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特表2023-504190遺伝子編集機構の脂質ナノ粒子送達のためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】遺伝子編集機構の脂質ナノ粒子送達のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/88 20060101AFI20230125BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230125BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230125BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230125BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230125BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20230125BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230125BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20230125BHJP
【ＦＩ】
C12N15/88 Z ZNA
C12N15/09 110
C12N15/113 Z
A61P21/00
A61K48/00
A61K9/14
A61K47/69
A61K47/44
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022533105
(86)(22)【出願日】2020-12-03
(85)【翻訳文提出日】2022-07-29
(86)【国際出願番号】 US2020063150
(87)【国際公開番号】W WO2021113536
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】62/943,093
(32)【優先日】2019-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507189666
【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】ガーズバック チャールズ エイ
(72)【発明者】
【氏名】ネルソン クリストファー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA31
4C076AA61
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB13
4C076BB15
4C076CC09
4C076CC41
4C076EE51
4C084AA13
4C084MA41
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
(57)【要約】
本発明は、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を使用した遺伝子編集機構の送達のためのＤＮＡ標的化システムおよび方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
筋細胞にＤＮＡ標的化システムを送達するための脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子であって、前記ＤＮＡ標的化システムは、変異ジストロフィン遺伝子のフラグメントを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子；および／または
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項2】
前記少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項3】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである、請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項4】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ標的化ドメインを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号８３、もしくは配列番号１１０から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１１２～１２４から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３８、配列番号４２、配列番号８４、もしくは配列番号１１１から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１２５～１３４またはそのフラグメントもしくは相補鎖から選択されるヌクレオチド配列を含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的化ドメインを含む、請求項２～３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項5】
前記第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１０の前記ヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１２４の前記ヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、前記第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１１の前記ヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１３４の前記ヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む、請求項４に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項6】
前記少なくとも１種のｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項7】
前記少なくとも１種のｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする前記ポリヌクレオチドはそれぞれ、別々の脂質ナノ粒子中に封入される、請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項8】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）、および固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項9】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項10】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項11】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項12】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項13】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項14】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）である、請求項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項15】
前記少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、前記変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソン、または前記変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソンと隣接するイントロンを標的とする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項16】
前記ＤＮＡ標的化システムは、野生型ジストロフィン遺伝子またはその機能的等価物のエクソンを含むドナー配列をさらに含み、前記エクソンは、前記野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項17】
前記少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する２つのイントロンを標的とする、請求項１～１６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項18】
前記ＤＮＡ標的化システムは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第１のイントロンにおける第１の二本鎖切断およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第２のイントロンにおける第２の二本鎖切断を誘導する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項19】
前記ポリヌクレオチドは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９をコードする、請求項１～１８のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項20】
前記ｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡである、請求項３～１９のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項21】
前記改変ｍＲＮＡは、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、ＨＡタグ、およびウリジン置換から選択される１つまたは複数の改変を含む、請求項２０に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項22】
前記筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞から選択される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項23】
請求項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項24】
対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは請求項２３に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項25】
前記対象は、投与後に前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼと交差反応性の液性応答を経験しないか、または限定された液性応答を経験する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対象は、変異ジストロフィン遺伝子を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
対象において変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、請求項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは請求項２３に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項28】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、もしくは異常なスプライスドナー部位、またはその組み合わせを含む、請求項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切断型遺伝子産物の原因となるフレームシフト変異を含む、請求項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、前記リーディングフレームを破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む、請求項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集は、未成熟終止コドンの除去、破壊されたリーディングフレームの修正、スプライスアクセプター部位の破壊によるスプライシングの調節、スプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調節、エクソン５１の除去、またはその組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記変異ジストロフィン遺伝子は、相同組み換え修復によって編集される、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記対象におけるジストロフィン発現は、編集後に少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する、請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、誕生前または誕生の１～２日以内に前記対象に投与される、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、筋肉内、静脈内、またはその組み合わせで前記対象に投与される、請求項２４～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記脂質ナノ粒子もしくは前記マイクロ粒子または前記組成物の投与は、前記対象において機能的なジストロフィンタンパク質または部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の発現をもたらす、請求項２４～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
請求項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，０９３号に対する優先権を主張するものであり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，０９３号に対する優先権を主張するものであり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１２月３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、「０２８１９３－９３３６－ＷＯ０１＿Ａｓ＿Ｆｉｌｅｄ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、サイズは１４４キロバイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１２月３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、「０２８１９３－９３３６－ＷＯ０１＿Ａｓ＿Ｆｉｌｅｄ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、サイズは１４４キロバイトである。
【0003】
技術分野
本開示は、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を使用した遺伝子編集機構の送達のためのシステムおよび方法に関する。
本開示は、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を使用した遺伝子編集機構の送達のためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【0004】
遺伝性の遺伝子疾患は、米国の小児に対して破滅的な影響がある。これらの疾患は、現在治癒せず、症状を軽減する試みによってなんとかすることしかできない。数十年間、遺伝子治療の分野には、これらの疾患を治す望みがあった。しかしながら、細胞および患者への安全で効率的な治療遺伝子の送達に関する技術的障害がこのアプローチを制限してきた。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、機能的なジストロフィンの欠損による筋消耗、歩行不能、および一般に２０代での死亡によって臨床的に特徴づけられる致死性遺伝子疾患である。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子における遺伝性または自然突然変異の結果である。ＤＭＤの原因となる大半の変異は、エクソンが欠失し、翻訳リーディングフレームがフレーム外に押し出された結果である。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、標的とするゲノム遺伝子座に部位特異的な二本鎖切断を導入するために使用することができる。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激して、２つの可能な修復経路のうちの１つにつながる。ドナー鋳型の非存在下では、この切断は、ＤＮＡの小さな挿入または欠失につながる誤りやすい修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されることになる。この方法は、標的とする遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、除去または改変するために使用することができる。しかしながら、ドナー鋳型がヌクレアーゼとともに供給される場合、細胞機構は、相同組み換えによって切断を修復することになり、これは、ＤＮＡ切断の存在下では桁違いに増強される。この方法は、標的部位においてＤＮＡ配列中に特異的な変化を導入するために使用することができる。操作されたヌクレアーゼは、さまざまなヒト幹細胞および細胞株における遺伝子編集のため、ならびにマウス肝臓における遺伝子編集のために使用されてきた。しかしながら、これらの技術を行うことに対する主な障害は、効果的で効率的であり、ゲノム改変の成功を容易にするような方法でのインビボにおける特定の組織への送達である。
インビボにおける遺伝子治療および遺伝子編集アプローチは、一般に遺伝子送達のためにウイルスベクターを使用する。これらのウイルスベクターは、製造するのが難しく、高価で、既にこれらのウイルスに対する免疫応答を有する患者には使用することができない。さらに、ウイルスベクターは、再投与に適さない場合もあり、他の安全性への懸念によって制限される。本明細書に記載の方法は、重大な宿主応答を含む、ウイルスベクター送達の危険を回避すると同時にデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト化マウスモデルにおいてジストロフィン遺伝子を編集し、ジストロフィンを首尾よく回復させるための、非ウイルスＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡおよび２種のｇＲＮＡを伴う、非ウイルス送達ビヒクルである脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子の成功した使用に関する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムは、標的とするゲノム遺伝子座に部位特異的な二本鎖切断を導入するために使用することができる。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激して、２つの可能な修復経路のうちの１つにつながる。ドナー鋳型の非存在下では、この切断は、ＤＮＡの小さな挿入または欠失につながる誤りやすい修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されることになる。この方法は、標的とする遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、除去または改変するために使用することができる。しかしながら、ドナー鋳型がヌクレアーゼとともに供給される場合、細胞機構は、相同組み換えによって切断を修復することになり、これは、ＤＮＡ切断の存在下では桁違いに増強される。この方法は、標的部位においてＤＮＡ配列中に特異的な変化を導入するために使用することができる。操作されたヌクレアーゼは、さまざまなヒト幹細胞および細胞株における遺伝子編集のため、ならびにマウス肝臓における遺伝子編集のために使用されてきた。しかしながら、これらの技術を行うことに対する主な障害は、効果的で効率的であり、ゲノム改変の成功を容易にするような方法でのインビボにおける特定の組織への送達である。
インビボにおける遺伝子治療および遺伝子編集アプローチは、一般に遺伝子送達のためにウイルスベクターを使用する。これらのウイルスベクターは、製造するのが難しく、高価で、既にこれらのウイルスに対する免疫応答を有する患者には使用することができない。さらに、ウイルスベクターは、再投与に適さない場合もあり、他の安全性への懸念によって制限される。本明細書に記載の方法は、重大な宿主応答を含む、ウイルスベクター送達の危険を回避すると同時にデュシェンヌ型筋ジストロフィーのヒト化マウスモデルにおいてジストロフィン遺伝子を編集し、ジストロフィンを首尾よく回復させるための、非ウイルスＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡおよび２種のｇＲＮＡを伴う、非ウイルス送達ビヒクルである脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子の成功した使用に関する。
【発明の概要】
【0005】
ある態様において、本開示は、ＤＮＡ標的化システムを含む脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子に関する。ＤＮＡ標的化システムは、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子、および／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、筋細胞にＤＮＡ標的化システムを送達するためのものである。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、変異ジストロフィン遺伝子のフラグメントを標的とする。
【0006】
ある態様において、本開示は、筋細胞にＤＮＡ標的化システムを送達するための脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子であって、ＤＮＡ標的化システムは、変異ジストロフィン遺伝子のフラグメントを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子、および／またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子に関する。
【0007】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ標的化ドメインを含み、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号８３、もしくは配列番号１１０から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１１２～１２４から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３８、配列番号４２、配列番号８４、もしくは配列番号１１１から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１２５～１３４またはそのフラグメントもしくは相補鎖から選択されるヌクレオチド配列を含み、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１０のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１２４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１３４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、別々の脂質ナノ粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）、および固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）である。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）である。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソン、または変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソンと隣接するイントロンを標的とする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化システムは、野生型ジストロフィン遺伝子またはその機能的等価物のエクソンを含むドナー配列をさらに含み、エクソンは、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する２つのイントロンを標的とする。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化システムは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第１のイントロンにおける第１の二本鎖切断およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第２のイントロンにおける第２の二本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９をコードする。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、改変ｍＲＮＡは、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、ＨＡタグ、およびウリジン置換から選択される１つまたは複数の改変を含む。いくつかの実施形態において、筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞から選択される。
【0008】
別の態様において、本開示は、本明細書において詳述される脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【0009】
本開示の別の態様は、対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法を提供する。本方法は、本明細書において詳述される脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは本明細書において詳述される組成物を対象に投与することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、対象は、投与後にＣａｓ９タンパク質またはヌクレアーゼと交差反応性の液性応答を経験しないか、または限定された液性応答を経験する。いくつかの実施形態において、対象は、変異ジストロフィン遺伝子を含む。
【0010】
本開示の別の態様は、対象において変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法を提供する。本方法は、本明細書において詳述される脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは本明細書において詳述される組成物を対象に投与することを含んでもよい。
【0011】
いくつかの実施形態において、変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、もしくは異常なスプライスドナー部位、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切断型遺伝子産物の原因となるフレームシフト変異を含む。いくつかの実施形態において、変異ジストロフィン遺伝子は、リーディングフレームを破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む。いくつかの実施形態において、変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集は、未成熟終止コドンの除去、破壊されたリーディングフレームの修正、スプライスアクセプター部位の破壊によるスプライシングの調節、スプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調節、エクソン５１の除去、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、変異ジストロフィン遺伝子は、相同組み換え修復によって編集される。いくつかの実施形態において、対象におけるジストロフィン発現は、編集後に少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、誕生前または誕生の１～２日以内に対象に投与される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、筋肉内、静脈内、またはその組み合わせで対象に投与される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子または組成物の投与は、対象において機能的なジストロフィンタンパク質または部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の発現をもたらす。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含むキットを提供する。
