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特表2023-504218細胞から培養食肉、組織及びそれらと関連製品を生産するシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-01
(54)【発明の名称】細胞から培養食肉、組織及びそれらと関連製品を生産するシステム
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20230125BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20230125BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022558367
(86)(22)【出願日】2020-11-30
(85)【翻訳文提出日】2022-07-29
(86)【国際出願番号】 IB2020061257
(87)【国際公開番号】W WO2021111270
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】62/942,568
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522217821
【氏名又は名称】アヴァント ミーツ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＶＡＮＴ ＭＥＡＴＳ ＣＯＭＰＡＮＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１１ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ Ｕｎｉｔ ６２０，６／Ｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ２，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １１ Ｗ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ（ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100116687
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 爾
(74)【代理人】
【識別番号】100098383
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100155860
【弁理士】
【氏名又は名称】藤松 正雄
(72)【発明者】
【氏名】チン，ポ サン マリオ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，カイ イー キャリー
(72)【発明者】
【氏名】リー，チュアン ワイ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029BB11
4B065AA90X
4B065AC20
4B065CA41
(57)【要約】
【課題】本発明の課題は、細胞の生産の規模を拡大する代替のシステム及び方法、また、細胞生産にとって最適な培地条件等を維持するシステムを提供し、更に、大規模細胞培養システムを提供すること等である。
【解決手段】本発明の細胞培養システムは、少なくとも一種類の細胞を保持するよう構成される細胞培養部と、第一の流体を、細胞培養部に供給し、かつ受け取るよう構成される新鮮培地部と、第二の流体を供給し、かつ新鮮培地部から受け取るよう構成される廃物除去部と、第一の流体を循環させるよう構成され、細胞培養部と新鮮培地部との間に接続される第一のポンプと、第二の流体を循環させるよう構成され、新鮮培地部と廃物除去部との間に接続される第二のポンプとを備え、細胞培養部、新鮮培地部、及び廃物除去部は、交差汚染を避けるよう、互いに分離されている細胞培養システムである。
【選択図】図７
【解決手段】本発明の細胞培養システムは、少なくとも一種類の細胞を保持するよう構成される細胞培養部と、第一の流体を、細胞培養部に供給し、かつ受け取るよう構成される新鮮培地部と、第二の流体を供給し、かつ新鮮培地部から受け取るよう構成される廃物除去部と、第一の流体を循環させるよう構成され、細胞培養部と新鮮培地部との間に接続される第一のポンプと、第二の流体を循環させるよう構成され、新鮮培地部と廃物除去部との間に接続される第二のポンプとを備え、細胞培養部、新鮮培地部、及び廃物除去部は、交差汚染を避けるよう、互いに分離されている細胞培養システムである。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも一種類の細胞を保持するよう構成される細胞培養部と、第一の流体を、細胞培養部に供給し、かつ受け取るよう構成される新鮮培地部と、
第二の流体を供給し、かつ新鮮培地部から受け取るよう構成される廃物除去部と、
第一の流体を循環させるよう構成され、細胞培養部と新鮮培地部との間に接続される第一のポンプと、
第二の流体を循環させるよう構成され、新鮮培地部と廃物除去部との間に接続される第二のポンプと
を備え、細胞培養部、新鮮培地部、及び廃物除去部は、交差汚染を避けるよう、互いに分離されている、
細胞培養システム。
【請求項2】
細胞が、哺乳類、魚、動物、又は植物の、皮膚、筋肉、脂肪、骨、又はその他の組織から得られる請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
新鮮培地部が、第一の流体から第二の流体へと廃物を抽出し、かつ第二の流体から第一の流体へと栄養素を供給するよう構成される第一の透析部を、更に備える請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
第一の透析部が、少なくとも一つの500 Da分子量遮断(MWCO)薄膜を更に備え、その薄膜は、セルロースエステル(CE)、再生セルロース(RC)、及びポリフッ化ビニリデン(PVDF)から選択される請求項３に記載のシステム。
【請求項5】
廃物除去部が、第二の流体から廃物を抽出するよう構成される第二の透析部を、更に備える請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
第二の透析部が、少なくとも一つの100 Da分子量遮断(MWCO)薄膜を更に備え、その薄膜は、セルロースエステル(CE)、再生セルロース(RC)、及びポリフッ化ビニリデン(PVDF)から選択される請求項５に記載のシステム。
【請求項7】
細胞培地を育てる方法であって、請求項１に記載の細胞培養システムを提供し、
少なくとも一種類の細胞を細胞培養部に入れ、
細胞培養部と新鮮培地部との間で第一の流体を循環させ、
新鮮培地部と廃物除去部との間で第二の流体を循環させ、
新鮮培地部で、第一の流体から第二の流体へと廃物を抽出し、
新鮮培地部で、第二の流体から第一の流体へと栄養素を補給する
ステップを備える方法。
【請求項8】
細胞が、哺乳類、魚、動物、又は植物の、皮膚、筋肉、脂肪、骨、又はその他の組織から得られる請求項７に記載の方法。
【請求項9】
廃物除去部で、第二の流体から廃物を抽出するステップを更に備える請求項７に記載の方法。
【請求項10】
培養容器を、培養のための所定の温度に加熱し、細胞培養部において、第一の流体を攪拌し、
細胞培地を所定の密度まで育てて、
第一の流体から細胞培地を分離する
ステップを更に備える請求項７に記載の方法。
【請求項11】
第一の流体が培養基であり、第二の流体が新鮮な基礎培地である請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
細胞を食肉へと形成するステップを更に備える請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
細胞を組織構築物へと形成するステップを更に備える請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
マイクロキャリアがあってもなくても細胞が成長する請求項７に記載の方法。
【請求項15】
骨組みがあってもなくても細胞が成長する請求項７に記載の方法。
【請求項16】
細胞が、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、及び衛星細胞といった様々な起源の幹細胞か又は遺伝子組換え細胞であり得る請求項７に記載の方法。
【請求項17】
第一の透析部で、分化培地の少なくとも一つの成分を第二の流体に供給し、工学的に作り出される機能組織を形成するために、幹細胞の拡大後に、分化を続いて起こすステップを更に備える請求項１６に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞培地を育てる、改良したシステム及び方法に関する。また、食肉生産及び組織構築/工学のための、改良したシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
動物の肉は、タンパク質が豊富で、身体機能のサポートに用いられるタンパク質を作るために必要なすべてのアミノ酸の供給源となる。消費される食肉は、伝統的には、養殖場で飼われる動物や魚から得られる。しかしながら、動物の肉を生産する畜産業や水生動物養殖業では、大量のエネルギーと資源が必要であり、カーボンフットプリントも高くなる。畜産業や水生動物養殖業で生産された食肉は、生産プロセスにおいて、病気や汚染源や毒素に露呈されるかもしれないので、そのような食肉では、人々の健康が危険にさらされかねない。人口増加、食肉需要の高まり、環境問題、陸地や水域の限りある資源、生物多様性の損失及び動物の屠殺に関しての否定的な見方と言った多くの懸念があって、科学者が、代替のプロセスで食肉を生産する技法を開発する運びとなった。
【0003】
生体外食肉生産は、細胞培養技法を用いて、実験室で、動物の筋肉組織又は臓器組織を成長させて食肉及び食肉製品を製造するプロセスである。ここで用いられている通り、生体外食肉及び食肉製品には、可溶な形態や固形であったりする動物タンパク製品ならびに非食肉製品が含まれる。まだ開発の初期段階ではあるが、生体外食肉及び食肉製品には、健康及び環境上の利点及び動物の繁栄にとっての利益と言った、伝統的な食肉製品に無い数多くの利点がある。それは、細胞畜産業又は細胞培養での畜産製品の生産と言う、より広い分野の一部として運用される次世代の新興の技術である。
【0004】
生体外食肉の生産のための細胞は、動物バイオプシーから取られる細胞（例えば、筋肉細胞、体細胞、幹細胞など）であり、そして、それは、バイオリアクター又はその他の種類の無菌環境における培養基（培地）で、動物から分離されて育てられる。その細胞は、バイオリアクターに置かれる三次元の可食の骨組みに付着することで、動物臓器を模した半固形又は固形へと成長する。出発細胞は、動物組織又は連続細胞株から直接得られる一次細胞である。適切な培養基において正しい条件で育てられたら、一次細胞は、成長して増殖するが、細胞のDNAの端におけるテロメア長に関連する有限の回数だけである。他方、連続細胞株は、生体外で、長期間培養できる。細胞生物学の研究によって、一次細胞を如何にして不死の連続細胞株に変えるのかについて手順が確立されている。ウイルス性癌遺伝子、化学処理、又は、テロメアが縮むのを防ぐためのテロメラーゼ逆転写酵素の過剰発現を用いて、一次細胞は、連続細胞株へと形質転換される。
【0005】
培養基は、アミノ酸、塩、ビタミン、成長因子、及びpHを制御するための緩衝システムといった細胞の増殖に必要な成分を含む。牛胎児血清(FBS)によって、生体巨大分子、成長因子、及び免疫分子が供給されるので、現在の方法では、FBSを、使用に先立って培養基に加える。しかしながら、FBSは、胎内の仔牛から得られるので、動物製品は使わないと言う目的と折りが合わない。動物成分を含まない培養基で細胞を育てると言うのが、生体外食肉生産の研究に従事する科学者が考える重要な要素である。成長因子には、ヒトを供給源として得られるものもある。
【0006】
現在の生体外食肉生産は、細胞ベースのビーフ、ポーク及び家禽肉といった商品肉は、大抵の種類をカバーしている。しかしながら、これらの種類の食肉は、現在の生物医学技術の技法を用いて生産するのが困難であって費用もかさむ複数の細胞腫を含む複雑な組織の有機体を有する。細胞培養技法で生産される食肉においてタンパク質レベルとバイオマス産出高を上げるための非GM（非遺伝子組み換え）方法もまた欠如している。更には、上述の通り、現在の細胞培養技術は、栄養源としての動物成分（例えば、FBS）並びに高価な非食品グレードの成長因子に依存している。
【0007】
