはヌクレオチド対長以上、または１０００００ヌクレオチド長もしくはヌクレオチド対長以上であり得る。
【0154】
より典型的には、ポリヌクレオチドは、約１～約１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さを有する。例えば、約１～約１０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対（例えば、約１０～約１０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対）、例えば、約５～約５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対、例えば、約１０～約１００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対、例えば、約２０～約８０ヌクレオチドまたはヌクレオチド対、例えば約３０～約５０ヌクレオチドまたはヌクレオチド対。
【0155】
任意の数のポリヌクレオチドを開示される方法で使用することができる。例えば、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、またはそれ以上のポリヌクレオチドを使用することを含み得る。２つ以上のポリヌクレオチドを使用する場合、それらは、異なるポリヌクレオチドであるか、または同じポリヌクレオチドの２つの例であり得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在しても人工であってもよい。
【0156】
ヌクレオチドは、任意の同一性を有し得、ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸塩（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸塩（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸塩（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸塩（ＵＭＰ）、５－メチルシチジン一リン酸塩、５－ヒドロキシメチルシチジン一リン酸塩、シチジン一リン酸塩（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸塩（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸塩（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸塩（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸塩（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸塩（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸塩（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸塩（ｄＣＭＰ）、およびデオキシメチルシチジン一リン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＵＭＰから選択される。ヌクレオチドは、脱塩基であり得る（すなわち、核酸塩基を欠き得る）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠き得る（すなわち、Ｃ３スペーサーである）。
【0157】
ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応の産物、ゲノムＤＮＡ、エンドヌクレアーゼ消化の産物、および／またはＤＮＡライブラリーを含み得る。ポリヌクレオチドは、任意の生物または微生物から得られ得るか、またはそれらから抽出され得る。ポリヌクレオチドは、ヒトまたは動物から、例えば、尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、もしくは羊水から、または全血、血漿、もしくは血清から得られ得る。ポリヌクレオチドは、植物、例えば、穀草類、マメ科植物、果物、または野菜から得られ得る。ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡを含み得る。ゲノムＤＮＡは断片化され得る。ＤＮＡは任意の好適な方法によって断片化され得る。例えば、ＤＮＡを断片化する方法は当該技術分野で既知であり、かかる方法は、ＭｕＡトランスポザーゼなどのトランスポザーゼを使用することができる。好ましくは、ゲノムＤＮＡは断片化されない。
【0158】
ポリヌクレオチドが分子標識で標識されることは、本明細書で提供される方法の範囲内である。分子標識は、本明細書で提供される方法においてポリヌクレオチドまたはコンジュゲートの検出を促進するポリヌクレオチドへの修飾であり得る。例えば、標識は、コンジュゲートが特徴付けられるときに得られるシグナルを改変する、ポリヌクレオチドへの修飾であり得る。例えば、標識はナノポアを通るイオンの流れに干渉し得る。このようにして、標識は方法の感度を向上させる可能性がある。
【0159】
アダプター
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それに付着したポリヌクレオチドアダプターを有する。アダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドの末端に付着することができるポリヌクレオチド鎖を含む。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それに付着したポリヌクレオチドアダプターを有する。アダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドの末端に付着することができるポリヌクレオチド鎖を含む。
【0160】
いくつかの実施形態において、アダプターは、ポリペプチドとのコンジュゲートが形成される前に、ポリヌクレオチドに付着される。いくつかの実施形態において、アダプターは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのコンジュゲートに付着される。
【0161】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、アダプター（例えば本明細書に記載のアダプター）をポリヌクレオチドに付着させ、ポリヌクレオチド／アダプター構築物を標的ポリペプチドにコンジュゲート化することによってコンジュゲートを形成することを含む。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、アダプター（例えば本明細書に記載のアダプター）をポリヌクレオチドに付着させ、アダプターを標的ポリペプチドに付着させることによってコンジュゲートを形成することによって形成される。
【0162】
いくつかの実施形態において、アダプターは、ポリヌクレオチドへのコンジュゲート化のための特定の部位を提供するために選択または修飾され得る。
【0163】
アダプターは、ポリヌクレオチドまたはコンジュゲートの一端だけに付着させることができる。ポリヌクレオチドアダプターは、ポリヌクレオチドまたはコンジュゲートの両末端に付加され得る。あるいは、異なるアダプターがポリヌクレオチドまたはコンジュゲートの２つの末端に付加され得る。
【0164】
二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖にアダプターを付加することができる。一本鎖ポリヌクレオチドにアダプターを付加することができる。アダプターをポリヌクレオチドに付加する方法は、当該技術分野で既知である。アダプターは、例えば、ライゲーションによって、クリックケミストリーによって、タグメンテーションによって、トポイソメラーゼ変換によって、または任意の他の好適な方法によってポリヌクレオチドに付着し得る。
【0165】
一実施形態では、当該または各アダプターは、合成または人工である。典型的には、当該または各アダプターは、本明細書に記載のポリマーを含む。いくつかの実施形態において、当該または各アダプターは、本明細書に記載されるようなスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、当該または各アダプターは、ポリヌクレオチドを含む。当該または各ポリヌクレオチドアダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、および／またはＰＥＧを含み得る。通常、当該または各アダプターは、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。アダプターは、それが付着しているポリヌクレオチド鎖と同じタイプのポリヌクレオチドを含み得る。アダプターは、それが付着しているポリヌクレオチド鎖とは異なるタイプのポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、開示される方法で使用されるポリヌクレオチド鎖は一本鎖ＤＮＡ鎖であり、アダプターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、典型的には一本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡ鎖であり、アダプターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば二本鎖または一本鎖ＤＮＡを含む。
【0166】
いくつかの実施形態において、アダプターは、架橋部分であり得る。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖を接続するために、架橋部分を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、架橋部分は、二本鎖ポリヌクレオチドのテンプレート鎖を二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖に接続するために使用される。
【0167】
架橋部分は、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖を共有結合する。架橋部分は、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖を連結することができる任意のものであり得るが、但し、架橋部分が、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動に干渉しないことを条件とする。好適な架橋部分には、ポリマーリンカー、化学リンカー、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、架橋部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ（例えば、脱塩基ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＥＧを含む。架橋部分は、より好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0168】
いくつかの実施形態では、架橋部分はヘアピンアダプターである。ヘアピンアダプターは、単一のポリヌクレオチド鎖を含むアダプターであり、ポリヌクレオチド鎖の末端は互いにハイブリダイズすることができるか、または互いにハイブリダイズされ、ポリヌクレオチドの中央部分がループを形成する。好適なヘアピンループアダプターは、当該技術分野で既知の方法を使用して設計され得る。いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、典型的には、４～１００ヌクレオチドの長さ、例えば、４～５０、例えば、４～２０、例えば、４～８ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、架橋部分（例えばヘアピンアダプター）は、二本鎖ポリヌクレオチドの一端に付着している。架橋部分（例えばヘアピンアダプター）は、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの両端に付着していない。
【0169】
いくつかの実施形態では、アダプターは直鎖アダプターである。直鎖アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方の末端に結合することができる。ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドである場合、直鎖アダプターは、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方の鎖のいずれかまたは両方の末端に結合することができる。直鎖アダプターは、本明細書に記載されるようなリーダー配列を含み得る。直鎖アダプターは、本明細書に記載されるようなタグ（ポアタグなど）とのハイブリダイゼーションのための部分を含み得る。直鎖アダプターは、１０～１５０ヌクレオチドの長さ、例えば、２０～１２０、例えば、３０～１００、例えば、４０～８０、例えば、５０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。直鎖アダプターは一本鎖でもよい。直鎖アダプターは二本鎖でもよい。
【0170】
いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｙアダプターであり得る。Ｙアダプターは、典型的には、ポリヌクレオチドアダプターである。Ｙアダプターは、典型的には二本鎖であり、（ａ）一方の末端に２つの鎖が一緒にハイブリダイズされる領域と、（ｂ）他方の末端に２つの鎖が相補的ではない領域とを含む。鎖の非相補的部分は、典型的には、オーバーハングを形成する。Ｙアダプター中の非相補領域の存在は、二本鎖部分とは異なり２本の鎖が典型的には互いにハイブリダイズしないため、アダプターにＹ形状を与える。Ｙアダプターの２つの一本鎖部分は、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。例えば、Ｙアダプターの一方の一本鎖部分は、１０～１５０ヌクレオチドの長さ、例えば、２０～１２０、例えば、３０～１００、例えば、４０～８０、例えば、５０～７０ヌクレオチドの長さであり得、かつＹアダプターの他方の一本鎖部分は、独立して、１０～１５０ヌクレオチドの長さ、例えば、２０～１２０、例えば、３０～１００、例えば、４０～８０、例えば、５０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。Ｙアダプターの二本鎖「ステム」部分は、例えば、１０～１５０ヌクレオチドの長さ、例えば、２０～１２０、例えば、３０～１００、例えば、４０～８０、例えば、５０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。
【0171】
アダプターは、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって標的ポリヌクレオチドに連結され得る。アダプターは、別個に合成され、標的ポリヌクレオチドに化学的に付着するか、またはそれに酵素的にライゲーションされ得る。代替的には、アダプターは、標的ポリヌクレオチドのプロセシング中に生成されてもよい。いくつかの実施形態において、アダプターは、標的ポリヌクレオチドの１つの末端において、またはその近くで標的ポリヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態において、アダプターは、標的ポリヌクレオチドの末端の５０以内、例えば、２０以内、例えば、１０ヌクレオチド以内で、標的ポリヌクレオチドに連結される。いくつかの実施形態において、アダプターは、標的ポリヌクレオチドの末端で標的ポリヌクレオチドに連結されている。アダプターが標的ポリヌクレオチドに連結されている場合、アダプターは、標的ポリヌクレオチドと同じタイプのヌクレオチドを含み得るか、または標的ポリヌクレオチドに対して異なるヌクレオチドを含み得る。
【0172】
