特表2023-504186標的化された核酸送達のためのペプチドドッキング賦形剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】標的化された核酸送達のためのペプチドドッキング賦形剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20230125BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20230125BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20230125BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230125BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230125BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20230125BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20230125BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20230125BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230125BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230125BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230125BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20230125BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230125BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20230125BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230125BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20230125BHJP
C07K 5/117 20060101ALI20230125BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20230125BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20230125BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230125BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20230125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
A61K31/7105
A61K31/711
A61P35/00
A61P35/04
A61K31/7125
A61K31/712
A61K47/04
A61K47/26
A61K48/00
A61P43/00 105
A61K47/65
A61K47/54
C07H21/04 Z
A61P1/16
C07H21/02
C07K5/117
C07K7/08
C07K7/06
C12N15/11 Z ZNA
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022533064
(86)(22)【出願日】2020-12-07
(85)【翻訳文提出日】2022-07-26
(86)【国際出願番号】 US2020063676
(87)【国際公開番号】W WO2021113851
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】62/945,042
(32)【優先日】2019-12-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509127310
【氏名又は名称】サーナオミクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ルー， シャオヤン
(72)【発明者】
【氏名】ルー， パトリック ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】エヴァンズ， デーヴィッド エム．
【テーマコード（参考）】
4B065
4C057
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA91X
4B065AA93X
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4C086ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA51
4H045BA54
4H045EA60
4H045FA34
(57)【要約】
ｓｉＲＮＡ分子などの治療化合物及び標的化リガンドを含有するペプチドドッキング賦形剤組成物が、それらの調製及び使用のための方法と共に提供される。組成物及び方法は、増強された治療の利益をもたらすために標的化リガンドを化合物に連結することによって、対象への治療化合物の標的化された細胞／組織送達を可能にする。対象は、動物又はヒトであり得る。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）標的化部分及び（ｂ）第１の治療用オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したペプチドドッキング賦形剤（ＰＤｏＶ）を含む化学的構成体。
【請求項2】
第１の治療用オリゴヌクレオチドと同じ又は異なる第２の治療用オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の構成体。
【請求項3】
ＰＤｏＶがヒスチジン及びリジンの複数の反復単位を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項4】
標的化部分がアシアロ糖タンパク質受容体に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項5】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、デコイオリゴヌクレオチド、又はＣｐＧモチーフを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項6】
前記治療用オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ分子である、請求項５に記載の構成体。
【請求項7】
ＰＤｏＶ構成体が、同じ若しくは異なる少なくとも２つの標的化部分及び／又は同じ若しくは異なる少なくとも２つの治療用オリゴヌクレオチドを含むエンドソーム放出モチーフを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項8】
以下に示される構造のうちの１つを有し、式中、Ｘ型部位は、標的化リガンドをコンジュゲートするために使用され、Ｙ型部位は、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートするために使用され、Ｘ及びＹは、同じであっても異なっていてもよく、Ａは、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫのペプチド配列、又は最大約５個のアミノ酸を含む任意の他のエンドソーム放出の短いペプチドであり、Ｂは、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫのペプチド配列、又は最大約５個のアミノ酸を含む任意の他の短いペプチド、任意の他のアミノ酸、若しくはリンカーとのアミノ酸の組み合わせであり、Ｄはオリゴヌクレオチドであり、ＲＬはリガンドであり、ＲＳは、オリゴヌクレオチドに対するリンカーである、請求項１から７のいずれか一項に記載の構成体。【請求項9】
ＤがｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はアプタマーである、請求項８に記載の構成体。
【請求項10】
ＰＤｏＶペプチド構成体が、ＫＨＨＨＣＫＨ、ＨＫＨＨＨＣＫＨ、ＨＨＫＨＨＨＣＫＨ、ＨＨＨＫＨＨＨＫＣＨＨＨＫＨＨＨ、ＨＨＨＫＨＨＣＫＨＨＨ、ＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨ、ＨＫＨＨＣＫＨ、ＨＫＨＣＨ、ＨＫＨＣＫＨ、ＨＫＨＣ、ＨＨＨＫ（Ｓ）ＨＨＣＫＨＨＨ及びＨＨＫ（Ｓ）ＨＨＫＣＨＨ（Ｓ）ＨＨＨからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む構造を有し、ＲＬがシステイン残留物の側鎖に結合し、ＲＳがリジン残留物の側鎖に結合しており、（Ｓ）が：【請求項10】
ＰＤｏＶペプチド構成体が以下の構造を有し、【請求項11】
リガンド部分ＲＬが、リンカー－１を含み、リンカー－１が、以下の構造：のうちの１つを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項12】
ＰＤｏＶペプチドに結合したリガンド間のリンカーが、ポリエチレングリコール鎖－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－又は－（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ－鎖を含み、ｎが２～１５の整数である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項13】
リガンドＲＬが、チオエーテル、アミド、又はトリアゾール結合を含むリンカーを介してＰＤｏＶペプチドに結合している、請求項１から１２のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項14】
オリゴヌクレオチドが、構造Ｒｓ－リンカー２－オリゴヌクレオチドを有する部分を介して連結されており、リンカー２が、脂肪族鎖、ポリエチレングリコール鎖、疎水性脂質鎖又は親水性鎖であり、末端部位の基２は、ｓｉＲＮＡ末端との化学的コンジュゲーションのための反応部位である、請求項１に記載の構成体。
【請求項15】
【請求項16】
オリゴヌクレオチドが、１０～２９の長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであるＲＮＡｉ分子である、請求項１に記載の構成体。
【請求項17】
オリゴヌクレオチドが、それぞれ１０～２９塩基又は１９～２７塩基の長さを有する２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖を含むｓｉＲＮＡ分子である、請求項６に記載の構成体。
【請求項18】
オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の構成体。
【請求項19】
オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項20】
ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項21】
オリゴヌクレオチドが、２’位に少なくとも１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項22】
化学修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アリル又は２’－Ｈ修飾ヌクレオチドを含む、請求項２８に記載の構成体。
【請求項23】
オリゴヌクレオチドが、【請求項24】
ｓｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドが、位置５’又は３’でリンカー３でさらに化学修飾されており、リンカー３が、リンカー２と共有結合的に反応してリガンド－ＰＤｏＶ及びヌクレオチドを連結することができる相補的なコンジュゲーション部位の基３を含有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項25】
以下に示す【請求項26】
標的化リガンドが、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルマール－ガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ブタノイルガラクトサミン、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項１から３２のいずれか先行する一項に記載の構成体。
【請求項27】
標的化リガンドがＮ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、請求項２６に記載の構成体。
【請求項28】