培養食肉の生産、又は再生医療/組織工学/組織構築の臨床への適用においては、十分な細胞数を収穫することが不可欠である。培養食肉の生産という用途では、1 kgのタンパク質が約8×1012個の筋肉細胞を含む。再生医療への適用では、治療毎に約1010個から1012個の細胞がほとんどの用途で必要とされる。例えば、成人では、損傷した心臓組織を置き換えるのに1×109個から2×109個の心筋細胞が必要とされよう。肝不全を治療するには、肝細胞の細胞数1010個を必要とするだろう。
【0008】
現在の細胞培養のアプローチは、培養基の存在のもと、培養容器の2D培地表面に細胞を接種する。一般に、培養基は、グルコース、ビタミン、無機塩、アミノ酸、及びその他の栄養素を含む。細胞が成長すると、栄養素が徐々に枯渇して代謝廃物が蓄積する。したがって、培養基を２、3日ごとに取り替えて、栄養を元に戻し、廃物を取り除く。この細胞培養アプローチにはいくつかの問題がある。第一に、細胞は、培地を取り替える間の、次善の条件で育つ。とりわけ、細胞に高度な増殖性があり、代謝率が高ければ、細胞は、グルコースのような栄養素を消費して、短時間で、乳酸や、アンモニアのような廃物を蓄積する。代謝廃物又は成長インヒビターのレベルが高くなると、細胞の成長が抑止され得る。これによって、次の培地の取り替えまで、細胞の、最適な速度での成長が妨げられる。第二に、培養基を変えると、栄養素と成長因子が無駄になってしまい、生産費が嵩んでしまう。使用済みの培養基を取り替えるときでも、それにはまだ栄養素が残っている。とりわけ、使用済みの培養基の成長因子は、血清サプリメントのものでも、細胞が分泌したものでも、培地を取り替える間に取り除かれてしまう。これによって、血清サプリメントの用量が増し、それが、培地の費用や生産費のかなりの部分に寄与してしまう。第三に、培地は、手作業で変える必要があるが、これによって、生産費が上昇し、大規模の製造においては、汚染の機会が増えてしまう。
【発明の概要】
【0009】
本開示の例は、前記課題を解決する、ヒトが消費する生体外食肉の生産方法に適用される方法を開示する。
【0010】
本発明の目的は、細胞の生産の規模を拡大する代替のシステム及び方法を提供し、それによって、培養食肉の生産、及び組織工学/再生医療/組織構築の適用にかかる費用を下げて、それらの規模を拡大することである。又、本発明の目的は、細胞生産にとって、最適な培地条件、安定した栄養素レベル、及び/又は最低の成長インヒビターレベルを維持するシステムを提供することである。更に、本発明のもう一つの目的は、使用されていない成長因子を持ち続けて、生産を高め、費用を低減しながら、自動的に、栄養素を元に戻し、細胞が生成した成長インヒビターを取り除くことができる大規模細胞培養システムを提供することである。
【0011】
本発明の他の目的は、細胞培養システムを用いて食肉製品を作る方法を提供することである。更に、本発明の目的は、この培養システムを用いる組織工学/組織構築の方法を提供することである。更に、本発明の目的は、再生医療への適用のために細胞を臨床的に意味がある数まで拡大させる方法を提供することである。
【0012】
本発明によって、次の利点が得られる。(1) 培養基において、最適な細胞の生存力と細胞の成長のために、グルコースのような栄養素を最適なレベルに保ち、アンモニアや乳酸のような廃物を低いレベルに保つ。(2) 細胞が分泌する成長因子を持ち続け、培養基における動物由来の血清の使用を低減する。成長因子は高価であり、したがって、本発明は、廃物を取り除きつつも、培養基に成長因子を持ち続けることで、費用を下げ、培地の使用を最適化するのに役立つ。
【0013】
以下により詳細に説明する通り、本発明によって、劇的に、(1) 細胞培養システムから排出される廃物が低減し、(2) 従来の技法と比べて細胞の大量生産が増進する。
【0014】
本発明の開示の一つの例によると、細胞培養システムが、少なくとも一種類の細胞を保持するよう構成される細胞培養部と、第一の流体を、細胞培養部に供給し、かつ受け取るよう構成される新鮮培地部と、第二の流体を供給し、かつ新鮮培地部から受け取るよう構成される廃物除去部と、第一の流体を循環させるよう構成され、細胞培養部と新鮮培地部との間に接続される第一のポンプと、第二の流体を循環させるよう構成され、新鮮培地部と廃物除去部との間に接続される第二のポンプとを備え、細胞培養部、新鮮培地部、及び廃物除去部は、交差汚染を避けるよう、互いに分離されている。
【0015】
本発明の開示の他の例によると、本発明の細胞培養システムを用いて細胞培地を育てる方法が、少なくとも一種類の細胞を細胞培養部に入れ、細胞培養部と新鮮培地部との間で第一の流体を循環させ、新鮮培地部と廃物除去部との間で第二の流体を循環させ、新鮮培地部で、第一の流体から第二の流体へと廃物を抽出し、新鮮培地部で、第二の流体から第一の流体へと栄養素を補給するステップを備える。
【0016】
ここに開示される例は、前記課題を解決する、ヒトが消費する生体外食肉の生産システム及び方法、及び/又は組織工学/組織構築/再生医療での適用にあてはまる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
図面の簡単な説明を以下にする。
【0018】
添付した図面を関連させて考慮すると、本開示は、詳細な説明を参照することで、よりよく理解される。図面中の構成要素は、必ずしも一定の比例に応じておらず、むしろ、開示の本質を例証することに重点が置かれている。
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【発明を実施するための形態】
【0031】
発明の詳細な説明
次に図面を参照し、とりわけ、図１を参照すると、生体外食肉生産の方法10が示されている。ここで用いられている通り、「生体外食肉生産」とは、細胞培養技法を用いて動物及び/又は植物の組織を実験室で育て、食肉及び食肉製品を製造する、細胞ベースの食肉生産プロセス又は細胞ベースの畜産プロセスのことを指して言うものである。ブロック12で、動物又は植物から組織が分離される。一つの例において、その組織は、ハタ、スズキ、又はニベと言った海水魚を含む硬骨魚綱の硬骨魚から得られる。他の例においては、牛組織のような他の種類の動物組織が分離される。例によっては、ブロック12には、魚から浮き袋のような臓器組織を収集して細胞懸濁液を作ることが含まれる。以下の説明では、魚を供給源として得られる組織が主に記述されているが、この概念を、他の種類の動物及び/又は植物を供給源として得られる組織に適用して、他の種類の生体外食肉及び/又は動物タンパク質製品、及び菜食主義者用食肉及び/又はタンパク質製品が提供されるようにしても良いことは理解されるものである。
次に図面を参照し、とりわけ、図１を参照すると、生体外食肉生産の方法10が示されている。ここで用いられている通り、「生体外食肉生産」とは、細胞培養技法を用いて動物及び/又は植物の組織を実験室で育て、食肉及び食肉製品を製造する、細胞ベースの食肉生産プロセス又は細胞ベースの畜産プロセスのことを指して言うものである。ブロック12で、動物又は植物から組織が分離される。一つの例において、その組織は、ハタ、スズキ、又はニベと言った海水魚を含む硬骨魚綱の硬骨魚から得られる。他の例においては、牛組織のような他の種類の動物組織が分離される。例によっては、ブロック12には、魚から浮き袋のような臓器組織を収集して細胞懸濁液を作ることが含まれる。以下の説明では、魚を供給源として得られる組織が主に記述されているが、この概念を、他の種類の動物及び/又は植物を供給源として得られる組織に適用して、他の種類の生体外食肉及び/又は動物タンパク質製品、及び菜食主義者用食肉及び/又はタンパク質製品が提供されるようにしても良いことは理解されるものである。
【0032】
分離される細胞の多くは成体細胞で、医療研究において確立された種々の方法を継続的に用いて増殖させることが可能である（ブロック14）。例えば、山中因子のような特定の遺伝子を用いて、成体細胞を人工多能性幹細胞（iPS細胞）のような幹細胞へとプログラムし直してもよい。代わりに、分離された成体細胞を、テロメラーゼ逆転写酵素過剰発現によって連続株細胞へと変換しても良い。他の例においては、他の種類の細胞が、成体幹細胞や胚性幹細胞のように分離されても良い。この点について、本発明の開示の方法には、あらゆる株細胞が供給源として含まれる。
【0033】
次のブロック16では、バイオリアクターのような無菌室又は無菌容器において、食品グレードの生体適合骨組に付着/固着することによって、細胞が、魚臓器のような動物臓器を模した固体又は半固体構造体へと成長する。無菌室又は無菌容器は、温度制御され、化学薬品、栄養素、及び細胞のような物質を導入して取り除くための導入口と排出口を有していて良い。食品グレードの生体適合骨組は、最終可食製品の一部となり、アガロース、アルジネート、キトサン、菌糸体、及びコンニャクグルコマンナンと言った植物ベース又は菌類ベースの材料で作られる。ただし、材料が、それらに限定される訳では無い。アルジネートは、褐藻から自然に得られるバイオポリマーであって、生体適合性がある。加えて、菌類から得られる植物ベースのキトサンは、抗菌性を有する。例によっては、無菌容器において、抗生剤や抗菌化合物の無いままブロック16が行われる。ブロック18は、細胞の生存と成長をサポートするための、培養基のバイオリアクターへの供給に関する。培養基は、無機塩（例えば、塩化カルシウム(CaCl2)、塩化カリウム(KCl)、塩化ナトリウム(NaCl)、重炭酸ナトリウム(NaHCO3)、リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)、硫酸マグネシウム(MgSO4)、等々）、アミノ酸、ビタミン（例えば、チアミン、リボフラビン、葉酸、等々）と言った成分、及びグルコース、β-メルカプトエタノール、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)及びピルビン酸ナトリウムと言ったその他の成分を含む緩衝溶液であって良い。ただし、成分が、それらに限定される訳では無い。限定されない成長培地には、例として、ライボビッツL-15培地、イーグル最小必須培地(MEM)、培地199、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ハムF12培地、ハムF10培地、マッコイ5A培地、グラスゴー改変イーグル培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地、及びRPMI 1640が含まれが、それらに限定される訳ではない。
【0034】
ブロック20によると、食品グレードの成長因子及びサイトカインが、バイオリアクターの培養基に導入されて、細胞の成長と増殖をサポートする。成長因子及びサイトカインには、インシュリン成長因子1(IGF-1)、インシュリン、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、インターロイキン11(IL-11)、線維芽細胞成長因子(FGF)、表皮成長因子(EGF)、及びトランスフェリンが含まれるが、それらに限定される訳ではない。ブロック20が、牛胎児血清(FBS)無しでの、生体工学的に作り出された細胞の、分離された細胞との同時培養に関するものもある。生体工学的に作り出された細胞は、前記成長因子とサイトカインを分泌するように作り出されており、これらの生体分子を、分離された細胞に、成長と増殖に必要なだけ供給する。
【0035】
ここで用いられている通り、「生体工学的に作り出された」細胞は、遺伝子組換え細胞と同等ではない。生体工学的に作り出された細胞は、一つ以上の特定のタンパク質を過剰発現する特定の遺伝子を有する。生体工学的に作り出された細胞は、魚の細胞又は、牛の細胞と言った、他の種類の動物の細胞であって良い。生体工学的に作り出された細胞は、最終食肉製品には含まれない。限定されるわけではない例として、生体工学的に作り出された魚の細胞が、分離された魚の細胞と同時培養されても良く、あるいは、生体工学的に作り出された牛の細胞が、分離された牛の細胞と同時培養されても良い。本発明の開示の同時培養方法によると、培養基において、動物由来である牛胎児血清(FBS)が必要で無くなる。更には、その同時培養方法によって、食品グレードの、特定の成長因子とサイトカインが、成長する分離された細胞に本来の位置（in situ）で継続的に供給され、製造プロセスが簡素化され、その費用が低減される。しかしながら、他の例においては、ブロック16では、細胞の成長をサポートするために、FBS、又はその他の血清を用いて、成長因子、サイトカイン、及びその他の栄養素を供給しても良い。
【0036】