本開示は、以下の詳細な説明および添付の図面に照らして明白になるであろうその他の態様および実施形態を提供する。
本開示の別の態様は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含むキットを提供する。
本開示は、以下の詳細な説明および添付の図面に照らして明白になるであろうその他の態様および実施形態を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＳｐＣａｓ９抗体に対するＥＬＩＳＡの結果を示す図であり、ＲＮＰの注射後にＳｐＣａｓ９酵素に対する液性応答を示すが、ＳｐＣａｓ９をコードするｍＲＮＡに対しては示さないことを示す図である。
【図2】ｍＲＮＡの局所投与はｈＤＭＤ／ｄ５２マウスからエクソン５１を除去することができたが、ＲＮＰはできなかったことを示す図である。
【図3】ｍＲＮＡの局所投与によるエクソン５１の除去がジストロフィンの発現を回復させることを示す図である。
【図4】ｍＲＮＡ注射が強い液性応答につながらなかったことを示す図である。ＲＮＰ投与は、局所および全身的注射の両方においてＣａｓ９抗体を上昇させた。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書に記載されるとおり、特定のＤＮＡ標的化システムおよび方法が遺伝子の発現の改変、ゲノム操作、および遺伝子疾患に関与する遺伝子における変異の影響の修正または低減に効果的であることが発見された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムの脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子送達は、１種または複数種の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されたＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび少なくとも１種のガイドＲＮＡを伴う。特に、本開示は、１種または複数種の脂質ナノ粒子マイクロ粒子における送達のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムのＤＮＡ配列標的化機能を組み合わせて、非ウイルス送達システムにより遺伝子発現および／またはエピジェネティクな状態の変更を可能にするＤＮＡ標的化システムを示す。本システムおよび方法は、ゲノム操作および遺伝子変異の影響の修正または低減にも使用することができる。
【0014】
１．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が優先されることになる。好ましい方法および材料が以下に示されるが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用されてもよい。本明細書において言及されるすべての公報、特許出願、特許およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書中で開示されている材料、方法、および例は、説明のためのものに過ぎず、限定することは意図しない。
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が優先されることになる。好ましい方法および材料が以下に示されるが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用されてもよい。本明細書において言及されるすべての公報、特許出願、特許およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書中で開示されている材料、方法、および例は、説明のためのものに過ぎず、限定することは意図しない。
【0015】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、およびその変形は、本明細書中で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を除外しない非限定的移行句、用語または語であることが意図される。単数形「１つの、ある（ａ）」、「および（ａｎｄ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り複数の言及を含む。本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書において提示されている実施形態または要素を「含む」、それ「からなる」ならびに「基本的にそれからなる」他の実施形態も意図する。
本明細書中で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り複数の指示対象を含む。このように、例えば、「あるイントロン（ａｎ ｉｎｔｒｏｎ）」の言及は、２つ以上のイントロンを含み、「ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」の言及は、複数のそのような細胞を含み、「その培養物（ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）」の言及は、１つまたは複数の培養物および当業者に既知のその等価物などの言及を含む。本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、別に明記されない限り本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書における数値範囲の列挙に関して、同精度のその間にあるそれぞれの数が明確に意図される。例えば、６～９の範囲に対して、６および９に加えて数７および８が意図され、範囲６．０～７．０に対して、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明確に意図される。
本明細書中で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り複数の指示対象を含む。このように、例えば、「あるイントロン（ａｎ ｉｎｔｒｏｎ）」の言及は、２つ以上のイントロンを含み、「ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」の言及は、複数のそのような細胞を含み、「その培養物（ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）」の言及は、１つまたは複数の培養物および当業者に既知のその等価物などの言及を含む。本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、別に明記されない限り本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書における数値範囲の列挙に関して、同精度のその間にあるそれぞれの数が明確に意図される。例えば、６～９の範囲に対して、６および９に加えて数７および８が意図され、範囲６．０～７．０に対して、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明確に意図される。
【0016】
「アミノ酸」は、本明細書中で使用される場合、天然に存在するアミノ酸および非天然の合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるものである。アミノ酸は、本明細書ではＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている一般的に知られているそれらの３文字記号または１文字記号のいずれかによって言及されてもよい。アミノ酸は、側鎖およびポリペプチド骨格部分を含む。
【0017】
「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与された個人または哺乳動物の細胞における発現を誘導することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントと機能可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含んでもよい。コード配列は、コドン最適化されてもよい。
【0018】
「相補鎖」または「相補的な」は、本明細書中で使用される場合、核酸を意味し、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間のワトソン・クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を意味する場合がある。「相補性」は、互いに逆平行に整列させられたときに、それぞれの位置のヌクレオチド塩基が相補的になるような２つの核酸配列の間で共有される特性を指す。
【0019】
「対照」、「基準レベル」、および「基準」という用語は、本明細書中で同義に使用される。基準レベルは、所定の値または範囲であってもよく、これは、測定結果を評価するためのベンチマークとして利用される。「対照群」は、本明細書中で使用される場合、対照の対象の群を指す。所定のレベルは、対照群からのカットオフ値であってもよい。所定のレベルは、対照群からの平均であってもよい。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、適用的指標モデル（ＡＩＭ）方法論によって決定されてもよい。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、患者群の生物学的サンプルからの受信者動作曲線（ＲＯＣ）分析によって決定されてもよい。生物学分野において公知であるＲＯＣ分析は、ある状態を別の状態と区別する試験の能力、例えば、ＣＲＣを有する患者を特定する際の各マーカーの性能を判断するための試験の能力の判定である。ＲＯＣ分析の説明は、P.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)において提供されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、カットオフ値は、患者群の生物学的サンプルの四分位分析によって決定されてもよい。例えば、カットオフ値は、２５～７５パーセンタイル範囲内の任意の値に対応する値、好ましくは、２５パーセンタイル、５０パーセンタイルまたは７５パーセンタイル、より好ましくは、７５パーセンタイルに対応する値を選択することによって決定されてもよい。そのような統計分析は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して実施されてもよく、（例えば、Ａｎａｌｙｓｅ－ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ．、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ．の）任意の数の市販のソフトウェアパッケージにより実施することができる。標的またはタンパク質活性に関する健康または正常なレベルまたは範囲は、標準的な実務に従って定義されてもよい。対照は、本明細書において詳述されるアゴニストを用いない対象または細胞であってもよい。対照は、疾患状態がわかっている対象またはその対象からのサンプルであってもよい。対象、またはその対象からのサンプルは、健康、病的状態、処置に先立つ病的状態、処置中の病的状態、もしくは処置後の病的状態、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0020】
「修正すること」、「ゲノム編集すること」、および「回復させること」は、本明細書中で使用される場合、切断型タンパク質をコードするか、またはまったくタンパク質をコードしない変異遺伝子を、完全長の機能的なタンパク質発現または部分的な長さの機能的なタンパク質発現が得られるような変更を指す。変異遺伝子を修正することまたは回復させることは、相同組み換え修復（ＨＤＲ）などの修復機構により変異がない遺伝子のコピーで変異を有する遺伝子の領域を置換することまたは変異遺伝子全体を置換することを含んでもよい。変異遺伝子を修正することまたは回復させることはまた、その後、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復される遺伝子に二本鎖切断を形成することによって未成熟終止コドン、異常なスプライスアクセプター部位または異常なスプライスドナー部位の原因となるフレームシフト変異を修復することも含んでもよい。ＮＨＥＪは、修復の間に少なくとも１つの塩基対を付加または除去する場合もあり、これが、適切なリーディングフレームに戻し、未成熟終止コドンを除去する場合もある。変異遺伝子を修正することまたは回復させることはまた、異常なスプライスアクセプター部位またはスプライスドナー配列を破壊することも含んでもよい。変異遺伝子を修正することまたは回復させることはまた、２つのヌクレアーゼ標的部位の間のＤＮＡを除去し、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することによって適切なリーディングフレームに戻すために同じＤＮＡ鎖に対する２種のヌクレアーゼの同時作用により必須でない遺伝子セグメントを除去することも含んでもよい。
【0021】
本明細書中で同義に使用される「ドナーＤＮＡ」、「ドナー鋳型」、「ドナー配列」、および「修復鋳型」は、目的とする遺伝子の少なくとも一部を含む二本鎖のＤＮＡフラグメントまたは分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質をコードする場合もある。ドナー配列は、タンパク質をコードする野生型配列のフラグメントを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ドナー配列は、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソンまたはその機能的等価物を含み、例えば、エクソンは、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される。
【0022】
本明細書中で同義に使用される「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」は、筋変性および最終的に死をもたらす劣性の致死性Ｘ連鎖障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性単一遺伝子疾患であり、３５００人に１人の男性に生じる。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中のナンセンス変異またはフレームシフト変異の原因となる遺伝性または自然突然変異の結果である。ＤＭＤの原因となるジストロフィン変異の大半は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子における未成熟な翻訳終結の原因となるエクソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、一般に小児期に自分を身体的に支える能力を失い、１０代の間に段々と弱くなり、２０代で死亡する。
【0023】
「ジストロフィン」は、本明細書中で使用される場合、細胞膜を通って筋線維の細胞骨格を周辺の細胞外基質と連結するタンパク質複合体の一部である棒状の細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の制御に関与する細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性を与える。本明細書中で同義に使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、遺伝子座Ｘｐ２１にある２．２メガベースである。一次転写は、約２，４００ｋｂを示し、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９のエクソンは、タンパク質をコードし、これは、３５００アミノ酸長を超える。
「封入される」は、本明細書中で使用される場合、完全な封入、部分的な封入、または両方によりｍＲＮＡまたはｇＲＮＡを提供する脂質ナノ粒子を指す。ある実施形態において、核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に完全に封入される。
「封入される」は、本明細書中で使用される場合、完全な封入、部分的な封入、または両方によりｍＲＮＡまたはｇＲＮＡを提供する脂質ナノ粒子を指す。ある実施形態において、核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に完全に封入される。
【0024】
「エクソン５１」は、本明細書中で使用される場合、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１を指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者においてフレームを破壊する欠失に高い頻度で隣接し、オリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピングに関する臨床試験において標的とされてきた。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンに関する臨床試験により、最近、４８週にわたる顕著な機能的な恩恵が報告され、ベースラインと比較して平均４７％ジストロフィン陽性線維であった。エクソン５１における変異は、理想的にはＮＨＥＪベースのゲノム編集による永続的な修正が適している。
本明細書中で同義に使用される「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡにおけるコドンのリーディングフレームのシフトを引き起こす遺伝子変異のタイプを指す。リーディングフレームのシフトは、タンパク質翻訳におけるアミノ酸配列の変更、例えば、ミスセンス変異または未成熟終止コドンなどにつながることがある。
本明細書中で同義に使用される「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡにおけるコドンのリーディングフレームのシフトを引き起こす遺伝子変異のタイプを指す。リーディングフレームのシフトは、タンパク質翻訳におけるアミノ酸配列の変更、例えば、ミスセンス変異または未成熟終止コドンなどにつながることがある。
【0025】
「機能的な」および「完全に機能的な」は、本明細書中で使用される場合、生物学的活性を有するタンパク質を示す。「機能性遺伝子」は、（完全または部分的に）機能的なタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
「融合タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、もともと別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の連結により作り出されるキメラタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元の各タンパク質由来の機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
「融合タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、もともと別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の連結により作り出されるキメラタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元の各タンパク質由来の機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
【0026】
「遺伝子コンストラクト」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与された個体の細胞において発現を誘導することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節エレメントに機能可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書中で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞に存在する場合、コード配列が発現されるよう、タンパク質をコードするコード配列に機能可能に連結された必須の調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトを指す。
「遺伝子疾患」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムの１つまたは複数の異常、特に、誕生時からある状態が部分的または完全に、直接的または間接的に原因となる疾患を指す。異常は、変異、挿入または欠失である場合がある。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼす場合もある。遺伝子疾患は、以下に限定されるものではないが、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病である場合もある。
「遺伝子疾患」は、本明細書中で使用される場合、ゲノムの１つまたは複数の異常、特に、誕生時からある状態が部分的または完全に、直接的または間接的に原因となる疾患を指す。異常は、変異、挿入または欠失である場合がある。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼす場合もある。遺伝子疾患は、以下に限定されるものではないが、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病である場合もある。
【0027】
「ゲノム編集」または「遺伝子編集」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子を変更することを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは回復させることを含んでもよい。ゲノム編集は、変異遺伝子または正常な遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含んでもよい。ゲノム編集は、目的とする遺伝子を変更することによって疾患を処置するため、または筋肉修復を増大させるために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書において詳述される組成物および方法は、生殖系列細胞でなく体細胞において使用するためのものである。
【0028】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列と関連した「同一の」または「同一性」は、本明細書中で使用される場合、配列が特定の領域にわたり同じである特定のパーセンテージの残基を有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適にアライメントし、特定の領域にわたり２つの配列を比較し、両配列において同一の残基が生じる位置の数を求めて、一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域にある位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出されてもよい。２つの配列の長さが異なるか、またはアライメントが１つまたは複数の付着末端をもたらし、比較の特定の領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、算出の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等と見なされてもよい。同一性は、手作業で行われてもよく、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用して行われてもよい。
【0029】
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、本明細書中で使用される場合、脂質成分によって形成された、ナノメートル台（例えば、１～１，０００ｎｍ）の少なくとも１つの寸法を有する粒子と定義される。ＬＮＰは、いくつかの実施形態において、治療用薬剤を封入する。治療用薬剤としては、以下に限定されるものではないが、核酸分子、化合物、ウイルス粒子、タンパク質、またはペプチドが挙げられる。一実施形態において、ＬＮＰは、１つまたは複数の核酸分子を封入する。「マイクロ粒子」という用語は、１０ｎｍから約２００マイクロメートルの少なくとも１つの寸法を有する粒子を指す。
【0030】
「脂質」という用語は、脂肪酸の誘導体（例えば、エステル）であり、一般に水には不溶性であるが、多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物のグループを指す。脂質は、通常、以下の少なくとも３つのクラスに分けられる：（１）脂肪および油ならびにワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。本明細書中で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性であるか、またはｐＨが脂質のイオン化基のｐＫよりも低くなるとカチオン性になる（プロトン化される）が、高いｐＨ値で段々に中性になる脂質を指す。ｐＫより低いｐＨ値では、その結果、脂質が負の電荷をもつ核酸と結合することができる。特定の実施形態において、カチオン性脂質は、ｐＨ低下時に正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。
本明細書中で同義に使用される「変異遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異が起きた遺伝子を指す。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を及ぼす遺伝物質の変化、例えば、喪失、増加，または交換が起こっている。「破壊された遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、未成熟終止コドンの原因となる変異を有する変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長型の破壊されていない遺伝子産物と比較して切断されている。
本明細書中で同義に使用される「変異遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異が起きた遺伝子を指す。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を及ぼす遺伝物質の変化、例えば、喪失、増加，または交換が起こっている。「破壊された遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、未成熟終止コドンの原因となる変異を有する変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長型の破壊されていない遺伝子産物と比較して切断されている。
【0031】
「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、本明細書中で使用される場合、相同鋳型を必要とせずに切断末端を直接に連結することによってＤＮＡの二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端の鋳型非依存的な再連結は、ＤＮＡ切断点にランダムな小さな挿入および小さな欠失（インデル）を組み込む確率的な誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とする遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、除去、または改変するために使用される場合もある。ＮＨＥＪは、一般に修復を誘導するためにマイクロホモロジーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、二本鎖切断の末端にある一本鎖オーバーハングに存在することが多い。オーバーハングが完全に適合する場合、ＮＨＥＪは、通常、切断を正確に修復するが、ヌクレオチドの喪失につながる不正確な修復が起こる場合もあり、オーバーハングが適合しない場合がはるかに一般的である。
【0032】
「正常な遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、遺伝物質の変化、例えば、喪失、増加、または交換が起こっていない遺伝子を指す。正常な遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を経る。
「ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ」は、本明細書中で使用される場合、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。
「ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ」は、本明細書中で使用される場合、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。
