特表 2023-503755 骨親和性骨補填品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-01

(54)【発明の名称】骨親和性骨補填品

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/12 20060101AFI20230125BHJP

   A61L 27/02 20060101ALI20230125BHJP

【ＦＩ】

A61L27/12

A61L27/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021572842

(86)(22)【出願日】2020-08-14

(85)【翻訳文提出日】2021-12-27

(86)【国際出願番号】 EP2020072884

(87)【国際公開番号】W WO2021032628

(87)【国際公開日】2021-02-25

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

(71)【出願人】

【識別番号】509223977

【氏名又は名称】ウニベルジテート ハイデルベルク

(71)【出願人】

【識別番号】521535490

【氏名又は名称】アンドレアス ハース

【氏名又は名称原語表記】ＡＮＤＲＥＡＳ ＨＡＡＳ

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｈｒｂａｃｈｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １４０， ６９１２６ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス ハース

(72)【発明者】

【氏名】クリスチャン カスペルク

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャエル ブルヒャルト

【テーマコード（参考）】

4C081

【Ｆターム（参考）】

4C081AB04

4C081CF03

4C081CF21

4C081CF22

4C081EA02

4C081EA11

4C081EA12

(57)【要約】

本発明は、ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石および／またはアパタイトを実質的に有する出発材料から骨親和性骨補填材を製造する方法に関する。前記出発物質は、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源と一緒にオートクレーブに導入され、実質的にポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石を有する出発物質を使用する場合には、リン酸塩源が導入される。さらに、Ｈ_２Ｏを溶剤の一部として前記オートクレーブに添加し、前記オートクレーブ内のｐＨ値を７を超える範囲にする。その後、密閉および充填された前記オートクレーブを少なくとも１時間加熱し、次いで冷却する。このようにして発達された骨親和性骨補填材は、続いて、前記リン、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源の残留物から洗浄される。さらに、本発明は、実質的にアパタイトからなり、ストロンチウムイオンが結晶格子に組み込まれている骨親和性骨補填材に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石および／またはアパタイト、特にヒドロキシアパタイト、を実質的に有する出発材料から骨親和性骨補填材を製造する方法であって、
前記出発材料が、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源と共にオートクレーブに導入され、
ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石を実質的に有する出発材料を使用する場合には、リン酸塩源が導入され、
Ｈ_２Ｏが、溶媒の一部として前記オートクレーブに添加され、
前記オートクレーブ内のｐＨ値を７を超える範囲とし、
密閉および充填された前記オートクレーブが少なくとも１時間加熱され、次いで冷却され、
続いて、前記オートクレーブの内容物が、前記リン、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源の残留物から洗浄される、方法。

【請求項2】

密閉および充填された前記オートクレーブが、少なくとも３０℃に加熱される、好ましくは１９０℃を超えて加熱されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記オートクレーブの内容物が、フィルター装置を用いて機械的に洗浄されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記オートクレーブの内容物が、好ましくは８未満のｐＨに達するまでＨ_２Ｏで洗われることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記オートクレーブ内のｐＨ値を７を超える範囲とするために、アルカリ性溶液、特にアンモニア溶液、が使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源が、前記出発材料に対して過剰に導入されることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

リン源として、リン酸二水素アンモニウムまたはリン酸二アンモニウムが添加されることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

全混合物中にカルシウムおよびリン原子は、１０：５（原子比）を超えない比で存在することを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイトおよび／または方解石は、燃焼、未燃焼および／または化学的に処理された生体骨格の形態で使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記アパタイトとして、熱分解または化学的浸軟後の脊椎動物の骨が使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

密閉および充填された前記オートクレーブが、少なくとも１２時間加熱されることを特徴とする、請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源として、洗い流しやすい、または水溶性が低い材料が使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項１１のいずれ
か一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源が、容器内で固形物として前記オートクレーブに添加され、
前記容器は固形物を保持したまま、前記溶媒と前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源のイオンの交換が可能であることを特徴とする、請求項１ないし請求項１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記オートクレーブに導入する前または後に、前記出発物質および／または前記オートクレーブの前記内容物を、熱分解処理および／または化学洗浄方法に供することを特徴とする、請求項１ないし請求項１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

実質的にアパタイトを有し、ストロンチウムイオンが前記アパタイトの結晶格子に組み込まれる、特に請求項１ないし請求項１４のいずれか一項に記載の方法に基づく、骨親和性骨補填材。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石（例えば石灰被覆藻類の骨格）、および／またはアパタイト（例えばヒドロキシアパタイトとして存在、例えば脊椎動物の骨または合成的な製造から得られる）を実質的に有する出発材料から骨親和性骨補填材（osteotropen Knochenersatz-materials）を製造する方法に関する。さらに、本発明は、本発明に基づく方法によって製造された骨親和性骨材料に関する。