標的化リガンドが、環状（ｃ）ＲＧＤ、ＡＰＲＰＧ、ＮＧＲ、Ｆ３ペプチド、ＣＧＫＲＫ、ＬｙＰ－１、ｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＲＣＰＤＣ）、ｉＮＧＲ、Ｔ７ペプチド（ＨＡＩＹＰＲＨ）、ＭＭＰ２切断可能オクタペプチド（ＧＰＬＧＩＡＧＱ）、ＣＰ１５（ＶＨＬＧＹＡＴ）、ＦＳＨ（ＦＳＨ－β、３３～５３アミノ酸、ＹＴＲＤＬＶＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦ）、ＬＨＲＨ（ＱＨＴＳＹｋｃＬＲＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）（ＣＧＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ）、ＲＶＧ（ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）、ＦＭＤＶ２０ペプチド配列（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ）、及びＧＬＰからなる群から選択されるペプチドであるか、又は葉酸である、請求項１に記載の構成体。
【請求項29】
標的化リガンドがＲＧＤ又はＧＬＰである、請求項２８に記載の構成体。
【請求項30】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の構成体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項31】
薬学的に許容される担体が、ヒスチジン－リジンリッチポリペプチドＨＫＰ、ＨＫＰ（Ｈ）、又はリポフェクタミンを含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項32】
薬学的に許容される担体が、水と、リン酸カリウム一塩基性無水ＮＦ、塩化ナトリウムＵＳＰ、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物ＵＳＰ、グルコース、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる群の１つ又は複数とを含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項33】
細胞にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、細胞を請求項１に記載の構成体と接触させることを含む、方法。
【請求項34】
肝細胞の細胞にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、細胞を請求項４に記載の構成体と接触させることを含む、方法。
【請求項35】
オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ分子であり、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物の細胞又は肝細胞に送達される、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
細胞がヒト細胞である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
哺乳動物の細胞又は肝細胞がヒト細胞又は肝細胞である、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
哺乳動物における遺伝子治療の方法であって、治療的有効量の請求項１から２９のいずれか一項に記載の構成体、又は請求項３０から３２に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含み、哺乳動物が場合によりヒトである、方法。
【請求項39】
ペプチドが、アミノ酸配列－ＨＨＫ、－ＫＨＨ、－ＨＨＨ、－ＨＨＨＫ、－ＫＨＨＨ、－ＨＨＨＨＫ、－ＫＨＨＨＨ、－Ｋ（ＨＨＨＫ）ｎ（ｎ＝１～８）、－Ｋ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ（ｎ＝１～４、ｍ＝１～８）、Ｋ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ－（ｎ＝１～４、ｍ＝１～８）を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の構成体。
【請求項40】
配列－Ｋ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ又はＫ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ－を有するペプチドを含み、式中ｎは１であり、ｍは３である、請求項３９に記載の構成体。
【請求項41】
ペプチドがエンドソーム放出ペプチドである、請求項５２に記載の構成体。
【請求項42】
ペプチドが細胞透過性ペプチドである、請求項５２に記載の構成体。
【請求項43】
式（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑを有するペプチドであり、式中、Ｈはヒスチジンであり、Ｋはリジンであり、Ｘ及びＹはアミノ酸及びリンカーから選択される官能性単位であり、ｎは１～１０であり、ｍは１～１０であり、ｏは１～１０であり、ｐは１～５であり、ｑは１～４である、ペプチド。
【請求項44】
標的化リガンドを結合させるための少なくとも２つのコンジュゲーション部位を含む、請求項４３に記載のペプチド。
【請求項45】
コンジュゲーション部位がリジン又はシステインである、請求項４４に記載のペプチド。
【請求項46】
オリゴヌクレオチドを結合させるための少なくとも２つのコンジュゲーション部位を含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項47】
請求項４３から４６のいずれか一項に記載のペプチドと、ペプチドに少なくとも１つのコンジュゲーション部位で連結された少なくとも１つの標的化リガンドとを含む化学的構成体。
【請求項48】
請求項４３から４６のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項４７に記載の構成体と、ペプチドに少なくとも１つのコンジュゲーション部位で連結された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを含む、化学的構成体。
【請求項49】
標的化リガンドが、環状（ｃ）ＲＧＤ、ＡＰＲＰＧ、ＮＧＲ、Ｆ３ペプチド、ＣＧＫＲＫ、ＬｙＰ－１、ｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＲＣＰＤＣ）、ｉＮＧＲ、Ｔ７ペプチド（ＨＡＩＹＰＲＨ）、ＭＭＰ２切断可能オクタペプチド（ＧＰＬＧＩＡＧＱ）、ＣＰ１５（ＶＨＬＧＹＡＴ）、ＦＳＨ（ＦＳＨ－β、３３～５３アミノ酸、ＹＴＲＤＬＶＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦ）、ＬＨＲＨ（ＱＨＴＳＹｋｃＬＲＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）（ＣＧＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ）、ＲＶＧ（ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）、ＦＭＤＶ２０ペプチド配列（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ）、及びＧＬＰからなる群から選択される、請求項１から２９のいずれか一項に記載の化学的構成体。
【請求項50】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、デコイオリゴヌクレオチド、及びＣｐＧモチーフからなる群から選択される、請求項１から２９又は４９のいずれか一項に記載の化学的構成体。
【請求項51】
オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はｍｉＲＮＡである、請求項５０に記載の化学的構成体。
【請求項52】
請求項１から２９又は４９から５１のいずれか一項に記載の構成体の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてがんを治療する方法。
【請求項53】
がんが固形腫瘍である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
がんが、肝臓がん、結腸がん、及び膵臓がんからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項55】
がんが肝臓がんであり、肝細胞癌、転移性結腸がん、及び転移性膵臓がんからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
哺乳動物がヒトである、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
構成体が、がん細胞を含む腫瘍に直接注射される、請求項５２から５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
単一又は複数の核酸がエンドソーム放出ペプチドに共有結合的にコンジュゲートされ、さらに少なくとも１つの小分子リガンドに共有結合的に連結される送達システムが提供される。重要な新規組成物が、それらの調製及び使用のための方法と共に提供される。選択されたリガンド及びリンカーを用いて、組成物及びシステムは、肝臓及び他の組織への核酸分子の標的化された送達を提供する。
【背景技術】
【0002】
二本鎖ＲＮＡは遺伝子発現をサイレンシングすることが示されており（Ｆｉｒｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６－８１１（１９９８），ａｎｄ Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４－４９８（２００１））、この現象はＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」、又は干渉ＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）と呼ばれている。短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘導ＲＮＡｉ調節は、がんから、薬になり得ない他の伝統的な疾患までの多種多様なヒトの疾患を治療する大きな潜在可能性を示している。ＲＮＡベースの治療薬には、従来の小分子及び抗体治療薬を上回る３つの主な利点がある。第１に、特定の細胞型又は組織への送達が考案されると（例えば、肝細胞へのｓｉＲＮＡ／アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）送達、中枢神経系へのＡＳＯ送達）、その細胞型におけるすべての疾患促進遺伝子が標的化され得る見込みがある。第２に、ＲＮＡ治療薬は単一遺伝子を選択的に標的とすることができ、オフターゲット遺伝子の調節を回避するように容易に操作することができるが、小分子阻害剤は頻繁に複数の標的にヒットし、未知のオフターゲット副作用を有する。第３に、静的小分子及び抗体とは異なり、ＲＮＡ治療薬は、例えばがん突然変異又はパンデミックのインフルエンザに追いつくためにそれらの配列を薬理学的に進化させることができる。これらの属性は、送達が適切に解決され得る限り、薬になり得ないヒトの疾患を治療する大きな潜在可能性を有するＲＮＡベースの治療薬を提供する。
【0003】
この分野では、ＡＳＯ、ＲＮＡｉ及びｍＲＮＡのケミストリーが進歩し、安定性の改善を可能にし、自然免疫応答を回避している。それはまた、抗体又は小分子の開発と比較して、比較的低コストでの自動合成による大規模での治療用ＡＳＯ及びＲＮＡ化合物の工業規模の生産を可能にする。しかし、２つの領域、（ａ）特定の細胞型又は組織へのこれらの分子の標的化、（ｂ）非毒性エンドソーム脱出剤の考案が、依然としてさらなる開発を必要としている。Ｄｏｗｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５：２２２－２２９（２０１７）。
【0004】
市販のＡＳＯ又はＲＮＡｉ薬物では、２種類の有効な送達方法が使用されている。１つは、複数の成分を含有するリポソームと呼ばれる脂質ベースのナノ粒子を使用する。もう１つは、ＧａｌＮＡｃ分子コンジュゲートＡＳＧＰＲ標的化（アシアロ糖タンパク質受容体）手法を使用する。
【0005】
ＲＮＡベースの治療薬の主な課題は、細胞への送達のための全経路が最終的にエンドソーム脱出をもたらすことである。肝へのＡＳＯ及びｓｉＲＮＡ送達は、肝細胞への高分子薬物送達によく適したＡＳＧＰＲの特性に起因して、ＡＳＧＰＲ標的化ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを使用して、達成することができる。特に、肝細胞は、細胞の表面に数百万コピーのＡＳＧＰＲを発現し、これは１０～１５分毎の急速な速度で循環する。これらの特性は、エンドソーム脱出率が０．０１％未満であると推定される場合でも、ＧａｌＮＡｃベースの送達アプローチを有効にする。対照的に、ＡＳＯ又はＲＮＡの他の組織への効果的な送達は達成されていない。他のリガンド受容体系は、ＡＳＧＰＲのような高いレベルで受容体を発現せず、エンドソームへの急速なサイクルもない。実際、ほとんどの細胞の表面の受容体は、細胞あたり１０，０００～１００，０００（又はそれ未満）の範囲で発現され、カベオリン及びクラスリン媒介性エンドサイトーシスは、典型的には９０分毎に再利用される。Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４，６５１８－６５４８（２０１６）を参照されたい。
