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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230125BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230125BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230125BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230125BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230125BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230125BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230125BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230125BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230125BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C12N15/63 Z
C07K16/28
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P1/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022527913
(86)(22)【出願日】2020-11-13
(85)【翻訳文提出日】2022-06-30
(86)【国際出願番号】 EP2020082072
(87)【国際公開番号】W WO2021094545
(87)【国際公開日】2021-05-20
(31)【優先権主張番号】19209100.7
(32)【優先日】2019-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19209104.9
(32)【優先日】2019-11-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516243504
【氏名又は名称】メモ テラポイティクス アクチェンゲゼルシャフト
(71)【出願人】
【識別番号】518375937
【氏名又は名称】ウニベルシテート バーゼル
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】レウブリ ハインツ
(72)【発明者】
【氏名】シュミット ジモーネ
(72)【発明者】
【氏名】エッスリンゲル クリシュトフ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA21
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA42
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片が開示される。これらの抗Siglec-9抗体分子または結合断片は、癌、急性または慢性B型肝炎の治療に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、
配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、
配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【請求項2】
以下を含む、請求項1に記載の抗体分子またはその結合断片：(i) 配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、
配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、
配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）；
または
(ii) 配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、
配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、
配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【請求項3】
以下を含む、請求項1に記載の抗体分子またはその結合断片:配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、
配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列からなる重鎖可変領域（VH）；および
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、
配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、および
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【請求項4】
以下を含む、請求項1に記載の抗体分子またはその結合断片：(i) 配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、
配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、
配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、および
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）；
または
(ii) 配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、
配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、
配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、および
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【請求項5】
以下を含む、請求項1～4のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片：(ii) 配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）；
または
(ii) 配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【請求項6】
以下の性質の1つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8または9）を含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の抗体分子またはその結合断片：(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1 nM、または 0.05 nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、 ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）;
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、 Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、 染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、 Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）。
【請求項7】
請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片と、ヒトSiglec-9への結合を競合する抗体分子またはその結合断片。
【請求項8】
請求項1～6のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片と、ヒトSiglec-9の同一エピトープへの結合を競合する、請求項7に記載の抗体分子またはその結合断片。
【請求項9】
請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片と、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤とを含む、医薬組成物。
【請求項10】
癌、急性および慢性B型肝炎からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片、または請求項9に記載の医薬組成物。
【請求項11】
癌が非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮性卵巣癌、肝細胞癌および前立腺癌からなる群から選択される、請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片または請求項10の使用のための請求項9項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
請求項1～8のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片の抗体重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項13】
請求項12に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項14】
請求項12に記載の核酸または請求項13に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項15】
請求項14に記載の宿主細胞を遺伝子発現に適した条件下で培養することを含む、抗体分子を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片に関する。本開示は、さらに、抗体分子またはその結合断片をコードする核酸、発現ベクター、宿主細胞、および抗体分子またはその結合断片を製造する方法に関する。また、この抗体分子またはその結合断片を含む医薬組成物も提供される。本開示の抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片は、癌、急性または慢性B型肝炎の治療に（単独または他の薬剤もしくは治療様式と組み合わせて）使用できる。したがって、本開示はさらに、癌、急性または慢性B型肝炎の治療に使用するための、抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片、あるいは抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
悪性化においては、糖転移酵素、グリコシダーゼ、単糖輸送体などの発現が癌の微小環境下で異なるため、糖鎖付加が健康な組織と比較して大きく変化していることが知られている。末端シアル酸構造のアップレギュレーションと変化は、がんの特徴である。
【0003】
シアル酸の構造パターンは、Siglecと呼ばれる認識受容体を通じて認識される。Siglecは、シアル酸構造に結合する免疫調節受容体であり、しばしば抑制性受容体であり、免疫細胞に優先的に発現する。近年、いくつかの実験モデルから、Siglecが癌の進行や免疫回避に関与している証拠が得られている。これらの実験モデルは、例えばSiglec-9のようなSiglecを標的として抗腫瘍免疫を向上させることができる可能性も示唆している。
【0004】
癌のような疾患を標的とした改良された戦略の必要性に鑑み、Siglec-9活性を調節するための新しい組成物が非常に望まれている。
【発明の概要】
【0005】
態様A
一態様A1において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関する。
一態様A1において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関する。
