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特表2023-504059アスペルギルス・ニガーからのベータ－フルクトフラノシダーゼの製造のための核酸、ベクター、宿主細胞及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】アスペルギルス・ニガーからのベータ－フルクトフラノシダーゼの製造のための核酸、ベクター、宿主細胞及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/56 20060101AFI20230125BHJP
C12N 9/26 20060101ALI20230125BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230125BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230125BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230125BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230125BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230125BHJP
C12P 19/00 20060101ALI20230125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/56 ZNA
C12N9/26 Z
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12P21/02 C
C07K19/00
C12P19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022530994
(86)(22)【出願日】2020-11-27
(85)【翻訳文提出日】2022-07-25
(86)【国際出願番号】 IN2020050985
(87)【国際公開番号】W WO2021106016
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】201941048686
(32)【優先日】2019-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522207202
【氏名又は名称】レベレイションズ バイオテック プライベート リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100170852
【弁理士】
【氏名又は名称】白樫 依子
(72)【発明者】
【氏名】ラビ チャンドラ ベエラム
(72)【発明者】
【氏名】ディパンウィタ シンハ
(72)【発明者】
【氏名】バラース バブ ムスク
(72)【発明者】
【氏名】チランジービ アレ
(72)【発明者】
【氏名】ディーピカ クマール
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD03
4B050LL01
4B050LL02
4B064AF04
4B064AG01
4B064CA06
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA57Y
4B065AA62Y
4B065AA72Y
4B065AA77X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB02
4B065CA21
4B065CA31
4B065CA41
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA10
4H045CA15
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、アスペルギルス・ニガーからのベータ－フルクトフラノシダーゼの製造のための核酸、ベクター、宿主細胞及び方法を提供する。本発明は、遺伝子操作の分野における進歩となり、分泌タンパク質としてのアスペルギルス・ニガーのｆｏｐＡ遺伝子によりコードされる新規の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの高い収率を得る方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＦＡＫ、ＦＡＫＳ、ＡＴ、ＡＡ、ＧＡ、ＩＮ、ＩＶ、ＫＰ、ＬＺ及びＳＡ又はこれらのバリアントを含む群から選択されるシグナルペプチドに融合した配列番号１のアミノ酸配列を含むアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼである、前記改変されたポリペプチド。
【請求項2】
ａ． ＦＡＫが配列番号３又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、ｂ． ＦＡＫＳが配列番号４又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｃ． ＡＴが配列番号５又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｄ． ＡＡが配列番号６又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｅ． ＧＡが配列番号７又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｆ． ＩＮが配列番号８又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｇ． ＩＶが配列番号９又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｈ． ＫＰが配列番号１０又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
ｉ． ＬＺが配列番号１１又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、及び
ｊ． ＳＡが配列番号１２又はそのバリアントのアミノ酸配列を含み、
且つ前記シグナルペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの細胞外分泌を可能にする、
請求項１に記載の改変されたポリペプチド。
【請求項3】
配列番号２のヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項4】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項5】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及びこれらのバリアントを含む群から選択される、請求項４に記載の核酸。
【請求項6】
プロモーターに作動可能に連結した請求項３又は請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項7】
β－フルクトフラノシダーゼ遺伝子の前記プロモーターが、ＡＯＸ１、ＡＤＨ３、ＤＡＳ、ＦＬＤ１、ＬＲＡ３、ＴＨＩ１１、ＧＡＰ、ＹＰＴ１、ＴＥＦ１、ＧＣｗ１４及びＰＧＫ１を含む群から選択される、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項8】
ベクターが、ｐＰＩＣＺαＡ、ｐＰＩＣＺαＢ、ｐＰＩＣＺαＣ、ｐＧＡＰＺαＡ、ｐＧＡＰＺαＢ、ｐＧＡＰＺαＣ、ｐＰＩＣ３、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ＰＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ＩＬ－Ｄ２、ｐＨＩＬ－Ｓ１、及び配列番号１に示されるアスペルギルス・ニガーからのβ－フルクトフラノシダーゼの分泌発現又は細胞内発現のために構成された発現ベクターを含む群から選択される、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項9】
