知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-31
(54)【発明の名称】ＨＩＶに対する広域中和抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/10 20060101AFI20230124BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230124BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20230124BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230124BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230124BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230124BHJP
【ＦＩ】
C07K16/10
A61K39/395 S ZNA
A61P31/18
A61P37/04
C12N15/13
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558359
(86)(22)【出願日】2020-12-02
(85)【翻訳文提出日】2022-07-22
(86)【国際出願番号】 EP2020084309
(87)【国際公開番号】W WO2021110764
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】19212986.4
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】308027710
【氏名又は名称】ウニヴェルジテート・ツー・ケルン
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】クライン フロリアン
(72)【発明者】
【氏名】グリュル ヘニング
(72)【発明者】
【氏名】ショマース フィリップ フレデリック
【テーマコード（参考）】
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4C085AA03
4C085AA14
4C085BA69
4C085EE01
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメント、かかるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物、かかる抗体又はその結合フラグメントを備えるキット、並びに医薬として及びヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる、モノクローナル抗体又はその結合フラグメント、及び医薬組成物、及びキットに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントであって、前記抗体アミノ酸配列がＶＨ１－４６遺伝子セグメント及び前記Ｖκ３－２０遺伝子セグメントを含み、前記抗体が、
ａ）重鎖アミノ酸配列
ＱＸＸＸＦＱＳＧＸＥＸＫＲＰＧＡＳＶＸＩＳＣＲＡＤＤＤＰＹＴＤＤＤＴＦＴＫＹＸＴＨＷＩＲＱＡＰＧＱＸＰＥＷＬＧＶＩＳＰＨＸＡＲＰＩＹＳＹＫＦＸＤＲＬＴＬＴＲＤＳＳＬＴＸＶＹＸＥＬＸＸＬＸＸＤＤＸＧＩＹＸＣＡＲＤＰＦＧＸＸＸＰＨＹＮＸＨＭＤＶＷＧＸＧＴＸＸＩＶＳＸ（コンセンサス配列番号１；配列番号４７）、
及び軽鎖アミノ酸配列
ＥＸＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＸＳＰＧＤＲＶＸＸＳＣＸＡＳＺＧＬＸＸＸＸＬＡＷＹＲＦＫＸＧＱＩＰＸＬＶＪＦＸＸＳＸＲＡＲＧＴＰＤＲＦＸＧＸＧＳＸＸＤＦＴＬＴＩＸＸＶＺＸＥＤＦＡＴＹＹＣＱＲＸＧＸＴＰＩＴＦＧＧＧＴＸＬＤＸＸ（コンセンサス配列番号２；配列番号４８）、又は、
ｂ）重鎖アミノ酸配列
ＱＬＸＱＸＧＧＧＶＸＸＰＧＡＳＶＸＸＳＣＸＸＰＥＸＴＦＴＫＹＸＪＨＷＸＲＱＡＰＧＸＧＸＥＷＸＧＸＶＳＰＨＧＧＲＰＸＸＸＸＸＦＲＤＲＬＴＸＴＲＸＩＨＸＴＴＨＸＭＸＬＸＧＬＸＸＸＤＸＸＸＹＸＣＡＲＤＸＸＧＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＭＤＸＷＧＧＧＸＸＸＸＶＸＳ（コンセンサス配列番号３；配列番号４９）、
及び軽鎖アミノ酸配列
ＸＸＸＬＴＱＳＰＸＴＬＳＸＳＰＧＥＸＸＸＬＳＣＲＡＸＸＧＸＸＸＸＨＸＸＷＦＱＸＸＸＧＸＸＰＲＬＬＩＦＸＸＸＲＲＡＸＧＸＸＸＲＦＸＸＸＸＸＸＳＸＸＸＸＸＬＴＩＸＸＶＥＸＸＤＦＡＸＹＸＣＱＸＹＧＸＩＴＰＪＸＦＧＧＧＴＸＸＤＸＫ（コンセンサス配列番号４；配列番号５０）を含み、
配列番号４７～配列番号５０のいずれかにおけるＸは、任意のアミノ酸であってもよく若しくはアミノ酸がなくてもよく、
又は抗体アミノ酸配列が該配列に対して少なくとも８０％同一である、モノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメント。
【請求項2】
請求項１の代替ｂ）の前記抗体がＦＷＲ１において２ａａの欠失を含む、及び／又は前記抗体若しくはその結合フラグメントが１６若しくは１９のアミノ酸長を有するＣＤＲＨ３を含まない、及び／又は前記抗体若しくはその結合フラグメントが１８、２０若しくは２１のアミノ酸長を有するＣＤＲＨ３を含む、請求項１に記載のモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメント。
【請求項3】
前記抗体又はその結合フラグメントが、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２５μｇ／ｍｌの抗体濃度で好ましくは全１２株を試験した場合、de Camp et al., J Virol. 2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルの１２株のＨＩＶ－１単離基準株のうち少なくとも１１株の中和によって例示される広範な中和活性を示す、請求項１又は２に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項4】
前記抗体又はその結合フラグメントが、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、少なくとも８９．９％（１１９個中１０７個）、好ましくは少なくとも９２．４％（１１９個中１１０個）、より好ましくは少なくとも９６．６％（１１９個中１１５個）のSchoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される１１９マルチクレードウイルスパネルに含まれる疑似ウイルスの中和によって例示される広範な中和活性を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項5】
前記抗体又はその結合フラグメントが、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２５μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、de Camp et al., J Virol.2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルの中和株に対して、０．３μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．２μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満、更に好ましくは０．０４８μｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは０．０３５μｇ／ｍｌ以下の中和効力（中和株の幾何平均ＩＣ５０）を示す、請求項１～４のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項6】
前記抗体又はその結合フラグメントが、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、Schoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される１１９マルチクレードウイルスパネルの中和株に対して、０．２μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０８μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満の中和効力（中和株の幾何平均ＩＣ５０）を示す、請求項１～５のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項7】
前記抗体又はその結合フラグメントが、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＨＩＶ－１疑似ウイルス８９－Ｆ１＿２＿２５（８９－Ｆ１＿２＿２５ｅｎｖ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ２１５３４９．１）に対して０．０５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０２μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の中和効力（ＩＣ５０）を示す、請求項１～６のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項8】
前記抗体又は結合フラグメントが、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＩＣ５０濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満で、エンベロープ変異Ｎ２７９Ｋ、Ｎ２８０Ｙ、Ｇ４５８Ｄ、Ｇ４５９Ｄ、又はＧ４７１Ｒ（ＨＩＶ－１ ＨＸＢ２エンベロープ遺伝子；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３４５５に従って番号が付与された残基）の１つを有するＹＵ２エンベロープ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ９３２５８．１）を含むＹＵ２疑似ウイルス変異体の全てを中和する、請求項１～７のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項9】
前記抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、Zhang et al., J Virol, 2002 Jun;76(12):6332-43に記載されるＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウスに対して、３日毎～４日毎に０．５ｍｇの前記抗体又はその結合フラグメントの定期的な皮下注射を行うことが、治療の４週間後、好ましくは治療の６週間後、更により好ましくは治療の８週間後に測定した場合、治療開始時に少なくとも５０００コピー／ｍｌ血漿のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷を有する治療マウスの少なくとも７０％において、治療開始と比較して、少なくとも０．８ ｌｏｇ１０、好ましくは少なくとも１．０ ｌｏｇ１０の血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷の減少をもたらす、請求項１～８のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項10】
前記ヒト化マウスを、３ＢＮＣ１１７若しくはＶＲＣ０１、又は両方の組合せ１ｍｇの１回の初期皮下注射で４週間にわたって先に治療し、続いて３日～４日後に、０．５ｍｇの３ＢＮＣ１１７若しくはＶＲＣ０１、又は両方の組合せの３日毎～４日毎の定期的な皮下注射を行う、請求項９に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項11】
前記抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、Zhang et al., J Virol, 2002 Jun;76(12):6332-43に記載されるＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウスに３日毎～４日毎に０．５ｍｇの前記抗体又はその結合フラグメントの皮下注射を行うことが、少なくとも４週間は、投与された抗体に対する耐性を媒介するＣＤ４結合部位エピトープ（ループＤ、ＣＤ４結合ループ、ベータ２３鎖、Ｖ５ループ、及びベータ２４鎖）における１つ以上の変異の発生をもたらさない、請求項１～１０のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項12】
ＮＲＧマウスへの０．５ｍｇの前記抗体又はその結合フラグメントの静脈内注射が、注射の１０日後に、少なくとも５０μｇ ＩｇＧ／ｍｌ血清の前記抗体又はその結合フラグメントの検出可能な血清レベルをもたらす、請求項１～１１のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項13】
前記抗体又はその結合フラグメントが、１－１８（配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２１（配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－３３（配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５４（配列番号７の重鎖アミノ酸配列と配列番号８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５５（配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１０（配列番号１１の重鎖アミノ酸配列と配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２２（配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２７（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－４７（配列番号１７の重鎖アミノ酸配列と配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－５９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、５－１８（配列番号２１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－１０（配列番号２３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－２３（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列と配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１０－７（配列番号２７の重鎖アミノ酸配列と配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－５２（配列番号２９の重鎖アミノ酸配列と配列番号３０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－８９（配列番号３１の重鎖アミノ酸配列と配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－７１（配列番号３３の重鎖アミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２３（配列番号３５の重鎖アミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２９（配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１２（配列番号３９の重鎖アミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２１（配列番号４１の重鎖アミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－０７（配列番号４３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－７８（配列番号４５の重鎖アミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）を含む群からの１つの抗体、好ましくは１－１８、１－３３、１－５５、２－２７、１－２３、１－２９、２－１２、２－２１、３－０７及び３－７８を含む群からの１つの抗体、より好ましくは１－１８、１－５５及び２－１２を含む群からの１つの抗体、更により好ましくは抗体１－１８又は２－１２、特に好ましくは抗体１－１８の重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項14】
前記抗体又はその結合フラグメントが、１－１８（配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２１（配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－３３（配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５４（配列番号７の重鎖アミノ酸配列と配列番号８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５５（配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１０（配列番号１１の重鎖アミノ酸配列と配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２２（配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２７（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－４７（配列番号１７の重鎖アミノ酸配列と配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－５９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、５－１８（配列番号２１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－１０（配列番号２３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－２３（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列と配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１０－７（配列番号２７の重鎖アミノ酸配列と配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－５２（配列番号２９の重鎖アミノ酸配列と配列番号３０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－８９（配列番号３１の重鎖アミノ酸配列と配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－７１（配列番号３３の重鎖アミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２３（配列番号３５の重鎖アミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２９（配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１２（配列番号３９の重鎖アミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２１（配列番号４１の重鎖アミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－０７（配列番号４３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－７８（配列番号４５の重鎖アミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）を含む群から選択される１つの抗体、好ましくは１－１８、１－３３、１－５５、２－２７、１－２３、１－２９、２－１２、２－２１、３－０７及び３－７８を含む群からの１つの抗体、より好ましくは１－１８、１－５５及び２－１２を含む群からの１つの抗体、更により好ましくは抗体１－１８又は２－１２、特に好ましくは抗体１－１８の重鎖及び軽鎖の組合せを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又は結合フラグメント。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントと、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物であって、好ましくは前記医薬組成物がヒト被験体用のワクチン接種組成物である、医薬組成物。
【請求項16】
請求項１～１４のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントと容器とを備えるキット。
【請求項17】
医薬として用いられる、好ましくはワクチンとして用いられる請求項１～１４のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体若しくはその結合フラグメント、請求項１５に記載の医薬組成物、又は請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
ヒト被験体におけるヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる、好ましくはヒト被験体における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防に用いられる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のモノクローナルヒト抗体若しくはその結合フラグメント、請求項１５に記載の医薬組成物、又は請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメント、かかるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントを含む医薬組成物、かかる抗体又はその結合フラグメントを備えるキット、並びに医薬として及びヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる、モノクローナル抗体又はその結合フラグメント、及び医薬組成物、及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を標的とする広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、動物モデルにおける感染を予防することができ、臨床試験において受動免疫について調査されているところである。さらに、ｂＮＡｂは、ＨＩＶ－１感染個体における抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）の中断後にウイルス血症を抑制し、ウイルスリバウンドを遅らせることが実証されている。
【0003】
これらの結果は、ｂＮＡｂの顕著な臨床的可能性を強調しているが、既往の及びｄｅ ｎｏｖｏのＨＩＶ－１耐性は治療の失敗を引き起こし、ヒトにおけるｂＮＡｂ適用を強く制限する可能性がある。したがって、ウイルスの逃避を予防及び克服するための戦略は、ＨＩＶ－１の予防及び治療のためのｂＮＡｂ媒介アプローチを効果的に実施するために重要である（非特許文献１）。
【0004】
近年、ＨＩＶ－１エンベロープ（Ｅｎｖ）三量体上の別個の脆弱なエピトープを標的とする強力なｂＮＡｂが、ＨＩＶ－１感染ドナーから単離された。これらのエピトープは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）、Ｖ１／Ｖ２ループ、Ｖ３ループグリカンパッチ、膜近位外部領域、及びｇｐ１２０とｇｐ４１ Ｅｎｖサブユニットとの間の界面を含む。
【0005】
これらの部位の中で、ＣＤ４はウイルス侵入の主要な受容体としてはたらくため、ＣＤ４ｂｓは特に興味深い。ほとんどの強力なＣＤ４ｂｓ ｂＮＡｂは、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントＩＧＶＨ１－２＊０２の使用、高レベルの体細胞超変異、軽鎖の５残基相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、及びＥｎｖ－ＣＤ４相互作用の模倣を特徴とする。
【0006】
原型抗体ＶＲＣ０１（非特許文献２）にちなんで命名されたこれらの抗体は、ＶＲＣ０１クラスｂＮＡｂと称される。このクラスのその他のメンバーとしては、３ＢＮＣ１１７、ＮＩＨ４５－４６、Ｎ４９－Ｐ７、Ｎ６、及びＶＲＣ０７－５２３が挙げられる。
【0007】
ＣＤ４結合を模倣する他のｂＮＡｂは、ＶＨ１－４６遺伝子セグメントに由来する。しかしながら、ＶＨ１－２由来のｂＮＡｂと比較して、これまでに報告されたＶＨ１－４６ ｂＮＡｂは、その臨床使用の可能性を制限する低い効力及び幅を有する。例えば、このクラスの最良の抗体の１つであるＣＨ２３５．１２は、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ株の大きなパネルに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した場合、ＶＲＣ０１クラスのｂＮＡｂ Ｎ６よりも広範ではなく、効力は１０分の１にも満たない（非特許文献３）。
【0008】
したがって、臨床試験に進んだ全てのＣＤ４ｂｓ ｂＮＡｂは、ＶＲＣ０１クラスのメンバー（３ＢＮＣ１１７、Ｎ６、ＶＲＣ０１、及びＶＲＣ０７－５２３）である。しかしながら、ＶＲＣ０１からの逃避はウイルスの適応度の低下と関連しているのに対し、ＶＲＣ０１クラスの単独療法の効果は一過性に過ぎず、臨床試験（非特許文献４）とＨＩＶ－１感染の動物モデル（非特許文献５）の両方でウイルスエスケープ変異体の急速な出現と関連していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Gruell, H., and Klein, F. (2018). Antibody-mediated prevention and treatment of HIV-1 infection. Retrovirology 15, 73
【非特許文献2】Wu, X., Yang, Z.Y., Li, Y., Hogerkorp, C.M., Schief, W.R., Seaman, M.S., Zhou, T., Schmidt, S.D., Wu, L., Xu, L., et al. (2010). Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science 329, 856-861.
