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▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】ペンタペプチドおよびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20230125BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230125BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230125BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230125BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230125BHJP
A61K 38/03 20060101ALI20230125BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230125BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230125BHJP
A61K 38/39 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20230125BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C07K19/00
A61P17/02
A61P31/04
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A61P43/00 111
A61K38/03
A61P17/00 101
A61K45/00
A61K38/39
A61K9/06
A61K9/08
A61K9/107
A61K9/20
A61K9/48
A61K9/12
A61K9/70 401
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022531406
(86)(22)【出願日】2020-11-25
(85)【翻訳文提出日】2022-07-27
(86)【国際出願番号】 US2020062140
(87)【国際公開番号】W WO2021108482
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】62/941,226
(32)【優先日】2019-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】513016884
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイ
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＴＲＵＳＴＥＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＩＬＬＩＮＯＩＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】アーカル，ヴィナイ クマール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA11
4C076AA17
4C076AA24
4C076AA36
4C076AA53
4C076AA72
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB14
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076BB24
4C076BB25
4C076BB31
4C076CC18
4C076CC19
4C076CC26
4C076CC29
4C076CC32
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA19
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA59
4C084MA02
4C084MA13
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA28
4C084MA32
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA12
4C084NA14
4C084ZA042
4C084ZA082
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZA901
4C084ZA902
4C084ZB072
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB332
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZB372
4C084ZC191
4C084ZC192
4C084ZC751
4H045AA10
4H045BA09
4H045BA41
4H045BA56
4H045CA40
4H045EA29
4H045FA10
(57)【要約】
配列ＳＨＸＧＹ（配列番号２）を含む合成ペプチドが、創傷治癒および上皮細胞移動を推進するために同じものを使用する方法として、記載されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉの構造を含む、合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩：【数3】
式中、
Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含む５～１０のアミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、およびＲ１またはＲ２の他方は、金属が結合しているペプチド、創傷治癒ペプチド、または抗菌ペプチドであり；
Ｚは、存在するか、または存在せず、および存在する場合には、外因性ペプチドであり；
Ｌは、リンカーであり；
および、ｎは、０または≧１であり、
ただし、ｎが、０である場合に、Ｒ１が、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含む５～１０のアミノ酸残基ペプチドである。
【請求項2】
リンカーが、炭化水素リンカーである、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項3】
各Ｌが、同じであるか異なるリンカーでもよい、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項4】
直鎖であるかまたは環化された、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項5】
グリコシル化、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化、スルホン化、ＰＥＧ化、または脂質化から選択される修飾を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項6】
金属が結合しているペプチドが、アミノ酸配列ＨＥＸＸＨ（配列番号１４）を含み、ここでＸが、Ｋ、Ｒ、またはＨである、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項7】
創傷治癒ペプチドが、アミノ酸配列ＳＮＹＬＹＤＮ（配列番号２６）またはＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含み、ここでＸは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥである、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項8】
抗菌ペプチドが、アミノ酸配列ＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号２８）またはＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号２９）を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項9】
請求項１に記載の１以上の合成ペプチドまたはその薬学的に許容し得る塩、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項10】
局所、経口、眼、静脈内、硝子体内、結膜下、皮下、筋肉内、腹腔内、脳内、動脈内、門脈内、病巣内、鞘内、または鼻腔内投与のために製剤化される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ゲル、希釈液、クリーム、タブレット、カプセル、ピル、溶液、点眼液、スプレー、絆創膏、コンタクトレンズ、貯留物、注射可能薬物、移植可能物、または徐放性製剤の形態である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
処置を必要とする対象に、請求項１に記載の合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩の有効量を投与し、それにより創傷治癒または上皮細胞移動を推進することを含む、創傷治癒または上皮細胞移動を推進するための方法。
【請求項13】
合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩の量が、１ナノモルから５００マイクロモルの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、抗傷剤、免疫調節剤、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、麻酔剤、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
処置を必要とする対象に、請求項９に記載の医薬組成物の有効量を投与し、それにより創傷治癒または上皮細胞移動を推進することを含む、創傷治癒または上皮細胞移動を推進するための方法。
【請求項16】
合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩の量が、１ナノモルから５００マイクロモルの範囲である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、抗傷剤、免疫調節剤、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、麻酔剤、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
処置を必要とする対象に、請求項１に記載の合成ペプチドまたはその薬学的に許容し得る塩の有効量を投与し、それにより細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）活性化を増大させることを含む、細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）活性化を増大させるための方法。
【請求項19】
請求項１に記載の１以上の合成ペプチドまたはその薬学的に許容し得る塩を含む、キット。
【請求項20】
抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、抗真菌剤、抗傷剤、免疫調節剤、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、麻酔剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
序論
本出願は、２０１９年１１月２７日に出願の米国仮特許出願第６２／９４１，２２６号に対して優先権の利益を主張し、その内容が、参照によって、本明細書に完全に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月２７日に出願の米国仮特許出願第６２／９４１，２２６号に対して優先権の利益を主張し、その内容が、参照によって、本明細書に完全に組み込まれる。
【0002】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された承認番号ＥＹ０２４３３９およびＥＹ０２９４０９；国防総省によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１７－１－０１２２；退役軍人省によって授与されたＩ０１ＢＸ００４０８０のもとの政府のサポートによって、成された。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
背景
ヒスタチン（ＨＴＮｓ）は、唾液ならびにヒト涙腺上皮中に見いだされる、ヒスチジンリッチなカチオン性小ペプチドである（Ａａｋａｌｕ， ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ５５：３１１５； Ｕｂｅｌｓ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ５３（１１）：６７３８－４７； Ｓｔｅｅｌｅ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ４３：９８）。ヒスタチンは、７から３８アミノ酸残基までの長さの、サイズにおける範囲にあり、抗細菌性および著しい抗真菌性を伴う抗菌ペプチドの群を、表す。加えて、ヒスタチンは創傷治癒、金属イオンキレート化、抗炎症効果、および血管新生に関係していた（Ｍｅｌｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （２０１４） ＦＥＢＳ Ｊ． ２８１：６５７－７２； Ｏｕｄｈｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． （２００８） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２２（１２）：３８０５－１２）； Ｏｕｄｈｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｄｅｎｔ． Ｒｅｓ． ８８（９）：８４６－５０； ＷＯ ２００７／１４２３８１）。構造－機能研究は、ＨＴＮ１およびＨＴＮ３の両方において、はっきりしたＮ末端およびＣ末端ドメインを同定し、それは、それぞれ抗微生物性および創傷治癒特性に、寄与する（Ｍｅｌｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：９６２６－３３； Ｂｒｅｗｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７６：２４７－５６； Ｇｕｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５４５：８６－９）。この点において、ヒスタチン、ならびにフラグメント、多量体、およびそれらの組み合わせは、眼表面疾患（ＵＳ ２０１３／０３１０３２７；２０１３／０３１０３２６；ＷＯ ２０１６／０６０９１６；ＷＯ ２０１６／０６０９１７；ＷＯ ２０１６／０６０９１８；ＷＯ ２０１６／０６０９２１；ＵＳ ２０１６／０２７９１９４）および創傷（ＵＳ ２０１３／０２８８９６４；ＵＳ ２０１１／０１７８０１０）を含む様々な状態の処置における使用に関して、示唆されていた。