請求項６に記載の発現ベクターを含む組換えピキア・パストリス宿主細胞。
【請求項10】
前記宿主細胞が、ピキア・パストリスＭｕｔ＋、Ｍｕｔ Ｓ、Ｍｕｔ－、ピキア・パストリスＫＭ７１Ｈ、ピキア・パストリスＫＭ７１、ピキア・パストリスＳＭＤ１１６８Ｈ、ピキア・パストリスＳＭＤ１１６８、ピキア・パストリスＸ３３、ピキア・パストリスＧＳ１１５又は任意の他のピキア・パストリス宿主株を含む群から選択される、請求項９に記載の組換えピキア・パストリス宿主細胞。
【請求項11】
配列番号１に示されるアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼを発現することができる組換えピキア・パストリス宿主細胞を製造する方法であって、ａ．配列番号１又はそのバリアントに示されるアスペルギルス・ニガーからのβ－フルクトフラノシダーゼをコードする改変された核酸を合成するステップ、
ｂ．前記改変された核酸を宿すベクターを構築するステップ、及び
ｃ．ステップ（ｂ）の前記ベクターを用いてピキア・パストリス宿主細胞を形質転換して組換えピキア・パストリス宿主細胞を得るステップ
を含む、前記方法。
【請求項12】
配列番号１に示されるアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼを高いレベルで発現させる方法であって、ａ．配列番号１に示されるアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼを発現することができる組換えピキア・パストリス宿主細胞を好適な発酵培地中で培養して発酵ブロスを得ること、
ｂ．上清を前記発酵ブロスから採取することであって、前記上清が組換えβ－フルクトフラノシダーゼを含有する、前記採取すること、及び
ｃ．組換えβ－フルクトフラノシダーゼを精製すること
を含む、前記方法。
【請求項13】
前記発酵培地が基礎塩培地である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記発酵ブロスのｐＨが４．０～７．５の範囲内に維持される、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記発酵ブロスの温度が１５℃～４５℃の範囲内に維持される、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
フルクトオリゴ糖の製造における使用のための請求項１に記載の改変されたポリペプチド又はその断片。
【請求項17】
前記断片が、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７を含む群から選択される、請求項１６に記載のフルクトオリゴ糖の製造における使用のための改変されたポリペプチド又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は遺伝子操作の分野に関する。より特には、本発明は、分泌タンパク質としてアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のｆｏｐＡ遺伝子によりコードされる新規の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの改良された製造を得ることに向けられている。
【背景技術】
【0002】
フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）としても公知のフルクトースオリゴマーは、一連の同種オリゴ糖を構成する。フルクトオリゴ糖は通常、式ＧＦnにより表され、１－ケストース（ＧＦ２）、ニストース（ＧＦ３）及びβ－フルクトフラノシルニストース（ＧＦ４）から主に構成され、２、３、及び４つのフルクトシル単位がグルコースのβ－２，１位において結合している。
【0003】
フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、多くの有益な特性、例えば低い甘味強度及びプレバイオティクスとしての有用性により特徴付けられる。低い甘味強度（スクロースと比較して約１／３～２／３）及び低いカロリー値（約０～３ｋｃａｌ／ｇ）に起因して、フルクトオリゴ糖は、様々な種類の食品において糖代用物として使用され得る。さらに、プレバイオティクスとして、フルクトオリゴ糖は、結腸がんに対する保護剤、免疫系の様々なパラメーターの増強、鉱物吸着の向上、血清脂質及びコレステロール濃度に対する有益な効果並びに肥満症及び糖尿病の制御のための血糖制御の発揮において使用されることが報告されている（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ， Ａｎａ Ｌｕｉｓａ， ｅｔ ａｌ． “Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｏｎ ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．“ Ｆｏｏｄ ａｎｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７．２ （２０１４）： ３２４－３３７．）。
【0004】
しかしながら、フルクトオリゴ糖は、果実、野菜、及び蜂蜜中の天然成分として微量でのみ見出される。そのような低い濃度に起因して、フルクトオリゴ糖を食品から抽出することは実際的に不可能である。
【0005】
フルクトオリゴ糖を酵素的合成を通じてスクロースから、トランスフルクトシル化活性を有する微生物酵素により製造する試みが為されている。しかしながら、先行する試みにおける大きな制約は、低い触媒効率、より低いＦＯＳ収率に繋がるグルコースによる酵素のフィードバック阻害、及び組換え宿主システム中で発現される酵素によるスクロースの変換のためのより長い期間の要求であった。さらに、トランスフルクトシル化活性を呈する微生物酵素の産業的製造は、酵素の大規模発現、酵素安定性、発酵及び精製過程と関連付けられる追加の制限に起因して課題となっている。
【0006】
フルクトオリゴ糖の商業規模の製造は効率的な酵素の同定及び大量製造を要求する。前述の制限に起因して、効率的なトランスフルクトシル化活性を有する微生物酵素の製造は、コスト上の問題があり、次いでそれはフルクトオリゴ糖の製造コストを増加させる。
【0007】
そのため、フルクトオリゴ糖の製造のコストを低下させる、優れたトランスフルクトシル化活性を有する微生物酵素を同定し、その製造のための効率的、安価且つ産業的に拡張可能な手段を提供することに対する必要性が長く存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明において解決されるべき技術的な問題は、アスペルギルス・ニガーの新規のβ－フルクトフラノシダーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＶＣ５＿ＡＳＰＮＧ）を同定し、且つその収率を向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
前記問題は、新規の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの高い収率を達成するために核酸配列、タンパク質配列、プロモーター、組換えベクター、宿主細胞及び分泌シグナルペプチドを操作することによるアスペルギルス・ニガーの新規のβ－フルクトフラノシダーゼの過剰発現により解決された。
【0010】
追加的に、発酵戦略を改変して、約２～５ｇｍ／Ｌの組換えβ－フルクトフラノシダーゼの高い収率が得られた。
【0011】
発明の概要
本発明は、新規のβ－フルクトフラノシダーゼの組換え発現のための核酸、タンパク質配列、ベクター及び宿主細胞に関する。本発明はまた、分泌タンパク質としての効率的な酵素のより高い収率の生成を可能にする、新規のβ－フルクトフラノシダーゼ酵素に融合したシグナルペプチドを含有する前駆体ペプチドに関する。
本発明は、新規のβ－フルクトフラノシダーゼの組換え発現のための核酸、タンパク質配列、ベクター及び宿主細胞に関する。本発明はまた、分泌タンパク質としての効率的な酵素のより高い収率の生成を可能にする、新規のβ－フルクトフラノシダーゼ酵素に融合したシグナルペプチドを含有する前駆体ペプチドに関する。
【0012】