加えて、ブロック22によると、細胞中のタンパク質発現が増大して、結果として得られる食肉製品のバイオマス産出高が増大する。ここで用いられている通り、「バイオマス産出高」は、結果として得られる食肉製品において、消費の際にエネルギーの産出に利用可能な消化できる材料（例えば、タンパク質）の量のことを言う。更に具体的には、ブロック22は、培養に先立って細胞の操作を行うことで、細胞におけるマイクロRNAレベルを変えてタンパク質発現を増大させることに関する。マイクロRNAは、転写後遺伝子発現の規制に関係する、内因性の、短い、非符号化単一撚線RNAシーケンスである。ブロック22は、メッセンジャーRNA(mRNA)翻訳を促進することによってタンパク質発現を増大させるマイクロRNAの上方制御の量を増やすこと、及び/又はmRNA翻訳を抑制することによってタンパク質発現を低減するマイクロRNAの下方制御の量を減らすことに関する。マイクロRNAレベルは、マイクロRNA、マイクロRNAミミック、又はマイクロRNAインヒビターを細胞に導入することによって、増やされたり減らされたりする。マイクロRNAミミックは、マイクロRNAと同じ機能を有するが、タンパク質発現を変える上で、より安定していてより効率的である。例によっては、エレクトロポレーションを用いて、特定のマイクロRNAを発現する命令を伝える細胞にエピソーマルベクターを導入する。代わりに、あるいはこれと組み合わせて、特定のマイクロRNAを発現するエピソーマル命令を伝える媒体としてアデノ随伴ウイルスを用いる。ターゲットとしたマイクロRNAの下方制御の量の低減は、ターゲットとしたマイクロRNAのインヒビターをトランスフェクションで細胞に導入することによって達成される。ここで、本発明の開示による、タンパク質発現/バイオマス産出量を増大する方法は、細胞のゲノムを変えずに実施されることに注意する。
【0037】
図２には、細胞株のタンパク質発現を転写後に高める方法が、概略的に描写されている。一つ以上の上方制御マイクロRNA(miRNA)を増大させて、mRNA翻訳と選択されたタンパク質のタンパク質生産を増やす。代わりに、又はこれと組み合わせて、一つ以上の下方制御miRNAをインヒビター(anti-miRNA)でブロックしてmRNA翻訳と選択されたタンパク質のタンパク質生産を増やしても良い。
【0038】
魚の浮き袋は、主には、線維芽細胞とコラーゲンタンパク質を含んでいる。コラーゲンタイプ1（コラーゲンI）が、魚の浮き袋において主要なタンパク質であり、培養された魚の浮き袋細胞においてコラーゲンIの発現を増大させると、バイオマス産出量が増える。魚の浮き袋細胞におけるコラーゲンIには、コラーゲン、タイプ１、アルファ１（COL1A1）とコラーゲン、タイプ１、アルファ２（COL1A2）とが含まれている。miR-21のレベルが増大すると魚の浮き袋細胞におけるCOL1A1とCOL1A2の生産が増えると言うように、COL1A1とCOL1A2の発現は、上方制御マイクロRNA 21 (miR-21) によって増やされる。加えて、miR-29aのレベルを低下させるかmiR-29aの作用をブロックするかすると、魚の浮き袋細胞におけるCOL1A1とCOL1A2の生産が増えると言うように、COL1A1とCOL1A2の発現は、下方制御マイクロRNA 29a (miR-29a) によって減らされる。図３及び図４には、miR-21のレベルを上げることによる、及び、インヒビター(anti-miR 29a)を用いてmiR-29aの作用をブロックすることによる、COL1A1（図３）とCOL1A2（図４）の生産の増加が示されている。COL1A1とCOL1A2の生産が増えた結果、結果として得られる食肉製品におけるバイオマス産出高が増える。同様の戦略を適用して、他の種類の動物細胞においても関係するタンパク質のレベルが上げられる。
【0039】
図５には、分離した細胞の培養に用いるのに適例のバイオリアクター30が示されている。バイオリアクター30における無菌室36に保持されている食品グレードの骨組34に備えられる固相サポート32に、細胞が付着して成長する。骨組34は、食肉製品の形を規定する。食品グレードの骨組34は、アガロース、アルジネート、キトサン、菌糸体、及びコンニャクグルコマンナンと言った植物ベース又は菌類ベースの材料で作られる。ただし、材料が、それらに限定される訳では無い。細胞が、固相サポート32の内側表面に付着して成長するように、サポート32は多孔質である。細胞に栄養素を供給する培養基が、導入口38からバイオリアクター30へと導入され、排出口40からバイオリアクター30の外に取り出される。
【0040】
図６には、図５のバイオリアクター30に類似するが、細かいメッシュ54で固相サポート32から分離される第二の固相52を更に含むバイオリアクター50が示されている。第二の固相52は、本来の位置である固相サポート32上で成長する細胞に、栄養素、成長因子、及びサイトカインを分泌する、生体工学的に作り出された細胞を包含するかサポートし、固相サポート32上の細胞から生体工学的に作り出された細胞を物理的に分離している。第二の固相52は、固相サポート32に類似する植物ベースの材料から作られる。メッシュ54は、栄養素、成長因子、及びサイトカインを透過させるが、細胞は透過させない。図６のバイオリアクター50は、生体工学的に作り出された細胞の、成長する細胞との同時培養を可能にする。例によっては、図５及び図６のバイオリアクター30及び50を縦に並べているものもある。他の例においては、プロセスの規模を拡大するために、バイオリアクター30が数台、バイオリアクター50が数台、又は、バイオリアクター30及び50が混合して、直列に並べられている。バイオリアクター30は、主に、バイオマス生産に用いられ、一方、バイオリアクター50は、成長する細胞に、栄養素、成長因子、及びサイトカインを提供するのに用いられる。
【0041】
図７において、典型的な細胞培養システム100は、細胞培養部102と、新鮮培地部104と、廃物除去部106とを備える。細胞培養部102は、ポンプ108a及び108bを通して新鮮培地部104と接続されており、第一の流体が、細胞培養部102から、ポンプ108aを通って新鮮培地部104へと流れ、かつ、その第一の流体が、新鮮培地部104から、ポンプ108bを通って細胞培養部102へと流れるようになっている。それによって、第一の流体が、細胞培養部102と新鮮培地部104との間で循環する。
【0042】
新鮮培地部104は、更に、ポンプ108c及び108dを通して廃物除去部106と接続されており、第二の流体が、新鮮培地部104から、ポンプ108cを通って廃物除去部106へと流れ、かつ、その第二の流体が、廃物除去部106から、ポンプ108dを通って新鮮培地部104へと流れるようになっている。それによって、第二の流体が、新鮮培地部104と廃物除去部106との間で循環する。第一の流体は、FBS、成長因子、又はサイトカインを補った基礎培地を含む細胞培養基であっても良い。成長因子又はサイトカインには、インシュリン成長因子1(IGF-1)、インシュリン、インターロイキン6 (IL-6)、インターロイキン6 受容体(IL-6R)、インターロイキン11 (IL-11)、線維芽細胞(FGF)、表皮成長因子(EGF)、及びトランスフェリンが、含まれても良いが、それらに限定される訳ではない。第二の流体は、新鮮基礎培地であって良く、それには、無機塩（例えば、塩化カルシウム(CaCl2)、塩化カリウム(KCl)、塩化ナトリウム(NaCl)、重炭酸ナトリウム(NaHCO3)、リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)、硫酸マグネシウム(MgSO4)、等々）、アミノ酸、ビタミン（例えば、チアミン、リボフラビン、葉酸、等々）と言った成分、及びグルコース、β-メルカプトエタノール、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)及びピルビン酸ナトリウムと言ったその他の成分を含有する緩衝溶液が含まれていても良い。ただし、成分が、それらに限定される訳では無い。限定されない成長培地には、例として、ライボビッツL-15培地、イーグル最小必須培地(MEM)、培地199、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ハムF12培地、ハムF10培地、マッコイ5A培地、グラスゴー改変イーグル培地(GMEM)、イスコヴ改変ダルベッコ培地、及びRPMI 1640が含まれが、それらに限定される訳ではない。
【0043】
ポンプ108は、ぜん動ポンプか、類似するその他の適切なポンプであって良い。
【0044】
細胞培養システム100には、一つ以上の容器が含まれる。細胞培養部102、新鮮培地部104、及び廃物除去部106は、各々、容器であって良い。例によっては、細胞培養システム100には、細胞培養部102、新鮮培地部104、及び廃物除去部106が、二つ以上含まれていても良い。複数の細胞培養部102は、並列又は直列に接続され、互いに近接して配置される。複数の新鮮培地部104は、並列又は直列に接続され、互いに近接して配置される。複数の廃物除去部106は、並列又は直列に接続され、互いに近接して配置される。
【0045】
例によっては、細胞培養システム100が、細胞培養部102の細胞にガスを供給するよう構成されるガス源を更に含むものがあっても良い。ガス源は、酸素か二酸化炭素である。
【0046】
細胞培養部102は、骨組み及び培養基を保持し、細胞が、固体又は半固体構造体へと成長するように構成される。例によっては、細胞が、細胞培養部102の内部の、食品グレードの生体適合骨組に付着/固着することによって、魚臓器のような動物臓器を模した固体又は半固体構造体へと成長するものもある。細胞培養部102は、少なくとも一種類の細胞を含有するように構成されて良い。適切な種類の細胞には、骨、軟骨、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺臓、及びそれらの任意の組合せが含まれるが、それらに限定される訳ではない。本発明内で、他の種類の、哺乳動物細胞、又は魚細胞を使用しても良い。他の植物種及び動物種の細胞も使用することができる。その他の開始細胞は、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、及び衛星細胞といった様々な起源の幹細胞であっても良い。開始細胞はまた、遺伝子組換え細胞や、いずれかの細胞株であっても良い。生体工学的に作り出された細胞も同様に使って良い。
【0047】
細胞培養部102において拡大する、異なる種類の、特定化した細胞は、生きた動物の生検によって得られる。
【0048】
細胞培養部102には、ポンプ108bを通して新鮮培地部104から第一の流体を受け入れるよう構成されている導入口と、ポンプ108aを通して新鮮培地部104へと第一の流体を移す/放出するよう構成されている排出口とが、更に含まれていても良い。細胞培養部102には、細胞培養部102の内部を所定の温度に加熱するよう構成される加熱装置と、細胞培養部102内の温度をそのような所定の温度に維持する温度制御部とが、更に含まれていても良い。その所定の温度は、およそ25℃から45℃までの範囲とすることができる。
【0049】
細胞培地には、細胞培養部102内で第一の流体を所定の速度で撹拌するよう構成される撹拌器が少なくとも一台更に含まれていても良い。その所定の速度は、およそ1分当たり10回転(rpm)から300 rpmとすることができる。
【0050】
細胞培養部102には、酸素又は二酸化炭素のガス源に接続されるガス排出口とガス導入口とが更に含まれていても良い。酸素又は二酸化炭素は、細胞培養条件を最適化するためにガス導入口を通して細胞培養部102へと送り込まれる。廃棄されるガスは、ガス排出口を通して放出される。ガスの流れはバルブによって制御される。
【0051】
例によっては、細胞培養部102は、図５に示されるようなバイオリアクター30とすることができる。また、例によっては、細胞培養部102は、図６に示されるようなバイオリアクター50とすることができる。例によっては、細胞培養部102は、容器である。例によって、細胞培養部102は、どのようなサイズであっても良い。例によって、細胞培養部102の容積は、0.1Lから2000Lの範囲であって良い。
【0052】
図８において、新鮮培地部104は、ポンプ108a及びポンプ108bにそれぞれ接続するよう構成される第一流体導入口110及び第一流体排出口112を備える。加えて、新鮮培地部104は、ポンプ108d及びポンプ108cにそれぞれ接続するよう構成される第二流体導入口114及び第二流体排出口116を更に備える。加えて、新鮮培地部104は、第一の透析薄膜123で分離される第一流体コンパートメント120と第二流体コンパートメント122を有する第一の透析部118を少なくとも一台備える。第一流体導入口110と第一流体排出口112は、第一流体コンパートメント120に接続される。第二流体導入口114と第二流体排出口116は、第二流体コンパートメント122に接続される。セルロースエステル(CE)、再生セルロース(RC)、及びポリフッ化ビニリデン(PVDF)を含む、透析薄膜123は、異なる種類を用いても良い。分子量カットオフ(MWCO)が異なる透析薄膜123を用いて、第一流体中に望ましい巨大分子を保留したり（例えば、培養容器における細胞が分泌する成長因子）、第一の透析部118の第一流体から廃物が取り除かれるようにしたりしても良い。例えば、100Da - 1,000,000Da MWCO薄膜、好ましくは、500 Da MWCO薄膜を用いて、第一流体中に、インシュリン様成長因子（IGF、組換え型については7.5kDa）及び形質転換成長因子ベータ（TGFベータ、プロTGFベータについては44kDa）を保有しつつ、乳酸(89 Da)とアンモニア(17 Da)が第一流体から除去できるようにしても良い。また、その様な薄膜を使うことで、グルコース(180 Da)の様な第二流体の栄養素が、薄膜を通り抜けて第一流体に補充されるようにしても良い。