ヒスタチン（ＨＴＮｓ）は、唾液ならびにヒト涙腺上皮中に見いだされる、ヒスチジンリッチなカチオン性小ペプチドである（Ａａｋａｌｕ， ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ５５：３１１５； Ｕｂｅｌｓ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ５３（１１）：６７３８－４７； Ｓｔｅｅｌｅ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ４３：９８）。ヒスタチンは、７から３８アミノ酸残基までの長さの、サイズにおける範囲にあり、抗細菌性および著しい抗真菌性を伴う抗菌ペプチドの群を、表す。加えて、ヒスタチンは創傷治癒、金属イオンキレート化、抗炎症効果、および血管新生に関係していた（Ｍｅｌｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （２０１４） ＦＥＢＳ Ｊ． ２８１：６５７－７２； Ｏｕｄｈｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． （２００８） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２２（１２）：３８０５－１２）； Ｏｕｄｈｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｊ． Ｄｅｎｔ． Ｒｅｓ． ８８（９）：８４６－５０； ＷＯ ２００７／１４２３８１）。構造－機能研究は、ＨＴＮ１およびＨＴＮ３の両方において、はっきりしたＮ末端およびＣ末端ドメインを同定し、それは、それぞれ抗微生物性および創傷治癒特性に、寄与する（Ｍｅｌｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：９６２６－３３； Ｂｒｅｗｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７６：２４７－５６； Ｇｕｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５４５：８６－９）。この点において、ヒスタチン、ならびにフラグメント、多量体、およびそれらの組み合わせは、眼表面疾患（ＵＳ ２０１３／０３１０３２７；２０１３／０３１０３２６；ＷＯ ２０１６／０６０９１６；ＷＯ ２０１６／０６０９１７；ＷＯ ２０１６／０６０９１８；ＷＯ ２０１６／０６０９２１；ＵＳ ２０１６／０２７９１９４）および創傷（ＵＳ ２０１３／０２８８９６４；ＵＳ ２０１１／０１７８０１０）を含む様々な状態の処置における使用に関して、示唆されていた。
【0004】
ヒスタチンの環状の類似体も、記載されていた。たとえば、ＵＳ ６，５５５，６５０は、前記アミノ酸単位の５～１６の環状の部分を構築するジスルフィド架橋を伴うＨＴＮ５の環状の類似体を、記載する。加えて、ＨＴＮ５の頭－尾環化は、その抗菌能力に影響を及ぼすことなくペプチドの両親媒性を増大させるために、示された（Ｓｉｋｏｒｓｋａ ＆ Ｋａｍｙｓｚ （２０１４） Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ． ２０：９５２－７）。さらに、ヒスタチン－１の環化は、モル活性をおよそ１０００倍に強化することが示されており（Ｏｕｄｈｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． （２００９） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２３：３９２８－３５）、創傷閉鎖活性を増加させる（Ｂｏｌｓｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２５：２６５０－８）。その上、ヒスタチンの環状の類似体は、増強された能力によって、微生物感染処置における使用のために提案された（ＵＳ ２０１０／０１７３８３３； Ｂｒｅｗｅｒ ＆ Ｌａｊｏｉｅ （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：５５２６－５５３６）。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩を提供し、前記ペプチドは、式Ｉの構造を有する：
式中、Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含む５～１０のアミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘが、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、およびＲ１またはＲ２の他方が、金属が結合しているペプチド、創傷治癒ペプチド、または抗菌ペプチドであり；Ｚは、存在するか、または存在せず、および存在する場合には、外因性ペプチドであり；Ｌは、リンカーであり；および、ｎは、０または≧１であり、ただし、ｎが、０である場合に、Ｒ１が、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含む５～１０のアミノ酸残基ペプチドである。ある側面において、Ｌの各出現は、同じまたは異なるリンカーを含んでもよく；合成ペプチドは、直鎖でもよいかまたは環化されてもよく；および／または、ペプチドは、グリコシル化、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化、スルホン化、ＰＥＧ化、または脂質化から選択される修飾を、含んでもよい。他の側面において、金属が結合しているペプチドは、アミノ酸配列ＨＥＸＸＨ（配列番号１４）を有してもよく、ここで、Ｘは、Ｋ、Ｒ、またはＨであり；
創傷治癒ペプチドは、アミノ酸配列ＳＮＹＬＹＤＮ（配列番号２６）またはＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有してもよく、ここで、Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり；および、抗菌ペプチドは、アミノ酸配列ＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号２８）またはＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号２９）を有してもよい。合成ペプチド、または薬学的に許容し得る担体または賦形剤と混合されたその薬学的に許容し得る塩もまた提供され、合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩、またはそれを含有する医薬組成物を使用した、創傷治癒および／または上皮細胞移動を推進し、および細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を増大させるためのキットおよび方法も同様に提供され、ここで、投与される合成ペプチドまたはその薬学的に許容し得る塩の量は、１ナノモル～５００マイクロモルの濃度の範囲である。いくつかの側面において、キットおよび方法は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、免疫調節性剤、抗傷剤、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、麻酔剤、またはそれらの組み合わせの使用を、更に含んでもよい。さらにその上、本開示の原理に従って調製されるペンタペプチドは、操作されて、掛け合わされ、直鎖配置または他の立体配置を志向されて、それらの機能を維持する。
【数1】
創傷治癒ペプチドは、アミノ酸配列ＳＮＹＬＹＤＮ（配列番号２６）またはＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有してもよく、ここで、Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり；および、抗菌ペプチドは、アミノ酸配列ＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号２８）またはＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号２９）を有してもよい。合成ペプチド、または薬学的に許容し得る担体または賦形剤と混合されたその薬学的に許容し得る塩もまた提供され、合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩、またはそれを含有する医薬組成物を使用した、創傷治癒および／または上皮細胞移動を推進し、および細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を増大させるためのキットおよび方法も同様に提供され、ここで、投与される合成ペプチドまたはその薬学的に許容し得る塩の量は、１ナノモル～５００マイクロモルの濃度の範囲である。いくつかの側面において、キットおよび方法は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、免疫調節性剤、抗傷剤、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、麻酔剤、またはそれらの組み合わせの使用を、更に含んでもよい。さらにその上、本開示の原理に従って調製されるペンタペプチドは、操作されて、掛け合わされ、直鎖配置または他の立体配置を志向されて、それらの機能を維持する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】図１は、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有ペプチドが、スクラッチ閉鎖率の加速のために必要および十分であることを示す。ペプチドは、スクラッチ閉鎖率を加速することにおける有効性のために試験された。陰性対照は、未処置および複数のスクランブルペプチド（ＳＰ）の対照を含んだ。すべてのペプチドは、８０μＭの濃度で試験された。すべての実験は、各実験について３つの技術的な再現による３重で遂行された。統計的有意差は、ダネットの事後検定（ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）による一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＹＡ）によって決定された。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。相対閉鎖＝（処置された試料の％閉鎖）／（未処置の対照の％閉鎖）。
【0007】
【図2】図２は、ヒスタチン－５またはＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドの適用が、マウス角膜上皮障害モデルの角膜創傷閉鎖率を加速することを示す。創傷領域は、Ｈｓｔ５、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）、またはＳＰ１ペプチド（各群に関してｎ＝７）で処置され、各々８０μＭの濃度で試験された。複数の時点の創傷領域は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、測定された。ベースラインと比較した１８時間および２４時間での、％維持角膜創傷領域の測定は、ＳＰ１と比較して、Ｈｓｔ５およびＳＨＲＧＹ（配列番号２）群において、統計的に有意な改善を示した。統計的有意差は、ボンフェローニの事後検定（ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）による二元配置分散分析（ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって決定された。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。％創傷領域＝（時間Ｘでの創傷領域／時間０での創傷領域）Ｘ１００。
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
発明の詳細な説明
上皮移動、接着、および増殖は、身体のすべての領域の創傷治癒にきわめて重大である。十分な上皮形成なしで、傷、炎症、疼痛、拘縮、視覚喪失、機能障害、感染、および異常血管増殖などの結果による異所性創傷治癒が、見られることができる。数個の細胞タイプおよび創傷モデルは、一般的に、創傷治癒を増強するための剤の適用性を試験するために用いられる。例示の系は、眼球の前部および眼表面である。眼球の前面の角膜および他の要素は、異常な上皮形成が、悲惨な失明または眼球の喪失にさえつながることができるので、創傷治癒のモデルとして使用される。ここで、ペンタペプチドＳＨＸＧＹ（配列番号１）が、上皮創傷治癒を増強できることが、見いだされていた。とりわけ、配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）、例として、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）およびＳＨＤＧＹ（配列番号３）を含有するペプチドが、いくつかの細胞タイプ（不死化されたヒト角膜上皮細胞、不死化されたヒト角膜輪部上皮細胞、ＨｅＬａヒト細胞）において、およびマウス角膜上皮創傷のモデルにおいて、有意に上皮移動を増強することができることが、示されていた。標準化された創傷方法を用いて傷つけられたマウスに、局所的に適用される場合に、ＳＨＸＧＹ（配列番号１）－含有ペプチドまたはそれらの多量体（例として、ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ；配列番号５１）は、有意に角膜治癒を改善することができる。加えて、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列を含む合成ペプチドが、創傷治癒の部位に対して、リン酸化された細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１／２（ｐＥＲＫ１／２）の免疫局在性を刺激することが示されており、創傷治癒増強における機能に加えて、それによりＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドが、免疫調節性活性も有することを示唆している。よって、このコアペンタペプチド配列は、上皮形成および細胞移動を推進することにおいて特に使用され、それは、創傷治癒、炎症、がん、他の現象の間の感染または障害に対する応答にとって、重要である。