開示される方法での使用に特に適したアダプターは、直鎖ホモポリマー領域（例えば約５～約２０ヌクレオチド、例えば、約１０～約３０ヌクレオチド、例えば、チミンまたはシチジン）および／または１つ以上のテザーもしくはアンカーにハイブリダイズするためのハイブリダイゼーション部位（本明細書でより詳細に説明されるようなもの）を含み得る。そのようなアダプターはまた、標的ポリペプチドに結合するための反応性官能基を含み得る。クリックケミストリー基は、この点で特に適している。例えば、アダプターに含めるための例示的な基には、銅を含まないクリックケミストリーにおいて粒子状になり（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）得る基、例えば、ＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノニン）およびその誘導体に基づく基、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基などが含まれる。そのような基の反応は当技術分野で周知である。例えば、ＢＣＮ基は、典型的には、例えばポリペプチドに取り込むことができるアジド、テトラジンおよびニトロンなどの基と反応する。ＤＢＣＯ基はアジド基に対して高い反応性を示す。特に適切な他の化学基には、２－ピリジンカルボキシアルデヒド（２－ＰＣＡ）基およびそれらの誘導体が含まれる。例えば、６－（アジドメチル）－２－ピリジンカルボキシアルデヒドは、ペプチドのＮ末端アミノ基と反応し得る。
【0173】
スペーサー
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドとの反応によって形成されるコンジュゲート、または本明細書に記載のアダプターは、スペーサーを含み得る。例えば、１つ以上のスペーサーがポリヌクレオチドアダプターに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドアダプターは、１～約２０のスペーサー、例えば、１～約１０、例えば、１～約５のスペーサー、例えば、１、２、３、４、または５のスペーサーを含み得る。スペーサーは、任意の好適な数のスペーサー単位を含み得る。スペーサーは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の移動を妨げるエネルギー障壁を提供し得る。例えば、スペーサーは、ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の牽引力を低下させることによって、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を失速させる可能性がある。これは、例えば、脱塩基スペーサー、すなわち、塩基がポリヌクレオチドアダプター中の１つ以上のヌクレオチドから除去されたスペーサーを使用することによって達成され得る。スペーサーは、例えば、大きい化学基を導入してポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の移動を物理的に妨げることによって、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の移動を物理的に遮断し得る。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドとの反応によって形成されるコンジュゲート、または本明細書に記載のアダプターは、スペーサーを含み得る。例えば、１つ以上のスペーサーがポリヌクレオチドアダプターに存在し得る。例えば、ポリヌクレオチドアダプターは、１～約２０のスペーサー、例えば、１～約１０、例えば、１～約５のスペーサー、例えば、１、２、３、４、または５のスペーサーを含み得る。スペーサーは、任意の好適な数のスペーサー単位を含み得る。スペーサーは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の移動を妨げるエネルギー障壁を提供し得る。例えば、スペーサーは、ポリヌクレオチド上のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の牽引力を低下させることによって、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を失速させる可能性がある。これは、例えば、脱塩基スペーサー、すなわち、塩基がポリヌクレオチドアダプター中の１つ以上のヌクレオチドから除去されたスペーサーを使用することによって達成され得る。スペーサーは、例えば、大きい化学基を導入してポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の移動を物理的に妨げることによって、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の移動を物理的に遮断し得る。
【0174】
いくつかの実施形態において、１つ以上のスペーサーは、それらがナノポアを通過するときまたはナノポアを横切るとき、すなわちそれらがナノポアに対して移動するときに、特有のシグナルを提供するため、本明細書に請求する方法で使用されるようなポリヌクレオチドもしくはコンジュゲート中、またはアダプター中に含まれる。
【0175】
いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリマーなどの直鎖状分子を含み得る。典型的には、かかるスペーサーは、コンジュゲート中で使用されるポリヌクレオチドとは異なる構造を有する。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、当該または各スペーサーは、典型的には、ＤＮＡを含まない。とりわけ、ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、当該または各スペーサーは、好ましくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する合成ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つ以上のニトロインドール、１つ以上のイノシン、１つ以上のアクリジン、１つ以上の２－アミノプリン、１つ以上の２－６－ジアミノプリン、１つ以上の５－ブロモ－デオキシウリジン、１つ以上の逆位チミジン（逆位ｄＴ）、１つ以上の逆位ジデオキシ－チミジン（ｄｄＴ）、１つ以上のジデオキシ－シチジン（ｄｄＣ）、１つ以上の５－メチルシチジン、１つ以上の５－ヒドロキシメチルシチジン、１つ以上の２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、１つ以上のイソ－デオキシシチジン（Ｉｓｏ－ｄＣ）、１つ以上のイソ－デオキシグアノシン（Ｉｓｏ－ｄＧ）、１つ以上のＣ３（ＯＣ３Ｈ６ＯＰＯ３）基、１つ以上の光切断可能な（ＰＣ）［ＯＣ３Ｈ６－Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２－Ｃ６Ｈ３ＮＯ２－ＣＨ（ＣＨ３）ＯＰＯ３］基、１つ以上のヘキサンジオール基、１つ以上のスペーサー９（ｉＳｐ９）［（ＯＣＨ２ＣＨ２）３ＯＰＯ３］基、もしくは１つ以上のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）［（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＰＯ３］基、または１つ以上のチオール結合を含み得る。スペーサーは、これらの基の任意の組み合わせを含み得る。これらの基のうちの多くは、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））から市販されている。例えば、Ｃ３、ｉＳｐ９、およびｉＳｐ１８スペーサーはすべてＩＤＴ（登録商標）から入手可能である。スペーサーは、スペーサー単位として任意の数の上記の基を含み得る。
【0176】
いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を失速させる１つ以上の化学基を含み得る。いくつかの実施形態では、好適な化学基は、１つ以上のペンダント化学基である。１つ以上の化学基は、ポリヌクレオチド、構築物またはアダプター中の１つ以上の核酸塩基に付着し得る。１つ以上の化学基は、ポリヌクレオチドアダプターの骨格に付着し得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上などの任意の数の適切な化学基が存在し得る。好適な基には、フルオロフォア、ストレプトアビジンおよび／またはビオチン、コレステロール、メチレンブルー、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニンおよび／または抗ジゴキシゲニン、ならびにジベンジルシクロオクチン基が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、スペーサーはポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリペプチドまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるポリマーを含み得る。
【0177】
いくつかの実施形態では、スペーサーは、１つ以上の脱塩基ヌクレオチド（すなわち、核酸塩基を欠くヌクレオチド）、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれ以上の脱塩基ヌクレオチドを含み得る。核酸塩基は、脱塩基ヌクレオチドにおける－Ｈ（ｉｄＳｐ）または－ＯＨによって置き換えられ得る。脱塩基スペーサーは、１つ以上の隣接するヌクレオチドから核酸塩基を除去することによって、標的ポリヌクレオチド中に挿入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、３－メチルアデニン、７－メチルグアニン、１，Ｎ６－エテノアデニンイノシン、またはヒポキサンチンを含むように修飾され得、核酸塩基は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）を使用してこれらのヌクレオチドから除去され得る。代替的には、ポリヌクレオチドは、ウラシルを含むように修飾され得、核酸塩基は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって除去され得る。一実施形態では、１つ以上のスペーサーは、いずれの脱塩基ヌクレオチドも含まない。
【0178】
スペーサーを使用してポリヌクレオチドアダプター上でヘリカーゼなどのポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を失速させる方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３５８３８に記載されている。
【0179】
アンカー
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドとのそのコンジュゲート、またはそれに付着したアダプターは、例えばアダプターに付着した膜アンカーまたは膜貫通ポアアンカーを含み得る。一実施形態では、アンカーは、本明細書に開示される方法によるコンジュゲートの特徴付けを助ける。例えば、膜アンカーまたは膜貫通ポアアンカーは、膜のナノポアの周りのコンジュゲートの局在化を促進し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドとのそのコンジュゲート、またはそれに付着したアダプターは、例えばアダプターに付着した膜アンカーまたは膜貫通ポアアンカーを含み得る。一実施形態では、アンカーは、本明細書に開示される方法によるコンジュゲートの特徴付けを助ける。例えば、膜アンカーまたは膜貫通ポアアンカーは、膜のナノポアの周りのコンジュゲートの局在化を促進し得る。
【0180】
アンカーは、膜に挿入することができるポリペプチドアンカーおよび／または疎水性アンカーであり得る。一実施形態では、疎水性アンカーは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質、またはアミノ酸であり、例えば、コレステロール、パルミチン酸塩、またはトコフェロールである。アンカーは、チオール、ビオチン、または界面活性剤を含み得る。
【0181】
一態様では、アンカーは、（ストレプトアビジンへの結合のための）ビオチン、（マルトース結合タンパク質または融合タンパク質への結合のための）アミロース、（ポリ－ヒスチジンまたはポリ－ヒスチジンタグ付きタンパク質への結合のための）Ｎｉ－ＮＴＡ、または（抗原などの）ペプチドであり得る。
【0182】
一実施形態では、アンカーは、１つのリンカー、または２、３、４、もしくはそれ以上のリンカーを含み得る。好ましいリンカーには、ポリマー、例えば、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖、およびポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。これらのリンカーは直鎖状、分岐状、または環状であってもよい。例えば、リンカーは環状ポリヌクレオチドであってもよい。アダプターは、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補的配列にハイブリダイズし得る。１つ以上のアンカーまたは１つ以上のリンカーは、切断または分解することができる成分、例えば制限部位または光解離性基を含み得る。リンカーは、マレイミド基で官能化されて、タンパク質のシステイン残基に付着する。好適なリンカーは、ＷＯ２０１０／０８６６０２に記載されている。
【0183】
一実施形態では、アンカーは、コレステロールまたは脂肪アシル鎖である。例えば、ヘキサデカン酸などの６～３０の炭素原子長を有する任意の脂肪アシル鎖が使用され得る。好適なアンカーおよびアンカーをアダプターに付着させる方法の例は、ＷＯ２０１２／１６４２７０およびＷＯ２０１５／１５０７８６に開示されている。
【0184】
ナノポアに対するコンジュゲートの移動の制御
上でより詳細に説明されるように、本明細書で提供される方法は、コンジュゲートを、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含む。
上でより詳細に説明されるように、本明細書で提供される方法は、コンジュゲートを、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と接触させることと、コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに、ポリペプチドに特徴的な１つ以上の測定を行うことと、を含む。
【0185】
ナノポアに対するコンジュゲートの移動は、任意の適切な手段によって駆動され得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの移動は、物理的または化学的力（電位）によって駆動される。いくつかの実施形態では、物理的な力は、電気的（例えば電圧）電位または温度勾配などによって提供される。
【0186】
いくつかの実施形態では、電位がナノポアを横切って印加されると、コンジュゲートはナノポアに対して移動する。ポリヌクレオチドは負に帯電しているため、ナノポアを横切って電位を印加すると、ポリヌクレオチドは、印加された電位の影響下でナノポアに対して移動する。例えば、正の電位がナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加されると、負に帯電した分析物がナノポアのシス側からナノポアのトランス側に移動するように誘導される。同様に、正の電位がナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加される場合、これは、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側への負に帯電した分析物の移動を妨げる。負の電位がナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加されると、逆のことが起こる。適切な電圧を印加する装置および方法は、本明細書でより詳細に記載されている。
【0187】
いくつかの実施形態では、化学的力は、濃度（例えば、ｐＨ）勾配によって提供される。
【0188】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、物理的または化学的力（電位）と同じ方向へのコンジュゲートの移動を制御する。例えば、いくつかの実施形態では、正の電位が、ナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加され、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御する。いくつかの実施形態において、正の電位は、ナノポアのトランス側に対してナノポアのシス側に印加され、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御する。
