特表 2023-504136 キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-01

(54)【発明の名称】キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20230125BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20230125BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230125BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 27/10 20060101ALI20230125BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230125BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20230125BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20230125BHJP

   A61K 31/07 20060101ALI20230125BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/35

C12N15/113 Z

C07K14/705

A61P27/10

A61P27/02

A61K48/00

A61K35/76

A61K47/62

A61K38/17

A61K31/07

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022532030

(86)(22)【出願日】2020-11-30

(85)【翻訳文提出日】2022-06-14

(86)【国際出願番号】 EP2020083960

(87)【国際公開番号】W WO2021105509

(87)【国際公開日】2021-06-03

(31)【優先権主張番号】01509/19

(32)【優先日】2019-11-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CH

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510239897

【氏名又は名称】ウニベルジテート ベルン

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100186897

【弁理士】

【氏名又は名称】平川 さやか

(72)【発明者】

【氏名】クラインローゲル，ソニア

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン ウィック，ミキール

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C087

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC10

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA41

4C084BA42

4C084BA44

4C084CA53

4C084DC50

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA331

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA33

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA03

4C206CA10

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA05

4C206NA13

4C206NA14

4C206ZA33

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

強力に発現し、且つ標的細胞の正しい細胞内コンパートメントを標的とする、光感受性上流オプシン部分及びキメラＣＴを含む標的ＧＰＣＲ部分を含むキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質が提供される。キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、標的ＧＰＣＲ経路に特異的な天然Ｇタンパク質を効率的に活性化し、天然標的ＧＰＣＲと同等の生理学的応答を誘発する。キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子並びにキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を含むか又は発現するカプシド、ベクター、細胞及び担体も提供される。さらに、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を遺伝子操作する方法及びキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の医療用途が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外及び細胞内ループ（ＥＬ及びＩＬ）によって接続された７つの膜貫通ドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）を含むキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質であって、
上流オプシンの光感受性オプシン部分を含み、
前記上流オプシン部分は、発色団を共有結合する発色団ポケットを含み、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、第２のＧＰＣＲタンパク質（標的ＧＰＣＲタンパク質）の第２のＧＰＣＲ部分（標的ＧＰＣＲ部分）を含み、
前記標的ＧＰＣＲ部分は、Ｃ末端ドメイン（標的－ＧＰＣＲ－ＣＴ）を含む、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質において、
前記上流オプシン部分は、上流オプシンＣＴの近位領域（Ｏ－ＣＴ近位領域）の遠位端又はその下流に位置する切断部位を有する切断型Ｃ末端ドメイン（切断型オプシンＣＴ）をさらに含み、
前記Ｏ－ＣＴ近位領域は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ及び遠位方向に続く７～１３アミノ酸を含み、
それにより、前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、キメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含み；
前記標的ＧＰＣＲ－ＣＴは、前記切断型オプシンＣＴの下流に位置することを特徴とするキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項2】

前記Ｏ－ＣＴ近位領域の前記遠位端は、
－ ヘリックス８（Ｈ８）の遠位端、
－ パルミトイル化部位、又は
－ ウシロドプシンのパルミトイル化部位に対応する位置
を含む群から選択される位置に位置する、請求項１に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項3】

前記Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端に前記上流オプシンＣＴの前記切断部位を含み、
前記Ｏ－ＣＴ近位領域への前記遠位伸長は、前記Ｏ－ＣＴ近位領域の前記遠位端の下流又は特に前記パルミトイル化部位の下流に最大５、若しくは最大１０、若しくは最大１６、若しくは最大２２又は最大２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項4】

前記上流オプシンは、メラノプシンの群から選択される、請求項３に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項5】

前記上流オプシンは、少なくとも５０、６５、８０、１００、１５０又は２００アミノ酸の長さを有するＣＴを含むオプシンの群から選択される、請求項３に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項6】

前記上流オプシン部分は、前記切断部位までの前記上流オプシン全体を含むか、又は
前記上流オプシン部分は、Ｅ（ＤＲＹ）モチーフから前記切断部位までの前記上流オプシンの連続領域を含むか、又は
前記上流オプシン部分は、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６及びＴＭ７と、任意選択により前記切断部位までの前記切断型オプシンＣＴとを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項7】

前記上流オプシン部分は、膜貫通ドメインＴＭ３及びＴＭ７を含み、特に膜貫通ドメインＴＭ３～ＴＭ７、ＴＭ２～ＴＭ７又はＴＭ１～ＴＭ７を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項8】

前記上流オプシン部分は、ＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３及びＮＴから選択される細胞外ドメインの１つ以上を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項9】

前記上流オプシン部分は、２つ以上の親オプシン、特に２つの親オプシンに由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項10】

前記上流オプシン部分は、非ヒトオプシンである親オプシンに由来する膜貫通ドメインを含み、
前記上流オプシン部分は、ヒトオプシンである親オプシンに由来する１つ、又は２つ、又は３つ、又は全ての細胞外ドメインをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項11】

ＴＭ７及び前記切断型オプシンＣＴは、同じ親オプシンに由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項12】

前記上流オプシン部分は、前記細胞外ドメインの全て、前記膜貫通ドメインの全て及び全ての細胞内ループを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項13】

前記上流オプシン部分は、前記上流オプシンＣＴの前記切断部位までの親上流オプシン全体を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項14】

前記上流オプシン部分は、単安定若しくは双安定オプシン又は三安定オプシン、特に双安定オプシンに由来する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項15】

前記上流オプシン部分は、
－ メラノプシン（ＯＰＮ４）、
－ ロドプシン（ＲＨＯ）、
－ 錐体オプシン（ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＬＷ及びＯＰＮ１ＭＷ）、
－ クラゲオプシン（ｃｕｂｏｐ、ＪｅｌｌｙＯＰ）、
－ ハエトリグモロドプシン（ＪＳＲ１）、
－ パラピノプシン（ＰＰＯ）、
－ ニューロプシン（ＯＰＮ５）、
－ エンセファロプシン（ＯＰＮ３）
を含むオプシンの群から選択される親オプシンに由来する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項16】

特に１つ以上のアミノ酸の欠失、特にＮＰｘｘＹモチーフと、パルミトイル化部位まで又は前記パルミトイル化部位に近位に隣接するアミノ酸位置までの任意のアミノ酸位置との間のＮ末端欠失を含む、親標的ＧＰＣＲのＣＴの機能的変異体である標的ＣＴを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項17】

前記標的ＧＰＣＲ部分は、非オプシンＧＰＣＲに由来するか、又は標的オプシンと呼ばれる第２のオプシンに由来する、請求項１に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項18】

前記標的ＣＴ部分は、
特に、
－ 錐体オプシン、特にＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＭＷ又はＯＰＮ１ＬＷ、
－ セロトニン受容体、特に５－ＨＴ７、
－ ミューオピオイド受容体、
－ βアドレナリン受容体、特にベータ１アドレナリン受容体、ベータ２アドレナリン受容体及びベータ３アドレナリン受容体
を含む群から選択されるクラスＡ ＧＰＣＲ；
特に、
－ ホルモン受容体、特にグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）
を含む群から選択されるクラスＢ ＧＰＣＲ；
特に、
－ ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、特にＧＡＢＡ_Ｂ１及びＧＡＢＡ_Ｂ２、
－ 代謝型グルタミン酸受容体、特にｍＧｌｕＲ６及びｍＧｌｕＲ５受容体
を含む群から選択されるクラスＣ ＧＰＣＲ
を含むＧＰＣＲタンパク質の群から選択される親標的ＧＰＣＲに由来する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項19】

前記標的ＧＰＣＲは、クラスＡ ＧＰＣＲ若しくはクラスＢ ＧＰＣＲ又はクラスＣ ＧＰＣＲを除く別のクラスのＧＰＣＲのＧＰＣＲであり、任意選択により、前記標的ＧＰＣＲ部分は、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項20】

前記標的ＧＰＣＲタンパク質は、クラスＣ ＧＰＣＲ、特にｍＧｌｕＲ６であり、前記クラスＣ標的ＧＰＣＲ部分は、任意選択により、以下の基準：
Ａ：前記キメラＧＰＣＲにおいて、前記上流オプシン部分に含まれる天然サイズのＩＬ３と、その天然位置に対応する位置における前記クラスＣ ＧＰＣＲの天然サイズのＩＬ２との同時存在は、除外されること；
Ｂ：前記上流オプシン部分は、前記細胞内ループＩＬ１～ＩＬ３の全てを含むこと；
Ｃ：前記上流オプシン部分は、ＩＬ１を含み、及び前記標的ＧＰＣＲ部分は、対応する位置で前記上流オプシンＩＬ２及びＩＬ３を置き換えるＩＬ２及びＩＬ３の両方を含むこと
の１つが満たされることを条件として、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項21】

前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、以下の要素の群：
－ ゴルジ搬出シグナル、
－ 膜輸送配列、
－ 蛍光タンパク質をコードする配列要素
から選択される１つ以上の配列要素をさらに含み、
前記１つ以上の選択された要素は、前記キメラオプシンＧＰＣＲ ＣＴのＣ末端に任意の順で独立して配置される、請求項１～２０のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項22】

前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、選択されたものとして、搬出シグナル、特に小胞体搬出シグナル、より具体的には配列番号８６によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、Ｋｉｒ２．１からの前記小胞体搬出シグナル又は特にゴルジ搬出シグナル、より具体的には配列番号８５によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、カリウムチャネルＫｉｒ２．１からの前記ゴルジ搬出シグナルを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項23】

前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、選択された配列要素として、特にオプシンからの、より具体的にはロドプシンからの、最も具体的には配列番号８７によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる膜輸送配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項24】

前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、蛍光タンパク質をコードする選択された配列要素、特にｍＫａｔｅ２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５又はｍＳｃａｒｌｅｔを含み、
前記蛍光タンパク質は、前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴに直接融合されているか、又はＩＲＥＳ又はＴ２Ａ配列を介して連結されているかのいずれかである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項25】

前記標的ＧＰＣＲ部分は、ＩＬ１をさらに含み、前記標的ＧＰＣＲのＩＬ１は、前記上流オプシンのＩＬ１を置き換える、請求項１～２４のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項26】

前記上流オプシンのＩＬ３は、前記標的ＧＰＣＲのＩＬ３によって置き換えられるか；又は
前記上流オプシンのＩＬ３は、キメラＩＬ３によって置き換えられ、前記標的ＧＰＣＲのＩＬ３は、前記オプシンＩＬ３内の可変領域を置き換える、請求項１～２５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項27】

特に、前記標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、前記標的ＣＴは、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ又はその上流に近位端を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項28】

前記標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、ｍＧｌｕＲ６のＩＬ３は、前記オプシンＩＬ３の可変領域を部分的に置き換え、それによりキメラＩＬ３を形成する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項29】

前記標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、
前記上流オプシン部分は、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される前記細胞内ループの１つ以上をさらに含み、
ただし、上流オプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラタンパク質において、前記上流オプシン部分に含まれる天然サイズのＩＬ３と、ｍＧｌｕＲ６部分に含まれる天然サイズのＩＬ２との同時存在は、除外されることを条件とする、請求項１～２８のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項30】

前記上流オプシン部分は、メラノプシンに由来し、且つＮＴ、ＥＬ１～ＥＬ３、ＴＭ１～ＴＭ７、ＩＬ１及び前記切断型オプシンＣＴを含み、前記標的ＧＰＣＲ部分は、ｍＧｌｕＲ６に由来し、且つＩＬ２、ＩＬ３及びＣＴを含むか、又は前記標的ＧＰＣＲ部分は、ｈＯＰＮ１ｍｗに由来し、且つＩＬ２、ＩＬ３及びＣＴを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項31】

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項32】

配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項３１に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項33】

前記アミノ酸配列は、
－ 保存的アミノ酸置換、
－ １～最大３、５、８又は１５アミノ酸の範囲の欠失、
－ １～最大３、５、８又は１５アミノ酸の範囲の挿入
から選択される１つ以上の変異を含む、前記配列のいずれか１つの変異体であり、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、前記標的ＧＰＣＲに特異的なＧアルファタンパク質の光活性化依存性結合を示す、請求項３５に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項34】

前記アミノ酸配列は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する、前記配列のいずれかの１つの変異体である、請求項３５又は３６に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【請求項35】

親オプシンＣＴ及び親標的ＧＰＣＲ ＣＴに由来するキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）、特に請求項１～３４のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の前記キメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含むペプチドであって、
特にヘリックス８（Ｈ８）及びそれぞれウシロドプシンのＣ３２２又はＣ３２３に対応するパルミトイル化部位を含み、且つ前記オプシンの前記パルミトイル化部位の下流に最大３３、３４又は３５アミノ酸を任意選択によりさらに含む、前記ＣＴの近位領域を含むオプシンの切断型Ｃ末端ドメイン（切断型オプシン－ＣＴ）を含み、
標的ＧＰＣＲのＣ末端ドメイン（標的ＧＰＣＲ ＣＴ）又はその機能的変異体、特に機能的フラグメントをさらに含み、前記標的ＧＰＣＲ ＣＴは、前記切断型オプシンＣＴの下流に位置する、ペプチド。

【請求項36】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はペプチドをコードする核酸分子。

【請求項37】

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含む群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列からなるキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸配列を含む、請求項３６に記載の核酸分子。

【請求項38】

配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列と少なくとも７０％、又は８０％、又は９０％同一である核酸配列を含む、請求項３６に記載の核酸分子。

【請求項39】

配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項３６に記載の核酸分子。

【請求項40】

請求項３５～３９のいずれか一項に記載の核酸分子を標的細胞に送達するための医学的治療において使用するためのＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項41】

ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）又はＡＡＶ８（ＢＰ２）のカプシドタンパク質である、請求項４０に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項42】

ＡＡＶ２カプシドポリペプチドであり、且つ野生型ＡＡＶ２のアミノ酸５８７及び５８８間にアミノ酸インサートを含み、
前記ペプチドインサートは、
－ ＳＡＳＥＡＳＴ（配列番号６０）、
－ ＴＰＰＳＩＴＡ（配列番号６１）、
－ ＰＲＴＰＨＴＡ（配列番号６２）、
－ ＮＨＡＰＮＨＣ（配列番号６３）
を含むペプチド配列の群から選択される配列を含むか又はそれからなる、請求項４１に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項43】

前記ＡＡＶ２カプシドは、７～１３アミノ酸のポリペプチドを含み、
特に、前記ペプチドインサートは、請求項４２に記載のペプチドインサートを含み、且つ１つ又は２つの隣接リンカーをさらに含み、
前記リンカーは、前記リンカー中のアミノ酸の総数が６アミノ酸を超えないことを条件として、いずれかの側に最大１、２、３、４又は５つのアミノ酸を含み、
特に、前記リンカーは、いずれかの側に２つ又は３つのアミノ酸を含み、
前記リンカーは、
ｉ．アミノ酸Ｇ及びＡ、又は
ｉｉ．アミノ酸Ａ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｎ、Ｌ及びＲ、特にＡ、Ｌ、Ｎ、Ｒ
から選択されるアミノ酸を含むか又はそれからなり、より具体的には、前記アミノ酸の少なくとも１つは、Ｎ及びＲから選択される、請求項４１又は４２に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項44】

野生型ＡＡＶ２のＮ５８７及びＲ５８８間において、
－ ＡＡＡＳＡＳＥＡＳＴＡＡ（配列番号６４）、
－ ＡＡＡＴＰＰＳＩＴＡＡＡ（配列番号６５）、
－ ＡＡＡＰＲＴＰＨＴＡＡＡ（配列番号６６）、
－ ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ（配列番号６７）、
－ ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ（配列番号６８）
から選択されるペプチドインサートを含む、請求項４３に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。

【請求項45】

野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）の５８７～５９２の位置、特にＡＡＶ血清型２のＮ５８７～Ｒ５８８の位置又は別の血清型のＡＡＶのそれに相同な位置にペプチドインサートを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、前記ペプチドインサートは、

【化1】

を含む配列の群から選択される、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。

【請求項46】

ａ．アミノ酸位置２５２、２７２、４４４、５００、７００、７０４及び／又は７３０のチロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）；及び／又は
ｂ．アミノ酸位置４９１のスレオニン（Ｔ）からバリン（Ｖ）
から選択される突然変異の１つ以上を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド又は請求項４５に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項47】

特に、配列番号７４によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４２に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド又は請求項４５若しくは請求項４５及び４６に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項48】

請求項４０～４７のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドをコードする核酸分子。

【請求項49】

ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）、又はＡＡＶ８（ＢＰ２）、又はＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）、又はＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）から選択されるカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４８に記載の核酸分子。

【請求項50】

－ ＡＡＡＳＡＳＥＡＳＴＡＡ（配列番号６４）、
－ ＡＡＡＴＰＰＳＩＴＡＡＡ（配列番号６５）、
－ ＡＡＡＰＲＴＰＨＴＡＡＡ（配列番号６６）、
－ ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ（配列番号６７）、
－ ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ（配列番号６８）
から選択される、ＡＡＶ２ゲノムのＮ５８７及びＲ５８８間のペプチドインサートを有するアミノ酸配列を含むカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４８又は４９に記載の核酸分子。

【請求項51】

導入遺伝子を含み、特に、前記導入遺伝子は、キメラオプシンＧＰＣＲをコードし、且つ特に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項52】

配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなるｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項53】

細胞特異的プロモーターを含み、
前記細胞特異的プロモーターは、前記導入遺伝子に作動可能に連結されており、
前記細胞特異的プロモーターは、特にＯＮ双極細胞特異的プロモーターであり、より具体的には２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター、配列番号７５による７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター若しくは配列番号７６による４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター又は網膜ＯＮ双極細胞若しくはその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーターを含む群から選択される、請求項５１又は５２に記載の核酸分子。

【請求項54】

請求項４５、又は請求項４５及び４６、又は請求項４５及び４７に記載のＡＡＶカプシドをコードする配列を含む組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）。

【請求項55】

請求項３６～３９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター、特にプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核発現ベクター。

【請求項56】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、請求項５４又は５５に記載のベクター。

【請求項57】

ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２、特にＡＡＶ２又はＡＡＶ８を含むＡＡＶ血清型の群から選択される、請求項５４～５６のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項58】

－ ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列、及び／又は
－ プロモーター、特に細胞特異的プロモーター、より具体的には双極細胞特異的プロモーター
を含む配列の群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項59】

特に、
－ ＧＲＭ６－ｓｖ４０プロモーター、
－ ４ｘＧＲＭ６－ｓｖ４０プロモーター、
－ ２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター、
－ ７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター 配列番号７５、
－ ４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター 配列番号７６、及び
－ 網膜ＯＮ双極細胞又はその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーター
を含むプロモーターの群から選択されるＯＮ双極細胞特異的プロモーターによって駆動される、請求項３５～３９のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子を含む、請求項５４～５８のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項60】

キメラメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６（Ｍｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６）、特にＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６若しくはＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６又はキメラＯＰＮ１ｍｗ－ｍＧｌｕＲ６或いは２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む、請求項５４～５９のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項61】

導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は、
－ 特に配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される配列の１つによるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号１５によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号２９又は配列番号３１から選択される配列による、細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６
を含む群から選択されるキメラＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６をコードする、請求項５４～６０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項62】

請求項４０～４７のいずれか一項、特に請求項４３～４７のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を追加的に含む、請求項５４～６１のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項63】

前記キメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された７７０Ｅｎ－４４５Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターを含み、
ＡＡＶ２（７ｍ８）、ＡＡＶ８（ＢＰ２）、ＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）及びＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）を含む群から選択されるカプシドをコードする核酸配列をさらに含み、
特に、前記導入遺伝子は、
－ 上流オプシンとしてメラノプシン若しくはｈＯＰＮ１ｍｗを含み、且つ標的オプシンとしてｍＧｌｕＲ６を含むキメラオプシンＧＰＣＲ又は２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲ、
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６又はＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６から選択されるキメラオプシンＧＰＣＲ、
－ 配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７、配列番号２９又は配列番号３１を含む群から選択される核酸配列によってコードされるキメラオプシンＧＰＣＲ
を含む群から選択される前記キメラオプシンＧＰＣＲをコードする、請求項５４～６２の組み合わせによるベクター。

【請求項64】

配列番号７９による配列を有する核酸分子を含むか又はそれからなる、請求項５４又は５５に記載のベクター。

【請求項65】

請求項３６～３９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むか、又は請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクターを含み、且つ／又は請求項１～３５のいずれか一項に記載のオプシン－ＧＰＣＲタンパク質を含むトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウス又はトランスジェニック細胞。

【請求項66】

特に生殖細胞株を除く幹細胞株に由来するか、又は
－ ＨＥＫ２９３－ＧＩＲＫ細胞、
－ 網膜内層ニューロン、特にＯＮ双極細胞、
－ 腎臓細胞、及び
－ Ｇｓ、Ｇｑ又はＧ_{１２／１３}から選択されるＧタンパク質を発現する細胞
を含む細胞株の群から特に選択される器官型細胞株に由来する、請求項６０に記載のトランスジェニック細胞。

【請求項67】

ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ修飾ゲノムを含む、請求項６５又は６６に記載のトランスジェニック動物又はトランスジェニック細胞。

【請求項68】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
請求項３６～３９のいずれか一項に記載の核酸分子若しくは請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクター
を含む担体であって、
前記核酸分子又は前記ベクターは、前記キメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含み、
前記担体は、前記キメラオプシンＧＰＣＲの標的細胞又はヒト若しくは非ヒト動物への導入に適しており、
任意選択により、前記担体は、小胞、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子及び金粒子を含む群から選択される、担体。

【請求項69】

前記導入遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓカセットを含む、請求項６８に記載の導入のための担体。

【請求項70】

キメラメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６（Ｍｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６）、特にＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６若しくはＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６又はキメラＯＰＮ１ｍｗ－ｍＧｌｕＲ６或いは２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲをコードする前記導入遺伝子を含む、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック細胞又は請求項６８若しくは６９に記載の導入のための担体。

【請求項71】

前記導入遺伝子は、
－ 特に配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される配列の１つによるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号１５によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号２９又は配列番号３１から選択される配列による、細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６
を含む群から選択されるキメラＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６をコードする、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック細胞又は請求項６８若しくは６９に記載の導入のための担体。

【請求項72】

特に請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はキメラペプチドをコードする核酸分子を遺伝子操作する方法であって、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又は前記キメラペプチドは、切断型上流オプシンＣＴを含むキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含み、
前記キメラＣＴは、親上流オプシンＣＴ及び親標的ＧＰＣＲ ＣＴに由来し、
前記方法は、
Ａ－１ Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端のアミノ酸位置又は前記Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長内において、前記親上流オプシンの前記ＣＴの切断部位（ｘ）を選択するステップ、
Ａ－２ 前記選択された切断部位で切断される切断型ＣＴを有する上流オプシン部分又はペプチドをコードする核酸分子を取得するステップ；
Ｂ－１ 前記親標的ＧＰＣＲ ＣＴの近位領域内、特にＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ若しくはその上流又はＮＰｘｘＹとＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフとの間において、切断部位（ｙ）を選択するステップ、
Ｂ－２ 標的ＧＰＣＲ ＣＴ又はその機能的変異体、特にその機能的フラグメントをコードする核酸分子を取得するステップ；及び
Ｃ－１ ステップＡ－２で取得された、前記切断型オプシン－ＣＴをコードする前記核酸分子を、ステップＢ－２で取得された、前記標的ＣＴ又は前記その機能的変異体をコードする前記核酸分子と融合させるステップ
を含む、方法。

【請求項73】

ステップＡ－１において、前記切断部位（ｘ）は、
－ 前記切断部位（ｘ）は、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ又はその少なくとも７、若しくは８、若しくは９、若しくは１０、若しくは１１、若しくは１２、若しくは１３アミノ酸下流に位置するヌクレオチドに位置すること、
－ 前記切断部位（ｘ）は、パルミトイル化部位又はパルミトイル化部位に対応するアミノ酸の下流、特に遠位に隣接して位置すること、
－ 前記切断部位は、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４５、又は４７、又は４９ヌクレオチド下流に位置すること
を含む基準の群から選択される基準の１つ以上を満たす、請求項７２に記載の遺伝子操作の方法。

【請求項74】

特に、前記上流オプシンは、メラノプシンであり、
ステップＡ－１において、前記切断部位（ｘ）は、
－ 前記切断部位（ｘ）は、Ｏ－ＣＴ近位領域の最大３０、又は３１、又は３２、又は３３、又は３４、又は３５アミノ酸下流、特に前記Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端に位置すること、
－ 前記切断部位（ｘ）は、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４５、又は４７、又は４９ヌクレオチド下流に位置すること、
－ 前記切断部位は、リン酸化部位の保存されたクラスターの下流のアミノ酸位置に、且つ特に保存されたリン酸化部位の前記クラスターの遠位端に遠位に隣接して位置すること
を含む基準の群から選択される基準の１つ以上を満たす、請求項７２に記載の遺伝子操作の方法。

【請求項75】

ステップＡ－１で選択される、前記上流オプシンにおける前記切断部位ｘ及びステップＢ－１で選択される、前記標的ＧＰＣＲの前記切断部位ｙは、両方ともそのそれぞれのパルミトイル化部位若しくはパルミトイル化部位に対応するアミノ酸位置に位置するか、又は両方とも前記ＮＲ（Ｋ）Ｑ部位の７～１３、特に８～１２、より具体的には９～１１又は１０アミノ酸下流に位置する、請求項７２に記載の遺伝子操作の方法。

【請求項76】

１つ以上の細胞内ループを置き換えるか又は部分的に置き換える、特に対応する位置において、前記上流オプシンの１つ以上の細胞内ループ又は部分的細胞内ループを、前記標的ＧＰＣＲの細胞内ループによって交換するための１つ以上の追加的なステップを含み、
特に、１つ以上のスプライシング部位は、
－ ＩＬ１の交換のための接合部ａ及び接合部ｂ、
－ ＩＬ２の交換のための接合部ｃ及び接合部ｄ、
－ ＩＬ３の交換のための接合部ｅ及び接合部ｆ、
－ 前記標的ＧＰＣＲのＩＬ３との交換で前記上流オプシンＩＬ３の高度可変領域を除去する、ＩＬ３内の２つのスプライシング部位
を含む群から選択される、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の遺伝子操作の方法。

【請求項77】

ステップＡ及び又はステップＢ前に、
－ 任意選択により配列アライメントツールを使用して、前記オプシン又はそのフラグメントのアミノ酸配列を、前記標的ＧＰＣＲ又はそのフラグメントのアミノ酸配列とアラインするステップ、
－ 特に、
－ Ｅ（Ｄ）ＲＹ／ＮＲＩ、
－ ＩＬ３のＴＭ６との接合部の周辺のＥ、
－ ＮＰｘｘＹ、
－ ＮＲ（Ｋ）Ｑ、
－ パルミトイル化Ｃ、及び
－ 前記標的ＧＰＣＲもオプシンである場合、ＴＭ７の発色団の結合のためのＫ
を含む、保存されたモチーフの群から選択される保存されたモチーフを構成するアミノ酸位置を決定するステップ
を含む、前記親ＧＰＣＲをコードする核酸配列の一方又は両方における保存されたモチーフの同定を追加的に含み、
任意選択により、前記上流オプシンのアミノ酸配列は、保存されたモチーフを構成するアミノ酸位置の同定のために、ウシロドプシンのアミノ酸配列とアラインされる、請求項７２～７６のいずれか一項に記載の遺伝子操作の方法。

【請求項78】

ステップＡ及び／又はステップＢ前に、二次／三次タンパク質構造を予測するためのプログラムに一次アミノ酸配列を入力するステップを含む、前記親オプシン及び前記親標的ＧＰＣＲの一方又は両方における保存された３Ｄ ＧＰＣＲドメイン又はサブドメイン、特にサブドメインヘリックス８の同定を追加的に含む、請求項７２～７７のいずれか一項に記載の遺伝子操作の方法。

【請求項79】

医学的使用、特に遺伝子治療のための、
請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
請求項３６～３９のいずれか一項に記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
請求項４０～４７のいずれか一項に記載のカプシド、又は
請求項４８～５３のいずれか一項に記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクター、又は
請求項６５～７１のいずれか一項に記載の担体若しくは細胞。

【請求項80】

請求項７９に記載の使用のためのものであり、前記使用の目的は、視力の改善、部分的又は完全な失明の処置、網膜色素変性症（ＲＰ）の処置、黄斑変性症の処置及び他の形態の光受容体変性の処置を含む群から選択される、
キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
前記オプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子、又は
カプシド若しくは前記カプシドをコードする核酸分子、又は
ベクター、若しくは担体、若しくは細胞。

【請求項81】

請求項７９又は８０に記載の使用のための、
キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
前記オプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子、又は
カプシド若しくは前記カプシドをコードする核酸分子、又は
ベクター、若しくは担体、若しくは細胞であって、
前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、特に、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、
キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
前記オプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子、又は
カプシド若しくは前記カプシドをコードする核酸分子、又は
ベクター、若しくは担体、若しくは細胞。

【請求項82】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
請求項３６～３９のいずれか一項に記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
請求項４０～４７のいずれか一項に記載のカプシド、又は
請求項４８～５３のいずれか一項に記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクター、又は
請求項６５～７１のいずれか一項に記載の担体若しくは細胞
を含む産物の群から選択される産物を含む医薬組成物であって、
任意選択により、前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、
任意選択により、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、医薬組成物。

【請求項83】

処置を必要とするヒト又は非ヒト動物を処置する方法であって、
請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
請求項３６～３９のいずれか一項に記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
請求項４０～４７のいずれか一項に記載のカプシド、又は
請求項４８～５３のいずれか一項に記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクター、又は
請求項６５～７１のいずれか一項に記載の担体若しくは細胞
の投与を含み、
任意選択により、前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、
任意選択により、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、方法。

【請求項84】

視力を改善するための医学的治療、又は部分的若しくは完全な失明の処置、又は網膜色素変性症（ＲＰ）の処置、又は黄斑変性症の処置、又は他の形態の光受容体変性症の処置のための薬剤の製造における、
請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
請求項３６～３９のいずれか一項に記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
請求項４０～４７のいずれか一項に記載のカプシド、又は
請求項４８～５３のいずれか一項に記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクター、又は
請求項６５～７１のいずれか一項に記載の担体若しくは又は細胞
の使用であって、
任意選択により、前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、
任意選択により、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、使用。