【0053】
新鮮培地部104は、透析部内において流体を所定の速度で撹拌するよう構成される撹拌器を少なくとも一台、コンパートメントの一方または双方に備えていても良い。その所定の速度は、およそ1分当たり10 rpmから500 rpmとすることができる。
【0054】
新鮮培地部104は、望ましい流体への栄養素の追加や補充、そこからの廃物の除去を行うために、コンパートメントの一方または双方に接続される分離した導入口及び排出口を更に含んでも良い。その望ましい流体は、細胞培養基、新鮮基礎培地、及び/又は分化培地であって良い。
【0055】
図９において、廃物除去部106は、ポンプ108c及びポンプ108dにそれぞれ接続するよう構成される廃物導入口124及び補給排出口126を備える。加えて、廃物除去部106は、廃物除去導入口128及び廃物除去排出口130を更に備える。加えて、廃物除去部106は、第二の透析薄膜137で分離される廃物コンパートメント134と廃物除去コンパートメント136を有する第二の透析部132を少なくとも一台備える。廃物導入口124と新線培地排出口116は、廃物コンパートメント134に接続される。廃物除去導入口128と廃物排出口130は、廃物除去コンパートメント136に接続される。廃物除去部106は、第二流体から廃物を除去する他の廃物除去技法を用いても良い。例えば、吸着剤としてのゼオライトに第二流体を通すことによって、廃物除去を行っても良い。ゼオライトは、微小孔性アルミノ珪酸鉱物である。例となるのは、方沸石、菱沸石、斜プチロル沸石、輝沸石、ソーダ沸石、フィリプス沸石、及び束沸石である。廃物除去部106には、柱状の充填層ゼオライトが含まれていても良い。第二流体が、一端から廃物除去部106に流れ込み、ゼオライトを通って、別の一端から廃物除去部106を抜け出る。ゼオライトは、毒性の薬品、又は、第二流体において細胞の成長を阻害する薬品、例えば、アンモニアや乳酸を吸収する。
【0056】
廃物除去部106は、アンモニアや乳酸の様な、第二流体における代謝廃物を取り除き、グルコースの様な、消耗培地における栄養素を最大量保留できるよう構成されている。100Da - 1,000,000 Da MWCO、好ましくは、100 Da MWCOの透析薄膜を用いて、アンモニアや乳酸を、透析液に入り込ませ、グルコースを第二流体に保留しておけるようにしても良い。透析液は、廃物除去コンパートメント136に入り込むが、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、又はその他の可能な緩衝液であり得る。
【0057】
例によっては、細胞培養部102、新鮮培地部104、及び廃物除去部106は、各々、取り外し可能なプラグインモジュールであっても良い。前述の各部の導入口と排出口の各々は、細胞培養システム100の各ポンプの導入口や排出口と接続、及び/又は切断しても良い。例えば、新鮮培地部104、又は廃物除去部106は、それをシステムのプラグから抜き取って、新しいユニットを細胞培養システム100のプラグに差し込むことで、迅速に取り替えても良い。本発明の例では、ユニットの一つが誤動作しても停止時間を低減し得る。更に、ユニットの各々を細胞培養システム100のプラグから抜き取っても、それ自体で作動し、独立して使用できる。
【0058】
ここで、細胞培地を育てるために細胞培養システム100を使用する方法を説明する。ここに記述される方法は、培養食肉を生産するために、皮膚、筋肉、脂肪、及び骨細胞のような細胞を培養するのに用いられる。その方法に含まれるのは、細胞培養システム100を準備し、代謝廃物、又は成長インヒビターを備える培養基を新鮮培地部104の第一の透析部118へと移し、新鮮培地部104の第一の透析部118において、栄養を補充し、かつ成長インヒビターを除去し、代謝廃物、又は成長インヒビターを備える基礎培地を新鮮培地部104の第一の透析部118から廃物除去部106へと移し、廃物除去部106において成長インヒビターを除去するステップである。
【0059】
細胞培養部102には、少なくとも一種類の細胞が加えられる。適切な種類の細胞には、骨、軟骨、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺臓、及びそれらの任意の組合せが含まれるが、それらに限定される訳ではない。本発明内で、他の種類の、哺乳動物細胞、又は魚細胞を使用しても良い。他の植物種及び動物種の細胞も使用することができる。
【0060】
培養容器において拡大する、異なる種類の、特定化した細胞は、生きた動物の生検によって得られる。その他の開始細胞は、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、及び衛星細胞といった様々な起源の幹細胞であっても良い。開始細胞はまた、遺伝子組換え細胞や、いずれかの細胞株であっても良い。
【0061】
細胞培養部102のような無菌室又は無菌容器において、食品グレードの生体適合骨組に付着/固着することによって、細胞が、魚臓器のような動物臓器を模した固体又は半固体構造体へと成長する。細胞培養部102の温度は制御され、培養基が、細胞培養部102へと、その導入口にて導入され、化学薬品、栄養素、及び細胞のような物質を除去するために細胞培養部102排出口から放出される。食品グレードの生体適合骨組は、最終可食製品の一部となる。
【0062】
牛胎児血清(FBS)サプリメント、又は組換え源から得られる成長因子及びサイトカインが、バイオリアクターの培養基に導入されて、細胞の成長と増殖をサポートする。成長因子及びサイトカインには、インシュリン成長因子1(IGF-1)、インシュリン、インターロイキン6 (IL-6)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、インターロイキン11 (IL-11)、線維芽細胞成長因子(FGF)、表皮成長因子(EGF)、及びトランスフェリンが含まれるが、それらに限定される訳ではない。その用途は、FBSが無い細胞培養部102において培養された細胞と、生体工学的に作り出された細胞を同時培養することに関係しても良い。生体工学的に作り出された細胞は、前記成長因子とサイトカインを分泌するように作り出されており、これらの生体分子を、培養された細胞に、成長と増殖に必要なだけ供給する。本発明の開示の同時培養方法によると、培養基において、動物由来である牛胎児血清(FBS)が必要で無くなる。更には、その同時培養方法によって、食品グレードの、特定の成長因子とサイトカインが、成長する分離された細胞に本来の位置で継続的に供給され、製造プロセスが簡素化され、その費用が低減される。しかしながら、他の例においては、細胞の成長をサポートするために、FBS、他の血清、又は組換え源から得られるタンパク質を用いて、成長因子、サイトカイン、及びその他の栄養素を供給しても良い。
【0063】
例によっては、細胞培養条件を最適化するためにガスを導入しても良い。酸素か二酸化炭素が用いられる。細胞培養部102には、0-10%の二酸化炭素が含有される。細胞培養部102には、15-30%の酸素が含有される。
【0064】
例によっては、細胞培養条件を最適化するために温度が制御されても良い。細胞の種類が異なると、最適培養温度も異なる。温度は、25℃から45℃の範囲であって良い。
【0065】
例によっては、細胞培養部102の培養基が撹拌される。裁断ストレスに対する細胞の反応は異なるということが知られているので、培養容器の撹拌速度を最適化して、細胞の拡大を増進しても良い。撹拌速度を最適化するのは、流入する培養基と細胞培養部102内の培養基との混合を増進するためであっても良い。撹拌速度は、10 rpmから300 rpmの範囲であって良い。
【0066】
ポンプ108aによって、培養基は、細胞培養部102から、新鮮培地部104の第一の透析部118まで移されて良い。
【0067】
第一の透析部118において、CE、RC、又はPVDFを含む、種類の異なる透析薄膜を用いても良い。分子量カットオフ(MWCO)が異なる透析薄膜を用いて、培養基に望ましい巨大分子を保留したり（例えば、培養容器における細胞が分泌する成長因子）、第一の透析部118の培養基から廃物が除去されるようにしたりしても良い。例えば、100Da - 1,000,000Da MWCO薄膜、好ましくは、500 Da MWCO薄膜を用いて、培養基に、インシュリン様成長因子（IGF、組換え型については7.5kDa）及び形質転換成長因子ベータ（TGFベータ、プロTGFベータについては44kDa）を保有しつつ、乳酸(89 Da)とアンモニア(17 Da)が培養基から除去できるようにしても良い。また、その様な薄膜を使うことで、グルコース(180 Da)の様な新鮮基礎培地の栄養素が、薄膜を通り抜けて培養基に補充されるようにしても良い。
【0068】
透析が行われるよう、新鮮基礎培地で第二流体コンパートメント122が満たされており、一方、培養基で第一流体コンパートメント120が満たされている。例えば、乳酸、アンモニア、及びその他の廃物は、培養基から第一の透析薄膜123を通って新鮮基礎培地へと移され、グルコース及びその他の成長を増進する成分は、新鮮基礎培地から第一の透析薄膜123を通って培養基へと移される。新鮮基礎培地の容量、透析薄膜内に入れられる培養基の容量、薄膜面積、温度、及び透析部での撹拌による揺動を変えることによって、透析の速度が制御できる。また、細胞培養部102から、第一の透析部118の第一流体コンパートメント120へと流体を流入させるポンプ汲み出し速度を1 ml/分から10 L/分までの範囲で変えることによって、透析部における培養基の栄養補給と廃物除去の速度を制御しても良い。
【0069】
代謝廃物、又は成長インヒビターは、培養基から第一の透析部118内の新鮮基礎培地へと移動する。成長インヒビターは、時間が経つにつれて新鮮基礎培地に蓄積していく。成長インヒビター（乳酸、アンモニアを含むが、それらに限定される訳ではない）が蓄積した基礎培地は、ここでは、廃物培地と称する。廃物培地は、ポンプ108cによって廃物除去部106へと移される。廃物培地のアンモニアや乳酸と言った代謝廃物は、廃物除去部106の第二の透析部132で透析の原理を用いて除去される。廃物除去方法によると、グルコースの様な栄養素を最大量、廃物培地に保留できるべきである。100 Da － 1,000,000 Da WMCO薄膜、好ましくは、100 Da WMCO薄膜の透析薄膜を用いて、グルコースを廃物培地に保持したまま、アンモニア及び乳酸が透析液に入り込めるようにしても良い。透析液は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、又はその他の可能な緩衝液であり得る。透析液の容量、透析薄膜137内に入れられる廃物培地の容量、薄膜面積、温度、及び透析部132での撹拌による揺動を変えることによって、透析の速度が制御できる。撹拌速度は、10 rpmから500 rpmの範囲であって良い。また、新鮮培地部104の第一の透析部118から、廃物除去部106へと流体を流入させるポンプ汲み出し速度を変えることによって、廃物除去部106における廃物除去の速度を制御しても良い。透析によって綺麗になった廃物培地は、新鮮培地部104の第一の透析部118へと戻され得る。ポンプ汲み出し速度は、1 ml/分から10 L/分までの範囲であって良い。
【0070】
新鮮基礎培地部104及び廃物培地部106から培地を分離することによって、生産の間中、細胞培養部102をしっかりと閉ざしておくことができる。いずれかのユニットに汚染があっても、影響のあったユニットに閉じ込められ、他のユニットには影響しない。
【0071】
更には、廃物除去部106は、第二流体から代謝廃物を抽出することによって、細胞培養システム100全体から、その様な廃物を、集中させ、抽出し、及び/又は収集するのに役立つ。そして、細胞培養システム100全体の廃物は、簡単に収集して、排出できる。それによって、排出される廃物と、細胞培養全体の運営費が、従来の細胞培養技法と比べて低減する。背景技術の欄で説明した通り、従来の細胞培養技法では、栄養素と廃物の双方を含有する使用済みの培養基を廃棄して、それを新しい培養基と取り換える。従って、従来の方法において生じる廃物の量/容量（すなわち、使用済みの培養基）は、本発明において生じる廃物の量/容量よりも多い。