【0006】
構造特性
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、抗体分子または結合断片は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの相補性決定領域（CDR）（または集合的にCDRの全て）を表6に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および／または軽鎖可変領域（VL）から含み、ここで、CDRの1以上（または集合的にCDRの全て）は1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変化、例えば表6に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有していてもよい。
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、抗体分子または結合断片は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの相補性決定領域（CDR）（または集合的にCDRの全て）を表6に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および／または軽鎖可変領域（VL）から含み、ここで、CDRの1以上（または集合的にCDRの全て）は1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変化、例えば表6に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有していてもよい。
【0007】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、抗体分子または結合断片は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの相補性決定領域（CDR）（または集合的にCDRの全て）を表5に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および／または軽鎖可変領域（VL）から含み、ここで、CDRの1以上（または集合的にCDRの全て）は1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変化、例えば表5に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有していてもよい。
【0008】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、抗体分子または結合断片は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの相補性決定領域（CDR）（または集合的にCDRの全て）を表1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および／または軽鎖可変領域（VL）から含み、ここで、CDRの1以上（または集合的にCDRの全て）は1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変化、例えば表1に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有していてもよい。
【0009】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
以下の1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列；および／または以下の1、2または3個を含む軽鎖可変領域（VL）：配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列。
以下の1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列；および／または以下の1、2または3個を含む軽鎖可変領域（VL）：配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列。
【0010】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
以下の1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列；および／または配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列。
以下の1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列；および／または配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列。
【0011】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
以下の1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列；および／または配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列。
以下の1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列；および／または配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列。
【0012】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0013】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0014】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0015】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0016】
態様A1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、もしくは3個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1もしくは２個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、もしくは3個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1もしくは２個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0017】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VH）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VH）。
【0018】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列；および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列,配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VH）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列；および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列,配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VH）。
【0019】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）,配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VH）。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）,配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VH）。
【0020】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）、
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号51の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号52の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）、
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
【0021】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）である。
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号45の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および
配列番号46の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）である。
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
【0022】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）であり、
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）であり、
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
【0023】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号47のアミノ酸配列、または配列番号47に対して少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）を含んでいる。
【0024】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号7のアミノ酸配列、または配列番号7に対して少なくとも約85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）を含んでいる。
【0025】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号48のアミノ酸配列、または配列番号48に対して少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含んでいる。
【0026】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号8のアミノ酸配列、または配列番号8に対して少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含んでいる。
【0027】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号47のアミノ酸配列、または配列番号47と少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号48のアミノ酸配列、または配列番号48に対して少なくとも約85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
【0028】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号7のアミノ酸配列、または配列番号7と少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号8のアミノ酸配列、または配列番号8に対して少なくとも約85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