【非特許文献3】Bonsignori, M., Zhou, T., Sheng, Z., Chen, L., Gao, F., Joyce, M.G., Ozorowski, G., Chuang, G.Y., Schramm, C.A., Wiehe, K., et al. (2016). Maturation Pathway from Germline to Broad HIV-1 Neutralizer of a CD4-Mimic Antibody. Cell 165, 449-463.
【非特許文献4】Scheid, J.F., Horwitz, J.A., Bar-On, Y., Kreider, E.F., Lu, C.L., Lorenzi, J.C., Feldmann, A., Braunschweig, M., Nogueira, L., Oliveira, T., et al. (2016). HIV-1 antibody 3BNC117 suppresses viral rebound in humans during treatment interruption. Nature 535, 556-560.
【非特許文献5】Klein, F., Halper-Stromberg, A., Horwitz J.A., Gruell, H., Scheid J.F., Bournazos S., Mouquet H., Spatz L.A., Diskin R., Abadir A., et al. (2012) HIV Therapy by a Combination of Broadly Neutralizing Antibodies in Humanized Mice. Nature 492 (7427), 118-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
現在調査中の既知のｂＮＡｂの欠点のため、ＨＩＶ－１感染生物で試験した場合に、既知の古典的ＶＨ１－２由来又はＶＨ１－４６由来ｂＮＡｂの効力及び幅を超え、ＶＲＣ０１クラスのエスケープ変異体に対して強力な中和活性を有し、ウイルスの逃避を効果的に制限し、ウイルス抑制を維持する、ＣＤ４結合部位を標的とするＨＩＶ抗体の需要が依然として存在する。
【0011】
したがって、かかるウイルス株に対する高い中和効力と組み合わせて、幅広い選択の異なるウイルス株に対して幅広い中和活性を有するＨＩＶ－１に対する新規ヒトモノクローナル抗体を提供することを本発明の目的とする。本発明の更なる目的は、エスケープ変異の発生の著しい制限を示し、かかるエスケープ変異を示すウイルスに対して有効性を維持するＨＩＶ－１に対する新規ヒトモノクローナル抗体を提供することである。また、抗体単独療法中に顕著なウイルスリバウンドを伴わずに感染個体において完全なウイルス抑制を伝えるＨＩＶ－１に対する新規ヒトモノクローナル抗体を提供することも本発明の目的である。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏで好ましい薬物動態特性を有するＣＤ４結合部位に対する新規なヒトモノクローナル抗体を提供することを本発明の目的とする。
【0012】
これらの目的は、以下に明示する本発明の態様によって解決された。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の第１の態様によれば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントが提供され、抗体アミノ酸配列がＶＨ１－４６遺伝子セグメント及びＶκ３－２０遺伝子セグメントを含み、抗体が、ａ）配列番号４７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号４８の軽鎖アミノ酸配列、又はｂ）配列番号４９の重鎖アミノ酸配列及び配列番号５０の軽鎖アミノ酸配列のいずれかを含み、配列番号４７～配列番号５０のいずれかにおけるＸは、任意のアミノ酸であってもよく若しくはアミノ酸がなくてもよく、又は抗体配列が該配列に対して少なくとも８０％同一である。
【0014】
本発明の第１の態様の好ましい実施の形態によれば、本発明の第１の態様の代替ｂ）の抗体は、ＦＷＲ１において２ａａの欠失を含む。
【0015】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２５μｇ／ｍｌの抗体濃度で好ましくは全１２株を試験した場合、de Camp et al., J Virol. 2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルの１２株のＨＩＶ－１単離基準株のうち少なくとも１１株の中和によって例示される広範な中和活性を示す。
【0016】
本発明の第１の態様の更に別の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、少なくとも８９．９％（１１９個中１０７個）、好ましくは少なくとも９２．４％（１１９個中１１０個）、より好ましくは少なくとも９６．６％（１１９個中１１５個）のSchoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される１１９マルチクレードウイルスパネルに含まれる疑似ウイルスの中和によって例示される広範な中和活性を示す。
【0017】
本発明の第１の態様の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２５μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、de Camp et al., J Virol. 2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルの中和株に対して、０．３μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．２μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満、更に好ましくは０．０４８μｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．０３５μｇ／ｍｌの中和効力（中和株の幾何平均ＩＣ５０）を示す。
【0018】
本発明の第１の態様の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、Schoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される１１９マルチクレードウイルスパネルの中和株に対して、０．２μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．０８μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満の中和効力（中和株の幾何平均ＩＣ５０）を示す。
【0019】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＨＩＶ－１疑似ウイルス８９－Ｆ１＿２＿２５（８９－Ｆ１＿２＿２５ｅｎｖ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ２１５３４９．１）に対して０．０５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０２μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の中和効力（ＩＣ５０）を示す。
【0020】
本発明の第１の態様の更に別の好ましい実施の形態によれば、抗体又は結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＩＣ５０濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満で、エンベロープ変異Ｎ２７９Ｋ、Ｎ２８０Ｙ、Ｇ４５８Ｄ、Ｇ４５９Ｄ、又はＧ４７１Ｒ（ＨＩＶ－１ ＨＸＢ２エンベロープ遺伝子；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３４５５に従って番号が付与された残基）のいずれか１つを有するＹＵ２エンベロープ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ９３２５８．１）を含むＹＵ２疑似ウイルス変異体の全てを中和する。
【0021】
本発明の第１の態様の好ましい一実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、Zhang et al., J Virol, 2002 Jun;76(12):6332-43に記載されるＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウスに対して、３日毎～４日毎に０．５ｍｇの抗体又はその結合フラグメントの定期的な皮下注射を行うことは、治療の４週間後、好ましくは治療の６週間後、更により好ましくは治療の８週間後に測定した場合、治療開始時に少なくとも５０００コピー／ｍｌ血漿のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷を有する治療マウスの少なくとも７０％において、治療開始と比較して、少なくとも０．８ ｌｏｇ１０、好ましくは少なくとも１．０ ｌｏｇ１０の血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷の減少をもたらす。
【0022】
本発明の第１の態様の上記実施の形態のより好ましい実施の形態によれば、ヒト化マウスを、３ＢＮＣ１１７若しくはＶＲＣ０１、又は両方の組合せ１ｍｇの１回の初期皮下注射で４週間にわたって先に治療し、続いて３日～４日後に、０．５ｍｇの３ＢＮＣ１１７若しくはＶＲＣ０１、又は両方の組合せの３日毎～４日毎の定期的な皮下注射を行う。
【0023】
本発明の第１の態様の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、Zhang et al., J Virol, 2002 Jun;76(12):6332-43に記載されるＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウスに３日毎～４日毎に０．５ｍｇの抗体又はその結合フラグメントの定期的な皮下注射を行うことが、少なくとも４週間は、投与された抗体に対する耐性を媒介するＣＤ４結合部位（ループＤ、ＣＤ４結合ループ、ベータ２３鎖、Ｖ５ループ、及びベータ２４）における１つ以上の変異の発生をもたらさない。
【0024】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態によれば、ＮＲＧマウスへの０．５ｍｇの抗体又はその結合フラグメントの静脈内注射は、注射の１０日後に、少なくとも５０μｇ ＩｇＧ／ｍｌ血清の抗体又はその結合フラグメントの検出可能な血清レベルをもたらす。
【0025】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、１６又は１９アミノ酸長を有するＣＤＲＨ３を含まない。
【0026】
本発明の第１の態様の好ましい一実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、１８、２０又は２１アミノ酸長を有するＣＤＲＨ３を含む。
【0027】
本発明の第１の態様の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、Freund et al., Sci. Transl. Med. 9, eaal2144 (2017)に記載される抗体ＮＣ３７、ＮＣ１３３、ＡＣ４０、ＡＣ４１又はＡＣ７２のアミノ酸配列を含まない、又はこれらのみからなるものではない。
【0028】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、１－１８（配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２１（配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－３３（配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５４（配列番号７の重鎖アミノ酸配列と配列番号８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５５（配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１０（配列番号１１の重鎖アミノ酸配列と配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２２（配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２７（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－４７（配列番号１７の重鎖アミノ酸配列と配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－５９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、５－１８（配列番号２１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－１０（配列番号２３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－２３（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列と配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１０－７（配列番号２７の重鎖アミノ酸配列と配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－５２（配列番号２９の重鎖アミノ酸配列と配列番号３０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－８９（配列番号３１の重鎖アミノ酸配列と配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－７１（配列番号３３の重鎖アミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２３（配列番号３５の重鎖アミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２９（配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１２（配列番号３９の重鎖アミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２１（配列番号４１の重鎖アミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－０７（配列番号４３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－７８（配列番号４５の重鎖アミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）を含む群からの１つの抗体、好ましくは１－１８、１－３３、１－５５、２－２７、１－２３、１－２９、２－１２、２－２１、３－０７及び３－７８を含む群からの１つの抗体、より好ましくは１－１８、１－５５及び２－１２を含む群からの１つの抗体、更により好ましくは抗体１－１８又は２－１２、特に好ましくは抗体１－１８の重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【0029】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、１－１８（配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２１（配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－３３（配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５４（配列番号７の重鎖アミノ酸配列と配列番号８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５５（配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１０（配列番号１１の重鎖アミノ酸配列と配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２２（配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２７（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－４７（配列番号１７の重鎖アミノ酸配列と配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－５９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、５－１８（配列番号２１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－１０（配列番号２３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－２３（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列と配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１０－７（配列番号２７の重鎖アミノ酸配列と配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－５２（配列番号２９の重鎖アミノ酸配列と配列番号３０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－８９（配列番号３１の重鎖アミノ酸配列と配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－７１（配列番号３３の重鎖アミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２３（配列番号３５の重鎖アミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２９（配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１２（配列番号３９の重鎖アミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２１（配列番号４１の重鎖アミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－０７（配列番号４３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－７８（配列番号４５の重鎖アミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）を含む群から選択される１つの抗体、好ましくは１－１８、１－３３、１－５５、２－２７、１－２３、１－２９、２－１２、２－２１、３－０７及び３－７８を含む群からの１つの抗体、より好ましくは１－１８、１－５５及び２－１２を含む群からの１つの抗体、更により好ましくは抗体１－１８又は２－１２、特に好ましくは抗体１－１８の重鎖及び軽鎖の組合せを含む。
【0030】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様によるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントと、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
【0031】
本発明の第２の態様の好ましい実施の形態によれば、医薬組成物はヒト被験体用のワクチン接種組成物である。
【0032】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第１の態様によるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントと容器とを備えるキットが提供される。
【0033】