【0002】

本発明の枠内において、記載された出発物質は、出発物質に類似した構造を有する、将来的に合成的に製造される物質を含むものと理解することもできる。

【背景技術】

【0003】

骨インプラントとして、または骨増強の枠内で骨補填材として用いられる、自己、同種、異種の自然骨、サンゴ、藻類からなる現在使用される多くの骨補填材、または、完全に合成的手段で製造されたヒドロキシアパタイト骨補填材は、骨伝導特性のみを有する。これは、これまで使用されてきたリン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイト骨補填材は、インプラント表面上で骨組織の直接成長に適した生体適合性表面を有することを意味するものであるが、インプラントの直接の骨環境において、新しい骨の形成を直接的に刺激するものではない。ヒドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム材料は一般に、骨伝導の性質のみを有する。したがって、それらは骨成長を可能にするが、それ自身は骨芽細胞またはその前駆細胞のような骨形成を誘導する細胞の増殖や分化を刺激するものではない。本発明の意味において、直接成長とは特に、インプラント表面と骨組織との間に「中間組織層」がない成長と理解することができる。

【0004】

骨誘導効果を展開するために、骨補填材または有機物質（例えばコラーゲンまたは有機分子）は、従来さらなるタンパク質、ペプチドまたは他の分子が付加されてきた。この例としては、成長因子（例えば、種々のＢＭＰ、ＩＧＦ１／２、ＦＧＦなど）、または血清産物である。これに伴う問題は、これらの物質が多くの場合インプラント部位から迅速に洗い流されるかまたは分解されるので、これらの物質の、インプラント中またはインプラント設置位置に残存する期間がしばしば不明瞭なことである。その結果、骨誘導特性は一方では短時間しか存在しないため実際には添加することができず、他方では、一般に意図されていない、生体全体における全身作用が起こり得る。

【0005】

このような骨補填材の製造方法の例は、欧州特許第２３０５７０号明細書および欧州特許第０２８０７４号明細書から得ることができる。この場合、石灰被覆海藻に由来するヒドロキシアパタイトからなる骨補填材は、天然に存在する炭酸カルシウム骨格を適切な方法で変換することによって得られる。

【0006】

しかしながら、すでに述べたように、このような骨補填手段は単に骨伝導性であり、骨誘導性ではない。

【0007】

さらには、Ｐ．Ｍｅｌｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃs １１７（１），８６－９０，（２００９）（整形外科に使用するためのガリウム含有ヒドロキシアパタイト）、中国特許出願公開第１０１９２８１３６号明細書（フッ化ヒドロキシアパタイトおよび人工骨の製造のためのその使用）、および欧州特許出願公開第２２２８０８０号明細書（歯や骨の欠損を充填するためのアパタイト構造を有するガリウム添加リンカルシウム化合物）から得ることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】欧州特許第２３０５７０号明細書

【特許文献2】欧州特許第０２８０７４号明細書

【特許文献3】中国特許出願公開第１０１９２８１３６号明細書

【特許文献4】欧州特許出願公開第２２２８０８０号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｐ．Ｍｅｌｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃs １１７（１），８６－９０，（２００９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、本発明は、長時間活性で局所的な骨親和特性を有する骨補填材を製造するための方法および骨補填材自体を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明によれば、この目的は、請求項１の特徴を有する骨親和性骨補填材を製造する方法によって、および請求項１５の特徴を有する骨親和性骨補填材によって達成される。

【0012】

本発明の有利な実施形態は、従属請求項に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】比較試験の結果（「１．試験」におけるアルカリホスファターゼの結果）を示した図。

【図2】比較試験の結果（「１．試験」における細胞分裂／細胞タンパク質の結果）を示した図。

【図3】比較試験の結果（「２．試験」におけるアルカリホスファターゼの結果）を示した図。

【図4】比較試験の結果（「２．試験」における細胞分裂／細胞タンパク質の結果）を示した図。

【図5】比較試験の結果（「３．試験」におけるアルカリホスファターゼの結果）を示した図。

【図6】比較試験の結果（「３．試験」における細胞分裂／細胞タンパク質の結果）を示した図。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明によれば、実質的にポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石および／またはアパタイト（例えば、ヒドロキシアパタイトとして存在する）を有する出発物質が使用されることが規定される。出発物質は、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源と一緒にオートクレーブに導入され、ここで、実質的にポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石を有する出発物質を使用する場合、リン酸塩源が導入される。アパタイトから実質的になる出発物質の場合にはリン酸塩源を導入することもできるが、これは必ずしも必要ではない。さらに、水を溶媒の一部としてオートクレーブに添加する。その後、室温および常圧で、オートクレーブ中のｐＨ値を７を超える範囲にする。次に、密閉され充填されたオートクレーブを少なくとも１時間加熱し、続いて冷却する。最後に、オートクレーブの内容物は、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源の残留物から洗浄される。リン源を用いた場合も同様である。

