特表2023-504236Ｌ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-02
(54)【発明の名称】Ｌ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230126BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230126BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20230126BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20230126BHJP
C12P 13/10 20060101ALI20230126BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20230126BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20230126BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N1/21 ZNA
C12N9/12
C12N15/70 Z
C12P13/10 B
C12N9/00
C12Q1/686 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022525726
(86)(22)【出願日】2020-05-15
(85)【翻訳文提出日】2022-06-02
(86)【国際出願番号】 CN2020090626
(87)【国際公開番号】W WO2021109467
(87)【国際公開日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】201911211097.X
(32)【優先日】2019-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517403123
【氏名又は名称】寧夏伊品生物科技股▲ふん▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】謝希賢
(72)【発明者】
【氏名】蒋帥
(72)【発明者】
【氏名】文晨輝
(72)【発明者】
【氏名】呉鶴云
(72)【発明者】
【氏名】劉益寧
(72)【発明者】
【氏名】李旋
(72)【発明者】
【氏名】田道光
(72)【発明者】
【氏名】熊博
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC07
4B050KK07
4B050LL05
4B063QA20
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4B063QQ42
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4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA17
(57)【要約】
Ｌ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用を開示する。該方法は、大腸菌にカルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子及びＬ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子を組み込むことにより、大腸菌のアルギニン合成経路及びアミノ酸代謝ネットワーク全体におけるアルギニンに関連する代謝フラックスを分析して再構成し、遺伝的背景が明確であり、プラスミドを含んでおらず、突然変異誘発を受けず、且つＬ－アルギニンを安定的かつ効率よく生産し得る遺伝子組換え菌を得るステップを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢを含有する、Ｌ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌株。
【請求項2】
大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカムを出発菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０又はＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５を出発菌株とし、好ましくは、前記ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢ遺伝子は大腸菌のｙｊｉＴ遺伝子部位に組み込まれ、好ましくは、前記ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢは枯草菌に由来する、請求項１に記載の遺伝子組換え菌株。
【請求項3】
Ｌ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子をさらに含有し、前記アルギニン生合成経路酵素は、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨから選ばれる１種又は複数種であり、好ましくは、前記Ｌ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子はＰｔｒｃプロモータによりスタートされ、好ましくは、前記Ｌ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子は大腸菌のｙｇｈＸ遺伝子部位に組み込まれている、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え菌株。
【請求項4】
アルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥをさらに含有し、好ましくは、前記ｌｙｓＥ遺伝子は大腸菌のｉｌｖＧ遺伝子部位に組み込まれ、好ましくは、前記ｌｙｓＥ遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８で示されるヌクレオチド配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え菌株。
【請求項5】
Ｌ－アルギニンを分解するコード遺伝子を含有しておらず、例えば、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子のうちの１種又は複数種の遺伝子がノックアウトされており、
好ましくは、前記アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はｓｐｅＡ、ａｄｉＡのうちの少なくとも１種を含み、前記アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はａｓｔＡであり、前記アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子はａｒｇＥであり、
好ましくは、前記遺伝子組換え菌株は、ｓｐｅＡ、ａｄｉＡ、ａｓｔＡ及びａｒｇＥ遺伝子が同時にノックアウトされた大腸菌である、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え菌株。
【請求項6】
遺伝子組換え菌株の構築方法であって、出発菌株のゲノムにｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢ遺伝子を組み込むステップ（１）と、
好ましくは、必要に応じて、
ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨのうちの１種又は複数種を含むアルギニン生合成経路酵素遺伝子、及び／又はアルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥを組み込むステップ（２）、及び
アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子をノックアウトするステップであって、例えば、前記アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子はｓｐｅＡ、ａｄｉＡのうちの少なくとも１種を含み、前記アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はａｓｔＡであり、前記アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子はａｒｇＥであるステップ（３）のうちの１つ又は２つとを含む、遺伝子組換え菌株の構築方法。
【請求項7】
大腸菌においてアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ａｄｉＡ及びアルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｓｔＡの３つの遺伝子をノックアウトするステップ（１）と、大腸菌においてアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＥをノックアウトし、必要に応じてグルタミン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪを大腸菌に組み込むステップ（２）と、
アルギニン生合成関連遺伝子クラスタ、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ及びａｒｇＨを組み込むステップ（３）と、
カルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢを組み込むステップ（４）と、
アルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥを大腸菌ゲノムに組み込むステップ（５）とを含む、請求項６に記載の構築方法。
【請求項8】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が仲介する遺伝子編集技術を用いて遺伝子の組み込み及びノックアウトを行うステップを含む、請求項６又は７に記載の構築方法。
【請求項9】
組換え断片及びｐＧＲＢプラスミドの構築を含み、好ましくは、前記ｐＧＲＢプラスミドの構築は、標的配列を設計し、標的配列を含むＤＮＡ断片を製造し、標的配列を含むＤＮＡ断片と線形化ベクター断片とを組換えるステップを含み、
好ましくは、組換え断片の構築は、遺伝子を組み込んだ組換え断片又は遺伝子がノックアウトされた組換え断片を構築するステップを含み、
好ましくは、遺伝子を組み込んだ組換え断片を構築するステップは、
出発菌株のゲノムをテンプレートとして、目的遺伝子の挿入部位の上流・下流配列に従って上流・下流相同性アームプライマーを設計し、目的ゲノムに従ってプライマーを設計し、目的遺伝子断片を増幅し、次にＰＣＲオーバーラップ技術により組換え断片を得るステップを含み、
好ましくは、遺伝子がノックアウトされた組換え断片を構築するステップは、
遺伝子をノックアウトする対象となる上流・下流配列をテンプレートとして、上流・下流相同性アームプライマーを設計するステップと、ＰＣＲ方法によって上流・下流相同アームをそれぞれ増幅し、次にオーバーラップＰＣＲにより組換え断片を製造するステップとを含み、
好ましくは、ｐＧＲＢプラスミドと上記の組換え断片とをｐＲＥＤＣａｓ９含有エレクトロコンピテント細胞に同時形質転換するステップを含み、
プラスミドを除去し、組換え遺伝子組換え菌株を得るステップをさらに含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の構築方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え菌の発酵によるＬ－アルギニン生産方法であって、上記の大腸菌遺伝子組換え菌株を発酵培地と接触させ、発酵培養を行い、Ｌ－アルギニンを製造するステップを含み、
好ましくは、前記発酵培養は振とうフラスコ発酵又は発酵槽発酵を含み、
好ましくは、Ｌ－アルギニンの蓄積量は１３０－１３５ｇ／Ｌ、転化率は０．４８ｇアルギニン／ｇグルコース、生産性は２．５ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０１９年１２月０２日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号２０１９１１２１１０９７．Ｘ、発明の名称「Ｌ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用」の先行出願の優先権を主張しており、当該先行出願の全内容は援用により本願に組み込まれるものとする。
【0002】
本発明は遺伝子工学の技術分野に属し、具体的には、Ｌ－アルギニンを安定的かつ効率よく生産する遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｌ－アルギニンは人体と動物体内の半必須塩基性アミノ酸又は条件性必須アミノ酸であり、重要な生化学的及び生理学的機能を有する。現在、Ｌ－アルギニンはすでに医薬、工業、食品、化粧品、牧畜業などの分野で広範な応用があり、重要な経済と社会価値がある。
【0004】
Ｌ－アルギニンの生産方法は主にタンパク質加水分解法と微生物発酵法を含み、タンパク質加水分解抽出法に比べ、微生物発酵法は生産技術が簡単で、環境への影響が小さく、製品の純度が高いという優位性があり、大規模な工業的生産に適している。
【0005】
現在のアルギニン生産菌種は主にコリネバクテリウム・グルタミカムであり、生産過程において発酵周期が長く（９０ｈ～１２０ｈ）、生産性が低いという問題があり、また、現在のコリネバクテリウム・グルタミカムの発酵プロセスはコーンスティープリカーなどの副原料の品質に大きく影響され、生産が変動しやすい。コリネバクテリウム・グルタミカムは遺伝子の編集が難しいので、現在のアルギニン生産菌株でプラスミド発現ベクターを用いてアルギニン合成に関連する重要な遺伝子を強化するのだが、発酵過程中にプラスミドの多コピーは菌体の成長に一定の負担を与え、発酵後期の生産量の低下をもたらし、しかも、生産過程中にプラスミド発現ベクターが失われやすく、あるいは一定の選択的圧力を加える必要があり、その結果、工業生産過程のコストが高すぎるという問題を引き起こした。多くの要因により、現在のアルギニン生産菌株は工業的生産に適用することが困難である。
【0006】
アルギニン合成代謝経路に多くのフィードバック制御が存在し、アルギニン代謝経路が多く、アルギニン合成に必要な前駆物質が関わる代謝ネットワークが複雑であるため、最初のアルギニン工業生産用菌株の研究開発は、主に伝統的な突然変異誘発とアルギニン構造類似体耐性スクリーニング方法を用いた。選択した出発菌株は、主にブレビバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・クレナタム、コリネバクテリウム・グルタミカムであり、研究戦略はアルギニン構造類似体の突然変異体のスクリーニングに集中し、アルギニン合成過程におけるフィードバック制御を解除し、細胞内のＬ－アルギニンの蓄積量を高める。その中で、李少平らはＮＴＧの段階的突然変異誘発によりヒスチジン欠損型、スルファグアニジン耐性、Ｄ－アルギニン耐性、ホモアルギニン耐性、Ｓ－メチルシステイン耐性を有するコリネバクテリウム・クレナタム（ＣＮ２０１０１０６１０９１７．５）をスクリーニングし、発酵実験により、５Ｌ発酵槽で９６ｈ培養したところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は３２．８ｇ／Ｌであることを検証した。しかし、突然変異誘発と構造類似体のスクリーニングを経て得られた生産菌株は、遺伝的安定性が悪いため、復帰突然変異が生じやすいなどの欠点があり、工業的な量産に適用することが難しい。
【0007】