【0189】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、物理的または化学的力（電位）とは反対の方向へのコンジュゲートの移動を制御する。例えば、いくつかの実施形態では、正の電位が、ナノポアのシス側に対してナノポアのトランス側に印加され、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのトランス側からナノポアのシス側へのコンジュゲートの移動を制御する。いくつかの実施形態では、正の電位が、ナノポアのトランス側に対してナノポアのシス側に印加され、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアのシス側からナノポアのトランス側へのコンジュゲートの移動を制御する。
【0190】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートの移動は、電位が印加されていない状態で、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質によって駆動される。
【0191】
開示される方法において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアに対するポリヌクレオチドの移動を制御することができる。言い換えれば、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートの移動を制御することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの移動を制御することができる。
【0192】
適切なポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、モータータンパク質またはポリヌクレオチドハンドリング酵素としても知られている。適切なポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は当技術分野で知られており、いくつかの例示的なポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、以下により詳細に記載されている。
【0193】
一実施形態では、モータータンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリング酵素であるか、またはそれに由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドと相互作用し、かつその少なくとも１つの特性を修飾することができるポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジ－またはトリヌクレオチドを形成するために、ポリヌクレオチドを切断することによってポリヌクレオチドを修飾してもよい。酵素は、それを配向するか、またはそれを特定の位置に移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾してもよい。
【0194】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ナノポアとの接触の前にコンジュゲート上に存在することができる。例えば、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲート中のポリヌクレオチド上に存在することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートの一部を含むアダプター上に存在するか、またはコンジュゲートの部分上に存在することができる。
【0195】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位と接触しているコンジュゲートの部分がポリペプチドを含む場合、コンジュゲートに結合したままであることができる。言い換えれば、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がコンジュゲートのポリペプチド部分と接触するとき、コンジュゲートから解離しない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、コンジュゲートの１つ以上の後続のポリヌクレオチド部分が接触するまで、ポリペプチド部分に対して自由に移動する。
【0196】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリペプチドを含むコンジュゲートの部分と接触するときに、コンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはアダプターから（コンジュゲート、ポリヌクレオチドまたはアダプターの末端から外れる（ｐａｓｓ ｏｆｆ）ことによる以外で）離脱するのを防ぐように修飾される。そのような修飾されたポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、開示される方法での使用に特に適している。
【0197】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を任意の好適な方法で適合させることができる。例えば、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチド、コンジュゲート、またはアダプター上に装填され、その後、それが離脱するのを防ぐために修飾され得る。あるいは、ポリヌクレオチド、コンジュゲート、またはアダプター上に装填する前に、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を修飾して、タンパク質が離脱するのを防ぐことができる。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチド、コンジュゲートまたはアダプターから離脱するのを防ぐためのポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の修飾は、当技術分野で既知の方法、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０１３２６０において考察されている方法を使用して、かつポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチド鎖から離脱するのを防ぐためのヘリカーゼなどのポリヌクレオチドハンドリングタンパク質（ポリヌクレオチド結合タンパク質）の修飾について記載する一節を特に参照して達成することができる。
【0198】
例えば、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がポリヌクレオチド鎖から離脱したときにその鎖が通過することができるポリヌクレオチド非結合開口部、例えば、空洞、溝、または空隙を有し得る。いくつかの実施形態では、所与のモータータンパク質（ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質）のポリヌクレオチド非結合開口部は、その構造を参照することにより、例えば、そのＸ線結晶構造を参照することにより決定することができる。Ｘ線結晶構造は、ポリヌクレオチド基質の存在下および／または不在下で得ることができる。いくつかの実施形態では、所与のポリヌクレオチドハンドリングタンパク質におけるポリヌクレオチド非結合開口部の位置は、当該技術分野で既知の標準パッケージを使用して分子モデリングによって推定または確認され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド非結合開口部は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の１つ以上の部分、例えば、１つ以上のドメインの移動によって一時的に生成され得る。
【0199】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質（モータータンパク質）は、ポリヌクレオチド非結合開口部を閉鎖することによって修飾され得る。したがって、ポリヌクレオチド非結合開口部を閉鎖することは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がコンジュゲートのポリペプチド部分から離脱するのを防ぐだけでなく、それがポリヌクレオチドまたはアダプターから離脱するのを防ぐことができる。例えば、モータータンパク質は、ポリヌクレオチド非結合開口部を共有結合的に閉鎖することによって修飾され得る。いくつかの実施形態では、このように対処するのに好ましいモータータンパク質は、本明細書に記載するようなヘリカーゼである。したがって、開示される方法のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチド鎖が結合を解くことができる未修飾タンパク質の少なくとも１つのコンフォメーション状態に存在する開口部を完全にまたは部分的に閉鎖するように修飾される。
【0200】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、本明細書に開示される方法で特徴付けられるコンジュゲートで使用されるポリヌクレオチドに従って選ばれるかまたは選択され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、コンジュゲートの移動を制御するために使用されるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質に従って選ばれるかまたは選択され得る。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、典型的には、ＤＮＡモータータンパク質を使用することができる。ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、ＲＮＡモータータンパク質を使用できる。ポリヌクレオチドがＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである場合、ＤＮＡとＲＮＡの両方をプロセシングできるモータータンパク質を使用できる。
【0201】
一実施形態では、モータータンパク質は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０、および３．１．３１のうちのいずれかのメンバーに由来する。
【0202】
特許請求される方法のいくつかの実施形態では、モータータンパク質は、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、またはそれらの変異体である。
【0203】
一実施形態では、モータータンパク質は、エキソヌクレアーゼである。好適な酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号１）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号２）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ（配列番号３）およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号４）、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼ、ならびにそれらの変異形が含まれるが、これらに限定されない。配列番号３に示される配列またはその変異形を含む３つのサブユニットが相互作用して、トリマーエキソヌクレアーゼを形成する。
【0204】
一実施形態では、モータータンパク質は、ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、ＮＥＢ製のＫｌｅｎｏｗ、またはそれらの変異形であり得る。一実施形態では、酵素は、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）またはその変異形である。開示する方法に使用され得るＰｈｉ２９ポリメラーゼの修飾されたバージョンが米国特許第５，５７６，２０４号に開示されている。
【0205】
ポリヌクレオチドに相補的な鎖を合成することによってコンジュゲートの移動を制御することを含む、本明細書で提供される方法の実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、典型的にはポリメラーゼ、例えば本明細書に記載のポリメラーゼである。
【0206】
一実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、トポイソメラーゼである。一実施形態では、トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のうちのいずれかのメンバーである。トポイソメラーゼは、ＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの形成を触媒することができる酵素である逆転写酵素であり得る。それらは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）から市販されている。
【0207】
一実施形態では、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ヘリカーゼである。任意の好適なヘリカーゼを本明細書に提供される方法に従って使用することができる。例えば、本開示に従って使用される当該または各モータータンパク質は独立して、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼ、ＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、およびＤｄａヘリカーゼ、またはそれらの変異形から選択され得る。単量体ヘリカーゼは、一緒に付着したいくつかのドメインを含み得る。例えば、ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、リラクゼースドメイン、およびＣ末端ドメインを含み得る。これらのドメインは、典型的には、オリゴマーを形成することなく機能することができる単量体ヘリカーゼを形成する。好適なヘリカーゼの具体的な例には、Ｈｅｌ３０８、ＮＳ３、Ｄｄａ、ＵｖｒＤ、Ｒｅｐ、ＰｃｒＡ、Ｐｉｆ１、およびＴｒａＩが挙げられる。これらのヘリカーゼは、典型的には、一本鎖ＤＮＡに作用する。二本鎖ＤＮＡの両方の鎖に沿って移動することができるヘリカーゼの例には、ＦｔｆＫおよび六量体酵素複合体、またはＲｅｃＢＣＤなどのマルチサブユニット複合体が挙げられる。ＮＳ３ヘリカーゼは、ＤＮＡとＲＮＡの両方をプロセシングすることができ、したがって、標的二本鎖核酸がＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである開示される方法の実施形態において使用され得るため、開示される方法での使用に特に適している。
【0208】
Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、全内容が参照により組み込まれるＷＯ２０１３／０５７４９５などの出版物に記載されている。ＲｅｃＤヘリカーゼは、全内容が参照により組み込まれるＷＯ２０１３／０９８５６２などの出版物に記載されている。ＸＰＤヘリカーゼは、全内容が参照により組み込まれるＷＯ２０１３／０９８５６１などの出版物に記載されている。Ｄｄａヘリカーゼは、各々の全内容が参照により組み込まれるＷＯ２０１５／０５５９８１およびＷＯ２０１６／０５５７７７などの出版物に記載されている。
【0209】
一実施形態では、ヘリカーゼは、配列番号６に示される配列（Ｔｒｗｃ Ｃｂａ）もしくはその変異形、配列番号７に示される配列（Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ）もしくはその変異形、または配列番号８に示される配列（Ｄｄａ）もしくはその変異形を含む。変異形は、本明細書で考察される方法のうちのいずれかで天然配列とは異なり得る。配列番号８の例示的な変異形は、Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃを含む。配列番号８のさらなる例示的な変異形は、Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、次いでＧ１およびＧ２の付加）を含む。