上皮移動、接着、および増殖は、身体のすべての領域の創傷治癒にきわめて重大である。十分な上皮形成なしで、傷、炎症、疼痛、拘縮、視覚喪失、機能障害、感染、および異常血管増殖などの結果による異所性創傷治癒が、見られることができる。数個の細胞タイプおよび創傷モデルは、一般的に、創傷治癒を増強するための剤の適用性を試験するために用いられる。例示の系は、眼球の前部および眼表面である。眼球の前面の角膜および他の要素は、異常な上皮形成が、悲惨な失明または眼球の喪失にさえつながることができるので、創傷治癒のモデルとして使用される。ここで、ペンタペプチドＳＨＸＧＹ（配列番号１）が、上皮創傷治癒を増強できることが、見いだされていた。とりわけ、配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）、例として、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）およびＳＨＤＧＹ（配列番号３）を含有するペプチドが、いくつかの細胞タイプ（不死化されたヒト角膜上皮細胞、不死化されたヒト角膜輪部上皮細胞、ＨｅＬａヒト細胞）において、およびマウス角膜上皮創傷のモデルにおいて、有意に上皮移動を増強することができることが、示されていた。標準化された創傷方法を用いて傷つけられたマウスに、局所的に適用される場合に、ＳＨＸＧＹ（配列番号１）－含有ペプチドまたはそれらの多量体（例として、ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ；配列番号５１）は、有意に角膜治癒を改善することができる。加えて、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列を含む合成ペプチドが、創傷治癒の部位に対して、リン酸化された細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ１／２（ｐＥＲＫ１／２）の免疫局在性を刺激することが示されており、創傷治癒増強における機能に加えて、それによりＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドが、免疫調節性活性も有することを示唆している。よって、このコアペンタペプチド配列は、上皮形成および細胞移動を推進することにおいて特に使用され、それは、創傷治癒、炎症、がん、他の現象の間の感染または障害に対する応答にとって、重要である。
【0010】
従って、本発明は、合成ペプチド、またはその薬学的に許容し得る塩、創傷治癒および／または上皮細胞移動を推進することにおける、同じものの使用の方法を、提供する。本発明の合成ペプチドは、式Ｉの一般的な構造を有する：
、
式中
（ｉ）Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、およびＲ１またはＲ２の他方は、金属が結合しているペプチド、創傷治癒ペプチド、または抗菌ペプチドであり；
（ｉｉ）Ｚは、存在するか、または存在せず、および存在する場合には、外因性ペプチドであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、リンカーであり；および
（ｉｖ）ｎは、０または≧１であり、
ただし、ｎが、０である場合に、Ｒ１が、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドである。
【数2】
式中
（ｉ）Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥであり、およびＲ１またはＲ２の他方は、金属が結合しているペプチド、創傷治癒ペプチド、または抗菌ペプチドであり；
（ｉｉ）Ｚは、存在するか、または存在せず、および存在する場合には、外因性ペプチドであり；
（ｉｉｉ）Ｌは、リンカーであり；および
（ｉｖ）ｎは、０または≧１であり、
ただし、ｎが、０である場合に、Ｒ１が、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドである。
【0011】
指示のとおり、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含む、５～１０のアミノ酸残基ペプチドであり、ここで、Ｘは、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、またはＥ（Ｇｌｕ）である。従って、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、アミノ酸配列ＳＨＲＧＹ（配列番号２）、ＳＨＤＧＹ（配列番号３）、ＳＨＫＧＹ（配列番号４）、ＳＨＨＧＹ（配列番号５）、またはＳＨＥＧＹ（配列番号６）を含む、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基ペプチドである。Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは、配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含み、それは、Ｃ末端および／またはＮ末端上の１～５の追加のアミノ酸残基を有してもよい。いくつかの側面において、１～５の追加のアミノ酸残基は、内因性であるかまたは天然のアミノ酸残基である。「天然の」または「内因性」アミノ酸残基は、天然に存在するタンパク質における詳述された位置に存在するアミノ酸残基である。例証として、配列ＳＨＲＧＹ（配列番号２）は、以下の通り、ヒスタチン３の中に存在する：ＤＳＨＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲＳＮＹＬＹＤＮ（配列番号７）。従って、Ｒ１および／またはＲ２が、ヒスタチンから誘導される場合に、Ｒ１および／またはＲ２は、配列ＨＨＳＨＲＧＹＲＳＮ（配列番号８）、ＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹ（配列番号９）、ＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号１０）、ＫＨＨＳＨＲＧＹ（配列番号１１）、ＨＨＳＨＲＧＹ（配列番号１２）、またはＨＳＨＲＧＹ（配列番号１３）を有することができる。
【0012】
いくつかの側面において、合成ペプチドは、Ｒ１のみから成る（すなわち、ｎ＝０）。この側面に従って、合成ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に規定される配列を含むかまたはそれらから成る５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基ペプチドである。
【0013】
他の側面において、合成ペプチドは、１以上のＲ２ペプチドを含む（すなわち、ｎ≧１）。この点において、合成ペプチドは、リンカーで結合される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のペプチドを含むことができる。一側面において、本発明の合成ペプチドのＲ１およびＲ２は、同一である。他の側面において、本発明の合成ペプチドのＲ１およびＲ２は、相違する。さらなる側面において、各Ｒ２は、同一であるかまたは相違することができる。理想的には、合成ペプチドの全長は、２０～１００のアミノ酸残基の範囲にある。
【0014】
Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドである一方で、Ｒ１またはＲ２の他方は、金属が結合しているペプチド、創傷治癒ペプチド、または抗菌ペプチドであってもよい。この点において、本発明の合成ペプチドは、（ｉ）金属が結合しているペプチド、（ｉｉ）創傷治癒ペプチド、（ｉｉｉ）抗菌ペプチド、または（ｉｖ）（ｉ）－（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ、と組み合わせたアミノ酸配列ＳＨＸＧＹを有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドで構成されてもよい。ある側面において、本発明の合成ペプチドは、第２の創傷治癒ペプチドと組み合わせた、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹを有する５～１０のアミノ酸残基ペプチドで、構成される。
【0015】
用語「金属と結合しているペプチド」は、本明細書に使用されるとき、金属と結合させるかまたは複合体を形成するアミノ酸のモチーフを指す。ヒスタチンの構造および機能的な特性評価は、以下の２つの金属－結合モチーフの存在を明らかにした：第３の位置における１つのヒスチジン残基を伴うアミノ－末端Ｃｕ（ＩＩ）／Ｎｉ（ＩＩ）結合（ＡＴＣＵＮ）モチーフ（ＮＨ２－Ｘ１Ｘ２Ｈ、ここでＸ１は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、およびＸ２は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、またはＳｅｒである）（Ｇｒｏｇａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４９１：７６－８０； Ｍｅｌｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１５３７３－８３； Ｍｅｌｉｎｏ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：９６２６－３３； Ｇｕｓｍａｎ， ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５４５：８６－９５）；およびＺｎ（ＩＩ）－結合モチーフＨＥＸＸＨ（配列番号１４）、ここでＸが、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、またはＨ（ｈｉｓ）などの塩基性のアミノ酸残基を示す。従って、いくつかの態様において、金属が結合しているペプチドは、配列ＤＳＨ、ＥＳＨ、ＤＡＨ、ＥＡＨ、ＤＴＨ、ＥＴＨ、ＤＭＨ、またはＥＭＨを含む。他の態様において、金属が結合しているペプチドは、配列ＨＥＫＫＨ（配列番号１５）、ＨＥＫＲＨ（配列番号１６）、ＨＥＫＨＨ（配列番号１７）、ＨＥＲＫＨ（配列番号１８）、ＨＥＲＲＨ（配列番号１９）、ＨＥＲＨＨ（配列番号２０）、ＨＥＨＫＨ（配列番号２１）、ＨＥＨＲＨ（配列番号２２）、またはＨＥＨＨＨ（配列番号２３）を含む。金属が結合しているペプチドは、上述した金属が結合しているペプチドの特定の配列を含むことができるかまたはＣ末端上の１～６の追加の天然のヒスタチン・アミノ酸残基および／または金属が結合しているペプチドのＮ末端を含むことができる。例証として、金属が結合しているペプチドは、配列ＧＹＫＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲ（配列番号２４）またはＨＥＫＲＨＨ（配列番号２５）を有することができる。
【0016】
いくつかの態様において、本発明の合成ペプチドは、１つの金属が結合しているペプチドを含む。他の態様において、合成ペプチドは、２つの金属が結合しているペプチドを含む。さらなる態様において、合成ペプチドは、３つの金属が結合しているペプチドを含む。ある態様において、金属が結合しているペプチドは、配列ＨＥＸＸＨ（配列番号１４）を有し、ここで、各Ｘは、塩基性のアミノ酸残基である。当業者によって容易に認識されるとおり、合成ペプチドにおける、１以上の金属が結合しているペプチドの包含は、金属イオンキレート、抗炎症薬、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害、および／または抗血管新生活性を、合成ペプチドにもたらす。その抗血管新生活性に照らして、かかる合成ペプチドは、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、がん、および慢性または急性の重篤なブドウ膜炎の処置において使用されるだろう。その金属イオンキレート化活性に照らして、かかる合成ペプチドはまた、伝染性角膜炎、眼内ブドウ膜炎、眼内炎、炎症性角膜炎、乾燥眼疾患、および眼表面または眼内疾患症などの、炎症性および伝染性疾患におけるマトリックスメタロプロテイナーゼおよび他の金属依存酵素によって媒介される組織破壊を阻害することにおいて、使用されるだろう。
【0017】
本明細書に使用のとおり、「創傷治癒ペプチド」は、創傷治癒を推進するかまたは促進するアミノ酸モチーフを指す。いくつかの側面において、創傷治癒ペプチドは、ヒスタチンから誘導される。ヒスタチンから誘導される創傷治癒ペプチドの例は、配列ＳＮＹＬＹＤＮ（配列番号２６）を含むペプチドである。別の側面において、創傷治癒ペプチドは、アミノ酸配列ＳＨＸＧＹ（配列番号１）を含み、ここで、Ｘは、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、またはＥである。注目すべきことに、本発明の合成ペプチドに含まれる場合に、ＳＨＸＧＹ（配列番号１）配列は、免疫調節性活性を合成ペプチドに授ける追加の利益を有する。創傷治癒ペプチドは、上述した創傷治癒ペプチドの特定の配列を含むことができるか、または創傷治癒ペプチドのＣおよび／またはＮ末端上の、１と６の間の追加のアミノ酸残基を含むことができる。例証として、ヒスタチンから誘導される創傷治癒ペプチドは、配列ＹＧＤＹＧＳＮＹＬＹＤＮ（配列番号２７）または配列番号２または８～１３のいずれか１つを有することができる。
【0018】
いくつかの態様において、配列番号１の創傷治癒ペプチドに加えて、本発明の合成ペプチドは、第２の創傷治癒ペプチドを含む。他の態様において、配列番号１の創傷治癒ペプチドに加えて、合成ペプチドは、２つの追加の創傷治癒ペプチドを含む。さらなる態様において、配列番号１の創傷治癒ペプチドに加えて、合成ペプチドは、３つの追加の創傷治癒ペプチドを含む。当業者によって容易に認識されるとおり、合成ペプチドにおける１以上の創傷治癒ペプチドの包含は、上皮細胞移動および活性のひろがりを合成ペプチドにもたらす。かかる合成ペプチドは、それゆえ創傷治癒ならびに網膜色素上皮治癒、乾性加齢黄斑変性、眼表面疾患および眼表面炎症性障害、角膜および眼内、網膜または脈絡膜を含む眼の新血管新生、および乾燥眼疾患の処置において使用される。
