特表2023-504118複数の独立したセル内の分子のプローブ溶液を収容するための装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】複数の独立したセル内の分子のプローブ溶液を収容するための装置
(51)【国際特許分類】
G01N 23/205 20180101AFI20230125BHJP
B01D 9/02 20060101ALI20230125BHJP
G01N 1/28 20060101ALI20230125BHJP
G01N 1/00 20060101ALI20230125BHJP
G01N 23/20025 20180101ALI20230125BHJP
G01N 23/2055 20180101ALI20230125BHJP
【ＦＩ】
G01N23/205
B01D9/02 602Z
B01D9/02 603Z
G01N1/28 W
G01N1/00 101H
G01N23/20025
G01N23/2055 310
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022531543
(86)(22)【出願日】2020-11-16
(85)【翻訳文提出日】2022-05-27
(86)【国際出願番号】 EP2020082185
(87)【国際公開番号】W WO2021104906
(87)【国際公開日】2021-06-03
(31)【優先権主張番号】19212142.4
(32)【優先日】2019-11-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501494414
【氏名又は名称】パウル・シェラー・インスティトゥート
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】辻野 壮一郎
(72)【発明者】
【氏名】富崎 孝司
【テーマコード（参考）】
2G001
2G052
【Ｆターム（参考）】
2G001AA01
2G001AA08
2G001BA18
2G001CA01
2G001DA09
2G001JA03
2G001JA10
2G001KA08
2G001MA04
2G001QA01
2G052DA06
2G052DA12
2G052DA23
2G052DA33
2G052EB05
2G052GA09
2G052GA19
(57)【要約】
本発明は、結晶の成長のために、溶液（１２）等である結晶化媒体を収容するための装置（２）を開示する。この装置は複数のセル（３）と、上述のセル（３）内の試料ホルダ（９）内の上述の結晶（２８）のＸ線回折実験のためのシステム（７０，１２０）とを含んでおり、これによって結晶（２８）の原子構造が決定される。上述のセル（３）は、ウェル（４）と、上述のウェル（４）内に配置されている薄いプレート（１０，１１）を含んでいる試料ホルダ（９）と、上部プレート（５）と、下部プレート（６）とを含んでいる。溶液（１２）は、試料ホルダ（９）内で、上述の薄いプレート（１０，１１）の間に、または単に１枚の薄いプレート上に収容されている。上部プレート（５）および／または下部プレート（６）の少なくとも一方は開口部（７）を備えており、この開口部（７）は、上述の開口部（７）を封止するキャップ（８）を有している。再使用可能なキャップ（８）を取り外すことによって、各試料ホルダ（９）を各ウェル（４）から独立して取り出すことができる。さらに、本発明は、原子分解で結晶構造を決定するために超音波音響浮揚装置（７６，１２６）を利用した、装置（２）のウェルから取り出された試料ホルダ（９）内に含まれている小さい結晶（２８，９４，１３４）のための自動化されたＸ線回折実験のシステム（７０，１２０）を開示する。各試料ホルダ（９）は、自動化された器具（１０１，１０２，１０３）を使用して、遠隔で、装置（２）から回収され、音響浮揚装置内へ装填される。Ｘ線回折像のデータ収集中に、試料ホルダを、試料ホルダの円板面に対して垂直な軸線を中心に回転させ、同時にＸ線ビームおよび回転軸線に対して垂直な方向において移動させることによって、Ｘ線ビーム（８２，１２２）は、スパイラル軌道に沿って、上述の浮揚させられている試料ホルダ（８５，１２５）にわたってスキャンされる。上述の結晶の一連の結晶構造解析Ｘ線回折データセットは、上述の試料ホルダにわたった上述のＸ線ビームのスキャン中に、高速フレームレートでピクセル化されるＸ線画像検出器（８３，１２３）を使用してＸ線回折像（８４，１２４）を連続的に記録することによって収集される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶液（１２）等である結晶化媒体からの分子の結晶（２８）の成長のための装置であって、前記結晶化媒体は前記分子を含んでおり、前記結晶（２８）はＸ線回折実験に適しており、これによって成長した前記結晶（２８）を含んでいる液滴において、原子分解で結晶の構造が分解され、前記液滴は、試料ホルダ（９）によって保持されており、前記装置は、
ａ）複数の独立したセル（３）を含んでおり、前記複数の独立したセル（３）は、ウェル（４）のアレイ、上部プレート（５）および下部プレート（６）によって提供され、これによって前記試料ホルダ（９）のための容積が形成され、各ウェル（４）は、前記上部プレート（５）と前記下部プレート（６）との間に試料ホルダ（９）を収容するように設計されており、前記上部プレート（５）および前記下部プレート（６）の一方または両方は、取り外し可能なキャップ（８）を備えた開口部（７）を有しており、
ｂ）独立したセルのスタックを含んでおり、前記独立したセルのスタックは、前記上部プレート（５）、試料ホルダフレーム（１４）、前記下部プレート（６）およびスペーサ層（１３，２０）によって形成されており、任意選択的に、前記層の間に接着層が挿入されており、
ｃ）前記試料ホルダフレーム（１４）に結合されている前記試料ホルダ（９）の周囲にある前記スペーサ層（１３，２０）内のスペーサバー（２１）を含んでおり、各ウェル（４）は、前記試料ホルダ（９）と前記試料ホルダフレーム（１４）との間の開口部を通じて前記試料ホルダ（９）の上方および下方の空間において、前記溶液の蒸気と平衡状態になるように調整されており、
ｄ）各ウェル（４）の前記キャップ（８）の厚さによって調整可能な各ウェル（４）の容積を含んでおり、
ｅ）前記上部プレート（５）、下部プレート（６）、キャップ（８）、スペーサ層（１３，２０）および任意選択的に前記接着層は防水材料から作製されており、
前記試料ホルダ（９）は、低いＸ線散乱を有する薄いプレートとして設計されており、
前記薄いプレートは、好ましくは、５～５０μｍの範囲の厚さを有しているポリイミドまたはフッ素化ポリイミドで作製されている、
装置。
【請求項2】
各試料ホルダ（９）は、サンドイッチ結晶化法を介して、溶液（１２）から分子の前記結晶（２８）を成長させるのに適した薄いプレート（１０，１１）を含んでおり、さらに、ａ）前記試料ホルダフレーム（１４）は上部試料ホルダフレーム（１４）と下部試料ホルダフレーム（１６）とに分割されており、前記試料ホルダ（９）の上部の薄いプレート（１０）の周囲の前記スペーサバー（２１）は前記上部試料ホルダフレーム（１４）に結合されており、前記試料ホルダ（９）の下部の薄いプレート（１１）の周囲のスペーサバー（２１）は前記下部試料ホルダフレーム（１６）に結合されており、かつ
ｂ）前記試料ホルダ（９）のすべての前記上部の薄いプレート（１０）は、１つの層として、前記試料ホルダ（９）の周囲の前記スペーサバー（２１）を介して前記上部試料ホルダフレーム（１４）に結合されており、前記試料ホルダ（９）のすべての前記下部の薄いプレート（１１）も、１つの層として、前記試料ホルダ（９）の周囲の前記スペーサバー（２１）を介して前記下部試料ホルダフレーム（１６）に結合されている、