【0210】
いくつかの実施形態では、モータータンパク質（例えば、ヘリカーゼ）は、少なくとも２つの活性動作モード（モータータンパク質が移動を促進するのに必要なすべての成分、例えば、本明細書で考察されるＡＴＰおよびＭｇ２＋などの燃料および補因子を備えている場合）および１つの不活性動作モード（モータータンパク質が移動を促進するのに必要な成分を備えていない場合）でコンジュゲートの移動を制御することができる。
【0211】
移動を容易にするのに必要なすべての成分を備えている場合（つまり、活性モードで）、モータータンパク質（エゲリカーゼ）は、ポリヌクレオチドに沿って５’から３’または３’から５’の方向（モータータンパク質によって異なる）に移動する。モータータンパク質を使用して、コンジュゲートをポアから（例えば、適用された力に反して）遠ざける（例えば、外に出す）、またはコンジュゲートをポアに（例えば、適用された力とともに）向かって（例えば中に入れる）移動させることができる。例えば、モータータンパク質が向かって移動するコンジュゲートの末端がポアによって捕捉されると、モータータンパク質は、力の方向に逆らって作用し、ねじ状（ｔｈｒｅａｄｅｄ）のコンジュゲートをポアから（例えばシスチャンバー内に）引き抜く。しかしながら、モータータンパク質が離れて移動する端がポア内で捕捉されると、モータータンパク質は、力の方向に従って作用し、ねじ状コンジュゲートをポア内に（例えば、トランスチャンバー内に）押し込む。
【0212】
モータータンパク質（例えば、ヘリカーゼ）が移動を促進するのに必要な成分を備えていない場合（すなわち、不活性モードで）、モータータンパク質は、コンジュゲートに結合し、例えば力によってポア内に引き込まれることによってそれがナノポアに対して移動するときに構築物の移動を遅延させるブレーキとして機能することができる。不活性モードでは、コンジュゲートのどちらの末端が捕捉されるかは問題ではなく、コンジュゲートのポアに対する移動を決定する適用された力が重要であり、ポリヌクレオチド結合タンパク質はブレーキとして機能する。不活性モードの場合、ポリヌクレオチド結合タンパク質によるコンジュゲートの移動の制御は、ラチェッティング、スライディング、およびブレーキングを含むいくつかの方法で説明することができる。
【0213】
モータータンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドのプロセシングをハンドリングするために燃料を必要とする。燃料は、典型的には、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体である。遊離ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）のうちの１つ以上であり得るが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、通常、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、典型的には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。
【0214】
モータータンパク質の補因子は、モータータンパク質が機能することを可能にする因子である。補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＣｏ２＋である。補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【0215】
本明細書で説明するように、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用される場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアとの間の距離を延長するために、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が修飾される。
【0216】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、任意の適切な方法で修飾され得る。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質などのタンパク質の修飾は、当業者の知識の範囲内である。
【0217】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、タンパク質構造に追加のアミノ酸を導入することによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、タンパク質の自然の範囲を超えて延びる１つ以上のループ領域を導入することによって修飾される。ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が複数のサブユニットを含む実施形態において、１つ以上のループ領域が、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の１つ以上のサブユニットに導入され得る。
【0218】
ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対して「着座位置」にあるときに、ナノポアを置換するために、１つ以上の追加のドメインの融合によって修飾され得る。
【0219】
ナノポア
上で説明したように、本明細書に開示される方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用して、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することを含む。
上で説明したように、本明細書に開示される方法は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質を使用して、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御することを含む。
【0220】
開示される方法では、任意の適切なナノポアを使用することができる。一実施形態では、ナノポアは、膜貫通ポアである。
【0221】
膜貫通ポアは、膜をある程度横断する構造である。それにより、印加電位によって駆動される水和イオンが膜を横切って流れるまたは膜内に流れることが可能になる。膜貫通ポアは、典型的には、膜全体を横断し、これにより、水和イオンが膜の片側から膜の反対側に流れることができるようになる。しかしながら、膜貫通ポアは膜を横断する必要はない。一方の末端が閉鎖していてもよい。例えば、ポアは、膜中のウェル、間隙、チャネル、溝、またはスリットであり得、それに沿ってまたはその中に水和イオンが流れることができる。
【0222】
任意の膜貫通ポアが本明細書に提供される方法で使用され得る。ポアは、生物学的であっても人工であってもよい。好適な細孔は、タンパク質細孔、ポリヌクレオチド細孔、および固体細孔を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、固体ポアは、ナノチャネルを含み得る。細孔は、ＤＮＡ折り紙細孔であり得る（Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３８：９３２－９３６）。好適なＤＮＡ折り紙ポアは、ＷＯ２０１３／０８３９８３に開示されている。
【0223】
一実施形態では、ナノポアは、膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、ポリヌクレオチドなどの水和イオンが膜の片側から膜の反対側へ流れることを可能にするポリペプチドまたはポリペプチドの集合体である。本明細書に提供される方法では、膜貫通タンパク質ポアは、印加電位によって駆動される水和イオンが膜の片側から反対側に流れることを可能にするポアを形成することができる。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくは、ポリヌクレオチドがトリブロックコポリマー膜などの膜の片側から反対側に流れることを可能にする。膜貫通タンパク質ポアは、ポリヌクレオチドをポアを通して移動させることを可能にする。
【0224】
一実施形態では、ナノポアは、モノマーまたはオリゴマーである膜貫通タンパク質ポアである。ポアは、好ましくは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、または少なくとも１６のサブユニットなどのいくつかの繰り返しサブユニットから構成されている。ポアは、好ましくは、六量体、七量体、八量体、または九量体ポアである。ポアは、ホモオリゴマーであってもヘテロオリゴマーであってもよい。
【0225】
一実施形態では、膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを含む。ポアのサブユニットは、典型的には、中心軸を取り囲み、鎖を膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通α－ヘリックスバンドルもしくはチャネルに寄与する。
【0226】
典型的には、膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、標的ポリヌクレオチド（本明細書に記載のもの）などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレルまたはチャネルの狭窄の近くに位置する。膜貫通タンパク質ポアは、典型的には、アルギニン、リジン、もしくはヒスチジンなどの１つ以上の正電荷アミノ酸、またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的には、ポアと、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸との間の相互作用を促進する。
【0227】
一実施形態では、ナノポアは、βバレルポアまたはαヘリックスバンドルポアに由来する膜貫通タンパク質ポアである。β－バレルポアは、β鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβ－バレルポアには、β－毒素、例えば、α－溶血毒、炭疽毒素、およびロイコシジン、ならびに細菌の外膜タンパク質／ポリン、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓポリン（Ｍｓｐ）、例えば、ＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、またはＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）、ならびに他のポア、例えば、リセニンが含まれるが、これらに限定されない。α－ヘリックスバンドルポアは、α－ヘリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なα－ヘリックスバンドル細孔は、内膜タンパク質およびα外膜タンパク質、例えばＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素を含むが、これらに限定されない。
【0228】
一実施形態では、ナノポアは、Ｍｓｐ、α－溶血素（α－ＨＬ）、リセニン、ＣｓｇＧ、ＣｌｙＡ、Ｓｐ１、もしくは溶血性タンパク質フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）に由来するか、またはそれらに基づく膜貫通ポアである。
【0229】
一実施形態では、ナノポアは、ＣｓｇＧ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ－１２亜株ＭＣ４１００由来のＣｓｇＧに由来する。かかるポアはオリゴマーであり、典型的には、ＣｓｇＧに由来する７、８、９、または１０個のモノマーを含む。ポアは、同一のモノマーを含むＣｓｇＧに由来するホモオリゴマーポアであり得る。あるいは、ポアは、他とは異なる少なくとも１つのモノマーを含むＣｓｇＧに由来するヘテロオリゴマーポアであり得る。ＣｓｇＧに由来する好適なポアの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０３４５９１に開示されている。
【0230】
一実施形態では、ナノポアは、リセニンに由来する膜貫通ポアである。リセニンに由来する好適なポアの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１５３３５９に開示されている。
【0231】
一実施形態では、ナノポアは、α－溶血素（α－ＨＬ）に由来するか、またはそれに基づく膜貫通ポアである。野生型α－溶血毒ポアは、７つの同一のモノマーまたはサブユニットから形成される（すなわち、それは七量体である）。α－溶血素ポアは、α－溶血素－ＮＮまたはその変異形であり得る。変異形は、好ましくは、Ｅ１１１位およびＫ１４７位にＮ残基を含む。
【0232】
一実施形態では、ナノポアは、Ｍｓｐに由来する、例えば、ＭｓｐＡに由来する膜貫通タンパク質ポアである。ＭｓｐＡに由来する好適なポアの例は、ＷＯ２０１２／１０７７７８に開示されている。
【0233】
一実施形態では、ナノポアは、ＣｌｙＡに由来するか、またはそれに基づく膜貫通ポアである。
【0234】
上で説明したように、いくつかの実施形態では、ナノポアは狭窄を含む。狭窄は、典型的には、ナノポアを通るチャネルの狭小化であり、これは、コンジュゲートがナノポアに対して移動するときに得られるシグナルを決定または制御し得る。本明細書で使用される場合、タンパク質および固体ナノポアの両方は、典型的には、「狭窄」を含む。
【0235】
いくつかの実施形態において、ナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質が、ナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用されている場合、ナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。いくつかの実施形態において、ナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアと接触しているときに、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。
【0236】
いくつかの実施形態において、ナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位とナノポアの狭窄領域との間の距離を延長するように修飾される。そのような実施形態では、距離は、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアに対するコンジュゲートの移動を制御するために使用されている場合、および／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質がナノポアと接触している場合、ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位とナノポアの狭窄との間の距離であり得る。
【0237】
ナノポアは、任意の適切な方法で修飾され得る。タンパク質ナノポアなどのナノポアの修飾は、当業者の知識の範囲内である。固体ナノポアの修飾はルーチンであり、ナノポアが形成される基板を制御する（例えば厚さ）かまたはナノポアが形成される構成要素を制御することによって達成され得る。
【0238】
例えば、ナノポアは、ポアを通るチャネルの長さを延長するように修飾され得る。
【0239】
タンパク質ナノポアは、ポア構造に追加のアミノ酸を導入することによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質ナノポアは、ナノポアの自然の範囲を超えて延びる１つ以上のループ領域を導入することによって修飾される。ナノポアが複数のサブユニットを含む実施形態では、１つ以上のループ領域を、ナノポアの１つ以上のサブユニットに導入することができる。ループ領域は、例えば、ナノポアのシス入口を超えて延びることができる。
【0240】
タンパク質ナノポアは、ポアを通るバレルまたはチャネルの長さを延長するように修飾され得る。例えば、ベータバレルのポアは、バレルを形成する部分のタンパク質配列に追加のアミノ酸を導入することによって修飾され、それによりバレルの長さを延長し得る。そのような修飾に関連する位置の合理的な設計は、例えば、タンパク質および／またはそのモノマーサブユニットの構造（例えば、Ｘ線）構造を参照することによって行うことができる。