【0029】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
【0030】
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
【0031】
態様A1のいくつかの実施形態において、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、ヒト化抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片である。
【0032】
機能特性
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下の特性の1つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8または9）を含む：
(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、または0.05nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）；
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること;または
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）。
態様A1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下の特性の1つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8または9）を含む：
(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、または0.05nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）；
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること;または
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）。
【0033】
一態様A2において、本開示は、ヒトSiglec-9への結合を本明細書に記載の抗体分子またはその結合断片と競合する抗体分子またはその結合断片に関するものである。態様A2のいくつかの実施形態において、本開示は、ヒトSiglec-9への結合を、以下を含む抗体分子またはその結合断片と競合する抗体分子またはその結合断片に関する：配列番号1の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号2の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号3の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および配列番号4の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号5の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号6の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。態様A2のいくつかの実施形態において、本開示は、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む抗体分子またはその結合断片とヒトSiglec-9への結合を競合する抗体分子またはその結合断片に関する。
【0034】
一態様A3において、本開示は、本明細書に記載の抗体分子またはその結合断片と、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤とを含む、医薬組成物に関する。
【0035】
一態様A4において、本開示は、癌、急性および慢性B型肝炎からなる群から選択される疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の抗Siglec-9抗体分子若しくはその結合断片、または本明細書に記載の抗Siglec-9抗体分子若しくはその結合断片を含む医薬組成物に関する。態様A4のいくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮性卵巣癌、肝細胞癌および前立腺癌からなる群から選択される。
【0036】
一態様A5において、本開示は、本明細書に記載の抗体分子またはその結合断片の抗体重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸に関する。
【0037】
一態様A6において、本開示は、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターに関する。
【0038】
一態様A7において、本開示は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【0039】
一態様A8において、本開示は、抗体分子を製造する方法に関し、本方法は、遺伝子発現に適した条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む。
【0040】
態様B
一態様B1において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関する。
一態様B1において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関する。
【0041】
構造特性
態様B1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、抗体分子または結合断片は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの相補性決定領域（CDR）（または集合的にCDRの全て）を表2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および／または軽鎖可変領域（VL）から含み、ここで、CDRの1以上（または集合的にCDRの全て）は1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変化、例えば表2に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有していてもよい。
態様B1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、抗体分子または結合断片は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの相補性決定領域（CDR）（または集合的にCDRの全て）を表2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および／または軽鎖可変領域（VL）から含み、ここで、CDRの1以上（または集合的にCDRの全て）は1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変化、例えば表2に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有していてもよい。
【0042】
態様B1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列のうちの1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）；および／または配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列のうちの1、2または3個を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列または1、2、3または4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列のうちの1、2または3個を含む重鎖可変領域（VH）；および／または配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入または欠失を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）、挿入もしくは欠失を有する配列のうちの1、2または3個を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0043】
態様B1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0044】
態様B1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0045】
態様B1のいくつかの実施形態において、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片に関し、以下を含む：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、もしくは3個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1もしくは２個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、もしくは3個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および／または
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1もしくは２個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）のアミノ酸配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0046】
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0047】
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下を含む：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
ここで、CDR内の1、2、3、4、5、6、7、または8個のアミノ酸が挿入、削除、または置換されている。
【0048】
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号36のアミノ酸配列、または配列番号36に対して少なくとも約85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）を含んでいる。
【0049】
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号37のアミノ酸配列、または配列番号37に対して少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含んでいる。
【0050】
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号36のアミノ酸配列、または配列番号36と少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号37のアミノ酸配列、または配列番号37に対して少なくとも約85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
【0051】
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec9抗体分子またはその抗Siglec9結合断片は、配列番号36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）および配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
【0052】
態様B1のいくつかの実施形態において、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、ヒト化抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片である。
【0053】
機能特性