【0033】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は、相補的な鎖の配列も定義する。このように、核酸は、描写される一本鎖の相補的な鎖も包含する。核酸の多くのバリアントが、所与の核酸と同じ目的のために使用されてもよい。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補鎖も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において標的配列とハイブリダイズすることができるプローブを提供する。よって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズするプローブも包含する。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、あるいは二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む、塩基の組み合わせを含んでもよい。核酸は、化学合成法によって、または組み換え法によって得られてもよい。
【0034】
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わるひと続きのコドンを指す。複数のエクソンを有する真核生物遺伝子において、イントロンが除去され、その後、エクソンが転写後に一緒に連結されて、タンパク質翻訳のための最終的なｍＲＮＡが得られる。オープンリーディングフレームは、連続的なひと続きのコドンであってもよい。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレームは、ゲノムＤＮＡではなく、タンパク質の発現のためのスプライシングされたｍＲＮＡにのみ適用される。
「機能可能に連結された」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子の発現が、遺伝子が空間的に接続されたプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置されてもよい。プロモーターと遺伝子の間の距離は、当該プロモーターが由来する遺伝子において、当該プロモーターとその制御する遺伝子の間の距離とほぼ同じであってもよい。当該技術分野において知られているとおり、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。
「部分的に機能的な」は、本明細書中で使用される場合、変異遺伝子によってコードされ、機能的なタンパク質よりも低いが、非機能的なタンパク質よりも高い生物学的活性を有するタンパク質を示す。
「機能可能に連結された」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子の発現が、遺伝子が空間的に接続されたプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置されてもよい。プロモーターと遺伝子の間の距離は、当該プロモーターが由来する遺伝子において、当該プロモーターとその制御する遺伝子の間の距離とほぼ同じであってもよい。当該技術分野において知られているとおり、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。
「部分的に機能的な」は、本明細書中で使用される場合、変異遺伝子によってコードされ、機能的なタンパク質よりも低いが、非機能的なタンパク質よりも高い生物学的活性を有するタンパク質を示す。
【0035】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の連結された配列である。ポリペプチドは、天然、合成、もしくは改変または天然および合成の組み合わせであってもよい。ペプチドおよびポリペプチドは、結合タンパク質、受容体、および抗体などのタンパク質を含む。「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、本明細書では同義に使用される。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内で局所的に配列された三次元構造を指す。これらの構造は、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、および細胞質テールドメインとして一般的に知られている。「ドメイン」は、ポリペプチドの小型単位を形成し、一般に１５～３５０アミノ酸長である、ポリペプチドの一部である。例となるドメインとしては、酵素活性またはリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、ひと続きのベータシートおよびアルファヘリックスなどのあまり組織化されていないセクションから構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有結合によって形成される三次元構造を指す。「モチーフ」は、ポリペプチド配列の一部であり、少なくとも２つのアミノ酸を含む。モチーフは、２～２０、２～１５、または２～１０アミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、モチーフは、３、４、５、６、または７つの連続したアミノ酸を含む。ドメインは、一連の同じタイプのモチーフから構成されてもよい。
【0036】
本明細書中で同義に使用される「未成熟終止コドン」または「アウトオブフレーム終止コドン」は、野生型遺伝子では通常見られない場所に終止コドンをもたらすＤＮＡの配列におけるナンセンス変異を指す。未成熟終止コドンは、切断されているか、またはタンパク質の完全長型版と比較して短いタンパク質をもたらす場合もある。
【0037】
「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合は、細胞における核酸の発現を付与、活性化、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、その発現をさらに増強させるならびに／あるいは空間的な発現および／または時間的な発現を改変する１または複数種の特定の転写調節配列を含んでもよい。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置してもよい遠位のエンハンサーまたは抑制エレメントも含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含むソース由来であってもよい。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織もしくは臓器に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘発剤などの外的刺激に応じて遺伝子成分の発現を構成的、または差別的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター・プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
【0038】
「組み換えの」という用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸またはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは細胞がそのように改変された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然の（天然に存在する）形態内では見られない遺伝子を発現するか、あるいは別の状況では普通もしくは異常に発現される、低発現の、またはまったく発現されない天然の遺伝子の第２のコピーを発現する。
【0039】
本明細書中で同義に使用される「反復可変二残基」または「ＲＶＤ」は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの３３～３５のアミノ酸を含む（「ＲＶＤモジュール」としても知られている）ＤＮＡ認識モチーフ内の１組の隣接するアミノ酸残基を指す。ＲＶＤは、ＲＶＤモジュールのヌクレオチド特異性を決定する。ＲＶＤモジュールは、ＲＶＤアレイをもたらすために組み合わされてもよい。「ＲＶＤアレイ長」は、本明細書中で使用される場合、ＴＡＬＥＮによって認識されるＴＡＬＥＮ標的領域、すなわち、結合領域内のヌクレオチド配列の長さに相当するＲＶＤモジュールの数を指す。
【0040】
「部位特異的ヌクレアーゼ」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ配列を特異的に認識し、切断することができる酵素を指す。部位特異的ヌクレアーゼは、操作されてもよい。操作された部位特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースのシステムが挙げられる。
【0041】
「対象」および「患者」は、本明細書中で使用される場合、同義に本明細書に記載の組成物または方法を望むか、またはそれを必要とする哺乳動物を含むが、これらに限定されないあらゆる脊椎動物を指す。対象は、ヒトまたは非ヒトであってもよい。対象は、脊椎動物であってもよい。対象は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物は、霊長類または非霊長類であってもよい。哺乳動物は、例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、アルパカ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、テンジクネズミ、ネコ、イヌ、ラット、およびマウスなどの非霊長類であってもよい。哺乳動物は、ヒトなどの霊長類であってもよい。哺乳動物は、例えば、サル、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、オラウータン、およびテナガザルなどの非ヒト霊長類であってもよい。対象は、例えば、成人、青年、０～２、２～４、２～６、もしくは６～１２歳などの小児、または０～１歳などの乳児などのいかなる年齢あるいは発達の段階であってもよい。対象は、男性であってもよい。対象は、女性であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、特定の遺伝子マーカーを有する。対象は、他の形態の処置を受けていてもよい。
【0042】
「標的遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、既知の遺伝子産物または推定される遺伝子産物をコードするあらゆるヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝子疾患に関与する変異した遺伝子であってもよい。
「導入遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、ある生物から単離され、異なる生物に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝物質を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物においてＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持してもよく、あるいはトランスジェニック生物の遺伝子コードの通常の機能を改変してもよい。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変える可能性がある。
「転写調節エレメント」または「調節エレメント」は、核酸配列の発現を制御すること、例えば、発現を活性化する、促進、もしくは低減することができるか、または核酸配列の空間的および／または時間的な発現を改変することができる遺伝子エレメントを指す。調節エレメントの例としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、および終結シグナルが挙げられる。調節エレメントは、機能可能に連結される遺伝子に対して「内在性」、「外来性」または「異種」であってもよい。「内在性」調節エレメントは、ゲノムの所与の遺伝子ともともと連結されているものである。「外来性」または「異種」調節エレメントは、所与の遺伝子と通常連結されていないが、遺伝子操作によって遺伝子と機能可能な連結で配置されたものである。
「導入遺伝子」は、本明細書中で使用される場合、ある生物から単離され、異なる生物に導入される遺伝子配列を含む遺伝子または遺伝物質を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物においてＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持してもよく、あるいはトランスジェニック生物の遺伝子コードの通常の機能を改変してもよい。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変える可能性がある。
「転写調節エレメント」または「調節エレメント」は、核酸配列の発現を制御すること、例えば、発現を活性化する、促進、もしくは低減することができるか、または核酸配列の空間的および／または時間的な発現を改変することができる遺伝子エレメントを指す。調節エレメントの例としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、および終結シグナルが挙げられる。調節エレメントは、機能可能に連結される遺伝子に対して「内在性」、「外来性」または「異種」であってもよい。「内在性」調節エレメントは、ゲノムの所与の遺伝子ともともと連結されているものである。「外来性」または「異種」調節エレメントは、所与の遺伝子と通常連結されていないが、遺伝子操作によって遺伝子と機能可能な連結で配置されたものである。
【0043】
「処置」または「処置すること」または「治療」は、疾患からの対象の保護を言及する場合、疾患の進行を抑制すること、抑えること、逆行させること、軽減すること、回復させること、もしくは阻害すること、または疾患を完全に排除することを意味する。処置は、短期的または長期的な様式のいずれかで行われてもよい。この用語は、疾患による苦痛に先立って疾患またはそのような疾患と関連する症状の重症度を低減することも指す。処置は、疾患の症状の発生率、頻度、重症度、および／または期間を低減する場合もある。疾患を予防することは、疾患の発症前に本発明の組成物を対象に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘導後であるが臨床的所見の前に本発明の組成物を対象に投与することを含む。疾患を抑えることまたは回復させることは、疾患の臨床的所見後に本発明の組成物を対象に投与することを含む。
【0044】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、特定の遺伝子の活性および／または発現が調節されるよう、ポリペプチドまたは核酸配列が患者の細胞に導入される、患者を処置する方法を指す。特定の実施形態において、遺伝子の発現が抑制される。特定の実施形態において、遺伝子の発現が増強される。特定の実施形態において、遺伝子の発現の時間的または空間的パターンが調節される。
【0045】
ポリヌクレオチドに関して本明細書中で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部もしくはフラグメント；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の相補鎖もしくはその一部；（ｉｉｉ）参照核酸と実質的に同一の核酸もしくはその相補鎖；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参照核酸とハイブリダイズする核酸、その相補鎖、もしくはそれと実質的に同一の配列を意味する。
【0046】
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する場合もある。「生物学的活性」の代表的な例としては、特異抗体もしくはポリペプチドによって結合される能力または免疫応答を促進する能力が挙げられる。バリアントは、その機能的なフラグメントを意味する場合がある。バリアントは、ポリペプチドの複数のコピーを意味する場合もある。複数のコピーは、タンデムであっても、またはリンカーによって分離されていてもよい。アミノ酸の保存的置換、例えば、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置換することは、一般に軽微な変化を伴うと当該技術分野において認識されている。これらの軽微な変化は、当該技術分野において理解されるとおり、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって部分的に特定することができる(Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、疎水性および電荷の考慮に基づく。類似の疎水性親水性指標のアミノ酸は、置換されてもよく、依然としてタンパク質機能を保持することが当該技術分野において知られている。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換される。生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために、アミノ酸の親水性も使用することができる。ペプチドと関連したアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で置換が行われてもよい。アミノ酸の疎水性指標および親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。その観察結果と一致して、生物学的機能と適合したアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、およびその他の特性によって明らかにされるとおり、アミノ酸の相対的な類似性、特にそうしたアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。
【0047】
本明細書において別に定義されていない限り、本開示に関連して使用される科学および技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して、ならびにそれらの技術に使用されるあらゆる専門語は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。用語の意味および範囲は明確であるべきであるが、あらゆる潜在的意味不確定の場合、本明細書において示される定義が、いかなる辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。
【0048】
２．ゲノム編集のためのＤＮＡ標的化システム
本発明は、ゲノム編集、ゲノム改変、または遺伝子発現の改変のためのＤＮＡ標的化システムを対象とする。好適な実施形態において、本発明は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）の編集、ゲノム改変、または遺伝子発現の改変のためのＤＮＡ標的化システムを対象とする。本ＤＮＡ標的化システムは、遺伝子配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。本ＤＮＡ標的化システムは、１または複数種の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化システムのｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の周辺のイントロン領域を標的とすることができ、ＤＭＤ患者からの細胞における機能的なジストロフィンの発現を回復させるためにこの領域のゲノム欠失を引き起こす。
本発明は、ゲノム編集、ゲノム改変、または遺伝子発現の改変のためのＤＮＡ標的化システムを対象とする。好適な実施形態において、本発明は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）の編集、ゲノム改変、または遺伝子発現の改変のためのＤＮＡ標的化システムを対象とする。本ＤＮＡ標的化システムは、遺伝子配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。本ＤＮＡ標的化システムは、１または複数種の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化システムのｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の周辺のイントロン領域を標的とすることができ、ＤＭＤ患者からの細胞における機能的なジストロフィンの発現を回復させるためにこの領域のゲノム欠失を引き起こす。
【0049】
３．ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、細胞膜を通って筋線維の細胞骨格を周辺の細胞外基質と連結するタンパク質複合体の一部である棒状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１にある２．２メガベースである。一次転写は、約２，４００ｋｂを示し、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９のエクソンは、３５００を超えるアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織は、少量のジストロフィンしか含まないが、異常な発現によるその欠如は重い症状の発症につながる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの変異は、罹患患者において欠陥があるジストロフィンの産生および重度のジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの変異は、罹患患者において部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかに軽度のジストロフィー表現型をもたらす。
ジストロフィンは、細胞膜を通って筋線維の細胞骨格を周辺の細胞外基質と連結するタンパク質複合体の一部である棒状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１にある２．２メガベースである。一次転写は、約２，４００ｋｂを示し、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９のエクソンは、３５００を超えるアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織は、少量のジストロフィンしか含まないが、異常な発現によるその欠如は重い症状の発症につながる。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの変異は、罹患患者において欠陥があるジストロフィンの産生および重度のジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子におけるいくつかの変異は、罹患患者において部分的に機能的なジストロフィンタンパク質およびはるかに軽度のジストロフィー表現型をもたらす。
【0050】
ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中のナンセンス変異またはフレームシフト変異の原因となる遺伝性または自然突然変異の結果である。ＤＭＤに関する天然に生じる変異およびその結果は、比較的よく理解されている。棒状ドメインに含まれるエクソン４５～５５領域（例えば、エクソン５１）に生じるインフレーム欠失が極めて機能的なジストロフィンタンパク質をもたらし、多くのキャリアが無症状かまたは軽度の症状を示すことがわかっている。さらに、６０％を超える患者が、ジストロフィン遺伝子のこの領域にあるエクソンを標的とすること（例えば、エクソン５１を標的とすること）によって理論上処置できる。ｍＲＮＡスプライシングの過程で必須でないエクソンをスキッピングすること（例えば、エクソン５１スキッピング）によってＤＭＤ患者の破壊されたジストロフィンリーディングフレームを元に戻して、内部的に欠失しているが機能的なジストロフィンタンパク質を産生するための努力がなされてきた。内部のジストロフィンエクソンの欠失（例えば、エクソン５１の欠失）は、適切なリーディングフレームを保持するが、重度の低いベッカー型筋ジストロフィー、すなわちＢＭＤをもたらす。ベッカー型筋ジストロフィー、すなわちＢＭＤ、遺伝子型は、欠失がジストロフィン遺伝子に存在すると言う点でＤＭＤと類似している。しかしながら、これらの欠失は、リーディングフレームを元のままにする。したがって、内部的に切断されるが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質が作り出される。ＢＭＤは、幅広い表現型を有するが、欠失がジストロフィンのエクソン４５～５５の間にある場合、表現型は、ＤＭＤと比較してはるかに軽症であることが多い。したがって、ＤＭＤ遺伝子型からＢＭＤ遺伝子型への変更は、ジストロフィンを修正するための一般的な戦略である。ジストロフィンを修正するために多くの方法が存在し、その多くが内在性ジストロフィンのリーディングフレームを元に戻すことによるものである。これにより、疾患遺伝子型がＤＭＤからベッカー型筋ジストロフィーに変化する。多くのＢＭＤ患者は、翻訳リーディングフレームを保持する遺伝子内欠失を有し、短いがおおかた機能的なジストロフィンタンパク質をもたらす。
【0051】
特定の実施形態において、リーディングフレームを元に戻すためのエクソン５１の改変（例えば、ＮＨＥＪによる、例えば、エクソン５１の欠失または除去）は、欠失変異を有するＤＭＤ対象を含む、表現型ＤＭＤ対象を改善する。特定の実施形態において、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１は、そのジストロフィン遺伝子のエクソン５１を指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者においてフレームを破壊する欠失に高い頻度で隣接し、オリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピングに関する臨床試験において標的とされてきた。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンに関する臨床試験により、４８週にわたる顕著な機能的な恩恵が報告され、ベースラインと比較して平均４７％ジストロフィン陽性線維であった。エクソン５１における変異は、理想的にはＮＨＥＪベースのゲノム編集による永続的な修正が適している。
【0052】
したがって、本開示は、本明細書において詳述される脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含むＤＮＡ標的化システムを提供する。脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ジストロフィン遺伝子、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子において切断を生じるＤＮＡ標的化システムを輸送することができる。特定の実施形態において、ＤＮＡ標的化システムは、ジストロフィン遺伝子の標的位置に隣接する２つのイントロン（第１のイントロンおよび第２のイントロン）に２つの二本鎖切断（第１の二本鎖切断および第２の二本鎖切断）を形成し、それによって、ジストロフィン標的位置を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるように構成される。ジストロフィンエクソンの標的位置の欠失は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている対象のジストロフィン配列を最適化することができ、例えば、コードされるジストロフィンタンパク質の機能もしくは活性を高めることができるか、または対象の疾患状態に改善をもたらすことができる。特定の実施形態において、ジストロフィンエクソンの標的位置の除去は、ジストロフィンリーディングフレームを元に戻す。ジストロフィンエクソンの標的位置は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンを含む場合がある。特定の実施形態において、ジストロフィン標的位置は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１を含む。
【0053】
本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１における極めて効率的な遺伝子編集を媒介することができる。本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＤＭＤ患者からの細胞においてジストロフィンタンパク質発現を回復させる。エクソン５１は、ＤＭＤにおいてフレームを破壊する欠失に隣接することが多い。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエクソン５１の排除は、すべてのＤＭＤ患者のうちのおよそ１５％を処置するために使用することができる。ジストロフィン変異のこのクラスは、理想的にはＮＨＥＪベースのゲノム編集およびＨＤＲによる永続的な修正に適している。本明細書に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１の標的改変のために開発された。本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ヒトＤＭＤ細胞に投与され、効率的な遺伝子改変および正しいリーディングフレームへの変換を媒介する。本発明のさまざまな態様において、ジストロフィン発現は、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する。
【0054】
４．ＣＲＩＳＰＲシステム
脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む本開示のＤＮＡ標的化システムは、以下に限定されるものではないが、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）を含む標的遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムのための構成要素を提供することができる。本明細書中で同義に使用される「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、およそ４０％の配列決定された細菌および ９０％の配列決定された古細菌のゲノムに見られる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ある形態の獲得免疫をもたらす侵入ファージおよびプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼシステムである。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲが関係する核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含む。スペーサーと呼ばれる外来性ＤＮＡの短いセグメントは、ＣＲＩＳＰＲリピート間のゲノムに組み込まれ、曝露後の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡ（本明細書において同義に「ｇＲＮＡ」とも言及される）の３’末端と複合体を形成し、そのタンパク質・ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端とプロトスペーサーとして知られている所定の２０ｂｐのＤＮＡ配列との間の相補的な塩基対合によってゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内にコードされる領域を介して病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に誘導する。非コードＣＲＩＳＰＲアレイは、転写され、ダイレクトリピート内で切断されて個々のスペーサー配列を含む短いｃｒＲＮＡにされ、これが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導される。発現されるｓｇＲＮＡの２０ｂｐの認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを新しいゲノム標的に誘導することが可能である。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核微生物のＲＮＡｉと類似の様式で外来性遺伝子エレメントを認識し、発現停止させるために使用される。
脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む本開示のＤＮＡ標的化システムは、以下に限定されるものではないが、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）を含む標的遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システムのための構成要素を提供することができる。本明細書中で同義に使用される「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、およそ４０％の配列決定された細菌および ９０％の配列決定された古細菌のゲノムに見られる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ある形態の獲得免疫をもたらす侵入ファージおよびプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼシステムである。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲが関係する核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡエレメントの組み合わせを含む。スペーサーと呼ばれる外来性ＤＮＡの短いセグメントは、ＣＲＩＳＰＲリピート間のゲノムに組み込まれ、曝露後の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡ（本明細書において同義に「ｇＲＮＡ」とも言及される）の３’末端と複合体を形成し、そのタンパク質・ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端とプロトスペーサーとして知られている所定の２０ｂｐのＤＮＡ配列との間の相補的な塩基対合によってゲノム標的を認識する。この複合体は、ｃｒＲＮＡ内にコードされる領域を介して病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に誘導する。非コードＣＲＩＳＰＲアレイは、転写され、ダイレクトリピート内で切断されて個々のスペーサー配列を含む短いｃｒＲＮＡにされ、これが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導される。発現されるｓｇＲＮＡの２０ｂｐの認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを新しいゲノム標的に誘導することが可能である。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核微生物のＲＮＡｉと類似の様式で外来性遺伝子エレメントを認識し、発現停止させるために使用される。
【0055】
３つのクラスのＣＲＩＳＰＲシステム（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ型エフェクターシステム）が知られている。ＩＩ型エフェクターシステムは、ｄｓＤＮＡを切断するための１種のエフェクター酵素Ｃａｓ９を使用して４つの連続したステップで標的とされるＤＮＡ二本鎖切断を行う。複合体として働く複数の別個のエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクターシステムと比較して、ＩＩ型エフェクターシステムは真核細胞などの別の状況においても機能可能である。ＩＩ型エフェクターシステムは、スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される長いｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質、およびｐｒｅ－ｃｒＲＮＡプロセシングに関与するｔｒａｃｒＲＮＡからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのスペーサーを分離するリピート領域とハイブリダイズし、それにより、内在性リボヌクレアーゼＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始する。この切断は、Ｃａｓ９による各スペーサー内における第２の切断事象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と結合したままの成熟ｃｒＲＮＡを生成して、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ・ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を形成する。
【0056】
Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ・ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はＤＮＡ二本鎖をほどき、切断のためにｃｒＲＮＡと合う配列を探す。標的認識は、標的ＤＮＡにある「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡにある残りのスペーサー配列との間の相補性の検出時に行われる。Ｃａｓ９は、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もプロトスペーサーの３’末端に存在する場合に、標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサー標的化に関して、配列は、ＤＮＡ切断に必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短い配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が直後に続かなくてはならない。異なるＩＩ型システムは、異なるＰＡＭ要件を有する。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲがＡまたはＧのいずれかである５’－ＮＲＧ－３’としてこのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に対するＰＡＭ配列を有する場合もあり、ヒト細胞におけるこのシステムの特異性を特徴づけた。本開示のＤＮＡ標的化システムの特有の能力は、１種のＣａｓ９タンパク質を２種以上のｓｇＲＮＡと同時発現することによって同時に複数の異なるゲノム遺伝子座を標的とする直接的な能力である。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型システムは、もともと「Ｎ」が任意のヌクレオチドであり得る「ＮＧＧ」配列を使用することを好むが、操作システムでは「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受け入れる（Hsu et al., Nature Biotechnology (2013) doi:10.1038/nbt.2647）。同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴの天然のＰＡＭを有するが、極めて変性したＮＮＮＮＧＮＮＮ ＰＡＭを含むさまざまなＰＡＭにわたり活性を有する（Esvelt et al. Nature Methods (2013) doi:10.1038/nmeth.2681）。
【0057】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ） （配列番号２２）を認識し、その配列の上流の標的核酸配列１～１０、例えば、３～５ｂｐの切断を誘導する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２３）を認識し、その配列の上流の標的核酸配列１～１０、例えば、３～５ｂｐの切断を誘導する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２４）を認識し、その配列の上流の標的核酸配列１～１０、例えば、３～５ｂｐの切断を誘導する。特定の実施形態において、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）（配列番号２５）を認識し、その配列の上流の標的核酸配列１～１０、例えば、３～５ｂｐの切断を誘導する。上記の実施形態において、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれかであってもよい。Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を改変するために操作されてもよい。
【0058】
５．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベースの遺伝子編集システム
化膿性連鎖球菌のＩＩ型エフェクターシステムの操作された形態は、ゲノム操作のためにヒト細胞において機能することが示された。このシステムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質は、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」はまた、短鎖キメラガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）と本明細書では同義に使用される）によってゲノム標的部位に誘導され、これは、リボヌクレアーゼＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシング全般を不要にするｃｒＲＮＡ・ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物である。ゲノム編集および遺伝子疾患の処置に使用するためのＤＮＡ標的化システムが本明細書において提供される。本開示のＤＮＡ標的化システムは、遺伝子疾患、加齢、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含む任意の遺伝子を標的とするよう設計することができる。ＤＮＡ標的化システムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび１または複数種のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡであってもよい。改変ｍＲＮＡは、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、ＨＡタグ、およびウリジン置換から選択される１つ以上の改変を含んでもよい。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、Ｃａｓ９に内在するものとは異なる活性を有するドメイン、例えばトランス活性化ドメインを含んでもよい。
化膿性連鎖球菌のＩＩ型エフェクターシステムの操作された形態は、ゲノム操作のためにヒト細胞において機能することが示された。このシステムにおいて、Ｃａｓ９タンパク質は、合成的に再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」はまた、短鎖キメラガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）と本明細書では同義に使用される）によってゲノム標的部位に誘導され、これは、リボヌクレアーゼＩＩＩおよびｃｒＲＮＡプロセシング全般を不要にするｃｒＲＮＡ・ｔｒａｃｒＲＮＡ融合物である。ゲノム編集および遺伝子疾患の処置に使用するためのＤＮＡ標的化システムが本明細書において提供される。本開示のＤＮＡ標的化システムは、遺伝子疾患、加齢、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含む任意の遺伝子を標的とするよう設計することができる。ＤＮＡ標的化システムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび１または複数種のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡであってもよい。改変ｍＲＮＡは、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、ＨＡタグ、およびウリジン置換から選択される１つ以上の改変を含んでもよい。Ｃａｓ９融合タンパク質は、例えば、Ｃａｓ９に内在するものとは異なる活性を有するドメイン、例えばトランス活性化ドメインを含んでもよい。
【0059】
標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）は、細胞の分化もしくは遺伝子の活性化が望まれ得る任意の他のプロセスに関与する可能性があるか、またはフレームシフト変異もしくはナンセンス変異などの変異を有する可能性がある。標的遺伝子が未成熟終止コドン、異常なスプライスアクセプター部位または異常なスプライスドナー部位の原因となる変異を有する場合、ＤＮＡ標的化システムは、未成熟終止コドン、異常なスプライスアクセプター部位または異常なスプライスドナー部位の上流または下流のヌクレオチド配列を認識し、結合するよう設計されてもよい。ＤＮＡ標的化システムは、スプライスアクセプターおよびドナーを標的として、未成熟終止コドンのスキッピングを誘導するか、または破壊されたリーディングフレームを元に戻すことによって通常の遺伝子スプライシングを妨害するために使用されてもよい。ＤＮＡ標的化システムは、ゲノムのタンパク質コード領域に対するオフターゲットの変化を媒介する場合も、またはしない場合もある。
【0060】
ａ．Ｃａｓ９分子およびＣａｓ９融合タンパク質
本発明のＤＮＡ標的化システムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、アキドウォラクス・アウェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクティノバキルルス・プレウロプネウモニアス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）、アクティノバキルルス・スッキノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクティノバキルルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、キュクリピルス・デニトゥリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウキウォランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンディダトゥス・プニケイスピリルルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガムマ・プロテオバクテリウム（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科細菌、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バキルリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ウィネアエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはウェルミネプロバクテル・エイスェニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）を含むが、これらに限定されるものではない任意の細菌または古細菌種由来であってもよい。特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、（本明細書において「ＳｐＣａｓ９」としても言及される）化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、（本明細書において「ＳａＣａｓ９」としても言及される）黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９分子は、変異Ｃａｓ９分子である。Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるよう変異していてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼ活性を有さない非活性化または不活性化Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９またはｉＣａｓ９）である。ヌクレアーゼ活性を不活性化するための化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列に関する例となる変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。ヌクレアーゼ活性を不活性化する黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９配列に関する例となる変異としては、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａが挙げられる。
本発明のＤＮＡ標的化システムは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、アキドウォラクス・アウェナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクティノバキルルス・プレウロプネウモニアス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）、アクティノバキルルス・スッキノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクティノバキルルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、キュクリピルス・デニトゥリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウキウォランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンディダトゥス・プニケイスピリルルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガムマ・プロテオバクテリウム（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シナエディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科細菌、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バキルリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ウィネアエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、またはウェルミネプロバクテル・エイスェニアエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）を含むが、これらに限定されるものではない任意の細菌または古細菌種由来であってもよい。特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、（本明細書において「ＳｐＣａｓ９」としても言及される）化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子である。特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、（本明細書において「ＳａＣａｓ９」としても言及される）黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９分子は、変異Ｃａｓ９分子である。Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるよう変異していてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９分子は、エンドヌクレアーゼ活性を有さない非活性化または不活性化Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９またはｉＣａｓ９）である。ヌクレアーゼ活性を不活性化するための化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列に関する例となる変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａおよび／またはＤ９８６Ａが挙げられる。ヌクレアーゼ活性を不活性化する黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９配列に関する例となる変異としては、Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａが挙げられる。
【0061】
Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡは、合成核酸配列であってもよい。例えば、合成核酸分子は、化学的に改変されてもよい。合成核酸配列は、コドン最適化されてもよく、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンまたはあまり一般的でないコドンが一般的なコドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、最適化された、例えば、本明細書に記載されている哺乳動物発現系における発現のために最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導することができる。本発明のさまざまな実施形態では、対象への投与後にＣａｓ９に対して交差反応性の液性応答が限定されているか、またはそれがない。
【0062】
さらにまたは代わりに、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡである。一実施形態において、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。核局在化配列は、当該技術分野において知られている。ＮＬＳは、Ｎ末端ＮＬＳまたはＣ末端ＮＬＳであってもよい。Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＨＡタグまたはウリジン置換を含むが、これらに限定されるものではないその他の改変を含んでもよい。
【0063】
さらにまたは代わりに、ＤＮＡ標的化システムは、融合タンパク質を含んでもよい。融合タンパク質は、２つの異種ポリペプチドドメインを含んでもよく、第１のポリペプチドドメインは、Ｃａｓタンパク質を含み、第２のポリペプチドドメインは、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸結合活性、メチラーゼ活性、またはデメチラーゼ活性などの活性を有する。融合タンパク質は、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、核酸結合活性、メチラーゼ活性、もしくはデメチラーゼ活性などの活性を有する第２のポリペプチドドメインと融合したＣａｓ９タンパク質または変異Ｃａｓ９タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドドメインは、ＶＰ１６タンパク質、複数のＶＰ１６タンパク質、例えば、ＶＰ４８ドメインもしくはＶＰ６４ドメイン、ＮＦカッパＢ転写活性化因子活性のｐ６５ドメイン、ｐ３００、例えば、完全なｐ３００もしくはｐ３００コア、ＫＲＡＢ、および／またはＴｅｔ１を含む。
【0064】
ｂ．ジストロフィン遺伝子を標的とするｇＲＮＡ
ＤＮＡ標的化システムは、１または複数種のｇＲＮＡ分子を含む。一実施形態において、本システムは、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子を含む。ｇＲＮＡは、システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２種の非コードＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的との相補的な塩基対合により標的特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって任意の所望のＤＮＡ配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与する天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣する。例えば、４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよい、この二本鎖は、標的核酸を切断するＣａｓ９のためのガイドとして働く。本明細書中で同義に使用される「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、システムが標的とする標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の領域を指す。ＤＮＡ標的化システムは、少なくとも１種のｇＲＮＡを含んでもよく、ｇＲＮＡはさまざまなＤＮＡ配列を標的とする。標的ＤＮＡ配列は、重なってもよい。標的配列またはプロトスペーサーには、プロトスペーサーの３’末端にあるＰＡＭ配列が続く。異なるＩＩ型システムは、異なるＰＡＭ要件を有する。例えば、化膿性連鎖球菌ＩＩ型システムは、「Ｎ」が任意のヌクレオチドであってもよい「ＮＧＧ」配列を使用する。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、「Ｎ」が任意のヌクレオチドであってもよい、「ＮＧＧ」であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）であってもよい。
ＤＮＡ標的化システムは、１または複数種のｇＲＮＡ分子を含む。一実施形態において、本システムは、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子を含む。ｇＲＮＡは、システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２種の非コードＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的との相補的な塩基対合により標的特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって任意の所望のＤＮＡ配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与する天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣する。例えば、４２ヌクレオチドのｃｒＲＮＡおよび７５ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含んでもよい、この二本鎖は、標的核酸を切断するＣａｓ９のためのガイドとして働く。本明細書中で同義に使用される「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、システムが標的とする標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の領域を指す。ＤＮＡ標的化システムは、少なくとも１種のｇＲＮＡを含んでもよく、ｇＲＮＡはさまざまなＤＮＡ配列を標的とする。標的ＤＮＡ配列は、重なってもよい。標的配列またはプロトスペーサーには、プロトスペーサーの３’末端にあるＰＡＭ配列が続く。異なるＩＩ型システムは、異なるＰＡＭ要件を有する。例えば、化膿性連鎖球菌ＩＩ型システムは、「Ｎ」が任意のヌクレオチドであってもよい「ＮＧＧ」配列を使用する。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、「Ｎ」が任意のヌクレオチドであってもよい、「ＮＧＧ」であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）またはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）であってもよい。