ことを含んでいる、請求項１記載の装置。
【請求項3】
前記試料ホルダ（９）の前記薄いプレート（１０，１１）の表面は凹部容積（２７）を有しており、前記凹部容積（２７）は、好ましくは、前記試料ホルダ（９）の前記スペーサバー（２１）の部分まで延在している、請求項１または２記載の装置。
【請求項4】
前記薄いプレート（１０，１１）の縁部に接着剤（３９）が配置されており、好ましくは、前記接着剤（３９）は前記スペーサバー（２１）に結合されている、請求項２または３記載の装置（２）。
【請求項5】
前記溶液の蒸発を減らすために、前記溶液（１２）に面する表面の側で、前記試料ホルダ（９）の前記薄いプレート（１０，１１）の縁部に突起および／または溝（４４）がパターン形成されている、請求項２から４までのいずれか１項記載の装置（２）。
【請求項6】
原子分解で結晶の構造を分解するためにＸ線回折像を収集する、室温で結晶の自動化された一連の結晶構造解析実験を行うシステム（７０，１２０）であって、前記システム（７０，１２０）は、
ａ）音響浮揚装置およびＸ線源（８１）およびハイフレームレートＸ線画像検出器を含んでいる音響浮揚回折計（７６，１２６）と、
ｂ）前記結晶（２８）の試料を前記試料ホルダ（９）内に有する、請求項１から５までのいずれか１項記載の装置（２）と、
ｃ）前記音響浮揚装置の軸線を、前記Ｘ線源によって生成されたＸ線ビームに対して斜角で回転させるゴニオステージと、
ｄ）前記音響浮揚回折計の前記音響浮揚装置（７６，１２６）を、前記Ｘ線ビームおよび前記音響浮揚装置の前記軸線に対して垂直な横方向において移動させる並進ステージと、
ｅ）前記試料ホルダ（８５，１２５）を前記装置（２）から回収する機構と、
を含んでおり、
ｆ）前記データ収集中の、前記試料ホルダ（８５，１２５）上の前記Ｘ線ビーム（８２，１２２）のスポットのスパイラル軌道は、前記音響浮揚装置（７６，１２６）における音響浮揚させられている前記試料ホルダ（８５，１２５）の回転と、前記音響浮揚装置（７６，１２６）による前記試料ホルダ（８５，１２５）の同時の横方向の並進との組み合わせによって達成され、
前記音響浮揚装置（７６，１２６）の超音波音圧は、前記音響浮揚装置（７６，１２６）において音響浮揚させられている前記試料ホルダ（８５，１２５）の回転速度を、その軸線が前記Ｘ線ビーム（８２，１２２）に対して斜めになるように設定するように調整されており、横方向の並進速度は、これに従って、所与のＸ線光子束での試料結晶（９４，１３４）上の適切なＸ線線量を伴って、前記試料ホルダ（８５，１２５）上の前記Ｘ線ビーム（８２，１２２）の前記スポットの前記スパイラル軌道の間の半径方向間隔を調整するように設定されている、
システム（７０，１２０）。
【請求項7】
前記スパイラル軌道の間の前記半径方向間隔は１０～２０μｍの範囲にあり、前記半径方向間隔は、典型的には５～１００μｍ、好ましくは１０～２０μｍ以下の範囲のサイズの小さい結晶に対して、前記一連の結晶構造解析実験を、各回折像につき１つの結晶での高い結晶命中率で行うのに好ましく、前記半径方向間隔は、前記試料ホルダ（８５，１２５）を約２ｒｐｓで回転させるのに約０．５ｋＰａの前記超音波音圧が加えられ、かつ横方向の前記並進ステージの前記並進速度が約０．２ｍｍ／秒に設定されている場合に設定されているものである、請求項６記載のシステム（７０，１２０）。
【請求項8】
前記超音波音圧および前記回転速度、横方向の前記並進速度ならびに前記ハイフレームレートＸ線画像検出器のフレームレートは、前記結晶試料上のＸ線の最大線量を、所与のＸ線光子束で結晶あたり１０～１０３ｋＧｙ未満に制限しながら、前記データセットの所定のデータ収集効率および信号対ノイズ比の値に調整される、請求項６または７記載のシステム（７０，１２０）。
【請求項9】
前記Ｘ線ビームの前記光子束は、タンパク質結晶構造解析実験を可能にするように調整されている、請求項６から８までのいずれか１項記載のシステム（７０，１２０）。
【請求項10】
前記試料ホルダ（９）の前記薄いプレート（１０，１１）の面に対して垂直な軸線を中心とした前記試料ホルダ（９，１２５）の回転を制御するために、器具（１４６）が前記試料ホルダ（９）に力を及ぼし、前記力は細い空気流によって生成されている、または前記力は音響放射力であり、前記音響放射力は、一定の圧の、または超音波の振幅または周波数に関して変調された圧の、または前記音響浮揚装置（１２６）の前記軸線の方向ならびに前記Ｘ線ビーム（１２２）の方向を横切る方向においてパルス変調された圧の超音波伝搬波または超音波定在波によって誘導される、請求項６から９までのいずれか１項記載のシステム（７０，１２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、複数の独立したセル内の分子のプローブ溶液を収容するための装置に関する。さらに、本発明は、原子分解で結晶構造を決定するための（小さい）結晶のＸ線回折実験のためのシステムに関する。上述の結晶は、上述の装置から取り出された試料ホルダ内で成長させられる。
【0002】
中間相において媒体中で混合された分子の溶液を、薄いガラスプレートの間に挟んで、元来の設定で分子の結晶を成長させるサンドイッチ結晶化法が知られている。この方法で成長した結晶を用いた回折実験の場合、サンドイッチプレートから結晶を取り出さなければならない。これは、ガラスプレートを切断し、結晶の周囲の不要な結晶化媒体を除去し、試料ホルダ上に、重ならずに結晶を回収することを含んでいる。媒体中の試料の乾燥を避けるために、この試料調製を短時間で行う必要があることを考慮すると、非能率的な従来技術の方法は、これらの時間制約を効率的にサポートするものではない。
【0003】
本発明の課題は、従来技術で必要とされる手動介入を最小限に抑え、粘性結晶媒体を伴うサンドイッチプレート内で成長した結晶の回折実験の自動化されたパイプラインを実現することである。
【0004】
上述の課題は、本発明に相応に、溶液または流体等である結晶化媒体からの分子の結晶の成長のための装置によって解決され、結晶化媒体は上述の分子を含んでおり、上述の結晶はＸ線回折実験に適しており、これによって上述の成長した結晶を含んでいる液滴において、原子分解(atomic resolution)で結晶の構造が分解(solve)され、上述の液滴は、サンドイッチ結晶化法に適した試料ホルダによって保持されており、上述の装置は、
ａ）複数の独立したセルを含んでおり、複数の独立したセルは、ウェルのアレイ、上部プレートおよび下部プレートによって提供され、これによって試料ホルダのための容積が形成され、各ウェルは、上部プレートと下部プレートとの間に試料ホルダを収容するように設計されており、上部プレートおよび下部プレートの一方または両方は、取り外し可能なキャップを備えた開口部を有しており、
ｂ）独立したセルのスタックを含んでおり、独立したセルのスタックは、上部プレート、試料ホルダフレーム、下部プレートおよびスペーサ層によって形成されており、任意選択的に、上述の層の間に接着層が挿入されており、
ｃ）試料ホルダフレームに結合されている上述の試料ホルダの周囲にあるスペーサ層内のスペーサバーを含んでおり、各ウェルは、試料ホルダと試料ホルダフレームとの間の開口部を通じて試料ホルダの上方および下方の空間において、溶液の蒸気と平衡状態になるように調整されており、
ｄ）各ウェルの上述のキャップの厚さによって調整可能な各ウェルの容積を含んでおり、
ｅ）上述の上部プレート、下部プレート、キャップ、スペーサ層および任意選択的に接着層は防水材料から作製されており、上述の試料ホルダは、低いＸ線散乱を有する薄いプレートとして設計されており、上述の薄いプレートは、好ましくは、５～５０μｍの範囲の厚さを有しているポリイミドまたはフッ素化ポリイミドで作製されている。