【請求項85】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
請求項３６～３９のいずれか一項に記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
請求項４０～４７のいずれか一項に記載のカプシド、又は
請求項４８～５３のいずれか一項に記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
請求項５４～６４のいずれか一項に記載のベクター、又は
請求項６５～７１のいずれか一項に記載の担体若しくは細胞
を含む産物の群から選択される産物を含み、
前記産物は、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を含むか、又は前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み、
前記キメラオプシンＧＰＣＲは、
－ 特に配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択される配列によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号１６によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号３０又は配列番号３２から選択される配列による、細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６
を含む群から選択される、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の医療用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光遺伝学の分野にあり、且つさらなる光感受性キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を導入する。特に、本発明は、光感受性オプシン及びさらなるＧＰＣＲタンパク質を含むキメラＧＰＣＲタンパク質、並びにそれらをコードする核酸分子、並びにそのような核酸分子を操作する方法に関する。本発明は、キメラオプシンＧＰＣＲ又はそれをコードする核酸分子を含むカプシド、ベクター及び粒子並びに治療用途、例えばキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の光活性化及び意図的に選択されたシグナル伝達カスケードへのカップリングに基づく医薬及び遺伝子治療の方法にさらに関する。本発明は、特に、オプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラタンパク質及び光受容体変性による視力喪失を患っているヒト又は動物患者の遺伝子治療処置のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

約３０００人に１人は、光受容体変性及び失明を引き起こす遺伝子変異を患っている。光受容体の喪失にもかかわらず、下流の網膜ニューロンは、大部分が無傷のままである。最近の研究では、光受容体喪失後に残存している網膜組織に光活性化可能なタンパク質を直接導入すると、光感受性及び機能的視力を回復できることが示された（Ｌａｇａｌｉ Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００８；ｖａｎ Ｗｙｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｃｅｈａｊｉｃ－Ｋａｐｅｔａｎｏｖｉｃ Ｊ．ｅｔ ａｌ．２０１５）。

【0003】

国際公開第２０１２／１７４６７４号パンフレットは、ｍＧｌｕＲ６の細胞内ドメインを含むキメラ光感受性Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）タンパク質を開示している。そのようなキメラＧＰＣＲタンパク質の１つは、光感受性ＧＰＣＲメラノプシン並びにｍＧｌｕＲ６のＩＬ２、ＩＬ３及びＣＴを含み、Ｏｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６とも呼ばれる（ｖａｎ Ｗｙｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。有利には、Ｏｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６タンパク質は、内因性ｍＧｌｕＲ６受容体の光活性化可能なバージョンであり、したがって標的ＯＮ－双極細胞中に排他的に存在する天然ｍＧｌｕＲ６タンパク質であるＧアルファ（ｏ）Ｇタンパク質を活性化することにより、光活性化をｍＧｌｕＲ６特異的細胞内シグナル伝達カスケードにカップリングすることができる。

【0004】

ＧＰＣＲは、製薬業界の主要なターゲットである（Ｓｒｉｒａｍ Ｐ．ｅｔ ａｌ，２０１８）。従来技術は、例えば、Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｏ－ＧＰＣＲｓ（Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ Ｓ．，２０１６）でレビューされているように、又は例えばオピオイドのシグナル伝達及び挙動を時空間的に制御するために、ｏｐｔｏ ＭＯＲと呼ばれるキメラロドプシンＭＯＰＲオピオイド受容体タンパク質が適用されるように（Ｓｉｕｄａ ｅｔ ａｌ．２０１５）、標的ＧＰＣＲ特異的Ｇタンパク質シグナル伝達カスケードの光学的活性化を可能にする他のアプローチを含む。

【0005】

したがって、機能的に活性なキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、以下の２つの機能を提供する。第一に、それらは、光活性化可能であり、すなわち、それらは、その光感受性オプシン部分のために光感受性である。第二に、それらは、光活性化を標的ＧＰＣＲタンパク質のＧＰＣＲシグナル伝達経路にカップリングする。

【0006】

ＧＰＣＲタンパク質（Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質；略してＧＰＣＲ）は、ヒトゲノムにおける受容体の最大のスーパーファミリーを表し、配列相同性及び機能的類似性に基づく系統分類のＧＲＡＦＳシステムに従って５つのファミリー（又はクラス）に分類される（Ｓｃｈｉｏｅｔｈ，Ｈ．Ｂ．及びＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ Ｒ，２００５）。

【0007】

クラスＡは、ＧＰＣＲタンパク質の最大且つ最もよく理解されているファミリーである。これは、その「プロトタイプ」にちなんでロドプシンファミリーとも呼ばれる。

【0008】

全てのファミリーのＧＰＣＲは、高度に保存された三次構造及び同様の活性化モードを共有している。全てのＧＰＣＲは、様々な長さの３つの細胞外ループ及び３つの細胞内ループ（ＥＬ及びＩＬ）並びに細胞外Ｎ末端ドメイン（ＮＴ）及び細胞内Ｃ末端ドメイン（ＣＴ）によって接続された７つの膜貫通ドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）を含む。

【0009】

さらに、大半のクラスＡ ＧＰＣＲ及び他のＧＰＣＲクラス、特にクラスＣ ＧＰＣＲのＧＰＣＲタンパク質の多く又は大部分は、７つの膜貫通ヘリックス（ＴＭ１～ＴＭ７）に加えて、ＴＭ７の下流のヘリックス８（Ｈ８）を含む（Ｂｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ，２０１２）。Ｈ８は、ＧＰＣＲのＣＴの近位領域にあるＣＴのサブドメインであり、膜貫通ヘリックスではない。むしろ、Ｈ８は、細胞膜の細胞質表面に平行且つ隣接して存在するため、両性ヘリックスと呼ばれることもある。

【0010】

ＧＰＣＲ受容体タンパク質は、３つの機能的サブユニット、すなわちＧ－アルファ、Ｇ－ベータ及びＧ－ガンマサブユニットからなるヘテロ三量体Ｇタンパク質と生理学的に相互作用する。Ｇタンパク質は、アルファサブユニットの構造的類似性及びそれらが誘導する調節性応答のタイプに基づいて４つのサブファミリー、すなわちＧｓ、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ／１１及びＧ１２／１３に分類されている。各ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質の１つのサブファミリーに優先的にカップリングするため、１つのシグナル伝達カスケードを優先的に刺激する。ＧＰＣＲ受容体とＧタンパク質の間の構造的相互作用は、例えば、Ｍｏｒｅｉｒａ Ｉ，２０１４に要約されるように、多くの研究の対象となっている。Ｇタンパク質の４つの主要なクラスは、それ自体がサブクラスに分けられる。例えば、活性化段階のｍＧｌｕＲ６は、Ｇアルファ（ｉ／ｏ）のサブクラスであるＧアルファ（ｏ）に結合する。

【0011】

例示的な親オプシンの生理学的細胞環境に存在する例示的な内因性Ｇタンパク質は、メラノプシンの場合にはＧ（アルファ）ｑ、錐体オプシンの場合にはＧ（アルファ）ｔ、クラゲオプシンの場合にはＧ（アルファ）である。

【0012】

驚くべきことに、ＧＰＣＲファミリーのメンバーは、類似した３次元構造にもかかわらず、機能、シグナル伝達及び３Ｄ構造安定性に重要な３つの主要なＧＰＣＲクラスＡ、Ｂ及びＣの構造アライメントによって同定されるいくつかの保存されたアミノ酸と短いモチーフを除いて（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｎｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．２０１３）、他のファミリーのメンバーと実質的に配列の類似性を示さない（Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ，２０１６）。

【0013】

過去１０年間で、ドメインは２つのＧＰＣＲ間、特に光活性化オプシンＧＰＣＲとリガンド活性化非オプシンＧＰＣＲタンパク質間で交換され、機能的に活性なキメラＧＰＣＲタンパク質のいくつかの例を提供している。これらのキメラＧＰＣＲは、リガンド又は特に光によって活性化され、これは、第１のＧＰＣＲタンパク質の特徴であり、第２のＧＰＣＲタンパク質の特徴であるＧアルファタンパク質に結合することにより、このシグナル活性化を第２のＧＰＣＲタンパク質にカップリングする（Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ，２０１６；Ｍｏｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｓｉｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。このようなドメインの交換は、配列の類似性がないにもかかわらず、ＧＰＣＲタンパク質の配列アライメント及び以下に標識として説明する保存されたモチーフを使用したドメインの同定によって可能になる。

【0014】

上記の高度に保存されたアミノ酸及び短いモチーフのいくつかは、細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間の接合部に位置しており、特に、
－ ＴＭ３とＩＬ２との間の接合部（ｃ）の高度に保存されたＥ（Ｄ）ＲＹ（配列番号８０）モチーフ、
－ ＩＬ３とＴＭ６との間の接合部（ｆ）のグルタミン酸残基（Ｅ）
（これらは一緒になって、ＴＭ３とＴＭ６との間に、ＧＰＣＲの非活性状態を安定させる「イオンロック」を形成する）；
－ ＴＭ７とＣＴの近位端との間、特にＴＭ７とヘリックス８（Ｈ８）の近位端との間の接合部（ｇ）のＮＰｘｘＹモチーフ（配列番号８１）
である。

【0015】

ＴＭ３とＩＬ２との接合部のＥ（Ｄ）ＲＹ部位及びＩＬ３とＴＭ６との接合部のグルタミン酸残基及びＴＭ７の末端のＮＰｘｘＹモチーフによって形成されるＴＭ３とＴＭ６との間のイオンロックは、両方とも重要な構造的制約を提供し、これは、シグナルに応じて、例えば光活性化によるレチナールの光異化時又はリガンド結合時に再配置され、それによりＧＰＣＲタンパク質の活性化構造を形成する（Ｆｒｉｔｚｅ ｅｔ ａｌ．２００３）。

【0016】

ＮＲ（Ｋ）Ｑ（例えば、ＨＰＫ又はＨＥＰ）配列（配列番号８２）は、大半のＧＰＣＲ、特にクラスＡ及びクラスＣ ＧＰＣＲのＣＴの近位領域におけるＨ８の近位端にあるさらに高度に保存されたモチーフである。ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフと、多くの場合にＨ８を含むＣＴの近位領域とは、活性化時のＧＰＣＲタンパク質の構造スイッチに関連しているようであり、すなわちリガンド結合又はオプシンの場合には光吸収によってトリガーされる。さらに、ＮＲ（Ｋ）ＱモチーフとＣＴの近位領域とは、ＧＰＣＲ活性を制御するためのアレスチン結合に重要であると考えられている（例えば、Ｓａｔｏ Ｔ，２０１９）。

【0017】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、７つの膜貫通ドメインを含み、特にＴＭ３の遠位端にあるＥ（Ｄ）ＲＹモチーフ及びＴＭ７の遠位端にあるＮＰｘｘＹモチーフなどの高度に保存されたモチーフを含む、ＧＰＣＲ受容体タンパク質の高度に保存された三次構造を示す。

【0018】

さらに部分的に保存された構造要素及びモチーフには、以下のものが含まれる。
－ Ｈ８の遠位方向に直接続き、ウシロドプシンのＣ３２２及びＣ３２３に対応する１つ又は２つのパルミトイル化部位（Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ Ｙｕ Ａ，１９８８）。パルミチン酸に結合したアミノ酸残基の共有結合修飾により、Ｈ８の遠位端が膜にアンカーされる。大半のオプシンでは、Ｈ８の遠位端のシステイン残基がパルミトイル化されている。Ｈ８の遠位端のアミノ酸残基のパルミトイル化は、主にＧＰＣＲ膜の局在化、脂質ラフトの動員及びタンパク質の安定化に関与していると考えられている。いくつかの例外的なオプシン、例えば錐体オプシンＯＰＮ１ＭＷ及びＯＰＮ１ＬＷは、Ｈ８の遠位端にパルミトイル化アミノ酸を含まない。
－ 一般的にパルミトイル化部位を超えて遠位方向に位置するＣ末端のリン酸化部位。リン酸化部位は、典型的には、リン酸化されたセリン若しくはスレオニン又はときにチロシン残基を指す。リン酸化部位は、ＧＰＣＲ受容体の代謝回転の脱感作及び内在化に関与している。それらは、特にＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）及びアレスチンなどの活性調節因子の結合優先度も決定し、これらは、Ｇタンパク質シグナル伝達の動態に影響を及ぼす。例えば、メラノプシンは、複数のリン酸化部位を有する特に長いＣ末端を有し、特に、いくつかの遠位リン酸化部位は、概日時計に同調するこのオプシンの時間的に統合された生理学的機能に有利なシグナル伝達の停止を遅くすることが示されている（Ｍｕｒｅ Ｌ．ｅｔ ａｌ，２０１６を参照されたい）。

【0019】

オプシンは、さらに保存されたモチーフを含む。特に、発色団を共有結合させるために発色団ポケットに存在する２つの保存されたモチーフがある。全ての動物オプシンの発色団は、１１－ｃｉｓ－レチナールである。発色団ポケットには、２つの高度に保存されたモチーフがある。
－ シッフ塩基を介して発色団１１－ｃｉｓ－レチナールに共有結合しているＴＭ７の保存されたリジン（Ｋ）、
－ １１－ｃｉｓ－レチナールのシッフ塩基結合を安定化させるＴＭ３の陰性対イオン（Ｅ）。

【0020】

換言すれば、発色団ポケットは、発色団に共有結合するＴＭ７のリジン残基であるシッフ塩基を含み、ＴＭ３の陰性対イオンをさらに含む。

【0021】

生理学的機能の回復及び調節又はＧＰＣＲ受容体活性の調節などの医学的治療におけるそれらの使用のために特に好ましい特性を示すように遺伝子操作された、さらなる光感受性キメラＧＰＣＲタンパク質に対するさらなる必要性が依然として存在する。特に好ましい特性には、例えば、構造安定性、生理学的に適切な速度論的特性、応答の有意な強度及び標的ＧＰＣＲの生理学的局在化への効率的な細胞内輸送が含まれる。

【0022】

さらなる医療用途のためのさらなる標的ＧＰＣＲを含む光感受性オプシンＧＰＣＲキメラの必要性も依然として存在する。さらなる医療用途における光活性化可能なＧＰＣＲ受容体タンパク質の所望の治療標的の非限定的な例には、例えば、痛み、心不全、不安又は色覚の処置が含まれる。

【0023】

さらに、遺伝子工学によって得られる機能的に活性なキメラ光感受性オプシンＧＰＣＲタンパク質の設計におけるさらなるガイダンスの必要性が依然として存在する。光感受性オプシンＧＰＣＲタンパク質を生成する単純で効率的な遺伝子工学的方法は、遺伝子治療による変性した光受容体の生理学的回復だけでなく、さらなる用途に適し得る他の標的ＧＰＣＲタンパク質の活性の操作にも依然として望まれている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0024】

したがって、本発明の一般的な目的は、上記のような必要性を満たし、オプシンと、標的ＧＰＣＲタンパク質と呼ばれるさらなるＧＰＣＲタンパク質との間にキメラＧＰＣＲタンパク質を提供することである。

【0025】

本発明の特定の目的は、例えばその天然の光受容体によって提供される光感受性シグナル伝達活性の欠如又は不十分さによる、部分的又は完全な視力喪失を有する患者の遺伝子治療におけるそれらの使用のための１つ以上の特に好ましい特性を示すさらなるキメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質を提供することである。

【0026】

本発明の特定の目的は、例えば、それらの標的細胞における効率的な発現、例えばＯＮ双極細胞におけるオプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラの効率的な発現；それらの標的細胞におけるその効率的且つ特異的な細胞内ソーティング、例えばＯＮ双極細胞におけるオプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラのｍＧｌｕＲ６シグナロソームへの樹状突起輸送；双極細胞におけるＧαｏへのカップリングなど、標的細胞の天然ＧＰＣＲ Ｇタンパク質シグナル伝達経路への効率的なカップリング；構造安定性、生理学的動態及び低い脱感作を伴う生理学的アウトプットを生成する能力を示すことを含む、１つ以上の特定の好ましい特性を有するキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を設計することである。

【0027】

本発明のさらなる目的は、任意の標的ＧＰＣＲに適用可能なキメラオプシン－ＧＰＣＲ設計の単純な原理を提供して、標的－ＧＰＣＲ特異的Ｇタンパク質シグナル伝達カスケードの光活性化を可能にすることである。この目的は、特に細胞の生理学的操作又は遺伝子治療又は他の医学的及び薬理学的用途における使用のために、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を設計及び遺伝子操作するための簡単な方法の必要性に対処する。

【0028】

本発明のさらなる目的は、特に現在の医薬品で達成されない比類のない特異性を有する治療的ＧＰＣＲシグナル伝達経路を再確立又は改善することを可能にする光遺伝学的治療においても使用するために、キメラオプシンＧＰＣＲによって選択された細胞応答を調節することである。

【0029】

本発明のこの目的の非限定的な例には、例えば、キメラオプシンオピオイド受容体ＧＰＣＲ、キメラオプシンヒドロキシトリプタミン受容体（ＨＴ）ＧＰＣＲ、キメラＧＡＢＡ（Ｂ）受容体及び薬剤としての使用のためのキメラオプシンベータアドレナリン作動性受容体ＧＰＣＲタンパク質などのさらなるキメラオプシンＧＰＣＲを提供することが含まれる。

【0030】

したがって、本発明の目的は、設計されたキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする遺伝子操作された核酸分子、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする融合遺伝子を含む核酸分子を遺伝子操作及び発現する方法並びに薬剤、特にキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はそれらをコードする核酸分子にそれぞれ基づく遺伝子治療産物及び方法を提供することをさらに含む。

【課題を解決するための手段】

【0031】

説明が進むにつれてより容易に明らかになる本発明のこれらの目的及びさらなる目的を実行するために、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質及びそれに関連する本発明の態様は、以下に記載される特徴によって明らかにされる。

【0032】

本発明の第１の態様において、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質が提供される。

【0033】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、様々な長さの細胞外及び細胞内ループ（ＥＬ及びＩＬ）によって接続された７つの膜貫通ドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）を含む。

【0034】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、上流オプシンの光感受性オプシン部分と、標的ＧＰＣＲタンパク質と呼ばれる第２のＧＰＣＲタンパク質の標的ＧＰＣＲ部分と呼ばれる第２のＧＰＣＲ部分とを含む。

【0035】

標的ＧＰＣＲ部分は、標的ＧＰＣＲ（標的ＧＰＣＲ ＣＴ又はより短い標的ＣＴ）のＣ末端ドメインを含む。

【0036】

上流オプシン部分は、発色団を共有結合する発色団ポケットを含む。

【0037】

上流のオプシン部分は、切断型Ｃ末端ドメインをさらに含む。上流オプシンのこの切断型ＣＴは、上流オプシンＣＴの近位領域（Ｏ－ＣＴ近位領域）の遠位端又はその下流に位置する切断部位を有する。

【0038】

このＯ－ＣＴ近位領域は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ及び遠位方向に続く７～１３アミノ酸を含み、それにより、前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、キメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含む。

【0039】

標的ＧＰＣＲ－ＣＴは、切断型オプシンＣＴの下流に位置する。

【0040】

以下でさらに詳細に説明するように、大半のオプシンのＣＴの近位領域は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフで始まり、その７～１３アミノ酸下流のアミノ酸位置で終わるヘリックス８（Ｈ８）と呼ばれるサブドメインを含む。最近、Ｇタンパク質結合及び活性調節におけるＨ８の潜在的に重要な役割が構造データによって示された（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓａｔｏ，２０１９，Ｔｓａｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。他方では、本発明者らが見出したように、Ｇタンパク質結合特異性は、ＣＴのより遠位の領域によって調節される。Ｈ８は、多くの場合、その遠位端で１つ以上のパルミトイル化部位によって細胞質膜にアンカーされている。Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの遠位端のおよそ１０アミノ酸、すなわち７～１３、又は８～１２、又は９～１１アミノ酸下流の任意のアミノ酸位置に配置され得る。文献では、Ｈ８は、ＴＭ７ドメインとＣＴドメインとの間に配置された追加のＧＰＣＲドメインと見なされることもあれば、ＣＴのサブドメインと見なされることもある。本文では、Ｈ８は、ＣＴのサブドメインと呼ばれる。

【0041】

したがって、いくつかの実施形態において、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端は、
－ ヘリックス８（Ｈ８）の遠位端、
－ パルミトイル化部位、又は
－ ウシロドプシンのパルミトイル化部位に対応する位置
を含む群から選択される位置に位置する。

【0042】

光活性化キメラオプシンＧＰＣＲは、その活性化を天然オプシンシグナル伝達経路にカップリングするのではなく、代わりに遺伝子工学によるキメラオプシンＧＰＣＲの設計及び構築に使用される意図的に選択された標的ＧＰＣＲのシグナル伝達経路にカップリングするため、第２のＧＰＣＲタンパク質は、標的ＧＰＣＲと呼ばれる。

【0043】

上流オプシンＣＴの近位領域（Ｏ－ＣＴ近位領域）を標的ＧＰＣＲのＣＴ（標的ＣＴ）と共に含むＣ末端ドメインが、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の光活性化を標的ＧＰＣＲのシグナル伝達カスケードに効率的にカップリングするのに十分であることは、本発明者の予想外の発見である。これは、特に、細胞内輸送、応答速度、Ｇタンパク質結合特異性及び標的ＧＰＣＲタンパク質の対応する特性を模倣するキメラオプシンＧＰＣＲの細胞内結合パートナーとの相互作用に関連している。

【0044】

これは、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端のパルミトイル化部位で切断され、標的ＣＴと一緒にスプライシングされた、上流オプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲで最初に観察された。

【0045】

切断型上流ＣＴ及び標的ＣＴを含む、すなわちキメラＣＴを含むキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質が、天然の標的ＧＰＣＲタンパク質の生理学的応答に対応するか、又はそれより優れた応答を有する標的ＧＰＣＲタンパク質の細胞内ループがない場合でも、標的ＧＰＣＲのシグナル伝達経路へのカップリングを実現することは、実際に特筆すべき驚きである。Ｏ－ＣＴ近位領域が埋め込まれた切断型オプシンＣＴは、標的ＣＴによるＧタンパク質活性化の効率を有意に向上させる。

【0046】

本発明のオプシンＧＰＣＲタンパク質は、光活性化Ｇタンパク質活性化を増強するためにＯ－ＣＴ近位領域を含むように設計されている。一方で、それらは、上流オプシンのＣＴ全体を含まないように設計されている。代わりに、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位に位置し、細胞内輸送、速度論的調節及び（本発明に示されるような）Ｇタンパク質特異性に関与する上流オプシンＣＴの領域は、キメラオプシンＧＰＣＲから除外される。換言すれば、キメラオプシンＧＰＣＲの標的ＧＰＣＲ部分のみが、これらの生理学的活性を誘導するＣ末端領域を含む。これにより、上流オプシンＣＴに由来する分子情報と標的ＧＰＣＲ ＣＴの分子情報との干渉が回避され、したがってＧタンパク質特異性、細胞内局在の特異性及び標的ＧＰＣＲに関連する速度論的調節が強化される。したがって、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、光活性化時、標的ＧＰＣＲの応答を模倣し、光活性化は、標的ＧＰＣＲのシグナル伝達カスケードに効率的にカップリングされる。

【0047】

標的ＧＰＣＲタンパク質の細胞内ループは、任意選択により、本発明のキメラオプシンＧＰＣＲに付加され得るが、それらは、必須ではない。したがって、本発明は、標的ＣＴの近位端と一緒にスプライシングされた上流オプシンＣＴの切断部位にある単一の遺伝子融合部位のみを用いて（所望の場合）、光活性化可能なキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の遺伝子操作を可能にする。

【0048】

したがって、本発明は、標的細胞の正しい細胞内区画で強力に発現し、標的ＧＰＣＲの生理学的応答を模倣する応答を誘発する標的細胞の天然Ｇタンパク質経路を効率的に活性化する、最小限の遺伝子操作のみを必要とするさらなるオプシンＧＰＣＲキメラを提供する。

【0049】

驚くべきことに、本明細書に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、全ての細胞内ループがない場合でも、例えばｏｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．２０１５）などの先行技術で利用可能なキメラ光感受性ＧＰＣＲと比較して、標的ＧＰＣＲに特異的な生理学的応答を模倣する。

【0050】

いくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲタンパク質は、代謝型グルタミン酸受容体６（ｍＧｌｕＲ６）である。ｍＧｌｕＲ６は、網膜ＯＮ双極細胞の内因性ＧＰＣＲタンパク質であり、これは、健常な生理学的視覚シグナル伝達カスケードにおいてグルタミン酸によって活性化され、Ｇアルファ（ｏ）タンパク質に結合することによってその活性化を視覚シグナルカスケードにカップリングする。ＯＮ双極細胞は、視覚シグナルカスケードの生理学的光受容体細胞の直接下流にある網膜ニューロンである。

【0051】

本発明の第１の態様は、Ｏ－ＣＴ近位領域及び標的ＧＰＣＲ ＣＴ又はその機能的変異体を含むキメラＣ末端ペプチドにさらに関する。キメラＣ末端ペプチドのいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲ ＣＴのそのような機能的変異体は、Ｈ８の遠位端又はパルミトイル化部位に近位端を有する標的ＧＰＣＲの遠位Ｃ末端フラグメントである。キメラＣ末端ペプチドのいくつかの実施形態において、Ｃ末端フラグメントは、標的ＧＰＣＲ ＣＴのＨ８をさらに含む。

【0052】

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様による、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質及びキメラＣ末端ペプチドをコードする核酸分子に関する。

【0053】

本発明の第３の態様は、第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲをコードする第２の態様による核酸分子を標的細胞に導入する、医学的使用のためのＡＡＶカプシドに関する。第３の態様は、カプシドをコードする核酸分子にさらに関する。

【0054】

独立した発明は、導入遺伝子を標的細胞及びカプシドをコードする核酸分子にパッケージング及び輸送するための、新規で合理的に設計されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドに関する。独立した発明は、特に、キメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子の標的細胞への導入に関する。

【0055】

本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はキメラＣ末端ペプチドをコードする本発明の第２の態様による核酸分子を含むベクターに関する。

【0056】

本発明の第５の態様は、第２の態様による核酸分子を含むか又はそれを発現する粒子、特にナノ粒子、小胞、細胞（特に生殖細胞を除く）及び動物、又は第３の態様によるベクター、又は本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲを含むベクターに関する。

【0057】

本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする第２の態様の核酸分子を遺伝子操作する方法に関する。

【0058】

本発明の第７の態様は、医学的使用のための本発明によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質に関する製品に関する。特に、第７の態様は、第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は第２の態様による前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は両方とも本発明の第３の態様によるカプシド又は前記カプシドをコードする核酸分子、又は第４の態様によるベクター、又は医学的治療における使用のための粒子、小胞又は細胞に関する。第７の態様は、本発明によるキメラＧＰＣＲタンパク質に基づく上記の産物を使用する薬剤及び処置方法にさらに関する。

【0059】

本発明の上記の態様のいくつかの実施形態は、特に、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質又は２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲ並びに特に光受容体変性による部分的又は完全な視力喪失を患っている患者の遺伝子治療のためのそれらの使用に関する。

【0060】

以下の詳細な説明を考慮すると、本発明は、よりよく理解され、上記以外の目的が明らかになるであろう。そのような説明では、添付の図面が参照される。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】オプシンの一般的な構造である。

【図2】例示的なキメラオプシンＧＰＣＲのスキームである。

【図3-1】キメラオプシンｍＧｌｕＲ６の例示的な実施形態である。

【図3-2】（上記のとおり。）

【図4】キメラオプシンＧＰＣＲの例示的な実施形態は、細胞膜を標的とする。

【図5】キメラＣ末端を有するキメラオプシンｍＧｌｕＲ６の例示的な実施形態は、親オプシンと比較して、オプシン－ｍＧｌｕＲ６によって媒介される光活性化電流を増加させた。

【図6-1】ＨＥＫ－ＧＩＲＫ細胞を用いたキメラオプシンＧＰＣＲのインビトロ機能スクリーニングの例である。

【図6-2】（上記のとおり。）

【図7-1】キメラオプシンＧＰＣＲの例示的な実施形態のＧタンパク質再標的化及び経路選択性を探索するプレートリーダー実験である。

【図7-2】（上記のとおり。）

【図8】キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６変異体の例示的な実施形態のＯＮ－双極細胞樹状突起及びｍＧｌｕＲ６シグナロソームへの正しいインビボ輸送である。

【図9】キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲの例示的な実施形態は、単離されたＯＮ－双極細胞を直接光感受性にする。

【図10】キメラオプシンｍＧｌｕＲ６変異体の例示的な実施形態によるＡＡＶ遺伝子治療によって処置された盲目マウスの視力のインビボ測定である。

【図11】キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６の例示的な実施形態で処置された盲目ｒｄ１網膜の網膜神経節細胞から記録されたｅエクスビボ光応答である。

【図12】キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６の例示的な実施形態を発現するＡＡＶの例示的な実施形態を用いた硝子体内遺伝子治療後の２つの盲目ｒｄ１網膜からの網膜を通る垂直凍結切片の顕微鏡写真である。

【図13】ＨＥＫ２９３－ＧＩＲＫ細胞で発現した例示的なＪＳＲ１（Ｓ１８６Ｆ）ｐａｌｍ－ベータ２ＡＲキメラの全細胞パッチクランプ法で測定された光誘導電流である。

【発明を実施するための形態】

【0062】

定義及び詳細な説明
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明に関する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。それ以外の場合、本明細書で使用される特定の用語は、以下の説明に記載される意味を有する。

【0063】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形を含む。

【0064】

特に明記しない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、一連の要素の全ての要素を指すと理解されるべきである。

【0065】

本文では、「含む」又は「含んでいる」という用語は、記載された要素若しくはステップ又は要素若しくはステップの群を含むように定義される。本文では、「含む」又は「含んでいる」という用語は、一般に、他の要素若しくはステップ又は要素若しくはステップの群を排除するものではない。さらに、本文の「含む」又は「含んでいる」という用語は、要素若しくはステップ又は要素若しくはステップの群の正確な記載にも関する。「含む」又は「含んでいる」という用語の意味のこの後者の場合にのみ、実際には、特許請求の範囲で指定されていない要素、ステップ又は成分を一般に除外する「からなる」という用語と一致する。