【0015】

本発明によれば、とりわけ、アパタイト構造に組み込まれたストロンチウム、フッ素および／またはガリウムイオンが、骨誘導性またはむしろ骨親和性または抗吸収特性を有することが実現された。

【0016】

本発明の本質的な態様は、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウムイオンをアパタイト中に、特にヒドロキシアパタイト構造中に適切な方法で単に付着させるのではなく、組み込むための、本発明に係る方法である。単なる表面的な付着の場合、付着した物質の分離が起こり得る。しかしながら、本発明に係る方法によって、骨親和性、すなわち骨誘導性、抗吸収特性を有するおよび／または骨組織の形成を促進する上述のイオンが、容易に分離できないような方法で、発達中のアパタイト構造に結合されることが可能になる。

【0017】

炭酸カルシウム材料（すなわち特にポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石）からなる出発材料をアパタイトまたはむしろヒドロキシアパタイト構造にうまく転化するためには、リン酸塩源の存在が必須であり、この場合、別リン酸塩を使用することができる。出発材料としてアパタイト材料（例えば脊椎動物の骨）を使用する場合、リン酸塩源の存在は必ずしも必要ではないが、有利であることが判明している。特に、これは、工法中に既存の構造が弱められることを防止する。

【0018】

本発明の基礎をなす試験によれば、密閉され充填されたオートクレーブが少なくとも３０℃、好ましくは１９０℃を超える温度に加熱される場合に、特に良好な結果を達成することができる。これは、オーブンまたは加熱モジュール内で行うことができる。オートクレーブと一体化された加熱モジュールを設けることも可能である。これらの温度で、出発物質のドープアパタイトへの十分に良好な転化が達成され、さらに、すでに述べたように、前述のイオンが取り込まれ、アパタイトの結晶格子に結合される。オーブンの温度が低ければ低いほど、オートクレーブ中で起こる反応は遅くなる。

【0019】

本発明に係る方法の意味する範囲内で、加熱キャビネットなどをオーブンとも呼ぶことができる。これに関連して重要なことは、器具が３０～数百度の間の所望の温度を、より長い時間にわたって一定のレベルに維持することができるという事実である。

【0020】

ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源ならびにリン源の残留物からオートクレーブの内容物を洗浄するために、異なる方法が可能である。供給源の選択に応じて、オートクレーブの内容物は、好ましくはフィルター装置を用いて機械的に洗浄することができる。これは、できるだけ大きいか、または溶解性が低い供給源が使用される場合である。

【0021】

本発明に係る骨補填材の良好な組織寛容性のために、特に機械的性質の洗浄に続いて、８未満のｐＨ値に達するまでオートクレーブの内容物を洗浄することが有利である。

【0022】

オートクレーブを閉じる前のｐＨ値を７を超える範囲にするために、アルカリ性溶液（特にアンモニア溶液）を使用することができる。例えば、リン酸二水素アンモニウム溶液または別のリン酸塩化合物もこの目的のために使用することができる。

【0023】

好ましくはストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源の導入は出発材料に対して過剰に行われる。有利には、これはリン酸塩源にも当てはまる。言い換えれば、アパタイトの結晶格子への良好な組み込みが高い確実性で達成され得るように、それぞれの材料についての大量のリザーバが利用可能にされる。最終的な、前述の洗浄工程では、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源ならびにリン源のそれぞれの未使用の出発物質が、製造された材料から除去される。これは、材料が清浄化されることを意味する。

【0024】

リン源として例えばリン酸二水素アンモニウムまたはリン酸二アンモニウムを使用する場合、これは同時に所望のｐＨ値とするために使用することができる。また、水に溶解したリン酸二水素アンモニウムの使用は添加が特に容易であり、最適な反応環境がオートクレーブ中で達成され得ることが判明した。

【0025】

好ましくは、オートクレーブ中の全混合物中に、カルシウムおよびリン原子が１０：５を超えない比で存在する。そのような比率は、それぞれの骨親和性、すなわち骨誘導性物質および／または抗吸収性効果を有するものが特に良好な結果をもたらす比率で存在するので、得られる骨補填材の骨親和特性にとって有利であることが証明されている。