【0019】
本発明の目的に関して、「抗菌」は、抗細菌および抗真菌剤を含む。従って、本明細書に使用のとおり、用語「抗菌ペプチド」は、細菌および／または真菌細胞への細胞増殖抑制または殺細胞活性を呈するアミノ酸のモチーフを、指す。ヒスタチンの特性評価は、陽性総電荷およびＨＴＮのアミノ末端部分が、抗菌活性を媒介することを、示す。とりわけ、ＨＴＮ３のアミノ酸配列ＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号２８）は、殺真菌活性を呈することが、示されていた（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（１２）：ｅ５１４７９）。同様に、Ｐ－１１３としても知られる配列ＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号２９）は、カンジダアルビカンスに対する殺真菌活性を呈する（Ｊａｎｇ， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５２９２）：４９７－５０４）。よって、抗菌ペプチドは、上述した抗菌ペプチドの特定の配列を含むことができるか、または抗菌ペプチドのＣおよび／またはＮ末端上の１と６の間の追加のアミノ酸残基を、含むことができる。
【0020】
いくつかの態様において、合成ペプチドは、１つの抗菌ペプチドを含む。
他の態様において、合成ペプチドは、２つの抗菌ペプチドを含む。さらなる態様において、合成ペプチドは、３つの抗菌ペプチドを含む。ある態様において、抗菌ペプチドは、配列ＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号２８）を有する。他の態様において、抗菌ドメインは、配列ＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号２９）を有する。当業者によって容易に認識されるとおり、合成ペプチドにおける１以上の抗菌ペプチドの包含は、抗真菌および／または抗細菌活性を、合成ペプチドにもたらす。かかる合成ペプチドは、それゆえカンジダ眼球感染などの微生物感染の処置、ならびに外科的移植片と関連する感染を防御において、使用されるだろう。
他の態様において、合成ペプチドは、２つの抗菌ペプチドを含む。さらなる態様において、合成ペプチドは、３つの抗菌ペプチドを含む。ある態様において、抗菌ペプチドは、配列ＲＫＦＨＥＫＨＨＳＨＲＧＹＲ（配列番号２８）を有する。他の態様において、抗菌ドメインは、配列ＡＫＲＨＨＧＹＫＲＫＦＨ（配列番号２９）を有する。当業者によって容易に認識されるとおり、合成ペプチドにおける１以上の抗菌ペプチドの包含は、抗真菌および／または抗細菌活性を、合成ペプチドにもたらす。かかる合成ペプチドは、それゆえカンジダ眼球感染などの微生物感染の処置、ならびに外科的移植片と関連する感染を防御において、使用されるだろう。
【0021】
同一であるかまたは相違する繰り返し単位を含有する合成ペプチドの例は、表１において、提示される。
【表1】
【0022】
本発明のある側面において、外因性であるかまたは異種組織の分子は、合成ペプチドに含まれる。具体的には、いくつかの側面で、合成ペプチドは、直接Ｒ１およびＲ２の一方または両方に付随する「Ｚ」および／または「Ｌ」部分を含み、ここで、「Ｚ」および「Ｌ」部分の両方は、Ｒ１およびＲ２に関して外因性であるかまたは異種組織の分子である。用語「異種組織の分子」または「外因性分子」は、通常ペプチドにおいて見いだされないか、または天然において、典型的にＲ１および／またはＲ２アミノ酸配列と関連しない分子を、指す。
【0023】
いくつかの側面において、合成ペプチドは、「Ｚ」部分を含む。他の側面において、「Ｚ」部分は、存在しない。存在する場合、Ｚは、本明細書に定義の外因性ペプチドである。この側面に従って、Ｚは１～５０のアミノ酸残基ペプチド、または好ましくは１～３０のアミノ酸残基ペプチド、またはより好ましくは１～２０のアミノ酸残基ペプチドであり、ここで、前記外因性ペプチドは、機能を有してもよいかまたは有さなくてもよい。例証として、外因性ペプチドは、金属の結合、創傷治癒、免疫調節、および／または抗菌活性を呈してもよいか、または例として、ＳＰ２ペプチドＨＳＨＫＥＧＨＨＹＫＲＦＫＲＫＨＨＡＤＳＨＲＧＹ（配列番号７０）においてあるとおりランダムなペプチド配列でもよい。ある側面において、Ｚは、１～５０、１～３０、または１～２０のアミノ酸残基のランダムなペプチド配列である。
【0024】
本明細書に使用されるとき、用語「Ｌ」または「リンカー」または「スペーサー」は、Ｒ１をＲ２に接続し、連結し、または結合し、および個々のＲ２部分を接続し、連結し、または結合するために使用される、異種組織の分子または外因性分子を、指す。本明細書に使用されるとき、用語「連結される（ｌｉｎｋｅｄ）」、「結合される（ｊｏｉｎｅｄ）」、または「接続される（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」は、一般には、天然に存在しない分子を生成するために、２つの連続するかまたは隣接するアミノ酸配列の間の、機能的な連結を指す。一般に、連結されたアミノ酸配列は、相互に連続しているか隣接しており、および結合される場合の、それらのそれぞれの作動可能性および機能を保持する。リンカーは、合成ペプチドの所望された発現、活性、および／または配座の位置決めができるようにするために、所望の可動性を提供してもよい。
【0025】
いくつかの態様において、合成ペプチドは、１つのリンカー、すなわち、ｎ＝１を含む。他の態様において、合成ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のリンカー、すなわち、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９を含む。ある側面において、リンカー（Ｌ）の各出現は、同じまたは異なるリンカーを含んでもよい。
【0026】
式Ｉの合成ペプチドにおける使用のリンカーは、可動性の、固定した、ｉｎ ｖｉｖｏで切断可能な、またはそれらの組み合わせであることができる。加えて、リンカーは、アミノ酸残基（すなわち、ペプチドリンカー）で構成されることができるか、または炭化水素鎖（すなわち、炭化水素リンカー）で構成されることができる。ペプチドリンカーは、Ｒ１およびＲ２または個々のＲ２部分を接続するためにいかなる適切な長さにもでき、好ましくはＲ１およびＲ２の適切な折りたたみおよび／または機能および／または活性を許容するように設計されている。よって、リンカーペプチドは、３以下、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、または６０以下のアミノ酸の長さを、有することができる。いくつかの態様において、リンカーペプチドは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０のアミノ酸の長さを、有することができる。いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも１０および６０以下のアミノ酸、少なくとも１０および５５以下のアミノ酸、少なくとも１０および５０以下のアミノ酸、少なくとも１０および４５以下のアミノ酸、少なくとも１０および４０以下のアミノ酸、少なくとも１０および３５以下のアミノ酸、少なくとも１０および３０以下のアミノ酸、少なくとも１０および２５以下のアミノ酸、少なくとも１０および２０以下のアミノ酸、または少なくとも１０および１５以下のアミノ酸を、含む。
【0027】
「可動性の」リンカーは、溶液中で固定構造（二次または三次構造）を有さない炭化水素またはペプチドリンカーを、指す。かかる可動性のリンカーは、それゆえ様々な立体配座を自由に採用することができる。本明細書において使用の可動性のリンカーは、小さい、非極性の（例として、Ｇｌｙ）および／または、極性の（例として、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸残基で構成される炭化水素リンカー、およびペプチドリンカーを含む。単純なアミノ酸（例として、単純な側鎖（例として、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＯＨ）を有するアミノ酸）は、これらのアミノ酸上の分枝の側鎖の欠如が、より大きな可動性（例として、二次元または三次元の可動性）をリンカーの中で、および、従って、ポリペプチド組成物の中で提供するので、ペプチドリンカーの使用に適している。可動性のリンカーは、可動性を維持するためにＴｈｒおよびＡｌａなどの追加のアミノ酸を、ならびに溶解性を改善するためにＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を、含有してもよい。アミノ酸は、機能（例として、発現されたおよび／または活性なポリペプチド（単数または複数）で結果として生じる）を維持する、一貫したいかなるやり方においても、代替／反復することができる。可動性のリンカーは、たとえば、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ６５（１０）：１３５７－１３６９； ＵＳ ２０１２／０２３２０２１； ＵＳ ２０１４／００７９７０１； Ｗ０ １９９９／０４５１３２； ＷＯ １９９４／０１２５２０およびＷＯ ２００１／１０５３４８０中に、記載されている。
【0028】
特定の側面において、可動性のリンカーは、炭化水素リンカーである。Ｒ１およびＲ２または個々のＲ２部分を連結する炭化水素は、合成ペプチドが、所望された配座を達成することができるように、十分な長さおよび可動性を有するべきである。ある態様において、炭化水素は、１以上のメチレン（－ＣＨ２）基で構成される。ある態様において、炭化水素は、３と２５の間のメチレン基、すなわち－（ＣＨ２）ｎ－を含み、ここでｎが、３～２５である。ある態様において、炭化水素リンカーは、構造－（ＣＨ２）６－を有する。グリコールリンカーなどの追加の炭素ベースリンカーも、本発明の合成ペプチドにおいて、使用されることができる。
【0029】
他の態様において、リンカーは、固定したリンカーである。「固定した」リンカーは、溶液中にある場合に、比較的に、明確に定義された配座を採用する分子を、指す。固定したリンカーは、それゆえ、溶液中で、特定の二次および／または三次構造を有するものである。固定したリンカーは、典型的には、二次または三次構造をリンカーに授けるのに十分なサイズをもつ。かかるリンカーは、芳香族分子（例として、ＵＳ ６，０９６，８７５またはＵＳ ５，９４８，６４８を参照）、プロリンが豊富なペプチドリンカー、または可動性でないヘリックス構造を有するペプチドリンカーを含む。固定したリンカーは、例えば、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ６５（１０）：１３５７－１３６９； ＵＳ ２０１０／０１５８８２３、およびＵＳ ２００９／１０２２１４７７中に、記載されている。
【0030】
他の態様において、リンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏで切断可能なリンカーである。ｉｎ ｖｉｖｏの切断可能なリンカーは、２つのシステイン残基の間に形成される切断可能なジスルフィド結合、または、例として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって認識されるプロテアーゼ認識配列を有するリンカーを、含むことができる。
【0031】
合成ペプチドの使用の好適なペプチドリンカーの例は、表２中に提供される。
ｎは、１～５である。Ｘは、いかなるアミノ酸残基でもあってもよいが、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕである。
【表2】
【0032】
本発明の合成ペプチドの個々のリンカーのそれぞれは、同じであるかまたは異なることができる。いくつかの態様において、合成ペプチドは、少なくとも１つの可動性のリンカーを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの可動性のリンカーは、炭化水素リンカーである。他の態様において、少なくとも１つの可動性のリンカーは、ペプチドリンカーである。特定の態様において、合成ペプチドの各リンカーは、炭化水素リンカーである。ある態様において、合成ペプチドの各リンカーは、構造－（ＣＨ２）６－を有する。
【0033】
繰り返し単位と可動性のリンカーとの組み合わせを含有する合成ペプチドの例は、表３において提示される。
【表3】
【0034】
いくつかの側面において、本発明の合成ペプチドは、薬学的に許容し得る塩として調製される。本明細書に使用されるとき、用語「薬学的に許容し得る塩」は、健全な医学判断の範囲内で、ヒト、および下等動物の組織と、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしでの接触における使用に好適であり、妥当な便益／危険比率に相応する合成ペプチドの、それらの塩を指す。薬学的に許容し得る塩は、当該技術分野において周知である。例として、Ｂｅｒｇｅ， ｅｔ ａｌ． （１９７７） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６６：１－１９を参照。塩は、本発明のペプチドの最終的な単離および精製の間に、その場で、または、別に遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって、調製されることができる。薬学的に許容し得る塩の例は、アミノ基と、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機の酸、または酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸などの有機酸とで形成されるか、またはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を用いることによる、無毒の酸付加塩を含むが、これに限定されるものではない。他の薬学的に許容し得る塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸、グルコナート、ヘミスルホン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、ペルオキソ硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、琥珀酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むが、これに限定されるものではない。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等を含む。さらなる薬学的に許容し得る塩は、適切な場合、無毒のアンモニウム、四級アンモニウム、および、ハロゲン化物、水酸化物、カルボキシラート、スルファート、ホスファート、ニトラート、１から６の炭素原子を有するアルキル、スルホナート、およびアリールスルホナートなどの対イオンを用いて形成されたアミンカチオンを、含む。