【0066】

本発明の第１の態様は、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質に関する。第２のＧＰＣＲタンパク質の光感受性上流オプシン部分及び第２のＧＰＣＲ部分（標的ＧＰＣＲ部分）を含む「キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質」という句は、上記のようにＧＰＣＲタンパク質の中で特徴的な保存された構造である三次構造を含む光感受性の遺伝子操作されたＧＰＣＲタンパク質を指す。キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質（又は（キメラ）オプシンＧＰＣＲ受容体、若しくは（キメラ）オプシンＧＰＣＲ、若しくはキメラＧＰＣＲとも呼ばれる）及びキメラ核酸分子又はそれらをコードするキメラ（融合）遺伝子は、特に、例えば親遺伝子の切断及び選択された親遺伝子部分のライゲーション又は例えばキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子の合成を含む当技術分野で公知の遺伝子工学技術によって入手可能である。上流オプシン部分は、キメラＧＰＣＲ受容体への光曝露時に光感受性及び活性化を付与する。第２のＧＰＣＲ部分は、上で説明したように、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の光活性化の、標的ＧＰＣＲの生理学的シグナル経路に特異的なＧタンパク質へのカップリングを提供するため、標的ＧＰＣＲ部分と呼ばれる。例示的な標的ＧＰＣＲには、例えば、βアドレナリン受容体、ＧＡＢＡ（Ｂ）受容体、ＭＯＲ、ミューオピオイド受容体、５－ＨＴ７などのセロトニン受容体、ＯＰＮ１などの第２オプシン及びｍＧｌｕＲ６又はｍＧｌｕＲ５などの代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）が含まれる。

【0067】

本文では、キメラオプシンＧＰＣＲが由来するオプシン及び標的ＧＰＣＲは、親ＧＰＣＲと呼ばれる。したがって、例えば、キメラメラノプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質は、親ＧＰＣＲメラノプシン及び親ｍＧｌｕＲ６の一部を使用して、設計及び操作される。文脈から明らかであるように、親ＧＰＣＲという用語は、親ＧＰＲＣタンパク質若しくは親ＧＰＣＲ遺伝子のいずれか又はその両方を指す。

【0068】

本文では、ＧＰＣＲタンパク質という用語は、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質を指す。

【0069】

本文では、「オプシン」という用語は、クラスＡ ＧＰＣＲタンパク質の光感受性メンバーを指し、特に生理学的な天然オプシンを指す。いくつかの実施形態における「オプシン」という用語は、機能的に活性である、すなわち、以下でさらに説明するように、保存されたＧＰＣＲ ３Ｄ構造及び保存されたモチーフを一般に含む天然オプシンの変異体である光感受性オプシンも含み得る。そのような遺伝子オプシン変異体は、例えば、変異したオプシン遺伝子又は遺伝子操作された、例えば機能的で光感受性のオプシンをコードするキメラオプシン遺伝子に由来する核酸分子によってコードされる。

【0070】

同様に、標的ＧＰＣＲという用語は、一般に、生理学的な天然に存在する標的ＧＰＣＲを指し、いくつかの実施形態において、ｍＧｌｕＲ６の変異体などの天然の標的ＧＰＣＲの変異体を指し、これは、一般に、上記の保存されたＧＰＣＲ ３Ｄ構造及び保存されたモチーフを示し、機能的である、すなわち活性化を標的ＧＰＣＲのシグナル伝達経路に効率的にカップリングすることができる。標的ＧＰＣＲのそのような変異体は、例えば、変異した標的ＧＰＣＲ遺伝子又は遺伝子操作された、例えば機能的活性標的ＧＰＣＲタンパク質をコードするキメラ標的ＧＰＣＲ遺伝子に由来する核酸分子によってコードされる。

【0071】

したがって、本文では、いくつかの実施形態におけるドメイン又はサブドメインという用語は、ＧＰＣＲタンパク質の生理学的な天然ドメインに加えて、例えば変異した又は遺伝子操作された、例えば天然のＧＰＣＲドメイン又はサブドメインを機能的に模倣するキメラ又は合成ドメイン又はサブドメインなどのドメイン又はサブドメインの遺伝子変異体を含み得る。

【0072】

上流オプシン部分の各ドメインは、上流オプシンをコードする遺伝子（上流オプシン遺伝子）又はその遺伝子変異体に由来する遺伝子フラグメントによってコードされる。標的ＧＰＣＲ部分の各ドメインは、標的ＧＰＣＲ遺伝子又はその遺伝子変異体に由来する遺伝子フラグメントによってコードされている。上流オプシン遺伝子フラグメントによってコードされるキメラオプシンＧＰＣＲの全てのドメインは一緒に上流オプシン部分と呼ばれ、同様に、標的ＧＰＣＲ遺伝子フラグメントによってコードされる全てのドメイン又はサブドメインは一緒に標的ＧＰＣＲ部分と呼ばれる。いくつかの実施形態において、上流オプシン部分及び又は標的ＧＰＣＲ部分は、１つ以上、特に２つ又は３つの親遺伝子に由来し得る。

【0073】

標的ＧＰＣＲは、任意のＧＰＣＲクラス、特にクラスＡ、Ｂ又はＣから、より具体的にはクラスＡ又はＣから選択され得る。クラスＡの例示的な標的ＧＰＣＲには、例えば、錐体オプシン、セロトニン受容体（例えば、５－ＨＴ７）、ミューオピオイド又はβアドレナリン受容体が含まれる。クラスＢの例示的な標的ＧＰＣＲには、例えば、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）及び他のホルモン受容体が含まれる。クラスＣの例示的な標的ＧＰＣＲには、例えば、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ、例えば、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ５）又はＧＡＢＡＢ受容体）が含まれる。

【0074】

ＧＰＣＲタンパク質の膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間及びそれに対応してそれらをコードする遺伝子フラグメントとの間の遷移を形成する、６つの接合部が存在し、図１に示すように、ＴＭ１とＩＬ１との間の接合部（ａ）、ＩＬ１とＴＭ２との間の接合部（ｂ）、ＴＭ３とＩＬ２との間の接合部（ｃ）、以下同様にＴＭ７とＣＴとの間の接合部（ｇ）まで名付けられる。

【0075】

同様に、ＧＰＣＲタンパク質の膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間及びそれらをコードする遺伝子フラグメントとの間の遷移を形成する、６つの接合部も存在し、図２に示すように、ＮＴとＴＭ１との間の接合部（Ａ’）ＴＭ２とＥＬ１との間の接合部（Ｂ’）ＥＬ１とＴＭ３との間の接合部（Ｃ’）、以下同様にＥＬ３とＴＭ７との間の接合部（Ｇ’）まで名付けられる。

【0076】

本文では、当技術分野で一般的に使用される「保存されたモチーフ」という用語は、まったく同一の、例えば特定の保存されたモチーフを指す場合に一般的に引用される３～５アミノ酸からなるモチーフに限定されない。むしろ、これらの保存されたモチーフのそれぞれは、例えば、以下の表１に含まれるものなど、いくつかの選択肢を表す特に高頻度のプロトタイプ配列から名付けられている。

【0077】

さらに、機能的変異体は、保存されたモチーフから誘導することができる。例えば、Ｅ（Ｄ）ＲＹモチーフの機能的変異体（ＥＲＹ及びＤＲＹ）には、ＤＲＩＹ（配列番号８３）、ＮＲＩＹ（配列番号８４）又はＮＲＹが含まれ、これらは全て光感受性オプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲを生成する（国際公開第２０１２／１７４６７４号パンフレットを参照されたい）。保存されたモチーフの例示的な機能的変異体も以下の表２に示されている。

【0078】

明らかに、いくつかの保存されたモチーフは、ＴＭドメインと細胞内ドメインとの間の接合部又はその周辺、すなわち膜貫通ヘリックス（ＴＭ１～ＴＭ７）と細胞内ループ（ＩＬ１～ＩＬ３）とＣ末端（ＣＴ）との間の接合部又はその周辺に生じる。しかし、全ての接合部が必ずしも高度に保存されたモチーフを含むわけではない。

【0079】

本文では、ＮＰｘｘＹモチーフという用語は、ＴＭ７の遠位端、すなわちＧＰＣＲタンパク質、特に親上流オプシン又は親標的ＧＰＣＲ又はキメラオプシンＧＰＣＲのＴＭ７／ＣＴ接合部周辺の保存されたモチーフを指し、以下の１つ以上の基準を満たすことによって定義される。
Ａ）アミノ酸の１文字コードによると、配列ＮＰｘｘＹの５つの連続アミノ酸の配列であり、ｘは任意のアミノ酸残基に対応する；
Ｂ）例えば以下の表Ｉに列挙された、特定のＧＰＣＲのＮＰｘｘＹモチーフに対応する配列である；
Ｃ）親ＧＰＣＲ、特に親上流オプシンのアミノ酸配列のアライメントにおいて、ウシロドプシンのアミノ酸配列が、ウシロドプシンのＮ（３０２）ＰｘｘＹ（１３６）の配列に対応する５つの連続アミノ酸の配列である。

【0080】

多くの配列変異を示しているが、ＮＰｘｘＹモチーフは、全てのクラスＡ ＧＰＣＲ及び他の大半のＧＰＣＲに存在し、同定可能である（例えば、Ｓａｔｏ，２０１９の表２を参照されたい）。

【0081】

本文では、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフという用語は、ＧＰＣＲタンパク質、特に親上流オプシン又は親標的ＧＰＣＲ又はキメラオプシンＧＰＣＲ及びＨ８の近位端周辺のオプシンＣＴのＮＰｘｘＹモチーフの数アミノ酸下流のＣＴの近位領域にある保存されたモチーフを指し、以下の基準の一方又は両方を満たすことによって定義される。
Ａ）特定のＧＰＣＲ、特に親上流オプシンのＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフに対応する配列であり、表Ｉ又はＤａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１０に記載されているもの；
Ｂ）親ＧＰＣＲ、特に親上流オプシンのアミノ酸配列のアライメントにおいて、ウシロドプシンのアミノ酸配列が、ウシロドプシンのＮ（３１０）ＫＱ（３１２）の配列に対応する３～４つの連続アミノ酸の配列である。

【0082】

ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフは、全てのクラスＡ ＧＰＣＲ及び他の大半のＧＰＣＲに存在し、同定可能である。特に、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフは、多くの配列変異を示すが、ウシロドプシンとの配列アライメントによって識別可能な３～４つの連続アミノ酸の配列に対応する。ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフには、ＨＰＫ、ＨＰＥ、ＨＫＱ、ＨＰＲ、ＩＲＫ、ＤＹＫなどの配列が含まれる（Ｄａｖｉｅｓ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0083】

本文では、「パルミトイル化部位」及び「パルミトイル化部位に対応するアミノ酸位置」（後者は略してパルミトイル化部位とも呼ばれる）という用語は、以下の基準Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの１つ以上を満たすことによって定義される。特に、パルミトイル化部位という用語は、１つの基準、例えばＡを満たすか、又は２つの基準Ｂ及びＣ又はＢ及びＤ又はＣ及びＤを満たすか、又は３つの基準Ｂ、Ｃ及びＤを満たす。基準Ａ～Ｄは、以下のとおりである。
Ａ）親ＧＰＣＲ、特に親オプシンのＣＴのパルミトイル化アミノ酸残基である；
Ｂ）アミノ酸システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）から選択されるオプシンのＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの遠位端の少なくとも７アミノ酸、特に少なくとも８又は９又は１０又は１１又は１２又は１３アミノ酸下流に位置する親ＧＰＣＲ、特に親オプシンのＣＴのパルミトイル化可能なアミノ酸残基である；
Ｃ）ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの遠位端の７～１３アミノ酸残基、特に８～１２、又は９～１１、又は１０アミノ酸残基下流に位置する、親ＧＰＣＲ、特に親オプシンのＣＴのアミノ酸残基である；
Ｄ）親ＧＰＣＲ、特に親オプシンのアミノ酸配列とウシロドプシンとのアライメントにおいて、ウシロドプシンのＣ３２２又はＣ３２３に対応するのはアミノ酸残基である。

【0084】

特に、この最後の基準Ｄは、実際にはパルミトイル化されていないが、アミノ酸配列アライメントでロドプシンのパルミトイル化Ｃ３２２及びＣ３２３に対応する、Ｈ８の末端に位置するアミノ酸残基を指す。例えば、ヒト錐体オプシンｈＯＰＮ１ＭＷとｈＯＰＮ１ＬＷの両方で、これらのアミノ酸位置は、アミノ酸残基Ｇ３３８及びＫ３３９に対応する。

【0085】

Ｈ８の遠位端にあるパルミトイル化アミノ酸残基（存在する場合）は、Ｈ８の膜結合を有利に増強する。したがって、Ｈ８の遠位端に１つ以上のパルミトイル化部位を有する上流オプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲでは、少なくとも１つのパルミトイル化部位が切断型上流オプシンＣＴに保持されることが最も好ましい。したがって、本文では、上記の基準Ａ又はＢを満たすパルミトイル化部位の切断部位への言及は、特に明記しない限り、パルミトイル化部位に隣接して遠位に配置される。

【0086】

本文では、タンパク質及び核酸分子に関連して、下流及び遠位という用語は、タンパク質のＣ末端方向又は領域及び核酸分子の３’方向又は領域を指し、一方、上流及び近位という用語は、タンパク質のＮ末端方向又は領域及び核酸分子の５’方向又は領域を指す。～の下流と～の遠位という用語、ひいては～の上流と～近位という用語も互換可能に使用される。

【0087】

本文では、ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の上流（又は近位）という用語は、近位に隣接する位置を含む、前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の近位端の上流（又は近位）である位置を指す。

【0088】

本文では、ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の下流（又は遠位）という用語は、遠位に隣接する位置を含む、前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の遠位端の下流（又は遠位）である位置を指す。

【0089】

本文では、特定のドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位「～において」という句は、前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位内の位置を指す。本文では、特定のモチーフ又は部位の「その位置又はその遠位」という句は、前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の内部又は遠位の位置を指す。「～又はその下流」、「～又はその近位」及び「～又はその上流」という句に準用することができる。

【0090】

本文では、２つの特定のモチーフ又は部位間の句、例えば、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフとパルミトイル化部位との間の句は、明示的に述べられているか、文脈から明らかでない限り、元のバージョン又は機能的に同等のバージョンで保持又は再構成されている限り、これらのモチーフ又は部位内のアミノ酸位置を含む。実際、２つの保存されたモチーフ若しくは部位間又は保存されたモチーフと別のアミノ酸位置との間のスプライシング部位を含むいくつかの好ましい実施形態において、好ましいスプライシング部位は、保存されたモチーフ内に位置し得、スプライシング操作の完了後、保存されたモチーフ又は部位又はその機能的同等物が保持又は再構成される。

【0091】

本文では、ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の近位端又は上流端の句には、まだ完全に又は部分的にその近位（又は上流）端の前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位内にあるか、又は前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の近位（又は上流端）に近位に隣接している近位（又は上流）端の位置が含まれる。

【0092】

本文では、ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の遠位端又は下流端の句には、同様に、まだ完全に又は部分的にその遠位（又は下流端）の前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位内にあるか、又は前記ドメイン、サブドメイン、領域、モチーフ又は部位の遠位に隣接している遠位（又は下流）端の位置が含まれる。

【0093】

本文では、上流及び下流のシグナル伝達経路に関連して、経路の前及び後のステップ又は前及び後のステップにそれぞれ関与する細胞又は成分を指す。

【0094】

本文では、（遺伝子）スプライシング部位という用語と、（遺伝子）融合部位、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）部位又は切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）及びライゲーション部位などの代替又は類似の用語は、特に異なる親ＧＰＣＲに由来する、異なる起源の遺伝子フラグメントが結合している部位を指す。

【0095】

反対の記載がない限り、保存されたモチーフ又は遺伝子操作の末端の部位に位置する遺伝子スプライシング部位（融合部位、切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）及びライゲーション部位、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）部位）は、上記のようなモチーフ又は設計と同一又は機能的に同等のものを保持又は再構成する。スプライシング部位が特定のモチーフ、部位又はアミノ酸位置の上流／近位又は下流／遠位に位置すると定義されている場合でも、完了した遺伝子操作（例えば、切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）、ライゲーション、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）融合、スプライシング）の結果として、保存されたモチーフ又はアミノ酸が、復元されるか、又は例えばいくつかの実施形態において保存的アミノ酸置換を含む上記のようなその機能的誘導体によって置き換えられるならば、前記遺伝子スプライシング部位は、そのような特定のモチーフ、部位又はアミノ酸に又はその中に位置し得る。

【0096】

本文では、Ｇタンパク質及びそれに対応するＧアルファサブユニットの略称が使用される場合があり、一般に、当技術分野で一般的な、Ｇアルファ（ｉ／ｏ）につきＧ（ｉ／ｏ）、Ｇアルファ（ｏ）につきＧａ（ｏ）、Ｇアルファ（ｑ）につきＧａ（ｑ）に従う。

【0097】

本文では、変異体という用語は、参照ポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持しているポリペプチド又はそれをコードする遺伝子を指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、その一次アミノ酸配列が、参照として使用される別のポリペプチドとは異なる。一般に、差異は、参照ポリペプチド及び変異体の配列が全体的に非常に類似し、多くの領域で同一であるように制限される。変異体及び参照ポリペプチドは、１つ以上の修飾（例えば、置換、付加及び／又は欠失）によってアミノ酸配列が異なり得る。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在するものであり得るか、又は天然に存在することが知られていない変異体であり得、すなわち、変異体は、人工的に構築され得る。

【0098】

本文では、アミノ酸配列に関連して、「パーセント配列同一性」、「とのパーセント同一性」、「とのパーセント類似性」という句は、アミノ酸配列の全長のアミノ酸残基の数と比較した、２つ以上のアラインしたアミノ酸配列の同一のアミノ酸の一致の数を説明する。したがって当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用して測定される最大の一致につき配列が比較及びアラインされる場合又は特に手動でアライン及び視覚的に検査される場合の短い配列モチーフについて、アライメントを使用して、２つ以上の配列について、同じであるアミノ酸残基のパーセンテージ（例えば、アミノ酸配列の全長にわたって９０％又は９５％又は１００％の同一性など）が決定され得る。したがって、配列同一性を決定するために比較される配列は、アミノ酸の置換、付加又は欠失によって異なり得る。タンパク質配列を整列させるための適切なプログラムは、当技術分野で公知である。

【0099】

比較のための配列のアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ２５及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の網羅的アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法又はＣＬＵＳＴＡＬ、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装によって実行され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。核酸配列を比較するためのそのような例の１つは、デフォルト設定：予想閾値：１０；文字サイズ：２８；クエリ範囲での最大一致：０；一致／不一致スコア：１．－２；ギャップコスト：線形を使用するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである。特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、それぞれ上記で同定されたタンパク質及び核酸比較の３５のデフォルトパラメーターを使用して、プログラムのＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を使用して得られた値を指す。

【0100】

本文では、保存的アミノ酸置換という用語は、例えば、同様のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的性質など、対応する参照と物理的、生物学的、化学的又は機能的に類似している修飾を指す。

【0101】

例えば、保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されているものが含まれ、例えば、セリンがスレオニンで置換され得る。アミノ酸残基は通常、以下のような一般的な類似の側鎖特性に基づいたファミリーに分類される。
１．非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン）、
２．非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、プロリン、システイン、トリプトファン）、
３．塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン）、
４．酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
５．ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び
６．芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。

【0102】

保存的置換には、非天然アミノ酸の使用も含まれ得る。

【0103】

本文では、「類似のタンパク質配列」という用語は、アラインされたときに、比較される配列の対応する位置で類似のアミノ酸残基及び大半の場合同一のアミノ酸残基を共有するものである。類似のアミノ酸残基は、側鎖の化学的特性によってファミリーにグループ化される。前記ファミリーは、「保存的アミノ酸置換」につき上で説明されている。配列間の「パーセント類似性」は、比較される配列の対応する配列位置に同一又は類似の残基を含む位置の数を、比較される位置の総数で除し、１００％を掛けたものである。例えば、１０個の配列位置のうちの６個が同一のアミノ酸残基を有し、１０個の位置のうちの２個が類似の残基を含む場合、配列は８０％の類似性を有する。２つの配列間の類似性は、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して決定できる。

【0104】

本文では、オプシンＣＴの近位領域は、Ｏ－ＣＴ近位領域と呼ばれ、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフとそれに続く遠位方向の約１０アミノ酸、特に７～１３、より具体的には８～１２又は最も具体的には９～１１アミノ酸を含むように定義され、これは、多くの場合、ヘリックス８（Ｈ８）を含む。オプシンＣＴの近位領域には、任意選択により、Ｈ８の遠位端にパルミトイル化部位（Ｃ）が含まれる。

【0105】

本文では、切断されたオプシンＣＴという用語は、切断部位で切断された上流オプシンの切断型ＣＴを指し、それを超えると、遠位方向で親上流オプシンＣＴのアミノ酸が切断型オプシンＣＴから除外される。切断型ＣＴの切断部位は、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端又はその遠位、特に上で定義されるようにＯ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端のアミノ酸位置に配置される。

【0106】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の好ましい実施形態において、切断型オプシンＣＴの切断部位は、上流オプシンＣＴの近位領域（Ｏ－ＣＴ近位領域）の遠位端に配置される。

【0107】

しかし、キメラオプシンＧＰＣＲのいくつかの実施形態は、Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端に上流オプシンＣＴの切断部位を含む。Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長は、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端の下流又は特にパルミトイル化部位の下流に最大５、若しくは最大１０、若しくは最大１６、若しくは最大２２又は最大２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５アミノ酸において遠位端を含む。

【0108】

いくつかの実施形態において、オプシンＣＴの切断部位は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４１又は最大４３又は最大４５又は最大４７アミノ酸下流の位置で選択される。

【0109】

Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長を含むいくつかの好ましい実施形態において、上流オプシンは、メラノプシンの群から選択される。

【0110】

Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長を含むいくつかの実施形態において、上流オプシンは長いＣＴドメインを含み、例えば、少なくとも５０、６５、８０、１００、１５０又は２００アミノ酸のＣＴを含む。

【0111】

Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長を伴うこれら及び他の実施形態のいくつかにおいて、遠位伸長の遠位端は、上流オプシンに特異的な細胞内輸送及び速度論的特性に影響を与える上流オプシンＣＴのサブドメインが除外されるように選択される。

【0112】

メラノプシンの異常に長いＣ末端細胞質領域（マウスＯＰＮ４のＡＡ３６４－５２１）は、他のＧＰＣＲとの限定された相同性を示す。したがって、これは、概日時計を同調させる環境光検出器である時間の経過と共に入力を合計するメラノプシンの特徴的な応答特性に寄与し得る。多様な種のメラノプシン間で高度に保存されたマウスＯｐｎ４のＡＡ３８１－３９７は、光活性化メラノプシンの応答を形成する上で重要な役割を果たしていることが示唆された（Ｍｕｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１６）。したがって、上流オプシンとしてメラノプシンを用いたキメラオプシンＧＰＣＲのいくつかの実施形態は、その応答動態を加速させるために、マウスメラノプシンのアミノ酸位置３９７で又はその遠位に切断型メラノプシンを含む。アミノ酸位置３９７は、マウスメラノプシンのアミノ酸位置３６４に位置するパルミトイル化部位の３３アミノ酸下流に対応する。

【0113】

したがって、オプシンがメラノプシンであるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、切断型オプシンＣＴは、パルミトイル化部位の最大およそ３３アミノ酸下流に対応する、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの遠位端の最大およそ４４アミノ酸下流を含む。

【0114】

キメラオプシンＧＰＣＲのいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、切断部位までの上流オプシン全体を含むか、又は上流オプシン部分は、Ｅ（ＤＲＹ）モチーフから切断部位までの上流オプシンの連続領域を含むか、又は上流オプシン部分は、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６及びＴＭ７と、任意選択により切断部位までの切断型上流オプシンＣＴとを含む。

【0115】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、膜貫通ドメインＴＭ３及びＴＭ７を含み、特に膜貫通ドメインＴＭ３～ＴＭ７、ＴＭ２～ＴＭ７を含むか、又はＴＭ１～ＴＭ７を含む。

【0116】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、ＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３及びＮＴから選択される細胞外ドメインの１つ以上をさらに含む。

【0117】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、２つ以上の親オプシン、特に２つの親オプシンに由来する。

【0118】

いくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、非ヒトオプシンである親オプシンに由来する膜貫通ドメインを含み、ヒトオプシンである親オプシンに由来する１つ又はいくつか、特に２つ若しくは３つ又は全ての細胞外ドメインをさらに含む。有利には、これらの実施形態において、ヒト免疫系は、ヒトオプシンに由来する細胞外ドメインを外来エピトープとして認識しない。したがって、オプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの好ましい実施形態において、全ての細胞外ドメインは、ヒトオプシンに由来する。

【0119】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、ＴＭ７及び切断型オプシンＣＴは、同じ親オプシンに由来する。

【0120】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、細胞外ドメインの全て、膜貫通ドメインの全て及び全ての細胞内ループを含む。

【0121】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、ＣＴの切断部位までの親上流オプシン全体を含む。

【0122】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、単安定若しくは双安定オプシン又は三安定オプシン、特に双安定オプシンに由来する。

【0123】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、
－ メラノプシン（ＯＰＮ４）、
－ ロドプシン（ＲＨＯ）、
－ 錐体オプシン（ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＬＷ及びＯＰＮ１ＭＷ）、
－ クラゲオプシン（ｃｕｂｏｐ、ＪｅｌｌｙＯＰ）、
－ ハエトリグモ（ｊｕｍｐｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ）ロドプシン（ＪＳＲ１）、
－ パラピノプシン（ＰＰＯ）、
－ ニューロプシン（ＯＰＮ５）、
－ エンセファロプシン（ＯＰＮ３）
を含むオプシンの群から選択される親オプシンに由来する。

【0124】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、生理学的親オプシンと比較して、欠失又は付加、特に最大５又は最大１０又は最大１５又は最大２０又は最大３０アミノ酸の欠失又は付加は、キメラオプシンＧＰＣＲの上流オプシン部分に存在する。これら及び他の実施形態のいくつかにおいて、生理学的親オプシンと比較して、アミノ酸、特に保存的アミノ酸の置換及び／又は特に最大５又は最大１０又は最大１５又は２０の置換アミノ酸は、キメラオプシンＧＰＣＲの上流オプシン部分に存在する。

【0125】

キメラオプシン－ＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分のアミノ酸配列は、生理学的な１つ以上の親オプシンの対応する部分と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、特に完全に同一であるか又は類似している。

【0126】

本文では、標的ＧＰＣＲ ＣＴ又は略して標的ＣＴという用語は、標的ＧＰＣＲの本質的に完全なＣＴ又はその機能的に活性な変異体を指す。標的ＣＴの機能的に活性な変異体は、キメラオプシンＧＰＣＲ又は親標的ＧＰＣＲの活性化を、同様の効率で親ＧＰＣＲの特定のシグナル伝達経路にカップリングすることができる。

【0127】

特に１つ以上のアミノ酸の欠失、特にＮＰｘｘＹモチーフと、パルミトイル化部位まで又はパルミトイル化部位に近位に隣接するアミノ酸位置までの任意のアミノ酸位置との間のＮ末端欠失を含む標的ＧＰＣＲを含む、先の請求項のいずれか１つに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。

【0128】

いくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲ ＣＴは本質的に完全である。特に、本質的に完全な標的ＧＰＲＣは、ＮＰｘｘＹ及びＮＲ（Ｋ）Ｑ部位又はそれらの間の近位端を含む。いくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲ ＣＴは、ＮＲ（Ｋ）Ｑ部位の１アミノ酸又は最大２又は最大３又は最大４又は最大５アミノ酸下流の近位端を有する。いくつかの実施形態において、標的ＣＴは、ＮＲ（Ｋ）Ｑ部位と、ＮＲ（Ｋ）Ｑ部位のおよそ７～１３又は８～１２又は９～１１又はおよそ１０アミノ酸遠位にあるか、又は特にパルミトイル化部位又は上記で定義されたパルミトイル化部位に対応するアミノ酸位置にある標的ＣＴの近位領域の遠位端との間に近位端を有する。

【0129】

親標的ＧＰＣＲのＣＴの機能的変異体を有するいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲのＴＭ７の遠位端にあるＮＰｘｘＹモチーフと標的ＧＰＣＲ ＣＴのＨ８の近位端にあるＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフとの間に位置する１つ以上のアミノ酸が欠失又は置換される。

【0130】

親標的ＧＰＣＲの機能的変異体を有するいくつかのさらなる実施形態において、標的ＧＰＣＲの近位領域は、最大Ｈ８の遠位端のパルミトイル化部位まで欠失される。したがって、これらの実施形態又はＨ８を含まない標的ＣＴを有するいくつかのさらなる実施形態において、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ及びそれに続く標的ＧＰＣＲの７～１３又は８～１２又は９～１１アミノ酸が欠失される。特定の実施形態において、パルミトイル化部位又は上記で定義されたパルミトイル化部位に対応する部位に近位のアミノ酸が欠失される。

【0131】

これらの実施形態のいくつかにおいて、そのような機能的標的ＧＰＣＲ ＣＴ及び切断型オプシンＣＴは、パルミトイル化部位で一緒にスプライシングされる。

【0132】

置換及び／又は欠失を含むＣＴの機能的変異体のいくつかの実施形態において、保存されたＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフは無傷に保たれる。

【0133】

親標的ＧＰＣＲのＣＴの機能的変異体を有するいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の標的ＧＰＣＲ部分の標的ＧＰＣＲ ＣＴのアミノ酸配列は、生理学的親標的ＧＰＣＲ ＣＴと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一又は類似である。

【0134】

キメラオプシンＧＰＣＲのいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲ部分は、非オプシンＧＰＣＲに由来する。キメラオプシンＧＰＣＲの他のいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲ部分は、オプシンに由来する。

【0135】

したがって、いくつかの実施形態は、２つのオプシン、上流オプシン及び標的オプシンと呼ばれる下流オプシンを含む。

【0136】

上流オプシン部分は光活性化可能であり、光活性化を標的ＧＰＣＲ ＣＴにカップリングする。標的オプシンは、標的オプシンに生理学的に関与するＧアルファタンパク質に結合することにより、標的オプシンのシグナル伝達カスケードへの光活性化のカップリングを達成する。