【0026】

アパタイトとしては、例えば脊椎動物または哺乳動物の骨を使用することができる。哺乳動物の骨（例えば、ウシやブタ動物に由来する）は、すでにかなりの割合のヒドロキシアパタイトおよび炭酸アパタイトとしてアパタイトを提供している。他方、出発物質として、アラゴナイトまたは方解石、石灰質藻類骨格または燃焼、未燃焼および／または化学的に処理された形態の他の炭酸カルシウム物質を使用することもできる。脊椎動物または哺乳動物の骨を使用する場合、これらは、有利には従来の熱分解または化学的浸軟、すなわち免疫原性物質の除去に供される。

【0027】

基本的には、密閉され充填されたオートクレーブをより長く加熱することが好ましい。本発明によれば、１～４日後に、発達中の骨親和性骨補填材の非常に良好な結果が達成され、その結果、非常に長い期間加熱することが、必ずしも有意に良好な結果をもたらさないことが見出された。

【0028】

既に述べたように、オートクレーブ中で加熱し、続いて冷却した後、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源を、得られた骨親和性骨補填材から、後者を洗浄することによって分離する。ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源として、洗い流しやすい、または水溶性が低い材料が使用されることが好ましい。洗い流すのが容易な材料の使用は、製造された骨親和性骨補填材を洗うとき、容易に洗い流すことができ、したがって、骨親和性骨補填材をより容易に洗浄することができるという利点を有する。あるいは、溶解性の低い（特に、結晶性の粗い）材料は、オートクレーブ中での転化プロセス中に、十分な量のストロンチウム、フッ素および／またはガリウムイオンが利用可能である一方で、後続の洗浄が特に容易な方法で、例えば機械的にも行われ得るという利点を有する。

【0029】

得られた骨親和性骨補填材の特に容易な洗浄は、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源が容器内で固体物としてオートクレーブに添加される場合に達成され得る。容器は、固形物を保持したまま、オートクレーブ中に存在する溶媒とストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源のイオンを交換できるように設計されている。これは、明らかに、得られる骨親和性骨補填材の最終洗浄を容易にする。

【0030】

オートクレーブへの導入の前または後に、出発物質および／またはオートクレーブの内容物を、方法の完了後に、熱分解処理および／または化学洗浄に供することが好ましい。熱分解処理および化学洗浄方法は、それぞれ、潜在的に存在するタンパク質または他の有機異物が製造された骨親和性骨補填材から除去され、その結果、人体への骨補填材の移植時に生じる相互作用が最小限に抑えられるか、または排除されるという利点を有する。

【0031】

さらに、本発明は、前述の本発明に係る方法に従って製造された骨親和性骨補填材に関する。アパタイトを実質的に有する骨親和性骨補填材は、その結晶格子中にストロンチウム、フッ素および／またはガリウムイオンを含有する。これらは、動物またはヒトの体内
への移植後に、骨親和特性を展開する。アパタイト（より具体的にはヒドロキシアパタイト）に加えて、少量のリン酸カルシウム、方解石、アラゴナイトおよびリン酸三カルシウムも存在し得る。本発明によれば、イオンの媒体濃度は、ストロンチウムイオンの場合、約０．５１～０．６０重量％の媒体濃度を超えるものであり、確立された骨補填材よりわかる。確立された骨補填材としては、脊椎動物または哺乳動物の骨（ＢｉｏＯｓｓ（登録商標）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ（登録商標））、Ｔｈｅ Ｇｒａｆｔ（登録商標）（Ｒｅｇｅｄｅｎｔ（登録商標））、ＭｉｎｅｒＯｓｓ（登録商標）ＸＰ（Ｃａｍｌｏｇ（登録商標）／ＢｉｏＨｏｒｉｚｏｎｓ（登録商標））：約０．５１～０．５６重量％）、石灰被覆藻（Ａｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）（Ｓｙｍｂｉｏｓ（登録商標））：約０．６０重量％）、または脊椎動物や哺乳動物の天然骨（ウシ動物：約０．５８重量％）であるが、特に不純物、追加の給餌、または異なる地質学的－地域条件にもよる。本発明によれば、この場合ストロンチウムイオンの媒体濃度は、少なくとも０．６５重量％、好ましくは０．７５重量％、特には１．０重量％を超えるものである。

【0032】

本発明に係る方法に従って製造された本発明に係る骨親和性骨補填材は例えば、寸法的に安定なブロックの製造に使用することができ、このブロックには、歯のシリンダーインプラントまたは他の金属体も一体化されている。これらのブロックは、将来的に歯インプラント支持体として顎骨に移植することができ、３～６ヶ月の治癒段階に続いて、さらなる二次的介入を必要とせずに直接使用することができる。得られる骨親和性骨補填材が粉末状の形態を有するという事実のために、それから製造される寸法的に安定なブロックは、寸法を測って作製され得、それによって、歯の欠落のような骨欠損に適合され得る。