遺伝子工学技術の急速な発展に伴い、代謝工学技術を用いてＬ－アルギニン生産菌株を構築する方法は、次第に伝統的な突然変異誘発育種方法に取って代わった。コリネバクテリウム・グルタミカムは、アルギニンの分解に関する遺伝子を有しておらず、グルタミン酸はアルギニン合成の主要な前駆物質の一つであり、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞内に取り込まれたグルコースは解糖経路を経てグルタミン酸を生成する代謝フラックスが強いため、コリネバクテリウム・グルタミカムは、Ｌ－アルギニン生産菌株を構築する主要な選択肢である。徐美娟ら（Xu M,Rao Z,Yang J,et al.J Ind Microbiol Biotechnol,2012,39(3):495-502.）は、Ｌ－アルギニンを合成する遺伝子クラスタａｒｇＣＪＢＤＦＲＧＨをｐＪＣｔａｃシャトル発現ベクターに連結し、コリネバクテリウム・クレナタムに導入し、この菌株は、９６ｈ（時間）発酵後、Ｌ－アルギニン産量が４５．６ｇ／Ｌに向上する。Ｐａｒｋら（Park S H,Kim H U,Kim T Y,et al.Nature Communications,2014,5:4618---）はコリネバクテリウム・グルタミカムを出発株とし、ランダム突然変異誘発によりＬ－アルギニン構造類似体に対するグルタミンの耐性を向上させ、システム代謝工学技術を用いて、アルギニン合成過程中のフィードバック阻害を解除し、合成過程中のＮＡＤＰＨの供給を増強し、前駆物質の供給を増強し、最終的に５Ｌ発酵槽で９６ｈ発酵させたところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は９２．５ｇ／Ｌ、転化率は０．３５ｇアルギニン／ｇグルコース、最大生産性は０．９ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達する。上記の生産菌株は一般的には、生産周期が長い、生産性が低いなどの問題が存在し、その上、菌株の構築過程において、アルギニン合成のキー遺伝子を発現ベクターに連結することでキー酵素の転写量を高め、さらにアルギニン合成経路の代謝フラックスを増強するが、生産過程において発現ベクターが失われやすく、あるいは一定の選択的圧力を加える必要があり、その結果、工業的生産に適用するのが困難である。
【0008】
大腸菌は発酵周期が短く、遺伝的背景が明確であり、分子操作が便利で、発酵技術が安定しているなどの優位性があるため、Ｌ－アルギニンの工業生産菌株を構築する上でより良い選択となっている。Ｇｉｎｅｓｙら（Ginesy M,Belotserkovsky J,Enman J,et al.Microbial Cell Factories,2015,14(1):29.）は大腸菌を出発菌株とし、ａｒｇＲをノックアウトしてアルギニンのフィードバック阻害を解除し、突然変異遺伝子ａｒｇＡ２１４（Ｈ１５Ｙ）を組み込んでアルギニンによるＡｒｇＡのフィードバック阻害を解除し、アルギニン分解関連遺伝子ａｄｉＡをノックアウトし、オルニチン分解関連遺伝子ｓｐｅＣとｓｐｅＦをノックアウトすることで、中間代謝産物の炭素流量をより多くＬ－アルギニンに流す。１Ｌ発酵槽で４２ｈ培養したところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は１１．６４ｇ／Ｌ、転化率は０．４４ｇアルギニン／ｇグルコース、生産性は０．２９ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達する。この菌株の発酵周期は明らかに短縮されたが、そのアルギニン蓄積量や生産性は工業的生産の要件を満たしていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上記の課題に対して、本発明の目的は、Ｌ－アルギニンを安定的かつ効率よく生産する、産業利用が期待できる遺伝子組換え菌、その構築方法及び使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は下記技術的解決手段を提供する。
【0011】
第１態様では、本発明は、カルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｙｒＡＡ、及びｐｙｒＡＢを含有するＬ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌株を提供する。
【0012】
一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株は、大腸菌又はコリネバクテリウム・グルタミカムを出発菌株、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０又はＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５を出発菌株とする。
【0013】
一実施形態では、前記ｐｙｒＡＡ、及びｐｙｒＡＢ遺伝子は大腸菌のｙｊｉＴ遺伝子部位に組み込まれる。
【0014】
一実施形態では、前記ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢは枯草菌に由来し、具体的には、前記ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０においてカルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子に由来する。
【0015】
一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株はＬ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子をさらに含有し、前記－アルギニン生合成経路酵素は、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨの酵素から選ばれる１種又は複数種であり、前記Ｌ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子はコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２）に由来し、一実施形態では、前記Ｌ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子はＰｔｒｃプロモータによりスタートされ、一実施形態では、前記Ｌ－アルギニン生合成経路酵素をコードする遺伝子は大腸菌のｙｇｈＸ遺伝子部位に組み込まれる。
【0016】
一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株はアルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿１４３７５８４３８．１）をさらに含有し、前記トランスポータ遺伝子はコリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）に由来し、一実施形態では、前記ｌｙｓＥ遺伝子は大腸菌のｉｌｖＧ遺伝子部位に組み込まれる。
【0017】
一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株はＬ－アルギニンを分解するコード遺伝子を含有しておらず、例えば、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子の１種又は複数種の遺伝子がノックアウトされている。前記アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、ｓｐｅＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３３５２）、ａｄｉＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３４０８５）のうちの少なくとも１種を含み、前記アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はａｓｔＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３２４１）であり、前記アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子はａｒｇＥ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３０５７４）である。一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株はｓｐｅＡ、ａｄｉＡ、及びａｓｔＡ遺伝子を同時にノックアウトした大腸菌である。
【0018】
一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株はｐｙｒＡＡ、ｐｙｒＡＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、及びｌｙｓＥ遺伝子を含有する。一実施形態では、前記遺伝子組換え菌株はｓｐｅＡ、ａｄｉＡ、 ａｓｔＡ及びａｒｇＥ遺伝子を含有していない。
【0019】
本発明では、ｐｙｒＡＡ、ｐｙｒＡＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨ、ｌｙｓＥ、ｓｐｅＡ、ａｄｉＡ、ａｓｔＡ及びａｒｇＥ遺伝子は、野生型遺伝子に限定されるものではなく、対応するタンパク質をコードする突然変異体、又は１つ又は複数の部位の置換、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失又は挿入を含むように人工修飾された遺伝子であってもよく、この突然変異体又は人工修飾された遺伝子でコードされるタンパク質は対応する活性を有し、機能的な欠陥がなければよい。これらの遺伝子は全てＧｅｎＢａｎｋに登録されており、当業者はＰＣＲによってこれらの遺伝子を得ることができる。一例として、ｐｙｒＡＡ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９３７３６８、ｐｙｒＡＢ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９３６６０８、ａｒｇＣ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７０、ａｒｇＪ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７１、ａｒｇＢ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７２、ａｒｇＤ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７３、ａｒｇＦ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７４、ａｒｇＧ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７６、ａｒｇＨ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７７、ｌｙｓＥ遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８で示されるヌクレオチド配列（ＮＣＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＷＰ＿１４３７５８４３８．１）であり、ｓｐｅＡ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３３５２、ａｄｉＡ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３４０８５、ａｓｔＡ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３２４１であり、ａｒｇＥ遺伝子はＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３０５７４である。
【0020】
第２態様では、本発明は出発菌株のゲノムにｐｙｒＡＡ、ｐｙｒＡＢ遺伝子を組み込むステップ（１）を含む上記の遺伝子組換え菌株の構築方法を提供する。
【0021】
例示的には、前記出発菌株は大腸菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。
【0022】
一実施形態では、前記構築方法は、必要に応じて、
ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨのうちの１種又は複数種を含むアルギニン生合成経路酵素遺伝子、及び／又はアルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥを組み込むステップ（２）、及び
アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び／又はアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子をノックアウトするステップであって、例えば、前記アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はｓｐｅＡ、ａｄｉＡのうちの少なくとも１種を含み、前記アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はａｓｔＡであり、前記アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子はａｒｇＥであるステップ（３）
のうちの１つ又は２つを含んでもよい。
ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨのうちの１種又は複数種を含むアルギニン生合成経路酵素遺伝子、及び／又はアルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥを組み込むステップ（２）、及び
アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子、アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び／又はアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子をノックアウトするステップであって、例えば、前記アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はｓｐｅＡ、ａｄｉＡのうちの少なくとも１種を含み、前記アルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子はａｓｔＡであり、前記アセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子はａｒｇＥであるステップ（３）
のうちの１つ又は２つを含んでもよい。
【0023】
一実施形態では、前記構築方法は、
大腸菌においてアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ａｄｉＡ及びアルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｓｔＡの３つの遺伝子をノックアウトするステップ（１）と、
大腸菌においてアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＥをノックアウトし、必要に応じてグルタミン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪを大腸菌に組み込むステップ（２）と、
ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ及びａｒｇＨのようなアルギニン生合成関連遺伝子クラスターを組み込み、Ｐｔｒｃプロモータによりスタートするステップ（３）と、
カルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢを組み込むステップ（４）と、
アルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥを大腸菌ゲノムに組み込むステップ（５）とを含む。
大腸菌においてアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ａｄｉＡ及びアルギニンサクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｓｔＡの３つの遺伝子をノックアウトするステップ（１）と、
大腸菌においてアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＥをノックアウトし、必要に応じてグルタミン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪを大腸菌に組み込むステップ（２）と、
ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ及びａｒｇＨのようなアルギニン生合成関連遺伝子クラスターを組み込み、Ｐｔｒｃプロモータによりスタートするステップ（３）と、
カルバモイルリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｐｙｒＡＡ及びｐｙｒＡＢを組み込むステップ（４）と、
アルギニントランスポータをコードする遺伝子ｌｙｓＥを大腸菌ゲノムに組み込むステップ（５）とを含む。
【0024】
当業者であれば理解できるように、本発明の上記の構築方法のステップ（１）～（５）の順序は限定されるものではなく、当業者によって実施可能な任意の順序で行われてもよい。好ましくはステップ（１）～（５）は順次行われる。
【0025】
上記の遺伝子ノックアウトは当該分野で公知の任意の遺伝子ノックアウト又は遺伝子サイレンシング方法によって行われてもよく、遺伝子の組み込みも当該分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え、オーバーラップＰＣＲ、突然変異誘発スクリーニング又は遺伝子編集などの技術によって行われてもよい。例えば、遺伝子ノックアウトは、遺伝子における特定の領域を除去して目的タンパク質を発現させる機能を失わせたり、又は部位特異的突然変異によりコード領域又はプロモータ領域に１つ又は複数のヌクレオチド配列の置換、欠失、挿入などを導入したり、化学試薬を使用してこの特定遺伝子でコードされる転写を低下又は解消したりすることにより行われてもよい。
【0026】
一実施形態では、前記構築方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が仲介する遺伝子編集技術を用いて遺伝子の組み込み及びノックアウトを行うステップを含む。
【0027】
一実施形態では、前記構築方法は組換え断片及びｐＧＲＢプラスミドの構築を含む。
【0028】
一実施形態では、前記ｐＧＲＢプラスミドの構築は、標的配列を設計し、標的配列を含むＤＮＡ断片を製造し、標的配列を含むＤＮＡ断片と線形化ベクター断片とを組換えることを含み、１つの特定実施形態では、前記標的配列は５’－ＮＧＧ－３’である。
【0029】
一実施形態では、前記構築方法において、組換え断片の構築は、遺伝子を組み込んだ組換え断片又は遺伝子をノックアウトした組換え断片を構築するステップを含む。ここで、遺伝子を組み込んだ組換え断片を構築するステップは、出発菌株のゲノムをテンプレートとして、目的遺伝子の挿入部位の上流・下流配列に従って上流・下流相同性アームプライマーを設計し、目的ゲノムに従ってプライマーを設計し、目的遺伝子断片を増幅し、次にＰＣＲオーバーラップ技術により組換え断片を得るステップを含む。遺伝子をノックアウトした組換え断片を構築するステップは、遺伝子をノックアウトする対象となる上流・下流配列をテンプレートとして、上流・下流相同性アームプライマーを設計するステップと、ＰＣＲ方法によって上流・下流相同アームをそれぞれ増幅し、次にオーバーラップＰＣＲにより組換え断片を製造するステップとを含む。
【0030】
一実施形態では、前記構築方法は、ｐＧＲＢプラスミドと上記の組換え断片とをｐＲＥＤＣａｓ９含有エレクトロコンピテント細胞に同時形質転換するステップと、プラスミドを除去し、組換え遺伝子組換え菌株を得るステップとをさらに含む。
【0031】
本発明では、Ｌ－アルギニンの製造における上記の遺伝子組換え菌の使用が提供される。
【0032】
本発明では、上記の大腸菌遺伝子組換え菌株を発酵培地と接触させ、発酵培養を行い、Ｌ－アルギニンを製造するステップを含む上記の遺伝子組換え菌の発酵によるＬ－アルギニン生産方法がさらに提供される。
【0033】
本発明によれば、前記発酵培養は振とうフラスコ発酵又は発酵槽発酵を含む。
【0034】
一実施形態では、振とうフラスコ発酵では、播種量は１０～１５％、発酵条件は、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振とう培養であり、ｐＨが発酵過程において７．０－７．２に維持され、アンモニア水の補充により調整可能である。発酵過程において発酵を持続するためにグルコース溶液を補充してもよく、好ましくは前記グルコース溶液の質量体積濃度は６０％（ｍ／ｖ）である。好ましくは、前記振とうフラスコ発酵の発酵時間は２６～３０ｈである。本発明では、グルコース溶液の補充量について特に限定はなく、発酵液中のグルコース濃度は５ｇ／Ｌ以下、例えば１－５ｇ／Ｌに維持されてもよい。
【0035】
一実施形態では、前記振とうフラスコ発酵は５００ｍＬ三角フラスコにて行われる。振とうフラスコ発酵が２６～３０ｈ行われたところ、発酵液中のＬ－アルギニン濃度は３０～３２ｇ／Ｌに達する。
【0036】
一実施形態では、発酵槽発酵では、播種量は１５～２０％、発酵温度は３５℃、溶存酸素は２５～３５％である。発酵過程においてｐＨが安定的に７．０～７．２に制御され、アンモニア水の補充により調整可能であり、培地中のグルコースが全て消費されると、８０％（ｍ／ｖ）のグルコース溶液を流加することで、発酵培地中のグルコース濃度を０．１～５ｇ／Ｌに維持する。
【0037】
一実施形態では、前記発酵槽発酵は５Ｌ発酵槽を用いて行われる。５Ｌ発酵槽で５０～５５ｈ培養したところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は、１３０～１３５ｇ／Ｌ、転化率は０．４８ｇアルギニン／ｇグルコース、生産性は２．５ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達する。
【0038】
本発明では、発酵は当該分野で公知の大腸菌発酵培地を用いて行われてもよい。
【0039】
一実施形態では、振とうフラスコ発酵の発酵培地の組成は以下のとおりである。グルコース２０～４０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１－３ｇ／Ｌ、ペプトン２～３ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３～６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １～２ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １５～２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １５～２０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ１２、ＶＨ：１～３ｍｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２。
【0040】
一実施形態では、発酵槽発酵の発酵培地の組成は以下のとおりである。グルコース１０～２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物１～５ｇ／Ｌ、ペプトン１～５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１～５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １～３ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０～３０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０～３０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ１２、ＶＨ：１～３ｍｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２。
【0041】
有利な効果
本発明では、成長周期が短く、代謝経路が明確であり、分子操作が簡便な大腸菌を出発菌株として、Ｌ－アルギニン合成代謝経路の遺伝子工学改変及び代謝ネットワーク全体の工学的改変により、大腸菌のアルギニン合成経路及びアミノ酸代謝ネットワーク全体におけるアルギニンに関連する代謝フラックスを分析して再構成し、遺伝的背景が明確であり、プラスミドを含んでおらず、突然変異誘発を受けず、Ｌ－アルギニンを安定的かつ効率よく生産し得る遺伝子組換え菌株が得られる。
本発明では、成長周期が短く、代謝経路が明確であり、分子操作が簡便な大腸菌を出発菌株として、Ｌ－アルギニン合成代謝経路の遺伝子工学改変及び代謝ネットワーク全体の工学的改変により、大腸菌のアルギニン合成経路及びアミノ酸代謝ネットワーク全体におけるアルギニンに関連する代謝フラックスを分析して再構成し、遺伝的背景が明確であり、プラスミドを含んでおらず、突然変異誘発を受けず、Ｌ－アルギニンを安定的かつ効率よく生産し得る遺伝子組換え菌株が得られる。
【0042】
本発明で得られた大腸菌は、Ｌ－アルギニンの循環経路を構築し、Ｌ－アルギニンフラックスや前駆物質の供給を向上させ、Ｌ－アルギニンの分解を低下させ、Ｌ－アルギニンの蓄積や輸送を促進し、これにより、Ｌ－アルギニンの生産量を効果的に向上させる。
【0043】
本発明に係るＬ－アルギニンを生産する遺伝子組換え菌は、５Ｌ発酵槽で５０～５５ｈ培養したときに、Ｌ－アルギニンの蓄積量は１３０～１３５ｇ／Ｌ、転化率は０．４８ｇアルギニン／ｇグルコース、生産性は２．５ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達し、２０１４年にＰａｒｋらにより報告された菌株（５Ｌ発酵槽で９６ｈ発酵したところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は９２．５ｇ／Ｌ、転化率は０．３５ｇアルギニン／ｇグルコース、最大生産性は０．９ｇアルギニン／Ｌ／ｈ）に比べて、該組換え菌は、Ｌ－アルギニンを生産する能力が強く、しかも突然変異誘発処理を受けず、プラスミドベクターを含んでおらず、このため、発酵周期が短く、遺伝的背景が明確であり、代謝が安定しており、生産性が高いなどの優位性があり、工業的応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】（ａ）ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドマップ、（ｂ）ｐＧＲＢプラスミドマップ。
【図2】ｓｐｅＡ遺伝子をノックアウトした断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：下流相同アーム；３：オーバーラップ断片；４：元の菌対照；５：陽性菌同定用断片。
【図3】ａｄｉＡ遺伝子をノックアウトした断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：下流相同アーム；３：オーバーラップ断片；４：元の菌対照；５：陽性菌同定用断片。
【図4】ａｓｔＡ遺伝子をノックアウトした断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：下流相同アーム；３：オーバーラップ断片；４：元の菌対照；５：陽性菌同定用断片。
【図5】ａｒｇＪ遺伝子を組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：ａｒｇＪ断片；３：下流相同アーム；４：オーバーラップ断片；５：元の菌対照；６：陽性菌同定用断片。
【図6】ａｒｇＣ－ａｒｇＪを組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：ａｒｇＣ－ａｒｇＪ断片；３：下流相同アーム；４：オーバーラップ断片；５：元の菌対照；６：陽性菌同定用断片。
【図7】ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦを組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ上流断片－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ遺伝子断片；２：下流相同アーム；３：オーバーラップ断片；４：元の菌対照；５：陽性菌同定用断片。
【図8】ａｒｇＧ－ａｒｇＨを組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：ａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片；３：下流相同アーム；４：オーバーラップ断片；５：元の菌対照；６：陽性菌同定用断片。
【図9】ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ第１部分を組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：１－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ断片；３：下流相同アーム；４：オーバーラップ断片；５：元の菌対照；６：陽性菌同定用断片。
【図10】ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ第２部分を組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：ｐｙｒＡＡの上流断片－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－下流相同アーム；２：下流相同アーム；３：オーバーラップ断片；４：元の菌対照； ５：陽性菌同定用断片。
【図11】ｌｙｓＥを組み込んだ断片の構築及び検証の電気泳動図。Ｍ：１ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：上流相同アーム；２：ｌｙｓＥ断片；３：下流相同アーム；４：オーバーラップ断片；５：元の菌対照；６：陽性菌同定用断片。
【図12】菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０を５Ｌ発酵槽にバッチ式で補充して発酵する過程の曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
以下、本発明の実施例を説明することによって、本発明の上記及び他の特徴や優位性をさらに詳しく解説、説明する。なお、以下の実施例は、本発明の技術的解決手段を例示的に説明するためのものであり、請求項及びその等価物により限定される本発明の特許範囲を制限することを意図していない。
【0046】
特に断らない限り、本明細書における材料及び試薬は全て市販商品、又は当業者が従来技術により製造したものであり得る。
【0047】
実施例１
遺伝子組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０の構築
１ 遺伝子編集方法