ａ）複数の独立したセルを含んでおり、複数の独立したセルは、ウェルのアレイ、上部プレートおよび下部プレートによって提供され、これによって試料ホルダのための容積が形成され、各ウェルは、上部プレートと下部プレートとの間に試料ホルダを収容するように設計されており、上部プレートおよび下部プレートの一方または両方は、取り外し可能なキャップを備えた開口部を有しており、
ｂ）独立したセルのスタックを含んでおり、独立したセルのスタックは、上部プレート、試料ホルダフレーム、下部プレートおよびスペーサ層によって形成されており、任意選択的に、上述の層の間に接着層が挿入されており、
ｃ）試料ホルダフレームに結合されている上述の試料ホルダの周囲にあるスペーサ層内のスペーサバーを含んでおり、各ウェルは、試料ホルダと試料ホルダフレームとの間の開口部を通じて試料ホルダの上方および下方の空間において、溶液の蒸気と平衡状態になるように調整されており、
ｄ）各ウェルの上述のキャップの厚さによって調整可能な各ウェルの容積を含んでおり、
ｅ）上述の上部プレート、下部プレート、キャップ、スペーサ層および任意選択的に接着層は防水材料から作製されており、上述の試料ホルダは、低いＸ線散乱を有する薄いプレートとして設計されており、上述の薄いプレートは、好ましくは、５～５０μｍの範囲の厚さを有しているポリイミドまたはフッ素化ポリイミドで作製されている。
【0005】
上述の課題は、システムに関して、本発明に相応に、原子分解で結晶の構造を分解するためにＸ線回折像を収集する、室温で結晶の自動化された一連の結晶構造解析実験を行うシステムによって解決され、このシステムは
ａ）音響浮揚装置およびＸ線源を含んでいる音響浮揚回折計(acoustic levitation diffractometer)
ｂ）結晶の試料を試料ホルダ内に有する、請求項のいずれか１項記載の装置
ｃ）音響浮揚装置の軸線を、Ｘ線源によって生成されたＸ線ビームに対して斜角で回転させるゴニオステージ
ｄ）上述の音響浮揚回折計の音響浮揚装置を、Ｘ線ビームおよび音響浮揚装置の軸線に対して垂直な横方向において移動させる並進ステージ
ｅ）上述の試料ホルダを装置から回収する機構
を含んでおり、
ｆ）データ収集中の、試料ホルダ上のＸ線ビームのスポットのスパイラル軌道は、音響浮揚装置における音響浮揚させられている試料ホルダの回転と、音響浮揚装置による試料ホルダの同時の横方向の並進との組み合わせによって達成され、音響浮揚装置の超音波音圧は、音響浮揚装置において音響浮揚させられている試料ホルダの回転速度を、その軸線がＸ線ビームに対して斜めになるように設定するように調整されており、横方向の並進速度は、これに従って、所与のＸ線光子束での試料上の適切なＸ線線量を伴って、試料ホルダ上のＸ線ビームスポットのスパイラル軌道の間の半径方向間隔を調整するように設定されている。
ａ）音響浮揚装置およびＸ線源を含んでいる音響浮揚回折計(acoustic levitation diffractometer)
ｂ）結晶の試料を試料ホルダ内に有する、請求項のいずれか１項記載の装置
ｃ）音響浮揚装置の軸線を、Ｘ線源によって生成されたＸ線ビームに対して斜角で回転させるゴニオステージ
ｄ）上述の音響浮揚回折計の音響浮揚装置を、Ｘ線ビームおよび音響浮揚装置の軸線に対して垂直な横方向において移動させる並進ステージ
ｅ）上述の試料ホルダを装置から回収する機構
を含んでおり、
ｆ）データ収集中の、試料ホルダ上のＸ線ビームのスポットのスパイラル軌道は、音響浮揚装置における音響浮揚させられている試料ホルダの回転と、音響浮揚装置による試料ホルダの同時の横方向の並進との組み合わせによって達成され、音響浮揚装置の超音波音圧は、音響浮揚装置において音響浮揚させられている試料ホルダの回転速度を、その軸線がＸ線ビームに対して斜めになるように設定するように調整されており、横方向の並進速度は、これに従って、所与のＸ線光子束での試料上の適切なＸ線線量を伴って、試料ホルダ上のＸ線ビームスポットのスパイラル軌道の間の半径方向間隔を調整するように設定されている。
【0006】
したがって、サンドイッチ結晶化法によって、中間相等の粘性結晶媒体において成長した結晶の回折実験の自動化されたパイプラインが、高輝度Ｘ線ビームを含んでいるＸ線回折計、ハイフレームレートでピクセル化されるＸ線画像検出器、超音波音響浮揚装置および遠隔で、本発明の装置において粘性結晶媒体において成長した上述の結晶を含んでいる複数の試料ホルダのうちの１つの試料ホルダを上述の装置から回収して、上述の試料ホルダをＸ線回折計へ送る器具によって実現される。試料ホルダにわたったＸ線ビームのスパイラル軌道でのスキャンを実現するために、浮揚させられた試料ホルダの回転および位置が制御される。
【0007】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、添付の従属請求項によって定義される。
【0008】
本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照しながら以降で説明する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】分子を含んでいる溶液を収容するための装置を概略的に示す図であり、上述の装置は複数のセルを含んでおり、各セルは、ウェルおよびウェル内の溶液用の試料ホルダを含んでいる。
【図2】第１の薄いプレート、第２の薄いプレートおよびそれらの間の溶液を含んでいる試料ホルダを概略的に示す図である。
【図3】セルの一例を概略的に示す図である。
【図4】斜視図（左側の上部パネル）、閉じられたセルの上面図（左側の下部パネル）およびセルの線Ａ－Ａ’に沿った断面図において装置を概略的に示す図である。
【図5】斜視図（左側の上部パネル）、閉じられたセルの上面図（左側の下部パネル）およびセルの線Ａ－Ａ’に沿った断面図において装置を概略的に示す図である。
【図6】第１の薄いプレート、第２の薄いプレートおよびそれらの間の溶液を含んでいる試料ホルダの例を概略的に示す図である。
【図7】第１の薄いプレート、第２の薄いプレートおよびそれらの間の溶液を含んでいる試料ホルダのための例を概略的に示す図である。
【図8】第１の薄いプレート、第２の薄いプレートおよびそれらの間の溶液を含んでいる試料ホルダの例を概略的に示す図である。
【図9】セルの別の例を概略的に示す図である。
【図10】斜視図（左側の上部パネル）、閉じられたセルの上面図（左側の下部パネル）およびセルの線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った断面図において装置を概略的に示す図である。
【図11A】第１の薄いプレート、第２の薄いプレートおよびそれらの間の溶液を含んでいる試料ホルダの別の例（左側のパネル）と、試料ホルダの線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った断面（右側のパネル）とを概略的に示す図である。
【図12】自動化された結晶回折実験を行うための従来技術の器械を側方から概略的に示す図である。
【図14】試料ホルダ内の成長した小さい結晶のＸ線回折実験を行うシステムを側方から概略的に示す図である。
【図15A】音響浮揚装置において浮揚および回転させられる試料ホルダ内の成長した小さい結晶のＸ線回折実験のシステムを上から概略的に示す図である。
【図15B】試料ホルダ上のＸ線ビームのスパイラル軌道を概略的に示す図である。
【図16】他のウェルを開放することなく、装置の複数のウェルのうちの１つのウェルを開放する器具を概略的に示す図であり、上述の装置は複数のセルを含んでいる。
【図17】複数のウェルのうちの１つのウェルが開放されたときに、複数のウェルのうちの１つのウェルから、複数の試料ホルダのうちの１つの試料ホルダを取り出す器具を概略的に示す図である。
【図18】装置の複数のウェルのうちの１つのウェルから取り出された複数の試料ホルダのうちの１つの試料ホルダを、器械の音響浮揚装置に送る器具を概略的に示す図である。