【0033】

本発明によるストロンチウム、フッ素および／またはガリウムイオンの埋め込みの結果として、骨補填材は、主に実質的にインプラント部位でのみ生じる局所的な骨親和性効果をさらに加えないことを展開する。したがって、本発明に係る骨補填材は、全身作用を有さない。

【0034】

別の利点は、本発明に係る骨補填材が移植部位に留まる全期間にわたってその骨誘導性または骨親和性効果を展開し、自己の骨組織によって置換されるとすぐにそのようにすることを止めることにある。このようにして、骨欠損のより迅速かつより持続可能な骨治癒が達成される。

【0035】

本発明に係る骨親和性骨補填材の別の適用例は、骨粗鬆症、外傷性および／または悪性関連の脊椎骨折または脊椎圧迫骨折の場合の安定化であり得る。別の可能性は、本発明により製造された材料を３－Ｄ印刷法のための出発材料として使用することである。

【0036】

本発明は、図面を参照して、概略的な例示的な実施形態によって、以下により詳細に説明される。

【0037】

製造方法
以下に、本発明に係る方法に従って実施される、本発明に係る骨親和性骨補填材の例示的な製造を記載する。

【0038】

この目的のために、１５０ｍｌの容量を有するテフロン容器が使用される。これには以下の物質が充填されている：

【0039】

【表1】

【0040】

出発物質として、石灰被覆藻類の骨格が、アラゴナイトの例として使用される。ＣＯ_２を含む出発物質を使用する場合、これらを燃焼させると通常好都合であり、その際、物質の外部組織を保持することが望ましい。しかしながら、記載されるように、本発明に係る方法はアパタイト材料（例えば、出発材料として脊椎動物骨からの）に適用することもでき、この場合、リン酸源の存在は一方では骨親和性イオンの導入に有利であるが、他方では、出発材料の構造を保持するためにも有利であることが証明されている。

【0041】

テフロン容器に添加する前に、藻類骨格を焼灼して、外来タンパク質、タンパク質などを除去する。さらに、リン酸二水素アンモニウム、フッ化ストロンチウム、フッ化カリウムおよび２５％アンモニア溶液を添加する。さらに、脱イオン水も添加される。

【0042】

添加された物質のそれぞれの重量またはそれぞれの体積は、表から知ることができる。

【0043】

この場合、リン酸二水素アンモニウムはリン酸塩源として役立つが、記載のように、他のリン酸塩源も可能である。フッ化ストロンチウムは、ストロンチウム源として、またフッ素源としても使用される。フッ化カリウムもフッ化物源として使用される。

【0044】

物質がテフロン容器に導入され、可能なガス形成が待たれた後、前記容器は閉じられる。その後、テフロン容器をオートクレーブ、例えば加圧分解容器に入れる。この容器は、好ましくはステンレス鋼で作られる。続いて、オートクレーブとなるように、カバーがしっかりとねじ込まれる。

【0045】

次いで、しっかりと閉じた対応する加圧分解容器を、１９０℃の温度を有する予熱キャビネットまたは加熱ブロックに入れる。

【0046】

加圧分解容器は５日間加熱キャビネット内に留まり、その間、１９０℃の温度が維持される。この時間が経過すると、加熱キャビネットはオフになる。次いで、加圧分解容器は、加熱キャビネットまたは加熱ブロック内でゆっくりと冷却される。これには約１日かかる。

【0047】

完全に冷却した後、加圧分解容器およびテフロン容器を開き、得られた骨親和性骨補填材を洗浄する。この目的のために、骨親和性骨補填材を水と一緒に濾紙上にかけて、洗浄する。いくつかの洗浄プロセス、例えばリンスプロセスは、８未満のｐＨ値に達するまで実施される。

【0048】

続いて、骨親和性骨補填材を再び加熱キャビネットに導入するが、４０℃でのみ乾燥させる。

【0049】

その後、骨親和性骨補填材は、さらなる使用に備える。例えば、その後、それを所望の形状に成形したり、滅菌したりできる。

【0050】

試験および結果
以下では、本発明に係る方法に従って製造された新しい骨親和性骨補填材の効果をより詳細に説明し、試験結果に基づいて骨誘導効果を証明する。結果が示すのは、本発明に係る骨補填材の使用によって、ヒト骨細胞における最も重要な骨形成マーカーであるアルカリホスファターゼが刺激されるという事実により、骨欠損における新しい骨の局所形成がさらに刺激されるであろうことである。