本発明で使用される遺伝子編集方法は文献（Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR－Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.）を参照して行われ、該方法に使用される２つのプラスミドマップは図１に示される。この中でも、ｐＲＥＤＣａｓ９はｇＲＮＡ発現プラスミドｐＧＲＢの除去システム、λファージのＲｅｄ組換えシステム及びＣａｓ９タンパク質発現システムを含んでおり、スペクチノマイシン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３２℃で培養されたものであり、ｐＧＲＢはｐＵＣ１８を骨格として、プロモータＪ２３１００、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９結合領域配列及びターミネータ配列を含み、アンピシリン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３７℃で培養されたものである。
遺伝子組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０の構築
１ 遺伝子編集方法
本発明で使用される遺伝子編集方法は文献（Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR－Cas9 meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.）を参照して行われ、該方法に使用される２つのプラスミドマップは図１に示される。この中でも、ｐＲＥＤＣａｓ９はｇＲＮＡ発現プラスミドｐＧＲＢの除去システム、λファージのＲｅｄ組換えシステム及びＣａｓ９タンパク質発現システムを含んでおり、スペクチノマイシン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３２℃で培養されたものであり、ｐＧＲＢはｐＵＣ１８を骨格として、プロモータＪ２３１００、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９結合領域配列及びターミネータ配列を含み、アンピシリン耐性（作動濃度：１００ｍｇ／Ｌ）であり、３７℃で培養されたものである。
【0048】
該方法のステップは具体的には以下のとおりである。
１．１ ｐＧＲＢプラスミドの構築
プラスミドｐＧＲＢを構築する目的は、対応するｇＲＮＡを転写し、Ｃａｓ９タンパク質とともに複合体を形成し、塩基対合及びＰＡＭを介して目的遺伝子の標的部位を認識することで、目的ＤＮＡ二本鎖切断を実現することである。標的配列を含むＤＮＡ断片と線形化ベクター断片とを組換える方法によってｐＧＲＢプラスミドを構築した。
１．１ ｐＧＲＢプラスミドの構築
プラスミドｐＧＲＢを構築する目的は、対応するｇＲＮＡを転写し、Ｃａｓ９タンパク質とともに複合体を形成し、塩基対合及びＰＡＭを介して目的遺伝子の標的部位を認識することで、目的ＤＮＡ二本鎖切断を実現することである。標的配列を含むＤＮＡ断片と線形化ベクター断片とを組換える方法によってｐＧＲＢプラスミドを構築した。
【0049】
１．１．１ 標的配列の設計
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓを使用して標的配列（ＰＡＭ：５’－ＮＧＧ－３’）を設計した。
１．１．２ 標的配列を含むＤＮＡ断片の製造
プライマー：５’－線形化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－酵素切断部位－標的配列（ＰＡＭ配列を含まない）－線形化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－３’及びこれと逆相補的なプライマーを設計し、一本鎖ＤＮＡのアニーリングによって標的配列を含むＤＮＡ断片を製造した。反応条件：予備変性９５℃、５ｍｉｎ（分）；アニーリング３０～５０℃、１ｍｉｎ。アニーリング系を以下の表１に示す。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓを使用して標的配列（ＰＡＭ：５’－ＮＧＧ－３’）を設計した。
１．１．２ 標的配列を含むＤＮＡ断片の製造
プライマー：５’－線形化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－酵素切断部位－標的配列（ＰＡＭ配列を含まない）－線形化ベクター末端配列（１５ｂｐ）－３’及びこれと逆相補的なプライマーを設計し、一本鎖ＤＮＡのアニーリングによって標的配列を含むＤＮＡ断片を製造した。反応条件：予備変性９５℃、５ｍｉｎ（分）；アニーリング３０～５０℃、１ｍｉｎ。アニーリング系を以下の表１に示す。
【0050】
１．１．３ 線形ベクターの製造
ベクターの線形化にはインバースＰＣＲによる増幅方法が使用された。
ベクターの線形化にはインバースＰＣＲによる増幅方法が使用された。
【0051】
１．１．４ 組換え反応
組換え系を以下の表２に示す。使用されるリコンビナーゼは全て
シリーズの酵素であり、組換え条件は３７℃、３０ｍｉｎとした。
組換え系を以下の表２に示す。使用されるリコンビナーゼは全て
【0052】
１．１．５ プラスミドの形質転換
反応液１０μＬを、ＤＨ５α化学的形質転換コンピテント細胞１００ｍＬに加え、軽く均一に混ぜて２０ｍｉｎ氷浴処理し、４２℃で４５～９０ｓ（秒）熱ショックした直後、２～３ｍｉｎ氷浴処理し、ＳＯＣ ９００μＬを加え、３７℃で１ｈ蘇生させた。８０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離して、一部の上澄みを捨て、約２００μＬを残して菌体を再懸濁したものを１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有平板に塗布し、平板を逆さにし、３７℃で一晩培養した。平板に単一コロニーが成長した後、コロニーＰＣＲにより同定し、陽性組換え体を選択した。
反応液１０μＬを、ＤＨ５α化学的形質転換コンピテント細胞１００ｍＬに加え、軽く均一に混ぜて２０ｍｉｎ氷浴処理し、４２℃で４５～９０ｓ（秒）熱ショックした直後、２～３ｍｉｎ氷浴処理し、ＳＯＣ ９００μＬを加え、３７℃で１ｈ蘇生させた。８０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離して、一部の上澄みを捨て、約２００μＬを残して菌体を再懸濁したものを１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有平板に塗布し、平板を逆さにし、３７℃で一晩培養した。平板に単一コロニーが成長した後、コロニーＰＣＲにより同定し、陽性組換え体を選択した。
【0053】
１．１．６ クローンの同定
ＰＣＲ陽性コロニーを１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培地に播種し、一晩培養した後、菌を保存し、プラスミドを抽出して、酵素切断し同定した。
ＰＣＲ陽性コロニーを１００ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培地に播種し、一晩培養した後、菌を保存し、プラスミドを抽出して、酵素切断し同定した。
【0054】
１．２ 組換えＤＮＡ断片の製造
ノックアウト用の組換え断片はノックアウトすべき遺伝子の上流・下流相同アームからなり（上流相同アーム－下流相同アーム）、組み込むための組換え断片は、組み込む部位の上流・下流相同アーム及び組み込む対象の遺伝子断片からなる（上流相同アーム－目的遺伝子－下流相同アーム）。プライマー設計ソフトウェアｐｒｉｍｅｒ５を利用して、ノックアウト対象の遺伝子又は組み込む対象の部位の上流・下流配列をテンプレートとして、上流・下流相同性アームプライマー（増幅長さ約４００～５００ｂｐ）を設計し、組み込まれる遺伝子をテンプレートとして、組み込まれる遺伝子の増幅プライマーを設計した。ＰＣＲ方法によって上流・下流相同アーム及び目的遺伝子断片をそれぞれ増幅し、次にオーバーラップＰＣＲにより組換え断片を製造した。ＰＣＲ系及び方法を以下の表３に示す。
オーバーラップＰＣＲ系を以下の表４に示す。
ＰＣＲ反応条件（タカラバイオ社製ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ酵素）：予備変性（９５℃）５ｍｉｎ；次に３０回サイクル：変性（９８℃）１０ｓ、アニーリング（（Ｔｍ－３／５）℃）１５ｓ、７２℃伸長；７２℃で１０ｍｉｎさらに伸長；保持（４℃）。
ノックアウト用の組換え断片はノックアウトすべき遺伝子の上流・下流相同アームからなり（上流相同アーム－下流相同アーム）、組み込むための組換え断片は、組み込む部位の上流・下流相同アーム及び組み込む対象の遺伝子断片からなる（上流相同アーム－目的遺伝子－下流相同アーム）。プライマー設計ソフトウェアｐｒｉｍｅｒ５を利用して、ノックアウト対象の遺伝子又は組み込む対象の部位の上流・下流配列をテンプレートとして、上流・下流相同性アームプライマー（増幅長さ約４００～５００ｂｐ）を設計し、組み込まれる遺伝子をテンプレートとして、組み込まれる遺伝子の増幅プライマーを設計した。ＰＣＲ方法によって上流・下流相同アーム及び目的遺伝子断片をそれぞれ増幅し、次にオーバーラップＰＣＲにより組換え断片を製造した。ＰＣＲ系及び方法を以下の表３に示す。
【0055】
１．３ プラスミド及び組換えＤＮＡ断片の形質転換
１．３．１ ｐＲＥＤＣａｓ９の形質転換
エレクトロポレーション方法によってｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドをＷ３１１０のエレクトロコンピテントセルにエレクトロポレーションし、菌体を蘇生させて培養してからスペクチノマイシン含有ＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。耐性平板上で単一コロニーを成長させ、同定プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、陽性組換え体をスクリーニングした。
１．３．１ ｐＲＥＤＣａｓ９の形質転換
エレクトロポレーション方法によってｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドをＷ３１１０のエレクトロコンピテントセルにエレクトロポレーションし、菌体を蘇生させて培養してからスペクチノマイシン含有ＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。耐性平板上で単一コロニーを成長させ、同定プライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、陽性組換え体をスクリーニングした。
【0056】
１．３．２ ｐＲＥＤＣａｓ９含有目的菌株のエレクトロコンピテントセルの製造
３２℃でＯＤ６００＝０．１～０．２まで培養すると、最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらにＯＤ６００＝０．６～０．７まで培養したときにコンピテントセルの製造を行った。ＩＰＴＧの添加は、ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミド上のリコンビナーゼの誘導発現のためである。コンピテントセル製造に必要な培地及び製造過程について一般的な標準的な操作を参照した。
３２℃でＯＤ６００＝０．１～０．２まで培養すると、最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらにＯＤ６００＝０．６～０．７まで培養したときにコンピテントセルの製造を行った。ＩＰＴＧの添加は、ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミド上のリコンビナーゼの誘導発現のためである。コンピテントセル製造に必要な培地及び製造過程について一般的な標準的な操作を参照した。
【0057】
１．３．３ ｐＧＲＢ及び組換えＤＮＡ断片の形質転換
ｐＧＲＢ及び組換えＤＮＡ断片をｐＲＥＤＣａｓ９含有エレクトロコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後に蘇生させて培養した菌体を、アンピシリンとスペクチノマイシンを含むＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。上流相同アーム上流プライマー及び下流相同アームの下流プライマー、又は専門に設計された同定プライマーを用いて、コロニーＰＣＲ検証を行い、陽性組換え体をスクリーニングして保存した。
ｐＧＲＢ及び組換えＤＮＡ断片をｐＲＥＤＣａｓ９含有エレクトロコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後に蘇生させて培養した菌体を、アンピシリンとスペクチノマイシンを含むＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。上流相同アーム上流プライマー及び下流相同アームの下流プライマー、又は専門に設計された同定プライマーを用いて、コロニーＰＣＲ検証を行い、陽性組換え体をスクリーニングして保存した。
【0058】
１．４ プラスミドの除去
１．４．１ ｐＧＲＢの除去
陽性組換え体を０．２％アラビノース含有ＬＢ培地に入れて一晩培養し、適切に希釈してスペクチノマイシン耐性ＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。それぞれ単一コロニーをアンピシリン及びスペクチノマイシン耐性ＬＢ平板に移し、アンピシリン平板では成長せず、スペクチノマイシン耐性平板では成長した単一コロニーを選択して保存した。
１．４．１ ｐＧＲＢの除去
陽性組換え体を０．２％アラビノース含有ＬＢ培地に入れて一晩培養し、適切に希釈してスペクチノマイシン耐性ＬＢ平板に塗布し、３２℃で一晩培養した。それぞれ単一コロニーをアンピシリン及びスペクチノマイシン耐性ＬＢ平板に移し、アンピシリン平板では成長せず、スペクチノマイシン耐性平板では成長した単一コロニーを選択して保存した。
【0059】
１．４．２ ｐＲＥＤＣａｓ９プラスミドの除去
陽性組換え体を耐性無しＬＢ液体培地に移し、４２℃で一晩培養し、適切に希釈して耐性無しＬＢ平板に塗布し、３７℃で一晩培養した。スペクチノマイシン耐性及び耐性無しＬＢ平板を比較し、スペクチノマイシン耐性平板では成長せず、耐性無し平板で成長した単一コロニーを選択して菌体を保存した。
陽性組換え体を耐性無しＬＢ液体培地に移し、４２℃で一晩培養し、適切に希釈して耐性無しＬＢ平板に塗布し、３７℃で一晩培養した。スペクチノマイシン耐性及び耐性無しＬＢ平板を比較し、スペクチノマイシン耐性平板では成長せず、耐性無し平板で成長した単一コロニーを選択して菌体を保存した。
【0060】
２．菌株構築に使用されるプライマーを表５に示す。
表５ 菌株構築に係るプライマー：
表５ 菌株構築に係るプライマー：
【0061】
３ 菌株構築の具体的な過程
３．１ ｓｐｅＡ、ａｄｉＡ及びａｓｔＡの３つの遺伝子のノックアウト
３．１．１ ｓｐｅＡ遺伝子のノックアウト
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｓｐｅＡ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３３５２）の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｓｐｅＡ－Ｓ、ＵＰ－ｓｐｅＡ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｓｐｅＡ－Ｓ、ＤＮ－ｓｐｅＡ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ｓｐｅＡ遺伝子ノックアウト断片（上流相同アーム－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ｓｐｅＡ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｓｐｅＡ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、組換えプラスミドｐＧＲＢ－ｓｐｅＡを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｓｐｅＡ及びｓｐｅＡノックアウト断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１を得た。ｓｐｅＡノックアウト断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図２に示す。ここで、上流相同アームの長さは３９７ｂｐ、下流相同アームの長さは４６８ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは８６５ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは２７５２ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは８６５ｂｐとした。