【0072】
また、新鮮培地部104と廃物除去部106は、運営費を下げ、細胞培地を育てるための培地の使用を最適化するのに役立つ。細胞培養基は、高価なFBS、成長因子、又はサイトカインを含有しているので、一般に、細胞培養基は、基礎培地よりも高価である。新鮮培地部104の助けもあって、細胞培養基は、早々に廃棄する必要もなく、回復される（すなわち、その廃物を除去して基礎培地から栄養を得る）ことが可能である。
【0073】
皮膚、骨、軟骨、心臓、及び肝臓が含まれるが、それらに限定される訳ではない、異なる種類の細胞を、適切な骨組みで培養して、細胞培養部102において組織を工学的に作り出すことができる。また、間葉幹細胞、人工多能性幹細胞、及び衛星細胞といった様々な起源の幹細胞を適切な骨組みで培養して、工学的な組織の作り出しに応用できる。骨組みにおける幹細胞の拡大の後、続いて分化が起きるように、分化培地の成分を、第一の透析部118、又は第二の透析部132の基礎培地に加えて、工学的に機能組織を形成することができる。例えば、デキサメタゾン、アスコルビン酸、及びβ-グリセロリン酸と言った骨誘導培地成分を、骨組みにおける幹細胞の骨分化のための基礎培地に加えることができる。骨誘導培地の成分が培養基に入り込めるようにするには、100 Da から 1,000,000 Da WMCOの範囲にある、好ましくは、500 Da WMCOの、第一の透析薄膜123を選択すべきである。
【0074】
あるいは、幹細胞は、細胞培養部102において2D培養表面上で拡大できる。幹細胞を拡大し、トリプシン処理して、再生医療用途のための高密度細胞懸濁液を得ることができる。例えば、ヒト間葉幹細胞は、患者から分離して、細胞培養部102の培養皿で拡大できる。コンフルーエンスすると、細胞をトリプシン処理して高密度細胞懸濁液を形成する。そして、細胞懸濁液を、治療のために患者の損傷部位に注入する。
【0075】
例１
【0076】
HEK293細胞の培地をPBSで洗ってトリプシン処理し、細胞密度が2.5 e6個/mlの細胞懸濁液を形成する。2.5 e6個/mlの懸濁液から、細胞懸濁液を200μl取り、予め正方形(1 cm×1 cm)に切ったコラーゲンをベースとする骨組みに載せて、合計細胞数5 e5個の組織構築物を作った。組織構築物を37℃、5% CO2で4時間培養した。各ウェルの横に、培地を800μl静かに加えた。そして、組織構築物を、細胞培養部102のバイオリアクター、及び対照用の6ウェル培養プレートへと移した。デイ0、デイ4、及びデイ11に、骨組み内の細胞の画像を明視野顕微鏡で撮影した。デイ0、デイ4、及びデイ11に、以下のプロトコールに従って、LIVE/DEAD染色を行った。デイ0、デイ4、及びデイ11に、組織培養ビン、対照、及び透析部から培地を収集してグルコースを測定した。
【0077】
骨組みにおける細胞のLIVE/DEAD染色
【0078】
1. カルセインAMとエチジウムホモ二量体-1（サーモフィッシャーのLIVE/DEADキット）を1:1000でDPBSに加えて、染色試薬を得た。
【0079】
2. サンプルを一度DPBSで洗浄した。
【0080】
3. サンプルを200 - 250μlの染色試薬で30分間染色した。
【0081】
4. サンプルを一度DPBSで洗浄して、蛍光顕微鏡で観察した。
【0082】
結果
【0083】
観察可能な微細組織が、バイオリアクターには形成されたが、対照においては形成されなかった。
【0084】
図10A-10Cには、バイオリアクターのプロトタイプ及び対照における、組織構築物の成長と細胞生存度が示されている。バイオリアクターの列には、稼働する細胞培養システムのプロトタイプにおいて培養された細胞が示されている。対照の列には、６ウェルプレートにおいて培養された細胞が示されている。デイ0で、図10Aに示される様に細胞が集合する骨組みに細胞が付着した。デイ4で、図10Bに示される様に、細胞の集合体が、バイオリアクターにおいてより大きな長球へと成長した。デイ11で、図10Cに示される様に、長球が凝集して、バイオリアクターにおいては微細組織を形成する一方で、対照における長球は、明白には成長をしていない様に見えた。LIVE/DEAD染色により、バイオリアクターにおける微細組織は、生存力のある長球を結び付けることで形成されることが示されたが、それらは、対照においてのものよりずっと大きかった。
【0085】
図11には、デイ11に形成された微細組織が示されている。バイオリアクターにおいて、観察可能な微細組織の集団が骨組みに形成されたが、これらの微細組織は対照においては観察されなかった。骨組みを消化するトリプシン処理の後、微細細胞が放出されたが、バイオリアクターの微細組織が、対照においてのものよりずっと高い容量を有していたのは注目すべきである。
【0086】
図12には、バイオリアクターの細胞培養部102の培養容器において、グルコースのレベルが維持されたことが示されている。
【0087】
デイ0での、本発明の培養容器の細胞培養部102におけるグルコース濃度 = 18.8 mmol/L。対照培地プレートにおけるグルコース濃度 = 18.7 mmol/L。第一の透析部118におけるグルコース濃度 = 20.9 mmol/L。
【0088】
デイ4での、本発明の培養容器の細胞培養部102におけるグルコース濃度 = 19.1 mmol/L。対照培地プレートにおけるグルコース濃度 = 4.9 mmol/L。第一の透析部118におけるグルコース濃度 = 20.0 mmol/L。
【0089】
デイ11での、本発明の培養容器の細胞培養部102におけるグルコース濃度 = 10.4 mmol/L。対照培地プレートにおけるグルコース濃度 = 検出不可。第一の透析部118におけるグルコース濃度 = 12.5 mmol/L。
【0090】
上述の通り、また、本発明によると、グルコースの様な栄養素は最適なレベルに保たれ、細胞の生育力や細胞の成長にとって最適なように、アンモニアや乳酸の様な成長インヒビターは低いレベルに保たれる。
【0091】
加えて、本発明によると、細胞が分泌する成長因子を保持し、培養基においての動物由来の血清の使用を低減することによって、細胞拡大プロセスが増進され、培養食肉産業及び組織工学の生産費が低減される。本発明は、大規模食肉生産に用いることができる。
【0092】
本発明の開示の生体外食肉生産方法によると、細胞が一種類の単純組織有機体を備える食肉製品が提供される。細胞が一種類の食肉製品は、複数種類の細胞を有する他の培養食肉に比べて、製造し、開発し、商品化するのが容易である。本発明の開示の他の例では、複数種類の細胞を有する食肉製品が提供される。更には、出願人は、成長している細胞におけるマイクロRNAレベル又は活性を変えることによって、バイオマス/タンパク質生産を増やす戦略を発見している。一つの例においては、魚の浮き袋の細胞に見られる主要なタンパク質（コラーゲンI）のレベルを高めるために、鍵となる二つのマイクロRNA（miR-21及びmiR-29a）をターゲットとしている。出願人が知る限りでは、培養食肉製品のタンパク質/バイオマス産出高の増大を達成するために、マイクロRNAレベル又は活性を変えることは、培養食肉開発の分野において他の人が使ったことのないものである。タンパク質の生産を増大させるためにマイクロRNAをターゲットとすることによって、既知のノックイン又はノックアウト方法よりも細胞へのストレスが引き起こされなくなる。生体工学的に作り出された細胞は、成長する動物細胞と同時培養され、成長する魚細胞に、本来の位置での細胞成長と増殖のための食品グレードの成長因子とサイトカインを供給し、培養基における動物由来のFBSの必要性を低減又は削除する。同時培養技法によって、生産プロセスが簡素化され、生産費用が低減される。
【0093】
更には、培養された食肉製品の栄養素をカスタマイズして、より健康的な食料製品を生成しても良い。例えば、培養された食肉製品を、栄養士からのダイエット勧告又は当人のゲノム試験に従ってカスタマイズしても良い。食肉製品における、高密度コレステロール、多価不飽和脂肪酸、及び一不飽和脂肪酸と言った健康的な栄養素を、細胞を特定の条件で培養することによって濃縮しても良い。代わりに、又はこれとの組み合わせにおいて、低密度コレステロールや飽和脂肪酸と言った健康を損なうことが知られている栄養素を、細胞を特定の条件で培養することによって低減しても良い。ビタミンやミネラルと言った微量栄養素もまた、強化されても良い。培養された食肉製品の栄養素のカスタマイズは、1) 細胞培養の間に成長する細胞に与えられる栄養素を調整する、及び/又は、2) 積層する骨組の、異なる細胞との比率を制御すると言った様々なやり方で達成される。ただし、そのやり方は、それらに限定されるものではない。
【0094】
培養食料製品は、清潔、無菌かつ高度に制御されたプロセスの元で生産される。そうして、食料製品における栄養素の、細菌や菌類と言った微生物による望ましくない劣化を最小限のものとする。微生物が栄養素を分解することによる望ましくない風味や臭いもまた最小限のものとされる。この特性によって、培養食品の、料理での新しい使い方が可能となり、新しいレシピを作り出すのに役立つ。培養食品を、そのように適用した一例が、魚の浮き袋から得られる魚の培養食道である。伝統的な魚の食道には、生産プロセスにおいて細菌がアミンを分解するために、望ましくない魚臭い風味と匂いがある。この望ましくない特性のために、食品の材料としては、熱いか温かいまま出されて風味のある料理に限定されることもある。細胞培養技法で生産される魚の培養食道は、望ましくない魚臭さや匂いがない。熱くて風味のある料理に加え、魚の培養食道は、デザートとして、あるいは、冷やして又は環境温度で直ぐに食べられる形で出される甘い料理にも用いることができる。
【0095】
代表的なプロトコール
A. 魚の浮き袋の細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なニベ、スズキ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から浮き袋を取り出す。
5. その臓器を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その臓器を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、臓器を小さな片(2-3 mm3)に切る。
8. 切った臓器を、PBS中に0.25%トリプシンEDTAを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞をT25フラスコ中に接種する。
14. 24-28℃で培養する。
15. 翌日、組織培養フラスコに付着していない細胞を取り除く。
16. 2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
17. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
A. 魚の浮き袋の細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なニベ、スズキ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から浮き袋を取り出す。
5. その臓器を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その臓器を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、臓器を小さな片(2-3 mm3)に切る。
8. 切った臓器を、PBS中に0.25%トリプシンEDTAを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞をT25フラスコ中に接種する。
14. 24-28℃で培養する。
15. 翌日、組織培養フラスコに付着していない細胞を取り除く。
16. 2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
17. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
【0096】
B. 組織外植による魚の浮き袋の細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なニベ、スズキ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から浮き袋を取り出す。