本発明はまた、分泌タンパク質としての新規の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの発現方法に関する。β－フルクトフラノシダーゼ濃度は約２～５ｇｍ／Ｌであることが見出される。酵素は、濾過後にほぼ８５％の純度を呈し、これはコストのかかるクロマトグラフィー手順の必要性を排除する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
本開示の特徴は、添付の図面と組み合わせて解釈される以下の記載から充分に明らかとなる。図面は、本開示によるいくつかの実施形態を描写するに過ぎず、その範囲の限定として考慮されるべきではないという理解と共に、本開示は、添付の図面の使用を通じてさらに記載される。
【0014】
【0015】
配列の簡単な説明及び配列表
配列番号１ － 新規のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（６５４アミノ酸）
配列番号２ － 新規のβ－フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の改変された核酸配列（１９６５塩基対）
配列番号１ － 新規のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（６５４アミノ酸）
配列番号２ － 新規のβ－フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子の改変された核酸配列（１９６５塩基対）
【表1】
【0016】
全ての分泌シグナルペプチド配列中に、４アミノ酸（ＬＥＫＲ）のストレッチをプレタンパク質の効率的なＫｅｘ２プロセシングのために付加した。
【0017】
【表2】
【0018】
配列番号２３ － 分泌されるβ－フルクトフラノシダーゼをコードするｆｏｐＡ遺伝子のネイティブな核酸配列（１９６５塩基対）
【表3】
【0019】
定義
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、方法が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意のベクター、宿主細胞、方法及び組成物もまたベクター、宿主細胞、方法及び組成物の実施又は試験において使用され得るが、代表的な実例がここに記載される。
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、方法が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意のベクター、宿主細胞、方法及び組成物もまたベクター、宿主細胞、方法及び組成物の実施又は試験において使用され得るが、代表的な実例がここに記載される。
【0020】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限及び下限の間の各介在する値並びにその記載される範囲内の任意の他の記載される又は介在する値が方法及び組成物に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、これらのより小さい範囲に独立して含まれることができ、これらもまた方法及び組成物に包含され、但し、記載される範囲内の任意の特に除外される限度を条件とする。記載される範囲が限度のうちの１つ又は両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか又は両方を除外した範囲もまた方法及び組成物に含まれる。
【0021】
明確性のために別々の実施形態の文脈において記載される方法のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組合せで提供されてもよいことが認められる。反対に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈において記載される方法及び組成物の様々な特徴はまた、別々に又は任意の好適な部分的組合せで提供されてもよい。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数の指示対象を含むことが留意される。請求項は、任意の任意選択的な要素を除外するように記述され得ることがさらに留意される。そのため、この記載は、請求項の要素の記載との繋がりでの「単独で」（ｓｏｌｅｌｙ）、「のみ」（ｏｎｌｙ）及び同種のものなどの排他的な用語の使用又は「否定的」（ｎｅｇａｔｉｖｅ）限定の使用のための前提的基礎として役立つことが意図される。
【0022】
本開示を読んだ当業者に明らかなように、本出願に記載及び図示される個々の実施形態の各々は、本発明の方法の範囲又は精神から離れることなく他の任意の実施形態の特徴から容易に分離され得る又は該特徴と容易に組み合わせられ得る別々の構成要素及び特徴を有する。任意の記載される方法は、記載される事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
【0023】
「宿主細胞」という用語は、発現構築物の対象のためのレシピエントであり得る、又は該レシピエントであった、個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含む。本発明の目的のための宿主細胞は、本発明の目的のために好適に使用され得るピキア・パストリスの任意の株を指す。本発明の目的のために使用され得る株の例としては、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の野生型、ｍｕｔ＋、ｍｕｔ Ｓ、ｍｕｔ－株、例えばＫＭ７１Ｈ、ＫＭ７１、ＳＭＤ１１６８Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５、Ｘ３３が挙げられる。
【0024】
「組換え株」又は「組換え宿主細胞」という用語は、本発明の発現構築物又はベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞を指す。
【0025】
「発現ベクター」という用語は、宿主の形質転換後に挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計された任意のベクター、プラスミド又は媒体を指す。
【0026】
「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写が始まる場所を定義するＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位の直接的に上流又は５’末端に位置する。ＲＮＡポリメラーゼ及び必要な転写因子は、プロモーター配列に結合して転写を開始させる。プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターのいずれかであることができる。構成的プロモーターは、その関連付けられた遺伝子の絶え間ない転写を可能とするプロモーターであり、それらの発現は通常、環境的及び発生因子により条件付けされない。構成的プロモーターは遺伝子操作における非常に有用なツールであり、その理由は、構成的プロモーターは、誘導因子フリーの条件下で遺伝子発現を駆動し、多くの場合に、一般的に使用される誘導性プロモーターよりも良好な特徴を示すからである。誘導性プロモーターは、生物的又は非生物的及び化学的又は物理的因子の存在又は非存在により誘導されるプロモーターである。誘導性プロモーターは遺伝子操作における非常に強力なツールであり、その理由は、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現を、生物の発生若しくは成長のある特定のステージにおいて又は特定の組織若しくは細胞種中でオン又はオフすることができるからである。
【0027】
「作動可能に連結した」という用語は、単一の核酸断片上での核酸配列の関連付けであって、一方の機能が他方により調節されるようなものを指す。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現を調節することができる（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合に、そのコーディング配列と作動可能に連結している。