３．１ ｓｐｅＡ、ａｄｉＡ及びａｓｔＡの３つの遺伝子のノックアウト
３．１．１ ｓｐｅＡ遺伝子のノックアウト
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｓｐｅＡ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３３５２）の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｓｐｅＡ－Ｓ、ＵＰ－ｓｐｅＡ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｓｐｅＡ－Ｓ、ＤＮ－ｓｐｅＡ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ｓｐｅＡ遺伝子ノックアウト断片（上流相同アーム－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ｓｐｅＡ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｓｐｅＡ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、組換えプラスミドｐＧＲＢ－ｓｐｅＡを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｓｐｅＡ及びｓｐｅＡノックアウト断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１を得た。ｓｐｅＡノックアウト断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図２に示す。ここで、上流相同アームの長さは３９７ｂｐ、下流相同アームの長さは４６８ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは８６５ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは２７５２ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは８６５ｂｐとした。
【0062】
３．１．２ ａｄｉＡ遺伝子のノックアウト
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのａｄｉＡ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３４０８５） の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｄｉＡ－Ｓ、ＵＰ－ａｄｉＡ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ａｄｉＡ－Ｓ、ＤＮ－ａｄｉＡ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｄｉＡ遺伝子ノックアウト断片（上流相同アーム－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｄｉＡ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｄｉＡ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｄｉＡを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｄｉＡ及びａｄｉＡノックアウト断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ２を得た。ａｄｉＡノックアウト断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図３に示す。ここで、上流相同アームの長さは８０６ｂｐ、下流相同アームの長さは４０２ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは１２０８ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは２１２４ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは１２０８ｂｐとした。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのａｄｉＡ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３４０８５） の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｄｉＡ－Ｓ、ＵＰ－ａｄｉＡ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ａｄｉＡ－Ｓ、ＤＮ－ａｄｉＡ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｄｉＡ遺伝子ノックアウト断片（上流相同アーム－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｄｉＡ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｄｉＡ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｄｉＡを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｄｉＡ及びａｄｉＡノックアウト断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ２を得た。ａｄｉＡノックアウト断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図３に示す。ここで、上流相同アームの長さは８０６ｂｐ、下流相同アームの長さは４０２ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは１２０８ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは２１２４ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは１２０８ｂｐとした。
【0063】
３．１．３ ａｓｔＡ遺伝子のノックアウト
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのａｄｉＡ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３２４１）の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｓｔＡ－Ｓ、ＵＰ－ａｓｔＡ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ａｓｔＡ－Ｓ、ＤＮ－ａｓｔＡ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｓｔＡ遺伝子ノックアウト断片（上流相同アーム－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｓｔＡ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｓｔＡ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｓｔＡを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ２のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｓｔＡ及びａｓｔＡノックアウト断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ３を得た。ａｓｔＡノックアウト断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図４に示す。ここで、上流相同アームの長さは４４３ｂｐ、下流相同アームの長さは５２３ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは９６５ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは１８６９ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは９６５ｂｐとした。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのａｄｉＡ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３３２４１）の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｓｔＡ－Ｓ、ＵＰ－ａｓｔＡ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ａｓｔＡ－Ｓ、ＤＮ－ａｓｔＡ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｓｔＡ遺伝子ノックアウト断片（上流相同アーム－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｓｔＡ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｓｔＡ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｓｔＡを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ２のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｓｔＡ及びａｓｔＡノックアウト断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ３を得た。ａｓｔＡノックアウト断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図４に示す。ここで、上流相同アームの長さは４４３ｂｐ、下流相同アームの長さは５２３ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは９６５ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは１８６９ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは９６５ｂｐとした。
【0064】
３．２ 大腸菌中のａｒｇＥ遺伝子のノックアウト、及び当該部位へのコリネバクテリウム・グルタミカム由来のａｒｇＪ遺伝子の組み込み
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのａｒｇＥ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３０５７４）の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｒｇＥ－Ｓ、ＵＰ－ａｒｇＥ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ａｒｇＥ－Ｓ、ＤＮ－ａｒｇＥ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＪ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７１）に従ってプライマー（ａｒｇＪ－Ｓ、ａｒｇＪ－Ａ）を設計し、ａｒｇＪ断片をＰＣＲ増幅し、プロモータＰｔｒｃを上流相同アームの下流プライマー及びａｒｇＪ遺伝子の上流プライマーに設計した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＥ遺伝子をノックアウトしたとともにａｒｇＪ遺伝子を組み込んだ組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ａｒｇＪ－下流相同アーム）を得て、プライマーｇＲＮＡ－ａｒｇＥ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｒｇＥ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｒｇＥを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ３のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｒｇＥ及びａｒｇＥ遺伝子をノックアウトしたとともにａｒｇＪ遺伝子を組み込んだ組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ４を得た。Ｐｔｒｃ－ａｒｇＪ断片を組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図５に示す。ここで、上流相同アームの長さは５１０ｂｐ、ａｒｇＪ遺伝子断片の長さは１２０６ｂｐ、下流相同アームの長さは６６８ｂｐ、オーバーラップ断片の長さは２４５８ｂｐとし、組換え体のＰＣＲ検証の際に、陽性組換え体から増幅された断片の長さは２４５８ｂｐ、元の菌から増幅された断片の長さは２１５４ｂｐとした。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのａｒｇＥ遺伝子（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１２９３０５７４）の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｒｇＥ－Ｓ、ＵＰ－ａｒｇＥ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ａｒｇＥ－Ｓ、ＤＮ－ａｒｇＥ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＪ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７１）に従ってプライマー（ａｒｇＪ－Ｓ、ａｒｇＪ－Ａ）を設計し、ａｒｇＪ断片をＰＣＲ増幅し、プロモータＰｔｒｃを上流相同アームの下流プライマー及びａｒｇＪ遺伝子の上流プライマーに設計した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＥ遺伝子をノックアウトしたとともにａｒｇＪ遺伝子を組み込んだ組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ａｒｇＪ－下流相同アーム）を得て、プライマーｇＲＮＡ－ａｒｇＥ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｒｇＥ－Ａをアニーリングして得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｒｇＥを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ３のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｒｇＥ及びａｒｇＥ遺伝子をノックアウトしたとともにａｒｇＪ遺伝子を組み込んだ組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ４を得た。Ｐｔｒｃ－ａｒｇＪ断片を組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図５に示す。ここで、上流相同アームの長さは５１０ｂｐ、ａｒｇＪ遺伝子断片の長さは１２０６ｂｐ、下流相同アームの長さは６６８ｂｐ、オーバーラップ断片の長さは２４５８ｂｐとし、組換え体のＰＣＲ検証の際に、陽性組換え体から増幅された断片の長さは２４５８ｂｐ、元の菌から増幅された断片の長さは２１５４ｂｐとした。