【0006】
エンドソーム脱出は、依然として、すべてのＲＮＡベースの治療に当てはまる問題である。肝細胞を超える細胞又は組織を標的とするためには、新しいケミストリー及び材料を開発することによりエンドソーム脱出を増強することが必要である。クロロキンなどの小分子エンドソーム溶解剤は、エンドソームを破壊又は溶解するために使用されてきたが、有効濃度では、これらの薬剤は細胞内のすべての種類のエンドソームを常に溶解し、実質的な毒性をもたらす。
【0007】
代替的なエンドソーム脱出手法は、エンドソーム分解ペプチド又は分子をＲＮＡに直接コンジュゲートさせることであり、これはＲＮＡ治療薬を含有するエンドソームへのそれらの作用を厳密に制限する。エンドソームから脱出するためにコレステロール又は溶解性メリチンペプチドを含有する二分子動的ポリコンジュゲート（ＤＰＣ）系を使用する様々な臨床治験は、毒性作用のために終了した。Ｗｏｏｄｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９７３－９８５（２０１３）；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３３，９３１－９４０（２０１５）。
【0008】
以下に記載される組成物及び方法は、オリゴヌクレオチド及び標的化リガンドにコンジュゲートしたエンドソーム放出ペプチドを使用する。構成体は、非毒性の様式で細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドカーゴの脱出を増強する。本発明の構成体は、本明細書では「ペプチドドッキング賦形剤」（ＰＤｏＶ）と呼ばれる。
【発明の概要】
【0009】
提供されるのは、（ａ）標的化部分及び（ｂ）第１の治療用オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したペプチドドッキング賦形剤（ＰＤｏＶ）を含む化学的構成体である。構成体は、第１の治療用オリゴヌクレオチドと同じ又は異なる第２の治療用オリゴヌクレオチドを含有してもよい。ＰＤｏＶは、ヒスチジン及びリジンの複数の反復単位を含み得る。一実施形態において、標的化部分はアシアロ糖タンパク質受容体に結合する。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、デコイオリゴヌクレオチド、又はＣｐＧモチーフを含むことができる。
【0010】
これらの構成体において、ＰＤｏＶ構成体は、同じ若しくは異なる少なくとも２つの標的化部分及び／又は同じ若しくは異なる少なくとも２つの治療用オリゴヌクレオチドを含むエンドソーム放出モチーフを含むことができる。
【0011】
構成体は、以下に示される構造のうちの１つを有し得て、式中、Ｘ型部位が、標的化リガンドをコンジュゲートさせるために使用され、Ｙ型部位は、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートするために使用され、Ｘ及びＹは、同じであっても異なっていてもよく、Ａは、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫのペプチド配列、又は最大約５個のアミノ酸を含む任意の他のエンドソーム放出の短いペプチドであり、Ｂは、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫのペプチド配列、又は最大約５個のアミノ酸を含む任意の他の短いペプチド、任意の他のアミノ酸、若しくはリンカーとのアミノ酸の組み合わせであり、Ｄはオリゴヌクレオチドであり、ＲＬはリガンドであり、ＲＳは、オリゴヌクレオチドに対するリンカーである。
【0012】
Ｄは、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はアプタマーであり得る。
【0013】
これらの構成体において、ＰＤｏＶペプチド構成体は、ＫＨＨＨＣＫＨ、ＨＫＨＨＨＣＫＨ、ＨＨＫＨＨＨＣＫＨ、ＨＨＨＫＨＨＨＫＣＨＨＨＫＨＨＨ、ＨＨＨＫＨＨＣＫＨＨＨ、ＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨ、ＨＫＨＨＣＫＨ、ＨＫＨＣＨ、ＨＫＨＣＫＨ、ＨＫＨＣ、ＨＨＨＫ（Ｓ）ＨＨＣＫＨＨＨ及びＨＨＫ（Ｓ）ＨＨＫＣＨＨ（Ｓ）ＨＨＨからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む構造を有し得て、ＲＬがシステイン残留物の側鎖に結合
し、ＲＳがリジン残留物の側鎖に結合しており、（Ｓ）が
である。
し、ＲＳがリジン残留物の側鎖に結合しており、（Ｓ）が
【0014】
他の実施形態において、ＰＤｏＶペプチド構成体が以下の構造を有し得て、
リガンドのうちの３つがペプチドにおいて個々にコンジュゲートされている。
【0015】
リガンド部分ＲＬが、リンカー－１を含み得、リンカー－１が、以下の構造：
式中、ｎは１、２又は３であり、ＯＣＨ２単位を有する１，５－トリアゾール環を介して架橋に結合されているか、又は
式中、ｎは１、２又は３であり、ＣＨ２ＯＣＨ２単位を有する１，５－トリアゾール環を介して架橋に結合されているか、又は
式中、ｎは１、２又は３であり、ＣＨ２ＯＣＨ２単位を有する１，５－トリアゾール環を介して架橋に結合している
のうちの１つを含むことができる。
のうちの１つを含むことができる。
【0016】
ＰＤｏＶペプチドに結合したリガンド間のリンカーが、ポリエチレングリコール鎖－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－又は－（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ－鎖を含み得、ｎが２～１５の整数である。リガンドＲＬは、チオエーテル、アミド、又はトリアゾール結合を含み得るリンカーを介してＰＤｏＶペプチドに結合され得る。
【0017】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、構造Ｒｓ－リンカー２－オリゴヌクレオチドを有する部分を介して連結され、式中、リンカー２は、脂肪族鎖、ポリエチレングリコール鎖、疎水性脂質鎖、又は親水性鎖である。末端部位の基２は、ｓｉＲＮＡ末端との化学的コンジュゲーションのための反応部位である。
【0018】
オリゴヌクレオチドは、１０～２９の長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであるＲＮＡｉ分子であってもよく、又はそれぞれ１０～２９塩基又は１９～２７塩基の長さを有する２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含有し得る。オリゴヌクレオチドは、２’位に少なくとも１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含有するｓｉＲＮＡ分子を含有し得、式中、例えば、化学修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル又は２’－フルオロ、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アリル又は２’－Ｈ修飾ヌクレオチドを含む。
【0019】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、
である少なくとも１つの化学修飾結合を含有するｓｉＲＮＡ分子を含有し得る。
【0020】
他の実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドが、位置５’又は３’でリンカー３でさらに化学修飾されており、リンカー３が、リンカー２と共有結合的に反応してリガンド－ＰＤｏＶ及びヌクレオチドを連結することができる相補的なコンジュゲーション部位の基３を含有する。
【0021】
さらなる実施形態では、構成体は、以下
に示すような構造を有し得る。
【0022】
これらの構成体の各々において、標的化リガンドが、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルマール－ガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ブタノイルガラクトサミン、及びアプタマーからなる群から選択され得る。他の実施形態において、標的化リガンドは、環状（ｃ）ＲＧＤ、ＡＰＲＰＧ、ＮＧＲ、Ｆ３ペプチド、ＣＧＫＲＫ、ＬｙＰ－１、ｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＲＣＰＤＣ）、ｉＮＧＲ、Ｔ７ペプチド（ＨＡＩＹＰＲＨ）、ＭＭＰ２切断可能オクタペプチド（ＧＰＬＧＩＡＧＱ）、ＣＰ１５（ＶＨＬＧＹＡＴ）、ＦＳＨ（ＦＳＨ－β、３３～５３アミノ酸、ＹＴＲＤＬＶＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦ）、ＬＨＲＨ（ＱＨＴＳＹｋｃＬＲＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）（ＣＧＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ）、ＲＶＧ（ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）、ＦＭＤＶ２０ペプチド配列（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ）、及びＧＬＰからなる群から選択されるペプチドであるか、又は葉酸である。
【0023】
これらの構成体のいずれにおいても、ペプチドは、アミノ酸配列－ＨＨＫ、－ＫＨＨ、－ＨＨＨ、－ＨＨＨＫ、－ＫＨＨＨ、－ＨＨＨＨＫ、－ＫＨＨＨＨ、－Ｋ（ＨＨＨＫ）ｎ（ｎ＝１～８）、－Ｋ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ（ｎ＝１～４、ｍ＝１～８）、Ｋ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ－（ｎ＝１～４、ｍ＝１～８）を含み得、例えば、構成体は、配列－Ｋ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ又はＫ（ＨＨＨＨＫ）ｎ（ＨＨＨＫ）ｍ－を有するペプチドを含み得、ｎは１であり、ｍは３である。ペプチドは、エンドソーム放出ペプチドであってもよく、又は細胞透過性ペプチドであってもよい。
【0024】
式（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑを有するペプチドであり、式中、Ｈはヒスチジンであり、Ｋはリジンであり、Ｘ及びＹはアミノ酸及びリンカーから選択される官能性単位であり、ｎは１～１０であり、ｍは１～１０であり、ｏは１～１０であり、ｐは１～５であり、ｑは１～４である、ペプチドがまた、提供される。ペプチドは、標的化リガンドを結合させるための少なくとも２つのコンジュゲーション部位を含むことができる。有利には、コンジュゲーション部位はリジン又はシステインである。ペプチドは、オリゴヌクレオチドを結合させるための少なくとも２つのコンジュゲーション部位を含み得る。構成体は、式（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑのペプチドと、少なくとも１つのコンジュゲーション部位を介してペプチドに連結された少なくとも１つの標的化リガンドとを含み得る。少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのコンジュゲーション部位を介してペプチドに連結され得る。標的化リガンドは、環状（ｃ）ＲＧＤ、ＡＰＲＰＧ、ＮＧＲ、Ｆ３ペプチド、ＣＧＫＲＫ、ＬｙＰ－１、ｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＲＣＰＤＣ）、ｉＮＧＲ、Ｔ７ペプチド（ＨＡＩＹＰＲＨ）、ＭＭＰ２切断可能オクタペプチド（ＧＰＬＧＩＡＧＱ）、ＣＰ１５（ＶＨＬＧＹＡＴ）、ＦＳＨ（ＦＳＨ－β、３３～５３アミノ酸、ＹＴＲＤＬＶＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣＴＦ）、ＬＨＲＨ（ＱＨＴＳＹｋｃＬＲＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）（ＣＧＧＮＨＷＡＶＧＨＬＭ）、ＲＶＧ（ＹＴＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ）、ＦＭＤＶ２０ペプチド配列（ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ）、及びＧＬＰからなる群から選択され得る。オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、デコイオリゴヌクレオチド、及びＣｐＧモチーフからなる群から選択され得る。
【0025】
上記請求項に記載の構成体及び薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物も提供される。薬学的に許容される担体は、ヒスチジン－リジンリッチポリペプチドＨＫＰ、ＨＫＰ（Ｈ）、又はリポフェクタミンを含有してもよく、及び／又は水、並びにリン酸カリウム一塩基性無水ＮＦ、塩化ナトリウムＵＳＰ、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物ＵＳＰ、グルコース、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる群の１つ又は複数を含有してもよい。
【0026】