【0241】
タンパク質ナノポアは、１つ以上の追加ドメインの融合によって修飾されて、ナノポアに対するポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の「着座位置」を上げることができる。
【0242】
いくつかの実施形態では、タンパク質ナノポアを別のタンパク質ナノポアに融合することによってタンパク質ナノポアを修飾することが可能である。このようにして、ナノポアの鎖を、それを通る単一のチャネルを含めて作製して、チャネルの狭窄とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を伸ばすことができる。このような場合、複数のナノポアは同じであっても異なっていてもよい。
【0243】
タグ
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、例えば、ナノポアによるコンジュゲートの捕捉を促進するために、ナノポア上のタグを使用することができる。
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、例えば、ナノポアによるコンジュゲートの捕捉を促進するために、ナノポア上のタグを使用することができる。
【0244】
ナノポア上のタグとポリヌクレオチド上の結合部位との間の相互作用（例えばコンジュゲートのポリヌクレオチド部分、またはコンジュゲートに付着したアダプターに存在する結合部位、ここで、結合部位はアダプターのアンカーもしくはリーダー配列によって、またはアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列によって提供することができる）は、可逆的であってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、例えばそのアダプターを介してナノポア上のタグに結合し、例えばナノポアによるポリヌクレオチドの特徴付け中および／またはモータータンパク質によるプロセシング中のある時点で放出することができる。強い非共有結合（例えば、ビオチン／アビジン）は依然として可逆的であり、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において有用である。例えば、相補体が（ナノポアから分離して拡散することなく）ナノポアの近傍に保持されるが、プロセシングされるときにナノポアから放出できるように、二本鎖ポリヌクレオチドの相補体（またはその相補体に付着しているアダプターの部分）とナノポアとの間の十分な相互作用を提供するために、ポアタグおよびポリヌクレオチドアダプターのペアを設計してもよい。
【0245】
ポアタグとポリヌクレオチドアダプターは、ナノポア上のタグへのポリヌクレオチド上の結合部位（例えば、アダプターのアンカーもしくはリーダー配列によって、またはアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列によって提供される結合部位）の結合強度またはアフィニティが、適用された力がかかり、結合したポリヌクレオチドをナノポアから放出するまで、ナノポアとポリヌクレオチドの間のカップリングを維持するのに十分であるように、構成され得る。
【0246】
いくつかの実施形態では、タグまたはテザーは荷電されていない。これにより、電位差が存在するならば、その影響下でタグまたはテザーがナノポア内に引き込まれないことを確実にすることができる。
【0247】
コンジュゲート、ポリヌクレオチドもしくはアダプターを引き付けるかまたはこれらに結合する１つ以上の分子が、ナノポアに連結されていてもよい。コンジュゲート、アダプターおよび／またはポリヌクレオチドにハイブリダイズする任意の分子を使用してもよい。ポアに付着した分子は、ＰＮＡタグ、ＰＥＧリンカー、短いオリゴヌクレオチド、正荷電アミノ酸およびアプタマーから選択してもよい。そのような分子がポアに結合していることは当該分野において既知である。例えば、短いオリゴヌクレオチドが付着したポアは、Ｈｏｗａｒｋａ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：６３６－６３９およびＷＯ２０１０／０８６６２０に開示されており、ポアのルーメン内に付着したＰＥＧを含むポアは、Ｈｏｗａｒｋａ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（１１）：２４１１－２４１６に開示されている。
【0248】
コンジュゲート中（例えばアダプター中のリーダー配列または別の一本鎖配列中）の配列に相補的な配列を含む、ナノポアに付着した短いオリゴヌクレオチドを使用して、本明細書記載の方法において、コンジュゲートの捕捉を増強してもよい。
【0249】
いくつかの実施形態では、タグまたはテザーは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、またはモルフォリノ）を含んでも、またはそれであってもよい。オリゴヌクレオチドは、約１０～３０ヌクレオチドの長さまたは約１０～２０ヌクレオチドの長さを有することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、他の修飾箇所または例えばビーズを含む固体基材表面へのコンジュゲート化のために修飾された少なくとも１つの末端（例えば、３´－または５´－末端）を有することができる。末端修飾剤は、結合に使用することができる反応性官能基を付加してもよい。付加することができる官能基の例としては、アミノ、カルボキシル、チオール、マレイミド、アミノオキシ、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。官能基は、オリゴヌクレオチド配列の末端から官能基の物理的距離を加えるために、異なる長さのスペーサー（例えば、Ｃ３、Ｃ９、Ｃ１２、スペーサー９および１８）と組み合わせることができる。
【0250】
オリゴヌクレオチドの３´および／または５´末端修飾の例としては、化学結合のための３´アフィニティタグおよび官能基（例えば、３´－ビオチン、３´－一級アミン、３´－ジスルフィドアミド、３´－ピリジルジチオ、およびそれらの任意の組み合わせを含む）；５´末端修飾（例えば、５´－一級アンミン、および／または５´－ダブシルを含む）；クリックケミストリーのための修飾（例えば、３´－アジド、３´－アルキン、５´－アジド、５´－アルキンを含む）、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0251】
いくつかの実施形態では、タグまたはテザーは、例えば、ナノポアへのカップリングを促進するために、ポリマーリンカーをさらに含んでもよい。例示的なポリマーリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これに限定されない。ポリマーリンカーは、約５００Ｄａ～約１０ｋＤａ（両端を含む）、または約１ｋＤａ～約５ｋＤａ（両端を含む）の分子量を有してもよい。ポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）は、例えば、これらに限定されないが、マレイミド、ＮＨＳエステル、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、アジド、ビオチン、アミン、アルキン、アルデヒド、およびそれらの任意の組み合わせを含む異なる官能基で官能化することができる。
【0252】
タグまたはテザーの他の例には、Ｈｉｓタグ、ビオチンまたはストレプトアビジン、検体に結合する抗体、検体に結合するアプタマー、ＤＮＡ結合ドメインなどの検体結合ドメイン（例えば、ロイシンジッパーのようなペプチドジッパー、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む）、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0253】
当技術分野で既知の任意の方法を使用して、タグまたはテザーをナノポアの外面、例えば、膜のシス側上に付着させてもよい。例えば、１つ以上のタグまたはテザーは、１つ以上のシステイン（システイン結合）、１つ以上のリジンなどの一級アミン、１つ以上の非天然アミノ酸、１つ以上のヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、１つ以上のビオチンまたはストレプトアビジン、１つ以上の抗体に基づいたタグ、エピトープの１つ以上の酵素修飾（例えば、アセチルトランスフェラーゼを含む）、およびそれらの任意の組み合わせを介してナノ細孔に付着することができる。そのような修飾を実施するための好適な方法は、当技術分野で周知である。好適な非天然アミノ酸には、４－アジド－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆａｚ）、およびＬｉｕ Ｃ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｐ．Ｇ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７９，４１３－４４４の図１中の１～７１が付番されたいずれかのアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
【0254】
１つ以上のタグまたはテザーがシステイン結合を介してナノポアに付着しているいくつかの実施形態では、１つ以上のシステインを、ナノポアを形成する１つ以上のモノマーに、置換により、導入することができる。いくつかの実施形態では、ナノポアは、以下の付着によって化学的に修飾され得る：（ｉ）４－フェニルアゾマレイナニル、１．Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）マレイミド、Ｎ－シクロヘキシルマレイミド、１．３－マレイミドプロピオン酸、１．１－４－アミノフェニル－１Ｈ－ピロール，２，５，ジオン、１．１－４－ヒドロキシフェニル－１Ｈ－ピロール，２，５，ジオン、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ－メトキシカルボニルマレイミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルマレイミド、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド、３－マレイミド－プロキシル、Ｎ－（４－クロロフェニル）マレイミド、１－［４－（ジメチルアミノ）－３，５－ジニトロフェニル］－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、Ｎ－［４－（２－ベンズイミダゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ－［４－（２－ベンゾオキサゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ－（１－ナフチル）－マレイミド、Ｎ－（２，４－キシリル）マレイミド、Ｎ－（２，４－ジフルオロフェニル）マレイミド、Ｎ－（３－クロロ－パラ－トリル）－マレイミド、１－（２－アミノ－エチル）－ピロール－２，５－ジオンヒドロクロリド、１－シクロペンチル－３－メチル－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、１－（３－アミノプロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンヒドロクロリド、３－メチル－１－［２－オキソ－２－（ピペラジン－１－イル）エチル］－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオンヒドロクロリド、１－ベンジル－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、３－メチル－１－（３，３，３－トリフルオロプロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、１－［４－（メチルアミノ）シクロヘキシル］－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオントリフルオロ酢酸、ＳＭＩＬＥＳ Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＣ＝２Ｃ＝ＣＮ＝ＣＣ２、ＳＭＩＬＥＳ Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＮ２ＣＣＮＣＣ２、１－ベンジル－３－メチル－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、１－（２－フルオロフェニル）－３－メチル－２，５－ジヒドロ１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン、Ｎ－（４－フェノキシフェニル）マレイミド、Ｎ－（４－ニトロフェニル）マレイミドなどのジアブロモマレイミドを含むマレイミド、（ｉｉ）３－（２－ヨードアセトアミド）－プロキシル、Ｎ－（シクロプロピルメチル）－２－ヨードアセトアミド、２－ヨード－Ｎ－（２－フェニルエチル）アセトアミド、２－ヨード－Ｎ－（２，２，２－トリフルオロエチル）アセトアミド、Ｎ－（４－アセチルフェニル）－２－ヨードアセトアミド、Ｎ－（４－（アミノスルホニル）フェニル）－２－ヨードアセトアミド、Ｎ－（１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－２－ヨードアセトアミド、Ｎ－（２、６－（ジエチルフェニル）－２－ヨードアセトアミド、Ｎ－（２－ベンゾイル－４－クロロフェニル）－２－ヨードアセトアミドなどのヨードアセトアミド、（ｉｉｉ）Ｎ－（４－（アセチルアミノ）フェニル）－２－ブロモアセトアミド、Ｎ－（２－アセチルフェニル）－２－ブロモアセトアミド、２－ブロモ－ｎ－（２－シアノフェニル）アセトアミド、２－ブロモ－Ｎ－（３－（（トリフルオロメチル）フェニル）アセトアミド、Ｎ－（２－ベンゾイルフェニル）－２－ブロモアセトアミド、２－ブロモ－Ｎ－（４－フルオロフェニル）－３－メチルブタンアミド、Ｎ－ベンジル－２－ブロモ－Ｎ－フェニルプロピオンアミド、Ｎ－（２－ブロモ－ブチル）－４－クロロ－ベンゼンスルホンアミド、２－ブロモ－Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアセトアミド、２－ブロモ－Ｎ－フェネチル－アセトアミド、２－アダマンタン－１－イル－２－ブロモ－Ｎ－シクロヘキシル－アセトアミド、２－ブロモ－Ｎ－（２－メチルフェニル）ブタンアミド、モノブロモアセトアニリドなどのブロモアセトアミド、（ｉｖ）アルドリチオール－２、アルドリチオール－４、イソプロピルジスルフィド、１－（イソブチルジスルファニル）－２－メチルプロパン、ジベンジルジスルフィド、４－アミノフェニルジスルフィド、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、ａｍ６ａｍＰＤＰ１－βＣＤなどのジスルフィド、および（ｖ）４－フェニルチアゾール－２－チオール、パーパルド、５，６，７，８－テトラヒドロ－キナゾリン－２－チオールなどのチオール。
【0255】
いくつかの実施形態では、タグまたはテザーは、ナノポアに直接または１つ以上のリンカーを介して付着してもよい。タグまたはテザーは、ＷＯ２０１０／０８６６０２に記載のハイブリリンカーを用いてナノ細孔に付着してもよい。あるいは、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリンカーはアミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可撓性、および親水性は、典型的には、モノマーおよび細孔の機能を妨げないように設計される。好ましい可撓性ペプチドリンカーは２～２０個、例えば、４、６、８、１０、または１６個のセリン、および／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可撓性リンカーは、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、および（ＳＧ）８を含み、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、２～３０個、例えば４、６、８、１６、または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛性リンカーは、Ｐがプロリンである、（Ｐ）１２を含む。