【0065】
本開示のＤＮＡ標的化システムによってコードされるｇＲＮＡ分子の数は、１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１１個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４５個の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも５０個の異なるｇＲＮＡであってもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ標的化システムは、２種のｇＲＮＡ分子、すなわち、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子をコードする。
【0066】
ｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭ配列が後に続く標的ＤＮＡ配列の相補的なポリヌクレオチド配列である標的化ドメインを含む。ｇＲＮＡは、標的化ドメインの５’末端に「Ｇ」または相補的なポリヌクレオチド配列を含んでもよい。ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、または少なくとも３５塩基対のＰＡＭ配列が後に続く標的ＤＮＡ配列の相補的なポリヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、１９～２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
【0067】
ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）の領域を標的としてもよい。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン、イントロン、プロモーター領域、エンハンサー領域、および／または転写領域のうちの少なくとも１つを標的としてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６６、または７５のうちの少なくとも１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン３、４、５、５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、８、５５、２、１７、７、１８、２１、２０、１２、２２、１９、５４、５９、５６、１１、６、５７、６１、６６、６３、６２、５８、または７５と隣接するイントロンのうちの少なくとも１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４３、４４、４５，４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５のうちの少なくとも１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン３、４、５、４３、４４、４５，４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、または５５と隣接するイントロンのうちの少なくとも１つ以上を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン２３、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１、エクソン４５～５５、エクソン５２～５３、およびエクソン５３のうちの１つまたは複数を標的とする。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５～５５ホットスポットを標的とする。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５０を標的とする。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５１を標的とする。特定の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１を標的とする。ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号１１０、配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖もしくはフラグメントを含む標的化ドメインを含んでもよい。フラグメントは、参照配列の任意の短いセグメントである。フラグメントは、例えば、参照配列よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド短くてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１～１９、３７～３８、４１～４２、８３～８４、１１０～１１１から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖によってコードされる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１１２～１３４から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号１、３、７～１５、３７、４１、８３、および１１０から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖によってコードされ、第２のｇＲＮＡは、配列番号２、４～６、１６～１９、３８、４２、８４、および１１１から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号１１２～１２４から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号１２５～１３４から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソン、または変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソンと隣接するイントロンを標的とする。
【0068】
単一ｇＲＮＡまたは多重ｇＲＮＡは、エクソン５１にある変異ホットスポットを標的とすること、またはおよびエクソン内の小さな挿入および欠失、またはエクソン５１の除去のいずれかを取り入れることによってジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう設計することができる。一実施形態において、第１のｇＲＮＡは、ＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡ（配列番号１１０）を含み、第２のｇＲＮＡは、エクソン５１を標的とするＧＣＡＧＴＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴ（配列番号１１１）を含む。本開示のＤＮＡ標的化システムによる処置後、インビトロでデュシェンヌ患者筋細胞においてジストロフィン発現を回復させることができる。
【0069】
６．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子
本開示のＤＮＡ標的化システムは、１種以上の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されてもよい。
脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、一般にイオン化可能なカチオン性脂質ならびに３種以上の追加の構成成分、一般にコレステロール、ＤＯＰＥおよび脂質を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から構成される。カチオン性脂質は、正の電荷をもつ核酸（ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡ）と結合して、核酸を分解から保護する高密度の複合体を形成することができる。構成成分は、自己集合して、１～１，０００ｎＭのサイズ範囲の粒子を形成し、その中で、ｇＲＮＡおよび／またはポリヌクレオチドがカチオン性脂質と複合体を形成し、脂質二重層様構造で取り囲まれたコア中に封入される。対象への注射後、こうした粒子は、細胞に吸収され、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子が核酸を細胞質に送達する。したがって、１または複数種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子封入は、両構成成分を細胞に効率的に送達するために使用することができる。Ｃａｓ９ポリヌクレオチドは、その後、Ｃａｓ９タンパク質に翻訳され、同じ、または異なる脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子によって細胞に輸送されたｇＲＮＡと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の核への移行を促進する核局在化シグナルを含む。あるいは、少なくとも１種のｇＲＮＡが核膜孔複合体を通過し、核内でＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する場合もある。核内でｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が相同標的部位に関してゲノムを調べたら、ゲノムの所望の標的部位に選択的に二本鎖切断を形成する。
本開示のＤＮＡ標的化システムは、１種以上の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されてもよい。
脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、一般にイオン化可能なカチオン性脂質ならびに３種以上の追加の構成成分、一般にコレステロール、ＤＯＰＥおよび脂質を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から構成される。カチオン性脂質は、正の電荷をもつ核酸（ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡ）と結合して、核酸を分解から保護する高密度の複合体を形成することができる。構成成分は、自己集合して、１～１，０００ｎＭのサイズ範囲の粒子を形成し、その中で、ｇＲＮＡおよび／またはポリヌクレオチドがカチオン性脂質と複合体を形成し、脂質二重層様構造で取り囲まれたコア中に封入される。対象への注射後、こうした粒子は、細胞に吸収され、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子が核酸を細胞質に送達する。したがって、１または複数種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドの脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子封入は、両構成成分を細胞に効率的に送達するために使用することができる。Ｃａｓ９ポリヌクレオチドは、その後、Ｃａｓ９タンパク質に翻訳され、同じ、または異なる脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子によって細胞に輸送されたｇＲＮＡと複合体を形成することができる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の核への移行を促進する核局在化シグナルを含む。あるいは、少なくとも１種のｇＲＮＡが核膜孔複合体を通過し、核内でＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する場合もある。核内でｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が相同標的部位に関してゲノムを調べたら、ゲノムの所望の標的部位に選択的に二本鎖切断を形成する。
【0070】
さまざまな実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）、または固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）である。
ＤＮＡ標的化システムの各種実施形態によると、本発明のｇＲＮＡおよびポリヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されてもよく、あるいはｇＲＮＡおよびポリヌクレオチドは、それぞれ別々の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されてもよい。したがって、ＤＮＡ標的化システムは、本発明の核酸の送達のための１種以上の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含んでもよい。
ＤＮＡ標的化システムの各種実施形態によると、本発明のｇＲＮＡおよびポリヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されてもよく、あるいはｇＲＮＡおよびポリヌクレオチドは、それぞれ別々の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入されてもよい。したがって、ＤＮＡ標的化システムは、本発明の核酸の送達のための１種以上の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含んでもよい。
【0071】
さまざまな実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍの平均径を有し、実質的に非毒性である。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子中に存在する場合、核酸は、ヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で抵抗性である。
【0072】
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、カチオン性脂質を含む。本明細書中で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、カチオン性であるか、またはｐＨが脂質のイオン化基のｐＫよりも低くなるとカチオン性になる（プロトン化される）が、高いｐＨ値で段々に中性になる脂質を指す。ｐＫより低いｐＨ値では、その結果、脂質が負の電荷をもつ核酸と結合することができる。特定の実施形態において、カチオン性脂質は、ｐＨ低下時に正電荷を帯びる双性イオン性脂質を含む。
【0073】
特定の実施形態において、カチオン性脂質は、生理的なｐＨなどの選択的なｐＨで正味の正電荷をもつ任意の多くの脂質種を含む。そのような脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ－（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－－（Ｎ’，Ｎ’ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－アンモニウムトリフルオロアセタート（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔａｔｅ）（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、およびＮ－（１，２ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0074】
さらに、本発明に使用可能なカチオン性脂質の多くの市販の調製物が入手可能である。これらとしては、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡおよび１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｎ－（１－（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－アンモニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）および（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）が挙げられる。以下の脂質は、カチオン性であり、生理的なｐＨ未満で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
【0075】
いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明に有用な適したアミノ脂質としては、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されているものが挙げられる。代表的なアミノ脂質としては、１，２－ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、および２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0076】
７．ＤＮＡ標的化組成物
本発明はまた、そのようなＤＮＡ標的化システムを含むＤＮＡ標的化組成物も対象とする。ＤＮＡ標的化組成物は、目的とする遺伝子を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む。目的とする遺伝子は、例えば、上記のとおりのジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）であってもよい。少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、標的領域と結合し、認識することができる。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう、可能性のあるアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流に選択される場合がある。標的領域はまた、修復プロセス中の挿入または欠失がスプライス部位破壊およびエクソン排除によってスプライシングを乱し、ジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位である場合もある。標的領域はまた、修復プロセス中の挿入または欠失が終止コドンを排除または破壊することによってジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう異常な終止コドンである場合もある。
本発明はまた、そのようなＤＮＡ標的化システムを含むＤＮＡ標的化組成物も対象とする。ＤＮＡ標的化組成物は、目的とする遺伝子を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含む。目的とする遺伝子は、例えば、上記のとおりのジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）であってもよい。少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、標的領域と結合し、認識することができる。標的領域は、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう、可能性のあるアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流に選択される場合がある。標的領域はまた、修復プロセス中の挿入または欠失がスプライス部位破壊およびエクソン排除によってスプライシングを乱し、ジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう、スプライスアクセプター部位またはスプライスドナー部位である場合もある。標的領域はまた、修復プロセス中の挿入または欠失が終止コドンを排除または破壊することによってジストロフィンリーディングフレームを元に戻すよう異常な終止コドンである場合もある。
【0077】
特定の実施形態において、ＤＮＡ標的化システムを含む本開示の組成物は、第１のｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡを含み、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１１０、配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖を含む標的化ドメインを含む。特定の実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的化ドメインを含む。特定の実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１１０の核酸配列を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号１１１の核酸配列を含む。特定の実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１１０からなる群から選択され、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号１１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１～１９、３７～３８、４１～４２、８３～８４、１１０～１１１から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖によってコードされる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１１２～１３４から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号１、３、７～１５、３７、４１、８３、および１１０から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖によってコードされ、第２のｇＲＮＡは、配列番号２、４～６、１６～１９、３８、４２、８４、および１１１から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖によってコードされる。いくつかの実施形態において、第１のｇＲＮＡは、配列番号１１２～１２４から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡは、配列番号１２５～１３４から選択されるポリヌクレオチド、またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む。
【0078】
特定の実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、以下からなる群から選択される：（ｉ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉ）配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｉｉ）配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｖ）配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖ）配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉ）配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉ）配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｖｉｉｉ）配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｉｘ）配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘ）配列番号１４に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘｉ）配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；（ｘｉｉ）配列番号４１に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；ならびに（ｘｉｉｉ）配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ分子、および配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化組成物は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列および／または配列番号３８に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0079】
特定の実施形態において、ＤＮＡ標的化組成物は、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号２４）もしくはＮＮＧＲＲＶ（配列番号２５）のいずれかのＰＡＭを認識する少なくとも１種のＣａｓ９分子もしくはＣａｓ９融合タンパク質、またはＣａｓ９分子もしくはＣａｓ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的化組成物は、配列番号８３または配列番号８４に示されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ標的化システムは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第１および第２のイントロンに第１および第２の二本鎖切断を形成し、それによってそれぞれがエクソン５１を含むジストロフィン遺伝子のセグメントを欠失させるよう構成される。
【0080】
本開示のＤＮＡ標的化システムの欠失効率は、欠失サイズ、すなわち、ＤＮＡ標的化システムによって欠失させられるセグメントのサイズに関連する可能性がある。特定の実施形態において、特異的欠失の長さまたはサイズは、標的とされる遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）におけるＰＡＭ配列間の距離によって決まる。特定の実施形態において、ジストロフィン遺伝子のセグメントの特異的欠失（その長さおよびそれが含む配列（例えば、エクソン５１）に関して定義される）は、標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）内の特異的なＰＡＭ配列の横で行われる切断の結果である。
【0081】
特定の実施形態において、欠失サイズは、約５０～約２，０００塩基対（ｂｐ）、例えば、約５０～約１９９９ｂｐ、約５０～約１９００ｂｐ、約５０～約１８００ｂｐ、約５０～約１７００ｂｐ、約５０～約１６５０ｂｐ、約５０～約１６００ｂｐ、約５０～約１５００ｂｐ、約５０～約１４００ｂｐ、約５０～約１３００ｂｐ、約５０～約１２００ｂｐ、約５０～約１１５０ｂｐ、約５０～約１１００ｂｐ、約５０～約１０００ｂｐ、約５０～約９００ｂｐ、約５０～約８５０ｂｐ、約５０～約８００ｂｐ、約５０～約７５０ｂｐ、約５０～約７００ｂｐ、約５０～約６００ｂｐ、約５０～約５００ｂｐ、約５０～約４００ｂｐ、約５０～約３５０ｂｐ、約５０～約３００ｂｐ、約５０～約２５０ｂｐ、約５０～約２００ｂｐ、約５０～約１５０ｂｐ、約５０～約１００ｂｐ、約１００～約１９９９ｂｐ、約１００～約１９００ｂｐ、約１００～約１８００ｂｐ、約１００～約１７００ｂｐ、約１００～約１６５０ｂｐ、約１００～約１６００ｂｐ、約１００～約１５００ｂｐ、約１００～約１４００ｂｐ、約１００～約１３００ｂｐ、約１００～約１２００ｂｐ、約１００～約１１５０ｂｐ、約１００～約１１００ｂｐ、約１００～約１０００ｂｐ、約１００～約９００ｂｐ、約１００～約８５０ｂｐ、約１００～約８００ｂｐ、約１００～約７５０ｂｐ、約１００～約７００ｂｐ、約１００～約６００ｂｐ、約１００～約１０００ｂｐ、約１００～約４００ｂｐ、約１００～約３５０ｂｐ、約１００～約３００ｂｐ、約１００～約２５０ｂｐ、約１００～約２００ｂｐ、約１００～約１５０ｂｐ、約２００～約１９９９ｂｐ、約２００～約１９００ｂｐ、約２００～約１８００ｂｐ、約２００～約１７００ｂｐ、約２００～約１６５０ｂｐ、約２００～約１６００ｂｐ、約２００～約１５００ｂｐ、約２００～約１４００ｂｐ、約２００～約１３００ｂｐ、約２００～約１２００ｂｐ、約２００～約１１５０ｂｐ、約２００～約１１００ｂｐ、約２００～約１０００ｂｐ、約２００～約９００ｂｐ、約２００～約８５０ｂｐ、約２００～約８００ｂｐ、約２００～約７５０ｂｐ、約２００～約７００ｂｐ、約２００～約６００ｂｐ、約２００～約２０００ｂｐ、約２００～約４００ｂｐ、約２００～約３５０ｂｐ、約２００～約３００ｂｐ、約２００～約２５０ｂｐ、約３００～約１９９９ｂｐ、約３００～約１９００ｂｐ、約３００～約１８００ｂｐ、約３００～約１７００ｂｐ、約３００～約１６５０ｂｐ、約３００～約１６００ｂｐ、約３００～約１５００ｂｐ、約３００～約１４００ｂｐ、約３００～約１３００ｂｐ、約３００～約１２００ｂｐ、約３００～約１１５０ｂｐ、約３００～約１１００ｂｐ、約３００～約１０００ｂｐ、約３００～約９００ｂｐ、約３００～約８５０ｂｐ、約３００～約８００ｂｐ、約３００～約７５０ｂｐ、約３００～約７００ｂｐ、約３００～約６００ｂｐ、約３００～約３０００ｂｐ、約３００～約４００ｂｐ、または約３００～約３５０ｂｐである。特定の実施形態において、欠失サイズは、約１１８塩基対、約２３３塩基対、約３２６塩基対、約７６６塩基対、約８０５塩基対、または約１６１１塩基対であってもよい。