【0028】
「転写」という用語は、遺伝子配列のＲＮＡコピーを作るプロセスを指す。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と呼ばれるこのコピーは、細胞核を離れて細胞質に入り、そこでそれがコードするタンパク質の合成を指令する。
【0029】
「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の配列をタンパク質合成の間にアミノ酸の配列に翻訳するプロセスを指す。遺伝コードは、遺伝子中の塩基対の配列及びそれがコードする対応するアミノ酸配列の間の関係性を記述する。細胞質中で、リボソームはｍＲＮＡの配列を３塩基の群で読み取って、タンパク質に集合させる。
【0030】
「発現」という用語は、コーディング配列によりコードされる産物の生物学的産生を指す。ほとんどの場合に、コーディング配列を含めて、ＤＮＡ配列は、転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が形成される。メッセンジャーＲＮＡは次に翻訳されて、関連する生物学的活性を有するポリペプチド産物が形成される。また、発現のプロセスは、転写のＲＮＡ産物に対するさらなるプロセシングステップ、例えばイントロンを除去するためのスプライシング、及び／又はポリペプチド産物の翻訳後プロセシングを伴い得る。
【0031】
「改変された核酸」という用語は、本明細書において使用される場合、シグナルペプチドに融合したβ－フルクトフラノシダーゼをコードする核酸を指すために使用される。実施形態において、改変された核酸は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２又はこれらの機能的に同等のバリアントにより表される。機能的なバリアントとしては、配列番号１３～２２に対して実質的な又は著しい配列同一性又は類似性を有し、且つその生物学的活性を保持する任意の核酸が挙げられる。
【0032】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合又は改変されたペプチド結合により互いに接合された２つ又はそれより多くのアミノ酸残基を指すために本明細書において交換可能に使用される。該用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーの他に、天然に存在するアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含有するもの、及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと一般的に称される短い鎖、及びタンパク質と一般に称されるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。同様に、「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を指し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、又は合成のペプチド模倣物構造から作られていてもよい。そのため、「アミノ酸」、又は「ペプチド残基」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。「アミノ酸」は、イミノ酸残基、例えばプロリン及びヒドロキシプロリンを含む。側鎖は、（Ｒ）配置又は（Ｓ）配置のいずれにあってもよい。
【0033】
「シグナルペプチド」又は「シグナルペプチド配列」という用語は、新たに合成された分泌又は膜ポリペプチドのＮ末端に通常存在し、細胞の細胞膜（原核生物における形質膜及び真核生物における小胞体膜）を越えるように又はその中にポリペプチドを方向付けるペプチド配列として本明細書において定義される。それは通常その後に除去される。特に、前記シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付けることが可能であり得る。
【0034】
「前駆体ペプチド」という用語は、本明細書において使用される場合、アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼに作動可能に連結したシグナルペプチド（リーダー配列としても公知）を含むペプチドを指す。シグナルペプチドは、ピキア宿主細胞の内側で翻訳後修飾の間に切断され、成熟β－フルクトフラノシダーゼ（配列番号１）は培地中に放出される。
【0035】
「バリアント」という用語は、前駆体ペプチド／タンパク質に関して本明細書において使用される場合、シグナルペプチド又は酵素の活性を実質的に減少させないアミノ酸置換、付加、欠失又は変更を有するペプチドを指す。バリアントとしては、構造的バリアントの他に、機能的バリアントが挙げられる。バリアントという用語はまた、非置換の親アミノ酸の代わりの置換されたアミノ酸の使用を含む。
【0036】
機能的に類似したアミノ酸を提供するアミノ酸置換表は当業者に周知である。以下の６つの群は、互いにバリアントであると考えられるアミノ酸の例である：
【0037】
【表4】
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、分泌タンパク質としてのアスペルギルス・ニガーの生物学的に活性且つ可溶性の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの効率的な製造のための核酸、ベクター及び組換え宿主細胞を開示する。さらに、本発明は、組換えβ－フルクトフラノシダーゼの商業規模の製造の方法を提供する。
【0039】
本発明は、異種宿主中での新規の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの高い収率を達成するための多次元的なアプローチを想定する。β－フルクトフラノシダーゼのネイティブな遺伝子は、ピキア・パストリス中での発現のために改変されている。さらに、改変された遺伝子は、１つ又は複数のシグナルペプチドに融合している。
【0040】
１つの実施形態において、アスペルギルス・ニガーの新規のβ－フルクトフラノシダーゼをコードする改変された核酸は配列番号２により表される。
【0041】
別の実施形態において、改変された核酸は、１つ又は複数のシグナルペプチドに融合している。
【0042】
別の実施形態において、シグナルペプチドは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルファ因子（ＦＡＫ）、Ｓ．セレビシエのＳ．セレビシエのアルファ因子全体（ＦＡＫＳ）、Ｓ．セレビシエのアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）、アスペルギルス・ニガーのアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ＧＡ）、クルイベロミセス・マキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｘｉａｎｕｓ）のイヌリナーゼ（ＩＮ）、Ｓ．セレビシエのインベルターゼ（ＩＶ）、Ｓ．セレビシエのキラータンパク質（ＫＰ）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）のリゾチーム（ＬＺ）、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の血清アルブミン（ＳＡ）から選択される。
【0043】
別の実施形態において、シグナルペプチドは以下の表５において提供される。
【0044】
【表5】
【0045】
別の実施形態において、シグナルペプチドは、表１に記載されるような改変されたシグナルペプチドのリストから選択される。
【0046】
別の実施形態において、１つ又は複数の改変されたシグナルペプチドに融合した核酸は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及びこれらのバリアントを含む群から選択される。
【0047】
別の実施形態において、改変された核酸は、発現ベクター中にクローニングされる。
【0048】