【図19】Ｘ線回折実験中の０秒（スキャンの開始）、４秒および８秒（スキャンの終了）の時点での浮揚させられている試料ホルダのスナップショットを概略的に示す図である。
【図20】下部パネルは、音響浮揚装置の軸線が鉛直方向から３０°だけ回転させられたときの、浮揚させられている試料ホルダの回転速度と超音波圧の振幅との間の関係を示す図であり、上部パネルは、音響浮揚装置の軸線が鉛直方向から３０°だけ傾斜させられたときの、浮揚させられている試料ホルダの回転の中心の二乗平均平方根（ＲＭＳ）変動と超音波圧の振幅との間の関係を示す図である。
【図21】試料ホルダ内の成長した小さい結晶のＸ線回折実験を行うための器械を側方から概略的に示す図である。
【図22】音響浮揚装置において浮揚および回転させられる試料ホルダ内の成長した小さい結晶のＸ線回折実験を行う器械を上から概略的に示す図である。
【図23A】音響浮揚装置において浮揚および回転させられる試料ホルダ内の成長した小さい結晶によるＸ線回折実験のための器械を側方から概略的に示す図である。
【図23B】横方向音響定在波が試料ホルダの回転を調整するときに、試料ホルダ内の成長した小さい結晶によるＸ線回折実験のための器械の方向に沿った点から見た、側方からの概略図である。
【図24】下部パネルは、フレーム数の関数としての、試料ホルダ内の成長した小さい結晶上の推定線量との間の関係を示す図であり、上部パネルは、スキャンが進行するときの、Ｘ線が命中した小さい結晶の累積数を示す図である。
【0010】
図１は、分子を含んでいる溶液を収容する装置２を概略的に示している。上述の装置２は、複数のセル３を含んでいる。各セル３のウェル４内で、上述の溶液は、１枚の薄いプレート１０上で混ぜ合わされる、または試料ホルダ９の少なくとも２枚の薄いプレート１０、１１の間で混ぜ合わされ、溶液中に含まれている上述の分子の結晶２８を成長させる。種々のセル３内の各ウェル４は、結晶２８の成長後のリガンド溶液の浸漬のために個別に開放可能である。他のセル３のウェル４を開放することなく、結晶２８の原子構造を決定するために、異なるウェル４内の各試料ホルダ９を個別に取り出すことができる。
【0011】
図１～図４を参照すると、装置２は、キャップ８を備えた開口部７を有する上部プレート５と、上部セパレータ１３と、試料ホルダ９の複数の第１の薄いプレート１０がスペーサバー２１を介して結合されている第１の薄いプレートのフレーム１４と、薄いプレートのセパレータ１５と、複数の第２の薄いプレート１１がスペーサバー２１を介して結合されている第２の薄いプレートのフレーム１６と、下部セパレータ２０と、下部プレート６とを含んでいる（図１、図３および図４を参照）。各試料ホルダ９について、上部の薄いプレート１０と下部の薄いプレート１１とが溶液１２を挟んでいる。
【0012】
図２は、第１の薄いプレート１０と第２の薄いプレート１１とを含んでいる試料ホルダ９を概略的に示している。右側のパネルは、左側のパネルに示されている線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った上述の試料ホルダ９の断面を概略的に示している。上述の薄いプレート１０と薄いプレート１１との間に、上述の溶液１２が貯蔵されている。溶液１２内で小さい結晶２８が成長する。
【0013】
分子の結晶の成長のために、装置２は、たとえば次の順序で組み立てられる。第１に、上述の第１の薄いプレートのセパレータ１５、複数の上述の第２の薄いプレート１１を有する上述の第２の薄いプレートのフレーム１６および上述の下部セパレータ２０が、上述の下部プレート６の上に積層される。第２に、複数の上述の第２の薄いプレート１１上に溶液液滴が分配される。第３に、キャップ８を備えた上述の上部プレート５、上述の上部セパレータ１３、複数の上述の第１の薄いプレート１０を有する上述の第１の薄いプレートのフレーム１４および上述の薄いプレートのセパレータ１５が積層される。最後に、層５、１３および１４の上述のスタックが、層１５、１６、２０を含んでいるスタックおよび６の上に積層される。装置２のセル３の各ウェル４は、これらの層と上部プレート５と下部プレート６との間に添加された接着剤によって封止されている。好ましくは、上述の層と上述の上部プレートと下部プレートとの位置合わせのためのガイド構造が、これらの層の位置合わせのために提供され、これによって、この装置は、たとえばこれらの層に孔を提供し、これらの層の上述の孔の位置で下部プレートおよび／または上部プレートに突出部を提供するように組み立てられる。
【0014】
図５は、斜視図（左側の上部パネル）、閉じられたセル３の上面図（左側の下部パネル）および線Ａ－Ａ’を通る平面に沿ったセル３の断面図において装置２を概略的に示している。ここでは、上部プレート５が開口部７を有しており、この開口部７は、上述のウェル４を封止するキャップ８を備えており、かつ右側に示されているように、他のウェル４を開放せずに、ウェル４から試料ホルダ９を個別に取り出すために開放可能である。下部プレート２２は付加的な凹部容積２３を有しており、これは上部セパレータ１３、第１の薄いプレートのフレーム１４、薄いプレートのセパレータ１５、第２の薄いプレートのフレーム１６および下部セパレータ２０の厚さとは無関係に設定可能な容積内でウェル４に溶液１２を貯蔵するためのものである。
【0015】
図６は、第１の薄いプレート２５と第２の薄いプレート２６とを含んでいる試料ホルダ２４を概略的に示している。右側のパネルは、左側のパネルに示されている線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った上述の試料ホルダ２４の断面を概略的に示している。上述の薄いプレート２５と薄いプレート２６との間に溶液１２が貯蔵されている。溶液１２内で小さい結晶２８が成長する。薄いプレート２５、２６は、溶液１２に面した表面上に付加的な凹部容積２７を有しており、これによって、薄いプレート２５と薄いプレート２６との間の間隔とは無関係に溶液１２の体積を調整することができる。
【0016】
図７は、第１の薄いプレート３１と第２の薄いプレート３２とを含んでいる試料ホルダ３０を概略的に示している。右側のパネルは、左側のパネルに示されている線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った上述の試料ホルダ３０の断面を概略的に示している。上述の薄いプレート３１と薄いプレート３２との間に溶液１２が貯蔵されている。溶液１２内で小さい結晶２８が成長する。薄いプレート３１、３２は、溶液１２に面した表面上に付加的な凹部容積３３を有しており、これによって、上述の薄いプレート３１と薄いプレート３２との間の間隔とは無関係に上述の溶液１２の体積を調整することができる。上述の凹部容積３３は、スペーサバー２１の表面上に延在することができる。
【0017】
図８は、第１の薄いプレート３６と第２の薄いプレート３７とを含んでいる試料ホルダ３５を概略的に示している。右側のパネルは、左側のパネルに示されている線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った上述の試料ホルダ３５の断面を概略的に示している。上述の薄いプレート３６と薄いプレート３７との間に溶液１２が貯蔵されている。溶液１２内で小さい結晶２８が成長する。薄いプレート３６、３７は、溶液１２に面した表面上に付加的な凹部容積３８を有しており、これによって、上述の薄いプレート３６と薄いプレート３７との間の間隔とは無関係に溶液１２の体積を調整することができる。２つの薄いプレート３６、３７の縁部での接着剤３９が、溶液１２のための容積を封止する。
【0018】