【0256】
膜
典型的には、開示される方法において、ナノポアは典型的には膜に存在する。任意の好適な膜を系で使用することができる。
典型的には、開示される方法において、ナノポアは典型的には膜に存在する。任意の好適な膜を系で使用することができる。
【0257】
膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、親水特性および親油特性の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成された層である。両親媒性分子は、合成または天然に存在するものであり得る。天然に存在しない両親媒性物質および単分子層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で既知であり、それらには、例えば、ブロックコポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７－１０４５０）が含まれる。ブロックコポリマーは、２つ以上のモノマーサブユニットが一緒に重合されて単一ポリマー鎖を作製するポリマー材料である。ブロックコポリマーは、典型的には、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが有しない固有の特性を有し得る。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットのうちの１つが疎水性（すなわち、親油性）である一方で、他のサブユニットが水性媒体中で親水性であるように操作され得る。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒特性を有し得、生体膜を模倣する構造を形成し得る。ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）であり得るが、３つ以上のモノマーサブユニットから構築されて両親媒性物質として挙動するより複雑な配置を形成し得る。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、またはペンタブロックコポリマーであり得る。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
【0258】
古細菌二極性テトラエーテル脂質は、脂質が単分子層膜を形成するように構築される天然に存在する脂質である。これらの脂質は、一般に、厳しい生物環境下で生き残る好極限性細菌、好熱菌、好塩菌、および好酸菌で見つけられる。それらの安定性は、最終二分子層の融合性質から得られると考えられている。一般モチーフ親水性－疎水性－親水性を有するトリブロックポリマーを作製することによってこれらの生物学的実体を模倣するブロックコポリマーを構築することは簡単である。この材料は、脂質二分子層と同様に挙動するモノマー膜を形成し、ベシクルから層状膜に至るまでの幅広い相挙動を包含し得る。これらのトリブロックコポリマーから形成された膜は、生体脂質膜に優るいくつかの利点を有する。トリブロックコポリマーが合成されたものであるため、その正確な構造を慎重に制御して、膜を形成し、かつポアおよび他のタンパク質と相互作用するのに必要な正しい鎖長および特性を提供することができる。
【0259】
ブロックコポリマーは、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構築される場合もあり、例えば、疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作製され得る。ブロックコポリマーの親水性サブセクションは低いタンパク質結合特性も有し得、これは、生の生体試料に曝露されたときに高度に耐性である膜の作製を可能にする。このヘッド基単位は、非分類脂質ヘッド基に由来する場合もある。
【0260】
トリブロックコポリマー膜は、生体脂質膜と比較して増加した機械的および環境的安定性、例えば、はるかに高い動作温度またはｐＨ範囲も有する。ブロックコポリマーの合成性質は、ポリマー系膜を幅広い用途のためにカスタマイズする基盤を提供する。
【0261】
いくつかの実施形態では、膜は、国際出願第ＷＯ２０１４／０６４４４３号または同第ＷＯ２０１４／０６４４４４号に開示される膜のうちの１つである。
【0262】
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドのカップリングを容易にするように化学的に修飾されても官能化されてもよい。両親媒性層は、単分子層であっても二分子層であってもよい。両親媒性層は、典型的には、平面である。両親媒性層は、湾曲していてもよい。両親媒性層は、支持されていてもよい。
【0263】
両親媒性膜は、典型的には、およそ１０－８ｃｍ ｓ－１の脂質拡散速度を有する二次元流体として本質的に作用する天然に移動性である。これは、ポアおよびカップリングされたポリヌクレオチドが典型的には両親媒性膜内で移動することができることを意味する。
【0264】
膜は、脂質二分子層であり得る。脂質二分子層は、細胞膜のモデルであり、幅広い実験研究のための優れた基盤として機能する。例えば、脂質二分子層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のインビトロ調査のために使用することができる。あるいは、脂質二分子層は、幅広い物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使用することができる。脂質二分子層は、任意の脂質二分子層であり得る。好適な脂質二分子層には、平面脂質二分子層、支持二分子層、またはリポソームが含まれるが、これらに限定されない。脂質二分子層は、好ましくは、平面脂質二分子層である。好適な脂質二分子層は、ＷＯ２００８／１０２１２１、ＷＯ２００９／０７７７３４、およびＷＯ２００６／１００４８４に開示されている。
【0265】
脂質二分子層を形成するための方法は、当該技術分野で既知である。脂質二分子層は、Ｍｏｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２；６９：３５６１－３５６６）の方法によって一般に形成され、この方法において、脂質一分子層は、水溶液／空気界面上で、その界面に対して直角な孔の両側を通り過ぎて担持される。脂質は、通常、最初にそれを有機溶媒中に溶解し、次いで少量の溶媒を孔の両側で水溶液の界面上で蒸発させることによって、電解質水溶液の界面に添加される。有機溶媒が蒸発すると、開口の両側の溶液／空気界面は、二分子層が形成されるまで開口を越えて物理的に上下に移動する。平面脂質二分子層は、開口を横切って膜内にまたは開口部を横切って陥凹部内に形成され得る。
【0266】
Ｍｏｎｔａｌ＆Ｍｕｅｌｌｅｒの方法は、タンパク質ポア挿入に好適な良質の脂質二分子層を形成するための費用対効果の高い、比較的簡単な方法であるため、好評である。二分子層形成の他の一般的な方法には、先端浸漬（ｔｉｐ－ｄｉｐｐｉｎｇ）、二分子層の塗装（ｐａｉｎｔｉｎｇ ｂｉｌａｙｅｒｓ）、およびリポソーム二分子層のパッチクランプが含まれる。
【0267】
先端浸漬二分子層形成は、脂質の単分子層を担持する試験溶液の表面上に開口面（例えば、ピペットチップ）を接触させることを伴う。この場合もやはり、脂質単分子層は、最初に有機溶媒中に溶解した少量の脂質を溶液表面で蒸発させることによって溶液／空気界面で生成される。その後、二分子層はラングミュア－シェーファー法によって形成され、溶液表面に対して開口を移動させるための機械的自動化を必要とする。
【0268】
二分子層の塗装の場合、有機溶媒中に溶解した少量の脂質が試験水溶液中に浸した開口に直接塗布される。脂質溶液は、塗装用刷毛または同等のものを使用して開口にわたって薄く広げられる。溶媒を薄くすることにより、脂質二分子層の形成がもたらされる。しかしながら、二分子層から溶媒を完全に除去することは困難であり、その結果として、この方法によって形成された二分子層は安定性が低く、電気化学的測定中にノイズを生じやすい。
【0269】
パッチクランプは、生体細胞膜の研究で一般に使用されている。細胞膜は吸引によりピペットの端部に留められ、膜のパッチが開口にわたって付着するようになる。この方法は、リポソームを留めてから破裂させて脂質二分子層をピペットの開口にわたって密封することによって脂質二分子層を産生するように適合されている。この方法は、安定した巨大な単分子層リポソーム、およびガラス表面を有する材料に小さい開口を製造することを必要とする。
【0270】
リポソームは、超音波処理、押出、またはＭｏｚａｆａｒｉ法（Ｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｉｃｒｏｎ ３８：８４１－８４７）によって形成することができる。
【0271】
いくつかの実施形態では、脂質二分子層は、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号に記載されるように形成される。この方法では有利に、脂質二分子層は乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態では、脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４に記載されるように、開口を横切って形成される。
【0272】
脂質二分子層は、脂質の２つの対向する層から形成される。これらの２つの脂質層は、それらの疎水性テール基が互いに向き合って疎水性内部を形成するように配置される。脂質の親水性ヘッド基は、二分子層の両側で水性環境に向かって外側に向いている。二分子層は、液体無秩序相（流体層状）、液体秩序相、固体秩序相（層状ゲル相、櫛型ゲル相）、および平面二分子層結晶（層状サブゲル相、ラメラ結晶相）を含むが、これらに限定されない、いくつかの脂質相に存在し得る。
【0273】
脂質二分子層を形成するいずれの脂質組成物も使用することができる。脂質組成物は、必要な特性、例えば、表面荷電、膜タンパク質を支持する能力、充填密度、または機械的特性を有する脂質二分子層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１つ以上の異なる脂質を含むことができる。例えば、脂質組成物は、最大１００個の脂質を含むことができる。脂質組成物は、好ましくは、１～１０個の脂質を含む。脂質組成物は、天然に存在する脂質および／または人工脂質を含み得る。
【0274】
脂質は、典型的には、ヘッド基、界面部分、および同じであっても異なってもよい２つの疎水性テール基を含む。好適なヘッド基には、中性ヘッド基、例えば、ジアシルグリセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）、双性イオンヘッド基、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）、負に帯電したヘッド基、例えば、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、およびカルジオリピン（ＣＡ）、ならびに正に帯電したヘッド基、例えば、トリメチルアンモニウム－プロパン（ＴＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。好適な界面部分には、天然に存在する界面部分、例えば、グリセロール系部分またはセラミド系部分が含まれるが、これらに限定されない。好適な疎水性テール基には、飽和炭化水素鎖、例えば、ラウリン酸（ｎ－ドデカノール酸（ｎ－Ｄｏｄｅｃａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ））、ミリスチン酸（ｎ－テトラデコノニン酸（ｎ－Ｔｅｔｒａｄｅｃｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、パルミチン酸（ｎ－ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ－オクタデカン酸）、およびアラキジン酸（ｎ－エイコサン酸）、不飽和炭化水素鎖、例えば、オレイン酸（シス－９－オクタデカン酸）、ならびに分岐炭化水素鎖、例えば、フィタノイルが含まれるが、これらに限定されない。不飽和炭化水素鎖中の鎖の長さならびに二重結合の位置および数は異なり得る。分岐炭化水素鎖中のメチル基などの鎖の長さならびに分岐の位置および数は異なり得る。疎水性テール基は、エーテルまたはエステルとして界面部分に連結され得る。脂質は、ミコール酸であり得る。
【0275】
脂質は、化学的に修飾することもできる。脂質のヘッド基またはテール基は化学的に修飾され得る。ヘッド基が化学的に修飾されている好適な脂質には、ＰＥＧ修飾脂質、例えば、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］、官能化ＰＥＧ脂質、例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］、ならびにコンジュゲーションのために修飾された脂質、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（スクシニル）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）が含まれるが、これらに限定されない。テール基が化学的に修飾されている好適な脂質には、重合性脂質、例えば、１，２－ビス（１０，１２－トリコサジイノイル（ｔｒｉｃｏｓａｄｉｙｎｏｙｌ））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、フッ化脂質、例えば、１－パルミトイル－２－（１６－フルオロパルミトイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、重水素化脂質、例えば、１，２－ジパルミトイル－Ｄ６２－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびエーテル結合脂質、例えば、１，２－ジ－Ｏ－フィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンが含まれるが、これらに限定されない。脂質は、ポリヌクレオチドのカップリングを容易にするように化学的に修飾されても官能化されてもよい。
【0276】
両親媒性層、例えば、脂質組成物は、典型的には、層の特性に影響を及ぼすであろう１つ以上の添加剤を含む。好適な添加剤には、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ミリスチン酸、およびオレイン酸、脂肪アルコール、例えば、パルミチンアルコール、ミリスチンアルコール、およびオレインアルコール、ステロール、例えば、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロール、およびスチグマステロール、リゾリン脂質、例えば、１－アシル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、およびセラミドが含まれるが、これらに限定されない。
【0277】
別の実施形態では、膜は、固体層を含む。固体層は、マイクロ電子材料、絶縁材料、例えば、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３、およびＳｉＯ、有機および無機ポリマー、例えば、ポリアミド、プラスチック、例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、またはエラストマー、例えば、二成分付加硬化シリコンゴム、およびガラスを含むが、これらに限定されない、有機材料および無機材料の両方から形成することができる。固体層は、グラフェンから形成され得る。好適なグラフェン層は、ＷＯ２００９／０３５６４７に開示されている。膜が固体層を含む場合、ポアは、典型的には、固体層内、例えば、固体層内の穴、ウェル、間隙、チャネル、溝、またはスリット内に含まれる両親媒性膜または層に存在する。当業者であれば、好適な固体／両親媒性ハイブリッド系を調製することができる。好適な系は、ＷＯ２００９／０２０６８２およびＷＯ２０１２／００５８５７に開示されている。上で考察される両親媒性膜または層のうちのいずれかを使用することができる。
【0278】