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下の特性の1つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10）を含む：
(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、または0.05nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）；
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること;
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）；または
(x)ヒトSiglec-7に結合すること。
態様B1のいくつかの実施形態では、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、以下の特性の1つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10）を含む：
(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、または0.05nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）；
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること;
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）；または
(x)ヒトSiglec-7に結合すること。
【0054】
一態様B2において、本開示は、ヒトSiglec-9への結合を本明細書に記載の抗体分子またはその結合断片と競合する抗体分子またはその結合断片に関するものである。態様B2のいくつかの実施形態において、本開示は、以下を含む抗体分子またはその結合断片と、ヒトSiglec-9への結合を競合する抗体分子またはその結合断片に関する。配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。態様B2のいくつかの実施形態において、本開示は、配列番号36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む抗体分子またはその結合断片と、ヒトSiglec-9への結合を競合する抗体分子またはその結合断片に関する。
【0055】
一態様B3において、本開示は、本明細書に記載の抗体分子またはその結合断片と、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤とを含む、医薬組成物に関する。
【0056】
一態様B4において、本開示は、癌、急性および慢性B型肝炎からなる群から選択される疾患の治療における使用のための、本明細書に記載の抗Siglec-9抗体分子若しくはその結合断片、または本明細書に記載の抗Siglec-9抗体分子若しくはその結合断片を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮性卵巣癌、肝細胞癌および前立腺癌からなる群から選択される。
【0057】
一態様B5において、本開示は、本明細書に記載の抗体分子またはその結合断片の抗体重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸に関する。
【0058】
一態様B6において、本開示は、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクターに関する。
【0059】
一態様B7において、本開示は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【0060】
一態様B8において、本開示は、抗体分子を製造する方法に関し、本方法は、遺伝子発現に適した条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】ELISA分析によるモノクローナル抗体（68D4と224B1；比較モノクローナル抗体mAbAと5C6、陰性対照53C3）のSiglec-5, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-15 と Siglec-9 に対する反応性。結合は、反応停止後に450nmで蓄積した発色産物を測定することにより決定した（n=3）。
【0062】
【図2】モノクローナル抗体（68D4と224B1、比較モノクローナル抗体mAbAと5C6、陰性対照53C3）のSiglec-9に対する結合曲線（ELISAで分析したもの）。反応停止後、450nmで蓄積した発色産物を測定することによって決定される、モノクローナル抗体のSiglec-9への結合を、評価対象のモノクローナル抗体の濃度に対してプロットする。GraphPad Prism（GraphPad Software）の3パラメータ解析で求めたEC50値をグラフの右下に示した（n=3）。
【0063】
【図3】モノクローナル抗体（68D4と224B1；比較モノクローナル抗体mAbAと5C6と陰性対照53C3）の、ヒトCD14+単球に発現したSiglec-9に対する結合曲線（フローサイトメトリーで分析）。CD14+集団に結合した二次抗体の平均蛍光シグナルを、評価対象のモノクローナル抗体の濃度に対してプロットした。GraphPad Prism（GraphPad Software）の3パラメータ解析で求めたEC50値は、グラフの右下に記載した。
【0064】
【図4】モノクローナル抗体（68D4と224B1；比較モノクローナル抗体mAbAと5C6＆陰性対照53C3）の滴定により、シアル酸を提示するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合のブロッキングを決定した。腫瘍細胞にはあらかじめカルセイン-AMを蛍光標識しておき、細胞溶解時に放出される蛍光で結合を判定した。抗体非存在下で放出される蛍光は、100%結合とした。データはGraphPad Prism (GraphPad Software)の3パラメータ解析でフィッティングした；n=3。
【0065】
【図5】CD8+T細胞の活性化アッセイ。モノクローナル抗体（68D4と224B1；比較モノクローナル抗体mAbAと5C6と陰性対照53C3）の滴定と、Siglec-9トランスジェニックマウス由来のCD8+T細胞（抗CD3と抗CD28抗体で共刺激）の増殖（A）、活性化マーカーCD69（B）とCD25（C）のアップレギュレーションに対する効果。CD8+T細胞の増殖と活性化マーカーのレベルは、フローサイトメトリーによって分析された。
【0066】
【図6】CD4+T細胞の活性化アッセイ。モノクローナル抗体（68D4と224B1；比較モノクローナル抗体mAbAと5C6＆陰性対照53C3）の滴定と、Siglec-9トランスジェニックマウスモデルに由来する（抗CD3抗体と抗CD28抗体で共刺激）CD4+T細胞の増殖（A）、活性化マーカーCD69（B）とCD25（C）のアップレギュレーションへの効果。CD4+T細胞の増殖と活性化マーカーのレベルは、フローサイトメトリーによって分析された。
【0067】
【図7】NK92細胞によるカルセイン-AM標識K562細胞の殺傷力を測定するためのモノクローナル抗体（68D4と224B1；比較モノクローナル抗体mAbAと5C6＆陰性対照53C3）の滴定。殺傷は、K562細胞の細胞溶解時に放出される蛍光で判定した。特異的溶解は次のように計算した。(溶解試験ウェル-自然溶解）/（最大溶解-自然溶解）×100%。洗剤Triton X-100添加時とK562細胞単独インキュベーション時に放出される蛍光を、それぞれ最大溶解と自然溶解の判定に使用した。データはGraphPad Prism（GraphPad Software）の1部位（合計）解析で解析した；n=3。
【0068】
【図8】ウサギ抗体68D4のヒト化。ヒトIgG 263E11の軽鎖可変ドメイン（配列番号54）、ヒト生殖細胞系列KV1-5/J4（配列番号55および配列番号56）、rb 68D4（配列番号8）および得られたグラフト68D4-hum（配列番号48）；およびヒトIgG 263E11の重鎖可変ドメイン（配列番号53）、ヒト生殖細胞配列VH3-23/J4（配列番号57および配列番号58）、rb 68D4（配列番号7）および得られたグラフト68D4-hum（配列番号47）のアラインメントを示す。
【0069】
【図9】モノクローナル抗体（ウサギ68D4、ヒト化68D4、比較モノクローナル抗体mAbA）のSiglec-9に対する結合曲線（ELISAによる分析）。反応停止後、450nmで蓄積した発色産物を測定することによって決定される、モノクローナル抗体のSiglec-9への結合を、評価対象のモノクローナル抗体の濃度に対してプロットする。
【0070】
(詳細な説明)
以下に例示的に説明する本発明は、本明細書に特に開示されていない要素または(複数の）要素、限定または(複数の）限定がない場合にも好適に実施することができる。
以下に例示的に説明する本発明は、本明細書に特に開示されていない要素または(複数の）要素、限定または(複数の）限定がない場合にも好適に実施することができる。
【0071】
以下、本発明を特定の実施形態に関して、また特定の図を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【0072】
本明細書および特許請求の範囲において、用語「含む」が使用されている場合、それは他の要素を除外するものではない。本発明の目的のために、用語「からなる」は、用語「含む」の好ましい実施形態であると考えられる。以下、あるグループが少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなるグループを開示するとも理解される。
【0073】
「a」、「an」、「the」など、単数形の名詞を指すときに不定冠詞または定冠詞が使用される場合、他の何かが明確に記述されていない限り、その名詞の複数形を含む。本発明の文脈における「約」または「およそ」という用語は、当業者が、当該特徴の技術的効果を依然として確保するために理解するであろう精度の間隔を示すものである。指示された数値に対して、±20%、好ましくは±10%、より好ましくは±5%の偏差を示す。
【0074】
専門用語はその技術常識で用いられる。特定の用語に特定の意味がある場合、その用語の定義は、その用語が使用されている文脈で、以下において記載する。
【0075】
ヒトSiglec-7（NCBI参照配列：Q9Y286.1）は、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号60）。
【0076】
ヒトSiglec-9(NCBI Reference Sequence:NP#055256.1)は、CD33に関連するSiglecファミリーのメンバーで、シアル酸結合Ig様レクチン9、CD329、CDw329、FOAP-9、OBBP-LIKEとも呼ばれる。ヒトSiglec-9は463アミノ酸からなり、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号9）。
【0077】
Siglec-9は、適応免疫系および自然免疫系の細胞（NK細胞、CD8+-およびCD4+T細胞、マクロファージなど）が腫瘍の微小環境で発現する抑制性免疫受容体であり、腫瘍の微小環境で発現する。この受容体を介した抑制的なシグナル伝達は、腫瘍細胞や腫瘍間質で発現が増加したリガンドによって引き起こされることが示された（Laubli et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2014 Sep 30;111(39):14211-6).重要なことは、CRC（大腸がん）およびNSCLC（非小細胞肺がん）がん患者のCD8+およびCD4+腫瘍浸潤リンパ球（TIL）が、特にPD-1を高レベルで発現するTILにおいて、Siglec-9のアップレギュレーションを示していることだ（Stanczakら、J Clin Invest.2018 Nov 1;128(11):4912-4923).さらに、B型肝炎ウイルスの複製を制御する方法として、Siglec-9を阻害することが示唆された（Zhao et al, Front Immunol.2018 May 30; 9:1124）。
【0078】