5. その臓器を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その臓器を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、臓器を小さな片(1-2 mm3)に切る。
8. 個々に、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）が入っている24ウェルプレートに、臓器片を載せる。
9. 24-28℃で培養する。
10. 組織外植をかき乱さずに、2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
11. 付着した細胞が観察されるまで組織外植を培養する。
12. 組織外植を取り出す。
13. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
1. 地元の魚市場で、健康なニベ、スズキ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から浮き袋を取り出す。
5. その臓器を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その臓器を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、臓器を小さな片(1-2 mm3)に切る。
8. 個々に、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）が入っている24ウェルプレートに、臓器片を載せる。
9. 24-28℃で培養する。
10. 組織外植をかき乱さずに、2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
11. 付着した細胞が観察されるまで組織外植を培養する。
12. 組織外植を取り出す。
13. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
【0097】
C. 魚の筋肉細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、組織を小さな片(2-3 mm3)に切る。
8. 切った組織を、PBS中にコラゲナーゼとディスパーゼを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞をT25フラスコ中に接種する。
14. 24-28℃で培養する。
15. 翌日、組織培養フラスコに付着していない細胞を取り除く。
16. 2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
17. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、組織を小さな片(2-3 mm3)に切る。
8. 切った組織を、PBS中にコラゲナーゼとディスパーゼを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞をT25フラスコ中に接種する。
14. 24-28℃で培養する。
15. 翌日、組織培養フラスコに付着していない細胞を取り除く。
16. 2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
17. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
【0098】
D. 組織外植からの魚の筋肉細胞株の発育
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、筋肉を小さな片(1-2 mm3)に切る。
8. 個々に、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）が入っている24ウェルプレートに、筋肉片を載せる。
9. 24-28℃で培養する。
10. 組織外植をかき乱さずに、2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
11. 付着した細胞が観察されるまで組織外植を培養する。
12. 組織外植を取り出す。
13. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、筋肉を小さな片(1-2 mm3)に切る。
8. 個々に、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10% を含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）が入っている24ウェルプレートに、筋肉片を載せる。
9. 24-28℃で培養する。
10. 組織外植をかき乱さずに、2-3日おきに培地の半分を新鮮な培地と取り替える。
11. 付着した細胞が観察されるまで組織外植を培養する。
12. 組織外植を取り出す。
13. 完全な単層が形成されると細胞が定着したと考えられ、定着した細胞は、二次培養の準備ができている。
【0099】
E. 成体幹細胞の分離と培養
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は６ヶ月かそれより若い同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、組織を小さな片(2-3 mm3)に切る。
8. 切った組織を、PBS中にコラゲナーゼとディスパーゼを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%、塩基性線維芽細胞成長因子100 ng/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞を、被覆のない平板上で1時間、24-28℃で培養する。
14. 上澄みを採取して、ラミニン、ゼラチン、マトリゲル又は類似する素地で被覆された平板上に載せる。
15. 24-28℃で培養する。
16. 24時間後に、しっかりと付着していない細胞を洗い落とす。
17. 培地を毎日、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%、塩基性線維芽細胞成長因子100 ng/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）と取り替える。
1. 地元の魚市場で、健康なハタ、タラ、シタビラメ、オヒョウ、カレイ又は６ヶ月かそれより若い同じ部類の魚を得る。
2. 細胞を分離するまでその魚を氷で冷やしておく。
3. その魚を10％の漂白剤に浸す。
4. 防腐処置を施した状態でその魚から筋肉を取り出す。
5. その組織を次亜塩素酸で一回以上洗浄する。
6. その組織を抗生物質培地（ペニシリン400 IU/ml、ストレプトマイシン400 pg/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で一回以上洗浄する。
7. 洗浄後、組織を小さな片(2-3 mm3)に切る。
8. 切った組織を、PBS中にコラゲナーゼとディスパーゼを含む遠心分離管に移す。
9. 1時間継続的に揺動させて室温で培養する。
10. 100 pmメッシュで上澄みを濾過して未消化の組織を取り除く。
11. 濾液を200 g、5分間、遠心分離機にかける。
12. 細胞ペレットを完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%、塩基性線維芽細胞成長因子100 ng/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）で再懸濁する。
13. 細胞を、被覆のない平板上で1時間、24-28℃で培養する。
14. 上澄みを採取して、ラミニン、ゼラチン、マトリゲル又は類似する素地で被覆された平板上に載せる。
15. 24-28℃で培養する。
16. 24時間後に、しっかりと付着していない細胞を洗い落とす。
17. 培地を毎日、完全培地（ペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%、塩基性線維芽細胞成長因子100 ng/mlを含むライボビッツL-15又はDMEM又はEMEM）と取り替える。
【0100】
F. iPSCの生成と培養
1. トランスフェクションの2-4日前、組織培養フラスコ中の完全培地（10%FBSを含むL15）で細胞を培養する。トランスフェクションの当日（デイ0）、細胞は、およそ75-90%コンフルエントである。
2. ゼラチンで被覆された6ウェルプレートから培地を吸い出して、ウェル毎に2mLの新鮮な完全培地と置き換える。被覆されたプレートを使う用意が整うまで37℃に置く。
3. Epi5（登録商標）ベクターを37℃で解凍し、使う用意が整うまでそれらを濡れた氷上に置く。使用前、解凍したベクターを軽く遠心分離機にかけて、それらを管の底に集める。
4. PBSで細胞を洗う。
5. 細胞が入っている培養フラスコに0.05%のトリプシン/EDTAを3 mL加える。
6. 室温で3分間フラスコを培養する。
7. 各フラスコに完全培地を5-8 mL加える。細胞を、空で無菌の15 mL 円錐管に注意深く移す。
8. トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
9. 細胞を200g、2分間、遠心分離機にかける。
10. 上澄みの大半を注意深く吸い出して、完全培地で再懸濁する。
11. 細胞を、ゼラチンで被覆された深皿プレート上に接種して、2 mL完全培地において30-60%コンフルエンスで６ウェルプレートにウェル当たり50,000から100,000細胞とし、24-28℃で一晩培養する。
12. Opti-MEM/Reduced-Serum Mediumを予め室温まで温めて、以下に記述する通り管A及び管Bを準備する。
13. 二つのEpi5（登録商標）Reprogramming Vector mixを各々1.2μL（合計2.4μL）、管Aとラベルを貼られた1.5 mLマイクロ遠心分離管の中のOpti-MEM培地118μLに加える。P3000（登録商標）試薬を4.8μL加えて良く混ぜる。
14. Lipofectamine 3000試薬3.6μLを、管Bとラベルを貼られた1.5 mLマイクロ遠心分離管の中の予め温められたOpti-MEM培地121μLで希釈する。
15. トランスフェクションマスターミックスを準備するために、管Aの中身を管Bに加えて良く混ぜる。
16. トランスフェクションマスターミックスを室温で５分間培養する。
17. もう一度混ぜて、トランスフェクションマスターミックス250μL全部を各ウェルに加える。
18. 24-28℃で一晩培養する。
19. トランスフェクションの24時間後に、培地をプレートから吸い出す。N2B27培地（IX N-2サプリメント、IX B27サプリメント、bFGF 100 ng/mLを含むL15）2 mLを各ウェルに加える。
20. 使用済みの培地をN2B27培地2 mLと交換して、合計14日間毎日N2B27培地を変える。
21. デイ14に、使用済みのN2B27培地を吸い出して、それを完全培地と交換する。ウェル毎に2 mL、毎日の培地交換を再開する。
22. 細胞が変形したことを示す、細胞塊の出現について、顕微鏡で１日おきにプレートを観察する。トランスフェクション後15日から21日以内に、iPSCコロニーは、移植に適切なサイズまで成長する。
23. デイ21までにコロニーがはっきりして、更なる培養及び増殖のために摘み取ることができる。
1. トランスフェクションの2-4日前、組織培養フラスコ中の完全培地（10%FBSを含むL15）で細胞を培養する。トランスフェクションの当日（デイ0）、細胞は、およそ75-90%コンフルエントである。
2. ゼラチンで被覆された6ウェルプレートから培地を吸い出して、ウェル毎に2mLの新鮮な完全培地と置き換える。被覆されたプレートを使う用意が整うまで37℃に置く。
3. Epi5（登録商標）ベクターを37℃で解凍し、使う用意が整うまでそれらを濡れた氷上に置く。使用前、解凍したベクターを軽く遠心分離機にかけて、それらを管の底に集める。
4. PBSで細胞を洗う。
5. 細胞が入っている培養フラスコに0.05%のトリプシン/EDTAを3 mL加える。
6. 室温で3分間フラスコを培養する。
7. 各フラスコに完全培地を5-8 mL加える。細胞を、空で無菌の15 mL 円錐管に注意深く移す。
8. トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
9. 細胞を200g、2分間、遠心分離機にかける。
10. 上澄みの大半を注意深く吸い出して、完全培地で再懸濁する。
11. 細胞を、ゼラチンで被覆された深皿プレート上に接種して、2 mL完全培地において30-60%コンフルエンスで６ウェルプレートにウェル当たり50,000から100,000細胞とし、24-28℃で一晩培養する。