【0082】
ｇＲＮＡは、配列番号１～１９、４１、４２、３７、３８、４１、４２、８３、８４、１１０、および１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその相補鎖もしくはそのフラグメントを標的としてもよい。例えば、本開示のＤＮＡ標的化システムは、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１における極めて効率的な遺伝子編集を媒介するよう操作されてもよい。これらのＤＮＡ標的化システムは、ＤＭＤ患者からの細胞におけるジストロフィンタンパク質発現を回復させることができる。さまざまな実施形態において、ＤＮＡ標的化システム組成物は、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列、配列番号１１１に示されるヌクレオチド配列、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列、配列番号８３に示されるヌクレオチド配列、および／または配列番号８４に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0083】
８．方法
ａ．変異遺伝子を修正し、対象を処置する方法
本開示の主題は、細胞において変異遺伝子（例えば、変異ジストロフィン遺伝子、例えば、変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修正し、ＤＭＤなどの遺伝子疾患を患っている対象を処置する方法を提供する。本方法は、上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を細胞または対象に投与することを含んでもよい。本方法は、上記のとおりのゲノム編集のための本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を対象に投与することを含んでもよい。少なくとも１種のｇＲＮＡおよびポリヌクレオチドを含むＤＮＡ標的化システムを対象に送達するための本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子の使用により、遺伝子全体もしくは変異を含む領域を交換することができる修復鋳型またはドナーＤＮＡを用いて完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を回復させることができる。ＤＮＡ標的化システムは、標的とするゲノム遺伝子座に部位特異的な二本鎖切断を導入するために使用されてもよい。ＤＮＡ標的化システムが標的ＤＮＡ配列と結合したとき、部位特異的二本鎖切断が作り出され、それによって標的ＤＮＡの切断を可能にすることができる。このＤＮＡ切断が、天然のＤＮＡ修復機構を刺激する場合もあり、相同組み換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の２つの可能な修復経路のうちの１つにつながる。
ａ．変異遺伝子を修正し、対象を処置する方法
本開示の主題は、細胞において変異遺伝子（例えば、変異ジストロフィン遺伝子、例えば、変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修正し、ＤＭＤなどの遺伝子疾患を患っている対象を処置する方法を提供する。本方法は、上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を細胞または対象に投与することを含んでもよい。本方法は、上記のとおりのゲノム編集のための本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を対象に投与することを含んでもよい。少なくとも１種のｇＲＮＡおよびポリヌクレオチドを含むＤＮＡ標的化システムを対象に送達するための本開示の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子の使用により、遺伝子全体もしくは変異を含む領域を交換することができる修復鋳型またはドナーＤＮＡを用いて完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質の発現を回復させることができる。ＤＮＡ標的化システムは、標的とするゲノム遺伝子座に部位特異的な二本鎖切断を導入するために使用されてもよい。ＤＮＡ標的化システムが標的ＤＮＡ配列と結合したとき、部位特異的二本鎖切断が作り出され、それによって標的ＤＮＡの切断を可能にすることができる。このＤＮＡ切断が、天然のＤＮＡ修復機構を刺激する場合もあり、相同組み換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の２つの可能な修復経路のうちの１つにつながる。
【0084】
本開示はまた、修復鋳型を用いないＤＮＡ標的化システムによるゲノム編集も対象とし、これは、リーディングフレームを効率的に修正し、遺伝子疾患に関与する機能的なタンパク質の発現を回復させることができる。本開示のＤＮＡ標的化システムは、相同組み換え修復またはヌクレアーゼ媒介非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ベースの修正アプローチを使用することを含む場合もあり、これは、相同組み換えまたは選択ベースの遺伝子修正を適用できない場合もある増殖が限定される初代細胞株において効率的な修正を可能にする。この戦略は、フレームシフト、未成熟終止コドン、異常なスプライスドナー部位または異常なスプライスアクセプター部位の原因となる必須でないコード領域における変異によって引き起こされる遺伝子疾患の処置のための有効なＤＮＡ標的化システムと効率的な遺伝子編集方法の高速で左右されない機構に統合される。
【0085】
ｉ．ヌクレアーゼ媒介非相同末端結合
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、鋳型を用いないＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復によるものでもよい。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過性の方法とは対照的に、一過性に発現されるＤＮＡ標的化システムによるゲノムにおける標的遺伝子リーディングフレームの修正が、それぞれの改変された細胞およびすべてのその後代による永続的に回復された標的遺伝子発現につながる場合もある。特定の実施形態において、ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪであり、これは、特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子によって開始されるＮＨＥＪを指し、二本鎖ＤＮＡを切断する。本方法は、本開示のＤＮＡ標的化システムまたはそれから構成される組成物を必要とする対象に投与することを含む。
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、鋳型を用いないＮＨＥＪ媒介ＤＮＡ修復によるものでもよい。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過性の方法とは対照的に、一過性に発現されるＤＮＡ標的化システムによるゲノムにおける標的遺伝子リーディングフレームの修正が、それぞれの改変された細胞およびすべてのその後代による永続的に回復された標的遺伝子発現につながる場合もある。特定の実施形態において、ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪであり、これは、特定の実施形態において、Ｃａｓ９分子によって開始されるＮＨＥＪを指し、二本鎖ＤＮＡを切断する。本方法は、本開示のＤＮＡ標的化システムまたはそれから構成される組成物を必要とする対象に投与することを含む。
【0086】
ヌクレアーゼ媒介ＮＨＥＪ遺伝子修正は、変異した標的遺伝子を修正することができ、ＨＤＲ経路を超えるいくつかの潜在的利点を提供する。例えば、ＮＨＥＪは、ドナー鋳型を必要とせず、これは、非特異的挿入変異誘発を引き起こす場合もある。ＨＤＲとは対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期のすべての段階で効率的に働くため、筋線維などの周期中の細胞および分裂終了細胞の両方で効果的に利用することができる。これは、オリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピングまたは終止コドンの薬理学的な強制的なリードスルーに代わる確固とした永続的な遺伝子回復を提供し、理論上、わずか１つの薬物治療しか必要としないであろう。ＤＮＡ標的化システム、ならびにメガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを含む、他の操作されたヌクレアーゼを使用したＮＨＥＪベースの遺伝子修正が、本明細書に記載されている脂質ナノ粒子アプローチに加えて、細胞および遺伝子ベースの治療のための他の既存のエクスビボおよびインビボプラットフォームと組み合わされてもよい。例えば、ｍＲＮＡベースの遺伝子導入による、または精製された細胞透過性タンパク質としてのＤＮＡ標的化システムの送達は、挿入変異誘発のいかなる可能性も回避するであろうＤＮＡを用いないゲノム編集アプローチを可能にするであろう。
【0087】
ｉｉ．相同組み換え修復
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組み換え修復を伴ってもよい。上記の方法は、ドナー鋳型を細胞に投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ドナー鋳型としては、ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と呼ばれる小型化されたジストロフィンコンストラクト、変異ジストロフィン遺伝子を回復させるための完全に機能的なジストロフィンコンストラクト、または相同組み換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の回復をもたらすジストロフィン遺伝子のフラグメントを挙げることができる。
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組み換え修復を伴ってもよい。上記の方法は、ドナー鋳型を細胞に投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能的なタンパク質または部分的に機能的なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。例えば、ドナー鋳型としては、ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と呼ばれる小型化されたジストロフィンコンストラクト、変異ジストロフィン遺伝子を回復させるための完全に機能的なジストロフィンコンストラクト、または相同組み換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の回復をもたらすジストロフィン遺伝子のフラグメントを挙げることができる。
【0088】
ｂ．疾患を処置する方法
本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法を対象とする。本方法は、対象の組織または細胞に上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、本方法は、対象の骨格筋組織もしくは細胞、平滑筋組織もしくは細胞、または心筋組織もしくは細胞に、上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、本方法は、対象の静脈に、上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、対象は、変性または虚弱を引き起こす骨格筋または心筋の状態あるいは遺伝子疾患を患っている。例えば、対象は、上記のとおりのデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている場合もある。
本方法は、上記のとおり、ジストロフィン遺伝子を修正し、上記の変異したジストロフィン遺伝子の完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質発現を回復させるために使用されてもよい。本発明のさまざまな態様において、対象におけるジストロフィン発現は、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する。
本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法を対象とする。本方法は、対象の組織または細胞に上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、本方法は、対象の骨格筋組織もしくは細胞、平滑筋組織もしくは細胞、または心筋組織もしくは細胞に、上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、本方法は、対象の静脈に、上記のとおりの本開示の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、ＤＮＡ標的化システム、またはそれから構成される組成物を投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、対象は、変性または虚弱を引き起こす骨格筋または心筋の状態あるいは遺伝子疾患を患っている。例えば、対象は、上記のとおりのデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患っている場合もある。
本方法は、上記のとおり、ジストロフィン遺伝子を修正し、上記の変異したジストロフィン遺伝子の完全に機能的または部分的に機能的なタンパク質発現を回復させるために使用されてもよい。本発明のさまざまな態様において、対象におけるジストロフィン発現は、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する。
【0089】
いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者におけるＤＭＤの影響（例えば、臨床的症状／徴候）を低減するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者のＤＭＤを処置するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者のＤＭＤを予防するための方法を提供する。いくつかの態様および実施形態において、本開示は、患者のＤＭＤのさらなる進行を予防するための方法を提供する。
【0090】
９．医薬組成物
本開示の主題は、上記の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子またはＤＮＡ標的化システムを含む組成物を提供する。本組成物は、医薬組成物であってもよい。本発明による医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化されてもよい。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、滅菌されたパイロジェンフリーおよび粒子フリーであってもよい。等張製剤が、好ましくは使用されてもよい。一般に、等張性にするための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ある場合には、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。
本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であってもよい。
本開示の主題は、上記の脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子またはＤＮＡ標的化システムを含む組成物を提供する。本組成物は、医薬組成物であってもよい。本発明による医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化されてもよい。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、滅菌されたパイロジェンフリーおよび粒子フリーであってもよい。等張製剤が、好ましくは使用されてもよい。一般に、等張性にするための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ある場合には、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。
本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの機能的分子であってもよい。
【0091】
１０．投与の経路
本開示のＤＮＡ標的化システムまたはそれから構成される組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入による、頬側投与による、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節腔内またはそれらの組み合わせを含む、さまざまな経路によって対象に投与されてもよい。特定の実施形態において、本開示のＤＮＡ標的化システムまたは組成物は、筋肉内、静脈内またはその組み合わせで対象（例えば、ＤＭＤを患っている対象）に投与される。獣医的使用に関して、本開示のＤＮＡ標的化システムまたは組成物は、通常の獣医実務に従って適切に許容される製剤として投与されてもよい。獣医師は、特定の動物に対して最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。本組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子銃」、またはその他の物理的方法、例えば、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波によって投与されてもよい。
本開示のＤＮＡ標的化システムまたはそれから構成される組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入による、頬側投与による、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節腔内またはそれらの組み合わせを含む、さまざまな経路によって対象に投与されてもよい。特定の実施形態において、本開示のＤＮＡ標的化システムまたは組成物は、筋肉内、静脈内またはその組み合わせで対象（例えば、ＤＭＤを患っている対象）に投与される。獣医的使用に関して、本開示のＤＮＡ標的化システムまたは組成物は、通常の獣医実務に従って適切に許容される製剤として投与されてもよい。獣医師は、特定の動物に対して最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。本組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子銃」、またはその他の物理的方法、例えば、エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波によって投与されてもよい。
【0092】
いくつかの実施形態において、本開示のＤＮＡ標的化システムまたはその組成物は、１）成体マウスへの尾静脈注射（全身的）；２）筋肉内注射、例えば、成体マウスのＴＡまたは腓腹筋などの筋肉への局所注射；３）Ｐ２マウスへの腹腔内注射；あるいは４）Ｐ２マウスへの顔面静脈注射（全身的）によって投与される。
【0093】
本開示のＤＮＡ標的化システムは、成熟後および発生の過程の任意の時期を含む、ライフサイクルの過程のいかなる時期の対象にも投与することができる。さまざまな実施形態において、ＤＮＡ標的化システムおよびそれから構成される組成物は、誕生前または誕生の１～２日以内に対象に投与することができる。
【0094】
１１．細胞タイプ
これらの送達方法および／または投与の経路のいずれかが、不死化筋芽細胞、例えば、野生型およびＤＭＤ患者由来の株、例えば、Δ４８－５０ ＤＭＤ、ＤＭＤ６５９４（ｄｅｌ４８－５０）、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８－５０）、Ｃ２５Ｃ１４およびＤＭＤ－７７９６細胞株、初代ＤＭＤ皮膚線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中胚葉系血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、ならびにＭｙｏＤもしくはＰａｘ７形質導入細胞またはその他の筋芽前駆細胞を含むが、これらに限定されるものではない、無数の細胞タイプ、例えば、ＤＭＤの細胞ベースの治療に関して現在調査中の細胞タイプとともに利用されてもよい。遺伝学的に修正された筋芽細胞のクローナルな誘導のために、ヒト筋芽細胞の不死化が使用されてもよい。細胞は、遺伝学的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み、ゲノムのタンパク質コード領域にその他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離し、増やすためにエクスビボで改変されてもよい。システムの脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を使用した非ウイルス遺伝子導入によるＤＮＡ標的化システムのｇＲＮＡおよびｍＲＮＡのインビボ送達は、最小限の外来性ＤＮＡ組み込みのリスクを伴うか、または伴わずに、インサイツでの極めて特異的な修正を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書において詳述される脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＤＮＡ標的化システムを筋細胞に送達するためのものである。筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および／または平滑筋細胞であってもよい。
これらの送達方法および／または投与の経路のいずれかが、不死化筋芽細胞、例えば、野生型およびＤＭＤ患者由来の株、例えば、Δ４８－５０ ＤＭＤ、ＤＭＤ６５９４（ｄｅｌ４８－５０）、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８－５０）、Ｃ２５Ｃ１４およびＤＭＤ－７７９６細胞株、初代ＤＭＤ皮膚線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３+細胞、中胚葉系血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、ならびにＭｙｏＤもしくはＰａｘ７形質導入細胞またはその他の筋芽前駆細胞を含むが、これらに限定されるものではない、無数の細胞タイプ、例えば、ＤＭＤの細胞ベースの治療に関して現在調査中の細胞タイプとともに利用されてもよい。遺伝学的に修正された筋芽細胞のクローナルな誘導のために、ヒト筋芽細胞の不死化が使用されてもよい。細胞は、遺伝学的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み、ゲノムのタンパク質コード領域にその他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離し、増やすためにエクスビボで改変されてもよい。システムの脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を使用した非ウイルス遺伝子導入によるＤＮＡ標的化システムのｇＲＮＡおよびｍＲＮＡのインビボ送達は、最小限の外来性ＤＮＡ組み込みのリスクを伴うか、または伴わずに、インサイツでの極めて特異的な修正を可能にすることができる。いくつかの実施形態において、本明細書において詳述される脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＤＮＡ標的化システムを筋細胞に送達するためのものである。筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および／または平滑筋細胞であってもよい。
【0095】
１２．キット
本明細書において変異したジストロフィン遺伝子を修正するために使用され得るキットが提供される。本キットは、変異したジストロフィン遺伝子を修正するための脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子またはＤＮＡ標的化システムあるいはそれから構成される組成物と、システムまたは組成物を使用するための説明書とを含む。
本明細書において変異したジストロフィン遺伝子を修正するために使用され得るキットが提供される。本キットは、変異したジストロフィン遺伝子を修正するための脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子またはＤＮＡ標的化システムあるいはそれから構成される組成物と、システムまたは組成物を使用するための説明書とを含む。
【0096】
キットに含まれる説明書は、包装材料に添付されてもよく、または添付文書として含まれてもよい。説明書は一般に書面かまたは印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を記憶し、それをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が本開示により意図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書中で使用される場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトアドレスを含んでもよい。
対象において変異したジストロフィンを修正するか、またはジストロフィン遺伝子のゲノム編集をするためのＤＮＡ標的化システムまたはそれから構成される組成物は、ｇＲＮＡ分子と、上記のとおり、ジストロフィン遺伝子の領域と特異的に結合し、切断するＣａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとを封入する脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含むことになる。上記のＤＮＡ標的化システムは、変異したジストロフィン遺伝子の特定の領域と特異的に結合し、標的とするためにキットに含まれてもよい。本キットは、上記のとおり、ドナーＤＮＡ、さまざまなｇＲＮＡ、または導入遺伝子をさらに含んでもよい。
対象において変異したジストロフィンを修正するか、またはジストロフィン遺伝子のゲノム編集をするためのＤＮＡ標的化システムまたはそれから構成される組成物は、ｇＲＮＡ分子と、上記のとおり、ジストロフィン遺伝子の領域と特異的に結合し、切断するＣａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとを封入する脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含むことになる。上記のＤＮＡ標的化システムは、変異したジストロフィン遺伝子の特定の領域と特異的に結合し、標的とするためにキットに含まれてもよい。本キットは、上記のとおり、ドナーＤＮＡ、さまざまなｇＲＮＡ、または導入遺伝子をさらに含んでもよい。
【実施例】
【0097】
（実施例１）
ＤＭＤ変異を処置するためのＣＲＩＳＰＲの非ウイルス性脂質ナノ粒子送達
ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥを使用して、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡまたはＲＮＰの製剤をマウスに注射した。ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥを、以下のヌクレオチド送達のために最適化した：（１）ＮおよびＣ末端ＮＬＳ ＨＡタグで改変され、ウリジン置換で改変されたＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ならびに（２）それぞれ末端にホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、３ｂｐを有するＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ（それぞれ０．２５ｍｇ／ｋｇ）。ＳａＣａｓ９（０．２５ｍｇ／ｋｇ）もマウスに送達した。
ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡの対象配列の配列は、配列番号１１０（ＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡ）および配列番号１１１（ＧＣＡＧＴＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴ）であった。
ＤＭＤ変異を処置するためのＣＲＩＳＰＲの非ウイルス性脂質ナノ粒子送達
ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥを使用して、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡまたはＲＮＰの製剤をマウスに注射した。ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥを、以下のヌクレオチド送達のために最適化した：（１）ＮおよびＣ末端ＮＬＳ ＨＡタグで改変され、ウリジン置換で改変されたＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ならびに（２）それぞれ末端にホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基、３ｂｐを有するＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ（それぞれ０．２５ｍｇ／ｋｇ）。ＳａＣａｓ９（０．２５ｍｇ／ｋｇ）もマウスに送達した。
ＳｐＣａｓ９ ｇＲＮＡの対象配列の配列は、配列番号１１０（ＧＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＣＴＡ）および配列番号１１１（ＧＣＡＧＴＴＧＣＣＴＡＡＧＡＡＣＴＧＧＴ）であった。
【0098】
ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ調製。ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（２４ｕＬ）を、ｍＲＮＡまたはＲＮＰとともに製造業者の説明書に従って調製した：１００μＬの１．２ｍｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ溶液を、以下の構成成分を１：１の比で混合することによって調製した：５０μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖溶液（２．４ｍｇ／ｍＬ）および５０μｌの複合体形成バッファー。ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を室温にし、１００μＬを１．５ｍＬチューブに添加した。希釈したｓｉＲＮＡ溶液を、チューブ中のＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬に直接添加した。チューブをすぐにボルテックスして、ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ・ｓｉＲＮＡ複合体形成を確実にした。ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ・ｓｉＲＮＡ二本鎖混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。チューブを短時間、遠心分離して、サンプルを回収した。ｐＨ７．４の１ｍＬのＰＢＳを加えることによって複合体を６倍希釈し、十分に混合した。その後、ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ・ｓｉＲＮＡを、インビボ送達のために準備した。
【0099】
ＡＡＶの筋肉内注射。７～８週齢の雄のｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスに麻酔をかけ、保温パッドに置いた。ｈＤＭＤΔ５２／ｍｄｘマウスは、ヒトジストロフィン遺伝子をもつが、エクソン５２が欠損しているよう操作されたｍｄｘマウスである。したがって、マウスモデルは、ヒトＤＭＤ変異を模倣し、エクソン５１スキッピングによって修正可能である。それぞれＴＡの左右への２４μｌのｍＲＮＡもしくはＲＮＰを伴うＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、または生理的食塩水の注射のために前脛骨（ＴＡ）筋を準備した。４週間後にマウスをＣＯ2吸入により安楽死させ、分析のために組織をＲＮＡＬａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に採取した。
雄のｈＤＭＤ／ｄ５２マウスのＴＡまたはＴＶにｍＲＮＡ／ｇＲＮＡまたはＲＮＰを注射し、注射の４週間後に採取した。処置した筋肉からゲノムＤＮＡを抽出し、領域にわたるＰＣＲにより意図された欠失が明らかにされた。
雄のｈＤＭＤ／ｄ５２マウスのＴＡまたはＴＶにｍＲＮＡ／ｇＲＮＡまたはＲＮＰを注射し、注射の４週間後に採取した。処置した筋肉からゲノムＤＮＡを抽出し、領域にわたるＰＣＲにより意図された欠失が明らかにされた。
【0100】
液性応答に関するＥＬＩＳＡ。ＷａｎｇらおよびＣｈｅｗらのプロトコルを適合させることによってＳｐＣａｓ９に対する抗体またはＳａＣａｓ９を検出した。組み換えＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９タンパク質を１×コーティングバッファー（ＫＰＬ）で希釈し、９６ウェルのＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、各ウェル当たり０．５μｇのタンパク質でコーティングするために使用した。タンパク質を４℃で一晩インキュベートして、プレートに吸着させた。プレートを、１×洗浄バッファー（ＫＰＬ）でそれぞれ５分間、３回洗浄した。プレートを、１％ＢＳＡブロッキング溶液（ＫＰＬ）で室温で１時間ブロッキングした。αＳｐＣａｓ９またはαＳａＣａｓ９抗体（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｃ１５２００２３０）を使用してＩｇＧに関する標準曲線を作成した。血清サンプルを１：４０～１：２００００の範囲の希釈物に添加し、プレートを振盪しながら４℃で５時間インキュベートした。プレートをそれぞれ５分間、３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ １：４０００）を含む１００μＬのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをそれぞれ５分間、４回洗浄し、１００μＬのＡＢＴＳ ＥＬＩＳＡ ＨＲＰ基質（ＫＰＬ）を各ウェルに添加した。４１０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）をプレートリーダーで測定した。
【0101】
ゲノム編集を観察するためのゲノムＤＮＡのＰＣＲ－ゲノムＤＮＡ分析。振盪ヒートブロックにおいて５６℃でＢｕｆｆｅｒ ＡＬＴおよびプロテイナーゼＫ中でマウス組織を消化した。細胞を、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬおよびプロテイナーゼＫ中において５６℃で１０分間消化した。ゲノムＤＮＡを回収するためにＤＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキットを使用してイントロン領域中のＳａＣａｓ９／ｇＲＮＡ切断部位と隣接するプライマーを用いてネステッドエンドポイントＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルにおいて電気泳動し、親バンドおよび欠失産物を観察するためにＢｉｏＲａｄ ＧｅｌＤｏｃ撮影装置で見た。ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したサンプルの最初の精製後、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって欠失産物を配列決定した。
ＲＮＰは、強い液性応答を誘発したが、ｍＲＮＡは誘発しなかった。図１は、ＳｐＣａｓ９に対するＥＬＩＳＡがＲＮＰの注射後にＳｐＣａｓ９に対して液性応答を示したが、ｍＲＮＡにコードされたＳｐＣａｓ９は示さなかったことを示す。
ＲＮＰは、強い液性応答を誘発したが、ｍＲＮＡは誘発しなかった。図１は、ＳｐＣａｓ９に対するＥＬＩＳＡがＲＮＰの注射後にＳｐＣａｓ９に対して液性応答を示したが、ｍＲＮＡにコードされたＳｐＣａｓ９は示さなかったことを示す。
【0102】
ｍＲＮＡは標的遺伝子を編集することができたが、ＲＮＰはできなかった。図２は、ｍＲＮＡがｈＤＭＤ／ｄ５２マウスからエクソン５１を除去することができたことを示し、図３は、エクソン５１のｍＲＮＡ除去がジストロフィンを回復させることを示す。
図４は、ｍＲＮＡ注射が液性応答につながらないことを示す。ＲＮＰ投与は、局所的または全身的注射において抗体を上昇させる。
図４は、ｍＲＮＡ注射が液性応答につながらないことを示す。ＲＮＰ投与は、局所的または全身的注射において抗体を上昇させる。
【0103】
特定の態様の前述の説明は、したがって、過度の実験を行うことなく、本開示の一般的な概念から逸脱することなく他者が当該技術分野の技術内の知識を適用することによって、そのような特定の態様のさまざまな用途のために容易に改変するかつ／または適合させることができる本発明の一般的本質を完全に明らかにするであろう。したがって、そのような適合および改変は、本明細書において提示される教示および指針に基づいて、本開示の態様の等価物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書の術語または用語が教示および指針に照らして当業者に解釈されるよう、本明細書中の用語または術語は説明のためのものであり、限定のためではないことが理解されるべきである。
【0104】
本開示の広さおよび範囲は、上記の例となる態様のいずれによっても限定されるべきではなく、添付の請求項およびその等価物によってのみ定義されるべきである。
本出願において引用されるすべての公報、特許、特許出願、および／またはその他の文書は、個々の公開、特許、特許出願、および／またはその他の文書のそれぞれが、あらゆる目的のために参照により組み込まれることを個別に示されたのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
本出願において引用されるすべての公報、特許、特許出願、および／またはその他の文書は、個々の公開、特許、特許出願、および／またはその他の文書のそれぞれが、あらゆる目的のために参照により組み込まれることを個別に示されたのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【0105】
完全にするために、本発明のさまざまな態様を以下の番号付けした条項に記載する。
条項１．筋細胞にＤＮＡ標的化システムを送達するための脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子であって、ＤＮＡ標的化システムは、変異ジストロフィン遺伝子のフラグメントを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子、および／またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２．少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含む、条項１に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項３．Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである、条項１または２に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項４．第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ標的化ドメインを含み、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号８３、もしくは配列番号１１０から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１１２～１２４から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３８、配列番号４２、配列番号８４、もしくは配列番号１１１から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１２５～１３４またはそのフラグメントもしくは相補鎖から選択されるヌクレオチド配列を含み、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的化ドメインを含む、条項１～３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項５．第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１０のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１２４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１３４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む、条項４に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項６．少なくとも１種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入される、条項１～５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項７．少なくとも１種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、別々の脂質ナノ粒子中に封入される、条項１～６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項８．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）、および固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）からなる群から選択される、条項１～７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項９．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１０．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１１．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１２．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１３．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１４．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１５．少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソン、または変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソンと隣接するイントロンを標的とする、条項１～１４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１６．ＤＮＡ標的化システムは、野生型ジストロフィン遺伝子またはその機能的等価物のエクソンを含むドナー配列をさらに含み、エクソンは、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、条項１～１５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１７．少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する２つのイントロンを標的とする、条項１～１６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１８．ＤＮＡ標的化システムは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第１のイントロンにおける第１の二本鎖切断およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第２のイントロンにおける第２の二本鎖切断を誘導する、条項１～１７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１９．ポリヌクレオチドは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９をコードする、条項１～１８のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２０．ｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡである、条項３～１９のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２１．改変ｍＲＮＡは、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、ＨＡタグ、およびウリジン置換から選択される１つまたは複数の改変を含む、条項２０に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２２．筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞から選択される、条項１～２１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２３．条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
条項２４．対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは条項２３に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
条項２５．対象は、投与後にＣａｓ９ヌクレアーゼと交差反応性の液性応答を経験しないか、または限定された液性応答を経験する、条項２４に記載の方法。
条項２６．対象は、変異ジストロフィン遺伝子を含む、条項２４または２５に記載の方法。
条項２７．対象において変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは条項２３に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
条項２８．変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、もしくは異常なスプライスドナー部位、またはその組み合わせを含む、条項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
条項２９．変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切断型遺伝子産物の原因となるフレームシフト変異を含む、条項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
条項３０．変異ジストロフィン遺伝子は、リーディングフレームを破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む、条項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
条項３１．変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集は、未成熟終止コドンの除去、破壊されたリーディングフレームの修正、スプライスアクセプター部位の破壊によるスプライシングの調節、スプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調節、エクソン５１の除去、またはその組み合わせを含む、条項２７に記載の方法。
条項３２．変異ジストロフィン遺伝子は、相同組み換え修復によって編集される、条項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
条項３３．対象におけるジストロフィン発現は、編集後に少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する、条項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
条項３４．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、誕生前または誕生の１～２日以内に対象に投与される、条項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
条項３５．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、筋肉内、静脈内、またはその組み合わせで対象に投与される、条項２４～３４のいずれか１項に記載の方法。
条項３６．脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子または組成物の投与は、対象において機能的なジストロフィンタンパク質または部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の発現をもたらす、条項２４～３５のいずれか１項に記載の方法。
条項３７．条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む、キット。
条項１．筋細胞にＤＮＡ標的化システムを送達するための脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子であって、ＤＮＡ標的化システムは、変異ジストロフィン遺伝子のフラグメントを標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ分子、および／またはＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２．少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子を含む、条項１に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項３．Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである、条項１または２に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項４．第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ標的化ドメインを含み、第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号８３、もしくは配列番号１１０から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１１２～１２４から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３８、配列番号４２、配列番号８４、もしくは配列番号１１１から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、あるいは配列番号１２５～１３４またはそのフラグメントもしくは相補鎖から選択されるヌクレオチド配列を含み、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、異なる標的化ドメインを含む、条項１～３のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項５．第１のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１０のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１２４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含み、第２のｇＲＮＡ分子は、配列番号１１１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む標的化ドメインを含むか、あるいは配列番号１３４のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくは相補鎖を含む、条項４に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項６．少なくとも１種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子中に封入される、条項１～５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項７．少なくとも１種のｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、別々の脂質ナノ粒子中に封入される、条項１～６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項８．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）、および固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）からなる群から選択される、条項１～７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項９．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１０．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１１．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質・薬物複合（ＬＤＣ）ナノ粒子である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１２．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、脂質ナノカプセル（ＬＮＣ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１３．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリマー脂質ハイブリッドナノ粒子（ＰＬＮ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１４．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、固体脂質マイクロ粒子（ＳＬＭ）である、条項８に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１５．少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソン、または変異ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択されるエクソンと隣接するイントロンを標的とする、条項１～１４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１６．ＤＮＡ標的化システムは、野生型ジストロフィン遺伝子またはその機能的等価物のエクソンを含むドナー配列をさらに含み、エクソンは、野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン１～８、１０、１１、１２、１４、１６～２２、４３～５９、および６１～６６から選択される、条項１～１５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１７．少なくとも１種のｇＲＮＡ分子は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する２つのイントロンを標的とする、条項１～１６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１８．ＤＮＡ標的化システムは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第１のイントロンにおける第１の二本鎖切断およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１と隣接する第２のイントロンにおける第２の二本鎖切断を誘導する、条項１～１７のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項１９．ポリヌクレオチドは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９をコードする、条項１～１８のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２０．ｍＲＮＡは、改変ｍＲＮＡである、条項３～１９のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２１．改変ｍＲＮＡは、Ｎ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、ＨＡタグ、およびウリジン置換から選択される１つまたは複数の改変を含む、条項２０に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２２．筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、および平滑筋細胞から選択される、条項１～２１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子。
条項２３．条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
条項２４．対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置する方法であって、条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは条項２３に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