別の実施形態において、発現ベクターは、アスペルギルス・ニガーからの組換えβ－フルクトフラノシダーゼの分泌発現又は細胞内発現のために構成される。
【0049】
さらに別の実施形態において、発現ベクターは、ｐＰＩＣＺαＡ、ｐＰＩＣＺαＢ、ｐＰＩＣＺαＣ、ｐＧＡＰＺαＡ、ｐＧＡＰＺαＢ、ｐＧＡＰＺαＣ、ｐＰＩＣ３、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ＰＡＯ８１５、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ＩＬ－Ｄ２及びｐＨＩＬ－Ｓ１を含む群から選択される。
【0050】
シグナルペプチドに融合した改変されたβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子の発現は、好ましくは、構成的又は誘導性プロモーターにより駆動される。
【0051】
別の実施形態において、発現されるべき核酸は、プロモーターに作動可能に連結している。
【0052】
別の実施形態において、構成的な又は誘導性プロモーターは、表６に列記される群から選択される。
【0053】
【表6】
【0054】
別の実施形態において、プロモーターはＡＯＸ１プロモーターであり、これはメタノールにより誘導され、グルコースにより抑制される。
【0055】
実施形態において、関心対象の改変された遺伝子（シグナルペプチドをコードする核酸に融合したβ－フルクトフラノシダーゼ遺伝子）を含有する発現ベクターにより適切な宿主は形質転換される。
【0056】
別の実施形態において、関心対象の遺伝子を含有する発現ベクターにより酵母細胞は形質転換される。
【0057】
別の実施形態において、酵母細胞はピキア・パストリスである。
【0058】
さらに別の実施形態において、ピキア・パストリス宿主細胞は、ｍｕｔ＋、ｍｕｔ Ｓ又はｍｕｔ－株である。Ｍｕｔ＋は、メタノール利用プラスの表現型を表す。
【0059】
さらに別の実施形態において、ピキア・パストリス宿主細胞株は、ＫＭ７１Ｈ、ＫＭ７１、ＳＭＤ１１６８Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５、Ｘ３３を含む群から選択される。
【0060】
別の実施形態において、本発明は、β－フルクトフラノシダーゼ前駆体ペプチドであって、アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼが１つ又は複数のシグナルペプチドに融合している、β－フルクトフラノシダーゼ前駆体ペプチドを提供する。
【0061】
別の実施形態において、アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼは、配列番号１及びその機能的なバリアントに示されるアミノ酸配列を有する。機能的なバリアントとしては、配列番号１に対して実質的な若しくは著しい配列同一性若しくは類似性を有し、且つ又は（ａｎｄ ｏｒ）配列番号１に対して実質的な若しくは著しい構造同一性若しくは類似性を有し、且つその生物学的活性を保持する任意のタンパク質配列が挙げられる。
【0062】
別の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号３に示されるＳ．セレビシエのアルファ因子全体（ＦＡＫ）、配列番号４に示されるＳ．セレビシエのアルファ因子全体（ＦＡＫＳ）、配列番号５に示されるＳ．セレビシエのアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）、配列番号６に示されるアスペルギルス・ニガーのアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）、配列番号７に示されるアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ＧＡ）、配列番号８に示されるクルイベロミセス・マキシアヌスのイヌリナーゼ（ＩＮ）、配列番号９に示されるＳ．セレビシエのインベルターゼ（ＩＶ）、配列番号１０に示されるＳ．セレビシエのキラータンパク質（ＫＰ）、配列番号１１に示されるセキショクヤケイのリゾチーム（ＬＺ）、配列番号１２に示されるホモサピエンスの血清アルブミン（ＳＡ）、及びこれらのバリアントを含む群から選択される。
【0063】
実施形態において、アスペルギルス・ニガーの組換えβ－フルクトフラノシダーゼの製造方法が提供される。
【0064】
本発明の態様は、改変された組換えβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子を含有する組換えピキア・パストリス細胞の発酵に関する。発酵の完了後に、発酵ブロスは遠心分離に供され、精密濾過を使用して濾過され、組換え酵素は分離される。回収された組換え酵素は、タンジェンシャルフロー限外濾過又は蒸発を使用して濃縮され、そして濃縮された酵素は製剤化される。
【0065】
１つの実施形態において、アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼを高いレベルで発現させる方法は、
ａ．組換え宿主細胞を好適な発酵培地中で培養して、発酵ブロス中に分泌された組換えβ－フルクトフラノシダーゼ酵素を得るステップ、
ｂ．上清を発酵ブロスから採取するステップであって、上清が組換えβ－フルクトフラノシダーゼを含有する、採取するステップ、及び
ｃ．組換えβ－フルクトフラノシダーゼを精製するステップ
を含む。
ａ．組換え宿主細胞を好適な発酵培地中で培養して、発酵ブロス中に分泌された組換えβ－フルクトフラノシダーゼ酵素を得るステップ、
ｂ．上清を発酵ブロスから採取するステップであって、上清が組換えβ－フルクトフラノシダーゼを含有する、採取するステップ、及び
ｃ．組換えβ－フルクトフラノシダーゼを精製するステップ
を含む。
【0066】
別の実施形態において、発酵培地は、表７に記載されるような基礎塩培地（ｂａｓａｌ ｓａｌｔ ｍｅｄｉｕｍ）である。
【0067】
さらに別の実施形態において、発酵ブロスからの上清は、遠心分離を使用して採取される。
【0068】
１つの実施形態において、発酵槽培養を開始させるための接種物又は出発培養物のパーセンテージは２．０％～１５．０％（ｖ／ｖ）の範囲内である。
【0069】
別の実施形態において、発酵培地のｐＨは、４．０～７．５の範囲内に維持され、分泌された酵素は適切なフォールディングを受け、このｐＨ範囲において生物学的に活性である。
【0070】
さらに別の実施形態において、発酵過程の温度は１５℃～４０℃の範囲内である。
【0071】
別の実施形態において、発酵過程の時間は５０～１５０時間の範囲内である。
【0072】
さらなる実施形態において、発酵ブロスは、連続的なオンライン遠心分離を使用して２０００×ｇ～１５０００×ｇの範囲内の速度で遠心分離される。
【0073】
遠心分離後に得られた上清は、精密濾過に供されて精製されて、生物学的に活性の組換えβ－フルクトフラノシダーゼが回収される。
【0074】
１つの実施形態において、遠心分離後に得られた上清は、タンジェンシャルフロー濾過ベースの限外濾過システムを使用して濃縮される。
【0075】
不純物を除去するため及び収集された培養上清を濃縮するために使用され得るタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムにおいて使用される膜のカットオフサイズは５～１００ｋＤａの範囲であってもよい。
【0076】
別の実施形態において、分泌された酵素の高い収率及び純度に起因して遠心分離は方法のために要求されない。
【0077】
本発明において得られるβ－フルクトフラノシダーゼ濃度は２～５ｇｍ／Ｌの範囲内であることが見出され、純度は約８５％である。
【実施例】
【0078】
以下の実施例は、本発明が行われる方式を特に記載する。しかしながら、本明細書に開示される実施形態は、いかなるようにも本発明の範囲を限定しない。
【0079】
実施例１：ピキア・パストリス中でのアスペルギルス・ニガーの組換えβ－フルクトフラノシダーゼの発現のための改変された核酸
アスペルギルス・ニガーのネイティブなβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）のｃＤＮＡは配列番号２３により表され、新規のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は配列番号１により表される。