本発明の第４の態様によれば、医薬として用いられる、好ましくはワクチンとして用いられる本発明の第１の態様によるモノクローナルヒト抗体若しくはその結合フラグメント、本発明の第２の態様による医薬組成物、又は本発明の第３の態様によるキットが提供される。
【0034】
本発明の第５の態様によれば、ヒト被験体におけるヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる、好ましくはヒト被験体における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防に用いられる、本発明の第１の態様によるモノクローナルヒト抗体若しくはその結合フラグメント、本発明の第２の態様による医薬組成物、又は本発明の第３の態様によるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合の異なるエンベロープアミノ酸配列を有する１２個のグローバルリファレンス疑似ウイルス株のパネル（de Camp et al., J Virol. 2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載される）に対する本発明の抗体の中和活性を示す図である。試験された抗体は、中和された株に対して高い効力を実証し、試験された疑似ウイルスの少なくとも９２％（１１／１２）及び最大では試験された全ての疑似ウイルスを中和する。
【図2】漸増量の競合抗体（ｘ軸）とのプレインキュベーション後の競合ＥＬＩＳＡにおける、ＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４のＨＩＶ－１ Ｅｎｖタンパク質に対する抗体１－１８（図２Ａ）、抗体１－５５（図２Ｂ）、及び抗体２－１２（図２Ｃ）の結合を示す図である。試験された抗体は、抗体３ＢＮＣ１１７、抗体ＶＲＣ０１及び抗体Ｎ６を標的とするＣＤ４結合部位とのプレインキュベーション後にＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４エンベロープタンパク質への結合の低下を示し、抗体がＣＤ４結合部位と重複するエピトープを共有することを示す。
【図3】ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合の異なるＨＩＶ－１エンベロープアミノ酸配列を有する１１９個の疑似ウイルスのマルチクレードパネル（Schoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される）に対する抗体の中和活性（ＩＣ５０）を示す図である。抗体１－１８、抗体１－５５、及び抗体２－１２、臨床的に進んだＶＨ１－２由来ＣＤ４結合部位抗体（３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、及びＮ６）、並びにＶ３ループ標的化抗体（１０－１０７４、ＰＧＴ１２１）についてのデータを示す。
【図4】他のＶＨ１－４６由来ＨＩＶ－１中和抗体と比較した抗体１－１８、抗体１－５５、抗体２－１２の中和活性を示す図であり、合計６２のＨＩＶ－１疑似ウイルスのパネルに対する結果は、抗体中和データベースＣＡＴＮＡＰ（Yoon et al., 2015）で入手可能であった。
【図5】ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルスアッセイによって測定される、異なるエンベロープアミノ酸配列を有する選択された疑似ウイルスに対する抗体の中和活性を示す図である。
【図6】左に示されるようにＣＤ４結合部位における単一アミノ酸変異の異なるエンベロープ配列を有するＨＩＶ－１ ＹＵ２疑似ウイルスのパネルに対する抗体１－１８、抗体１－５５、及び抗体２－１２の中和活性を示す図であり、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて測定した場合の中和活性をＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、Ｎ６、及びＶＨ１－４６由来抗体８ＡＮＣ１３１と比較して示す。変異エンベロープ残基は、ＨＩＶ－１ＨＸＢ２基準株に従って番号が付与される。
【図7】ＨＩＶ－１ＹＵ２（エンベロープ遺伝子がＹＵ２のものと置換されたＮＬ４－３ウイルス）に感染したヒト化マウスにおけるＨＩＶ－１ ＲＮＡ血漿コピー数（上段）及びそれらのｌｏｇ１０変化（下段、ベースライン（－１日目のＨＩＶ－１ ＲＮＡ血漿コピー数）と比較）を示す図である。マウスに抗体あたり１ｍｇの負荷用量で皮下治療を行い、続いて３日～４日毎に抗体あたり０．５ｍｇの皮下注射を行った。既知のＣＤ４ｂｓ抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又は両方の抗体の組合せで治療したマウスは、ウイルス血症の一過性の減少を示し、続いて急速なウイルスリバウンドを示す。対照的に、本発明の抗体１－１８単独で治療されたマウスは、８週間の治療期間を通してウイルス血症の持続的な減少を示す。黒の破線は、平均ｌｏｇ１０変化を示す。
【図8】４週間の抗体療法の後、図７に示される選択されたマウスの単一ゲノム配列決定によって血漿から得られたＨＩＶ－１配列を示す図である。図７に対応するマウスＩＤを左側に示す。配列は、上段に示すＹＵ２野生型配列に対してアラインメントされる。ＹＵ２野生型配列とのアミノ酸配列の一致は点で示され、ＹＵ２野生型配列と比較した変異又は欠失は、それぞれアミノ酸１文字コード又は横線で示される。既知のＣＤ４ｂｓ抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又はそれらの組合せで治療したマウスでは、ＹＵ２野生型配列と比較したＣＤ４結合部位エピトープ（ループＤ、ベータ２３鎖、Ｖ５ループ）における変異は、ウイルスリバウンドと関連していたが、かかる変異は、本発明の抗体１－１８単独による４週間の治療法の後には観察されなかった。
【図9】ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又は両方の組合せ（図７を参照されたい）で予備治療したＨＩＶ－１ＹＵ２（ＮＬ４－３／ＹＵ２）に感染したヒト化マウスにおけるＨＩＶ－１ ＲＮＡ血漿コピー数（上段）及びそれらのｌｏｇ１０変化（下段、ベースライン（２８日目におけるＨＩＶ－１ ＲＮＡ血漿コピー数）と比較）を示す図である。４週間の治療後、抗体１－１８を、全体を通して継続した以前の治療レジメンに追加した。１－１８を１ｍｇの負荷用量で皮下投与し、続いて３日～４日毎に０．５ｍｇ投与した。他のＣＤ４結合部位抗体及びＣＤ４結合部位に変異を有する循環ウイルス変異体による予備治療後のウイルスリバウンドにもかかわらず（図８を参照されたい）、抗体１－１８による治療は、１８／１９匹のマウスにおいてウイルス抑制の維持をもたらした。
【図10】０日目（矢印で示す）に０．５ｍｇの抗体を単回静脈内注射した後のＮＲＧマウスにおいてＥＬＩＳＡにより決定されたヒトＩｇＧの血清中濃度を示す図である。既知のＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、及び４５－４６Ｇ５４Ｗと比較して、本発明の抗体１－１８、抗体１－５５、及び抗体２－１２は、より遅い抗体濃度の低下を示し、これは、ヒトにおいて３ＢＮＣ１１７よりも長い半減期を有するＶ３ループ標的化抗体１０－１０７４により類似している（Mendoza et al., 2018）。
【図11】ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルスアッセイにおいて決定された異なるエンベロープアミノ酸配列を有する選択された疑似ウイルスに対する抗体の中和活性（ＩＣ５０）を示す図である。疑似ウイルスパネルを、世界的なＨＩＶ－１パンデミックの多様性を代表するものとして選択した（de Camp et al., 2014）。本発明の抗体を、ＶＨ１－４６由来ＣＤ４結合部位抗体８ＡＮＣ１３１と比較する。
【図12】ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルスアッセイにおいて決定された６５４５．ｖ４．ｃ１及び８９－Ｆ１＿２＿２５ ＨＩＶ－１疑似ウイルス株に対する抗体の中和活性（ＩＣ５０）をそれぞれ示す図である。本発明の抗体を、ＨＩＶ－１中和ＣＤ４結合部位抗体Ｎ６、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、ＶＲＣ０７、ＶＲＣ０７－５２３－ＬＳ、８ＡＮＣ１３１、ＮＩＨ４５－４６及びＮＩＨ４５－４６Ｇ５４Ｗと比較する。
【図13】ベースライン（０日目）と比較した、ＨＩＶ－１ＢＡＬ（エンベロープ遺伝子をＨＩＶ－１株ＢＡＬのものに置換したＮＬ４－３ウイルス）に感染したヒト化マウスにおけるＨＩＶ－１ ＲＮＡ血漿コピー数のｌｏｇ１０変化を示す図である。マウスに抗体あたり１ｍｇの負荷用量で皮下治療を行い、続いて３日～４日毎に抗体あたり０．５ｍｇの皮下注射を行った。ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７又はＶＲＣ０１で治療されたマウスは、ウイルス血症の中程度の一過性の減少を示し、続いて急速なウイルスリバウンドを示す。対照的に、本発明の抗体１－１８で治療されたマウスは、６週間の治療期間を通してウイルス血症の持続的な減少を示す。対照マウスには治療を行わなかった。縞模様の黒線は、ベースラインと比較した平均ｌｏｇ１０変化を示す。数字は、個々のマウスをそれぞれのＩＤで示す。右側の表は、各治療コホートについて観察された最大平均ｌｏｇ１０ ＨＩＶ－１ ＲＮＡ変化、２１日目のｌｏｇ１０ ＨＩＶ－１ ＲＮＡ変化、及び４２日目のｌｏｇ１０ ＨＩＶ－１ ＲＮＡ変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本発明者らは、本発明の課題の解決に専念し、既知の抗体の不利益及び欠点を克服するＨＩＶ－１に対する新規で有用なヒトモノクローナル抗体を見出すことに成功した。
【0037】
本明細書において、本発明者らは、古典的なＶＨ１－４６及びＶＨ１－２に由来するｂＮＡｂの効力及び幅を超える新規なＶＨ１－４６及びＶκ３－２０に由来するＣＤ４結合部位抗体を記載する。観察された高い活性の構造的根拠は、共通の構造特性によって引き起こされると考えられる。これらの特性は、ＶＨ１－４６及びＶκ３－２０に由来する配列類似性の組合せに基づいており、それらの活性に決定的な残基を示すコンセンサス配列によって更に規定される。
【0038】
特に興味深いのは、２つの最も臨床的に進んだＣＤ４ｂｓ ｂＮＡｂである３ＢＮＣ１１７及びＶＲＣ０１と比較して、本発明による抗体は、ＨＩＶ－１感染ヒト化マウスで試験した場合に、ウイルス逃避を効果的に制限し、ＶＲＣ０１クラスエスケープ変異体に対する中和活性及び完全なウイルス抑制の両方を維持する。したがって、本発明の抗体は、ＨＩＶ－１感染を効果的に治療及び予防するための抗体媒介戦略の非常に有望な候補を含む。
【0039】
したがって、本発明は、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントであって、抗体配列がＶＨ１－４６遺伝子セグメント及びＶκ３－２０遺伝子セグメントを含み、
抗体が、
ａ）重鎖配列
ＱＸＸＸＦＱＳＧＸＥＸＫＲＰＧＡＳＶＸＩＳＣＲＡＤＤＤＰＹＴＤＤＤＴＦＴＫＹＸＴＨＷＩＲＱＡＰＧＱＸＰＥＷＬＧＶＩＳＰＨＸＡＲＰＩＹＳＹＫＦＸＤＲＬＴＬＴＲＤＳＳＬＴＸＶＹＸＥＬＸＸＬＸＸＤＤＸＧＩＹＸＣＡＲＤＰＦＧＸＸＸＰＨＹＮＸＨＭＤＶＷＧＸＧＴＸＸＩＶＳＸ（コンセンサス配列番号１；配列番号４７）
及び軽鎖配列
ＥＸＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＸＳＰＧＤＲＶＸＸＳＣＸＡＳＺＧＬＸＸＸＸＬＡＷＹＲＦＫＸＧＱＩＰＸＬＶＪＦＸＸＳＸＲＡＲＧＴＰＤＲＦＸＧＸＧＳＸＸＤＦＴＬＴＩＸＸＶＺＸＥＤＦＡＴＹＹＣＱＲＸＧＸＴＰＩＴＦＧＧＧＴＸＬＤＸＸ（コンセンサス配列番号２；配列番号４８）、又は、
ｂ）重鎖配列
ＱＬＸＱＸＧＧＧＶＸＸＰＧＡＳＶＸＸＳＣＸＸＰＥＸＴＦＴＫＹＸＪＨＷＸＲＱＡＰＧＸＧＸＥＷＸＧＸＶＳＰＨＧＧＲＰＸＸＸＸＸＦＲＤＲＬＴＸＴＲＸＩＨＸＴＴＨＸＭＸＬＸＧＬＸＸＸＤＸＸＸＹＸＣＡＲＤＸＸＧＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＭＤＸＷＧＧＧＸＸＸＸＶＸＳ（コンセンサス配列番号３；配列番号４９）
及び軽鎖配列
ＸＸＸＬＴＱＳＰＸＴＬＳＸＳＰＧＥＸＸＸＬＳＣＲＡＸＸＧＸＸＸＸＨＸＸＷＦＱＸＸＸＧＸＸＰＲＬＬＩＦＸＸＸＲＲＡＸＧＸＸＸＲＦＸＸＸＸＸＸＳＸＸＸＸＸＬＴＩＸＸＶＥＸＸＤＦＡＸＹＸＣＱＸＹＧＸＩＴＰＪＸＦＧＧＧＴＸＸＤＸＫ（コンセンサス配列番号４；配列番号５０）を含み、
配列番号４７～配列番号５０のいずれかにおけるＸは、任意のアミノ酸であってもよく若しくはアミノ酸がなくてもよく、
又は抗体配列が該配列に対して少なくとも８０％同一である、モノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントを提供する。
抗体が、
ａ）重鎖配列
ＱＸＸＸＦＱＳＧＸＥＸＫＲＰＧＡＳＶＸＩＳＣＲＡＤＤＤＰＹＴＤＤＤＴＦＴＫＹＸＴＨＷＩＲＱＡＰＧＱＸＰＥＷＬＧＶＩＳＰＨＸＡＲＰＩＹＳＹＫＦＸＤＲＬＴＬＴＲＤＳＳＬＴＸＶＹＸＥＬＸＸＬＸＸＤＤＸＧＩＹＸＣＡＲＤＰＦＧＸＸＸＰＨＹＮＸＨＭＤＶＷＧＸＧＴＸＸＩＶＳＸ（コンセンサス配列番号１；配列番号４７）
及び軽鎖配列
ＥＸＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＸＳＰＧＤＲＶＸＸＳＣＸＡＳＺＧＬＸＸＸＸＬＡＷＹＲＦＫＸＧＱＩＰＸＬＶＪＦＸＸＳＸＲＡＲＧＴＰＤＲＦＸＧＸＧＳＸＸＤＦＴＬＴＩＸＸＶＺＸＥＤＦＡＴＹＹＣＱＲＸＧＸＴＰＩＴＦＧＧＧＴＸＬＤＸＸ（コンセンサス配列番号２；配列番号４８）、又は、
ｂ）重鎖配列
ＱＬＸＱＸＧＧＧＶＸＸＰＧＡＳＶＸＸＳＣＸＸＰＥＸＴＦＴＫＹＸＪＨＷＸＲＱＡＰＧＸＧＸＥＷＸＧＸＶＳＰＨＧＧＲＰＸＸＸＸＸＦＲＤＲＬＴＸＴＲＸＩＨＸＴＴＨＸＭＸＬＸＧＬＸＸＸＤＸＸＸＹＸＣＡＲＤＸＸＧＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＭＤＸＷＧＧＧＸＸＸＸＶＸＳ（コンセンサス配列番号３；配列番号４９）
及び軽鎖配列
ＸＸＸＬＴＱＳＰＸＴＬＳＸＳＰＧＥＸＸＸＬＳＣＲＡＸＸＧＸＸＸＸＨＸＸＷＦＱＸＸＸＧＸＸＰＲＬＬＩＦＸＸＸＲＲＡＸＧＸＸＸＲＦＸＸＸＸＸＸＳＸＸＸＸＸＬＴＩＸＸＶＥＸＸＤＦＡＸＹＸＣＱＸＹＧＸＩＴＰＪＸＦＧＧＧＴＸＸＤＸＫ（コンセンサス配列番号４；配列番号５０）を含み、
配列番号４７～配列番号５０のいずれかにおけるＸは、任意のアミノ酸であってもよく若しくはアミノ酸がなくてもよく、
又は抗体配列が該配列に対して少なくとも８０％同一である、モノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントを提供する。
【0040】
本発明の文脈内で、本明細書において作製及び記載されている抗体は、完全なモノクローナルヒト抗体として、又はその任意の機能フラグメント若しくは結合フラグメントとして使用され、特許請求の範囲に記載され得る。好ましくは、モノクローナルヒト抗体、又はその任意の種類の機能フラグメント若しくは結合フラグメントは、少なくともヒトモノクローナル抗体の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３及び軽鎖のＣＤＲ１～３を含まなければならない。
【0041】
本明細書に記載の抗体配列のＣＤＲ領域は、好ましくは、Ｃｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームの適応であるＩＭＧＴのナンバリングスキームに従って規定される（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（商標）；Lefranc et al., NAR 27:209-212 (1999)；http://www.imgt.org）。
【0042】
好ましい一実施形態において、抗体は、結合特異性及び感染性病原体を中和する能力を保持するモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。好ましい一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。例えば、抗体は、任意のヒトＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃドメインを含む抗体であり得る。
【0043】
任意に、抗原結合化合物は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体フラグメント、又は複数の異なる抗体フラグメントを含む多重特異性抗体のみからなるか、又はそれらを含む。
【0044】
本発明内において、ＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対する抗体又は結合フラグメントとは、無関係なエピトープ、タンパク質又はタンパク質領域と比較して、少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍増加した親和性を有するＨＩＶ－１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質内のＣＤ４結合部位領域に結合する抗体を意味する。一般に、本明細書においてＣＤ４結合部位という用語は、ＨＩＶ－１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質内のＣＤ４結合部位領域を指す。
【0045】
更に本発明内において、ＶＨ１－４６遺伝子セグメント及びＶκ３－２０遺伝子セグメントを含む抗体アミノ酸配列は、それぞれ、上記遺伝子セグメントに基づく、及び／又は該遺伝子セグメントに由来する抗体アミノ酸配列を意味する。抗体アミノ酸配列をアセンブリするためにどのＶＨ又はＶκの遺伝子セグメントが使用されるかを決定する方法は、当該技術分野で一般的に知られている。上記遺伝子セグメントの変異は、天然抗体のアセンブリにおいて一般的に生じるが、特異的抗体を構成するためのＶＨ１－４６遺伝子セグメント及びＶκ３－２０遺伝子セグメントの使用を要求することによって、どの一次配列要件が定められるかは、当業者には容易に明らかであろう。
【0046】
したがって、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントは、好ましくは、ＶＨ１－４６遺伝子セグメントとＶκ３－２０遺伝子セグメントとの組合せから天然に誘導され得る配列を含むものとして理解されるものとする。これは、好ましくは、上記遺伝子セグメントの天然に存在する程度の変異誘発を含み得る。
【0047】
特許請求の範囲に記載される抗体の全体的な構造的基礎に対するこれら２つのセグメントの意義及び影響を理解するために、ＶＨ１－４６は、コンセンサス配列番号１による重鎖中の合計１３１アミノ酸のうち１０４アミノ酸を担い、コンセンサス配列番号３による重鎖中の合計１２６アミノ酸のうち９６アミノ酸を担うことに留意すべきである。
【0048】
同様に、Ｖκ３－２０は、コンセンサス配列番号２による軽鎖中の合計１０８アミノ酸のうち９６アミノ酸を占め、コンセンサス配列番号４による軽鎖中の合計１１１アミノ酸のうち９８アミノ酸を占める。
【0049】
本発明者らが同定することができた機能的抗体の数に基づいて、ＶＨ１－４６遺伝子セグメント及びＶκ３－２０遺伝子セグメントを含み、ＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対する抗体について、２組のコンセンサス配列を組み立てることが更に可能となった。これら２つのセットは、ＣＤ４結合部位への高効率の結合、ウイルス逃避の制限、並びにウイルス中和の幅及び効力を実現するための異なる一次配列アプローチとなるようである。
【0050】
配列の第１のセットは、重鎖について配列番号４７によるコンセンサス配列番号１及び軽鎖について配列番号４８によるコンセンサス配列番号２からなる。これらのコンセンサス配列に適合する多くの個別化配列が本明細書で研究されており、それによって得られた結果は、コンセンサス配列と規定されたセグメントとの組合せが、一連の機能的抗体を得るのに十分な構造的指針を与えることを真実味のあるものとする。さらに、配列の第１のセットに適合する一連の抗体の２つの代表的ものは、更に詳細に研究されている抗体１－１８及び抗体１－５５である。
【0051】