細胞を上記の構成体又は薬学的組成物と接触させることを含む、細胞にオリゴヌクレオチドを送達する方法も提供される。
【0027】
上記のような構成体と細胞を接触させることを含む、オリゴヌクレオチドを肝細胞の細胞に送達する方法も提供される。
【0028】
これらの方法では、オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ分子であり得、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞又は肝細胞に送達され得る。細胞はヒト細胞であり得る。
【0029】
治療的有効量の上記の構成体を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物における遺伝子治療の方法も提供され、哺乳動物は任意選択的にヒトである。
【0030】
上記のような構成体の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、ヒトなどの哺乳動物のがんを治療する方法も提供される。がんは固形腫瘍であり得る。がんは、肝臓がん、結腸がん、又は膵臓がんであり得る。肝臓がんは、肝細胞癌、転移性結腸がん、又は転移性膵臓がんであり得る。構成体は、がん細胞を含有する腫瘍に直接注射され得る。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】［ＧａｌＮＡｃ］ペプチドドッキング賦形剤（Ｇ－ＰＤｏＶ）の設計のイラストの表現を示す。三価ＧａｌＮＡｃを１つのドッキング部位Ａに共有結合的にコンジュゲートさせた。オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡを他の１つ又は２つのドッキング部位Ｂにそれぞれコンジュゲートさせた。
【図2】［リガンド］ペプチドドッキング賦形剤の代替設計のイラストの表現を示す。一価のＧａｌＮＡｃを１～４つのドッキング部位Ａに共有結合的にコンジュゲートさせた。オリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡをそれぞれ他の１つ又は２つのドッキング部位Ｂにコンジュゲートさせた。
【図3】ペプチドドッキング賦形剤（ＰＤｏＶ）の設計を示す。それは、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）並びに官能性単位Ｘ及びＹ（アミノ酸又は機能性リンカー）の複数の反復単位有する（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑペプチド骨格を有し、式中＝１～１０、ｍ＝１～１０、ｏ＝１～１０、ｐ＝１～５、ｑ＝１～５である。ＨＫ反復単位は良好な細胞透過能を有することが示されており、エンドソームの放出を促進するために、リジン又は様々な官能性単位Ｘ若しくはＹがリガンドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として採用され、Ｙが異なる共有結合を介したオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として採用される。例えば、部位１は、ＧａｌＮＡｃ又は他の標的化リガンドなどのリガンドの存在下でのみ反応できる。部位３は、特定の条件下でのみ、オリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡとコンジュゲートすることができる。
【図4】３つのリガンドコンジュゲーション部位及びマルチオリゴヌクレオチド部位を有するペプチドドッキング賦形剤（ＰＤｏＶ）の設計を示す。（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑペプチド骨格は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）並びに官能性単位Ｘ及びＹ（アミノ酸又は機能性リンカー）の多重反復単位を有し、式中ｎ＝１～１０、ｍ＝１～１０、ｏ＝１～１０、ｐ＝１～５、ｑ＝１～５である。ＨＫ反復単位は、良好な細胞透過能を有し、エンドソームの放出を促進することが実証されている。リジン残留物又は様々な官能性単位Ｘは、リガンドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として適合され、Ｙは、異なる共有結合を介したオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として適合される。例えば、部位１は、ＧａｌＮＡｃ又は他の標的化リガンドなどのリガンドの存在下でのみ反応することができる。部位３は、特定の条件下でのみオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡとコンジュゲートすることができる。
【図5】ＰＤｏＶ構成体の構造を示す。ＰＤｏＶ構成体は、複数のコンジュゲーション部位Ｘ及びＹが挿入された細胞透過性／エンドソーム放出ペプチドである。部位Ｘは、標的化リガンドをコンジュゲートするために使用され、部位Ｙは、複数のオリゴヌクレオチド又は核酸をコンジュゲートするために使用される。ＰＤｏＶのいくつかの構成体の例としては、Ａがペプチド配列Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫ又は他の短いペプチドを表す場合、Ｂが、ペプチド配列Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫ、又は他の短いペプチド、他のアミノ酸若しくは組み合わせを表す場合、Ｄが、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマーを表す場合、ＲＬがリガンドを表す場合、及びＲＳがオリゴヌクレオチドに対するリンカーを表す場合が挙げられる。
【図6】１つ又は２つのオリゴヌクレオチド部位及び１つのリガンドコンジュゲーション部位を含む第１発生ＰＤｏＶの構造の例を示す。
【図7】２つのオリゴヌクレオチド部位及び１つの多価リガンドコンジュゲーション部位を含む第２発生ＰＤｏＶの構造の例を示す。
【図8】２つのオリゴヌクレオチド部位及び１つの多価リガンドコンジュゲーション部位を含むＰＤｏＶの代替構造の例を示す。リガンドは、ＰＤｏＶ骨格に１つずつ個々にコンジュゲートすることができる。
【図9A】コンジュゲーション部位の結合選択を示す。化学基Ｒｓは、オリゴヌクレオチドをＰＤｏＶペプチド賦形剤とコンジュゲートするための「クリック」様反応性部分を表す。反応性部分は、アミン、ヒドラジン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキン、カルボン酸、チオール、マレイミド、又は当該技術分野で公知の他の化学反応性部分であり得る。
【図9B】リンケージの代表的な例を示す。
【図9C】いかように、コンジュゲーションＲ－リンカー２－ｓｉＲＮＡのリンカー２は、ペプチドとコンジュゲーション部位との間にある化学的なスペーサーであり、コンジュゲーション部位をリンカーの末端部位に結合させているかを示す。リンカー２は、脂肪族鎖若しくはポリエチレングリコール鎖、又は他の疎水性脂質若しくは親水性鎖であり得る。末端部位の基２は、ｓｉＲＮＡ末端との化学的コンジュゲーションのための反応部位である。
【図10】リガンドコンジュゲーション部位の連結の選択の一例を示す。リガンドコンジュゲーションＲＬの結合は、一価のＧａｌＮＡｃ分子、二価のＧａｌＮＡｃ分子及び三価のＧａｌＮＡｃ分子に基づく選択であり得る。コンジュゲーション部位は、マレイミド／チオールであり得るか、又は図９に示される基２のリストから選択され得る。
【図11】ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物１の構築の代表例を示す。
【図12】ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物２の構築の代表例を示す。
【図13】ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物３の構築の代表例を示す。
【図14】いくつかの可能なｓｉＲＮＡ配列及び構造修飾のリストを示す。
【図15A】ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３のコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ段階希釈データを示す。
【図15B】ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの段階希釈データを示す。
【図15C】ｍＴＴＲ２－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロールコンジュゲートの段階希釈データを示す。
【図15D】Ａｈａ１－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロールコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの段階希釈データを示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
定義：
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、１００ヌクレオチド未満（例えば、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、又は２５ヌクレオチド未満）の長さを有する化学修飾又は非修飾核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。それは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、アプタマー、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アプタマーであり得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉ剤である。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、１００ヌクレオチド未満（例えば、５０ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、又は２５ヌクレオチド未満）の長さを有する化学修飾又は非修飾核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。それは、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ模倣物、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、アプタマー、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アプタマーであり得る。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉ剤である。
【0033】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ分子」又は「ＲＮＡｉ分子」は、分子が細胞に導入された後に、細胞内の遺伝子の発現に干渉する二重鎖オリゴヌクレオチド、すなわち短い二本鎖ポリヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、一本鎖標的ＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列を標的として結合する。慣例により、ｓｉＲＮＡ分子が特定のヌクレオチド配列によって同定される場合、配列は二重鎖分子のセンス鎖を指す。分子を含むリボヌクレオチドの１つ又は複数は、当該技術分野で公知の技術によって化学的に修飾することができる。その個々のヌクレオチドの１つ以上のレベルで修飾されることに加えて、オリゴヌクレオチドの骨格を修飾することができる。さらなる修飾には、ｓｉＲＮＡ分子へのコンジュゲーションのための小分子（例えば糖分子）、アミノ酸、ペプチド、コレステロール、及び他の大きな分子の使用が含まれる。
【0034】
「ペプチドドッキング賦形剤」（ＰＤｏＶ）は、１つ以上の標的化リガンド及び１つ以上のオリゴヌクレオチドとのコンジュゲーションを可能にする複数のコンジュゲーション部位を含む定義された配列の合成ペプチドを指す。それは、細胞へのコンジュゲートＰＤｏＶの送達後に細胞のエンドソームの内部に捕捉されたオリゴヌクレオチドペイロードの放出を促進する、疎水性鎖又はｐＨ感受性残留物などの官能基を含有する。
【0035】
治療上の利益が増強された干渉ＲＮＡ分子を使用する組成物及び方法が提供される。組成物及び方法は、標的化リガンドを化合物に連結することによって、ｓｉＲＮＡ分子などの治療化合物の対象への標的化された細胞／組織送達を可能にする。対象は、動物又はヒトであり得る。
【0036】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるような標的化リガンドは、直交型バイオコンジュゲーション法によってエンドソーム放出ペプチドにコンジュゲート化され得る。標的化リガンドは、特に、肝臓などの選択された標的へのＲＮＡｉ分子の送達を改善するために使用され得る。他の実施形態では、標的化リガンドは、ＲＮＡｉ分子の他の組織、例えば皮膚や脳への標的化された送達を可能にする。
【0037】