アスペルギルス・ニガーのネイティブなβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）のｃＤＮＡは配列番号２３により表され、新規のβ－フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は配列番号１により表される。
【0080】
ピキア・パストリス中での発現を最大化させるためにネイティブなｃＤＮＡを改変した。改変された核酸は配列番号２により表される。ネイティブな配列及び改変された配列の間の差異は図１において描写される。
【0081】
ピキア・パストリス中での発現を最大化させるために、β－フルクトフラノシダーゼをコードする発現カセットを改変した。改変されたオープンリーディングフレームは、シグナルペプチドに融合したβ－フルクトフラノシダーゼをコードする改変されたヌクレオチド配列（配列番号２）を含有する。コードされるシグナルペプチドが前駆体ペプチドの効率的なＫｅｘ２プロセシングのために４アミノ酸（ＬＥＫＲ）の追加のストレッチを含有するように核酸を設計した。
【0082】
ピキア・パストリス中での発現のために好ましいコドンを希少コドンの代わりに使用した。
【0083】
改変されたシグナルペプチドと融合したβ－フルクトフラノシダーゼをコードする改変されたオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は以下に与えられる：
・Ｓ．セレビシエのアルファ因子（ＦＡＫ）は配列番号１３により表される
・Ｓ．セレビシエのアルファ因子全体（ＦＡＫＳ）は配列番号１４により表される
・Ｓ．セレビシエのアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）は配列番号１５により表される
・アスペルギルス・ニガーのアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）は配列番号１６により表される
・アスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ＧＡ）は配列番号１７により表される
・クルイベロミセス・マキシアヌスのイヌリナーゼ（ＩＮ）は配列番号１８により表される
・Ｓ．セレビシエのインベルターゼ（ＩＶ）は配列番号１９により表される
・Ｓ．セレビシエのキラータンパク質（ＫＰ）は配列番号２０により表される
・セキショクヤケイのリゾチーム（ＬＺ）は配列番号２１により表される
・ホモサピエンスの血清アルブミン（ＳＡ）は配列番号２２により表される。
・Ｓ．セレビシエのアルファ因子（ＦＡＫ）は配列番号１３により表される
・Ｓ．セレビシエのアルファ因子全体（ＦＡＫＳ）は配列番号１４により表される
・Ｓ．セレビシエのアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）は配列番号１５により表される
・アスペルギルス・ニガーのアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）は配列番号１６により表される
・アスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ＧＡ）は配列番号１７により表される
・クルイベロミセス・マキシアヌスのイヌリナーゼ（ＩＮ）は配列番号１８により表される
・Ｓ．セレビシエのインベルターゼ（ＩＶ）は配列番号１９により表される
・Ｓ．セレビシエのキラータンパク質（ＫＰ）は配列番号２０により表される
・セキショクヤケイのリゾチーム（ＬＺ）は配列番号２１により表される
・ホモサピエンスの血清アルブミン（ＳＡ）は配列番号２２により表される。
【0084】
配列番号１３の核酸配列は、化学的に合成してｐＰＩＣＺαＡベクターにクローニングし、残りの改変された核酸配列は、配列番号１３の発現カセットを鋳型として使用してオーバーラップ伸長ＰＣＲにより生成した。
【0085】
実施例２：シグナルペプチドに融合したβ－フルクトフラノシダーゼのポリペプチド配列
シグナルペプチドと融合したアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を翻訳することにより組換え前駆体タンパク質を得た。
シグナルペプチドと融合したアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子を翻訳することにより組換え前駆体タンパク質を得た。
【0086】
改変された前駆体ペプチドにおいて使用されたシグナルペプチドは、配列番号３により表されるＳ．セレビシエのアルファ因子（ＦＡＫ）、配列番号４により表されるＳ．セレビシエのアルファ因子全体（ＦＡＫＳ）、配列番号５により表されるＳ．セレビシエのアルファ因子＿Ｔ（ＡＴ）、配列番号６により表されるアスペルギルス・ニガーのアルファ－アミラーゼ（ＡＡ）、配列番号７により表されるアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ＧＡ）、配列番号８により表されるクルイベロミセス・マキシアヌスのイヌリナーゼ（ＩＮ）、配列番号９により表されるＳ．セレビシエのインベルターゼ（ＩＶ）、配列番号１０により表されるＳ．セレビシエのキラータンパク質（ＫＰ）、配列番号１１により表されるセキショクヤケイのリゾチーム（ＬＺ）及び配列番号１２により表されるホモサピエンスの血清アルブミン（ＳＡ）であった。改変されたシグナルペプチドは、前駆体ペプチドの効率的なＫｅｘ２プロセシングのために４アミノ酸（ＬＥＫＲ）の追加のストレッチを含有する。
【0087】
シグナルペプチドは、ピキア宿主細胞の内側で翻訳後修飾の間に切断され、配列番号１のアミノ酸配列を含む成熟組換えβ－フルクトフラノシダーゼは培地に放出される。
【0088】
実施例３：組換えプラスミドでの形質転換による組換え宿主細胞の開発
方法において使用されたベクターはｐＰＩＣＺαＡであった。ベクターは、実施例１に記載されるような改変されたオープンリーディングフレーム及び誘導性プロモーター、ＡＯＸ１を含有した。組換えタンパク質をコードする改変された配列をｐＰＩＣＺαＡベクターにクローニングした。
方法において使用されたベクターはｐＰＩＣＺαＡであった。ベクターは、実施例１に記載されるような改変されたオープンリーディングフレーム及び誘導性プロモーター、ＡＯＸ１を含有した。組換えタンパク質をコードする改変された配列をｐＰＩＣＺαＡベクターにクローニングした。
【0089】
通常の分子生物学的手順を使用して、β－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子をコードする配列番号２の改変された核酸を、ｐＰＩＣＺαＡベクターのＭＣＳ中に存在するＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ制限部位の間にクローニングし、Ｓ．セレビシエのシグナル配列アルファ因子（ＦＡＫ）とインフレームとし、配列番号１３の発現カセットを作出した。ｐＰＩＣＺαＡのベクターマップを図２に表す。
【0090】
２５μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する低塩－ＬＢ培地上で推定上の組換えプラスミドを選択し、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ制限消化分析によりスクリーニングした。
【0091】
組換えプラスミドｐＰＩＣＺαＡ－ｆｏｐＡをＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ制限消化分析により確認したところ、１９８０ｂｐ断片の放出が結果としてもたらされた。制限消化分析の結果を図３に描写する。
【0092】
その後、ピキア・パストリスＫＭ７１Ｈ細胞に直線化組換えｐＰＩＣＺαＡ－ｆｏｐＡ ＤＮＡをエレクトロポレートした。ピキア組込み体を、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する酵母抽出物ペプトンデキストロースソルビトール寒天（ＹＰＤＳＡ）上で選択した。
【0093】