【0051】

初代ヒト骨芽細胞を用いたインビトロ試験を実施して、初代ヒト細胞と接触した場合の本発明に係る骨親和性骨補填材の直接的影響を試験した。これはまた、細胞死を伴うようなヒト骨細胞について、本発明に係る骨親和性骨補填材の有害な影響を見落とすことを回避するために実施された。

【0052】

したがって、インビボでの新しい骨補填材の臨床使用の前に、初代ヒト骨芽細胞は、ヒト骨細胞代謝に対する新しい骨補填材の効果を調べるための感受性試験系として適している。

【0053】

インビトロの細胞（かく初代ヒト骨細胞も）には、４つの考えられる反応態様がある：
・全く反応しない
・アポトーシス（細胞死）
・細胞分裂の増加／減少
・インビボでの新たな骨組織の蓄積およびミネラル化やヒドロキシアパタイトの形成に必要な分化細胞産物（例えば、骨細胞の場合にはアルカリホスファターゼ）の産生の増加／減少。

【0054】

試験を実施するために、初代ヒト骨細胞の共培養を使用した。効果を比較するために、市販の骨補填材と本発明に係る方法に従って製造された骨親和性骨補填材とを使用した。インビトロ実験において、以下の骨補填材を、初代ヒト骨細胞に対するそれらの効果に関して比較試験した：
１．ＢｉｏＯｓｓ（登録商標）（ウシ骨顆粒、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ社より市販）
２．Ａｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）（欧州特許第２３０５７０号明細書に基づく、Ｄｅｎｔｓｐｌｙ社より市販）
３．Ｎｅｗ Ａｌｇｉｐｏｒｅ１（＝ＮＡ１）本発明に係る骨親和性骨補填材
４．Ｎｅｗ Ａｌｇｉｐｏｒｅ２（＝ＮＡ２）本発明に係る骨親和性骨補填材
５．Ｎｅｗ ＢｉｏＯｓｓ１（本発明に係る方法に供されたＢｉｏＯｓｓ（登録商標））

【0055】

【表2】

【0056】

初代ヒト骨細胞の細胞機能に対する上記材料の影響を調べるために、以下の判定方法を選択した：
ａ．アルカリホスファターゼ
ｂ．細胞タンパク質

【0057】

１．試験
アルカリホスファターゼ
比較結果は、コントロール＋／－標準偏差％で表す。最初に、アルカリホスファターゼの活性を、種々の物質の存在下でのヒト骨細胞の培養後の培地上清中で試験した。コントロールとして、細胞なしで単独で使用された細胞培養増殖培地のアリコートを使用した。これは、細胞を材料に曝露する前の無血清リンスにもかかわらず、培養プレートのキャビティには常に培養培地中に含まれる血清の残留物が残っているからである。血清はまた、常に少量のアルカリホスファターゼを含有する。この最初の試験ではＮｅｗ ＢｉｏＯｓｓ１はまだ入手できなかった。

【0058】

【表3】

【0059】

これらの結果を図１にグラフで示す。

【0060】

解釈
ＢｉｏＯｓｓ（登録商標）は、ヒト骨細胞の骨形成やミネラルに不可欠である酵素アルカリホスファターゼの活性を低下させる傾向にあるが、本発明に係る骨補填材はヒト骨細胞によって分泌されるアルカリホスファターゼの活性の非常に有意な増加をもたらす。

【0061】

したがって、最も重要な骨芽細胞マーカータンパク質としての骨特異的アルカリホスファターゼは、従来の材料の存在下よりも、本発明に係る骨補填材によって、ヒト骨細胞モデルにおいて極めて有意に強い程度に刺激される。アルカリホスファターゼ活性におけるＮＡ１およびＮＡ２の有効性の違いは、ＮＡ１と比較するＮＡ２中のフッ化物およびストロンチウム含有量の増加によるものと考えられる。

【0062】

細胞培養上清中のアルカリホスファターゼの活性を測定する場合、骨芽細胞の微小環境へのアルカリホスファターゼの分泌によって、インビボでのミネラルまたは骨形成が細胞外で起こることを考慮に入れる必要がある。

【0063】

細胞分裂／細胞タンパク質
細胞分裂に対する骨補填材の効果の指標として、個々の「キャビティ」、すなわち、使用した多孔板の反応チャンバー中のタンパク質含量を分析した。このために、それぞれのキャビティのトリトン抽出物が、ＢＣＡ法に従ってタンパク質含量を決定するために使用された。個々のキャビティ中のタンパク質含量が高いほど、より多くのタンパク質材料に対応する細胞材料がキャビティ中に存在する必要がある。これは、骨細胞が常に同じサイズであり、タンパク質が骨細胞の細胞内に大量に貯蔵されていないため、細胞数が増加したことを意味するものである。したがって、細胞培養キャビティ、すなわち反応チャンバ内のタンパク質含量の減少は、細胞培養ベース上または骨補填材上に付着する細胞数の減少に等しい（アポトーシス細胞、すなわち死細胞は付着したままではなく、トリトンの添加前に洗い流される）。結果を再びコントロール＋／－標準偏差％で示す。