本明細書に記載の標的化リガンドは、１つ以上の標的化部分及び１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、クリックケミストリー、チオール／マレイミドケミストリー、又は他の生体直交ケミストリーによってｓｉＲＮＡ及び標的化リガンドと共有結合的にコンジュゲートされる。リンカーは有利には親水性であり、例えば、十分に安定的であり、１つ又は複数の標的化部分間の潜在的な相互作用を制限する水溶性可撓性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ＰＥＧは、臨床研究から安全であり、治療目的に適合することが確認されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、エステル結合が酵素的又は加水分解的に不安定である、定義された分子量のポリ（Ｌ－ラクチド）ｎ（ｎ＝５～２０）であり得る。
【0038】
標的化リガンドは、１つ以上の標的化部分、リンカー反応性接続部分を有する１つ以上の基を含み得る。それらは、クリックケミストリー、チオール／マレイミドケミストリー、又は他の生体直交ケミストリーによってｓｉＲＮＡ及び標的化リガンドと共有結合的にコンジュゲートされる。リンカー反応性接続部分は、チオール－マレイミド結合、アルキンとアジドとの反応によって形成されるトリアゾール結合、及びアミン－ＮＨＳエステル結合から形成されるアミドであってもよいが、これらに限定されない。これらの結合の各々は、標的化リガンドと治療化合物の両方を共有結合的に連結させるのに適している。
【0039】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される標的化リガンドは、１つ以上の標的化部分、反応性接続部分を有する１つ以上のリンカーを含む。リンカーは、チオール部分又はマレイミド部分、カルボン酸又はアミン、アジド基、アルキン基などを含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される標的化特異的ＲＮＡ化合物は、ＲＮＡの３’又は５’末端を介してエンドソーム放出ドッキングペプチドに直接コンジュゲートすることができる。標的化リガンド（例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン）も、適合する方法で同じドッキングペプチドとコンジュゲートされる。
【0041】
いくつかの態様では、本明細書に開示される標的化特異的ＲＮＡ化合物は、例えばＲＮＡの３’又は５’末端を介して、標的化リガンド（例えばＮ－アセチル－ガラクトサミン）に直接コンジュゲートすることもできる。いくつかの態様では、ＲＮＡは、３’－ＯＭｅ、３’－Ｆ、又は３’－ＭＯＥなどの１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’若しくは３’末端、又は二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’若しくは３’末端に連結される。あるいは、標的化リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の３’／３’’、３’／５’又は５’／５’末端に連結されてもよい。
【0042】
標的化リガンドは、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’又は５’末端のリン酸基、ホスホロチオエート基又はホスホネート基を介してＲＮＡｉ分子に共有結合的に結合され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される標的化特異的ＲＮＡ化合物は、ＴＧＦβ１又はＡｐｏＢ１００、ｍＲＮＡ発現阻害特異的化合物である。
【0043】
ＰＤｏＶは、その高分子カーゴの細胞質への脱出を非毒性の様式で促進する。これにより、例えばＲＮＡｉ治療薬の効果的な送達が可能になる。
【0044】
非毒性の様式で細胞質への高分子カーゴ、例えばｓｉＲＮＡ分子の脱出を増強するエンドソーム脱出ペプチド（ＰＤｏＶ）が提供される。ＰＤｏＶプラットフォームの様々な例を図１～図４に示す。ＰＤｏＶでは、エンドソーム脱出ペプチドは、ＲＮＡ及び標的化リガンドのドッキング部位リンカー両方として作用する。複数のＲＮＡ分子を同じ構成体とコンジュゲートさせて、異なる標的ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ分子の同時送達を達成することができ、それにより、多疾患関連遺伝子をサイレンシングするための相乗的利益をもたらす。ヒスチジン及びリジンリッチポリペプチド又は線状ヒスチジン及びリジンリッチペプチドは、ＲＮＡの送達において効果的な細胞透過性及びエンドソーム剥離剤であることが示されてきた。ペプチドはヒスチジンリッチドメインを含有し、それにおいてヒスチジン残留物のイミダゾール環はより低いｐＨの値（ｐＨ＜約６）でプロトン化され、エンドソームの内側でプロトンスポンジとして作用し、エンドソーム脂質二重層の溶解及びＲＮＡの放出をもたらす。ＰＤｏＶのコンジュゲーション部位は、以下に、より詳細に記載される。
【0045】
次のいくつかのセクションでは、ＲＮＡｉ剤、標的化リガンド、ＲＮＡｉとペプチドとの間のリンカー、リガンドとペプチドとの間のリンカー、及びエンドソーム放出ドッキングペプチドを含む各成分を詳細に考察する。
【0046】
ＲＮＡｉ剤
ＲＮＡｉ分子は二本鎖化合物である。例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡは、抗ＴＧＦβ１又は抗ＡｐｏＢ１００であり得、２’位において、例えば、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｆ、若しくは２’－Ｏ－ＭＯＥで、又は５’位において、－Ｐ（Ｏ）２＝Ｓで、非修飾又は化学修飾され得る。他の化学修飾は当該技術分野で公知であり、例えば、ＲＮＡｉの全体的な安定性及びバイオアベイラビリティを改善するためのペグ化又は脂質官能化を含み得る。
ＲＮＡｉ分子は二本鎖化合物である。例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡは、抗ＴＧＦβ１又は抗ＡｐｏＢ１００であり得、２’位において、例えば、２’－ＯＣＨ３、２’－Ｆ、若しくは２’－Ｏ－ＭＯＥで、又は５’位において、－Ｐ（Ｏ）２＝Ｓで、非修飾又は化学修飾され得る。他の化学修飾は当該技術分野で公知であり、例えば、ＲＮＡｉの全体的な安定性及びバイオアベイラビリティを改善するためのペグ化又は脂質官能化を含み得る。
【0047】
特定の実施形態では、二本鎖ｓｉＲＮＡは、図１４の二重鎖のいずれか１つ又は複数の２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７又は１６個の近接する塩基対からなる導出された二重鎖であり得る。
【0048】
標的化リガンド
標的化リガンド部分は、例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルマール－ガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ブタノイルガラクトサミン、ｃＲＧＤ、ＧＬＰペプチド又は他の小分子であり得る。標的化リガンドは、共有結合によってペプチドに共有結合的にカップリングする。リガンドの数は、１、２又は３であり得る。ここに開示されている標的化リガンドは、以下によって表される構造を有していた：
標的化リガンド部分は、例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルマール－ガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ブタノイルガラクトサミン、ｃＲＧＤ、ＧＬＰペプチド又は他の小分子であり得る。標的化リガンドは、共有結合によってペプチドに共有結合的にカップリングする。リガンドの数は、１、２又は３であり得る。ここに開示されている標的化リガンドは、以下によって表される構造を有していた：
【0049】
ＲＮＡｉとペプチドとの間のリンカー
リガンドコンジュゲーションＲｓの連結：化学基Ｒｓは、オリゴヌクレオチドをＰＤｏＶペプチド賦形剤とコンジュゲートさせるために使用される様々な「クリック」様反応性部分の１つであり得る。Ｒｓは、アミン、ヒドラジン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキン、カルボン酸、チオール若しくはマレイミド、又は当該技術分野で公知の他の化学反応性部分であり得る。代表的な例を図９に示す。
リガンドコンジュゲーションＲｓの連結：化学基Ｒｓは、オリゴヌクレオチドをＰＤｏＶペプチド賦形剤とコンジュゲートさせるために使用される様々な「クリック」様反応性部分の１つであり得る。Ｒｓは、アミン、ヒドラジン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキン、カルボン酸、チオール若しくはマレイミド、又は当該技術分野で公知の他の化学反応性部分であり得る。代表的な例を図９に示す。
【0050】
コンジュゲーションＲ－リンカー２－ｓｉＲＮＡのリンカー２は、ペプチドとコンジュゲーション部位との間に配置された化学的なスペーサーであり、コンジュゲーション部位をリンカーの末端部位に結合させる。リンカー２は、脂肪族鎖若しくはポリエチレングリコール鎖、又は他の疎水性脂質若しくは親水性鎖であり得る。末端部位の基２は、ｓｉＲＮＡ末端との化学的コンジュゲーションのための反応部位である。
【0051】
リガンドとペプチドとの間のリンカー
本明細書に開示される標的化リガンド及びＲＮＡｉ部分はリンカー－１を含み、それはｓｉＲＮＡ（センス鎖の３’又は５’末端）を直接接続し、リンカー３－リガンドを含む架橋が、センス鎖の３’又は５’末端によってＲＮＡｉに連結する。リンカー－１の間隔は、直鎖ポリエチレングリコール、式中ｎは１から５０のエチレングリコール単位の数であり得る、又はポリ（Ｌ－ラクチド、式中ｎは１ １から５０の間のエチルエステルの反復単位の数又は１００から３５００の平均分子量であり得る、から選択される構造である。コンジュゲーション部位は、マレイミド／チオールであり得るか、又は図１０の基２のリストから選択され得る。
本明細書に開示される標的化リガンド及びＲＮＡｉ部分はリンカー－１を含み、それはｓｉＲＮＡ（センス鎖の３’又は５’末端）を直接接続し、リンカー３－リガンドを含む架橋が、センス鎖の３’又は５’末端によってＲＮＡｉに連結する。リンカー－１の間隔は、直鎖ポリエチレングリコール、式中ｎは１から５０のエチレングリコール単位の数であり得る、又はポリ（Ｌ－ラクチド、式中ｎは１ １から５０の間のエチルエステルの反復単位の数又は１００から３５００の平均分子量であり得る、から選択される構造である。コンジュゲーション部位は、マレイミド／チオールであり得るか、又は図１０の基２のリストから選択され得る。
【0052】
エンドソーム放出ドッキングペプチド
ペプチドドッキング賦形剤（ＰＤｏＶ）は、有利には、複数のオリゴヌクレオチド部位と共に１つのリガンドコンジュゲーション部位を有する。ＰＤｏＶは、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）並びに官能性単位Ｘ及びＹ（式中、Ｘ又はＹはアミノ酸、又はリンカー１及び図１０に示される官能基から選択されるアミノ酸誘導体であり、ｎ＝１～１０、ｍ＝１～１０、ｏ＝１～１０、ｐ＝１～５、及びｑ＝１～５である）の複数の反復単位を有する一般構造体：（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑを有するペプチド骨格を有する。ＰＤｏＶの文脈におけるＹは、アミノ酸チロシンを意味せず、むしろ機能性アミノ酸又はリンカーを定義することに留意されたい。ＨＫ反復単位は、エンドソームの放出を促進することが実証されている。リジン残留物又は官能性単位Ｘは、リガンドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として使用され得、Ｙは、異なる共有結合を介したオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションのためのドッキング部位を提供する。図３は、ＰＤｏＶがどのようにコンジュゲートされ得るかの概略図を示す。例えば、部位１は、ＧａｌＮＡｃなどのリガンド又は他の標的化リガンドの存在下でのみ反応することができる。部位３は、図１０に例示されるように、選択された条件下でのみオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡとコンジュゲートすることができる。
ペプチドドッキング賦形剤（ＰＤｏＶ）は、有利には、複数のオリゴヌクレオチド部位と共に１つのリガンドコンジュゲーション部位を有する。ＰＤｏＶは、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）並びに官能性単位Ｘ及びＹ（式中、Ｘ又はＹはアミノ酸、又はリンカー１及び図１０に示される官能基から選択されるアミノ酸誘導体であり、ｎ＝１～１０、ｍ＝１～１０、ｏ＝１～１０、ｐ＝１～５、及びｑ＝１～５である）の複数の反復単位を有する一般構造体：（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑを有するペプチド骨格を有する。ＰＤｏＶの文脈におけるＹは、アミノ酸チロシンを意味せず、むしろ機能性アミノ酸又はリンカーを定義することに留意されたい。ＨＫ反復単位は、エンドソームの放出を促進することが実証されている。リジン残留物又は官能性単位Ｘは、リガンドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として使用され得、Ｙは、異なる共有結合を介したオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションのためのドッキング部位を提供する。図３は、ＰＤｏＶがどのようにコンジュゲートされ得るかの概略図を示す。例えば、部位１は、ＧａｌＮＡｃなどのリガンド又は他の標的化リガンドの存在下でのみ反応することができる。部位３は、図１０に例示されるように、選択された条件下でのみオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡとコンジュゲートすることができる。
【0053】
あるいは、ＰＤｏＶは、３つのリガンドコンジュゲーション部位及びマルチオリゴヌクレオチド部位を有し得る（図４を参照のこと）。（ＨｎＫｍ）ｏＸｐＹｑペプチド骨格は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）並びに官能性単位Ｘ及びＹ（アミノ酸又は機能性リンカー）の多重反復単位を有し、式中ｎ＝１～１０、ｍ＝１～１０、ｏ＝１～１０、ｐ＝１～５、ｑ＝１～５である。ＨＫ反復単位は、良好な細胞透過能を有し、エンドソームの放出を促進することが実証されている。リジン又は様々な官能性単位Ｘは、リガンドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として適合され、Ｙは、異なる共有結合を介したオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションのためのドッキング部位として適合される。例えば、部位１は、ＧａｌＮＡｃ又は他の標的化リガンドなどのリガンドの存在下でのみ反応することができる。部位３は、特定の条件下でのみオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡとコンジュゲートすることができる。図４を参照されたい。
【0054】
構造設計において、ＰＤｏＶ構成体は、複数のコンジュゲーション部位Ｘ及びＹが挿入されたエンドソーム放出ペプチドである。部位Ｘは、標的化リガンドをコンジュゲートするために使用され、部位Ｙは、複数のオリゴヌクレオチド又は核酸をコンジュゲートするために使用される。ＰＤｏＶのための構成体のいくつかの例を図５に示しており、式中、Ａはペプチド配列Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫ又は他の短いペプチドを表すし、Ｂは、ペプチド配列Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＨＨ、ＨＨＨ、ＨＨＨＨ、ＨＨＫ、ＨＨＨＫ、又は他の短いペプチド若しくは他のアミノ酸若しくは組み合わせを表し、Ｄは、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はアプタマーを表し、ＲＬはリガンドを表し、ＲＳは、オリゴヌクレオチドに対するリンカーを表す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５～１５アミノ酸を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、ＰＤｏＶは、図６に示すような構造を有する。
【実施例】
【0056】
実施例１
ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物の構築の模式的代表例。ｓｉＲＮＡ分子の１つ又は２つは、ＰＤｏＶペプチドとコンジュゲートすることができる。
工程１．ペプチドアジド修飾：
工程２．標的化リガンドとペプチドとのコンジュゲーション
工程３及び工程４．アジド－ＰＤｏＶ－ＧａｌＮＡｃ３とのオリゴヌクレオチドコンジュゲーション
ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物の構築の模式的代表例。ｓｉＲＮＡ分子の１つ又は２つは、ＰＤｏＶペプチドとコンジュゲートすることができる。
工程１．ペプチドアジド修飾：
【0057】
実施例２
ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物の構築の模式的代表例。
工程１．ペプチドアジド修飾
工程２．標的化リガンドとペプチドのコンジュゲーション
工程３及び工程４．アジド－ＰＤｏＶ－ＧａｌＮＡｃ３とのオリゴヌクレオチドコンジュゲーション
ｓｉＲＮＡ－ＰＤｏＶ－リガンド化合物の構築の模式的代表例。
工程１．ペプチドアジド修飾
【0058】
実施例３
アジド－ＰＤｏＶ１（１）の合成及び特徴づけ：
ペプチドアジド－ＰＤｏＶ１（配列ＨＨＨ｛ＬＹＳ（ＰＥＧ４－Ｎ３）｝ＨＨＣＫＨＨＨ）を、短縮されたサービスにより、配列の標準アミノ酸及びリジン－ＰＥＧ４－Ｎ３修飾剤を使用して、自動ペプチド合成装置によって合成した。ペプチドをＣ－１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、質量分析及び１Ｈ ＮＭＲによって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
アジド－ＰＤｏＶ１（１）の合成及び特徴づけ：
ペプチドアジド－ＰＤｏＶ１（配列ＨＨＨ｛ＬＹＳ（ＰＥＧ４－Ｎ３）｝ＨＨＣＫＨＨＨ）を、短縮されたサービスにより、配列の標準アミノ酸及びリジン－ＰＥＧ４－Ｎ３修飾剤を使用して、自動ペプチド合成装置によって合成した。ペプチドをＣ－１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、質量分析及び１Ｈ ＮＭＲによって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
【0059】
実施例４
ＰＤｏＶ２及びアジド－ＰＤｏＶ２の合成：
ＰＤｏＶ２（２）、配列ＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨの合成。ペプチドＰＤｏＶ２（ＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨ）を、短縮されたサービスにより、配列の標準アミノ酸を使用して、自動ペプチド合成装置によって合成した。ペプチドをＣ－１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、質量分析によって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
アジド－ＰＤｏＶ２（３）の合成：
ＰＤｏＶ２及びアジド－ＰＤｏＶ２の合成：
ＰＤｏＶ２（２）、配列ＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨの合成。ペプチドＰＤｏＶ２（ＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨ）を、短縮されたサービスにより、配列の標準アミノ酸を使用して、自動ペプチド合成装置によって合成した。ペプチドをＣ－１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、質量分析によって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
アジド－ＰＤｏＶ２（３）の合成：
【0060】
アジドリンカーのエステル活性化カルボン酸とＰＤｏＶ２（２）のリジン側鎖の第一級アミンとの間のアミド結合形成を介して、アジドリンカーをペプチドドッキング賦形剤２（ＰＤｏＶ２）に結合させて、化合物３を形成した。ＰＤｏＶ２ペプチドＨＨＨＫＨＨＣＲＨＨＨ（４２ｍｇ、０．０２８０ｍｍｏｌ）を１．０ｍＬのＤＭＦに懸濁した。トリエチルアミン（３９ｕＬ、１０当量）を添加し、混合物を室温で２０分間撹拌した。アジド－Ｐｅｇ４－ＮＨＳエステル（５４ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ、５当量）を含む２０ｕＬのＤＭＦの溶液を、反応混合物に添加した。反応混合物は３０分間にわたってゆっくりと透明な溶液に変化し、室温で１６時間さらに撹拌した。反応混合物のＴＬＣプロファイルを、ＰＤｏＶ２の十分完全な変換のＨＰＬＣプロファイルによってモニターした（図１）。
【0061】
反応混合物を水（２００μＬ）でクエンチし、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮し、粗物質を、１０～９０％のバッファーＢ（アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）の増加勾配を使用する半分取ＲＰ－Ｃ１８カラムでのＨＰＬＣを通して、精製した。アジド－ＰＤｏＶ２（２）を１０．５～１１．５分の保持時間で主要生成物として単離した。試料の画分を凍結乾燥させ、化合物２の透明な残留油（４４ｍｇ、収率８８％）を得た。そのプロトン及びＭＳ分析は以下の通りであった：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、図２）δ８．７４（ｂｒｄ ｄ、８Ｈ）及びδ７．３５（ｂｒｄ ｄ、８Ｈ）は、δ６．００ｐｐｍを超えるペプチドでの８のヒスチジンテトラゾールに関連する芳香族水素と一致する。δ４．７５～４．３０（ｂｒｄ ｔ、１１Ｈ）の全１１アミノ酸のアルファ炭素におけるメチン水素、δ３．９０～３．７５（ｍ、１００Ｈ）でのポリエチレン基に結合したエチレン水素、δ３．６～２．７５（ｍ、５３Ｈ）及びδ１．８～１．３（ｍ、１２Ｈ）のエチレン水素は、リジン、アルギニン及びシステインの側鎖プロトンと会合している。合計で１０４の水素が非芳香族領域において観察され、４１の水素が過剰である。これらの余分な水素は、２個のアジド－ペグ４基と等価である。ＮＭＲデータはＥＳＩ－ＭＳデータと一致している：予想のｍ／ｚ １７７５．９ Ｄａ及び観測されたｍ／ｚ ２３２３．５ Ｄａ（図３）。観測された質量電荷比は、予想した値よりも５４７．６ Ｄａ単位大きい。余分な質量単位は、２つのアジドリンカーの質量と一致する。
【0062】
実施例５
アジド－ＰＤｏＶ３ペプチド（４）の合成及び特徴づけ
ペプチドアジド－ＰＤｏＶ３（｛ＬＹＳ（ＰＥＧ４－Ｎ３）｝ＨＨＨＣＨＨ）を、配列の標準アミノ酸＋リジン－ＰＥＧ４－Ｎ３修飾剤を使用する固相自動合成を使用して合成した。ペプチドをＣ－１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、Ｈ１ＮＭＲ及び質量分析によって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
アジド－ＰＤｏＶ３ペプチド（４）の合成及び特徴づけ
ペプチドアジド－ＰＤｏＶ３（｛ＬＹＳ（ＰＥＧ４－Ｎ３）｝ＨＨＨＣＨＨ）を、配列の標準アミノ酸＋リジン－ＰＥＧ４－Ｎ３修飾剤を使用する固相自動合成を使用して合成した。ペプチドをＣ－１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、Ｈ１ＮＭＲ及び質量分析によって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
【0063】
実施例６
ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（５）の合成及び特徴づけ
スキーム１：ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（５）の合成
ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（５）の合成及び特徴づけ
【0064】
乾燥ＤＭＦ（４００ｕＬ）のＰＥＧ６－ＧａｌＮＡｃ３（９）（３．０ｍｇ、１．５６μｍｏｌ）を、リン酸バッファー（１ｍＬ、ｐＨ＝７．４）のＮ３－ＰＤｏＶ１ ２（３．５４ｍｇ、２．０３μｍｏｌ）の溶液に添加した。得られた混合物を窒素下で、２５℃にて一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、試料を脱塩し、ＰＤ－１０カラムによって精製して、純粋な生成物ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３ ５（５．１ｍｇ、白色固体、収率９０％）を得た。生成物を、逆相Ｃ１８カラム、溶媒０．１％のＴＦＡ水及び０．１％アセトニトリルによる勾配溶出を使用してＨＰＬＣによって分析した。保持時間はＲｔ＝４．８７７分、純度＞９０％。マススペクトル分析（ＥＳＩ、陽性）：Ｃ１５４Ｈ２４０Ｎ４８Ｏ５５Ｓの計算値３６７３．７、実測値３６７４．８。
【0065】
実施例７
ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３ ６及び７の合成及び特徴づけ
スキーム２：ＰＤｏＶ２－リンカー－ＧａｌＮＡｃ３の調製
ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３ ６及び７の合成及び特徴づけ
【0066】
ＰＤｏＶ２－Ｐｅｇ６－ＧａｌＮＡｃ３（化合物６）の調製：求核種である化合物２（４９．８ｍｇ、０．０２４３ｍｍｏｌ）をｐＨ７．４の脱気させたＰＢＳバッファー１．０ｍＬに溶解した。三価ＧａｌＮＡｃリガンド（９）（３０．８ｍｇ、０．０１６０ｍｍｏｌ）を溶解し、４００ｕＬの乾燥ＤＭＦに送達した。反応混合物を乾燥アルゴン下で再び脱気し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（１００μＬ）でクエンチし、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈが推奨するプロトコールに従って１．０μｍｏｌのセファデックスナップカラムを通して脱塩した。溶出剤を凍結乾燥し、粗物質を、１０～９０％のバッファーＢ（アセトニトリル及び水における０．１％のＴＦＡ（図７）の勾配を増加させながら、半分取Ｃ１８逆相カラムを介してＨＰＬＣで溶出した。生成物は４．０分の保持時間を有し、油（３９ｍｇ、収率６０％）として単離した。修飾されたオリゴの質量分析により、ＰＤｏＶ２－ｐｅｇ６－ＧａｌＮＡｃ３構成体の合成が成功したことが確認された。