【0137】

切断型上流オプシンＣＴには、Ｏ－ＣＴ近位領域が包埋されている。上流オプシン及び標的オプシンを含むいくつかの実施形態は、２つのＯ－ＣＴ近位領域を含み、１つは上流オプシンに由来し、もう１つは標的ＧＰＣＲに由来する。これらの実施形態は、２つのオプシンＣＴ Ｈ８サブドメイン、上流オプシンＨ８及び標的ＧＰＣＲ Ｈ８も含み得る。

【0138】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、標的ＣＴ部分は、
特に、
－ 錐体オプシン、特にＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＭＷ又はＯＰＮ１ＬＷ、
－ セロトニン受容体、特に５－ＨＴ７、
－ ミューオピオイド受容体、
－ βアドレナリン受容体、特にベータ１アドレナリン受容体、ベータ２アドレナリン受容体及びベータ３アドレナリン受容体
を含む群から選択されるクラスＡ ＧＰＣＲ；
特に、
－ ホルモン受容体、特にグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）
を含む群から選択されるクラスＢ ＧＰＣＲ；
特に、
－ ＧＡＢＡ_Ｂ受容体、特にＧＡＢＡ_Ｂ１及びＧＡＢＡ_Ｂ２、
－ 代謝型グルタミン酸受容体、特にｍＧｌｕＲ６及びｍＧｌｕＲ５受容体
を含む群から選択されるクラスＣ ＧＰＣＲ
を含むＧＰＣＲタンパク質の群から選択される親標的ＧＰＣＲに由来する。

【0139】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲは、クラスＡ ＧＰＣＲ若しくはクラスＢ ＧＰＣＲ又はクラスＣ ＧＰＣＲを除く別のクラスのＧＰＣＲである。これらの実施形態のいくつかにおいて、標的ＧＰＣＲ部分は、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループを含む。

【0140】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲは、クラスＣ ＧＰＣＲ、特にｍＧｌｕＲ６である。これらの実施形態のいくつかにおいて、標的クラスＣ ＧＰＣＲ部分、特にｍＧｌｕＲ６部分は、以下の基準：
Ａ：キメラＧＰＣＲにおいて、上流オプシン部分に含まれる天然サイズのＩＬ３と、その天然位置に対応する位置におけるクラスＣ ＧＰＣＲの天然サイズのＩＬ２との同時存在は、キメラＧＰＣＲにおけるこれらの２つのＩＬ間の立体障害を回避するために除外されること；
Ｂ：上流オプシン部分は、細胞内ループＩＬ１～ＩＬ３の全てを含むこと；
Ｃ：上流オプシン部分は、ＩＬ１を含み、及び標的ＧＰＣＲ部分は、対応する位置で上流オプシンＩＬ２及びＩＬ３を置き換えるＩＬ２及びＩＬ３の両方を含むこと
の１つが満たされることを条件として、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループを含む。

【0141】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲのＣＴは、以下の要素の群：
－ ゴルジ搬出シグナル、
－ 膜輸送配列、
－ 蛍光タンパク質をコードする配列要素
から選択される配列要素をさらに含む。

【0142】

１つ以上の選択された要素は、キメラオプシンＧＰＣＲのＣＴのＣ末端に任意の順で独立して配置される。

【0143】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲのＣＴは、選択された配列要素として、搬出シグナル、特に小胞体又はゴルジ搬出シグナル、特にアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号８５）を有するカリウムチャネルＫｉｒ２．１からのゴルジ搬出シグナル又はアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号８６）を有するＫｉｒ２．１からのＥＲ搬出シグナルを含む。

【0144】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲのＣＴは、選択された配列要素として、特にオプシンからの膜輸送配列、より具体的には１Ｄ４エピトープタグ又は略して１Ｄ４タグとも呼ばれるアミノ酸配列ＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号５３）（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｌｏｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１３を参照されたい）を含む。

【0145】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲのＣＴは、特にｍＫａｔｅ２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５又はｍＳｃａｒｌｅｔから選択される、蛍光タンパク質をコードする配列要素を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、蛍光タンパク質は、キメラオプシンＧＰＣＲのＣＴに直接融合されており、これらの実施形態のいくつかの他のものにおいて、蛍光タンパク質は、ＩＲＥＳ又はＴ２Ａ配列を介して連結されている。

【0146】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲ部分は、ＩＬ１をさらに含み、標的ＧＰＣＲのＩＬ１は、上流オプシンのＩＬ１を置き換える。

【0147】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシンのＩＬ３は、標的ＧＰＣＲのＩＬ３によって置き換えられる。いくつかの他の実施形態において、上流オプシンＩＬ３内の可変領域は、標的ＧＰＣＲのＩＬ３によって置き換えられる。これにより、オプシンＩＬ３内の可変領域を置換する位置に標的ＧＰＣＲのＩＬ３全体を含むキメラＩＬ３が得られ、形成される。上流オプシンＩＬ３の可変領域に近位及び遠位に隣接する上流オプシンＩＬ３の部分は、キメラＩＬ３に保持される。

【0148】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、特に標的ＧＰＣＲとしてｍＧｌｕＲ６を用いて、標的ＣＴの近位端は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ若しくはその上流又はパルミトイル化部位に配置される。

【0149】

ｍＧｌｕＲ Ｃ末端及びそれらの結合パートナーとの相互作用は、十分に特徴付けられている（例えば、Ｅｎｚ Ｒ，２０１２を参照されたい）。ｍＧｌｕＲ６では、アミノ酸ＨＰＥがＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフを構成する。

【0150】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、ｍＧｌｕＲ６のＩＬ３は、オプシンＩＬ３の可変領域を部分的に置き換え、それにより、キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６ ＩＬ３を形成する。したがって、これらの実施形態は、キメラＣＴに加えてキメラＩＬ３を含む。

【0151】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、上流オプシン部分は、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループをさらに含み、ただし、オプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラタンパク質において、上流オプシン部分に含まれる天然サイズのＩＬ３と、ｍＧｌｕＲ６部分に含まれる天然サイズのＩＬ２との同時存在は、除外されることを条件とする。

【0152】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態において、上流オプシン部分は、メラノプシンに由来し、且つＮＴ、ＥＬ１～ＥＬ３、ＴＭ１～ＴＭ７、ＩＬ１及び切断型オプシンＣＴを含み、標的ＧＰＣＲ部分は、ｍＧｌｕＲ６又はｈＯＰＮ１ｍｗのいずれかに由来し、且つＩＬ２、ＩＬ３及びＣＴを含む。

【0153】

オプシン－ＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。これらの配列のいくつかは、ゴルジ搬出シグナル及び／又は１Ｄ４タグから選択されるＣ末端付加配列を含む。ゴルジ搬出シグナル及び１Ｄ４タグは、いずれも任意選択による。したがって、ゴルジ搬出シグナル及び／又は１Ｄ４タグを含む上記の配列番号のいずれかによる配列は、任意選択によるＣ末端に付加された配列の一方又は両方が存在しない変異体を含むように定義される。

【0154】

キメラオプシン－ＧＰＣＲタンパク質のいくつかの特に好ましい実施形態は、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

【0155】

オプシン－ＧＰＣＲタンパク質のいくつかの実施形態は、
－ 保存的アミノ酸置換、
－ １～最大３又は最大５、最大８又は最大１５アミノ酸の範囲の欠失、
－ １～最大３又は最大５、最大８又は最大１５アミノ酸の範囲の挿入
から選択される１つ以上の変異を含む、上記の配列番号を有する配列のいずれか１つの変異体であるアミノ酸配列を含み、ここで、キメラオプシン－ＧＰＣＲタンパク質は、標的ＧＰＣＲに特異的なＧアルファタンパク質の光活性化依存性結合を示す。これらの実施形態のいくつかにおいて、標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、光活性化時にキメラオプシンｍＧｌｕＲ６はＧアルファ（ｏ）に結合する。

【0156】

オプシン－ＧＰＣＲタンパク質の実施形態いくつかは、上記の配列番号を有する配列のいずれか１つの変異体であるアミノ酸配列を含み、前記配列は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する。

【0157】

キメラオプシンＧＰＣＲのいくつかの好ましい実施形態において、標的ＧＰＣＲ部分は、ＮＰｘｘｙ及びＮＲ（Ｋ）Ｑ部位間に近位端を有する本質的に完全なＣＴを含むか又はそれからなる。特に好ましい実施形態において、標的ＧＰＣＲ部分は、ｍＧｌｕＲ６又は第２のオプシン（標的オプシン）、特に錐体オプシン又はロドプシンに由来する。

【0158】

これら及び他の好ましい実施形態のいくつかにおいて、上流オプシンＣＴの切断部位は、パルミトイル化部位又は上記で定義されたパルミトイル化部位に対応するアミノ酸位置に配置される。いくつかの好ましい実施形態において、上流オプシンＣＴの切断部位は、パルミトイル化部位の遠位、例えば、パルミトイル化部位の最大５又は最大１０又は最大３３アミノ酸遠位に配置される。

【0159】

キメラオプシンＧＰＣＲのこれら及び他の好ましい実施形態のいくつかにおいて、上流オプシン部分は、ＣＴの切断部位までの上流オプシン全体を含む。

【0160】

これら及び他の好ましい実施形態のいくつかにおいて、特に非ヒト起源の上流オプシンを含む場合、任意選択により、１つ又はいくつか又は全ての細胞外ドメインが、ヒトオプシンの細胞外ドメインと交換される。任意選択により、これらの好ましい実施形態及び他の実施形態のいくつかにおいて、追加的又は代替的に、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループは、標的ＧＰＣＲに由来するＩＬ、特にＩＬ１又はＩＬ３又は上記のＩＬ３の一部と交換される。

【0161】

キメラオプシンＧＰＣＲのこれら及び他の好ましい実施形態のいくつかにおいて、上流オプシンは、メラノプシン、錐体オプシン、特に中波錐体オプシン、ハコクラゲ（ｂｏｘ ｊｅｌｌｙ ｆｉｓｈ）オプシン、又はパラピノプシン、又はハエトリグモ（ｊｕｍｐｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ）ロドプシン（ＪＳＲ１又はｈＪＳＲ（Ｓ１８６Ｆ））を含む群から選択される。

【0162】

上流オプシンとしてメラノプシン及び標的オプシンとしてｍＧｌｕＲ６を含む、これら及び他の好ましい実施形態のいくつかは、略してｍｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６と呼ばれる。ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６と呼ばれる特に好ましいｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６の実施形態において、メラノプシンは、Ｈ８の遠位端のパルミトイル化部位で切断され、ｍＧｌｕＲ６の本質的に完全なＣＴに融合される。ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６キメラのいくつかの最も好ましい実施形態は、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択されるアミノ酸配列又はその変異体を含むか又はそれからなる。

【0163】

上記のように、本発明のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、ＧＰＣＲタンパク質の共通の３Ｄ構造を示す。キメラオプシンＧＰＣＲは、Ｅ（Ｄ）ＲＹモチーフ、ＮＰｘｘＹモチーフ、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフを有するイオンロックなど、全てのＧＰＣＲタンパク質に特徴的な保存されたモチーフをさらに含む。本発明によるキメラＧＰＣＲタンパク質は、上流オプシン部分及び標的ＧＰＣＲ部分を含む。

【0164】

上流オプシン部分は、実施形態において、略してオプシン部分とも呼ばれ、ここで、標的ＧＰＣＲは、非オプシンＧＰＣＲである。上流オプシン部分は、発色団ポケットを含み、Ｏ－ＣＴ近位領域を含み任意選択により遠位伸長を有する切断型オプシンＣＴを含む。

【0165】

このＯ－ＣＴ近位領域は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ及び遠位方向に続くおよそ１０アミノ酸を含み、多くの実施形態において、これはＨ８を形成し、任意選択により、その遠位端に１つ以上のパルミトイル化部位を有する。いくつかの実施形態において、Ｏ－ＣＴ近位領域は、ＮＰｘｘＹ部位までの近位伸長及び／又はＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大およそ４４アミノ酸下流に対応する、パルミトイル化部位の最大およそ３３アミノ酸下流までの遠位伸長を含む。

【0166】

標的ＧＰＣＲ部分は、本質的に、標的ＧＰＣＲのＣＴ全体又は機能的変異体、特にその機能的フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲは、さらなるオプシンである。

【0167】

いくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は２つのヘリックスＨ８を含む。１つは切断型オプシンＣＴにあり、もう１つは標的ＧＰＣＲ ＣＴにある。

【0168】

親上流オプシンのＯ－ＣＴ近位領域は、キメラオプシンＧＰＣＲの上流オプシン部分の構造安定性及び光活性化機能を有利に増強することが見出された。

【0169】

標的ＧＰＣＲ又はその機能的変異体、特に機能的フラグメントは、細胞膜への輸送を含む、正しい細胞内タンパク質輸送を有利に媒介する。さらに、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の細胞膜への正しい輸送は、光活性化への応答及び親オプシンのＧアルファタンパク質から標的ＧＰＣＲのＧアルファタンパク質へのＧタンパク質結合選択性の移行の両方を強化すると考えられている。

【0170】

したがって、Ｏ－ＣＴ近位領域及び標的ＣＴを含むキメラＣＴが驚くべき技術的効果をもたらす。標的ＧＰＣＲのＧアルファタンパク質に結合することにより、キメラオプシンＧＰＣＲの光活性化を治療標的細胞の内因性シグナロソームにカップリングするように、上流オプシンの変換には、それのみで十分である。

【0171】

いくつかの実施形態において、キメラＧＰＣＲタンパク質は、上流オプシン部分及びｍＧｌｕＲ６部分を含む。オプシン部分は、発色団ポケット及びＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ及びＨ８を含む切断型オプシン－ＣＴ並びに任意選択により１つ以上のパルミトイル化部位及び／又は任意選択によりパルミトイル化部位の最大およそ３３アミノ酸下流又はＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大およそ４４アミノ酸下流を含む。ｍＧｌｕＲ６部分は、本質的に、ｍＧｌｕＲ６－ＣＴ全体又は機能的変異体、特にその機能的フラグメントを含む。これらの実施形態によるオプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲタンパク質は、ｍＧｌｕＲ６－ＣＴの上流に切断型オプシン－ＣＴを有するキメラＣＴを有する。いくつかの実施形態において、これは２つのヘリックスＨ８を含む。１つは切断型オプシンＣＴにあり、もう１つは標的ＧＰＣＲ ＣＴにある。

【0172】

キメラＣＴは、例示的なキメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６タンパク質をＯＮ双極細胞のシグナロソームに標的化するのに十分であり、光活性化すると、親メラノプシンの生理学的細胞環境に内因性であるシグナロソームの異なるＧタンパク質の代わりに、Ｇアルファ（ｏ）タンパク質に結合する。

【0173】

オプシンｍＧｌｕＲ６キメラのいくつかの実施形態において、オプシンはメラノプシンである。

【0174】

有利には、切断型メラノプシンＣＴ及び天然の標的ＧＰＣＲ ＣＴを含むキメラＣＴを含むキメラメラノプシンＧＰＣＲの例示的な実施形態は、親メラノプシンよりもはるかに速い光に対する応答を示す。メラノプシンの反応速度が概日リズムの調節におけるその生理学的役割に適応している（このプロセスは、視覚に必要な反応速度よりも光の変化に対する反応速度を遅くする必要がある）ことを考えると、これは確かに望ましいことである。

【0175】

キメラオプシンＧｌｕＲ６タンパク質は、それらの生理学的親オプシンが光活性化を健常な光受容体細胞におけるそのシグナル伝達カスケードにカップリングするため、光活性化をｍＧｌｕＲ６シグナル伝達カスケードに同様の効率でカップリングすることが観察された。

【0176】

したがって、オプシン－ＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲをコードする核酸分子による生理学的に光非感受性のニューロン、特にＯＮ双極細胞の遺伝的変換は、視覚シグナル伝達経路の光受容細胞をバイパスし、ＯＮ双極細胞を、神経網膜を活性化できる「置換光受容体」に変えることにより、変性した光受容体細胞を有する網膜の視力の回復を可能にする。

【0177】

先行技術、例えば上記のキメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質は、以前にこの治療概念を証明した。本発明の特筆すべき驚きは、生理学的オプシンに、特に切断型オプシン－ＣＴ及び標的ＧＰＣＲの本質的に全体のＣＴに埋め込まれた、Ｏ－ＣＴ近位領域を含む遺伝子操作されたキメラＣＴを単に装備することで十分であるということである。さらに、この遺伝子設計は、試験された全てのオプシンＧＰＣＲキメラに適用可能である。

【0178】

対照的に、先行技術は、ＣＴに加えて、細胞内ループ、特にＩＬ３及びＩＬ２がＧタンパク質選択性に特に重要であるか又は必要でさえあるように思われることを教示している（ＷＯ２０１２／１７４６７４，Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ，２０１６；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ，２０１８）。

【0179】

したがって、驚くべきことに、本発明のキメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６タンパク質によるｍＧｌｕＲ６シグナロソームの特異的Ｇアルファ（ｏ）結合は、ｍＧｌｕＲ６の細胞内ループのいずれも完全に存在しない状態で達成される。

【0180】

実際、キメラＣＴのみを含み、ｍＧｌｕＲ６の追加の細胞内ドメインを含まない例示的なキメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲタンパク質は、例えば、光活性化に対する応答の速い動態及び振幅など、又は親標的ＧＰＣＲを含む細胞の生理学的区画に対応する細胞内区画への正しい細胞内輸送などの有利な特性における細胞内ループの追加の置換を含む、先行技術のキメラオプシンＧＰＣＲを模倣するか又はそれを超える。例えば、本発明のキメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲは、従来技術で利用可能なキメラオプトｍＧｌｕＲ６と比較して、ＯＮ双極細胞の樹状突起をより効率的に標的とし、光誘導網膜応答を増強する（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ，２０１５）。

【0181】

本発明によるキメラＣＴ又は標的オプシンＣＴを有するキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の特定の利点は、単一の必須のスプライシング部位のみの選択に基づく最小限のインシリコモデリング及び遺伝子操作を必要とする設計の卓越した単純さである。それにもかかわらず、例えばキメラオプシンｍＧｌｕＲ６又はキメラオプシン５－ヒドロキシトリプタミン受容体７（５－ＨＴ７）など、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の光活性化に対する機能的応答は、強度及び速度が親標的ＧＰＣＲの生理学的応答にさえ対応する。

【0182】

本発明の第１の態様は、親オプシンＣＴ及び親標的ＧＰＣＲ ＣＴに由来するキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含むペプチド、特に上記のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含むペプチドにさらに関する。キメラＣ末端ペプチドは、ＣＴの近位領域（Ｏ－ＣＴ近位領域）を含む上流オプシンの切断型Ｃ末端ドメイン（切断型オプシン－ＣＴ）を含む。特にＯ－ＣＴ近位領域は、ヘリックス８（Ｈ８）及びウシロドプシンのＣ３２２又はＣ３２３にそれぞれ対応するパルミトイル化部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｏ－ＣＴ近位領域は、例えば、オプシンのパルミトイル化部位の下流に例えば最大およそ３３、３４又は３５アミノ酸の遠位伸長を含む。ペプチドは、標的ＧＰＣＲのＣ末端ドメイン（標的ＧＰＣＲ ＣＴ）又はその機能的変異体、特に機能的フラグメントをさらに含む。標的ＧＰＣＲ ＣＴは、切断型オプシンＣＴの下流に位置する。

【0183】

本発明の第２の態様は、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードし、切断型オプシンＣＴ及び標的ＧＰＣＲ ＣＴ又はその機能的変異体を含むキメラＣ末端ペプチドをコードする核酸分子に関する。前記核酸分子は、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸配列を含むか又はそれからなる。

【0184】

キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質及びキメラＣ末端ペプチド及びそれらをコードする核酸配列は、遺伝子スプライシング産物とも呼ばれる遺伝子融合産物であり、親上流オプシンをコードする親遺伝子のフラグメント及び上記の親標的ＧＰＣＲをコードする親遺伝子のフラグメントを含む。

【0185】

本文では、キメラオプシンＧＰＣＲ又はキメラＣ末端ペプチドをコードする核酸配列は、キメラオプシンＧＰＣＲ遺伝子又はキメラオプシンＧＰＣＲ導入遺伝子とも呼ばれる。

【0186】

本文では、導入遺伝子という用語は、生物又は細胞のゲノムに導入された遺伝子又は核酸分子に関する。特に、導入遺伝子という用語は、本発明のキメラオプシンＧＰＲＣ又はキメラＣ末端ペプチドをコードする遺伝子又は核酸分子を指す。

【0187】

本文において、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質及び前記オプシンキメラＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子という用語は、天然にはそれ自体で存在しないタンパク質及び核酸分子を指す。むしろ、それらは、例えば、遺伝子クローニング、遺伝子発現、組換え核酸技術、組換え核酸分子の固相化学合成などの化学合成などの分子技術によって得られる人工分子である。それらは、当技術分野で公知の他の方法でも処理、製造及び操作され得る。分子的、遺伝的及び生化学的方法及び化学的方法に使用される標準的な技術については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ Ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。

【0188】

したがって、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲ又はペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる核酸分子に関する。

【0189】

核酸分子のいくつかの実施形態において、これは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含むアミノ酸配列の群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％，９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％同一である、アミノ酸配列からなるキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸配列を含む。

【0190】

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４から選択されるアミノ酸配列からなるキメラオプシンＧＰＣＲをコードするそのような核酸配列の例には、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３から選択される核酸配列と同一の核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。

【0191】

いくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列と少なくとも７０％同一である、例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％同一である、核酸配列を含むか又はそれからなる。

【0192】

好ましいｍｅｌａ（ｐａｌｍ ｍＧｌｕＲ６キメラオプシンＧＰＣＲをコードする、請求項３８に記載の核酸分子のいくつかの特に好ましい実施形態において、前記核酸分子は、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなる。

【0193】

本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様による核酸分子を標的細胞に送達する医学的使用のためのアデノ随伴ウイルスカプシド（ＡＡＶカプシド）ポリペプチドに関する。したがって、第３の態様は、第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする導入遺伝子を標的細胞に導入するためのＡＡＶカプシドを提供する。第３の態様は、前記医学的使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子にも関する。

【0194】

態様Ａにおいて本明細書に記載される主な発明から独立した第２の発明は、新規ＡＡＶカプシドポリペプチド自体に関し、態様Ｂにおいて、前記新規ＡＡＶカプシドをコードする配列を含む核酸分子に関する。

【0195】

独立した第２の発明の態様Ｃは、導入遺伝子を標的細胞に送達する医学的使用のための、新規ＡＡＶカプシドポリペプチド（及びそれをコードする核酸分子）に関する。独立した第２の発明の態様Ｃは、標的細胞に対する第１の主な発明の第２の態様及び第１の態様それぞれによるキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子を送達する医学的使用のための、新規ＡＡＶカプシドポリペプチド（及びそれをコードする核酸分子）も含む。

【0196】

独立した第２の発明の態様Ｄは、独立した第２の発明の態様Ａによる新規カプシドをコードする態様Ｂによる核酸分子を含む組換えＡＡＶベクターに関する。

【0197】

以下の説明及び特許請求の範囲において、ＡＡＶカプシド又はカプシドという用語は、文脈から異なって明らかでない限り、主な発明による医学的使用のためのカプシド及び独立した第２の発明によるカプシド自体の両方を指す。

【0198】

したがって、本発明の第３の態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド及びＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸分子は、本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする本発明の第２の態様による核酸分子を標的細胞に送達するための医学的治療において使用するために提供される。

【0199】

いくつかの実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）（Ｄａｌｋａｒａ Ｄ ｅｔ ａｌ，２０１３）又はＡＡＶ８（ＢＰ２）（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１４）のカプシドタンパク質又はそれらに由来する変異体である。

【0200】

野生型ＡＡＶでは、ゲノムにはカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードするＣａｐ遺伝子が含まれており、これらは互いに相互作用して、二十面体対称性を有するカプシドと、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を形成する。これは、新しく産生されたＶＰタンパク質を安定化し細胞質から細胞核に輸送するために必要である。３つのＶＰは全て、１つのｍＲＮＡから翻訳され、異なってスプライシングされる。最大の９０ｋＤａ ＶＰ１はスプライシングされていない転写物であり、７２ｋＤａ ＶＰ２は非従来型のＡＣＧ開始コドンから翻訳され、最小の６０ｋＤａ ＶＰ３はＡＵＧコドンから翻訳される。３つのＶＰは全て、重複するＣ末端を有する。

【0201】

本文に関連して、ＡＡＶカプシドのアミノ酸位置への言及は、ＧｅｎＢａｎｋエントリー番号Ｊ０１９０１．１（アデノ随伴ウイルス２、完全ゲノム）でアクセス可能なＡＡＶ２の参照配列によるＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列に関する。

【0202】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ペプチドインサートを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、特にピーク又はとがった突起に挿入される。

【0203】

ペプチドは、ＡＡＶ２カプシドの５８７位に挿入される。とがった突起（ピーク）は、カプシドの最も露出した領域を表している。最も高いピークはアミノ酸位置４５３にあり、ＡＡＶ２カプシドの位置５８７に２番目に高いピークがある。これらのピークは、カプシドのアセンブリを妨げることなくペプチドの挿入を受容し、非許容細胞を標的とする機会を提供する。同様に、突起は、ＡＡＶの宿主相互作用、受容体結合及び免疫原性の重要な部位を表す。

【0204】

野生型カプシドＡＡＶ２配列（配列番号５９）は、太字及び下線でマークされたＮ５８７とＲ５８８との間の上記のペプチドの挿入点と共に以下に示される。

【化1】

【0205】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質であり、アミノ酸５８７及び５８８間のアミノ酸インサートを含み、ここで、ペプチドインサートは、
－ ＳＡＳＥＡＳＴ（配列番号６０）、
－ ＴＰＰＳＩＴＡ（配列番号６１）、
－ ＰＲＴＰＨＴＡ（配列番号６２）、
－ ＮＨＡＰＮＨＣ（配列番号６３）
を含むペプチドの群から選択される。

【0206】

Ｎ５８７とＲ５８８との間のペプチドインサートは、先行技術に記載されている（Ｄａｖｉｄ Ａ．，２０１８；欧州特許出願第１９２０６６０３．３号明細書、未公開）。これらの実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、７つのアミノ酸からなるペプチドインサートを含み、これは略して７量体ペプチドインサートとも呼ばれる。

【0207】

いくつかのさらなる実施形態において、ＡＡＶカプシドポリペプチドは、７～１３量体であるペプチドインサートを含む。特に、これらの実施形態は、上記の７量体ペプチドインサートなどの７量体を含み、０～６アミノ酸の１つ又は２つの隣接リンカーをさらに含み、６は、Ｎ及びＣ末端に付加された隣接アミノ酸の総数の最大数である。

【0208】

いくつかの例示的な実施形態は、リンカー配列を含まないペプチドインサートを含み、他の実施形態は、片側又は両側にリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）若しくはグリシン（Ｇ）又はその混合物を含むアミノ酸の群から選択されるが、これらに限定されない。

【0209】

いくつかの好ましい実施形態において、１つ又は２つの隣接リンカーは、
ｉ．アミノ酸Ｇ及びＡ、又は
ｉｉ．アミノ酸Ａ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｎ、Ｌ及びＲ、特にＡ、Ｌ、Ｎ、Ｒ
から選択されるアミノ酸を含むか又は好ましくはそれからなる。

【0210】

いくつかの好ましい実施形態において、隣接リンカーの一方又は両方は、Ｎ及びＲから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。いくつかの特に好ましい実施形態において、リンカーは、いずれかの側に２つ又は３つのアミノ酸を含む。これら及び他の実施形態のいくつかにおいて、リンカーは、アミノ酸Ａ、Ｌ、Ｎ、Ｒから選択される１つ以上のアミノ酸からなる。例示的な好ましい実施形態において、リンカー及びペプチドインサートは、

【化2】

の配置を有する。

【0211】

いくつかの好ましい実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質又はその突然変異体であり、Ｎ５８７とＲ５８８との間において、
－ ＡＡＡＳＡＳＥＡＳＴＡＡ（配列番号６４）、
－ ＡＡＡＴＰＰＳＩＴＡＡＡ（配列番号６５）、
－ ＡＡＡＰＲＴＰＨＴＡＡＡ（配列番号６６）、
－ ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ（配列番号６７）、
－ ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ（配列番号６８）
から選択されるペプチドインサートを含む。

【0212】

本文では、インサートを含むＡＡＶ２カプシドの実施形態は、野生型ＡＡＶ血清型とそれに続く括弧内の修飾を列挙する省略された命名法でも言及されている。上記のようなペプチドインサートを含む例示的なカプシドのそのような省略された命名法は、例えば、括弧内に記載されたペプチドインサート中の７アミノ酸を含み、任意選択により１つ又は２つの隣接リンカーをさらに含むＡＡＶ２カプシドを指す、ＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）又は例えば列挙された７アミノ酸ＰＲＴＰＨＴＡを有するペプチドインサートを含み、任意選択により１つ又は２つの隣接リンカーを含む、ＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）カプシドである。

【0213】

隣接リンカーを含むペプチドインサートの上記の例示的な実施形態は、ＡＡＶ２カプシドのわずかに伸長された配列に関連して隣接リンカーと共に以下に列挙されている。リンカーの例示的な実施形態には下線が付されている。最初の３つのリンカーはアラニンを含み、－ＡＡＡ－．．．－ＡＡ－の形態であり、最後の２つのリンカーは、アラニンに加えて、代替アミノ酸、すなわちアルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）及びリジン（Ｌ）を含み、以下に示すように、（Ａ）は、

【化3】

の形態である。

【化4】

【0214】

配列番号６７、ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ又は配列番号６８、ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲによるペプチドインサートを含むカプシドは、それ自体新規であり、独立した発明を構成する。したがって、これらの新規カプシドは、本明細書に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする導入遺伝子をパッケージングするためのｒＡＡＶ２ベクターに関連して限定されない。特に、これらの新規カプシドは、本発明の第１及び第２の態様による、キメラオプシンＧＰＣＲ又はそれをコードする核酸分子による医学的使用に限定されない。

【0215】

したがって、独立した発明では、５８７～５９２の位置、好ましくはＡＡＶ血清型２カプシドのＮ５８７～Ｒ５８８の位置又は別の血清型のＡＡＶのそれに相同な位置にペプチドインサートを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドが提供され、ここで、ペプチドインサートは、以下を含む配列の群から選択される。