条項２５．対象は、投与後にＣａｓ９ヌクレアーゼと交差反応性の液性応答を経験しないか、または限定された液性応答を経験する、条項２４に記載の方法。
条項２６．対象は、変異ジストロフィン遺伝子を含む、条項２４または２５に記載の方法。
条項２７．対象において変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子あるいは条項２３に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
条項２８．変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊されたリーディングフレーム、異常なスプライスアクセプター部位、もしくは異常なスプライスドナー部位、またはその組み合わせを含む、条項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
条項２９．変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切断型遺伝子産物の原因となるフレームシフト変異を含む、条項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
条項３０．変異ジストロフィン遺伝子は、リーディングフレームを破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む、条項２６～２７のいずれか１項に記載の方法。
条項３１．変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集は、未成熟終止コドンの除去、破壊されたリーディングフレームの修正、スプライスアクセプター部位の破壊によるスプライシングの調節、スプライスドナー配列の破壊によるスプライシングの調節、エクソン５１の除去、またはその組み合わせを含む、条項２７に記載の方法。
条項３２．変異ジストロフィン遺伝子は、相同組み換え修復によって編集される、条項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
条項３３．対象におけるジストロフィン発現は、編集後に少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または少なくとも５０％増加する、条項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
条項３４．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、誕生前または誕生の１～２日以内に対象に投与される、条項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
条項３５．脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子は、筋肉内、静脈内、またはその組み合わせで対象に投与される、条項２４～３４のいずれか１項に記載の方法。
条項３６．脂質ナノ粒子もしくはマイクロ粒子または組成物の投与は、対象において機能的なジストロフィンタンパク質または部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の発現をもたらす、条項２４～３５のいずれか１項に記載の方法。
条項３７．条項１～２２のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子またはマイクロ粒子を含む、キット。
【0106】
配列
【表1】
【0107】
配列番号２６
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列
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化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列
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【0108】
配列番号２７
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９分子の対応するアミノ酸配列
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【0109】
配列番号２８
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
atgaaaaggaactacattctggggctggacatcgggattacaagcgtggggtatgggattattgactatgaaacaagggacgtgatcgacgcaggcgtcagactgttcaaggaggccaacgtggaaaacaatgagggacggagaagcaagaggggagccaggcgcctgaaacgacggagaaggcacagaatccagagggtgaagaaactgctgttcgattacaacctgctgaccgaccattctgagctgagtggaattaatccttatgaagccagggtgaaaggcctgagtcagaagctgtcagaggaagagttttccgcagctctgctgcacctggctaagcgccgaggagtgcataacgtcaatgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtctacaaaggaacagatctcacgcaatagcaaagctctggaagagaagtatgtcgcagagctgcagctggaacggctgaagaaagatggcgaggtgagagggtcaattaataggttcaagacaagcgactacgtcaaagaagccaagcagctgctgaaagtgcagaaggcttaccaccagctggatcagagcttcatcgatacttatatcgacctgctggagactcggagaacctactatgagggaccaggagaagggagccccttcggatggaaagacatcaaggaatggtacgagatgctgatgggacattgcacctattttccagaagagctgagaagcgtcaagtacgcttataacgcagatctgtacaacgccctgaatgacctgaacaacctggtcatcaccagggatgaaaacgagaaactggaatactatgagaagttccagatcatcgaaaacgtgtttaagcagaagaaaaagcctacactgaaacagattgctaaggagatcctggtcaacgaagaggacatcaagggctaccgggtgacaagcactggaaaaccagagttcaccaatctgaaagtgtatcacgatattaaggacatcacagcacggaaagaaatcattgagaacgccgaactgctggatcagattgctaagatcctgactatctaccagagctccgaggacatccaggaagagctgactaacctgaacagcgagctgacccaggaagagatcgaacagattagtaatctgaaggggtacaccggaacacacaacctgtccctgaaagctatcaatctgattctggatgagctgtggcatacaaacgacaatcagattgcaatctttaaccggctgaagctggtcccaaaaaaggtggacctgagtcagcagaaagagatcccaaccacactggtggacgatttcattctgtcacccgtggtcaagcggagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaatgatatcattatcgagctggctagggagaagaacagcaaggacgcacagaagatgatcaatgagatgcagaaacgaaaccggcagaccaatgaacgcattgaagagattatccgaactaccgggaaagagaacgcaaagtacctgattgaaaaaatcaagctgcacgatatgcaggagggaaagtgtctgtattctctggaggcctccccctggaggacctgctgaacaatccattcaactacgaggtcgatcatattatccccagaagcgtgtccttcgacaattcctttaacaacaaggtgctggtcaagcaggaagagaactctaaaaagggcaataggactcctttccagtacctgtctagttcagattccaagatctcttacgaaacctttaaaaagcacattctgaatctggccaaaggaaagggccgcatcagcaagaccaaaaaggagtacctgctggaagagcgggacatcaacagattctccgtccagaaggattttattaaccggaatctggtggacacaagatacgctactcgcggcctgatgaatctgctgcgatcctatttccgggtgaacaatctggatgtgaaagtcaagtccatcaacggcgggttcacatcttttctgaggcgcaaatggaagtttaaaaaggagcgcaacaaagggtacaagcaccatgccgaagatgctctgattatcgcaaatgccgacttcatctttaaggagtggaaaaagctggacaaagccaagaaagtgatggagaaccagatgttcgaagagaagcaggccgaatctatgcccgaaatcgagacagaacaggagtacaaggagattttcatcactcctcaccagatcaagcatatcaaggatttcaaggactacaagtactctcaccgggtggataaaaagcccaacagagagctgatcaatgacaccctgtatagtacaagaaaagacgataaggggaataccctgattgtgaacaatctgaacggactgtacgacaaagataatgacaagctgaaaaagctgatcaacaaaagtcccgagaagctgctgatgtaccaccatgatcctcagacatatcagaaactgaagctgattatggagcagtacggcgacgagaagaacccactgtataagtactatgaagagactgggaactacctgaccaagtatagcaaaaaggataatggccccgtgatcaagaagatcaagtactatgggaacaagctgaatgcccatctggacatcacagacgattaccctaacagtcgcaacaaggtggtcaagctgtcactgaagccatacagattcgatgtctatctggacaacggcgtgtataaatttgtgactgtcaagaatctggatgtcatcaaaaaggagaactactatgaagtgaatagcaagtgctacgaagaggctaaaaagctgaaaaagattagcaaccaggcagagttcatcgcctccttttacaacaacgacctgattaagatcaatggcgaactgtatagggtcatcggggtgaacaatgatctgctgaaccgcattgaagtgaatatgattgacatcacttaccgagagtatctggaaaacatgaatgataagcgcccccctcgaattatcaaaacaattgcctctaagactcagagtatcaaaaagtactcaaccgacattctgggaaacctgtatgaggtgaagagcaaaaagcaccctcagattatcaaaaagggc
【0110】
配列番号２９
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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【0111】
配列番号３０
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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【0112】
配列番号３１
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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【0113】
配列番号３２
黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子をコードするコドン最適化核酸配列、および任意に核局在化配列（ＮＬＳ）
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【0114】
配列番号３３
黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列
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黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列
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【0115】
配列番号３４
変異黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするＤＮＡ
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変異黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）をコードするＤＮＡ
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【0116】
配列番号３５
変異黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（Ｎ５８０Ａ）をコードするＤＮＡ
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変異黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（Ｎ５８０Ａ）をコードするＤＮＡ
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【0117】
配列番号３６
NGGNG
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【0118】
配列番号３７
ｐＤＯ２４０－１７９（ＪＣＲ１７９を有するプラスミド）
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ｐＤＯ２４０－１７９（ＪＣＲ１７９を有するプラスミド）
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【0119】
配列番号３８
ｐＤＯ２４０－１８３（ＪＣＲ１８３を有するプラスミド）
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ｐＤＯ２４０－１８３（ＪＣＲ１８３を有するプラスミド）
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【0120】
配列番号３９
ＰＴ３６６ ＡＡＶ１７９（ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡ１７９を有するＡＡＶ）
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ＰＴ３６６ ＡＡＶ１７９（ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡ１７９を有するＡＡＶ）
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【0121】
配列番号４０
ＰＴ３６６ ＡＡＶ１８３（ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡ１８３を有するＡＡＶ）
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ＰＴ３６６ ＡＡＶ１８３（ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡ１８３を有するＡＡＶ）
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggcctctagactcgaggcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactaccggtgccaccATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGggatcctacccatacgatgttccagattacgcttacccatacgatgttccagattacgcttacccatacgatgttccagattacgcttaagaattcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaggtaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttGTGGAAAGGACGAAACACCgagaactggtgggaaatggtctaggttttagtactctggaaacagaatctactaaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagatttttgcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccag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【0122】
配列番号４１
ＪＣＲ９４
aacaaatatcccttagtatc
配列番号４２
ＪＣＲ９９
aatgtatttcttctattcaa
ＪＣＲ９４
aacaaatatcccttagtatc
配列番号４２
ＪＣＲ９９
aatgtatttcttctattcaa
【0123】
配列番号４３
ＮＬＳを有するＡＡＶにおけるＳａＣａｓ９をコードするＤＮＡ
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag
ＮＬＳを有するＡＡＶにおけるＳａＣａｓ９をコードするＤＮＡ
atggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag
【0124】
配列番号４４
ＮＬＳを有さないＡＡＶにおけるＳａＣａｓ９をコードするＤＮＡ
aagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggc
ＮＬＳを有さないＡＡＶにおけるＳａＣａｓ９をコードするＤＮＡ
aagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggc
【0125】
配列番号４５
ＮＬＳを有さないＡＡＶにおけるＳａＣａｓ９によってコードされるＳａＣａｓ９のアミノ酸配列
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ＮＬＳを有さないＡＡＶにおけるＳａＣａｓ９によってコードされるＳａＣａｓ９のアミノ酸配列
KRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
【0126】
【表2】
【0127】
配列番号８３
ｐＤＯ２４２（インビトロ研究のためにすべてのＪＣＲ８９／９１プロジェクトおよびＪＣＲ１５７／１６０プロジェクトにおいて使用されるＳａＣａｓ９）
ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacCtttaattctagtactatgcaTgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactaccggtgccaccatgaaaaggaactacattctggggctggacatcgggattacaagcgtggggtatgggattattgactatgaaacaagggacgtgatcgacgcaggcgtcagactgttcaaggaggccaacgtggaaaacaatgagggacggagaagcaagaggggagccaggcgcctgaaacgacggagaaggcacagaatccagagggtgaagaaactgctgttcgattacaacctgctgaccgaccattctgagctgagtggaattaatccttatgaagccagggtgaaaggcctgagtcagaagctgtcagaggaagagttttccgcagctctgctgcacctggctaagcgccgaggagtgcataacgtcaatgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtctacaaaggaacagatctcacgcaatagcaaagctctggaagagaagtatgtcgcagagctgcagctggaacggctgaagaaagatggcgaggtgagagggtcaattaataggttcaagacaagcgactacgtcaaagaagccaagcagctgctgaaagtgcagaaggcttaccaccagctggatcagagcttcatcgatacttatatcgacctgctggagactcggagaacctactatgagggaccaggagaagggagccccttcggatggaaagacatcaaggaatggtacgagatgctgatgggacattgcacctattttccagaagagctgagaagcgtcaagtacgcttataacgcagatctgtacaacgccctgaatgacctgaacaacctggtcatcaccagggatgaaaacgagaaactggaatactatgagaagttccagatcatcgaaaacgtgtttaagcagaagaaaaagcctacactgaaacagattgctaaggagatcctggtcaacgaagaggacatcaagggctaccgggtgacaagcactggaaaaccagagttcaccaatctgaaagtgtatcacgatattaaggacatcacagcacggaaagaaatcattgagaacgccgaactgctggatcagattgctaagatcctgactatctaccagagctccgaggacatccaggaagagctgactaacctgaacagcgagctgacccaggaagagatcgaacagattagtaatctgaaggggtacaccggaacacacaacctgtccctgaaagctatcaatctgattctggatgagctgtggcatacaaacgacaatcagattgcaatctttaaccggctgaagctggtcccaaaaaaggtggacctgagtcagcagaaagagatcccaaccacactggtggacgatttcattctgtcacccgtggtcaagcggagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaatgatatcattatcgagctggctagggagaagaacagcaaggacgcacagaagatgatcaatgagatgcagaaacgaaaccggcagaccaatgaacgcattgaagagattatccgaactaccgggaaagagaacgcaaagtacctgattgaaaaaatcaagctgcacgatatgcaggagggaaagtgtctgtattctctggaggccatccccctggaggacctgctgaacaatccattcaactacgaggtcgatcatattatccccagaagcgtgtccttcgacaattcctttaacaacaaggtgctggtcaagcaggaagagaactctaaaaagggcaataggactcctttccagtacctgtctagttcagattccaagatctcttacgaaacctttaaaaagcacattctgaatctggccaaaggaaagggccgcatcagcaagaccaaaaaggagtacctgctggaagagcgggacatcaacagattctccgtccagaaggattttattaaccggaatctggtggacacaagatacgctactcgcggcctgatgaatctgctgcgatcctatttccgggtgaacaatctggatgtgaaagtcaagtccatcaacggcgggttcacatcttttctgaggcgcaaatggaagtttaaaaaggagcgcaacaaagggtacaagcaccatgccgaagatgctctgattatcgcaaatgccgacttcatctttaaggagtggaaaaagctggacaaagccaagaaagtgatggagaaccagatgttcgaagagaagcaggccgaatctatgcccgaaatcgagacagaacaggagtacaaggagattttcatcactcctcaccagatcaagcatatcaaggatttcaaggactacaagtactctcaccgggtggataaaaagcccaacagagagctgatcaatgacaccctgtatagtacaagaaaagacgataaggggaataccctgattgtgaacaatctgaacggactgtacgacaaagataatgacaagctgaaaaagctgatcaacaaaagtcccgagaagctgctgatgtaccaccatgatcctcagacatatcagaaactgaagctgattatggagcagtacggcgacgagaagaacccactgtataagtactatgaagagactgggaactacctgaccaagtatagcaaaaaggataatggccccgtgatcaagaagatcaagtactatgggaacaagctgaatgcccatctggacatcacagacgattaccctaacagtcgcaacaaggtggtcaagctgtcactgaagccatacagattcgatgtctatctggacaacggcgtgtataaatttgtgactgtcaagaatctggatgtcatcaaaaaggagaactactatgaagtgaatagcaagtgctacgaagaggctaaaaagctgaaaaagattagcaaccaggcagagttcatcgcctccttttacaacaacgacctgattaagatcaatggcgaactgtatagggtcatcggggtgaacaatgatctgctgaaccgcattgaagtgaatatgattgacatcacttaccgagagtatctggaaaacatgaatgataagcgcccccctcgaattatcaaaacaattgcctctaagactcagagtatcaaaaagtactcaaccgacattctgggaaacctgtatgaggtgaagagcaaaaagcaccctcagattatcaaaaagggcagcggaggcaagcgtcctgctgctactaagaaagctggtcaagctaagaaaaagaaaggatcctacccatacgatgttccagattacgcttaagaattcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaggtagcggccgcCCgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgcttt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ｐＤＯ２４２（インビトロ研究のためにすべてのＪＣＲ８９／９１プロジェクトおよびＪＣＲ１５７／１６０プロジェクトにおいて使用されるＳａＣａｓ９）
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【0128】
配列番号８４
ｐＪＲＨ１（すべてのＪＣＲ１７９／１８３プロジェクトに使用されるＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９は、大文字であり、ＮＬＳは、小文字、太字、および下線付きである）
ｐＪＲＨ１（すべてのＪＣＲ１７９／１８３プロジェクトに使用されるＳａＣａｓ９、ＳａＣａｓ９は、大文字であり、ＮＬＳは、小文字、太字、および下線付きである）
【0129】
配列番号８５
ＰＴ３６６のＮＬＳ配列
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ＰＴ３６６のＮＬＳ配列
aaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaag
【0130】
配列番号８６
ｐＤＯ２０３ － ＳｐＣａｓ９のためのｇＲＮＡをクローン化する一般的な骨格；ＪＣＲ９４およびＪＣＲ９９を細胞における試験のために太字の部位に挿入した後、ｈＤＭＤ－ｄｅｌｔａ５２／ｍｄｘマウスを作製するためにｍＲＮＡを作製した
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ｐＤＯ２０３ － ＳｐＣａｓ９のためのｇＲＮＡをクローン化する一般的な骨格；ＪＣＲ９４およびＪＣＲ９９を細胞における試験のために太字の部位に挿入した後、ｈＤＭＤ－ｄｅｌｔａ５２／ｍｄｘマウスを作製するためにｍＲＮＡを作製した
ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttatcgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGGGTCTTCGAGAAGACCTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac
【0131】
【表3】
【0132】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】