【0035】
本明細書に記載の合成ペプチドは、一般に融合またはキメラペプチドと称される。かかる分子は、組換えタンパク質発現、化学物質合成、またはそれらの組み合わせを含むルーチンの方法によって、合成されることができる。いくつかの態様において、本発明の合成ペプチドは、組換えによって、組換えＤＮＡ技術を用いて合成される。よって、本発明は、本発明の合成ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、提供する。関連した側面において、本発明は、ベクター、とりわけ本発明の合成ペプチドをコードするポリヌクレオチドを収容する発現ベクターを、提供する。ある態様において、ベクターは、真核細胞または原核細胞における所望の合成ヒスタチンの組換え合成を促進する複製、転写、および／または翻訳制御配列を、提供する。従って、本発明は、合成ペプチドの組換え発現のための宿主細胞、および宿主細胞によって生成される合成ペプチドを回収し、精製する方法も、提供する。組換えペプチドの生成および精製は、当業者にルーチンの実行であり、いかなる好適な方法論も、使用されることができる。
【0036】
別の態様において、合成ペプチドは、当該技術分野において公知の化学物質合成技法のいずれか、とりわけ固相合成技法によって、たとえば、商業的に入手可能な自動化されたペプチド合成装置を使用して、合成される。たとえば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ （１９８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．； Ｔａｒｎ， ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５：６４４２－５５； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１－３４７； およびＢａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３０：７０５－７３９参照。
【0037】
合成ペプチドは、ゲルろ過およびアフィニティ精製を含むが、これに限らず、当該技術分野において公知のいかなる好適な方法によっても、単離されおよび／または精製されることができる。いくつかの態様において、合成ペプチドは、合成ペプチドの単離を促進するためのタグ、例としてエピトープタグとともに生成される。一側面において、合成ペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定されるとき、少なくとも１％純粋であり、例として少なくとも５％純粋で、少なくとも１０％純粋で、少なくとも２０％純粋で、少なくとも４０％純粋で、少なくとも６０％純粋で、少なくとも８０％純粋で、少なくとも９０％純粋である。一旦単離されおよび／または精製されると、合成ペプチドの特性は、容易に当業者に公知の技法によって、確認されることができる。
【0038】
本明細書に記載の合成ペプチドの誘導体および類似体は、全て予測され、置換、添加、および／または欠失／切断よって、それらのアミノ酸配列を変化させることによって、または、結果として機能的に等価な分子になる化学物質修飾を導入することによって、作成されることができる。いずれかのポリペプチドの配列におけるあるアミノ酸が、ポリペプチドの活性に悪影響を与えることなく、他のアミノ酸と置換されてもよいことが、当業者によってよく理解されるだろう。
【0039】
ある態様において、本発明の合成ペプチドは、これに限らず、リン酸化、グリコシル化、ヒドロキシル化、スルホン化、アミド化、アセチル化、カルボキシル化、パルミチル化、ＰＥＧ化、非加水分解性結合の導入、およびジスルフィド形成を含む１以上の修飾を含む。修飾は、合成ペプチドの安定性および／または活性を改善してもよい。
【0040】
たとえば、Ｃ末端は、アミド化、ペプチドアルコールおよびアルデヒドの付加、エステルの付加、またはｐ－ニトロアニリンおよびチオエステルの付加によって、修飾されてもよい。Ｎ末端および側鎖は、ＰＥＧ化、アセチル化、ホルミル化、脂肪酸の付加、ベンゾイルの付加、ブロモアセチルの付加、ピログルタミルの付加、スクシニル化、テトラブチオキシカルボニル（tetrabutyoxycarbonyl）の付加、および３－メルカプトプロピルの付加、アシル化（例として、リポペプチド）、ビオチン化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、マレイミド基の導入、部分、発色団、または蛍光団のキレート化によって、修飾されてもよい。
【0041】
一態様において、合成ペプチドは、脂肪酸に接合され、例として、合成ペプチドはミリストイル化される。たとえば、脂肪酸は、合成ペプチドのＮ末端に接合されてもよい。かかる脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等々を含む。さらにその上、合成ペプチドのシステインは、パルミトイル化されることができる。一態様において、合成ペプチドは、Ｎ末端アミノ酸でミリスチル化、ステアリル化、またはパルミトイル化される。
【0042】
加えて、または、変形例として、翻訳後修飾に、合成ペプチドは、担体ペプチドなどの別のペプチドに、接合されることができるかまたは連結されることができる。担体ペプチドは、細胞－貫通を促進してもよく、アンテナペディアペプチド、ペネトラチンペプチド、ＴＡＴ、トランスポータン、またはポリアルギニンなどのペプチドを、含むことができる。一つの態様において、合成ペプチドは、アンテナペディアペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５６）に接合されるかまたは連結される。
【0043】
本発明の合成ペプチドは、環化されてもよい。本明細書に使用されるとき、用語「環化された」または「環状の」は、アミノ酸残基に間に、環状の構造を形成するために少なくとも１つの架橋基（例として、アミド、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カルバミン酸エステル、炭化水素、またはスルホンアミド）を組み込む、直鎖ペプチドの類似体を、示す。架橋基は、側鎖のアミノ酸残基または末端アミノ酸残基上に存在することができ、それにより側鎖環化（例として、ラクタム架橋、チオエステル）、頭－尾環化、または炭化水素ステープルペプチドを、提供することができる。
【0044】
ある態様において、環状の合成ペプチドは、２つの末端システイン残基の間に、ジスルフィド架橋を有する。環化された合成ペプチドを調製するための代表的なアミノ酸配列は、表４において提供される。
【表4】
【0045】
他の態様において、環状合成ペプチドは、直鎖ペプチドから、ソルターゼによる環化によって、調製される。「ソルターゼによる環化」または「ソルターゼにより環化された」は、直鎖ペプチドを、酵素ソルターゼを用いて環化する方法を指す。ソルターゼ－ベースの環化は、大きい環状のペプチドを製造することに関して、当該技術分野において公知である。Ｂｏｌｓｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２５（８）：２６５０－２６５８、およびその中の引用文献参照。
【0046】
ブテラーゼ環化も、ペプチドを環化するために用いられてきた。Ｃ末端のトリペプチドＡｓｎ－ｈｉｓ－Ｖａｌのモチーフの付加は、合成ペプチドを、ソルターゼＡのそれより著しく速い速度で環化するために、基質をブテラーゼに提供する。Ｎｇｕｙｅｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １１：１９７７－８８； Ｔａｍ， ｅｔ ａｌ． （Ｊｕｎｅ ２０１５） Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２０１５： Ｐｒｏｃ． ２４ｔｈ Ａｍ． Ｐｅｐｔ． Ｓｙｍｐ．， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ， ｐｇ． ２７参照。
【0047】
当業者は、本発明の合成ペプチドが、疾患の処置のために有益であると、認めるだろう。従って、投与を促進するために、本発明は、１以上の内因性および／または合成ペプチド、および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含有する組成物も、提供する。本明細書に提供される医薬組成物は、経口の、眼の、静脈内の、硝子体内の、結膜下の、皮下の、筋肉内の、腹腔内の、脳内の、動脈内の、門脈内の、病巣内の、鞘内の、鼻腔内の投与または局所投与のために、製剤化されることができる。好適な医薬組成物は、たとえば、投与の意図された経路、送達フォーマット、および所望の投与量に依存して、当業者によって、決定されることができる。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９５）参照。
【0048】
合成ペプチド（単数または複数）は、ゲル、希釈液、クリーム、タブレット、カプセル、ピル、溶液、点眼液、スプレー、絆創膏、コンタクトレンズ、貯留物、注射可能物、移植可能物、または徐放性製剤などの従来の投与形態で、組み込まれることができる。投与形態は、必要な生理学的に受け入れられる担体材料、賦形剤、滑沢剤、緩衝液、界面活性剤、抗細菌剤、充填剤（マンニトールなどの）、酸化防止剤（アスコルビン酸またはナトリウム亜硫酸水素塩）またはその種の他のものを含んでもよい。
【0049】
許容可能な製剤材料は、好ましくは、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに無毒である。医薬組成物は、たとえば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌、安定性、溶解または放出の速度、組成物の吸着または透過を、修飾、維持、または保存するための製剤材料を、含有してもよい。好適な製剤材料は、以下を含むが、これに限定されるものではない：アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど）；抗菌物質；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸などの）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；着色剤、香料、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩－形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０などのポリソルベート、ＴＲＩＴＯＮ、トリメタハムイン、レシチン、コレステロール、またはチロキサポールなど）；安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）；等張増強剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトール、またはソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバント。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｄ参照。
【0050】
医薬組成物の第１の担体または賦形剤は、天然において水性でもよいかまたは非水系でもよい。たとえば、好適な担体または賦形剤は、おそらく非経口投与のための組成物において一般的な、その他の材料で補充される、注射用蒸留水、生理的食塩水溶液、または人工脳脊髄液でもよい。血清アルブミンと混和される中性の緩衝食塩水または食塩水は、さらなる例示的な賦形剤である。医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝剤、または約ｐＨ４．０～５．５の酢酸塩緩衝剤を含むことができ、それは、ソルビトールまたは好適な代用品をさらに含んでもよい。本発明の医薬組成物は、所望された程度の純度を有する選択された組成物を、任意の製剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｄ．）と、凍結乾燥されたケークまたは水性溶液の形で混和することによって、保存のために調製されてもよい。さらに、本発明の合成ペプチドは、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【0051】
本発明の医薬組成物のための投与経路は、経口経路；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路による注入；または持続的放出システムを介する、または移植デバイスによるものを、含む。医薬組成物は、ボーラス注入によって、または連続的に点滴によって、または埋め込みデバイスによって、投与されてもよい。医薬組成物は、合成ヒスタチン（単数または複数）が吸収されたかまたはカプセル化された膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みを経て、局所的に投与されることもできる。埋め込みデバイスが使用される所で、該デバイスは、いずれかの好適な組織または臓器に埋め込まれてもよく、内因性または合成のヒスタチン（単数または複数）の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または連続投与を介してもよい。
【0052】
非経口投与が意図される場合に、本発明のために用いられる組成物は、パイロジェンフリーな、薬学的に許容し得るビヒクルにおける本発明の内因性または合成のヒスタチン（単数または複数）を含有する、非経口的に許容可能な水性溶液の形でもよい。非経口注入のための、とりわけ好適なビヒクルは、合成ペプチド（単数または複数）が、その中で、無菌性等張溶液として製剤化され、適切に保存される、無菌性蒸留水である。調製は、注入可能なミクロスフェア、バイオ－浸食可能粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズ、またはリポソームなどの、合成ペプチド（単数または複数）の制御または持続放出を提供してもよい剤との、合成ペプチド（単数または複数）の製剤化に関わることができ、それは、次いで貯留物注入を介して送達されてもよい。とりわけ、ヒアルロン酸を伴う製剤は、血行における持続期間を推進する効果を有する。