図９は、上部プレート５、下部プレート６、上部セパレータ１３、第１の薄いプレートのフレーム１４、薄いプレートのセパレータ１５、第２の薄いプレートのフレーム１６、下部セパレータ２０、第１の薄いプレート３６、第２の薄いプレート３７および接着剤３９を含んでいるセル３の例を概略的に示している。試料ホルダは、第１の薄いプレート３６と第２の薄いプレート３７とを含んでおり、互いに対向する薄いプレート３６、３７の表面は凹部容積を含んでいる。接着剤３９によって薄いプレート３６、３７の縁部が封止される。試料ホルダは、第１の薄いプレートのフレーム１４に結合されている第１の薄いプレート３６の周囲のスペーサバー２１を介してウェルに結合されている。第２の薄いプレート３７の周囲のスペーサバーが第２の薄いプレートのフレーム１６に結合されている、または接着剤３９の周囲のスペーサバー２１が第１の薄いプレートのセパレータ１５に結合されている、またはこれらの組み合わせ、またはこれらのすべてと結合されている。
【0019】
図１０は、斜視図（左側の上部パネル）、閉じられたセルの上面図（左側の下部パネル）および線Ａ－Ａ’を通る平面に沿ったセル３の断面図において装置２を概略的に示している。ここでは、上部プレート５が開口部７を有しており、この開口部７は、上述のウェル４を封止することができるキャップ８を備えており、かつ右側に示されているように、他のウェル４を開放せずに、ウェル４から試料ホルダを個別に取り出すために開放可能である。試料ホルダ９は、第１の薄いプレート３６と第２の薄いプレート３７とを含んでおり、これらは、互いに対向する表面上に凹部容積を有しており、薄いプレート３６、３７の縁部で接着剤３９によって接着されている。
【0020】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、第１の薄いプレート４１と第２の薄いプレート４２とを含んでいる試料ホルダ４０を概略的に示している。図の右側のパネルは、図１１Ａの左側のパネルに示されている線Ａ－Ａ’を通る平面に沿った上述の試料ホルダ４０の断面と、図１１Ｂの左側のパネルに示されている線Ｂ－Ｂ’を通る平面に沿った上述の試料ホルダ４０の断面とを概略的に示している。上述の薄いプレート４１と薄いプレート４２との間に溶液１２が貯蔵されている。溶液１２内で小さい結晶２８が成長する。薄いプレート４１、４２は、溶液１２に面した表面上に付加的な凹部容積４３を有しており、これによって、上述の薄いプレート４１と薄いプレート４２との間の間隔とは無関係に上述の溶液１２の体積を調整することができる。上述の２つの薄いプレート４１、４２の縁部における突起または溝またはその両方を含んでいる表面構造４４は、上述の薄いプレート４１と薄いプレート４２との間の間隔を狭める。上述の薄いプレート４１と薄いプレート４２との間の狭められた間隔は、上述の薄いプレート４１、４２を２つの薄いプレート４１、４２の縁部で封止するために接着剤が添加される場合に、封止効果を高めることができる。
【0021】
一般に、すべての薄いプレートの材料は、中間相における結晶の成長を監視する目的で、試料ホルダの観察をより容易にするために透明であってよい。回折像における高い信号対ノイズ比のために、薄いプレートからの不必要なＸ線散乱を回避するために、薄いプレートの材料は、非晶質または非結晶性であってよい。溶液１２が薄いプレート内へ浸透しないという意味において、薄いプレートの材料は密であるべきである。さらに、上述の試料ホルダの薄いプレートの表面の少なくとも一部を、親水性を高めるために科学的に改良することができる。好ましくは、試料ホルダ９の薄いプレートは、Ｘ線散乱が低い薄いプレートとして設計されている。上述の薄いプレートは、好ましくは、５～５０μｍ、好ましくは２０～２５μｍの範囲の厚さを有するポリイミドまたはフッ素化ポリイミドから作製されている。
【0022】
上述の装置２の複数のセル３は、９６ｗｅｌｌ，ＡＮＳＩ規格ＳＢＳ（Ｔｈｅ ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）プレート等の結晶化規格によって与えられるような、９．１ｍｍのピッチを伴う８行および１２列で与えられていてよい。上述の試料ホルダ９、２４、３０、３５および４０のジオメトリは、幅０．５ｍｍおよび長さ１ｍｍの４つのスペーサバーが取り付けられた直径４ｍｍの円板部分であってよい。上述の薄いプレートの材料は、ポリイミド、フッ素化ポリイミドまたは水の透過率が低い他の同様のポリマであってよい。上述の薄いプレートの厚さは、サンドイッチ試料ホルダの完全性が維持される限り、１２～２５μｍ以下の範囲にあってよい。好ましくは、試料ホルダが、Ｘ線ビームスキャン用の音響浮揚装置における高い位置安定性および回転制御性に適合する。
【0023】
試料ホルダ９をシステム７０または１２０内で音響浮揚させる際に、試料ホルダの円板部分の円周上にスペーサバー２１を配置することによって、円板面に対して垂直な軸線に沿った回転の位置安定性および安定性の観点から試料ホルダの安定性が向上する。試料ホルダの円板部分の平面内にある回転軸線を中心とした、浮揚させられている試料ホルダの回転を阻止することによっても、試料ホルダの安定性が向上する。
【0024】
上述のスペーサバーの個数Ｎは４であってよく、上述の複数のスペーサバーは、図４に示されているように、円板の中心を通り、かつ試料ホルダの円板面に対して垂直な軸線を中心とした回転に関して対称に配置されてよい。それにもかかわらず、試料ホルダが、４より大きいまたは小さいＮを有する形状と同様の対称的な形状または準対称的な形状を有することができることは言うまでもない。
【0025】
図１２は、自動化された結晶回折実験を行うための従来技術のシステム５０を側面から概略的に示している。原子分解で結晶構造を分解するのに十分な質の単結晶５５を成長させ、結晶化プレート６３内のウェルに貯蔵する。液滴６４内に封入されている上述の単結晶５５が回収され、超音波音響浮揚装置５６内に装填される。超音波音響浮揚装置５６は、電源６１によって駆動される超音波トランスデューサ５７、音響ミラー反射器６０および音響定在波５８が励起される音響空洞５９を含んでいる。Ｘ線源５１は、Ｘ線ビーム５２を発生させる。上述のＸ線ビーム５２によって、上述の結晶５５が照射される。上述の結晶５５からのＸ線回折５４は、高速フレームレートでピクセル化されるＸ線画像検出器５３によって記録される。結晶５５は、上述の電源６１の出力を調整することによって、または上述の音響空洞５９の共鳴を調整することによって、超音波音響定在波５８によって調整された回転速度で回転させられる。音響浮揚装置５６が取り付けられている器具６２によって、上述の結晶５５の位置が、上述のＸ線ビーム５２に位置合わせされる。
【0026】
【0027】
図１２および図１３を参照すると、分子の単結晶５５に対して、自動化されたＸ線回折実験を行うシステム５０は次のことを必要とする。すなわち、結晶の回収および音響浮揚装置への装填が、遠隔で、集束された音響放射による結晶化液を伴う結晶の音響放射によって成し遂げられ得る、または結晶化液を伴う結晶で充填された毛細管からの音響放射と、それに続く、音響浮揚装置によって放出された液滴の捕捉によって成し遂げられ得ることを必要とする。結晶５５を含んでいる、浮揚させられている液滴中の対流性の流れの強さを調整することによって、浮揚させられている液滴中の結晶が所望の回転速度で回転させられる。これによって、対流性の流れの強さおよび空間パターンは、液滴の周囲の音響流の強さおよび空間パターンを介して超音波音響波によって決定される。しかし、中間相等の高粘性媒体において調製された結晶の遠隔回収および装填は、音響浮揚装置への高粘性液滴の装填、ならびに特に、音響放射による膜タンパク質の従来技術による結晶化法のために使用される中間相媒体における結晶の自動回収および装填という点で困難を伴うため、器械５０では困難である。
【0028】