配列の第２のセットは、重鎖について配列番号４９によるコンセンサス配列番号３及び軽鎖について配列番号５０によるコンセンサス配列番号２からなる。ここでも、多くの個別化配列がコンセンサス配列の第２のセットの例として本明細書で研究されており、それによって得られた結果はまた、これらのコンセンサス配列と規定されたセグメントとの組合せが機能的抗体を得るのに十分な構造的指針を与えることを真実味のあるものとする。さらに、配列の第２のセットに適合する一連の抗体の１つの代表的なものは、抗体２－１２であり、これもまた、より詳細に研究されている。
【0052】
本明細書に記載のコンセンサス配列に関して、アミノ酸配列内のＸ又はＸａａは、任意のアミノ酸又は非アミノ酸を表し得る。しかしながら、特許請求の範囲に記載された抗体がＶＨ１－４６遺伝子セグメント及びＶκ３－２０遺伝子セグメントを含むものとするという追加の要件に基づいて、各抗体の根底にある基礎を形成するこれらの遺伝子セグメントによって選択肢がより制限されることは当業者には明らかである。
【0053】
一般に、本明細書に記載されるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントは、更に、それらが依然としてヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するものである限り、上記で規定した配列に対して少なくとも８０％同一である抗体アミノ酸配列を包含する。これは、ＣＤ４結合部位に対する抗体の構造的折り畳み及び親和性を妨げない抗体アミノ酸配列の些細な変異を有する配列を含むことを意味する。
【0054】
或る程度の同一性を示す抗体が、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１のＣＤ４結合部位に対するものであるかどうかを、上記又は一般的な常識に基づいて判断することは、当業者にとって些細な作業である。
【0055】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、Karlin及びAltschulの数学的アルゴリズムを用いて、本発明に従い、達成される（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5873-5877）。かかるアルゴリズムは、Altschul et al.(J. Mol. Biol. (1990) 215:403-410)のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムの基礎である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行われる。比較の目的でギャップのあるアラインメントを取得するために、Altschul et al.(Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402)によって説明されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用する。
【0056】
本発明の好ましい実施形態によれば、上に規定され、本明細書に開示される配列と少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、更により好ましくは少なくとも９５％同一である核酸配列のみからなる又はそれを含む抗体アミノ酸配列は、本発明の一部を形成する。
【0057】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の第１の態様の代替ｂ）の抗体は、ＦＷＲ１において２ａａの欠失を含む。
【0058】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、モノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて、最大２５μｇ／ｍｌの抗体濃度で好ましくは全１２株を試験した場合、de Camp et al., J Virol. 2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルの１２株のＨＩＶ－１単離基準株のうち少なくとも１１株の中和によって例示される広範な中和活性を示す。
【0059】
ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイは、様々なＨＩＶ－１株に対する抗体の中和効力の分析のため、当該技術分野及び本発明の技術分野において一般的に使用される非常に標準化されたアッセイである。簡単に言えば、抗体及びウイルス株を、ＴＺＭ－ｂｌ標的細胞が添加される前に共にインキュベートする。これらの細胞は、感染が成功した場合にルシフェラーゼ活性を示し、細胞の溶解後にルシフェリンの存在下で検出可能な発光シグナルをもたらす。中和抗体は、感染、したがって発光の発生を防ぐことができる。中和抗体の効力は、ウイルス感染力を特定の量だけ低下させるのに必要な抗体の濃度によって決定される。
【0060】
このアッセイを設定及び採用する標準化された方法は、Sarzotti-Kelsoe et al.; J Immunol Methods. 2014 July ; 0: 131-146. doi:10.1016/j.jim.2013.11.022に開示され、詳細に記載されている。この説明を単独で、及び一般的な従来技術と組み合わせて、当業者は、本明細書で使用されるＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイの決定的な読み出しを確立し、決定することを可能にする。
【0061】
de Camp et al., J Virol.2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルは、選択された１２個の代表的なＨＩＶ－１ウイルス変異体を含む。この１２ウイルスパネルで見られるＨＩＶ－１血清中和活性のスペクトルは、サブタイプマッチウイルスで見られる活性に密接に近似するために一般的に受け入れられている。さらに、このパネルは、多くの既知の広域中和抗体の検出に対して感度が高い。このパネルで実施された研究は、所与の抗体の中和幅及び／又は効力の信頼できる予測を可能にする。
【0062】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、少なくとも８９．９％（１１９個中１０７個）、好ましくは少なくとも９２．４％（１１９個中１１０個）、更により好ましくは少なくとも９６．６％（１１９個中１１５個）のSchoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される１１９マルチクレードウイルスパネルに含まれる疑似ウイルスの中和によって例示される広範な中和活性を示す。
【0063】
Schoofs et al., 2019による、及びそこで参照されているより包括的なパネルは、多数の異なる疑似ウイルス（すなわち、ＨＩＶ－１株）を試験することによって、幅及び効力を正確に特定するのに役立つ。この大きなパネルは、全ての主要な循環ＨＩＶ－１クレードの代表として一般的に受け入れられており、検査された抗体の中和能力に関する詳細な情報を提供する。
【0064】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２５μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、de Camp et al., J Virol. 2014 Mar; 88(5): 2489-2507に記載されるグローバルリファレンスパネルの中和株に対して、０．３μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．２μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．１５μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満、更に好ましくは０．０４８μｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．０３５μｇ／ｍｌの中和効力（幾何平均ＩＣ５０）を示す。
【0065】
本明細書で規定される中和効力は、好ましくは、それぞれの抗体によって中和されていると肯定的に決定され得るそれらのウイルス変異体のみを考慮に入れる。次いで、肯定的に中和された変異体の選択に基づき、幾何平均ＩＣ５０を中和された株に対して決定する。
【0066】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ細胞疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、Schoofs et al., Immunity, 2019 Jun 18;50(6):1513-1529.e9に記載される１１９マルチクレードウイルスパネルの中和株に対して、０．２μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．０８μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満の中和効力（幾何平均ＩＣ５０）を示す。
【0067】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＨＩＶ－１疑似ウイルス８９－Ｆ１＿２＿２５（８９－Ｆ１＿２＿２５ｅｎｖ遺伝子；ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ２１５３４９．１）に対して０．０５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０２μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは多くとも０．０１μｇ／ｍｌ、更により好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の中和効力（ＩＣ５０）を示す。
【0068】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＨＩＶ－１疑似ウイルス６５４６．ｖ４．ｃ１（６５４６．ｖ４．ｃ１ ｅｎｖ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ２１５３３２．１）に対して、１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満、更により好ましくは多くとも０．０１μｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ未満の中和効力（ＩＣ５０）を示す。
【0069】
ＨＩＶ－１疑似ウイルス８９－Ｆ１＿２＿２５は、既知のＣＤ４結合部位抗体による中和のための最も困難な株の１つであるようである。実際、ＣＤ４結合部位を標的とする以前より知られていた抗体のいずれも、０．１９４μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で上記疑似ウイルスの中和に成功したことが未だに実証されていない。しかしながら、本発明による抗体は、はるかに高い効力で上記株を中和することができる。
【0070】
ＨＩＶ－１疑似ウイルス６５４５．ｖ４．ｃ１もまた、ＣＤ４結合部位抗体による中和に対して非常に困難な株であるようである。ＣＤ４結合部位を標的とする以前より知られている抗体のいずれも、０．０９１μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で上記疑似ウイルスの中和に成功したことが未だに実証されていない。しかしながら、はるかに高い効力で上記株を中和することができる本発明による抗体が存在する。
【0071】
本発明の好ましい一実施形態によれば、抗体又は結合フラグメントは、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて試験した場合、ＩＣ５０濃度が０．１μｇ／ｍｌ未満、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌ未満で、エンベロープ変異Ｎ２７９Ｋ、Ｎ２８０Ｙ、Ｇ４５８Ｄ、Ｇ４５９Ｄ、又はＧ４７１Ｒ（ＨＩＶ－１ ＨＸＢ２エンベロープ遺伝子；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３４５５に従って番号が付与された残基）のいずれか１つを有するＹＵ２エンベロープ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ９３２５８．１）を含むＹＵ２疑似ウイルス変異体の全てを中和する。
【0072】
変異Ｎ２７９Ｋ、Ｎ２８０Ｙ、Ｇ４５８Ｄ、及びＧ４５９Ｄは、ＨＩＶ－１感染のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＣＤ４結合部位抗体による治療中のウイルスリバウンドの発生（すなわち、治療失敗）と関連しており、投与されたＣＤ４結合部位抗体に対するウイルス耐性の発生を示す（非特許文献５、Horwitz et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2013 Oct 8;110(41):16538-43）。この場合も、本発明による抗体は、上述したＹＵ２エンベロープ遺伝子中の変異が中和を消失させず、本発明による抗体に対するエスケープ変異として作用しないという点で、従来技術の既知のＣＤ４結合部位抗体よりも優れている。
【0073】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、Zhang et al., J Virol, 2002 Jun;76(12):6332-43に記載されるＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウスに対して、３日毎～４日毎に０．５ｍｇの抗体又はその結合フラグメントの定期的な皮下注射を行うことが、治療の４週間後、好ましくは治療の６週間後、更により好ましくは治療の８週間後に測定した場合、治療開始時に少なくとも５０００コピー／ｍｌ血漿のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷を有する治療マウスの少なくとも７０％において、治療開始と比較して、少なくとも０．８ ｌｏｇ１０、好ましくは少なくとも１．０ ｌｏｇ１０の血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷の減少をもたらす。
【0074】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、ＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＢＡＬに感染したヒト化マウスに対して、３日毎～４日毎に０．５ｍｇの抗体又はその結合フラグメントの定期的な皮下注射を行うことが、治療の４週間後、更により好ましくは治療の６週間後に測定した場合、治療開始時に少なくとも３００００コピー／ｍｌ血漿のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷を有する治療マウスの少なくとも６０％において、治療開始と比較して、少なくとも１．０ ｌｏｇ１０、好ましくは少なくとも１．５ ｌｏｇ１０、更により好ましくは少なくとも１．７５ ｌｏｇ１０の血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡ負荷の減少をもたらす。
【0075】
上記実施形態のより好ましい実施形態によれば、ヒト化マウスを、３ＢＮＣ１１７若しくはＶＲＣ０１、又は両方の組合せ１ｍｇの１回の初期皮下注射で４週間にわたって先に治療し、続いて３日～４日後に、０．５ｍｇの３ＢＮＣ１１７若しくはＶＲＣ０１、又は両方の組合せの３日毎～４日毎の定期的な皮下注射を行う。
【0076】
ＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウス（Zhang et al., J Virol, 2002;76: 6332-6343に記載されるＮＬ４－３骨格中のＹＵ２ ｅｎｖ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＶ－１抗体を中和する抗ウイルス活性を研究するための当該技術分野で十分に確立されたモデルを提供する。これらのマウスは、安定したレベルのウイルス血症（すなわち、血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡコピー数）を維持することができ、ｅｎｖ遺伝子においてヒトで観察されるものと類似したＨＩＶ－１配列多様化率を示すことができる（非特許文献５）。
【0077】
このモデルは、ＣＤ４結合部位抗体による単独療法の効果を調べるためにも使用されている（Freund et al., PLoS Pathog, 2015, Oct 30;11(10):e1005238、非特許文献５、Horwitz et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2013 Oct 8;110(41):16538-43、Freund et al., Sci Transl Med, 2017 Jan 18;9(373). pii: eaal2144）。単独療法として与えられる本発明による抗体は、治療されたマウスにおけるＨＩＶ－１ウイルス量抑制の維持をもたらし、したがって、抗体単独療法中のＨＩＶ－１ウイルス量の一過性の減少のみが観察される他の研究されたＣＤ４結合部位抗体よりも優れている。さらに、１－１８のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、マウスがＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又はこれらの組合せによる先の治療の間にウイルスリバウンドを発生した後にもウイルス抑制の維持が達成されるという点で他のＣＤ４結合部位抗体よりも優れている。
【0078】
本発明の第１の態様の好ましい一実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメント１ｍｇの初期皮下注射に続いて、３日～４日後に、Zhang et al., J Virol, 2002 Jun;76(12):6332-43に記載されるＨＩＶ－１ ＮＬ４－３／ＹＵ２に感染したヒト化マウスに３日毎～４日毎に０．５ｍｇの抗体又はその結合フラグメントの定期的な皮下注射を行うことが、少なくとも４週間は、投与された抗体に対する耐性を媒介するＣＤ４結合部位（ループＤ、ＣＤ４結合ループ、ベータ２３鎖、Ｖ５ループ、及びベータ２４鎖）における１つ以上の変異の発生をもたらさない。
【0079】
好ましくは、先の実施形態の状況で使用される投与された抗体に対する耐性を、この変異を含むウイルス配列で生成されたＨＩＶ－１疑似ウイルスが試験されるときに、ＴＺＭ－ｂｌ中和疑似ウイルスアッセイにおいて少なくとも２．５μｇ／ｍｌの投与された抗体のＩＣ５０をもたらすと規定することができる。
【0080】
抗体耐性をもたらす及び／又はウイルスリバウンドに関連するエスケープ変異の発生（すなわち、治療の失敗）は、他のＣＤ４結合部位抗体の抗体単独療法研究において実証されている（Freund et al., PLoS Pathog, 2015, Oct 30;11(10):e1005238、非特許文献５、Horwitz et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2013 Oct 8;110(41):16538-43、Freund et al., Sci Transl Med, 2017 Jan 18;9(373). pii: eaal2144）。これらのＣＤ４結合部位抗体と比較して、本発明の抗体は、ＣＤ４結合部位エピトープにおける変異の発生を防止し、したがって治療の失敗を防ぎ、抗ウイルス活性を維持することができる点で優れている。
【0081】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態によれば、ＮＲＧマウスへの０．５ｍｇの抗体又は結合フラグメントの静脈内注射は、注射の１０日後に、少なくとも５０μｇ ＩｇＧ／ｍｌ血清の抗体又はその結合フラグメントの検出可能な血清レベルをもたらす。
【0082】
ＨＩＶ－１中和抗体は、それらの薬物動態学的特性において変化し得る。ヒトにおいて、現在知られているＣＤ４結合部位抗体は、Ｖ３ループを標的とする抗体よりも短い半減期を有するようであり（Mendoza et al., Nature, 2018 Sep;561(7724):479-484)、マウスモデルにおいても観察がなされている（非特許文献５、Horwitz et al, Proc Natl Acad Sci U S A, 2013 Oct 8;110(41):16538-43）。他のＣＤ４結合部位抗体と比較して、本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでより高い血清レベルをより長期間維持することから優れている。