【0064】

【表4】

【0065】

これらの結果を図２にグラフで示す。

【0066】

解釈
細胞培養キャビティ中の細胞タンパク質含量に関して、試験した材料間に差異はない。したがって、アポトーシス変性細胞は付着したままではなく離脱し、アッセイ方法の前に洗い流されるので、材料は細胞分裂にも細胞死にも影響を与えない。

【0067】

全体像
これらの観察は、本発明に係る方法に従って得られた材料がヒト骨細胞のアルカリホスファターゼ活性に対して非常に肯定的な効果を有することを示す。この観察は、細胞分裂が影響を受ける（すなわち刺激や阻害される）ことなく、インビボで骨ミネラル形成を刺激する、本発明に係る骨補填材の非常に好ましい持続的効果と一致するものである。

【0068】

２．試験、本発明に係る方法による従来のＢｉｏＯｓｓ（登録商標）材料の活性化
これまで歯科医学や口腔外科で骨補填材として使用されてきたＢｉｏＯｓｓ（登録商標）材料は、ウシ動物の無機骨組織の天然ヒドロキシアパタイト材料からなるものである。本発明に係る方法によって、天然リン酸カルシウム結晶格子の場合でさえ、ヒドロキシアパタイト結晶中のカルシウムイオンと、ストロンチウムおよびフッ化物イオンとの部分的交換を制御された方法にて行うことができる。この場合、カルシウムおよびリン原子はオートクレーブ正味重量の全混合物中に１０：５を超えない比で存在すべきである。

【0069】

初代ヒト骨芽細胞を用いた以下の実験において、アルカリホスファターゼ活性に対する従来のＢｉｏＯｓｓ（登録商標）材料の効果を、本発明に係る方法によって活性化されたＢｉｏＯｓｓ１材料の効果と並行して試験する。

【0070】

同時に、並行試験バッチにおいて本発明に係る方法によって製造された全ての材料の有効性のランク付けを可能にするために、上記で既に試験された材料も同じ実験で使用された。この場合も、細胞培養上清中のアルカリホスファターゼ活性を、２４時間にわたる新しい材料との細胞のインキュベーション時間後に測定した。

【0071】

この実験は、最初の実験（１．試験）とは別個体の初代ヒト骨細胞を用いて再び実施した。

【0072】

アルカリホスファターゼ

【0073】

【表5】

【0074】

これらの結果を図３にグラフで示す。

【0075】

細胞分裂／細胞タンパク質

【0076】

【表6】

【0077】

これらの結果を図４にグラフで示す。

【0078】

解釈
従来のＢｉｏＯｓｓ（登録商標）材料は、骨補填材と接触がないヒト骨細胞を比較として、細胞培養上清中のアルカリ性ホスファターゼ活性に対して有意な刺激効果を有さないが、本発明に係る方法によって前処理されたＢｉｏＯｓｓ（登録商標）材料（ＢｉｏＯｓｓ１）は、ほぼ２倍のアルカリ性ホスファターゼ活性をもたらす。したがって、本発明に係る方法は市販のウシヒドロキシアパタイト材料を活性化するのにも適しており、これまで骨伝導性の性質しかなかったＢｉｏＯｓｓ（登録商標）材料に骨誘導特性を与える。

【0079】

さらに、この試験は、すでに上記で分析された第１の試験の結果を再現するものである：市販のＢｉｏＯｓｓ（登録商標）は、アルカリホスファターゼの実質的な刺激を示さない一方で、本発明に係る方法によって製造されるＢｉｏＯｓｓ１は、ほぼ２倍高いアルカリホスファターゼ活性の活性化を示す。同様に、本発明に係る方法によって製造された「藻類ヒドロキシアパタイト材料」ＮＡ１および特にＮＡ２は、アルカリホスファターゼ活性のさらに強力な刺激を示す。

【0080】

この比較実験では、試験した骨補填材が反応チャンバーの細胞上清中の細胞総タンパク質産生に有意に異なる影響を与えるという信頼できる指標は、再び得られなかった。（図４を参照のこと）。

【0081】

３．試験、結果の再現
別のバッチでは、全ての実験を、第３の健康なドナーの異なる初代ヒト骨芽細胞で、もう一度繰り返し、結果を首尾一貫した方法で再現する。したがって、この場合、本発明に係る方法に従ってこれまでに製造されたすべての材料の効果は、別の試験バッチにおいて再び並行して再現され、市販の骨補填材の効果と比較される。