【0067】
ＰＤｏＶ２－Ｐｅｇ１２－ＧａｌＮＡｃ３（化合物７）の調製：化合物７アジド－ＰＤｏＶ２（４．９ｍｇ、２．７４μｍｏｌ）を１．０ｍＬの脱気させたＰＢＳバッファーｐＨ７．４に溶解した。ＧａｌＮＡｃリガンド（３．０ｍｇ、１．３７μｍｏｌ）を溶解し、４００ｕＬの乾燥ＤＭＦに送達した。反応混合物を乾燥窒素下で再び脱気し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（１００μＬ）でクエンチし、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈが推奨するプロトコールに従って、１．０μｍｏｌのセファデックスナップカラムを通して脱塩した。溶出剤を凍結乾燥し、粗物質を、１０～９０％のバッファーＢ（アセトニトリル及び水における０．１％のＴＦＡ（図４）の勾配を増加させながら、半分取Ｃ１８逆相カラムを介してＨＰＬＣで溶出した。生成物は主生成物として排他的に形成され、保持時間は４．２分であり、白色粉末として単離された（４．４ｍｇ、収率８１％）。プロトンＮＭＲ及びＭＳ分析：ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、）δ７．９４（ｓ、３Ｈ、トリアゾール）、δ８．５７－δ７．１９（ｍ、１８Ｈ、８ヒスチジン芳香族）、δ４．７５－４．３０（ｍ、１４Ｈ、アミノ酸）、δ４．５（ｄ、３Ｈ、ガラクトース）、δ２．０５（ｓ、９Ｈ）、ＮＭＲデータはＥＳＩ－ＭＳデータと一致している。ＥＳＩ－ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）Ｃ１６８Ｈ２６８Ｎ５０Ｏ６１Ｓについて計算値３９６８．２、観測値は３９６８．２。
【0068】
実施例８
ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３（８）の合成
スキーム３：ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３（８）の合成
ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３（８）の合成
【0069】
ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３（化合物８）の合成：ＤＭＦ（１．５ｍＬ）のアジド－ＰＤｏＶ３化合物４（４７．０ｍｇ、３８．９μｍｏｌ）を、窒素下のリン酸バッファー（４ｍＬ、ｐＨ７．４）の三価ＧａｌＮＡｃ（９）（５０．０ｍｇ、２５．９μｍｏｌ）の混合物に、２５℃で添加した。得られた反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した。ＧａｌＮＡｃ９が完全に消費されるまで、ＨＰＬＣによって反応をモニターした。溶媒を凍結乾燥によって除去し、粗物質をゲル浸透カラムクロマトグラフＰＤ－１０カラムによって精製して、純粋な生成物ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３化合物８（７０ｍｇ、収率８６．４％）を得た。ＨＰＬＣは、逆相Ｃ－１８カラムで、水における０．１％のＴＦＡの溶媒、及びアセトニトリルにおける０．１％のＴＦＡの溶媒の勾配溶出によって、Ｒｔ＝５．０３８分で行った。ＭＳ（ＥＳＩ、陽性モード）、正確な質量：式に対して３１３４．４５、Ｃ１３０Ｈ２０７Ｎ３７Ｏ５１Ｓ、実測値：３１３６．３５。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
【0070】
実施例９
コントロール３－ＧａｌＮＡｃ３（１１）の合成
スキーム４：コントロール３－ＧａｌＮＡｃ３（１１）の合成
コントロール３－ＧａｌＮＡｃ３（１１）の合成
【0071】
ＰＤｏＶ３－コントロール３－ＧａｌＮＡｃ３の調製：
化合物アジド－コントロール３ペプチド１１（配列｛ＬＹＳ（ＰＥＧ４－Ｎ３）｝ＳＳＳＣＳＳ）（２．６ｍｇ、２．５９μｍｏｌ）を、１．０ｍＬの脱気させたＰＢＳバッファーｐＨ７．４に溶解した。ＧａｌＮＡｃ－リガンド（５．０ｍｇ、２．５９μｍｏｌ）を溶解し、５００ｕＬの乾燥ＤＭＦに送達した。反応混合物を乾燥アルゴン下で再び脱気し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（１００μＬ）でクエンチし、１．０μｍｏｌのセファデックスナップカラムを通して脱塩した。いくつかの溶出剤の画分を回収し、凍結乾燥させて、所望の化合物であるコントロール３－ＧａｌＮＡｃ３ １０を得た。この化合物を、分析ＨＰＬＣ Ｃ１８ ＲＰカラムを使用して、バッファーＢ（アセトニトリル及び水における０．１％のＴＦＡ）の１０～９０％の増加性の勾配で分析した。生成物は３．８０分の保持時間を有し、透明な油状物として単離された（４．９ｍｇ、収率６７％）。修飾されたオリゴヌクレオチドのマススペクトルにより、ＰＤｏＶ３－コントロール３－ｐｅｇ６－ＧａｌＮＡｃ構成体の構造が確認された。
化合物アジド－コントロール３ペプチド１１（配列｛ＬＹＳ（ＰＥＧ４－Ｎ３）｝ＳＳＳＣＳＳ）（２．６ｍｇ、２．５９μｍｏｌ）を、１．０ｍＬの脱気させたＰＢＳバッファーｐＨ７．４に溶解した。ＧａｌＮＡｃ－リガンド（５．０ｍｇ、２．５９μｍｏｌ）を溶解し、５００ｕＬの乾燥ＤＭＦに送達した。反応混合物を乾燥アルゴン下で再び脱気し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（１００μＬ）でクエンチし、１．０μｍｏｌのセファデックスナップカラムを通して脱塩した。いくつかの溶出剤の画分を回収し、凍結乾燥させて、所望の化合物であるコントロール３－ＧａｌＮＡｃ３ １０を得た。この化合物を、分析ＨＰＬＣ Ｃ１８ ＲＰカラムを使用して、バッファーＢ（アセトニトリル及び水における０．１％のＴＦＡ）の１０～９０％の増加性の勾配で分析した。生成物は３．８０分の保持時間を有し、透明な油状物として単離された（４．９ｍｇ、収率６７％）。修飾されたオリゴヌクレオチドのマススペクトルにより、ＰＤｏＶ３－コントロール３－ｐｅｇ６－ＧａｌＮＡｃ構成体の構造が確認された。
【0072】
実施例１０
ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（１２）の合成及び特徴づけ
スキーム５．ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（１２）の合成
ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（１２）の合成及び特徴づけ
【0073】
ＤＭＦ（９５μＬ）におけるＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３ ５（３８１μｇ、０．１０４μｍｏｌ）を、ＲＮＡｓｅを含まない水（２５０μＬ）のＡｐｏＢ１００－センス－５’－ＤＢＣＯ（５００ｕｇ、０．０６９μｍｏｌ）の溶液に加えた。得られた混合物を２５℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、粗物質をＧｌｅｎ Ｇｅｌ ＰａＫカラムクロマトグラフによって精製して、純粋な生成物センスＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３化合物１２（０．６６ｍｇ、収率８８％）を得た。ＨＰＬＣは、ｐＨ＝１１、Ｒｔ＝１３．０１５分、純度＞８５％のリン酸バッファーを使用してＰＡ２００イオン交換カラムで行った。ＭＳ（ＥＳＩ、陽性モード）式：Ｃ３８８Ｈ５１０Ｎ１２５Ｏ２０８Ｐ２２Ｓについて計算値１０９１１．６６。実測値：１０９２９．３［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］。ＡｐｏＢ１００アンチセンス鎖で１：１アニーリング（９５℃で５分間、約１℃／分で室温まで冷却した後、－２０℃で保存）を行った後、最終的なコンジュゲート二重鎖ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３（１２）を得た。色素Ａｌｅｘ－６４７で標識されたＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３を、ＡｐｏＢ１００アンチセンスを色素標識アンチセンスＡｐｏＢ１００－Ａｌｅｘａ６４７（５’－ｕｕｕＧｆＴａａｕｃｇｕｃｇａｕＡｆｃｃｃｕｇｃｕｃｇ－Ａｌｅｘｉａ６４７－３’）に置き換えることによって、調製した。生成物をＨＰＬＣ及びＭＳによって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
【0074】
実施例１１
ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３の合成及び特徴づけ
ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ（６又は７、０．０３４１μｍｏｌ、１．５当量）とＡＰＯＢ１００－ＳＳ－５’Ｃ６ＮＨＳ（ＤＢＣＯ）（０．０２２７μｍｏｌ）とを反応させることにより、ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３ １３を、ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３ １２と同様の方法で調製した。アジド－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃを、最初にＤＭＳＯ１５０μＬあたり１ｍｇのアジドの比率でＤＭＳＯに溶解した。次いで、得られたアジド溶液を、１００μＬのＲＮＡｓｅ非含有水において１０ＯＤの５’－ＤＢＣＯ標識オリゴに添加した。次いで、反応溶液混合物を室温で３～４時間インキュベートした。次いで、コンジュゲートされたオリゴをＧｌｅｎ Ｇｅｌ－Ｐａｋ（商標）脱塩カラムで脱塩して、有機溶媒及び任意の非コンジュゲートのペプチドを除去した。例として、ＰＤｏＶ２－ＰＥＧ１２－ＧａｌＮＡｃ７が反応物質であったとき、最終的なＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３ １４が白色の固体として収率７７％で得られた。ＨＰＬＣは、ｐＨ＝１１、Ｒｔ＝１２．０７７分、純度＞８５％のリン酸バッファーを使用して、ＰＡ２００イオン交換カラムで行った。ＭＳ（ＥＳＩ、陽性モード）、計算値の計算１１５５１．４、実測値：１１５５３．５。アンチセンスでの１：１アニーリング（９５℃で５分間、約１℃／分で室温まで冷却した後、－２０℃で保存）により、最終的なコンジュゲート二重鎖ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３（１４）が得られた。
ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３の合成及び特徴づけ
【0075】
色素Ａｌｅｘａ－６４７標識ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３は、ＡｐｏＢ１００アンチセンスを色素標識アンチセンスＡｐｏＢ１００－Ａｌｅｘａ６４７（５’－ｕｕｕＧｆＴａａｕｃｇｕｃｇａｕＡｆｃｃｃｕｇｃｕｃｇ－Ａｌｅｘｉａ ６４７－３’）で置換することによって調製した。生成物をＨＰＬＣ及びＭＳによって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
【0076】
実施例１２
ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３ １５の合成及び特徴づけ
ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３ １５の合成及び特徴づけ
【0077】
ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３ ８（１５０μｇ、０．１４８μｍｏｌ）を、ＲＮＡｓｅを含まない水（２００μＬ）の５’－ＤＢＣＯ－Ｃ６ＨＮ－ＡＰＯＢ１００センス鎖（２３０．７μｇ、０．０３１９μｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を２５℃で３時間撹拌した。溶媒を凍結乾燥によって除去した後、粗物質をＧｌｅｎ Ｇｅｌ Ｐａｋカラムによって精製して、純粋な生成物センスＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３化合物１５（２９８μｇ、収率９０％）を得た。ＨＰＬＣは、ｐＨ＝１１、Ｒｔ＝１２．００２分、純度＞８９％のリン酸バッファーを使用してＰＡ２００イオン交換カラムで行った。アンチセンスでの１：１アニーリング（９５℃で５分間、約１℃／分で室温まで冷却、－２０℃で保存）により、最終的なコンジュゲート二重鎖ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３を得た。色素Ａｌｅｘａ－６４７標識ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３は、ＡｐｏＢ１００アンチセンスを色素標識アンチセンスＡｐｏＢ１００－Ａｌｅｘａ６４７（５’－ｕｕｕＧｆＴａａｕｃｇｕｃｇａｕＡｆｃｃｃｕｇｃｕｃｇ－Ａｌｅｘｉａ ６４７－３’）で置換することによって調製した。生成物をＨＰＬＣ及びＭＳによって特徴を明らかにした。分析データはすべて、予想される構造と一致していた。