本開示のある態様は、少なくとも部分的に、以下の抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片の同定に基づく。
Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの間の相互作用を阻害する；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD8+T細胞の増殖を増加させる；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD8+T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートする；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD4+T細胞の増殖を増加させる；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD4+T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートする；および／または
NK細胞による殺傷活性を高める。
Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの間の相互作用を阻害する；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD8+T細胞の増殖を増加させる；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD8+T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートする；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD4+T細胞の増殖を増加させる；および／または
抗CD3/抗CD28刺激CD4+T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートする；および／または
NK細胞による殺傷活性を高める。
【0079】
上述のように、本開示は、抗Siglec-9抗体分子またはその結合断片を考察するものである。全長抗体には、定常ドメインと可変ドメインがある。定常領域は、抗体の抗原結合性断片に存在する必要はない。
【0080】
したがって、結合断片は、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域など、無傷の完全長抗体の一部を含むことができる。抗体断片の例としては、Fab、F（ab'）2、IdおよびFv断片；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；二重特異性、三重特異性、および多重特異性抗体などの多重特異性抗体断片（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）；ミニボディ；キレート組換え抗体；トリボディまたはビボディ；イントラボディ；ナノボディ；小型モジュール免疫医薬品（SMIP）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；VHH含有抗体；および抗体断片から形成されるその他のポリペプチドを含む。当業者は、抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることを認識している。
【0081】
また、ヒト化抗体も本開示の範囲内である。
【0082】
本明細書で開示されるのは、指定された配列、またはそれと実質的に同一もしくは類似の配列、例えば指定された配列に対して少なくとも約85％、90％、95％、または99％の配列同一性を有するポリペプチドのことである。
【0083】
2つの配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:5873-5877の数学アルゴリズムを用いて達成される。このようなアルゴリズムは、NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)で入手可能であるAltschul et al.(1990) J. Mol.Biol.215:403-410プログラムに組み込まれている。同一性の割合の決定は、BLASTpプログラムの標準的なパラメータで行うことができる。一般的なパラメータとしては、「Max Target Sequences」ボックスを100に、「Short queries」ボックスをチェックし、「Expect threshold」ボックスを10に、「Word Size」ボックスを「3」に、「Max matches in a query range」ボックスを「0」に設定することができる。スコアリング・パラメータについては、「Matrix」ボックスを「BLOSUM62」に設定し、「Gap Costs」ボックスを「Existence:11 Extension:1」に設定し、「Compositional adjustments」ボックスを「Conditional compositional score matrix adjustment」に設定してもよい。フィルタとマスキングパラメータでは、「Low complexity regions」ボックスにチェックがない場合、「Mask for lookup table only」 ボックスにチェックがない場合、および「Mask lower case letters」ボックスにチェックがない場合があり得る。
【0084】
本開示によれば、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【0085】
前述のように、本開示はまた、いくつかの実施形態において、抗体分子またはその結合断片をコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、およびそのような核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【0086】
抗体分子またはその結合断片は、単一の核酸（例えば、抗体の軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸）によりコードされてもよいし、それぞれが抗体分子または抗体断片の異なる部分をコードする、2以上の別々の核酸によってコードされてもよい。核酸は、DNA、cDNA、RNAなどであってもよい。
【0087】
本明細書に記載された核酸は、ベクターに挿入することができる。「ベクター」とは、コード化されたポリペプチドの合成が行われる適切な細胞内に核酸配列を運ぶ能力を有する任意の分子または組成物のことである。
【0088】
いくつかの態様における本開示は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞（例えば、単離または精製された細胞）をさらに提供する。宿主細胞は、それによってコードされるポリペプチドを産生するように、本発明の核酸またはベクターで形質転換することができる任意のタイプの細胞であることができる。
【0089】
本発明の抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片は、組成物、特に医薬組成物に配合することができる。このような組成物は、治療的有効量の抗体またはその結合断片を、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混和して含む。
【0090】
さらに、本明細書に記載の抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片および医薬組成物は、癌、急性および慢性B型肝炎からなる群から選択される疾患を有する患者の治療方法において投与することができ、この疾患は、1以上のSiglec-9リガンドの発現上昇によって特徴付けられることができる。
【0091】
非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮性卵巣癌、肝細胞癌および前立腺癌の治療は、本明細書に記載の抗Siglec-9抗体分子または抗Siglec-9結合断片もしくは医薬組成物を使用する場合に特に有効であると考えられる。
【0092】
本発明の態様B1～B8の好ましい実施形態は、以下に関する：
1. 以下を含む、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
2. 以下を含む、項目1に記載の抗体分子またはその結合断片：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
1. 以下を含む、抗Siglec-9抗体分子またはその抗Siglec-9結合断片：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）のアミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列、および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列、または1、2、3、もしくは4個のアミノ酸置換を有する配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
2. 以下を含む、項目1に記載の抗体分子またはその結合断片：
配列番号30の重鎖相補性決定領域1（VHCDR1）アミノ酸配列、配列番号31の重鎖相補性決定領域2（VHCDR2）アミノ酸配列、および配列番号32の重鎖相補性決定領域3（VHCDR3）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）；および
配列番号33の軽鎖相補性決定領域1（VLCDR1）アミノ酸配列、配列番号34の軽鎖相補性決定領域2（VLCDR2）アミノ酸配列および配列番号35の軽鎖相補性決定領域3（VLCDR3）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）。
【0093】
3. 配列番号36のアミノ酸配列、または配列番号36に対して少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）を含む、項目1または2に記載の抗体分子またはその結合断片。
【0094】
4. 配列番号37のアミノ酸配列、または配列番号37に対して少なくとも約85％、90％、95％、もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む、項目1～3のいずれか一項に記載の抗体分子またはその結合断片。
【0095】
5. 配列番号36のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、および配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む、項目1～4のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片。
【0096】
6. 以下の性質の1つ以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10）を含む、項目1～5のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片。
(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、または0.05nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）；
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること;
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）；または
(x)ヒトSiglec-7に結合すること。
(i）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例3に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、または0.05nM未満のEC50でヒトSiglec-9に結合すること；