【化5】

【0216】

いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２カプシドであり、少なくとも１つの突然変異を含み、この少なくとも１つの変異は、以下から選択される：
ａ．アミノ酸位置２５２、２７２、４４４、５００、７００、７０４及び／又は７３０のチロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）；及び／又は
ｂ．アミノ酸位置４９１のスレオニン（Ｔ）からバリン（Ｖ）。

【0217】

新規カプシドの特に好ましい実施形態は、以下に示すように、配列番号７４によるＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲインサートを有するＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列を含む。

【0218】

ＶＰ１とオーバーラップするＶＰ３（灰色の配列）、チロシンからフェニルアラニン（Ｙ－Ｆ）への変異は濃灰色でハイライトされ、下線が付され、アミノ酸番号はＶＰ１配列全体を指す。モチーフが挿入されたＧ４５３の最も高いピークとＮ５８７の２番目に高いピークに下線が付され、白のアンダーレイで示される。インサートは斜体且つ枠付きである。

【化6】

【0219】

第３の態様及び独立した発明は、上記のように、ＡＡＶカプシドをコードする核酸分子にも関する。

【0220】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）、又はＡＡＶ８（ＢＰ２）、又はＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）、又はＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）から選択されるカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる。

【0221】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、
－ ＡＡＡＳＡＳＥＡＳＴＡＡ（配列番号６４）、
－ ＡＡＡＴＰＰＳＩＴＡＡＡ（配列番号６５）、
－ ＡＡＡＰＲＴＰＨＴＡＡＡ（配列番号６６）、
－ ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ（配列番号６７）、
－ ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ（配列番号６８）
から選択される、ＡＡＶ２ゲノムのＮ５８７とＲ５８８との間にペプチドインサートを有するアミノ酸配列を含むカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる、請求項４９に記載の核酸分子。

【0222】

いくつかの実施形態において、核酸分子は、特にキメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかの好ましいものにおいて、導入遺伝子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなる。

【0223】

いくつかの特に好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなるｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む。

【0224】

カプシド及び導入遺伝子をコードする核酸分子のいくつかの実施形態において、導入遺伝子は、細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている。これらの実施形態のいくつかにおいて、細胞特異的プロモーターは、特にＯＮ双極細胞特異的プロモーターであり、より具体的には、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター、配列番号７５による７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター若しくは配列番号７６による４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター又は網膜ＯＮ双極細胞若しくはその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーターを含む群から選択されるプロモーターである。

【0225】

Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６又はＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６という用語は、それぞれパルミトイル化部位で切断された、又はパルミトイル化部位の３３アミノ酸下流で切断された切断型メラノプシンＣＴを含むメラノプシンｍＧｌｕＲ６キメラオプシンＧＰＣＲの好ましい実施形態を指す。

【0226】

したがって、カプシドをコードする核酸分子のいくつかの特に好ましい実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ２（７ｍ８）、又はＡＡＶ８（ＢＰ２）、又はＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）、又はＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）カプシドから選択される。さらに、前記核酸分子は、Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６又はＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６などのキメラオプシンＧＰＣＲの好ましい実施形態をコードする導入遺伝子をさらに含み、さらに導入遺伝子は７７０Ｅｎ－４４５Ｐ（ｈＧＲＭ６ ）プロモーター又は４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターの制御下にある。

【0227】

新規ｒＡＡＶカプシドに関する独立した発明のいくつかの実施形態において、上記のような新規ペプチドインサートを有する新規ｒＡＶＶカプシドを含むベクターが提供される。

【0228】

本発明の第５の態様によるカプシドの実施形態が特定の配列番号による特定の配列を指す場合には常に、上記のような特定の配列の変異体がこれらの実施形態に含まれることが理解される。

【0229】

本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はキメラＣ末端ペプチドをコードする本発明の第２の態様による核酸分子を含むベクターに関する。したがって、第４の態様は、標的細胞への遺伝子導入のための、そして特にその中でキメラオプシンＧＰＣＲを発現させるための、ベクターに関する。換言すれば、本発明の第４の態様によるベクターは、本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＲＣ又はキメラＣ末端ペプチドをコードする導入遺伝子を含む。

【0230】

したがって、本発明の第１及び第２の態様にそれぞれ記載されるように、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸又は核酸分子によってコードされるキメラＣ末端ペプチドを含む、ベクター、特に核酸発現ベクターが提供される。核発現ベクターは、キメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子によってコードされる導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0231】

いくつかの実施形態において、最適化されたコザック配列が導入遺伝子に先行する。コザック配列は、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＡｃｃＡＵＧＧ（配列番号７７）又は（ｇｃｃ）ｇｃｃＧｃｃＡＵＧＧ（配列番号７８）を有し、翻訳の開始を強化する。

【0232】

いくつかの実施形態において、核酸発現ベクターは、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節要素）調節配列（Ｈｕｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０の配列番号２０を参照されたい）も含む。ＷＰＲＥは、転写されると発現を促進する三次構造を作るＤＮＡ配列である。

【0233】

いくつかの実施形態において、核酸発現ベクターは、導入遺伝子の下流に挿入されるポリＡテールも含む。ポリＡテールは、導入遺伝子の翻訳を促進する。

【0234】

いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。前記ベクターは、上記の本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はキメラＣ末端ペプチドをコードする核酸分子を含むため、組換え（ｒＡＡＶ）ベクターである。

【0235】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的ベクター（ｓｃＡＡＶ）のいずれかである。

【0236】

いくつかの実施形態において、ベクターは、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はＡＡＶ１２を含むＡＡＶ血清型の群から選択される組換えＡＡＶベクターである。いくつかの好ましい実施形態において、ベクターは、ｒＡＡＶ２又はｒＡＡＶ８ベクターである。

【0237】

これら及び他の実施形態のいくつかにおいて、ベクターは、以下を含む配列の群から選択される核酸配列をさらに含む。
－ ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列、及び／又は
－ プロモーター、特に細胞特異的プロモーター、より具体的には双極細胞特異的プロモーター。

【0238】

プロモーター、特に細胞特異的プロモーターを含むいくつかの実施形態において、ベクターは、エンハンサー配列及び任意選択によりスペーサーをさらに含む。５’末端から３’末端まで、ベクターは、最初にエンハンサー、次に任意選択によるスペーサー、次にプロモーターを含む。導入遺伝子は、プロモーターによって駆動される導入遺伝子の発現のためにプロモーターの３’方向に位置しており、すなわち、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0239】

いくつかの実施形態において、特に、ｍＧｌｕＲ６標的ＧＰＣＲ ＣＴを含むキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子を発現するベクターのうち、ベクターは、ＯＮ双極細胞特異的プロモーターを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＯＮ双極細胞特異的プロモーターは、ＧＲＭ６－ｓｖ４０プロモーター（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２００８）又は４ｘＧＲＭ６－ｓｖ４０プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）又は２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）又は７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）又は４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター（Ｈｕｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０及びＥＰ１９２０００８２．６（未発表）を参照されたい）を含む群から選択される。

【0240】

７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターは、配列番号７５を含むか又はそれからなる。７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターは、マウスとヒトのゲノム間の３００ｂｐの保存配列（－１３８７３～－１３４６７ ｒｅｌ．ＴＬＳＳ ＧＲＭ６）を含み、さらに、３’ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークとＤｎａｓｅ過敏性クラスター（－１３９９０～－１３８１６ ｒｅｌ．ＴＬＳＳＧＲＭ６）を含む、エンハンサー７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）（－１４２３６～－１３４６７ ｒｅｌ．ＴＬＳＳＧＲＭ６）を含む。

【0241】

４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターは、配列番号７６を含むか又はそれからなる。４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターは、エンハンサー４４４Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）（－１４０３３～－１３５９０ ｒｅｌ．ＴＬＳＳＧＲＭ６）を含み、ＣｈｉＰ－ｓｅｑピークの３’及び５’のみを含む７７０Ｅｎ（ｈＧＲＭ６）の３’及び５’切断型バージョンである。

【0242】

細胞特異的プロモーターを含むベクターのいくつかの実施形態において、細胞特異的プロモーターは、網膜ＯＮ双極細胞又はその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーターである。

【0243】

上記のようなＯＮ双極細胞特異的プロモーターを含むベクターのいくつかの好ましい実施形態は、キメラメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６をコードする核酸分子を発現する。これらの実施形態のいくつかにおいて、キメラメラノプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質は、略してＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６とも呼ばれるパルミトイル化部位に切断されたオプシンＣＴを含むか、又は略してＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６とも呼ばれるパルミトイル化部位の下流に切断型３３アミノ酸を含む。さらに好ましい実施形態において、ベクターは、キメラＯＰＮ１ｍｗ－ｍＧｌｕＲ６又は２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲを含む。

【0244】

ベクターのいくつかの特に好ましい実施形態は、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７の１つ又はＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６による、特に配列番号１５又は細胞内ループを追加で含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６による、特にＯＮ双極細胞特異的プロモーター（特に、２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐ、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）又は４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター又は網膜ＯＮ双極細胞又はその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーターから選択される）の制御下にある配列番号２９又は配列番号３１から選択される配列によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６を発現する。

【0245】

ベクターのいくつかの実施形態は、本発明の第３の態様による、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ベクターは、上記のように、Ｎ５８７とＲ５８８との間にペプチドインサートを有するＡＡＶカプシドをコードする。

【0246】

いくつかの好ましい実施形態において、ベクターは、キメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された７７０Ｅｎ－４４５Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターを含み、ＡＡＶ２（７ｍ８）、又はＡＡＶ８（ＢＰ２）、又はＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）、又はＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）を発現する核酸分子をさらに含む。これら及び他の実施形態のいくつかにおいて、キメラオプシンＧＰＣＲは、好ましくは、以下から選択される。
－ 上流オプシンとしてメラノプシン若しくはｈＯＰＮ１ｍｗを含み、且つ標的オプシンとしてｍＧｌｕＲ６を含むキメラオプシンＧＰＣＲ又は２つのオプシンを含む、キメラオプシンＧＰＣＲ、
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６又はＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６から選択されるキメラオプシンＧＰＣＲ、
－ 配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７、配列番号２９又は配列番号３１を含む群から選択される核酸配列によるキメラオプシンＧＰＣＲ。

【0247】

ベクターの特に好ましい実施形態は、配列番号７９による配列を含むか又はそれからなる。ベクターのこの実施形態において、それは、７７０Ｅｎ－４４５Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターの制御下にある配列番号１９による例示的なｈｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６導入遺伝子を含み、さらに、ＡＡＶ８（ＢＰ２）カプシドをコードする核酸配列を含む。

【0248】

本発明の第４の態様によるベクターの実施形態が特定の配列番号による特定の配列を指す場合には常に、上記のような特定の配列の変異体がこれらの実施形態に含まれることが理解される。

【0249】

第５の態様は、第２の態様による核酸分子を含むか又はそれを発現する粒子、特にナノ粒子、小胞、特に生殖細胞株を除く細胞株及び動物、又は第３の態様によるベクター、又は第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲを含むベクターなどに関する。

【0250】

本発明の第５の態様のいくつかの実施形態において、トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウス又はトランスジェニック細胞株が提供される。遺伝子改変動物又はトランスジェニック細胞株は、本発明の第２の態様の核酸分子又は第４の態様のベクターを含み、且つ／又は本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を発現する。

【0251】

トランスジェニック細胞のいくつかの実施形態は、トランスジェニック生殖細胞株又は器官型細胞株を任意選択により除外する幹細胞株などのキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を発現するための適切な細胞株に由来する。特に、適切な細胞株は、以下を含む細胞株の群から選択される。
－ＨＥＫ２９３－ＧＩＲＫ細胞、
－網膜内層ニューロン、特にＯＮ双極細胞、
－腎臓細胞、及び
－Ｇｓ、Ｇｑ又はＧ_{１２／１３}から選択されるＧタンパク質を発現する細胞。

【0252】

トランスジェニック動物又はトランスジェニック細胞のいくつかの実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ修飾ゲノムを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集は、当業者に公知である（例えばＶａｎｄｅｍｏｏｒｔｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）、例えばＬｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）、例えばＨｓｕ ｅｔ ａｌ（２０１４），Ｃｅｌｌ １５７（６）：１２６２－１２７８及びそれらの参考文献を参照されたい）。

【0253】

第５の態様のいくつかの実施形態において、本発明は、本発明の先の態様の１つによるキメラオプシンＧＰＣＲ又はそれをコードする核酸分子又はベクターの標的細胞への導入のための担体、特に粒子又はナノ粒子又は小胞を提供する。

【0254】

いくつかの実施形態において、担体は、本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む、第２の態様による核酸分子又は第４の態様によるベクターを含むか、又は本発明の第１の態様によるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、担体は、ナノ粒子又はマイクロ粒子であり、これは、遺伝子銃での使用に特に適している。これら及び他の実施形態のいくつかにおいて、担体は金粒子である。

【0255】

本文では、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又は核酸分子又はベクターの導入のための担体は、略して「導入用担体」とも呼ばれる。導入のための担体は、ヒト又は非ヒト動物の標的細胞又は標的生物のレシピエントゲノムへのその導入に適したキメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む、キメラオプシン－ＧＰＣＲタンパク質又は核酸分子又はベクターを付着又はパッケージングすることができる任意の適切な化学的又は物理的構造を指す。

【0256】

導入のための担体の例示的な実施形態は、小胞及び粒子、特にマイクロ粒子又はナノ粒子である。例示的な小胞には、例えば、生物起源又は合成起源の膜小胞が含まれる。例示的な粒子は、特に、遺伝子銃での使用に適したマイクロ粒子及びナノ粒子であり、例えば、特に吸着又は共有結合したリガンドとして、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はそれをコードするキメラ核酸でコーティングされた金粒子を含む（Ｏ’Ｂｒｉａｎ ａｎｄ Ｌｕｍｍｉｓ，２０１１）。担体のいくつかの実施形態において、それは、１つ以上のｇＲＮＡ、特にｓｇＲＮＡの個別のトランスフェクションと組み合わせるために、導入遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓカセット、すなわちＣａｓ酵素をコードするプラスミド、例えばＣａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）など、特に単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）又はＣａｓ酵素、特にＣａｓ９をコードするプラスミドを含む。

【0257】

本発明のこれら及び他の実施形態のいくつかにおいて、担体は、本発明の第２の態様による核酸配列又は導入遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓカセットを含む本発明の第４の態様によるベクターを含む。

【0258】

いくつかの好ましい実施形態において、トランスジェニック動物又はトランスジェニック細胞又は上記の導入のための担体は、キメラメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６（Ｍｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６）、特にＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６若しくはＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６又はキメラＯＰＮ１ｍｗ－ｍＧｌｕＲ６或いは２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む。

【0259】

いくつかのさらに好ましい実施形態において、トランスジェニック動物又はトランスジェニック細胞又は上記の導入のための担体において、導入遺伝子は、以下を含む群から選択されるキメラＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６をコードする。
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、特に配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される配列の１つによるもの、又は
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、特に配列番号１５、又は
－ 細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６、特に配列番号２９又は配列番号３１から選択される配列によるもの。

【0260】

本発明の第５の態様による担体、細胞又は動物の実施形態が特定の配列番号による特定の配列を指す場合には常に、上記のような特定の配列の変異体がこれらの実施形態に含まれることが理解される。

【0261】

本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする第２の態様の核酸分子を遺伝子操作する方法に関する。

【0262】

さらに、本発明の第６の態様は、特に本発明の第１の態様及び標的ＧＰＣＲ ＣＴによる、上流オプシンＣＴの近位領域を含むキメラＣ末端ペプチドをコードする核酸分子を操作する方法に関する。

【0263】

全てのＧＰＣＲタンパク質に共通の保存された３Ｄ構造、特にまた、接合部ＴＭ３／ＩＬ２周辺のＥ（Ｄ）ＲＹ、ＩＬ３とＴＭ６の接合部周辺のＥ、ＴＭ７の遠位端周辺のＮＰｘｘＹ及びヘリックス８の近位端周辺のＮＲ（Ｋ）Ｑ又はＨ８の遠位端のパルミトイル化部位などの部分的に保存された要素及びＧＰＣＲ間でさらに保存された要素などのＧＰＣＲの遍在的に保存されたモチーフは、プロトタイプＧＰＣＲウシロドプシンとの配列アライメントによって簡単に同定される。

【0264】

例示的な適切なスプライシング部位は、膜貫通ドメイン／細胞内ドメイン接合部ＧＰＣＲの任意の構造アライメント及び保存された配列モチーフについて特に膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の接合部の周辺の配列をスキャンすることによっても容易に同定される。

【0265】

それらの間のキメラ接合部での１つ以上の選択された親ＧＰＣＲ（親オプシン／親標的ＧＰＣＲ）の保存されたモチーフ又はその機能的変異体の保存又は再構成は、機能的に活性なキメラＧＰＣＲにおいて高い確率で生じる。

【0266】

したがって、本発明の第６の態様では、オプシンの光感受性、正しい細胞内輸送、効率的なＧタンパク質結合及び標的ＧＰＣＲのＧタンパク質特異性などの所望の機能を有するキメラＧＰＣＲを遺伝子操作及び設計する効率的且つ単純な方法が提供される。この方法では、上流オプシンと標的ＣＴとの間に必須の融合部位が１つのみ必要である。上流オプシンの所望の切断部位は、ａ）上記のウシロドプシンのパルミトイル化部位の１つに対応する、ＮＲ（Ｋ）Ｑ部位の７～１３、特に８～１２、より具体的には９～１１若しくはおよそ１０アミノ酸下流を数えることによる、Ｈ８又は１つ以上のパルミトイル化部位の位置若しくは「推定」パルミトイル化部位の知識、又はｂ）標的ＧＰＣＲのＣ末端の位置に関する知識に基づいて容易に同定される。

【0267】

異なるクラスのＧＰＣＲ間の配列相同性が最小限であるにもかかわらず、保存された３Ｄ構造は、ＧＰＣＲタンパク質の機能ドメインにおけるアミノ酸配列の変異の大きい耐性を示す。さらに、機能的キメラオプシンＧＰＣＲの操作は、例えば、保存的アミノ酸置換により得られた、保存された配列又はその機能的類似体を保存しながら、保存された構造要素若しくはモチーフ又はその周辺でスプライシングすることによって単純化される。いくつかの実施形態において、スプライシング部位は、親ＧＰＣＲの保存されたモチーフ内の対応する位置に意図的に配置され、同じ又は機能的に同等のバージョンで再構成される。この理論的根拠は、特にＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ又はＯ－ＣＴ近位領域の近位端と遠位端の周りにそれぞれ配置されたパルミトイル化部位でのスプライシングに適用される。

【0268】

上流オプシンＣＴにおける切断部位及び／又は標的ＧＰＣＲ ＣＴにおける切断部位の選択の前に、本発明の第２の態様による核酸分子を操作する方法のいくつかの実施形態は、親ＧＰＣＲの一方又は両方の保存されたモチーフ及びそれらをコードする遺伝子は、以下のステップを含むことによって同定される。
－ 配列アライメントツールを使用して、上流オプシン（又はそのフラグメント）のアミノ酸配列を、標的ＧＰＣＲ（又はそのフラグメント）のアミノ酸配列とアライメントするステップ、
－ 特に、Ｅ（Ｄ）ＲＹ、ＩＬ３のＴＭ６との接合部周辺のＥ（Ｄ）ＲＹ，ＥＴＭ７／ＣＴ接合部周辺のＮＰｘｘＹ、ＣＴのＮＲ（Ｋ）Ｑ及びパルミトイル化されたＣ及び（標的ＧＰＣＲがオプシンである場合）ＴＭ７での発色団の結合のためのＫを含む保存されたモチーフの群から選択される保存されたモチーフを構成するアミノ酸位置を決定するステップ。

【0269】

これらの実施形態のいくつかにおいて、オプシンのアミノ酸配列は、任意選択により、保存されたモチーフを構成するアミノ酸位置の同定のために、ウシロドプシンのアミノ酸配列とアラインされる。適切なアライメントツールには、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ）及び上記の他のアライメントツールが含まれる。

【0270】

これら及び他の上流オプシンＣＴにおける切断部位及び／又は標的ＧＰＣＲ ＣＴにおける切断部位の選択の前に、キメラオプシンＧＰＣＲ又はそれを含むペプチドをコードする核酸分子を操作する方法の実施形態のいくつかにおいて、親オプシンと親標的ＧＰＣＲの一方又は両方における保存された３Ｄ ＧＰＣＲドメイン又はサブドメイン、特にサブドメインヘリックス８の同定は、二次／三次タンパク質構造を予測するためのプログラムに一次アミノ酸配列を入力するステップを含む。例えば、ＹＡＳＰＩＮ（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）などの適切なプログラム又は例えば以下のリストｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｌｂｉｏｌ－ｔｏｏｌｓ．ｃａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｔｅｒｔｉａｒｙ＿ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｈｔｍ若しくはＫｕｈｌｍａｎｎｅｔａｌ．，２０１９）若しくはＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅ）から選択される別のプログラムが当技術分野で利用可能である。特に組換え核酸技術、シリカにおける組換えクローニング設計及び化学的核酸合成を含む、上記のように当技術分野で利用可能な方法は、当業者に公知である。

【0271】

したがって、本発明の第６の態様では、特に上記のように、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はペプチドをコードし、Ｏ－ＣＴ近位領域を含む切断型オプシンＣＴを含むキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含み、本質的に完全な標的ＧＰＣＲ ＣＴ又はその機能的誘導体をさらに含む、核酸分子を遺伝子操作する方法が提供される。キメラＣＴは、親上流オプシンＣＴ及び親標的ＧＰＣＲ ＣＴに由来する。遺伝子操作の方法は、以下のステップを含む。
Ａ－１ Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端のアミノ酸位置又はＯ－ＣＴ近位領域への遠位伸長内において、親上流オプシンのＣＴの切断部位（ｘ）を選択するステップ、
Ａ－２ 選択された切断部位で切断される切断型ＣＴを有する上流オプシン部分又はペプチドをコードする核酸分子を取得するステップ；
Ｂ－１ 標的ＧＰＣＲ ＣＴの近位領域内、特にＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ若しくは上流又はＮＰｘｘＹとＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフとの間において、切断部位（ｙ）を選択するステップ、
Ｂ－２ 標的ＧＰＣＲ ＣＴ又は機能的変異体、特にその機能的フラグメントをコードする核酸分子を取得するステップ；及び
Ｃ－１ ステップＡ－２で取得された、切断型オプシン－ＣＴをコードする核酸分子を、ステップＢ－２で取得された、標的ＣＴ又はその機能的変異体をコードする核酸分子と融合させるステップ。

【0272】

ステップＡ－１のキメラオプシンＧＰＣＲ又はペプチドをコードする核酸分子を遺伝子操作する方法のいくつかの実施形態において、切断部位（ｘ）は、以下の基準の１つを満たす。
－ 切断部位（ｘ）は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ又はその少なくとも７、若しくは８、若しくは９、若しくは１０、若しくは１１、若しくは１２、若しくは１３アミノ酸下流に位置するヌクレオチドに位置すること、
－ 切断部位（ｘ）は、パルミトイル化部位又はパルミトイル化部位に対応するアミノ酸の下流、特に遠位に隣接して位置すること、
－ 切断部位は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４５、又は４７、又は４９ヌクレオチド下流に位置すること。

【0273】

キメラオプシンＧＰＣＲのいくつかの実施形態において、特にメラノプシンなどの異常に多数のアミノ酸を有する広範なＣ末端を含む上流オプシンを有する実施形態において、切断部位（ｘ）は、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端の下流、特に上記説明によるＯ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端のアミノ酸位置に配置される。Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端は、特に、それぞれＯ－ＣＴ近位領域の遠位端の最大３０、若しくは３１、若しくは３２、若しくは３３、若しくは３４、若しくは３５アミノ酸下流又はＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４５、若しくは４７、若しくは４９ヌクレオチド下流に位置する。

【0274】

メランドプシンなどの広範なＣＴを有する上流オプシンを含むいくつかの実施形態において、切断部位（ｘ）は、光活性化の応答終結に寄与する保存されたリン酸化部位のクラスターの下流に位置する。そのような保存されたリン酸化部位は、特に、Ｍｕｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１６に記載されるように、マウスメラノプシンの位置３８１及び３９７に対応するアミノ酸位置間に位置する。換言すれば、これらの実施形態において、Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端は、好ましくは、保存されたリン酸化部位の前記クラスターの遠位端の下流に又は特に遠位に隣接して選択される。

【0275】

キメラオプシンＧＰＣＲ又はペプチドをコードする核酸分子を遺伝子操作する方法のいくつかの実施形態において、ステップＡ－１で選択される、上流オプシンにおける切断部位ｘ及びステップＢ－１で選択される、標的ＧＰＣＲの切断部位ｙは、両方ともそのそれぞれのパルミトイル化部位若しくはパルミトイル化部位に対応するアミノ酸位置に位置するか、又は両方ともＮＲ（Ｋ）Ｑ部位の７～１３、特に８～１２、より具体的には９～１１又は１０アミノ酸下流に位置する。

【0276】

キメラオプシンＧＰＣＲ又はペプチドをコードする核酸分子を遺伝子操作する方法のいくつかの実施形態は、１つ以上の細胞内ループを交換又は部分的に交換する、例えば対応する位置において、上流オプシンの１つ以上の細胞内ループ又は部分的細胞内ループを、標的ＧＰＣＲの細胞内ループ又は部分的細胞内ループによって置き換えるための１つ以上の追加的なステップを含む。

【0277】

ここで、特に、１つ以上のスプライシング部位は、以下に位置するスプライシング部位の群から選択される。
－ ＩＬ１の交換のための接合部ａ及び接合部ｂ、
－ ＩＬ２の交換のための接合部ｃ及び接合部ｄ、
－ ＩＬ３の交換のための接合部ｅ及び接合部ｆ、
－ 標的ＧＰＣＲのＩＬ３との交換で上流オプシンＩＬ３の高度可変領域を除去する、ＩＬ３内の２つのスプライシング部位。

【0278】

本発明の第７の態様は、キメラオプシンＧＰＣＲに関連する上記産物を使用する医療用途に関する。医療用途には、特に、処置を必要とするヒト又は非ヒト個体を処置するための薬剤及び方法が含まれる。本発明の先に記載された全ての態様及び実施形態による産物は、第７の態様、すなわち医療用途に適用可能である。

【0279】

医学的使用、特に遺伝子治療における使用に適用可能な本発明の上記の態様による産物は、以下を含む産物の群から選択される。
－ 本発明の第１の態様によるキメラオプシン－ＧＰＣＲタンパク質、
－ 本発明の第２の態様による前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、
－ 本発明の第３の態様によるカプシド又は前記カプシドをコードする核酸分子、
－ 本発明の第４の態様によるベクター、
－ 本発明の第６の態様による担体又は細胞。

【0280】

いくつかの実施形態において、本発明の第７の態様は、部分的又は完全な視力喪失を患っている患者の、特に遺伝子治療の形態での医学的処置に関する。これらの実施形態のいくつかにおいて、産物は、オプシン及びｍＧｌｕＲ６を含むか又は２つのオプシンを含む、キメラオプシンＧＰＣＲを含むか又はそれをコードする。

【0281】

本文では、２つのオプシンを含む、すなわち上流オプシン及び標的オプシンを含む実施形態は、略してキメラオプシン－オプシン（ＧＰＣＲ）とも呼ばれる。上流オプシン及びｍＧｌｕＲ６を含む実施形態は、略してオプシン－ｍＧｌｕＲ６とも呼ばれる。

【0282】

医学的処置のためのキメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６のいくつかの好ましい実施形態は、標的ＧＰＣＲとしてｍＧｌｕＲ６に上流で融合するメラノプシン又はその他のオプシン、例えば、ハコクラゲ（ｂｏｘ ｊｅｌｌｙ ｆｉｓｈ）オプシン、パラピノプシン若しくはハエトリグモ（ｊｕｍｐｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ）ロドプシン又はそれらのヒト化変異体又は錐体オプシンなどを含む。医学的処置のためのキメラオプシンＧＰＣＲの他のいくつかの好ましい実施形態は、２つのオプシンを含み、特に錐体オプシン又はロドプシンに由来する標的ＧＰＣＲに融合された任意のオプシンを含む。

【0283】

これらの好ましいいくつかの及び医学的処置のためのキメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６のさらなる実施形態において、上流オプシンは、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端、特に本明細書に記載の例示的なＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６におけるものなど、上記のようなパルミトイル化部位で切断される。これらの好ましいさらなる実施形態の他のものにおいて、上流オプシンは、Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位伸長の遠位端、特に本明細書に記載の例示的なＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３Ａ）－ｍＧｌｕＲ６におけるものなど、上記のようなパルミトイル化部位のおよそ３３アミノ酸下流で切断される。

【0284】

本発明の第７の態様による医学的使用のいくつかの好ましい実施形態、特に遺伝子治療において、視力を改善し、本発明の第７の態様による視力の部分的又は完全な喪失を処置するために、導入遺伝子はＯＮ双極細胞特異的プロモーター、特に７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）又は４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターに作動可能に連結される。

【0285】

視力の部分的又は完全な喪失を処置するための本発明の第７の態様による医学的使用のいくつかの好ましい実施形態において、遺伝子治療用のベクター、特にｒＡＡＶベクターが適用される。これら及び他の実施形態のいくつかにおいて、ＡＡＶカプシド、特にＡＡＶ２（７ｍ８）、ＡＡＶ２（ＢＰ２）又は上記のようなペプチドインサートを有するＡＡＶ２が適用される。

【0286】

本発明の第７の態様のいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲは、部分的又は完全な視力喪失を患っている患者の処置における使用のためのものであり、処置の臨床適応症は、特に網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢に伴う黄斑変性症及びその他の任意の形態の光受容体変性症を含む群から選択される。

【0287】

本発明の第７の態様は、本発明による産物を含む医薬組成物にさらに関する。特に、医薬組成物は、眼への投与に適した医薬製剤で提供される。

【0288】

例示的な実施形態において、上記のＡＡＶベクターは、眼への網膜下又は硝子体内注射のいずれかのために、緩衝生理食塩水に溶解される。いくつかの例示的な実施形態において、ＡＡＶは、遺伝子治療製剤として０．０４％のＴｗｅｅｎ－２０を含む緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解される。