【0083】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、抗体若しくはその結合フラグメントは１６若しくは１９のアミノ酸長を有するＣＤＲＨ３を含まない、及び／又は抗体若しくはその結合フラグメントは１８、２０若しくは２１のアミノ酸長を有するＣＤＲＨ３を含む。
【0084】
本発明の第１の態様の好ましい一実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、Freund et al., Sci.Transl. Med.9, eaal2144 (2017)に記載される抗体ＮＣ３７、ＮＣ１３３、ＡＣ４０、ＡＣ４１又はＡＣ７２のアミノ酸配列を含まない、又はこれらのみからなるものではない。
【0085】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、１－１８（配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２１（配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－３３（配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５４（配列番号７の重鎖アミノ酸配列と配列番号８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５５（配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１０（配列番号１１の重鎖アミノ酸配列と配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２２（配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２７（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－４７（配列番号１７の重鎖アミノ酸配列と配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－５９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、５－１８（配列番号２１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－１０（配列番号２３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－２３（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列と配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１０－７（配列番号２７の重鎖アミノ酸配列と配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－５２（配列番号２９の重鎖アミノ酸配列と配列番号３０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－８９（配列番号３１の重鎖アミノ酸配列と配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－７１（配列番号３３の重鎖アミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２３（配列番号３５の重鎖アミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２９（配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１２（配列番号３９の重鎖アミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２１（配列番号４１の重鎖アミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－０７（配列番号４３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－７８（配列番号４５の重鎖アミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）を含む群からの１つの抗体、好ましくは１－１８、１－３３、１－５５、２－２７、１－２３、１－２９、２－１２、２－２１、３－０７及び３－７８を含む群からの１つの抗体、より好ましくは１－１８、１－５５及び２－１２を含む群からの１つの抗体、更により好ましくは抗体１－１８又は２－１２、特に好ましくは抗体１－１８の重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【0086】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、抗体又はその結合フラグメントは、１－１８（配列番号１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２１（配列番号３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－３３（配列番号５の重鎖アミノ酸配列と配列番号６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５４（配列番号７の重鎖アミノ酸配列と配列番号８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－５５（配列番号９の重鎖アミノ酸配列と配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１０（配列番号１１の重鎖アミノ酸配列と配列番号１２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２２（配列番号１３の重鎖アミノ酸配列と配列番号１４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２７（配列番号１５の重鎖アミノ酸配列と配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－４７（配列番号１７の重鎖アミノ酸配列と配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－５９（配列番号１９の重鎖アミノ酸配列と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、５－１８（配列番号２１の重鎖アミノ酸配列と配列番号２２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－１０（配列番号２３の重鎖アミノ酸配列と配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－２３（配列番号２５の重鎖アミノ酸配列と配列番号２６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１０－７（配列番号２７の重鎖アミノ酸配列と配列番号２８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、８－５２（配列番号２９の重鎖アミノ酸配列と配列番号３０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－８９（配列番号３１の重鎖アミノ酸配列と配列番号３２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、９－７１（配列番号３３の重鎖アミノ酸配列と配列番号３４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２３（配列番号３５の重鎖アミノ酸配列と配列番号３６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、１－２９（配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－１２（配列番号３９の重鎖アミノ酸配列と配列番号４０の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、２－２１（配列番号４１の重鎖アミノ酸配列と配列番号４２の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－０７（配列番号４３の重鎖アミノ酸配列と配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列とからなる）、３－７８（配列番号４５の重鎖アミノ酸配列と配列番号４６の軽鎖アミノ酸配列とからなる）を含む群から選択される１つの抗体、好ましくは１－１８、１－３３、１－５５、２－２７、１－２３、１－２９、２－１２、２－２１、３－０７及び３－７８を含む群からの１つの抗体、より好ましくは１－１８、１－５５及び２－１２を含む群からの１つの抗体、更により好ましくは抗体１－１８又は２－１２、特に好ましくは抗体１－１８の重鎖及び軽鎖の組合せを含む。
【0087】
本出願の記載において、抗体の呼称が用いられる場合がある。抗体は、重鎖及び軽鎖からなることが指摘され、これらはまた本記載の一部を形成する。抗体をその呼称によって、又は配列番号に対して言及する場合、これらの参照方法は同じ意味を有することを理解されたい。
【0088】
本発明は、本明細書に規定され、更に記載される本発明によるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントと、少なくとも１つの薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物に更に関する。好ましくは、医薬組成物はヒト被験体用のワクチン接種組成物である。
【0089】
本発明はまた、本明細書で規定され、更に記載される本発明によるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメントと容器とを備えるキットを包含する。
【0090】
一態様において、本発明はまた、医薬として用いるための、好ましくはワクチンとして用いるための本明細書に規定され、更に記載される本発明によるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメント、本明細書に記載される医薬組成物、及びキットに関する。
【0091】
別の態様において、本発明はまた、ヒト被験体におけるヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる、好ましくはヒト被験体における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防に用いられる、本明細書に規定され、更に記載される本発明によるモノクローナルヒト抗体又はその結合フラグメント、本明細書に記載の医薬組成物、及びキットに関する。
【0092】
他の一態様において、本発明はまた、ヒト被験体においてヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患に罹患している患者の治療方法、好ましくはヒト被験体における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防に用いられる方法に関し、患者には、有効量の本発明によるモノクローナルヒト抗体若しくはその結合フラグメント、又は本発明の医薬組成物が投与される。
【0093】
別の態様において、本発明はまた、ヒト被験体におけるヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１によって引き起こされる疾患の治療のための、好ましくはヒト被験体における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の治療又は予防のための医薬の製造における本発明によるモノクローナルヒト抗体若しくはその結合フラグメント、又は本発明の医薬組成物の使用に関する。
【0094】
本明細書に記載される本発明の全ての実施形態は、あらゆる組合せで、当業者がそのような組合せを何ら技術的な意味をなさないと考えない限りは組み合わせることができると見なされる。
【実施例】
【0095】
Ａ）実験方法
モノクローナル抗体配列の単離
血液及び白血球アフェレーシスの試料を、ケルン大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコル（プロトコル１３－３６４及び１６－０５４）に基づいて得て、参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によって単離し、９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ中、－１５０℃で保存した。Ｂ細胞を磁気細胞分離によってＰＢＭＣから単離し、抗ヒトＣＤ１９－ＡＦ７００、抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ、ＤＡＰＩ（BD）、及びＨＩＶ－１ Ｅｎｖベイトタンパク質（bait protein）で氷上で３０分間標識した。ＨＩＶ－１ Ｅｎｖベイトタンパク質は、ＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４－ＧＦＰ（Sliepen et al., 2015）、又はストレプトアビジン－ＰＥで標識されたビオチン化（ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ Ｂｉｏｔｉｎｇ及びＬａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Thermo Fisher）ＹＵ２ｇｐ１４０（Yang et al., 2000）のいずれかであった。Ｅｎｖ反応性ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋ＤＡＰＩ－単一細胞を、前に記載されるように選別した（Ehrhardt et al., 2019）。選別した細胞を、ランダムヘキサマープライマー、ＮＰ－４０、及びＲＮａｓｅフリーＨ２Ｏと共に６５℃で１分間インキュベートした。続いて、ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｈ２Ｏ、ＲＮａｓｉｎ、及びＲＮａｓｅＯＵＴの存在下で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶを用いてｃＤＮＡを作製した。単一細胞分析のための抗体配列を、Ｔａｑポリメラーゼ及び以前に記載されたプライマーＣＧ＿ＲＴ（Ozawa et al., 2006、第１のＰＣＲ）、ＩｇＧ＿Ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＴ（Tiller et al., 2008、第２のＰＣＲ）、及びＯＰＴ５／ｏＰＲ－プライマーミックス（Kreer et al., 2019、両方のＰＣＲ）を用いたセミネステッドＰＣＲによって増幅した。
モノクローナル抗体配列の単離
血液及び白血球アフェレーシスの試料を、ケルン大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコル（プロトコル１３－３６４及び１６－０５４）に基づいて得て、参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離によって単離し、９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ中、－１５０℃で保存した。Ｂ細胞を磁気細胞分離によってＰＢＭＣから単離し、抗ヒトＣＤ１９－ＡＦ７００、抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ、ＤＡＰＩ（BD）、及びＨＩＶ－１ Ｅｎｖベイトタンパク質（bait protein）で氷上で３０分間標識した。ＨＩＶ－１ Ｅｎｖベイトタンパク質は、ＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４－ＧＦＰ（Sliepen et al., 2015）、又はストレプトアビジン－ＰＥで標識されたビオチン化（ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ Ｂｉｏｔｉｎｇ及びＬａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Thermo Fisher）ＹＵ２ｇｐ１４０（Yang et al., 2000）のいずれかであった。Ｅｎｖ反応性ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋ＤＡＰＩ－単一細胞を、前に記載されるように選別した（Ehrhardt et al., 2019）。選別した細胞を、ランダムヘキサマープライマー、ＮＰ－４０、及びＲＮａｓｅフリーＨ２Ｏと共に６５℃で１分間インキュベートした。続いて、ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｈ２Ｏ、ＲＮａｓｉｎ、及びＲＮａｓｅＯＵＴの存在下で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶを用いてｃＤＮＡを作製した。単一細胞分析のための抗体配列を、Ｔａｑポリメラーゼ及び以前に記載されたプライマーＣＧ＿ＲＴ（Ozawa et al., 2006、第１のＰＣＲ）、ＩｇＧ＿Ｉｎｔｅｒｎａｌ ＲＴ（Tiller et al., 2008、第２のＰＣＲ）、及びＯＰＴ５／ｏＰＲ－プライマーミックス（Kreer et al., 2019、両方のＰＣＲ）を用いたセミネステッドＰＣＲによって増幅した。
【0096】
抗体配列解析
平均Ｐｈｒｅｄスコア２８以上及び最小２４０ヌクレオチド長を有する第２のＰＣＲ産物の配列をＩｇＢＬＡＳＴで注釈を付け（Ye et al., 2013）、可変領域のフレームワーク領域（ＦＷＲ）１からＪ遺伝子の末端までトリミングした。Ｐｈｒｅｄスコア１６未満の塩基コールはマスクされ、１５超のマスクされたヌクレオチド、フレームシフト、又は終止コドンを有する配列を更なる分析から除外した。潜在的なクローン性について配列を分析するために、全ての生産的重鎖配列を同一のＶ遺伝子によってグループ化し、それらのＣＤＲＨ３の対毎のレーベンシュタイン距離を決定した。個々の配列を、同じＶ遺伝子を共有し、７５％の最小ＣＤＲＨ３同一性を有していたクローンにグループ化した。配列のランダム化入力による１０ラウンド後、割り当てられていない（非クローン）配列の数が最も少ない結果を、更なる分析のために選択した。全てのクローンを、共有変異を同定するために、研究者によって手動で再検証した。当初は異なるクローンに割り当てられていたが、同じＶＤＪ遺伝子及びアミノ酸及び／又はサイレントヌクレオチド変異を共有していた配列を、その後サブクローンにグループ化した。生殖細胞系列に対するヌクレオチドの配列同一性を、ＩｇＢＬＡＳＴを用いて算出した。
平均Ｐｈｒｅｄスコア２８以上及び最小２４０ヌクレオチド長を有する第２のＰＣＲ産物の配列をＩｇＢＬＡＳＴで注釈を付け（Ye et al., 2013）、可変領域のフレームワーク領域（ＦＷＲ）１からＪ遺伝子の末端までトリミングした。Ｐｈｒｅｄスコア１６未満の塩基コールはマスクされ、１５超のマスクされたヌクレオチド、フレームシフト、又は終止コドンを有する配列を更なる分析から除外した。潜在的なクローン性について配列を分析するために、全ての生産的重鎖配列を同一のＶ遺伝子によってグループ化し、それらのＣＤＲＨ３の対毎のレーベンシュタイン距離を決定した。個々の配列を、同じＶ遺伝子を共有し、７５％の最小ＣＤＲＨ３同一性を有していたクローンにグループ化した。配列のランダム化入力による１０ラウンド後、割り当てられていない（非クローン）配列の数が最も少ない結果を、更なる分析のために選択した。全てのクローンを、共有変異を同定するために、研究者によって手動で再検証した。当初は異なるクローンに割り当てられていたが、同じＶＤＪ遺伝子及びアミノ酸及び／又はサイレントヌクレオチド変異を共有していた配列を、その後サブクローンにグループ化した。生殖細胞系列に対するヌクレオチドの配列同一性を、ＩｇＢＬＡＳＴを用いて算出した。
【0097】
モノクローナル抗体産生