図１４は、試料ホルダ８５内の成長した小さい結晶２８のＸ線回折実験を行う、本発明によるシステム７０を側面図で概略的に示している。自動化された器具１０１、１０２、１０３を用いて、上述の試料ホルダ８５は、遠隔で、装置２の複数のウェル４のうちの１つのウェルから回収され、超音波音響浮揚装置８６内へ装填される。超音波音響浮揚装置８６は、電源９１によって駆動される超音波トランスデューサ８７、音響ミラー反射器９０、音響定在波８８が励起される音響空洞８９を含んでいる。Ｘ線源８１はＸ線ビーム８２を発生させる。上述の電源９１の出力を調整することによって、または上述の音響空洞８９の共振を調整することによって、音響定在波８８の超音波音圧によって調整された回転速度で、試料ホルダ８５の円板面に対して垂直な回転軸線で、上述の試料ホルダ８５が回転させられる。音響浮揚装置８６が取り付けられている器具９２によって、上述の試料ホルダ８５の位置を、上述のＸ線ビーム８２に対して位置合わせする。音響浮揚装置の軸線９５を、器具９３によって、鉛直方向９６から角度θだけ回転させることができ、これによって、試料ホルダに斜角でＸ線ビームを照射することができる。
【0029】
図１５Ａは、音響浮揚装置８６において浮揚および回転させられる試料ホルダ８５内の成長した小さい結晶９４のＸ線回折実験のシステム７０を上から概略的に示している。上述のＸ線ビーム８２によって、上述の試料ホルダ８５内の上述の小さい結晶が照射される。Ｘ線ビームは、スパイラル軌道１１０に沿って試料ホルダ８５上でスキャンされる。データ収集中、上述の結晶９４からのＸ線回折８４は、上述の試料ホルダ８５が器具９５によって回転させられ、ｘ方向に移動させられる間、高速フレームレートでピクセル化されるＸ線画像検出器８３によって連続的に記録される。
【0030】
図１５Ｂは、浮揚させられている試料ホルダ８５が１回／秒で回転させられ、０．２５ｍｍ／秒の速度で８秒間、水平方向に並進させられたときの試料ホルダ８５上のＸ線ビーム８２のスパイラル軌道１１０を概略的に示している。試料ホルダ８５上の、Ｘ線ビーム８２によって覆われる円形部分の直径は４ｍｍである。
【0031】
図１６は、他のウェルを開放することなく、装置２の複数のウェル４のうちの１つのウェルを開放する器具１０１を概略的に示している。
【0032】
図１７は、装置２の開放されたウェル４から、複数の試料ホルダ８５のうちの１つの試料ホルダを取り出す器具１０２を概略的に示している。
【0033】
図１８は、小さい結晶のＸ線回折実験を行うために、複数のウェル４のうちの１つのウェルから取り出された複数の試料ホルダ８５のうちの１つの試料ホルダを、器械７０の音響浮揚装置８６に送る器具１０３を概略的に示している。
【0034】
図１９は、Ｘ線ビームの方向から撮影された、Ｘ線回折実験中の０秒（スキャンの開始）、４秒および８秒（スキャンの終了）の時点での浮揚させられている試料ホルダ８５のスナップショットを示している。浮揚させられている試料ホルダ８５は、約１回／秒で回転させられ、０．２５ｍｍ／秒の速度で右から左へ＋ｘ方向において水平方向に並進させられた。データ収集の期間は８秒であり、その間に回折像が連続的に撮影された。各画像において、Ｘ線ビームスポットは、各画像の線Ａ－Ａ’と線Ｂ－Ｂ’との交点にあった。試料ホルダの中心は、各画像の線Ａ－Ａ’と線Ｓ－Ｓ’との交点にある。
【0035】
図２０は、下部パネルにおいて、音響浮揚装置の軸線が鉛直方向から３０°だけ回転させられたときの、浮揚させられている試料ホルダ８５の回転速度と超音波圧の振幅との間の関係を示している。上部パネルは、音響浮揚装置の軸線が鉛直方向から３０°だけ傾斜させられたときの、浮揚させられている試料ホルダの回転中心の二乗平均平方根（ＲＭＳ）変動と超音波圧の振幅との間の関係を示している。
【0036】
図２１は、試料ホルダ１２５内の成長した小さい結晶１３４（図２２を参照）のＸ線回折実験を行う別のシステム１２０を側面図で概略的に示している。自動化された器具１０１、１０２、１０３を用いて、上述の試料ホルダ１２５は、遠隔で、装置２の複数のウェル４のうちの１つのウェルから回収され、超音波音響浮揚装置１２６内へ装填される。超音波音響浮揚装置１２６は、電源１３１によって駆動される超音波トランスデューサ１２７、音響ミラー反射器１３０、音響定在波１２８が励起される音響空洞１２９を含んでいる。Ｘ線源１２１はＸ線ビーム１２２を発生させる。上述の試料ホルダ１２５は、器具１４６によって励起される音場によって調整された回転速度で、試料ホルダの円板面に対して垂直な回転軸線によって回転させられる。音響浮揚装置１２６、器具１３３および１４６が取り付けられている器具１３２によって、上述の試料ホルダ１２５の位置を、上述のＸ線ビーム１２２に対して位置合わせする。音響浮揚装置１２６の軸線１３５を、器具１３３によって、鉛直方向１３６から角度θだけ回転させることができ、これによって、試料ホルダに斜角でＸ線ビームを照射することができる。
【0037】
図２２は、音響浮揚装置１２６において浮揚および回転させられる試料ホルダ１２５内の成長した小さい結晶１３４のＸ線回折実験を行うシステム１２０を上から概略的に示している。上述のＸ線ビーム１２２によって、上述の試料ホルダ１２５内の成長した上述の小さい結晶が照射される。Ｘ線ビームは、スパイラル軌道１１０に沿って試料ホルダ上でスキャンされる。データ収集中、上述の結晶からのＸ線回折１２４は、上述の試料ホルダが器具１３５によって回転させられ、ｘ方向に移動させられる間、高速フレームレートでピクセル化されるＸ線画像検出器１２３によって連続的に記録される。上述の試料ホルダ１２５は、器具１４６によって励起されるＸ線ビームに対して垂直な方向において、音場１５１によって調整された回転速度で、試料ホルダ１２５の円板面に対して垂直な回転軸線によって回転する。この器具１４６は、電源１４９によって駆動される超音波トランスデューサ１４７と、音響反射器１４８と、音響空洞１５０とを含んでいる。上述の浮揚させられている試料ホルダ１２５の回転は、定在波１５１の超音波圧によって調整されている。
【0038】
図２３Ａは、音響浮揚装置において浮揚および回転させられる試料ホルダ１２５内の成長した小さい結晶１３４のＸ線回折実験のシステム１２０を側方から概略的に示している。図２３Ｂは、横方向音響定在波１５１が試料ホルダの回転を調整するときに、試料ホルダ１２５内の成長した小さい結晶１３４のＸ線回折実験のシステム１２０の方向１５２に沿った視点１５３から見た、側方からの概略図である。器具１４６内で励起された音響定在波１５１の軸線１５５は、軸線１３５および方向１５２の両方に対して垂直な軸線１５４からφだけ回転させられる。
【0039】
図２４において下部パネルは、フレーム数の関数としての、試料ホルダ内の成長した小さい結晶上の推定線量との間の関係を示している。上部パネルは、スキャンが進行するときの、Ｘ線が命中した小さい結晶の累積数を示している。想定されるパラメータは、以下のとおりである：１０１２光子／秒の光子束、５μｍのＸ線ビームスポットサイズ、２０μｍの結晶サイズ、３ｋＨｚのＸ線画像検出器のフレームレート、０．２５ｍｍ／秒での試料ホルダの横方向の並進速度および８秒の総スキャン時間。異なる試料ホルダ回転速度である、０．５回／秒（ａ）、１回／秒（ｂ）および２回／秒（ｃ）が想定された。
【0040】
ここで再び図１４～図１８を参照すると、装置２のウェルから取り出された試料ホルダ１０、８５内に含まれている小さい結晶２８、９４に関する自動化されたＸ線回折実験の器械７０は、２オングストローム以上のオーダの原子分解で結晶構造を決定する能力を有している。試料ホルダは、上述の試料ホルダの遠隔回収および装填のための各器具１０１、１０２、１０３を使用することによって、自動的に回収され、超音波音響浮揚装置８６へ送られる。従来技術の器械５６とは異なり、試料ホルダ内の中間相媒体内で小さい結晶を成長させるための装置２を使用することによって、本発明は、高度に自動化された方式でＸ線回折データセットを収集する器械を提供し、これによって、高粘性媒体中の結晶に対する原子分解でのその結晶構造が最小の手動介入で決定される。