【0065】
３．２ 大腸菌中のｙｇｈＸ遺伝子部位へのコリネバクテリウム・グルタミカムのアルギニン合成オペロンの組み込み
コリネバクテリウム・グルタミカム中のアルギニン合成オペロン遺伝子（ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨの７つの遺伝子を含む）を大腸菌のｙｊｈＸ遺伝子部位に順次組み込み、プロモータＰｔｒｃによってこの外因性オペロンの転写発現をスタートし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ７を構築した。
コリネバクテリウム・グルタミカム中のアルギニン合成オペロン遺伝子の組み込みは合計３段階に分けられた。
コリネバクテリウム・グルタミカム中のアルギニン合成オペロン遺伝子（ａｒｇＣ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＤ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、ａｒｇＨの７つの遺伝子を含む）を大腸菌のｙｊｈＸ遺伝子部位に順次組み込み、プロモータＰｔｒｃによってこの外因性オペロンの転写発現をスタートし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ７を構築した。
コリネバクテリウム・グルタミカム中のアルギニン合成オペロン遺伝子の組み込みは合計３段階に分けられた。
【0066】
３．２．１ Ｐｔｒｃ－ａｒｇＣ－ａｒｇＪの組み込み
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｇｈＸ遺伝子の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｙｇｈＸ－Ｓ、ＵＰ－ｙｇｈＸ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ｓ１、ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ １３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７０、１０１９３７１）に従ってプライマー（ａｒｇＣ－ａｒｇＪ－Ｓ、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ－Ａ）を設計し、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ断片をＰＣＲ増幅し、プロモータＰｔｒｃを上流相同アームの下流プライマー及びａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子の上流プライマーに設計した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子の組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ａｒｇＣ－ａｒｇＪ－下流相同アーム）を得て、プライマーｇＲＮＡ－ｙｇｈＸ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｙｇｈＸ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ配列を、プラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｙｇｈＸを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ４のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｙｇｈＸ及びａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ５を得た。Ｐｔｒｃ－ａｒｇＣ－ａｒｇＪ断片を組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図６に示す。ここで、上流相同アームの長さは６０２ｂｐ、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子断片の長さは２３２４ｂｐ、下流相同アームの長さは５６１ｂｐ、オーバーラップ断片の長さは３６５０ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１０６８ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｇｈＸ遺伝子の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｙｇｈＸ－Ｓ、ＵＰ－ｙｇｈＸ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ｓ１、ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ １３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子配列（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７０、１０１９３７１）に従ってプライマー（ａｒｇＣ－ａｒｇＪ－Ｓ、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ－Ａ）を設計し、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ断片をＰＣＲ増幅し、プロモータＰｔｒｃを上流相同アームの下流プライマー及びａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子の上流プライマーに設計した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子の組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ａｒｇＣ－ａｒｇＪ－下流相同アーム）を得て、プライマーｇＲＮＡ－ｙｇｈＸ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｙｇｈＸ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ配列を、プラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｙｇｈＸを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ４のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｙｇｈＸ及びａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ５を得た。Ｐｔｒｃ－ａｒｇＣ－ａｒｇＪ断片を組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図６に示す。ここで、上流相同アームの長さは６０２ｂｐ、ａｒｇＣ－ａｒｇＪ遺伝子断片の長さは２３２４ｂｐ、下流相同アームの長さは５６１ｂｐ、オーバーラップ断片の長さは３６５０ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１０６８ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
【0067】
３．２．２ ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの組み込み
コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７２、１０１９３７３、１０１９３７４）及びその上流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ－Ｓ、ＵＰ－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ－Ａ）を設計し、上流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、ｙｇｈＸ遺伝子の下流配列に従って下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ｓ２、ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ａ）を設計し、その下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの組み込み断片（ａｒｇＢの上流断片－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｒｇＢＤＦ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｒｇＢＤＦ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｒｇＢＤＦを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ５のコンピテント細胞を製造ｓヴぃ、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｒｇＢＤＦ及びａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ６を得た。ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ断片を組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図７に示す。ここで、ａｒｇＢの上流断片－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの総長さは３５７５ｂｐ、下流相同アームの長さは５６１ｂｐ、オーバーラップ断片の長さは４２１９ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１０３４ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７２、１０１９３７３、１０１９３７４）及びその上流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ－Ｓ、ＵＰ－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ－Ａ）を設計し、上流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、ｙｇｈＸ遺伝子の下流配列に従って下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ｓ２、ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ａ）を設計し、その下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの組み込み断片（ａｒｇＢの上流断片－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｒｇＢＤＦ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｒｇＢＤＦ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｒｇＢＤＦを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ５のコンピテント細胞を製造ｓヴぃ、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｒｇＢＤＦ及びａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ６を得た。ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦ断片を組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図７に示す。ここで、ａｒｇＢの上流断片－ａｒｇＢ－ａｒｇＤ－ａｒｇＦの総長さは３５７５ｂｐ、下流相同アームの長さは５６１ｂｐ、オーバーラップ断片の長さは４２１９ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１０３４ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
【0068】
３．２．３ ａｒｇＧ－ａｒｇＨの組み込み
コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＧ－ａｒｇＨ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７６、１０１９３７７）及びその上流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ｓ、ＵＰ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ａ）及びａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片プライマー（ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ｓ、ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ａ）を設計し、その上流相同アーム断片及びａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片をＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｇｈＸ遺伝子の下流配列に従って下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ｓ３、ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ａ）を設計し、その下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＧ－ａｒｇＨの組み込み断片（ａｒｇＧの上流断片－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ配列をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ６のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ及びａｒｇＧ－ａｒｇＨの組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ７を得た。ａｒｇＧ－ａｒｇＨを組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図８に示す。ここで、ａｒｇＧの上流断片の総長さは４０５ｂｐ、ａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片の総長さは２８２６ｂｐ、下流相同アームの長さは５６１ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは３８７５ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１５２１ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムをテンプレートとして、ａｒｇＧ－ａｒｇＨ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０１９３７６、１０１９３７７）及びその上流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ｓ、ＵＰ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ａ）及びａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片プライマー（ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ｓ、ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ａ）を設計し、その上流相同アーム断片及びａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片をＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｇｈＸ遺伝子の下流配列に従って下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ｓ３、ＤＮ－ｙｇｈＸ－Ａ）を設計し、その下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ａｒｇＧ－ａｒｇＨの組み込み断片（ａｒｇＧの上流断片－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ配列をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ６のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ａｒｇＧ－ａｒｇＨ及びａｒｇＧ－ａｒｇＨの組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ７を得た。ａｒｇＧ－ａｒｇＨを組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図８に示す。ここで、ａｒｇＧの上流断片の総長さは４０５ｂｐ、ａｒｇＧ－ａｒｇＨ断片の総長さは２８２６ｂｐ、下流相同アームの長さは５６１ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは３８７５ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１５２１ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
【0069】
３．３ 枯草菌由来のｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の大腸菌のｙｊｉＴ遺伝子部位への組み込み
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０は枯草菌１６８菌株を出発菌株として、ＡＲＴＰ突然変異誘発とハイスループットスクリーニングを組み合わせた方法によって育種したものである（該菌株は２０１５年１２月２日に中国普通微生物菌種保蔵管理センター（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）（アドレス：北京市朝陽区北辰西路ｌ号院３号、中国科学院微生物研究所、郵便番号：１００１０１、菌種寄託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１７７５）に寄託された）。該菌株は、ウリジル酸及びアルギニンによるカルバモイルリン酸シンターゼのフィードバック調整作用を解除し、そのピリミジンヌクレオシドオペロン遺伝子をシーケンシングしたところ、そのカルバモイルリン酸大サブユニット（ｐｙｒＡＢコード）の第９４９位のグルタミン酸が欠失していることを見出した（出願公開番号ＣＮ１０５６７１００７Ａ）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０においてアルギニンフィードバックにより阻害されていないカルバモイルリン酸シンターゼ（ｐｙｒＡＡ、ｐｙｒＡＢ）を大腸菌に組み込むことで、アルギニン合成中の前駆物質であるカルバモイルリン酸の供給量を向上させた。
枯草菌中ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子は合計４２９２ｂｐであり、２つの部分に分けて大腸菌に組み込まれ、第１部分の長さは２６５１ｂｐ、第２部分の長さは１６４１ｂｐである。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０は枯草菌１６８菌株を出発菌株として、ＡＲＴＰ突然変異誘発とハイスループットスクリーニングを組み合わせた方法によって育種したものである（該菌株は２０１５年１２月２日に中国普通微生物菌種保蔵管理センター（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC）（アドレス：北京市朝陽区北辰西路ｌ号院３号、中国科学院微生物研究所、郵便番号：１００１０１、菌種寄託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１７７５）に寄託された）。該菌株は、ウリジル酸及びアルギニンによるカルバモイルリン酸シンターゼのフィードバック調整作用を解除し、そのピリミジンヌクレオシドオペロン遺伝子をシーケンシングしたところ、そのカルバモイルリン酸大サブユニット（ｐｙｒＡＢコード）の第９４９位のグルタミン酸が欠失していることを見出した（出願公開番号ＣＮ１０５６７１００７Ａ）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０においてアルギニンフィードバックにより阻害されていないカルバモイルリン酸シンターゼ（ｐｙｒＡＡ、ｐｙｒＡＢ）を大腸菌に組み込むことで、アルギニン合成中の前駆物質であるカルバモイルリン酸の供給量を向上させた。
枯草菌中ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子は合計４２９２ｂｐであり、２つの部分に分けて大腸菌に組み込まれ、第１部分の長さは２６５１ｂｐ、第２部分の長さは１６４１ｂｐである。
【0070】
３．３．１ 第１部分Ｐｔｒｃ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢの組み込み
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｊｉＴ遺伝子の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｙｊｉＴ－Ｓ、ＵＰ－ｙｊｉＴ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ｓ、ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１７７５）ゲノムをテンプレートとして、遺伝子ｐｙｒＡＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９３７３６８）、ｐｙｒＡＢ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９３６６０８）に従ってプライマー（１－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ｓ、１－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ａ）を設計し、第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子断片を増幅した。プロモータＰｔｒｃは上流相同アームの下流プライマー及びｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の上流プライマーに設計されている。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－下流相同アーム）を得て、プライマーｇＲＮＡ－ｙｊｉＴ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｙｊｉＴ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｙｊｉＴを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ７のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｙｊｉＴ及び第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションしたところ、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ８を得た。第１部分Ｐｔｒｃ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図９に示す。ここで、上流相同アームの長さは３１６ｂｐ、第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子断片の長さは２６５１ｂｐ、下流相同アームの長さは６６７ｂｐ、組み込み断片の総長さは３６３４ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１１００ｂｐであり、元の菌にはバンドがなかった。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｊｉＴ遺伝子の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｙｊｉＴ－Ｓ、ＵＰ－ｙｊｉＴ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ｓ、ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１７７５）ゲノムをテンプレートとして、遺伝子ｐｙｒＡＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９３７３６８）、ｐｙｒＡＢ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９３６６０８）に従ってプライマー（１－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ｓ、１－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ａ）を設計し、第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子断片を増幅した。プロモータＰｔｒｃは上流相同アームの下流プライマー及びｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の上流プライマーに設計されている。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－下流相同アーム）を得て、プライマーｇＲＮＡ－ｙｊｉＴ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｙｊｉＴ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｙｊｉＴを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ７のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｙｊｉＴ及び第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションしたところ、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ８を得た。第１部分Ｐｔｒｃ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図９に示す。ここで、上流相同アームの長さは３１６ｂｐ、第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子断片の長さは２６５１ｂｐ、下流相同アームの長さは６６７ｂｐ、組み込み断片の総長さは３６３４ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片の長さは１１００ｂｐであり、元の菌にはバンドがなかった。
【0071】
３．３．２ 第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢの組み込み