単一細胞由来抗体のクローニングのため、単一細胞ＰＣＲの第１のＰＣＲ産物を鋳型として用い、Ｑ５ハイフィデリティポリメラーゼ、並びにその後の配列及びライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）のための発現ベクターオーバーハングを含むＶ領域及びＪ領域のそれぞれのヌクレオチド配列に類似した特異的フォワードプライマー及びリバースプライマー（Tiller et al., 2008）を用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を、以前に記載されるように（von Boehmer et al., 2016）ＳＬＩＣアセンブリによってヒト抗体発現ベクター（ＩｇＧ１、カッパ、又はラムダ鎖）にクローニングした。抗体を、ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションによりＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において産生した。５日～７日後、プロテインＧインキュベーション及びその後の０．１Ｍグリシン（ｐＨ＝３．０）を用いたクロマトグラフィーカラムからの溶出後の上清から抗体を精製した。バッファー中和、ＰＢＳへのバッファー交換、及びフィルター滅菌後、抗体を４℃で保存した。
単一細胞由来抗体のクローニングのため、単一細胞ＰＣＲの第１のＰＣＲ産物を鋳型として用い、Ｑ５ハイフィデリティポリメラーゼ、並びにその後の配列及びライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）のための発現ベクターオーバーハングを含むＶ領域及びＪ領域のそれぞれのヌクレオチド配列に類似した特異的フォワードプライマー及びリバースプライマー（Tiller et al., 2008）を用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を、以前に記載されるように（von Boehmer et al., 2016）ＳＬＩＣアセンブリによってヒト抗体発現ベクター（ＩｇＧ１、カッパ、又はラムダ鎖）にクローニングした。抗体を、ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションによりＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞において産生した。５日～７日後、プロテインＧインキュベーション及びその後の０．１Ｍグリシン（ｐＨ＝３．０）を用いたクロマトグラフィーカラムからの溶出後の上清から抗体を精製した。バッファー中和、ＰＢＳへのバッファー交換、及びフィルター滅菌後、抗体を４℃で保存した。
【0098】
疑似ウイルスの産生
疑似ウイルスを、以前に記載されるように（Doria-Rose et al., 2017、Sarzotti-Kelsoe et al., 2014、Hraber et al., 2017、Seaman et al., 2010）、ｐＳＧ３ΔＥｎｖプラスミドとの同時トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生した。ＹＵ２疑似ウイルス変異パネルを生成するため、部位特異的変異誘発法を用いてＹＵ２エンベロープ遺伝子をコードするプラスミドに点変異を導入した。
疑似ウイルスを、以前に記載されるように（Doria-Rose et al., 2017、Sarzotti-Kelsoe et al., 2014、Hraber et al., 2017、Seaman et al., 2010）、ｐＳＧ３ΔＥｎｖプラスミドとの同時トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生した。ＹＵ２疑似ウイルス変異パネルを生成するため、部位特異的変異誘発法を用いてＹＵ２エンベロープ遺伝子をコードするプラスミドに点変異を導入した。
【0099】
ＴＺＭ－ｂｌ細胞中和アッセイ
中和アッセイを、以前に記載されるように実施した（Sarzotti-Kelsoe et al., 2014、Seaman et al., 2010）。マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）偽型ウイルスを用いて、非特異的活性を判定した。抗体を二連で試験した。疑似ウイルス変異体（mutants）及びグローバルリファレンスパネルのアッセイでは、ルシフェリン／溶解バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ中、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ補酵素Ａ、１７ｍＭ ＩＧＥＰＡＬ（いずれもSigma-Aldrich）、及び１ｍＭ Ｄ－ルシフェリン（GoldBio））を添加した後に生物発光を判定した。
中和アッセイを、以前に記載されるように実施した（Sarzotti-Kelsoe et al., 2014、Seaman et al., 2010）。マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）偽型ウイルスを用いて、非特異的活性を判定した。抗体を二連で試験した。疑似ウイルス変異体（mutants）及びグローバルリファレンスパネルのアッセイでは、ルシフェリン／溶解バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ中、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍＭ補酵素Ａ、１７ｍＭ ＩＧＥＰＡＬ（いずれもSigma-Aldrich）、及び１ｍＭ Ｄ－ルシフェリン（GoldBio））を添加した後に生物発光を判定した。
【0100】
ＨＩＶ－１感染ヒト化マウス
ヒト化マウスを、以前の記載（非特許文献５）に変更を加えて作製した。ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１ｍｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）マウスを、生後５日以内に、致死量以下の照射から３時間～６時間後にヒトＣＤ３４＋造血臍帯血及び／又は胎盤組織幹細胞の肝内注射によりヒト化した。ヒト化マウスに、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清から採取した複製可能な組換えＨＩＶ－１ＹＵ２（ＮＬ４－３骨格中のＹＵ２ ｅｎｖ（Zhang et al., 2002））又はＨＩＶ－１ＢＡＬ（ＮＬ４－３骨格中のＢＡＬ ｅｎｖ）を用いて腹腔内チャレンジにより感染させた。
ヒト化マウスを、以前の記載（非特許文献５）に変更を加えて作製した。ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１ｍｏｍＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＲＧ）マウスを、生後５日以内に、致死量以下の照射から３時間～６時間後にヒトＣＤ３４＋造血臍帯血及び／又は胎盤組織幹細胞の肝内注射によりヒト化した。ヒト化マウスに、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清から採取した複製可能な組換えＨＩＶ－１ＹＵ２（ＮＬ４－３骨格中のＹＵ２ ｅｎｖ（Zhang et al., 2002））又はＨＩＶ－１ＢＡＬ（ＮＬ４－３骨格中のＢＡＬ ｅｎｖ）を用いて腹腔内チャレンジにより感染させた。
【0101】
ＨＩＶ－１ウイルス量の測定
血漿ＲＮＡは、オンカラムＤＮａｓｅ Ｉ消化工程を含むＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを用いてＥＤＴＡ血漿試料から抽出した。ウイルス量を、以前に記載される（Horwitz et al., 2013）ｐｏｌ特異的プライマーを用いる定量的リアルタイムＰＣＲにより決定した。ｑＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃｔ １－Ｓｔｅｐ－Ｋｉｔを用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩで実施した。ウイルス量を、ｑＰＣＲ実行毎に既知のコピー数の試料から導出された標準曲線を含むことによって定量した。ｑＰＣＲの精度の限界を３８４コピー／ｍｌと決定した。ウイルス量３８４コピー／ｍｌ未満に対するＬｏｇ１０の変化を、コピー数が３８３コピー／ｍｌであると仮定して計算した。
血漿ＲＮＡは、オンカラムＤＮａｓｅ Ｉ消化工程を含むＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔを用いてＥＤＴＡ血漿試料から抽出した。ウイルス量を、以前に記載される（Horwitz et al., 2013）ｐｏｌ特異的プライマーを用いる定量的リアルタイムＰＣＲにより決定した。ｑＰＣＲを、Ｔａｑｍａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－Ｃｔ １－Ｓｔｅｐ－Ｋｉｔを用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩで実施した。ウイルス量を、ｑＰＣＲ実行毎に既知のコピー数の試料から導出された標準曲線を含むことによって定量した。ｑＰＣＲの精度の限界を３８４コピー／ｍｌと決定した。ウイルス量３８４コピー／ｍｌ未満に対するＬｏｇ１０の変化を、コピー数が３８３コピー／ｍｌであると仮定して計算した。
【0102】
ＨＩＶ－１感染ヒト化マウスの抗体治療
ＰＢＳで希釈した抗体を皮下注射した。１ｍｇの負荷用量に続いて、０．５ｍｇの用量を３日～４日毎に注射した。
ＰＢＳで希釈した抗体を皮下注射した。１ｍｇの負荷用量に続いて、０．５ｍｇの用量を３日～４日毎に注射した。
【0103】
ヒト化マウスにおけるＨＩＶ－１の単一ゲノムシーケンシング
ＨＩＶ－１感染ヒト化マウスの抗体治療中のＨＩＶ－１ ｅｎｖ遺伝子における潜在的なエスケープ変異の発生を判定するため、抽出された血漿ＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ及びアンチセンスプライマーＹＢ３８３を用いてｃＤＮＡを生成し（Horwitz et al., 2017）、続いてＲＮａｓｅ Ｈインキュベーションを行った。続いて、Ｔａｑポリメラーゼと、第１のＰＣＲ用のプライマーＹＢ３８３及びＹＢ５０と、第２のＰＣＲ用のプライマーＹＢ４９及びＹＢ５２とを用いて限界希釈ネステッドＰＣＲを行って、単一ゲノムｅｎｖ ｃＤＮＡを増幅した（Schoofs et al., 2019）。ＰＣＲ効率３０％未満の希釈率での陽性ＰＣＲ反応は、以前の記載（Kryazhimskiy et al., 2014、Schoofs et al., 2016）に変更を加えた、イルミナ色素シーケンシングを用いる配列であった。タグ付け、限定サイクルＰＣＲによるインデックス及びアダプターの付加、並びに精製の後、ＰＣＲ産物をイルミナＭｉＳｅｑ上で配列決定し、リードをアセンブルした（Gaebler et al., 2019）。１０未満の曖昧さ（リード全体で７５％未満ヌクレオチド同一性）を有する完全長ｅｎｖ配列を解析した。
ＨＩＶ－１感染ヒト化マウスの抗体治療中のＨＩＶ－１ ｅｎｖ遺伝子における潜在的なエスケープ変異の発生を判定するため、抽出された血漿ＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ及びアンチセンスプライマーＹＢ３８３を用いてｃＤＮＡを生成し（Horwitz et al., 2017）、続いてＲＮａｓｅ Ｈインキュベーションを行った。続いて、Ｔａｑポリメラーゼと、第１のＰＣＲ用のプライマーＹＢ３８３及びＹＢ５０と、第２のＰＣＲ用のプライマーＹＢ４９及びＹＢ５２とを用いて限界希釈ネステッドＰＣＲを行って、単一ゲノムｅｎｖ ｃＤＮＡを増幅した（Schoofs et al., 2019）。ＰＣＲ効率３０％未満の希釈率での陽性ＰＣＲ反応は、以前の記載（Kryazhimskiy et al., 2014、Schoofs et al., 2016）に変更を加えた、イルミナ色素シーケンシングを用いる配列であった。タグ付け、限定サイクルＰＣＲによるインデックス及びアダプターの付加、並びに精製の後、ＰＣＲ産物をイルミナＭｉＳｅｑ上で配列決定し、リードをアセンブルした（Gaebler et al., 2019）。１０未満の曖昧さ（リード全体で７５％未満ヌクレオチド同一性）を有する完全長ｅｎｖ配列を解析した。
【0104】
ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ結合の競合を判定するためのＥＬＩＳＡ
抗体１－１８、抗体１－５５及び抗体２－１２を、製造業者の指示に従ってＥＺ Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ Ｂｉｏｔｉｎ及びＬａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）を用いてビオチン化し、続いてＰＢＳにバッファー交換した。高結合ＥＬＩＳＡプレートに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を２μｇ／ｍｌで４℃にて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳ中３％ＢＳＡで３７℃にて６０分間ブロッキングし、ＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４－Ｈｉｓ（Sanders et al., 2013）と共にＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで３７℃にて６０分間インキュベートした。競合する抗体を、ＰＢＳ中３２μｇ／ｍｌの濃度で開始して１：３希釈で室温にて６０分間インキュベートした。目的のビオチン化抗体をＰＢＳ中３％ＢＳＡで０．５μｇ／ｍｌに希釈し、室温で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で１：５０００に希釈したペルオキシダーゼ－ストレプトアビジンを加えた。４１５ｎｍにおける吸光度を、ＡＢＴＳ溶液の添加後にマイクロプレートリーダーで決定した。プレートを各工程の間にＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。
抗体１－１８、抗体１－５５及び抗体２－１２を、製造業者の指示に従ってＥＺ Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ Ｂｉｏｔｉｎ及びＬａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）を用いてビオチン化し、続いてＰＢＳにバッファー交換した。高結合ＥＬＩＳＡプレートに抗６×Ｈｉｓタグ抗体を２μｇ／ｍｌで４℃にて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳ中３％ＢＳＡで３７℃にて６０分間ブロッキングし、ＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４－Ｈｉｓ（Sanders et al., 2013）と共にＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで３７℃にて６０分間インキュベートした。競合する抗体を、ＰＢＳ中３２μｇ／ｍｌの濃度で開始して１：３希釈で室温にて６０分間インキュベートした。目的のビオチン化抗体をＰＢＳ中３％ＢＳＡで０．５μｇ／ｍｌに希釈し、室温で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で１：５０００に希釈したペルオキシダーゼ－ストレプトアビジンを加えた。４１５ｎｍにおける吸光度を、ＡＢＴＳ溶液の添加後にマイクロプレートリーダーで決定した。プレートを各工程の間にＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。
【0105】
ｉｎ ｖｉｖｏ抗体薬物動態分析
ＮＲＧマウスに、２００μｌ ＰＢＳ中の０．５ｍｇの抗体を静脈内注射した。ヒトＩｇＧの総血清中濃度を、以前の記載（非特許文献５）に軽微な変更を加えてＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に言えば、高結合ＥＬＩＳＡプレートに室温で一晩２．５μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＩｇＧをコーティングした。続いて、ウェルをブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、１μＭ ＥＤＴＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロッキングした。ヒトＩｇＧ１カッパ標準物質の段階希釈（二連）及びＰＢＳ中の血清試料を室温で９０分間インキュベートし、続いてブロッキングバッファー中で１：１０００に希釈したＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを室温で９０分間インキュベートした。ＡＢＴＳの添加に続いて、４１５ｎｍにおける光学濃度を、マイクロプレートリーダーを用いて決定した。プレートを各工程の間にＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。抗体注射前に得られた血清試料を、ヒト血清ＩｇＧが存在しないベースラインを確認するために使用した。
ＮＲＧマウスに、２００μｌ ＰＢＳ中の０．５ｍｇの抗体を静脈内注射した。ヒトＩｇＧの総血清中濃度を、以前の記載（非特許文献５）に軽微な変更を加えてＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に言えば、高結合ＥＬＩＳＡプレートに室温で一晩２．５μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトＩｇＧをコーティングした。続いて、ウェルをブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ、１μＭ ＥＤＴＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロッキングした。ヒトＩｇＧ１カッパ標準物質の段階希釈（二連）及びＰＢＳ中の血清試料を室温で９０分間インキュベートし、続いてブロッキングバッファー中で１：１０００に希釈したＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを室温で９０分間インキュベートした。ＡＢＴＳの添加に続いて、４１５ｎｍにおける光学濃度を、マイクロプレートリーダーを用いて決定した。プレートを各工程の間にＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。抗体注射前に得られた血清試料を、ヒト血清ＩｇＧが存在しないベースラインを確認するために使用した。
【0106】
Ｂ）本発明の抗体の具体例
実施例Ｉ ＨＩＶ－１感染エリートニュートラライザーからの広範で強力なＶＨ１－４６由来ＨＩＶ－１中和抗体の単離
ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質に反応するヒトＢ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＨＩＶ－１に対して並外れた血清中和活性を有すると以前に同定されたＨＩＶ－１感染個体から単離した。
実施例Ｉ ＨＩＶ－１感染エリートニュートラライザーからの広範で強力なＶＨ１－４６由来ＨＩＶ－１中和抗体の単離
ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質に反応するヒトＢ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＨＩＶ－１に対して並外れた血清中和活性を有すると以前に同定されたＨＩＶ－１感染個体から単離した。
【0107】
この目的のため、単離されたＢ細胞を蛍光色素標識可溶性ＨＩＶ－１ Ｅｎｖタンパク質（ＹＵ２ｇｐ１４０又はＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４）と共にインキュベートし、単一細胞の選別を行った（Ehrhardt et al., 2019）。このアプローチにより、ＰＣＲによる個々のＨＩＶ－１ Ｅｎｖ反応性Ｂ細胞からの重抗体及び軽抗体遺伝子セグメントのその後の増幅が可能となった。これにより、個々のＢ細胞によってコードされる対応する抗体の組換え産生用の発現ベクターへのＰＣＲ産物のクローニングが可能になり、抗体の機能試験が可能になった。