(ii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例4に記載のように、表面プラズモン共鳴、例えばカーターラLSAを用いて二価の分子として試験する場合、解離定数（KD）が約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満でヒトSiglec-9に結合すること；
(iii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例5に記載のように、フローサイトメータを用いて二価の分子として試験する場合、約10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nMまたは0.1nM未満のEC50でヒトCD14+単球に結合すること；
(vi)抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例6に記載のように、ELISAを用いて二価分子として試験する場合、Siglec-9と1つ以上のSiglec-9リガンドとの相互作用を阻害すること（例えば、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を阻害する）；
(v）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の増殖を増加させること；
(vi）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD8＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること；
(vii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、Cell Trace Violetおよびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験する場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の増殖を増加させること；
(viii）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例7に記載のように、染色およびフローサイトメーターを用いたT細胞活性化アッセイにおいて二価分子として試験される場合、抗CD3／抗CD28刺激CD4＋T細胞の活性化マーカーCD69およびCD25をアップレギュレートすること;
(ix）抗体分子またはその結合断片を、例えば実施例8に記載のように、カルセイン-AM標識K562細胞を用いて二価の分子として試験する場合、NK細胞媒介性殺傷活性を増加させること（例えば、Siglec-9を過剰発現するNK92細胞によるK562細胞の殺傷を増加させる）；または
(x)ヒトSiglec-7に結合すること。
【0097】
7. 項目1～6のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片と、ヒトSiglec-9への結合を競合する、抗体分子またはその結合断片。
【0098】
8. 項目1～6のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片と、ヒトSiglec-9の同じエピトープへの結合を競合する、項目7に記載の抗体分子またはその結合断片。
【0099】
9. 項目1～8のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片と、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤とを含む、医薬組成物。
【0100】
10. 癌、急性および慢性B型肝炎からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、項目1～8のいずれか1項に記載の抗体分子もしくはその結合断片または項目9に記載の医薬組成物。
【0101】
11. 項目1～8のいずれか1項に記載の抗体分子もしくはその結合断片、または項目10の使用のための項目9に記載の医薬組成物であって、癌が、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮性卵巣癌、肝細胞癌および前立腺癌からなる群から選択される、抗体分子もしくはその結合断片。
【0102】
12. 項目1～8のいずれか1項に記載の抗体分子またはその結合断片の抗体重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸。
【0103】
13. 項目12に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【0104】
14. 項目12に記載の核酸または項目13に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【0105】
15. 抗体分子を製造する方法であって、項目14に記載の宿主細胞を、遺伝子発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
【実施例】
【0106】
抗体探索
実施例1a
NZWウサギをDNA免疫またはSiglec-9-Fc-protein注射により免疫し、ウサギ免疫グロブリン定数重領域とヒトCD8由来の膜貫通ドメインを含む発現カセットに免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域をクローニングすることにより、リンパ節および脾臓B細胞から抗体レパートリー発現ライブラリーを作成した。抗体ライブラリーのスクリーニングは、HEK293T細胞にライブラリーを導入した後、蛍光標識したSiglec-9を用いて抗原特異的にソーティングして行った。この選別で1000個以上のSiglec-9特異的抗体発現細胞クローンが得られ、さらに増殖させて抗体の特性を下流で解析した。次に、Siglec-7と交差反応性がなく、高い親和性を持つSiglec-9特異的抗体を可溶性抗体発現用ベクターにサブクローニングし、HEK293F細胞で一過性にトランスフェクション後発現させた。その後、プロテインGをベースに精製した後、様々なアッセイで抗体の特性を確認した。
実施例1a
NZWウサギをDNA免疫またはSiglec-9-Fc-protein注射により免疫し、ウサギ免疫グロブリン定数重領域とヒトCD8由来の膜貫通ドメインを含む発現カセットに免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域をクローニングすることにより、リンパ節および脾臓B細胞から抗体レパートリー発現ライブラリーを作成した。抗体ライブラリーのスクリーニングは、HEK293T細胞にライブラリーを導入した後、蛍光標識したSiglec-9を用いて抗原特異的にソーティングして行った。この選別で1000個以上のSiglec-9特異的抗体発現細胞クローンが得られ、さらに増殖させて抗体の特性を下流で解析した。次に、Siglec-7と交差反応性がなく、高い親和性を持つSiglec-9特異的抗体を可溶性抗体発現用ベクターにサブクローニングし、HEK293F細胞で一過性にトランスフェクション後発現させた。その後、プロテインGをベースに精製した後、様々なアッセイで抗体の特性を確認した。
【0107】
遺伝子免疫に使用したSiglec-9のDNA配列は、以下の配列（ヒトの配列と比較してコドンを最適化したもの）であった。
【0108】
タンパク質免疫に使用したSiglec-9-Fcタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有していた。
【0109】
抗Siglec-9抗体68D4のアミノ酸配列。
【表1】
【0110】
実施例1b
NZWウサギをDNA免疫またはSiglec-9-Fc-protein注射により免疫し、ウサギ免疫グロブリン定数重領域とヒトCD8由来の膜貫通ドメインを含む発現カセットに免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域をクローニングすることにより、リンパ節および脾臓B細胞から抗体レパートリー発現ライブラリーを作成した。抗体ライブラリーのスクリーニングは、HEK 293T細胞にライブラリーを導入した後、蛍光標識したSiglec-9を用いて抗原特異的にソーティングして行った。この選別で1000個以上のSiglec-9特異的抗体発現細胞クローンが得られ、さらに増殖させて抗体の特性を下流で解析した。次に、Siglec-7と高い親和性と交差反応性を持つSiglec-9特異的抗体を可溶性抗体発現用の発現ベクターにサブクローニングし、HEK 293F細胞で一過性トランスフェクション後に発現させた。その後、プロテインGをベースに精製した後、様々なアッセイで抗体の特性を確認した。
NZWウサギをDNA免疫またはSiglec-9-Fc-protein注射により免疫し、ウサギ免疫グロブリン定数重領域とヒトCD8由来の膜貫通ドメインを含む発現カセットに免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域をクローニングすることにより、リンパ節および脾臓B細胞から抗体レパートリー発現ライブラリーを作成した。抗体ライブラリーのスクリーニングは、HEK 293T細胞にライブラリーを導入した後、蛍光標識したSiglec-9を用いて抗原特異的にソーティングして行った。この選別で1000個以上のSiglec-9特異的抗体発現細胞クローンが得られ、さらに増殖させて抗体の特性を下流で解析した。次に、Siglec-7と高い親和性と交差反応性を持つSiglec-9特異的抗体を可溶性抗体発現用の発現ベクターにサブクローニングし、HEK 293F細胞で一過性トランスフェクション後に発現させた。その後、プロテインGをベースに精製した後、様々なアッセイで抗体の特性を確認した。
【0111】
遺伝子免疫に用いたSiglec-9 DNA配列およびタンパク質免疫に用いたSiglec-9-Fcタンパク質は、実施例1a（配列番号10および配列番号11）について記載したものと同じであった。
【0112】
抗Siglec9抗体224B1のアミノ酸配列。
【表2】
【0113】
アッセイ
比較抗体
mAbA（WO 2017/153433）、5C6（WO 2017/075432）；mAbAはマウス-ヒトキメラとしてWO 2017/153433に記載のようにクローン化された。マウスVHおよびVLドメインとヒト定数ドメインを融合してIgG発現させ、得られたmAbA抗体は二次抗ヒトIgGで検出された。5C6（WO 2017/075432）は、マウスとウサギのキメラとしてクローニングされた。マウスVHおよびVLドメインは、IgG発現のためにウサギのコンスタントドメインと融合させた。得られた5C6抗体は、ここに記載したウサギ抗体と同じ二次抗ウサギ抗体で検出された。陰性対照:53C3.53C3は、無関係のペプチドで免疫することにより、ウサギで発現させた。
比較抗体
mAbA（WO 2017/153433）、5C6（WO 2017/075432）；mAbAはマウス-ヒトキメラとしてWO 2017/153433に記載のようにクローン化された。マウスVHおよびVLドメインとヒト定数ドメインを融合してIgG発現させ、得られたmAbA抗体は二次抗ヒトIgGで検出された。5C6（WO 2017/075432）は、マウスとウサギのキメラとしてクローニングされた。マウスVHおよびVLドメインは、IgG発現のためにウサギのコンスタントドメインと融合させた。得られた5C6抗体は、ここに記載したウサギ抗体と同じ二次抗ウサギ抗体で検出された。陰性対照:53C3.53C3は、無関係のペプチドで免疫することにより、ウサギで発現させた。
【0114】
比較用抗Siglec-9抗体mAbA（WO 2017/153433）および5C6（WO 2017/075432）のアミノ酸配列
【表3】
【0115】
実施例2 - Siglec9特異的抗体のSiglec5、-7、-8、-9および-15に対する特異性/交差反応性
材料と方法
Siglec-5, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-15, Siglec-9 に対する特異性は、96 well half-area ELISA plate (Corning) を用いて酵素結合免疫吸着法 (ELISA) で測定された。Siglec-5-Fc (R&D systems), Siglec-7-Fc (自社製造、使用したSiglec-7-Fcタンパク質は以下のアミノ酸配列であった。