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１７７５）ゲノムをテンプレートとして、第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子配列及びその上流配列に従って上流相同性アームプライマー（２－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ｓ、２－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ａ）を設計し、その上流相同アーム断片（第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ下流配列２６６ｂｐと組み込まれる第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ配列１６４１ｂｐを合計１９０７ｂｐ含む）をＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｊｉＴ遺伝子の下流配列に従って下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ｓ１、ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ａ）を設計し、その下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢの組み込み断片（第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ８のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ及び第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ９を得た。第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢを組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図１０に示す。ここで、第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢの上流断片の総長さは１９０７ｂｐ、下流相同アームの長さは６６７ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは２５７４ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片長さは１１３５ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ａ２６０（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１７７５）ゲノムをテンプレートとして、第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子配列及びその上流配列に従って上流相同性アームプライマー（２－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ｓ、２－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ａ）を設計し、その上流相同アーム断片（第１部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ下流配列２６６ｂｐと組み込まれる第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ配列１６４１ｂｐを合計１９０７ｂｐ含む）をＰＣＲ増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｙｊｉＴ遺伝子の下流配列に従って下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ｓ１、ＤＮ－ｙｊｉＴ－Ａ）を設計し、その下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅した。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢの組み込み断片（第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－下流相同アーム）を得た。プライマーｇＲＮＡ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ８のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ及び第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ９を得た。第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢを組み込む過程において、組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図１０に示す。ここで、第２部分ｐｙｒＡＡ－ｐｙｒＡＢの上流断片の総長さは１９０７ｂｐ、下流相同アームの長さは６６７ｂｐ、オーバーラップ断片の総長さは２５７４ｂｐ、同定プライマーから増幅された断片長さは１１３５ｂｐとし、元の菌にはバンドがなかった。
【0072】
３．４ コリネバクテリウム・エフィシエンス中のｌｙｓＥ遺伝子の大腸菌ｉｌｖＧ遺伝子部位への組み込み
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｉｌｖＧ遺伝子の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｉｌｖＧ－Ｓ、ＵＰ－ｉｌｖＧ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｉｌｖＧ－Ｓ、ＤＮ－ｉｌｖＧ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、ｌｙｓＥ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿１４３７５８４３８．１）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）に従ってプライマー（ｌｙｓＥ－Ｓ、ｌｙｓＥ－Ａ）を設計し、ｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。プロモータＰｔｒｃは上流相同アームの下流プライマー及びｌｙｓＥ遺伝子の上流プライマーに設計されている。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ｌｙｓＥ遺伝子の組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ｌｙｓＥ－下流相同アーム）を得て、ｉｌｖＧプライマーｇＲＮＡ－ｉｌｖＧ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｉｌｖＧ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｉｌｖＧを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ９のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｉｌｖＧ及びｌｙｓＥ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０を得た。Ｐｔｒｃ－ｌｙｓＥ組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図１１に示す。ここで、上流相同アームの長さは４１２ｂｐ、Ｐｔｒｃ－ｌｙｓＥ遺伝子断片の長さは８０６ｂｐ、下流相同アームの長さは４８１ｂｐ、組み込み断片の総長さは１６９９ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは１６９９ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは１４２６ｂｐとした。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）ゲノムをテンプレートとして、そのｉｌｖＧ遺伝子の上流・下流配列に従って上流相同性アームプライマー（ＵＰ－ｉｌｖＧ－Ｓ、ＵＰ－ｉｌｖＧ－Ａ）及び下流相同性アームプライマー（ＤＮ－ｉｌｖＧ－Ｓ、ＤＮ－ｉｌｖＧ－Ａ）を設計し、その上流・下流相同アーム断片をＰＣＲ増幅し、ｌｙｓＥ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿１４３７５８４３８．１）配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）に従ってプライマー（ｌｙｓＥ－Ｓ、ｌｙｓＥ－Ａ）を設計し、ｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。プロモータＰｔｒｃは上流相同アームの下流プライマー及びｌｙｓＥ遺伝子の上流プライマーに設計されている。上記の断片をオーバーラップＰＣＲ方法で融合して、ｌｙｓＥ遺伝子の組み込み断片（上流相同アーム－Ｐｔｒｃ－ｌｙｓＥ－下流相同アーム）を得て、ｉｌｖＧプライマーｇＲＮＡ－ｉｌｖＧ－Ｓ及びｇＲＮＡ－ｉｌｖＧ－Ａをアニーリングして得られた標的配列を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＲＢに連結し、ｐＧＲＢ－ｉｌｖＧを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ９のコンピテント細胞を製造し、１．３及び１．４に記載の方法に従って操作し、プラスミドｐＧＲＢ－ｉｌｖＧ及びｌｙｓＥ遺伝子の組み込み断片をコンピテント細胞に同時にエレクトロポレーションし、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０を得た。Ｐｔｒｃ－ｌｙｓＥ組み込み断片の構築及び陽性菌株のＰＣＲ検証による電気泳動図を図１１に示す。ここで、上流相同アームの長さは４１２ｂｐ、Ｐｔｒｃ－ｌｙｓＥ遺伝子断片の長さは８０６ｂｐ、下流相同アームの長さは４８１ｂｐ、組み込み断片の総長さは１６９９ｂｐとし、ＰＣＲ検証の際に、陽性菌のＰＣＲ増幅断片長さは１６９９ｂｐ、元の菌のＰＣＲ増幅断片長さは１４２６ｂｐとした。
【0073】
実施例２
遺伝子組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０の発酵によるアルギニン生産方法は以下のとおりである。
（１）振とうフラスコ発酵：
斜面培養：－８０℃で保蔵した菌種を活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養し、１回継代した。
振とうフラスコシード培養：斜面シードを１かき取り、３０ｍＬシード培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで開口をシールし、３７℃、２００ｒｐｍで７～１０ｈ培養した。
振とうフラスコ発酵培養：シード培養液に対して１５体積％の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積３０ｍＬ）、９層ガーゼで開口をシールし、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで振とう培養し、発酵中にアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）グルコース溶液を補充して発酵を持続し、発酵周期を２６～３０ｈとした。
斜面培地の組成：グルコース１ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２
シード培地の組成：グルコース２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン３ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ１２、ＶＨ：１ｍｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２。
発酵培地の組成：グルコース２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物３ｇ／Ｌ、ペプトン２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ１２、ＶＨ：１ｍｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２。
振とうフラスコ発酵を２６～３０ｈ行ったところ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０菌株発酵液中のＬ－アルギニンの産量は３０～３２ｇ／Ｌであった。
遺伝子組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０の発酵によるアルギニン生産方法は以下のとおりである。
（１）振とうフラスコ発酵：
斜面培養：－８０℃で保蔵した菌種を活性化斜面にストリーク播種し、３７℃で１２ｈ培養し、１回継代した。
振とうフラスコシード培養：斜面シードを１かき取り、３０ｍＬシード培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し、９層ガーゼで開口をシールし、３７℃、２００ｒｐｍで７～１０ｈ培養した。
振とうフラスコ発酵培養：シード培養液に対して１５体積％の播種量で発酵培地を容れた５００ｍＬ三角フラスコに播種し（最終体積３０ｍＬ）、９層ガーゼで開口をシールし、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで振とう培養し、発酵中にアンモニア水を補充することでｐＨを７．０～７．２に維持し、６０％（ｍ／ｖ）グルコース溶液を補充して発酵を持続し、発酵周期を２６～３０ｈとした。
斜面培地の組成：グルコース１ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、牛肉ペースト１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２
シード培地の組成：グルコース２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン３ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ／Ｌ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ１２、ＶＨ：１ｍｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２。
発酵培地の組成：グルコース２５ｇ／Ｌ、酵母抽出物３ｇ／Ｌ、ペプトン２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１、ＶＢ３、ＶＢ５、ＶＢ１２、ＶＨ：１ｍｇ／Ｌ、水：残量、ｐＨ ７．０～７．２。
振とうフラスコ発酵を２６～３０ｈ行ったところ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ＡＲＧ１０菌株発酵液中のＬ－アルギニンの産量は３０～３２ｇ／Ｌであった。
【0074】
（２）発酵槽発酵：
斜面活化培養：－８０℃の冷蔵庫にある細菌保存チューブから菌種を１かき取り、活性化斜面に均一に塗布し、３７℃で１２～１６ｈ培養し、ナスフラスコに移して、さらに１２～１６ｈ培養した。
シード培養：適量の無菌水をナスフラスコに取り、菌懸濁液をシード培地に播種し、ｐＨを７．０程度に安定化し、温度を３７℃、溶存酸素を２５～３５％に維持し、細胞の乾燥重量が５～６ｇ／Ｌに達するまで培養した。
発酵培養：１５％播種量で新鮮な発酵培地に播種し、発酵を開始させ、発酵過程においてｐＨを約７．０に安定化させ、温度を３５℃、溶存酸素を２５～３５％に維持し、培地中のグルコースが全て消費されると、８０％（ｍ／ｖ）のグルコース溶液を流加し、発酵培地中のグルコース濃度を０．１～５ｇ／Ｌに維持した。
斜面培地、シード培地及び発酵培地は振とうフラスコ発酵と同様であった。
５Ｌ発酵槽にて５０～５５ｈ培養したところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は１３０～１３５ｇ／Ｌ、転化率は０．４８ｇアルギニン／ｇグルコース、生産性は２．５ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達する。発酵過程の曲線を図１２に示す。
斜面活化培養：－８０℃の冷蔵庫にある細菌保存チューブから菌種を１かき取り、活性化斜面に均一に塗布し、３７℃で１２～１６ｈ培養し、ナスフラスコに移して、さらに１２～１６ｈ培養した。
シード培養：適量の無菌水をナスフラスコに取り、菌懸濁液をシード培地に播種し、ｐＨを７．０程度に安定化し、温度を３７℃、溶存酸素を２５～３５％に維持し、細胞の乾燥重量が５～６ｇ／Ｌに達するまで培養した。
発酵培養：１５％播種量で新鮮な発酵培地に播種し、発酵を開始させ、発酵過程においてｐＨを約７．０に安定化させ、温度を３５℃、溶存酸素を２５～３５％に維持し、培地中のグルコースが全て消費されると、８０％（ｍ／ｖ）のグルコース溶液を流加し、発酵培地中のグルコース濃度を０．１～５ｇ／Ｌに維持した。
斜面培地、シード培地及び発酵培地は振とうフラスコ発酵と同様であった。
５Ｌ発酵槽にて５０～５５ｈ培養したところ、Ｌ－アルギニンの蓄積量は１３０～１３５ｇ／Ｌ、転化率は０．４８ｇアルギニン／ｇグルコース、生産性は２．５ｇアルギニン／Ｌ／ｈに達する。発酵過程の曲線を図１２に示す。
【0075】
以上は、本発明の実施形態を説明したものであるが、本発明は上記の実施形態に限定されるものではない。本発明の主旨や原則を逸脱することなく行われる任意の修正、同等置換や改良などは、本発明の特許範囲に含まれるものとする。
【図1(a)】
【図1(b)】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】