【0053】
組成物は、吸入のために製剤化されてもよい。これらの態様において、本発明の合成ペプチド（単数または複数）は、吸入のための乾燥粉末として製剤化され、または吸入溶液は、噴霧療法によるなどの、エアロゾル送達のための推進体によって、製剤化されてもよい。肺投与は、例としてＷＯ１９９４／０２００６９で、さらに記載されている。
【0054】
本発明の医薬組成物は、経口的になどの、消化管を通して、送達されることができる。かかる薬学的に許容し得る組成物の調製は、当該技術の熟練の範囲内である。この様式で投与される本発明の合成ペプチド（単数または複数）は、タブレットおよびカプセルなどの固体投与形態の調合において習慣的に使用される担体の有無にかかわらず、製剤化されてもよい。バイオアビアビリティが、最大化され、および、あらかじめ全身性の分解が、最小化される場合に、カプセルは、製剤の活性部分を消化管中の位置でリリースするために設計されてもよい。追加の剤は、合成ペプチド（単数または複数）の吸収を促進するために含まれることができる。希釈剤、香料、低い融点のワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、タブレット崩壊剤、および結合剤も、使用されてもよい。
【0055】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを、含有してもよい。微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌性および抗真菌性剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、およびその他同種のものの包含によって、確保されることができる。糖、塩化ナトリウム、およびその他同種のものなどの等張剤を含むことが、所望されてもよい。注入可能な製薬形態の長期にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる剤の包含によってもたらされることができる。
【0056】
ある態様において、合成ペプチド（単数または複数）は、眼球表面上および内部の両方で、眼疾患または状態を処置するために製剤化される。特定の態様において、本発明の合成ペプチド（単数または複数）は、製剤化され、以下の通り眼球に投与されてもよい；滴下の形態で；局所のゲルの形態で；固体の製剤（例として、ＬＡＣＲＩＳＥＲＴ、ヒドロキシプロピルセルロースの眼挿入剤と同様の）として；前眼房への注入によって；血管新生の阻害、破壊的なＭＭＰ活性の阻害のための、または上皮創傷治癒を増強するための後眼房への注入によって、；外科的デバイス（眼内レンズ、緑内障デバイス、角膜補綴、涙腺挿管チューブ、涙腺バイパスチューブ）のコーティングによって；コンタクトレンズのコーティングによって；またはマイクロビーズ、ナノビーズ、または他の同様の構築物のコーティングによって。
【0057】
当業者も認識するとおり、本明細書に記載の組成物は、有害副作用の最小化をもたらすように、製剤化されることができる。本明細書に記載の組成物は、長期使用のために単独で好適であることができ；抗菌剤（例として、ヒスタチン、シスタチン、ラクリチン、ラクトフェリン、ＬＬ－３７）、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、免疫調節剤（例として、糖質コルチコイド、サイクロスポリン、ＮＳＡＩＤ）、抗傷剤（例として、マイトマイシンＣまたは同様の代謝拮抗剤）、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、麻酔剤、またはそれらの組み合わせと一緒になって補助治療として有用であり；および／または、これらの剤のいずれかまたは全部の間の循環に関わり、それによっていずれかの剤への長期暴露（および、それゆえ、結果として生じる副作用）を減少させるプログラムにおいて有用である。
【0058】
本発明は、１以上の合成ペプチド、または同じものを含有する医薬組成物、および、任意に１以上の抗菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、免疫調節剤、抗傷剤、コラーゲン、ゼラチン、鎮痛剤、または麻酔剤を含有するキットも、提供する。キットは、典型的に好適な容器（例として、たとえば、フォイル、プラスチック、または段ボールパッケージ）において提供される。ある態様において、キットは、本明細書に記載されているとおり、１以上の医薬賦形剤または担体、医薬賦形剤、その他同種のものを含んでもよい。他の態様において、キットは、たとえば、目盛付きカップ、シリンジ、針、洗浄補助器具、眼内レンズ、緑内障デバイス、眼窩インプラント、角膜補綴、涙腺挿管チューブ、涙腺バイパスチューブ、コンタクトレンズ、およびその他同種のものなどの、適切な投与のための手段を、含んでもよい。ある態様において、キットは、適切な投与のための取扱説明書および／または適切な投与のための調製物を含んでもよい。
【0059】
創傷治癒および本明細書に開示の合成ペプチドの活性を推進する上皮細胞移動を考慮すれば、本発明は、創傷治癒および／または上皮細胞移動を推進するために、かかる処置を必要とする対象に、有効量の１以上の本発明の合成ペプチドを投与することによって、創傷治癒および／または上皮細胞移動を推進する方法も提供する。「対象」は、本明細書に使用されるとき、ヒト、ならびにヒト以外の動物、とりわけ疾患または状態を有するものを含み、それは、例として、外科的創傷、切除創傷、疱疹、潰瘍、他の障害、スクラッチ、剥離創傷、切り傷、不潔な創傷、沸騰および熱または腐食性熱傷などの、上皮欠陥および再発性の上皮浸食に関係する創傷または他の身体表面障害の処置における治療として、創傷治癒および／または上皮細胞移動の推進から利益を得てもよい。
かかる創傷は、機械的損傷および、ステロイド、放射線治療、非ステロイド性抗炎症薬、および抗がん薬の系統的使用に関係する糖尿病、角膜ジストロフィ、尿毒症、栄養不足、ビタミン欠乏、肥満、感染、免疫欠乏、または合併症など他の疾患によって引き起こされることができる。
かかる創傷は、機械的損傷および、ステロイド、放射線治療、非ステロイド性抗炎症薬、および抗がん薬の系統的使用に関係する糖尿病、角膜ジストロフィ、尿毒症、栄養不足、ビタミン欠乏、肥満、感染、免疫欠乏、または合併症など他の疾患によって引き起こされることができる。
【0060】
注目すべきことに、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列を含む合成ペプチドも、ＥＲＫ１／２活性化を増大させることが、示された。従って、本発明は、かかる処置を必要とする対象に、ＥＲＫ活性化を増大させるための有効な量で、本発明の１以上の合成ペプチドを投与することによって、ＥＲＫ活性化を増大させるための方法も、提供する。ＥＲＫ調節が、自然免疫系および適応免疫系の両方において重要であることが、十分に確立されている（Ｚｈａｎｇ ＆ Ｄｏｎｇ （２００５） Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２（１）：２０－２７）。本明細書に立証されるように、Ｈｓｔ５の適用は、リン酸化されたＥＲＫ１／２のシグナル強度を増大させ、このことは、創傷上皮へのＨｓｔ５の増大したＥＲＫ１／２活性化を示した。加えて、未処置およびＳＰ１ペプチド（ＳＨＲＧＹ（配列番号２）を欠く）処置試料は、ｐＥＲＫ１／２と同様の局在位置を有し、Ｈｓｔ５およびＳＰ２処置試料は、創傷治癒の部位で、ｐＥＲＫ１／２の免疫局在性を上昇させた。この予想外の結果は、これまでＥＲＫを調節するいかなる公知の能力も有せず、機能ドメインの理解に基づいてそうすることを予測されなかっただろうＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドが、本明細書に開示の合成ペプチドに、免疫調節活性を授けることができることを示す。
【0061】
本明細書に使用されるとき、用語「有効量」または「治療有効量」は、明示された所望の結果を達成するに十分な本発明の合成ペプチド、または該合成ペプチドを含有する医薬組成物の、量を指す。いくつかの側面において、有効量は、かかる処置を受けなかった対象と比較して、上皮細胞移動速度、創傷閉鎖速度または時間、および／またはＥＲＫおよび生存経路調節の増大における測定可能な改善を提供する。「有効量」または「治療有効量」を構成するペプチドの量は、処置される患者の疾患の重篤度、状態、体重、または年齢、投与の頻度、または投与の経路に応じて、変化してもよいが、日常的に当業者によって、決定されることができる。処置される場所および状態に応じて、合成ペプチドの１ナノモルから５００マイクロモルの範囲またはそれより多い用量が、使用されてもよい。臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量または投与経路を滴定して（ｔｉｔｅｒ）もよい。典型的な投与量は、上記の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれより多い範囲にある。ある態様において、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲でもよい。
【0062】
対象を「処置すること」は、以下の１以上を達成することを意味する：（ａ）疾患または状態の重篤度を減少させること；（ｂ）疾患または状態の進展を抑えること；（Ｃ）疾患または状態を悪化させることを阻害すること；（ｄ）あらかじめ疾患または状態を有していた患者における疾患または状態の再発を制限するかまたは防御すること；（ｅ）疾患または状態の退行を引き起こすこと；（ｆ）疾患または状態の症状を改善するかまたは除去すること；および／または（ｇ）生存を改善すること。
【0063】
本発明に従って、合成ペプチドは、これに限定されないが、角膜炎症（例として、Ｍｏｏｒｅｎのまたは炎症性および感染性潰瘍）、壊死性強膜炎、炎症によって媒介される眼の表面疾患、アルカリ熱傷、およびアトピー性であるかアレルギー性結膜炎または湿疹性疾患などの慢性アトピー性疾患、真菌および細菌性感染、および角膜および結膜創傷、とりわけ神経栄養性／糖尿病性神経障害と関連する創傷などの、眼の表面炎症性障害を含む、眼の疾患または状態の処置において、特に使用される。
【0064】
眼の疾患または状態の処置に加えて、合成ペプチドは、とりわけ創傷、炎症、がん、感染、または障害の処置における、関連する他の組織または臓器の創傷治癒および／または上皮移動を推進するために、手直しされることができる。一態様において、薄板状組織、神経組織、結合組織、血管組織、筋肉組織、骨格組織、または血液成分が、処置される。別の態様において、皮膚、肝臓、肺、腎臓、心臓、または腸などの臓器が、処置される。
【0065】
以下の非限定例を、さらに本発明を例証するために、提供する。
【0066】
例１：材料および方法
ペプチド合成。
ヒスタチン－５ペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）上の標準Ｆｍｏｃベース固相合成化学を使用して、合成した。第１のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ－ＯＨ）を、Ｗａｎｇ樹脂に共有結合した。ペプチドを、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン中でのＦｍｏｃ基の除去で開始し、サイクルで合成した。次のアミノ酸を、３０分間Ｘ２で０．４Ｍの４－メチルモルホリンを含有するＤＭＦ中０．１ＭのＨＢＴＵを使用して連結し、そしてこのプロセスを、連続させて合成を完了した。樹脂結合したペプチドを、脱保護し、そしてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して樹脂から切断した。エチルエーテルを加えて、ペプチドを、ＴＦＡ溶液から沈殿させた。沈殿したペプチドを、次いで水中５０％アセトニトリルで溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチドを、ＢｉｏＣａｄＳＰＲＩＮＴ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）ＨＰＬＣシステムを使用して、Ｋｉｎｅｔｅｘ（商標）逆相Ｃ１８カラム、１５０×２１．１ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）上で、精製した。純粋なペプチド画分を、エレクトロスプレーイオン化電離質量分析（ＥＳＩ ＭＳ）によって同定し、適切に凍結乾燥した。ＳＨＲＧＹ（配列番号２）の環化されたバージョンを、６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）カプロン酸、（６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸（Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ４））で構成されるリンカー／スペーサーを使用して、調製した。
ペプチド合成。
ヒスタチン－５ペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）上の標準Ｆｍｏｃベース固相合成化学を使用して、合成した。第１のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ－ＯＨ）を、Ｗａｎｇ樹脂に共有結合した。ペプチドを、Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジン中でのＦｍｏｃ基の除去で開始し、サイクルで合成した。次のアミノ酸を、３０分間Ｘ２で０．４Ｍの４－メチルモルホリンを含有するＤＭＦ中０．１ＭのＨＢＴＵを使用して連結し、そしてこのプロセスを、連続させて合成を完了した。樹脂結合したペプチドを、脱保護し、そしてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して樹脂から切断した。エチルエーテルを加えて、ペプチドを、ＴＦＡ溶液から沈殿させた。沈殿したペプチドを、次いで水中５０％アセトニトリルで溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチドを、ＢｉｏＣａｄＳＰＲＩＮＴ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、ＣＡ）ＨＰＬＣシステムを使用して、Ｋｉｎｅｔｅｘ（商標）逆相Ｃ１８カラム、１５０×２１．１ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）上で、精製した。純粋なペプチド画分を、エレクトロスプレーイオン化電離質量分析（ＥＳＩ ＭＳ）によって同定し、適切に凍結乾燥した。ＳＨＲＧＹ（配列番号２）の環化されたバージョンを、６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）カプロン酸、（６－（Ｆｍｏｃ－アミノ）ヘキサン酸（Ｃ２１Ｈ２３ＮＯ４））で構成されるリンカー／スペーサーを使用して、調製した。