【0289】

さらに、本発明の第７の態様は、本発明による産物の群から選択される産物の投与を含む、処置を必要とするヒト個体又は非ヒト個体、特に動物を処置する方法に関する。この方法のいくつかの実施形態において、キメラオプシンＧＰＣＲは、硝子体内投与、特に硝子体内注射又は網膜下投与によって投与される。

【0290】

本文では、硝子体内投与という用語は、例えば、核酸分子、ベクター又は導入用の担体などの薬剤の投与経路に関連し、薬剤は、眼の硝子体に送達される。硝子体内投与は、硝子体液ゲルと呼ばれるゼリー状の流体で満たされた硝子体腔と呼ばれる目の後ろの空間に薬剤を直接入れる手順である。

【0291】

本文では、網膜下投与という用語は、網膜色素上皮細胞と光受容体との間の空間への薬剤、特に本明細書に関連するウイルスの投与経路に関する。

【0292】

本発明の第７の態様は、視力を改善するための医学的治療、又は部分的若しくは完全な失明の処置、又は網膜色素変性症（ＲＰ）の処置、又は黄斑変性症の処置若しくは他の形態の光受容体変性症の処置のための薬剤の製造における本発明による製品の使用に関する。

【0293】

本発明の第７の態様は、
－ 本発明の第１の態様によるキメラオプシン－ＧＰＣＲタンパク質、
－ 本発明の第２の態様による前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、
－ 本発明の第３の態様によるカプシド又は前記カプシドをコードする核酸分子、
－ 本発明の第４の態様によるベクター、
－ 本発明の第６の態様による担体又は細胞
を含む産物の群から選択される産物を含む、上記のような医療用途にも関し、ここで、産物は、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を含むか、又は前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み、ここで、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、以下を含む群から選択される。
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、特に配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択される配列によるもの、又は
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、特に配列番号１６、又は
－ 細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６、特に配列番号３０又は配列番号３２から選択される配列によるもの

【0294】

本発明の第７の態様による医療用途の実施形態が特定の配列番号による特定の配列を指す場合には常に、上記のような特定の配列の変異体がこれらの実施形態に含まれることが理解される。

【0295】

以下に、本発明のいくつかの実施形態に関連する非限定的なさらなる例示的詳細が、例えば、表、配列リスト、従属請求項、図面の説明及び図面で提示される。これらの例示的な実施形態は理解を助けるものであり、本発明の範囲を限定することを意味するものではない。

【0296】

単一の分離可能な特徴の代替物が「実施形態」として記載されている場合には常に、そのような代替物は自由に組み合わせることができ、依然として本明細書に記載の本発明の範囲内にとどまることを理解されたい。

【0297】

切断型ＣＴを有する上流オプシンとしてメラノプシンを有するキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質のいくつかの例示的な実施形態に関して、例示的なトランケーション部位は、以下に示されるヒト及びマウスのメラノプシンアミノ酸配列において同定される。この切断部位は、パルミトイル化部位（パルミトイル化システイン）の３３アミノ酸下流に位置している。この例示的な切断部位は「ｐａｌｍ＋３３ＡＡ」部位と呼ばれ、Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端を形成する。

【0298】

以下に示すヒト及びマウスのメラノプシン遺伝子（ＯＰＮ４）の配列セクションでは、Ｃ末端メラノプシンフラグメントのアミノ酸配列は、Ｏ－ＣＴ近位領域の近位端、すなわちＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ（ｈＯＰＮ４とｍＯＰＮ４ではＨＰＫである）から始まる。ｐａｌｍ＋３３ＡＡの切断部位は、アミノ酸位置３９７に下向きの矢印で示されている。以下のアミノ酸残基は、枠で囲まれている。
－ 保存されたＨＰＫ、すなわちＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ、
－ パルミトイル化システイン、
－ 切断部位の上流の保存されたリン酸化セリン及びスレオニン残基。
ｈＯＰＮ４－配列番号５７

【化7】

ｍＯＰＮ４－配列番号５８

【化8】

【0299】

キメラオプシンＧＰＣＲ、特にキメラメラノプシンＧＰＣＲの他の例示的な実施形態において、切断型ＣＴの切断部位は、「ｐａｌｍ＋３３ＡＡ」部位の上流の任意のアミノ酸位置又はさらに下流、例えばパルミトイル化部位の３４又は３５アミノ酸下流までに位置し得る。

【0300】

キメラオプシン－ＧＰＣＲにおいて機能的誘導体として有利に保存又は再構成される親オプシン及び親標的ＧＰＣＲの例示的な関連する保存部位を以下の表Ｉに提供する。

【0301】

機能的なキメラオプシンＧＰＲＣタンパク質を産生する例示的な試験されたスプライシング部位を以下の表ＩＩに示す。

【0302】

いくつかの実施形態において、スプライシング部位は、両方の親ＧＰＣＲの保存されたモチーフ又は部位に配置される。

【0303】

いくつかの実施形態において、保存されたモチーフ又は部位は、適切なスプライシング部位を同定するための参照点として機能する。そのようなスプライシング部位は、特定の保存されたモチーフ又は上記の例示的なｐａｌｍ＋３３部位などの両方の親ＧＰＣＲの部位と同等の距離に位置するであろう。

【0304】

一般に、親オプシンの配列は、２つの親ＧＰＣＲのドメイン又はサブドメインを結合するための適切なスプライシング部位の同定のために保存された部位に基づいて整列される（例えば、切断及びその後のライゲーション又はインシリコで設計されたキメラオプシンＧＰＣＲの核酸合成により）。

【0305】

親オプシンが既知のパルミトイル化部位を欠くいくつかの実施形態において、パルミトイル化可能部位又はウシロドプシンのパルミトイル化部位に対応する部位の両方をアラインして、スプライシングに適した部位又は参照点として部位を特定した。

【0306】

【表1】

【0307】

【表2】

【0308】

【表3】

【0309】

【表4】

【実施例】

【0310】

図５～１２は、顕微鏡による可視化に加え、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の機能を証明するために適用された３つの異なる実験的アプローチの結果を示す。

【0311】

インビトロ：
１．ＨＥＫ－ＧＩＲＫパッチクランプＧβγ活性アッセイ：機能性オプシンは、ＧＩＲＫ（Ｋｉｒ３．１／３．２）カリウムチャネルを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞株で発現した。光刺激はオプシンを活性化し、オプシンは内因性細胞内Ｇｉ／ｏタンパク質を活性化する。活性化されたＧβγタンパク質は次にＧＩＲＫイオンチャネルを開き、その結果、光刺激にタイムロックされ記録できる電気的応答をもたらす。方法の詳細については、（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２０１５）を参照されたい。

【0312】

２．Ｇα特異性生物発光プレートリーダーアッセイ：各オプシンは、ＨＥＫ２９３細胞株でレポーター発現プラスミドと共発現した。ＧＩＲＫアッセイと同様に、活性化されたオプシンはＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質はｃＡＭＰ（Ｇｓ及びＧｉ）又はＣａ２＋（Ｇｑ）を生成する酵素を阻害又は活性化する。これらの産物（ｃＡＭＰ及びＣａ２＋）の蓄積は、それぞれｃＡＭＰ又はＣａ２＋によって活性化される生物発光タンパク質の光放出によって測定できる。Ｇｓ及びＧｉ活性の変化を視覚化するために、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ Ｇｌｏ２２Ｆをレポータープラスミドとして使用し、Ｇｑシグナル伝達の変化については、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ ｍｔＡｅｑをレポータープラスミドとして使用した。ルシフェラーゼ又はセレンテラジンをそれぞれ基質として添加し、ｃＡＭＰ（Ｇｓ及びＧｉ）又はＣａ２＋（Ｇｑ）レベルの変化を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００Ｐｒｏ Ｔｅｃａｎプレートリーダー（スイス、メンネドルフ）で測定した発光の変化によって示した。光誘起蛍光変化をオプシントランスフェクションレベルに正規化するために、蛍光の絶対変化を、測定プレートのそれぞれのウェルの全体的なｍＣｉｔｒｉｎｅレポーター蛍光で除した。

【0313】

エクスビボ：
本発明者らは、これらのオプシンタンパク質がＡＡＶ遺伝子治療による残存網膜に導入された、光受容体細胞のない網膜のマウス網膜ニューロン（ｒｄ１網膜色素変性症マウス、Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウス系統）からの光応答を記録した（ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）及び以下の図１１の説明を参照されたい）。

【0314】

インビボ：
本発明者らは、これらのオプシンタンパク質がＡＡＶ遺伝子治療による残存網膜に導入された光受容体変性を有するマウスモデルからの行動性視線運動反射を記録した（以下の図１０の説明を参照されたい）。

【0315】

図の詳細な説明
以下の詳細な説明を考慮すると、本発明は、よりよく理解され、上記以外の目的が明らかになるであろう。そのような説明は、添付の図面を参照する。

【0316】

図１：オプシンの一般的な構造。

【0317】

図１は、７つの膜貫通ドメインＴＭ１～ＴＭ７、細胞外ドメイン、Ｎ末端ＮＴ及び細胞外ループＥＬ１、ＥＬ２及びＥＬ３並びに細胞内ドメインＣ末端ＣＴ及び細胞内ループＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３を有する親オプシンの一般構造の概略図を示す。膜と細胞質の境界でのＴＭドメインと細胞内ドメイン間の接合部は、接合部（ａ）～（ｇ）として示されている。任意選択によるオプシン－ＧＣＰＲキメラタンパク質のスプライシング部位は、例えば、細胞内ループの交換のためにこれらの接合部に位置し得る。さらに、ＣＴの保存されたサブドメイン、ＣＴの近位領域にあるヘリックス８（Ｈ８）及びオプシンに存在するいくつかの保存された配列モチーフ、特に以下が示される。
－ ＩＬ３とＴＭ６との間の接合部（ｆ）のグルタミン酸残基（Ｅ）に連結したＴＭ３の細胞質境界のＥ（Ｄ）ＲＹ部位間のイオンロック、
－ ＴＭ７のリジン残基（Ｋ）がシッフ塩基を介して発色団１１－ｃｉｓ－レチナールに結合した発色団結合ポケット及びシッフ塩基を安定化するＴＭ３の陰性対イオン、典型的にはグルタミン酸、
－ ＴＭ７のＣ末端のＮＰｘｘＹモチーフ、
－ Ｈ８の遠位端にある１つ以上のパルミトイル化部位（Ｃ）、
－ ＣＴの細胞質領域のＣ末端リン酸化部位（Ｐ）。

【0318】

さらに、図１は、例として、ＣＴの３つの例示的な切断部位（ｘ－１）、（ｘ－２）及び（ｘ－３）を示す。

【0319】

示されている切断部位（ｘ－１）は、Ｈ８の遠位端に位置し、ウシロドプシン（Ｃ３２２又はＣ３２３）のパルミトイル化部位に対応するパルミトイル化システイン残基に遠位で隣接している。示されている切断部位（ｘ－２）は、パルミトイル化部位の下流に位置し、パルミトイル化部位の３３アミノ酸下流のメラノプシン又はＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４０、４１、４２、４３、４４又は４５アミノ酸下流までである。示されている切断部位（ｘ－３）は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ内又はその直接遠位側にある。図示されていない他の切断部位は、特に、（ｘ－１）と（ｘ－２）との間又は（ｘ－３）と（ｘ－１）との間のアミノ酸位置に位置している。

【0320】

図２：例示的なキメラオプシンＧＰＣＲのスキーム。

【0321】

図２は、単一のスプライシング部位（ｘ－１）のみで最小限の遺伝子操作のみを必要とするキメラオプシンＧＰＣＲの例示的な実施形態を示す。ここで、例示的な親上流オプシンの切断されたＣ末端は、パルミトイル化部位に隣接して遠位で切断され、例示的な標的ＧＰＣＲのＣＴと融合されている。（ｘ－２）及び（ｘ－３）などの代替の例示的なスプライス部位が示され、図１に記載されている。

【0322】

図２に示される例示的な実施形態は、Ｃ末端の極めて遠位端に任意選択により付加され得る追加の配列をさらに含む。そのような任意選択による追加の配列は、マーカータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）又は輸送配列（例えば、ゴルジ及びＥＲ搬出シグナル又は膜輸送配列）をコードし得る。本明細書に示されていないさらなる例示的な実施形態において、任意選択による追加のスプライシング部位は、非ヒトオプシンが再利用された場合、潜在的なヒト治療におけるタンパク質の抗原性を低下させるための、ヒトオプシンドメインとの細胞外ドメイン交換のため、ＴＭドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）と細胞外ドメイン（ＮＴ、ＥＬ１～ＥＬ３）との間の接合部（Ａ’）－（Ｇ’）の周辺に導入できる。

【0323】

図３：キメラオプシンｍＧｌｕＲ６の例示的な実施形態。

【0324】

（Ａ）：図３は、キメラＣ末端を有するメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲの例示的な実施形態を示し、パルミトイル化部位（Ｃ）までの（その部位を含む）切断型メラノプシンＣ末端を含み、その後、遠位方向のパルミトイル化部位に遠位隣接し、最初にフルサイズのｍＧｌｕＲ６ＣＴが続き、次に、ｍＫａｔｅ２蛍光マーカーが続き、最後に追加のゴルジ搬出シグナルと標的ＣＴの最遠位端にあるロドプシン膜輸送配列が続く。さらに、メラノプシンのＩＬ１は、接合部ａ及びｂに位置する切断スプライシング部位でｍＧｌｕＲ６のＩＬ１に完全に置き換えられ、ｍＧｌｕＲ６の完全なＩＬ３は、メラノプシンのより長いＩＬ３の高度可変領域内に位置するスプライシング部位に導入された。

【0325】

この例示的な実施形態において、ｍＧｌｕＲ６の短いＩＬ３は、可変領域が機能的差異、すなわちここでは潜在的にＧタンパク質特異性を決定するという理論的根拠の下、メラノプシンのより長いＩＬ３の最も保存されていない領域に導入される。実際、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＩＬ３を用いたこの実施形態は、図６Ｂに示されるように、オプシンＩＬ３に導入されたｍｅｌａ（ｐａｌｍ）ｍＧｌｕＲ６と比較して機能性を増強する。

【0326】

（Ｂ）－上：異なる種（ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２５１１１）からのメラノプシン遺伝子（ＯＰＮ４）のアライメントは、ＴＭ５とＴＭ６との間にＩＬ３の超可変領域を示す。

【0327】

（Ｂ）－下：ｍＧｌｕＲ６のＩＬ３の挿入位置。下向きの矢印は、本明細書で使用されているマウスメラノプシン（Ｍ．ＯＰＮ４）の切断部位を示し、上向きの矢印は、Ａで示されている接合部ｅ及びｆを示す。

【0328】

図４：キメラオプシンＧＰＣＲの例示的な実施形態は、細胞膜を標的とする。

【0329】

原形質膜への適切な細胞内輸送を確認するために、オプシン－ｍＧｌｕＲ６－ｍＫａｔｅ２融合タンパク質を生成し、蛍光レポータータンパク質（ｍＫａｔｅ２）を使用してタンパク質の局在化を研究した。融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞で発現した。微分干渉顕微鏡画像（Ａ、Ｃ）と蛍光画像（Ｂ、Ｄ）を比較することにより、オプシン－ｍＧｌｕＲ６タンパク質が細胞膜に存在することが確認された。これは、２つの異なるキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、すなわち（Ａ、Ｂ）のメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６－ｍＫａｔｅ２キメラＧＰＣＲと、（Ｃ、Ｄ）のクラゲオプシン－ｍＧｌｕＲ６－ｍＫａｔｅ２キメラＧＰＣＲで示されている。両方のキメラＧＰＣＲにおいて、切断部位は、メラノプシンＣＴのパルミトイル化部位に隣接して遠位に位置している。

【0330】

図５：キメラＣ末端を有するキメラオプシンｍＧｌｕＲ６の例示的な実施形態は、親オプシンと比較して、オプシン－ｍＧｌｕＲ６によって媒介される光活性化電流を増加させたことを示している。

【0331】

様々な例示的なキメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６コンストラクト（追加の輸送配列を欠く）を、ＧＩＲＫ１／２チャネル（Ｇｉ／ｏファミリーの活性化Ｇタンパク質によって直接開かれるカリウムチャネル）を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株に一過性にトランスフェクトした。細胞が電位クランプモード（－７５ｍＶ保持電位）でパッチクランプされると、５秒間提示される４７０ｎｍの光刺激（１×１０^１４光子ｃｍ^－２ｓｅｃ^－１）が、ヒストグラムで変異体につき示される内向きＧＩＲＫ電流を活性化する。異なるコンストラクトによって活性化されたＧＩＲＫ電流の相対的なサイズ（ｐＦでパッチされた細胞のサイズに正規化）が示されている。星印は、スチューデントのｔ検定によって決定された有意水準を示す（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１）

【0332】

（Ａ）中波錐体オプシン（ＯＰＮ１ＭＷ）によって誘発されたＧＩＲＫ電流は、キメラＯＰＮ１ＭＷ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６ＣＴによって誘発されたものよりも有意に小さい。

【0333】

（Ｂ）メラノプシン変異体による光活性化ＧＩＲＫ電流の比較、１＝未修飾メラノプシン、２＝パルミトイル化部位でＣＴ ｍＧｌｕＲ６を添加して切断されたメラノプシン、３ ＝さらにメラノプシンの完全なＩＬ１がｍＧｌｕＲ６のＩＬ１に置き換えられ、４＝さらに、完全なｍＧｌｕＲ６ ＩＬ３は、メラノプシンの長いＩＬ３の可変位置に配置された。ｍＧｌｕＲ６のＣ末端のＣ末端付加は、光によって誘発されるＧＩＲＫ電流を有意に増加させる。

【0334】

図６：ＨＥＫ－ＧＩＲＫ細胞を用いたキメラオプシンＧＰＣＲのインビトロ機能スクリーニングの例。

【0335】

オプシン標的ＧＰＣＲキメラでトランスフェクトされたＨＥＫ－ＧＩＲＫ細胞は、Ｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）に記載されるように、Ｇｉ／ｏ Ｇタンパク質シグナル伝達を活性化する能力について評価された。標的ＧＰＣＲ ＣＴに加えて、ｍＫａｔｅ蛍光タンパク質並びに追加のゴルジ及び膜輸送配列を運搬する様々なオプシン－ＧＰＣＲ変異体でトランスフェクトされたＨＥＫ－ＧＩＲＫ細胞から記録されたパッチクランプトレースの光応答の例が示される（黒の水平線として表される光刺激；４７０ｎｍ；１×１０^１４光子／秒／ｃｍ^２）。（Ａ）プロトタイプＯｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６（国際公開第２０１２／１７４６７４Ａ１号パンフレット及びｖａｎ Ｗｙｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５））、（Ｂ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６、（Ｃ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）＋ＩＬ１－ｍＧｌｕＲ６、（Ｄ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）＋ＩＬ３－ｍＧｌｕＲ６、（Ｅ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、（Ｆ）ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、（Ｇ）ＯＰＮ１ＭＷ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、（Ｈ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ＯＰＮ１ＭＷ（ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＣＴ）。

【0336】

図７：キメラオプシンＧＰＣＲの例示的な実施形態のＧタンパク質再標的化及び経路選択性を探索するプレートリーダー実験。

【0337】

ＨＥＫ２９３細胞にオプシン－ＧＰＣＲキメラレポーター発現プラスミドを共トランスフェクトし、生物発光プレートリーダーアッセイでＧα特異性を評価した。ＧＩＲＫアッセイと同様に、活性化オプシンはＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質は、ｃＡＭＰ（Ｇｓ）を生成する酵素を阻害又は活性化し、ｃＡＭＰ（Ｇｉ／ｏ）を減少させ、細胞内Ｃａ２＋（Ｇｑ）を増加させる。これらの産物（ｃＡＭＰ及びＣａ２ ＋）の蓄積は、それぞれｃＡＭＰ又はＣａ２＋によって活性化される生物発光タンパク質の光放出によって測定できる。光照射（４８０ｎｍ、１０秒）は、黒矢印で示されている。光誘起蛍光変化をオプシントランスフェクションレベルに正規化するために、蛍光の絶対変化を、測定プレートのそれぞれのウェルの全体的なｍＣｉｔｒｉｎｅレポーター蛍光で除した。黒矢印は光刺激を示す。（Ａ、Ｂ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（黒トレース）と未修飾メラノプシン（灰色トレース）のＧｉ／ｏ（Ａ）及びＧｑ（Ｂ）カップリングの優先度。（Ａ）では、光活性化キメラタンパク質によるｃＡＭＰの減少を測定できるように、フォルスコリン（アデニル酸シクラーゼを刺激）の添加によって細胞内ｃＡＭＰが初めて増強されたことに留意されたい。グラフは、パルミトイル化部位でのメラノプシンのＣ末端とｍＧｌｕＲ６のＣ末端の交換により、Ｇタンパク質の優先度がＧｑ（メラノプシン）からＧｉ／ｏ（ｍＧｌｕＲ６）に移行することを示す。メラノプシンのパルミトイル化部位にｍＧｌｕＲ６のＣ末端を挿入すると、Ｇ－αサブユニットの優先度がＧｑからＧｉ／ｏに移行する。（Ｃ）ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（黒トレース）と比較したＪｅｌｌｙＯＰ未修飾（灰色トレース）のＧｉ／ｏ対Ｇｓカップリングの優先度。ＰＴＸはＧｉ／ｏの阻害剤であり、ＪｅｌｌｙＯＰはＧｓにのみ結合することを示している（（●）なし及びＰＴＸの添加後（■）のシグナル変化なし）が、ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６は明らかにＧｉ／ｏに結合し、微分輝度値（Δ）として、ＰＴＸの添加前（●）に視認でき、ＰＴＸの添加後（■）に明らかに増加した。クラゲオプシンのパルミトイル化部位にｍＧｌｕＲ６のＣ末端を挿入すると、Ｇ－αサブユニットの優先度がＧｓからＧｉ／ｏに移行する。（Ｄ）ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－５ＨＴ７は、光活性化ｃＡＭＰの増加によって効率的に示されるＧｓを活性化する。対照：光活性化キメラタンパク質を含まない、ｍＣｉｔｒｉｎｅを発現するＨＥＫ２９３細胞のみ。（Ｅ）前帯状皮質の錐体細胞で発現するＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－５ＨＴ７は、ＨＣＮチャネルの活性を低下させ、それにより、膜電位を脱分極する。この効果は、薬理学的な５－ＨＴ７刺激の効果と同一である（Ｓａｎｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５））。マウス前帯状皮質の急性切片からの錐体細胞の体細胞パッチクランプ記録（上に表示）からのデータ（下）。ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－５ＨＴ７は、定位的注入によるＡＡＶｄｊ遺伝子治療によって導入された。

【0338】

図８：キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６変異体の例示的な実施形態のＯＮ－双極細胞樹状突起及びｍＧｌｕＲ６シグナロソームへの正しいインビボ輸送。

【0339】

マウスは、ｓｓＡＡＶ２（７ｍ８）（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３））を使用し、メラノプシン－ｍＧｌｕＲ６遺伝子を７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター（ＥＰ１９２０００８２．６、本出願に添付）の制御下に置く遺伝子治療で処置された。（Ａ）天然ｍＧｌｕＲ６も存在する、ＯＮ－双極細胞の樹状突起におけるキメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質の正しい細胞内局在を示すスケッチ。（Ｂ）抗メラノプシン抗体（白）で可視化されたメラ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６－ＩＲＥＳ－ＴｕｒｂｏＦＰ６３５は、ＯＮ双極細胞の樹状突起で明確に発現している。神経節細胞層（ＧＣＬ）に由来する軸索は、メラノプシンを天然に発現するｉｐＲＧＣ（内因性光感受性網膜神経節細胞）に由来する。抗ＲＦＰ抗体で視覚化されたＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６－ｍＫａｔｅ２（Ｃ）及びＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６－ｍＫａｔｅ２（Ｄ）は、タンパク質の樹状突起の局在を明確に示している。オプシン（ｐａｌｍ）バージョンは、キメラタンパク質を標的細胞に正しく局在化させるのに十分である。

【0340】

図９：キメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲの例示的な実施形態は、単離されたＯＮ－双極細胞を直接光感受性にする。

【0341】

マウスは、パパインで消化された除核後、Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６及びＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６及び網膜で遺伝子治療的に処置された。単離された細胞をガラスカバースリップ上にプレーティングし、穿孔パッチ技術を使用してパッチクランプした。（Ａ）双極細胞はＤＩＣ光学下で容易に同定された。（Ｂ）トランスフェクトされた双極細胞は、蛍光レポーター遺伝子の共発現によって同定され、ここで、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５は蛍光顕微鏡で可視化された。（Ｃ、Ｄ）２秒間の青色光（４７０ｎｍ；１×１０＾１４光子／ｃｍ＾２／秒）に応答した、形質導入されたＯＮ双極細胞からのパッチクランプ記録の例は、垂直破線で示されている。（Ｃ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６を発現するＯＮ双極細胞からの灰色と黒の２つのオーバーレイされたトレース例。光に応答して、細胞は明らかに過分極し、ＴＲＰＭ１非選択的カチオンチャネルを負にゲーティングするｍＧｌｕＲ６カスケードの直接活性化を示す。（Ｄ）網膜切片で記録されたＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６を発現するＯＮ双極細胞（黒トレース）及び光受容体によって直接活性化されたロッド双極細胞（灰色トレース）からのパッチクランプトレースの比較。ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６を発現する双極細胞は、６７０ｍｓの応答オフセット（Ｔａｕ（ｏｆｆ））で、非常に速い反応速度を示した。これは、光受容体活性化下の双極細胞の応答オフセットと実質的に同一である（この例ではＴａｕ（ｏｆｆ）＝５７０ｍｓ）。また、ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６の応答発生（Ｔａｕ（ｏｎ）＝９０ｍｓ）は、光受容体によって活性化された双極細胞の応答発生（７０ｍｓ）と実質的に同一である。内因性の迅速な動態は、ｍＧｌｕＲ６シグナロソームにおけるＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６の正しい局在化及び双極細胞内での適切なシグナル伝達を明確に示している。運動パラメータ（タウ値）の適合は、赤及び緑の線で示される。

【0342】

図１０：キメラオプシンｍＧｌｕＲ６変異体の例示的な実施形態によるＡＡＶ遺伝子治療によって処置された盲目マウスの視力のインビボ測定。

【0343】

ヒストグラムは、ｘ軸に示されている異なるキメラオプシン－ｍＧｌｕＲ６コンストラクトを用いたＡＡＶ遺伝子治療によって処置された盲目の網膜色素変性症ｒｄ１（網膜変性Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ系統）マウスの平均視力（±ｓ．ｅ．ｍ．）を示し、ここで、（ｐａｌｍ）は、メラノプシン、クラゲオプシン及び中波錐体オプシンのＣＴでパルミトイル化部位に隣接して遠位に位置する切断部位を指し、Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）は、メラノプシンＣＴのパルミトイル化部位の下流のアミノ酸位置３３に隣接して遠位に位置する切断部位を指し、ここで、＋ＩＬ１又は＋ＩＬ３は、ｍＧｌｕＲ６のＣＴに加えて、ｍＧｌｕＲ６のこれらのサブユニットの存在を指し、最後に、ＪｅｌｌｙＯＰ及びＯＰＮ１ＭＷは、それぞれクラゲオプシンとヒト中波錐体オプシンを指す。Ｃ５７ＢＬ／６は、注射されていない、視力を有する野生型マウスを指し、陽性対照として使用される。この試験では、マウスは、空間周波数が変化する黒及び白のバーを示す仮想現実（Ｓｔｒｉａｔａｔｅｃｈ、視線運動ドラム）に囲まれた高いプラットフォーム上に拘束されずに配置される（詳細については、Ｐｒｕｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）を参照されたい）。マウスの頭部運動（視運動反射）の追跡は、赤外線カメラによって自動的に監視され、マウスがまだ認識している最高の空間視力（サイクル／度）を定量化するために分析される。Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６を注射したマウスは、盲目の同腹仔（ｒｄ１）よりも有意に優れたパフォーマンスを示す。全てのメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６変異体で処置されたマウスは、ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６及びＯＰＮ１ＭＷ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６を注射されたマウスでも同様に良好に機能した。有意水準は一元配置分散分析によって決定され、グラフでは有意水準は、以下のように示される：＊ｐ≦０．０５、＊＊＊ｐ≦０．００１及びｎ．ｓ．有意差なし。要約すると、全てのコンストラクトは、盲目ｒｄ１マウスの空間視力の有意な回復において同等によく機能した。遺伝子治療は、ｓｓＡＡＶ２（７ｍ８）（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ（２０１３）ベクターを使用して、７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターの制御下でキメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質遺伝子を設定して実施した。

【0344】

図１１：新規オプシン－ｍＧｌｕＲ６コンストラクトで処理された盲目ｒｄ１網膜の網膜神経節細胞から記録されたエクスビボ光応答。

【0345】

細胞接着型パッチクランプ記録は、エクスビボで、全載網膜で実施された。（Ａ）細胞型の同定のためのパッチクランプ記録後に細胞内で標識された網膜神経節細胞。（Ｂ）Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６キメラで処理されたｒｄ１網膜の網膜神経節細胞のスパイク応答を示す例示的なラスタープロット。応答は、ｍＧｌｕＲ６受容体アゴニスト、Ｌ－ＡＰ４（２５μＭ）によって遮断されず、光受容体からＯＮ双極細胞への入力を遮断する。これは、光応答がＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６によって駆動されることを確認する。点線間で２秒間光を当てた。バーの各水平線（番号１～８）は、１つの記録を示す。各垂直線は、神経節細胞の記録された活動電位に対応する。明らかに、この細胞は、光が非常に確実に照射されると活動電位発火を増加させる。（Ｃ）処置がなければ盲目のネズミｒｄ１網膜におけるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６発現によって回復した一過性のＯＦＦ、ＯＮ、ＯＮ－ＯＦＦ神経節細胞のスパイク時間ヒストグラムの例。光に対する神経節細胞の応答の天然の多様性の回復（すなわちＯＦＦセルと呼ばれる光オフセット（左）でのスパイク頻度の増加、ＯＮセルと呼ばれる光開始（中央）でのスパイク頻度の増加又はＯＮ－ＯＦＦセルと呼ばれる光オン及びオフセット（右）での発火の増加）は、内因性の網膜内層機能の回復を確認する。（Ｄ）異なるキメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質変異体で形質導入されたマウスのｒｄ１網膜フラットマウントからの多電極アレイ（ＭＥＡ）記録。反復される光刺激（トレースの上の水平バーで示される光刺激の持続時間）の選択された電極（番号１～５）からのラスタープロット（Ｂと同様）の例が示されている。ｒｄ１は未処置の同腹仔であり、光刺激による基礎発火率に変化はない。対照的に、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６タンパク質の全ての網膜は、顕著な光ロック応答を示す。