【0041】
Ｘ線回折データセットは、各試料ホルダ８５に含まれているランダムな結晶方位を有する複数の結晶からの複数のＸ線回折像を含んでおり、原子分解での結晶構造は、このような一連の結晶構造解析データを分析するために従来技術のアルゴリズムを使用して決定される。ランダムな結晶方位の各結晶には、名目上、高輝度Ｘ線ビームが一度だけ照射される。
【0042】
ここで、器械７０の概略的な上面図である図１５Ａを参照すると、浮揚させられている試料ホルダは、試料ホルダの円板面に対して垂直な軸線に沿って、時計回りまたは反時計回りに回転させられ、データ収集中に、Ｘ線ビームおよび音響浮揚装置の軸線に対して垂直な方向において、＋ｘ方向または－ｘ方向に沿って移動させられる。このようにして、Ｘ線ビームは、たとえば図１５Ｂに示されているスパイラル軌道１１０に沿って試料ホルダ上でスキャンされる。
【0043】
Ｘ線回折実験のための個々の試料ホルダの回収および装填は、遠隔で行われる以降のステップを含んでいる：
ａ）器具１０１が、上述の装置２の複数のウェル４のうちの１つのウェルの上にあるキャップ８を開ける
ｂ）器具１０２が、開放された上述のウェル４から試料ホルダを取り出す
ｃ）器具１０３が、上述の試料ホルダを音響浮揚装置８６に送る
ｄ）次いで、浮揚させられている試料ホルダの位置および回転を相応に調整する
ａ）器具１０１が、上述の装置２の複数のウェル４のうちの１つのウェルの上にあるキャップ８を開ける
ｂ）器具１０２が、開放された上述のウェル４から試料ホルダを取り出す
ｃ）器具１０３が、上述の試料ホルダを音響浮揚装置８６に送る
ｄ）次いで、浮揚させられている試料ホルダの位置および回転を相応に調整する
【0044】
上部プレート５の個々の開口部７は、キャップ８をたとえば、ねじとして扱うことによる、遠隔制御可能なマニピュレータによるウェル４の繰り返される開放および封止を可能にするために、キャップ８によって封止され得る。この繰り返される開放および封止は、器具１０１の動作である。上述の装置２のウェル４がウェル４の下方に第２のキャップを備えている場合、上述の器具１０１はこの第２のキャップも開けることができる。
【0045】
上述のセル３の上述のウェル４内の上述の試料ホルダは、第１の薄いプレートのフレーム１４および薄いプレートのフレーム１６に取り付けられている。器具１０２によって、上述のウェル４から上述の試料ホルダを取り出すステップは、１４および１６からの上述の試料ホルダの取り外し、および上述のウェル４の外側への上述の試料ホルダのピックアップを含んでいる。この取り外しを、試料ホルダのスペーサバー２１の端部を切断することによって行うことができる。真空チャックまたはベルヌーイ式グリッパを含んでよい適切な機械式マニピュレータは、このピックアップを行うことができる。
【0046】
音響浮揚装置８６への上述の試料ホルダの自動化された装填器具１０３は、試料ホルダとの最小限の物理的接触で、試料ホルダを薄いフォークまたは低密度材料のホルダに配置し、試料ホルダを音響浮揚装置へ挿入することによって、このタスクを達成することができ、これによって音響放射力がこのような試料ホルダから、この試料ホルダをピックアップすることができる。択一的に、たとえば小さなプラスチックの毛細管からの真空チャックを利用する試料ホルダ－ピックアップマニピュレータは、試料ホルダを音響浮揚装置へ送ることができる。マニピュレータからの試料ホルダの解放は、真空ラインを閉じることによって、または毛細管の先端に弱い正圧を加えることによって達成され得る。
【0047】
図２０を参照すると、浮揚させられている試料ホルダの回転速度と一軸音響浮揚装置の超音波圧との間の典型的な関係ならびに浮揚させられている試料ホルダの二乗平均平方根の位置変動と一軸音響浮揚装置の超音波圧との間の関係が示されている。浮揚および回転させられている試料ホルダの位置安定性は、図１９および図２０に示されているように数十μｍ以内であってよく、これらは、図１５Ｂに示されているようなスパイラル軌道１１０にわたったＸ線ビームの安定したスキャンを実現するのに適している。図２０における、浮揚させられている試料ホルダの回転速度および位置安定性が、回転している試料ホルダのビデオ記録を分析することによって評価された。しかし、図２０に示された高い位置安定性を考慮すると、回転している試料ホルダの全体または縁部を狭い光ビームで照射し、光の透過または反射の変調周波数を測定することによって、回転速度を別個に監視することができる。さらに、このようにして得られた回転速度を用いて、音響浮揚装置の超音波圧を調整して、標準的なフィードバック制御方式において所望の回転速度を得ることができる。
【0048】
均一なサイズを有する試料ホルダおよび試料ホルダ内の溶液の場合、上述の音響浮揚装置における上述の試料ホルダの浮揚位置および回転の繰り返しの調整は、名目上、試料ホルダを交換した後に必要とされない。それにもかかわらず、Ｘ線ビームに対する、浮揚させられている試料ホルダの位置は、たとえば、オンライン画像モニタを設置して、記録された画像を分析することによって、音響浮揚装置をＸ線ビームに対して並進させることによって、遠隔で調整可能である。図２０に示されているように音響浮揚装置の超音波圧を調整することによって、浮揚させられている試料ホルダの回転速度を、典型的には０．５～２Ｈｚの範囲にある所望の値に調整することができる。
【0049】
図２１および図２２を参照すると、これらの概略図は、音響浮揚装置１２６内で浮揚および回転させられる試料ホルダ１２５内で成長した小さい結晶１３４のＸ線回折実験を行う器械１２０を示しており、器具１４６は、音響浮揚装置１２６の軸線１３５およびＸ線ビーム１２２を横切る方向で音場を生成する。試料ホルダ１２５がゼロ回転で浮揚させられている場合、器具１４６において励起された定在波１５１によって生じる音響放射力の適用が、浮揚させられている試料ホルダ１２５の回転をオンにする。音響浮揚装置１２６の軸線１３５および方向１３７の両方に対して垂直な軸線１５２に沿った方向１５３からの概略的な側面図における図２３を参照すると、上述の定在波１５１の軸線１５５は、方向１３７および１５４からφだけ回転されている。音響浮揚装置１２６の超音波圧が、試料ホルダをゼロ回転で浮揚させるように設定されている場合、音響定在波１５１によって発生された音響放射力が重畳されて、上述の試料ホルダ１２５の回転を開始させる。これは、上述の試料ホルダに加えられる全音響放射力が上述の試料ホルダを回転させるのに十分である場合、および上述の定在波１５１の超音波圧が上述の試料ホルダを縦に反転させないほど弱い場合である。定在波１５１および定在波１２８の脈動が、浮揚させられている試料ホルダの回転および位置運動に及ぼす影響を回避するために、上述の定在波１２８の超音波周波数と上述の定在波１５１の超音波周波数とは、５０～１００Ｈｚの範囲における量よりも多く異なっていてよく、これは、回転および位置運動に関する上述の試料ホルダの典型的な応答時間の逆数と比べて十分に大きい。波１２８と波１５１との周波数差は、浮揚させられている上述の試料ホルダの軸方向および半径方向の共鳴振動の周波数範囲（球状の液滴のケースでは、１～３ｋＰａ・ｒｍｓの超音波圧の場合に１０～４０Ｈｚの範囲にある）と一致すべきではない。１５１の超音波圧の振幅は、上述の試料ホルダの回転を開始させるために一定の値に設定されてよい。択一的に、１５１の超音波圧は、上述の試料ホルダの回転を調整するために、振幅変調、周波数変調またはパルス変調されてよい。Ｘ線ビーム１２２は、スパイラル軌道１１０に沿って試料ホルダ１２５上でスキャンされる。データ収集中、上述の試料ホルダが器具１３５によってｘ方向に回転および移動させられる間、上述の結晶からのＸ線回折信号１２４は、高速フレームレートでピクセル化されるＸ線画像検出器１２３によって連続的に記録される。