組込みをコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）でスクリーニングした。ｃＰＣＲのために、ピキア組込み体の各々からの鋳型をアルカリ溶解法により生成した。コロニーＰＣＲスクリーニングの結果を図４に描写する。
【0094】
ピキア組込み体をＢＭＤ１培地中で４８ｈ生育し、最初にＢＭＭ２、次に連続的にＢＭＭ１０培地でさらに誘導したところ、培養培地中に０．５％のメタノールの最終濃度が提供された。９６時間の誘導期間の終わりに、異なるクローンからの培養上清を採取した。採取された上清の各々からの全タンパク質を２０％のＴＣＡで沈殿させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
【0095】
誘導によりβ－フルクトフラノシダーゼタンパク質バンドは、図５に描写されるように約１１０ｋＤａのサイズに見られた。
【0096】
算出された分子量は約７０．８５ｋＤａであった。分子量の増加にはグリコシル化が寄与した可能性がある。
【0097】
実施例４：アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼを発現する組換えピキア・パストリスの発酵
実施例１に記載されるような改変されたβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子を含有する組換えピキア・パストリス細胞の発酵を５０Ｌ発酵槽中で実行した。発酵は、本明細書に記載されるような基礎塩培地中で実行した。選択された組換え宿主はＫＭ７１Ｈであり、これは、遅い方式でメタノールを代謝するｍｕｔ Ｓ株である。
実施例１に記載されるような改変されたβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子を含有する組換えピキア・パストリス細胞の発酵を５０Ｌ発酵槽中で実行した。発酵は、本明細書に記載されるような基礎塩培地中で実行した。選択された組換え宿主はＫＭ７１Ｈであり、これは、遅い方式でメタノールを代謝するｍｕｔ Ｓ株である。
【0098】
予備種（ｐｒｅ－ｓｅｅｄ）及び種接種物（ｓｅｅｄ ｉｎｏｃｕｌｕｍ）の調製：
予備種は、グリセロールストックから２５ｍＬの無菌ＹＥＰＧ培地中に接種し、温度制御されたオービタルシェーカー中３０℃で終夜生育することにより生成した。種を生成するために、１５～２５のＯＤ600に達するまで、温度制御されたオービタルシェーカー中３０℃で流れを調節されたシェークフラスコ中の基礎塩培地中で接種物を生育した。
予備種は、グリセロールストックから２５ｍＬの無菌ＹＥＰＧ培地中に接種し、温度制御されたオービタルシェーカー中３０℃で終夜生育することにより生成した。種を生成するために、１５～２５のＯＤ600に達するまで、温度制御されたオービタルシェーカー中３０℃で流れを調節されたシェークフラスコ中の基礎塩培地中で接種物を生育した。
【0099】
発酵過程
発酵槽への種培養物の接種から最終採取までの発酵の全過程は約１３０時間を要した。基礎塩培地を調製し、発酵槽中インサイチューで滅菌した。
発酵槽への種培養物の接種から最終採取までの発酵の全過程は約１３０時間を要した。基礎塩培地を調製し、発酵槽中インサイチューで滅菌した。
【0100】
発酵過程のために最適化された基礎塩培地の組成を表７に提供する。
【0101】
【表7】
【0102】
ピキア微量鉱物（Ｐｉｃｈｉａ Ｔｒａｃｅ Ｍｉｎｅｒａｌｓ；ＰＴＭ）塩溶液を表８に記載されるように調製した。ＰＴＭ塩を溶解させ、１Ｌの体積とし、フィルター滅菌した。ＰＴＭ塩溶液を、基礎塩培地の滅菌後に初期培地体積１リットル当たり４ｍｌの比率で含めた。
【0103】
【表8】
【0104】
増殖期：
増殖期は、５０Ｌ発酵槽中の基礎塩培地に５％の種培養物を接種することにより開始され、約２４時間継続する。溶解酸素（ＤＯ）レベルを連続的にモニターし、決して４０％を下回らないようにした。
増殖期は、５０Ｌ発酵槽中の基礎塩培地に５％の種培養物を接種することにより開始され、約２４時間継続する。溶解酸素（ＤＯ）レベルを連続的にモニターし、決して４０％を下回らないようにした。
【0105】
１８ｈ後に、炭素供給源（グリセロール）の枯渇を指し示すＤＯスパイクが観察された。ＯＤ600が２００に達するまで５０％のグリセロール（供給１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ塩を含む）を約６時間供給することによりグリセロールフェドバッチを開始させた。
【0106】
誘導期：
充分なバイオマスが生成されたら、グリセロール供給を中止し、メタノール供給を開始することにより誘導期を開始させた。メタノール（供給１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ塩を補充した）を初期発酵体積１リットル当たり０．５ｇ～３ｇの比率で供給した。ＤＯを４０％に維持し、メタノール供給をこれに伴って調整した。
充分なバイオマスが生成されたら、グリセロール供給を中止し、メタノール供給を開始することにより誘導期を開始させた。メタノール（供給１リットル当たり１２ｍｌのＰＴＭ塩を補充した）を初期発酵体積１リットル当たり０．５ｇ～３ｇの比率で供給した。ＤＯを４０％に維持し、メタノール供給をこれに伴って調整した。
【0107】
酵素活性アッセイにより培養上清を分析することによりβ－フルクトフラノシダーゼ（ｆｏｐＡ）遺伝子の誘導を定期的にモニターした。ＯＤ600が６００に達し、湿潤バイオマスが培養ブロス１リットル当たり約５６０グラムに達するまで誘導期を約１００時間継続した。
【0108】
発酵を１３０時間後に中止し、発酵の終わりに発酵槽ブロス中の酵素活性は、ＤＮＳ法（Ｍｉｌｌｅｒ， １９５９）により１０５７３単位であると決定された。１単位は、５５℃のｐＨ５．５の１００ｍＭのクエン酸緩衝液中の１０％のスクロース溶液から１マイクロモルの還元糖（グルコース当量）を放出させるために要求される酵素の量として定義される。培養ブロス中の組換えβ－フルクトフラノシダーゼの総量をブラッドフォードアッセイにより推定した。
【0109】
発酵条件：
考慮された発酵パラメーターを表９に与えた。これらの必須パラメーターを発酵過程の間にモニターした。
考慮された発酵パラメーターを表９に与えた。これらの必須パラメーターを発酵過程の間にモニターした。
【0110】
【表9】
【0111】
実施例５：細胞採取及び精製
８０００ＲＰＭでの連続的な遠心分離により酵素の採取を行う。遠心分離後に得られた透明な上清を、０．１ミクロンカットオフの渦巻き形ＴＦＦ膜を使用する精密濾過に供した。濾液を、１０ｋＤａカットオフの渦巻き形ＴＦＦ膜を使用する限外濾過及びダイアフィルトレーションにさらに供し、所望の活性に達するように充分に濃縮した。３５～５０％のグリセロール及び食品グレード防腐剤を最終調製物中に含めることにより酵素を処方した。酵素の最終純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析による決定で８５％であると観察された。
８０００ＲＰＭでの連続的な遠心分離により酵素の採取を行う。遠心分離後に得られた透明な上清を、０．１ミクロンカットオフの渦巻き形ＴＦＦ膜を使用する精密濾過に供した。濾液を、１０ｋＤａカットオフの渦巻き形ＴＦＦ膜を使用する限外濾過及びダイアフィルトレーションにさらに供し、所望の活性に達するように充分に濃縮した。３５～５０％のグリセロール及び食品グレード防腐剤を最終調製物中に含めることにより酵素を処方した。酵素の最終純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析による決定で８５％であると観察された。
【0112】
図６（ａ）は、組換えβ－フルクトフラノシダーゼ酵素を発現するピキア・パストリスＫＭ７１Ｈ株の発酵の間に異なる時間間隔で収集された試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を描写する。図６（ｂ）は、精製後の組換えβ－フルクトフラノシダーゼ酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を描写する。
【0113】
β－フルクトフラノシダーゼ濃度は約２．４ｇｍ／Ｌであることが見出された。バッチのほとんどにおいて、濃度は２～５ｇｍ／Ｌであった。組換えβ－フルクトフラノシダーゼの純度は約８５％であることが観察された。