【0067】
ペプチドを、細胞培養物グレード水中で溶解し、１０ｍＭのストック濃度を得て、－２０℃で保存された。スクランブルペプチド（ＳＰ１、ＳＰ２、ＳＰ３、ＳＰ４およびＳＰ５）を、対照として使用した。ＳＰ１は、完全長の天然のＨｓｔ５ペプチドに基づく、２４のアミノ酸残基スクランブルペプチドであった。ＳＰ２は、１９のスクランブルＮ末端アミノ酸残基（天然のＨｓｔ５ペプチドのＮ末端の１９のアミノ酸残基に基づく）およびＣ末端でＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列を、含んだ。ＳＰ３およびＳＰ４は、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドのスクランブルバージョンであり、ＳＰ５は、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）に対して同様の電荷特性および分子量を伴う、ランダムなペンタペプチドであった。表５は、この研究で使用したペプチドの配列を、示す。
【表5】
【0068】
細胞培養。ヒト角膜輪部上皮（ＨＣＬＥ）細胞を、０．２ｎｇ／ｍＬのｒｈＥＧＦ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ウシ下垂体抽出物（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、および１％のアンホテリシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で補充されたケラチノサイト－血清フリーの培地（Ｋ－ＳＦＭ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で培養した。標準細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ２、＞９５％湿度）を、ルーチンの継代の間、使用した。培養培地を、播種後４８時間毎に置き換えた。
【0069】
ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞を、Ｍｅｄｉｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で培養した。ＨｅＬａ細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で維持した。両方の培地を、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で補充した。ＭＣＦ－７細胞株を、３７℃で、５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気中で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ； Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）および１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）で補充されたＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０； Ｇｉｂｃｏ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で、培養した。
【0070】
ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析を、各細胞株に遂行し、使用した各細胞株の確実性を確認した。
【0071】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏスクラッチアッセイ。ＨＣＥ、ＨＣＬＥ、ＨＥＬＡ、およびＭＣＦ－７細胞を、２．５ｘｌ０５（細胞／ウェル）播種密度で、２４ウェルプレート中で培養して、２４ウェルプレート上にコンフルエントに増殖させた。続いて、直線状のスクラッチを、無菌性Ｐ２００ピペット先端部材で作成した。細胞を、次いで２回リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞の破片を取り除いた。創傷領域を、次いで、低減された血清条件を伴う標準培地の様々な濃度（ＭＥＭ培地中の０．５％ＦＢＳ（ＨＣＥ）、成長因子フリーのＫ－ＳＦＭ培地（ＨＣＬＥ）、ＤＭＥＭ培地中の１％ＦＢＳ（ＨｅＬａ）、およびＲＰＭＩ １６４０培地中の０．５％ＦＢＳ（ＭＣＦ－７））で、表５中に提供されるペプチドで、処理した。スクラッチを、顕微鏡によって、４×倍率（Ｉｍａｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で、毎時間、実験のコースにわたって撮影した。各時点の創傷領域を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｊ １．４７ｖ， ＮＩＨ， Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を用いて、測定した。相対的な創傷閉鎖を、処置した創傷の閉鎖を未処置の創傷のそれで割ることによって、算出した。トランケートされたヒスタチン－５を含むすべての実験のために、８０μＭの最終的な濃度を、使用した。５０μＭの最終的な濃度で、ＰＤ９８０５９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ））を、ＭＥＫの具体的な阻害剤として使用した。ＰＤ９８０５９を、細胞培養と同時に、ヒスタチンペプチドとして加えた。
【0072】
創傷治癒アッセイ。マウスにおける角膜創傷実験を、視覚と眼科学研究協会会議（ＡＲＶＯ）のＳｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って遂行した。プロトコルは、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｃｈｉｃａｇｏの承認を得た。１２～１９週齢のＣ５７ＢＬｌ６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって麻酔した。局所の０．５％プロパラカインの２つの滴下を適用した後に、中枢上皮の２．０－ｍｍの領域を、２－ｍｍの使い捨て可能な生検パンチを使用して境界を定めて、ＡｌｇｅｒＢｒｕｓｈ ＩＩ（Ｔｈｅ Ａｌｇｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｌａｇｏ Ｖｉｓｔａ， ＴＸ）によって取り除いた。処置（ｎ＝７）または対照（ｎ＝７）群において、Ｈｉｓｔａｔｉｎ＝５（８０μＭ）、ＳＨＲＧＹペプチド（配列番号２；８０μＭ）、またはＳＰ１（８０μＭ）を、角膜に１日３回適用した。０、１８、および２４時間で、角膜を、フルオレセイン（ＦＵＬ－ＧＬＯ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｓｔｒｉｐｓ， Ａｋｏｒｎ， Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ， ＩＬ）で染色し、そしてＮＩＫＯＮ Ｄ２００カメラ（（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ， ＮＹ）を伴うＮＩＫＯＮ ＦＳ－２フォト－スリットランプを使用して、撮影した。創傷サイズを、各マウスに関してベースラインと比較し、そして創傷閉鎖のパーセンテージを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、測定した。
【0073】
細胞発芽アッセイ。細胞発芽アッセイを、商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の下で販売された可溶性基底膜中のＨＣＥ細胞を使用して、遂行した。（ＭＥＭ １：１中で低減化し、希釈した；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ， ＭＡ）。ＨＣＥ細胞を、可溶性基底膜に、５ｘｌ０５細胞／１０μＬスポットで、植えた。次いで、細胞スポットプレートを、低減した血清培地（０．５％ＦＢＳ）（未処置の陰性対照）、Ｈｓｔ５（５０μＭ）、または１０％ＦＢＳ（陽性対照）に暴露した。次いで、ＨＣＥ細胞移動を、時間経過顕微鏡によって追跡し、４ｘで画像化した（Ｉｍａｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＣＡ）。所与の時点での細胞被覆領域を、Ｉｍａｇｅ Ｊを使用して、測定した。
【0074】
ウエスタンブロット。ウエスタンブロットを、標準的な方法に追従して、実施した。タンパク質ライセート（２０μｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中で、１０分間沸騰させ、そして、１２％ＮｕＰＡＧＥ（商標）ビス－トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）上で電気泳動に供して、続いて、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｒｏｔｒａｎ， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）へ移動した。次いで、膜を、３％脱脂粉乳を含有するトリス－緩衝食塩水によって、１時間ブロックし、ｐＥＲＫ１／２に対する第１の抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒ、ＭＡ）（１：１０００）とともに、４℃で終夜インキュベートした。０．０５％ポリソルベート２０を含有する０．０５％トリス－緩衝食塩水で洗浄後に、次いで、膜を、二次抗体としてヤギ抗－ウサギ－ＨＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）（１：２０００）とともに、１時間インキュベートした。膜を、Ｘ線フィルムおよびＥＣＬ Ｐｒｏ溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して現像した。ベータ－アクチンを、内部標準として使用した。
【0075】
免疫蛍光画像化。ＨＣＥ細胞を、９ｘ１０４（細胞／ウェル）播種密度で、８－ウェルチャンバースライドに中に播種して、そしてインキュベートさせて、コンフルエントな単層を形成させた。続いて、直線状のスクラッチを、無菌性Ｐ１０ピペット先端部材で作成した。次いで、細胞を、培地で洗浄し、細胞の破片を取り除いた。続いて、創傷領域を、未処置のまま、または０．５％ＦＢＳを伴うＭＥＭ培地中８０μＭの濃度で、Ｈｓｔ５、ＳＰ１、またはＳＰ２と、４５分間処置したままにした。細胞を、次いで４％のパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、そして０．１％トリトンＸ－１００で、５分間透過化処理した。ＰＢＳで洗浄の後、細胞を、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および５％正常ヤギ血清で、室温で３０分間インキュベートした。細胞を、続いて１％ＢＳＡ中に希釈したｐ－ＥＲＫ１／２（ｌ：２００）に対する第１の抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ， Ｄａｎｖｅｒ， ＭＡ）とともに、４℃で１６時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄の後、細胞を、１％ＢＳＡ中に希釈したフルオレセインイソチオシアネート接合ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）（１：５００）とともに、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳでの広範な洗浄の後、細胞を、次いで、４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールで、核染色のため２分間染色した（ＤＡＰＩ； （Ｒｏｃｈｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ＧＥ）。細胞を、トリス緩衝剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｔｔｆｉｅｌｄ， ＰＡ）とともにフルオロゲル中に搭載し、そして共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で、対物ｌ０ｘを使用して、観察した。
【0076】
免疫蛍光法のために、切除されたマウス眼球全体を、最適切断温度化合物（ＯＣＴ；（Ｆｉｓｈｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｇａｌｄｅｒｍａ， ＣＡ））において急速凍結した。凍結組織を、１０μｍ凍結切片（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮＸ５０ Ｃｒｙｏｍｉｃｒｏｔｏｍｅ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に切り、そして続いてＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔプラススライド（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に搭載した。スライドを、メタノール中で２０分間固定し、数回ＰＢＳによって洗浄し、２分間ＤＡＰＩで染色して、そしてさらにＰＢＳおよび脱イオン水によって洗浄した。スライドを、トリス緩衝剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈａｔｔｆｉｅｌｄ， ＰＡ）とともにフルオロゲル中に搭載し、そして共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で、対物ｌ０Ｘを使用して、観察した。