【0050】
音響浮揚させられている対象物を回転させる従来技術の方法は、音響定在波の円筒形の対称性およびその機械的な回転を破壊するための機械的インサートの使用、または音響浮揚装置の軸線の方向において角度モーメントを有する音場によって生成される粘性トルクの使用を含んでいる。この角度モーメントは、たとえば音響浮揚装置の軸線に対して垂直な方向において、一対の交差した定在波を加えることによって生成されてよく、これによって、２つの定在波のノードが、浮揚させられている対象物の位置と一致し、２つの定在波の位相がたとえば９０°シフトされる。しかし、典型的には１５０ｄＢのオーダの音圧レベル（ＳＰＬ）を有する十分な粘性トルクを誘導するために必要とされる音圧は、本願で考察される、浮揚させられている試料ホルダの回転を制御するためには適切ではない場合がある。なぜなら、このような相当な音圧は、浮揚させられている試料ホルダの円板面を鉛直方向において反転させるリスクを有しているからである。
【0051】
音響浮揚させられている対象物を回転させる従来の方法と比較して、本発明は、高い角度（Ｘ線画像検出器に向かって６０°のオーダ）および高い分解能（２オングストローム以上のオーダ）のＸ線回折信号が妨害されないように、浮揚させられている試料ホルダからＸ線画像検出器までの大きなステレオ角度を可能にする、より単純な構成を提供する。音響浮揚装置８６内で浮揚させられている試料ホルダの回転は、音響定在波８８の超音波圧を、試料ホルダの小さな弾性変形または塑性変形と試料ホルダ面に対する音響放射力との結合を介して調整して、上述の浮揚させられている試料ホルダの円板面に対して垂直な方向においてトルクを誘導することによって制御することができる。
【0052】
器械１２０内の浮揚させられている試料ホルダの回転の速度および方向の制御は、次のことによっても達成可能である。すなわち、試料ホルダの片側の小さな毛細管から放出される細い空気流、または上述の試料ホルダが浮揚させられているノードとは異なる、複数のノードのうちの１つのノードに放出される細い空気流を適用することによっても達成可能である。付加的な位置不安定性を最小限にするために、空気流の量は十分に弱くなければならない。浮揚させられている試料ホルダの回転速度を０～１０回／秒の範囲で制御するために、超音波音響定在波によって及ぼされる音響放射力を使用することによって、このような位置不安定性の付加が回避されることに留意されたい。
【0053】
音響浮揚装置８６内の浮揚させられている試料ホルダの回転速度は、上述の定在波８８の超音波圧を調整することによって制御可能であるが、超音波圧の調整の範囲が重要になる幾つかの状況において、超音波圧の上述の調整が、特に垂直方向における、浮揚させられている位置の変化につながる可能性があるということにも留意されたい。上述の試料ホルダの回転が器具１４６によって調整される場合、回転速度制御と浮揚位置との間のこの干渉は、器械１２０内に存在していない。
【0054】
音響浮揚装置８６、１２６は一軸型であってよく、これによって、直径２０ｍｍの円筒形ホーンが約４０ｋＨｚで動作するランジュバン型超音波振動子によって駆動され、設置されたホーンと直径２０ｍｍおよび焦点距離２０ｍｍを有する、設置された凹球面ミラー反射器とが音響空洞を形成する。超音波トランスデューサの周囲の加熱された空気からの対流性の空気流による、浮揚させられている試料ホルダで起こり得る位置の乱れを回避するために、ホーンが音響浮揚装置の上部に設けられてよく、ミラーが音響浮揚装置の下部に設けられてよい。Ｘ線回折実験の場合、音響浮揚装置が第７の共振に調整され、かつ音響浮揚装置軸線が鉛直方向からまたはＸ線ビームに対して垂直な方向から３０°だけ回転させられる場合に、試料ホルダを、ミラー反射器から第３の圧力ノード付近で浮揚させることができる。
【0055】
浮揚装置８６、１２６によって浮揚させられている試料ホルダの回転速度は、０．５１～０．５５ｋＰａ・ｒｍｓの間の超音波音圧を調整することによって、数十μｍのオーダの高い位置安定性で０．５～２Ｈｚの範囲において制御可能である。明らかに、正確に要求される超音波音圧は、正確な材料、その中の中間相媒体の体積および試料ホルダの形状およびジオメトリに応じて変化する。音響浮揚装置８６、１２６および正確な浮揚装置のジオメトリは、２オングストローム以上のオーダの高い分解能に対応する高い角度までＸ線回折が妨げられないことを条件に、上述の試料ホルダにおける小さい結晶にわたってＸ線ビームを高速でスキャンすることでＸ線回折像の高速データ収集を達成できる限り、上述のものに限定されない。
【0056】
器具１４６は、約４０ｋＨｚで動作するランジュバン型超音波発振子によって駆動される超音波トランスデューサによって励起される先端直径８ｍｍのカテノイダルホーンとミラー反射器とを含んでいる音響空洞１５０であってよく、ここでは０～０．６ｋＰａの範囲の音圧が加えられる。音響空洞の周波数および直径は、これらの値に限定されず、これによって、空洞のサイズおよび音響波長を試料ホルダのサイズに適合させて、０～１０Ｈｚの範囲の回転が達成される。
【0057】
明らかに、正確に要求される超音波音圧は、正確な材料、その中の中間相媒体の体積、および試料ホルダの形状およびジオメトリに応じて変化する。音響浮揚装置８６、１２６および器具１４６は、試料ホルダ８５、１２５に作用する音響放射力が所望の回転をもたらす限り、周波数、サイズまたは駆動方法が上述のものに限定されない。
【0058】
図２４を参照すると、試料ホルダ内で成長した２０μｍのサイズの結晶を測定するための、１０１２光子／秒の光子束、５μｍのスポットサイズを有するＸ線ビームのケースにおいて、２オングストロームよりも良好な十分な分解能でブラグ反射を記録するための結晶あたりの十分な線量（１０１～１０２ｋＧｙ）が、次のような場合に得られる。すなわち、４ｍｍの直径（円板部分）の試料ホルダを、０．５～２回転／秒の範囲での一定の試料ホルダ回転速度で、０．２５ｍｍ／秒に等しい、横方向における試料ホルダの一定の速度で、３ｋＨｚの検出器フレームレートで、かつ８秒に等しい、Ｘ線回折像の記録時間で回転させた場合である。８秒のスキャンの間に測定された結晶の総数は、試料ホルダ内の結晶密度が４×１０４／ｃｍ２の場合、５００～２０００であると推定される。
【0059】
器械７０、１２０を利用するＸ線回折データ収集のケースでは、浮揚させられている試料ホルダの回転速度が、スキャン中に適切な速度で増す場合に、個々の試料ホルダのデータセット内の結晶あたりの線量の増加を抑制することができる。同時に、データセット内の、Ｘ線ビームによって照射される試料ホルダの小さい結晶の総数の減少を部分的に回避するために、横方向において、浮揚させられている試料ホルダの並進速度を並行して適切な速度で減少させることができる。器具９５、１３５の速度設定をプログラミングすることによって、データ収集中の試料ホルダの並進速度の変化を容易に実現することができる。データ収集中の試料ホルダの回転速度の変化を、器械７０の音響浮揚装置８６の超音波圧を相応にプログラミングすることによって容易に実現することができる。データ収集中の試料ホルダの回転速度の変化を、器械１２０の音響浮揚装置１２６の超音波圧を相応にプログラミングすることによって、または器械１２０の器具１４６の超音波圧を相応にプログラミングすることによって、容易に実現することができる。器械１２０を使用し、器具１４６の超音波圧を調整することは、結晶ごとの線量の最小限の位置変動で、上述の試料ホルダにおける小さい結晶上でＸ線回折実験を行うために有利である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24】
【国際調査報告】