【0108】
ＨＩＶ－１－Ｅｎｖ反応性Ｂ細胞の配列の解析から、拡大ＶＨ１－４６由来Ｂ細胞クローンを同定することができた。これらのクローンの１つは、重鎖ＣＤＲ１領域への６つのアミノ酸（ａａ）挿入を特徴とし、このクローンは重鎖（配列番号４７）及び軽鎖（配列番号４８）のコンセンサス配列によって表される。３つの追加のＢ細胞クローンが同定され、それらは互いに、また以前に記載されるクローンと類似性を共有する。これらの追加のクローンは、６ａａのＣＤＲＨ１挿入を伴わないが、それらの軽鎖のフレームワーク領域１において２ａａの欠失を示す。これらのクローンは、重鎖（配列番号４９）及び軽鎖（配列番号５０）に対する別々のコンセンサス配列によって表される。
【0109】
同定されたＶＨ１－４６由来Ｂ細胞クローンを代表する合計２３個の抗体を、モノクローナル抗体として産生した。それらの全体的な中和効力及び幅を決定するため、これらの抗体を、「グローバルパネル」と称される１２のＨＩＶ－１疑似ウイルス株のリファレンスパネルに対するＴＺＭ－ｂｌ細胞中和アッセイにおいてそれらの中和活性について試験した（図１）。この疑似ウイルスのパネルは、以前は、世界的なＨＩＶ－１流行の多様性を表し、中和抗体の活性の標準化された評定を可能にするように設計されていた。
【0110】
注目すべきことに、単離されたＶＨ１－４６由来抗体の全ては、１２株のＨＩＶ－１基準株のうち少なくとも１１株に対して高い中和活性を示した（図１）。配列番号４７及び配列番号４８で表されるＶＨ１－４６由来抗体は、試験された全ての株に対して活性を実証した。それらの中和幅に加えて、試験されたＶＨ１－４６由来抗体はまた、高い中和効力を実証した。中和効力は、通常５０％阻害濃度（ＩＣ５０）によって表される。「グローバルパネル」に対して試験したところ、試験した全てのＶＨ１－４６由来抗体は、中和ウイルス株に対して０．２μｇ／ｍｌ以下の幾何平均ＩＣ５０で高活性であった（図１）。
【0111】
実施例ＩＩ 本発明の抗体の標的としてのＣＤ４結合部位の同定
本発明による抗体のエピトープを決定するため、特異性がわかっている抗体の存在下でのＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４のＨＩＶ－１エンベロープ三量体への代表的な抗体１－１８、抗体１－５５、及び抗体２－１２の結合を調べた。ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、抗体Ｎ６、及び抗体ＶＲＣ０１との干渉を検出した（図２）。このことは、本発明の抗体がＣＤ４結合部位及びＣＤ４結合部位に結合する他の抗体のエピトープと重複するエピトープを標的とすることを示す。
本発明による抗体のエピトープを決定するため、特異性がわかっている抗体の存在下でのＢＧ５０５ＳＯＳＩＰ．６６４のＨＩＶ－１エンベロープ三量体への代表的な抗体１－１８、抗体１－５５、及び抗体２－１２の結合を調べた。ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、抗体Ｎ６、及び抗体ＶＲＣ０１との干渉を検出した（図２）。このことは、本発明の抗体がＣＤ４結合部位及びＣＤ４結合部位に結合する他の抗体のエピトープと重複するエピトープを標的とすることを示す。
【0112】
実施例ＩＩＩ 高い効力及び幅の抗体１－１８、抗体１－５５、及び抗体２－１２
単離されたＶＨ１－４６由来ＨＩＶ－１抗体の中和効力及び幅を確認するため、代表的な抗体１－１８、抗体１－５５及び抗体２－１２を、Schoofs et al., 2019で以前に試験したように、１１９個のＨＩＶ－１疑似ウイルスの拡張パネルに対して個別に試験した。この疑似ウイルスのパネルは、Seaman et al., 2010に詳細に記載されている疑似ウイルスのパネルの開発を表す。これは、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ変異体の遺伝的及び全体的な多様性の表現を提供する。これは、伝染／創始者（transmitted/founder）ウイルス及び中和が困難なウイルスから単離された変異体を含む、異なるクレード又はサブタイプのＨＩＶ－１変異体を含む。
単離されたＶＨ１－４６由来ＨＩＶ－１抗体の中和効力及び幅を確認するため、代表的な抗体１－１８、抗体１－５５及び抗体２－１２を、Schoofs et al., 2019で以前に試験したように、１１９個のＨＩＶ－１疑似ウイルスの拡張パネルに対して個別に試験した。この疑似ウイルスのパネルは、Seaman et al., 2010に詳細に記載されている疑似ウイルスのパネルの開発を表す。これは、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ変異体の遺伝的及び全体的な多様性の表現を提供する。これは、伝染／創始者（transmitted/founder）ウイルス及び中和が困難なウイルスから単離された変異体を含む、異なるクレード又はサブタイプのＨＩＶ－１変異体を含む。
【0113】
注目すべきことに、試験された本発明のＶＨ１－４６由来抗体は、１１９－疑似ウイルスマルチクレードパネルで試験した場合、高い中和効力及び幅を実証した（図３）。特に、最大２０μｇ／ｍｌの抗体濃度で試験した場合、抗体１－１８は試験した疑似ウイルスの９６．６％を中和し、中和された疑似ウイルスに対して０．０４８μｇ／ｍｌの幾何平均ＩＣ５０を示した（図３）。この幅及び効力は、ＣＤ４結合部位も標的とし、ＶＨ１－２遺伝子セグメントに由来し、臨床試験の段階が進んだ他のＨＩＶ－１中和抗体（３ＢＮＣ１１７及びＶＲＣ０１）に見られるよりも高い（図３）。さらに、１１９マルチクレードパネルにおける抗体１－１８の効力は、臨床試験における別のＶＨ１－２由来ＣＤ４結合部位抗体であるＮ６の効力よりも高かった（図３）。
【0114】
さらに、合計６２個の同一のＨＩＶ－１疑似ウイルスに対する結果が利用可能であった（Yoon et al., 2015）ＣＤ４結合部位を標的とする他のＶＨ１－４６由来ＨＩＶ－１中和抗体と比較すると、本発明の代表的なＶＨ１－４６由来抗体は、より高い効力及び幅を実証した（図４）。
【0115】
実施例ＩＶ 他のＣＤ４結合部位抗体によって十分に中和されていない疑似ウイルスに対する中和活性
ＣＤ４結合部位抗体は高レベルの中和幅を達成することができるが（すなわち、多数の異なるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ変異体に対して活性を有する）、抗体耐性ＨＩＶ－１変異体が存在する。したがって、かかるＨＩＶ－１変異体に対して高活性である新規ＣＤ４結合部位抗体を同定することが重要である。
ＣＤ４結合部位抗体は高レベルの中和幅を達成することができるが（すなわち、多数の異なるＨＩＶ－１ Ｅｎｖ変異体に対して活性を有する）、抗体耐性ＨＩＶ－１変異体が存在する。したがって、かかるＨＩＶ－１変異体に対して高活性である新規ＣＤ４結合部位抗体を同定することが重要である。
【0116】
臨床試験の段階が進んだＣＤ４結合部位抗体（Ｎ６、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１）と比較して、本発明の抗体は、はるかに高い効力で（すなわち、それらはより低いＩＣ５０を有する）幾つかの株を中和する（代表メンバーである１－１８、１－５５及び２－１２を図５に示す）。
【0117】
例えば、ウイルス株８９－Ｆ１＿２＿２５のＨＩＶ－１ Ｅｎｖタンパク質を含む疑似ウイルスは、ＴＺＭ－ｂｌ疑似ウイルス中和アッセイにおいて最大２０μｇ／ｍｌの濃度で試験した場合、臨床試験においてＣＤ４結合部位抗体（Ｎ６、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１）によって中和されない（すなわち、これらの抗体はこの特定のウイルスに対してＩＣ５０に達しない）（図５）。さらに、中和抗体データベースＣＡＴＮＡＰ（Yoon et al., 2015）内に収載されている３０個のＣＤ４結合部位ＩｇＧ抗体のうち、８９．７％（２６／２９）の抗体はこのウイルスを全く中和しない（すなわち、ＩＣ５０＞２０μｇ／ｍｌ）。このウイルスを中和する３つの抗体のうち、ＮＣ３７は１７．７μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有し、ＶＲＣ１６は３．１２μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有し、ＶＨ１－６９遺伝子由来抗体ＶＲＣ１３は０．１９μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有する。対照的に、本発明の代表的な抗体（１－１８、１－５５、及び２－１２）は、本発明の他の全ての抗体（全ての抗体にわたって０．００６μｇ／ｍｌ～０．０２５μｇ／ｍｌのＩＣ５０、図１２を参照されたい）と同様に、非常に高い効力（それぞれ０．００７μｇ／ｍｌ、０．０１４μｇ／ｍｌ、及び０．００６μｇ／ｍｌのＩＣ５０）でＨＩＶ－１疑似ウイルス８９－Ｆ１＿２＿２５を中和する。一般的なＣＤ４結合部位抗体に対して耐性が高い別のウイルス株は、６５４５．ｖ４．ｃ１株である。この株は、中和抗体データベースＣＡＴＮＡＰ（Yoon et al., 2015）内に収載された４３個のＣＤ４結合部位ＩｇＧ抗体の７５％に対して耐性である。最も重要なのは、段階が進んだＣＤ４結合部位抗体のいずれも、この株を強力に（ＩＣ５０＜１０μ／ｍｌ）中和することはできないことである（Ｎ６のＩＣ５０：１６．２３；３ＢＮＣ１１７：２０超；ＶＲＣ０１：２０超；ＶＲＣ０７－５２３－ＬＳ：２０超）。対照的に、本発明の全ての抗体は、０．００８μｇ／ｍｌ～９．３７μｇ／ｍｌのＩＣ５０でこの株を強力に中和する（図１２）。
【0118】
したがって、本発明の抗体は、ＣＤ４結合部位抗体によるウイルス８９－Ｆ１＿２＿２５及び６５４５．ｖ４．ｃ１の不十分な中和に対する解決策を提供する。８９－Ｆ１＿２＿２５に対して試験した場合、本発明の抗体は、前に記載したこのウイルスに対する最良のＣＤ４結合部位抗体よりも約１ ｌｏｇ１０強力である。
【0119】
実施例Ｖ 他のＣＤ４結合部位抗体に対する耐性を付与するＣＤ４結合部位変異を有する疑似ウイルスに対する中和活性
ＣＤ４結合部位エスケープ変異の発生によって媒介される抗体耐性は、ＨＩＶ－１感染の抗体療法の治療失敗をもたらす（非特許文献５）。したがって、これらのエスケープ変異の影響を受けないＣＤ４結合部位抗体を同定することは、これらの変異を保有するＨＩＶ－１変異体に対する治療選択肢を提供するために重要である。
ＣＤ４結合部位エスケープ変異の発生によって媒介される抗体耐性は、ＨＩＶ－１感染の抗体療法の治療失敗をもたらす（非特許文献５）。したがって、これらのエスケープ変異の影響を受けないＣＤ４結合部位抗体を同定することは、これらの変異を保有するＨＩＶ－１変異体に対する治療選択肢を提供するために重要である。
【0120】
ＣＤ４結合部位抗体を、特異的ＣＤ４結合部位変異を有するＹＵ２疑似ウイルス変異体のパネルに対してＴＺＭ－ｂｌ細胞中和アッセイにおいて試験した（図６）。ＣＤ４結合部位における変異は、以前に知られていたＣＤ４結合部位抗体の活性に影響を与えた（図６）。例えば、野生型ＹＵ２疑似ウイルスに対するＣＤ４結合部位抗体ＶＲＣ０１及び８ＡＮＣ１３１のＩＣ５０は、それぞれ０．１０７μｇ／ｍｌ及び０．２５６μｇ／ｍｌであったが、試験されたループＤ変異の変異体のいずれに対しても中和は観察されなかった（すなわち、試験された抗体濃度２．５μｇ／ｍｌまでＩＣ５０はなかった）。別のＣＤ４結合部位抗体であるＮ６は、Ｎ２７９Ｋの変異の影響を受けた（図６）。対照的に、試験された本発明の代表的な抗体（１－１８、１－５５、及び２－１２）は、試験されたＹＵ２疑似ウイルス変異体に対して高い中和活性を維持した（図６）。
【0121】
したがって、本発明の抗体は、ＣＤ４結合部位に変異を有するウイルス変異体に対するＣＤ４結合部位抗体の耐性に対する解決策を提供する。
【0122】
実施例ＶＩ ＨＩＶ－１感染のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける抗体単独療法によるウイルス抑制の維持
ＨＩＶ－１ＹＵ２に感染したヒト化マウス（Zhang et al., 2002）は、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＶ－１抗体を中和する抗ウイルス活性を研究するためのモデルを提供する。ヒト化マウスを作製するため、免疫不全ＮＲＧマウスに、生後最初の日以内に照射し、ヒト造血ＣＤ３４＋幹細胞を肝内注射する。これは、複製可能なＨＩＶ－１で感染させることができるヒトリンパ球の発生をもたらす。これらのマウスは、安定したレベルのウイルス血症（すなわち、血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡコピー数）を維持することができ、ヒトで観察されるものと類似したＨＩＶ－１配列多様化率を示すことができる（非特許文献５）。このマウスモデルは、ｉｎ ｖｉｖｏで単独療法として与えられた幾つかのＣＤ４結合部位抗体の抗ウイルス活性を決定するために以前から用いられてきた（１７９ＮＣ７５：Freund et al., 2015；３ＢＮＣ１１７：Horwitz et al, 2013；４５－４６Ｇ５４Ｗ：非特許文献５；ＮＣ３７：Freund et al., 2017）。これらの研究の全てにおいて、ウイルス量に対する一過性の影響のみが観察され、ウイルスリバウンド（すなわち、ウイルス血症のベースラインレベルへの復帰）が急速に発生した。さらに、このウイルスリバウンドは、抗体標的部位における変異の発生と関連していた。したがって、単独療法として与えられた場合にウイルス抑制を維持できる新規なＣＤ４結合部位抗体が必要とされている。
ＨＩＶ－１ＹＵ２に感染したヒト化マウス（Zhang et al., 2002）は、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＶ－１抗体を中和する抗ウイルス活性を研究するためのモデルを提供する。ヒト化マウスを作製するため、免疫不全ＮＲＧマウスに、生後最初の日以内に照射し、ヒト造血ＣＤ３４＋幹細胞を肝内注射する。これは、複製可能なＨＩＶ－１で感染させることができるヒトリンパ球の発生をもたらす。これらのマウスは、安定したレベルのウイルス血症（すなわち、血漿中のＨＩＶ－１ ＲＮＡコピー数）を維持することができ、ヒトで観察されるものと類似したＨＩＶ－１配列多様化率を示すことができる（非特許文献５）。このマウスモデルは、ｉｎ ｖｉｖｏで単独療法として与えられた幾つかのＣＤ４結合部位抗体の抗ウイルス活性を決定するために以前から用いられてきた（１７９ＮＣ７５：Freund et al., 2015；３ＢＮＣ１１７：Horwitz et al, 2013；４５－４６Ｇ５４Ｗ：非特許文献５；ＮＣ３７：Freund et al., 2017）。これらの研究の全てにおいて、ウイルス量に対する一過性の影響のみが観察され、ウイルスリバウンド（すなわち、ウイルス血症のベースラインレベルへの復帰）が急速に発生した。さらに、このウイルスリバウンドは、抗体標的部位における変異の発生と関連していた。したがって、単独療法として与えられた場合にウイルス抑制を維持できる新規なＣＤ４結合部位抗体が必要とされている。
【0123】
ＨＩＶ－１ＹＵ２感染ヒト化マウスをＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又はそれらの組合せで治療した場合（皮下に（ｓ．ｃ．）抗体あたり１ｍｇの負荷用量を与え、続いて３日～４日毎に０．５ｍｇをｓ．ｃ．で与えた）、ＨＩＶ－１ ＲＮＡコピー数の一過性の減少のみが観察され、ウイルス血症は２週間～３週間以内にほとんどのマウスでベースラインレベルに戻った（図７）。対照的に、マウスを本発明の代表的な抗体１－１８を用いて同じ投薬スキームに従って治療すると、治療開始時のウイルスコピー数と比較してウイルス抑制が、８週間の治療期間にわたって全ての治療マウスにおいて観察された（図７）。マウスの８０％以上において、ＨＩＶ－１ ＲＮＡ血漿コピー数は、使用されたアッセイの精度の限界（３８４コピー／ｍｌ）を下回るレベルまで減少した。
【0124】
したがって、本発明の抗体は、単独療法として与えられた場合であってもＨＩＶ－１ＹＵ２感染ヒト化マウスにおいてウイルス抑制を効果的に維持することができる。
【0125】
さらに、上記のようにＨＩＶ－１ＢＡＬ感染ヒト化マウスをＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７又はＶＲＣ０１で治療した場合、ＨＩＶ－１ ＲＮＡコピー数の軽微で一過性の減少のみが観察され、２週間以内にほとんどのマウスにおいてウイルス血症がベースラインレベルに戻った（図１３）。対照的に、マウスを本発明の代表的な抗体１－１８を用いて同じ投薬スキームに従って治療した場合、治療開始時のウイルスコピー数と比較してウイルス抑制が、６週間の治療期間にわたって全ての治療されたマウスにおいて観察された（図１３）。
【0126】
したがって、本発明の抗体は、単独療法として与えられた場合でもＨＩＶ－１ＢＡＬ感染ヒト化マウスにおいてウイルス抑制を効果的に維持することができる。
【0127】
実施例ＶＩＩ 抗体単独療法中のＣＤ４結合部位におけるウイルス変異の発生の防止
ＣＤ４結合部位抗体を用いた抗体単独療法中のウイルスリバウンドは、典型的には、抗体標的部位におけるウイルス配列変異の発生と関連している（１７９ＮＣ７５：Freund et al., 2015；３ＢＮＣ１１７：Horwitz et al, 2013；４５－４６Ｇ５４Ｗ：非特許文献５；ＮＣ３７：Freund et al., 2017）。したがって、ＣＤ４結合部位抗体における変異の発生を防止することができる新規なＣＤ４結合部位抗体は、かかる変異によって媒介される抗体耐性を防止するために必要とされる。
ＣＤ４結合部位抗体を用いた抗体単独療法中のウイルスリバウンドは、典型的には、抗体標的部位におけるウイルス配列変異の発生と関連している（１７９ＮＣ７５：Freund et al., 2015；３ＢＮＣ１１７：Horwitz et al, 2013；４５－４６Ｇ５４Ｗ：非特許文献５；ＮＣ３７：Freund et al., 2017）。したがって、ＣＤ４結合部位抗体における変異の発生を防止することができる新規なＣＤ４結合部位抗体は、かかる変異によって媒介される抗体耐性を防止するために必要とされる。
【0128】
ＣＤ４結合部位（ループＤ、ベータ２３鎖／Ｖ５ループ）における変異は、実施例ＩＶに記載されるように、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又は３ＢＮＣ１１７＋ＶＲＣ０１療法を受けた全ての試験マウスにおいて観察された（図８）。対照的に、これらの部位の変異は、本発明の抗体１－１８による抗体療法の４週間後に検出可能なウイルス血症が残存していた実施例ＩＶに記載の実験のマウスにおける１０個の配列のうちの１つにおいてのみ見出された（図７）。注目すべきことに、この変異（Ｇ４５９Ｄ）をＹＵ２疑似ウイルスパネルで試験したところ、１－１８の活性は影響を受けなかった（図６）。
【0129】
実施例ＶＩＩＩ ＶＲＣ０１クラス療法からのウイルスリバウンド後のＨＩＶ－１感染のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける抗体単独療法によるウイルス抑制の維持
ＨＩＶ－１感染ヒト化マウスにおけるＣＤ４結合部位抗体を用いた抗体単独療法の失敗は、ウイルスリバウンドをもたらし、投与された抗体に対するウイルス耐性と関連している（Freund et al., 2015、Horwitz et al, 2013、非特許文献５、Freund et al., 2017）。したがって、ＣＤ４結合部位抗体療法の以前の失敗後にｉｎ ｖｉｖｏ治療の選択肢を提供する新規なＣＤ４結合部位抗体が必要とされている。
ＨＩＶ－１感染ヒト化マウスにおけるＣＤ４結合部位抗体を用いた抗体単独療法の失敗は、ウイルスリバウンドをもたらし、投与された抗体に対するウイルス耐性と関連している（Freund et al., 2015、Horwitz et al, 2013、非特許文献５、Freund et al., 2017）。したがって、ＣＤ４結合部位抗体療法の以前の失敗後にｉｎ ｖｉｖｏ治療の選択肢を提供する新規なＣＤ４結合部位抗体が必要とされている。
【0130】
３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、又はそれらの組合せ（実施例ＶＩに記載される）による治療の４週間の間に観察されたウイルスリバウンドに続いて、本発明の抗体１－１８を治療レジメンに追加すると（ｓ．ｃ．で１ｍｇの負荷用量を与え、続いて３日～４日毎にｓ．ｃ．で０．５ｍｇを与えた）、治療されたマウスの９５％（１８／１９）においてウイルス血症の持続的な減少をもたらした（図９）。したがって、本発明の抗体は、他のＣＤ４結合部位抗体による予備治療の失敗後であってもＨＩＶ－１のｉｎ ｖｉｖｏ制御のための選択肢を提供する。