12. Opti-MEM/Reduced-Serum Mediumを予め室温まで温めて、以下に記述する通り管A及び管Bを準備する。
13. 二つのEpi5（登録商標）Reprogramming Vector mixを各々1.2μL（合計2.4μL）、管Aとラベルを貼られた1.5 mLマイクロ遠心分離管の中のOpti-MEM培地118μLに加える。P3000（登録商標）試薬を4.8μL加えて良く混ぜる。
14. Lipofectamine 3000試薬3.6μLを、管Bとラベルを貼られた1.5 mLマイクロ遠心分離管の中の予め温められたOpti-MEM培地121μLで希釈する。
15. トランスフェクションマスターミックスを準備するために、管Aの中身を管Bに加えて良く混ぜる。
16. トランスフェクションマスターミックスを室温で５分間培養する。
17. もう一度混ぜて、トランスフェクションマスターミックス250μL全部を各ウェルに加える。
18. 24-28℃で一晩培養する。
19. トランスフェクションの24時間後に、培地をプレートから吸い出す。N2B27培地（IX N-2サプリメント、IX B27サプリメント、bFGF 100 ng/mLを含むL15）2 mLを各ウェルに加える。
20. 使用済みの培地をN2B27培地2 mLと交換して、合計14日間毎日N2B27培地を変える。
21. デイ14に、使用済みのN2B27培地を吸い出して、それを完全培地と交換する。ウェル毎に2 mL、毎日の培地交換を再開する。
22. 細胞が変形したことを示す、細胞塊の出現について、顕微鏡で１日おきにプレートを観察する。トランスフェクション後15日から21日以内に、iPSCコロニーは、移植に適切なサイズまで成長する。
23. デイ21までにコロニーがはっきりして、更なる培養及び増殖のために摘み取ることができる。
【0101】
G. 細胞を二次培養する方法
1. 培養基を取り除いて廃棄する。
2. 細胞をPBSでゆすいでトリプシンインヒビターを含む血清の形跡を全て取り除く。
3. 0.25%トリプシンEDTA溶液を2-3 mLフラスコに加える。
4. 室温で1分間培養する。
5. 完全成長培地を5-8 mL加える。
6. 細胞をピペットで丁寧に吸い出す。
7. 適当な分量の細胞懸濁液を1 : 2から1 : 3という二次培養比で新しい培養フラスコに加える。
8. 24-28℃で培養する。
1. 培養基を取り除いて廃棄する。
2. 細胞をPBSでゆすいでトリプシンインヒビターを含む血清の形跡を全て取り除く。
3. 0.25%トリプシンEDTA溶液を2-3 mLフラスコに加える。
4. 室温で1分間培養する。
5. 完全成長培地を5-8 mL加える。
6. 細胞をピペットで丁寧に吸い出す。
7. 適当な分量の細胞懸濁液を1 : 2から1 : 3という二次培養比で新しい培養フラスコに加える。
8. 24-28℃で培養する。
【0102】
H. 懸濁培養液への適応
1. トリプシン処理によって問題の細胞にとって適切な頻度で単一層培地を継代培養する。
2. 継代培養を行う毎に、細胞単一層をPBSで洗い、0.25%トリプシンを上塗りする。
3. 室温で5分間培養する。
4. 完全培地で酵素を不活性化する。
5. 細胞懸濁液を採取して、トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
6. 細胞懸濁液を別の培地フラスコに接種する。
7. 懸濁した細胞の生存率が90%以上になるまで継代培養を繰り返す。
8. 撹拌又は振動フラスコにおいて50 mL完全培地で細胞密度が10万-50万/mlの懸濁培養液を定着させる。
9. 単一層培養にとって最適な温度、湿度及び雰囲気が同じ条件のもとCO2培養器において撹拌又は振動フラスコの懸濁培養液を培養する。
10. 2-3日毎に新鮮な培地で、細胞密度を10万-50万/mlに調整する。
11. トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
12. 健全な細胞の成長を促進する細胞密度で、複数の培養を並行して定着させる。
13. 培養の一部を用いて細胞密度を徐々に100万/mlまで高める。
14. 細胞密度を高めることで細胞が死滅してしまうなら、高密度の培養を破棄する。
15. ステップ12の細胞を用いて高密度適応を再開する。
16. 細胞が懸濁液において成長するよう適応するとき、3 Lのバイオリアクターへと規模を拡大する。
1. トリプシン処理によって問題の細胞にとって適切な頻度で単一層培地を継代培養する。
2. 継代培養を行う毎に、細胞単一層をPBSで洗い、0.25%トリプシンを上塗りする。
3. 室温で5分間培養する。
4. 完全培地で酵素を不活性化する。
5. 細胞懸濁液を採取して、トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
6. 細胞懸濁液を別の培地フラスコに接種する。
7. 懸濁した細胞の生存率が90%以上になるまで継代培養を繰り返す。
8. 撹拌又は振動フラスコにおいて50 mL完全培地で細胞密度が10万-50万/mlの懸濁培養液を定着させる。
9. 単一層培養にとって最適な温度、湿度及び雰囲気が同じ条件のもとCO2培養器において撹拌又は振動フラスコの懸濁培養液を培養する。
10. 2-3日毎に新鮮な培地で、細胞密度を10万-50万/mlに調整する。
11. トリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
12. 健全な細胞の成長を促進する細胞密度で、複数の培養を並行して定着させる。
13. 培養の一部を用いて細胞密度を徐々に100万/mlまで高める。
14. 細胞密度を高めることで細胞が死滅してしまうなら、高密度の培養を破棄する。
15. ステップ12の細胞を用いて高密度適応を再開する。
16. 細胞が懸濁液において成長するよう適応するとき、3 Lのバイオリアクターへと規模を拡大する。
【0103】
I. 血清を含まない培地（植物水解物）への適応
1. DMEM/F12完全培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、10% FBS）において細胞を培養する。
2. 血清を含まない培地（DEMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、20% 植物水解物、例えば、大豆、綿実、菜種、小麦、酵母又はそれらに相当する物）への適応
3. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地I（新鮮な完全培地40%、以前の継代培地からの条件培地40%、血清を含まない培地20%）と取り替える。
4. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
5. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ3を繰り返す。
6. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地II（新鮮な完全培地30%、ステップ1における細胞からの条件培地30%、血清を含まない培地40%）と取り替える。
7. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
8. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ6を繰り返す。
9. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地III（新鮮な完全培地20%、ステップ1における細胞からの条件培地20%、血清を含まない培地60%）と取り替える。
10. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
11. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ9を繰り返す。
12. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地IV（新鮮な完全培地10%、ステップ1における細胞からの条件培地10%、血清を含まない培地80%）と取り替える。
13. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
14. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ12を繰り返す。
15. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を、血清を含まない培地と取り替える。
16. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
17. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ15を繰り返す。
18. 血清を含まない培地の使用は、各ステップにおいて、より緩やかに増やすこと、すなわち、各ステップで20%以下の増加が可能である。
1. DMEM/F12完全培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、10% FBS）において細胞を培養する。
2. 血清を含まない培地（DEMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、20% 植物水解物、例えば、大豆、綿実、菜種、小麦、酵母又はそれらに相当する物）への適応
3. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地I（新鮮な完全培地40%、以前の継代培地からの条件培地40%、血清を含まない培地20%）と取り替える。
4. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
5. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ3を繰り返す。
6. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地II（新鮮な完全培地30%、ステップ1における細胞からの条件培地30%、血清を含まない培地40%）と取り替える。
7. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
8. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ6を繰り返す。
9. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地III（新鮮な完全培地20%、ステップ1における細胞からの条件培地20%、血清を含まない培地60%）と取り替える。
10. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
11. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ9を繰り返す。
12. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地IV（新鮮な完全培地10%、ステップ1における細胞からの条件培地10%、血清を含まない培地80%）と取り替える。
13. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
14. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ12を繰り返す。
15. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を、血清を含まない培地と取り替える。
16. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
17. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ15を繰り返す。
18. 血清を含まない培地の使用は、各ステップにおいて、より緩やかに増やすこと、すなわち、各ステップで20%以下の増加が可能である。
【0104】
J. 血清を含まない培地（既知組成）への適応
1. DMEM/F12完全培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、10% FBS）において細胞を培養する。
2. 血清を含まない培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、アスコルビン酸2リン酸65-130μg/ml、NaHCO3 550-1100μg/ml、亜セレン酸ナトリウム14-28 ng/ml、インシュリン19-38μg/ml、トランスフェリン11-22μg/ml、FGF-2 100-200 ng/ml、TGF-beta 2-4 ng/ml）を調合する。
3. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地I（新鮮な完全培地40%、以前の継代培地からの条件培地40%、血清を含まない培地20%）と取り替える。
4. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
5. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ3を繰り返す。
6. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地II（新鮮な完全培地30%、ステップ1における細胞からの条件培地30%、血清を含まない培地40%）と取り替える。
7. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
8. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ6を繰り返す。
9. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地III（新鮮な完全培地20%、ステップ1における細胞からの条件培地20%、血清を含まない培地60%）と取り替える。
10. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
11. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ9を繰り返す。
12. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地IV（新鮮な完全培地10%、ステップ1における細胞からの条件培地10%、血清を含まない培地80%）と取り替える。
13. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
14. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ12を繰り返す。
15. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を、血清を含まない培地と取り替える。
16. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
17. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ15を繰り返す。
18. 血清を含まない培地の使用は、各ステップにおいて、より緩やかに増やせる。例えば、各ステップで20%以下の増加となる。
1. DMEM/F12完全培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、10% FBS）において細胞を培養する。
2. 血清を含まない培地（DMEM培地とハムF12培地の1 : 1混合物、2-4 mMグルタミン、アスコルビン酸2リン酸65-130μg/ml、NaHCO3 550-1100μg/ml、亜セレン酸ナトリウム14-28 ng/ml、インシュリン19-38μg/ml、トランスフェリン11-22μg/ml、FGF-2 100-200 ng/ml、TGF-beta 2-4 ng/ml）を調合する。
3. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地I（新鮮な完全培地40%、以前の継代培地からの条件培地40%、血清を含まない培地20%）と取り替える。
4. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
5. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ3を繰り返す。
6. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地II（新鮮な完全培地30%、ステップ1における細胞からの条件培地30%、血清を含まない培地40%）と取り替える。
7. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
8. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ6を繰り返す。
9. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地III（新鮮な完全培地20%、ステップ1における細胞からの条件培地20%、血清を含まない培地60%）と取り替える。
10. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
11. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ9を繰り返す。
12. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を適応培地IV（新鮮な完全培地10%、ステップ1における細胞からの条件培地10%、血清を含まない培地80%）と取り替える。
13. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
14. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ12を繰り返す。
15. 細胞が、コンフルーエンスに到達すると、培地を、血清を含まない培地と取り替える。
16. 2-3日毎にトリパンブルー色素排除細胞生存アッセイによって生存率をチェックする。
17. 適応によって細胞が死滅してしまうなら、培養を破棄してステップ15を繰り返す。
18. 血清を含まない培地の使用は、各ステップにおいて、より緩やかに増やせる。例えば、各ステップで20%以下の増加となる。
【0105】
K. 転写後のタンパク質発現の増強
1. 完全培地（ライボビッツL-15、又はDMEM、又はペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%を備えるEMEM）、又は血清を含まない培地（植物加水分解物、又は化学的に定義された成分を備えるDMEM/F12）において細胞を培養する。
2. 培養基を取り除いて廃棄する。
3. 細胞PBSを軽くゆすいで、トリプシンインヒビターを含む血清の痕跡を全て取り除く。
4. 0.25%トリプシン-EDTA溶液2-3 mLをフラスコに加える。
5. 室温で１分間培養する。
6. 細胞をゆっくりとピペットで吸引する。
7. 細胞を、200gで２分間、遠心分離機にかける。
8. 完全培地、又は血清を含まない培地に、細胞を再懸濁する。
9. ６ウェルプレートの各ウェルに、50万個の細胞を加える。
10. 24-28℃で一晩培養する。
11. ポリエチレンイミン、リポソーム、電気穿孔法、その他の方法を用いて、マイクロRNAオリゴヌクレオチド（miR-21、miR-29a、miR-21ミミック、miR-29aミミック、anti-miR-21、anti-miR-29a、又はそれらの等価物）を細胞に形質移入する。
12. 24-28℃で一晩培養する。
13. 温度、湿度、及び大気が最適の培地と同じ条件のもと、CO2培養器中の、多層フラスコ、スピナーフラスコ、又は振とうフラスコに、細胞を移す。
1. 完全培地（ライボビッツL-15、又はDMEM、又はペニシリン200 IU/ml、ストレプトマイシン200 pg/ml、牛胎児血清10%を備えるEMEM）、又は血清を含まない培地（植物加水分解物、又は化学的に定義された成分を備えるDMEM/F12）において細胞を培養する。
2. 培養基を取り除いて廃棄する。
3. 細胞PBSを軽くゆすいで、トリプシンインヒビターを含む血清の痕跡を全て取り除く。
4. 0.25%トリプシン-EDTA溶液2-3 mLをフラスコに加える。
5. 室温で１分間培養する。
6. 細胞をゆっくりとピペットで吸引する。
7. 細胞を、200gで２分間、遠心分離機にかける。
8. 完全培地、又は血清を含まない培地に、細胞を再懸濁する。
9. ６ウェルプレートの各ウェルに、50万個の細胞を加える。
10. 24-28℃で一晩培養する。
11. ポリエチレンイミン、リポソーム、電気穿孔法、その他の方法を用いて、マイクロRNAオリゴヌクレオチド（miR-21、miR-29a、miR-21ミミック、miR-29aミミック、anti-miR-21、anti-miR-29a、又はそれらの等価物）を細胞に形質移入する。
12. 24-28℃で一晩培養する。
13. 温度、湿度、及び大気が最適の培地と同じ条件のもと、CO2培養器中の、多層フラスコ、スピナーフラスコ、又は振とうフラスコに、細胞を移す。
【0106】
L. 細胞培養のための骨組（コンニャク＋ゴム）
1. サフランを２、３片入れた水を薄黄色になるまで沸騰させる。
2. サフランを取り除いてぬるくなるまで溶液を放置する。
3. 全ての乾燥成分を調合する。
a. コンニャク-0.5-5%、好ましくは3%
b. ふくらし粉-0.3%-3%、好ましくは2%
c. 完全キサンタンガム-0.2%-2%、好ましくは1.5%
4. サフラン溶液を100 ml計りとる。
5. ふくらし粉、ローカストビーンガム、キサンタンガムを連続して加える。各原料を加えた後、混合物をよく撹拌する。
6. コンニャクを溶液上に少しずつ振り撒いて加える。撹拌し続ける。溶液はお粥状になる。
7. コンニャクの混合物を型に入れておよそ1-15 mmの厚さに広げる。
8. 型を蓋で覆い、室温で30分を超えて放置する。
9. 型を4℃の冷蔵庫に4時間入れる。
10. 弱い熱で型を40分間蒸す。
11. 型を室温で2時間放置する。
12. 骨組を45-55℃で15分間脱水する。
1. サフランを２、３片入れた水を薄黄色になるまで沸騰させる。
2. サフランを取り除いてぬるくなるまで溶液を放置する。
3. 全ての乾燥成分を調合する。
a. コンニャク-0.5-5%、好ましくは3%
b. ふくらし粉-0.3%-3%、好ましくは2%
c. 完全キサンタンガム-0.2%-2%、好ましくは1.5%
4. サフラン溶液を100 ml計りとる。
5. ふくらし粉、ローカストビーンガム、キサンタンガムを連続して加える。各原料を加えた後、混合物をよく撹拌する。
6. コンニャクを溶液上に少しずつ振り撒いて加える。撹拌し続ける。溶液はお粥状になる。
7. コンニャクの混合物を型に入れておよそ1-15 mmの厚さに広げる。
8. 型を蓋で覆い、室温で30分を超えて放置する。
9. 型を4℃の冷蔵庫に4時間入れる。
10. 弱い熱で型を40分間蒸す。
11. 型を室温で2時間放置する。
12. 骨組を45-55℃で15分間脱水する。
【0107】
M. 細胞培養のための骨組（アルギン酸塩＋もち米粉）
1. アルギン酸ナトリウムを0.1-2 g (0.1-2%)、好ましくは約1g(1%)計量する。
2. ブレンダーに水を100 ml加える。
3. ブレンダーにアルギン酸塩粉を加え、溶解するまで混合物を混ぜる。
4. 容器をプラスチックフィルムで覆い、アルギン酸溶液を一晩冷蔵庫に入れて気泡を除去する。
5. もち米粉を1-10 g (1-10%)、好ましくは約5g (5%)計量して型に入れる。
6. アルギン酸溶液を型に加え、およそ1-15 mmの厚さとする。
7. 粉末が全て溶けるまで混合物を撹拌する。
8. 形に固まるまで弱い熱で混合物を30分間蒸す。
9. 型を蓋で覆い、室温で30分間放置する。
10. 乳酸カルシウムを1%計量し、水中で撹拌して溶かす。
11. 骨組を、1%の乳酸カルシウム溶液に、少なくとも2.5時間浸し、骨組のまわりへの膜組織の形成を可能とする。
1. アルギン酸ナトリウムを0.1-2 g (0.1-2%)、好ましくは約1g(1%)計量する。
2. ブレンダーに水を100 ml加える。
3. ブレンダーにアルギン酸塩粉を加え、溶解するまで混合物を混ぜる。
4. 容器をプラスチックフィルムで覆い、アルギン酸溶液を一晩冷蔵庫に入れて気泡を除去する。
5. もち米粉を1-10 g (1-10%)、好ましくは約5g (5%)計量して型に入れる。
6. アルギン酸溶液を型に加え、およそ1-15 mmの厚さとする。
7. 粉末が全て溶けるまで混合物を撹拌する。
8. 形に固まるまで弱い熱で混合物を30分間蒸す。
9. 型を蓋で覆い、室温で30分間放置する。
10. 乳酸カルシウムを1%計量し、水中で撹拌して溶かす。
11. 骨組を、1%の乳酸カルシウム溶液に、少なくとも2.5時間浸し、骨組のまわりへの膜組織の形成を可能とする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12】
【国際調査報告】