本明細書に開示される方法は、典型的には、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二分子層、または（ｉｉｉ）ポアが内部に挿入された細胞を使用して実行される。この方法は、典型的には、人工トリブロックコポリマー層などの人工両親媒性層を使用して実行される。層は、ポアに加えて、他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質、ならびに他の分子を含み得る。好適な装置および条件は、以下で考察される。開示される方法は、典型的には、インビトロで実施される。
【0279】
条件
上で説明したように、開示される方法は、ポリペプチドが含まれるコンジュゲートがナノポアに対して移動するにつれて、ポリペプチドを特徴付けることを含む。
上で説明したように、開示される方法は、ポリペプチドが含まれるコンジュゲートがナノポアに対して移動するにつれて、ポリペプチドを特徴付けることを含む。
【0280】
特徴付け方法は、ポアが膜内に挿入される膜／ポア系の調査に好適な任意の装置を使用して実行され得る。特徴付け方法は、膜貫通ポアセンシングに好適な任意の装置を用いて実行され得る。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの区分に分離する障壁とを備え得る。障壁は、膜貫通ポアを含む膜が形成される開口を有し得る。膜貫通ポアは、本明細書に記載されている。
【0281】
特徴付け方法は、ＷＯ２００８／１０２１２０、ＷＯ２０１０／１２２２９３、またはＷＯ００／２８３１２に記載の装置を使用して実行され得る。
【0282】
特徴付け方法は、典型的には電流の測定によって、ポアを通るイオン電流の流れを測定することを含み得る。あるいは、ポアを通るイオンの流れは、Ｈｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９ Ｖｏｌ．１３１，Ｎｏ．５，２００９によって開示されるように、光学的に測定され得る。したがって、装置は、電位を印加し、かつ膜およびポアを横切って電気信号を測定することができる電気回路も備え得る。特徴付け方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実行され得る。特徴付け方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を伴う。
【0283】
特徴付け方法は、各アレイが１２８、２５６、５１２、１０２４、２０００、３０００、４０００、６０００、１００００、１２０００、１５０００、またはそれ以上のウェルを備えるシリコンベースのウェルアレイで実行され得る。
【0284】
特徴付け方法は、ポアを流れる電流を測定することを含み得る。この方法は、典型的には、電圧が膜およびポアを横切って印加された状態で実行される。使用される電圧は、典型的には＋２Ｖ～－２Ｖ、典型的には－４００ｍＶ～＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、－４００ｍＶ、－３００ｍＶ、－２００ｍＶ、－１５０ｍＶ、－１００ｍＶ、－５０ｍＶ、－２０ｍＶ、および０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、および＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲内である。使用される電圧は、より好ましくは１００ｍＶ～２４０ｍＶの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶ～２２０ｍＶの範囲内である。増加した印加電位を使用することによって、ポアごとに異なるヌクレオチド間の識別を増加させることが可能である。
【0285】
特徴付け方法は、典型的には、金属塩、例えば、アルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば、塩化物塩、例えば、アルカリ金属塩化物塩などの任意の電荷担体の存在下で実行される。電荷担体には、イオン性液体または有機塩、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウム、または１－エチル－３－メチルイミダゾリウムクロリドが含まれ得る。上で考察される例示的な装置では、塩は、チャンバ内の水溶液に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が典型的に使用される。ＫＣｌが好ましい。塩は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）などのアルカリ土類金属塩であり得る。塩濃度は、飽和時のものであり得る。塩濃度は、３Ｍ以下であり得、典型的には、０．１～２．５Ｍ、０．３～１．９Ｍ、０．５～１．８Ｍ、０．７～１．７Ｍ、０．９～１．６Ｍ、または１Ｍ～１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ～１Ｍである。特徴付け方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を使用して実行される。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比を提供し、正常な電流変動のバックグラウンドに対する結合／結合なしを示す電流の特定を可能にする。
【0286】
特徴付け方法は、典型的には、緩衝液の存在下で実行される。上で考察される例示的な装置では、緩衝液は、チャンバ内の水溶液に存在する。任意の好適な緩衝液が使用され得る。典型的には、緩衝液は、ＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝液は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液である。本方法は、典型的には、４．０～１２．０、４．５～１０．０、５．０～９．０、５．５～８．８、６．０～８．７、または７．０～８．８、または７．５～８．５のｐＨで実行される。使用されるｐＨは、好ましくは、約７．５である。
【0287】
特徴付け方法は、０℃～１００℃、１５℃～９５℃、１６℃～９０℃、１７℃～８５℃、１８℃～８０℃、１９℃～７０℃、または２０℃～６０℃で実施され得る。特徴付け方法は、典型的には、室温で実行される。特徴付け方法は、任意選択で、酵素機能を支持する温度、例えば、約３７℃で実行される。
【0288】
修飾ナノポア
狭窄領域を含むナノポアも提供され、このナノポアは、狭窄領域と、ナノポアと接触しているポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾される。ナノポアは、本明細書に記載されている通りであり得る。ナノポアは、本明細書に記載されるように修飾され得る。
狭窄領域を含むナノポアも提供され、このナノポアは、狭窄領域と、ナノポアと接触しているポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾される。ナノポアは、本明細書に記載されている通りであり得る。ナノポアは、本明細書に記載されるように修飾され得る。
【0289】
システム
－狭窄領域を含むナノポアと、
－ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、
を含むシステムも提供され、
ｉ）このナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素がナノポアと接触しているときに、狭窄領域とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を増加させるように修飾され、かつ／または
ｉｉ）このシステムは、ナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間に配置され、それによりナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長する、１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む。
－狭窄領域を含むナノポアと、
－ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、
を含むシステムも提供され、
ｉ）このナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素がナノポアと接触しているときに、狭窄領域とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を増加させるように修飾され、かつ／または
ｉｉ）このシステムは、ナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間に配置され、それによりナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長する、１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む。
【0290】
いくつかの実施形態において、ナノポア、コンジュゲートおよび／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質、ならびに任意選択で、存在する場合、１つ以上のディスプレーサーユニットは、本明細書に記載される通りである。
【0291】
キット
－狭窄領域を含むナノポアと、
－標的ポリヌクレオチドにコンジュゲート化するための反応性官能基を含むポリヌクレオチドと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、を含む、キットも提供される。
－狭窄領域を含むナノポアと、
－標的ポリヌクレオチドにコンジュゲート化するための反応性官能基を含むポリヌクレオチドと、
－ポリヌクレオチドハンドリングタンパク質と、を含む、キットも提供される。
【0292】
いくつかの実施形態において、このナノポアは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素がナノポアと接触しているときに、狭窄領域とポリヌクレオチドハンドリングタンパク質との間の距離を増加させるように修飾される。
【0293】
いくつかの実施形態において、このキットは、ナノポアとポリヌクレオチドハンドリングタンパク質の活性部位との間の距離を延長するための１つ以上のディスプレーサーユニットをさらに含む。
【0294】
いくつかの実施形態において、ナノポア、ポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドハンドリングタンパク質、ならびに任意選択で、存在する場合、１つ以上のディスプレーサーユニットは、本明細書に記載される通りである。
【0295】
キットは、コンピュータシステム上で実行されるように適合された、本明細書でも提供されるアルゴリズムとともに使用するように構成され得る。アルゴリズムは、ポリペプチドに特徴的な（例えば、ポリペプチドの配列および／またはポリペプチドが修飾されているかどうかに特徴的な）情報を検出し、ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートがナノポアに対して移動する際に得られたシグナルを選択的にプロセシングするように適合させることができる。ポリペプチドに特徴的な（例えば、ポリペプチドの配列および／またはポリペプチドが修飾されているかどうかに特徴的な）情報を検出し、ポリヌクレオチドにコンジュゲート化されたポリペプチドを含むコンジュゲートがナノポアに対して移動する際に得られたシグナルを選択的にプロセシングするように構成されたコンピューティング手段を含むシステムも提供される。いくつかの実施形態では、システムは、ポリペプチドの検出からデータを受信するための受信手段、コンジュゲートがナノポアに対して移動する際に得られるシグナルをプロセシングするためのプロセシング手段、およびこうして得られた特徴付け情報を出力するための出力手段を含む。
【0296】
特定の実施形態、特定の構成、ならびに材料および／または分子が、本発明による方法について本明細書で考察されているが、形態および詳細の様々な変更または修正が本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく行われてもよいことを理解されたい。前述の実施形態および以下の実施例は、例示のためにのみ提供されており、用途を限定するとみなされるべきではない。本出願は、特許請求の範囲のみによって制限される。
【実施例】
【0297】
実施例１
この例は、２片のポリヌクレオチド；ｄｓＤＮＡ Ｙアダプター（ＤＮＡ１）とｄｓＤＮＡテール（ＤＮＡ２）に隣接するポリペプチドを含むコンジュゲートの制御された転座を示す。ナノポアのシス側にあるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、最初にＤＮＡ１を巻き戻し、ｓｓＤＮＡ上で５’－３’で転座し、次にポリペプチドセクションにわたってスライドして最後にＤＮＡ２セグメントを巻き戻すことにより、コンジュゲートの移動を制御する。この構築物がナノポアのシス側からトランス側に移動し、ＲＥＤを通過すると、ポリペプチドセクションを電流対時間のプロットで視覚化できるため、特徴付けが可能になる。
この例は、２片のポリヌクレオチド；ｄｓＤＮＡ Ｙアダプター（ＤＮＡ１）とｄｓＤＮＡテール（ＤＮＡ２）に隣接するポリペプチドを含むコンジュゲートの制御された転座を示す。ナノポアのシス側にあるポリヌクレオチドハンドリングタンパク質は、最初にＤＮＡ１を巻き戻し、ｓｓＤＮＡ上で５’－３’で転座し、次にポリペプチドセクションにわたってスライドして最後にＤＮＡ２セグメントを巻き戻すことにより、コンジュゲートの移動を制御する。この構築物がナノポアのシス側からトランス側に移動し、ＲＥＤを通過すると、ポリペプチドセクションを電流対時間のプロットで視覚化できるため、特徴付けが可能になる。
【0298】
Ｙアダプターは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３）をアニーリングすることによって調製された。ＷＯ２０１４／０１３２６０に記載されているように、ＤＮＡモーター（Ｄｄａヘリカーゼ）をアダプターに装填して閉鎖した。その後の材料をＨＰＬＣ精製した。Ｙアダプターには、ナノポアによる捕捉を容易にする３０のＣ３リーダーセクションと、膜にテザリングするためのサイドアームが含まれている。ＤＮＡテールは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１４、配列番号１６）をアニーリングすることによって作製された。
【0299】
この例では、モデルポリペプチド分析物（配列番号２０、２１、２２）は、Ｎ末端と、ペプチド骨格に沿ったエチルジアミンスペーサーを使用して、Ｃ末端の直後で、事前合成されたアジド部分を含み、得られた。次に、各分析物は、アジドとＢＣＮ（ビシクロ［６．１．０］ノニン）部分の間の銅を含まないクリックケミストリー反応を介して、ＹアダプターとＤＮＡテールにコンジュゲート化された。得られた構築物の概略図を図４Ａに示す。サンプルは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）ビーズを使用して精製され、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓシーケンスキット（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）のＬＮＢで２回洗浄された。コンジュゲート化された基質を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）に溶出した。
【0300】
電気的測定は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＩＯＮ Ｍｋ１ｂと、ＭｓｐＡナノポアを備えたカスタムＭｉｎＩＯＮフローセルを使用して取得された。フローセルは、５０ｎＭのＤＮＡテザーとＡＴＰを欠くシーケンシング緩衝液を含むテザーミックスでフラッシュされた。最初に８００μＬのテザーミックスを５分間追加し、次にさらに２００μＬのミックスを、ＳｐｏｔＯＮポートを開いた状態でシステムに流した。ＤＮＡ－ペプチド構築物は、ＡＴＰを欠くシーケンシング緩衝液とＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓシーケンシングキット（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０９）のＬＢで、０．５ｎＭの濃度で調製され、「シーケンシングミックス」を生じた。７５μＬのシーケンシングミックスを、ＳｐｏｔＯＮフローセルポートを介してＭｉｎＩＯＮフローセルに追加した。混合物をフローセル上で５～１０分間インキュベートして、構築物のテザリングとそれに続くナノポアによる捕捉を可能にした。ＡＴＰがない場合、ＤＮＡモーターはＹアダプターのスペーサー領域で停止したままになり、コンジュゲートはナノポアに捕捉されるが、転座しない。インキュベーション後、ＡＴＰを含む２００μＬのシーケンシング緩衝液を添加し、ＡＴＰの存在下では、捕捉されたＤＮＡ－ペプチドコンジュゲートはヘリカーゼによってナノポアを横切って移動し、再現性のある電流フットプリントをもたらす。