【0131】
実施例ＩＸ 他のＣＤ４結合部位抗体と比較して好ましいｉｎ ｖｉｖｏ半減期
ＨＩＶ－１中和抗体は、中和効力及び幅だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期においても変化し得る。例えば、Ｖ３ループ標的化抗体１０－１０７４は、ＨＩＶ－１感染個体に与えられた場合、ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７よりも長い半減期を有する（Mendoza et al., 2018）。したがって、ＣＤ４結合部位を標的とする新規抗体は、現在入手可能なＣＤ４結合部位抗体と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで好ましい薬物動態学的特性を有するはずである。
ＨＩＶ－１中和抗体は、中和効力及び幅だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期においても変化し得る。例えば、Ｖ３ループ標的化抗体１０－１０７４は、ＨＩＶ－１感染個体に与えられた場合、ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７よりも長い半減期を有する（Mendoza et al., 2018）。したがって、ＣＤ４結合部位を標的とする新規抗体は、現在入手可能なＣＤ４結合部位抗体と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで好ましい薬物動態学的特性を有するはずである。
【0132】
それらの薬物動態学的特性を決定するため、本発明の代表的な抗体（１－１８、１－５５、及び２－１２）をＮＲＧマウスに個々に静脈内注射した。ＣＤ４結合部位抗体３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ０１、及び４５－４６Ｇ５４Ｗと比較して、試験された本発明の抗体は、総ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによって決定されたそれらの血清ＩｇＧ濃度のより遅い低下を示し、１０－１０７４のものとより類似していた（図１０）。したがって、試験された本発明の抗体は、ＨＩＶ－１を標的とする他のＣＤ４結合部位抗体と比較して好ましい薬物動態学的特性を実証する。
【0133】
実施例欄の参照文献：
Anderson, J.P., et al. (2000). Testing the hypothesis of a recombinant origin of human immunodeficiency virus type 1 subtype E. J. Virol. 74, 10752-10765.
deCamp, A., et al. (2014). Global Panel of HIV-1 Env Reference Strains for Standardized Assessments of Vaccine-Elicited Neutralizing Antibodies. J, Virol. 88, 2489-2507.
Doria-Rose, N.A., et al. (2017). Mapping Polyclonal HIV-1 Antibody Responses via Next-Generation Neutralization Fingerprinting. PLoS Pathog 13, e1006148.
Dosenovic, P., et al. (2019). Anti-idiotypic antibodies elicit anti-HIV-1- specific B cell responses. J. Exp. Med.
Ehrhardt et al., (2019) Polyclonal and convergent antibody response to Ebola virus vaccine rVSV-ZEBOV. Nat Med. 25,1589-1600.
Freund, N.T., et al. (2015). A New Glycan-Dependent CD4-Binding Site Neutralizing Antibody Exerts Pressure on HIV-1 In Vivo. PLoS Pathog. 11, :e1005238.
Freund, N.T., et al. (2017). Coexistence of potent HIV-1 broadly neutralizing antibodies and antibody-sensitive viruses in a viremic controller. Sci Transl Med. 9, eaal2144
Gaebler, C., et al. (2019). Combination of quadruplex qPCR and next- generation sequencing for qualitative and quantitative analysis of the HIV-1 latent reservoir. J. Exp. Med.
Horwitz, J.A., et al. (2013). HIV-1 suppression and durable control by combining single broadly neutralizing antibodies and antiretroviral drugs in humanized mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 16538-16543.
Horwitz, J.A., et al. (2017). Non-neutralizing Antibodies Alter the Course of HIV-1 Infection In Vivo. Cell 170, 637-648 e610.
Hraber, P., et al. (2017). Panels of HIV-1 Subtype C Env Reference Strains for Standardized Neutralization Assessments. J. Virol. 91.
Klein, F., et al. (2012). HIV therapy by a combination of broadly neutralizing antibodies in humanized mice. Nature 492, 118-122.
Kreer, C., et al. (2019). openPrimeR for multiplex amplification of highly diverse templates. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/847574
Kryazhimskiy, S., et al. (2014). Microbial evolution. Global epistasis makes adaptation predictable despite sequence-level stochasticity. Science 344, 1519-1522.
Mendoza, P., et al. (2018). Combination therapy with anti-HIV-1 antibodies maintains viral suppression. Nature 561, 479-484.
Pietzsch, J., et al. (2010). Human anti-HIV-neutralizing antibodies frequently target a conserved epitope essential for viral fitness. J. Exp. Med. 207, 1995- 2002.
Sanders, R.W., et al. (2013). A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog. 9, e1003618.
Sarzotti-Kelsoe, M., et al. (2014). Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J. Immunol. Methods 409, 131-146.
Schoofs, T., et al. (2016). HIV-1 therapy with monoclonal antibody 3BNC117 elicits host immune responses against HIV-1. Science 352, 997-1001.
Seaman, M.S., et al. (2010). Tiered categorization of a diverse panel of HIV-1 Env pseudoviruses for assessment of neutralizing antibodies. J. Virol. 84, 1439-1452.
Sliepen, K., et al. (2015). Engineering and Characterization of a Fluorescent Native-Like HIV- 1 Envelope Glycoprotein Trimer. Biomolecules 5, 2919-2934.
Tiller, T., et al. (2008). Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT- PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods 329, 112-124.
von Boehmer, L., et al. (2016). Sequencing and cloning of antigen-specific antibodies from mouse memory B cells. Nat. Protoc. 11, 1908-1923.
Yang, X., et al.. (2000). Characterization of stable, soluble trimers containing complete ectodomains of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins. J. Virol. 74, 5716-5725.
Ye, J., et al. (2013). IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Res. 41, W34-40.
Yoon, H., et al. (2015). CATNAP: a tool to compile, analyze and tally neutralizing antibody panels. Nucleic Acids Res. 43, W213-219.
Zhang, Y.J., et al. (2002). Envelope-dependent, cyclophilin-independent effects of glycosaminoglycans on human immunodeficiency virus type 1 attachment and infection. J. Virol. 76, 6332-6343.
Anderson, J.P., et al. (2000). Testing the hypothesis of a recombinant origin of human immunodeficiency virus type 1 subtype E. J. Virol. 74, 10752-10765.
deCamp, A., et al. (2014). Global Panel of HIV-1 Env Reference Strains for Standardized Assessments of Vaccine-Elicited Neutralizing Antibodies. J, Virol. 88, 2489-2507.
Doria-Rose, N.A., et al. (2017). Mapping Polyclonal HIV-1 Antibody Responses via Next-Generation Neutralization Fingerprinting. PLoS Pathog 13, e1006148.
Dosenovic, P., et al. (2019). Anti-idiotypic antibodies elicit anti-HIV-1- specific B cell responses. J. Exp. Med.
Ehrhardt et al., (2019) Polyclonal and convergent antibody response to Ebola virus vaccine rVSV-ZEBOV. Nat Med. 25,1589-1600.
Freund, N.T., et al. (2015). A New Glycan-Dependent CD4-Binding Site Neutralizing Antibody Exerts Pressure on HIV-1 In Vivo. PLoS Pathog. 11, :e1005238.
Freund, N.T., et al. (2017). Coexistence of potent HIV-1 broadly neutralizing antibodies and antibody-sensitive viruses in a viremic controller. Sci Transl Med. 9, eaal2144
Gaebler, C., et al. (2019). Combination of quadruplex qPCR and next- generation sequencing for qualitative and quantitative analysis of the HIV-1 latent reservoir. J. Exp. Med.
Horwitz, J.A., et al. (2013). HIV-1 suppression and durable control by combining single broadly neutralizing antibodies and antiretroviral drugs in humanized mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 16538-16543.
Horwitz, J.A., et al. (2017). Non-neutralizing Antibodies Alter the Course of HIV-1 Infection In Vivo. Cell 170, 637-648 e610.
Hraber, P., et al. (2017). Panels of HIV-1 Subtype C Env Reference Strains for Standardized Neutralization Assessments. J. Virol. 91.
Klein, F., et al. (2012). HIV therapy by a combination of broadly neutralizing antibodies in humanized mice. Nature 492, 118-122.
Kreer, C., et al. (2019). openPrimeR for multiplex amplification of highly diverse templates. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/847574
Kryazhimskiy, S., et al. (2014). Microbial evolution. Global epistasis makes adaptation predictable despite sequence-level stochasticity. Science 344, 1519-1522.
Mendoza, P., et al. (2018). Combination therapy with anti-HIV-1 antibodies maintains viral suppression. Nature 561, 479-484.
Pietzsch, J., et al. (2010). Human anti-HIV-neutralizing antibodies frequently target a conserved epitope essential for viral fitness. J. Exp. Med. 207, 1995- 2002.
Sanders, R.W., et al. (2013). A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathog. 9, e1003618.
Sarzotti-Kelsoe, M., et al. (2014). Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J. Immunol. Methods 409, 131-146.
Schoofs, T., et al. (2016). HIV-1 therapy with monoclonal antibody 3BNC117 elicits host immune responses against HIV-1. Science 352, 997-1001.
Seaman, M.S., et al. (2010). Tiered categorization of a diverse panel of HIV-1 Env pseudoviruses for assessment of neutralizing antibodies. J. Virol. 84, 1439-1452.
Sliepen, K., et al. (2015). Engineering and Characterization of a Fluorescent Native-Like HIV- 1 Envelope Glycoprotein Trimer. Biomolecules 5, 2919-2934.
Tiller, T., et al. (2008). Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT- PCR and expression vector cloning. J. Immunol. Methods 329, 112-124.
von Boehmer, L., et al. (2016). Sequencing and cloning of antigen-specific antibodies from mouse memory B cells. Nat. Protoc. 11, 1908-1923.
Yang, X., et al.. (2000). Characterization of stable, soluble trimers containing complete ectodomains of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins. J. Virol. 74, 5716-5725.
Ye, J., et al. (2013). IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Res. 41, W34-40.
Yoon, H., et al. (2015). CATNAP: a tool to compile, analyze and tally neutralizing antibody panels. Nucleic Acids Res. 43, W213-219.
Zhang, Y.J., et al. (2002). Envelope-dependent, cyclophilin-independent effects of glycosaminoglycans on human immunodeficiency virus type 1 attachment and infection. J. Virol. 76, 6332-6343.
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】