Siglec-8-Fc (R&D systems), Siglec-15-Fc (R&D systems), Siglec-9-Fc (自社製造, 配列番号11) を1μg/mlで50mM炭酸-重炭酸塩緩衝液 pH 9.6 で4℃、15-20時間コートした。抗原を洗浄し（Tecan Hydrospeed）、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の5％脱脂乳でブロッキングした。プレートを洗浄後、0.5%ミルクPBS中、5μg/ml (33nM)の抗体を3連（in triplicates）で添加した。抗体の入ったプレートは、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合した抗体を西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識ポリクローナル抗ウサギIgG抗体（Biolegend）またはmAbA用抗ヒトFab断片（Sigma Aldrich）で検出した。3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB; Sigma Aldrich) 発色を硫酸添加により停止し、450 nmで吸光度を検出した (Tecan, CM INFINITE MONO 200)。
材料と方法
Siglec-5, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-15, Siglec-9 に対する特異性は、96 well half-area ELISA plate (Corning) を用いて酵素結合免疫吸着法 (ELISA) で測定された。Siglec-5-Fc (R&D systems), Siglec-7-Fc (自社製造、使用したSiglec-7-Fcタンパク質は以下のアミノ酸配列であった。
【0116】
結果
モノクローナル抗体68D4は、Siglec-9に特異的に結合するが、近縁のSiglec-5, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-15には交差反応を示さない。2つの比較用抗体mAbAと5C6も同じ挙動を示す。陰性対照53C3は、試験したいずれの抗原に対しても反応性を示さない。モノクローナル抗体224B1は、Siglec-9とSiglec-7に特異的に結合するが、近縁のSiglec-5、Siglec-8、Siglec-15には交差反応を示さない（図1）。
モノクローナル抗体68D4は、Siglec-9に特異的に結合するが、近縁のSiglec-5, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-15には交差反応を示さない。2つの比較用抗体mAbAと5C6も同じ挙動を示す。陰性対照53C3は、試験したいずれの抗原に対しても反応性を示さない。モノクローナル抗体224B1は、Siglec-9とSiglec-7に特異的に結合するが、近縁のSiglec-5、Siglec-8、Siglec-15には交差反応を示さない（図1）。
【0117】
実施例3 - Siglec-9特異的抗体の酵素結合免疫吸着法（ELISA）におけるSiglec-9タンパク質に対するEC50の測定
材料と方法
Siglec-9に対する抗体の結合親和性は、ELISA法において、一定濃度のSiglec-9タンパク質に対する分析抗体の希釈系列によって測定された。このため、Siglec-9を1μg/mlで50mM炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.6中で4℃、15-20時間コートした。抗原溶液を洗浄し（Tecan Hydrospeed）、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の5％脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、0-420nMの濃度で抗体を添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートをもう1回洗浄した。結合した抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体の添加により検出された。ウサギ抗体はポリクローナル抗ウサギIgG抗体（Biolegend）、mAbAは抗ヒトFab断片（Sigma Aldrich）で検出した。最後の洗浄工程の後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB; Sigma Aldrich) の添加によりプレートを発色させた。反応は硫酸の添加により停止した。450 nmで吸光度を検出した（Tecan, CM INFINITE MONO 200）。データをフィッティングし、GraphPad Prism (GraphPad Software) の3パラメータ解析によりEC50値を決定した。
材料と方法
Siglec-9に対する抗体の結合親和性は、ELISA法において、一定濃度のSiglec-9タンパク質に対する分析抗体の希釈系列によって測定された。このため、Siglec-9を1μg/mlで50mM炭酸-重炭酸塩緩衝液pH9.6中で4℃、15-20時間コートした。抗原溶液を洗浄し（Tecan Hydrospeed）、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の5％脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、0-420nMの濃度で抗体を添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートをもう1回洗浄した。結合した抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体の添加により検出された。ウサギ抗体はポリクローナル抗ウサギIgG抗体（Biolegend）、mAbAは抗ヒトFab断片（Sigma Aldrich）で検出した。最後の洗浄工程の後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB; Sigma Aldrich) の添加によりプレートを発色させた。反応は硫酸の添加により停止した。450 nmで吸光度を検出した（Tecan, CM INFINITE MONO 200）。データをフィッティングし、GraphPad Prism (GraphPad Software) の3パラメータ解析によりEC50値を決定した。
【0118】
結果
モノクローナル抗体68D4と224B1は、mAbAと5C6に比べ、Siglec-9に対して非常に強いアビディティを示す（図2）。
モノクローナル抗体68D4と224B1は、mAbAと5C6に比べ、Siglec-9に対して非常に強いアビディティを示す（図2）。
【0119】
実施例4 - 表面プラズモン共鳴（SPR）による親和性測定
材料と方法
KDの測定は、スルホ-NHS/EDCカップリング化学によってHC2000Mチップに抗体を個別にコーティングすることによりSPRで行った。その後、チップをエタノールアミンでブロッキングした。抗原は3種類の濃度（20nM、100nM、500nM）のいずれかを、240sの接触時間、その後120sの解離相で適用した。各抗原インキュベーション後、結合した抗原をpH2.0の10mMグリシンで抗体から除去した。すべてのキネティックパラメーター（kon, koff, KD）はキネティックフィッティングプログラム（LSA Kinetics, Carterra）を用いて決定した。
材料と方法
KDの測定は、スルホ-NHS/EDCカップリング化学によってHC2000Mチップに抗体を個別にコーティングすることによりSPRで行った。その後、チップをエタノールアミンでブロッキングした。抗原は3種類の濃度（20nM、100nM、500nM）のいずれかを、240sの接触時間、その後120sの解離相で適用した。各抗原インキュベーション後、結合した抗原をpH2.0の10mMグリシンで抗体から除去した。すべてのキネティックパラメーター（kon, koff, KD）はキネティックフィッティングプログラム（LSA Kinetics, Carterra）を用いて決定した。
【0120】
結果
モノクローナル抗体68D4は、比較抗体mAbAと比較して、オンレートが速く、オフレートが遅いという強いアビディティを示し、その結果、解離定数が約16.7倍改善された。モノクローナル抗体224B1は、強いアビディティを示す。
SPRで決定したキネティックパラメーター
モノクローナル抗体68D4は、比較抗体mAbAと比較して、オンレートが速く、オフレートが遅いという強いアビディティを示し、その結果、解離定数が約16.7倍改善された。モノクローナル抗体224B1は、強いアビディティを示す。
SPRで決定したキネティックパラメーター
【0121】
【表4】
【0122】
実施例5 - Siglec9特異的抗体のヒト単球への結合性
材料と方法
単球は標的であるSiglec-9を強くかつ均一に発現していることから、ヒト単球への抗体の結合を評価した。したがって、ヒト単球はSiglec-9特異的抗体の結合を特徴づけるための優れたex vivoモデルであり、関連性が高い。
材料と方法
単球は標的であるSiglec-9を強くかつ均一に発現していることから、ヒト単球への抗体の結合を評価した。したがって、ヒト単球はSiglec-9特異的抗体の結合を特徴づけるための優れたex vivoモデルであり、関連性が高い。
【0123】
ヒトex vivo PBMCを、単球マーカーCD14に対する蛍光標識（アロフィコシアニン、APC）抗体（Biolegend）で、アッセイバッファー（0.5%(v/v)熱不活性化牛胎児血清（Gibco）、2mM EDTA、リン酸緩衝生理水）中で染色した。その後、様々な濃度（67nM - 0.38pM）の評価対象抗体と細胞をインキュベートした。洗浄工程後、細胞をヒトIgG（mAbA）またはウサギIgGに対する蛍光標識（Brilliant Violet 421TM）二次抗体（評価した他のすべてのモノクローナル抗体；両方の二次抗体はBiolegend社製）とインキュベートした。
【0124】
単球（CD14陽性生細胞）へのSiglec-9特異的抗体の結合は、CytoFLEXフローサイトメーター（Beckham Coulter's）で分析された。各希釈度におけるCD14陽性集団の二次抗体染色の平均蛍光強度は、Flow Joソフトウェア（BD）を用いて求めた。この解析で得られたデータポイントをフィッティングし、GraphPad Prism (GraphPad Software) の3パラメータ解析によりEC50値を決定した。
【0125】
結果
ヒトCD14+単球の関連する細胞状況では、モノクローナル抗体68D4は、mAbAと比較して、単球に発現するSiglec-9に対して約3倍の強いアビディティを示している。モノクローナル抗体5C6と比較すると、68D4は約22倍も強く結合しているように見える。ヒトCD14+単球の関連する細胞状況では、モノクローナル抗体224B1は、mAbAと比較して、単球発現Siglec-9に対して同様のアビディティを示す。モノクローナル抗体5C6と比較すると、224B1は約10倍強く結合しているように見える（図3）。
ヒトCD14+単球の関連する細胞状況では、モノクローナル抗体68D4は、mAbAと比較して、単球に発現するSiglec-9に対して約3倍の強いアビディティを示している。モノクローナル抗体5C6と比較すると、68D4は約22倍も強く結合しているように見える。ヒトCD14+単球の関連する細胞状況では、モノクローナル抗体224B1は、mAbAと比較して、単球発現Siglec-9に対して同様のアビディティを示す。モノクローナル抗体5C6と比較すると、224B1は約10倍強く結合しているように見える（図3）。
【0126】
実施例6 - Siglec-9へのリガンド結合の阻害
材料と方法