【0077】
統計分析。実験を、２方向または１方向ＡＮＯＹＡ、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉまたはＤｕｎｎｅｔｔの事後検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、適切に分析した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、実施した。
【0078】
マウス角膜創傷実験のための試料サイズを決定するための能力分析は、処置（ＳＨＲＧＹ（配列番号２）またはＨｓｔ５）と対照（ＳＰ１）群間を比較するＧ－Ｐｏｗｅｒを使用して、実施した。算出のためのパラメータは、０．８のベータ、０．０５のアルファ、および２５％の効果サイズを含み、そしてｎ＝６の群あたりの試料サイズを生んだ。
【0079】
例２：ヒスタチン－５が、細胞移動を推進する
商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ， ＭＡ）の下で販売された成長因子低減可溶性基底膜中のスポットとして植えられたＨＣＥ細胞を使用した細胞発芽アッセイを、ＨＳＴ５が上皮細胞移動を推進することができるかどうか決定するために、使用した。７２時間で、ビヒクルのみの対照と比較して、統計的に有意な増大が、Ｈｓｔ５（５０μＭ）処置条件における細胞移動において、あった。ＨＣＬＥ細胞株を使用した、標準化スクラッチアッセイで、細胞移動に対するＨｓｔ５の効果を試験した。ＨＣＬＥ細胞を、コンフルエントに増殖させ、機械的にピペット先端部材で傷つけた。細胞を、Ｈｓｔ５の種々の濃度（２０、５０、８０、および１００μＭ）で処置するか、または対照として未処置のままにした。経時的顕微鏡検査法を実施し、創傷領域を、種々の時点で分析した。この分析は、未処置の対照と比較して、Ｈｓｔ５の適用によるｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイ閉鎖速度における用量依存的増加を立証した。スクラッチ閉鎖率におけるもっとも著しい増加は、５０μＭで通知された。これらの所見は、スクランブルペプチド対照（ＳＰ１）と比較して、８０μＭで統計的に有意なピーク効果を伴うＨＣＥ角膜細胞株において、補強された。統計的に有意な効果は、ＨｅＬａ細胞株およびＭＣＦ－７乳がん細胞株でも観察された。
商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ， ＭＡ）の下で販売された成長因子低減可溶性基底膜中のスポットとして植えられたＨＣＥ細胞を使用した細胞発芽アッセイを、ＨＳＴ５が上皮細胞移動を推進することができるかどうか決定するために、使用した。７２時間で、ビヒクルのみの対照と比較して、統計的に有意な増大が、Ｈｓｔ５（５０μＭ）処置条件における細胞移動において、あった。ＨＣＬＥ細胞株を使用した、標準化スクラッチアッセイで、細胞移動に対するＨｓｔ５の効果を試験した。ＨＣＬＥ細胞を、コンフルエントに増殖させ、機械的にピペット先端部材で傷つけた。細胞を、Ｈｓｔ５の種々の濃度（２０、５０、８０、および１００μＭ）で処置するか、または対照として未処置のままにした。経時的顕微鏡検査法を実施し、創傷領域を、種々の時点で分析した。この分析は、未処置の対照と比較して、Ｈｓｔ５の適用によるｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイ閉鎖速度における用量依存的増加を立証した。スクラッチ閉鎖率におけるもっとも著しい増加は、５０μＭで通知された。これらの所見は、スクランブルペプチド対照（ＳＰ１）と比較して、８０μＭで統計的に有意なピーク効果を伴うＨＣＥ角膜細胞株において、補強された。統計的に有意な効果は、ＨｅＬａ細胞株およびＭＣＦ－７乳がん細胞株でも観察された。
【0080】
例３：Ｈｓｔ５のＣ末端ＳＨＲドメインは、上皮細胞移動を推進するために要求される
上皮細胞移動のために要求されるＨｓｔ５の残基を特定するために、連続切断実験を実施し、徐々にＨｓｔ５中の残基を除去した。この分析は、移動を推進するのに、Ｈｓｔ５のＣ末端ＳＨＲＧＹ（配列番号２）残基が、必要十分なことを示した（図１）。すべてのペプチドを、８０μＭ濃度で試験した。Ｃ末端ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列を含まなかった、Ｈｓｔ５の短縮バージョン、すなわち、Ｈｓｔ５（１－１４）、Ｈｓｔ５（ｌ－１９）、Ｈｓｔ５（ｌ－２１）、Ｈｓｔ５（ｌ－２２）、およびＨｓｔ５（１－２３））は、創傷閉鎖率の著しい増加を示さなかった（図１）。しかしながら、完全なＳＨＲＧＹ配列、すなわちＨｓｔ５、Ｈｓｔ５（５－２４）、ＳＰ２、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）、前記配列の４つの繰り返し単位で構成されるＳＨＲＧＹ（配列番号２）の多量体（すなわち、ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ（配列番号５１））、および環化されたＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチド（ｃ－ＳＨＲＧＹ）を含有する構築物は、スクラッチ閉鎖率において、有意な増加を示した（図１）。スクランブルペプチドＳＰ３およびＳＰ４は、有意に創傷閉鎖率を増加させなかった。同じく、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）に対して同様の分子量および電荷特性を伴うランダムなペンタペプチドＳＰ５は、創傷閉鎖率の有意な改善を示さなかった。よって、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイにおける上皮移動速度を推進するために、必要十分である。
上皮細胞移動のために要求されるＨｓｔ５の残基を特定するために、連続切断実験を実施し、徐々にＨｓｔ５中の残基を除去した。この分析は、移動を推進するのに、Ｈｓｔ５のＣ末端ＳＨＲＧＹ（配列番号２）残基が、必要十分なことを示した（図１）。すべてのペプチドを、８０μＭ濃度で試験した。Ｃ末端ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列を含まなかった、Ｈｓｔ５の短縮バージョン、すなわち、Ｈｓｔ５（１－１４）、Ｈｓｔ５（ｌ－１９）、Ｈｓｔ５（ｌ－２１）、Ｈｓｔ５（ｌ－２２）、およびＨｓｔ５（１－２３））は、創傷閉鎖率の著しい増加を示さなかった（図１）。しかしながら、完全なＳＨＲＧＹ配列、すなわちＨｓｔ５、Ｈｓｔ５（５－２４）、ＳＰ２、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）、前記配列の４つの繰り返し単位で構成されるＳＨＲＧＹ（配列番号２）の多量体（すなわち、ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ－（ＣＨ２）６－ＳＨＲＧＹ（配列番号５１））、および環化されたＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチド（ｃ－ＳＨＲＧＹ）を含有する構築物は、スクラッチ閉鎖率において、有意な増加を示した（図１）。スクランブルペプチドＳＰ３およびＳＰ４は、有意に創傷閉鎖率を増加させなかった。同じく、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）に対して同様の分子量および電荷特性を伴うランダムなペンタペプチドＳＰ５は、創傷閉鎖率の有意な改善を示さなかった。よって、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクラッチアッセイにおける上皮移動速度を推進するために、必要十分である。
【0081】
例４：ＥＲＫ活性化が、Ｈｓｔ５のプロ移動効果のために必要である
創傷の有無、Ｈｓｔ５適用の有無によるＥＲＫの活性化／リン酸化のレベルを、Ｈｓｔ５のプロ移動効果を支える細胞シグナル伝達経路が、他の上皮細胞タイプにおけるＨｓｔ１のものと同様だったかどうかを決定するために、調査した。創傷は、増大したＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）のリン酸化形態を、引き起こす。免疫局在性を、上皮のスクラッチシートへのＨｓｔ５の適用が、ｐＥＲＫ１／２レベルに影響を及ぼすかどうかを決定するために、用いた。ウエスタンブロット分析によって、創傷が、ｐＥＲＫ１／２レベルを単独で増加させて、これらのレベルが、さらにＨｓｔ５の適用によって増加したことが、確認された。ＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有スクランブルペプチドＳＰ２の適用は、Ｈｓｔ５に対する相対強度に対して、ｐＥＲＫ１／２レベルを増大させた。ＳＰ１、それはＳＨＲＧＹ（配列番号２）を含有しないが、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有ペプチドと同様の増大を、ｐＥＲＫ１／２免疫局在性において、引き出さなかった。Ｈｓｔ５およびＭＥＫ特異的阻害剤ＰＤ９８０５９の共処置は、Ｈｓｔ５の効果が、ＥＲＫ活性化を要求することを示す、創傷閉鎖を推進することにおける、Ｈｓｔ５の効果を除去した。
創傷の有無、Ｈｓｔ５適用の有無によるＥＲＫの活性化／リン酸化のレベルを、Ｈｓｔ５のプロ移動効果を支える細胞シグナル伝達経路が、他の上皮細胞タイプにおけるＨｓｔ１のものと同様だったかどうかを決定するために、調査した。創傷は、増大したＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）のリン酸化形態を、引き起こす。免疫局在性を、上皮のスクラッチシートへのＨｓｔ５の適用が、ｐＥＲＫ１／２レベルに影響を及ぼすかどうかを決定するために、用いた。ウエスタンブロット分析によって、創傷が、ｐＥＲＫ１／２レベルを単独で増加させて、これらのレベルが、さらにＨｓｔ５の適用によって増加したことが、確認された。ＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有スクランブルペプチドＳＰ２の適用は、Ｈｓｔ５に対する相対強度に対して、ｐＥＲＫ１／２レベルを増大させた。ＳＰ１、それはＳＨＲＧＹ（配列番号２）を含有しないが、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有ペプチドと同様の増大を、ｐＥＲＫ１／２免疫局在性において、引き出さなかった。Ｈｓｔ５およびＭＥＫ特異的阻害剤ＰＤ９８０５９の共処置は、Ｈｓｔ５の効果が、ＥＲＫ活性化を要求することを示す、創傷閉鎖を推進することにおける、Ｈｓｔ５の効果を除去した。
【0082】
例５：Ｈｓｔ５の適用は、マウス角膜障害モデルの創傷治癒を推進する
角膜障害の標準マウスモデルを使用して、Ｈｓｔ５またはＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドの局所投与が、スクランブルペプチド対照（ＳＰ１）より優れていたレベルで、角膜創傷閉鎖率における有意な改善を提供したことを、観察した（図２）。創傷角膜の組織学的分析（角膜の断面上のＤＡＰＩ染色）は、ＳＰ１処置対照と比較して、Ｈｓｔ５処置状態における角膜創傷サイズの低下の病理学証拠を、立証した。よって、Ｈｓｔ５およびＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有ペプチドは、マウス角膜上皮障害の綿密に調べられたモデルにおいて、創傷治癒を増強することができる。
角膜障害の標準マウスモデルを使用して、Ｈｓｔ５またはＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペプチドの局所投与が、スクランブルペプチド対照（ＳＰ１）より優れていたレベルで、角膜創傷閉鎖率における有意な改善を提供したことを、観察した（図２）。創傷角膜の組織学的分析（角膜の断面上のＤＡＰＩ染色）は、ＳＰ１処置対照と比較して、Ｈｓｔ５処置状態における角膜創傷サイズの低下の病理学証拠を、立証した。よって、Ｈｓｔ５およびＳＨＲＧＹ（配列番号２）－含有ペプチドは、マウス角膜上皮障害の綿密に調べられたモデルにおいて、創傷治癒を増強することができる。
【0083】
例６：毒性および塩の形態
ＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペンタペプチドの増大する濃度、すなわち、３１．２５μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、２０００μＭ、４０００μＭ、および８０００μＭに暴露されたヒト角膜上皮細胞は、従来のＷＳＴ１アッセイを用いて決定したとき、２４時間後、４０００μＭ以下の濃度で細胞生存度における最小の低下を示し、またはＬＤＨアッセイにおいて、２４時間で、４０００μＭ濃度を超えるまで、細胞死を誘導した。
ＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペンタペプチドの増大する濃度、すなわち、３１．２５μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、２０００μＭ、４０００μＭ、および８０００μＭに暴露されたヒト角膜上皮細胞は、従来のＷＳＴ１アッセイを用いて決定したとき、２４時間後、４０００μＭ以下の濃度で細胞生存度における最小の低下を示し、またはＬＤＨアッセイにおいて、２４時間で、４０００μＭ濃度を超えるまで、細胞死を誘導した。
【0084】
ＳＨＲＧＹ（配列番号２）ペンタペプチドの種々の塩の形態の細胞毒性も、調査した。ＳＨＲＧＹ（配列番号２）の３つの種々の塩の形態、すなわち、酢酸、塩酸塩、およびトリフルオロ酢酸を、調製し、従来のＷＳＴ１アッセイを使用して決定したとおり、毒性を、１５．６２５μＭ、３１．２５μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、および５００μＭで分析した。ＳＨＲＧＹ（配列番号２）の３つ全ての塩の形態は、未処置の試料と比較して、試験したペプチド濃度のいずれでも、有意な毒性を、示さなかった。
【0085】
３つの塩の形態の創傷閉鎖速度を、本明細書に開示の方法に従っても分析した。とりわけ、ヒト角膜上皮細胞を、標準化されたスクラッチアッセイを使用して傷つけ、そして創傷治癒の速度を、ＳＨＲＧＹ（配列番号２）の酢酸、塩酸、およびトリフルオロ酢酸塩形態の適用の後、測定した。すべての試験した形態は、創傷閉鎖の増大された速度を提示した（図３）。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】