【0078】
実施例１３
ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３（１６）の合成及び特徴づけ
ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３（１６）の合成及び特徴づけ
【0079】
ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３は、ＤＭＳＯ／水の溶媒におけるＰＤｏＶ２－ｐｅｇ６－ＧａｌＮＡｃ６（０．５４７ｍｇ、０．１３７４μｍｏｌ）及びＤＢＣＯ標識ｍＴＴＲ１センス鎖（０．５ｍｇ、０．０６８７μｍｏｌ）を使用することによる、ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３の合成と同様の手順に従って、調製した。粗物質をゲル浸透カラムクロマトグラフＧ２５カラムによって精製して純粋な生成物を得た。収率は約７８％であった。アンチセンス鎖での１：１アニーリング（９５℃で５分間、約１℃／分で室温まで冷却した後、－２０℃で保存）の後、最終コンジュゲート二重鎖ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３（１６）を得た。
【0080】
実施例１４
ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３ １７の合成及び特徴づけ
ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３ １７の合成及び特徴づけ
【0081】
ＤＭＳＯ（９９．６μＬ）中のＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３ ８（９９６μｇ、０．３１７μｍｏｌ）を、ＲＮＡｓｅを含まない水（１００μＬ）におけるｍＴＴＲ１－センス－５’－ＤＢＣＯ（１．５４ｍｇ、０．２１２μｍｏｌ）の溶液に加えた。得られた混合物を２５℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した後、粗物質をゲル浸透カラムクロマトグラフＰＤ－１０カラムによって精製して、純粋な生成物センスｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３化合物１７（ｍｇ、収率８５％）を得た。ＨＰＬＣは、ｐＨ＝１１、Ｒｔ＝１４．７４４分、純度＞８５％のリン酸バッファーを使用してＰＡ２００イオン交換カラムで行った。アンチセンス鎖での１：１アニーリング（９５℃で５分間、約１℃／分で室温まで冷却し、－２０℃で保存）、最終コンジュゲート二重鎖ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３を得た。
【0082】
実施例１５
ＡＰＯＢ１００－ＰＤｏＶｎ－ＧａｌＮＡｃ３のコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
Ａｌｅｘａ ６４７標識ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３－Ａｌｅｘａ６４７、ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３－Ａｌｅｘａ６４７、ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３－Ａｌｅｘａ６４７）をｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞取り込み実験で使用した。リポフェクタミン送達Ａｌｅｘａ ６４７標識ｓｉＲＮＡを対照として使用した。ＡＳＧＰＲ過剰発現のＨｅｐＧ２細胞及びＨｕｈ７細胞を使用して、トランスフェクション実験における野生型細胞と比較した。５０００の細胞を９６ウェルプレートに一晩播種した。細胞を５０ｎＭのｓｉＲＮＡで２時間、２４時間及び４８時間トランスフェクトした。核をＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色し、細胞をＰＢＳ中のＣｙｔａｔｉｏｎイメージングステーションで画像化した。画像を２０倍の倍率で取得した。得られたデータは、ＡＳＧＰＲを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞が、過剰発現したＡＳＧＰＲを欠く野生型ＨｅｐＧ２細胞よりもはるかに大きい蛍光性に標識された物質の取り込みを示したことを示した。
ＡＰＯＢ１００－ＰＤｏＶｎ－ＧａｌＮＡｃ３のコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
Ａｌｅｘａ ６４７標識ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ１－ＧａｌＮＡｃ３－Ａｌｅｘａ６４７、ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３－Ａｌｅｘａ６４７、ＡｐｏＢ１００－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３－Ａｌｅｘａ６４７）をｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞取り込み実験で使用した。リポフェクタミン送達Ａｌｅｘａ ６４７標識ｓｉＲＮＡを対照として使用した。ＡＳＧＰＲ過剰発現のＨｅｐＧ２細胞及びＨｕｈ７細胞を使用して、トランスフェクション実験における野生型細胞と比較した。５０００の細胞を９６ウェルプレートに一晩播種した。細胞を５０ｎＭのｓｉＲＮＡで２時間、２４時間及び４８時間トランスフェクトした。核をＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色し、細胞をＰＢＳ中のＣｙｔａｔｉｏｎイメージングステーションで画像化した。画像を２０倍の倍率で取得した。得られたデータは、ＡＳＧＰＲを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞が、過剰発現したＡＳＧＰＲを欠く野生型ＨｅｐＧ２細胞よりもはるかに大きい蛍光性に標識された物質の取り込みを示したことを示した。
【0083】
ＡＳＧＰＲを過剰発現するＨｕｈ７細胞はまた、ＡＳＧＰＲ受容体を過剰発現しないＨｕｈ７細胞と比較して増加した取り込みを示したが、標識は野生型ＨｅｐＧ２細胞ほど強くなかった。
【0084】
ＰＤＯＶ１及びＰＤＯＶ２は両方とも、ＡＳＧＰＲを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞への標識されたｓｉＲＮＡの送達を実証したが、野生型細胞の標識はほとんど又はまったくなかった。構成体でのＧａｌＮａｃの非存在下では、本発明者らは、ＡＳＧＰＲ過剰発現細胞への取り込みを何ら認めなかった。
【0085】
その後の実験で、本発明者らは、ＡＳＧＰＲを過剰発現するＨｕｈ７のＰＤＯＶ１、２及び３のバリエーションによる送達を調べた。ＰＤｏＶ２及び３は、野生型細胞と比較して、これらの細胞への取り込みのいくらかの特異性を示した。ＰＤｏＶ１はまた、これらの細胞へのいくらかの送達を示したが、ＰＤｏＶ２及びＰＤｏＶ３ほど大きくはなかった。ＰＤｏＶ２は、２４時間の曝露後に顕著な取り込みを示した。
【0086】
実施例１６
初代マウス肝細胞におけるｍＴＴＲ－ＰＤｏＶｘ－ＧａｌＮＡｃのｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究
標的ＴＴＲについて初代マウス肝細胞を使用して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３、ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３、ｍＴＴＲ２－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロール、ｍＴＴＲ２－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロール）についての用量応答スクリーニングを行った。細胞密度は４００００細胞／９６ウェルであった。濃度は、最高５倍希釈物１μＭから最低３ｐＭまでであった。細胞を７２時間の直接的なインキュベーションによってトランスフェクトした。データをｂＤＮＡアッセイによって読み出した。データをＸＬｆｉｔソフトウェアによって分析した。Ｇａｐｄｈに対して正規化されたＴＴＲシグナル、四連の平均、模擬処理細胞セット＝１、ＩＣ５０値の計算に対しＸｌｆｉｔであった。使用した初代肝細胞は、ドイツのＰｒｉｍａｃｙｔ（ロットＭＨ１８１２１９）から購入し、ＣＤ１マウスから誘導され、融解直後にｓｉＲＮＡで処理した。
初代マウス肝細胞におけるｍＴＴＲ－ＰＤｏＶｘ－ＧａｌＮＡｃのｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究
標的ＴＴＲについて初代マウス肝細胞を使用して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート化ｓｉＲＮＡ（ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３、ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３、ｍＴＴＲ２－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロール、ｍＴＴＲ２－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロール）についての用量応答スクリーニングを行った。細胞密度は４００００細胞／９６ウェルであった。濃度は、最高５倍希釈物１μＭから最低３ｐＭまでであった。細胞を７２時間の直接的なインキュベーションによってトランスフェクトした。データをｂＤＮＡアッセイによって読み出した。データをＸＬｆｉｔソフトウェアによって分析した。Ｇａｐｄｈに対して正規化されたＴＴＲシグナル、四連の平均、模擬処理細胞セット＝１、ＩＣ５０値の計算に対しＸｌｆｉｔであった。使用した初代肝細胞は、ドイツのＰｒｉｍａｃｙｔ（ロットＭＨ１８１２１９）から購入し、ＣＤ１マウスから誘導され、融解直後にｓｉＲＮＡで処理した。
【0087】
２つのｓｉＲＮＡを両方とも３’末端で三価ＧａｌＮＡｃクラスターにコンジュゲートさせた（ｍＴＴＲ２ ｓｉＲＮＡ配列は完全に修飾された配列であり、ｍＴＴＲ１よりもオリゴヌクレオチドにおいて４つ多いＰＳ結合修飾であった。（Ｎａｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６：１６９５８－１６９６１（２０１４）。Ａｈａ１－ＧａＮＡｃ３ポジティブコントロールを、ハウスキーパーａｈｓａ１を標的とする標準対照として使用した。これをネガティブコントロール及びポジティブコントロールの両方として使用し、細胞溶解物をスクリーニング標的又はａｈｓａ１特異的プローブのいずれかにハイブリダイズさせた。表ｅ１は、２つのコントロールｓｉＲＮＡの配列及びＧａｌＮＡｃクラスターの構造を列挙している。
【0088】
ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ３－ＧａｌＮＡｃ３のコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの重大な希釈データ－図１５Ａを参照：ＩＣ５０＝１．８２ｎＭは、同じｓｉＲＮＡ配列２１及びオリゴヌクレオチドに対する化学修飾についてのＩＣ５０＝１．３９ｎＭの文献報告（Ｎａｉｒら、前出）と同等である。図１５Ｂは、ｍＴＴＲ１－ＰＤｏＶ２－ＧａｌＮＡｃ３コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの段階希釈データを示す。図１５Ｃは、ｍＴＴＲ２－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロールコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの段階希釈データの段階希釈データを示す：ｍＴＴＲ２ ｓｉＲＮＡ配列は完全に修飾された配列であり、オリゴヌクレオチドにさらに４個のＰＳ結合修飾を有する（前掲のＮａｉｒ）。図１５Ｄは、Ａｈａ１－ＧａｌＮＡｃ３ポジティブコントロールコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの段階希釈データを示す。
【0089】
発行された特許及び公開された特許出願を含む、本明細書で特定されるすべての刊行物、及びｕｒｌのアドレス又は寄託番号によって特定されるすべてのデータベースエントリは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0090】
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されており、例示の目的で多くの詳細が記載されているが、本発明は追加の実施形態の影響を受けやすく、本明細書に記載の特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく変更することができることは当業者には明らかであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【国際調査報告】