【0346】

図１２：２匹の処置された変性マウス（ｒｄ１網膜変性マウス系統Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ）からの網膜を通る垂直凍結切片の顕微鏡写真は、ＡＡＶ２カプシドをコードするウイルスＶＰ１遺伝子のＮ５８７とＲ５８８との間にペプチドインサート（ａ）ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ及び（ｂ）ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲを含むＡＡＶ２による硝子体内遺伝子治療後にＯＮ双極細胞を発現するｈＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６－ＩＲＥＳ２－ＴｕｒｂｏＦＰ６３５を示す。ｈＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６－ＩＲＥＳ２－ＴｕｒｂｏＦＰ６３５の発現は、いずれの場合にも７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）ＯＮ双極細胞特異的プロモーターによって駆動される。

【0347】

図１３：例示的なＪＳＲ１（Ｓ１８６Ｆ）ｐａｌｍ－ベータ２ＡＲキメラオプシンＧＰＣＲをＨＥＫ２９３－ＧＩＲＫ細胞で発現させ、全細胞パッチクランプ法で光誘導電流を測定した。３８５ ｎｍの照明は、ＧＩＲＫ電流を誘導したが、５５０ｎｍの光は、双安定ＪＳＲ１（Ｓ１８６Ｆ）変異体の二色性のために活性を停止した。例示的なｈＪＳＲ（Ｓ１８６Ｆ）ｐａｌｍ－ＧＡＢＡＢ２キメラオプシンＧＰＣＲで実施された同じ照明を使用した類似のパッチクランプ実験は、類似のＧＩＲＫ電流を誘導した（データは示さず）。

【0348】

以下の表３の概要に提示されるようなキメラオプシンＧＰＣＲＳの例示的な実施形態の選択のためのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。

【0349】

【表5】

【0350】

【表6】

【0351】

【表7】

【0352】

以下に列挙されているアミノ酸配列において、枠付きのアミノ酸は保存されたモチーフを示し、灰色のハイライトはパルミトイル化されたＣｙｓを示す。

【0353】

実施形態（Ａ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６（マウス配列に基づく）
構成：メラノプシンは、ＡＡ３９７の後に切断され、ｍＧｌｕＲ６のＣ末端がＮＲ（Ｋ）Ｑ／ＨＰＥモチーフから追加された。
ｃＤＮＡ－配列番号１

【化9】

ペプチド配列－配列番号２

【化10】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0354】

実施形態（Ｂ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（マウス配列に基づく）
構成：メラノプシンは、メラノプシンのパルミトイル化Ｃｙｓ（ＡＡ３６４）の後で切断され、より良い配列アライメントの結果としてプロトタイプＯｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６に対し２つの追加の近位アミノ酸を含むｍＧｌｕＲ６ Ｃ末端が付加された（ｖａｎ Ｗｙｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ｃＤＮＡ－配列番号３

【化11】

ペプチド配列－配列番号４

【化12】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0355】

実施形態（Ｃ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）＋ＩＬ１－ｍＧｌｕＲ６（マウス配列に基づく）
構成：実施形態Ａのとおり、ただしメラノプシンＩＬ１とｍＧｌｕＲ６のＩＬ１とのさらなる完全な交換を伴う。プロトタイプＯｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６と同一の切断部位（ｖａｎ Ｗｙｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ｃＤＮＡ－配列番号５

【化13】

ペプチド配列－配列番号６

【化14】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0356】

実施形態（Ｄ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）＋ＩＬ１－ｍＧｌｕＲ６（マウス配列に基づく）
構成：メラノプシンは、メラノプシンのパルミトイル化Ｃｙｓ（ＡＡ３６４）の後で切断され、プロトタイプＯｐｔｏ－ｍＧｌｕＲ６に対し２つの追加の近位ＡＡを含むｍＧｌｕＲ６ Ｃ末端が付加された（ｖａｎ Ｗｙｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ｃＤＮＡ－配列番号７

【化15】

ペプチド配列－配列番号８

【化16】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0357】

実施形態（Ｅ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）＋ＩＬ３－ｍＧｌｕＲ６（マウス配列に基づく）
構成：（１）のとおり、ただしメラノプシンの長いＩＬ３の可変部分へのｍＧｌｕＲ６の短いＩＬ３のさらなる挿入を伴う。
ｃＤＮＡ－配列番号９

【化17】

ペプチド配列－配列番号１０

【化18】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0358】

実施形態（Ｆ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ＯＰＮ１ＭＷ（ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＣＴ）（マウス配列に基づく）
構成：
ｍｅｌａの全ての細胞内ドメインが、ＣＴスプライス部位Ｘ－１を有するＯＰＮ１ＭＷの対応する細胞内ドメインによって交換されたキメラ（図３、オプション１）
ｃＤＮＡ－配列番号１１

【化19】

ペプチド配列－配列番号１２

【化20】

説明：
下線＝ＯＰＮ１ＭＷ
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0359】

実施形態（Ｇ）：ＯＰＮ１ＭＷ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（マウス配列に基づく）
構成：ＨＰＥモチーフを含むｍＧｌｕＲ６ Ｃ末端は、推定パルミトイル化部位、すなわちウシロドプシンのパルミトイル化部位Ｃ３２２の直前の残基（Ｆ、灰色で強調表示）の後ろに付加された。
ｃＤＮＡ－配列番号１３

【化21】

ペプチド配列－配列番号１４

【化22】

説明：
下線＝ｍＧｌｕＲ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0360】

実施形態（Ｈ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３ＡＡ）－ｍＧｌｕＲ６（ヒト配列に基づく）
構成：マウスコンストラクトを有する上記
ｃＤＮＡ－配列番号１５

【化23】

ペプチド配列－配列番号１６

【化24】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0361】

実施形態（Ｉ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（ヒト配列に基づく）
構成：マウスコンストラクトを有する上記
対立遺伝子変異体：「Ｌ変異体」
ｃＤＮＡ－配列番号１７

【化25】

ペプチド配列－配列番号１８

【化26】

対立遺伝子変異体：Ｐ変異体
ｃＤＮＡ配列番号１９（ヒトメラノプシンアイソフォーム１を有する）

【化27】

ペプチド配列－配列番号２０
ヒトメラノプシンのアイソフォーム１（「ｐ変異体」）を有するＡＡ配列メラノプシン－ｍＧｌｕＲ６）

【化28】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ
枠付き＝対立遺伝子変異体及び保存されたモチーフ
コメント：ＨＥＫ２９３細胞での比較実験では、Ｌ変異体とＰ変異体は同等に機能した。Ｐ変異体は、最も一般的なｍＧｌｕＲ６対立遺伝子変異体であり、ほとんどの実験で使用されている。

【0362】

実施形態（Ｊ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３Ａ）＋ＩＬ１－ｍＧｌｕＲ６（ヒト配列に基づく）
構成：マウスコンストラクトを有する上記
ｃＤＮＡ－配列番号２９

【化29】

ペプチド配列－配列番号３０

【化30】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0363】

実施形態（Ｋ）：Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３Ａ）＋ＩＬ３－ｍＧｌｕＲ６（ヒト配列に基づく）
構成：ｍＧｌｕＲ６（ＧＲＭ６）ＩＬ３及びｍＧｌｕＲ６（ＧＲＭ６）ＣＴを有するヒトメラノプシンキメラ
ｃＤＮＡ－配列番号３１

【化31】

ペプチド配列－配列番号３２

【化32】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0364】

実施形態（Ｌ）：ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６
構成：ＪｅｌｌｙＯＰのパルミトイル化部位（灰色Ｃｙｓ）の後ろにマウスＧＲＭ６のＣ末端が付加されたハコクラゲ（Ｂｏｘ ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）オプシンキメラ
ｃＤＮＡ－配列番号３３

【化33】

ペプチド配列－配列番号３４

【化34】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0365】

実施形態（Ｍ）：ＪｅｌｌｙＯＰ（ｐａｌｍ）－５ＨＴ７
構成：ＪｅｌｌｙＯＰのパルミトイル化部位（灰色Ｃｙｓ）の後ろにマウス５－ヒドロキシトリプタミン受容体７（アイソフォーム１）のＣ末端が付加されたハコクラゲ（Ｂｏｘ ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）オプシンキメラパルミトイル化部位の後ろから始まる５－ＨＴ７受容体のＣ末端配列がここに追加された
ｃＤＮＡ－配列番号３５

【化35】

ペプチド配列－配列番号３６

【化36】

説明：
下線＝５ＨＴ７
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0366】

実施形態（Ｎ）：ＰＰＯ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（マウスｍＧｌｕＲ６）
構成：カワヤツメ（Ｌｅｔｈｅｎｔｅｒｏｎ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｍ）パラピノプシン（ＰＰＯ）
ＨＰＥ部位の上流の２アミノ酸でｍＧｌｕＲ６のＣＴと融合したＰＰＯのパルミトイル化部位のスプライシング部位ｘ。
ＤＮＡ配列－配列番号３７

【化37】

ペプチド配列－配列番号３８

【化38】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0367】

実施形態（Ｏ）：ＪＳＲ１（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６（マウスｍＧｌｕＲ６）
ハエトリグモ（ｊｕｍｐｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ）ロドプシン、アダンソンハエトリ（Ｈａｓａｒｉｏｕｓ ａｄａｎｓｏｎｉ）のＫｕｍｐｏｐｓｉｎ １
構成：ＨＰＥ部位の上流の２アミノ酸でｍＧｌｕＲ６のＣＴと融合したＪＳＲ１のパルミトイル化部位のスプライシング部位ｘ。
ｃＤＮＡ配列－配列番号３９

【化39】

ペプチド配列－配列番号４０

【化40】

説明：
下線＝ＧＲＭ６
下線且つ太字＝任意選択によるゴルジ搬出シグナル
太字＝任意選択による１Ｄ４エピトープ

【0368】

参考文献
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■Ｈｕｌｌｉｇｅｒ Ｃａｒｌｏｓ Ｅｌｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｐｏｗｅｒｉｎｇ Ｒｅｔｉａｎｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆＨｕｍａｎ Ｒｏｄ ａｎｄ Ｃｏｎｅ ＯＮ－Ｂｉｐｏｌａｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１７，Ｊｕｎｅ ２０２０．ｐｐ．５０５－５１９－Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
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■Ｋｉｍ Ｄ，Ｍａｔｓｕｄａ Ｔ ａｎｄ Ｃｅｐｋｏ Ｃ．“Ａ Ｃｏｒｅ Ｐａｉｒｅｄ－Ｔｙｐｅ ａｎｄ ＰＯＵＨｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｄｒｉｖｅｓ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｂｉｐｏｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００８，２８：ｐ．７７４８－７７６４；
■Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ Ｓ，“Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｏ－ＧＰＣＲｓ”．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｄｍａｒｋ，２１，７９４－８０５，Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１６．
■Ｋｕｈｌｍａｎ，Ｂ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｐ．，“Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ”．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，６８１－６９７（２０１９）
■Ｌａｇａｌｉ Ｐ．Ｓ．，Ｂａｌｙａ Ｄ．，Ａｗａｔｒａｍａｎｉ Ｇ．Ｂ．，Ｍｕｅｎｃｈ Ｔ．Ａ．，Ｋｉｍ Ｄ．Ｓ．，Ｂｕｓｓｋａｍｐ Ｖ．，Ｃｅｐｋｏ Ｃ．Ｌ．，Ｒｏｓｋａ Ｂ，“Ｌｉｇｈｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ＯＮ ｂｉｐｏｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｔｏｒｅ ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８ Ｊｕｎ；１１（６）：６６７－７５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．２１１７．Ｅｐｕｂ ２００８ Ａｐｒ ２７．
■Ｌｉｎ Ｋ．，Ｓｉｍｏｓｓｉｓ Ｖ．Ａ．，Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．，Ｈｅｒｉｎｇａ Ｊ．，“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｆａｓｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇＨｉｄｄｅｎ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１（２）：１５２－１５９（２００５）
■Ｌｏｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌｓ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｓｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ａ Ｃｉｌｉａｒｙ ＧＰＣＲ，Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｇｕｓｔ ２１，２０１３，－３３（３４）：１３６２１－１３６３８．１３６２１
■Ｌｏｎｇ Ｃ．，ＬｉＨ．，Ｔｉｂｕｒｃｙ Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｃａｙｃｅｄｏ Ｃ．，Ｋｙｒｙｃｈｅｎｋｏ Ｖ．，ＺｈｏｕＨ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｍｉｎ Ｙ．，Ｓｈｅｌｔｏｎ Ｊ．Ｍ．，Ｍａｍｍｅｎ Ｐ．Ａ．，Ｌｉａｗ Ｎ．Ｙ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｗ．Ｈ．，Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ Ｒ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｊ．Ｗ．ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ Ｅ．Ｎ．，“Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＨｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｉｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ４（１）（２０１８）ｅａａｐ９００４，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｐ９００４
■Ｌｕ Ｑ，Ｇａｎｊａｗａｌａ Ｔ，Ｉｖａｎｏｖａ Ｅ，Ｃｈｅｎｇ Ｊ，Ｔｒｏｉｌｏ Ｄ ａｎｄ Ｐａｎ Ｚ，“ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｂｉｐｏｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍＧｌｕＲ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｉｍａｔｅｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１６，２３：ｐ．６８０－９．
■Ｍｏｒｅｉｒａ Ｉ Ｓ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ＧＰＣＲ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｏｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ Ｖｏｌ．１８４０＿１，ｐ．１６－３３，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｇｅｎ．２０１３．０８．０２７）
■Ｍｏｒｒｉ Ｍ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｒｏｍｅｒｏ Ｉ，Ｔｉｃｈｙ ＡＭ，Ｋａｉｎｒａｔｈ Ｓ，Ｇｅｒｒａｒｄ ＥＪ，Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ＰＰ，Ｓｃｈｗａｒｚ Ｊ，ＪａｎｏｖｊａｋＨ “Ｏｐｔｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｌａｓｓ Ａ ｏｒｐｈａｎ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：１９５０（２０１８），
ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０４３４２－１（２０１８）．
■Ｍｕｒｅ Ｌ，Ｈａｔｏｒｉ Ｍ，Ｚｈｕ Ｑ，Ｄｅｍａｓ Ｊ，Ｋｉｍ Ｉ，Ｎａｙａｋ Ｓ，Ｐａｎｄａ Ｓ，“Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ－Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｇａｎｇｌｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ”．２０１６，Ｎｅｕｒｏｎ ９０，１０１６－１０２７，Ｊｕｎｅ １，２０１６；Ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１６．０４．０１６）
■Ｎｙｇａａｒｄ Ｒ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ β－Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．Ｃｅｌｌ １５２，５３２－５４２，Ｊａｎ ３１，２０１３．（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｇｅｎ．２０１３．０８．０２７）
■Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｌｕｍｍｉｓ，Ｓ．Ｃ．，“Ｎａｎｏ－ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ－ｓｉｚｅｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ”，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１，６６（２０１１）．Ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１４７２－６７５０－１１－６６
■Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ Ｙｕ Ａ，Ａｂｄｕｌａｅｖ ＮＧ，Ｂｏｇａｃｈｕｋ ＡＳ，“Ｔｗｏ ａｄｊａｃｅｎｔ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎｈｔｔｐｓ”，／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｇｅｎ．２０１３．０８．０２７ ａｒｅ ｐａｌｍｉｔｉｌａｔｅｄ．Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８８；２３０：１－５．［ＰｕｂＭｅｄ：３３５０１４６］
■Ｐｒｕｓｋｙ Ｇ．Ｔ．，Ａｌａｍ Ｎ．Ｍ．，Ｂｅｅｋｍａｎ，Ｓ．，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ．Ｍ．，“Ｒａｐｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｓｐａｔｉａｌ Ｖｉｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｏｐｔｏｍｏｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ”，４５：４６１１－４６１６，Ｄｅｃ．２００４
■Ｓａｎｔｅｌｌｏ Ｍ．，Ｎｅｖｉａｎ Ｔ．，“Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｉｎ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｂｙ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎｅｒｇｉｃ Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”，Ｎｅｕｒｏｎ ８６（１）：２３３－２４６，Ｍａｒｃｈ ２６，２０１５
■Ｓａｔｏ Ｔ．，“Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ２ｎｄ Ｒｅｓｉｄｕｅ ｏｆＨｅｌｉｘ ８ ｏｆ ＧＰＣＲ Ｍａｙ Ｃｏｎｆｅｒ ｔｈｅ Ｓｕｂｃｌａｓｓ－Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｎｄ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｒｏｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｒａｐｉｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１９，２０，１７５２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ２００７１７５２．
■Ｓｃｈｉｏｔｈ，Ｈ．Ｂ，Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ Ｒ，“Ｔｈｅ ＧＲＡＦＳ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”．Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４２，Ｆｅｂ．１５，２００５，９４－１０１．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｇｃｅｎ．２００４．１２．０１８．
■Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｔ，Ｆｒｉｍｕｒｅｒ Ｔ，Ｈｏｌｓｔ Ｂ，Ｒｏｓｅｎｋｉｌｄｅ Ｍ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇ Ｃ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ７ＴＭ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ａ ｇｌｏｂａｌ ｔｏｇｇｌｅ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｄｅｌ”．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ４６，４８１－５１９（２００６－ ＤＯＩ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｐｈａｒｍｔｏｘ．４６．１２０６０４．１４１２１８．
■Ｓｉｕｄａ Ｅ，Ｃｏｐｉｔｓ Ｂ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ，Ｂａｉｒｄ Ｍ，Ａｌ－Ｈａｓａｎｉ Ｒ，Ｐｌａｎｅｒ Ｗ，Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｋ Ｓ，ＭｃＣａｌｌ Ｊ，Ｇｅｒｅａｕ ＩＶ Ｒ，Ｂｒｕｃｈａｓ Ｍ，“Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｐｉｏｉｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ”．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１５ Ｍａｙ ２０；８６（４）：９２３－９３５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１５．０３．０６６
■Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ Ｐ，Ｗｙｒｉｃｋ ＧＲ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＤＣ，Ｇｈａｈａｒｉ Ａ，Ｐｉｎｈａｌ ＣＭ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＭＳ，Ｒｕｐｐ ＡＣ，Ｃｕｉ Ｌ，Ｗｕ Ｚ，Ｂｒｏｗｎ ＲＬ，Ｂａｄｅａ ＴＣ，Ｈａｔｔａｒ Ｓ，ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＰＲ．，“Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ ｉｎ ｍｉｃｅ”．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７ Ｍａｒ ７；１１４（１０）：２７４１－２７４６．
■Ｓｒｉｒａｍ Ｋ ａｎｄ Ｉｎｓｅｌ Ｐ Ａ，“Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｄｒｕｇｓ：Ｈｏｗ Ｍａｎｙ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄＨｏｗ Ｍａｎｙ Ｄｒｕｇｓ？”．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９３：２５１－２５８，Ａｐｒｉｌ ２０１８．Ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２４／ｍｏｌ．１１７．１１１０６２
■Ｔｓａｉ Ｃ－Ｊ，Ｐａｍｕｌａ Ｆ，Ｎｅｈｍｅ Ｒ，Ｍｕｅｈｌｅ Ｊ，Ｗｅｉｎｅｒｔ Ｔ，Ｆｌｏｃｋ Ｔ，Ｎｏｇｌｙ Ｐ，Ｅｄｗａｒｄｓ Ｐ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ Ｂ，Ｇｒｕｈｌ Ｔ，Ｍａ Ｐ，Ｄｅｕｐｉ Ｘ，Ｓｔａｎｄｆｕｓｓ Ｊ，Ｔａｔｅ Ｃ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ Ｇ，“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｎｉ－Ｇｏ ｓｈｅｄｓ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｓｃｉ．Ａｄｖ．２０１８；４ ：ｅａａｔ ７０５２ １９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１８
■Ｔｓａｉ ＣＪ，Ｍａｒｉｎｏ Ｊ，Ａｄａｉｘｏ Ｒ，Ｐａｍｕｌａ Ｆ，Ｍｕｅｈｌｅ Ｊ，Ｍａｅｄａ Ｓ，Ｆｌｏｃｋ Ｔ，Ｔａｙｌｏｒ ＮＭ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ｉ，ＭａｔｉｌｅＨ，Ｄａｗｓｏｎ ＲＪ，Ｄｅｕｐｉ Ｘ，ＳｔａｈｌｂｅｒｇＨ，Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ Ｇ，“Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－Ｇαｉ－βγ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ ｔｏ ｔｈｅ Ｇβ ｓｕｂｕｎｉｔ”．Ｅｌｉｆｅ ２０１９ Ｊｕｎ ２８；８：ｅ４６０４１．Ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４６０４１
■Ｖａｎｄｅｍｏｏｒｔｅｌｅ，Ｇ．，Ｄｅ Ｓｕｔｔｅｒ，Ｄ．ａｎｄ Ｅｙｃｋｅｒｍａｎ，Ｓ．，“Ｒｏｂｕｓｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ａｎｄ ｒＡＡＶ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”．Ｂｉｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ ７（７）：ｅ２２１１（２０１７）．ＤＯＩ：１０．２１７６９／ＢｉｏＰｒｏｔｏｃ．２２１１．
■ｖａｎ Ｗｙｋ Ｍ．，Ｐｉｅｌｅｃｋａ－Ｆｏｒｔｕｎａ Ｊ．，Ｌｏｅｗｅｌ Ｓ．，Ｋｌｅｉｎｌｏｇｅｌ Ｓ．，“Ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ＯＮ Ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｂｌｉｎｄ Ｒｅｔｉｎａｓ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｏｐｓｉｎ ｍＧｌｕＲ６ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ－Ｔａｉｌｏｒｅｄ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｏｏｌ”．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｍａｙ ７；１３（５）：ｅ１００２１４３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００２１４３．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１５ Ｍａｙ．
■Ｚｈｕ Ｘ，Ｂｒｏｗｎ Ｂ，Ｌｉ Ａ，Ｍｅａｒｓ ＡＪ，Ｓｗａｒｏｏｐ Ａ，Ｃｒａｆｔ ＣＭ，“ＧＲＫ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ ａｎｄ Ｍ ｏｐｓｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃｏｎｅ ａｒｒｅｓｔｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｅ ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｒｅｔｉｎａ．”Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３ Ｊｕｌ ９，２３（１４）：６１５２－６０．

【0369】

本発明の現在好ましい実施形態が上に示され、説明されたが、本発明は、それらに限定されず、他の方法で以下の特許請求の範囲内において様々に具体化及び実施され得ることが明確に理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

2023504136000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-08-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外及び細胞内ループ（ＥＬ及びＩＬ）によって接続された７つの膜貫通ドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）を含むキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質であって、
第１の光感受性オプシン部分及び第２のＧＰＣＲ部分（標的ＧＰＣＲ部分）を含み、
前記オプシン部分は、発色団を共有結合する発色団ポケットと、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの少なくとも７アミノ酸下流に位置する切断部位を有する切断型Ｃ末端ドメインとを含み、
前記ＧＰＣＲ部分は、前記オプシン部分の前記切断型Ｃ末端ドメインの下流に位置するＣ末端ドメイン（標的－ＧＰＣＲ－ＣＴ）を含むことを特徴とするキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項2】

前記切断部位は、
－ ヘリックス８（Ｈ８）の遠位端、又は
－ パルミトイル化部位
に、又は、の下流に位置する、請求項１に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項3】

前記切断部位は、前記パルミトイル化部位の最大３３アミノ酸下流に位置する、請求項１又は２に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項4】

前記オプシンは、メラノプシン；ロドプシン；錐体オプシン;ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＬＷ及びＯＰＮ１ＭＷから選択される錐体オプシン；クラゲオプシン；ｃｕｂｏｐ及びＪｅｌｌｙＯＰから選択されるクラゲオプシン；ハエトリグモロドプシン（ＪＳＲ１）；パラピノプシン（ＰＰＯ）；ニューロプシン（ＯＰＮ５）；又はエンセファロプシン（ＯＰＮ３）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項5】

前記オプシン部分は、２つ以上の親オプシンに由来する、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項6】

前記オプシン部分は、前記切断部位までの親オプシン全体を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項7】

前記オプシン部分は、単安定若しくは双安定オプシン又は三安定オプシンに由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項8】

ａ）前記標的－ＧＰＣＲ－ＣＴが、前記親標的ＧＰＣＲの前記ＣＴの機能的変異体である、
ｂ）前記標的－ＧＰＣＲ－ＣＴが、前記ＮＰｘｘＹモチーフと、パルミトイル化部位までの任意のアミノ酸位置との間のＮ末端欠失を含む、又は
ｃ）前記標的－ＧＰＣＲ－ＣＴのＮ末端が、前記標的ＧＰＣＲ ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフに、若しくは、前記標的ＧＰＣＲ ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの上流にある、
請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項9】

前記標的－ＧＰＣＲ－ＣＴは、前記標的ＧＰＣＲタンパク質のＧＰＣＲシグナリング経路に光活性化をカップリングすることができる、請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項10】

前記標的ＧＰＣＲタンパク質は、クラスＣ ＧＰＣＲである、又は、前記標的ＧＰＣＲタンパク質は、ｍＧｌｕＲ６である、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項11】

前記オプシンがメラノプシンであり、且つ、前記標的ＧＰＣＲタンパク質がｍＧｌｕＲ６である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項12】

前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、以下の要素の群：
－ ゴルジ搬出シグナル；
－ 膜輸送配列、又は１Ｄ４タグである膜輸送配列；、及び
－ 蛍光タンパク質をコードする配列要素
から選択される１つ以上の配列要素をさらに含み、
前記１つ以上の選択された要素は、前記キメラオプシンＧＰＣＲ ＣＴのＣ末端に任意の順で独立して配置される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項13】

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項14】

配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、又はからなる、請求項１３に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項15】

前記アミノ酸配列は、
－ 保存的アミノ酸置換、
－ １～最大３、５、８又は１５アミノ酸の範囲の欠失、及び
－ １～最大３、５、８又は１５アミノ酸の範囲の挿入
から選択される１つ以上の変異を含む、前記配列のいずれか１つの変異体であり、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、前記標的ＧＰＣＲに特異的なＧアルファタンパク質の光活性化依存性結合を示す、請求項１３又は１４に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子。

【請求項17】

請求項１６に記載の核酸分子を含むベクター、又は、プロモーターに作動可能に連結されている、若しくは細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、若しくは双極細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核発現ベクター。

【請求項18】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２を含むＡＡＶ血清型の群から選択されるｒＡＡＶベクターである、請求項１７に記載のベクター。

【請求項19】

請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする請求項１６に記載の核酸分子、又は請求項１７若しくは１８に記載のベクターを含む、医薬組成物。

【請求項20】

治療に使用するための、又は遺伝子治療である治療に使用するための、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

視力の改善に使用するための、部分的若しくは完全な失明の処置に使用するための、網膜色素変性症（ＲＰ）の処置に使用するための、黄斑変性症の処置に使用するための、又は他の形態の光受容体変性の処置に使用するための、請求項１９に記載の医薬組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０３６９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0369】

本発明の現在好ましい実施形態が上に示され、説明されたが、本発明は、それらに限定されず、他の方法で以下の特許請求の範囲内において様々に具体化及び実施され得ることが明確に理解されるべきである。