【0082】

アルカリホスファターゼ

【0083】

【表7】

【0084】

これらの結果を図５にグラフで示す。

【0085】

細胞分裂／細胞タンパク質

【0086】

【表8】

【0087】

これらの結果を図６にグラフで示す。

【0088】

解釈
この実験においても、本発明に係る方法によって「活性化された」骨補填材ＮＡ２およびＢｉｏＯｓｓ１は、市販の骨補填材ＢｉｏＯｓｓ（登録商標）およびＡｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）よりも、アルカリホスファターゼ活性の刺激に関して有意に強い効果を有することが証明されている。初期プロセスで処理されたＮＡ１材料は、市販のＡｌｇｉｐｏｒｅ（登録商標）骨補填材に匹敵する効果を示す。

【0089】

その結果、本発明に係る製造方法によって「活性化された」あらゆる骨補填材は、骨芽細胞標準骨形成マーカーアルカリホスファターゼの刺激に関して、以前の製品よりも優れていることが証明されている。

【0090】

したがって、本発明に係る製造方法は、炭酸カルシウムもしくはポルトランダイト、酸化カルシウムおよび方解石の混合物からアパタイト材料への転化プロセス中、および既存のヒドロキシアパタイト材料から直接、ストロンチウムイオンなどの活性化イオンを結晶格子に組み込んで活性骨補填材を製造するのに適している。本発明の枠内で、材料は特に、骨誘導性、骨親和性または抗吸収性も有する活性化されたものと考えることができる。

【0091】

したがって、本発明に係る方法および本発明に係る方法を使用して製造された骨親和性骨補填材によって、持続的かつ局所的な骨誘導性または骨親和特性を有し、骨組織内のインプラント材料として非常に適した材料が提供される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【手続補正書】

【提出日】2021-07-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石および／またはアパタイト、特にヒドロキシアパタイト、を実質的に有する出発材料から骨親和性骨補填材を製造する方法であって、
燃焼、未燃焼および／または化学的に処理された生体骨格の形態で、前記ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイトおよび／または方解石は使用され、
および／または、前記アパタイトとして、熱分解または化学的浸軟後の脊椎動物の骨が使用され、
前記出発材料が、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源と共にオートクレーブに導入され、
ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイト、方解石を実質的に有する出発材料を使用する場合には、リン酸塩源が導入され、
Ｈ_２Ｏが、溶媒の一部として前記オートクレーブに添加され、
前記オートクレーブ内のｐＨ値を７を超える範囲とし、
密閉および充填された前記オートクレーブが少なくとも１時間加熱され、次いで冷却され、
続いて、前記オートクレーブの内容物が、前記リン、ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源の残留物から洗浄される、方法。

【請求項2】

密閉および充填された前記オートクレーブが、少なくとも３０℃に加熱される、好ましくは１９０℃を超えて加熱されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記オートクレーブの内容物が、フィルター装置を用いて機械的に洗浄されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記オートクレーブの内容物が、好ましくは８未満のｐＨに達するまでＨ_２Ｏで洗われ
ることを特徴とする、請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記オートクレーブ内のｐＨ値を７を超える範囲とするために、アルカリ性溶液、特にアンモニア溶液、が使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源が、前記出発材料に対して過剰に導入されることを特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

リン源として、リン酸二水素アンモニウムまたはリン酸二アンモニウムが添加されることを特徴とする、請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

全混合物中にカルシウムおよびリン原子は、１０：５（原子比）を超えない比で存在することを特徴とする、請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

密閉および充填された前記オートクレーブが、少なくとも１２時間加熱されることを特徴とする、請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源として、洗い流しやすい、または水溶性が低い材料が使用されることを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源が、容器内で固形物として前記オートクレーブに添加され、
前記容器は固形物を保持したまま、前記溶媒と前記ストロンチウム、フッ素および／またはガリウム源のイオンの交換が可能であることを特徴とする、請求項１ないし請求項１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記オートクレーブに導入する前または後に、前記出発物質および／または前記オートクレーブの前記内容物を、熱分解処理および／または化学洗浄方法に供することを特徴とする、請求項１ないし請求項１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

実質的にアパタイトを有し、
燃焼、未燃焼および／または化学的に処理された生体骨格の形態の、ポルトランダイト、酸化カルシウム、アラゴナイトおよび／または方解石から製造され、
および／または、熱分解または化学的浸軟後の脊椎動物の骨から製造され、
ストロンチウム、フッ素および／またはガリウムイオンが前記アパタイトの結晶格子に組み込まれる、特に請求項１ないし請求項１２のいずれか一項に記載の方法に基づく、骨親和性骨補填材。

【国際調査報告】