抗Siglec-9抗体がリガンド結合ドメインを認識し、Siglec-9とそのリガンドであるシアル酸との結合を阻害するかどうかを解析するために、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9-Fcの結合をELISAで評価するセルベースアッセイを実施した。ELISAプレートに3μg/mlのProtein-A (Thermo Fisher Scientific)を4℃で一晩コーティングした。プレートはPBS, 1% BSAで1時間ブロッキングした後、5μg/mlのSiglec-9-Fcと1時間RTでインキュベートした。異なる濃度（8μg/mlまたは53nMから）の抗Siglec-9抗体とCalcein-AM（Thermo Fisher Scientific）標識A549腫瘍細胞を1:1で混合した。ELISAプレートに添加し、4℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄後、PBS, 1% Triton-X 100で結合した細胞を溶解し、放出された蛍光をSynergy H1 (BioTek) を用いて励起485 nm、発光535 nmで測定した。データはGraphPad Prism (GraphPad Software)の3パラメータ解析でフィッティングした。
材料と方法
抗Siglec-9抗体がリガンド結合ドメインを認識し、Siglec-9とそのリガンドであるシアル酸との結合を阻害するかどうかを解析するために、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9-Fcの結合をELISAで評価するセルベースアッセイを実施した。ELISAプレートに3μg/mlのProtein-A (Thermo Fisher Scientific)を4℃で一晩コーティングした。プレートはPBS, 1% BSAで1時間ブロッキングした後、5μg/mlのSiglec-9-Fcと1時間RTでインキュベートした。異なる濃度（8μg/mlまたは53nMから）の抗Siglec-9抗体とCalcein-AM（Thermo Fisher Scientific）標識A549腫瘍細胞を1:1で混合した。ELISAプレートに添加し、4℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄後、PBS, 1% Triton-X 100で結合した細胞を溶解し、放出された蛍光をSynergy H1 (BioTek) を用いて励起485 nm、発光535 nmで測定した。データはGraphPad Prism (GraphPad Software)の3パラメータ解析でフィッティングした。
【0127】
結果
モノクローナル抗体68D4と224B1は、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を、濃度依存的に、比較モノクローナル抗体mAbAと5C6と同程度にブロックした（図4）。
モノクローナル抗体68D4と224B1は、シアル酸を発現するA549腫瘍細胞とSiglec-9の結合を、濃度依存的に、比較モノクローナル抗体mAbAと5C6と同程度にブロックした（図4）。
【0128】
実施例7 - T細胞活性化アッセイ
材料と方法
T細胞活性化アッセイには、Siglec-9トランスジェニックマウスの細胞（Stanczak et al, J Clin Invest.2018 Nov 1;128(11):4912-4923) を使用した。これらのマウスでは、Creリコンビナーゼを用いて、Siglec-9遺伝子の前にあるGFP-stopカセットを切除することにより、Siglec-9の発現が誘導される。Creの発現はCD4プロモーターによって駆動される。これらのT細胞にSiglec-9を発現させると、T細胞受容体のトリガーによる刺激とCD28受容体を介した共刺激シグナルだけでは細胞の活性化に不十分で、Siglec-9を介した抑制を解除する第3のシグナルが必要な表現型となる。
材料と方法
T細胞活性化アッセイには、Siglec-9トランスジェニックマウスの細胞（Stanczak et al, J Clin Invest.2018 Nov 1;128(11):4912-4923) を使用した。これらのマウスでは、Creリコンビナーゼを用いて、Siglec-9遺伝子の前にあるGFP-stopカセットを切除することにより、Siglec-9の発現が誘導される。Creの発現はCD4プロモーターによって駆動される。これらのT細胞にSiglec-9を発現させると、T細胞受容体のトリガーによる刺激とCD28受容体を介した共刺激シグナルだけでは細胞の活性化に不十分で、Siglec-9を介した抑制を解除する第3のシグナルが必要な表現型となる。
【0129】
T細胞活性化アッセイでは、96ウェル平底プレートに0.5μg/ml抗CD3および1μg/ml抗CD28を4℃で一晩、または37℃で2時間コートした。Siglec-9トランスジェニックマウスから脾臓細胞およびリンパ節細胞を分離した。赤血球を溶解し、Cell Trace Violet (Thermo Fisher Scientific)で細胞を標識した。250.000細胞/ウェルを様々な濃度（0.25μg/ml - 0.0125μg/ml; 1.7nM - 83pM）で評価中の抗体と共に、または抗体なしで添加した。細胞は48時間培養した後、T細胞マーカーCD3、CD4、CD8、活性化マーカーCD69、CD25を染色した。細胞の増殖は、Cell Trace Violetの希釈度を分析することにより評価した。細胞はCytoFLEXフローサイトメーター（Beckham Coulter`s）で分析された。Expansion IndexはFlow Joソフトウェア（BD）を用いて算出した。 細胞の活性化は、T細胞上のCD69とCD25の平均蛍光強度によって測定された。データはGraphPad Prism (GraphPad Software)を用いて描写した。
【0130】
結果
モノクローナル抗体68D4または224B1で共刺激したCD8+T細胞は、濃度依存的に増殖し、活性化マーカーCD69とCD25をアップレギュレートすることで反応した。モノクローナル抗体68D4は、比較抗体mAbAと比較して、低濃度でより強い増殖と活性化を示した。モノクローナル抗体224B1は、比較抗体mAbAと比較して、高濃度でより強い増殖を示した。活性化因子は224B1抗体とmAbA抗体で同等であると思われる。モノクローナル抗体5C6は、刺激も活性化もしないようであった（図5）。
モノクローナル抗体68D4または224B1で共刺激したCD8+T細胞は、濃度依存的に増殖し、活性化マーカーCD69とCD25をアップレギュレートすることで反応した。モノクローナル抗体68D4は、比較抗体mAbAと比較して、低濃度でより強い増殖と活性化を示した。モノクローナル抗体224B1は、比較抗体mAbAと比較して、高濃度でより強い増殖を示した。活性化因子は224B1抗体とmAbA抗体で同等であると思われる。モノクローナル抗体5C6は、刺激も活性化もしないようであった（図5）。
【0131】
同様に、CD4+T細胞では、モノクローナル抗体68D4はmAbAと比較して低濃度ではるかに強い増殖を示し、モノクローナル抗体224B1はmAbAと比較して高濃度ではるかに強い増殖を示した。CD8+T細胞の場合と同様に、モノクローナル抗体5C6は、刺激性または活性化反応を引き起こすことができなかった。また、いずれの場合も、より強い増殖は、活性化マーカーであるCD69とCD25のより強い発現を伴っている（図6）。
【0132】
実施例8-ナチュラルキラー細胞活性の賦活化
材料と方法
Siglec-9を過剰発現させたヒトNK細胞株を用いて、NK細胞殺傷アッセイを実施した。
材料と方法
Siglec-9を過剰発現させたヒトNK細胞株を用いて、NK細胞殺傷アッセイを実施した。
【0133】
NK92細胞はSiglec-9とGFPを含むプラスミドで安定的にトランスフェクションされた（NK92-Siglec-9）。対照細胞はGFPのみを安定的にトランスフェクトしたもの（NK92-GFP）。NK92細胞を20ng/mlのIL-15で一晩活性化し、カルセイン-AM標識K562細胞と3：1の割合で、96ウェルVボトムプレートで抗体希釈系列とともに、あるいは抗体希釈系列なしで4時間共培養した。遠心分離により細胞をペレット化し、上清を黒色96ウェルフラットボトムプレートに移した。K562細胞の溶解度は、Synergy H1 (BioTek) を用いて、485nmで励起、535nmで発光させ、上清中に放出されたCalcein-AMとして測定した。特異的溶解は次のように計算した。(溶解試験ウェル-自然溶解）/（最大溶解-自発溶解）×100%。自発細胞溶解には、K562細胞のみを使用。最大溶解には、K562細胞にはTriton X-100を添加した。データはGraphPad Prism (GraphPad Software)で解析された。
【0134】
結果
モノクローナル抗体68D4は、濃度依存的にNK細胞を介した殺傷活性を活性化することを示した。比較対象のモノクローナル抗体であるmAbAや5C6と比較すると、低濃度ですでに高い細胞溶解能に達している。後者の抗体は、テストした中で最も高い濃度でのみ細胞溶解を生じさせた。モノクローナル抗体224B1は、濃度依存的にNK細胞を介した殺傷活性を活性化することを示した。特異的な細胞溶解は、比較モノクローナル抗体mAbAと同程度の値を示した（図7）。
モノクローナル抗体68D4は、濃度依存的にNK細胞を介した殺傷活性を活性化することを示した。比較対象のモノクローナル抗体であるmAbAや5C6と比較すると、低濃度ですでに高い細胞溶解能に達している。後者の抗体は、テストした中で最も高い濃度でのみ細胞溶解を生じさせた。モノクローナル抗体224B1は、濃度依存的にNK細胞を介した殺傷活性を活性化することを示した。特異的な細胞溶解は、比較モノクローナル抗体mAbAと同程度の値を示した（図7）。
【0135】
実施例9 - ウサギ抗体 68D4 のヒト化
ヒトIgG 263E11は、68D4と類似しているため、Memo Therapeutics AGのヒトIgGデータベースから選択した。最初の手段として、ウサギ免疫グロブリン68D4のCDRを263E11可変ドメインフレームワークにグラフト化した。更なる変更をフレームワーク位置で行い、重鎖のKabat位置27、28、29と94をウサギのアミノ酸に置き換えた（図8参照）。さらに、いくつかのウサギのCDRの位置はヒトのアミノ酸に変更された。軽鎖可変ドメインでは、CDR1のKabat位置24と30をヒトのアミノ酸側鎖に置き換えた（図8）。重鎖CDR2のKabat位置61、62、63はヒトのアミノ酸に置換された。得られた重鎖および軽鎖配列の遺伝子を合成し、IgG1/kappa発現ベクターにクローニングした。ヒト化 68D4 (68D4-hum) を HEK293F 細胞から発現・精製した。68D4-humを、その親rb 68D4およびmAbAと、基本的に実施例3に記載のプロトコルに従ったELISAで比較した。
ヒトIgG 263E11は、68D4と類似しているため、Memo Therapeutics AGのヒトIgGデータベースから選択した。最初の手段として、ウサギ免疫グロブリン68D4のCDRを263E11可変ドメインフレームワークにグラフト化した。更なる変更をフレームワーク位置で行い、重鎖のKabat位置27、28、29と94をウサギのアミノ酸に置き換えた（図8参照）。さらに、いくつかのウサギのCDRの位置はヒトのアミノ酸に変更された。軽鎖可変ドメインでは、CDR1のKabat位置24と30をヒトのアミノ酸側鎖に置き換えた（図8）。重鎖CDR2のKabat位置61、62、63はヒトのアミノ酸に置換された。得られた重鎖および軽鎖配列の遺伝子を合成し、IgG1/kappa発現ベクターにクローニングした。ヒト化 68D4 (68D4-hum) を HEK293F 細胞から発現・精製した。68D4-humを、その親rb 68D4およびmAbAと、基本的に実施例3に記載のプロトコルに従ったELISAで比較した。
【0136】
抗原としては、Siglec-9の細胞外ドメインとC末端のhis-tagを融合したものを使用した。
【0137】
結合したIgGの検出には、ポリクローナル抗ウサギIgG抗体（68D4; Biolegend, #406401）、または抗ヒトFcγ断片（ヒト化68D4およびmAbA; Jackson Immuno Research laboratories, # 109-035-098）が使用された。その結果、68D4をヒト化することで、ウサギの68D4と比較して、結合能がやや低下した高親和性のSiglec-9バインダーが得られることが確認された（図9）。Siglec-9の結合能は、マウス可変ドメインをヒトIgG Fcで発現させたmAbAと同等である。
【0138】
ヒト化抗Siglec-9抗体68D4のアミノ酸配列。
【表5】
【0139】
ウサギ/ヒト化抗Siglec-9抗体 68D4 のCDRアミノ酸配列。
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】