【0114】
実施例６：β－フルクトフラノシダーゼ活性の推定
β－フルクトフラノシダーゼの活性を推定するための研究を実行した。推定研究のために、β－フルクトフラノシダーゼ酵素の作用に起因して生成された還元糖の量を、ＤＮＳ（３，５ジニトロサリチル酸）法（Ｇ． Ｌ． Ｍｉｌｌｅｒ， “Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ”， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， １９５９， ３１， ４２６－４２８）を使用して算出した。
β－フルクトフラノシダーゼの活性を推定するための研究を実行した。推定研究のために、β－フルクトフラノシダーゼ酵素の作用に起因して生成された還元糖の量を、ＤＮＳ（３，５ジニトロサリチル酸）法（Ｇ． Ｌ． Ｍｉｌｌｅｒ， “Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ”， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， １９５９， ３１， ４２６－４２８）を使用して算出した。
【0115】
酵素活性アッセイを実行するために、１０％のスクロース（１００ｍＭのクエン酸緩衝液中に溶解）を基質として使用した。β－フルクトフラノシダーゼを発酵ブロスから回収し、限外濾過（ｕｔｒａ－ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通じて処理した。限外濾過した試料を次に１００ｍＭのクエン酸緩衝液中での段階希釈により２５，０００Ｘに希釈し、使用した。反応体積は２．５ｍＬであった。ｐＨを５．５に維持し、反応を１５分間継続した。
【0116】
インキュベーション後に３ｍＬのＤＮＳ（３，５ジニトロサリチル酸）を各反応混合物に加え、１０分間煮沸し、冷却し、５４０ｎｍで分光光度的に吸光度を読み取った。
【0117】
異なる濃度でのグルコースのＯＤは、表１０に示され、図７に描写されるように測定された。その後、反応後の吸光度測定に基づいて、酵素活性は表１１に示されるように算出された。図７は、β－フルクトフラノシダーゼ酵素の活性の推定のために使用されたグルコース標準曲線を描写する。
【0118】
【表10】
【0119】
【表11】
【0120】
実施例７：スクロース及び組換えβ－フルクトフラノシダーゼ酵素からのフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の生成
フルクトオリゴ糖の形成における酵素の能力を理解するための研究を実行した。９０％（ｗ／ｖ）のスクロースの１００ｍＬ溶液を１５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に調製した。これに、５１６９２単位／ｍｌの活性を有する９６．７μＬのβ－フルクトフラノシダーゼ酵素（計５０００単位の酵素と同等）を加えた。
フルクトオリゴ糖の形成における酵素の能力を理解するための研究を実行した。９０％（ｗ／ｖ）のスクロースの１００ｍＬ溶液を１５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に調製した。これに、５１６９２単位／ｍｌの活性を有する９６．７μＬのβ－フルクトフラノシダーゼ酵素（計５０００単位の酵素と同等）を加えた。
【0121】
反応物を２５０ｍＬ円錐フラスコに準備し、６５℃及び２２０ｒｐｍでインキュベートした。定期的な時間間隔で試料を採取し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート上で分析した。
【0122】
グルコース、スクロース、フルクトース及びＦＯＳ（ケストース、ニストース及びフルクトフラノシルニストースを含有する）を薄層クロマトグラフィー分析用の標準品として使用した。使用された移動相はｎ－ブタノール：氷酢酸：水（４：２：２ ｖ／ｖ）であり、使用された顕色／染色溶液は尿素リン酸であった。
【0123】
図８は、スクロース及び組換えβ－フルクトフラノシダーゼ酵素からのフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の生成のために行われたＴＬＣ分析を描写する。
【0124】
フルクトオリゴ糖の製造の定量的推定のために試料を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にさらに供した。４．６（ＩＤ）×１５０ｍｍ（長さ）及び５μｍ（粒子サイズ）を有するアミンカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＮＨ2カラム、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＰＬＣ分析を行った。異なる濃度のグルコース、フルクトース、ケストース、ニストース、フルクトフラノシルニストース及びスクロースの標準溶液を、標準曲線を生成するために流した。
【0125】
図９はＦＯＳ試料のＨＰＬＣ分析クロマトグラムを描写する。表１２は、６０分の反応時間の終わりにおけるフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）の形成のパーセンテージ並びに回収されたグルコース、フルクトース及びスクロースを描写する。
【0126】
【表12】
【0127】
スクロースのＦＯＳへの変換のために１００ｍｌの９０％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液をβ－フルクトフラノシダーゼ酵素と反応させた。６０分の終わりに熱により反応を終了させた後の反応から回収されたＦＯＳ、スクロース、グルコース、及びフルクトースの量を測定し、９０％及び１００％のスクロースを基準として提示した。
【0128】
精製された酵素は非常に多くの量の糖をフルクトオリゴ糖を有効に変換できることを研究は実証した。
【0129】
実施例８：アスペルギルス・ニガーの組換えβ－フルクトフラノシダーゼの特徴付け
アスペルギルス・ニガーの採取されたβ－フルクトフラノシダーゼを特徴付けして生物活性断片を同定した。β－フルクトフラノシダーゼの以下の生物活性断片が保存され、触媒活性を説明することが見出された：
アスペルギルス・ニガーの採取されたβ－フルクトフラノシダーゼを特徴付けして生物活性断片を同定した。β－フルクトフラノシダーゼの以下の生物活性断片が保存され、触媒活性を説明することが見出された：
【0130】
【表13】
【0131】
アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼ中の以下のアミノ酸残基は、触媒性三連構造（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）の周辺の水素結合ネットワークの形成に関与することがさらに見出された。水素結合ネットワークは、触媒性三連構造の周囲の安定な立体化学のために重要である：
・Ａｒｇ－１９０
・Ｔｙｒ－３６９
・Ｇｌｕ－３１８
・Ｈｉｓ－３３２
・Ａｓｐ－１９１
・Ｔｈｒ－２９３
・Ａｓｐ－１１９
・Ｈｉｓ－１４４
・Ａｒｇ－１９０
・Ｔｙｒ－３６９
・Ｇｌｕ－３１８
・Ｈｉｓ－３３２
・Ａｓｐ－１９１
・Ｔｈｒ－２９３
・Ａｓｐ－１１９
・Ｈｉｓ－１４４
【0132】
アスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼ中の以下の疎水性残基は、活性部位の周辺の負に荷電したポケットの形成に関与することもまた見出された：
・Ｌｅｕ－７８
・Ｐｈｅ－１１８
・Ａｌａ－３７０
・Ｔｒｐ－３９８
・Ｉｌｅ－１４３
・Ｌｅｕ－７８
・Ｐｈｅ－１１８
・Ａｌａ－３７０
・Ｔｒｐ－３９８
・Ｉｌｅ－１４３
【0133】
さらに、活性ポケットの入口における相互作用に関与するアスペルギルス・ニガーのβ－フルクトフラノシダーゼの以下の重要な残基が同定された：
・Ｇｌｕ－４０５
・Ｈｉｓ－３３２
・Ｔｙｒ－４０４
・Ｇｌｕ－４０５
・Ｈｉｓ－３３２
・Ｔｙｒ－４０４
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】