【0301】
１８０ｍＶで標準シーケンシングスクリプトを３０分～１時間実行し、１分ごとに静的フリップを実行して拡張ナノポアブロックを除去した。生データは、ＭｉｎＫＮＯＷソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してバルクＦＡＳＴ５ファイルに収集された。
【0302】
ＤＮＡ Ｙアダプターとテールにコンジュゲート化されたモデルペプチド（配列番号２０）の１つについて、電流対時間のトレースの例を図９に示す。ＹアダプターセクションとｄｓＤＮＡテールは、「曲がりくねった曲線」（トレース）のペプチド部分から分離して、ペプチドの特徴付けを可能にすることができる。
【0303】
１秒当たりに複数の転座事象が観察され、ハイスループットが達成された。複数の捕捉および転座事象を示す電流対時間のトレース例を、図９で使用したものと同じ構築物（すなわち、配列番号２０のペプチド領域を含むもの）について図１０に示す。
【0304】
他のコンジュゲート化されたポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の特徴付けを、上記のように実施した。図１１～１３は、正に帯電したアミノ酸（配列番号２１；図１１）；芳香族アミノ酸（配列番号２２、図１２）および負に帯電したアミノ酸（配列番号２０、図１３）を含むペプチド領域を組み込んだ構築物の特徴付けを可能にする再現可能な電流対時間のトレースを示す。
【0305】
参照を容易にするために、配列番号２２のペプチドを使用して得られた構築物の概略構造を図１４に示す。
【0306】
実施例２
この実施例は、付着基を含むように事前合成されていないペプチドから得られたポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物を特徴付けることにおける、開示される方法の有用性を実証している。
この実施例は、付着基を含むように事前合成されていないペプチドから得られたポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物を特徴付けることにおける、開示される方法の有用性を実証している。
【0307】
この実施例では、Ｙアダプターは実施例１と同じであり、ｄｓＤＮＡテールは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１５、配列番号１６）をアニーリングすることによって調製された。データ収集は、実施例１で確立されたプロトコルを使用して、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭｉｎＩＯＮ Ｍｋ１ｂと、ＭｓｐＡナノポアを備えたカスタムＭｉｎＩＯＮフローセルで実行された。
【0308】
この実施例で使用されるペプチド分析物は、実施例１で使用されるモデルペプチド（ＧＧＳＧＤＤＳＧＳＧ、実施例１の配列番号２０；実施例２の配列番号２３）とほぼ同一であったが、ポリヌクレオチドアダプターとテールのクリックケミストリーコンジュゲート化用の事前合成されたアジド分子を欠いた。マレイミド化学を可能にするために、追加のＣ末端システインが含まれた。ペプチドのＮ末端はテトラジン－ＮＨＳエステル化合物（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、製品コード：ＢＰ－２２９４６）で官能化された。非コンジュゲート化テトラジンは、アミノ官能化磁性粒子（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、製品コード：５３５７２）で除去された。
【0309】
次に、ペプチドをＤＮＡテール（配列番号１５、配列番号１６）とともに４℃で一晩インキュベートして、テトラジンとＴＣＯ（トランスシクロオクテン）との間のクリック反応を促進した。インキュベーション後、Ｃ末端ペプチドシステイン間の可能なジスルフィド結合を５ｍＭ ＤＴＴで室温で３０分間還元し、ペプチド－ＤＮＡコンジュゲートをＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、未反応のペプチドとＤＴＴを除去した。次に、曝露されたシステインをアジド－ＰＥＧ３－マレイミド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、製品コード：ＢＰ－２２４６８）と反応させた。過剰なマレイミドリンカーをＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで除去し、ＢＣＮとアジド間のクリックケミストリーを介して構築物をＹアダプターと４℃で一晩反応させた。ペプチドのＣ末端とＹアダプター、およびＮ末端とＤＮＡテールとの間のコンジュゲート化によって形成された、生じた構築物を、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製し、ペプチド－ＤＮＡテールから完全な構築物を分離した。
【0310】
最終構築物を、図１５に示されている例示的な電流トレースを使用して、実施例１に示されているように評価した。見てわかるように、ペプチドの特徴付けは、付着点の事前合成を必要とせずに可能であった。
【0311】
実施例３
この実施例は、１０アミノ酸ペプチドと比較して２１アミノ酸ペプチドを特徴付ける際の、開示される方法を比較する。
この実施例は、１０アミノ酸ペプチドと比較して２１アミノ酸ペプチドを特徴付ける際の、開示される方法を比較する。
【0312】
２１アミノ酸ペプチドのポリヌクレオチド－ポリペプチドコンジュゲートを、実施例１に記載の方法に従って調製および分析した。２１アミノ酸構築物で得られた電流対時間のトレースを、実施例２からの１０アミノ酸構築物で得られたものと比較した。使用したペプチド配列は、ＧＤＤＤＧＳＡＳＧＤＤＤＧＳＡＳＧＤＤＤＧ（２１ａａ；配列番号２４）およびＧＧＳＧＤＤＳＧＳＧ（１０ａａ；配列番号２０）であった。
【0313】
１０アミノ酸ペプチドと２１アミノ酸ペプチドのポリヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの転座に関する電流対時間のトレースを示すデータを図１６に示す。同じタイムスケールに配置された２つのトレースは、２１アミノ酸のポリペプチドの電流セクションが１０アミノ酸のポリペプチドの約２倍の長さであることを示す。
【0314】
したがって、この実施例は、開示される方法を使用して、様々で拡張された長さのポリペプチドを特徴付けることができることを確認する。
【0315】
配列表の説明
配列番号１は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の（ヘキサヒスチジンタグ付き）エキソヌクレアーゼＩ（ＥｃｏＥｘｏ Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ－ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列は、トリマーを構築する３つの同一のサブユニットのうちの１つである。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。
配列番号５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、Ｔｒｗｃ Ｃｂａ（Ｃｉｔｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｔｈｙｏｍａｒｉｎｕｍ）ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、腸内細菌ファージＴ４由来のＤｄａヘリカーゼ１９９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、実施例１に記載されるようなＹアダプターの生成に使用される第１のポリヌクレオチド鎖（Ｃ３［（ＯＣ３Ｈ６ＯＰＯ３））リーダー、３’ＢＣＮクリック付着、および酵素失速化学；８＝ｉＳｐ１８［（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＰＯ３］）を有するＤＮＡ１－トップ）の配列を示す。
配列番号１２は、実施例１に記載されるようなＹアダプターの生成に使用される第２のポリヌクレオチド鎖（テザー用のサイドアームを備えたＤＮＡ１－バック）の配列を示す。
配列番号１３は、実施例１に記載されるようなＹアダプターの生成に使用される第３のポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ１－ボトム）の配列を示す。
配列番号１４は、実施例１に記載されるようなｄｓＤＮＡテールの生成に使用される第１のポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ２－トップ鎖、５’ＢＣＮクリックケミストリー）の配列を示す。
配列番号１５は、実施例１に記載されるようなｄｓＤＮＡテールの生成に使用される第２のポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ２－トップ鎖、５’ＴＣＯ（直交クリックケミストリー））の配列を示す。
配列番号１６は、実施例２に記載されるようなｄｓＤＮＡテールの生成に使用されるポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ２－ボトム鎖、サイドアームなし）の配列を示す。
配列番号２０は、実施例１に記載されるような第１のポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される第１のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、実施例１に記載されるような第２のポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される第２のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、実施例１に記載されるような第３のポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される第３のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、実施例２に記載されるようなポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用されるペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、実施例３に記載されるようなポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される２１アミノ酸ペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号１は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の（ヘキサヒスチジンタグ付き）エキソヌクレアーゼＩ（ＥｃｏＥｘｏ Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ－ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列は、トリマーを構築する３つの同一のサブユニットのうちの１つである。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。
配列番号５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、Ｔｒｗｃ Ｃｂａ（Ｃｉｔｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂａｔｈｙｏｍａｒｉｎｕｍ）ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｂｕ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）ヘリカーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、腸内細菌ファージＴ４由来のＤｄａヘリカーゼ１９９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、実施例１に記載されるようなＹアダプターの生成に使用される第１のポリヌクレオチド鎖（Ｃ３［（ＯＣ３Ｈ６ＯＰＯ３））リーダー、３’ＢＣＮクリック付着、および酵素失速化学；８＝ｉＳｐ１８［（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＰＯ３］）を有するＤＮＡ１－トップ）の配列を示す。
配列番号１２は、実施例１に記載されるようなＹアダプターの生成に使用される第２のポリヌクレオチド鎖（テザー用のサイドアームを備えたＤＮＡ１－バック）の配列を示す。
配列番号１３は、実施例１に記載されるようなＹアダプターの生成に使用される第３のポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ１－ボトム）の配列を示す。
配列番号１４は、実施例１に記載されるようなｄｓＤＮＡテールの生成に使用される第１のポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ２－トップ鎖、５’ＢＣＮクリックケミストリー）の配列を示す。
配列番号１５は、実施例１に記載されるようなｄｓＤＮＡテールの生成に使用される第２のポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ２－トップ鎖、５’ＴＣＯ（直交クリックケミストリー））の配列を示す。
配列番号１６は、実施例２に記載されるようなｄｓＤＮＡテールの生成に使用されるポリヌクレオチド鎖（ＤＮＡ２－ボトム鎖、サイドアームなし）の配列を示す。
配列番号２０は、実施例１に記載されるような第１のポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される第１のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、実施例１に記載されるような第２のポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される第２のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、実施例１に記載されるような第３のポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される第３のペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、実施例２に記載されるようなポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用されるペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、実施例３に記載されるようなポリヌクレオチド－ポリペプチド構築物の生成に使用される２１アミノ酸ペプチド断片のアミノ酸配列を示す。
【0316】
配列表
【配列表１】
【0317】
【配列表２】
【0318】
【配列表３】
【0319】
【配列表４】
【0320】
【配列表５】
【0321】
【配列表６】
【0322】
【配列表７】
【0323】
【配列表８】
【0324】
【配列表９】
【0325】
【配列表１０】
【0326】
【配列表１１】
【0327】
【配列表１２】
【0328】
【配列表１３】
【0329】
【配列表１４】
【0330】
【配列表１５】
【0331】
【配列表１６】
【0332】
【配列表１７】
【0333】
【配列表１８】
【0334】
【配列表１９】
【0335】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】