本発明は、以下の態様を提供しうる。
[１]
細胞外及び細胞内ループ（ＥＬ及びＩＬ）によって接続された７つの膜貫通ドメイン（ＴＭ１～ＴＭ７）を含むキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質であって、
上流オプシンの光感受性オプシン部分を含み、
前記上流オプシン部分は、発色団を共有結合する発色団ポケットを含み、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、第２のＧＰＣＲタンパク質（標的ＧＰＣＲタンパク質）の第２のＧＰＣＲ部分（標的ＧＰＣＲ部分）を含み、
前記標的ＧＰＣＲ部分は、Ｃ末端ドメイン（標的－ＧＰＣＲ－ＣＴ）を含む、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質において、
前記上流オプシン部分は、上流オプシンＣＴの近位領域（Ｏ－ＣＴ近位領域）の遠位端又はその下流に位置する切断部位を有する切断型Ｃ末端ドメイン（切断型オプシンＣＴ）をさらに含み、
前記Ｏ－ＣＴ近位領域は、ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ及び遠位方向に続く７～１３アミノ酸を含み、
それにより、前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、キメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含み；
前記標的ＧＰＣＲ－ＣＴは、前記切断型オプシンＣＴの下流に位置することを特徴とするキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。
[２]
前記Ｏ－ＣＴ近位領域の前記遠位端は、
－ ヘリックス８（Ｈ８）の遠位端、
－ パルミトイル化部位、又は
－ ウシロドプシンのパルミトイル化部位に対応する位置
を含む群から選択される位置に位置する、上記[１]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３]
前記Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端に前記上流オプシンＣＴの前記切断部位を含み、
前記Ｏ－ＣＴ近位領域への前記遠位伸長は、前記Ｏ－ＣＴ近位領域の前記遠位端の下流又は特に前記パルミトイル化部位の下流に最大５、若しくは最大１０、若しくは最大１６、若しくは最大２２又は最大２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４若しくは３５アミノ酸を含む、上記[１]又は[２]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[４]
前記上流オプシンは、メラノプシンの群から選択される、上記[３]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[５]
前記上流オプシンは、少なくとも５０、６５、８０、１００、１５０又は２００アミノ酸の長さを有するＣＴを含むオプシンの群から選択される、上記[３]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[６]
前記上流オプシン部分は、前記切断部位までの前記上流オプシン全体を含むか、又は前記上流オプシン部分は、Ｅ（ＤＲＹ）モチーフから前記切断部位までの前記上流オプシンの連続領域を含むか、又は
前記上流オプシン部分は、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６及びＴＭ７と、任意選択により前記切断部位までの前記切断型オプシンＣＴとを含む、上記[１]～[５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[７]
前記上流オプシン部分は、膜貫通ドメインＴＭ３及びＴＭ７を含み、特に膜貫通ドメインＴＭ３～ＴＭ７、ＴＭ２～ＴＭ７又はＴＭ１～ＴＭ７を含む、上記[１]～[６]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[８]
前記上流オプシン部分は、ＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３及びＮＴから選択される細胞外ドメインの１つ以上を含む、上記[１]～[７]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[９]
前記上流オプシン部分は、２つ以上の親オプシン、特に２つの親オプシンに由来する、上記[１]～[８]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１０]
前記上流オプシン部分は、非ヒトオプシンである親オプシンに由来する膜貫通ドメインを含み、
前記上流オプシン部分は、ヒトオプシンである親オプシンに由来する１つ、又は２つ、又は３つ、又は全ての細胞外ドメインをさらに含む、上記[１]～[９]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１１]
ＴＭ７及び前記切断型オプシンＣＴは、同じ親オプシンに由来する、上記[１]～[１０]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１２]
前記上流オプシン部分は、前記細胞外ドメインの全て、前記膜貫通ドメインの全て及び全ての細胞内ループを含む、上記[１]～[１１]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１３]
前記上流オプシン部分は、前記上流オプシンＣＴの前記切断部位までの親上流オプシン全体を含む、上記[１]～[１２]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１４]
前記上流オプシン部分は、単安定若しくは双安定オプシン又は三安定オプシン、特に双安定オプシンに由来する、上記[１]～[１３]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１５]
前記上流オプシン部分は、
－ メラノプシン（ＯＰＮ４）、
－ ロドプシン（ＲＨＯ）、
－ 錐体オプシン（ＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＬＷ及びＯＰＮ１ＭＷ）、
－ クラゲオプシン（ｃｕｂｏｐ、ＪｅｌｌｙＯＰ）、
－ ハエトリグモロドプシン（ＪＳＲ１）、
－ パラピノプシン（ＰＰＯ）、
－ ニューロプシン（ＯＰＮ５）、
－ エンセファロプシン（ＯＰＮ３）
を含むオプシンの群から選択される親オプシンに由来する、上記[１]～[１４]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１６]
特に１つ以上のアミノ酸の欠失、特にＮＰｘｘＹモチーフと、パルミトイル化部位まで又は前記パルミトイル化部位に近位に隣接するアミノ酸位置までの任意のアミノ酸位置との間のＮ末端欠失を含む、親標的ＧＰＣＲのＣＴの機能的変異体である標的ＣＴを含む、上記[１]～[１５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１７]
前記標的ＧＰＣＲ部分は、非オプシンＧＰＣＲに由来するか、又は標的オプシンと呼ばれる第２のオプシンに由来する、上記[１]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１８]
前記標的ＣＴ部分は、
特に、
－ 錐体オプシン、特にＯＰＮ１ＳＷ、ＯＰＮ１ＭＷ又はＯＰＮ１ＬＷ、
－ セロトニン受容体、特に５－ＨＴ７、
－ ミューオピオイド受容体、
－ βアドレナリン受容体、特にベータ１アドレナリン受容体、ベータ２アドレナリン受容体及びベータ３アドレナリン受容体
を含む群から選択されるクラスＡ ＧＰＣＲ；
特に、
－ ホルモン受容体、特にグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）
を含む群から選択されるクラスＢ ＧＰＣＲ；
特に、
－ ＧＡＢＡ _Ｂ 受容体、特にＧＡＢＡ _Ｂ１ 及びＧＡＢＡ _Ｂ２ 、
－ 代謝型グルタミン酸受容体、特にｍＧｌｕＲ６及びｍＧｌｕＲ５受容体
を含む群から選択されるクラスＣ ＧＰＣＲ
を含むＧＰＣＲタンパク質の群から選択される親標的ＧＰＣＲに由来する、上記[１]～[１７]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[１９]
前記標的ＧＰＣＲは、クラスＡ ＧＰＣＲ若しくはクラスＢ ＧＰＣＲ又はクラスＣ ＧＰＣＲを除く別のクラスのＧＰＣＲのＧＰＣＲであり、任意選択により、前記標的ＧＰＣＲ部分は、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループを含む、上記[１]～[１８]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質。
[２０]
前記標的ＧＰＣＲタンパク質は、クラスＣ ＧＰＣＲ、特にｍＧｌｕＲ６であり、前記クラスＣ標的ＧＰＣＲ部分は、任意選択により、以下の基準：
Ａ：前記キメラＧＰＣＲにおいて、前記上流オプシン部分に含まれる天然サイズのＩＬ３と、その天然位置に対応する位置における前記クラスＣ ＧＰＣＲの天然サイズのＩＬ２との同時存在は、除外されること；
Ｂ：前記上流オプシン部分は、前記細胞内ループＩＬ１～ＩＬ３の全てを含むこと；
Ｃ：前記上流オプシン部分は、ＩＬ１を含み、及び前記標的ＧＰＣＲ部分は、対応する位置で前記上流オプシンＩＬ２及びＩＬ３を置き換えるＩＬ２及びＩＬ３の両方を含むことの１つが満たされることを条件として、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される１つ以上の細胞内ループを含む、上記[１]～[１９]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２１]
前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、以下の要素の群：
－ ゴルジ搬出シグナル、
－ 膜輸送配列、
－ 蛍光タンパク質をコードする配列要素
から選択される１つ以上の配列要素をさらに含み、
前記１つ以上の選択された要素は、前記キメラオプシンＧＰＣＲ ＣＴのＣ末端に任意の順で独立して配置される、上記[１]～[２０]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２２]
前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、選択されたものとして、搬出シグナル、特に小胞体搬出シグナル、より具体的には配列番号８６によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、Ｋｉｒ２．１からの前記小胞体搬出シグナル又は特にゴルジ搬出シグナル、より具体的には配列番号８５によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、カリウムチャネルＫｉｒ２．１からの前記ゴルジ搬出シグナルを含む、上記[１]～[２１]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２３]
前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、選択された配列要素として、特にオプシンからの、より具体的にはロドプシンからの、最も具体的には配列番号８７によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる膜輸送配列を含む、上記[１]～[２２]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２４]
前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴは、蛍光タンパク質をコードする選択された配列要素、特にｍＫａｔｅ２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５又はｍＳｃａｒｌｅｔを含み、
前記蛍光タンパク質は、前記キメラオプシンＧＰＣＲの前記ＣＴに直接融合されているか、又はＩＲＥＳ又はＴ２Ａ配列を介して連結されているかのいずれかである、上記[１]～[２３]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２５]
前記標的ＧＰＣＲ部分は、ＩＬ１をさらに含み、前記標的ＧＰＣＲのＩＬ１は、前記上流オプシンのＩＬ１を置き換える、上記[１]～[２４]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２６]
前記上流オプシンのＩＬ３は、前記標的ＧＰＣＲのＩＬ３によって置き換えられるか；又は
前記上流オプシンのＩＬ３は、キメラＩＬ３によって置き換えられ、前記標的ＧＰＣＲのＩＬ３は、前記オプシンＩＬ３内の可変領域を置き換える、上記[１]～[２５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２７]
特に、前記標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、前記標的ＣＴは、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ又はその上流に近位端を含む、上記[１]～[２６]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２８]
前記標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、ｍＧｌｕＲ６のＩＬ３は、前記オプシンＩＬ３の可変領域を部分的に置き換え、それによりキメラＩＬ３を形成する、上記[１]～[２７]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[２９]
前記標的ＧＰＣＲは、ｍＧｌｕＲ６であり、
前記上流オプシン部分は、ＩＬ１、ＩＬ２及びＩＬ３から選択される前記細胞内ループの１つ以上をさらに含み、
ただし、上流オプシン－ｍＧｌｕＲ６キメラタンパク質において、前記上流オプシン部分に含まれる天然サイズのＩＬ３と、ｍＧｌｕＲ６部分に含まれる天然サイズのＩＬ２との同時存在は、除外されることを条件とする、上記[１]～[２８]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３０]
前記上流オプシン部分は、メラノプシンに由来し、且つＮＴ、ＥＬ１～ＥＬ３、ＴＭ１～ＴＭ７、ＩＬ１及び前記切断型オプシンＣＴを含み、前記標的ＧＰＣＲ部分は、ｍＧｌｕＲ６に由来し、且つＩＬ２、ＩＬ３及びＣＴを含むか、又は前記標的ＧＰＣＲ部分は、ｈＯＰＮ１ｍｗに由来し、且つＩＬ２、ＩＬ３及びＣＴを含む、上記[１]～[２９]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３１]
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記[１]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３２]
配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、上記[３１]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３３]
前記アミノ酸配列は、
－ 保存的アミノ酸置換、
－ １～最大３、５、８又は１５アミノ酸の範囲の欠失、
－ １～最大３、５、８又は１５アミノ酸の範囲の挿入
から選択される１つ以上の変異を含む、前記配列のいずれか１つの変異体であり、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質は、前記標的ＧＰＣＲに特異的なＧアルファタンパク質の光活性化依存性結合を示す、上記[３５]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３４]
前記アミノ酸配列は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する、前記配列のいずれかの１つの変異体である、上記[３５]又は[３６]に記載のキメラオプシンＧＰＣＲ。
[３５]
親オプシンＣＴ及び親標的ＧＰＣＲ ＣＴに由来するキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）、特に上記[１]～[３４]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質の前記キメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含むペプチドであって、
特にヘリックス８（Ｈ８）及びそれぞれウシロドプシンのＣ３２２又はＣ３２３に対応するパルミトイル化部位を含み、且つ前記オプシンの前記パルミトイル化部位の下流に最大３３、３４又は３５アミノ酸を任意選択によりさらに含む、前記ＣＴの近位領域を含むオプシンの切断型Ｃ末端ドメイン（切断型オプシン－ＣＴ）を含み、
標的ＧＰＣＲのＣ末端ドメイン（標的ＧＰＣＲ ＣＴ）又はその機能的変異体、特に機能的フラグメントをさらに含み、前記標的ＧＰＣＲ ＣＴは、前記切断型オプシンＣＴの下流に位置する、ペプチド。
[３６]
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はペプチドをコードする核酸分子。
[３７]
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０及び配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４を含む群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列からなるキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸配列を含む、上記[３６]に記載の核酸分子。
[３８]
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列と少なくとも７０％、又は８０％、又は９０％同一である核酸配列を含む、上記[３６]に記載の核酸分子。
[３９]
配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなる、上記[３６]に記載の核酸分子。
[４０]
上記[３５]～[３９]のいずれかに記載の核酸分子を標的細胞に送達するための医学的治療において使用するためのＡＡＶカプシドポリペプチド。
[４１]
ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）又はＡＡＶ８（ＢＰ２）のカプシドタンパク質である、上記[４０]に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。
[４２]
ＡＡＶ２カプシドポリペプチドであり、且つ野生型ＡＡＶ２のアミノ酸５８７及び５８８間にアミノ酸インサートを含み、
前記ペプチドインサートは、
－ ＳＡＳＥＡＳＴ（配列番号６０）、
－ ＴＰＰＳＩＴＡ（配列番号６１）、
－ ＰＲＴＰＨＴＡ（配列番号６２）、
－ ＮＨＡＰＮＨＣ（配列番号６３）
を含むペプチド配列の群から選択される配列を含むか又はそれからなる、上記[４１]に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。
[４３]
前記ＡＡＶ２カプシドは、７～１３アミノ酸のポリペプチドを含み、
特に、前記ペプチドインサートは、上記[４２]に記載のペプチドインサートを含み、且つ１つ又は２つの隣接リンカーをさらに含み、
前記リンカーは、前記リンカー中のアミノ酸の総数が６アミノ酸を超えないことを条件として、いずれかの側に最大１、２、３、４又は５つのアミノ酸を含み、
特に、前記リンカーは、いずれかの側に２つ又は３つのアミノ酸を含み、
前記リンカーは、
ｉ．アミノ酸Ｇ及びＡ、又は
ｉｉ．アミノ酸Ａ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｎ、Ｌ及びＲ、特にＡ、Ｌ、Ｎ、Ｒ
から選択されるアミノ酸を含むか又はそれからなり、より具体的には、前記アミノ酸の少なくとも１つは、Ｎ及びＲから選択される、上記[４１]又は[４２]に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。
[４４]
野生型ＡＡＶ２のＮ５８７及びＲ５８８間において、
－ ＡＡＡＳＡＳＥＡＳＴＡＡ（配列番号６４）、
－ ＡＡＡＴＰＰＳＩＴＡＡＡ（配列番号６５）、
－ ＡＡＡＰＲＴＰＨＴＡＡＡ（配列番号６６）、
－ ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ（配列番号６７）、
－ ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ（配列番号６８）
から選択されるペプチドインサートを含む、上記[４３]に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド。
[４５]
野生型ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）の５８７～５９２の位置、特にＡＡＶ血清型２のＮ５８７～Ｒ５８８の位置又は別の血清型のＡＡＶのそれに相同な位置にペプチドインサートを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、前記ペプチドインサートは、
[化１]

を含む配列の群から選択される、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
[４６]
ａ．アミノ酸位置２５２、２７２、４４４、５００、７００、７０４及び／又は７３０のチロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）；及び／又は
ｂ．アミノ酸位置４９１のスレオニン（Ｔ）からバリン（Ｖ）
から選択される突然変異の１つ以上を含む、上記[４０]～[４４]のいずれかに記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド又は上記[４５]に記載のＡＡＶカプシド。
[４７]
特に、配列番号７４によるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、上記[４２]に記載の使用のためのＡＡＶカプシドポリペプチド又は上記[４５]若しくは上記[４５]及び[４６]に記載のＡＡＶカプシド。
[４８]
上記[４０]～[４７]のいずれかに記載のＡＡＶカプシドをコードする核酸分子。
[４９]
ＡＡＶ２、ＡＡＶ２（７ｍ８）、又はＡＡＶ８（ＢＰ２）、又はＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）、又はＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）から選択されるカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる、上記[４８]に記載の核酸分子。
[５０]
－ ＡＡＡＳＡＳＥＡＳＴＡＡ（配列番号６４）、
－ ＡＡＡＴＰＰＳＩＴＡＡＡ（配列番号６５）、
－ ＡＡＡＰＲＴＰＨＴＡＡＡ（配列番号６６）、
－ ＮＬＡＮＨＡＰＮＨＣＡＲ（配列番号６７）、
－ ＮＬＡＰＲＴＰＨＴＡＡＲ（配列番号６８）
から選択される、ＡＡＶ２ゲノムのＮ５８７及びＲ５８８間のペプチドインサートを有するアミノ酸配列を含むカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むか又はそれからなる、上記[４８]又は[４９]に記載の核酸分子。
[５１]
導入遺伝子を含み、特に、前記導入遺伝子は、キメラオプシンＧＰＣＲをコードし、且つ特に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９及び配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９及び配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなる、上記[４８]～[５０]のいずれかに記載の核酸分子。
[５２]
配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される核酸配列を含むか又はそれからなるｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６キメラＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む、上記[４８]～[５１]のいずれかに記載の核酸分子。
[５３]
細胞特異的プロモーターを含み、
前記細胞特異的プロモーターは、前記導入遺伝子に作動可能に連結されており、
前記細胞特異的プロモーターは、特にＯＮ双極細胞特異的プロモーターであり、より具体的には２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター、配列番号７５による７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター若しくは配列番号７６による４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター又は網膜ＯＮ双極細胞若しくはその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーターを含む群から選択される、上記[５１]又は[５２]に記載の核酸分子。
[５４]
上記[４５]、又は上記[４５]及び[４６]、又は上記[４５]及び[４７]に記載のＡＡＶカプシドをコードする配列を含む組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）。
[５５]
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター、特にプロモーターに作動可能に連結されている、上記[３６]～[３９]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核発現ベクター。
[５６]
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、上記[５４]又は[５５]に記載のベクター。
[５７]
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２、特にＡＡＶ２又はＡＡＶ８を含むＡＡＶ血清型の群から選択される、上記[５４]～[５６]のいずれかに記載のベクター。
[５８]
－ ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列、及び／又は
－ プロモーター、特に細胞特異的プロモーター、より具体的には双極細胞特異的プロモーター
を含む配列の群から選択される核酸配列をさらに含む、上記[５４]～[５７]のいずれかに記載のベクター。
[５９]
特に、
－ ＧＲＭ６－ｓｖ４０プロモーター、
－ ４ｘＧＲＭ６－ｓｖ４０プロモーター、
－ ２００Ｅｎ－ｍＧｌｕＲ５００Ｐプロモーター、
－ ７７０Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター 配列番号７５、
－ ４４４Ｅｎ＿４５４Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーター 配列番号７６、及び
－ 網膜ＯＮ双極細胞又はその要素の内因性ｍＧｌｕＲ６プロモーター
を含むプロモーターの群から選択されるＯＮ双極細胞特異的プロモーターによって駆動される、上記[３５]～[３９]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子を含む、上記[５４]～[５８]のいずれかに記載のベクター。
[６０]
キメラメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６（Ｍｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６）、特にＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６若しくはＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６又はキメラＯＰＮ１ｍｗ－ｍＧｌｕＲ６或いは２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含む、上記[５４]～[５９]のいずれかに記載のベクター。
[６１]
導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は、
－ 特に配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される配列の１つによるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号１５によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号２９又は配列番号３１から選択される配列による、細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６
を含む群から選択されるキメラＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６をコードする、上記[５４]～[６０]のいずれかに記載のベクター。
[６２]
上記[４０]～[４７]のいずれか一項、特に上記[４３]～[４７]のいずれかに記載のＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を追加的に含む、上記[５４]～[６１]のいずれかに記載のベクター。
[６３]
前記キメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子に作動可能に連結された７７０Ｅｎ－４４５Ｐ（ｈＧＲＭ６）プロモーターを含み、
ＡＡＶ２（７ｍ８）、ＡＡＶ８（ＢＰ２）、ＡＡＶ２（ＮＨＡＰＮＨＣ）及びＡＡＶ２（ＰＲＴＰＨＴＡ）を含む群から選択されるカプシドをコードする核酸配列をさらに含み、特に、前記導入遺伝子は、
－ 上流オプシンとしてメラノプシン若しくはｈＯＰＮ１ｍｗを含み、且つ標的オプシンとしてｍＧｌｕＲ６を含むキメラオプシンＧＰＣＲ又は２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲ、
－ Ｍｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６又はＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６から選択されるキメラオプシンＧＰＣＲ、
－ 配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７、配列番号２９又は配列番号３１を含む群から選択される核酸配列によってコードされるキメラオプシンＧＰＣＲ
を含む群から選択される前記キメラオプシンＧＰＣＲをコードする、上記[５４]～[６２]の組み合わせによるベクター。
[６４]
配列番号７９による配列を有する核酸分子を含むか又はそれからなる、上記[５４]又は[５５]に記載のベクター。
[６５]
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の核酸分子を含むか、又は上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクターを含み、且つ／又は上記[１]～[３５]のいずれかに記載のオプシン－ＧＰＣＲタンパク質を含むトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウス又はトランスジェニック細胞。
[６６]
特に生殖細胞株を除く幹細胞株に由来するか、又は
－ ＨＥＫ２９３－ＧＩＲＫ細胞、
－ 網膜内層ニューロン、特にＯＮ双極細胞、
－ 腎臓細胞、及び
－ Ｇｓ、Ｇｑ又はＧ _{１２／１３} から選択されるＧタンパク質を発現する細胞
を含む細胞株の群から特に選択される器官型細胞株に由来する、上記[６０]に記載のトランスジェニック細胞。
[６７]
ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ修飾ゲノムを含む、上記[６５]又は[６６]に記載のトランスジェニック動物又はトランスジェニック細胞。
[６８]
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の核酸分子若しくは上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクター
を含む担体であって、
前記核酸分子又は前記ベクターは、前記キメラオプシンＧＰＣＲをコードする導入遺伝子を含み、
前記担体は、前記キメラオプシンＧＰＣＲの標的細胞又はヒト若しくは非ヒト動物への導入に適しており、
任意選択により、前記担体は、小胞、粒子、マイクロ粒子、ナノ粒子及び金粒子を含む群から選択される、担体。
[６９]
前記導入遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓカセットを含む、上記[６８]に記載の導入のための担体。
[７０]
キメラメラノプシン－ｍＧｌｕＲ６（Ｍｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６）、特にＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６若しくはＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６又はキメラＯＰＮ１ｍｗ－ｍＧｌｕＲ６或いは２つのオプシンを含むキメラオプシンＧＰＣＲをコードする前記導入遺伝子を含む、上記[６５]～[６７]のいずれかに記載のトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック細胞又は上記[６８]若しくは[６９]に記載の導入のための担体。
[７１]
前記導入遺伝子は、
－ 特に配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５及び配列番号２７を含む群から選択される配列の１つによるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号１５によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号２９又は配列番号３１から選択される配列による、細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６
を含む群から選択されるキメラＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６をコードする、上記[６５]～[６７]のいずれかに記載のトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック細胞又は上記[６８]若しくは[６９]に記載の導入のための担体。
[７２]
特に上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又はキメラペプチドをコードする核酸分子を遺伝子操作する方法であって、
前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質又は前記キメラペプチドは、切断型上流オプシンＣＴを含むキメラＣ末端ドメイン（キメラＣＴ）を含み、
前記キメラＣＴは、親上流オプシンＣＴ及び親標的ＧＰＣＲ ＣＴに由来し、
前記方法は、
Ａ－１ Ｏ－ＣＴ近位領域の遠位端のアミノ酸位置又は前記Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長内において、前記親上流オプシンの前記ＣＴの切断部位（ｘ）を選択するステップ、Ａ－２ 前記選択された切断部位で切断される切断型ＣＴを有する上流オプシン部分又はペプチドをコードする核酸分子を取得するステップ；
Ｂ－１ 前記親標的ＧＰＣＲ ＣＴの近位領域内、特にＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ若しくはその上流又はＮＰｘｘＹとＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフとの間において、切断部位（ｙ）を選択するステップ、
Ｂ－２ 標的ＧＰＣＲ ＣＴ又はその機能的変異体、特にその機能的フラグメントをコードする核酸分子を取得するステップ；及び
Ｃ－１ ステップＡ－２で取得された、前記切断型オプシン－ＣＴをコードする前記核酸分子を、ステップＢ－２で取得された、前記標的ＣＴ又は前記その機能的変異体をコードする前記核酸分子と融合させるステップ
を含む、方法。
[７３]
ステップＡ－１において、前記切断部位（ｘ）は、
－ 前記切断部位（ｘ）は、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフ又はその少なくとも７、若しくは８、若しくは９、若しくは１０、若しくは１１、若しくは１２、若しくは１３アミノ酸下流に位置するヌクレオチドに位置すること、
－ 前記切断部位（ｘ）は、パルミトイル化部位又はパルミトイル化部位に対応するアミノ酸の下流、特に遠位に隣接して位置すること、
－ 前記切断部位は、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４５、又は４７、又は４９ヌクレオチド下流に位置すること
を含む基準の群から選択される基準の１つ以上を満たす、上記[７２]に記載の遺伝子操作の方法。
[７４]
特に、前記上流オプシンは、メラノプシンであり、
ステップＡ－１において、前記切断部位（ｘ）は、
－ 前記切断部位（ｘ）は、Ｏ－ＣＴ近位領域の最大３０、又は３１、又は３２、又は３３、又は３４、又は３５アミノ酸下流、特に前記Ｏ－ＣＴ近位領域への遠位伸長の遠位端に位置すること、
－ 前記切断部位（ｘ）は、前記ＮＲ（Ｋ）Ｑモチーフの最大４５、又は４７、又は４９ヌクレオチド下流に位置すること、
－ 前記切断部位は、リン酸化部位の保存されたクラスターの下流のアミノ酸位置に、且つ特に保存されたリン酸化部位の前記クラスターの遠位端に遠位に隣接して位置することを含む基準の群から選択される基準の１つ以上を満たす、上記[７２]に記載の遺伝子操作の方法。
[７５]
ステップＡ－１で選択される、前記上流オプシンにおける前記切断部位ｘ及びステップＢ－１で選択される、前記標的ＧＰＣＲの前記切断部位ｙは、両方ともそのそれぞれのパルミトイル化部位若しくはパルミトイル化部位に対応するアミノ酸位置に位置するか、又は両方とも前記ＮＲ（Ｋ）Ｑ部位の７～１３、特に８～１２、より具体的には９～１１又は１０アミノ酸下流に位置する、上記[７２]に記載の遺伝子操作の方法。
[７６]
１つ以上の細胞内ループを置き換えるか又は部分的に置き換える、特に対応する位置において、前記上流オプシンの１つ以上の細胞内ループ又は部分的細胞内ループを、前記標的ＧＰＣＲの細胞内ループによって交換するための１つ以上の追加的なステップを含み、特に、１つ以上のスプライシング部位は、
－ ＩＬ１の交換のための接合部ａ及び接合部ｂ、
－ ＩＬ２の交換のための接合部ｃ及び接合部ｄ、
－ ＩＬ３の交換のための接合部ｅ及び接合部ｆ、
－ 前記標的ＧＰＣＲのＩＬ３との交換で前記上流オプシンＩＬ３の高度可変領域を除去する、ＩＬ３内の２つのスプライシング部位
を含む群から選択される、上記[７２]～[７５]のいずれかに記載の遺伝子操作の方法。
[７７]
ステップＡ及び又はステップＢ前に、
－ 任意選択により配列アライメントツールを使用して、前記オプシン又はそのフラグメントのアミノ酸配列を、前記標的ＧＰＣＲ又はそのフラグメントのアミノ酸配列とアラインするステップ、
－ 特に、
－ Ｅ（Ｄ）ＲＹ／ＮＲＩ、
－ ＩＬ３のＴＭ６との接合部の周辺のＥ、
－ ＮＰｘｘＹ、
－ ＮＲ（Ｋ）Ｑ、
－ パルミトイル化Ｃ、及び
－ 前記標的ＧＰＣＲもオプシンである場合、ＴＭ７の発色団の結合のためのＫ
を含む、保存されたモチーフの群から選択される保存されたモチーフを構成するアミノ酸位置を決定するステップ
を含む、前記親ＧＰＣＲをコードする核酸配列の一方又は両方における保存されたモチーフの同定を追加的に含み、
任意選択により、前記上流オプシンのアミノ酸配列は、保存されたモチーフを構成するアミノ酸位置の同定のために、ウシロドプシンのアミノ酸配列とアラインされる、上記[７２]～[７６]のいずれかに記載の遺伝子操作の方法。
[７８]
ステップＡ及び／又はステップＢ前に、二次／三次タンパク質構造を予測するためのプログラムに一次アミノ酸配列を入力するステップを含む、前記親オプシン及び前記親標的ＧＰＣＲの一方又は両方における保存された３Ｄ ＧＰＣＲドメイン又はサブドメイン、特にサブドメインヘリックス８の同定を追加的に含む、上記[７２]～[７７]のいずれかに記載の遺伝子操作の方法。
[７９]
医学的使用、特に遺伝子治療のための、
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
上記[４０]～[４７]のいずれかに記載のカプシド、又は
上記[４８]～[５３]のいずれかに記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクター、又は
上記[６５]～[７１]のいずれかに記載の担体若しくは細胞。
[８０]
上記[７９]に記載の使用のためのものであり、前記使用の目的は、視力の改善、部分的又は完全な失明の処置、網膜色素変性症（ＲＰ）の処置、黄斑変性症の処置及び他の形態の光受容体変性の処置を含む群から選択される、
キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
前記オプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子、又は
カプシド若しくは前記カプシドをコードする核酸分子、又は
ベクター、若しくは担体、若しくは細胞。
[８１]
上記[７９]又は[８０]に記載の使用のための、
キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
前記オプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子、又は
カプシド若しくは前記カプシドをコードする核酸分子、又は
ベクター、若しくは担体、若しくは細胞であって、
前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、特に、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、
キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
前記オプシンＧＰＣＲをコードする核酸分子、又は
カプシド若しくは前記カプシドをコードする核酸分子、又は
ベクター、若しくは担体、若しくは細胞。
[８２]
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
上記[４０]～[４７]のいずれかに記載のカプシド、又は
上記[４８]～[５３]のいずれかに記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクター、又は
上記[６５]～[７１]のいずれかに記載の担体若しくは細胞
を含む産物の群から選択される産物を含む医薬組成物であって、
任意選択により、前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、
任意選択により、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、医薬組成物。
[８３]
処置を必要とするヒト又は非ヒト動物を処置する方法であって、
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
上記[４０]～[４７]のいずれかに記載のカプシド、又は
上記[４８]～[５３]のいずれかに記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクター、又は
上記[６５]～[７１]のいずれかに記載の担体若しくは細胞
の投与を含み、
任意選択により、前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、
任意選択により、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、方法。
[８４]
視力を改善するための医学的治療、又は部分的若しくは完全な失明の処置、又は網膜色素変性症（ＲＰ）の処置、又は黄斑変性症の処置、又は他の形態の光受容体変性症の処置のための薬剤の製造における、
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
上記[４０]～[４７]のいずれかに記載のカプシド、又は
上記[４８]～[５３]のいずれかに記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクター、又は
上記[６５]～[７１]のいずれかに記載の担体若しくは又は細胞
の使用であって、
任意選択により、前記キメラオプシンＧＰＣＲは、キメラオプシンｍＧｌｕＲ６ ＧＰＣＲ又は上流オプシン及び標的オプシンを含むキメラＧＰＣＲから選択され、
任意選択により、前記標的オプシンは、錐体オプシン又はロドプシンである、使用。
[８５]
上記[１]～[３５]のいずれかに記載のキメラオプシンＧＰＣＲタンパク質、又は
上記[３６]～[３９]のいずれかに記載の前記オプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸分子、又は
上記[４０]～[４７]のいずれかに記載のカプシド、又は
上記[４８]～[５３]のいずれかに記載の前記カプシドをコードする核酸分子、又は
上記[５４]～[６４]のいずれかに記載のベクター、又は
上記[６５]～[７１]のいずれかに記載の担体若しくは細胞
を含む産物の群から選択される産物を含み、
前記産物は、キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質を含むか、又は前記キメラオプシンＧＰＣＲタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含み、
前記キメラオプシンＧＰＣＲは、
－ 特に配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号２８を含む群から選択される配列によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号１６によるＭｅｌａ（ｐａｌｍ＋３３）－ｍＧｌｕＲ６、又は
－ 特に配列番号３０又は配列番号３２から選択される配列による、細胞内ループを追加的に含むＭｅｌａ－ｍＧｌｕＲ６
を含む群から選択される、上記[７９]～[８４]のいずれかに記載の医療用途。

【国際調査報告】